JPH10330364A - New substance egs-1300-1 and its production - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To produce a new compound, having activities for inhibiting sialic acid transferases and effective as an inhibitor, etc., of cancer metastasis. SOLUTION: This compound is represented by the formula (R is linoleoyl) or its pharmacologically acceptable salt. The physicochemical properties thereof manifest properties such as a red glassy solid. The compound is preferably produced by culturing a microorganism, belonging to the genus Penicillium and having the ability to produce the above compound (FERM BP-5869) on a culture medium at 16-37 deg.C temperature and pH 4-10 for 1-7 days according to a liquid culture method, especially a submerged spinner culture method, etc., and isolating the resultant compound from a cultured product. The daily dose of the compound for an adult is usually preferably about 0.01-2 mg/kg.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、シアル酸転移酵素
阻害活性を有する新規EGS-1300-1化合物またはその薬理
学的に許容される塩およびそれらの製造法に関する。[0001] The present invention relates to a novel EGS-1300-1 compound having sialyltransferase inhibitory activity, a pharmacologically acceptable salt thereof, and a method for producing the same.

【０００２】[0002]

【従来の技術】シアル酸（例えばN-アセチルノイラミン
酸）は、糖蛋白、糖脂質、多糖系糖鎖などとして細胞表
面に存在していることが知られている。このシアル酸
は、神経機能、癌、炎症、細胞の分化、ウィルス感染、
免疫等において重要視され、細胞表面に局在する特異な
活性分子として医学ならびに薬学的に注目されつつあ
る。2. Description of the Related Art It is known that sialic acid (for example, N-acetylneuraminic acid) exists on cell surfaces as glycoproteins, glycolipids, polysaccharide sugar chains, and the like. This sialic acid is used for nervous function, cancer, inflammation, cell differentiation, viral infection,
It is regarded as important in immunity and the like, and is attracting medical and pharmacological attention as a specific active molecule localized on the cell surface.

【０００３】また、生体内でシアル酸を糖鎖に転移する
のはシアル酸転移酵素であることが知られていることか
ら、シアル酸転移酵素の作用を阻害する化合物は、神経
機能、癌、炎症、細胞の分化、ウィルス感染、免疫など
を解明するうえで有用であると期待される。特にある種
の癌細胞では、糖鎖の非還元末端を占めるシアル酸の膜
表面における含有量と癌細胞の転移能とが正の相関を示
すことが最近報告されている［Shimono et al., Am. J.
Gastroenterol., 89, 101-105 (1994)；Nakayama et a
l., Cancer, 75, 2051-2056 (1995)］。このため、シア
ル酸転移酵素の作用を阻害する化合物は、癌の転移阻害
剤として有効であることが期待される。Since it is known that sialyltransferase transfers sialic acid to a sugar chain in a living body, compounds that inhibit the action of sialyltransferase include nervous functions, cancer, and the like. It is expected to be useful in elucidating inflammation, cell differentiation, virus infection, immunity, etc. Particularly in some cancer cells, it has recently been reported that the content of sialic acid occupying the non-reducing end of the sugar chain on the membrane surface and the metastatic ability of cancer cells show a positive correlation [Shimono et al., Am. J.
Gastroenterol., 89, 101-105 (1994); Nakayama et a
l., Cancer, 75, 2051-2056 (1995)]. Therefore, a compound that inhibits the action of sialyltransferase is expected to be effective as a cancer metastasis inhibitor.

【０００４】シアル酸転移酵素に対して阻害作用を有す
る低分子化合物としては、N-アセチルラクトサミン誘導
体［Kajihara et al., Carbohydrate Research, 247, 1
79-193 (1993)］やシアル酸誘導体などの基質誘導体
（特開平8-198891号公報、特開平198892号公報）が知ら
れている。[0004] Low molecular weight compounds having an inhibitory effect on sialyltransferase include N-acetyllactosamine derivatives [Kajihara et al., Carbohydrate Research, 247, 1].
79-193 (1993)] and substrate derivatives such as sialic acid derivatives (JP-A-8-198891 and JP-A-198892).

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、シア
ル酸転移酵素に対して阻害活性を有する化合物およびそ
れらの製造法を提供することにある。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide compounds having inhibitory activity on sialyltransferase and a method for producing them.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明によれば、式
（Ｉ）According to the present invention, there is provided a compound of formula (I)

【０００７】[0007]

【化２】 Embedded image

【０００８】（式中、Ｒはリノレオイルを表す）で表さ
れるシアル酸転移酵素阻害作用を有する化合物EGS-1300
-1またはその薬理学的に許容される塩が提供される。ま
た本発明により、ペニシリウム属に属し、EGS-1300-1を
生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物か
らEGS-1300-1を採取することを特徴とするEGS-1300-1の
製造法が提供される。A compound having a sialyltransferase inhibitory activity represented by the formula (wherein R represents linoleoyl):
-1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is provided. Further, according to the present invention, belonging to the genus Penicillium, cultivating a microorganism having the ability to produce EGS-1300-1 in a medium, EGS-1300-1 characterized by collecting EGS-1300-1 from the culture, A manufacturing method is provided.

【０００９】[0009]

【発明の実施の形態】本発明を詳細に説明する。以下、
式（Ｉ）で表される化合物のうち、DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention will be described in detail. Less than,
Among the compounds represented by the formula (I),

【００１０】[0010]

【化３】 Embedded image

【００１１】で表される化合物を化合物EGS-1300-1aと
する。化合物EGS-1300-1aの物理化学的性質は以下に示
すとおりである。なお、以下のデータは下記の機器によ
り測定した。 融点：柳本製作所 ミクロ融点測定装置 比旋光度：日本分光 DIP-370 デジタル旋光計 紫外部吸収スペクトル：島津製作所 UV-2200 分光計 赤外部吸収スペクトル：日本電子 JIR-RFX3001 分光計 FAB マススペクトルおよび高分解能FAB マススペクト
ル：日本電子 JMS-HX110/110A質量分析計¹³ Cおよび¹H NMRスペクトル：日本電子 JNM-α400 核磁
気共鳴装置The compound represented by the following formula is designated as compound EGS-1300-1a. The physicochemical properties of compound EGS-1300-1a are as shown below. The following data was measured with the following equipment. Melting point: Yanagimoto Seisakusho Micro melting point apparatus Specific rotation: JASCO DIP-370 Digital polarimeter Ultraviolet absorption spectrum: Shimadzu Corporation UV-2200 spectrometer Red outside absorption spectrum: JEOL JIR-RFX3001 Spectrometer FAB Mass spectrum and high resolution FAB mass spectrum: JEOL JMS-HX110 / 110A mass spectrometer ¹³ C and ¹ H NMR spectrum: JEOL JNM-α400 nuclear magnetic resonance apparatus

【００１２】化合物EGS-1300-1aの物理化学的データ 性状：赤色ガラス状固体 FABMSスペクトル：m/z ポジティブモード；1134・1136 (M+Na)⁺, 1112・1114
(M+H)⁺ ネガティブモード；1110・1112 (M-H)^- 高分解能FABMSスペクトル：m/z ポジティブモード；1112.6357 (M+H)⁺, Δ=-0.1 mmu (C
₆₂H₉₆O₁₂N³⁵ClPとして) ネガティブモード；1110.6216 (M-H)^-, Δ=+1.4 mmu (C
₆₂H₉₄O₁₂N³⁵ClPとして) UVスペクトル (CH₃OH)：λ_max nm (ε) 478 (6,200),
370 (37,100), 345 sh(35,000), 232 (28,900) IRスペクトル (CHCl₃)：ν_max cm^-1 3400, 2927, 173
4, 1699, 1591, 1506,1456, 1371, 1086¹ H NMRスペクトル (500 MHz, CDCl₃, 内部標準 TMS)：
δppm (積分, 多重度,結合定数） 8.23 (1H, br s), 6.
96 (1H, s), 6.92 (1H, d, J=15.1 Hz), 6.18(1H, d, J
=15.1 Hz), 5.68 (1H, d, J=9.9 Hz), 5.40-5.29 (8H,
m), 5.15 (1H,m), 4.32 (1H, dd, J=11.5, 2.1 Hz), 4.
19 (1H, m), 4.11 (1H, m), 4.09 (1H, m), 4.04 (2H,
m), 3.85 (1H, m), 3.77 (1H, m), 2.76 (4H, t, J=6.5
Hz),2.48 (1H, m), 2.25 (4H, m), 2.13 (3H, s), 2.0
4 (8H, m), 1.80 (3H, s), 1.55 (4H, m), 1.52 (3H,
s), 1.43 (2H, m), 1.38-1.20 (28H, m), 1.01 (3H, d,
J=6.6 Hz), 0.89 (6H, t, J=7.4 Hz), 0.88 (3H, t, J=
6.9 Hz)¹³ C NMRスペクトル (125MHz, CDCl₃, 内部標準 TMS)、
複数のシグナルが重なっている部分があるのでシグナル
の数と炭素原子の数とは一致しない：δppm (多重度)
195.3 (s), 183.9 (s), 173.7 (s), 173.5 (s), 170.7
(s), 148.5 (s), 148.0 (d), 145.6 (d), 144.6 (s), 1
44.0 (d), 132.2 (s), 130.3 (d), 130.0 (d), 128.2
(d), 127.9 (d), 114.7 (d), 113.6 (s), 111.4 (d), 1
01.8 (s), 85.4 (s), 70.5 (d), 63.5 (t), 63.2 (t),
62.7 (t), 53.7 (t), 35.0 (d),34.3 (t), 34.1 (t), 3
2.0 (t), 31.6 (t), 30.1 (t), 29.76 (t), 29.73 (t),
29.63 (t), 29.42 (t), 29.39 (t), 29.38 (t), 29.34
(t), 29.27 (t), 29.22(t), 29.18 (t), 27.26 (t), 2
7.24 (t), 25.7 (t), 25.0 (t), 24.9 (t), 23.4(q), 2
2.6 (t), 20.4 (q), 20.2 (q), 14.13 (q), 14.09 (q),
12.6 (q), 12.0(q)³¹ P NMR スペクトル (161.7MHz, CDCl₃, 外部標準 85%
リン酸)：δppm 0.7 0 Physicochemical data of compound EGS-1300-1a : red glassy solid FABMS spectrum: m / z positive mode: 1134.1136 (M + Na) ⁺ , 1112.1114
(M ⁺ H) + negative mode; 1110 · 1112 (MH) ^- High resolution FABMS spectrum: m / z positive ^{mode; 1112.6357 (M + H) +} , Δ = -0.1 mmu (C
Negative mode; 1110.6216 (MH) ^- , Δ = + 1.4 mmu (as ₆₂ H ₉₆ O ₁₂ N ³⁵ ClP)
₆₂ H ₉₄ O ₁₂ N ³⁵ ClP) UV spectrum (CH ₃ OH): λ _max nm (ε) 478 (6,200),
370 (37,100), 345 sh (35,000), 232 (28,900) IR spectrum (CHCl ₃ ): ν _max cm ^-1 3400, 2927, 173
4, 1699, 1591, 1506, 1456, 1371, 1086 ¹ H NMR spectrum (500 MHz, CDCl ₃ , internal standard TMS):
δppm (integral, multiplicity, coupling constant) 8.23 (1H, br s), 6.
96 (1H, s), 6.92 (1H, d, J = 15.1 Hz), 6.18 (1H, d, J
= 15.1 Hz), 5.68 (1H, d, J = 9.9 Hz), 5.40-5.29 (8H,
m), 5.15 (1H, m), 4.32 (1H, dd, J = 11.5, 2.1 Hz), 4.
19 (1H, m), 4.11 (1H, m), 4.09 (1H, m), 4.04 (2H,
m), 3.85 (1H, m), 3.77 (1H, m), 2.76 (4H, t, J = 6.5
Hz), 2.48 (1H, m), 2.25 (4H, m), 2.13 (3H, s), 2.0
4 (8H, m), 1.80 (3H, s), 1.55 (4H, m), 1.52 (3H,
s), 1.43 (2H, m), 1.38-1.20 (28H, m), 1.01 (3H, d,
J = 6.6 Hz), 0.89 (6H, t, J = 7.4 Hz), 0.88 (3H, t, J =
6.9 Hz) ¹³ C NMR spectrum (125 MHz, CDCl ₃ , internal standard TMS),
The number of signals and the number of carbon atoms do not match because some signals overlap: δppm (multiplicity)
195.3 (s), 183.9 (s), 173.7 (s), 173.5 (s), 170.7
(s), 148.5 (s), 148.0 (d), 145.6 (d), 144.6 (s), 1
44.0 (d), 132.2 (s), 130.3 (d), 130.0 (d), 128.2
(d), 127.9 (d), 114.7 (d), 113.6 (s), 111.4 (d), 1
01.8 (s), 85.4 (s), 70.5 (d), 63.5 (t), 63.2 (t),
62.7 (t), 53.7 (t), 35.0 (d), 34.3 (t), 34.1 (t), 3
2.0 (t), 31.6 (t), 30.1 (t), 29.76 (t), 29.73 (t),
29.63 (t), 29.42 (t), 29.39 (t), 29.38 (t), 29.34
(t), 29.27 (t), 29.22 (t), 29.18 (t), 27.26 (t), 2
7.24 (t), 25.7 (t), 25.0 (t), 24.9 (t), 23.4 (q), 2
2.6 (t), 20.4 (q), 20.2 (q), 14.13 (q), 14.09 (q),
12.6 (q), 12.0 (q) ³¹ P NMR spectrum (161.7 MHz, CDCl ₃ , 85% external standard)
Phosphoric acid): δppm 0.70

【００１３】化合物EGS-1300-1の薬理学的に許容される
塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、
アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等
を包含する。酸付加塩としては塩酸塩、硫酸塩、リン酸
塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、
酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩等の有機酸塩があげら
れ、金属塩としてはリチウム塩、ナトリウム塩、カリウ
ム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等
があげられ、アンモニウム塩としてはアンモニウム、テ
トラメチルアンモニウム等の塩があげられ、有機アミン
付加塩としてはモルホリン、ピペリジン等の付加塩があ
げられ、アミノ酸付加塩としてはグリシン、フェニルア
ラニン、アスパラギン酸、リジン等の付加塩があげられ
る。The pharmacologically acceptable salts of the compound EGS-1300-1 include pharmacologically acceptable acid addition salts, metal salts,
Includes ammonium salts, organic amine addition salts, amino acid addition salts and the like. Acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate and phosphate, acetate, maleate, fumarate,
Organic salts such as tartrate, citrate and lactate can be mentioned. Examples of metal salts include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, and aluminum. Salts, zinc salts, etc .; ammonium salts, such as ammonium and tetramethylammonium; organic amine addition salts, such as morpholine and piperidine; and amino acid addition salts, such as glycine and phenylalanine. , Aspartic acid, lysine and the like.

【００１４】次に、化合物EGS-1300-1の製造法について
説明する。化合物EGS-1300-1は、ペニシリウム属に属
し、EGS-1300-1生産能を有する微生物を培地に培養し、
培養物中にEGS-1300-1を生成蓄積させ、該培養物からEG
S-1300-1を採取することにより得られる。EGS-1300-1生
産能を有する微生物としては、ペニシリウム属に属し、
EGS-1300-1生産能を有する菌株であればいずれの菌株で
も用いることができる。また、これらの菌株の人工的変
異方法、たとえば紫外線照射、X 線照射、変異誘起剤処
理などによって変異させた変異株あるいは自然的に変異
した変異株でも EGS-1300-1生産能を有するものであれ
ば本発明に用いることができる。Next, a method for producing the compound EGS-1300-1 will be described. Compound EGS-1300-1 belongs to the genus Penicillium, and cultured in a medium a microorganism having EGS-1300-1 producing ability,
EGS-1300-1 was produced and accumulated in the culture, and EG was extracted from the culture.
Obtained by collecting S-1300-1. As a microorganism capable of producing EGS-1300-1, belongs to the genus Penicillium,
Any strain having EGS-1300-1 producing ability can be used. In addition, artificial strains of these strains, for example, mutant strains mutated by ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, mutagen treatment, etc. or naturally mutated strains, can also produce EGS-1300-1. If present, it can be used in the present invention.

【００１５】具体的に好敵な例としては、ペニシリウム
・スピーシーズ（Penicillium sp.）G-1300株があげら
れる。本発明者らは土壌から分離したG-1300株を培地に
培養して得られる培養液中にシアル酸転移酵素阻害作用
を有する物質（EGS-1300-1）が生産されることを見い出
した。A particularly favorable example is Penicillium sp. G-1300 strain. The present inventors have found that a substance having a sialyltransferase inhibitory activity (EGS-1300-1) is produced in a culture solution obtained by culturing a G-1300 strain isolated from soil in a medium.

【００１６】本発明化合物を生産する代表菌株ペニシリ
ウム・スピーシーズ（Penicilliumsp.）G-1300株の菌学
的性質について以下に述べる。The bacteriological properties of the representative strain Penicillium sp. G-1300 producing the compound of the present invention are described below.

【００１７】肉眼的観察 麦芽エキス寒天培地を用いて、25℃で培養したとき、集
落の直径は培養7 日目で28〜30 mm、培養14日目で48〜5
0 mmに達する。集落の表面は灰色がかった緑青色から暗
灰色を呈し、周囲はオレンジ色を呈する。また、集落裏
面はオレンジ色から褐色を呈する。培地中には褐色系の
色素を出す。 Macroscopic observation When cultivated on a malt extract agar medium at 25 ° C., the diameter of the colonies was 28 to 30 mm on the 7th day of culture and 48 to 5 mm on the 14th day of culture.
Reaches 0 mm. The surface of the settlement is grayish green-blue to dark gray, and the surrounding area is orange. In addition, the backside of the colony turns orange to brown. A brownish pigment appears in the medium.

【００１８】バレイショ・ブドウ糖寒天培地を用いて、
25℃で培養したとき、集落の直径は培養7 日目で32〜34
mm、培養14日目で55〜57 mmに達する。集落の表面は灰
色がかった緑青色から暗灰色を呈し、周囲はオレンジ色
を呈する。また、集落裏面はオレンジ色から褐色を呈す
る。培地中には褐色系の色素を出す。本菌の至適生育温
度は11〜32℃で、26℃付近で最も良好に生育する。生育
しうるpHは2〜11で、pH 6前後で最も良好に生育する。Using a potato-glucose agar medium,
When cultured at 25 ° C, the diameter of the colonies is 32-34 on day 7 of culture.
mm, reaching 55-57 mm on day 14 of culture. The surface of the settlement is grayish green-blue to dark gray, and the surrounding area is orange. In addition, the backside of the colony turns orange to brown. A brownish pigment appears in the medium. The optimal growth temperature of this bacterium is 11-32 ° C, and it grows best around 26 ° C. It can grow at pH 2-11, and grows best around pH 6.

【００１９】光学顕微鏡的観察 麦芽エキス寒天培地を用いて、25℃で2 週間培養したと
きの本菌の光学顕微鏡による観察結果は以下のとおりで
ある。菌糸は隔壁を有し、平滑でよく分岐する。分生子
柄は束状になることはなく、菌糸から単生し、立ち上が
る。分生子柄は、平滑で、隔壁を有し、幅2.0〜3.2μ
m、長さは180 μmに至る。分生子柄の先端に7〜11本の
フィアライドを形成し、そのフィアライド先端より分生
子を形成する。フィアライドはトックリ形を呈し、無
色、平滑で、長さ8.0〜12.5μm、幅は最も広い部位にお
いて3.0〜5.5 μm、先端部は幅1.0〜1.5 μmである。分
生子の個体発生様式は内生出芽型であり、その形成様式
はフィアロ型である。フィアロ型分生子は単細胞、球形
〜亜球形、平滑で、直径2.0〜3.0 μmである。分生子は
単独では無色を呈するが、集合すると黄金色を呈する。
本菌株は上述したアナモルフのみ観察され、テレオモル
フは観察されない。[0019] Using an optical microscope observation malt extract agar, observation by an optical microscope of this bacteria when cultured for 2 weeks at 25 ° C. is as follows. Hyphae have septum and are smooth and well-branched. The conidiophores do not form a bundle, but stand singly from mycelium and stand up. Conidiophores are smooth, with septum, width 2.0-3.2μ
m, length up to 180 μm. 7 to 11 phialides are formed at the tip of the conidiophore, and conidium is formed from the phialide tip. The phialide has a stocky shape, is colorless and smooth, has a length of 8.0 to 12.5 μm, a width of 3.0 to 5.5 μm at the widest part, and a width of 1.0 to 1.5 μm at the tip. The ontogeny mode of the conidium is the endogenous budding type, and its formation mode is the phialo type. Phialo-conidia are unicellular, spherical to subspherical, smooth, 2.0-3.0 μm in diameter. Conidia alone are colorless, but when assembled they appear golden.
In this strain, only the anamorph described above is observed, and no teleomorph is observed.

【００２０】以上の菌学的性質より、本菌の分類学的位
置を「ザ・ジェネラ・オブ・ファンジャイ・スポルレイ
ティング・イン・ピュア・カルチャー 第２版 [The G
enera of Fungi Sporulating in Pure Culture, 2nd e
d., Cramer, Vaduz, J. A. von Arx, (1974)]」に従っ
て検索した結果、本菌は糸状不完全菌類のペニシリウム
(Penicillium)属に属することが明らかとなった。本発
明者らは本菌株を「ペニシリウム・スピーシーズ G-13
00 (Penicillium sp. G-1300)」と命名し、微工研条寄
ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６９号として、工業技術院生命工
学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番
３号）に平成９年３月１３日付けで寄託した。Based on the mycological properties described above, the taxonomic position of the fungus was referred to as "The Generala of Funjay Sporrating in Pure Culture 2nd Edition [The G
enera of Fungi Sporulating in Pure Culture, 2nd e
d., Cramer, Vaduz, JA von Arx, (1974)].
( Penicillium) . The present inventors referred to this strain as "Penicilium sp.
00 (Penicillium s p. G-1300) ", and the name is FERM BP-5869, which is a microfabrication laboratory of the Ministry of Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). Was deposited on March 13, 1997.

【００２１】本発明のEGS-1300-1生産菌の培養に際して
は、菌類の培養に用いられる通常の培養方法が適用され
る。用いられる培地は、微生物の資化し得る炭素源、窒
素源、無機物などを程よく含有する培地であれば合成培
地、天然培地いずれでも用いることができる。炭素源と
しては、グルコース、マンノース、フラクトース、シュ
クロース、ラクトース、キシロース、アラビノース、マ
ンニトール、澱粉、デキストリン、糖蜜などの炭水化
物、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、フマール酸などの有機
酸、メタノール、エタノールなどのアルコール、メタ
ン、エタン、プロパン、n-パラフィンなどの炭化水素な
どが単独または組合せて用いられる。In culturing the EGS-1300-1 producing bacterium of the present invention, a usual culturing method used for culturing fungi is applied. As the medium to be used, any of a synthetic medium and a natural medium can be used as long as the medium appropriately contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, etc. which can be used by microorganisms. As a carbon source, glucose, mannose, fructose, sucrose, lactose, xylose, arabinose, mannitol, starch, dextrin, carbohydrates such as molasses, citric acid, organic acids such as malic acid, acetic acid, fumaric acid, methanol, ethanol, etc. And hydrocarbons such as methane, ethane, propane and n-paraffin, etc. are used alone or in combination.

【００２２】窒素源としては、塩化アンモニウム、硝酸
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
などのアンモニウム塩、アスパラギン酸、グルタミン、
シスチン、アラニンなどのアミノ酸、尿素、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・
リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または組合せて
用いられる。Examples of the nitrogen source include ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate and ammonium phosphate, aspartic acid, glutamine,
Amino acids such as cystine and alanine, urea, peptone,
Meat extract, yeast extract, dried yeast, corn steep,
Liquor, soy flour, casamino acid and the like are used alone or in combination.

【００２３】無機物としては、リン酸一水素カリウム、
リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン
酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸
マンガン、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化コバル
ト、炭酸カルシウム、炭酸バリウムなどが用いられる。
その他必要に応じて培地にビタミン、たとえばサイアミ
ンなどの菌体の増殖あるいは EGS-1300-1の生産を促進
する物質を加える。また用いる微生物が特定の物質を要
求する場合は、該物質を加える。As inorganic substances, potassium monohydrogen phosphate,
Potassium dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, nickel sulfate, zinc sulfate, copper sulfate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, cobalt chloride, calcium carbonate And barium carbonate.
In addition, if necessary, a substance that promotes the growth of bacterial cells or the production of EGS-1300-1 such as vitamins, for example, thiamine, is added to the medium. When the microorganism used requires a specific substance, the substance is added.

【００２４】培養は、液体培養法、特に深部攪拌培養法
などにより、16〜37℃の温度、好ましくは25〜32℃の温
度で、pH 4〜10、好ましくはpH 6〜8で行われる。通常1
〜7日の培養によって、目的化合物EGS-1300-1が培養物
中および菌体中に生成蓄積される。なお、培地の pH 調
整には、アンモニア水や炭酸アンモニウム溶液などが用
いられる。培養物中のEGS-1300-1生成量が最大に達した
ときに培養を停止する。The cultivation is carried out by a liquid culture method, particularly a submerged stirring culture method, at a temperature of 16 to 37 ° C., preferably 25 to 32 ° C., at pH 4 to 10, preferably pH 6 to 8. Usually 1
By culturing for 77 days, the target compound EGS-1300-1 is produced and accumulated in the culture and in the cells. Ammonia water or ammonium carbonate solution is used for adjusting the pH of the medium. The culture is stopped when the amount of EGS-1300-1 produced in the culture reaches a maximum.

【００２５】培養物中に蓄積した EGS-1300-1を培養物
から単離採取するに際しては、通常の生理活性物質を培
養物から採取する通常の方法が適用される。例えば、培
養物を濾過により培養濾液と菌体とに分け、菌体をメタ
ノールなどで抽出する。ついで、抽出液を希釈して、ポ
リスチレン系吸着剤、例えばダイヤイオン HP 20（三菱
化学社製）などに通塔して活性成分を吸着させ、ついで
アセトンとメタノールの混合溶媒などで溶出する。溶出
液を濃縮し、高速液体クロマトグラフィーなどにより、
目的化合物EGS-1300-1を得る。なお、培養、精製操作中
のEGS-1300-1の検出は、シリカゲル薄層クロマトグラフ
ィー、または、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に
よるEGS-1300-1の紫外部吸収を目安として追跡すること
ができる。When the EGS-1300-1 accumulated in the culture is isolated and collected from the culture, a general method for collecting a normal physiologically active substance from the culture is applied. For example, the culture is separated by filtration into a culture filtrate and cells, and the cells are extracted with methanol or the like. Next, the extract is diluted and passed through a polystyrene-based adsorbent, for example, Diaion HP 20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) to adsorb the active component, and then eluted with a mixed solvent of acetone and methanol. Concentrate the eluate, and by high performance liquid chromatography,
The target compound EGS-1300-1 is obtained. In addition, the detection of EGS-1300-1 during the culture and purification operations can be traced using the ultraviolet absorption of EGS-1300-1 by silica gel thin-layer chromatography or high-performance liquid chromatography (HPLC) as a guide. .

【００２６】なお、本化合物EGS-1300-1は立体異性体が
存在し得るが、それら異性体またはそれら異性体のいか
なる比率の混合物も本発明に包含される。化合物EGS-13
00-1の塩を取得したいとき、化合物EGS-1300-1が塩の形
で得られる場合には、そのまま精製すればよく、また、
遊離の形で得られる場合には、適当な溶媒に溶解または
懸濁し、酸を加え塩を形成させればよい。The present compound EGS-1300-1 may exist in stereoisomers, and the present invention includes those isomers or a mixture of these isomers in any ratio. Compound EGS-13
When obtaining the salt of 00-1, when the compound EGS-1300-1 is obtained in the form of a salt, it may be purified as it is.
When it is obtained in a free form, it may be dissolved or suspended in a suitable solvent and an acid may be added to form a salt.

【００２７】また、化合物EGS-1300-1またはそれらの薬
理学的に許容される塩は、水あるいは各種溶媒との付加
物の形で存在することもあるが、それら付加物も本発明
に包含される。次に化合物EGS-1300-1の生物活性につい
て試験例で説明する。The compound EGS-1300-1 or a pharmacologically acceptable salt thereof may be present in the form of an adduct with water or various solvents, and these adducts are also included in the present invention. Is done. Next, the biological activity of the compound EGS-1300-1 will be described in Test Examples.

【００２８】試験例 シアル酸転移酵素阻害試験 シアル酸転移酵素阻害効果は以下の方法で測定した。 （１）試料 シアル酸転移酵素としては、プロテインA と融合させた
Gal β 1,4 GlcNAc α2,3シアル酸転移酵素をナマルバK
JM-1細胞の培養上清に分泌させたものを用いた（特開平
5-336963、特開平6-277052）。 （２）測定方法 化合物EGS-1300-1と、アミノピリジンにより蛍光標識し
た0.1 mMの四糖類Galβ 1,4 GlcNAc β 1,3 Gal b 1, 4
Glc（ラクト-N-ネオテトラオース）を受容体基質と
し、5 mMのCMP-NeuAc をドナー基質として、シアル酸転
移酵素の活性を測定した。反応液に5 mlの酵素液および
0.1 M カコジル酸ナトリウム（pH 6.8）、0.01 Mの塩化
マンガン、0.45 % Triton X-100を加えて最終量を30 ml
とし、37℃で2時間保温した。その後試料を5分間煮沸
して反応を停止した。試料を12000x g で遠心した後、
その上清を下記条件の高速液体クロマトグラフィー（HP
LC）により分析した。HPLCの反応生成物（α2,3 シアリ
ルラクト-N-ネオテトラオース）と未反応基質（ラクト-
N-ネオテトラオース）のピーク面積により定量した。HPLC分析条件 カラム：TSK-gel ODS-80T_M（Tosoh社製） 溶出液：20 mM 酢酸アンモニウム（pH 4.0） 流速：1.0 ml/min 検出：蛍光強度（励起波長 320 nm、検出波長 400 nm） 試験結果を図１に示す。Test Example Sialyltransferase Inhibition Test The sialyltransferase inhibitory effect was measured by the following method. (1) Sample The sialyltransferase was fused with protein A.
Gal β 1,4 GlcNAc α2,3 sialyltransferase Namalba K
What was secreted into the culture supernatant of JM-1 cells was used.
5-336963, JP-A-6-277052). (2) Measurement method Compound EGS-1300-1 and 0.1 mM tetrasaccharide Galβ 1,4 GlcNAc β 1,3 Gal b 1,4 fluorescently labeled with aminopyridine
Sialyltransferase activity was measured using Glc (lacto-N-neotetraose) as an acceptor substrate and 5 mM CMP-NeuAc as a donor substrate. Add 5 ml enzyme solution and
Add 0.1 M sodium cacodylate (pH 6.8), 0.01 M manganese chloride, 0.45% Triton X-100 to a final volume of 30 ml
And kept at 37 ° C. for 2 hours. Thereafter, the sample was boiled for 5 minutes to stop the reaction. After centrifuging the sample at 12000xg,
The supernatant is subjected to high performance liquid chromatography (HP
LC). HPLC reaction product (α2,3 sialyl lacto-N-neotetraose) and unreacted substrate (lacto-
(N-neotetraose). HPLC analysis conditions _{Column: TSK-gel ODS-80T M} (Tosoh Corp.) eluent: 20 mM ammonium acetate (pH 4.0) flow rate: 1.0 ml / min Detection: Fluorescence intensity (excitation wavelength 320 nm, detection wavelength 400 nm) tests The results are shown in FIG.

【００２９】図１によれば、化合物EGS-1300-1は、明ら
かなシアル酸転移酵素阻害作用を示した。以上の試験結
果より、化合物EGS-1300-1は、優れたシアル酸転移酵素
阻害作用を有し、癌などの治療剤として有用であること
が確認された。化合物EGS-1300-1は、そのまま、あるい
は各種の医薬組成物として経口的または非経口的に投与
することができる。このような医薬組成物の剤形として
は、たとえば錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤、
坐剤、注射剤、点滴剤などがあげられる。According to FIG. 1, compound EGS-1300-1 showed a clear sialyltransferase inhibitory action. From the above test results, it was confirmed that the compound EGS-1300-1 has an excellent sialyltransferase inhibitory activity and is useful as a therapeutic agent for cancer and the like. Compound EGS-1300-1 can be administered as it is or orally or parenterally as various pharmaceutical compositions. Examples of the dosage form of such a pharmaceutical composition include tablets, pills, powders, granules, capsules,
Suppositories, injections, drops and the like can be mentioned.

【００３０】上記剤形の製剤化には、通常知られている
方法が適用され、たとえば各種の賦形剤、潤滑剤、結合
剤、崩壊剤、懸濁化剤、等張化剤、乳化剤、吸収促進剤
などを含有していてもよい。医薬組成物に使用される担
体としては、たとえば水、注射用蒸留水、生理食塩水、
グルコース、フラクトース、白糖、マンニット、ラクト
ース、澱粉、コーン・スターチ、ポテト・スターチ、セ
ルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、アル
ギン酸、タルク、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウ
ム、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウ
ム、尿素、シリコーン樹脂、ソルビタン脂肪酸エステ
ル、グリセリン脂肪酸エステルなどがあげられ、これら
は製剤の種類に応じて適宜選択される。For the preparation of the above dosage forms, generally known methods are applied, for example, various excipients, lubricants, binders, disintegrants, suspending agents, isotonic agents, emulsifiers, It may contain an absorption promoter or the like. The carrier used in the pharmaceutical composition includes, for example, water, distilled water for injection, physiological saline,
Glucose, fructose, white sugar, mannitol, lactose, starch, corn starch, potato starch, cellulose, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, hydroxypropyl cellulose, alginic acid, talc, sodium citrate, calcium carbonate, calcium hydrogen phosphate, stearin. Examples thereof include magnesium acid, urea, silicone resin, sorbitan fatty acid ester, and glycerin fatty acid ester, and these are appropriately selected according to the type of preparation.

【００３１】化合物EGS-1300-1の投与量は、目的とする
治療効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、体重など
により決められるが、経口もしくは非経口（たとえば、
注射、点滴、座剤による直腸投与あるいは皮膚貼付な
ど）的投与方法により、通常成人１日当り0.01〜2 mg/k
gである。以下に実施例をあげて本発明の態様を説明す
る。The dose of the compound EGS-1300-1 is determined depending on the desired therapeutic effect, the administration method, the treatment period, the age and weight of the patient, etc.
Injection, infusion, rectal administration with suppository or skin patch), usually 0.01 to 2 mg / k per adult per day
g. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to examples.

【００３２】[0032]

【実施例】実施例１ 化合物EGS-1300-1の製造法 種菌として、ペニシリウム・スピーシーズ G-1300株を
用いた。該菌株を 300ml 容量の三角フラスコ中のマッ
シュポテト素（雪印）30 g/L、酵母エキス 5 g/L、グル
コース 100 g/Lの組成からなる種培地（殺菌前 pH 6.
5）50 ml に植菌し、25℃で 72 時間振盪培養した。得
られた種培養液を 2 L容量の三角フラスコ中の下記組成
の発酵培地 500 mlに 10 %（容量）の割合で移し、25℃
で振盪（200rpm）培養を行った。Example 1 Method for producing compound EGS-1300-1 Penicillium sp . G-1300 was used as a seed bacterium . The strain was placed in a 300 ml Erlenmeyer flask in a seed medium consisting of 30 g / L of mashed potato (snow mark), 5 g / L of yeast extract, and 100 g / L of glucose (pH before sterilization: 6.
5) Inoculated into 50 ml, and cultured with shaking at 25 ° C for 72 hours. The obtained seed culture solution was transferred at a rate of 10% (volume) to 500 ml of a fermentation medium having the following composition in a 2 L Erlenmeyer flask at 25 ° C
And shaking (200 rpm).

【００３３】発酵培地組成：グルコース 20 g/L、マッ
シュポテト素（雪印）20 g/L、ペプトン（極東） 5 g/
L、 リン酸二水素カリウム 5 g/L、リン酸マグネシウム
0.5 g/L（殺菌前 pH 6.0、NaOHで調整） 培養中、培地の pH は特に制御しないで、96時間培養し
た。培養液から菌体を分離し、菌体に培養液と等量のメ
タノールを添加して攪拌した後、濾液 2.5 Lを得た。濾
液を水で希釈し、ポリスチレン系吸着剤、ダイヤイオン
HP 20（三菱化学社製）カラム 400 ml に通塔して活性
物質を吸着させた。メタノール、アセトン、脱イオン水
の混合溶液で活性物質を溶出した。活性画分を水で希釈
し、ポリスチレン系吸着樹脂剤、ダイヤイオンHP 20ss
（三菱化学社製）カラム 300 mlに通塔して活性物質を
吸着させた。カラムをメタノール、アセトン、脱イオン
水の混合溶液で溶出した。溶出された活性画分を濃縮
し、 下記の条件で高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
により活性画分を分画した。分画した活性画分をさらに
順相シリカゲルカラムを用いたHPLCによりクロロホル
ム、メタノール、水（800 : 100 : 5）で溶出し分画し
た。得られた活性画分をLH-20を用いてメタノールでゲ
ルろ過することにより、活性物質であるEGS-1300-1を1
4.2 mg 得た。HPLC分画条件 カラム：YMC-Pack SH-343-5AQ（YMC社製） 溶出液：溶媒A：95 %メタノール、溶媒B：メタノール／アセトン = 7 : 3 100 % A → 100 % Bの直線濃度勾配溶出 流速：2 ml/minFermentation medium composition: 20 g / L glucose, 20 g / L mashed potato (snow mark), 5 g / peptone (Far East)
L, potassium dihydrogen phosphate 5 g / L, magnesium phosphate
0.5 g / L (pH 6.0 before sterilization, adjusted with NaOH) During the culture, the culture was cultured for 96 hours without any special control of the pH of the medium. The cells were separated from the culture solution, methanol was added to the cells in an amount equal to that of the culture solution, and the mixture was stirred to obtain 2.5 L of filtrate. Dilute the filtrate with water and use polystyrene adsorbent, Diaion
The active substance was adsorbed by passing through a 400 ml HP 20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) column. The active substance was eluted with a mixed solution of methanol, acetone and deionized water. The active fraction is diluted with water and the polystyrene-based adsorption resin agent, Diaion HP 20ss
The column was passed through a 300 ml column (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) to adsorb the active substance. The column was eluted with a mixed solution of methanol, acetone and deionized water. The eluted active fractions are concentrated and subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) under the following conditions.
The active fraction was fractionated by. The fractionated active fraction was further eluted with chloroform, methanol and water (800: 100: 5) by HPLC using a normal phase silica gel column to fractionate. The obtained active fraction was subjected to gel filtration with methanol using LH-20, whereby 1% of the active substance EGS-1300-1 was obtained.
4.2 mg were obtained. HPLC fractionation condition column: YMC-Pack SH-343-5AQ (manufactured by YMC) Eluent: solvent A: 95% methanol, solvent B: methanol / acetone = 7: 3 100% A → 100% B linear concentration gradient Elution flow rate: 2 ml / min

【００３４】製剤例１ 錠剤 EGS-1300-1 100 g、ラクトース 40 g、コーンスターチ
18 gおよびカルボキシメチルセルロースカルシウム 10
gを混合し、10 %ヒドロキシプロピルセルロース溶液を
加えて練合する。この練合液を1.0 mmのバスケットを取
り付けた押しだし造粒機で造粒し、ステアリン酸マグネ
シウムを加えて整粒して打錠用顆粒とし、常法により打
錠を行って、1製剤（170 mg）中にEGS-1300-1を100 mg
含む8 mm径の錠剤を得る。Formulation Example 1 Tablet EGS-1300-1 100 g, lactose 40 g, corn starch
18 g and carboxymethylcellulose calcium 10
g are mixed, and a 10% hydroxypropylcellulose solution is added and kneaded. The kneaded liquid was granulated by an extrusion granulator equipped with a 1.0 mm basket, and magnesium stearate was added to the granulated granules to obtain granules for tableting. 100 mg of EGS-1300-1
To obtain tablets of 8 mm diameter.

【００３５】製剤例２ カプセル剤 EGS-1300-1の 50 g、ラクトース 80 gおよびポテトスタ
ーチ 38 gからなる混合物に、10 %ヒドロキシプロピル
セルロース溶液を加えて練合し、以下実施例1と同様に
造粒し、ステアリン酸マグネシウムを加えてカプセル充
填機によりハードカプセルに充填し、常法により1カプ
セル（170 mg）中 EGS-1300-1を 50 mg含むカプセル剤
を得る。Formulation Example 2 A 10% hydroxypropylcellulose solution was added to a mixture consisting of 50 g of capsule EGS-1300-1, 80 g of lactose and 38 g of potato starch, and kneaded. After granulation, magnesium stearate is added, and the mixture is filled into hard capsules by a capsule filling machine to obtain a capsule containing 50 mg of EGS-1300-1 in 1 capsule (170 mg) by a conventional method.

【００３６】製剤例３ ソフトカプセル剤 10 gのEGS-1300-1を100 gの大豆油に溶かし、得られる
溶液を常法によりカプセルに注入することにより、１カ
プセル当り10 mgの EGS-1300-1を含むソフトカプセル剤
を得る。Formulation Example 3 Soft capsules 10 g of EGS-1300-1 was dissolved in 100 g of soybean oil, and the resulting solution was injected into capsules by a conventional method to give 10 mg of EGS-1300-1 per capsule. To obtain a soft capsule.

【００３７】[0037]

【発明の効果】本発明により、シアル酸転移酵素阻害活
性を有する新規EGS-1300-1化合物またはその薬理学的に
許容される塩およびそれらの製造法が提供される。Industrial Applicability According to the present invention, there is provided a novel EGS-1300-1 compound having sialyltransferase inhibitory activity, a pharmacologically acceptable salt thereof, and a method for producing the same.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】この発明の、シアル酸転移酵素に対する阻害活
性を測定した実施例の結果を示したグラフである。横軸
はEGS-1300-1濃度（μｇ／ｍｌ）、縦軸は阻害率（％）
を表す。FIG. 1 is a graph showing the results of Examples of the present invention in which the inhibitory activity on sialyltransferase was measured. Horizontal axis shows EGS-1300-1 concentration (μg / ml), vertical axis shows inhibition rate (%)
Represents

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:80） (72)発明者 松田 譲 東京都小金井市貫井南町１−22−７──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI C12R 1:80) (C12P 17/12 C12R 1:80) (72) Inventor Yuzuru Matsuda 1-22-Nukii Minamimachi, Koganei-shi, Tokyo 7

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒはリノレオイルを表す）で表される化合物EG
S-1300-1またはその薬理学的に許容される塩。1. Formula (I): (Wherein, R represents linoleoyl)
S-1300-1 or a pharmacologically acceptable salt thereof. 【請求項２】 ペニシリウム属に属し、EGS-1300-1を生
産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物から
EGS-1300-1を採取することを特徴とする請求項１記載の
EGS-1300-1の製造法。2. A microorganism belonging to the genus Penicillium and having the ability to produce EGS-1300-1 is cultured in a medium, and the microorganism is cultured.
2. The method according to claim 1, wherein EGS-1300-1 is collected.
Manufacturing method of EGS-1300-1.