JPH1033180A

JPH1033180A - 組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ

Info

Publication number: JPH1033180A
Application number: JP8194557A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Kato; 暢夫加藤; Yasuyoshi Sakai; 康能阪井; Yoshiki Tani; ▲吉▼樹谷; Hiroshi Fukuya; 博司福家
Original assignee: KDK Corp; Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 1998-02-10
Anticipated expiration: 2016-07-24
Also published as: JP3819969B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ＤＮＡ組換え技術によるフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼの製造。【解決手段】異種遺伝子を導入された真核細胞により
生産されたことを特徴とするフルクトシルアミノ酸オキ
シダーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ組換え技術
によるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、ＦＡ
ＯＤ−Ｌと称する）の真核細胞による製造に関し、より
詳しくは、アスペルギルス属（Aspergillu s）由来のＦ
ＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子を含有し、真核細胞内で
機能的な発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換
された真核細胞、得られた形質転換体を培養することに
よる組換えＦＡＯＤ−Ｌの製造、そのようにして得られ
る組換えＦＡＯＤ−Ｌ、該組換えＦＡＯＤ−Ｌを用いる
アマドリ化合物の分析法及び該分析法に有用な試薬に関
する。

【０００２】

【従来技術】アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチド
及びアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アルド
ースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基とア
ルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマドリ
転移することにより生成される物質であり、醤油等の食
品、及び血液等の体液に含有されている。その生成速度
は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数であ
ることから、生成量を測定することにより、それら反応
性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることが
できる。例えば、生体内では、グルコースとアミノ酸が
結合したアマドリ化合物であるフルクトシルアミン誘導
体が生成しており、血液中のヘモグロビンが糖化された
フルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アル
ブミンが糖化された誘導体はグリコアルブミン、血液中
のタンパクが糖化された誘導体はフルクトサミンと呼ば
れる。これらの血中濃度は、過去の一定期間の平均血糖
値を反映しており、その測定値は、糖尿病の症状の重要
な指標となり得るために、測定手段の確立は臨床上、極
めて有用である。また、食品中のアマドリ化合物を定量
することにより、その食品の製造後の保存状況や期間を
知ることができ、品質管理に役立つと考えられる。この
ように、アマドリ化合物の定量分析は医学及び食品を含
む広範な分野で有用である。

【０００３】従来、アマドリ化合物を含有する試料に酸
化還元酵素を作用させ、酸素の消費量又は過酸化水素の
発生量を測定することにより、定量する分析法が提案さ
れている（例えば、特公平５−３３９９７号公報、特開
昭６１ー２６８１７８号公報、特開平２−１９５９００
号公報、特開平３−１５５７８０号公報）。さらに、糖
尿病の診断のための糖化タンパクの定量法も開示されて
いる（特開平２−１９５８９９号公報、特開平２−１９
５９００号公報）。

【０００４】アマドリ化合物の酸化還元酵素による分解
反応は下記の一般式で表すことができる。

【化１】Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ² ＋Ｏ₂ ＋
Ｈ₂Ｏ→Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨＯ＋Ｒ²−ＮＨ₂ ＋Ｈ₂
Ｏ₂ （式中、Ｒ¹はアルドース残基、Ｒ²はアミノ酸、タンパ
ク質又はペプチド残基を表す）本出願人は、上記の目的に適う酵素として、フサリウム
属（Fusa rium）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼ（ＦＡＯＤ−Ｌ及びＦＡＯＤ−Ｓ）を精製し、その有
用性を明らかにした（特開平８−１５４６７２、特開平
７−２８９２５３）。また、アスペルギルス属（Ａsper
gillus）が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡ
ＯＤ−Ｌ）を生産することも明らかにした。

【０００５】

【発明が解決すべき課題】しかしながら、微生物を培養
し、培地から該酵素を抽出して製造する方法は、多くの
労力と時間を必要とし、非効率的である。また、精製法
で得られる酵素には、フサリウム属又はアスペルギルス
属の菌株固有のタンパク質等の不純物が付随する確立が
高く、そのような不純物には、ＦＡＯＤ−Ｌ活性に悪影
響を及ぼす物質が混在する可能性があり、測定の信頼性
が十分に確保できない恐れがあった。従って、フサリウ
ム属またはアスペルギルス属の菌に由来する不純物を伴
わないＦＡＯＤ−Ｌを効率よく製造する方法の開発が求
められていた。そのためには、フサリウム属又はアスペ
ルギルス属由来のＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡをク
ローニングし、該ＤＮＡを含有する適当な発現ベクター
を構築し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該
形質転換体を適当な培地で培養することにより、解決す
ることができる。しかしながら、フサリウム属またはア
スペルギルス属由来のＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡ
がクローニングされた例はなく、まず、そのようなＤＮ
Ａのクローニングが必要であった。

【０００６】本発明者らは、上記課題を解決するために
鋭意研究を行った結果、アスペルギルス・テレウスＧ
Ｐ１（Ａspergillus terreus ＧＰ１：ＦＥＲＭ−１５
６６４）が産生するＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡを
クローニングし、該ＤＮＡを含有する発現ベクターを構
築し、該発現ベクターで大腸菌を形質転換し、得られた
大腸菌形質転換体（Ｅ．coli ＳＯＬＲ／ｐＦＡＬ２及
びＥ．coli ＪＭ１０９／ｐＦＡＬ２）を培養すること
により、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性を有す
る組換えＦＡＯＤ−Ｌを製造した。

【０００７】しかしながら、本来、真核生物であるアス
ペルギルス・テレウスＧＰ１（Ａspergillus terreus
ＧＰ１：ＦＥＲＭ−１５６６４）が生産していたＦＡ
ＯＤ−Ｌを原核生物に生産させると、インクルージョン
ボディ（封入体）を形成し、効率的な酵素の生産を確保
できない恐れがある。このような現象は当業者に公知で
あり、多くの文献に記載されている（例、ラボマニュア
ル遺伝子工学増補版、丸善株式会社、１８７頁参照）。
従って、ＦＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子（又はＤＮ
Ａ）を含有し、真核細胞を形質転換することが可能な発
現ベクターを構築し、該発現ベクターで真核細胞を形質
転換し、得られた形質転換体を培養して酵素を生産させ
る方法の開発が必要であった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、ＦＡＯＤ−Ｌ
をコードする遺伝子（又はＤＮＡ）を適当な発現ベクタ
ーに挿入し、得られたベクターを用いて真核細胞を形質
転換し、ＦＡＯＤ−Ｌを生産させることに成功した。す
なわち、本発明はアスペルギルス属（Ａspergillus）の
菌に由来するＦＡＯＤ−Ｌをコードする異種遺伝子を導
入された真核細胞により生産されたことを特徴とするＦ
ＡＯＤ−Ｌを提供するものである。異種遺伝子として
は、アスペルギルス属（Ａsper gillus）の菌に由来する
ＦＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子であることが好まし
く、アスペルギルス・テレウスＧＰ１（Ａs pergillus t
err eus ＧＰ１：ＦＥＲＭ−１５６６４）由来のＦＡＯ
Ｄ−Ｌをコードする遺伝子がより好ましい。本発明のＦ
ＡＯＤ−Ｌは、例えば、後述する実施例に記載のごとく
原核性宿主を形質転換して得られる形質転換体（例、
Ｅ．col i ＳＯＬＲ／ｐＦＡＬ２又はＥ．coli ＪＭ１０
９／ｐＦＡＬ２）から得られるＦＡＯＤ−Ｌをコードす
るＤＮＡ断片を真核細胞に発現させることによって得る
ことができる。

【０００９】さらに、本発明は、上記のＦＡＯＤ−Ｌを
コードする異種遺伝子を含有し、真核細胞内で機能的な
発現ベクターを提供するものである。該遺伝子は、好ま
しくはアスペルギルス属（Ａspergillus）の菌、より好
ましくはアスペルギルス・テレウスＧＰ１（Ａsp ergi
llus terre us ＧＰ１：ＦＥＲＭ−１５６６４）由来の
ＦＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子である。そのような発
現ベクターには、実施例に記載の原核性形質転換体であ
るＥ．coli ＳＯＬＲ／ｐＦＡＬ２又はＥ．c oli ＪＭ１
０９／ｐＦＡＬ２から得られるＦＡＯＤ−Ｌをコードす
るＤＮＡ断片を含有させてもよい。最も好ましい発現ベ
クターはプラスミドｐＮＦＬ８である。本明細書中、発
現ベクターが真核細胞内で「機能的」であるとは、該ベ
クターを真核細胞に導入したとき、得られた形質転換体
が適当な培地で増殖し、該ベクターに含有されている異
種のＦＡＯＤ−Ｌを生産しうることを意味する。「異種
遺伝子」とは、ＦＡＯＤ−Ｌを生産する真核細胞固有の
遺伝子以外の外来性遺伝子であることを意味する。な
お、本明細書中、「遺伝子」及び「ＤＮＡ」なる語句
は、起源に関係なく、目的のＦＡＯＤ−Ｌ活性を有する
ペプチドをコードすることを条件として、相互変換可能
に用いられる。

【００１０】本発明はまた、上記発現ベクターで真核細
胞を形質転換して得られる形質転換体を提供するもので
ある。真核細胞は、好ましくは酵母、より好ましくはメ
タノール酵母である（メチロトロフ酵母またはメタノー
ル資化性酵母）。さらに、本発明は、これらの形質転換
体を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オ
キシダーゼを回収することを特徴とするフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、アマドリ化合物を含有する試料と、こ
れら形質転換体の培養物又はその処理物を接触させ、酸
素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定することを特
徴とする、試料中のアマドリ化合物の分析法を提供する
ものである。本発明の分析法は、アマドリ化合物を含有
する試料の全てに適用可能であるが、生体成分であるこ
とが好ましい。また、その場合、該生体成分中の糖化タ
ンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクト
サミンの定量により行うことが好ましい。本発明はま
た、上記の形質転換体の培養物又はその処理物を含有す
るアマドリ化合物の分析のための試薬又はキットを提供
するものである。該試薬及びキットは、好ましくは生体
成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あ
るいはフルクトサミンの定量のために用いられるもので
ある。

【００１１】本発明のＦＡＯＤ−Ｌは、以下の特性：（１）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化して、α−
ケトアルデヒド、アミン誘導体及び過酸化水素を生成す
る反応を触媒する酵素活性を有し；（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定したとき、分子量約
４８,０００ダルトンの同一サブユニット２個より成
り；（３）そのＮ末端に配列表の配列番号２で示されるアミ
ノ酸配列を、また、中間に配列番号３で示されるアミノ
酸配列を有し；かつ（４）アスペルギルス属（Ａspergill us）の菌由来の他
のタンパク質を実質上含有しない；を有するペプチド又
はその酵素活性を有するフラグメントである。本発明の
ＦＡＯＤ−Ｌ又はそのフラグメントは、配列番号１記載
のアミノ酸配列又はその部分配列を含有することが好ま
しい。また、本発明の発現ベクターは、１つの実施態様
として、配列番号１記載の塩基配列又はその部分配列を
含有する。

【００１２】本明細書中、培養物の「処理物」とは培養物
から得られる物質であって、上記式(Ｉ)で示される反応
を触媒する酵素活性を高め、及び／又は酵素活性の利用
をより容易にするために、当該技術分野で通常の方法に
より処理された物質を指す。ＦＡＯＤ−Ｌ活性が形質転
換体細胞内に止まっている場合、処理物の例として以下
のものを挙げることができる。（１）生の細胞：ろ過又は遠心等の通常の方法で培養物
から分離された細胞。（２）乾燥細胞：（１）の生細胞を凍結乾燥又は真空乾
燥したもの。（３）細胞抽出物：（１）又は（２）の細胞を通常の方
法（例えば有機溶媒中での自己溶菌、アルミナや海砂と
混合しての摩砕、又は超音波処理）して得られる。（４）酵素溶液：細胞抽出物を常法通り精製するか部分
精製することにより得られる。（５）精製酵素：（４）に記載の酵素溶液をさらに精製
し、不純物を含まないもの。（６）酵素活性を有するフラグメント；精製酵素等を適
当な方法で断片化処理することにより得られるペプチド
フラグメント。（７）固定化細胞又は酵素：細胞又は酵素を通常の方法
で固定化（例えばポリアクリルアミド、ガラスビーズ、
イオン交換樹脂等に固定化）したもの。培地に分泌され
る場合は、培養物そのもの及びそれから精製される酵素
（溶液、凍結乾燥品、断片化したフラグメント等）及び
固定化酵素が培養物又は処理物の例として挙げられる。
本発明の目的には、酵素活性を有するフラグメントも有
用であり、そのような「酵素活性を有するフラグメン
ト」は、（６）に記載のごとく、ＦＡＯＤ−Ｌ活性を有
し、本発明の目的に有用なペプチドフラグメントを指
す。それは、例えば、上記（５）の精製酵素を、適当な
方法で断片化処理することにより得ることができ、培養
物の処理物の１つである。なお、本明細書で、単にＦＡ
ＯＤ−Ｌというときにも、上記の培養物の処理物の１つ
を表す場合がある。

【００１３】

【発明の実施の形態】ＦＡＯＤ−Ｌの真核細胞での生産
のための発現ベクターの構築、形質転換及び形質転換体
の培養は、当該技術分野で既知の方法に従って行うこと
ができる。本発明のＦＡＯＤ−Ｌの生産に適した真核細
胞としては、酵母、特にＳ a ccharomyces属に属する株
（例えば、Ｓ．cerevisiae）やＣandida属に属する株
（例えば、Ｃ．boidinii）、動物細胞又は培養植物細
胞、例えば、マウスＬ９２９細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞などが例示される。通常、発現
には菌体内発現と分泌発現の２種類があるが、各々につ
いて適当な発現系が存在する。例えば、酵母形質転換体
に、発現産物を細胞外に分泌させる必要があれば、ＦＡ
ＯＤ−ＬをコードするＤＮＡのＮ末端に宿主酵母由来の
分泌蛋白質のシグナル配列の遺伝子を連結させて、発現
産物をペリプラスムに分泌させるよう、発現系を構築す
る。

【００１４】真核性宿主に使用するのに適した発現ベク
ターは既知であり、それらから任意に選択することがで
きるが、酵母でのＦＡＯＤ−Ｌの発現のための発現ベク
ターとしては、ＧＡＬプロモーターやＡＯＤプロモータ
ー等のプロモーターを含有するものが好ましい。又、哺
乳動物細胞でのＦＡＯＤ−Ｌ発現のための発現ベクター
としては、ＳＶ４０プロモーター等のプロモーターを有
するものが挙げられる。また、発現効率を高めるため
に、当該技術分野で既知の多コピー型プラスミドを用い
て、多コピー型発現ベクターを構築することもできる。
ＦＡＯＤ−Ｌ発現ベクターの構築は、適当な方法で得ら
れるＦＡＯＤ−Ｌをコードする遺伝子又はＤＮＡ、例え
ばｍＲＮＡの逆転写によって得られるｃＤＮＡ、既にク
ローン化されたＤＮＡ、あるいは合成ＤＮＡ等を、適当
な発現ベクターに挿入することにより行うことができ、
そのような方法は当該技術分野で既知である。

【００１５】以下に、酵母での発現に適した発現ベクタ
ーの構築方法を示すが、これは１例にすぎず、本発明は
以下の発現ベクターに限定されるものではない。酵母で
のＦＡＯＤ−Ｌ遺伝子の発現のために、Ｃ．boidin iiの
染色体挿入型発現ベクターであるプラスミドpＮＯＴel
（特開平５−３４４８９５）を用い、ＦＡＯＤ−Ｌ発現
ベクターを構築する。このプラスミドpＮＯＴelは、Ａ
ＯＤプロモーターとＵＲＡ３遺伝子を含んでおり、該プ
ラスミドで形質転換された形質転換体を、Ｕｒａ要求を
指標として選抜する手段を与えることができる。まず、
クローン化ＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡを含む大腸菌発現ベク
ターｐＦＡＬ２を、実施例の記載に従って得られるＥ．
coli ＳＯＬＲ／ｐＦＡＬ２又はＥ．coli ＪＭ１０９／
ｐＦＡＬ２から得、これを鋳型としてＦＡＯＤ−ＬのＮ
末端とＣ末端に相当する２種のプライマー（配列番号４
及び５）を用いてＰＣＲを行い、約１.３ｋｂのＦＡＯ
Ｄ−ＬｃＤＮＡ断片を得、精製した。他方、プラスミド
pＮＯＴelを制限酵素ＮotIにより消化した後、ウシ腸ホ
スファターゼを用いて脱リン酸化処理し、上記の、ＦＡ
ＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片と共にＤＮＡ Blunting Kit（宝
酒造株式会社）を用いて平滑化した。これらをＤＮＡ l
igation Kit（宝酒造株式会社）を用いて連結し、プラ
スミドｐＮＦＬを得た。これを大腸菌にＨanahan法（Ｈ
anahan，Ｄ，Ｔechniques for Ｔransformation of Ｅ.
coli. Ｉn：ＤＮＡＣloning, vol Ｉ, Ｇlover, Ｄ.
Ｍ.(ed), pp109-136, ＩＲＬＰress,1985）で形質転換
し、得られた形質転換体から任意に８４株を選択してプ
ラスミドを調製した。プラスミドを制限酵素ＨindIIIで
処理して挿入片の方向性を確認し、ＦＡＯＤ−ＬｃＤＮ
Ａ断片がＡＯＤプロモーターの下流に挿入されているプ
ラスミドｐＮＦＬ８を得た。該プラスミドｐＮＦＬ８の
制限地図は図５に示されている。

【００１６】上記のプラスミドｐＮＦＬ８を用い、Ｕｒ
ａ要求性のＣ．boidiniiTK62株を形質転換し、形質転換
体をＵｒａを含まないＹＮＢ培地で培養した。ＵＲＡ ⁺
型形質転換体から任意に１４株を選び、これらの株をメ
タノール含有基本培地で培養すると、その１１株が後述
の表１に示すように、ＦＡＯＤ−Ｌを生産した。形質転
換体のサザン解析の結果、大多数の形質転換体がシング
ルコピーを有していることがわかった。

【００１７】発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は
既知であり、Ｍolecular Ｃloning：A LABOLATORY MANU
AL, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐressに記載
の方法で行うことができる。真核性宿主の場合は、コン
ピテントセル作製法、エレクトロポレーション法、リチ
ウム改変法、哺乳動物細胞の場合はトランスフェクショ
ン法、エレクトロポレーション法により行うことができ
る。形質転換体の培養に用いる培地は、炭素源（例えば
グルコース、メタノール、ガラクトース、フルクトース
等）及び無機また有機窒素源（例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カ
ザミノ酸等）を含有していてよい。所望により、培地に
他の栄養源（例えば無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カ
リウム）、ビタミン類（例えばビタミンＢ₁）、抗生物
質（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイ
シン等)）を加えてもよい。哺乳動物細胞の培養には、
イーグル培地が適当である。本発明のＦＡＯＤ−Ｌの製
造に適した培地は、０.１〜５.０％、好ましくは０.５
〜２.０％のＮＨ₄Ｃｌ及び／又は０.１〜５.０％、好ま
しくは１％の酵母エキスを含有する、メタノール０.１
〜５.０％、好ましくは１.５％を含有する基本培地であ
る。例えば、後述の表２及び３には、宿主細胞がメタノ
ール酵母である場合の培地条件の比較が示されている。
表から、１.５％メタノール含有基本培地でも十分にＦ
ＡＯＤ−Ｌが生産されるが、窒素源としてＮＨ₄Ｃｌを
含有することが好ましく、酵母エキスの濃度が約１％で
あることが好ましいことが分る。

【００１８】形質転換体の培養は、通常、pＨ５.０〜
８.０、好ましくはpＨ５.５〜６.０、２５〜４０℃（好
ましくは２８℃）で１６〜９６時間行えばよい。生産さ
れたＦＡＯＤ−Ｌが培養溶液、培養濾液（上澄み）中に
存在しているときは、培養物を濾過又は遠心分離する。
培養濾液から、ＦＡＯＤ−Ｌを天然又は合成のタンパク
質の精製、単離に一般的に用いられる常法（例えば透
析、ゲル濾過、抗ＦＡＯＤ−Ｌモノクロナール抗体を用
いてのアフィニティカラムクロマトグラフィー、適当な
吸着剤を用いてのカラムクロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー等）によって精製できる。生産され
たＦＡＯＤ−Ｌが培養形質転換体のペリプラズム及び細
胞質中に存在するときは、濾過や遠心分離によって細胞
を集め、それらの細胞壁及び／又は細胞膜を、たとえば
超音波及び／又はリゾチーム処理によって、破壊して、
デブリス（細胞破砕物）を得る。デブリスを適当な水溶
液（例えばトリス−塩酸緩衝液）に溶解させる。この溶
液から、常法によって、ＦＡＯＤ−Ｌを精製することが
できる。

【００１９】形質転換体中で生産されたＦＡＯＤ−Ｌを
再生（リフォールディング）する必要があるときは、こ
れを常法によって行なうことができる。本発明方法で得
られる形質転換体を適当な培地で培養して得られる培養
物はＦＡＯＤ−Ｌ活性を示すが、このものを上記のごと
く当業者既知の通常の方法でさらに処理して酵素溶液等
の処理物を調製することができる。また、所望により精
製してもよい。例えば、培養物を遠心してＦＡＯＤ−Ｌ
産生−形質転換体を収穫し、りん酸緩衝液に懸濁し、音
波処理等によって細胞を破壊する。次いで、上清を遠心
分離することにより、酵素標品を得る。さらに、上清を
透折し、クロマトグラフィー等でさらに精製すれば精製
酵素が得られる。次いで、制限酵素処理やエキソヌクレ
アーゼ処理等により、酵素活性を有するフラグメントを
得ることができる。

【００２０】上記の培養物、その処理物（精製酵素標品
及び酵素活性を有するフラグメントを含む）は、ＦＡＯ
Ｄ−Ｌ酵素活性を有し、アマドリ化合物の定量分析に適
しており、例えば、糖尿病の診断に有用である。既述の
ごとく、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物
及びその処理物は以下の反応式：

【化２】Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ² ＋Ｏ₂ ＋
Ｈ₂Ｏ→Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨＯ＋Ｒ²−ＮＨ₂ ＋Ｈ₂
Ｏ₂ （式中、Ｒ¹はアルドース残基、Ｒ²はアミノ酸、タンパ
ク質又はペプチド残基を表す）で示されるアマドリ化合
物の酸化還元反応を触媒する。上記式において、Ｒ¹が
−ＯＨ、−（ＣＨ₂）_n−、又は−［ＣＨ（ＯＨ)］_n−Ｃ
Ｈ₂ＯＨ（式中、ｎは０−６の整数）であり、Ｒ²が−Ｃ
ＨＲ³−［ＣＯＮＨＲ³］_mＣＯＯＨ（式中、Ｒ³はα−ア
ミノ酸側鎖残基、ｍは１−４８０の整数を表す）で示さ
れるアマドリ化合物が基質として好ましい。中でも、Ｒ
³がリジン、ポリリジン、バリン、アスパラギンなどか
ら選択されるアミノ酸の側鎖残基であり、またｎが５〜
６、ｍが５５以下である化合物が好ましい。

【００２１】本発明の分析法を行うには、アマドリ化合
物を含有すると考えられる試料と本発明のＦＡＯＤ−Ｌ
を発現する形質転換体の培養物又はその処理物を、水又
は緩衝液中で接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の
発生量を測定することにより、試料中のアマドリ化合物
を分析する。本発明の分析法は、生体成分中の、糖化タ
ンパクの量及び／又は糖化率の測定、あるいはフルクト
サミンの定量に基づいて行われる。例えばアマドリ化合
物を含有する緩衝液中の試料に、培養物又はその処理物
の水又は緩衝液中懸濁液（溶液）を加える。pＨ、温度
及び反応時間等の反応条件は特に限定されるものでな
く、同様の酵素反応に通常用いられる条件から適宜選択
するとよい。しかしながら、約ｐＨ４.０〜１２.０、好
ましくはｐＨ７.０〜９.０であり、より好ましくはｐＨ
約８.０、温度２５〜５０℃、好ましくは２５〜４０
℃、より好ましくは３５℃で反応させる。

【００２２】本発明方法に用いる被検液としては、アマ
ドリ化合物を含有する任意の試料溶液を用いることがで
き、例えば、血液（全血、血漿又は血清）、尿等の生体
由来の試料の外、醤油等の食品が挙げられる。緩衝液と
してはトリス−塩酸緩衝液等を用いる。ＦＡＯＤ−Ｌ、
ＦＡＯＤ−Ｌを発現する形質転換体の培養物又はその処
理物の使用量は、終点分析法においては通常、０.１単
位／ml以上、好ましくは１〜１００単位／mlである。本
発明の分析法では、下記のいずれかのアマドリ化合物の
定量法を用いる。（１）過酸化水素発生量に基づく方法当該技術分野で既知の過酸化水素の定量法、例えば、発
色法、過酸化水素電極を用いる方法等で測定し、過酸化
水素及びアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲線
と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定量
する。具体的には、後述の力価の測定法に準じる。ただ
し、ＦＡＯＤ−Ｌ量は１ユニット／ｍｌとし適当に希釈
した試料を添加し、生成する過酸化水素量を測定する。
過酸化水素発色系としては、４−アミノアンチピリン／
フェノール系のかわりに４−アミノアンチピリン／Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−ｍ−トルイジン，４−アミノアンチピリン／Ｎ,Ｎ−
ジメチルアニリン，４−アミノアンチピリン／Ｎ,Ｎ−
ジエチルアニリン，ＭＢＴＨ／Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリ
ン，４−アミノアンチピリン／２，４−ジクロロフェノ
ール等の組み合わせが可能である。

【００２３】（２）酸素の消費量に基づく方法反応開始時の酸素量から反応終了時の酸素量を差し引い
た値（酸素消費量）を測定し、酸素消費量とアマドリ化
合物の量に関して作成した標準曲線と比較することによ
り、試料中のアマドリ化合物を定量する。具合的には、
後述の力価の測定法に準じて行う。但し用いるＦＡＯＤ
−Ｌ量は１ユニット／mlとし、適当に希釈した試料を添
加し吸収される酸素量を求める。

【００２４】本発明方法は試料溶液をそのまま用いて行
うこともできるが、対象によっては、あらかじめ糖が結
合したリジン残基を遊離させてから行うことが好まし
い。そのような目的には、タンパク質分解酵素を用いる
場合（酵素法）と、塩酸等の化学物質を用いる場合（化
学法）があるが、前者が好ましい。本発明方法に用いる
ことができるタンパク質分解酵素は、当業者に既知であ
り、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢ、パパイ
ン、アミノペプチダーゼ、キモトリプシン、サーモリシ
ン、ズブシリシン、プロティナーゼＫ、プロナーゼ等を
挙げることができる。酵素処理の方法も既知であり、例
えばプロテアーゼ処理は、下記実施例に記載の方法で行
うことができる。

【００２５】上記のごとく、本発明のＦＡＯＤ−Ｌを発
現する形質転換体の培養物又はその処理物は、糖化タン
パクに含まれるフルクトシルリジンに高い基質特異性を
有するものであることから、血液試料中の糖化タンパク
を測定することを含む、糖尿病の診断などに有用であ
る。また、フルクトシルバリンにも特異性を有すること
から、糖化ヘモグロビンの測定にも有用である。なお、
検体として血液試料（全血、血漿又は血清）を用いる場
合、採血した試料をそのまま、あるいは透折等の処理を
した後用いる。さらに、本発明方法に用いるＦＡＯＤ−
Ｌを発現する形質転換体の培養物又はその処理物、ある
いはパーオキシダーゼ等の酵素は、溶液状態で用いても
よいが、適当な固体支持体に固定化してもよい。例え
ば、ビーズに固定化した酵素をカラムに充填し、自動化
装置に組み込むことにより、臨床検査など、多数の検体
の日常的な分析を効率的に行うことができる。しかも、
固定化酵素は再使用が可能であることから、経済効率の
点でも好ましい。さらには、酵素と発色色素とを適宜組
み合わせ、臨床分析のみならず、食品分析にも有用なア
マドリ化合物の分析のためのキットを得ることができ
る。

【００２６】酵素の固定化は当該技術分野で既知の方法
により行うことができる。例えば、担体結合法、架橋化
法、包括法、複合法等によって行う。担体としては、高
分子ゲル、マイクロカプセル、アガロース、アルギン
酸、カラギーナンなどがある。結合は共有結合、イオン
結合、物理吸着法、生化学的親和力を利用し、当業者既
知の方法で行う。固定化酵素を用いる場合、分析はカラ
ム又はバッチ方式のいずれでもよい。上記のごとく、固
定化酵素は、血液試料中の糖化タンパクの日常的な分析
（臨床検査）に特に有用である。臨床検査が糖尿病診断
を目的とする場合、診断の基準としては、結果を糖化タ
ンパク濃度として表すか、試料中の全タンパク質濃度に
対する糖化タンパク質の濃度の比率で表される。全タン
パク質濃度は、通常の方法（２８０nmの吸光度、Lowry
法あるいは、アルブミンの自然蛍光など）で測定するこ
とができる。

【００２７】本発明のアマドリ化合物の定量のための試
薬は、本発明のＦＡＯＤ−Ｌを発現する形質転換体の培
養物又はその処理物、及び好ましくはｐＨ７.０〜９.
０、より好ましくはｐＨ８.０の緩衝液からなる。該培
養物又はその処理物が固定化されている場合、固体支持
体は高分子ゲルなどから選択され、好ましくはアルギン
酸である。試薬中の培養物又はその処理物の量は、終点
分析を行う場合、試料あたり、通常１〜１００単位／m
l、バッファーはトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）が好
ましい。過酸化水素の生成量に基づいてアマドリ化合物
を定量する場合、発色系としては、上記の各種の組み合
わせを利用することが可能である。本発明のアマドリ化
合物の分析試薬と、適当な発色剤ならびに比較のための
色基準あるいは標準物質を組み合わせてキットとするこ
ともできる。そのようなキットは、予備的な診断、検査
に有用であると考えられる。

【００２８】

【実施例】次下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明す
るが、これらは本発明を制限するものではない。以下の
実施例において用いたプラスミド類、様々な制限酵素等
の酵素類は、市販品から入手し、供給者の指示に従って
使用するか、文献記載の方法で製造することができる。
また、プラスミドの構築、宿主の形質転換、形質転換体
の培養及び培養物からの酵素の回収は、当業者既知の方
法、あるいは文献記載の方法に準じて行なった。また、
酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定した。力価測定法（１）生成する過酸化水素を比色法により測定する方
法。Ａ.速度法１００ｍＭＦＺＬ溶液はあらかじめ得られたＦＺＬを
蒸留水で溶解することによって調製した。４５mＭ４−
アミノアンチピリン、６０ユニット／ｍｌパーオキシダ
ーゼ溶液、及び６０ｍＭフェノール溶液それぞれ１０
０μｌと、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）
１ｍｌ、及び酵素溶液５０μｌを混合し、全量を蒸留水
で３.０ｍｌとする。３０℃で平衡化した後、１００ｍ
ＭＦＺＬ溶液５０μｌを添加し、５０５ｎｍにおける
吸光度を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子
吸光係数（５.１６×１０³Ｍ^-1cm^-1）から、１分間に生
成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を
酵素活性単位とする。

【００２９】Ｂ.終末法上記Ａ法と同様に処理し、基質添加後、２０分間３０℃
でインキュベートした後の５０５ｎｍにおける吸光度を
測定し、別にあらかじめ標準過酸化水素溶液を用いて作
成した検量線から生成した過酸化水素量を算出すること
により、酵素活性を測定する。（２）酵素反応による酸素吸収を測定する方法０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液1ｍｌと酵素溶液５０μｌ
を混合し、蒸留水で全量を３.０ｍｌとし、ランクブラ
ザーズ社の酸素電極のセルに入れる。３０℃で攪拌し、
溶存酸素と温度を平衡化した後、５０ｍＭＦＺＬ１０
０μｌを添加し、酸素吸収を記録計で連続的に計測し、
初速度を得る。標準曲線から１分間に吸収された酸素量
を求め、これを酵素単位とする。

【００３０】実施例１ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮ
Ａのクローニング１．アスペルギルス・テレウスＧＰ１(Ａsper gillus te
rreus ＧＰ１；ＦＥＲＭＰ−１５６６４）のＦＡＯＤ−
Ｌの部分アミノ酸配列の決定１）Ａ. terreus ＧＰ１の培養及びＦＡＯＤ−Ｌの精製Ａspergillus terreus ＧＰ１；Ｐ−１５６６４）をＦ
ＺＬ０.５％、グルコース１.０％、リン酸二カリウム
０.１％、リン酸一ナトリウム０.１％、硫酸マグネシ
ウム０.０５％、塩化カルシウム０.０１％, イースト
エキス０.２％を含有した培地（ｐＨ６.０)１０Ｌに植
菌し、ジャーファーメンターを用いて通気量２Ｌ／分、
攪拌速度４００ｒｐｍの条件で２８℃、２４時間攪拌培
養した。培養物は瀘過して集めた。菌糸体２５９ｇ（湿
重量）を、２ｍＭのＤＴＴを含む、０.１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８.５)８００mlに懸濁し、ダイノ・ミル
により菌糸体を破砕した。破砕液を９,５００ｒｐｍで
２０分間遠心分離し、得られた液を粗酵素液とし、以下
の方法で精製した。

【００３１】粗酵素液に４０％飽和になるように硫酸ア
ンモニウム（以下、硫安と略す）を加え、攪拌し、１
２,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上
清に７５％飽和になるように硫安を加え、撹拌し、１
２,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿を２ｍ
ＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８.５）（以下、緩衝液Ａと略す）に溶解した。
その溶液に硫安４０％を含む緩衝液Ａを等量加え、次い
で、約２００mlのブチル−トヨパール（butyl-ＴＯＹＯ
ＰＥＡＲＬ）樹脂を加え、穏やかに撹拌した。同緩衝液
で洗浄後、緩衝液Ａを用い、バッチ法で溶出した。溶出
液を硫安濃縮し、２５％飽和硫安を含む緩衝液Ａで平衡
化したフェニル−トヨパール（phenyl-ＴＯＹＯＰＥＡ
ＲＬ）カラムに吸着した。同緩衝液にて洗浄した後、硫
安濃度２５−０％飽和の直線勾配で溶出した。活性画分
を集め、硫安濃縮後、４０％飽和硫安を緩衝液Ａで平衡
化したブチル−トヨパールカラムに吸着した。同緩衝液
にて洗浄した後、硫安濃度４０−０％飽和の直線濃度勾
配にて溶出した。活性画分を統合し、緩衝液Ａで平衡化
したＤＥＡＥ−トヨパールカラムに供した。活性画分は
同緩衝液による洗浄画分に認められたので、これを集
め、硫安濃縮した。続いて得られた酵素溶液を０.１Ｍ
ＮａＣl、２mＭＤＴＴを含む０.１Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８.５）にて平衡化したセファクリルＳ−３０
０カラムによりゲル瀘過を行い、７０〜１００ユニット
の精製酵素を得た。

【００３２】得られた精製酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電
気泳動）において、標準タンパクとしてホスホリラーゼ
Ｂ、牛血清アルブミン、オボアルブミン、カルボニック
アンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターを用い、
デービスの方法に従って分子量を測定した。即ち、１０
％ゲルを用いて、４０ｍＡで３時間泳動し、クーマシー
ブリリアントブルーＧ−２５０でタンパク染色を行っ
た。分子量既知の数種のタンパクについて同様に泳動
し、検量線から分子量を求めた結果、サブユニットの分
子量は約４８,０００ダルトンであることが示された
（図６）。また、スーパーデックス２００ｐｇによるゲ
ルろ過による分子量測定では、図７の検量線図から明ら
かなように、約９４,０００ダルトンであった。

【００３３】２）部分アミノ酸配列の決定上記の方法で精製した酵素標品をＶ８プロテアーゼ（シ
グマ社製）により断片化し、クリーブランド法［D.W.Cl
eaveland, S.G.Fisher, M.W. Kirschner and U.K. Laem
mli, J.Biol.Chem., 252, 1102 (1977)］によりさらに
断片化した。次いで、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンフル
オリド、ミリポア社製、商品名，イモピロン−ＰＳＱ）
膜にトランスファー（１４Ｖで一晩（１２時間））し、
プロテインシーケンサー４７６Ａ（アプライドバイオシ
ステムズ社）を用い、エドマン分解法によりアミノ酸配
列を決定した。その結果、Ｎ−末端及び内部ペプチドの
２断片からそれぞれ、配列番号２及び３に示す１７及び
１６残基のアミノ酸配列が決定された。

【００３４】２．ＲＴ−ＰＣＲによる部分ｃＤＮＡ断片
の増幅１）オリゴヌクレオチドプライマーの調製上記１．２）で得たアミノ酸配列から推定される塩基配
列を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）に用い
るためのプライマーを、図１に示すように設計した。こ
のプライマーの設計に際して、アスペルギルス属のコド
ン使用率を考慮に入れ、またサブクローニングを容易に
するために、プライマーの端にＢamＨＩ認識配列を付加
した。これらプライマー１及び２の塩基配列をそれぞ
れ、配列番号４及び５に示す。なお、プライマー２は、
プライマー１が付着するＤＮＡに相補なＤＮＡに付着す
るよう、図１に記載の配列に基づき、そのＣ末端側から
合成されている。

【００３５】２）totalＲＮＡの調製上記１．１）の方法で培養したＡ. terreus ＧＰ１株の
菌糸体１ｇからグアニジン／フェノール／クロロホルム
法(Chomczynski,P. and Sacchi,N. (1987) Single-step
method of RNA isolation by acid guanidinium thioc
yanate-PhOH-chloroform extraction, Anal. Biochem.
162, 156-159）に従って、totalＲＮＡ５mgを得た。

【００３６】３）ＲＴ−ＰＣＲ上記１．２）で設計したプライマーと、２．２）で調製
したtotalＲＮＡを用い、以下の手順で逆転写ポリメラ
ーゼチェーン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ａ）totalＲＮＡ（５μg／μl）２μlに滅菌水３６μl
を加え、６５℃、５分加温した後、氷上で急冷する。ｂ）ａ）の溶液に以下の溶液を加える。５×buffer ２０μl dNTPmix（各２０mＭ）５μl ＲＮase inhibitor（１１５Ｕ／ml）２μl Ｏligo dt （０.４２μg／μl）２４μl ＲＴase (ＭＬＶ）（２００Ｕ／μl）１μl ＤＴＴ（０.１Ｍ）１０μl ｃ）ａ）＋ｂ）の溶液を２５℃、１０分放置した後、４
２℃で一夜反応させる。そして、９５℃で５分加熱した
後、氷上で急冷するとｃＤＮＡが得られる。ｄ）ｃ）で合成したｃＤＮＡ２μlに以下の溶液を加え
る。１０×ＰＣＲ buffer ２.５μl ｄＮＴＰｍｉｘ１.８μｌプライマー１１ μｌプライマー２１ μｌ減菌水１６.５７５μｌｅ）ｄ）の溶液を９５℃で５分加熱した後、氷上で急冷
した後、Ｔaq ＤＮＡＰolymerase（５Ｕ／ｍｌ）を０．
１２５μｌ加える。ｆ）ｅ）にミネラルオイルを重層して以下の条件でＰＣ
Ｒ反応を行う。（９４℃，１分；６０℃，２分；７２
℃，２分）からなる一連の処理を３０サイクル行った
後、７２℃で３分処理する。ｇ）次いで、アガロースゲル電気泳動にかける。その結
果、プライマー１と２を用いたとき、図３に示すように
約４００bpの断片の増幅が確認できた。図３は、アガロ
ース電気泳動の結果を示す模写図である。図中、レーン
１はφＸ１７４／ＨincII（マーカー）、レーン２はプ
ライマー１及び２を用いた電気泳動パターンである。マ
ーカーはＰＣＲにより増幅した断片のサイズを判断する
ために泳動を行った。

【００３７】３．ＰＣＲ断片のサブクローニング上記２．で得た約４００bpのＰＣＲ断片をアガロースゲ
ルから切り出し、ＤＮＡ回収用フィルター付遠心チュー
ブ（孔径０.２２μｍ、宝酒造社製Ｃode Ｎo.９０４
０）を用いて、１０,０００ｒｐｍ．４℃、１時間の遠
心の後、エタノール沈殿を行うことで精製した。次い
で、ＰＣＲ断片（１μl）、Ｋ buffer（１μl）、Ｂam
ＨＩ（１μl）及び減菌水（７μl）を混合し、３７℃で
４時間の消化を行った。得られたＢamＨＩ消化断片を、
同じくＢamＨＩで消化したpBluescreipt II SK+（STRAT
AGENE社製：ｌａｃプロモータ−を有する大腸菌用発現
ベクター）に、ライゲーション（１６℃・３０分）し、
得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌ＪＭ１０
９株を形質転換した。形質転換は、ＴａＫａＲａＬiga
tion Ｋit Ｖer. ２.０（宝酒造）を使用し、Ｈanahan
法（Ｈanahan，Ｄ，Ｔechniques for Ｔransformation
of Ｅ.coli. Ｉn：ＤＮＡＣloning, vol Ｉ, Ｇlover,
Ｄ.Ｍ.(ed), pp109-136, ＩＲＬＰress, 1985）に従
って行った。その結果、図４に示すように、約４００bp
のＰＣＲ断片がpBluescreipt II SK⁺のＢamＨＩサイト
に挿入されたプラスミドｐＦＬＰを得た。図４におい
て、レーン１はλ／ＥcoＴ１４１（マーカー）を、レー
ン２はｐＦＬＰ／ＢamＨＩを表す。その塩基配列をジデ
オキシ法により決定したところ、ＦＡＯＤ−ＬのｃＤＮ
Ａの部分配列であることが確認された。

【００３８】４．ｃＤＮＡライブラリーの作成及びプラ
ークハイブリダイゼーション上記の２．２）の方法で得たtotal ＲＮＡからｍＲＮＡ
Ｐurification Ｋit（ファルマシア社）を用いてｍＲ
ＮＡを得た。該ｍＲＮＡ５μgから、ＺＡＰ-cＤＮＡ
Ｓynthesis Ｋit（STRATAGENE社製）を用いてｃＤＮＡ
ライブラリーを作成した。即ちｍＲＮＡ５μgから逆転
写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、λＺＡＰＩＩベク
ター（STRATAGENE社製）に連結し、Gigapack III Gold
（STRATAGENE社製）を用いてインビトロでパッケージン
グしてｃＤＮＡライブラリーを得た。（条件等はマニュ
アルに従った。）次いで、ｃＤＮＡのタイターを測定した結果、１.０×
１０⁵pfu/μgベクターであった。このファージライブラ
リーを大腸菌ＸＬＩ−Ｂlue ＭＲＦ株に感染させ、３
７℃で１２時間培養することによりプラークを形成させ
た。次いで、３.でサブクローニングしたＰＣＲ断片を
³²Ｐで標識してプローブとして用い、プラークハイブリ
ダイゼーションによりスクリーニングした。即ち、得ら
れたプラークをニトロセルロースフィルターに転写し、
アルカリ変性後、４２℃で³²Ｐで標識したプローブと１
２時間ハイブリダイズさせた。洗浄後、Ｘ線フィルムに
１２時間露光させた。その結果、約２０,０００プラー
クから７つの陽性プラークを得た。

【００３９】５. ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡの
サブクローニングＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡのプラスミドへのサブ
クローニングはインビトロ切除法で行った。７個の陽性
プラークからExAssistヘルパーファージ（STRATAGENE社
製）を用いて添付のマニュアルに従い、大腸菌ＪＭ１０
９（Ｅ.coli ＪＭ１０９Ｃompetent Ｃell．宝酒造株
式会社）に形質転換した。得られた形質転換体からプラ
スミドを抽出し塩基配列を決定した。その結果、ＦＡＯ
Ｄ−ＬのＮ末端アミノ酸配列に相当する塩基配列を有す
る約１.５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐ
ＦＡＬ２を保持するクローンを１株得た（大腸菌形質転
換体（Ｅ.coli ＪＭ１０９／ｐＦＡＬ２))。このｐＦＡ
Ｌ２の制限地図を図２に示す。該クローンの塩基配列及
び推定のアミノ酸配列を配列番号１に示す。又、該プラ
スミドｐＦＡＬ２を用いて大腸菌ＳＯＬＲ（STRATAGENE
社）を形質転換して大腸菌形質転換体（Ｅ.coli ＳＯＬ
Ｒ／ｐＦＡＬ２)を得た。

【００４０】実施例２酵母でのＦＡＯＤ−Ｌの発現（１）ＦＡＯＤ−Ｌ発現ベクターの構築アスペルギルス・テレウスＧＰ１（Ａsperg illus ter
reus ＧＰ１：ＦＥＲＭ−１５６６４）由来のクローン
化ｃＤＮＡを含む大腸菌発現ベクターｐＦＡＬ２を、
Ｅ.coli ＪＭ１０９／ｐＦＡＬ２（実施例１）から得
た。得られたｐＦＡＬ２を鋳型としてＦＡＯＤ−ＬのＮ
末端とＣ末端に相当する２種のプライマー（配列番号６
及び７）を用いて以下の条件でＰＣＲを行って約１.３
ｋｂのＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件：
［９４℃,１分；６０℃,１分；７２℃,３分］を３０サ
イクル＋７２℃,５分を１回。アガロース電気泳動後、
断片を常法通り精製し、ＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片を得
た。

【００４１】プラスミドpＮＯＴel（特開平５−３４４
８９５）を制限酵素ＮotＩにより消化した後、ウシ腸ホ
スファターゼ（ベーリンガーマンハイム社）を用いて脱
リン酸化処理し、上記の、ＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片と
共にＤＮＡ Blunting Kit（宝酒造株式会社）を用いて
平滑化した。これらをＤＮＡ ligation Kit（宝酒造株
式会社）を用いて連結し、プラスミドｐＮＦＬを得た。
次いで、プラスミドｐＮＦＬを用い、Hanahan法（前
掲）でＥ．coli JM109株を形質転換した。得られた形質
転換体から任意に８４株を選択してプラスミドを調製し
た。プラスミドを制限酵素ＨindIIIで処理して挿入片の
方向性を確認し、ＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片がＡＯＤプ
ロモーターの下流に挿入されているプラスミドｐＮＦＬ
８を得た。該プラスミドｐＮＦＬ８の制限地図を図５に
示す。

【００４２】（２）形質転換上記のプラスミドｐＮＦＬ８を、制限酵素ＢamＨＩによ
り直鎖状にした後、リチウム改変法を用いてＣ．boidin
iiTK62株に形質転換した。このＴＫ６２株はＵｒａ要求
性であり、プラスミドpNOTelにはＵＲＡ３遺伝子が含ま
れているので、Ｕｒａ要求を指標に形質転換体を選抜す
ることができる。形質転換体をＵｒａを含まないＹＮＢ
培地に塗布することにより得られたＵＲＡ ⁺型の形質転
換体から任意に１４株を選び、１.５％メタノール含有
基本培地に接種し、２８℃で３日間震盪培養した。集菌
後、菌体内のＦＡＯＤ−Ｌ活性を上記の力価測定法の
Ａ．速度法により測定し、表１の結果を得た。なお、以
下の実施例におけるＦＡＯＤ−Ｌの力価測定は同様の方
法で行った。

【００４３】表１ｐＮＦＬ８により形質転換された
Ｃ．b oidiniiのＦＡＯＤ−Ｌ活性

【表１】注：１，検出されず２，pＮＯＴelで形質転換したＣ．boid iniiTK62株表１から明らかに、１１株にＦＡＯＤ−Ｌ活性が認めら
れ、その内、ＦＬＣ１４株が最大の活性を示した。

【００４４】（３）形質転換体のサザン解析Ｃ．boidiniiTK62株の染色体ＤＮＡに挿入されたプラス
ミドのコピー数を決定するためにサザン解析を行った。
活性の異なる形質転換体３株より染色体ＤＮＡを抽出
し、制限酵素ＥcoＲＩで消化した後、アガロースゲル電
気泳動に供し、常法通りサザンブロッティングした。プ
ローブとしてＵＲＡ３遺伝子を用い、プローブの標識は
ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法により行った。結果は図８に示す
ように、強い活性を示すＣ．boidi nii TK62/pNEL14株の
みにおいて８.８ｋｂの断片が認められたので、２コピ
ー以上のＦＡＯＤ−ＬｃＤＮＡ断片が染色体ＤＮＡに挿
入されていることが予想された。それ以外のものは全て
シングルコピーであった。これは、挿入されているコピ
ーが１つの時はＥｃｏＲＩ処理により、C.boidiniiのＥ
ｃｏＲＩ認識部位とｐＮＦＬ８のＥｃｏＲＩ認識部位か
ら９.１ｋｂの断片が切り出されるだけであるのに対し
て、２つ以上のコピーが挿入されていれば、２カ所のｐ
ＮＦＬ８のＥｃｏＲＩ認識部位から切り出される断片が
生じ、この断片のサイズが８.８ｋｂであることによる
ものである。

【００４５】（４）ＦＡＯＤ−Ｌ活性を有する形質転換
体の培養条件の検討上記（３）で最も高活性を示した形質転換体Ｃ．boidi n
ii TK62/pNEP14株を用い、好適な培養条件を検討した。
１.５％メタノールを含有する基本培地を用い、無機窒
素源を種々変えて培養しＦＡＯＤ−Ｌ活性を測定した。
その結果を表２に示す。表２Ｃ．boidinii TK62/pNEP14株によるＦＡＯＤ−Ｌ
生産に対する窒素源の影響

【表２】表２から、窒素源としてＮＨ₄Ｃｌが好ましいことが分
かる。その培地中の含有量は、０.１〜５.０％、より好
ましくは０.５〜２.０％である。

【００４６】次いで、酵母エキス濃度を種々変化させて
検討した結果、下記の表３に示すように、酵母エキス濃
度が高いほど、ＦＡＯＤ−Ｌ活性が上昇する。好ましい
酵母エキス濃度は０.１〜５.０％、より好ましくは約１
％である。表３Ｃ．boidinii TK62/pNEP14株によるＦＡＯＤ−Ｌ
生産に対する酵母エキス濃度の影響

【表３】

【００４７】さらに、炭素源として１.５％メタノー
ル、１.５％メタノール＋３％グリセロール、３％グリ
セロールのいずれかを含有する培地でＣ．boidinii Ｔ
Ｋ６２／ｐＮＥＰ１４株を培養しＦＡＯＤ−Ｌ生産のタ
イムコースをとったところ、図９に示すように、メタノ
ール培地でのみ、顕著な生産が認められ、培養４０時間
で最大の生産性を示した。以上の実験の結果から、ＦＡ
ＯＤ−Ｌ生産能力を有する形質転換体の培養に適した培
地は、メタノール０.１〜５.０％、好ましくは１.５％
を含有する基本培地に、０.１〜５.０％、より好ましく
は０.５〜２.０％のＮＨ₄Ｃｌ及び／又は０.１〜５.０
％、より好ましくは１％の酵母エキスを含有するもので
あることが分かる。

【００４８】（５）Ｃ．boidinii TK62/pNEP14株のジャ
ーファーメンターを用いた大量培養C .boidinii TK62/pNEP14株を１５Ｌ容のジャーファーメ
ンターを用い、１Ｌの培地中で培養することにより、Ｆ
ＡＯＤ−Ｌの大量生産を行った。培地は以下の方法で調
整した。１Ｌ中に（ＮＨ₄Ｃｌ：５ｇ，Ｋ₂ＨＰＯ₄：１
ｇ，ＮａＨ₂ＰＯ₄：１ｇ，ＭｇＳＯ₄・２Ｈ₂０：０.５
ｇ，ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂０：０.１ｇ，酵母エキス：１０
ｇ）を含有する混合物を、ｐＨ６.０に調整し、１２０
℃，２０分オートクレイブ処理した後、１.５％になる
ようにメタノールを加える。その結果、図１０に示すよ
うに、培養４０時間でＦＡＯＤ−Ｌの生産は最大にな
り、４０時間を過ぎると生産性の減少が認められた。次
いで、得られた培養物を、遠心分離（１０,０００ｒｐ
ｍ、４℃、１分）により集菌し、ペレットを０.８５％
ＫＣｌで洗浄し、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液 (pH 8.
0)に懸濁した。MINI-BEAT BEATER（ジャパンラムダ社）
で菌体を３,８００ｒｐｍ、３０秒で氷冷をはさみなが
ら６回ビーズ破砕し、遠心分離（１,４００ｒｐｍ、４
℃、５分）して無細胞抽出液を調製した。このものを以
後、酵素液として用いた。

【００４９】実施例３糖化ヒト血清アルブミン濃度の
測定糖化ヒト血清アルブミン（シグマ社）を０.９％塩化ナ
トリウム水溶液で溶解させ、０〜１.０％の範囲で濃度
の異なる糖化ヒト血清アルブミン溶液を調製した。これ
らの溶液を用いて以下の操作を行った。１）プロテアーゼ処理糖化アルブミン溶液６０μl １２.５mg/ml プロテアーゼXIV（シグマ社）溶液６０μl この混合液を３７℃で３０分間インキュベートし、その
後、約９０℃で５分間、加熱して反応を停止させた。

【００５０】２）活性測定ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。４５mＭ４−アミノアンチピリン溶液３０μｌ６０mＭＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ− ３−スルホプロピル）−m−トルイジン溶液３０μｌ６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液３０μｌ０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）３００μｌ６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液５０μｌ蒸留水で全量を１mlとした。６ユニット／ml ＦＡＯＤ
−Ｌ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを６ユ
ニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（p
Ｈ８.０）で希釈して調製した。ＦＡＯＤ反応液を３０
℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアー
ゼ処理溶液を１００μl加え、３０分後の５５５nmにお
ける吸光度を測定した。この方法で得られる糖化アルブ
ミンの濃度と吸光度との関係を図１１に示す。図中の縦
軸は５５５nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸
は糖化アルブミンの濃度を表す。図は、糖化アルブミン
の濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示し
ている。

【００５１】実施例４ヒト血清アルブミンの糖化率の
測定０.９％塩化ナトリウム水溶液３mlに、糖化ヒト血清ア
ルブミン（シグマ社）１５０mg、ヒト血清アルブミン
（シグマ社）１５０mgをそれぞれ溶解した。これらの溶
液を混合することにより、糖化率の異なる溶液を作製
し、自動グリコアルブミン測定装置（京都第一科学）を
用いて検定したところ、その糖化率は、２４.６％〜６
１.１％であった。これらの溶液を用いて以下の操作を
行った。１）プロテアーゼ処理糖化アルブミン溶液６０μl １２.５mg/ml プロテアーゼXIV（シグマ社）溶液６０μl この溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、その
後、約９０℃で５分間加熱して反応を停止させた。

【００５２】２）活性測定ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。４５mＭ４−アミノアンチピリン溶液３０μｌ６０mＭＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ− ３−スルホプロピル）−m−トルイジン溶液３０μｌ６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液３０μｌ０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）３００μｌ６ユニット／ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液５０μｌ蒸留水で全量を１mlとした。６ユニット／ml ＦＡＯＤ
−Ｌ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを６ユ
ニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（p
Ｈ８.０）で希釈して調製した。ＦＡＯＤ反応液を３０
℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアー
ゼ処理溶液を１００μl加え、３０分後の５５５nmにお
ける吸光度を測定した。この方法で得られるアルブミン
の糖化率と吸光度との関係を図１２に示す。図中の縦軸
は５５５nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸は
アルブミンの糖化率を表す。図は、アルブミンの糖化率
と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示してい
る。

【００５３】実施例４糖化ヘモグロビン濃度の測定グリコヘモグロビンコントロール（シグマ社）を蒸留水
で溶解させ、０〜３０％の範囲で濃度の異なる糖化ヘモ
グロビン溶液を調製した。これらの溶液を用いて以下の
操作を行った。１）プロテアーゼ処理糖化ヘモグロビン溶液２５μl ５００ユニット／ml アミノペプチダーゼ溶液５μl ０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）２０μl この混合液を３０℃で３０分間インキュベートした。そ
の後、１０％トリクロロ酢酸を５０μl加えて撹拌し、
０℃で３０分間静置した後１２０００回転で１０分間遠
心分離を行った。得られた上清に２ＭＮaＯＨを約５
０μl加え中性溶液にした。

【００５４】２）活性測定ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。３ｍＭＮ−カルボメチルアミノ−２−フェニルアミン溶液３０μl ６０ユニット/ml パーオキシダーゼ溶液３０μl 0.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pＨ８.０）３００μl ４ユニット/ml ＦＡＯＤ−Ｌ溶液１０μl 蒸留水で全量を１mlとした。４ユニット／ml ＦＡＯＤ
−Ｌ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤ−Ｌを４ユ
ニット／mlになるよう、０.１Ｍトリス−塩酸緩衝液（p
Ｈ８.０）で希釈して調製した。ＦＡＯＤ反応液を３０
℃で２分間インキュベートした後、上記の各プロテアー
ゼ処理溶液を８０μl加え、３０分後の７２７nmにおけ
る吸光度を測定した。この方法で得られる糖化ヘモグロ
ビンの濃度と吸光度との関係を図１３に示す。図中の縦
軸は７２７nmの吸光度（過酸化水素の量に対応）、横軸
は糖化ヘモグロビンの濃度を表す。図は、糖化ヘモグロ
ビンの濃度と過酸化水素発生量が相関関係にあることを
示している。

【００５５】

【配列表】

【００５６】配列番号：１配列の長さ：１３１４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源生物名：Ａspergillus terreus ＧＰ１配列 ATG CCA GTC ACC AAG TCT TCG TCG ATA TTG ATC ATC GGG GCG GGC 45 Met Pro Val Thr Lys Ser Ser Ser Ile Leu Ile Ile Gly Ala Gly 1 5 10 15 ACC TGG GGT TGC TCA ACT GCC CTG CAT CTT GCC CGC AGA GGA TAC 90 Thr Trp Gly Cys Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly Tyr 20 25 30 ACC AAT GTC ACT GTC CTT GAC CCG TAC CCG GTT CCA TCA GCC ATT 135 Thr Asn Val Thr Val Leu Asp Pro Tyr Pro Val Pro Ser Ala Ile 35 40 45 TCG GCC GGC AAC GAC GTC AAC AAG ATC ATC TCG TCC GGC CAG TAC 180 Ser Ala Gly Asn Asp Val Asn Lys Ile Ile Ser Ser Gly Gln Tyr 50 55 60 AGC AGC AAG AAG GAC GAG GTC GAA GTC AAT GAG ATT ATC GCC GAA 225 Ser Ser Lys Lys Asp Glu Val Glu Val Asn Glu Ile Ile Ala Glu 65 70 75 CAG GCC TTC AAT GGC TGG AAA AAT GAC CCC ATC TTC AAG CCG TAC 270 Gln Ala Phe Asn Gly Trp Lys Asn Asp Pro Ile Phe Lys Pro Tyr 80 85 90 TAC CAC GAC ACC GGC GTC GTG ATG TCC GCC ACC ACA CAG GAA GGA 315 Tyr His Asp Thr Gly Val Val Met Ser Ala Thr Thr Gln Glu Gly 95 100 105 TTG GAG CGT CTG GGG GTC CGC GTG CGA CCT GAA GAT GAA CCC GAT 360 Leu Glu Arg Leu Gly Val Arg Val Arg Pro Glu Asp Glu Pro Asp 110 115 120 GTA GCC GAA TTG ACT CGG CCG GAG CAG TTC CGC CAG CTG GCC CCC 405 Val Ala Glu Leu Thr Arg Pro Glu Gln Phe Arg Gln Leu Ala Pro 125 130 135 GGC GTC TTG AAG GGT AAC TTC CCC GGT TGG AGG GGG TAC CAC ATT 450 Gly Val Leu Lys Gly Asn Phe Pro Gly Trp Arg Gly Tyr His Ile 140 145 150 CGC TCA AAC GCG GGC TGG GCG CAT GCG CGC AAC GCC CTG GTC GCC 495 Arg Ser Asn Ala Gly Trp Ala His Ala Arg Asn Ala Leu Val Ala 155 160 165 GCG GCG CGG GAG GCA CAG CGC CTG GGT GTG CGC TTC GTC GCG GGA 540 Ala Ala Arg Glu Ala Gln Arg Leu Gly Val Arg Phe Val Ala Gly 170 175 180 TCG CCG CAG GGC AGA GTC ATC ACG TTG ATT TTT GAG AAC AAC GAT 585 Ser Pro Gln Gly Arg Val Ile Thr Leu Ile Phe Glu Asn Asn Asp 185 190 195 GTG AAG GGT GCC GTC ACG GCG GAC GGC AAG ATC TGG CGG GCC GAG 630 Val Lys Gly Ala Val Thr Ala Asp Gly Lys Ile Trp Arg Ala Glu 200 205 210 CAG ACT ATC CTC TGC GCT GGT GCG GCC GCC GGC CAG TTT CTG GAT 675 Gln Thr Ile Leu Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gln Phe Leu Asp 215 220 225 TTC AAG GAC CAA CTG CGT CCC ACT GCG TGG ACT CTG GTC CAC ATC 720 Phe Lys Asp Gln Leu Arg Pro Thr Ala Trp Thr Leu Val His Ile 230 235 240 CAG TTG AAG CCG GAA GAG CGT GCC CAG TAT AAA AAC ATG CCG GTG 765 Gln Leu Lys Pro Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Lys Asn Met Pro Val 245 250 255 GTC TTC AAC ATC GAG AAG GGG TTC TTC TTC GAG CCG GAT GAG GAG 810 Val Phe Asn Ile Glu Lys Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp Glu Glu 260 265 270 CGT GGT GAA ATC AAG ATC TGC GAC GAA CAC CCC GGG TAC ACG AAT 855 Arg Gly Glu Ile Lys Ile Cys Asp Glu His Pro Gly Tyr Thr Asn 275 280 285 ATG ACC ACG GGG GCC GAC GGC CGC GTG AGG AGC ATT CCC TTC GAG 900 Met Thr Thr Gly Ala Asp Gly Arg Val Arg Ser Ile Pro Phe Glu 290 295 300 AAG ACG CAG GTT CCT CGA GAA GCG GAG ATG CGC GTC CGC AAG CTT 945 Lys Thr Gln Val Pro Arg Glu Ala Glu Met Arg Val Arg Lys Leu 305 310 315 CTG TCT GAA ACG ATG CCT CAG CTT GCG GAC CGG CCG TTC AGT TTC 990 Leu Ser Glu Thr Met Pro Gln Leu Ala Asp Arg Pro Phe Ser Phe 320 325 330 GCA AGG ATC TGC TGG TGT GCG GAT ACC CCC AAT CGC GAG TTT ATC 1035 Ala Arg Ile Cys Trp Cys Ala Asp Thr Pro Asn Arg Glu Phe Ile 335 340 345 ATT GAC CGT CAT CCC GAA TAC CCG TCG CTT GTT CTT GGG TGT GGT 1080 Ile Asp Arg His Pro Glu Tyr Pro Ser Leu Val Leu Gly Cys Gly 350 355 360 GCT TCA GGA CGA GGC TTC AAA TAT CTT CCC TCG ATC GGA AGC ATC 1125 Ala Ser Gly Arg Gly Phe Lys Tyr Leu Pro Ser Ile Gly Ser Ile 365 370 375 ATC GCA GAC GCC ATG GAG GAC AAA ACC CCG GCA AAA ATC CAC AAG 1170 Ile Ala Asp Ala Met Glu Asp Lys Thr Pro Ala Lys Ile His Lys 380 385 390 CTG ATC CGC TGG AGC CCG GAA ATC GCG ATC AAC CGT AAC TGG GGG 1215 Leu Ile Arg Trp Ser Pro Glu Ile Ala Ile Asn Arg Asn Trp Gly 395 400 405 GAC AGA TTA GGT CGA TTT GGA GGG CCC AAC CGG GTC ATG GAT TTC 1260 Asp Arg Leu Gly Arg Phe Gly Gly Pro Asn Arg Val Met Asp Phe 410 415 420 AAT GAA GTG AAG GAG TGG ACT AAT GTC ACC CAA AGG GAC ATC TCG 1305 Asn Glu Val Lys Glu Trp Thr Asn Val Thr Gln Arg Asp Ile Ser 425 430 435 AAG TTA TAG 1314 Lys Leu 437

【００５７】配列番号：２配列の長さ：１７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：Ａspergillus terreus ＧＰ１配列ＰｒｏＶａｌＴｈｒＬｙｓＳｅｒＳｅｒＳｅｒＩｌｅＬｅｕ
ＩｌｅＩｋｅＧｌｙＡｌａＧｌｙＴｈｒＴｒｐ１５
１０１５Ｇｌｙ１７

【００５８】配列番号：３配列の長さ：１６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：Ａspergillus terreus ＧＰ１配列 Leu Thr Arg Pro Glu Gln Phe Arg Gln Leu Ala Pro Gly Val Leu Lys 1 5 10 16

【００５９】配列番号：４配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 YTNATHATHG GNGCNGGN C NTGG 24

【００６０】配列番号：５配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＣＣＮＧＧＮＧＣＮＡＲＹＴＧＮＣＫＲＡＡＹＴＧＹＴＣ
２６

【００６１】配列番号：６配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＡＴＡＡＴＧＣＣＡＧＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣＴ
２１

【００６２】配列番号：５配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列ＧＡＴＡＧＡＴＴＡＡＣＴＡＴＴＡＴＡＣＡＴＣＧＡ
２４

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＲに用いるためのプライマーの、ＦＡＯ
Ｄ−Ｌの部分アミノ酸配列との関係を示す説明図。

【図２】ＦＡＯＤ−ＬをコードするＤＮＡを含むプラ
スミドｐＦＡＬ２の制限地図。

【図３】ＲＴ−ＰＣＲにおけるアガロース電気泳動の
結果を示す模写図であって、図中、レーン１はφＸ１７
４／ＨｉｎｃＩＩ；レーン２はプライマー１及び２を用
いた電気泳動パターンを表す。

【図４】図３の約４００bpのＰＣＲ断片のサブクロー
ニングにおける電気泳動の結果を示す模写図であって、
図中、レーン１はλ／ＥcoＴ１４１、レーン２はｐＦＬ
Ｐ／ＢamＨＩの泳動パターンを表す。

【図５】ＦＡＯＤ−Ｌ発現ベクターｐＮＦＬ８の制限
地図。

【図６】アスペルギルス・テレウスＧＰ１（Ａsper
gillus terreus ＧＰ１；ＦＥＲＭＰ−１５６６４）
由来の精製ＦＡＯＤ−ＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル
硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に
かけて得た移動パターンを示す写真。

【図７】図６と同様のＦＡＯＤ−Ｌの、スーパーデッ
クス２００pgを用いたゲルろ過による分子量測定の結果
を示すグラフ。

【図８】ｐＮＦＬ８により形質転換されたC.boidi nii
形質転換体の染色体ＤＮＡのサザン解析の結果を示すア
ガロース電気泳動パターンの模写図。

【図９】 C.boidinii TK62/pNEP14株の、１.５％メタ
ノール、１.５％メタノール＋３％グリセロール又は３
％グリセロールを含有する培地でのＦＡＯＤ−Ｌ活性産
生のタイムコースを示すグラフ。

【図１０】 C.boidinii TK62/pNEP14株のジャーファー
メンター培養におけるＦＡＯＤ−Ｌ活性産生のタイムコ
ースを示すグラフ。

【図１１】糖化ヒト血清アルブミンの濃度とＦＡＯＤ
作用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラ
フ。

【図１２】ヒト血清アルブミンの糖化率とＦＡＯＤ作
用により生成された過酸化水素量との関係を示すグラ
フ。

【図１３】糖化ヘモグロビンの濃度とＦＡＯＤ作用に
より生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/26 9452−4ＢＣ１２Ｑ 1/26 Ｇ０１Ｎ 33/66 Ｇ０１Ｎ 33/66 33/68 33/68 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:72） (72)発明者福家博司京都府京都市南区東九条西明田町57番地株式会社京都第一科学内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アスペルギルス属（Ａspergillus）の菌
に由来するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコード
する異種遺伝子を導入された真核細胞により生産された
ことを特徴とするフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項２】アスペルギルス属の菌がアスペルギルス
・テレウスＧＰ１（Ａspergillus te rreus ＧＰ１；
ＦＥＲＭ−１５６６４）である請求項１記載のフルクト
シルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項３】異種遺伝子が、ｍＲＮＡから逆転写酵素
により合成されたＤＮＡ又はその断片である請求項１記
載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項４】異種遺伝子が、ｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣ
Ｒにより合成されたＤＮＡ又はその断片である請求項１
記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載のフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子を含有
し、真核細胞内で機能的な発現ベクター。
【請求項６】プラスミドｐＮＦＬ８である請求項５記
載の発現ベクター。
【請求項７】請求項５又は６に記載の発現ベクターで
形質転換された形質転換体。
【請求項８】酵母である請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】メタノール酵母である請求項８記載の形
質転換体。
【請求項１０】請求項８又は９に記載の形質転換体を
培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼを回収することを特徴とするフルクトシルアミノ
酸オキシダーゼの製造方法。
【請求項１１】培地が、メタノール０.１〜５.０％、
及び０.１〜５.０％のＮＨ₄Ｃｌ及び／又は０.１〜５.
０％の酵母エキスを含有するものである請求項１０記載
の方法。
【請求項１２】アマドリ化合物を含有する試料と、請
求項７〜９のいずれかに記載の宿主細胞の培養物又はそ
の処理物を接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発
生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ化
合物の分析法。
【請求項１３】試料が生体成分であり、アマドリ化合
物の分析が、該生体成分中の糖化タンパクの量及び／又
は糖化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量により
なされることを特徴とする請求項１２記載の分析法。
【請求項１４】請求項７〜９のいずれかに記載の宿主
細胞の培養物またはその処理物を含有するアマドリ化合
物の分析のための試薬又はキット。
【請求項１５】生体成分中の糖化タンパクの量及び／
又は糖化率の測定、あるいはフルクトサミンの定量のた
めに用いられることを特徴とする請求項１４記載の試薬
又はキット。