JPH1045574A - Shikonin-containing synthetic suppressor of protein belonging to hsp27 family - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject medicine capable of suppressing synthesis of a specific heat shock protein and treating diseases such as cancers and mutilple sclerosis by including shikonin as an active ingredient. SOLUTION: This medicine contains shikonin as an active ingredient. Shikonin is included in a crude medicine such as shikon, Shikon extract can be obtained by extracting shikon with water (e.g. cold water, warm water or hot water) or an organic solvent. Thereby, since biosynthesis of heat shock protein having 16-40K dalton molecular weight in a cell is suppressed, the medicine can be used for preventing and treatment of cancers in which malignant alteration is caused in relation with the protein as well as prevention and treatment of autoimmune diseases such as multiple sclerosis which crisis is caused in relation with the protein.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、シコニンを有効成
分として含有する、分子量が１６キロダルトン（ｋＤ）
から４０ｋＤまでの間の熱ショックタンパク質群（以
下、ＨＳＰ２７ファミリーと称する）に属するタンパク
質の合成抑制剤に関する。本発明によるＨＳＰ２７ファ
ミリーに属するタンパク質の合成抑制剤は、特に、ＨＳ
Ｐ２７ファミリーに属するタンパク質の組織内合成を抑
制することによって、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタ
ンパク質が発症、悪性化、又は治療の障害に関与するも
のと考えられている病気、例えば、癌、又は多発性硬化
症などの患者の生理学的状態を有効に改善させ、前記の
病気を効果的に治療することができる。TECHNICAL FIELD [0001] The present invention contains shikonin as an active ingredient and has a molecular weight of 16 kilodaltons (kD).
To 40 kD to a synthetic inhibitor of proteins belonging to the heat shock protein group (hereinafter referred to as HSP27 family). The inhibitor of the synthesis of proteins belonging to the HSP27 family according to the present invention is
By suppressing the tissue synthesis of the protein belonging to the P27 family, the protein belonging to the HSP27 family is thought to be involved in the onset, malignant transformation, or impaired treatment, such as cancer or multiple sclerosis. Etc. can be effectively improved to effectively treat the above-mentioned diseases.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年の化学療法、外科療法、放射線療
法、及び免疫療法などの進歩にもかかわらず、依然とし
て癌による死亡原因に癌の悪性化が直接的又は間接的に
関わっており、癌の悪性化の克服が今後の癌治療の大き
な課題の一つとなっている。癌の悪性度は、癌の増殖
性、浸潤性、又は転移性などによって定められる。悪性
化の現象の一つである転移は原発癌の種類により、転移
を起こしやすい臓器が異なる。癌の転移は複合事象であ
り、原発腫瘍の増殖、癌細胞の原発巣からの離脱と周辺
組織への浸潤・増殖から始まって、腫瘍血管新生、癌細
胞の最寄りの血管内への侵入、血流による遠隔部位への
移動と血管内皮細胞への接着・着床、更に、血管外への
浸潤、遠隔部位（転移組織）での増殖の開始に続いて新
たな腫瘍血管が新生され、やがて可視的な転移巣の形成
に至るまでの複雑な反応カスケードから成り立ってい
る。一般に、癌は、高い悪性度を有するものと、比較的
に悪性度の低いものとに分けられる。しかし、悪性度の
高い癌に対しては根本的な治療法は確立しておらず、患
者は遂には死に至ることが極めて多い。BACKGROUND OF THE INVENTION Despite recent advances in chemotherapy, surgery, radiation therapy, immunotherapy, etc., the cause of death due to cancer is still directly or indirectly related to the malignant transformation of cancer. Overcoming malignancy has become one of the major challenges in cancer treatment in the future. The malignancy of a cancer is determined by the proliferative, invasive, or metastatic nature of the cancer. Metastasis, which is one of the phenomena of malignant transformation, depends on the type of primary cancer, and the organs that are prone to metastasis vary. Cancer metastasis is a complex event that begins with the growth of the primary tumor, withdrawal of cancer cells from the primary focus and invasion / proliferation of surrounding tissues, tumor angiogenesis, invasion of cancer cells into nearby blood vessels, blood New tumor blood vessels are born, which is visible after the movement to the distant site by flow and adhesion / implantation to vascular endothelial cells, infiltration outside the blood vessel, and the initiation of proliferation at the distant site (metastasis). It consists of a complex reaction cascade leading to the formation of specific metastatic foci. Generally, cancer is divided into those with high malignancy and those with relatively low malignancy. However, no radical treatment has been established for highly aggressive cancers, and patients are most likely to eventually die.

【０００３】また、癌の温熱療法（ハイパーサーミア；
hyperthermia）とは、癌組織を加温することにより、腫
瘍細胞を選択的に殺し、癌を治療しようとする方法であ
り、近年注目を浴びている。温熱療法による癌治療は、
温熱の生物学的効果をみると、４１〜４５℃の比較的温
和な加温で細胞致死効果が得られること、また放射線や
抗癌剤などと併用することにより相乗的な効果が得られ
ることなど、有利な点が多い。温熱療法による癌の治療
法は、臨床においてはほとんどすべての各科で試みられ
ている。しかし、温熱療法の問題点の一つは、加温後一
過性に誘導される温熱耐性である。すなわち、癌細胞が
１回目の加温により一時的に温熱耐性になるために、次
の加温による殺細胞効果が減少する。温熱耐性とは、細
胞（又は組織）を一度亜致死的な加温をすることによ
り、次の加温に対してその細胞（又は組織）が一過性に
温熱抵抗性になることである。温熱耐性のため、現在ほ
とんどの施設において温熱療法を行うのは週１〜２回に
限定されているのが現状である。[0003] Hyperthermia for cancer (hyperthermia;
Hyperthermia) is a method of selectively killing tumor cells by heating a cancer tissue to treat cancer, and has recently attracted attention. Cancer treatment with hyperthermia
Looking at the biological effects of heat, a cell-killing effect can be obtained with relatively mild heating of 41 to 45 ° C, and a synergistic effect can be obtained when used in combination with radiation or an anticancer agent. There are many advantages. Treatment of cancer by hyperthermia has been tried in almost all departments in the clinic. However, one of the problems of hyperthermia is heat resistance which is transiently induced after heating. That is, since the cancer cells temporarily become thermotolerant by the first heating, the cell killing effect by the next heating is reduced. The thermotolerance means that once a cell (or tissue) is heated sub-lethal once, the cell (or tissue) becomes transiently heat resistant to the next heating. Due to heat resistance, the current practice is that thermal treatment is performed in most facilities only once or twice a week.

【０００４】また、癌の化学療法においても、化学療法
に殆ど反応しない肺癌や大腸癌などの固型癌が依然とし
て存在する一方で、化学療法剤に反応する癌でも、やが
て抗癌剤が効かなくなる耐性化が問題となっている。１
９８８年のアメリカの統計によれば、１年間に診断され
た癌の４９％が化学療法に最初から抵抗性を示す内因性
耐性であり、４７％が当初化学療法が有効で、腫瘍がい
ったん消退した後に再発した獲得性耐性とされている。
これらの事実から、癌に対する化学療法の効果を妨げる
最も重要な問題の一つは細胞毒性薬剤に対する耐性であ
ることがわかる。[0004] In cancer chemotherapy, there are still solid cancers such as lung cancer and colon cancer which hardly respond to chemotherapy. Is a problem. 1
According to United States statistics of 988, 49% of cancers diagnosed in one year are intrinsically resistant to chemotherapy initially, and 47% were initially chemotherapy effective and the tumor regressed It is said that the acquired resistance has recurred.
These facts indicate that one of the most important problems that hinders the effects of chemotherapy on cancer is resistance to cytotoxic drugs.

【０００５】また、多発性硬化症（multiple sclerosi
s，ＭＳ）は中枢神経白質を特異的に障害する炎症性脱
髄性疾患であり、その発症機序に、神経線維を包んでい
るミエリン鞘を免疫系が攻撃することが示されている自
己免疫疾患である。多発性硬化症は多くの場合、初期に
は急性憎悪・寛解を繰り返すが、その後徐々に進行性の
経過をとるようになる。急性期の症状改善を目的とした
ものとして、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）や副腎
皮質ステロイド剤が、また寛解期での再発予防や慢性進
行型の症状進展防止を目的として、アザチオプリンやサ
イクロフォスファミドなどの免疫抑制剤が用いられてき
た。しかし、現在、多発性硬化症患者に投与されている
薬剤の多くは、その効果が期待されていたほどでなく、
非特異的な療法で副作用も多くみられるなど、十分とは
いい難いのが現状である。多発性硬化症のより特異的な
治療法の開発が期待されている。In addition, multiple sclerosi
s, MS) is an inflammatory demyelinating disease that specifically impairs the central nervous white matter, and its pathogenesis has been demonstrated by the immune system to attack the myelin sheath that surrounds nerve fibers. It is an immune disease. Multiple sclerosis often repeats acute hatred / remission in the early stages, but then gradually progresses. Adrenocorticotropic hormone (ACTH) and corticosteroids are used to improve symptoms during the acute phase, and azathioprine and cyclophosphamide are used to prevent recurrence during remission and to prevent chronic progression of symptoms. Immunosuppressive drugs such as sac have been used. However, many of the drugs currently being administered to multiple sclerosis patients are not as effective as expected,
The current situation is that it is not enough, as non-specific therapy has many side effects. Development of a more specific treatment method for multiple sclerosis is expected.

【０００６】一方、熱ショックタンパク質（heat shock
protein；ＨＳＰ、ストレスタンパク質ともいう）は、
細胞を何らかのストレス、例えば熱、重金属、薬剤、ア
ミノ酸類似体、又は低酸素（低濃度酸素）などで刺激す
ることにより、細胞に発現される一群のタンパク質であ
る。熱ショックタンパク質は、自然界に普遍的に存在し
ており、細菌、酵母、植物、昆虫、及びヒトを含む高等
動物により産生される。On the other hand, heat shock proteins (heat shock proteins)
protein; HSP, also called stress protein)
A group of proteins expressed in cells by stimulating the cells with some stress, such as heat, heavy metals, drugs, amino acid analogs, or hypoxia (low oxygen concentration). Heat shock proteins are ubiquitous in nature and are produced by bacteria, yeast, plants, insects, and higher animals including humans.

【０００７】ＨＳＰは、その種類は多種多様であるが、
分子量の大きさからＨＳＰ９０ファミリー（例えば、９
０ｋＤ又は１１０ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳＰ７０ファ
ミリー（例えば、７０〜７３ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳ
Ｐ６０ファミリー（例えば、５７〜６８ｋＤのＨＳＰな
ど）、低分子ＨＳＰファミリー（例えば、２０ｋＤ、２
５〜２８ｋＤ、又は４７ｋＤのＨＳＰなど）の４ファミ
リーに大別することができる。なお、本明細書において
は、特定分子量を有するＨＳＰを、ＨＳＰとその直後に
記載する数字とによって示すものとし、例えば、分子量
２７ｋＤのＨＳＰを『ＨＳＰ２７』と称するものとす
る。以上のように、ＨＳＰには多くの種類が存在する
が、これらは分子量だけでなく、構造、機能、又は性質
などもそれぞれ異なるものである。ストレスへの応答に
加えて、これらのタンパク質の中には構成的に合成され
るものがあり、正常な環境の下で、タンパク質のフォー
ルディング、アンフォールディング、タンパク質サブユ
ニットの会合、タンパク質の膜輸送のような、必須の生
理的な役割を演じていることが示されている。熱ショッ
クタンパク質としてのこれらの機能は、分子シャペロン
と称される。HSPs are of various types,
Due to the molecular weight, the HSP90 family (for example, 9
0 kD or 110 kD HSP, etc.), HSP70 family (eg, 70-73 kD HSP, etc.), HS
P60 family (eg, 57-68 kD HSP etc.), small molecule HSP family (eg, 20 kD, 2
5-28 kD or 47 kD HSP). In the present specification, an HSP having a specific molecular weight is indicated by an HSP and a number described immediately after the HSP. For example, an HSP having a molecular weight of 27 kD is referred to as “HSP27”. As described above, there are many kinds of HSPs, but they differ not only in molecular weight but also in structure, function, or property. In addition to stress response, some of these proteins are constitutively synthesized and, under normal circumstances, are involved in protein folding, unfolding, protein subunit association, and protein membrane transport. It has been shown to play an essential physiological role. These functions as heat shock proteins are called molecular chaperones.

【０００８】ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質
の発現は、ヒト乳癌において、リンパ節転移、リンパや
血管への浸潤、より短い生存率との間に顕著な相関があ
る（"J. Natl. Cancer Inst." 83: 170-178, 1991)。胃
癌においてもＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質
はネガティブな予後因子であるとの報告がある（"Br.J.
Surg.", 78: 334-336, 1991)。ＨＳＰ２７ファミリー
に属するタンパク質の原発癌細胞における発現レベルが
癌悪性度、特に癌の再発率と正の相関があるという報告
もあるので（"Breast Cancer Res. Treat.", 12: 130,
1988; "Proc.Am. Assoc. Cancer Res.", 30: 252, 19
89)、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の発現
を抑制することにより、癌の悪性化を防止することが可
能である。Expression of proteins belonging to the HSP27 family is significantly correlated with lymph node metastasis, lymphatic and vascular invasion, and shorter survival rate in human breast cancer ("J. Natl. Cancer Inst."). 83 : 170-178, 1991). It has been reported that a protein belonging to the HSP27 family is also a negative prognostic factor in gastric cancer ("Br.J.
Surg. ", 78 : 334-336, 1991). There is also a report that the expression level of proteins belonging to the HSP27 family in primary cancer cells is positively correlated with cancer malignancy, especially the recurrence rate of cancer (" Breast Cancer "). Res. Treat. ", 12 : 130,
1988; "Proc. Am. Assoc. Cancer Res.", 30 : 252, 19
89) By suppressing the expression of proteins belonging to the HSP27 family, malignant transformation of cancer can be prevented.

【０００９】癌の温熱療法で問題となる温熱耐性にＨＳ
Ｐ２７ファミリーに属するタンパク質が関与するという
報告がある。ヒトＨＳＰ２７遺伝子をマウス又はハムス
ター細胞に導入して発現させたところ、熱ショック後に
生き残る温熱耐性の細胞がＨＳＰ２７のタンパク質の量
に依存して誘導され増加する（"J. Cell. Biol.", 109
: 7-15, 1989）。また、チャイニーズハムスター細胞
で、ＨＳＰ２７を定常的に発現するようになった変異株
が熱耐性を獲得できるようになる（"J. Cell. Physio
l.", 137 : 157, 1988)。α−Ｂクリスタリンは、熱シ
ョック処理で誘導され、ＨＳＰ２７とアミノ酸配列の相
同性が高いタンパク質であり、ＨＳＰ２７ファミリーに
属するタンパク質の一つであるが、α−Ｂクリスタリン
を過剰発現させた細胞も熱ストレスに対する耐性を獲得
する（"J. Cell. Biol.", 125 : 1385-1393, 1994)。こ
のことは、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の
発現を抑制することにより、温熱耐性を抑え、癌に対す
る温熱療法の効果を増強する可能性を示している。ま
た、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の発現と
薬剤耐性とが相関するとの報告もあるので（"Breast Ca
ncer Res. Treat.", 23:178, 1992; "Cancer Res.", 5
1: 5245-5252, 1991)、ＨＳＰ２７ファミリーに属する
タンパク質の発現を抑制することにより、薬剤耐性を抑
え、化学療法の効果を増強することも可能である。HS for heat resistance, which is a problem in hyperthermia of cancer
There are reports that proteins belonging to the P27 family are involved. When the human HSP27 gene was introduced into mouse or hamster cells and expressed, the number of heat-resistant cells surviving after heat shock was induced and increased depending on the amount of HSP27 protein ("J. Cell. Biol.", 109
: 7-15, 1989). In addition, in Chinese hamster cells, a mutant strain that constantly expresses HSP27 becomes able to acquire heat resistance ("J. Cell. Physio").
l. ", 137 : 157, 1988) α-B crystallin is a protein which is induced by heat shock treatment and has a high homology in amino acid sequence with HSP27, and is one of the proteins belonging to the HSP27 family. Cells overexpressing -B crystallin also acquire resistance to heat stress ("J. Cell. Biol.", 125 : 1385-1393, 1994), which suppresses the expression of proteins belonging to the HSP27 family. This has shown the possibility of suppressing hyperthermia and enhancing the effect of hyperthermia on cancer, and has also been reported to correlate the expression of proteins belonging to the HSP27 family with drug resistance ("Breast Ca
ncer Res. Treat. ", 23 : 178, 1992;" Cancer Res. ", 5
1 : 5245-5252, 1991), it is also possible to suppress drug resistance and enhance the effect of chemotherapy by suppressing the expression of proteins belonging to the HSP27 family.

【００１０】多発性硬化症における免疫的に優性な抗原
が、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質であるα
−Ｂクリスタリンであることが突き止められている（"N
ature", 375 : 739-740, 1995)。α−Ｂクリスタリン
は、多発性硬化症患者の神経組織中での発現が、非発病
者の組織中での発現よりも強く、非常に免疫原性が高い
（"Nature", 375 : 798-801, 1995)。これらの事実は、
多発性硬化症で自己抗原となっているのは、ＨＳＰ２７
ファミリーに属するタンパク質の１種であるα−Ｂクリ
スタリンであり、ミエリン鞘におけるα−Ｂクリスタリ
ンの発現を抑制することが多発性硬化症の根本的治療に
結び付くことを示している。The immunodominant antigen in multiple sclerosis is αα, a protein belonging to the HSP27 family.
-B crystallin ("N
Nature ", 375 : 739-740, 1995). The expression of α-B crystallin in nervous tissue of multiple sclerosis patients is stronger than that in non-diseased tissues and is very immunogenic. Is high ("Nature", 375 : 798-801, 1995). These facts
HSP27 is the autoantigen in multiple sclerosis
This is α-B crystallin, which is one of the proteins belonging to the family, and it has been shown that suppressing the expression of α-B crystallin in the myelin sheath is linked to the fundamental treatment of multiple sclerosis.

【００１１】[0011]

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、癌や多発性硬化症などの病気の患者の生理学
的状態を有効に改善させ、前記の病気を効果的に治療す
ることのできる方法を開発するために、ＨＳＰ２７ファ
ミリーに属するタンパク質に対して合成抑制作用を示す
化合物に関して、種々検討を重ねてきた。その結果、本
発明者らは、意外にも、シコンの成分であるシコニン
が、病態を示す組織の細胞におけるＨＳＰ２７ファミリ
ーに属するタンパク質の合成を特異的に抑制することを
見出した。すなわち、シコニンを投与することによっ
て、細胞内でのＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク
質の合成が抑制され、従って、癌や多発性硬化症などの
病気の治療が可能であることを見出したのである。本発
明はこうした知見に基づくものであり、癌や多発性硬化
症などの病気を効果的に治療することのできる、ＨＳＰ
２７ファミリーに属するタンパク質の合成抑制剤を提供
することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION In view of the above circumstances, the present inventors effectively improve the physiological condition of a patient suffering from a disease such as cancer or multiple sclerosis, and effectively treat the disease. In order to develop a possible method, various studies have been conducted on compounds showing a synthetic inhibitory action on proteins belonging to the HSP27 family. As a result, the present inventors have surprisingly found that shikonin, which is a component of shikon, specifically suppresses the synthesis of proteins belonging to the HSP27 family in cells of tissues showing pathological conditions. That is, it was discovered that the administration of shikonin suppresses intracellular synthesis of proteins belonging to the HSP27 family, and thus can treat diseases such as cancer and multiple sclerosis. The present invention is based on such findings, and can effectively treat diseases such as cancer and multiple sclerosis.
An object of the present invention is to provide a synthesis inhibitor for proteins belonging to the 27 family.

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、シコ
ニンを有効成分として含有することを特徴とする、分子
量１６キロダルトンから４０キロダルトンまでの間の熱
ショックタンパク質（すなわち、ＨＳＰ２７ファミリー
に属するタンパク質）の合成抑制剤に関する。Therefore, the present invention is characterized by containing shikonin as an active ingredient, and is characterized by a heat shock protein having a molecular weight of 16 to 40 kilodaltons (ie, belonging to the HSP27 family). (Protein) synthesis inhibitor.

【００１３】本明細書において、「ＨＳＰ２７ファミリ
ー」とは、前記のとおり、分子量が１６ｋＤ〜４０ｋＤ
の熱ショックタンパク質群を意味する。ＨＳＰ２７ファ
ミリーに属するタンパク質としては、例えば、哺乳動物
のＨＳＰ２７（すなわち、分子量２７ｋＤの熱ショック
タンパク質）〔若しくはＨＳＰ２８（すなわち、分子量
２８ｋＤの熱ショックタンパク質）〕、トリのＨＳＰ２
５（すなわち、分子量２５ｋＤの熱ショックタンパク
質）、又は酵母のＨＳＰ２６（すなわち、分子量２６ｋ
Ｄの熱ショックタンパク質）などを挙げることができ
る。なお、一般的に、タンパク質の分子量は、例えば、
分子量測定方法又は実験条件などの違いにより多少の差
が生じるので、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク
質の中には、例えば、哺乳動物におけるＨＳＰ２７とＨ
ＳＰ２８とのように、分子量表記が異なっていても、そ
れらがアミノ酸配列の異なる別異のタンパク質であるの
か、あるいは単に分子量表記のみが外見上異なる同一の
タンパク質であるのかが、現在のところ明らかではない
ものも含まれている。ＨＳＰ２７ファミリーに属するタ
ンパク質は、前記の低分子ＨＳＰファミリーに属する熱
ショックタンパク質のうち哺乳動物において最も主要な
熱ショックタンパク質であり、生物種を超えてよく保存
された特徴を示す。しかし、ＨＳＰ２７ファミリーに属
するタンパク質は、他の熱ショックタンパク質とは異な
り、種ごとに異なる分子量を有しており、分子量１６ｋ
Ｄ〜４０ｋＤと、非常に多様なタンパク質である。ま
た、ＨＳＰ２７とアミノ酸配列の相同性の高いα−Ｂク
リスタリンも熱ショック処理で誘導され、ＨＳＰ２７フ
ァミリーに属するタンパク質の一つであるAs used herein, the "HSP27 family" has a molecular weight of 16 kD to 40 kD.
Of heat shock proteins. Examples of proteins belonging to the HSP27 family include mammalian HSP27 (ie, a heat shock protein having a molecular weight of 27 kD) [or HSP28 (ie, a heat shock protein having a molecular weight of 28 kD)] and avian HSP2
5 (ie, a heat shock protein with a molecular weight of 25 kD) or yeast HSP26 (ie, a molecular weight of 26 kD).
D heat shock protein). Generally, the molecular weight of a protein is, for example,
Since some differences occur due to differences in molecular weight measurement methods, experimental conditions, and the like, some proteins belonging to the HSP27 family include HSP27 and HSP27 in mammals.
Even though the molecular weights are different, such as SP28, it is not clear at present whether they are different proteins having different amino acid sequences, or whether they are the same proteins that differ only in the molecular weight. Some are not included. The protein belonging to the HSP27 family is the most major heat shock protein in mammals among the heat shock proteins belonging to the small HSP family described above, and exhibits characteristics that are well conserved across species. However, proteins belonging to the HSP27 family are different from other heat shock proteins and have different molecular weights for each species, and have a molecular weight of 16 k
It is a very diverse protein with D to 40 kD. Α-B crystallin having a high amino acid sequence homology with HSP27 is also induced by heat shock treatment and is one of the proteins belonging to the HSP27 family.

【００１４】[0014]

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明の合成抑制剤は、有効成分としてシコニン
（ｓｈｉｋｏｎｉｎ）を含有する。本発明の合成抑制剤
において有効成分として使用することのできるシコニン
は、式（Ｉ）：BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail. The synthesis inhibitor of the present invention contains shikonin as an active ingredient. Shikonin which can be used as an active ingredient in the synthesis inhibitor of the present invention has the formula (I):

【化１】 で表される化合物であり、例えば、シコン等の生薬に含
まれている。シコニンには、立体異性体が存在し、それ
らの任意の純粋の立体異性体又はそれらの混合物を、本
発明の合成抑制剤の有効成分として用いることができ
る。Embedded image Is contained in crude drugs such as Sikon. There are stereoisomers of shikonin, and any pure stereoisomers or a mixture thereof can be used as an active ingredient of the synthesis inhibitor of the present invention.

【００１５】本発明の合成抑制剤に含有されるシコニン
は、化学合成によって、又は天然物から抽出して精製す
ることによって、調製することができる。あるいは、市
販品を用いてもよい。本発明の合成抑制剤において有効
成分として用いるシコニンを、天然物から抽出する場合
には、例えば、シコニンを含有する植物の全体又は一部
分（例えば、全草、葉、根、根茎、茎、根皮、花、若し
くは果実）をそのまま用いて、又は簡単に加工処理（例
えば、乾燥、切断、湯通し、蒸気加熱、若しくは粉末
化）したもの（例えば、生薬）を用いて抽出する。抽出
条件は一般的に植物抽出に用いられる条件ならば特に制
限はない。シコニンを含有する植物としては、これに限
定するものではないが、例えば、ムラサキ（Ｌｉｔｈｏ
ｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ Ｓｉｅ
ｂｏｌｄ ｅｔ Ｚｕｃｃａｒｉｎｉ）、又はアルネビ
ア・エウクロマ〔Ａｒｎｅｂｉａ ｅｕｃｈｒｏｍａ
（Ｒｏｙｌｅ） Ｊｏｈｎｓｔ．〕等を使用することが
できる。The shikonin contained in the synthetic inhibitor of the present invention can be prepared by chemical synthesis or by extraction from a natural product and purification. Alternatively, a commercially available product may be used. When shikonin used as an active ingredient in the synthetic inhibitor of the present invention is extracted from a natural product, for example, whole or a part of a plant containing shikonin (eg, whole plant, leaf, root, rhizome, stem, root bark) , Flowers, or fruits) as they are, or simply processed (for example, dried, cut, blanched, steam-heated, or powdered) (for example, crude drugs). The extraction conditions are not particularly limited as long as they are generally used for plant extraction. Plants containing shikonin include, but are not limited to, for example, purple (Litho)
sperm erythrorhizon Sie
Bold et Zuccarini), or Arnevia euchroma
(Royle) Johnst. ] Etc. can be used.

【００１６】本発明におけるシコニンを生薬から抽出す
る場合、これに限定するものではないが、例えば、シコ
ンから抽出することが好ましい。シコン（紫根；Ｌｉｔ
ｈｏｓｐｅｒｍｉ ｒａｄｉｘ；Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍ
ｕｍ ｒｏｏｔ）とは、ムラサキの根を意味し、それら
の部分を単独であるいは任意に組み合わせて使用するこ
とができる。In the present invention, when shikonin is extracted from a crude drug, it is not limited to this, but, for example, it is preferable to extract from shikon. Shikon (Shikon; Lit)
hospermi radix; Lithosperm
um root) means the root of purple, and those parts can be used alone or in any combination.

【００１７】本発明の合成抑制剤において有効成分とし
て用いることのできるシコン抽出物は、前記のシコニン
を含有していればよく、従って、シコンの粗抽出物を用
いることができる。本発明で用いることのできるシコン
抽出物の製造方法としては、シコンを、水（例えば、冷
水、温水、又は熱湯）によって抽出するか、又は有機溶
媒を用いて抽出することによって、得ることができる。
有機溶媒としては、例えば、炭素数１〜６のアルコール
（例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−
プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、若しく
はブチルアルコール）、エステル（例えば、酢酸メチ
ル、酢酸エチル、酢酸プロピル、若しくは酢酸ブチ
ル）、ケトン（例えば、アセトン若しくはメチルイソブ
チルケトン）、エーテル、石油エーテル、ｎ−ヘキサ
ン、シクロヘキサン、トルエン、ベンゼン、炭化水素の
ハロゲン誘導体（例えば、四塩化炭素、ジクロロメタ
ン、若しくはクロロホルム）、ピリジン、グリコール
（例えば、プロピレングリコール、若しくはブチレング
リコール）、ポリエチレングリコール、又はアセトニト
リルなどを用いることができ、これらの有機溶媒を単
独、又は適宜組み合わせ、一定の比率で混合し、更には
無水又は含水状態で用いることができる。好ましくは、
エーテル及び／又はジクロロメタン等が望ましい。水抽
出又は有機溶媒抽出の方法としては、通常の生薬抽出に
用いられる方法を用いることができ、例えば、（乾燥）
シコン１重量部に対し、水又は有機溶媒３〜３００重量
部を用いて、攪拌しながら、その沸点以下の温度で加熱
還流、常温で超音波抽出、あるいは冷浸することが望ま
しい。抽出工程は、通常は５分〜７日間、好ましくは１
０分〜６０時間実施し、必要に応じて、攪拌等の補助的
手段を加えることにより、抽出時間を短縮することがで
きる。The silicon extract which can be used as an active ingredient in the synthesis inhibitor of the present invention only needs to contain the aforementioned shikonin, and therefore, a crude extract of silicon can be used. The method for producing a silicon extract that can be used in the present invention can be obtained by extracting silicon with water (for example, cold, hot, or hot water) or by extracting with an organic solvent. .
Examples of the organic solvent include alcohols having 1 to 6 carbon atoms (eg, methyl alcohol, ethyl alcohol, n-
Propyl alcohol, isopropyl alcohol, or butyl alcohol), ester (eg, methyl acetate, ethyl acetate, propyl acetate, or butyl acetate), ketone (eg, acetone or methyl isobutyl ketone), ether, petroleum ether, n-hexane, cyclohexane , Toluene, benzene, a halogen derivative of a hydrocarbon (eg, carbon tetrachloride, dichloromethane, or chloroform), pyridine, glycol (eg, propylene glycol or butylene glycol), polyethylene glycol, or acetonitrile, and the like. Can be used alone or in an appropriate combination, mixed at a constant ratio, and further used in an anhydrous or water-containing state. Preferably,
Ether and / or dichloromethane and the like are desirable. As the method of water extraction or organic solvent extraction, a method used for ordinary crude drug extraction can be used, for example, (drying)
It is desirable to heat and reflux at a temperature not higher than the boiling point of the silicon or 1 to 300 parts by weight of water or an organic solvent with respect to 1 part by weight of silicon, or to carry out ultrasonic extraction or cold immersion at room temperature. The extraction step is usually performed for 5 minutes to 7 days, preferably 1 minute.
The extraction is performed for 0 minute to 60 hours, and the extraction time can be reduced by adding auxiliary means such as stirring as needed.

【００１８】抽出工程終了後、濾過又は遠心分離等の適
当な方法により、水又は有機溶媒抽出液から、不溶物を
分離して粗抽出物を得ることができる。なお、本発明の
合成抑制剤において、天然物より抽出、分画したシコニ
ンを用いる場合には、前記の粗抽出物を特に精製するこ
となく、そのまま使用してもよい。常法による水抽出物
又は有機溶媒抽出物の他に、前記の粗抽出物を各種有機
溶媒又は吸着剤等により、更に処理した精製抽出物も、
本発明の合成抑制剤の有効成分として用いることができ
る。これらの粗抽出物及び各種の精製処理を終えた精製
抽出物を含むシコン抽出物は、抽出したままの溶液を用
いても、溶媒を濃縮したエキスを用いても良いし、溶媒
を留去し乾燥した粉末、更には結晶化して精製したも
の、あるいは粘性のある物質を用いても良く、またそれ
らの希釈液を使用することもできる。こうして得られた
シコン抽出物は、シコンに含まれるシコニンを含み、同
時に原料のシコンに由来する不純物を含んでいる。After completion of the extraction step, the insoluble matter can be separated from the water or organic solvent extract by a suitable method such as filtration or centrifugation to obtain a crude extract. When shikonin extracted and fractionated from a natural product is used in the synthesis inhibitor of the present invention, the crude extract may be used without purification. In addition to water extract or organic solvent extract by a conventional method, a purified extract obtained by further treating the above crude extract with various organic solvents or adsorbents,
It can be used as an active ingredient of the synthesis inhibitor of the present invention. These crude extracts and sicon extracts including purified extracts after various purification treatments may be used in the form of an extracted solution, an extract in which the solvent is concentrated, or the solvent may be distilled off. A dried powder, a crystallized and purified substance, or a viscous substance may be used, or a diluent thereof may be used. The thus obtained siconium extract contains the shikonin contained in the sicon and simultaneously the impurities derived from the sicon as the raw material.

【００１９】本発明の合成抑制剤は、シコニン、又はシ
コニンを含有する植物の抽出物、例えば、シコニンを含
有する生薬の抽出物（特には、シコン抽出物）を、それ
単独で、又は好ましくは製剤学的若しくは獣医学的に許
容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましく
は哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。投
与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒
剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン
剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、
又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリ
ーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることがで
きる。これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン
酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶ
どう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デ
キストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、
大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステ
アリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ
酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニ
ウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢
剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯
味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を
用いて、常法に従って製造することができる。例えば、
シコニン１重量部と乳糖９９重量部とを混合して充填し
たカプセル剤などである。The synthetic inhibitor according to the present invention may be used alone or preferably as an extract of shikonin or an extract of a plant containing shikonin, for example, an extract of a crude drug containing shikonin (particularly, an extract of shikonin). It can be administered to animals, preferably mammals (especially humans), together with conventional pharmaceutically or veterinarily acceptable carriers. The dosage form is not particularly limited, for example, powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, extracts, or oral preparations such as pills,
Or parenteral preparations such as injections, external solutions, ointments, suppositories, creams for topical administration, or eye drops. These oral preparations include, for example, gelatin, sodium alginate, starch, corn starch, sucrose, lactose, glucose, mannitol, carboxymethylcellulose, dextrin, polyvinylpyrrolidone, crystalline cellulose,
Excipients such as soybean lecithin, sucrose, fatty acid ester, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol, magnesium silicate, anhydrous silicic acid or synthetic aluminum silicate, binders, disintegrants, surfactants, lubricants It can be produced according to a conventional method using a fluidity promoter, a diluent, a preservative, a coloring agent, a flavoring agent, a flavoring agent, a stabilizer, a moisturizing agent, a preservative, an antioxidant and the like. For example,
Capsules prepared by mixing and filling 1 part by weight of shikonin with 99 parts by weight of lactose.

【００２０】非経口投与方法としては、注射（皮下、静
脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなか
で、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の
調製においては、有効成分としてのシコニン、又はシコ
ニンを含有する植物の抽出物、例えば、シコニンを含有
する生薬の抽出物（特には、シコン抽出物）の他に、例
えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、
植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブド
ウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助
剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任
意に用いることができる。また、本発明の合成抑制剤
は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用
いて投与してもよい。例えば、本発明の合成抑制剤をエ
チレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、
このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植するこ
とができる。Examples of the parenteral administration method include injection (subcutaneous, intravenous, etc.), rectal administration and the like. Among these, the injection is most preferably used. For example, in the preparation of an injection, in addition to shikonin as an active ingredient or an extract of a plant containing shikonin, for example, an extract of a crude drug containing shikonin (particularly, an extract of shikonin), for example, physiological A water-soluble solvent such as saline or Ringer's solution,
A water-insoluble solvent such as vegetable oil or fatty acid ester, an isotonic agent such as glucose or sodium chloride, a solubilizing agent, a stabilizer, a preservative, a suspending agent, or an emulsifying agent can be optionally used. In addition, the synthetic inhibitor of the present invention may be administered by the method of sustained release preparation using a sustained release polymer or the like. For example, by incorporating the synthesis inhibitor of the present invention into ethylene vinyl acetate polymer pellets,
The pellet can be surgically implanted in the tissue to be treated.

【００２１】本発明の合成抑制剤は、これに限定される
ものではないが、シコニンを、０．０１〜９９重量％、
好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することがで
きる。また、シコニンを含有する植物の抽出物、例え
ば、シコニンを含有する生薬の抽出物（特には、シコン
抽出物）を有効成分として含有する本発明の合成抑制剤
は、その中に含まれるシコニンが前記の量範囲になるよ
うに適宜調整して、調製することができる。なお、シコ
ニンを含有する植物の抽出物、例えば、シコニンを含有
する生薬の抽出物（特には、シコン抽出物）を有効成分
として含有する合成抑制剤を、経口投与用製剤とする場
合には、製剤学的に許容することのできる担体を用い
て、製剤化することが好ましい。本発明の合成抑制剤を
用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性
別、体重、症状の程度、又は投与方法などにより異な
り、特に制限はないが、シコニン量として通常成人１人
当り１ｍｇ〜１０ｇ程度を、１日１〜４回程度にわけ
て、経口的に又は非経口的に投与する。更に、用途も医
薬品に限定されるものではなく、種々の用途、例えば、
機能性食品や健康食品として飲食物の形で与えることも
可能である。The synthesis inhibitor of the present invention is not limited to this, but contains 0.01 to 99% by weight of shikonin,
Preferably, it can be contained in an amount of 0.1 to 80% by weight. Further, a plant extract containing shikonin, for example, a herbal medicine extract containing shikonin (particularly, shikon extract) is a synthetic inhibitor of the present invention containing as an active ingredient, shikonin contained therein. It can be prepared by appropriately adjusting the amount to fall within the above range. Incidentally, a plant extract containing shikonin, for example, a herbal medicine extract containing shikonin (particularly, shikon extract) a synthetic inhibitor containing as an active ingredient, when the formulation for oral administration, It is preferred to formulate using a pharmaceutically acceptable carrier. The dose when using the synthetic inhibitor of the present invention varies depending on the type of disease, age, sex, weight, degree of symptoms, degree of administration or the like of the patient, and is not particularly limited, but the amount of shikonin is usually one adult. About 1 mg to 10 g per day is orally or parenterally administered in about 1 to 4 times a day. Further, the application is not limited to pharmaceuticals, but various applications, for example,
It can also be provided in the form of food and drink as functional foods and health foods.

【００２２】[0022]

【作用】上記したように、本発明の合成抑制剤に含有さ
れるシコニンは、細胞内のＨＳＰ２７ファミリーに属す
るタンパク質の合成を特異的に抑制する作用があるの
で、前記シコニンを投与すると細胞でのＨＳＰ２７ファ
ミリーに属するタンパク質の生合成が特異的に減少す
る。従って、前記シコニンは、例えば、ＨＳＰ２７ファ
ミリーに属するタンパク質がその悪性化に関連する癌の
予防及び治療、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク
質がその療法への障害となる温熱耐性に関連する癌温熱
療法の効果の増強、又はＨＳＰ２７ファミリーに属する
タンパク質がその発症に関連する多発性硬化症などの自
己免疫疾患の予防及び治療などに使用することができ
る。また、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の
発現と薬剤耐性とが相関するとの報告もあるので（"Bre
ast Cancer Res. Treat.", 23: 178, 1992; "Cancer R
es.", 51: 5245-5252, 1991)、ＨＳＰ２７ファミリーに
属するタンパク質の発現を抑制することにより、薬剤耐
性を抑え、化学療法の効果を増強することも可能であ
る。As described above, shikonin contained in the synthesis inhibitor of the present invention has the action of specifically inhibiting the synthesis of proteins belonging to the HSP27 family in cells. Biosynthesis of proteins belonging to the HSP27 family is specifically reduced. Therefore, the shikonin is effective in preventing and treating cancers in which proteins belonging to the HSP27 family are associated with malignant transformation, and in the effects of cancer hyperthermia related to thermotolerance in which proteins belonging to the HSP27 family are obstacles to the therapy. The protein belonging to the enhancement or HSP27 family can be used for prevention and treatment of autoimmune diseases such as multiple sclerosis associated with the onset thereof. There is also a report that the expression of proteins belonging to the HSP27 family is correlated with drug resistance ("Bre
ast Cancer Res. Treat. ", 23 : 178, 1992;" Cancer R
es. ", 51 : 5245-5252, 1991), it is also possible to suppress drug resistance and enhance the effect of chemotherapy by suppressing the expression of proteins belonging to the HSP27 family.

【００２３】[0023]

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：ヒト培養癌細胞のＨＳＰ発現量の測定 （１）ヒト培養癌細胞の培養 胃癌細胞株ＫＡＴＯ III （ＡＴＣＣ ＨＴＢ １０
３）を、１０％非働化ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４
０培地中で、５％二酸化炭素条件下で、熱ショック時以
外は、３７℃で培養した。The present invention will be described in detail below with reference to examples, but these do not limit the scope of the present invention. Example 1: Measurement of HSP expression level in cultured human cancer cells (1) Culture of cultured human cancer cells Gastric cancer cell line KATO III (ATCC HTB 10
3) RPMI 164 containing 10% inactivated fetal bovine serum
The cells were cultured in 0 medium under the condition of 5% carbon dioxide at 37 ° C. except for the time of heat shock.

【００２４】（２）シコニン処理及び熱ショック処理 播種２日後の胃癌細胞株ＫＡＴＯ III の培地中には、
最終濃度１μＭになるように前記式（Ｉ）で表されるシ
コニン（一丸ファルコス）を添加し、２４時間培養し
た。その後、４５℃にて１５分間熱ショック処理をして
から、３７℃にて終夜培養した。対照試験は、シコニン
を添加しないこと以外は前記と同様に実施した。(2) Shikonin treatment and heat shock treatment Two days after seeding, the medium of gastric cancer cell line KATO III contains
Shikonin (Ichimaru Falcos) represented by the above formula (I) was added to a final concentration of 1 μM, and the cells were cultured for 24 hours. Then, after heat shock treatment at 45 ° C. for 15 minutes, the cells were cultured at 37 ° C. overnight. The control test was performed in the same manner as described above except that no shikonin was added.

【００２５】（３）ヒト培養癌細胞でのＨＳＰ発現量の
測定 前項（２）で処理した各細胞を、以下に示す方法により
ホモジナイズし、ＨＳＰ発現量をウェスタンブロット法
にて測定した。すなわち、前項（２）で処理した細胞
を、リン酸緩衝生理食塩水〔組成：ＫＣｌ＝０．２ｇ／
ｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ＝０．２ｇ／ｌ，ＮａＣｌ＝８ｇ／
ｌ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄ （無水）＝１．１５ｇ／ｌ；以下、
ＰＢＳ（−）と称する〕で洗浄した後、ライシスバッフ
ァー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）〔１．０％ＮＰ−４
０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−Ｎ−エ
チルマレイミド、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オリド、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペ
プスタチン〕１ｍｌを加え、氷上で２０分間静置した。
その後、４℃で１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心
を行った。遠心後の上清１０μｌをＰＢＳ（−）７９０
μｌに加え、更にプロテインアッセイ染色液（Dye Reag
ent Concentrate : バイオラッド，カタログ番号500-00
06）２００μｌを加えた。５分間、室温にて静置した
後、５９５ｎｍで吸光度を測定してタンパク質定量を行
った。(3) Measurement of HSP expression level in cultured human cancer cells Each cell treated in the above section (2) was homogenized by the following method, and the HSP expression level was measured by Western blotting. That is, the cells treated in the above (2) were treated with phosphate buffered saline [composition: KCl = 0.2 g /
1, KH ₂ PO ₄ = 0.2 g / l, NaCl = 8 g /
1, Na ₂ HPO ₄ (anhydrous) = 1.15 g / l;
PBS (-)), and then lysed buffer (lysis buffer) [1.0% NP-4
0, 0.15M sodium chloride, 50 mM Tris-HC
1 (pH 8.0), 5 mM-EDTA, 2 mM-N-ethylmaleimide, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 2 μg / ml leupeptin and 2 μg / ml pepstatin] were added, and the mixture was allowed to stand on ice for 20 minutes.
Thereafter, centrifugation was performed at 12,000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes. 10 μl of the supernatant after centrifugation was added to PBS (-) 790
In addition to μl, protein assay stain (Dye Reag
ent Concentrate: Bio-Rad, Catalog No. 500-00
06) 200 μl was added. After standing at room temperature for 5 minutes, the absorbance was measured at 595 nm for protein quantification.

【００２６】タンパク質定量を行った試料を用いて、Ｌ
ａｅｍｍｌｉのバッファー系（Laemmli, N. K., "Natur
e", 283 : pp. 249-256, 1970)にて、等量のタンパク質
を含むライセートのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。電気泳動後、ブロッティング及びそれに
続くブロッキングを行った。すなわち、タンパク質転写
装置（Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell：バ
イオ・ラッド，カタログ番号170-3946）を用いて、室温
にて１００Ｖにて、０．４５μｍニトロセルロース膜
（Schleicher & Schuell，カタログ番号401196）にゲル
を密着させ、３時間ブロッティングを行った。ブロッテ
ィングバッファーとしては、０．０２５Ｍトリス及び
０．１９２ＭグリシンよりなりｐＨ８．５に調整された
トリスグリシンバッファー（Tris Gly Running and Blo
tting Buffer；Enprotech, 米国マサチューセッツ州，
カタログ番号 SA100034)にメチルアルコールを２０％に
なるように加えて調製したバッファーを用いた。ブロッ
ティング後、ニトロセルロース膜を１０％スキムミルク
（雪印乳業）−ＰＢＳ（−）溶液に室温にて３０分間、
インキュベートし非特異的結合をブロックした。Using the sample for which the protein was quantified, L
aemmli buffer system (Laemmli, NK, "Natur
e ", 283 : pp. 249-256, 1970), SDS polyacrylamide gel electrophoresis of a lysate containing an equal amount of protein was performed. After electrophoresis, blotting and subsequent blocking were performed. Using a transfer device (Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell: Bio-Rad, Catalog No. 170-3946), adhere the gel to a 0.45 μm nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell, Catalog No. 401196) at 100 V at room temperature. Blotting was carried out for 3 hours, and the blotting buffer was Tris Gly Running and Blos (0.025 M Tris and 0.192 M glycine) adjusted to pH 8.5.
tting Buffer; Enprotech, Massachusetts, USA,
A buffer prepared by adding 20% methyl alcohol to catalog number SA100034) was used. After blotting, the nitrocellulose membrane was added to a 10% skim milk (Snow Brand Milk Products) -PBS (-) solution at room temperature for 30 minutes.
Incubate to block non-specific binding.

【００２７】ブロッキング後、ニトロセルロース膜の上
で、抗ヒトＨＳＰ２７マウスモノクローナル抗体（Stre
ssGen, Victoria, B.C., Canada, カタログ番号 SPA-8
00）により、１次抗体反応を行った。この抗ヒトＨＳＰ
２７マウスモノクローナル抗体は、ヒト乳癌細胞株ＭＣ
Ｆ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ２２）より単離したＨＳＰ２
４を免疫原として作製した抗体であり（"Cancer Res.",
42, 4256-4258, 1982)、ＨＳＰ２７（ヒトＨＳＰ２
７、チンパンジーＨＳＰ２７、及びヒツジＨＳＰ２７）
と特異的に反応し（"Cancer Res.", 42, 4256-4258, 1
982 ； "Cancer Res.", 43, 4297-4301, 1983)、ＨＳＰ
２４及びＨＳＰ２８とも特異的に反応する。１次抗体反
応後、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、溶液を取り替えて２
回の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーによって行
い、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バイ
オ・ラッド，カタログ番号170-6531）溶液で１５分間ず
つ、溶液を取り替えて４回の洗浄を行った。最終的に、
ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、２回の洗浄を行った。After blocking, an anti-human HSP27 mouse monoclonal antibody (Stre
ssGen, Victoria, BC, Canada, Catalog Number SPA-8
00), a primary antibody reaction was performed. This anti-human HSP
The 27 mouse monoclonal antibody is a human breast cancer cell line MC
HSP2 isolated from F7 (ATCC HTB 22)
4 was an immunogen produced by using "Cancer Res.",
42 , 4256-4258, 1982), HSP27 (human HSP2)
7, chimpanzee HSP27, and sheep HSP27)
("Cancer Res.", 42 , 4256-4258, 1
982; "Cancer Res.", 43 , 4297-4301, 1983), HSP
It also reacts specifically with 24 and HSP28. After the primary antibody reaction, the solution was exchanged with PBS (-) for 5 minutes each for 2 minutes.
Washing is performed by a slow rocking shaker, and further, washing is performed four times by replacing the solution with a PBS (−)-0.1% Tween 20 (Bio-Rad, Cat. No. 170-6531) solution for 15 minutes. Was. Finally,
Washing was performed twice for 5 minutes each with PBS (-).

【００２８】洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスＩｇＧ抗体（CAPPEL，カタログ番号55550)を、２
％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５０００倍に
希釈して調製した抗体溶液５ｍｌを用いて、２時間、２
次抗体反応を行った。反応終了後、ニトロセルロース膜
に関して、ＰＢＳ（−）溶液で５分間ずつ溶液を変えて
２回、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液
で１５分間ずつ溶液を変えて５回の洗浄をスロー・ロッ
キング・シェイカーにより行った。最後にＰＢＳ（−）
溶液で５分間ずつ２回の洗浄を行った。余分なＰＢＳ
（−）溶液を除去した後、ウェスタンブロッティング検
出試薬（ECL Western blotting detectionreagent；Ame
rsham，カタログ番号RPN2106)をニトロセルロース膜上
に振りかけ、１分間インキュベートした後、余分な検出
試薬を除去し、ニトロセルロース膜をラップに包み、反
応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT, AR, カタログ
番号165 1454）に密着させて露光し、現像してＨＳＰ２
７の有無の検討を行った。After the washing was completed, a peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG antibody (CAPPEL, Catalog No. 55550) was
Using 5 ml of antibody solution prepared by diluting 5000 times with PBS (-) solution containing% skim milk, 2 hours, 2
A secondary antibody reaction was performed. After completion of the reaction, the nitrocellulose membrane was washed twice with a PBS (-) solution for 5 minutes each, and for 5 times with a PBS (-)-0.1% Tween 20 solution for 15 minutes each. Performed by slow rocking shaker. Finally PBS (-)
The solution was washed twice for 5 minutes each. Extra PBS
(-) After removing the solution, the western blotting detection reagent (ACL Western blotting detection reagent; Ame
rsham, catalog number RPN2106), sprinkle onto the nitrocellulose membrane, incubate for 1 minute, remove excess detection reagent, wrap the nitrocellulose membrane in wrap, and cover the reaction surface with X-ray film (Kodak X-OMAT, AR, Cathode No. 165 1454) exposed to light, developed and HSP2
7 was examined.

【００２９】その結果、対照試験、すなわち、シコニン
を添加しなかった胃癌細胞株ＫＡＴＯ III では、分子
量約２７ｋＤのバンドが一本検出された。なお、分子量
は、前記抗ヒトＨＳＰ２７マウスモノクローナル抗体と
の結合、及び分子量マーカー（ダイズトリプシンインヒ
ビター及びウシカーボニックアンヒドラーゼ）により決
定した。シコニンを添加した胃癌細胞株ＫＡＴＯ III
では、対照試験に比べて分子量約２７ｋＤのバンドの濃
度が有意に薄くなった。すなわち、シコニンは、ＨＳＰ
２７の発現を抑制する合成抑制剤の活性を有するものと
結論することができる。As a result, in the control test, that is, in the gastric cancer cell line KATO III to which shikonin was not added, one band having a molecular weight of about 27 kD was detected. The molecular weight was determined by binding to the anti-human HSP27 mouse monoclonal antibody and molecular weight markers (soybean trypsin inhibitor and bovine carbonic anhydrase). Gastric cancer cell line KATO III supplemented with shikonin
, The concentration of the band having a molecular weight of about 27 kD was significantly reduced as compared with the control test. That is, shikonin is HSP
It can be concluded that it has the activity of a synthetic inhibitor that suppresses the expression of 27.

【００３０】[0030]

【発明の効果】以上詳述したように、シコニンは、細胞
内のＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質の発現を
抑制する合成抑制剤の活性を有する。従って、シコニン
を投与することにより、例えば、ＨＳＰ２７ファミリー
に属するタンパク質がその悪性化や温熱療法の効果の減
少に関連する癌、その発症に関連する多発性硬化症など
の自己免疫疾患の患者の生理学的状態を有効に改善さ
せ、前記病気を効果的に治療することができる。また、
ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク質発現と薬剤耐
性とが相関するとの報告もあるので（"Breast Cancer R
es. Treat.",23: 178, 1992; "Cancer Res.", 51: 5245
-5252, 1991)、ＨＳＰ２７ファミリーに属するタンパク
質の発現を抑制することにより、薬剤耐性を抑え、化学
療法の効果を増強することも可能である。Industrial Applicability As described above in detail, shikonin has the activity of a synthetic inhibitor that suppresses the expression of intracellular proteins belonging to the HSP27 family. Therefore, by administering shikonin, for example, the physiology of a patient belonging to the autoimmune disease such as a cancer associated with malignancy or a decrease in the effect of hyperthermia or a multiple sclerosis associated with the onset of a protein belonging to the HSP27 family is reduced. The target condition can be effectively improved, and the disease can be effectively treated. Also,
It has been reported that the expression of a protein belonging to the HSP27 family is correlated with drug resistance ("Breast Cancer R
es. Treat. ", 23 : 178, 1992;" Cancer Res. ", 51 : 5245
-5252, 1991), it is also possible to suppress drug resistance and enhance the effect of chemotherapy by suppressing the expression of proteins belonging to the HSP27 family.

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 シコニンを有効成分として含有すること
を特徴とする、分子量１６キロダルトンから４０キロダ
ルトンまでの間の熱ショックタンパク質の合成抑制剤。1. A heat shock protein synthesis inhibitor having a molecular weight of 16 kDa to 40 kDa, comprising shikonin as an active ingredient. 【請求項２】 シコニンを含有する植物の抽出物を有効
成分として含有することを特徴とする、分子量１６キロ
ダルトンから４０キロダルトンまでの間の熱ショックタ
ンパク質の合成抑制剤。2. A heat shock protein synthesis inhibitor having a molecular weight of from 16 to 40 kilodaltons, comprising an extract of a plant containing shikonin as an active ingredient. 【請求項３】 シコンの抽出物を有効成分として含有す
ることを特徴とする、分子量１６キロダルトンから４０
キロダルトンまでの間の熱ショックタンパク質の合成抑
制剤。3. A molecular weight of 16 kilodaltons to 40, which contains an extract of Sikon as an active ingredient.
Heat shock protein synthesis inhibitors up to kilodaltons.