JPH10500010A

JPH10500010A - 植物において病原体耐性を誘導する方法

Info

Publication number: JPH10500010A
Application number: JP7529439A
Authority: JP
Inventors: ダラスジョージジョーンズ，ジョナサン; エリザベスハモンド−コサック，キム; アレンジョーンズ，デビット
Original assignee: ジョンインズセンターイノベイションズリミティド
Priority date: 1994-05-11
Filing date: 1995-05-11
Publication date: 1998-01-06
Also published as: EP0759086A1; CA2188562A1; WO1995031564A2; AU703644B2; WO1995031564A3; AU2415495A

Abstract

(57)【要約】斑形成した植物は増加された病原体耐性を有する：植物の細胞は、壊死及び／又は植物防御応答を含み得る表現型を発現し、この表現型を発現しない他の細胞は増加された病原体耐性を有する。本発明の実施形態は、例えば可動遺伝要素の挿入の結果として不活性化され、その後植物細胞内において再活性化されて壊死及び／又は植物防御応答を生じ、増加された病原体耐性に導くクラドスポリウム・フルブム病原体耐性遺伝子を含む種々の遺伝子を用いる。このシステムに関連した遺伝子の種々の組合せを含む細胞、植物及び他の物の組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】植物において病原体耐性を誘導する方法本発明は、植物に病原体耐性、特に広範囲の病原体耐性を導入する方法、及び該方法により得られうる、少くとも１つ、好ましくは１を超える病原体に対する耐性を示す植物に関する。植物は、潜在的に病原性の微生物により常に攻撃されている。作物は、それらが通常遺伝的に均一な単一栽培として成長するため特に攻撃されやすく、病気が襲った時、損害が激しくなり得る。しかしながら、大抵の植物は大抵の植物病原体に対する耐性を有している。自分自身を守るために、植物は厚いもしくは化学的に架橋された細胞壁構成物又は複合植物生合成経路由来の毒性化学物質のような病原体侵入に対する防壁を含む一連の予め存在して誘導可能な両方の防御を有するように進化してきている。病原体、特に生きている植物細胞との親密な関連から栄養を得る生物毒性病原体は、宿主の防御機構を回避するように特殊化しなければならない。病原体が病気を引きおこすことができるなら、その相互作用は適合可能であると言われるが、植物が耐性であれば、その相互作用は適合不可能であると言われる。誘導された耐性は、攻撃された病原体侵入の部位における局所的な細胞死に関連する誘導された応答である過敏な応答（HR）と強い相互関係がある。HRにより植物が生きている細胞の病原体をはばむことが仮説として挙げられているが、局所的な細胞死が植物防御機構から生じるのか、又はそれを誘導するのかについては確かでない。大抵の植物防御機構は不成功の病原体による攻撃に応答して強く誘発される。このような増強された耐性の誘発は、全身性（以後本明細書において全身的獲得耐性(SAR)という）であり得る(Ross，1961；Ryals et al.，1992) 。獲得した耐性は局所性（以後本明細書においてLARという）でもあり得る（Rya ls et al.，1992）。獲得耐性は広範囲にわたり調査されており、種々の事実が確立されている。例えば、葉において死んだ植物細胞の領域を生じるHRを刺激するために生物の刺激が必要とされる。創傷又は他の非生物的なストレスから生じる細胞死は十分でないであろう（Ryals et al.，1992；Enyedi et al.，1992）。更に、SARは抗真菌活性が証明されているものもある広範囲の一連の病原関連（PR）蛋白質の誘発と相互関係がある(Ward et al.，1991)。 SARの種々の例が研究されており、タバコモザイクウイルス(TMV)耐性のＮ遺伝子を有するタバコのTMVでの攻撃、及びタバコ壊死ウイルスもしくはコレトトリチウム・ラルゲナリウム（Colletotrichum largenarium）でのキュウリ苗木の攻撃を含む。結果は、１つの病原体での攻撃が広範囲の種々の他の病原体に対する耐性の増強を導くことを示す（Ryals et al.，1992）。 SARは病原体により攻撃されている植物におけるサリチル酸のレベルの増加とも関連しており(Malamy et al.，1990；Metraux et al.，1990)、これは、外来性サリチル酸の攻撃されていない植物への供給がSARを生じさせることができることを示す研究により確認されている(Ward et al.，1991；Hennig et al.，199 3)。サリチル酸の蓄積がサリチル酸ヒドロキシラーゼ遺伝子の発現により防止されるように設計された形質転換植物は、サリチル酸の蓄積が防止されていない非形質転換植物と比較してSARが削減されていることを示す（Gaffney et al.，199 3）。SARは、２，６−ジクロロイソニコチン酸(INA)のようなCiba-Geigyにより製造される多くの化学物質によっても誘導することができる（UKnes et al.，1992）。 SARは、広範囲の病気制御を行うことができる注目の方法である。しかしながら、２つの大きな欠点がその商用的活用をじゃましている：SARは、遺伝性の特徴はなく、従ってこの事象は存在する作物においてそれぞれの植物内にうまく導入されなければならない作物の生涯を通して有効であるために、SAR表現型は規則的な間隔をおいて再促進されなければならない。 SARを生じさせる機構は十分に理解されていないが、植物が該植物が耐性のある病原体により攻撃される時、適合不可能病原体の攻撃された侵入の部位においてHRをおこさせる。誘導されたHRは、攻撃されていない植物において通常、病気を引きおこすであろう毒性の病原体に対する植物耐性の全身的増強及び獲得を導く。 HRに関連する病気耐性は優性遺伝子（Ｒ遺伝子）により（排他的ではないが）しばしば規定されることが長い間知られている。フローは、病原体がこのようなＲ遺伝子を負かすために変異する場合、これらの変異が劣性であることを示した。フローは、Ｒ遺伝子が機能するために、病原体内に相当する遺伝子、“無毒性遺伝子”（Avr遺伝子）も存在しなければならないと結論づけた。毒性になるために、病原体はＲ遺伝子依存防御機構を活性化する産物を製造することを停止しなければならない（Flor，1971）。エソシター／レセプターモデルとしばしば呼ばれる広く受け入れられている役立つ仮説は、病原体が相当するAVR遺伝子を有するならば、Ｒ遺伝子は植物が前記病原体の存在を検出するのを可能にする産物をコードすることである(Gabriel and Rolte，1990)。その後この認識は防御応答の活性化に導入されている。大麦のMlo遺伝子のmlo対立遺伝子は、植物育種において現在広範囲に用いられている劣性の病気耐性遺伝子の一例である。この遺伝子の劣性対立遺伝子のためのホモ接合する系統は、病原体の欠損下においてでさえ（細胞壁アポジションの形成を含む）防御応答を活性化する(Wolter et al. ，1993)。これによりmlo変異は、壊死又は病気障害擬似表現型としても知られる防御擬似表現型の原因となり、早発的に活性化されるか又はより多くの“ヘア・トリガー（hair trigger）”により制御されるように防御応答を制御解除するようである。このような病気障害擬似変異のいくつかの例はトウモロコシにおいて存在する（Johal et al，1994，Pryor，1987，Walbot，1983）。現在、このような変異体がアラビドプシス(Arabidopsis)において調べられている。１つのこのような変異体、acdlのキャラクタリゼーションが報告されている(Greenberg and Ausubel，1993)このタイプの更なる変異体は科学の会合において報告されている（Rutgers University，New Jersey，USA，April 1993における会合におけるF ．M．Ausubelによるアラビドプシスacd2変異体；Wye College，Kent，UK in Apr il 1993におけるARAPANET(Arabidopsis Pathology Network)研究集会におけるR ．Dietrich and J．Danglによる（防御応答を刺激する障害のための）１sdとして現在知られているアラビドプシス変異体）。acd2及び１sd変異体を記載する原稿はDietrich et al．及びGreenberg et al．（1994）である。より構造的になり、又はより迅速に活性化され、又はより容易に不活性化されない防御応答を残すこのような変異体スクリーンにおいて同定される劣性変異は、それが植物に有害であるような激しさになることを防ぐための防御応答を通常低下させる遺伝子内にある。想像では、クローンされ、相当する遺伝子の発現を削減するためのアンチセンス又はセンス配置において発現され得るであろう（Hamilton，1990，Na poli et al，1989）。病原体無毒性遺伝子はまだほとんど理解されていない。いくつかのバクテリアAvr遺伝子は蛋白質の他のクラスと相同性のない親水性蛋白質をコードするが、一方、他のものはその数が無毒性を示す植物の範囲を変化させるように改良され得る繰り返し単位を有する（Keen，1992；Long and Staskawicz，1 993）。付加的なバクテリアの遺伝子(hrp遺伝子)は、HRを導入するためにバクテリアのAvr遺伝子に、及び病原性にも必要とされる（Keen，1992；Long and Stas kawicz，1993）。病原体が植物が該病原体を検出することを可能にする産物をなぜ作り出すのかは明らかでない。特定の容易に捨てられるAvr遺伝子が、病原性には必要とされないが寄与しており、一方他のAvr遺伝子がより重要であると広く確信されている（Keen，1992；Long and Staskawicz，1993）。２つの真菌の無毒性遺伝子、Avr４及びAvr９（De Wit et al.，1992；Joostenet al.，1994）も報告されている。原因となる生物マグナポルテ・グリセア（Magnaporthe gris ea）からのイネ芽球無毒性遺伝子及び大麦病原体リンコスポリウム・セカリス（ Rhynchosporium secalis）の無毒性遺伝子(NTP蛋白質)をクローニングするための研究も行われている。２つのウイルスの無毒性遺伝子も以前にクローニングされている。カルバー及びダウソン(Culver and Dawson，1991)は、タバコモザイクウイルスコート蛋白質がＮ′遺伝子産物のための無毒性決定基であることを示した。更に、ポテトウイルス×コート蛋白質はＲ_x及びＮ_x遺伝子のための無毒性決定基であるようである（Ka 1993；Goulden et al.，1993）。最近、バクテリアのスペック病原体シュードモナス・シリンガエ（Pseudomona s syringae）pv トマト(Pst)に対する“gene-for-gene”耐性を与えるトマトPto 遺伝子の地図ベースのクローニングが報告されている(Martin et al.，1993)。シュードモナス・シリンガエ耐性を与えるアラビドプシスRps２遺伝子及び（ウイルス耐性を与える）タバコＮ遺伝子がクローニングされることも最近報告されている（Keystone Sympo sium，January 1994）。より最近になって、Rps２及びCf−９遺伝子の特徴が植物における伝達の生物学における13th Annual Symposium in Columbia，Missour i，April 13th〜16th 1994において示されている、国際特許出願第PCT/GB94/028 12は、植物耐性遺伝子を一般的に同定及びクローニングするための方法を記載する。主に遺伝的判定基準を基礎とした遺伝子単離のための技術が近年劇的に改良されており、多くの研究者らは種々のＲ遺伝子のクローニングを現在試みている。標的は、（特に）（トランスポゾン標識によるトウモロコシ、アンチルリヌム(A ntirrhinum) 及び亜麻におけるサビ病耐性遺伝子；（地図ベースのクローニング及びＴ−DNA標識による）レタス及びアラビドプシスにおけるべと病耐性遺伝子；（標識、地図ベースのクローニング及び無毒性遺伝子産物のアフィニティー標識による）トマトにおけるクラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulvum) （Cf）耐性遺伝子；（地図ベースのクローニング及び標識による）トマト及びタバコにおけるウイルス耐性遺伝子；（地図ベースのクローニングによる）トマトにおける線虫耐性遺伝子；並びに（地図ベースのクローニングによる）アラビドプシス及びトマトにおけるバクテリア病原体に対する耐性のための遺伝子を含む。トマト(Lycopersicon esculentum)は葉の糸状菌病原体クラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulvum)により引きおこされる病気にかかりやすい。De Wi t，1992に従うとCf−９遺伝子を有する種々のトマトを攻撃しようとするＣ．フルブム種に無毒性を与えるＣ．フルブムのAvr９遺伝子は、最終的に処理されたサイズが28アミノ酸である分泌されたシステインの豊富なペプチドをコードする。しかしながら、適合可能な相互作用におけるその役割は明らかでない。Ｃ．フルブムに対して作用するＲ遺伝子（Cf遺伝子）が同定されており、しばしばトマトの関連した種からの栽培された種々のものに仕込まれている(Dickinson et al.，1993；Jon es et al.，1993)。Ｃ．フルブムは、病気を攻撃する宿主防御機構の活性化を導くCf−遺伝子を含む植物による認識を与えるAvr遺伝子を含む（適合不可能性）。Avr４及びAvr９遺伝子は、それらから抽出され得る感染した葉の細胞間の空間内に病原体から分泌される小さいペプチドをマードする。これは、これらのペプチドの精製及びシークエンシング並びにそれらをコードする遺伝子の単離を可能にする(De Wit，1 992；Joosten et al.，1994)。実験は、Avr９遺伝子がAvr９を欠失する病原体の種内に形質転換されている場合、その後病原体の種がCf−９遺伝子を有する植物に対して無毒性になることを示している。更に、Cf−９遺伝子を有する植物に対して無毒である病原体種におけるAvr９遺伝子の破壊がCf−９含有植物に対する適合可能性を与えることが示されている(Van Den Ackerveken et al.，1992，Ma rmeisse et al.，1993)。更に、De Witらは、Avr９遺伝子によりコードされる分泌されたペプチドが、注入された領域における壊死的応答を誘導するためにCf−９含有トマトの葉に注入され得ることを更に示している。壊死的応答は防御応答の局所性及び強力な活性化で一慣している(De Wit，1992；WO91/15585)。国際特許出願第PCT/GB94/028 12号は、Cf−９植物における致死の原因となるストロングカリフラワーモザイクウイルス355植物プロモーターを用いるAvr９の形質転換した発現を記載する。この形質転換した発現は、Cf−９遺伝子を単離してこの遺伝子のDNA配列分析を行うために、Cf−９遺伝子がトランスポゾン挿入により不活性化されている変異体を選択するのに用いられている。これらのCf遺伝子を負かす種々の病原体が発生してきており、それらが打ち勝つことができるCf−遺伝子の名をとって命名されている。例えば、Ｃ．フルブム種４はCf−９を負かすことができ：Ｃ．フルブム種５はCf−５を負かすことができ；そしてＣ．フルブム種２，４，５，９はCf−２，Cf−４，Cf−５及びCf−９を負かすことができる。 WO91/15585は推測に基づく方法により、Cf−９遺伝子及び／又はAvr９遺伝子が広範囲の病原体により誘導されるプロモーターの制御下において発現されるなら、その後一般的な防御応答が誘導されるであろうことを記載する。しかしながら、ポリヌクレオチド配列が耐性遺伝子として、又は広範囲の病原体により適切に影響を受けるであろう実際のプロモーターとしてのいずれかで用いられ得るであろう点を開示していない。この提案された方法の更なる問題はCf−９及びAvr ９遺伝子の組合せにより誘導される壊死は、植物の産出における壊死及び激しい削減の広がりを導くAvr９及び／又はCf−９の更なる誘導を導くことができるであろうことである。植物防御遺伝子、及びPR遺伝子（病原性関連遺伝子）のような防御応答に関連する他の遺伝子のためのプロモーターのようなプロモーターが適合可能な及び適合不可能な相互作用の両方において誘導されるのでこの問題がおこる。それゆえ、広範囲の病原体により効果的に誘導されるプロモーターが存在する場合でさえ、プロモーターが適合可能病原体の出現によってのみ誘導されるのでないならこの方法は存在できないであろう。防御応答がプロモーターの更なる誘導を供するのであれば植物は壊死の広がりを被り得るであろう。本発明は、最初のものはCf−９である耐性遺伝子のトランスポゾン標識に関連する実験から得られたものである。トウモロコシ要素解離（Dissoclation）(Ds) により不活性化されているCf−９遺伝子の多量の対立遺伝子（Cf−９^*Ds）を単離した。これらの不活性Cf−９^*Ds遺伝子は、構造的に発現されたAvr９転移遺伝子（35S：SP Avr９）に応答する防御機構の構造的及び致死的活性化をおこさない。ホモ接合状態であるがCf−９を欠失するアクティベーター（Ac）トランスポサーゼ遺伝子(sAc)を有するトマト植物にCf−９^*Ds及び35S：SP：Avr９遺伝子を有する植物を戻し交配することによって、結果として生ずる子孫の４分の１はsA c，35S：SP：Avr９及びCf−９^*Dsを有する。これらの植物は、構造的に発現されたAvr−９ペプチドの認識により、Cf−９の機能を体に復元して植物防御応答の細胞における局所的な活性化をおこさせるCf−９^*Ds遺伝子からのDsの体的削除を示した。これらの細胞は乾燥して小さな壊死領域を作り出し、植物は壊死させる病原体で攻撃された植物におけるSARの誘導に関連した壊死の体の斑に似た防御に関連した壊死のための斑を示した。更なる研究は、この様に植物防御応答の体の領域のため斑を形成する植物が特定の範囲の病原体に対して増加された耐性を有することを示した。これにより、本発明の第１の態様は、遺伝子が発現又は抑制されることにより壊死が活性化されている斑を誘導することにより、植物において、病原体耐性、特に広範囲の病原体耐性を与える方法に関する。本発明に従う方法は、（ｉ）植物細胞壊死に寄与するヌクレオチド配列を不活性化する又は植物細胞壊死に寄与するヌクレオチド配列の組合せの一部を形成する１以上のヌクレオチド配列を不活性化するステップと；（ii）前記ヌクレオチド配列を植物のゲノム内に導入するステップと；（iii）前記ヌクレオチド配列を機能形態に戻して特定レベルの壊死を生じさせ、病原耐性を与えるステップと、を含む。前記植物細胞壊死は、好ましくは、防御関連植物細胞壊死である。本発明の第２の態様は、遺伝子が発現又は抑制されることにより植物防御応答が活性化されている斑を誘導することにより植物に病原体耐性を与える方法であって、（ｉ）前記植物防御応答に寄与するヌクレオチド配列を不活性化する又は前記植物防御応答に寄与するヌクレオチド配列の組合せの一部を形成する１以上のヌクレオチド配列を不活性化するステップと；（ii）前記ヌクレオチド配列を植物のゲノム内に導入するステップと；（iii）前記不活性化されたヌクレオチド配列を機能形態に戻して病原体耐性を生じさせるステップと、を含むことを特徴とする方法に関する。前記斑は、一般的に体の領域においてであろう。病原体耐性は、野生型と比べて一般的に増加されているであろう。前記ヌクレオチド配列は１以上の遺伝子を含む。前記植物防御応答及び／又は植物細胞壊死は遺伝子の発現によりおこる。前記防御応答及び／又は植物細胞壊死は、１以上の相互作用性遺伝子の発現において条件的又は非条件的であり得る。物質又は物質の組合せは、増加された病原体耐性をおこし得る。例が更に以下に議論される。例えば、ヌクレオチド配列は、例えば植物防御応答の活性化により、壊死を導く物質、又は壊死のしるしなしに植物防御応答を導く物質をコードする遺伝子を含み得る。例えば、前記配列は、植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）、無毒性遺伝子(A vr)もしくは他のＲ遺伝子のエリシターもしくはガンド遺伝子（Ｌ）、又はＲ遺伝子及びＬ遺伝子の両方を含み得る。植物防御応答及び／又は植物細胞壊死に寄与するヌクレオチド配列の不活性化は、好ましくは、ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列の組合せを形成する１以上のヌクレオチド配列内に可動遺伝要素を挿入することにより行われる。前記可動遺伝要素は、好ましくは、トランスポゾンの切り出しが植物防御応答及び／又は壊死の活性化を生じさせるように特定のヌクレオチド配列に隣接するトランスポゾン又はヌクレオチド配列である。これにより、ヌクレオチド配列内への遺伝障害の挿入は、植物防御応答及び／又は植物細胞壊死に寄与することにおいて機能することができる産物の発現を防ぐための遺伝子を壊死する。例えばトランスポゾンのような転置因子の切り出しの後の、障害の欠如において、遺伝子が発現されて機能的産物を産生され得る。即ち遺伝子機能が元に戻される。この障害は発現産物をコードする遺伝子の部分内に挿入され得、又は前記産物の発現に必要とされるプロモーターのような調節配列内であり得る。本発明のこの形態において、植物における再活性化は、好ましくは、不活性化ヌクレオチド配列の回復により植物防御応答及び／又は壊死を活性化させることにより行われる。このような回復は、植物を栽培することによる。この核酸配列がその中の転置因子の挿入により不活性化される場合、植物ゲノムは、（例えばトランスポサーゼを含む）相当するトランスポゾン活性化システムをコードする少くとも１つのヌクレオチド配列を含むべきである。あるいは、不活性化形態は、組換えが遺伝子の不活性化形態を活性化するように（特異的レコンビナーゼを含む）部位特異的組換えシステムにより作用されるレコンビナーゼ認識配列により隣接され得るであろう。従って、不活性化ヌクレオチド配列が植物ゲノム内に導入される場合、トランスポゾンの体の切り出し又はヌクレオチド配列の組換えがいくつかの細胞においておこり、細胞の特定のクローンにおいて植物防御応答及び／又は壊死の活性化を導く。機能の回復がおこっている細胞の数は種々であり得る。更に後述されるように、例えば必要とされるヌクレオチド配列をそのゲノム内に有する植物の栽培による転置因子の自然的切り出しの頻度を調節することにより、システムを最適化するために特定の測定が利用できる。本発明は、本発明の方法により得られうる病原体耐性が増加された形質転換された植物、及びこのような植物のいずれかのクローン、種子、自己的もしくは雑種的子孫、並びに切断物、種子のようなこれらのいずれかの一部分を更に提供する。本発明は、切断物及び種子等を含む有性もしくは無性生殖もしくは繁殖において用いられ得るいずれかの一部分であるいずれかの植物零余子を促進する。植物の誘導体も本発明により促進される。誘導体はいずれかによって行われたそれ由来のいずれかの機能単位（例えば、由来である植物の使用又は製造なしで作られ得ないであろう変異誘発、組換えDNA、合成、又は植物により作られた遺伝子の機能的対立遺伝子）である。本発明に従う形質転換植物は、誘導された植物防御応答及び／又は植物細胞の壊死が隣接した細胞のような他の細胞が病原体耐性を獲得する原因となり得るので、増加された病原体耐性を示し得る。例えば植物細胞の植物耐性遺伝子の活性化は、この細胞の子孫により遺伝される。この植物耐性遺伝子の発現は、植物細胞壊死の領域を生じる関与する植物細胞の死を最終的に導き得る細胞における防御応答の開始を導く。従って、植物は、防御関連植物細胞壊死が活性化されている小さな体の領域のための斑を有し得る。この応答は、他の細胞において病原体耐性を誘導することができる。同様の一般的原理により行う、代わりにおいて、１以上の植物病原体耐性遺伝子の発現は、植物防御応答が活性化されている小さな体の領域のための斑を生ずるにとどまる防御応答の又は植物細胞壊死が活性化されている小さな体の領域のための斑を生ずる植物防御応答に関連しない植物細胞壊死の開始のいずれかを導くことができる。従って、植物は、壊死に寄与する遺伝子に関連する病原体ばかりでなく広範囲の病原体、例えばcf−9/Avr遺伝子の組合せの場合のC.フルブム(C．fulvum)に対する耐性を獲得することができる。例えば、本発明に従う形質転換トマト植物は、１以上のバクテリアの植物病原体(例えばキサントモナス・カムベストリス（X anthomonas campestris ）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringa e ）、真菌の植物病原体（例えば、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophth ora infestans ）、フサリウム・オキシスホルム（Fusarium oxysporum）、ボトリテス・シネレア（Botrytis cinerea ）、ベルチシリウム・ダーリアエ（Vertic illium dahliae ）、アルテナリア・ソラーニ（Altenaria solani）、リゾクトニア・ソラーニ（Rhizoctonia solani ))及びウィルスの病原体(例えばTMV，PVX，P VY，TSWV)のような広範囲の病原体に対する耐性を示し得る。同様に、形質転換タバコ、アラビドプシス及びポテト植物にような他の形質転換植物は、ペロノスポーラ(Peronospora)、フィトフトーラ（Phytophthora）、プッシニア（Puccini a）、エリシフェ（Erysiphe）及びボトリティス（Botrytis）のような重要な作物種の多数の主要な病気に対する耐性を示す。これにより、本発明の更なる態様によれば、第１の表現型を発現する細胞、及び野性型と比較して病原体耐性が増加された第２の表現型を発現する他の細胞のクローンで表現的に斑入りにされた植物又はそのいずれかの一部分を促進する。第１の表現型は、好ましくは、壊死及び／又は植物防御応答表現型である。議論されたように、このような表現型のための体の領域により斑入りされた植物は、壊死している、及び／又は植物防御応答が活性化されている第１の表現型を有する細胞に隣接し得る細胞における第２の表現型の結果として増加された病原体耐性を有し得る。表現型の斑は、遺伝子の第１の表現型を有する細胞、又はこのような表現型に寄与する遺伝子を含む核酸における発現から生ずる。他方、このような表現型でない他の細胞はこのような遺伝子発現を欠如する。本明細書に議論されるように、これは、例えばトランスポゾンのような転置因子のランダムな切り出しにより、耐性遺伝子のような先に不活性化されている遺伝子の再活性化からおこり得る。更なる態様において、本発明は、植物もしくは微生物細胞又は少くとも１つの該細胞を含む植物のような宿主細胞であって、（ｉ）植物防御応答及び／又は細胞壊死を引きおす又はこれに寄与する１以上のヌクレオチド配列をコードする核酸であって、前記ヌクレオチド配列の少くとも１つが例えばトランスポゾンのような転置因子の挿入により、可逆的に不活性化されている核酸と、（ii）トランスポゾンの場合トランスポサーゼのような、不活性化を逆転することができる分子をコードする核酸と、を含むことを特徴とする宿主細胞を提供する。これにより、前記細胞は、植物耐性遺伝子又は植物防御応答に関連するもしくは（単独又は１以上の配列、例えばＲ遺伝子の場合相当するエリシターとの組合せのいずれかで）その中で発現された時細胞を殺すことができる他の遺伝子を含むことができる。前記遺伝子はトランスポゾンのその中への挿入により不活性化され、前記細胞はトランスポサーゼをコードする遺伝子を更に含む。典型的な実施形態において、細胞のゲノムは、トランスポゾンのその中への挿入により不活性化された、遺伝子Cf−９、又はCf−９の機能を保持するその変異体、誘導体もしくは対立遺伝子を含む。前記ゲノムは Avr−９ゲノム、又はAvr−９の機能を保持するその変異体、誘導体もしくは対立遺伝子、並びにCf−９遺伝子からトランスポゾンを切り出すことができるトランスポサーゼをコードする遺伝子もしくはその機能的等価物も含む。他の耐性遺伝子は、更に本明細書に記載されるような、細胞壊死を引きおこすためにエリシター分子の存在を必要としない遺伝子として用いられ得る。前記細胞は、当業者に利用できるいずれかの適切な技術を用いて、例えば形質転換により、前記細胞又は前記核酸のその祖先内に導入することにより種々の遺伝子をコードする核酸を含み得る。更に、前記細胞を含む植物、及びそれによる種子は、いずれかの利用できる植物交配技術に従って、そのゲノムが必要とされる核酸を含んでいる雑種を作り出すための適切な親を交雑することにより作られ得る。例えばトランスポゾン又は他の不活性化障害を含む植物耐性遺伝子をそのゲノム内に含む親株は、植物耐性遺伝子のためのエリシター分子、及びトランスポゾンの切り出しのための適切なトランスポサーゼをコードする遺伝子をそのゲノム内に含む第２の株と交雑され得る。親の雑種の子孫、例えば種子又はそれから成長した植物の少くとも一部分は、この例において植物耐性遺伝子並びにエリシターとの相互作用に続いて植物防御応答及び／又は植物細胞壊死の植物における活性化のための必要とされる核酸を含むであろう。本発明のこの態様に従う植物は、遺伝的に斑入りにされるであろう。細胞のクローンは、壊死のような第１の表現型が示され、他方、他の細胞において前記配列が不活性化を維持してこれらの細胞が第１の表現型を示さないであろうように、トランスポゾンのような不活性化障害の除去により再活性化された植物防御応答及び／又は細胞壊死を引きおこす。又はこれらに寄与する１以上のヌクレオチド配列を有するであろう。この細胞において、核酸は染色体内に組み込まれ得る。植物のゲノム内に安定に組み込まれた遺伝子は、子孫が要求される表現型の斑を示してこれにより増強された病原体耐性有し得るように、植物の子孫へ世代を通して残る。植物の他に、本発明は、このような植物のいずれかのクローン、種子、自己もしくは雑種の子孫、切断物、種子のようなこれらのいずれかの一部分を提供する。本発明は、切断物及び種子等を含む有性又は無性、生殖又は繁殖において用いられ得るいずれかの一部分であるいずれかの植物の子孫を提供する。本発明の更なる態様は、核酸（例えばベクター）の導入に関連するこのような細胞を作製する方法であって、（ｉ）植物防御応答及び／又は細胞壊死を引きおこす、又はこれらに寄与する１以上のヌクレオチド配列をコードする核酸であって、前記ヌクレオチド配列の少くとも１つが例えばトランスポゾンのような転置因子の挿入により、可逆的に不活性化されている核酸、及び／又は（ii）トランスポゾンの場合、トランスポサーゼを植物細胞内に入れるように不活性化をもどすことができる分子をコードする核酸を含むことを特徴とする方法を提供する。核酸（ｉ）の導入は、核酸（ii）の導入の前又は後に行われ得る。このような導入は、核酸と植物細胞ゲノムとの間の組換えによりヌクレオチドの配列をゲノム内に導入することの前に行われ得る。核酸がその中に導入されている細胞の子孫は、本発明の範囲内に含まれる。小さな体の領域における植物防御応答及び／又は植物細胞壊死のレベルは、獲得した耐性の誘導又は他の防御応答の誘導を引きおこすのに十分であるべきである。この方法は、獲得した耐性の活性化を導くが遺伝されるので、遺伝獲得耐性（Genetic Acquired Resis tance）(GAR)と呼ばれる。従って、GARへ導く斑を生じさせるいずれのシステムも本発明に適用できる。本発明に従う方法及び植物等は、植物防御応答及び／又は植物細胞壊死に寄与するヌクレオチド配列、例えば無毒性遺伝子及び植物耐性遺伝子が、構成プロモーターもしくはＲ遺伝子の場合それ自体の内在性プロモーター、又は細胞型特異的プロモーターのようないずれかの適したプロモーターの制御下においてであり得るため、特に有利である。更に、例えばトランスポゾンの体の切り出しによる、ヌクレオチド配列の回復は、病原体に攻撃されているか否かにかかわらず、植物を通した細胞の多くの小さなクローンにおける植物防御応答の再発的かつ広範囲の誘導をおこす。植物に与えられた耐性は、それゆえ構成的かつ幅広い。本発明は、多くの適用のために用いられ得、F1ハイブリッド種子産生システムにおける展開に適している。このシステムにおいて、親の１方は、例えばトランスポサーゼ又はリマンビナーゼ遺伝子について、ホモ接合であるべきである。更に、２つの構成物がAvr９／Cf−９遺伝子組合せにおけるもののように壊死を誘導するために必要とされるシステムにおいて、この親も構成的に発現された遺伝子についてホモ接合的である。他方の親は、トランスポゾン又はリマンビナーゼ −認識配列のような非自律性不活性システムをコードする遺伝子についてホモ接合的であるべきである。体的切り出し又は組換えにより、この遺伝的構成の組の間の交雑を作った後に、防御応答及び／又は植物細胞壊死を起こす遺伝子の機能は、結果として生じる子孫における体の領域において復元される。植物防御応答及び／又は植物細胞壊死のための斑を供するいずれかの遺伝子又は遺伝子の組合せが本発明の方法において用いられ得ることは当業者に明らかであろう。更に、ヌクレオチド配列の不活性化を行い、次に機能的配列の回復を行ういずれかのシステムが用いられ得る。本発明は、更なる態様において、本明細書において用いられる種々の物質をコードするヌクレオチド配列の組合せを含む物質の種々の組成物も提供する。本発明に従う細胞内に導入され得るヌクレオチド配列のこのような組合せは次の通りである：（Ｘ）：タイプＸの１以上の遺伝子を有するヌクレオチド配列を表す。（XY）：タイプＸの１以上の遺伝子及びタイプＹの１以上の遺伝子等を有するヌクレオチド配列を表す。Ｒ：レセプター遺伝子Ｌ：（Ｒ遺伝子と相互作用することができる）リガンド遺伝子Ｉ：遺伝的挿入物Ａ：遺伝的挿入物の転位のアクティベーターＲは、植物におけるその存在が植物防御応答、壊死及び／又は増加された病原体耐性を引きおこす物質をコードし、ここでＩは、Ｒを不活性化することができる遺伝的挿入物であり、Ａは、Ｉにより不活性化されたＲを再活性化することができる物質をコードする。（１）１．（Ｒ），（Ｉ）及び（Ａ）；２．（Ｒ）及び（IA）；３．（Ｉ）及び（AR）；又は４．（Ａ）及び（RI）；５．（RIA）のいずれかの組合せ。あるいは、Ｒ及びＬは、植物におけるその一緒の存在が植物防御応答、壊死及び／又は増加された病原体耐性をおこす物質をコードし得る。ここで、Ｉは、Ｒ及び／又はＬを不活性化することができる遺伝的挿入物であり、Ａは、Ｉにより不活性化されたＲ及び／又はＬを再活性化することができる物質をコードする。１．（Ｒ），（Ｌ），（Ｉ）及び（Ａ）；２．（Ｒ），（LI）及び（Ａ）３．（Ｒ），（LA）及び（Ｉ）４．（Ｒ），（IA）及び（Ｌ）５．（Ｌ），（IR）及び（Ａ）６．（Ｌ），（AR）及び（Ｉ）７．（Ｉ），（LR）及び（Ａ）８．（Ｒ）及び（LIA）９．（Ｌ）及び（IAR） 10．（Ｉ）及び（ARL）；又は 11．（Ａ）及び（RLI）； 12．（RLIA）のいずれかの組合せ。遺伝的挿入物（Ｉ）がＲ又はＬ遺伝子のいずれかと連結されるなら、可能な組合せの数は、（１）：（RI）及び（Ａ）；又は（RIA）（２）：（RI）（Ｌ）及び（Ａ）（Ｒ），（LI）及び（Ａ）（RI）及び（LA）（RA）及び（LI）（RLIA）となろう。本発明は、Ｒ，Ｉ及びＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物、又はその一部分、零余子、誘導体もしくは子孫を作る方法であって、Ｒが、植物におけるその存在が植物防御応答及び／又は増加された病原体耐性を引きおこす物質をコードし、Ｉが、Ｒを不活性化できる遺伝的挿入物であり、そしてＡが、Ｉにより不活性化されたＲを再活性化することができる物質をコードし、前記方法が、ゲノムがＲ，Ｉ，Ａ及びその組合せのいずれかを含む植物系統を交雑して植物又はその先祖を作ることを含むことを特徴とする方法も提供する。更なる態様において、Ｒ，Ｌ，Ｉ及びＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物、又はその一部分、零余子、誘導体もしくは子孫を産生する方法であって、Ｒ及びＬが、植物における一緒のその存在が植物防御応答及び／又は増加された病原体耐性を引きおこす物質をコードし、ＩがＲ及び／又はＬを不活性化することができる遺伝的挿入物であり、そしてＡがＩにより不活性化されたＲ及び／又はＬを再活性化することができる物質をコードし、前記方法が、そのゲノムがＲ，Ｌ，Ｉ，Ａ及びその組合せのいずれかを含む植物系統を交雑して植物又はその祖先を製造することを含むことを特徴とする方法を提供する。前記植物系統は、植物又はその祖先の細胞の形質転換の結果として、Ｒ，Ｌ，Ｉ，Ａ及びその組合せのいずれかを含む核酸を含むことができる。本明細書において、文脈が他を要求しないのであれば、“レセプター”は他の産物、即ちリガンドと相互作用することができる遺伝子によりコードされた産物である。本発明の種々の実施形態が、限定されない実施例により、以下に更に詳細に記載される。植物防御応答及び／又は壊死を与えるヌクレオチド配列又は配列配列の少くとも１つが不活性化されているヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列の組合せは多数であり、ユビキチン接合酵素の作製された対立遺伝子(Becker et al.，1993)，CaMV遺伝子VI蛋白質(Takashashi et al.，1989) 適切なウイルス耐性遺伝子の存在下におけるウイルスコート蛋白質、例えばタバコモザイクウイルスエリシターコート蛋白質及び遺伝子Ｎ′(Culver and Dawson ，1991)、バクテリアヘアピン蛋白質（Wei et al.，1992；He et al.，1993）、遺伝子Ｎ（例えばWhitham et al(1994)を参照のこと）及び（Padgett及びBeachy （1993）によりクローニングされた）ToMb−Ob遺伝子、ポテトウイルスＸコート蛋白質及びその無毒性決定基（Ka 1993；Goulden et al.，1993)，Pto及びavrPto（例えばRommens et al.，1995を参照のこと）、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）のRPS２及びその無毒性遺伝子avrRPt２(Bent et al.，Mindrinos et al.)、並びにGreenbe rg et al．(1994)，Dietrich et al.，(1994)及びBowling et al.，(1994)により同定されたもののようなアラビドプシスの遺伝子を含み得る。 BARNASE(Mariani et al.，1990)又はジフテリア毒（Thorsness et al.，1993 ）のような迅速な細胞死を導く物質をコードする遺伝子は、これらの後者の例における細胞死が防御応答の活性化によるものでない場合でさえ、GARを誘導する変化を誘導するのに用いられ得る。細胞死が防御応答の局所的誘導から発生し、この細胞死が隣接した細胞を活性化して防御応答をひきおこさせることができることはこの分野の研究者の間で広く信じられている。しかしながら、これらの出来事の間の正確な原因及び効果の関係は現在明らかでない。植物における防御応答が壊死に必然的に関連しているか否かも明らかでない。従って、細胞は、例えばプロテアーゼインヒビター又はアルカロイド生合成の活性化を導くように創傷誘導可能防御応答を活性化することにより隣接細胞のBAR，NASE誘導死に応答し得る。この様に用いられ得る他の遺伝子は、形質転換タバコ植物においてMittler et al(1995 )により発現されたもののようなバクテリアプロトンポンプのようなプロトンポンプを含む。本発明の好ましい例は、Cf−９／Avr９遺伝子システムの使用である。これは、Avr９遺伝子の構成的発現へのCf−９遺伝子のトランスポゾン不活性化対立遺伝子のマッチングに関連し得る。このシステムは、関連する遺伝子の同様の組合せ、例えば、本明細書において提供される配列であるAvr４及びCf−４遺伝子（C f−４のクローニングは本願と同時に出願された同時係属中のGB出願において記載される）；本明細書において提供される配列であるAvr２及びCf−２遺伝子（Ｃｆ−２のクローニングは本明細書においてクレームされる優先権であるGB9506 658.5に記載される）；Avr５及びCf−５遺伝子、又は本明細書において提供される配列であるRPP５のような他のシステムからの耐性遺伝子及び相当する無毒性遺伝子をクローニングすることにより置き換えられ得る（RPP５のクローニングは本明細書内でクレームされる優先権であるGB9507232.8に記載される）。それは、例えば過剰発現により相当するAvrの欠如下においてＲ遺伝子を発現する植物細胞において適切な応答を刺激することが可能であり得る特定の場合である。完全なAvr又は他のエリシター遺伝子が必要とされ得ないことも注目すべきである。代わりに、植物防御応答及び／又は植物細胞壊死を刺激するために相互作用するエリシター分子の一部分を表すフラグメントを用いることができる。ヌクレオチド配列が不活性化Ｒ遺伝子、不活性化Avr遺伝子もしくは両方を含む、又はその遺伝子の一方が不活性化されているＲ及びAvr遺伝子の両方を含むことが可能である。用いられる遺伝子によって、植物防御応答及び／又は植物細胞壊死は両遺伝子の発現に依存し得るので、１つの例は、Ｒ遺伝子が構造的に発現され、Avr遺伝子がAvr９遺伝子発現の体的切り出し及び回復のため発現のために体の斑を示し得るであろうこと、又はその逆であろう。本発明において用いられるヌクレオチド配列は、利用できるものから選択された野生型配列（例えば遺伝子）、又はこのような配列の１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段による変異体、誘導体もしくは対立遺伝子をコードし得る。ヌクレオチド配列の代わり又は違いは、遺伝コードの縮退によって、コードされたアミノ酸配列における変化において反映され得る又は反映され得ない。好ましい変異体、誘導体及び対立遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされる蛋白質の機能的特徴、即ち本文脈において植物防御応答及び／又は植物細胞壊死を与える能力を保持するものである。もちろん、コードされたアミノ酸配列に差異を与える核酸への変化が含まれる。同様に、他の種又は類からのその使用が本明細書に開示される種々の遺伝子の相同体は、該相同体の変異体、及び誘導体と共に、用いられ得る。植物防御応答及び／又は壊死を与えるヌクレオチト配列又は配列の不活性化及び再活性化本発明に従う方法は、トウモロコシActivator／Dissociation（本明細書においてAc／Dsシステムと呼ぶ）（Fedoroff，1989）；トウモロコシEnhancer／Supp ressormutator(En／Spm)システム（Fedoroff，1989）；及びAntirrhinum Tam１及びTam３システム(Coen et al.，1989)を含む当業者に周知である種々のトランスポゾンシステムのいずれかを用いることができる。更に、バクテリアCre−Lox p(Odell et al，1990)又は“FLP／FRT”システム(Lloyd及び Davis，1994)のような適切な結果を生じるよう作製されたいずれかの改良された組換えシステムが用いられ得る。植物防御応答及び／又は植物細胞壊死を導く物質をコートするヌクレオチド配列を不活性化するのに用いられるトランスポゾン、組換え又は他のシステムの特定の選択が本発明に本質的なものでなく、又は本発明を限定するものでいなことは当業者に明らかであろう。いくつかのシステムにおいて、トランスポゾン又は組換えシステムは、許容されないレベルの壊死が見られるように活性であり得るであろう。敵対したなら、これは、活性化されたヌクレオチド配列の頻度がAc(Cla)になるように減少されているトランスポゾン又はリコンビナーゼ認識配列の対立遺伝子を作製することにより克服し得る(Keller et al.，1993)。あるいは、化学的又は部位特異的変異誘発が、より活性化されていない壊死誘導性遺伝子の対立遺伝子を回復するのに用いられ得、それにより、植物細胞壊死のより容易なレベルを生ずる(Hammond -Kosack et al.，1994)。他のシステムにおいて、トランスポゾン又は組換えは、不十分なレベルの植物細胞壊死を導くほとんど活性化されていないヌクレオチド配列を生ずる不十分なものであり得る。これは、有効なレベルまで切り出し又は組換えの頻度を増加させるために、植物遺伝子内のトランスポサーゼ又はリコンビナーゼ遺伝子への適切なプロモーター融合体を作製することにより克服し得る（Swinburne et al.， 1992）。最も適切なプロモーターは、早期の大きな領域よりむしろ器官発達の間の後期の壊死の小さな領域に主におこり得る。トランスポゾン切除又は組換えの後、防御応答及び／又は壊死を活性化するためのメカニズムとして多くの他のバリエーションが可能である。Cf−９遺伝子の形態は、それがそのリガンドの欠如下においてでさえ防御応答を活性化するように作製され得る。例えば、（目の発達に関連する）キイロショウジョウバエ属のレセプターは、それがそのリガンドの欠如下において活性化されるように変異され得る（Basler et al，1991）。例えば、病気耐性遺伝子の高レベル発現、又は他の種における病気耐性遺伝子の発現は、無毒性産物の欠如下においてでさえ防御応答及び／又は壊死の活性化を導き得る(Bonneus，et al(1995))。代わりに、もとの病気耐性遺伝子は、それが農薬のような規定された化学物質と結合してこれがCf−９を活性化して防御応答及び／又は壊死を開始するように変異され得る。従って、遺伝子を活性化する切除のための遺伝子型の斑は、防御応答による体的壊死反応の開始なしにおこり得る。防御応答は、農薬が適用されて、無毒性遺伝子産物が存在するかのように同じ反応を誘発する耐性遺伝子により認識される時に開始するであろう。植物防御応答及び／又は壊死のための斑形成を与えるヌクレオチド配列又は配列の植物ゲノム内への導入不活性化されたヌクレオチド配列、又はその少くとも１つが不活性化されたヌクレオチド配列の組合せは、植物において発現された時に防御応答を活性化する、又は植物細胞壊死を誘導して広範囲の病原体耐性を与える物質をコードする。核酸は、組換えベクター、例えばプラスミド又はアグロバクテリアバイナリーベクター（Van den Elzen et al.，1985）の形態であり得る。核酸は、植物細胞における発現のための適切なプロモーター及び調節因子の制御下においてであり得る。ゲノムDNAの場合、これは、それ自体のプロモーター及び調節因子を含むことができ、cDNAの場合、これは宿主細胞内での発現のための適切なプロモーター及び調節因子の制御下であり得る。当業者は、組換え遺伝子発現のためのベクター及びプロトコルを十分に作製することができる。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー配列及び適切な他の配列を含む適切な調節配列を含む適切なベクターが選択され、又は作製され得る。更に詳しくは、例えばMolecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd edition，Sambrook et al，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。例えば核酸作製、変異誘発、シークエンシング、細胞内へのDNAの導入及び遺伝子発現、並びに蛋白質の分析の操作のための多くの周知の技術及びプロトコルは、Short Prot ocols in Molecular Biology，Second Edition，Ausubel et al．eds.，John Wi ley & Sons，1992に詳しく記載されている。Sambrook et al．及びAusubel et a l.の開示は引用により本明細書内に組み込まれる。選択された遺伝子又は遺伝子構成物を細胞内に導入する場合、当業者に公知である特定の問題が説明されなければならない。挿入されるべき核酸は、転写を促進するであろう有効な調節因子を含む構成物内に構築され得る。細胞内に構成物を輸送する方法が利用できなければならない。いったん構成物が細胞メンブラン内に入ると、内在性の染色体材料内への一体化が本発明の異なる実施形態に従っておこり得る、又はおこり得ない。好ましい実施形態において、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）内に一体化される。一体化は、標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列の含有により促進され得る。最後に、植物を考える限り、標的細胞タイプは、細胞が全植物内に再生され得るようにあるべきである。プレ配列を含むDNA断片で形質転換された植物は、植物の遺伝的操作について既に知られている標準的な技術により作製され得る。DNAは、自然遺伝子転位能力を利用するアグロバクテリア(Agroba cterium)により行われるジスアームドTi−プラスミドベクター（EP−Ａ−270355 ，EP−Ａ−0116718，NAR12（22）8711〜87215，1984）、粒子もしくはマイクロプロジェクティルボンバードメント（US5100792，EP−Ａ−444882，EP−Ａ−434 616）、マイクロインジェクション（WO92/09696，WO94/00583，EP331083，EP175 966）、エレクトロポレーション(EP290395，WO8706614)又は直接的DNA取り込みの他の形態(DE4005152，WO9012096，US4684611)のようないずれかの適切な技術を用いて植物細胞内に形質転換され得る。双子葉植物種を形質転換するために、アグロバクテリア形質転換が当業者に広く用いられている。アグロバクテリアはいくつかの単子葉植物内に外来性DNAを形質転換することができると報告されている（WO92/14828）が、アグロバクテリアが不十分又は有効でない場合にはマイクロプジェクティルボンバードメント、エレクトロポレーション及び直接的なDN A取り込みが好ましい。あるいは、異なる技術の組合せ、例えばアグロバクテリアコート微粒子を用いてのボンバードメント（EP−Ａ−486234）、又は創傷を導くためのマイクロプジェクティルボンバードメントの後のアグロバクテリアとの同時培養（EP−Ａ−486233）が形質転換過程の効能を増強するのに用いられ得る。形質転換技術の特定の選択は、特定の植物種を形質転換する効能並びに選択された特定の方法を用いて本発明を行う人の経験及び好みにより決定されるであろう。植物細胞内に核酸を導入するための形質転換システムの特定の選択が本発明に本質的なものでなく、また本発明を限定するものでないことは当業者に明らかであろう。カナマイシン、ヒグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルホロン、メトトレキサート、ゼンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾールイノネス及びグリホセートのような抗生物質に対する耐性のような選択可能な表現型を与えるキメラ遺伝子からなる選択可能遺伝マーカーを用いることができる（Herrera-Estrella et al，1983； van den Elzen et al，1985）。本発明は、作物及びアメニティー植物において用いるのに特に有利である。適切な植物の例は、タバコ、ポテト、コショウ、ウリ科植物、ニンジン、アブラナ属野菜、レタス、ストロベリー、脂肪種子アブラナ属、テンサイ、小麦、大麦、トウモロコシ、コメ、大豆、エンドウ、ヒマワリ、カーネーション、キク属、他の観賞植物、芝、ポプラー、ユーカリノキ及びマツを含む。本発明の更に詳しい実施形態は、添付の図面の参照と共に以下の非限定の実施例において記載される。図１は、標識された対立遺伝子を示すCf−９遺伝子を概略的に示す。図２は、Avr９発現性トマト植物においてCf−９耐性遺伝子からのDs要子の切除により引きおこされる壊死領域形成の後に誘導されたＣ．フルブムに遺伝的に獲得された耐性を示す。接種後14日における葉当りのＣ．フルブムのいぼの数を示す。図３は、フィトフトーラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）（トマト及びポテトの遅延性の葉枯れ病）に対する遺伝的に獲得した耐性を示す。Cf −９^*DsからのGA⁺及びGAR^-植物、変異体系統Ｍ31及びＭ50並びにCf０植物を10,0 00胞子嚢柄／mlでスプレー様に接種した。パネルＡにおいて、接種後７日の変異体50の実験からの葉の外観を示す。パネルＢにおいて、接種された種々の遺伝子型における（接種後の）葉の器官脱離の比率を示す。図４は、フィトフトーラ・インフェスタンス（遅延性の葉枯れ病）に対する遺伝的に獲得した耐性を示す。Cf−９^*DsからのGAR⁺及びGAR^-植物、変異体系統Ｍ3 1及びＭ50並びにCf０植物を100胞子嚢柄／mlでスプレー様に接種した。パネルＡにおいて、接種後７日の変異体50の実験からの葉の外観(GAR⁺−右手側)をGAR^-（左手側）と比較して示す。パネルＢにおいて、接種された種々の植物遺伝子型への胞子形成性障害形成の比率を、接種後５，７，10，13及び16日において得られた胞子形成障害／木葉の平均数と共に示す。図５は、オイジウム・リコペルシシ（Oidium lycopersici）（粉末状ウドンコ病）に対する獲得した耐性を示す。Cf−９^*DsからのGAR⁺及びGAR^-を植物、変異系統Ｍ31及びＭ50並びにCf０植物を当量の数の胞子でぬった。パネルＡにおいて、接種後14日の葉の外観を示し、GAR^-を左側に、GAR⁺を右側に示す。Ｂにおいて、種々の植物遺伝子型における退縁障害（上側パネル）及び胞子形成性障害（下側パネル）形成の比率を、接種後７，10，14，21，24及び30日において得られた障害の平均数と共に変異体31について示す。Ｃは変異体50での同じ結果を示す。図６は、花の授粉後２，３，４，５，６及び７週間における変異体系統Ｍ23からのGAR⁺（sAc，Cf−９^*Ds−右手側）及びGAR^-（sAc，Cf−９^*Ds，Avr−９左手側）植物におけるトマト果実の外観を示す。暗緑色の領域が５週間によりGAR⁺果実上に形成されるがGAR^-果実上に形成されていない。これらの暗緑色の領域は、赤色の果実においては見ることができない。図７は、病原体接種実験直後のCf−９^*Ds変異体系統Ｍ23，Ｍ31及びＭ50からのGAR⁺及びGAR^-植物における防御関連遺伝子のレベルを示す。ノーザン分析は、パネルＡにおいて塩基性β−１，３グルカナーゼ遺伝子転写物のレベルを、パネルＢにおいて陰イオン性ペルオキシダーゼ遺伝子転写物のレベルを示す。図８は、タバコ及びポテトにおけるそれ自体のプロモーターの制御下における Cf−９遺伝子の機能的発現を示す。パネルＡは、Avr ９ペプチドを含むか又はAvr９ペプチドを欠如するかいずれかの細胞間流体（IF ）が接種されているタバコの葉を示す。Avr９＋IFは形質転換タバコ又は品種５に関連する適合可能なＣ．フルブム−トマト相互作用から得られた。Avr９−IF は、形質転換されていないタバコ又は品種２，４，５，９に関連する適合可能なＣ．フルブム−トマト相互作用から得られた。灰色の壊死は、Avr＋IFを受容している葉のパネルにおいてのみ、注入後３〜４時間で目で見ることができた。パネルＢにおいて、IFの単ータイプが注入されている各々を有する４つの別れたポテトの葉を示す。Avr９＋IFを受容した２つの葉のみが24時間により灰色の壊死を発達させた。図９は、タバコ・クロス・cv．Petite Havana 6201A（35S：SP：Avr９）ホモ接合体Ｘ cos 34.1(ゲノムCf−９)ヘテロ接合体からの接種における壊死の致死的表現型の発達を示す。種子の植えつけ後５〜12日の時間の過程(dsp)を示す。苗木の50％が種子の発芽の２日以内に葉枯れして死んだ。図10は、アラビドプシス・クロス・6201B4（35S：SP：Avr９）ヘテロ接合体Ｘ cos 138（ゲノムCf−９）ヘテロ接合体からの苗木の壊死的致死的表現型の発達を示す。苗木の大部分が発芽した後19日の苗木の外観。１つの苗木が死んで他は壊死的子葉を有していた。図11は、ポテト植物にGARを適用するための単一Ｔ−DNA構成物システムを示す。Ｔ−DNAは、低レベルの切除をすることができるのみである自律性Ac因子、Ac( Cla)因子（Keller et al．1993；Schofield et al．1994）及び35S：SP：Avr９トランスジーンにより不活性化されているそれ自体のプロモーターの制御下におけるCf−９遺伝子配列を含む。図12は、３つの葉の写真を示し、これらの２つはＣ．フルブムで病気にかかっており、１つはGARを発現してＣ．フルブムの同じ接種物に耐性を有している。図13は、いかにしてGAR⁺植物が（１）Dsトランスポゾンの挿入により不活性化されたCf−９遺伝子、及びAvr−９遺伝子、並びに（２）実施例１に記載されるA cトランスポサーゼ遺伝子を含む安定した系統を交雑することにより作られ得るかを示す。図14は、増加された病原体耐性を有する植物を作るための基本的な単純化した半数体交雑スキームを示す。Ｔ：形質転換系統Ｐ：形質転換系統の子孫Ｔ₁／Ｐ₁：４つの遺伝子Ｒ，Ｌ，Ｉ又はＡの各々の少くとも１つをそのゲノム内に含む系統Ｔ_1,2／Ｐ_1,2：４つの遺伝子Ｒ，Ｌ，Ｉ又はＡの２つの各々の少くとも１つをそのゲノム内に含む系統Ｔ₃／Ｐ₃：Ｔ_1,2内に存在しない４つの遺伝子Ｒ，Ｌ，Ｉ又はＡの各々の少くとも１つをそのゲノム内に含む系統Ｔ_3,4／Ｐ_3,4：Ｔ_1,2内に存在しない４つの遺伝子Ｒ，Ｌ，Ｉ又はＡの２つの少くとも１つをそのゲノム内に含む系統Ｔ_1,2,3／Ｐ_1,2,3：４つの遺伝子Ｒ，Ｌ，Ｉ又はＡの３つの各々の少くとも１つをそのゲノム内に含む系統Ｔ₄／Ｐ₄：Ｔ_1,2,3内に存在しない４つの遺伝子Ｒ，Ｌ，Ｉ又はＡの各々の少くとも１つをそのゲノム内に含む系統配列番号：１は、Cf−９遺伝子のゲノムのDNA配列を示す。特徴：核酸配列− ヌクレオチド898において翻訳開始；ヌクレオチド3487において翻訳停止；ヌクレオチド3703〜3708においてポリアデニル化シグナル（AATAAA）；ヌクレオチド3823においてポリアデニル化部位；ヌクレオチド3507／９〜ヌクレオチド3622／４の３′非コーディング配列における11 5bpイントロン。予想される蛋白質配列−主要翻訳産物863アミノ酸；シグナルペプチド配列アミノ酸１〜23；成熟ペプチドアミノ酸24〜863。配列番号：２はCf−９蛋白質アミノ酸配列を示す。配列番号：３はCf−９cDNAクローンの１つの配列を示す。翻訳は位置＋58．Cf −９ゲノム配列におけるATGにおいて開始する。配列番号：４は、本明細書に記載されるように用いられるキメラAvr９遺伝子の好ましい形態のアミノ酸配列及びDNA配列を示す。配列番号：５は、Cf−2.1遺伝子のゲノムのDNA配列を示す。特徴：核酸配列− ヌクレオチド1677において翻訳開始；ヌクレオチド5012において翻訳停止；翻訳停止の下流の特徴的な配列において共通のポリアデニル化シグナル（AATAAA）は存在しない。予想される蛋白質配列−主要翻訳産物1112アミノ酸；シグナルペプチド配列アミノ酸１〜26；成熟ペプチドアミノ酸27〜1112。配列番号：６はCf−2.1と命名されたCf−２蛋白質アミノ酸配列を示す。配列番号：７はCf−2.2遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。２つのCf−２遺伝子間で異なるアミノ酸を下線で示す。配列番号：８はCf２−２遺伝子に相当するほぼ全長のcDNAクローンの配列を示す。配列番号：９は、RPP５遺伝子のゲノムのDNA配列を示す。予想されるイントロンを小文字で示す。特徴：核酸配列−ヌクレオチド966において翻訳開始；ヌクレオチド5512において翻訳停止。配列番号：10は予想されるRPP５蛋白質アミノ酸配列を示す。配列番号：11は、Cf−４のゲノムのDNA配列を示す。この配列の特徴は、ヌクレオチド201における翻訳開始部位、ヌクレオチド2619における翻訳停止開始部位；ヌクレオチド2835における共通なポリアデニル化配列開始部位、2641における３′未翻訳配列におけるスプライシングドナー配列、ヌクレオチド2755におけるスプライシングアクセプター配列終了部位、ヌクレオチド2955におけるポリアデニル化の提唱される部位を含む。配列番号：12は、予想されるCf−４アミノ酸配列を示す。予想される蛋白質配列は、806アミノ酸の主要な翻訳産物、シグナルペプチド配列アミノ酸１〜23、成熟ペプチドアミノ酸24〜806から構成される。配列番号：13は、Ｃ．フルブムAVR４の成熟処理された形態をコードするよう提唱された配列に融合されたPR1aシグナルペプチド配列をコードするClaＩ/Sal Ｉ DNAフラグメントの二本鎖核酸及び導き出されたアミノ酸配列を示す。ヌクレオチド５における翻訳開始コドン、ヌクレオチド413における停止コドンの開始。アミノ酸１〜30はシグナルペプチドを表し、アミノ酸31〜136は成熟AVR４ペプチドを表す。実施例１ Cf−９を用いて遺伝的に獲得した耐性（GAR）（ｉ）変異誘発されたCf−９遺伝子を有する配偶子が得られかつ同定され得る保存体の確立トランスポゾン標識によりCf−９遺伝子を単離するための実験において、トランスポゾンDsの挿入により不活性化されているCf−９遺伝子（Cf−９^*Ds）の対立遺伝子を単離した（更に詳しくは国際特許出願番号PCT/GB94/02812を参照のこと）。この不活性化されたCf−９^*Ds遺伝子は、構造的に発現された35S：SP：Av r９遺伝子に対して防御メカニズムの構造的かつ致死的活性化をおこさなかった。我々は、トウモロコシトランスポゾンアクティベーター（Ac）及びその解離（ Ds）誘導体を用いてトマトにおけるトランスポゾン標識(tagging)を行う能力を確立している(Scofield et al 1992；Thomas et al 1993；Caroll et al 1993) 。これらのトランスポゾンが結合部位に優先的に転移するという事実によりストラテジーを見い出した。その位置においてDssを有する種々の系統が有用であり、これは、Cf−９に結合したDsを有するFT33（Rommens et al 1992）、並びに（ａ）Ｔ−DNA***系を監視するためのβ−グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子（Jeffer son et al 1987）及び（ｂ）トランスポサーゼを発現してDsをトランス−活性化することができるが転移しないであろう安定なAc（sAc）(Scofield et al 1992) を含む構成物SLJ10512(Scofield et al 1992)を有する系統を含む。系統FT33はCf−９遺伝子を有さない。我々は、結合した標的とされた標識を行うために、FT33におけるＴ−DNAをシスにおけるCf−９に置く組換え体を得た。２つのストラテジーを同時に追跡した。（ａ）FT33をCf−９遺伝子を有する保存体であるCf９と交雑した。その後、結果として生ずるF1をCf０（Cf−遺伝子を有さない保存体）と戻し交雑した。FT33 Ｔ−DNAを有する子孫はカナマイシン耐性を有している。カナマイシン耐性子孫をCf−９の存在についてテストした；５Ｃ．フルブム耐性個体を約180得た。我々は、Cf−９についてホモ接合体であり、SLJ10512のsAc Ｔ−DNAを有する子孫も作った。これらをCf−９及びFT33がシスである組換え体と交雑した。FT33 Ｔ−DNAにおいて、転置Ds因子はヒグロマイシン耐性遺伝子内にクローニングされてその機能を妨害する。トランスポサーゼ遺伝子発現の存在下においてのみおこるこのDs因子の体性トランス活性化は、ヒグロマイシンの活性化をおこす。これにより、 Cf−９及びFT33の間の組換え体を交雑することからsAc含有Cf−９ホモ接合体へ、sAc及びFT33を有し、Cf−９についてホモ接合的であるようなヒグロマイシン耐性個体が得られうるであろう。これによりこの遺伝子型の140個体を得た。（ｂ）sAc，FT33を有し、Cf−９ホモ接合体である個体を得ることを速めるために、FT33／Cf−９ F1をCf−９及びsAcのためにヘテロ接合体である系統と交雑した。結果として生ずる子孫の25％は両方のＴ−DNAを有しておりヒグロマイシン耐性であり、これらの50％を少し超えたものが、それらがCf−９遺伝子の少くとも１つの複製を有するため病気耐性であった。Cf−９遺伝子についてホモ接合体とヘテロ接合体との間を区別することを可能にするCP46として設計されたRFLP マーカーを利用した(Balint-Kurti et al 1993)。この方法において、Cf−９ホモ接合体であり、FT−33 Ｔ−DNAとsAcとの両方を有する２つの個体を得た。これらの２つの個体を、この遺伝子型により多くの交雑が行われ得るであろうように切断物を取り出すことにより増殖させた。（ii）機能的成熟AVR９蛋白質を発現するトマト保存体の確立遺伝子標識実験においていずれかの要求される変異体を得るための頻度は1000 のうち１未満、しばしば10,000のうち１未満であろう物をスクリーニングすることを避けるために、我々は、植物における真菌のAvr ９遺伝子を発現することを基礎にした上述の変異体のための選択方法を確立した。成熟Avr９蛋白質の28アミノ酸の配列は周知である（van Kan et al 1991）。それは分泌された蛋白質であり、Ｃ．フルブムのAvr９含有類が感染した葉の細胞間流体が抽出され得る。植物細胞からの分泌のために、我々は、成熟Avr９蛋白質の最初のアミノ酸に先んずるPrla遺伝子（Cornelissen et al 1987）から、30アミノ酸植物シグナルペプチドを有する遺伝子を組み立てるためにオリゴヌクレオチドをデザインした（配列番号：４を参照のこと）。配列番号：４に示された好ましいAvr９遺伝子配列は、Pr−1aシグナルペプチド配列(Cornelissen et al，1987)及びAvr９遺伝子配列(vanKan et al，1991)から作られるキメラ遺伝子を示す。この読み枠を当業者に公知である技術及び直ちに利用できるプラスミド（Jones et al 1992）を用いて、カリフラワーモザイクウイルスの355プロモーター(Odell et al 1984)及びオクトパイン合成遺伝子の３′ターミネーター配列（DeGreve et al 1983）に融合して、植物形質転換のためのバイナリープラスミドベクター内に導入した。我々は、この遺伝子を発現する形質転換Cf０トマト系統を得た。（iii）AVR９発現性保存体のCf−９発現性保存体との交雑（ii）において得られた形質転換系統をCf−９遺伝子を有する植物と交雑した。結果として生ずる子孫が発芽した時、50％が苗木の死に終わる壊死表現型であった。この結果は、Avr９遺伝子を含む苗木においてのみ観察された。同じ形質転換体をCf０植物と交雑した時、結果として生ずる子孫は全て十分に生存可能であった。最初の形質転換体を自家受粉させることから、個体はAvr９トランスジーンについてホモ接合体であることが同定された。Avr９ホモ接合体をCf−９と交雑した時、全ての子孫が死んだ。これにより、このシステムは、Cf−９遺伝子における変異を有する個体のための強力な選択方法を提供する。（iv）Cf−９の標識及び不活性化 Avr９遺伝子についてホモ接合体である個体（セクション（iv））を、Cf−９についてホモ接合体であり、FT33 Ｔ−DNAにおいてsAcとDsとの両方を有する個体（セクション（iiiａ）及び（iiiｂ））に受粉するための雄性の親として用いた。この交雑から生じた何千もの子孫を発芽させた。ほとんどが死んだがいくつかは生き残った。生存体からDNAを得て、Dsプローブを用いたサザンブロット分析を行った。いくつかの独立した変異体が共通サイズのBgl IIフラグメント内へのDsの挿入と相互関連した。これは、いくつかの独立した変異体が同じDNAフラグメント内へのD sの挿入の結果であることを示唆した。Ds配列に対するプライマーを用いて、転移したDs含有変異体＃18におけるDsに近接したDNAを逆PCR(Trig Ba et al 1988) を用いて増幅した。このDNAを他の変異体に対するプローブとして用いて、独立した変異体においてDsが同じ6.7kb Bgl IIフラグメント内に挿入されていることを証明した。 FT33におけるDsは、バクテリアの選択可能マーカーとしてバクテリアレプリコン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでいる（Rommens et al 1992）。これは、転移されたDsを有する植物DNAが(Bgl IIのような)Ds内で切断されない制限酵素で消化され得、この消化産物が再循環し得、そしてその後形質転換大腸菌に用いられ得ることを意味する。Ds及び近接した植物DNAを有するクロラムフェニルコール耐性クローンを得ることができる。Dsの３′側の植物DNAの1.8kb、及びDsの５′側の植物DNAの4.9kbを有するクローンを得るのにこの方法を用いた。 Cf−９遺伝子の我々の現在の理解事項を図１に概略的に示す。Cf−９遺伝子配列及び推定されるアミノ酸配列を配列表に示す。一連のプライマー（図１に示されるF1，２，３，４，５，６，７，12，13，10 ，26，27及び25）を、Dsの配列を基礎にしたプライマーと組み合わせたPCR分析により大数の独立した変異体を特徴づけるのに用いた。従って、これらのプライマーをトランスポゾン挿入により引きおこされるCf−９の他の変異の位置を特徴づけるために、トウモロコシAc／Dsトランスポゾン配列を基礎にしたプライマーとのポリメラーゼ鎖反応において用いた。18の独立した挿入を特徴として示されるように位置していた。変異体Ｅ，＃55，＃74及び＃100は不完全な生存を示し、壊死表現型を示し、利用できる配列情報を基礎にすると、それらが実際の読み枠の５′にあり、不完全な防御応答を活性化するために十分なCf９蛋白質発現を許容し得るであろう。遺伝子から得れた配列を用いて、Ds因子の配列を基礎にしたプライマーと組み合わせたポリメラーゼ鎖反応において用いられ得るであろうオリゴヌクレオチドプライマーをデザインして、遺伝子における他のトランスポゾン挿入の位置及び方向の両方をキャラクタライズした。これらを図１に示す。この実験の結果を基礎として、17の他のDs挿入物の地図の位置を（図１に示すように）信頼可能にアサインした。（ｖ）GAR植物の製造ホモ接合体状態においてAcトランスポサーゼ遺伝子(GUS遺伝子を欠くsAc)を有するかCf−９を欠如するトマト植物に、Cf−９^*Ds及び35S：SP：Avr９遺伝子を有する植物を戻し交配することにより、結果として生ずる子孫のsAc，35S：SP： Avr９及びCf−９^*Ds（図13参照）植物の４分の１は、Cf−９^*Ds遺伝子からのDs の体的切除、Cf−９機能の体的回復、及び防御応答が活性化されている壊死の体の領域の発生を示した。これにより、表現型的に、これらの植物は、壊死性病原体により攻撃された植物がSARの誘導に関連したHRの体の斑を示すのと同様に防御関連壊死のための斑を示した。壊死領域は、植物の発達を通して、子葉、葉、幹、葉柄、萼片、及び緑果実において目で見えた。また、壊死領域は、全葉肉層及び管状組織を覆う細胞において、下側及び上側表皮の両方において形成された。壊死領域のサイズ及びそれらの形成の頻度を、Cf−９配列におけるDs因子の位置及びDsの方向の両方により決定した。壊死のために斑を有する植物を、それらが、Cf−９^*Dsを有するか、又はCf− ９遺伝子を有さない斑のないそれらの類よりＣ．フルブムに対して耐性があるか否かを評価するためにテストした。DsがCf−９遺伝子における５つの異なる位置に独立して挿入されている５つの独立したCf−９^*Ds系統をテストした。これらの５つの独立した挿入物は、Cf−９アミノ酸、７と８（＜Ｍ23），28と29（＜Ｍ 18），47と48（＞Ｍ50），56と57（＞Ｍ31）、及び789と790（＞Ｍ30）の間である。矢印（＜又は＞）は、Ds因子の転写の方向を示す。体の壊死領域が発達したＦ₁植物は、壊死領域が発達していない類の子孫よりＣ．フルブムに対する耐性があった。壊死領域を有する植物において葉当り平均１〜２の小さな膿疱が、５ ×10⁵胞子／mlの接種後14日に発達した。Cf遺伝子を欠如する植物及び斑形成していない個体全てが葉当り平均38の大きな胞子形成性膿疱を示した。この例を図２に示す。９つの斑形成したCf−９^*Ds＃20植物、15の斑形成したCf−９^*Ds＃23植物、18 の斑形成したCf−９^*Ds＃30植物及び28の斑形成したCf−９^*Ds＃31植物をテストして、壊死のための斑形成をしていない全部で198の植物と比較した。植物が４週間経過して２倍に広がった葉を有した時に、Ｃ．フルブム（５×10⁵胞子／ml ）を接種した。斑形成した植物及び斑形成していない植物にＣ．フルブムを接種した時に同様の結果が得られた。18の斑形成したGAR⁺＃50植物において、葉当り１〜３の膿疱を形成し、他方、42の斑形成していないGAR^-＃50植物において、接種後14日に葉当り35超の膿疱が発達した。接種後14日及び21日の各々において目で見える胞子性膿疱の数を計数することにより、病原体に対する感受性を測定した。サンプルを顕微鏡分析のためにも取り出した。14日後のアッセイの結果を図２に示し、21日後の各々の表現型への典型的な感染を図12に示す。図２は、異なる個々のトマト植物の感受性を葉当りの胞子的膿疱の数としてｙ軸に表現したヒストグラムを示す。DsはGUS遺伝子を有している。Ｍ20，Ｍ23，Ｍ30及びＭ31は、Cf−９^*DsとsAcの間の交雑から得られた、そして各々Cf−９^*D s＃20，Cf−９^*Ds＃23，Cf−９^*Ds＃30及びCf−９^*Ds＃31から得られた植物におけるＣ．フルブムの増殖を示す。これらの個体はCf−９^*Dsから、そしてsAcのために分離する。Cf０はＲ遺伝子を有さず、Ｍ20，Ｍ23，Ｍ30及びＭ31 GUS−植物は、Cf−９^*DSとsAcとの両方の分離により失なっており、これにより病気感受性類は、感受性個体における病気の徴候のための良好な対照を供する。植物がsAc でなくDsを受容しているなら、それらは、Cf−９＊DsとsAcとの両方を必要とする壊死のための斑を発現しないGUS＋であり得る。見られ得るように、（全てが3 5S：Avr９遺伝子を有する）壊死的個体は、それらの病気感受性個体と比べて明らかに葉当りにほとんど膿疱が見られない。図２は、これらの実験において、（Cf−９遺伝子を欠如する）Cf０植物が葉当り約38の膿疱を示し、Cf−９^*Ds＃20，Cf−９^*Ds＃23又はCf−９^*Ds＃31由来の斑形成していない個体も葉当り約38の膿疱を示した。Cf−９^*Ds＃30を有する斑形成していない個体は、標識Cf−９対立遺伝子のいくつかの残った作用を示す葉当り約17の膿疱を示した。しかしながら、Cf−９^*Ds＃20，Cf−９^*Ds＃23，Cf− ９^*Ds＃30又はCf−９^*Ds＃31を有する斑形成個体は、葉当り１〜３の膿疱を示した。全部で70の斑形成個体を評価した。これらの結果は、この方法による極めて重大なレベルの病気制御を証明する。図12は３つの葉を示す。葉１及び葉２は、白いけば様の外観を与えるＣ．フルブムに感染されたものである。葉１はCf０であり、葉２はCf−９^*Ds23からの病気感受性の類である。最小の胞子形成を示す葉３は、Cf−９^*Ds＃23，sAc及び35 S：Avr９を有する（壊死の小さな領域が識別可能である）壊死的個体である。従って葉３はGARを発現している。この実施例において、Ｃ．フルブム病原体に耐性のある斑形成植物の領域は機能的Cf−９遺伝子を含まないことを認識することが重要である。（その機能がトランスポゾン切除により体に回復されている）機能的Cf−９遺伝子を有する実質的に全ての細胞は、それらが内在的に発現されたAvr９ペプチドの認識後に防御応答を表す時に殺される。これにより、非耐性の細胞は、壊死が隣接する細胞において明らかにされることにより耐性を有するように誘導される。実施例２ Cf−９を用いる斑形成植物の病原体耐性実施例１において製造された斑形成植物はＣ．フルブムに対する耐性が増加されていることを証明することに加えて、我々は、この植物が３つの関係のない真菌病原体、フィトフトーラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）（トマト及びポテトの遅延的葉枯れ病の原因体）及びオイジウム・リコペルシッシ（ Oidium lycopersici）（粉末状ウドンコ病）並びに（葉及び果実の斑の原因である）コレトトリチウム・ラルゲナリウム(Collectotrichum largenarium)に対するより多くの耐性も有している。Ｐ．インフェスタンス実験のために、壊死のため斑形成しているか又はそうでないかいずれかである変異体Cf−９^*Ds系統Ｍ31及びＭ50からの戻し交配子孫及びCf−遺伝子を欠く対照植物（Cf０）を、高度に有毒な単離体DSSI（A1交配型）の胞子嚢柄のスプレー適用（10,000又は100胞子／ml ）で攻撃した。接種後に、この植物を一定の100％RH及び16℃で12ｈ露光時間における拡散光条件に維持した。高胞子投与の適用後数日において、斑形成していたい植物の葉及びCf０植物のものをそれらの葉緑において豊富な胞子嚢柄を有するＰ．インフェスタンス障害の広がりにより完全に破壊した。対照的に、斑形成植物をＰ．インフェスタンスで感染させたが障害は３〜５mm径であり胞子形成しなかった（図３Ａ，Ｂ）。斑形成植物の完全な緑葉組織が破壊されて真菌の胞子形成が閉まる前に更に５〜６日が必要とされた。より低量の胞子投与において、接種後７日に、平均８〜10の大きな胞子形成障害が斑のない植物及びCf０植物の各々の葉に存在し、他方壊死のため斑形成している植物においては、10の葉当り１〜２の小さな非胞子形成障害が存在した（図４Ａ，Ｂ）。18の植物の平均を各々の遺伝子型／胞子のために用いた。オイジウム・リコペルシッシ実験のために、同一の植物遺伝子型を用いた。全体の上側表面にわたり一つの14日を経た胞子形成性膿疱からの胞子をハケでブラッシングすることにより、各々の葉に接種した。その後、接種された植物を16ｈの露光期間20℃、そして暗所期間18℃の拡散光条件下に維持した。RHは70％に維持した。接種後10日において、８〜10の退緑障害が、斑形成していない植物及びCf０植物の葉において明らかになり、これらの１〜２において胞子形成が始まっていた。斑を形成した植物との対比により、１〜２のより小さな退緑的非胞子形成性障害が各々の葉に存在していた（図５）。接種後14日において葉当り20超の胞子形成性障害が斑形成していない植物において存在し、これらは、葉の残りにおける厳しい退緑的症状を伴っていた。斑形成した植物において、２〜４の小さな胞子形成障害が葉当りに存在していた（図5A）。接種後14日において斑形成していない葉及びCf０の葉において見つけられたものと同様のレベルの胞子形成及び退緑が斑形成している葉において形成されるのに更に７〜10日を要した（各々16の植物）。実施例３果実における斑暗緑領域が、花の授粉後５週間において、GAR植物の緑色トマト果実において形成された（図６）。このトマト果実が、潜在的な商業的活用のために促進される赤色にいったん変わると、これらの領域は目に見えなくなった。GAR⁺及びGAR^- 植物から得られた成熟赤色果実にコレトトリチウム・ラジナリウム(Colletotric hum laginarium) の胞子100μｌ（10⁴胞子／ml）を注入した時、GAR^-果実のみが７日後に典型的な腐敗病の症状を示した。GAR⁺果実の繰り返しの接種は、病気をおこさなかった。要するに、上述の結果は、Cf−９遺伝子機能の回復のための斑形成しており、構造的にAvr９遺伝子を発現する植物において達成され得る極めて重大なレベルの病気制御の証拠となる。このデータは、この方法により達成され得る病気制御が、制御された４つの真菌病原体が極めて異なる形態の寄生を行うことから潜在的に広範囲のものであることも示す：Ｃ．フルブムは、吸器を形成しないビオトローフ（biotroph）であり、葉の葉肉層の細胞外空間において排他的に増殖する；Ｏ．リコペルシッシもビオトローフであるが、皮の表皮上側にのみ住みついて複合的細胞内吸器を形成する；Ｐ．インフェスタ及びＣ．ラルゲナリウムは、単純な吸器を最初に形成するヘミビオトローフ（hemibiotroph）であるが、後に表皮及び葉肉層の両方において宿主細胞を殺す。ホモ接合体Cf−９^*Ds，35S：SP Avr９系統をトマト系統Ｍ31及びＭ50のために確立した。ホモ接合体sAcソースへの交雑から得られたＦ₁戻し交配子孫は、以下を含む種々の病原体に対する耐性について評価することができる：ポテトウイルスＸ、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）pv ．トマト、壊死性真菌−ボトリティス（Botrytis）種、コレトトリチウム（Coll etotrichum）種、線虫−メロイドジーネ・インコグナータ(Meloidogyne incogna ta) 、アリマキ−モモアカアブラムシ、及び果実、さや、根又は塊茎攻撃性病原体。また、菌根の群集の定着に対するGARの効果がテストされ得る。壊死のための斑形成した植物において示される増加された耐性は遺伝獲得耐性 (Genetic Acquired Resistance)(GAR)といわれている。それは遺伝的特性であり、全体の植物の生活を通して活性であるためSARと区別される。いくつかの防御関連遺伝子の発現をGAR^-及びGAR⁺植物において比較した時、GA R⁺植物において各々の遺伝子のより大きく高いレベルの発現が見い出された。この例を、塩基性トマトβ−１，３グルカナーゼプローブ及びトマト陰イオン性ペルオキシダーゼプローブ（pTAP 4.5）を用いたＭ23，Ｍ31及びＭ50系統からのCf −９^*Ds系統について図７に示す。植物の病気を抑制することにおけるGARの効能は、領域の大きさと逆の関係があるようである。高頻度の小さな壊死領域を有する２つの独立したCf−９^*Ds系統（系統Ｍ31及びＭ50）は最もGARを示す。これは、注意深のCf−９機能の体的回復の頻度を操作することにより、更に高レベルの植物保護が開発されるであろう。現在、GARを説明する２つの可能な仮説がある。まだ生きている最初に活性化された宿主細胞が局所的及び全身的シグナルを作り出し、壊死的障害がCf−９−Avr９媒介応答の副産物であること。あるいは、活性化された宿主細胞の最終的な応答である実際の死及び壊死反応がSARに類似した方式で局所的及び全身的シグナルを作りだすこと。正確にいかにしてGARが作用するかは本発明を行うのに知る必要はない。必要な遺伝構成物が存在するなら、 GAR植物は野生型と比較して病原体耐性が増加されている。実施例４異種植物種におけるCf−９の発現及び細胞壊死の誘導我々は、Cf−９遺伝子を含む異なるゲノムクローンのタバコ及びトマトへの転移に続いて、これらの配列が形質転換植物をAvr９エリシター応答性にすることを示した（図８）。また、形質転換タバコ発現Cf−９を、構造的にAvr９ペプチドを発現するように作製された形質転換タバコ植物と交雑する時、種子発芽の２日以内にF1苗木は死ぬ（図９）。 Cf−９を発現する形質転換アラビドプシスをAvr９発現形質転換アラビドプシスと交雑する時、種子発芽後10日でF2苗木は死ぬ（図10）。これにより、我々は、種々の種において、Cf−９蛋白質により媒介される植物防御の活性化に必要とされる遺伝子が存在して機能することを示した。実施例５ポテトにおけるCf−９を用いた遺伝獲得耐性ポテト植物にGARを適用するために一本鎖Ｔ−DNA構成物システムを用いる。このシステムは、低レベルの切除のみを行うことができる自律性Ac因子（Ac(C la)因子(Keller et al．1993)及び355：SP Avr９トランスジーン）により不活性化されているそれ自体のプロモーターの制御下におけるCf−９遺伝子配列を含む一本鎖Ｔ−DNA構成物（図11）をおよその基礎とする。このAc因子は、Cf−９機能が回復されている高頻度の小さな体の領域を作るための最も良い配置を決定するために、Cf−９配列において、両方の方向における種々の位置に挿入される。細胞型特異的プロモーターの制御下にCf−９配列及び他のＲ遺伝子をおくことは、GAR表現型を増強し得る。潜在的な標的細胞の部位は、表皮及び管状柔組織細胞を含む。実施例６形質転換植物におけるCf−４の発現及び増加された病原体耐性の証明 Cf−４遺伝子を以下のいくつかの方法において形質転換植物においてテストした：最初に、相当する無毒性遺伝子Avr４を含むＣ．フルブムの類を接種することによりこの類が形質転換植物に対する適合不可能的応答を与えるか否かをテストし；第２に、Avr４を含む適合可能相互作用体から単離された細胞間流体を形質転換植物の葉に注入することにより；第３に、Cf−９/AVR９相互作用の研究(H ammond-Kosack et al.，1995)において先に記載されるような組換えポテトウイルスＸの形態においてAVR４を供することによる。 AVR４をコードするＣ．フルブム遺伝子のDNA配列が報告されており、成熟処理したポリペプチドのアミノ酸配列も報告されている（Joosten et al.，1994）。我々は、公表されている配列に対するプライマーを用いてＣ．フルブム類2.5からのAvr４遺伝子をPCRにより増幅して、提唱された成熟ポリペプチドをコードする配列を、タバコPRla蛋白質のＮ末端シグナルペプチドをコードするDNA配列に融合させた。これは、発現されている形質転換植物における細胞間空間にAVR４を標的づけするのを容易にするであろう。このキメラ遺伝子(SPAvr４)を、先に記載(Hammond-Kosack et al.，1995)されるように ClaＩ/SalＩ DNAフラグメント（配列番号：13）としてポテトウイルスＸのcDNA コピー内に挿入して、PVX：SP Avr４を作製した。組換えウイルスの感染的転写を、試験管内転写により行った。当業者に公知である標準的な技術を用いて全ての核酸操作を行った。トマト３週間を経たトマト苗木において組換えウイルスをテストするため実験を計画した。接種されたCf−４含有植物において、現われた子葉は、ウイルス接種の部位において少しの機械的損傷のしるしを示したのみであるCf０対照と対照的に、接種後３日（ｄ．ｐ．ｉ）に最終的に脱落した。Cf０植物は、野生型ウイルスで観察された症状、即ち退緑モザイク症状に匹敵する目に見えるウイルス感染の症状まで７〜10ｄ．ｐ．ｉに発達した。Cf−４を含む植物において４〜５ｄ．ｐ．ｉに、壊死障害がより若い葉において観察された。これはおそらくAvr９又はCf −９含有植物を含むPVXでの同様の実験において先に記載されるようなウイルスの全身的な広がりのためであろう(Hammond-Kosack et al.，1995)。他の特徴は、葉柄及び幹上の壊死領域を含む。壊死表現型が広く全身的に見られており、14 ｄ．ｐ．ｉにおいて、苗木を含むCf−４の大部分が死んだ。Cf０対照植物は死ななかったが、退緑及び葉脈透明化の症状を示した。これらの結果は、Cf−４は形質転換トマト植物において機能的であり、エリシターAVR４の存在下で壊死性防御応答を引きおこすことを確かにする。タバコ Cf−４を含むバイナリーベクターコスミドを用いて、当業者に公知である技術を用いて形質転換タバコ植物も作製した(Fillatti e t al.，1987；Horsch et al.，1985)。 Cf−４を含むコスミドを含む形質転換タバコにPVX：SP Avr４を接種した。ほとんどの形質転換体において、いくつかのウイルス耐性種におけるウイルス接種に応答して出現する障害に見られるのと同様に、３〜４ｄ．ｐ．ｉにウイルス接種の部位において壊死障害が観察された。これらの個体において、壊死は、最終的に合着した局所的な障害を全く確立されず、７〜10ｄ．ｐ．ｉにおいて葉の壊死がウイルス接種の全体の領域にわたり現れた。いくつかの形質転換体において、PVX：SP Avr４に対する反応はより激しく、壊死的葉の領域の領域を３〜４ｄ．ｐ．ｉにおいて観察することができた。Cf−４を欠如するコスミドを含む形質転換タバコ、又はPVX：SP Avr４で攻撃された形質転換されていない対照植物におけるこれらの表現型のいずれも観察されなかった。これにより、形質転換タバコにおけるCf−４の機能的発現も、エリシターAVR ４の存在下における壊死的防御応答の活性化と共に示された。病原体耐性 12のトマト形質転換体にPVX：SP Avr４を接種することによりCf−４活性を検出することができるように挿木により形質転換植物を増加させた。Cf−４を含む形質転換トマト植物は、３〜４ｄ．ｐ．ｉにおいて接種された葉において葉の壊死を示した。この壊死は、先に記載された実験においてCf−４含有植物において先に観察されたように最終的に全身に広がった。壊死的葉領域を示す形質転換植物は、最終的に死んだ。形質転換実験の最初の回において得られたいくつかの形質転換植物の挿木を、Ｃ．フルブム類５で接種することによりCf−４機能について更にアッセイした。テストされた５の形質転換植物において、PVX：SP Avr４依存性壊死を示す植物と病原体に対する耐性との間に明確な相互関係が観察された。この実験において、適合可能対照植物（Cf０）において病原体増殖が観察されたが、適合不可能対照植物（Cf２）においては観察されなかった。本文中に言及される全ての文書は引用により本明細書に組み込まれている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年５月２０日【補正内容】請求の範囲１．遺伝子が細胞内において発現又は抑制されることにより植物防御応答を活性化する斑形成を誘導することにより、植物又は植物の一部もしくは零余子において病原体耐性を増加させる方法であって、（ｉ）植物防御応答を供するヌクレオチド配列を不活性化するステップ又は植物防御応答を供するヌクレオチド配列の組合せの一部を形成する１以上のヌクレオチド配列を不活性化するステップと、（ii）前記ヌクレオチド配列を植物のゲノム内に導入するステップと、（iii）前記植物もしくはその子孫、又は該植物もしくは子孫の一部もしくは零余子の細胞内において前記ヌクレオチド配列を機能形態に戻して、病原体耐性を増加させるステップと、を含むことを特徴とする方法。２．遺伝子が発現又は抑制されることにより壊死を生ずる斑形成を誘導することにより、植物又はその一部分もしくは零余子において病原体耐性を増加させる方法であって、（ｉ）壊死を供するヌクレオチド配列を不活性化するステップ、又は壊死を供するヌクレオチト配列の組合せの一部を形成する１以上のヌクレオチド配列を不活性化するステップと、（ii）前記ヌクレオチド配列を植物のゲノム内に導入するステップと、（iii）前記植物もしくはその子孫、又は該植物もしくは子孫の一部もしくは零余子の細胞内において前記不活性化されたヌクレオチド配列を機能形態に戻すステップと、を含むことを特徴とする方法。３．前記ヌクレオチド配列が病原体耐性の増加を引きおこす物質又は物質の組合せをコードすることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。４．前記ヌクレオチド配列が遺伝子を含み、そして前記ヌクレオチド配列の発現による植物防御応答及び／又は壊死の活性化が、前記ヌクレオチド配列に含まれるいずれの他の遺伝子の発現にも依存しないことを特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の方法。５．前記ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列の組合せが１以上の遺伝子を含み、そして前記ヌクレオチド配列の発現による植物防御応答及び／又は壊死の活性化が、１以上の相互作用性遺伝子の発現を条件とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一に記載の方法。６．前記ヌクレオチド配列が植物防御応答及び／又は壊死を誘導することができる又は共に誘導することができる１以上の物質をコードし、そして前記ヌクレオチド配列の少くとも１つがステップ（ｉ）において不活性化されていることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．前記ヌクレオチド配列が、植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体、又は病原体無毒性遺伝子(Avr)又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体、又は他のＲ遺伝子エリシター(elicitor)(Ｅ)、又は（ｉ）Ｒ遺伝子又はその突然変異体、変異体、もしくは誘導体と（ii）対応するAvr遺伝子、又はその突然変異体、変異体もしくは誘導体、又は他のＲ遺伝子エリシター（Ｅ）との両方を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。８．前記植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）がトマトCf−９遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体であり、前記無毒性遺伝子がクラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvum） Avr−９遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体である又は他のCf−９エリシターをコートすることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．前記植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）がトマトCf−２遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体であり、前記無毒性遺伝子がクラドスポリウム・フルブムAvr−２遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体である又は他のCf−２エリシターをコードする；又は前記植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）がトマトCf−４遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体であり、前記無毒性遺伝子がクラドスポリウム・フルブムAvr−４遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体である又は他のCf−４エリシターをコードする；又は前記植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）がタバコＮ′遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体であり、前記無毒性遺伝子が適切なタバコモザイクウイルスコート蛋白質、又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体である又は他のＮ′エリシターをコードする；又は前記植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）がポテトＲ_x遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体であり、前記無毒性遺伝子が適切なPVXコート蛋白質又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体又は他のＲ_xエリシターである；又は前記植物病原体耐性遺伝子が他のウイルスの耐性遺伝子であり、前記無毒性遺伝子が対応するウイルスコート蛋白質又は前記ウイルスの耐性遺伝子の他のエリシターであることを特徴とする請求項７に記載の方法。 10．前記ヌクレオチド配列が、カリフラワーモザイクウイルス遺伝子VI蛋白質、バクテリアヘアピン遺伝子蛋白質、アラビドプシス（Arabidopsis）RPP５遺伝子蛋白質、ユビキチン接合酵素、バルナーゼ(Barnase)のようなRNase、これらのいずれかの１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体、又はジフテリア毒のような他の毒性ポリペプチドもしくはペプチド又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体をコードすることを特徴とする請求項５に記載の方法。 11．前記植物防御応答又は壊死が該植物防御応答を禁止的に調節する遺伝子の発現の減少を導くヌクレオチド配列からの発現に依存し、前記植物防御応答及び／又は壊死を生ずることを特徴とする請求項４に記載の方法。 12．前記植物防御応答又は壊死が、遺伝子の産物と相互作用することができるリガンドの欠如下において前記植物防御応答を活性化するヌクレオチド配列からの前記遺伝子の対立遺伝子の発現に依存し、前記植物防御応答及び／又は壊死を生ずることを特徴とする請求項４に記載の方法。 13．前記植物防御応答又は壊死が、該植物防御応答及び該防御応答の弱められた禁止的レギュレーターの発現を活性化することができるヌクレオチド配列からの遺伝子の変異対立遺伝子の発現に依存し、前記植物防御応答及び／又は壊死を誘導することを特徴とする請求項５に記載の方法。 14．前記ヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列の１以上の不活性化が、可動遺伝要素のその中への挿入により行われることを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の方法。 15．前記可動遺伝要素が、トランスポゾン又は部位特異的組換えシステムにより認識され得る特定のヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項14に記載の方法。 16．前記植物ゲノムが、病原体耐性を増加させるように前記不活性化されたヌクレオチド配列を機能形態に戻すことができる物質をコードする少くとも１つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の方法。 17．前記可動遺伝要素の切除又は転位により前記不活性化されたヌクレオチド配列を機能形態に戻すことを含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。 18．前記可動遺伝要素がトランスポゾンである場合、前記植物ゲノムが前記トランスポゾンの体的切除をおこすための対応するトランスポゾン活性化システムをコードする少くとも１つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項17 に記載の方法。 19．前記トランスポゾン及びトランスポサーゼをコードする遺伝子が、アクティベーター／ジソシエーション(Activator／Dissocia tion)可動遺伝要素ファミリー（Ac／Ds）から、又はエンハンサー／サプレッサー（Enhancer／Suppressor）ミューテータートランスポゾンファミリー(En／Spm )から得られることを特徴とする請求項18に記載の方法。 20．前記ヌクレオチド配列の前記不活性化形態がレコンビナーゼ認識配列に隣接する場合、該レコンビナーゼ認識配列が組換えを起こすための特定のレコンビナーゼを含む部位特異的組換えシステムにより作用されることを特徴とする請求項17に記載の方法。 21．野生型と比較して病原体耐性が増加され、先の請求項のいずれかに記載の方法を用いて得られうる形質転換植物もしくはその子孫、又は該植物もしくは子孫の一部もしくは零余子。 22．第１の表現型を発現する細胞もしくはクローン並びに第２の表現型を発現する他の細胞を含み、野生型と比較して増加された病原体耐性を含み、ここで表現型の斑形成が、機能形態に戻されて該表現型を供する予め不活性化されたヌクレオチド配列からの前記第１の表現型を有する細胞における発現から生じ、前記ヌクレオチド配列は前記第１の表現型を有さない細胞において非機能的形態であることを特徴とする表現型的に斑形成されている植物もしくはその子孫、又は該植物もしくは子孫の一部もしくは零余子、又はこれらのいずれかの誘導体。 23．前記第１の表現型が壊死及び／又は植物防御応答表現型であることを特徴とする請求項22に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 24．前記非機能的形態が、前記ヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の１以上内への可動遺伝要素の挿入から生ずることを特徴とする請求項22又は23に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 25．前記ヌクレオチド配列が、植物病原体耐性遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体である遺伝子（Ｒ）；又は病原体無毒性遺伝子(Avr)又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体、又は他のエリシターもしくはリガンド遺伝子である遺伝子（Ｌ）であってこれらの産物はＲ遺伝子の産物と相互作用することができる遺伝子；又はＲ遺伝子とＬ遺伝子との両方を含むことを特徴とする請求項22〜24のいずれか一に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 26．前記Ｒ遺伝子がトマトCf−９遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体であり、前記Ｌ遺伝子がクラドスポリウム・フルブムAvr−９遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体である又は他のCf−９エリシターをコードすることを特徴とする請求項25に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 27．前記Ｒ遺伝子が、（ｉ）トマト病原体耐性遺伝子；（ii）タバコ病原体耐性遺伝子；（iii）ポテト病原体耐性遺伝子；（iv）アラビドプシス病原体耐性遺伝子；（ｖ）亜麻病原体耐性遺伝子；（vi）CaMV遺伝子VI蛋白質をコードするヌクレオチド配列；（vii）バクテリアヘアピン遺伝子蛋白質をコードするヌクレオチド配列；（viii）ユビキチン接合酵素をコードするヌクレオチド配列；（ix）RNaseをコードするヌクレオチド配列；（ｘ）毒性ペプチドをコードするヌクレオチド配列；（xi）（ｉ）〜（ｘ）のいずれかの１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段による突然変異体、変異体もしくは誘導体又は相同体であることを特徴とする請求項25に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 28．前記トマト病原体耐性遺伝子が、Cf−２，Cf−４，Cf−５及びCf−９を含むクラドスポリウム・フルブム耐性遺伝子から選択され；前記タバコ病原体耐性遺伝子がＮ′であり；前記ポテト病原体耐性遺伝子がＮ_xであり；前記アラビドプシス病原体耐性遺伝子がRPP５又はRP52であり；前記亜麻病原体耐性遺伝子がL 6であり；前記RNaseがバルナーゼ(Barnase)であり；又は前記毒性ペプチドがジフテリア毒であることを特徴とする請求項27に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 29．前記Ｌ遺伝子が、（ｉ）クラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子又はクラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子のための耐性遺伝子の他のエリシター；（ii）適切なTMVコート蛋白質又は他のＮ′エリシター；（iii）適切なPVXコート蛋白質又は他のＲ_xエリシター；又は（iv）（ｉ）〜（iii）のいずれかの１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段による突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体、であることを特徴とする請求項25に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 30．前記クラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子がAvr２，A vr４，Avr５又はAvr９であることを特徴とする請求項29に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 31．（ｉ）植物防御応答及び／又は細胞壊死を供する１以上のヌクレオチド配列であって、少くとも１つの前記ヌクレオチド配列が非機能的形態であるヌクレオチド配列と、（ii）前記ヌクレオチド配列を機能形態に戻すことができる分子をコードする核酸と、を含む細胞。 32．前記非機能的形態が前記ヌクレオチド配列の１以上への可動遺伝要素の挿入から生ずることを特徴とする請求項31に記載の細胞。 33．前記可動遺伝要素がトランスポゾンであり、前記分子が該トランスポゾンの切除を行うための相当するトランスポゾン活性化システムを供することを特徴とする請求項32に記載の細胞。 34．前記ヌクレオチド配列が、植物病原体耐性遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体である遺伝子（Ｒ）；又は病原体無毒性遺伝子(Avr)又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体、又は他のエリシターもしくはリガンド遺伝子である遺伝子（Ｌ）であって、これらの産物がＲ遺伝子の産物と相互作用することができる遺伝子；又はＲ遺伝子とＬ遺伝子との両方を含むことを特徴とする請求項31〜33のいずれか一に記載の細胞。 35．前記Ｒ遺伝子がトマトCf−９遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体であり、前記Ｌ遺伝子がクラドスポリウム・フルブムAvr−９遺伝子又は１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段によるその突然変異体、変異体もしくは誘導体又はその相同体である又は他のCf−９エリシターをコードすることを特徴とする請求項34に記載の細胞。 36．前記Ｒ遺伝子が、（ｉ）トマト病原体耐性遺伝子；（ii）タバコ病原体耐性遺伝子；（iii）ポテト病原体耐性遺伝子；（iv）アラビドプシス病原体耐性遺伝子；（ｖ）亜麻病原体耐性遺伝子；（vi）CaMV遺伝子VI蛋白質をコードするヌクレオチド配列；（vii）バクテリアヘアピン遺伝子蛋白質をコードするヌクレオチド配列；（viii）ユビキチン接合酵素をコードするヌクレオチド配列；（ix）RNaseをコードするヌクレオチド配列；（ｘ）毒性ペプチドをコードするヌクレオチド配列；（xi）（ｉ）〜（ｘ）のいずれかの突然変異体、変異体、誘導体又は相同体であることを特徴とする請求項35に記載の細胞。 37．前記トマト病原体耐性遺伝子が、Cf−２，Cf−４，Cf−５及びCf−９を含むクラドスポリウム・フルブム耐性遺伝子から選択され；前記タバコ病原体耐性遺伝子がＮ′であり；前記ポテト病原体耐性遺伝子がＮ_xであり；前記アラビドプシス病原体耐性遺伝子がRPP５又はRP52であり；前記亜麻病原体耐性遺伝子がL 6であり；前記RNaseがバルナーゼであり；又は前記毒性ペプチドがジフテリア毒であることを特徴とする請求項36に記載の細胞。 38．前記Ｌ遺伝子が、（ｉ）クラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子又はクラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子のための耐性遺伝子の他のエリシター；（ii）適切なTMVコート蛋白質又は他のＮ′エリシター；（iii）適切なPVXコート蛋白質又は他のＲ_xエリシター；又は（iv）（ｉ）〜（iii）のいずれかの１以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失もしくは置換の手段による突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体、であることを特徴とする請求項39に記載の細胞。 39．前記クラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子がAvr２，Avr４，Avr５又はAvr９であることを特徴とする請求項38に記載の細胞。 40．微生物細胞である請求項31〜39のいずれか一に記載の細胞。 41．植物細胞である請求項31〜39のいずれか一に記載の細胞。 42．請求項41に記載の細胞を含む植物又はそのいずれかの一部もしくは零余子又は誘導体。 43．前記ヌクレオチド配列が不活性化又は活性化されている細胞のために斑形成されている請求項42に記載の植物、一部、零余子又は誘導体。 44．核酸（ｉ）及び／又は（ii）を細胞又はその祖先に導入することを含むことを特徴とする請求項31〜43のいずれか一に記載の細胞を製造する方法。 45．（ｉ）Ｒを含むヌクレオチド配列、Ｉを含むヌクレオチド配列及びＡを含むヌクレオチド配列；（ii）Ｒを含むヌクレオチド配列、並びにＩ及びＡを含むヌクレオチド配列；（iii）Ｉを含むヌクレオチド配列、並びにＡ及びＲを含むヌクレオチド配列；（iv）Ａを含むヌクレオチド配列、並びにＲ及びＩを含むヌクレオチド配列；並びに（ｖ）Ｒ，Ｉ及びＡを含むヌクレオチド配列；のヌクレオチド配列の組合せのいずれかを含み、Ｒが、植物におけるその存在が植物防御応答、壊死及び／又は増加された病原体耐性を引きおこす物質をコートし、ＩがＲを不活性化することができる遺伝挿入物であり、そしてＡがＩにより不活性化されたＲを再活性化することができる物質をコートすることを特徴とする組成物。 46．（ｉ）Ｒを含むヌクレオチド配列、Ｌを含むヌクレオチド配列、Ｉを含むヌクレオチド配列、及びＡを含むヌクレオチド配列；（ii）Ｒを含むヌクレオチド配列、Ｌ及びＩを含むヌクレオチド配列、並びにＡを含むヌクレオチド配列；（iii）Ｒを含むヌクレオチド配列、Ｌ及びＡを含むヌクレオチド配列、並びにＩを含むヌクレオチド配列；（iv）Ｒを含むヌクレオチド配列、Ｉ及びＡを含むヌクレオチド配列、並びにＬを含むヌクレオチド配列；（ｖ）Ｌを含むヌクレオチド配列、Ｉ及びＲを含むヌクレオチド配列、並びにＡを含むヌクレオチド配列；（vi）Ｌを含むヌクレオチド配列、Ａ及びＲを含むヌクレオチド配列、Ｉを含むヌクレオチド配列；（vii）Ｉを含むヌクレオチド配列、Ｌ及びＲを含むヌクレオチド配列、並びにＡを含むヌクレオチド配列；（viii）Ｒを含むヌクレオチド配列、並びにＬ，Ｉ及びＡを含むヌクレオチド配列；（ix）Ｌを含むヌクレオチド配列、並びにＩ，Ａ及びＲを含むヌクレオチド配列；（ｘ）Ｉを含むヌクレオチド配列、並びにＡ，Ｒ及びＬを含むヌクレオチド配列；（xi）Ａを含むヌクレオチド配列、並びにＡ，Ｒ及びＩを含むヌクレオチド配列；（xii）Ｒ，Ｌ，Ｉ及びＡを含むヌクレオチド配列；のヌクレオチド配列の組合せのいずれかを含み、Ｒ及びＬが、植物におけるその存在が植物防御応答、壊死及び／又は増加された病原体耐性を引きおこす物質をコードし、ＩがＲ及び／又はＬを不活性化することができる遺伝挿入物であり、そしてＡがＩにより不活性化されたＲ及び／又はＬを再活性化することができる物質をコードすることを特徴とする組成物。 47．１以上の核酸ベクターである請求項45又は46に記載の組成物。 48．細胞が前記ヌクレオチド配列の組合せのいずれかを含むことを特徴とする請求項45〜47のいずれか一に記載の組成物。 49．請求項48に記載の組成物に従う細胞を含む植物又はその一部、零余子、誘導体もしくは子孫。 50．Ｒ，Ｉ及びＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物又はその一部、零余子、誘導体もしくは子孫の製造方法であって、Ｒが、植物におけるその存在が植物防御応答、壊死及び／又は増加された病原体耐性を引きおこす物質をコードし、ＩがＲを不活性化することができる遺伝挿入物であり、そしてＡがＩにより不活性化されたＲを再活性化することができる物質をコードし、そのゲノムがＲ，Ｉ，Ａ及びその組合せのいずれかを含む植物系統を交雑して、植物又はその祖先を製造することを含むことを特徴とする方法。 51．前記植物系統の１以上が、植物又はその祖先の細胞の形質転換の結果として、Ｒ，Ｉ，Ａ及びその組合せのいずれかを含む核酸を含むことを特徴とする請求項50に記載の方法。 52．Ｒ，Ｌ，Ｉ及びＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物又はその一部、零余子、誘導体もしくは子孫の製造方法であって、Ｒ及びＬが、植物におけるその存在が植物防御応答、壊死及び／又は増加された病原体耐性を引きおこす物質をコードし、ＩがＲ及び／又はＬを不活性化することができる遺伝挿入物であり、そしてＡがＩにより不活性化されたＲ及び／又はＬを再活性化することができる物質をコードし、そのゲノムがＲ，Ｌ，Ｉ，Ａ及びその組合せのいずれかを含む植物系統を交雑して、植物又はその祖先を製造することを含むことを特徴とする方法。 53．前記植物系統の１以上が、植物又はその祖先の細胞の形質転換の結果として、Ｒ，Ｌ，Ｉ，Ａ及びその組合せのいずれかを含む核酸を含むことを特徴とする請求項52に記載の方法。 54．請求項50〜53のいずれか一に記載の方法を用いて得られうる植物又はその一部、零余子、誘導体もしくは子孫。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号９５０６６５８．５ (32)優先日 1995年３月31日 (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９５０７２３２．８ (32)優先日 1995年４月７日 (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハモンド−コサック，キムエリザベスイギリス国，ノーウィッチアールエヌ４６エヌエル，チェストナットヒル６ (72)発明者ジョーンズ，デビットアレンイギリス国，ノーウィッチエヌアール４６ピーディー，イートングリーンウェイズ 139

Claims

【特許請求の範囲】１．遺伝子が細胞内において発現又は抑制されることにより植物防御応答を活性化する斑形成を誘導することにより、植物又は植物の一部もしくは零余子において病原体耐性を増加させる方法であって、（ｉ）植物防御応答を供するヌクレオチド配列を不活性化するステップ又は植物防御応答を供するヌクレオチド配列の組合せの一部を形成する１以上のヌクレオチド配列を不活性化するステップと、（ii）前記ヌクレオチド配列を植物のゲノム内に導入するステップと、（iii）前記植物もしくはその子孫、又は該植物もしくは子孫の一部もしくは零余子の細胞内において前記ヌクレオチド配列を機能形態に戻して、病原体耐性を増加させるステップと、を含むことを特徴とする方法。２．遺伝子が発現又は抑制されることにより壊死を生ずる斑形成を誘導することにより、植物又はその一部分もしくは零余子において病原体耐性を増加させる方法であって、（ｉ）壊死を供するヌクレオチド配列を不活性化するステップ、又は壊死を供するヌクレオチド配列の組合せの一部を形成する１以上のヌクレオチド配列を不活性化するステップと、（ii）前記ヌクレオチド配列を植物のゲノム内に導入するステップと、（iii）前記植物もしくはその子孫、又は該植物もしくは子孫の一部もしくは零余子の細胞内において前記不活性化されたヌクレオチド配列を機能形態に戻すステップと、を含むことを特徴とする方法。３．前記ヌクレオチド配列が病原体耐性の増加を引きおこす物質又は物質の組合せをコードすることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。４．前記ヌクレオチド配列が遺伝子を含み、そして前記ヌクレオチド配列の発現による植物防御応答及び／又は壊死の活性化が、前記ヌクレオチド配列に含まれるいずれの他の遺伝子の発現にも依存しないことを特徴とする先の請求項のいずれか一に記載の方法。５．前記ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列の組合せが１以上の遺伝子を含み、そして前記ヌクレオチド配列の発現による植物防御応答及び／又は壊死の活性化が、１以上の相互作用性遺伝子の発現を条件とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一に記載の方法。６．前記ヌクレオチド配列が植物防御応答及び／又は壊死を誘導することができる又は共に誘導することができる１以上の物質をコードし、そして前記ヌクレオチド配列の少くとも１つがステップ（ｉ）において不活性化されていることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．前記ヌクレオチド配列が、植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）又はその突然変異体、変異体もしくは誘導体、又は病原体無毒性遺伝子（Avr）又はその突然変異体、変異体もしくは誘導体、又は他のＲ遺伝子エリシター(elicitor)(Ｅ)、又は（ｉ）Ｒ遺伝子又はその突然変異体、変異体、もしくは誘導体と（ii）対応する Avr遺伝子、又はその突然変異体、変異体もしくは誘導体、又は他のＲ遺伝子エリシター（Ｅ）との両方を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。８．前記植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）がトマトCf−９遺伝子又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体であり、前記無毒性遺伝子がクラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvum）Avr−９遺伝子又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体である又は他のCf−９エリシターをコードすることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．前記植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）がトマトCf−２遺伝子又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体であり、前記無毒性遺伝子がクラドスポリウム・フルブムAvr−２遺伝子又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体である又は他のCf−２エリシターをコードする；又は前記植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）がトマトCf−４遺伝子又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体であり、前記無毒性遺伝子がクラドスポリウム・フルブムAvr−４遺伝子又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体である又は他のCf−４エリシターをコードする；又は前記植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）がタバコＮ′遺伝子又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体であり、前記無毒性遺伝子が適切なタバコモザイクウイルスコート蛋白質、又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体である又は他のＮ′エリシターをコードする；又は前記植物病原体耐性遺伝子（Ｒ）がポテトＲ_x遺伝子又は突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体であり、前記無毒性遺伝子が適切なPVXコート蛋白質又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体又は他のＲ_xエリシターである；又は前記植物病原体耐性遺伝子が他のウイルスの耐性遺伝子であり、前記無毒性遺伝子が対応するウイルスコート蛋白質又は前記ウイルスの耐性遺伝子の他のエリシターであることを特徴とする請求項７に記載の方法。 10．前記ヌクレオチド配列が、カリフラワーモザイクウイルス遺伝子VI蛋白質、バクテリアヘアピン遺伝子蛋白質、アラビドプシス（Arabidopsis）RPP５遺伝子蛋白質、ユビキチン接合酵素、バルナーゼ（Barnase）のようなRNase、これらのいずれかの突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体、又はジフテリア毒のような他の毒性ポリペプチドもしくはペプチド又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体をコードすることを特徴とする請求項５に記載の方法。 11．前記植物防御応答又は壊死が該植物防御応答を禁止的に調節する遺伝子の発現の減少を導くヌクレオチド配列からの発現に依存し、前記植物防御応答及び／又は壊死を生ずることを特徴とする請求項４に記載の方法。 12．前記植物防御応答又は壊死が、遺伝子の産物と相互作用することができるリガンドの欠如下において前記植物防御応答を活性化するヌクレオチド配列からの前記遺伝子の対立遺伝子の発現に依存し、前記植物防御応答及び／又は壊死を生ずることを特徴とする請求項４に記載の方法。 13．前記植物防御応答又は壊死が、該植物防御応答及び該防御応答の弱められた禁止的レギュレーターの発現を活性化することができるヌクレオチド配列からの遺伝子の変異対立遺伝子の発現に依存し、前記植物防御応答及び／又は壊死を誘導することを特徴とする請求項５に記載の方法。 14．前記ヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列の１以上の不活性化が、可動遺伝要素のその中への挿入により行われることを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の方法。 15．前記可動遺伝要素が、トランスポゾン又は部位特異的組換えシステムにより認識され得る特定のヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項14に記載の方法。 16．前記植物ゲノムが、病原体耐性を増加させるように前記不活性化されたヌクレオチド配列を機能形態に戻すことができる物質をコードする少くとも１つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の方法。 17．前記可動遺伝要素の切除又は転位により前記不活性化されたヌクレオチド配列を機能形態に戻すことを含むことを特徴とする請求項16に記載の方法。 18．前記可動遺伝要素がトランスポゾンである場合、前記植物ゲノムが前記トランスポゾンの体的切除をおこすための対応するトランスポゾン活性化システムをコードする少くとも１つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項17 に記載の方法。 19．前記トランスポゾン及びトランスポサーゼをコードする遺伝子が、アクティベーター／ジソシエーション（Activator／Dissociation）可動遺伝要素ファミリー（Ac／Ds）から、又はエンハンサー／サプレッサー（Enhancer／Suppress or）ミューテータートランスポゾンファミリー(En／Spm)から得られることを特徴とする請求項18に記載の方法。 20．前記ヌクレオチド配列の前記不活性化形態がレコンビナーゼ認識配列に隣接する場合、該レコンビナーゼ認識配列が組換えを起こすための特定のレコンビナーゼを含む部位特異的組換えシステムにより作用されることを特徴とする請求項17に記載の方法。 21．野生型と比較して病原体耐性が増加され、先の請求項のいずれかに記載の方法を用いて得られうる形質転換植物もしくはその子孫、又は該植物もしくは子孫の一部もしくは零余子。 22．第１の表現型を発現する細胞もしくはクローン並びに第２の表現型を発現する他の細胞を含み、野生型と比較して増加された病原体耐性を含み、表現型的に斑形成されている植物もしくはその子孫、又は該植物もしくは子孫の一部もしくは零余子、又はこれらのいずれかの誘導体。 23．前記第１の表現型が壊死及び／又は植物防御応答表現型であることを特徴とする請求項22に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 24．前記表現型の斑形成が、該表現型を供するヌクレオチド配列からの第１の表現型を有する細胞における発現からおこり、ここで前記ヌクレオチド配列からの前記発現が前記第１の表現型を有さない細胞において不活性化されていることを特徴とする請求項22又は23に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 25．前記発現が予め不活性化されている遺伝子の再活性化から生ずることを特徴とする請求項24に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 26．前記不活性化が前記ヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の１以上内への可動遺伝要素の挿入から生ずることを特徴とする請求項24又は25に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 27．前記ヌクレオチド配列が、植物病原体耐性遺伝子又はその突然変異体、変異体もしくは誘導体である遺伝子（Ｒ）；又は病原体無毒性遺伝子(Avr)又はその突然変異体、変異体もしくは誘導体、又は他のエリシターもしくはリガンド遺伝子である遺伝子（Ｌ）であってこれらの産物はＲ遺伝子の産物と相互作用することができる遺伝子；又はＲ遺伝子とＬ遺伝子との両方を含むことを特徴とする請求項24〜26のいずれか一に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 28．前記Ｒ遺伝子がトマトCf−９遺伝子又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体であり、前記Ｌ遺伝子がクラドスポリウム・フルブムAvr−９遺伝子又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体である又は他のCf−９エリシターをコードすることを特徴とする請求項27に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 29．前記Ｒ遺伝子が、（ｉ）トマトからの病原体耐性遺伝子；（ii）タバコからの病原体耐性遺伝子；（iii）ポテトからの病原体耐性遺伝子；（iv）アラビドプシスからの病原体耐性遺伝子；（ｖ）亜麻からの病原体耐性遺伝子；（vi）CaMV遺伝子VI蛋白質をコードするヌクレオチド配列；（vii）バクテリアヘアピン遺伝子蛋白質をコードするヌクレオチド配列；（viii）ユビキチン接合酵素をコードするヌクレオチド配列；（ix）RNaseをコードするヌクレオチド配列；（ｘ）毒性ペプチドをコードするヌクレオチド配列；（xi）（ｉ）〜（ｘ）のいずれかの突然変異体、変異体、誘導体又は相同体であることを特徴とする請求項27に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 30．トマトからの前記病原体耐性遺伝子が、Cf−２，Cf−４，Cf−５及びCf− ９を含むクラドスポリウム・フルブム耐性遺伝子から選択され；タバコからの前記病原体耐性遺伝子がＮ′であり；ポテトからの前記病原体耐性遺伝子がＮ_xであり；アラビドプシスからの前記病原体耐性遺伝子がRPP５又はRP52であり；亜麻からの前記病原体耐性遺伝子がL6であり；前記RNaseがバルナーゼ（Barnase）であり；又は前記毒性ペプチドがジフテリア毒であることを特徴とする請求項29 に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 31．前記Ｌ遺伝子が、（ｉ）クラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子又はクラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子のための耐性遺伝子の他のエリシター；（ii）適切なTMVコート蛋白質又は他のＮ′エリシター；（iii）適切なPVXコート蛋白質又は他のＲ_xエリシター；又は（iv）（ｉ）〜（iii）のいずれかの突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体、であることを特徴とする請求項27に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 32．前記クラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子がAvr２，Avr４，Avr５又はAvr９であることを特徴とする請求項31に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 33．（ｉ）植物防御応答及び／又は細胞壊死を供する１以上のヌクレオチド配列であって、少くとも１つの前記ヌクレオチド配列が逆に不活性化されているヌクレオチド配列と、（ii）前記不活性化を逆転することができる分子をコードする核酸と、を含む細胞。 34．前記不活性化が前記ヌクレオチド配列の１以上への可動遺伝要素の挿入から生ずることを特徴とする請求項33に記載の細胞。 35．前記可動遺伝要素がトランスポゾンであり、前記分子が該トランスポゾンの切除を行うための相当するトランスポゾン活性化システムを供することを特徴とする請求項34に記載の細胞。 36．前記ヌクレオチド配列が、植物病原体耐性遺伝子又はその突然変異体、変異体もしくは誘導体である遺伝子（Ｒ）；又は病原体無毒性遺伝子(Avr)又はその突然変異体、変異体もしくは誘導体、又は他のエリシターもしくはリガンド遺伝子である遺伝子（Ｌ）であって、これらの産物がＲ遺伝子の産物と相互作用することができる遺伝子；又はＲ遺伝子とＬ遺伝子との両方を含むことを特徴とする請求項33〜35のいずれか一に記載の細胞。 37．前記Ｒ遺伝子がトマトCf−９遺伝子又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体であり、前記Ｌ遺伝子がクラドスポリウム・フルブムAvr−９遺伝子又はその突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体である又は他のCf−９エリシターをコードすることを特徴とする請求項36に記載の細胞。 38．前記Ｒ遺伝子が、（ｉ）トマトからの病原体耐性遺伝子；（ii）タバコからの病原体耐性遺伝子；（iii）ポテトからの病原体耐性遺伝子；（iv）アラビドプシスからの病原体耐性遺伝子；（ｖ）亜麻からの病原体耐性遺伝子；（vi）CaMV遺伝子VI蛋白質をコードするヌクレオチド配列；（vii）バクテリアヘアピン遺伝子蛋白質をコードするヌクレオチド配列；（viii）ユビキチン接合酵素をコードするヌクレオチド配列；（ix）RNaseをコードするヌクレオチド配列；（ｘ）毒性ペプチドをコードするヌクレオチド配列；（xi）（ｉ）〜（ｘ）のいずれかの突然変異体、変異体、誘導体又は相同体であることを特徴とする請求項37に記載の植物、子孫、誘導体、一部又は零余子。 39．トマトからの前記病原体耐性遺伝子が、Cf−２，Cf−４，Cf−５及びCf− ９を含むクラドスポリウム・フルブム耐性遺伝子から選択され；タバコからの前記病原体耐性遺伝子がＮ′であり；ポテトからの前記病原体耐性遺伝子がＮ_xであり；アラビドプシスからの前記病原体耐性遺伝子がRPP５又はRP52であり；亜麻からの前記病原体耐性遺伝子がL6であり；前記RNaseがバルナーゼであり；又は前記毒性ペプチドがジフテリア毒であることを特徴とする請求項38に記載の細胞。 40．前記Ｌ遺伝子が、（ｉ）クラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子又はクラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子のための耐性遺伝子の他のエリシター；（ii）適切なTMVコート蛋白質又は他のＮ′エリシター；（iii）適切なPVXコート蛋白質又は他のＲ_xエリシター；又は（iv）（ｉ）〜（iii）のいずれかの突然変異体、変異体、誘導体もしくは相同体、であることを特徴とする請求項36に記載の細胞。 41．前記クラドスポリウム・フルブム無毒性遺伝子がAvr２，Avr４，Avr５又はAvr９であることを特徴とする請求項40に記載の細胞。 42．微生物細胞である請求項33〜41のいずれか一に記載の細胞。 43．植物細胞である請求項33〜41のいずれか一に記載の細胞。 44．請求項43に記載の細胞を含む植物又はそのいずれかの一部もしくは零余子又は誘導体。 45．前記ヌクレオチド配列が不活性化又は活性化されている細胞のために斑形成されている請求項44に記載の植物、一部、零余子又は誘導体。 46．核酸（ｉ）及び／又は（ii）を細胞又はその祖先に導入することを含むことを特徴とする請求項33〜45のいずれか一に記載の細胞を製造する方法。 47．（ｉ）Ｒを含むヌクレオチド配列、Ｉを含むヌクレオチド配列及びＡを含むヌクレオチド配列；（ii）Ｒを含むヌクレオチド配列、並びにＩ及びＡを含むヌクレオチド配列；（iii）Ｉを含むヌクレオチド配列、並びにＡ及びＲを含むヌクレオチド配列；（iv）Ａを含むヌクレオチド配列、並びにＲ及びＩを含むヌクレオチド配列；並びに（ｖ）Ｒ，Ｉ及びＡを含むヌクレオチド配列；のヌクレオチド配列の組合せのいずれかを含み、Ｒが、植物におけるその存在が植物防御応答、壊死及び／又は増加された病原体耐性を引きおこす物質をコードし、ＩがＲを不活性化することができる遺伝挿入物であり、そしてＡがＩにより不活性化されたＲを再活性化することができる物質をコードすることを特徴とする物の組成物。 48．（ｉ）Ｒを含むヌクレオチド配列、Ｌを含むヌクレオチド配列、Ｉを含むヌクレオチド配列、及びＡを含むヌクレオチド配列；（ii）Ｒを含むヌクレオチド配列、Ｌ及びＩを含むヌクレオチド配列、並びにＡを含むヌクレオチド配列；（iii）Ｒを含むヌクレオチド配列、Ｌ及びＡを含むヌクレオチド配列、並びにＩを含むヌクレオチド配列；（iv）Ｒを含むヌクレオチド配列、Ｉ及びＡを含むヌクレオチド配列、並びにＬを含むヌクレオチド配列；（ｖ）Ｌを含むヌクレオチド配列、Ｉ及びＲを含むヌクレオチド配列、並びにＡを含むヌクレオチド配列；（vi）Ｌを含むヌクレオチド配列、Ａ及びＲを含むヌクレオチド配列、Ｉを含むヌクレオチド配列；（vii）Ｉを含むヌクレオチド配列、Ｌ及びＲを含むヌクレオチド配列、並びにＡを含むヌクレオチド配列；（viii）Ｒを含むヌクレオチド配列、並びにＬ，Ｉ及びＡを含むヌクレオチド配列；（ix）Ｌを含むヌクレオチド配列、並びにＩ，Ａ及びＲを含むヌクレオチド配列；（ｘ）Ｉを含むヌクレオチド配列、並びにＡ，Ｒ及びＬを含むヌクレオチド配列；（xi）Ａを含むヌクレオチド配列、並びにＡ，Ｒ及びＩを含むヌクレオチド配列；（xii）Ｒ，Ｌ，Ｉ及びＡを含むヌクレオチド配列；のヌクレオチド配列の組合せのいずれかを含み、Ｒ及びＬが、植物におけるその存在が植物防御応答、壊死及び／又は増加された病原体耐性を引きおこす物質をコードし、ＩがＲ及び／又はＬを不活性化することができる遺伝挿入物であり、そしてＡがＩにより不活性化されたＲ及び／又はＬを再活性化することができる物質をコードすることを特徴とする物の組成物。 49．１以上の核酸ベクターである請求項47又は48に記載の物の組成物。 50．細胞が前記ヌクレオチド配列の組合せのいずれかを含むことを特徴とする請求項47〜49のいずれか一に記載の物の組成物。 51．請求項50に記載の組成物に従う細胞を含む植物又はその一部、零余子、誘導体もしくは子孫。 52．Ｒ，Ｉ及びＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物又はその一部、零余子、誘導体もしくは子孫の製造方法であって、Ｒが、植物におけるその存在が植物防御応答、壊死及び／又は増加された病原体耐性を引きおこす物質をコードし、ＩがＲを不活性化することができる遺伝挿入物であり、そしてＡがＩにより不活性化されたＲを再活性化することができる物質をコートし、そのゲノムがＲ，Ｉ，Ａ及びその組合せのいずれかを含む植物系統を交雑して、植物又はその祖先を製造することを含むことを特徴とする方法。 53．前記植物系統の１以上が、植物又はその祖先の細胞の形質転換の結果として、Ｒ，Ｉ，Ａ及びその組合せのいずれかを含む核酸を含むことを特徴とする請求項52に記載の方法。 54．Ｒ，Ｌ，Ｉ及びＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物又はその一部、零余子、誘導体もしくは子孫の製造方法であって、Ｒ及びＬが、植物におけるその存在が植物防御応答、壊死及び／又は増加された病原体耐性を引きおこす物質をコードし、ＩがＲ及び／又はＬを不活性化することができる遺伝挿入物であり、そしてＡがＩにより不活性化されたＲ及び／又はＬを再活性化することができる物質をコードし、そのゲノムがＲ，Ｌ，Ｉ，Ａ及びその組合せのいずれかを含む植物系統を交雑して、植物又はその祖先を製造することを含むことを特徴とする方法。 55．前記植物系統の１以上が、植物又はその祖先の細胞の形質転換の結果として、Ｒ，Ｌ，Ｉ，Ａ及びその組合せのいずれかを含む核酸を含むことを特徴とする請求項54に記載の方法。 56．請求項52〜55のいずれか一に記載の方法を用いて得られうる植物又はその一部、零余子、誘導体もしくは子孫。