JPH1042891A - Preparation of high-purity amylase inhibitor - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject inhibitor low in trypsin inhibitory activity and useful for treatment of diabetes, arteriosclerosis and obesity in high productivity, by treating a crude amylase inhibitor with a specific enzyme derived from Aspergillus oryzae. SOLUTION: First, a dough prepared by kneading wheat flour with water is washed with water to extract gluten and wheat starch, sodium alginate is then added to the resultant liquid extract followed by adjustment to pH4.0 and recovering the gel formed. Secondly, water is added to the gel followed by addition of calcium chloride, thoroughly agitation, and centrifugal separation to collect the resultant supernatant. Thirdly, the supernatant is heated to effect precipitation of unstable matter which is then eliminated, and the remaining supernatant is subjected to ultrafiltration and concentrated, thus obtaining a crude amylase inhibitor. Fourthly, the crude inhibitor is treated with a protease 35,000-45,000 in molecular weight derived from Aspergillus oryzae, thus obtaining the objective high-purity amylase inhibitor low in trypsin lnhibitory activity.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、高純度アミラーゼ
阻害物質の調製方法、および該方法により得られる高純
度アミラーゼ阻害物質に関する。より詳細には、本発明
は、アミラーゼ阻害物質の含有量が多く且つトリプシン
阻害活性の極めて低い高純度アミラーゼ阻害物質を、簡
単な操作により生産性よく調製する方法、および該方法
により得られる高純度アミラーゼ阻害物質に関する。[0001] The present invention relates to a method for preparing a high-purity amylase inhibitor and a high-purity amylase inhibitor obtained by the method. More specifically, the present invention provides a method for preparing a high-purity amylase inhibitor having a high content of an amylase inhibitor and extremely low trypsin inhibitory activity with high productivity by a simple operation, and a high purity obtained by the method. It relates to an amylase inhibitor.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年我が国では食生活が豊かになり、糖
尿病をはじめとする代謝性疾患が急増している。過剰の
栄養摂取はインシュリンの大量分泌を誘導し、間接的に
代謝バランスの崩壊をもたらし、耐糖機能の低下（高血
糖）、糖尿病、高脂血症、動脈硬化等を引き起こす。特
に、糖尿病患者ではインシュリン作用が不足し耐糖能が
低下しているため、食後の血糖値の上昇が著しく、毛細
血管の損傷や動脈硬化などの合併症の原因となってい
る。2. Description of the Related Art In recent years, eating habits have become rich in Japan, and metabolic diseases such as diabetes have rapidly increased. Excessive nutrient intake induces massive secretion of insulin, indirectly disrupts the metabolic balance, causes a decrease in glucose tolerance (hyperglycemia), diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, and the like. Particularly, in diabetic patients, the insulin action is insufficient and glucose tolerance is reduced, so that the blood glucose level after meals is significantly increased, which causes complications such as damage to capillaries and arteriosclerosis.

【０００３】上記のような疾患の予防および治療には、
必要な栄養を摂取しても血糖値が上昇しにくかったり、
インシュリンの大量分泌を抑制し得る食品や物質の摂取
が有効であるとされている。そのため摂取した澱粉が少
糖類に分解するのを抑制または阻害し得る物質およびイ
ンシュリンの分泌を抑制できる物質が求められてきた。For the prevention and treatment of the above diseases,
Even if you take in the necessary nutrients, it is difficult for your blood sugar to rise,
Ingestion of foods and substances that can suppress the massive secretion of insulin is said to be effective. Therefore, a substance capable of suppressing or inhibiting the degradation of the ingested starch into oligosaccharides and a substance capable of suppressing insulin secretion have been demanded.

【０００４】上記の点から、澱粉を糖に分解するアミラ
ーゼの活性を阻害する作用を有するいわゆるアミラーゼ
阻害物質に対する研究が色々行われるようになってお
り、小麦中にもアミラーゼ阻害物質が含まれていること
が報告されて以来、小麦由来のアミラーゼ阻害物質に関
する研究や開発が種々なされるようになった（例えば特
開昭４６−１８３３号公報、特開昭６１−１７１４３１
号公報）。[0004] In view of the above, various studies have been made on so-called amylase inhibitors having an action of inhibiting the activity of amylase which degrades starch into sugar, and wheat also contains amylase inhibitors. Since then, various studies and developments have been made on wheat-derived amylase inhibitors (for example, JP-A-46-1833, JP-A-61-171431).
No.).

【０００５】しかしながら、上記した従来の小麦由来の
アミラーゼ阻害物質は、人間に経口で投与した場合に期
待どおりの効果がみられず、特に米飯のような加熱調理
した澱粉の消化に対しては糖への分解抑制作用が低く、
しかも高価であるなどの欠点を有していた。したがっ
て、近年、加熱調理した澱粉の消化に対しても、経口投
与により糖への分解抑制作用を有する有効なアミラーゼ
阻害物質を経済的に得る方法が求められていた。[0005] However, the conventional wheat-derived amylase inhibitors described above do not have the expected effect when administered orally to humans, and are particularly susceptible to the digestion of cooked starch such as cooked rice. Has a low inhibitory effect on
Moreover, it has disadvantages such as being expensive. Therefore, in recent years, there has been a demand for a method for economically obtaining an effective amylase inhibitor having an inhibitory effect on decomposition into sugar by oral administration even for digestion of cooked starch.

【０００６】[0006]

【発明の内容】本発明者らは小麦から有用成分を得るこ
とについて長年研究を行ってきたが、そのような研究の
一環として、小麦からのアミラーゼ阻害物質の取得につ
いても研究を続けてきた。その結果、工業的に高純度の
アミラーゼ阻害物質を製造する方法として、アミラーゼ
阻害物質含有液にアルギン酸などの多糖類を加えて不溶
性の複合体を形成させて分取し、次いでこの複合体より
多糖類を分離除去した後に、更に陽イオン交換体で処理
する工程を施し、その陽イオン交換体通過画分からアミ
ラーゼ阻害物質を回収する方法を確立して先に出願した
（特開平５−３０１８９８号）。The present inventors have been conducting research on obtaining useful components from wheat for many years, and as part of such research, have also continued research on obtaining an amylase inhibitor from wheat. As a result, as a method for industrially producing a high-purity amylase inhibitor, a polysaccharide such as alginic acid is added to a solution containing an amylase inhibitor to form an insoluble complex, fractionated, and then separated from the complex. After separating and removing the saccharides, a step of further treating with a cation exchanger is performed, and a method for recovering the amylase inhibitor from the fraction passing through the cation exchanger has been established (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 5-301898). .

【０００７】本発明者らによる上記の方法で得られるア
ミラーゼ阻害物質は、極めて高いアミラーゼ阻害活性を
有する一方で、有害なトリプシン阻害物質の含有量が少
ないことから、体内においてアミラーゼ阻害物質のアミ
ラーゼ阻害活性を妨害することがなく、しかもトリプシ
ン阻害物質に起因する膵臓の肥大や膵臓癌の発生がない
という良好な特性を有しており、そのためインシュリン
分泌抑制に極めて有効である。そして、上記した特開平
５−３０１８９８号公報に記載の方法では、陽イオン交
換体による処理が純度の向上および有害なトリプシン阻
害物質の除去の点で大きな効力を発揮している。[0007] The amylase inhibitor obtained by the above method of the present inventors has an extremely high amylase inhibitory activity, but has a low content of harmful trypsin inhibitor. It has good properties that it does not interfere with its activity and that it does not cause pancreatic hypertrophy or pancreatic cancer caused by a trypsin inhibitor, and is therefore extremely effective in suppressing insulin secretion. In the method described in JP-A-5-301898, treatment with a cation exchanger exerts a great effect in terms of improving purity and removing harmful trypsin inhibitor.

【０００８】しかしながら、上記の方法は、イオン交換
樹脂（イオン交換体）の使用を必須にしているため、イ
オン交換樹脂筒（カラム）などの設備、イオン交換樹脂
の再生などが必要であり、その操作性や生産性の点で未
だ十分には満足し得る方法ではない。そこで、イオン交
換樹脂を用いずに、上記した方法と同様に、アミラーゼ
阻害物質の含有量が多く、しかもトリプシン阻害物質の
含有量の少ない、高純度のアミラーゼ阻害物質を簡単な
操作で生産性良く調製し得る方法が求められている。ま
た、イオン交換樹脂を用いる上記した特開平５−３０１
８９８号公報に記載された方法などにより得られる高純
度のアミラーゼ阻害物質の場合でも、そこで得られたア
ミラーゼ阻害物質を、簡単な操作でより一層高純度のも
のにすることのできる方法が、アミラーゼ阻害物質の有
効利用などの点から求められている。However, since the above-mentioned method requires the use of an ion exchange resin (ion exchanger), equipment such as an ion exchange resin tube (column) and regeneration of the ion exchange resin are required. It is not yet a satisfactory method in terms of operability and productivity. Therefore, without using an ion-exchange resin, a high-purity amylase inhibitor having a high content of an amylase inhibitor and a low content of a trypsin inhibitor is obtained with a simple operation in a similar manner to the above-described method. There is a need for a method that can be prepared. Also, the above-mentioned Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-301 using an ion exchange resin.
Even in the case of a high-purity amylase inhibitor obtained by the method described in US Pat. No. 898, an amylase inhibitor can be obtained by a simple operation. It is required in terms of effective use of inhibitors.

【０００９】そこで、本発明者らは、純度が高くて且つ
トリプシン阻害活性の少ないアミラーゼ阻害物質を、簡
単な操作で生産性良く調製し得る方法を開発すべく更に
色々検討を重ねてきた。その結果、アスペルギルス・オ
リゼーに由来する分子量３５０００〜４５０００、特に
分子量が約４００００のプロテアーゼが、アミラーゼ阻
害物質に対してはあまり分解作用を示さず、アミラーゼ
阻害物質中に夾雑物として含まれる蛋白質（以下「夾雑
蛋白質」という）を優先的に分解して低分子化し得るこ
とを見出した。そしてそのような知見に基づいて、粗製
アミラーゼ阻害物質をアスペルギルス・オリゼー由来の
該分子量３５０００〜４５０００、特に４００００のプ
ロテアーゼで処理したところ、アミラーゼ阻害物質中に
含まれるトリプシン阻害物質や夾雑蛋白質がまず最初に
優先的に分解されて低分子化され、その一方でアミラー
ゼ阻害物質が分解されないため、その処理物から分解に
より生じた低分子化物を除去すると、トリプシン阻害物
質や夾雑蛋白質の含有量が大幅に低減された、アミラー
ゼ阻害物質の含有量の極めて多い、高純度のアミラーゼ
阻害物質を簡単な操作で生産性良く調製することができ
た。Therefore, the present inventors have further studied variously in order to develop a method capable of preparing an amylase inhibitor having high purity and low trypsin inhibitory activity with high productivity by a simple operation. As a result, a protease having a molecular weight of 35,000 to 45,000, particularly a molecular weight of about 40,000, derived from Aspergillus oryzae, does not significantly decompose the amylase inhibitor, and the protein contained as a contaminant in the amylase inhibitor (hereinafter referred to as protein) (Referred to as "contaminating protein") can be preferentially degraded to reduce the molecular weight. Based on such findings, the crude amylase inhibitor was treated with Aspergillus oryzae-derived protease having a molecular weight of 35,000 to 45,000, particularly 40,000, and the trypsin inhibitor and contaminating proteins contained in the amylase inhibitor were firstly found. The amylase inhibitor is not degraded preferentially, while the amylase inhibitor is not degraded, so if the degraded product produced by the degradation is removed from the processed product, the content of trypsin inhibitor and contaminating protein will be greatly increased A high-purity amylase inhibitor having a reduced amylase inhibitor content and an extremely high content could be prepared with a simple operation with high productivity.

【００１０】さらに、本発明者らは、上記の研究の一環
として、アスペルギルス・オリゼー由来の分子量３５０
００〜４５０００のプロテアーゼと共にトリプシンを用
いてアミラーゼ阻害物質の処理を行ったところ、該プロ
テアーゼ処理によって完全に分解されずに場合により少
量残存しているトリプシン阻害物質がトリプシンにてブ
ロックされてそのトリプシン阻害活性がなくなって、ト
リプシン阻害活性の極めて低い、高純度のアミラーゼ阻
害物質を調製することができた。[0010] Further, the present inventors, as part of the above-mentioned research, have a molecular weight of 350 from Aspergillus oryzae.
When the amylase inhibitor was treated with trypsin together with the protease of No. 00 to 45000, the trypsin inhibitor which was not completely decomposed by the protease treatment and possibly remained in a small amount was blocked by trypsin to inhibit its trypsin inhibition. The activity was lost, and a high-purity amylase inhibitor having extremely low trypsin inhibitory activity could be prepared.

【００１１】したがって、本発明は、粗製アミラーゼ阻
害物質を、アスペルギルス・オリゼー由来の分子量３５
０００〜４５０００のプロテアーゼで処理することを特
徴とする、アミラーゼ阻害物質の含有量が多く、且つト
リプシン阻害活性の低い、高純度アミラーゼ阻害物質の
調製方法である。[0011] Accordingly, the present invention provides a crude amylase inhibitor having a molecular weight of 35 from Aspergillus oryzae.
A process for preparing a high-purity amylase inhibitor having a high amylase inhibitor content and a low trypsin inhibitory activity, characterized by treating with 000 to 45000 protease.

【００１２】さらに、本発明は、前記したアスペルギル
ス・オリゼー由来の分子量３５０００〜４５０００のプ
ロテアーゼで処理する方法に加えてトリプシンで処理す
ることを特徴とする、高純度アミラーゼ阻害物質の調製
方法である。そして、本発明のこれらの方法による場合
は、夾雑蛋白質がアスペルギルス・オリゼー由来の分子
量３５０００〜４５０００のプロテアーゼで分解されて
低分子化されるのでそれを適当な方法でアミラーゼ阻害
物質から分離・除去し、さらに系に残存しているトリプ
シン阻害物質をトリプシンで不活化してそのトリプシン
阻害活性を消失または低減させることによって、アミラ
ーゼ阻害活性の高い高純度のアミラーゼ阻害物質が好ま
しく調製される。Further, the present invention provides a method for preparing a high-purity amylase inhibitor, which comprises treating with trypsin in addition to the above-mentioned method of treating with Aspergillus oryzae-derived protease having a molecular weight of 35,000 to 45,000. According to these methods of the present invention, the contaminating protein is degraded by Aspergillus oryzae-derived protease having a molecular weight of 35,000 to 45,000 to be reduced in molecular weight. Therefore, it is separated and removed from the amylase inhibitor by an appropriate method. Further, by inactivating the trypsin inhibitor remaining in the system with trypsin to eliminate or reduce the trypsin inhibitory activity, a high-purity amylase inhibitor having high amylase inhibitory activity is preferably prepared.

【００１３】そして、本発明は、上記の調製方法で得ら
れる高純度アミラーゼ阻害物質を包含する。[0013] The present invention includes a high-purity amylase inhibitor obtained by the above-mentioned preparation method.

【００１４】[0014]

【発明の実施の形態】以下に本発明について詳細に説明
する。本発明でいう粗製アミラーゼ阻害物質とは、アミ
ラーゼ阻害物質と共にトリプシン阻害物質やその他の夾
雑蛋白質を含有するアミラーゼ阻害物質を言う。本発明
で用いる粗製アミラーゼ阻害物質は特に制限されず、ア
ミラーゼ阻害物質と共に夾雑蛋白質を含有するものであ
ればいずれでもよく、例えば粗製アミラーゼ阻害物質の
製造方法、粗製アミラーゼ阻害物質におけるアミラーゼ
阻害物質の含有量（粗製アミラーゼ阻害物質の純度）、
粗製アミラーゼ阻害物質に含まれる夾雑蛋白質の種類や
含有量などは特に制限されない。例えば、本発明で用い
る粗製アミラーゼ阻害物質が低純度（アミラーゼ阻害物
質含有量が低い）ものである場合には、本発明の方法を
行うことによって、それよりもアミラーゼ阻害物質含有
率の高いアミラーゼ阻害物質を調製することができ、ま
た本発明で用いる粗製アミラーゼ阻害物質が比較的純度
の高いもの（アミラーゼ阻害物質の含有率の高いもの）
である場合には、本発明の方法を行うことによって純度
の一層高い（アミラーゼ阻害物質の含量量の一層多い）
アミラーゼ阻害物質を得ることができる。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described below in detail. The crude amylase inhibitor referred to in the present invention refers to an amylase inhibitor containing a trypsin inhibitor and other contaminating proteins together with the amylase inhibitor. The crude amylase inhibitor used in the present invention is not particularly limited, and any one may be used as long as it contains contaminating proteins together with the amylase inhibitor.For example, a method for producing a crude amylase inhibitor, the inclusion of an amylase inhibitor in a crude amylase inhibitor Amount (purity of crude amylase inhibitor),
The type and content of the contaminating protein contained in the crude amylase inhibitor are not particularly limited. For example, when the crude amylase inhibitor used in the present invention has low purity (low amylase inhibitor content), the method of the present invention allows the amylase inhibitor having a higher amylase inhibitor content to be obtained. The substance can be prepared, and the crude amylase inhibitor used in the present invention has relatively high purity (high amylase inhibitor content)
, The higher purity (the higher the content of the amylase inhibitor) by performing the method of the present invention.
Amylase inhibitors can be obtained.

【００１５】そのうちでも、本発明の方法では、粗製ア
ミラーゼ阻害物質として小麦に由来するものが好ましく
用いられる。何ら限定されるものではないが、本発明で
好ましく用いられる小麦由来の粗製アミラーゼ阻害物質
としては、例えば、上記した特開平５−３０１８９８号
公報に記載されている方法で得られる粗製アミラーゼ阻
害物質、特開平７−４８２６８号公報、特開平７−４８
４００号公報、特開平７−４１４９９号公報、特願平８
−２３４４６号などに記載されている粗製アミラーゼ阻
害物質などをあげることができる。Among them, in the method of the present invention, those derived from wheat are preferably used as crude amylase inhibitors. Although not particularly limited, examples of the wheat-derived crude amylase inhibitor preferably used in the present invention include a crude amylase inhibitor obtained by the method described in JP-A-5-301898 described above, JP-A-7-48268, JP-A-7-48
No. 400, JP-A-7-41499, Japanese Patent Application No. 8
And crude amylase inhibitors described in JP-A-23446 and the like.

【００１６】また、本発明で用いる粗製アミラーゼ阻害
物質、および本発明の調製方法により得られる高純度ア
ミラーゼ阻害物質中には、１種のアミラーゼ阻害物質の
みが含まれていても、または２種以上のアミラーゼ阻害
物質が含まれていてもよい。 例えば、小麦由来のアミラーゼ阻害物質には、Davis ら
の方法（Annals New York Academy of Science，121，
ｐ404，1985）に準じて、ポリアクリルアミド電気泳動
にかけたときに、移動度約０．１９の位置にバンドとし
て現れる分子量約２４０００の蛋白質（以下これを
「０．１９ＡＩ」ということがある）、移動度約０．２
６の位置にバンドとして現れる蛋白質（以下これを
「０．２６ＡＩ」ということがある）、移動度０．２８
の位置にバンドとして現れる蛋白質（以下これを「０．
２８ＡＩ」ということがある）、移動度０．５３の位置
にバンドとして現れる蛋白質（以下これを「０．５３Ａ
Ｉ」ということがある）（前記した０．１９ＡＩ、０．
２６ＩＡ、０．２８ＡＩ、０．５３ＡＩのアミノ酸配列
については特開平７−４１４９９号公報を参照）、移動
度約０．２６の位置にバンドとして現れるが上記した
０．２６ＡＩよりも２残基欠落したアミノ酸配列を有す
る蛋白質（特願平８−２３４４６号参照）などがあり、
本発明で用いる粗製アミラーゼ阻害物質および本発明の
調製方法で得られる粗製アミラーゼ阻害物質は、上記し
たアミラーゼ阻害物質のうちの１種のみを含有していて
も、または２種以上を含有していてもよい。The crude amylase inhibitor used in the present invention and the high-purity amylase inhibitor obtained by the preparation method of the present invention may contain only one kind of amylase inhibitor or two or more kinds thereof. Amylase inhibitor may be contained. For example, amylase inhibitors derived from wheat include the method of Davis et al. (Annals New York Academy of Science, 121,
p. 404, 1985), a protein having a molecular weight of about 24000 (hereinafter sometimes referred to as "0.19 AI") appears as a band at a mobility of about 0.19 when subjected to polyacrylamide electrophoresis. Degree about 0.2
Protein appearing as a band at position 6 (hereinafter sometimes referred to as “0.26 AI”), mobility 0.28
Protein appearing as a band at the position (hereinafter referred to as “0.
28AI), and a protein appearing as a band at a mobility of 0.53 (hereinafter referred to as “0.53A”).
I ") (0.19 AI, 0.
Regarding the amino acid sequences of 26IA, 0.28AI, and 0.53AI, see JP-A-7-41499), a band appears at a mobility of about 0.26, but two residues are missing from the above-mentioned 0.26AI. Proteins having an amino acid sequence (see Japanese Patent Application No. 8-23446);
The crude amylase inhibitor used in the present invention and the crude amylase inhibitor obtained by the preparation method of the present invention may contain only one of the above-mentioned amylase inhibitors, or may contain two or more thereof. Is also good.

【００１７】アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus
oryzae）は、複数種のプロテアーゼを産生するが、本発
明でそれらのプロテアーゼのうちで、分子量が３５００
０〜４５０００の範囲にあるプロテアーゼ、特に分子量
が約４００００のプロテアーゼを用いることが必要であ
る。本発明で用いる分子量３５０００〜４５０００の範
囲のプロテアーゼ、特に分子量約４００００のプロテア
ーゼは、上記したように、アミラーゼ阻害物質に対する
分解作用が小さく、その一方でアミラーゼ阻害物質（特
に小麦由来のアミラーゼ阻害物質）以外の夾雑蛋白質に
対する分解作用が大きくて、該夾雑蛋白質を優先的に分
解するという性質を有している。そのため、アミラーゼ
阻害物質と夾雑蛋白質を含有する粗製アミラーゼ阻害物
質に対してこのプロテアーゼを作用させると、アミラー
ゼ阻害物質以外の夾雑蛋白質が最初に優先的に分解され
て低分子化され、その低分子化物を適当な方法でアミラ
ーゼ阻害物質から分離・除去することによって、高純度
のアミラーゼ阻害物質を得ることができる。Aspergillus oryzae
oryzae) produces a plurality of proteases, and in the present invention, among those proteases, the molecular weight is 3500.
It is necessary to use proteases in the range of 0 to 45000, especially those having a molecular weight of about 40,000. As described above, the protease having a molecular weight of 35,000 to 45,000 used in the present invention, particularly a protease having a molecular weight of about 40,000 has a small decomposing effect on an amylase inhibitor, while an amylase inhibitor (especially an amylase inhibitor derived from wheat). It has a large degrading effect on other contaminating proteins, and has the property of degrading the contaminating proteins preferentially. Therefore, when this protease is allowed to act on a crude amylase inhibitor containing an amylase inhibitor and a contaminant protein, contaminant proteins other than the amylase inhibitor are first preferentially degraded and reduced in molecular weight, and Can be separated and removed from the amylase inhibitor by an appropriate method to obtain a high-purity amylase inhibitor.

【００１８】ここで、本発明でいうアスペルギルス・オ
リゼー由来のプロテアーゼの「分子量３５０００〜４５
０００」とは、アスペルギルス・オリゼー由来の酵素を
含む原料（酵素製剤等）を緩衝液に溶解し、これをゲル
濾過カラムにかけてクロマトグラフィーを行い、その溶
出液の各フラクションごとの酵素活性（蛋白質分解活
性）を調べ、アミラーゼ阻害物質に対しては分解能が低
く他の蛋白質に対しては分解能の高いフラクションを選
び出し、前記で選び出したフラクションをＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて、
分子量既知の蛋白質混合物との関係から求められた分子
量であり、その詳細については下記の実施例の項で説明
するとおりである。Here, the protease of Aspergillus oryzae referred to in the present invention has a "molecular weight of 35,000-45.
"000" means that a raw material (enzyme preparation, etc.) containing an enzyme derived from Aspergillus oryzae is dissolved in a buffer solution, which is subjected to chromatography on a gel filtration column, and the enzymatic activity of each fraction of the eluate (protein degradation) Activity), fractions with low resolution for amylase inhibitors and high resolution for other proteins were selected, and the fractions selected above were subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE).
It is a molecular weight determined from the relationship with a protein mixture of a known molecular weight, the details of which are as described in the Examples section below.

【００１９】アスペルギルス・オリゼー由来の分子量３
５０００〜４５０００のプロテアーゼ（以下これを
「Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼ」ということがあ
る）は、純品でも、またはＡ.oryzae由来４０Ｋプロテ
アーゼと本発明の目的にかなう悪影響のない他の酵素
（プロテアーゼ）との混合物でもよい。Ａ.oryzae由来
４０Ｋプロテアーゼを含有する酵素製剤は既に色々市販
されており、例えばスミチームＬＰ（新日本化学工業株
式会社製）、デナチームＡＰ（ナガセ生化学工業株式会
社製）、プロテアーゼＡ（天野製薬株式会社製）などを
挙げることができ、本発明ではそれらのいずれもが使用
できる。Molecular weight derived from Aspergillus oryzae 3
The 5000 to 45000 protease (hereinafter sometimes referred to as “A.oryzae-derived 40K protease”) may be a pure product or another enzyme (protease which does not adversely affect A.oryzae-derived 40K protease for the purpose of the present invention). )). A variety of enzyme preparations containing A. oryzae-derived 40K protease are already commercially available. And the like, and any of them can be used in the present invention.

【００２０】粗製アミラーゼ阻害物質を、Ａ.oryzae由
来４０Ｋプロテアーゼで処理して夾雑蛋白質を分解する
に当たっては、粗製アミラーゼ阻害物質を水、水／アル
コール混合液などに溶解または分散させ、液のｐＨを３
〜５に調整し、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを添
加して４０〜６０℃程度の温度で粗製アミラーゼ阻害物
質中に含まれる夾雑蛋白質の分解を行う方法が好ましく
用いられる。その場合に、粗製アミラーゼ阻害物質は濃
度が約０．０１〜３０重量％程度の水溶液または分散液
にしてＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼで処理するの
が、夾雑蛋白質の分解が円滑に行われると共に、トリプ
シン阻害物質も大幅に低減される。また、上記のｐＨ調
整は無機酸および／または有機酸のいずれを用いて行っ
てもよく、一般的には塩酸、クエン酸、リン酸、乳酸な
どを用いて行うのが安全性の点から好ましい。In treating the crude amylase inhibitor with 40K protease derived from A. oryzae to decompose contaminating proteins, the crude amylase inhibitor is dissolved or dispersed in water, a water / alcohol mixture or the like, and the pH of the solution is adjusted. 3
It is preferably used a method in which the concentration is adjusted to 5 and A. oryzae-derived 40K protease is added to decompose contaminating proteins contained in the crude amylase inhibitor at a temperature of about 40 to 60 ° C. In this case, the crude amylase inhibitor is prepared as an aqueous solution or dispersion having a concentration of about 0.01 to 30% by weight and treated with 40K protease derived from A. oryzae. Trypsin inhibitors are also greatly reduced. In addition, the above pH adjustment may be performed using any of an inorganic acid and / or an organic acid, and it is generally preferable to perform the pH adjustment using hydrochloric acid, citric acid, phosphoric acid, lactic acid, or the like from the viewpoint of safety. .

【００２１】一般的な酵素処理では、酵素添加量と酵素
反応時間は深く関係しており、酵素量が多い場合は反応
時間が短くなり、一方酵素量が少ない場合は反応時間が
長くなることが知られている。したがって、本発明にお
いても、添加するＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼの
量に応じて反応時間を調節することが必要であり、Ａ.o
ryzae由来４０Ｋプロテアーゼの添加量が多い場合は反
応時間を短くし、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼの
添加量が少ない場合は反応時間を長くするのがよい。ま
た、使用する酵素製剤中におけるＡ.oryzae由来４０Ｋ
プロテアーゼの含有量、粗製アミラーゼ阻害物質中に含
まれる夾雑蛋白質の量などによっても反応時間を調節す
る必要がある。そのため、粗製アミラーゼ阻害物質に対
するＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼの添加量および
反応時間は一概には決められないが、一般的には粗製ア
ミラーゼ阻害物質（基質蛋白質）の全重量に基づいて
Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを含有する酵素製剤
を０．１〜５重量％の割合で添加して、１〜２４時間の
反応時間で夾雑蛋白質の分解処理を行うのが好ましい。In general enzyme treatment, the amount of enzyme added and the reaction time of the enzyme are closely related. When the amount of enzyme is large, the reaction time is short, while when the amount of enzyme is small, the reaction time is long. Are known. Therefore, also in the present invention, it is necessary to adjust the reaction time according to the amount of A.oryzae-derived 40K protease to be added.
When the amount of 40K protease derived from ryzae is large, the reaction time should be shortened, and when the amount of 40K protease derived from A. oryzae is small, the reaction time should be long. In addition, 40K derived from A. oryzae in the enzyme preparation used
The reaction time also needs to be adjusted depending on the protease content, the amount of contaminating proteins contained in the crude amylase inhibitor, and the like. Therefore, the amount of A.oryzae-derived 40K protease added to the crude amylase inhibitor and the reaction time cannot be determined unconditionally, but generally, the amount of A.oryzae-derived 40K protease is determined based on the total weight of the crude amylase inhibitor (substrate protein). It is preferable that an enzyme preparation containing 40K protease is added at a ratio of 0.1 to 5% by weight, and degradation of contaminating proteins is performed in a reaction time of 1 to 24 hours.

【００２２】そして、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアー
ゼを用いて粗製アミラーゼ阻害物質の分解処理を行う
と、反応の初期の段階ではアミラーゼ阻害物質は分解さ
れずに粗製アミラーゼ阻害物質中に含まれている夾雑蛋
白質が優先的に分解されるが、反応が進行して夾雑蛋白
質の量が少なくなるとアミラーゼ阻害物質自体の分解も
生ずるようになる。そのため、アミラーゼ阻害物質を高
純度で且つ高収率で得るためには、アミラーゼ阻害物質
の分解が大きくならない段階で反応を停止する必要があ
る。一般には、被処理物のアミラーゼ阻害活性が、最初
のアミラーゼ阻害活性（Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテア
ーゼによる分解処理を行う前の粗製アミラーゼ阻害物質
のアミラーゼ阻害活性）の８５〜９５％程度になった時
点で分解反応を停止させると、夾雑蛋白質の殆どが分解
されて純度が高くなり、しかもアミラーゼ阻害物質の分
解を防止できるために、高純度のアミラーゼ阻害物質を
高収率（高歩留り）で得ることができる。被処理物のア
ミラーゼ阻害活性が最初のアミラーゼ阻害活性の８５％
よりも低くなるまで分解処理を行うと、純度は高くなる
が、アミラーゼ阻害物質の歩留りが低くなる。適当な反
応終点を求めるに当たっては、粗製アミラーゼ阻害物質
（被処理物）中に含まれる、特定のアミラーゼ阻害物質
（例えば０．１９ＡＩ）に着目し、それを指標としてそ
のアミラーゼ阻害物質の被処理物中における含有量（減
少程度）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）な
どによって調べることによって行うことができる。When the crude amylase inhibitor is decomposed by using 40K protease derived from A. oryzae, the amylase inhibitor is not decomposed in the initial stage of the reaction, and the impurities contained in the crude amylase inhibitor are not decomposed. Proteins are preferentially degraded, but as the reaction proceeds and the amount of contaminating proteins decreases, degradation of the amylase inhibitor itself also occurs. Therefore, in order to obtain an amylase inhibitor with high purity and high yield, it is necessary to stop the reaction at a stage where the decomposition of the amylase inhibitor does not increase. Generally, when the amylase inhibitory activity of the substance to be treated reaches about 85 to 95% of the first amylase inhibitory activity (amylase inhibitory activity of the crude amylase inhibitor before the degradation treatment with A. oryzae-derived 40K protease) When the degradation reaction is stopped, most of the contaminating proteins are degraded to increase the purity, and the degradation of the amylase inhibitor can be prevented, so that a high-purity amylase inhibitor can be obtained in a high yield (high yield). Can be. The amylase inhibitory activity of the material to be treated is 85% of the initial amylase inhibitory activity
When the decomposition treatment is performed to a lower level, the purity increases, but the yield of the amylase inhibitor decreases. In determining an appropriate reaction end point, attention is paid to a specific amylase inhibitor (for example, 0.19 AI) contained in the crude amylase inhibitor (the substance to be treated), and the substance to be treated with the amylase inhibitor is used as an index. It can be performed by examining the content (degree of decrease) in the medium by high performance liquid chromatography (HPLC) or the like.

【００２３】粗製アミラーゼ阻害物質の分解反応が所定
の状態に達した段階で、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテア
ーゼを失活させて反応を停止させる。酵素の失活は一般
に加熱により行うことができる。加熱温度が高すぎたり
加熱時間が長すぎると、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテア
ーゼの失活のみならずアミラーゼ阻害物質のアミラーゼ
阻害活性も低下するので、一般には、７０〜８５℃の温
度で１０〜６０分間程度の加熱を行ってＡ.oryzae由来
４０Ｋプロテアーゼを失活させるのがよい。When the decomposition reaction of the crude amylase inhibitor reaches a predetermined state, the 40K protease derived from A. oryzae is inactivated to stop the reaction. Inactivation of the enzyme can generally be performed by heating. If the heating temperature is too high or the heating time is too long, not only the inactivation of A. oryzae-derived 40K protease but also the amylase inhibitory activity of the amylase inhibitor decreases, so that the temperature is generally 10 to 60 ° C. at a temperature of 70 to 85 ° C. It is preferable to inactivate the A. oryzae-derived 40K protease by heating for about a minute.

【００２４】次いで、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアー
ゼによる分解処理によって低分子化された夾雑物をアミ
ラーゼ阻害物質から分離して除去する。夾雑物の分離法
としては、アミラーゼ阻害物質から低分子化された夾雑
物を円滑に分離できる方法であればいずれも採用でき特
に制限されない。そのうちでも、限界濾過膜を使用して
行うと夾雑物の分離・除去が円滑に行われるので望まし
い。その場合の限外濾過膜のポアサイズは、分子量１０
０００以下から２００００以下のものが分離できるよう
なサイズであるのが好ましい。Next, impurities reduced in molecular weight by a decomposition treatment with A. oryzae-derived 40K protease are separated and removed from the amylase inhibitor. As a method for separating contaminants, any method capable of smoothly separating low-molecular-weight contaminants from an amylase inhibitor can be used, and is not particularly limited. Among them, it is desirable to use an ultrafiltration membrane because separation and removal of impurities can be performed smoothly. In this case, the pore size of the ultrafiltration membrane is 10
It is preferable that the size is such that those having a size of 000 or less to 20,000 or less can be separated.

【００２５】そして、上記で夾雑物を除去した後に残留
するアミラーゼ阻害物質を含有する液を乾燥することに
よって目的とする高純度のアミラーゼ阻害物質を粉末な
どの固形状で高収率で得ることができる。その際の乾燥
処理は、例えば凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥などによ
って行うことができる。また、乾燥をいわゆるボール乾
燥法によって行ってもよく、ボール乾燥法による場合
は、アミラーゼ阻害物質を含有する液をボール表面に被
覆してボールを流動状態や転動状態で乾燥することによ
って、ボール表面に形成されたアミラーゼ阻害物質の被
覆層が乾燥してボール表面から剥離して分離・回収され
る。Then, by drying the solution containing the amylase inhibitor remaining after removing the contaminants as described above, the desired high-purity amylase inhibitor can be obtained in a solid form such as a powder in a high yield. it can. The drying process at that time can be performed by, for example, freeze drying, reduced pressure drying, spray drying, or the like. Further, drying may be performed by a so-called ball drying method. In the case of the ball drying method, a ball containing a solution containing an amylase inhibitor is coated on the ball surface and the ball is dried in a flowing state or a rolling state. The coating layer of the amylase inhibitor formed on the surface is dried, peeled off from the ball surface, and separated and collected.

【００２６】上記した処理を行うことによって、例え
ば、処理を行う前の粗製アミラーゼ阻害物質中における
０．１９ＡＩの含有量が２５重量％程度であったのが、
処理後には０．１９ＡＩの含有量が約４５重量％以上に
も達するような、高純度のアミラーゼ阻害物質を簡単な
操作で、円滑に得ることができる。しかも、その際にト
リプシン阻害物質もＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼ
によって分解されて低分子化されるために、最終的に得
られるアミラーゼ阻害物質におけるトリプシン阻害物質
含有量（トリプシン阻害活性）も大幅に低減されたもの
となっている。By performing the above-mentioned treatment, for example, the content of 0.19 AI in the crude amylase inhibitor before the treatment was about 25% by weight.
After the treatment, a high-purity amylase inhibitor having a 0.19 AI content of about 45% by weight or more can be smoothly obtained by a simple operation. Moreover, at this time, the trypsin inhibitor is also degraded by A. oryzae-derived 40K protease and is reduced in molecular weight, so that the trypsin inhibitor content (trypsin inhibitory activity) in the finally obtained amylase inhibitor is greatly reduced. It has been done.

【００２７】さらに、本発明において、Ａ.oryzae由来
４０Ｋプロテアーゼを用いる上記した処理方法におい
て、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼと共にさらにト
リプシンを用いて処理を行うと、トリプシン阻害活性の
一層低減された、高純度アミラーゼ阻害物質を高収率で
得ることができる。すなわち、Ａ.oryzae由来４０Ｋプ
ロテアーゼを用いる分解処理においても、Ａ.oryzae由
来４０Ｋプロテアーゼの添加量を多くしたり、処理時間
を長くすれば、トリプシン阻害物質の分解をも完全に行
うことができてトリプシン阻害物質の含有量の極めて少
ないアミラーゼ阻害物質を得ることができるが、その場
合にはアミラーゼ阻害物質の分解も生じて、アミラーゼ
阻害物質の収率が低くなり易い。Furthermore, in the present invention, in the above-mentioned treatment method using A. oryzae-derived 40K protease, when the treatment is further carried out with trypsin together with A. oryzae-derived 40K protease, the trypsin inhibitory activity is further reduced. Purified amylase inhibitors can be obtained in high yield. That is, in the degradation treatment using A. oryzae-derived 40K protease, if the addition amount of A. oryzae-derived 40K protease is increased or the treatment time is extended, the trypsin inhibitor can be completely degraded. An amylase inhibitor having an extremely low content of a trypsin inhibitor can be obtained, but in that case, the amylase inhibitor is also decomposed, and the yield of the amylase inhibitor tends to be low.

【００２８】また、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼ
と共にトリプシンを用いて粗製アミラーゼ阻害物質の処
理を行う本発明のこの第２の方法を採用する場合は、ア
ミラーゼ阻害物質を高収率で得るためにトリプシン阻害
物質の分解が完全に行われない段階で夾雑蛋白質の分解
処理を停止させても、そのときに反応系に残存している
トリプシン阻害物質のトリプシン阻害活性をトリプシン
によって消失または低減させることができるので、最終
的に得られるアミラーゼ阻害物質中におけるトリプシン
阻害活性が極めて低いものとなっている。その理由は明
確ではないが、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼと共
にトリプシンを用いることによって、分解されないで残
存しているトリプシン阻害物質が何らかの形態でトリプ
シンと複合体を形成してそのトリプシン阻害活性を失う
ことによるものと推定される。When this second method of the present invention, in which the crude amylase inhibitor is treated using trypsin together with 40K protease derived from A. oryzae, is employed, the trypsin is used in order to obtain the amylase inhibitor in high yield. Even if the degradation treatment of the contaminating protein is stopped at the stage where the inhibitor is not completely degraded, the trypsin inhibitory activity of the trypsin inhibitor remaining in the reaction system at that time can be eliminated or reduced by trypsin. Therefore, the trypsin inhibitory activity in the finally obtained amylase inhibitor is extremely low. Although the reason is not clear, the use of trypsin together with A. oryzae-derived 40K protease causes the remaining trypsin inhibitor that is not degraded to form a complex with trypsin in some form and loses its trypsin inhibitory activity. It is presumed to be due to

【００２９】Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼと共に
トリプシンを用いる場合は、トリプシンとして純品を使
用しても、または他のものとの混合物を使用してもよ
く、トリプシン含有製剤の調製法、由来などは何ら制限
されない。コストの点からは、純品（試薬）に比べて安
価な、トリプシンを含有する酵素製剤が好ましく、例え
ば、ＰＴＮ３.０ Ｓ（ノボノルディスクバイオインダス
トリー社製）などのような市販の酵素製剤を用いること
ができる。When trypsin is used together with 40K protease derived from A. oryzae, a pure product may be used as trypsin, or a mixture with trypsin may be used. There is no restriction. From the viewpoint of cost, an enzyme preparation containing trypsin, which is cheaper than a pure product (reagent), is preferable. For example, a commercially available enzyme preparation such as PTN3.0S (manufactured by Novo Nordisk Bioindustry) may be used. Can be used.

【００３０】そして、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアー
ゼと共にトリプシンを用いる本発明のこの第２の方法に
よる場合は、トリプシンに比べて一般に安価に入手でき
るＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼがアミラーゼ阻害
物質中に含まれるトリプシン阻害物質の大半を分解して
アミラーゼ阻害物質中のトリプシン阻害物質の含有量を
大幅に低減できるので、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテア
ーゼを用いずにトリプシンのみを使用してアミラーゼ阻
害物質中に含まれるトリプシン阻害物質のトリプシン阻
害活性を低減させる場合に比べて、高価なトリプシンの
使用量を大幅に低減することができ、それによって有害
なトリプシン阻害物質の含有量の極めて少ない、高純度
のアミラーゼ阻害物質を、高収率に且つ低コストで得る
ことができる。According to the second method of the present invention using trypsin together with A.oryzae-derived 40K protease, the A.oryzae-derived 40K protease which is generally available at a lower cost than trypsin is contained in the amylase inhibitor. Most of the trypsin inhibitor can be decomposed to greatly reduce the content of the trypsin inhibitor in the amylase inhibitor, so that the trypsin inhibitor is contained in the amylase inhibitor using only trypsin without using the 40K protease derived from A. oryzae. Compared with the case of reducing the trypsin inhibitory activity of trypsin inhibitor, the amount of expensive trypsin used can be significantly reduced, whereby the content of harmful trypsin inhibitor is very small, high-purity amylase inhibitor Can be obtained in high yield and at low cost.

【００３１】Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼとトリ
プシンを用いて粗製アミラーゼ阻害物質の処理を行うに
当たっては、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼおよび
トリプシンは、粗製アミラーゼ阻害物質を含有する上記
した水性溶液または分散液に同時に添加しても、または
別々に添加してもよい。そのうちでも、粗製アミラーゼ
阻害物質を含有する水性溶液または水性分散液に、Ａ.o
ryzae由来４０Ｋプロテアーゼを最初に添加してＡ.oryz
ae由来４０Ｋプロテアーゼによる夾雑蛋白質の分解処理
を行った後に、トリプシンを添加して処理を行うと、両
酵素の機能を充分に発揮させることができるので望まし
い。In treating the crude amylase inhibitor using A. oryzae-derived 40K protease and trypsin, the A. oryzae-derived 40K protease and trypsin are treated with the above-mentioned aqueous solution or dispersion containing the crude amylase inhibitor. They may be added simultaneously or separately. Among them, an aqueous solution or an aqueous dispersion containing a crude amylase inhibitor contains A.o.
A.oryz was first added with 40K protease from ryzae.
It is desirable to carry out the treatment by adding trypsin after decomposing the contaminating protein with the ae-derived 40K protease, since the functions of both enzymes can be sufficiently exhibited.

【００３２】本発明の適当な高純度アミラーゼ阻害物質
の製造法としては、例えば、ｐＨを３〜５に調整した粗
製アミラーゼ阻害物質を含有する水性溶液または分散液
にＡ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼを添加し、４０〜
６０℃の温度で夾雑蛋白質の分解処理を行い（好ましく
は被処理物のアミラーゼ阻害活性が最初の８５〜９５％
程度になるまで分解処理を行い）、反応終了後に液のｐ
Ｈを７．５〜９に調整してトリプシンを加えて同温度で
１０〜６０分間トリプシンと反応させ、次いで液のｐＨ
を再度３〜５に調整して７０〜８５℃の温度で１０〜６
０分間加熱処理して酵素を失活させると、高純度のアミ
ラーゼ阻害物質を高い収率で得ることができる。また、
他の態様として、Ａ.oryzae由来４０Ｋプロテアーゼと
トリプシンとを前記粗製アミラーゼ阻害物質を含有する
水性溶液または水性分散液にはじめに加えて、前記と同
様に処理してもよい。As a method for producing a suitable high-purity amylase inhibitor of the present invention, for example, A. oryzae-derived 40K protease is added to an aqueous solution or dispersion containing a crude amylase inhibitor whose pH has been adjusted to 3 to 5. And 40 ~
Decompose the contaminating protein at a temperature of 60 ° C. (preferably, the amylase inhibitory activity of the substance to be treated is 85 to 95% of the initial value
Decomposition treatment is performed until the reaction reaches the
H was adjusted to 7.5 to 9 and trypsin was added and reacted with trypsin at the same temperature for 10 to 60 minutes.
Is adjusted again to 3-5, and at a temperature of 70-85 ° C., 10-6
When the enzyme is inactivated by heat treatment for 0 minutes, a high-purity amylase inhibitor can be obtained in a high yield. Also,
In another embodiment, A. oryzae-derived 40K protease and trypsin may be first added to the aqueous solution or aqueous dispersion containing the crude amylase inhibitor and treated in the same manner as described above.

【００３３】そして、上記したいずれの場合にも、酵素
を失活させた後の液を、分子量２００００万以下のも
の、特に望ましくは分子量１００００〜２００００のも
のを分離できるようなポアサイズを有する限界濾過膜に
よって濾過して夾雑物を分離・除去し、次いで乾燥する
ことによってアミラーゼ阻害物質含有率が高く且つトリ
プシン阻害活性の低い、高純度アミラーゼ阻害物質を粉
末などの固形状で高収率で得ることができる。In any of the above cases, the solution after deactivating the enzyme is subjected to ultrafiltration having a pore size capable of separating a liquid having a molecular weight of not more than 200,000,000, particularly preferably a liquid having a molecular weight of 10,000 to 20,000. Filtration through a membrane to separate and remove contaminants, followed by drying to obtain a high-purity amylase inhibitor having a high amylase inhibitor content and a low trypsin inhibitory activity in a solid form such as a powder in a high yield. Can be.

【００３４】本発明により得られるアミラーゼ阻害物質
は、特に体内におけるアミラーゼ阻害物質のアミラーゼ
阻害活性の妨害や膵臓の肥大や膵臓癌の発生の原因とも
なるトリプシン阻害活性が極めて少ないために、膵液中
に含まれるアミラーゼに対する阻害活性が高くて、イン
シュリンの分泌抑制に有効であり、米飯のように加熱調
理された澱粉の消化抑制、すなわち糖への分解抑制に対
して高い効果があり、しかも膵臓の肥大や膵臓癌の発生
の危険が少ない。The amylase inhibitor obtained according to the present invention has a very small amount of trypsin inhibitory activity, which is a cause of inhibiting the amylase inhibitory activity of the amylase inhibitor in the body, causing enlargement of the pancreas and the occurrence of pancreatic cancer. It has a high inhibitory activity against amylase contained, is effective in suppressing insulin secretion, has a high effect on suppressing digestion of starch cooked like cooked rice, that is, has a high effect on suppressing decomposition into sugar, and also has an enlarged pancreas. And the risk of pancreatic cancer is low.

【００３５】本発明により得られるアミラーゼ阻害物質
は、そのままで、または公知の担体や助剤等を使用して
液剤、顆粒剤、錠剤等の形態にして血糖値上昇抑制剤お
よび／またはインシュリン分泌調節剤として用いること
ができる。更に、食品、特に澱粉質を多く含むパン、ク
ッキー等の炭水化物系食品に添加して使用したり、お茶
類、スープ類、ふりかけやバター、ジャム等のスプレッ
ド類に添加して使用することができる。該アミラーゼ阻
害物質の投与量や食品への添加量は、投与される対象の
状態、症状、食品の種類やその摂取量等に応じて適宜調
節することができ、例えば食品に添加して摂取する場合
は、一回の食事当たりの該アミラーゼ阻害物質の摂取量
を約０．１〜２０ｇ、好ましくは約０．４〜８ｇの範囲
にするのがよい。The amylase inhibitor obtained according to the present invention may be used as it is or in the form of a liquid, granule, tablet or the like using known carriers and auxiliaries, etc., as a suppressor of blood glucose elevation and / or regulation of insulin secretion. It can be used as an agent. Furthermore, it can be used by adding to foods, especially carbohydrate-based foods such as bread and cookies containing a large amount of starch, and can be used by adding to teas, soups, sprinkles, butter, jams and other spreads. . The dose of the amylase inhibitor and the amount of the amylase inhibitor added to the food can be appropriately adjusted depending on the condition of the subject to be administered, symptoms, the type of the food, the amount of the food to be taken, and the like. In this case, the intake of the amylase inhibitor per meal may be in the range of about 0.1 to 20 g, preferably about 0.4 to 8 g.

【００３６】[0036]

【実施例】以下に本発明を実施例などにより具体的に説
明するが、本発明はそれらの例により何ら限定されな
い。以下の例において、得られた生成物中の０．１９Ａ
Ｉの含有量およびトリプシン阻害活性は下記の方法によ
り測定した。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which should not be construed as limiting the present invention. In the following example, 0.19A in the obtained product
I content and trypsin inhibitory activity were measured by the following methods.

【００３７】０．１９ＡＩの含有量：試料１００ｍｇを
０．１％トリフルオロ酢酸水溶液１００ｍｌに溶解し、
下記の表１に示す条件下に高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）に供して、クロマトグラム中の０．１９Ａ
Ｉのピーク面積を測定した。一方、０．１９ＡＩ標品
（純度１００％）１００ｍｇを同じ条件下にＨＰＬＣに
供してクロマトグラム中の０．１９ＡＩのピーク面積を
測定し、下記の数式１により試料中の０．１９ＡＩ含量
を算出した。 Content of 0.19 AI : Dissolve 100 mg of sample in 100 ml of 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution,
The sample was subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) under the conditions shown in Table 1 below to obtain 0.19A in the chromatogram.
The peak area of I was measured. On the other hand, 100 mg of a 0.19 AI standard (purity 100%) was subjected to HPLC under the same conditions, the peak area of 0.19 AI in the chromatogram was measured, and the 0.19 AI content in the sample was calculated by the following formula 1. did.

【００３８】[0038]

【表１】 ［ＨＰＬＣ条件］ カラム： 充填材：CAPCELL PAK C18 SG120A ３μｍ(資生堂社製) サイズ：４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ 温 度：５０℃ 流 速：０．５ｍｌ／分 注入量：２０μｌ 検 出：２８０ｎｍにおける吸光度 移動相： Ａ液；０．１％トリフルオロ酢酸水溶液 Ｂ液；８０％アセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢酸の水溶液 よりなる下記の時間／濃度勾配を有する高圧リニアグラジエンド溶出 時間(分) Ａ液(％) Ｂ液(％) ０．０ ６５．５ ３４．５ １５．０ ６５．５ ３４．５ １５．１ ０ １００ ２０．０ ０ １００ ２０．１ ６５．５ ３４．５ ３５．０ 停 止 [Table 1] [HPLC conditions] Column : Packing material: CAPCELL PAK C18 SG120A 3 μm (manufactured by Shiseido) Size: 4.6 mmφ × 150 mm Temperature: 50 ° C. Flow rate : 0.5 ml / min Injection volume : 20 μl Detection : absorbance at 280 nm Mobile phase : Liquid A 0.1% aqueous trifluoroacetic acid solution B; high pressure linear gradient end elution time (min) consisting of an aqueous solution of 80% acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid having the following time / concentration gradient: liquid A (%) B Liquid (%) 0.0 65.5 34.5 15.0 65.5 34.5 15.1 100 100 20.0 0 100 20.1 65.5 34.5 35.0 Stop

【００３９】[0039]

【数１】試料中の０.１９ＡＩ含量(％)＝（Ｓａ／Ｓ
ｔ）×１００ 式中、Ｓａ＝試料の０.１９ＡＩのピーク面積 Ｓｔ＝標品の０.１９ＡＩのピーク面積## EQU1 ## 0.19 AI content (%) in sample = (Sa / S
t) × 100 where Sa = peak area of 0.19 AI of sample St = peak area of 0.19 AI of sample

【００４０】トリプシン阻害活性の測定： １．試薬 （Ａ）トリス−ＨＣｌ緩衝液：２０ｍＭ塩化カルシウム
を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．２） （Ｂ）基質液：ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニ
トロアニリド（シグマ社製「Ｂ−４８７５」）２０ｍｇ
を０．５ｍｌのジメチルスルホキシドに加えて３７℃で
溶解させ、この溶液を３７℃に保温した上記（Ａ）のト
リス−塩酸緩衝液５０ｍｌに加えて基質液を調製する。 （Ｃ）トリプシン液：１ｍＭ塩酸５０ｍｌにトリプシン
（シグマ社製「Ｔ−８６４２」）１ｍｇを加えてトリプ
シン液を調製する。 （Ｄ）反応停止液：３０％酢酸。 Measurement of trypsin inhibitory activity : Reagents (A) Tris-HCl buffer: 50 mM Tris-HCl buffer containing 20 mM calcium chloride (pH 8.2) (B) Substrate solution: benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (Sigma, "B-4875") )) 20mg
Is added to 0.5 ml of dimethyl sulfoxide and dissolved at 37 ° C., and this solution is added to 50 ml of the above Tris-HCl buffer (A) kept at 37 ° C. to prepare a substrate solution. (C) Trypsin solution: 1 mg of trypsin (“T-8642” manufactured by Sigma) is added to 50 ml of 1 mM hydrochloric acid to prepare a trypsin solution. (D) Reaction stop solution: 30% acetic acid.

【００４１】２．操作 （１） 試料液４００μｌと上記（Ｃ）のトリプシン液
４００μｌを混合して３７℃で５分間プレインキュベー
トした後、３７℃に保温してある上記（Ｂ）の基質液を
１ｍｌ加えて反応を開始させる。３７℃で正確に１０分
間インキュベートした後、上記（Ｄ）の反応停止液２０
０μｌを加えて反応を停止させ、４１０ｎｍにおける吸
光度を測定し、下記の数式２および数式３によりトリプ
シン阻害活性を求める。 （２） ポジティブコントロール（Ｐ．Control）は、
試料液の代わりに蒸留水４００μｌを用いて上記（１）
と同様の操作を行う。 （３） ブランクは、試料液の代わりに蒸留水４００μ
ｌを用いて、上記の（１）において基質液を加える前に
反応停止液を加える。 （４） 試料ブランクは、上記（１）の操作において、
トリプシン液を反応停止液添加後に添加して行う。2. Procedure (1) After mixing 400 μl of the sample solution and 400 μl of the trypsin solution of the above (C) and preincubating at 37 ° C. for 5 minutes, 1 ml of the substrate solution of the above (B) kept at 37 ° C. was added to carry out the reaction. Let it start. After incubating at 37 ° C. for exactly 10 minutes, the reaction stop solution 20
The reaction is stopped by adding 0 μl, the absorbance at 410 nm is measured, and the trypsin inhibitory activity is determined by the following formulas 2 and 3. (2) Positive control (P. Control)
(1) using 400 μl of distilled water instead of the sample solution
Perform the same operation as. (3) Blank is 400μ of distilled water instead of sample solution.
Using 1), add a reaction stop solution before adding the substrate solution in the above (1). (4) In the operation of the above (1), the sample blank is
This is performed by adding a trypsin solution after the addition of the reaction stopping solution.

【００４２】３．トリプシン阻害活性の計算 ４１０ｎｍにおける吸光度をブランクを対照として測定
する。使用したトリプシン阻害物質のトリプシン阻害活
性は下記の数式２より求め、試料添加物のトリプシン阻
害活性は下記の数式３より求める。使用したトリプシン
阻害物質のトリプシン阻害活性と試料添加物におけるト
リプシン阻害活性の差を求めて、試料１ｍｇ当たりのト
リプシン阻害活性をもって、トリプシン阻害活性とす
る。3. Calculation of trypsin inhibitory activity The absorbance at 410 nm is measured using a blank as a control. The trypsin inhibitory activity of the trypsin inhibitor used is determined by the following formula 2, and the trypsin inhibitory activity of the sample additive is determined by the following formula 3. The difference between the trypsin inhibitory activity of the trypsin inhibitor used and the trypsin inhibitory activity of the sample additive is determined, and the trypsin inhibitory activity per 1 mg of the sample is defined as the trypsin inhibitory activity.

【００４３】[0043]

【数２】使用したトリプシン阻害物質のトリプシン阻害
活性（ｕ）＝｛Ｐ．Controlの410ｎｍ吸光度)／５｝×
１００The trypsin inhibitory activity of the trypsin inhibitor used (u) = シ ン P. Control 410nm absorbance) / 5 Control ×
100

【００４４】[0044]

【数３】試料添加物のトリプシン阻害活性＝｛(試料添
加物の410ｎｍ吸光度−ブランクの410ｎｍ吸光度)／
５｝×１００## EQU3 ## Trypsin inhibitory activity of sample additive = ｛(410 nm absorbance of sample additive−410 nm absorbance of blank) /
5｝ × 100

【００４５】《参考例 １》［粗製アミラーゼ阻害物質
の製造］ （１） 小麦粉８００ｋｇに水４００リットルを加え、
混練して生地を形成させた。この生地を６０００リット
ルの水を用いて洗浄して、グルテン４００ｋｇおよび小
麦澱粉５００ｋｇを回収した。その際に５７８０リット
ルの洗浄液が生じたので、この洗浄液（水抽出液）に塩
酸を加えてｐＨ３に調整し、３０分放置した後、アンモ
ニアでｐＨを６．５に調整すると不溶物が沈殿した。沈
殿を除去して上澄み液５２００リットルを回収した。 （２） 上記（１）で回収した上澄み液１００リットル
にアルギン酸ナトリウム３００ｐｐｍを加えた後、ｐＨ
を４．０に調整して生成したゲル４０リットルを回収し
た。この回収したゲル４０リットルに、カルシウム濃度
が４００ｐｐｍとなるように塩化カルシウムを加えて充
分撹拌した後、１時間放置した。次いでゲルをドラバル
型遠心分離機にかけて約１０リットルの沈殿物を回収し
た。沈殿物にさらに水３０リットルを加えて充分に撹拌
し、ドラバル型遠心分離機にかけ６．５ｋｇの沈殿物を
回収した。Reference Example 1 [Production of Crude Amylase Inhibitor] (1) 400 liters of water was added to 800 kg of flour,
The mixture was kneaded to form a dough. The dough was washed with 6000 liters of water to recover 400 kg of gluten and 500 kg of wheat starch. At that time, 5780 liters of a washing solution was generated. The washing solution (water extract) was adjusted to pH 3 by adding hydrochloric acid, and allowed to stand for 30 minutes. After adjusting the pH to 6.5 with ammonia, insoluble substances precipitated. . The precipitate was removed and 5,200 liters of the supernatant was recovered. (2) After adding 300 ppm of sodium alginate to 100 liters of the supernatant liquid collected in the above (1),
Was adjusted to 4.0, and 40 liters of the generated gel was collected. Calcium chloride was added to 40 liters of the collected gel so that the calcium concentration was 400 ppm, and the mixture was sufficiently stirred, and left for 1 hour. The gel was then centrifuged through a De Laval centrifuge to recover about 10 liters of precipitate. 30 liters of water was further added to the precipitate, and the mixture was sufficiently stirred, and then subjected to a Laval type centrifuge to collect 6.5 kg of the precipitate.

【００４６】（３） 上記（２）で回収した沈殿物６．
５ｋｇに水２５リットルを加え、カルシウム濃度が３０
００ｐｐｍとなるように塩化カルシウムを添加して充分
撹拌し、ドラバル型遠心分離機を使用して上澄み液２５
リットルを回収した。一方、この遠心分離によって沈殿
物５リットルが同時に生成したので、これに塩化カルシ
ウム水溶液（３０００ｐｐｍ）１２リットルを加えて充
分洗浄し、洗浄液をドラバル型遠心分離機を使用して回
収し、この液と前記２５リットルの上澄み液を併せて３
９リットルの溶出液を得た。 （４） 上記（３）で得られた溶出液３９リットルに、
リン酸二水素ナトリウム塩２９．１ｇを加えてｐＨを
７．２に調整した。この液を８０℃まで加熱して、熱に
不安定な物質を沈殿させて、それをドラバル型遠心分離
機を使用して分離除去した。(3) Precipitate recovered in (2) above
25 kg of water was added to 5 kg, and the calcium concentration was 30
Then, calcium chloride was added to a concentration of 00 ppm, and the mixture was sufficiently stirred.
One liter was collected. On the other hand, since 5 liters of precipitates were simultaneously formed by this centrifugation, 12 liters of an aqueous solution of calcium chloride (3000 ppm) was added to the precipitates, which were thoroughly washed. The washings were collected using a DeLaval centrifuge, and this solution was collected. Combine the 25 liters of supernatant with 3
9 liters of eluate were obtained. (4) To 39 liters of the eluate obtained in the above (3),
The pH was adjusted to 7.2 by adding 29.1 g of sodium dihydrogen phosphate. The solution was heated to 80 ° C. to precipitate heat-labile substances, which were separated off using a DeLaval centrifuge.

【００４７】（５） 上記（４）で熱に不安定な物質を
除去した後の液を限外濾過膜［日東電工株式会社製「Ｎ
ＴＵ−３２５０ＣＩＲ」（２万分画）］を用いて濃縮
し、併せて余剰カルシウム塩の脱塩を行って濃縮液を得
た。 （６） 上記（５）で得られた濃縮液を凍結乾燥して３
００ｇの粉末状の粗製アミラーゼ阻害物質を得た。この
乾燥粉末中の０．１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻
害活性を上記した方法で測定したところ、０．１９ＡＩ
の含有量は２５重量％、トリプシン阻害活性は１０ｕ／
ｍｇであった。(5) The liquid after removing the heat unstable substance in the above (4) is subjected to an ultrafiltration membrane [Nitto Denko Corporation “N
TU-3250CIR "(20,000 fractions)] and desalting of excess calcium salt was performed to obtain a concentrated solution. (6) The concentrate obtained in the above (5) is lyophilized to 3
00 g of a powdery crude amylase inhibitor was obtained. The content of 0.19 AI in the dried powder and the trypsin inhibitory activity were measured by the methods described above.
Is 25% by weight, and the trypsin inhibitory activity is 10 u /
mg.

【００４８】《参考例 ２》［粗製アミラーゼ阻害物質
の製造］ （１） 参考例１の（１）〜（５）と全く同じ工程を行
って濃縮液を調製した。 （２） 上記（１）で得られた濃縮液をアンモニアでｐ
Ｈ７．５に調整し、フィルタープレスにて夾雑物を除去
した後、３ｋｇの陽イオン交換樹脂（三菱化成株式会社
製「ダイヤイオンＨＰＫ−５５」）で処理し、処理液の
ｐＨをクエン酸を用いて４に調整した。 （３） 上記（２）でｐＨ４に調整した液を８０℃で加
熱処理した後、凍結乾燥して約２５０ｇの粉末状の粗製
アミラーゼ阻害物質を得た。この乾燥粉末中の０．１９
ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性を上記した方法
で測定したところ、０．１９ＡＩの含有量は３０重量
％、トリプシン阻害活性は１．５ｕ／ｍｇであった。こ
の参考例２ではイオン交換樹脂による処理を行っている
ことによって、イオン交換樹脂処理を行っていない参考
例１に比べて、粗製アミラーゼ阻害物質中における０．
１９ＡＩの含有量が高く、且つトリプシン阻害物質の含
有量（トリプシン阻害活性）が低くなっていた。Reference Example 2 [Production of Crude Amylase Inhibitor] (1) A concentrate was prepared by performing exactly the same steps as in (1) to (5) of Reference Example 1. (2) The concentrated solution obtained in the above (1) is p
After adjusting to H7.5 and removing impurities by a filter press, the mixture was treated with 3 kg of a cation exchange resin (“Diaion HPK-55” manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), and the pH of the treatment solution was adjusted to citric acid. And adjusted to 4. (3) The solution adjusted to pH 4 in the above (2) was heated at 80 ° C., and then freeze-dried to obtain about 250 g of a powdery crude amylase inhibitor. 0.19 in this dry powder
When the content of AI and the trypsin inhibitory activity were measured by the methods described above, the content of 0.19 AI was 30% by weight, and the trypsin inhibitory activity was 1.5 u / mg. In Reference Example 2, since the treatment with the ion exchange resin was performed, the amount of 0.1% in the crude amylase inhibitor was lower than that in Reference Example 1 in which the ion exchange resin treatment was not performed.
The content of 19AI was high and the content of trypsin inhibitor (trypsin inhibitory activity) was low.

【００４９】《参考例 ３》［夾雑蛋白質の分解作用を
有するプロテアーゼの検出］ （１） ゲル濾過カラム（ファルマシア社製「Ｓｅｐａ
ｈｃｒｙｌ Ｓ−２００」；２．６ｃｍφ×７８ｃｍ）
を作製し、流速１ｍｌ／分にて１００ｍＭ 塩化ナトリ
ウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化
した。 （２） ３００ｍｇのスミチームＬＰ（新日本化学工業
株式会社製）に上記(１)の平衡化に用いたのと同じ緩衝
液（４℃）５ｍｌを加えて、充分に撹拌した後、メンブ
ランフィルター［（株）バイオフィールド社製「クロマ
トディスク２５Ａ」；膜厚０．４５μｍ）で濾過し、濾
過液を上記（１）で準備しておいたゲル濾過カラムにか
けて平衡化と同じ条件下にてグロマトグラフィーを行い
（実験はすべて４℃で実施）、溶出してきた液を１０ｍ
ｌごとにフラクションコレクターで分取し、２８０ｎｍ
における吸光度を測定した。その結果、フラクション
８、９、１０、１６および１７に蛋白質が含有されてい
ることが確認された。Reference Example 3 [Detection of Protease Having Degradation of Contaminant Protein] (1) Gel filtration column (“Sepa” manufactured by Pharmacia)
hcryl S-200 "; 2.6cmφ × 78cm)
Was prepared and equilibrated with a 50 mM acetate buffer (pH 4.0) containing 100 mM sodium chloride at a flow rate of 1 ml / min. (2) To 300 mg of Sumiteam LP (manufactured by Nippon Chemical Industry Co., Ltd.), 5 ml of the same buffer (4 ° C.) used for the equilibration in (1) above was added, and the mixture was thoroughly stirred. (Chromatographic Disc 25A, Biofield Co., Ltd .; film thickness: 0.45 μm), and the filtrate was applied to the gel filtration column prepared in (1) above under the same conditions as for equilibration. (Every experiment was carried out at 4 ° C.)
Each fraction is collected with a fraction collector and collected at 280 nm.
Was measured. As a result, it was confirmed that the fractions 8, 9, 10, 16 and 17 contained proteins.

【００５０】（３） 上記の参考例１で得られた粉末状
の粗製アミラーゼ阻害物質２ｇに蒸留水１６０ｍｌを加
え、塩酸にてｐＨを４に調製した後、全量が２００ｍｌ
になるように蒸留水でメスアップし、それにより得られ
た液を濾過して基質液を調製した。 （４） 上記（３）で調製した基質液の４ｍｌごとに、
上記（２）で分取したフラクション８、９、１０、１６
および１７の１ｍｌずつを加えて５０℃で３０分間イン
キュベートした。インキュベートの終了後、メンブラン
フィルター［（株）バイオフィールド社製「クロマトデ
ィスク２５Ａ」；膜厚０．４５μｍ）で濾過した後、上
記の表１に示したのと同じ条件下にＨＰＬＣ分析を行っ
て、上記した０．１９ＡＩの含有量の測定法と同様にし
て各フラクションを加えた基質液における０．１９ＡＩ
含有率の増加状態を調べた（すなわち各フラクションに
含まれている酵素による粗製アミラーゼ阻害物質中に含
まれている夾雑蛋白質の分解状況を調べた）ところ、フ
ラクション８、９および１０については、夾雑蛋白質に
対する０．１９ＡＩ含有率の相対的増加が認められ、こ
れらのフラクション中に粗製アミラーゼ阻害物質に含ま
れる夾雑蛋白質を分解するプロテアーゼが存在すること
が確認された。一方、フラクション１６および２０では
０．１９ＡＩの含有率に変化がなく、したがってフラク
ション１６および２０に存在する酵素は、粗製アミラー
ゼ阻害物質中の夾雑蛋白質の分解作用をもたないプロテ
アーゼであることが確認された。(3) Distilled water (160 ml) was added to 2 g of the powdery crude amylase inhibitor obtained in the above Reference Example 1, and the pH was adjusted to 4 with hydrochloric acid.
And the resulting solution was filtered to prepare a substrate solution. (4) For every 4 ml of the substrate solution prepared in (3) above,
Fractions 8, 9, 10, 16 collected in (2) above
And 1 ml each were added and incubated at 50 ° C. for 30 minutes. After completion of the incubation, the mixture was filtered through a membrane filter (“Chromatodisc 25A” manufactured by Biofield Co., Ltd .; film thickness: 0.45 μm), and subjected to HPLC analysis under the same conditions as shown in Table 1 above. In the same manner as in the method for measuring the content of 0.19AI described above, 0.19AI in the substrate solution to which each fraction was added.
The state of increase in the content was examined (that is, the degradation state of the contaminating protein contained in the crude amylase inhibitor by the enzyme contained in each fraction was examined). As for fractions 8, 9 and 10, contamination was observed. A relative increase in the 0.19 AI content relative to the protein was observed, confirming the presence of proteases in these fractions that degrade contaminating proteins contained in the crude amylase inhibitor. On the other hand, the fractions 16 and 20 showed no change in the content of 0.19 AI, and thus it was confirmed that the enzyme present in the fractions 16 and 20 was a protease having no action of degrading contaminating proteins in the crude amylase inhibitor. Was done.

【００５１】（５） 上記（４）で粗製アミラーゼ阻害
物質中の夾雑蛋白質を分解し得るプロテアーゼの存在が
認められたフラクション８、９および１０、酵素が存在
しないことが上記（２）で確認されているフラクション
１１、並びに分子量既知の蛋白質の混合物を含む液を、
共にＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）（ファルマシア社製「ファストシステム」）にか
けたところ、図１に示す結果が得られ、フラクション
８、９および１０では約４０Ｋ（分子量約４００００）
の位置にメインバンドが認められ、さらにフラクション
９および１０では３０Ｋ（分子量約３００００）の位置
にサブバンドが認められた。 （６） 上記（５）の結果から、スミチームＬＰに含ま
れる複数種のアスペルギルス・オリゼー由来のプロテア
ーゼのうちでも、分子量が約４００００のプロテアーゼ
が、粗製アミラーゼ阻害物質中に含まれる夾雑蛋白質の
分解作用を有することが確認された。(5) Fractions 8, 9 and 10 in which the presence of a protease capable of degrading contaminating proteins in the crude amylase inhibitor in the above (4), and the absence of the enzyme were confirmed in the above (2). Fraction 11, and a liquid containing a mixture of proteins of known molecular weight,
Both are SDS polyacrylamide electrophoresis (SDS-PA
GE) ("Fast System" manufactured by Pharmacia) and the result shown in FIG. 1 was obtained. In fractions 8, 9 and 10, about 40K (molecular weight about 40000) was obtained.
, A sub-band was observed at 30K (molecular weight of about 30,000) in fractions 9 and 10. (6) From the results of the above (5), among the proteases derived from Aspergillus oryzae contained in Sumiteam LP, a protease having a molecular weight of about 40,000 is capable of degrading contaminating proteins contained in the crude amylase inhibitor. It was confirmed to have.

【００５２】《実施例 １》［高純度アミラーゼ阻害物
質の調製］ （１） 参考例１で得られた乾燥粉末（粗製アミラーゼ
阻害物質；０．１９ＡＩ含有量２５重量％；トリプシン
阻害活性１０ｕ／ｍｇ）１ｇに蒸留水約８０ｍｌを加
え、塩酸にてｐＨを４に調整した後、蒸留水を加えて全
量を１００ｍｌにメスアップして酸性基質液を調製し
た。 （２） 一方、２０ｍｇのスミチームＬＰに蒸留水２ｍ
ｌを加えて酵素液を調製した。 （３） 上記（１）で調製した酸性基質液１００ｍｌ
に、上記（２）で調製した酵素液１ｍｌを加えて（基質
に対して１重量％）、５０℃で３時間インキュベートし
た。インキュベート終了後、８０℃で１０分間加熱処理
して酵素を失活させた。 （４） 上記（３）で得られた酵素処理液を限外濾過膜
（アミコン社製「セントリプレップ１０」；通過分子量
１００００）に通して限外濾過を行って、分解して低分
子化したペプチド断片を除去した。その際に限外濾過
は、蒸留水を加えながら行い、限外濾過により得られた
濃縮液を凍結乾燥して乾燥粉末６６０ｍｇを得た。 （５） 上記（４）で得られた乾燥粉末中における０．
１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性を上記した
方法で測定したところ、０．１９ＡＩの含有量は４４重
量％およびトリプシン阻害活性は２．８ｕ／ｍｇであ
り、アミラーゼ阻害物質の含有量が大幅に上昇する一方
で、トリプシン阻害活性が大幅に低下していた。Example 1 [Preparation of high-purity amylase inhibitor] (1) Dry powder obtained in Reference Example 1 (crude amylase inhibitor; 0.19 AI content: 25% by weight; trypsin inhibitory activity: 10 u / mg) ) About 80 ml of distilled water was added to 1 g, the pH was adjusted to 4 with hydrochloric acid, and then distilled water was added to make up the total amount to 100 ml to prepare an acidic substrate solution. (2) On the other hand, 2 mg of distilled water was added to 20 mg of Sumiteam LP.
1 was added to prepare an enzyme solution. (3) 100 ml of the acidic substrate solution prepared in (1) above
Then, 1 ml of the enzyme solution prepared in the above (2) was added (1% by weight based on the substrate), and the mixture was incubated at 50 ° C. for 3 hours. After completion of the incubation, the enzyme was inactivated by heating at 80 ° C. for 10 minutes. (4) The enzyme-treated solution obtained in the above (3) was subjected to ultrafiltration through an ultrafiltration membrane ("Centriprep 10" manufactured by Amicon; passing molecular weight 10,000) to decompose and reduce the molecular weight. The peptide fragment was removed. At that time, ultrafiltration was performed while adding distilled water, and the concentrate obtained by ultrafiltration was freeze-dried to obtain 660 mg of dry powder. (5) 0.1% of the dry powder obtained in the above (4).
When the content of 19AI and the trypsin inhibitory activity were measured by the methods described above, the content of 0.19AI was 44% by weight and the trypsin inhibitory activity was 2.8u / mg, and the content of the amylase inhibitor increased significantly. On the other hand, the trypsin inhibitory activity was significantly reduced.

【００５３】《実施例 ２》［高純度アミラーゼ阻害物
質の調製］ （１） 参考例１で得られた粉末状の粗製アミラーゼ阻
害物質（０．１９ＡＩ含有量２５重量％；トリプシン阻
害活性１０ｕ／ｍｇ）１ｇに蒸留水約８０ｍｌを加え、
塩酸にてｐＨを４に調整した後、蒸留水を加えて全量を
１００ｍｌにメスアップして酸性基質液を調製した。 （２） 一方、１００ｍｇのスミチームＬＰに蒸留水５
ｍｌを加えて酵素液を調製した。 （３） 上記（１）で調製した酸性基質液１００ｍｌ
に、上記（２）で調製した酵素液２．５ｍｌを加えて
（基質に対して５重量％）、５０℃で１時間インキュベ
ートした。インキュベート終了後、８０℃で１０分間加
熱処理して酵素を失活させた。 （４） 上記（３）で得られた酵素処理液を実施例１で
使用したのと同じ限外濾過膜に通して限外濾過を行っ
て、分解して低分子化したペプチド断片を除去した。そ
の際に限外濾過は、蒸留水を加えながら行い、限外濾過
により得られた濃縮液を凍結乾燥して乾燥粉末５４０ｍ
ｇを得た。 （５） 上記（４）で得られた乾燥粉末中における０．
１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性を上記した
方法で測定したところ、０．１９ＡＩの含有量は５０重
量％およびトリプシン阻害活性は２．３ｕ／ｍｇであ
り、アミラーゼ阻害物質の含有量が大幅に上昇する一方
で、トリプシン阻害活性が大幅に低下していた。Example 2 [Preparation of high-purity amylase inhibitor] (1) Powdery crude amylase inhibitor obtained in Reference Example 1 (0.19AI content 25% by weight; trypsin inhibitory activity 10 u / mg) ) Add about 80ml of distilled water to 1g,
After adjusting the pH to 4 with hydrochloric acid, distilled water was added to adjust the total volume to 100 ml, thereby preparing an acidic substrate solution. (2) On the other hand, distilled water was added to 100 mg of Sumiteam LP.
The enzyme solution was prepared by adding ml. (3) 100 ml of the acidic substrate solution prepared in (1) above
Then, 2.5 ml of the enzyme solution prepared in the above (2) was added (5% by weight based on the substrate), and the mixture was incubated at 50 ° C. for 1 hour. After completion of the incubation, the enzyme was inactivated by heating at 80 ° C. for 10 minutes. (4) The enzyme-treated solution obtained in the above (3) was subjected to ultrafiltration through the same ultrafiltration membrane as used in Example 1 to remove peptide fragments that were decomposed and reduced to low molecular weight. . At that time, ultrafiltration was performed while adding distilled water, and the concentrated liquid obtained by ultrafiltration was freeze-dried to obtain 540 m of dry powder.
g was obtained. (5) 0.1% of the dry powder obtained in the above (4).
When the content of 19AI and the trypsin inhibitory activity were measured by the methods described above, the content of 0.19AI was 50% by weight and the trypsin inhibitory activity was 2.3u / mg, and the content of the amylase inhibitor increased significantly. On the other hand, the trypsin inhibitory activity was significantly reduced.

【００５４】《実施例 ３》［高純度アミラーゼ阻害物
質の調製］ （１） 参考例１で得られた粉末状の粗製アミラーゼ阻
害物質（０．１９ＡＩ含有量２５重量％；トリプシン阻
害活性１０ｕ／ｍｇ）１ｇに蒸留水約８０ｍｌを加え、
塩酸にてｐＨを４に調整した後、蒸留水を加えて全量を
１００ｍｌにメスアップして酸性基質液を調製した。 （２） 一方、１００ｍｇのスミチームＬＰに蒸留水５
ｍｌを加えて酵素液を調製した。 （３） また、トリプシンを含有する酵素製剤（ノボノ
ルディスクバイオインダストリー社製「ＰＴＮ３.０
Ｓ」）１００ｍｇに蒸留水５ｍｌを加えて、トリプシン
液を調製した。 （４） 上記（１）で調製した酸性基質液１００ｍｌ
に、上記（２）で調製した酵素液（スミチームＬＰ液）
２．５ｍｌを加えて（基質に対して５重量％）、５０℃
で１時間インキュベートした。次いで、水酸化ナトリウ
ム水溶液でｐＨを８に調整した後、上記（３）で調整し
たトリプシン液５００μｌを加え（基質に対して１重量
％）、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュ
ベート終了後に、塩酸でｐＨを４に再調整し、８０℃で
１０分間加熱処理して酵素を失活させた。 （５） 上記（４）で得られた酵素処理液を実施例１で
使用したのと同じ限外濾過膜に通して限外濾過を行っ
て、分解して低分子化したペプチド断片を除去した。そ
の際に限外濾過は、蒸留水を加えながら行い、限外濾過
により得られた濃縮液を凍結乾燥して乾燥粉末５５０ｍ
ｇを得た。 （６） 上記（５）で得られた乾燥粉末中における０．
１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性を上記した
方法で測定したところ、０．１９ＡＩの含有量は４９重
量％およびトリプシン阻害活性は１．１ｕ／ｍｇであ
り、アミラーゼ阻害物質の含有量が大幅に上昇する一方
で、トリプシン阻害活性がトリプシン処理を行うことに
よって一層低下していた。<< Example 3 >> [Preparation of high-purity amylase inhibitor] (1) Powdery crude amylase inhibitor obtained in Reference Example 1 (0.19 AI content: 25% by weight; trypsin inhibitory activity: 10 u / mg) ) Add about 80ml of distilled water to 1g,
After adjusting the pH to 4 with hydrochloric acid, distilled water was added to adjust the total volume to 100 ml, thereby preparing an acidic substrate solution. (2) On the other hand, distilled water was added to 100 mg of Sumiteam LP.
The enzyme solution was prepared by adding ml. (3) In addition, an enzyme preparation containing trypsin (“PTN3.0” manufactured by Novo Nordisk Bioindustry Co., Ltd.)
S ") 5 ml of distilled water was added to 100 mg to prepare a trypsin solution. (4) 100 ml of the acidic substrate solution prepared in (1) above
Next, the enzyme solution (Sumizyme LP solution) prepared in the above (2)
Add 2.5 ml (5% by weight based on the substrate), 50 ° C
For 1 hour. Next, after adjusting the pH to 8 with an aqueous sodium hydroxide solution, 500 μl of the trypsin solution adjusted in the above (3) was added (1% by weight based on the substrate), and the mixture was incubated at 50 ° C. for 60 minutes. After the completion of the incubation, the pH was readjusted to 4 with hydrochloric acid, and the enzyme was inactivated by heating at 80 ° C. for 10 minutes. (5) The enzyme-treated solution obtained in (4) above was passed through the same ultrafiltration membrane as used in Example 1 to perform ultrafiltration, thereby removing peptide fragments that were decomposed and reduced to low molecular weight. . At that time, the ultrafiltration was performed while adding distilled water, and the concentrated liquid obtained by the ultrafiltration was freeze-dried to a dry powder of 550 m
g was obtained. (6) In the dry powder obtained in the above (5), the content of 0.1% in the dry powder.
When the content of 19AI and the trypsin inhibitory activity were measured by the above-described methods, the content of 0.19AI was 49% by weight and the trypsin inhibitory activity was 1.1u / mg, and the content of the amylase inhibitor significantly increased. On the other hand, the trypsin inhibitory activity was further reduced by the trypsin treatment.

【００５５】《実施例 ４》［高純度アミラーゼ阻害物
質の調製］ （１） 参考例１で得られた粉末状の粗製アミラーゼ阻
害物質（０．１９ＡＩ含有量３０重量％；トリプシン阻
害活性１．５ｕ／ｍｇ）１ｇに蒸留水約８０ｍｌを加
え、塩酸にてｐＨを４に調整した後、蒸留水を加えて全
量を１００ｍｌにメスアップして酸性基質液を調製し
た。 （２） 一方、１００ｍｇのスミチームＬＰに蒸留水５
ｍｌを加えて酵素液を調製した。 （３） また、トリプシンを含有する酵素製剤（ノボノ
ルディスクバイオインダストリー社製「ＰＴＮ３.０
Ｓ」）１００ｍｇに蒸留水５ｍｌを加えて、トリプシン
液を調製した。 （４） 上記（１）で調製した酸性基質液１００ｍｌ
に、上記（２）で調製した酵素液（スミチームＬＰ液）
１．５ｍｌ（基質に対して３重量％）、および上記
（３）で調製したトリプシン液２５０μｌ（基質に対し
て０．５重量％）を加えた。それを５０℃で１時間イン
キュベートした後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８
に調整し、さらに５０℃で３０分間インキュベートし
た。インキュベート終了後に、塩酸でｐＨを４に再調整
し、８０℃で１０分間加熱処理して酵素を失活させた。 （５） 上記（４）で得られた酵素処理液を実施例１で
使用したのと同じ限外濾過膜に通して限外濾過を行っ
て、分解して低分子化したペプチド断片を除去した。そ
の際に限外濾過は、蒸留水を加えながら行い、限外濾過
により得られた濃縮液を凍結乾燥して乾燥粉末５２０ｍ
ｇを得た。 （６） 上記（５）で得られた乾燥粉末中における０．
１９ＡＩの含有量およびトリプシン阻害活性を上記した
方法で測定したところ、０．１９ＡＩの含有量は５２重
量％およびトリプシン阻害活性は０．７ｕ／ｍｇであ
り、アミラーゼ阻害物質の含有量が大幅に上昇する一方
で、トリプシン阻害活性がトリプシン処理を行うことに
よって一層低下していた。Example 4 [Preparation of high-purity amylase inhibitor] (1) Powdery crude amylase inhibitor obtained in Reference Example 1 (0.19AI content 30% by weight; trypsin inhibitory activity 1.5u) After adding about 80 ml of distilled water to 1 g of the resulting solution and adjusting the pH to 4 with hydrochloric acid, distilled water was added to adjust the total volume to 100 ml, thereby preparing an acidic substrate solution. (2) On the other hand, distilled water was added to 100 mg of Sumiteam LP.
The enzyme solution was prepared by adding ml. (3) In addition, an enzyme preparation containing trypsin (“PTN3.0” manufactured by Novo Nordisk Bioindustry Co., Ltd.)
S ") 5 ml of distilled water was added to 100 mg to prepare a trypsin solution. (4) 100 ml of the acidic substrate solution prepared in (1) above
Next, the enzyme solution (Sumizyme LP solution) prepared in the above (2)
1.5 ml (3% by weight based on the substrate) and 250 μl of the trypsin solution prepared in the above (3) (0.5% by weight based on the substrate) were added. After incubating it at 50 ° C for 1 hour, the pH was adjusted to 8 with aqueous sodium hydroxide solution.
And further incubated at 50 ° C. for 30 minutes. After the completion of the incubation, the pH was readjusted to 4 with hydrochloric acid, and the enzyme was inactivated by heating at 80 ° C. for 10 minutes. (5) The enzyme-treated solution obtained in (4) above was passed through the same ultrafiltration membrane as used in Example 1 to perform ultrafiltration, thereby removing peptide fragments that were decomposed and reduced to low molecular weight. . At that time, the ultrafiltration was performed while adding distilled water, and the concentrated liquid obtained by the ultrafiltration was freeze-dried to a dry powder of 520 m
g was obtained. (6) In the dry powder obtained in the above (5), the content of 0.1% in the dry powder.
When the content of 19AI and the trypsin inhibitory activity were measured by the methods described above, the content of 0.19AI was 52% by weight and the trypsin inhibitory activity was 0.7u / mg, and the content of the amylase inhibitor significantly increased. On the other hand, the trypsin inhibitory activity was further reduced by the trypsin treatment.

【００５６】[0056]

【発明の効果】アスペルギルス・オリゼー由来の分子量
３５０００〜４５０００のプロテアーゼを用いて粗製ア
ミラーゼ阻害物質を処理する本発明の方法による場合
は、極めて簡単な操作でアミラーゼ阻害物質中に含まれ
る夾雑蛋白質を優先的に分解して除去することができ
て、純度が高く、しかもアミラーゼ阻害物質のアミラー
ゼ阻害活性の妨げとなったり膵臓肥大や膵臓癌の発生原
因ともなるとトリプシン阻害活性の極めて低い、高品質
のアミラーゼ阻害物質を高収率で生産性よく製造するこ
とができる。そして、アスペルギルス・オリゼー由来の
分子量３５０００〜４５０００のプロテアーゼと共にト
リプシンを用いて粗製アミラーゼ阻害物質を処理する本
発明のよる場合は、アミラーゼ阻害物質の純度が一層高
く且つトリプシン阻害活性の一層低減されたアミラーゼ
阻害物質を良好な操作性で、高収率で得ることができ
る。本発明により得られるアミラーゼ阻害物質は、純度
が高く、しかもトリプシン阻害活性が極めて低いため、
人膵臓α−アミラーゼに対して高い阻害活性を有し、し
かも膵臓肥大や膵臓癌の発生の心配が少ないので、人間
に極めて有効であり、血糖値の上昇抑制、インシュリン
分泌の調節に高い効果を有し、満腹感を持続させて食欲
抑制を容易にすることができ、更に高血糖症、糖尿病、
高脂血症、動脈硬化、肥満などの予防および治療に極め
て有効である。According to the method of the present invention in which a crude amylase inhibitor is treated with a protease having a molecular weight of 35,000 to 45,000 derived from Aspergillus oryzae, contaminating proteins contained in the amylase inhibitor are prioritized by a very simple operation. High-quality amylase that can be decomposed and removed, has high purity, and has very low trypsin inhibitory activity when it interferes with the amylase inhibitory activity of the amylase inhibitor or causes pancreatic hypertrophy or pancreatic cancer. Inhibitors can be produced with high yield and high productivity. In the case of treating the crude amylase inhibitor using trypsin together with a protease having a molecular weight of 35,000 to 45000 derived from Aspergillus oryzae according to the present invention, the amylase having a higher purity of the amylase inhibitor and a further reduced trypsin inhibitory activity is used. The inhibitor can be obtained with good operability and high yield. The amylase inhibitor obtained by the present invention has high purity and extremely low trypsin inhibitory activity,
It has a high inhibitory activity against human pancreatic α-amylase, and is less susceptible to pancreatic hypertrophy and pancreatic cancer, so it is extremely effective for humans, and has a high effect on suppressing blood sugar rise and regulating insulin secretion. Have, can maintain a feeling of satiety and facilitate appetite suppression, further hyperglycemia, diabetes,
It is extremely effective in preventing and treating hyperlipidemia, arteriosclerosis, obesity and the like.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】参考例３において、アスペルギルス・オリゼー
由来のプロテアーゼを含む酵素製剤をＨＰＬＣにかけて
得られる各フラクション、および分子量既知の蛋白質の
混合物を含む液を、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて得られた結果を示す図で
ある。FIG. 1 In Reference Example 3, fractions obtained by subjecting an enzyme preparation containing a protease derived from Aspergillus oryzae to HPLC and a liquid containing a mixture of proteins of known molecular weights and a liquid containing a mixture of proteins of known molecular weight were subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE). It is a figure showing the obtained result.

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/55 ＡＣＮ Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＣＮ ＡＤＮ ＡＤＮ ＡＤＰ ＡＤＰ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 村山 隆二 兵庫県宍粟郡山崎町三谷40番地１Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Agency reference number FI Technical display location A61K 38/55 ACN A61K 37/64 ACN ADN ADN ADP ADP (C12P 21/00 C12R 1:69) (72) Invention Person Ryuji Murayama 40-1 Mitani, Yamazaki-cho, Shiso-gun, Hyogo

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 粗製アミラーゼ阻害物質を、アスペルギ
ルス・オリゼー由来の分子量３５０００〜４５０００の
プロテアーゼで処理することを特徴とする、アミラーゼ
阻害物質の含有量が多く、且つトリプシン阻害活性の低
い、高純度アミラーゼ阻害物質の調製方法。1. A high-purity amylase having a high amylase inhibitor content and a low trypsin inhibitory activity, characterized by treating a crude amylase inhibitor with a protease derived from Aspergillus oryzae and having a molecular weight of 35,000 to 45,000. Method for preparing inhibitors. 【請求項２】 粗製アミラーゼ阻害物質を、アスペルギ
ルス・オリゼー由来の分子量３５０００〜４５０００の
プロテアーゼおよびトリプシンで処理することを特徴と
する、アミラーゼ阻害物質の含有量が多く、且つトリプ
シン阻害活性の低い、高純度アミラーゼ阻害物質の調製
方法。2. The method according to claim 1, wherein the crude amylase inhibitor is treated with a protease having a molecular weight of 35,000 to 45,000 derived from Aspergillus oryzae and trypsin, wherein the content of the amylase inhibitor is high and the trypsin inhibitory activity is low. A method for preparing a pure amylase inhibitor. 【請求項３】 分子量４００００のアスペルギルス・オ
リゼー由来のプロテアーゼを用いる請求項１または２の
調製方法。3. The method according to claim 1, wherein a protease derived from Aspergillus oryzae having a molecular weight of 40,000 is used. 【請求項４】 アミラーゼ阻害活性が、最初に用いた粗
製アミラーゼ阻害物質の８５〜９５％になった時点で、
アスペルギルス・オリゼー由来の分子量３５０００〜４
５０００のプロテアーゼによる反応を停止させることか
らなる請求項１〜３のいずれか１項の調製方法。4. When the amylase inhibitory activity reaches 85 to 95% of the crude amylase inhibitor used initially,
Molecular weight 35,000-4 derived from Aspergillus oryzae
The method according to any one of claims 1 to 3, comprising stopping the reaction with 5000 proteases. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項の調製方法
により得られる高純度アミラーゼ阻害物質。5. A high-purity amylase inhibitor obtained by the preparation method according to any one of claims 1 to 4.