JPH10323187A - Expression vector for fused protein derived from antibody variable region and functional protein - Google Patents
Expression vector for fused protein derived from antibody variable region and functional proteinInfo
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- JPH10323187A JPH10323187A JP15297397A JP15297397A JPH10323187A JP H10323187 A JPH10323187 A JP H10323187A JP 15297397 A JP15297397 A JP 15297397A JP 15297397 A JP15297397 A JP 15297397A JP H10323187 A JPH10323187 A JP H10323187A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、抗体の可変領域と
機能性蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターに関す
るものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a vector for expressing a fusion protein of an antibody variable region and a functional protein.
【０００２】[0002]
【従来の技術】現在、体内成分の検出や定量に用いられ
る診断薬には、抗原抗体反応を利用した各種のイムノア
ッセイが広範囲に利用されている。その第一の理由は、
測定対象物と特異的に反応する抗体が比較的簡単に得ら
れる点である。初期のイムノアッセイでは、測定対象物
を抗原として動物に免疫し、動物の血中に出現するポリ
クローナルな抗体を精製して用いていたが、１９７５年
にKohlarとMilsteinがモノクローナル抗体の作成方法を
報告してからは(Nature Vol.256,page495-497(1975))、
細胞融合による抗体産生細胞株の確立と、クローニング
による特異性の高い抗体の選択が行えるようになり、質
的にも量的にもより安定な抗体の供給が可能になった。
最近では、遺伝子組み換え技術の発達により、抗体の遺
伝子をクローニングして大腸菌や培養細胞で抗体を製造
することも可能になった（文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA
Vol.81,page6851-6855(1984))。細胞融合により製造さ
れるモノクローナル抗体は、その大部分がマウス由来で
あったが、遺伝子組み換えにより製造される抗体は、抗
体分子の可変領域と定常領域の組み合わせにも自由度が
増し、抗体の利用範囲を大きく広げた。中でもヒト以外
の動物を免疫して得られた抗体分子の可変領域に、ヒト
の抗体分子の定常領域を結合して作るヒト型キメラ抗体
は、ヒトに投与した際の抗原性、免疫活性、安定性等の
点で他の抗体より優れており、体内診断薬や治療薬への
応用が試みられている。特開平７−１３５９７８では、
そうしたヒト型キメラ抗体を簡便に作成するための抗体
可変領域遺伝子の増幅用プライマーとキメラ抗体製造用
ベクターが開示されている。2. Description of the Related Art At present, various immunoassays utilizing an antigen-antibody reaction are widely used as diagnostic agents used for detection and quantification of internal components. The first reason is that
The point is that an antibody that specifically reacts with the measurement object can be obtained relatively easily. In early immunoassays, animals were immunized with the analyte as an antigen, and polyclonal antibodies that appeared in the blood of the animals were purified and used.In 1975, Kohlar and Milstein reported how to make monoclonal antibodies. And then (Nature Vol. 256, page 495-497 (1975)),
It has become possible to establish an antibody-producing cell line by cell fusion and to select a highly specific antibody by cloning, and to supply a more stable antibody qualitatively and quantitatively.
Recently, the development of genetic recombination technology has made it possible to produce antibodies in Escherichia coli and cultured cells by cloning antibody genes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Vol.81, page6851-6855 (1984)). Most of the monoclonal antibodies produced by cell fusion were derived from mice, but antibodies produced by genetic recombination have more flexibility in combining the variable region and constant region of the antibody molecule, and the use of antibodies The range has been greatly expanded. Above all, human-type chimeric antibodies made by binding the constant region of a human antibody molecule to the variable region of an antibody molecule obtained by immunizing a non-human animal are antigenic, immunologically active and stable when administered to humans. It is superior to other antibodies in terms of sex and the like, and its application to in vivo diagnostics and therapeutics has been attempted. In JP-A-7-135978,
A primer for amplifying an antibody variable region gene and a vector for producing a chimeric antibody for easily producing such a human chimeric antibody are disclosed.
【０００３】一方イムノアッセイでは、測定対象物ある
いはそれに対する抗体を標識物質で標識する必要があ
る。放射性物質は検出感度や標識操作の面で標識物質と
してよく用いられる物質の一つである。しかしながら、
放射性物質は作業者の被曝の危険性や廃棄物の処理とい
う面では不都合な点が多い。[0003] On the other hand, in an immunoassay, it is necessary to label an object to be measured or an antibody thereto with a labeling substance. A radioactive substance is one of the substances often used as a labeling substance in terms of detection sensitivity and labeling operation. However,
Radioactive materials have many disadvantages in terms of worker exposure risk and waste disposal.
【０００４】この問題を解決するために、各種の非放射
性のイムノアッセイが行われており、酵素を標識物質と
したエンザイムイムノアッセイは、その代表的なもので
ある。標識用の酵素としてはアルカリホスファターゼ、
β−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼなどが用いら
れる。一方、被標識物はほとんどの場合抗体である。そ
の理由として、抗体分子の場合、抗原結合部位以外の構
造が共通で、いったん確立した標識方法を応用しやす
い。標識抗体の方がイムノアッセイ以外にも利用範囲が
広い、などがあげられる。また、免疫組織染色の分野で
抗体の酵素標識法がある程度確立していたことも大きな
理由である。[0004] In order to solve this problem, various non-radioactive immunoassays have been performed, and an enzyme immunoassay using an enzyme as a labeling substance is a typical example. Alkaline phosphatase as an enzyme for labeling,
β-galactosidase, peroxidase and the like are used. On the other hand, the label is almost always an antibody. The reason is that in the case of an antibody molecule, the structure other than the antigen binding site is common, and it is easy to apply the labeling method once established. Labeled antibodies have a wider range of uses other than immunoassays. Another major reason is that the enzyme labeling method for antibodies has been established to some extent in the field of immunohistological staining.
【０００５】酵素による標識反応は、通常被標識物質と
酵素をそれぞれの持つ官能基と反応する二価性の架橋剤
で結合させることにより行われる。架橋剤としてはマレ
イミド化合物、ピリジン・スルフィド化合物などがよく
用いられる。かつて架橋剤による標識反応に伴った問題
点のほとんどは今日では解決されており、典型的な標識
酵素の製造は次のようにして行われる(J.of Biochemist
ry Vol.78,page423-425(1975))。抗体はＦｃ部位が関与
する非特異反応を抑え、かつ抗体の活性を損なわないた
めにヒンジ部のチオール基で架橋させる。そのためにペ
プシンで消化した後、還元してＦａｂ’に加工した抗体
分子断片にしておく。酵素側のアミノ基にはマレイミド
等の架橋剤を結合させておく。抗体とマレイミド化酵素
を反応させると抗体のヒンジ部のチオール基に架橋剤を
介して酵素が結合する。マレイミドを用いる反応の特異
性は、架橋剤を用いる反応の中では高い方であり、一般
的には抗体の活性を損なうことも少なく、商業的な供給
を可能にする程度の収量も期待できるとされている。[0005] The labeling reaction with an enzyme is usually carried out by bonding the substance to be labeled and a functional group of the enzyme with a divalent cross-linking agent which reacts with the functional group. As the crosslinking agent, a maleimide compound, a pyridine sulfide compound, or the like is often used. Most of the problems associated with labeling reactions with cross-linking agents have been solved today, and the production of a typical labeling enzyme is carried out as follows (J. of Biochemist
ry Vol.78, page 423-425 (1975)). The antibody is cross-linked with a thiol group at the hinge to suppress non-specific reactions involving the Fc site and not to impair the activity of the antibody. For this purpose, the antibody molecule fragment is digested with pepsin and then reduced to produce an Fab′-processed antibody molecule fragment. A crosslinking agent such as maleimide is bound to the amino group on the enzyme side. When the antibody is reacted with the maleimidating enzyme, the enzyme binds to the thiol group at the hinge portion of the antibody via a crosslinking agent. The specificity of the reaction using a maleimide is higher in the reaction using a cross-linking agent, and generally, the activity of the antibody is less likely to be impaired, and a yield that enables commercial supply can be expected. Have been.
【０００６】しかし、化学的架橋剤を用いる方法にも残
された問題点は存在する。まず架橋反応により、酵素や
抗体が損傷を受け、活性が損なわれる場合もある。また
抗体と酵素の結合は均一でなく、結合比率を均一にする
には高度な製造技術が要求される。このように架橋反応
による酵素標識抗体の製造は、商業的な水準には達して
いるものの歩留まりの面では充分とはいえず、より確実
に酵素標識抗体を大量生産できる方法が望まれている。[0006] However, there still remain problems in the method using a chemical crosslinking agent. First, the cross-linking reaction may damage the enzyme or antibody and impair its activity. In addition, the binding between the antibody and the enzyme is not uniform, and a high production technique is required to make the binding ratio uniform. As described above, the production of enzyme-labeled antibodies by the cross-linking reaction has reached a commercial level, but is not sufficient in terms of yield, and a method for more reliably producing large quantities of enzyme-labeled antibodies is desired.
【０００７】前記の問題点を解決するために、遺伝子組
み換えの技術を利用した酵素と抗体の融合蛋白質が考え
出された。抗体の重鎖または可変領域の遺伝子をクロー
ニングし、その下流に同様にクローニングした酵素の遺
伝子を連結してベクターに組み込む。このベクターを適
当な宿主で発現させると抗原に対する結合能と酵素活性
を併せ持つ融合蛋白質ができあがる。このような酵素−
抗体融合蛋白質であれば、化学的な架橋反応と異なり分
子が損傷を受けることはまったくない。また、酵素と抗
体の結合は安定かつ均一であり、結合比率も一定であ
る。そして、宿主細胞の培養により、架橋反応によるも
のよりも低コストで大量の酵素−抗体融合蛋白質を得る
ことができる。[0007] In order to solve the above problems, a fusion protein of an enzyme and an antibody utilizing a gene recombination technique has been devised. The gene for the antibody heavy chain or variable region is cloned, and the gene for the enzyme cloned in the same manner is ligated downstream of the gene and incorporated into a vector. When this vector is expressed in an appropriate host, a fusion protein having both antigen-binding ability and enzymatic activity is completed. Such enzymes-
In the case of an antibody fusion protein, unlike a chemical crosslinking reaction, the molecule is not damaged at all. The binding between the enzyme and the antibody is stable and uniform, and the binding ratio is constant. By culturing the host cells, a large amount of the enzyme-antibody fusion protein can be obtained at a lower cost than that obtained by the crosslinking reaction.
【０００８】このようにして得られる酵素−抗体融合蛋
白質に関しては、数多くの実例があり、Nature Vol.31
2,page604-608(1984)やGene Vol.43,page319-324(1986)
はその一例である。しかし、遺伝子組み換えによる酵素
−抗体融合蛋白質の製造にも難点はある。酵素ならびに
抗体の定常領域の遺伝子の塩基配列は不変であるが、抗
体の可変領域の遺伝子の塩基配列は多様な抗原と反応す
るために無限といえるほどの組み合わせを持つ。したが
って、目的とする抗原と反応する酵素−抗体融合蛋白質
を製造するためにはその都度可変領域に合わせてクロー
ニングを行わなければならなかった。先にあげた実例は
そのような初期の酵素−抗体融合蛋白質の作成例であ
り、イムノアッセイの酵素標識抗体として用いるより
も、酵素の精製を容易にするのが目的であり、別の抗体
には応用しにくいものであった。あるいは、特殊な結合
活性を備えた抗体を利用した生体内での標的治療の実現
を目的としたものであった。このような用途では、商業
的に多岐な成果が期待できるため、抗体遺伝子のクロー
ニングにコストをさくことが許容される。しかし、生体
外診断に用途を限った場合、このようなコストのかかる
技術は応用しにくい。加えてこれらの論文の中では、抗
体分子に他の蛋白質を融合させることによってヒンジ領
域における重鎖−重鎖間のＳ−Ｓ結合が阻害され、２価
構造を取りにくくなることが報告されている。[0008] There are many examples of the thus obtained enzyme-antibody fusion protein.
2, page604-608 (1984) and Gene Vol.43, page319-324 (1986)
Is an example. However, production of an enzyme-antibody fusion protein by genetic recombination also has disadvantages. The base sequences of the constant region genes of enzymes and antibodies are invariable, but the base sequences of the variable region genes of antibodies have an infinite number of combinations to react with various antigens. Therefore, in order to produce an enzyme-antibody fusion protein that reacts with the antigen of interest, cloning must be performed in accordance with the variable region each time. The example given above is an example of the preparation of such an initial enzyme-antibody fusion protein, which is intended to facilitate the purification of the enzyme rather than using it as an enzyme-labeled antibody in an immunoassay. It was difficult to apply. Alternatively, it has been aimed at realizing targeted therapy in vivo using an antibody having a special binding activity. In such applications, a wide variety of commercial results can be expected, so that it is acceptable to reduce the cost for cloning the antibody gene. However, if the application is limited to in vitro diagnosis, such an expensive technique is difficult to apply. In addition, in these articles, it has been reported that the fusion of an antibody molecule with another protein inhibits the SS bond between the heavy chain and the heavy chain in the hinge region and makes it difficult to form a bivalent structure. I have.
【０００９】また、可変領域遺伝子のクローニングを簡
単にするためには、特開平８−３８１７８に開示されて
いるような、各種のイムノグロブリンの可変領域の５’
側に共通性の高い塩基配列をいくつか選んでプライマー
とし、それらの混合物を用いる方法もある。しかし、共
通性の高いプライマーの混合物を使用しても、すべての
可変領域の遺伝子のバリエーションに対応できるわけで
はなく、増幅漏れが生じる可能性は残っている。また、
可変領域の各遺伝子を均等に増幅するために、各プライ
マーの混合比率を厳密に設定しなければならない。In order to simplify the cloning of the variable region gene, 5 'of the variable region of various immunoglobulins as disclosed in JP-A-8-38178 is disclosed.
There is also a method in which some base sequences having high commonality are selected as primers and a mixture thereof is used. However, even if a mixture of primers having high commonality is used, it is not possible to cope with gene variations in all variable regions, and there is a possibility that amplification leakage may occur. Also,
In order to uniformly amplify each gene in the variable region, the mixing ratio of each primer must be strictly set.
【００１０】後にはＰＣＲ(Poymerase Chain Reaction)
法により、遺伝子のクローニングが容易になり、ｓｃＦ
ｖ(single chain Fv)によるファージディスプレイ法(Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.85,page5879-5883(1988))を
応用して可変領域と酵素との融合蛋白質の製造が容易に
なった(Nature Vol.339,page394-397(1989),Annals of
the New York Academy of Science Vol.646,page106-11
4(1991),Biotechnology Vol.10,page1128-1132(199
2))。しかし、これらの試みはいずれも大腸菌による発
現系であり、元の蛋白質に比べて活性が変化したり、時
には融合蛋白質が大腸菌にとって毒性を示す場合も予想
される。またｓｃＦｖに基づく大腸菌による発現系では
シングルチェーンとして発現させるので多くの場合もと
の抗体活性を実現しにくいという問題が有った。大腸菌
においてｓｃＦｖではなく軽鎖も備えた完全な抗体分子
を発現することができる方法も知られている（特開平６
−２７７０９２）が、この方法によって得られる融合蛋
白質では融合させた酵素の活性が明らかでない。またフ
ァージディスプレイ法と同様に細菌細胞を宿主として発
現させているので、動物由来の蛋白質において糖鎖の付
加が再現できずやはり活性維持が困難となるケースが生
じる。以上のように、抗体遺伝子の組み換えが容易で、
しかもイムノアッセイの分野で必要とされる酵素と抗体
の両方の活性を高い水準で維持した融合蛋白質を、動物
細胞で発現させる技術は未だに実用化されていない。[0010] Later, PCR (Poymerase Chain Reaction)
Method facilitates cloning of the gene,
v (single chain Fv) phage display method (Pr
Uc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 85, page 5879-5883 (1988)) facilitated the production of fusion proteins of variable regions and enzymes (Nature Vol. 339, page 394-397 (1989)). ), Annals of
the New York Academy of Science Vol.646, page106-11
4 (1991), Biotechnology Vol. 10, page 1128-1132 (199
2)). However, each of these attempts is an expression system using Escherichia coli, and it is expected that the activity may be changed as compared to the original protein, and sometimes the fusion protein may be toxic to Escherichia coli. In addition, the expression system using Escherichia coli based on scFv has a problem that it is difficult to realize the original antibody activity in many cases because it is expressed as a single chain. There is also known a method capable of expressing a complete antibody molecule having a light chain instead of a scFv in Escherichia coli (Japanese Patent Application Laid-Open No.
However, the activity of the fused enzyme is not clear in the fusion protein obtained by this method. In addition, since bacterial cells are expressed as a host in the same manner as in the phage display method, the addition of sugar chains cannot be reproduced in protein derived from animals, so that it may be difficult to maintain the activity. As described above, recombination of antibody genes is easy,
In addition, a technique for expressing a fusion protein, which maintains the activities of both an enzyme and an antibody required in the field of immunoassay at a high level, in animal cells has not yet been put to practical use.
【００１１】更に単に融合蛋白質としたのでは抗体や酵
素の活性を十分に期待できないケースもあることが明ら
かになってきている。たとえばアルカリホスファターゼ
と抗体分子と融合させる場合に、融合蛋白質を構成する
遺伝子を、これとは別にアルカリホスファターゼのサブ
ユニットのみをコードする分子とともに発現させること
によって高度な酵素活性を得る技術が知られている（特
開平８−７０８７５）。しかしこの方法では、付加的に
発現したサブユニットと融合蛋白質とが必ずしも好適な
バランスで接合するとは限らないため、十分な酵素活性
を期待できない可能性が予想される。Further, it has become clear that there are cases where the activity of antibodies and enzymes cannot be sufficiently expected simply by using a fusion protein. For example, in the case where alkaline phosphatase is fused with an antibody molecule, a technique for obtaining a high enzyme activity by expressing a gene constituting the fusion protein together with a molecule encoding only a subunit of alkaline phosphatase is known. (JP-A-8-70875). However, in this method, since the additionally expressed subunit and the fusion protein are not always joined in a suitable balance, it is expected that sufficient enzyme activity may not be expected.
【００１２】[0012]
【発明が解決しようとする課題】本発明が解決すべき課
題は、各種機能性蛋白質と可変領域を含む抗体分子との
結合が安定で均一な融合蛋白質を、簡便かつ大量に製造
するための技術を提供することである。多様性に富む抗
体分子を、低いコストで自由に組み換えることのできる
融合蛋白質の製造技術の提供が本発明の最大の課題であ
る。より具体的には、たとえば酵素−抗体融合蛋白質を
架橋反応によるダメージを受けない方法により、簡単に
製造するためのベクターとその構築方法を提供すること
である。更に本発明は、特に機能性蛋白質が複数のサブ
ユニットで構成される多量体構造であるときにも機能性
蛋白質と抗体分子の両者の活性を高度に維持できる新し
い技術を提供するものである。The problem to be solved by the present invention is to provide a simple and large-scale method for producing a stable and uniform fusion protein in which the binding between various functional proteins and an antibody molecule containing a variable region is stable. It is to provide. The greatest object of the present invention is to provide a technique for producing a fusion protein capable of freely recombining a variety of antibody molecules at low cost. More specifically, it is an object of the present invention to provide a vector for easily producing an enzyme-antibody fusion protein by a method that is not damaged by a crosslinking reaction, and a method for constructing the vector. Further, the present invention provides a new technique capable of maintaining the activity of both the functional protein and the antibody molecule at a high level even when the functional protein has a multimeric structure composed of a plurality of subunits.
【００１３】[0013]
【課題を解決するための手段】本発明者は、前記課題の
解決のために鋭意検討を行った。その結果、以下に示す
発明を提供することで前記課題を解決することを見出し
た。Means for Solving the Problems The present inventor has made intensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, they have found that the above-mentioned object can be solved by providing the following invention.
【００１４】［１］少なくとも可変領域を含む抗体分子
と機能性蛋白質とで構成される融合蛋白質を発現するベ
クターであって、抗体分子をコードする遺伝子を組み込
むための制限酵素サイトを有し、前記制限酵素サイトが
遺伝子増幅反応用のプライマーによって規定される塩基
配列に対応しており、可変領域を含む領域をコードする
遺伝子の下流に機能性蛋白質をコードする遺伝子が連結
されて１つの読み取り枠を構成しているベクター[1] A vector for expressing a fusion protein composed of an antibody molecule containing at least a variable region and a functional protein, the vector having a restriction enzyme site for incorporating a gene encoding the antibody molecule, The restriction enzyme site corresponds to the base sequence defined by the primer for the gene amplification reaction, and the gene encoding the functional protein is linked downstream of the gene encoding the region containing the variable region to form one open reading frame. Constituting vectors
【００１５】［２］抗体の可変領域をコードする遺伝子
を増幅するための３’側のプライマーが、ＩｇＧのＪ領
域において高度の保存性を有する領域に対して相補的で
あり、かつ制限酵素の切断部位を含む塩基配列、または
ＩｇＧのＪ領域において高度の保存性を有する領域に対
して相補的であり、かつ制限酵素の切断部位を付加した
塩基配列を含む塩基配列から選択される［１］のベクタ
ー[2] The 3 'primer for amplifying the gene encoding the variable region of the antibody is complementary to a highly conserved region in the IgG J region, and [1] selected from a nucleotide sequence containing a cleavage site, or a nucleotide sequence complementary to a region having a high degree of conservation in the IgG J region and containing a nucleotide sequence to which a restriction enzyme cleavage site has been added; Vector
【００１６】［３］抗体の可変領域をコードする遺伝子
を増幅するための５’側のプライマーが、塩基配列中に
少なくとも一か所の制限酵素の切断部位を含むｃＤＮＡ
の５’末端結合用アダプターである［１］のベクター[3] A 5'-side primer for amplifying a gene encoding a variable region of an antibody is a cDNA comprising at least one restriction enzyme cleavage site in the base sequence.
The vector of [1], which is an adapter for 5 'end binding of
【００１７】［４］抗体の可変領域が重鎖可変領域であ
る［１］のベクター[4] The vector according to [1], wherein the variable region of the antibody is a heavy chain variable region
【００１８】［５］同一のベクター上に、抗体の可変領
域として重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備え、このうち
重鎖可変領域が機能性蛋白質と融合している［１］のベ
クター[5] The vector according to [1], wherein the same vector is provided with a heavy chain variable region and a light chain variable region as antibody variable regions, of which the heavy chain variable region is fused to a functional protein.
【００１９】［６］更に抗体の定常領域をコードする遺
伝子を備えている［１］のベクター[6] The vector according to [1], further comprising a gene encoding a constant region of the antibody.
【００２０】［７］定常領域をコードする遺伝子が軽鎖
−重鎖間のＳ−Ｓ結合に関与するシステインを含むが、
重鎖−重鎖間のＳ−Ｓ結合に関与するシステインを含ま
ない領域をコードするものであり、ＩｇＧの軽鎖を組み
込んだ別のベクターとともに宿主細胞に導入し形質転換
させることによってＦａｂ類似の分子を発現する［６］
のベクター[7] The gene encoding the constant region contains a cysteine involved in the SS bond between the light chain and the heavy chain,
It encodes a region that does not contain cysteine that participates in the SS bond between heavy chains, and is introduced into another host cell together with another vector incorporating an IgG light chain, and transformed into a host cell. Expressing a molecule [6]
Vector
【００２１】［８］定常領域をコードする遺伝子が軽鎖
−重鎖間のＳ−Ｓ結合に関与するシステインと重鎖−重
鎖間のＳ−Ｓ結合に関与するシステインを含む領域をコ
ードするものであり、ＩｇＧの軽鎖を組み込んだ別のベ
クターとともに宿主細胞に導入し形質転換させることに
よってＦ（ａｂ’）２類似の分子を発現する［６］のベ
クター[8] The gene encoding the constant region encodes a cysteine involved in the SS bond between the light chain and the heavy chain and a cysteine involved in the SS bond between the heavy chain and the heavy chain. The vector of [6], which expresses a molecule similar to F (ab ') 2 by introducing it into a host cell together with another vector incorporating an IgG light chain and transforming the host cell.
【００２２】［９］抗体由来の遺伝子の下流に、リンカ
ーを介して機能性蛋白質をコードする遺伝子が連結され
ている［８］のベクター[9] The vector according to [8], wherein a gene encoding a functional protein is linked to the downstream of the antibody-derived gene via a linker.
【００２３】［１０］更に機能性蛋白質をコードする遺
伝子を組み込むための制限酵素サイトを持ち、前記制限
酵素サイトが機能性蛋白質をコードする遺伝子を増幅す
るためのプライマーによって規定される塩基配列に対応
している［１］のベクター[10] It further has a restriction enzyme site for incorporating a gene encoding a functional protein, and the restriction enzyme site corresponds to a base sequence defined by a primer for amplifying the gene encoding the functional protein. Vector of [1]
【００２４】［１１］機能性蛋白質が、酵素、サイトカ
イン、ホルモン、毒素、レセプター、シグナル伝達因
子、ＤＮＡ結合蛋白質、構造蛋白質、またはその断片、
あるいは誘導体で構成される群から選択される生理活性
物質である［１］のベクター[11] The functional protein is an enzyme, a cytokine, a hormone, a toxin, a receptor, a signal transduction factor, a DNA binding protein, a structural protein, or a fragment thereof,
Alternatively, the vector according to [1], which is a physiologically active substance selected from the group consisting of derivatives
【００２５】［１２］酵素が、アルカリホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキ
シダーゼ、またはその断片、あるいは誘導体から選択さ
れた酵素である［１］のベクター[12] The vector according to [1], wherein the enzyme is an enzyme selected from alkaline phosphatase, β-galactosidase, luciferase, peroxidase, or a fragment or derivative thereof.
【００２６】［１３］ベクターがＳＲαプロモーターと
イムノグロブリンのリーダー配列を備え、これらの構成
要素は前記抗体分子および／または融合蛋白質をコード
する遺伝子に対して機能的に配置され、動物細胞を宿主
として発現させるものである［１］のベクター[13] The vector comprises an SRα promoter and an immunoglobulin leader sequence, and these components are operatively arranged for the gene encoding the antibody molecule and / or the fusion protein, and the animal cell is used as a host. The vector of [1] to be expressed
【００２７】［１４］機能性蛋白質が動物に由来するも
のである［１３］のベクター[14] The vector according to [13], wherein the functional protein is derived from an animal.
【００２８】［１５］機能性蛋白質が、ポリ−Ｌ−ヒス
チジン、ポリ−Ｌ−リジン、またはビオチン結合性蛋白
質である［１］のベクター[15] The vector according to [1], wherein the functional protein is poly-L-histidine, poly-L-lysine, or a biotin-binding protein.
【００２９】［１６］機能性蛋白質が多量体構造を持つ
ものであり、この多量体構造を構成するサブユニット、
またはその断片が抗体分子と融合している［１］のベク
ター[16] The functional protein has a multimeric structure, and the subunits constituting the multimeric structure include:
Or the vector of [1], wherein the fragment is fused to the antibody molecule
【００３０】［１７］少なくとも可変領域を含む抗体分
子と、複数のサブユニットから構成される多量体構造を
取ることによって活性を発現する機能性蛋白質を構成す
るサブユニットとの融合蛋白質であって、融合蛋白質同
志が接合することによって機能性蛋白質の活性を発現す
るとともに、前記抗体分子の抗原結合活性も維持されて
いる融合蛋白質[17] A fusion protein of an antibody molecule containing at least a variable region and a subunit constituting a functional protein that exhibits an activity by taking a multimeric structure composed of a plurality of subunits, A fusion protein that expresses the activity of a functional protein by conjugation of fusion proteins and maintains the antigen-binding activity of the antibody molecule
【００３１】［１８］可変領域を含む抗体分子のうち少
なくとも重鎖が前記機能性蛋白質のサブユニットと融合
しており、前記重鎖が軽鎖との間に存在するＳ−Ｓ結合
を与えるシステインを含むが重鎖−重鎖間に存在するＳ
−Ｓ結合を与えるシステインは含まず、前記機能性蛋白
質のサブユニットが会合することによって多価の抗体様
の構造を取る［１７］の融合蛋白質[18] A cysteine that provides an SS bond existing between the heavy chain and the light chain, wherein at least the heavy chain of the antibody molecule containing the variable region is fused to the subunit of the functional protein. But exists between heavy chains and heavy chains.
The fusion protein of [17], which does not contain a cysteine that provides -S bond and has a multivalent antibody-like structure by associating the subunits of the functional protein.
【００３２】［１９］重鎖−重鎖間に存在するＳ−Ｓ結
合を与えるシステインを含まない抗体分子が、Ｆａｂま
たはＦａｂ類似の分子である［１８］の融合蛋白質[19] The fusion protein of [18], wherein the antibody molecule that does not contain cysteine that provides an SS bond existing between heavy chains is a Fab or a Fab-like molecule.
【００３３】［２０］重鎖−重鎖間に存在するＳ−Ｓ結
合を与えるシステインを含まない抗体分子が、このシス
テインを欠損するか、または他のアミノ酸に置換した変
異体分子である［１８］の融合蛋白質[20] An antibody molecule that does not contain a cysteine that provides an SS bond existing between heavy chains is a mutant molecule that lacks this cysteine or substitutes another amino acid [18] ] Fusion protein
【００３４】［２１］機能性蛋白質を構成するサブユニ
ットと、少なくとも可変領域を含む抗体の重鎖分子とか
らなる融合蛋白質であって、前記重鎖が軽鎖との間に存
在するＳ−Ｓ結合を与えるシステインと、重鎖−重鎖間
に存在するＳ−Ｓ結合を与えるシステインのいずれをも
含み、前記機能性蛋白質のサブユニットの接合とともに
抗体分子の間にもＳ−Ｓ結合を構成することによって多
価の抗体様の構造を取る［１７］の融合蛋白質[21] A fusion protein comprising a subunit constituting a functional protein and a heavy chain molecule of an antibody containing at least a variable region, wherein the heavy chain exists between the light chain and the SS It contains both cysteine that gives a bond and cysteine that gives an SS bond existing between heavy chains, and forms an SS bond between antibody molecules together with the subunit of the functional protein. Fusion protein of [17], which takes on a multivalent antibody-like structure by
【００３５】［２２］抗体分子と機能性蛋白質とが両者
の活性に影響を与えないアミノ酸配列からなるリンカー
を介して融合されている［２１］の融合蛋白質[22] The fusion protein of [21], wherein the antibody molecule and the functional protein are fused via a linker consisting of an amino acid sequence that does not affect the activities of both.
【００３６】［２３］多量体構造を取ることによって活
性を発現する機能性蛋白質が、アルカリホスファター
ゼ、またはβガラクトシダーゼである［１７］の融合蛋
白質[23] The fusion protein of [17], wherein the functional protein which expresses its activity by taking a multimeric structure is alkaline phosphatase or β-galactosidase
【００３７】［２４］少なくとも可変領域を含む抗体分
子と、複数のサブユニットから構成される多量体構造を
取ることによって活性を発現する機能性蛋白質を構成す
るサブユニットとの融合蛋白質において、前記抗体分子
が重鎖−重鎖間のＳ−Ｓ結合を与えるシステインを含ま
ないものとすることによって機能性蛋白質の活性を増強
する方法[24] A fusion protein of an antibody molecule containing at least a variable region and a subunit constituting a functional protein that exhibits activity by taking a multimeric structure composed of a plurality of subunits, wherein the antibody Method for enhancing the activity of a functional protein by making the molecule free of cysteine that provides heavy-to-heavy chain SS bond
【００３８】［２５］以下の工程を含む、少なくとも可
変領域を備えた抗体分子と機能性蛋白質とで構成される
融合蛋白質を発現するベクターを構築する方法 １）目的とする抗体の可変領域をコードする遺伝子を制
限酵素の認識配列を含むプライマーによって増幅する工
程 ２）工程１のプライマーによって規定される制限酵素認
識配列を備えたベクターに、当該制限酵素を利用して抗
体の可変領域をコードする遺伝子を組み込む工程 ３）工程２によって得られるベクターライブラリーを抗
体活性を指標としてクローニングした後に、または前に
融合させるべき機能性蛋白質をコードする遺伝子を組み
込む工程、ただし工程２のベクター上において抗体の可
変領域をコードする遺伝子の上流には蛋白質の発現に必
要な制御領域を持ち、下流には機能性蛋白質をコードす
る遺伝子が連結されて１つの読み取り枠を構成しており
１本のポリペプチドとして翻訳される[25] A method for constructing a vector for expressing a fusion protein composed of an antibody molecule having at least a variable region and a functional protein, comprising the following steps: 1) encoding a variable region of the desired antibody Amplifying the target gene with a primer containing a restriction enzyme recognition sequence 2) A gene encoding a variable region of an antibody using the restriction enzyme in a vector having a restriction enzyme recognition sequence defined by the primer in step 1 3) a step of incorporating a gene encoding a functional protein to be fused after or before cloning the vector library obtained in step 2 using the antibody activity as an index, except that the antibody The regulatory region required for protein expression is located upstream of the gene encoding the region, and downstream Is translated as a functional protein encoding genes linked one constitutes one reading frame to the polypeptide
【００３９】［２６］ベクターがＳＶ４０ｏｒｉ領域を
備えており、Large Ｔ抗原産生細胞を宿主としてベクタ
ーを発現させ、得られる発現産物を抗体活性のスクリー
ニングに用いる［２５］のベクターを構築する方法[26] A method for constructing a vector according to [25], wherein the vector has an SV40 ori region, the vector is expressed using a Large T antigen-producing cell as a host, and the resulting expression product is used for screening for antibody activity.
【００４０】［２７］抗体可変領域−機能性蛋白質融合
蛋白質が免疫学的な分析に用いるためのものであり、抗
体活性のスクリーニングにあたって抗体を介して免疫学
的な結合によって固相化した抗原を用いる［２６］のベ
クターを構築する方法[27] The antibody variable region-functional protein fusion protein is for use in immunological analysis. In screening for antibody activity, an antigen immobilized by immunological binding via an antibody is used. Method for constructing the vector of [26] to be used
【００４１】本発明において、「ＩｇＧのＪ領域」と
は、ＩｇＧの重鎖をコードするＶＤＪの各遺伝子（軽鎖
の場合はＶＪ）のうち、最も定常領域に接近した部分で
あり、複数種類のＪ領域が存在する（例えば重鎖の場合
はヒトではＪＨ１〜ＪＨ６の６種類、マウスではＪＨ１
〜ＪＨ４の４種類である。）。そして、かかるＪ遺伝子
の間で高度に保存されている領域を選択し、本発明では
可能な限り少ない種類のプライマーで全ての遺伝子の増
幅が可能となるように後述のプライマーを設定した。In the present invention, the “J region of IgG” refers to the portion of each gene of VDJ (VJ in the case of light chain) encoding the heavy chain of IgG which is closest to the constant region. (For example, in the case of a heavy chain, six types of JH1 to JH6 in humans, and JH1 in mouse).
To JH4. ). Then, a region highly conserved among the J genes was selected, and in the present invention, primers described later were set so that all the genes could be amplified with as few types of primers as possible.
【００４２】なお、本発明における「高度の保存性を有
する領域」とは、前記ＩｇＧのＪ領域において、その抗
体が認識する抗原決定基の違いにかかわらず定常性を有
する遺伝子部位のことである。例えばヒトＩｇＧ重鎖の
場合、Ｊ領域は前記のＪＨ１〜ＪＨ６の中から任意に選
択されることが知られている。そして、かかる一つのセ
グメントの中で（例えばＪＨ１ならＪＨ１の中で）アミ
ノ酸配列にはわずかずつの違いが存在するが、ＪＨ１内
のアミノ酸配列の違いのみならず、ＪＨ１〜ＪＨ６の各
セグメントの間に存在する比較的相同性の低いアミノ酸
配列間においても高度の定常性を有する部分のことを指
す。In the present invention, the "region having a high degree of conservation" refers to a gene site having constantity irrespective of the difference in the antigenic determinant recognized by the antibody in the J region of IgG. . For example, in the case of a human IgG heavy chain, it is known that the J region is arbitrarily selected from the aforementioned JH1 to JH6. And although there is a slight difference in the amino acid sequence in such one segment (for example, in JH1 in the case of JH1, not only the difference in the amino acid sequence in JH1 but also the difference between each segment of JH1 to JH6) And has a high degree of constancy even between amino acid sequences having relatively low homology.
【００４３】「相補的」とは、ＤＮＡ鎖同士における塩
基対が、原則として、アデニン(A)とチミン(T)及びグア
ニン(G)とシトシン(C)の対応関係を有することをいう。
しかしながら、本発明における「相補的」は、必ずしも
１００ ％の前記対応関係が要求されるわけではなく、
全体として７０％以上の前記塩基の対応関係、すなわち
相補性があれば足りる。かかる相補性が７０％未満にな
ると、Ｔｍが３０℃以上も下がり２０mer前後のプライ
マーでは一般的な温度条件でＤＮＡ鎖同士の結合が不十
分になる。あるいはアニール温度を下げると必然的に非
特異的結合の可能性も高まるため増幅産物のノイズが多
くなり、遺伝子増幅用プライマーとして利用しにくくな
るため好ましくない。"Complementary" means that, in principle, the base pairs in the DNA strands have a correspondence relationship between adenine (A) and thymine (T) and guanine (G) and cytosine (C).
However, “complementary” in the present invention does not necessarily require the above-mentioned correspondence of 100%.
It suffices that there is a correspondence of 70% or more of the bases as a whole, that is, complementarity. If the complementarity is less than 70%, the Tm drops by 30 ° C. or more, and the primers around 20 mer become insufficiently bonded to each other under a general temperature condition. Alternatively, lowering the annealing temperature inevitably increases the possibility of non-specific binding, which increases the noise of the amplification product and makes it difficult to use it as a primer for gene amplification.
【００４４】また、「相補的な塩基配列を含む」とは、
プライマー中に特定の塩基配列が包含されるという意味
であるが、同時にプライマー鎖の長さが特定の塩基配列
よりも短い場合をも含む。ただし、前者の場合はプライ
マー鎖全体に対する特定の塩基配列が含まれる割合が７
０％以上であることが条件であり、後者の場合はプライ
マー鎖の鎖長が特定の塩基配列の７０％以上であること
が条件となる。当該割合が７０％未満または当該鎖長が
７０％未満となると、Ｔｍが３０℃以上も下がり２０me
r前後のプライマーでは一般的な温度条件でＤＮＡ鎖同
士の結合が不十分になる。あるいはアニール温度を下げ
ると必然的に非特異的結合の可能性も高まるため増幅産
物のノイズが多くなり、遺伝子増幅用プライマーとして
利用しにくくなるため好ましくない。Further, "including a complementary nucleotide sequence" means
This means that the specific base sequence is included in the primer, but also includes the case where the length of the primer chain is shorter than the specific base sequence. However, in the former case, the ratio of the specific base sequence to the entire primer chain is 7%.
The condition is 0% or more, and in the latter case, the condition is that the length of the primer chain is 70% or more of the specific base sequence. When the ratio is less than 70% or the chain length is less than 70%, the Tm drops by 30 ° C. or more to 20 me.
r With primers before and after, binding between DNA strands becomes insufficient under general temperature conditions. Alternatively, lowering the annealing temperature inevitably increases the possibility of non-specific binding, which increases the noise of the amplification product and makes it difficult to use it as a primer for gene amplification.
【００４５】「制限酵素」とは、特定の識別塩基配列中
または当該識別塩基配列から離れた特定の位置でＤＮＡ
を切断し得る酵素のことをいう。かかる「制限酵素」識
別部位の種類は、エクソン中に存在する可能性の低いも
のを選択する必要があり、一般的には６塩基認識以上の
ものを用いる。後述のように、本発明においては、抗体
遺伝子のエクソン中に存在する可能性の低いものを選択
することがより好ましい。かかる好適な制限酵素として
は、例えばEcoRI、XhoI等を挙げることができる。な
お、以後本明細書中において「制限酵素」と記載された
ものは、かかる「制限酵素」を意味するものとする。"Restriction enzyme" refers to a DNA at a specific discriminating nucleotide sequence or at a specific position distant from the discriminating nucleotide sequence.
Refers to an enzyme that can cleave DNA. It is necessary to select a type of such a “restriction enzyme” identification site that is unlikely to be present in the exon, and generally uses one having 6 bases or more. As described later, in the present invention, it is more preferable to select one having a low possibility of existing in the exon of the antibody gene. Such preferred restriction enzymes include, for example, EcoRI, XhoI and the like. Hereinafter, what is described as “restriction enzyme” in the present specification means such “restriction enzyme”.
【００４６】「Ｆａｂ類似分子」とは、イムノグロブリ
ンをパパインで消化して得られる抗体可変領域からなる
Ｆａｂフラグメントと同等の組み換え蛋白質のことをい
う。Ｆａｂはパパインによりイムノグロブリンの重鎖を
切断して生成する軽鎖１分子と定常領域の一部を欠く重
鎖１分子がＳ−Ｓ結合したフラグメントであるが、Ｆａ
ｂ類似分子はイムノグロブリンの軽鎖遺伝子と定常領域
の一部を欠いた重鎖遺伝子を別々のあるいは一つのベク
ターに組み込んで発現させたＦａｂと同等の分子であ
る。したがってそのアミノ酸配列は必ずしもパパイン消
化部位に対応しなくてもよい。軽鎖とのＳ−Ｓ結合を備
え、パパイン消化によって得られるＦａｂと同様の基本
構造を持つものはＦａｂ類似分子に含まれる。Ｆａｂは
重鎖定常領域の一部を持たないため非特異的な結合を起
こしにくく組織染色に用いられる。また抗原性が低いこ
とからヒト以外の動物由来のＦａｂでもヒトに投与した
際に抗体産生を誘導しにくいため、Ｆａｂに薬剤等を結
合して投与しターゲッティングに用いられる。本発明で
得られるＦａｂ類似分子も、Ｆａｂと同等の効果が期待
できる。The term "Fab-like molecule" refers to a recombinant protein equivalent to a Fab fragment comprising an antibody variable region obtained by digesting immunoglobulin with papain. Fab is a fragment in which one light chain molecule produced by cleaving the immunoglobulin heavy chain with papain and one heavy chain molecule lacking a part of the constant region are S--S bonded.
The b-like molecule is a molecule equivalent to a Fab expressed by incorporating the immunoglobulin light chain gene and the heavy chain gene lacking a part of the constant region into separate or one vector. Therefore, the amino acid sequence does not necessarily have to correspond to the papain digestion site. Those having an SS bond to a light chain and having a basic structure similar to that of Fab obtained by papain digestion are included in Fab-like molecules. Since Fab does not have a part of the heavy chain constant region, it hardly causes nonspecific binding and is used for tissue staining. In addition, Fabs derived from animals other than humans are unlikely to induce antibody production when administered to humans because of their low antigenicity. Thus, Fabs are used after being bound with a drug or the like for targeting. Fab-like molecules obtained by the present invention can be expected to have the same effect as Fab.
【００４７】本発明のＦａｂ類似分子のバリエーション
として重鎖間のＳ−Ｓ結合を支えるシステインを欠損し
たりあるいは他のアミノ酸に置換した変異体分子（ミュ
ータント）を挙げることができる。具体的には、Ｖ領域
からＣＨ１を経てヒンジ領域に至るＦ（ａｂ’）２と同
じ構造を持ちながら、ヒンジ領域のシステインを他のア
ミノ酸に置換したために重鎖−重鎖間のＳ−Ｓ結合を欠
損しているものを例示できる。このような構造のＦａｂ
類似分子は、Ｆ（ａｂ’）２とほとんど同じ構造を持ち
ならが抗体分子としては単独では多価構造を取り得ない
ので、本発明においてはＦａｂ類似分子の一つとして含
まれる。このようなミュータントは、予めベクター側に
システインを他のアミノ酸に置換した配列を持つヒンジ
領域をコードする遺伝子を用意しておき、この上流にＦ
ａｂをコードする遺伝子を組み込むことによって発現さ
せることができる。Variations of the Fab-like molecule of the present invention include mutant molecules (mutants) in which the cysteine that supports the SS bond between heavy chains is deleted or replaced with another amino acid. Specifically, while having the same structure as F (ab ') 2 from the V region to the hinge region through CH1, the cysteine in the hinge region was replaced with another amino acid, so that the SS Those lacking a bond can be exemplified. Fab having such a structure
An analogous molecule has almost the same structure as F (ab ') 2, but cannot have a polyvalent structure by itself as an antibody molecule. Therefore, the analogous molecule is included as one of Fab-like molecules in the present invention. For such a mutant, a gene encoding a hinge region having a sequence in which cysteine is replaced with another amino acid is prepared in advance on the vector side, and F
It can be expressed by incorporating a gene encoding ab.
【００４８】「Ｆ（ａｂ’）２類似分子」とは、イムノ
グロブリンをペプシンで消化して得られる抗体可変領域
からなるＦ（ａｂ’）２フラグメントと同等の組み換え
蛋白質のことをいう。Ｆ（ａｂ’）２はペプシンにより
イムノグロブリンの重鎖を切断して生成するイムノグロ
ブリンから定常領域の一部を欠いた形のフラグメントで
あるが、Ｆ（ａｂ’）２類似分子はイムノグロブリンの
軽鎖遺伝子と定常領域の一部を欠いた重鎖遺伝子を別々
のあるいは一つのベクターに組み込んで発現させたＦ
（ａｂ’）２と同等の分子である。なおアミノ酸配列レ
ベルで必ずしもペプシン消化部位に対応していなくても
よい点については前述のＦａｂ類似分子と同じである。
Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆａｂと同様の用途に用いられる
が、本発明で得られるＦ（ａｂ’）２類似分子もＦ（ａ
ｂ’）２と同等の効果が期待できる。The "F (ab ') 2 similar molecule" refers to a recombinant protein equivalent to an F (ab') 2 fragment comprising an antibody variable region obtained by digesting immunoglobulin with pepsin. F (ab ') 2 is a fragment obtained by cleaving the heavy chain of an immunoglobulin with pepsin and lacking a part of the constant region from immunoglobulin. F expressed by integrating the light chain gene and the heavy chain gene lacking a part of the constant region into separate or integrated vectors
(Ab ') is a molecule equivalent to 2. It is the same as the Fab-like molecule described above in that it does not necessarily correspond to the pepsin digestion site at the amino acid sequence level.
F (ab ′) 2 is used for the same applications as Fab, but the F (ab ′) 2 analog molecule obtained in the present invention is also F (a ′) 2.
b ') An effect equivalent to 2 can be expected.
【００４９】「リンカー」とは２つの分子を結合させる
ために用いる鎖状の分子のことをいう。２つの分子を直
接結合させると立体障害等で反応性をそこなうような場
合に用いる。一般的には、直鎖炭化水素、オリゴペプチ
ド、オリゴヌクレオチドなどがある。本発明でいうとこ
ろのリンカーとは、抗体分子と機能性蛋白質とを結合さ
せるオリゴペプチド、ならびに該領域をコードするオリ
ゴヌクレオチドをさす。一例としてｓｃＦｖの発現系で
知られている（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３のフレキシブルリ
ンカーを示すことができる。これらのリンカーを介して
抗体分子と機能性蛋白質を結合させた構造とすることに
よって、両者の活性を高い水準に維持することができ
る。リンカーは、蛋白質の活性維持という目的だけでな
く機能性蛋白質の精製においても利用することができ
る。本発明の融合蛋白質は、抗体分子の結合活性を利用
して機能性蛋白質の精製にも応用することができる。こ
のときリンカーとして切断可能なアミノ酸配列を利用す
れば、抗体部分の結合活性によって固相に吸着した融合
蛋白質の回収が容易となる。このようなリンカーには、
エンドペプチダーゼが認識するアミノ酸配列が利用され
る。候補となるエンドペプチダーゼの中から、機能性蛋
白質の活性に影響を与えない条件の基で十分な切断活性
を示し、しかも目的とする機能性蛋白質や抗体分子の中
に存在しないアミノ酸配列を認識するものを選択する。
融合蛋白質の切断に利用できるエンドプロテアーゼとし
て、コラゲナーゼ（特開平４−２３４９８８）、カリク
レインＢ（特開昭５６−１６６２００）、あるいはトロ
ンビン等が知られている。The term "linker" refers to a chain-like molecule used to join two molecules. It is used when direct binding of two molecules impairs reactivity due to steric hindrance or the like. Generally, there are linear hydrocarbons, oligopeptides, oligonucleotides and the like. The linker in the present invention refers to an oligopeptide that binds an antibody molecule to a functional protein, and an oligonucleotide that encodes the region. As an example, a (Gly4-Ser) 3 flexible linker known in the scFv expression system can be shown. By forming a structure in which an antibody molecule and a functional protein are bound via these linkers, both activities can be maintained at a high level. The linker can be used not only for maintaining the activity of the protein, but also for purifying the functional protein. The fusion protein of the present invention can be applied to the purification of a functional protein utilizing the binding activity of an antibody molecule. At this time, if a cleavable amino acid sequence is used as a linker, the fusion protein adsorbed on the solid phase can be easily recovered by the binding activity of the antibody portion. Such linkers include:
The amino acid sequence recognized by endopeptidase is used. Among the candidate endopeptidases, show sufficient cleavage activity under conditions that do not affect the activity of the functional protein, and recognize amino acid sequences that are not present in the target functional protein or antibody molecule Choose one.
As an endoprotease that can be used for cleavage of the fusion protein, collagenase (Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-234988), kallikrein B (Japanese Patent Application Laid-Open No. 56-166200), thrombin, and the like are known.
【００５０】「機能性蛋白質」とは、特定の機能を有す
る蛋白質やペプチドのことをいう。具体的にはペプチド
ホルモン、サイトカイン、酵素、毒素、レセプター、シ
グナル伝達因子、ＤＮＡ結合蛋白質、構造蛋白質等の生
体が産生する生理活性を持つ蛋白質、またはそれらと同
等の機能を持つ合成ペプチド、リジンやヒスチジン等の
反応性の高いアミノ酸の繰り返し配列、さらには、ヘモ
グロビンやビオチン結合性蛋白質のように他の物質と協
同して機能を発揮する蛋白質を指す。これらの生理活性
物質は、必ずしも完全な分子である必要はなく、その生
理活性部位を備えていれば充分である。あるいは複数の
サブユニットが集合して活性を与える生理活性物質にお
いては、活性の発現に必要なサブユニットを機能性蛋白
質として用いる。この他、安定性や活性の改善を期待し
てアミノ酸配列に変異を導入する技術も公知である。抗
体と融合することによって有用性が期待できる生理活性
物質には、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、ルシフェラーゼ、あるいはパーオキシダーゼ等の
酵素を示すことができる。酵素は抗体の標識成分として
一般に用いられているので、両者を融合させた蛋白質は
そのまま標識抗体として利用できる。[0050] "Functional protein" refers to a protein or peptide having a specific function. Specifically, biologically active proteins such as peptide hormones, cytokines, enzymes, toxins, receptors, signal transduction factors, DNA binding proteins, structural proteins, and the like, or synthetic peptides having the same functions as those, It refers to a repetitive sequence of highly reactive amino acids such as histidine, and also a protein such as hemoglobin or biotin-binding protein that functions in cooperation with other substances. These biologically active substances do not necessarily need to be complete molecules, but it is sufficient if they have the biologically active site. Alternatively, in a physiologically active substance in which a plurality of subunits are aggregated to give an activity, a subunit necessary for the expression of the activity is used as a functional protein. In addition, a technique for introducing a mutation into an amino acid sequence in the hope of improving stability and activity is also known. Bioactive substances that can be expected to be useful when fused with an antibody include enzymes such as alkaline phosphatase, β-galactosidase, luciferase, and peroxidase. Since an enzyme is generally used as a labeling component of an antibody, a protein obtained by fusing both of them can be used as a labeling antibody as it is.
【００５１】前記生理活性物質のうち、本発明の開示に
よって特別な効果を期待できるものとして、複数のサブ
ユニットからなる多量体構造を取ることで活性を発現す
るものを示すことができる。たとえばヒトの胎盤に由来
するアルカリホスファターゼは、ホモダイマーとなって
酵素活性を発現する。βガラクトシダーゼでは、活性発
現のために４量体構造が必要である。本発明者はこれら
の酵素を構成するサブユニットを抗体分子と融合させた
時に、抗体の重鎖−重鎖間のＳ−Ｓ結合が存在している
と酵素の活性が低下する場合のあることを確認した。多
量体構造を持つ酵素の活性を抗体分子との融合後も高い
水準に維持するには、抗体分子は重鎖−重鎖間のＳ−Ｓ
結合を持たないものとするのが有利である。具体的には
実施例に示すようなＦａｂ、あるいは先にＦａｂ類似分
子として説明したＦ（ａｂ’）２を与えるヒンジ領域の
システインを他のアミノ酸に置換したミュータント等を
抗体分子として利用すると良い。先に抗体分子と機能性
蛋白質の両方の活性を高く維持する手段の一つとしてリ
ンカーを例示したが、抗体分子における重鎖−重鎖間の
Ｓ−Ｓ結合を除くことでも活性の維持が可能ということ
である。Among the above-mentioned physiologically active substances, those which can be expected to have a special effect according to the disclosure of the present invention are those which exhibit an activity by taking a multimeric structure comprising a plurality of subunits. For example, alkaline phosphatase derived from human placenta forms a homodimer and expresses enzymatic activity. β-galactosidase requires a tetrameric structure for expression of activity. The present inventor may find that when the subunits constituting these enzymes are fused with an antibody molecule, the activity of the enzyme may be reduced if an SS bond between the heavy chains of the antibody is present. It was confirmed. In order to maintain the activity of an enzyme having a multimeric structure at a high level even after fusion with an antibody molecule, the antibody molecule must have a heavy-chain SS
Advantageously, it has no bonds. Specifically, Fab as described in Examples or a mutant in which cysteine in the hinge region giving F (ab ') 2 described above as a Fab-like molecule is substituted with another amino acid may be used as the antibody molecule. Although a linker has been exemplified as one of the means for maintaining both the activity of the antibody molecule and the functional protein at a high level, the activity can also be maintained by removing the SS bond between heavy chains in the antibody molecule. That's what it means.
【００５２】更に、本発明のＦａｂ’類似分子が重鎖−
重鎖間のＳ−Ｓ結合を持たないために抗体分子が互いに
接合することがないことから、２機能性抗体 (bifuncti
onalantibody) の調製に応用することができる。通常の
ＩｇＧ分子は等しい結合活性を持つ２つの分子が接合し
た構造、すなわち２価構造を持っている。２機能性抗体
とは、２つの分子が異なる結合活性を持っているものの
総称である。従来の製造技術においては、抗体分子を還
元して１価の状態とし、これを他の抗体分子から得た１
価の抗体分子と接合することによって製造されていた。
この製造原理から明らかなように、同じ抗体分子が接合
したホモ接合体を生じる可能性を常に伴うため高い収率
を望みにくい。Further, the Fab ′ analog of the present invention is characterized in that
Since the antibody molecules do not have an S--S bond between the heavy chains and therefore do not conjugate with each other, the bifunctional antibody (bifuncti
onalantibody). A normal IgG molecule has a structure in which two molecules having the same binding activity are joined, that is, a bivalent structure. A bifunctional antibody is a generic term for two molecules having different binding activities. In the conventional production technology, an antibody molecule is reduced to a monovalent state, and the monovalent state is obtained from another antibody molecule.
It was produced by conjugation with a multivalent antibody molecule.
As is apparent from this production principle, it is difficult to expect a high yield because it always involves the possibility of producing a homozygote conjugated with the same antibody molecule.
【００５３】本発明に基づいて２機能性抗体を得るに
は、以下のような融合蛋白質を発現させると良い。まず
機能性蛋白質としてヘテロダイマーを構成するサブユニ
ットの組み合わせを選択する。ヘテロダイマー構造を持
つ機能性蛋白質には、ｆｏｓ−ｊｕｎのようなロイシン
ジッパーによって接合する蛋白質の組み合わせ等を示す
ことができる。蛋白質間の接合をもたらす構造には、こ
の他にもヘリックスループヘリックス（ＨＬＨ）構造も
知られており、ロイシンジッパーと同様に本発明におけ
る機能性蛋白質に応用することができる。これらの接合
体ペアを構成するサブユニットのそれぞれに対して、異
なる結合活性を持つ抗体分子を融合した融合蛋白質をコ
ードするベクターを構築する。それぞれのベクターを別
の宿主で発現させてその培養上清を混合すれば、ヘテロ
ダイマーの接合によって最終的には２機能性抗体と同じ
結合活性を持つヘテロな接合体を生じることになる。ヘ
テロダイマーを構成するサブユニットを用いているので
ホモ接合体を生じることがなく、効率良く２機能性抗体
を得ることができる。ファージディスプレー法におい
て、ヘテロダイマーとの融合により２機能性抗体の調製
を試みた報告も有るが(J.Biol.Chem.,271(13),7630-763
4,1996)、本発明のような重鎖と軽鎖を備えた完全な抗
体分子でヘテロダイマーとの組み合わせにより２機能性
抗体を得る技術は知られていない。同一のベクター上に
異なる結合活性を持つ抗体分子をコードする遺伝子を組
みこんだり、あるいは２つのベクターで同一の宿主細胞
を形質転換 (co-transfect) する方法も考えられるが、
結合活性の違う抗体分子の間で重鎖と軽鎖の組み換えが
起きる可能性を伴うので好ましくない。２機能性抗体の
製造を目的とするときには、融合させる機能性蛋白質に
は結合活性しか求められないので、ヘテロダイマー構造
の他にも親和性を持つ異なる蛋白質分子の組み合わせを
採用することも可能である。例えば以下のような物質の
組み合わせは、親和性を持つ蛋白質のペアとして知られ
ている。ところでこれらのリガンド−リセプター間の結
合には一般的に糖鎖が重要な役割を持つケースが少なく
ない。本発明では動物細胞での発現系を構成することが
できるので、糖鎖構造の再現については細菌を宿主とす
る場合よりも有利である。 細胞膜表面蛋白質／アクセサリー分子 細胞膜リセプター／このレセプターと相互作用する細胞
内蛋白質 このようにして得られた本発明に基づく２機能性抗体
は、分子間の接合が機能性蛋白質によって達成されるた
めに抗体分子として見るとＦａｂ類似分子で構成するこ
とが可能である。したがって、抗原性の問題を生じにく
いという付加的な作用ももたらす。In order to obtain a bifunctional antibody according to the present invention, it is preferable to express the following fusion protein. First, a combination of subunits constituting a heterodimer is selected as a functional protein. Functional proteins having a heterodimer structure include combinations of proteins joined by leucine zippers such as fos-jun. A helix-loop-helix (HLH) structure is also known as a structure that causes protein-protein conjugation, and can be applied to the functional protein of the present invention, like the leucine zipper. A vector encoding a fusion protein in which antibody molecules having different binding activities are fused to each of the subunits constituting these conjugate pairs is constructed. If each vector is expressed in a different host and the culture supernatant is mixed, heterozygous conjugation will ultimately result in a heterozygote having the same binding activity as the bifunctional antibody. Since a subunit constituting a heterodimer is used, a homozygote is not generated, and a bifunctional antibody can be obtained efficiently. In the phage display method, there have been reports of attempts to prepare bifunctional antibodies by fusion with a heterodimer (J. Biol. Chem., 271 (13), 7630-763).
4, 1996), a technique for obtaining a bifunctional antibody by combining a complete antibody molecule having a heavy chain and a light chain with a heterodimer as in the present invention is not known. A method of incorporating genes encoding antibody molecules having different binding activities on the same vector, or transforming the same host cell with two vectors (co-transfect) is also conceivable.
It is not preferable because heavy chains and light chains may be recombined between antibody molecules having different binding activities. When the purpose is to produce a bifunctional antibody, only the binding activity is required for the functional protein to be fused, so that a combination of different protein molecules having affinity in addition to the heterodimer structure can be employed. is there. For example, the following combinations of substances are known as protein pairs having affinity. In many cases, sugar chains generally play an important role in binding between these ligands and receptors. In the present invention, since an expression system in animal cells can be constructed, it is more advantageous to reproduce the sugar chain structure than when bacteria are used as a host. Cell membrane surface protein / accessory molecule Cell membrane receptor / intracellular protein interacting with this receptor The bifunctional antibody thus obtained according to the present invention is an antibody in which conjugation between molecules is achieved by the functional protein. When viewed as a molecule, it can be composed of Fab-like molecules. Therefore, an additional effect that the problem of antigenicity hardly occurs is also provided.
【００５４】「蛋白質の発現に必要な制御領域」とは、
組み換え蛋白質を発現させるためにベクターに組み込ま
れる塩基配列のことをいう。具体的にはプロモーターや
エンハンサーの配列を指す。これらの配列は組み込まれ
る蛋白質遺伝子の上流に配置される。ただし、エンハン
サー配列は必ずしも組み込まれる蛋白質遺伝子の上流で
なくても良い。ところで本発明のベクターは、特に機能
性蛋白質として動物由来のものを選んだ時には動物細胞
を宿主として発現させるのが望ましい。細菌宿主では動
物由来の蛋白質が宿主の生育を阻害する恐れがあるため
である。動物細胞を宿主として本発明による融合蛋白質
を発現させるとき、必要なプロモーターとしてはＳＲα
プロモーター等が有利である。ＳＲαはエンハンサーと
して機能する配列も含んでいるので、構造蛋白質に対し
て発現増強効果も期待することができる。The "regulatory region necessary for protein expression"
It refers to a base sequence that is incorporated into a vector to express a recombinant protein. Specifically, it refers to a promoter or enhancer sequence. These sequences are located upstream of the protein gene to be integrated. However, the enhancer sequence does not necessarily have to be upstream of the protein gene to be integrated. By the way, the vector of the present invention is desirably expressed by using an animal cell as a host, particularly when an animal-derived functional protein is selected. This is because in a bacterial host, an animal-derived protein may inhibit the growth of the host. When expressing the fusion protein of the present invention in an animal cell as a host, the necessary promoter is SRα.
Promoters and the like are advantageous. Since SRα also contains a sequence that functions as an enhancer, an effect of enhancing expression of structural proteins can be expected.
【００５５】「一つの読みとり枠」とは、二つ以上の蛋
白質を連結して、単一の遺伝子産物として発現させるた
めの遺伝子領域の構成をさす。二つ以上の蛋白質をコー
ドする遺伝子領域が連続していて、１回の転写でメッセ
ンジャーＲＮＡに翻訳されること、また、各蛋白質をコ
ードする遺伝子はフレームシフトを起こさないように配
置されていなければならない。[0055] "One reading frame" refers to the constitution of a gene region for linking two or more proteins and expressing them as a single gene product. If the gene regions encoding two or more proteins are contiguous and are translated into messenger RNA in one transcription, and the genes encoding each protein must be arranged so as not to cause a frameshift. No.
【００５６】後述する本発明に利用することが可能な抗
体遺伝子増幅用プライマー、ｃＤＮＡ合成用プライマ
ー、および機能性蛋白質遺伝子増幅用プライマーは、共
にその塩基配列に応じて通常公知のオリゴヌクレオチド
合成方法によって合成することができる（例えば、ホス
フェイト トリエステル法；Nature Vol.310,page105(1
984)等) 。しかしながら、特にＤＮＡシンセサイザーを
用いて合成するのが、当該核酸合成の迅速及び確実を図
る上において好ましい。A primer for amplifying an antibody gene, a primer for synthesizing a cDNA, and a primer for amplifying a functional protein gene which can be used in the present invention, which will be described later, are all prepared by a generally known oligonucleotide synthesis method according to their base sequences. Can be synthesized (for example, phosphate triester method; Nature Vol. 310, page 105 (1)
984) etc.). However, it is particularly preferable to synthesize using a DNA synthesizer in order to achieve quick and reliable synthesis of the nucleic acid.
【００５７】(１) 抗体遺伝子増幅用プライマーの作成 本発明に示す抗体増幅用プライマーは、たとえば特開平
７−１３５９７８に開示されている方法により塩基配列
を設定し、作成する。すなわち、イムノグロブリンをコ
ードする遺伝子の５’側は、極めて変異性が高く、抗原
との結合活性を大きく左右する部分でもあるので、天然
の遺伝子の塩基配列中にプライマーを求めず、末端に付
加するアダプターとして人為的な塩基配列を設定するこ
とによって前記の高い変異性に対応させることにした。
かかるアダプターの塩基配列の設定にあたっては、エク
ソン中に存在する塩基配列に対応する可能性の低い塩基
配列を選択することと、クローニングに必要な制限酵素
の切断部位を含む塩基配列を選択することが条件であ
る。(1) Preparation of Primer for Antibody Gene Amplification The primer for antibody amplification according to the present invention is prepared by, for example, setting a base sequence by the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-135778. That is, since the 5 'side of the gene encoding the immunoglobulin has extremely high variability and is also a part that greatly influences the binding activity to the antigen, the primer is not required in the nucleotide sequence of the natural gene, and is added to the end. By setting an artificial base sequence as an adapting adapter, it was decided to cope with the high variability described above.
In setting the nucleotide sequence of such an adapter, it is necessary to select a nucleotide sequence having a low possibility of corresponding to the nucleotide sequence present in the exon and to select a nucleotide sequence containing a restriction enzyme cleavage site necessary for cloning. Condition.
【００５８】また、３’側のプライマーは、増幅産物を
クローニング用ベクターに導入する関係上クローニング
用ベクターのクローニングサイトに応じた制限酵素部位
を末端に有することが必要である。この制限酵素部位の
種類は、前記の通り抗体遺伝子のエクソン中に存在する
可能性の低いものを選択する必要性がある。したがっ
て、かかる制限酵素部位は、エクソンではなくイントロ
ンに導入する必要があるか、若しくは最も定常領域に近
いＪ領域の３’側で可能な限り保存された領域を多く含
むものを選択し、この３’側に制限酵素部位を付加する
方法を採るのが好ましい。実施例で利用したプライマー
はｃＤＮＡに対してアニールするが、付加した制限酵素
の認識サイトはベクター上ではイントロン領域に相当す
る。したがって実施例において製造したベクターには、
可変領域をコードする配列とＣＨ１をコードする配列の
間にイントロンが介在し、ｍＲＮＡに翻訳される時にス
プライシングを受ける。このような高度な発現系は動物
細胞を宿主に選択することで初めて実現できる。なお、
５’側の遺伝子増幅プライマーは前述のごとくアダプタ
ーであるので、前記３’側のような問題はない。In addition, the 3′-side primer needs to have a restriction enzyme site at the end corresponding to the cloning site of the cloning vector in order to introduce the amplification product into the cloning vector. As described above, it is necessary to select a type of the restriction enzyme site that is unlikely to be present in the exon of the antibody gene. Therefore, such a restriction enzyme site should be introduced into an intron instead of an exon, or a site containing as much of the conserved region as possible on the 3 ′ side of the J region closest to the constant region was selected. It is preferable to adopt a method of adding a restriction enzyme site to the 'side. The primer used in the examples anneals to the cDNA, but the recognition site of the added restriction enzyme corresponds to the intron region on the vector. Therefore, the vectors produced in the Examples include
An intron is interposed between the sequence encoding the variable region and the sequence encoding CH1, and is spliced when translated into mRNA. Such an advanced expression system can be realized only by selecting an animal cell as a host. In addition,
Since the 5 'gene amplification primer is an adapter as described above, there is no problem as in the 3' side.
【００５９】(２) ｃＤＮＡ合成用プライマーの作成 ｃＤＮＡは、通常ｍＲＮＡのポリＡ末端に対応させたオ
リゴｄＴを合成用プライマーとして逆転写酵素を用いて
合成する。しかしながら、本発明においては特開平７−
１３５９７８において開示されているように、ＩｇＧを
コードする遺伝子を可能な限り効率的に合成するのがよ
り好ましいことから、ＩｇＧをコードする遺伝子に対し
て相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをｃＤ
ＮＡ合成用プライマーとし、同時に後のＩｇＧ遺伝子の
増幅工程を考慮して当該プライマー中には制限酵素切断
部位を含ませる。(2) Preparation of primer for cDNA synthesis cDNA is usually synthesized using a reverse transcriptase with oligo dT corresponding to the poly A end of mRNA as a primer for synthesis. However, in the present invention, Japanese Patent Laid-Open No.
As disclosed in US Pat. No. 135978, it is more preferable to synthesize a gene encoding IgG as efficiently as possible, so that an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to the gene encoding IgG is used as cD.
A primer for NA synthesis is used, and at the same time, a restriction enzyme cleavage site is included in the primer in consideration of the subsequent IgG gene amplification step.
【００６０】かかるｃＤＮＡ合成用プライマーをｍＲＮ
Ａにアニールさせて、次いで逆転写酵素を作用させてｍ
ＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成することにより、所望
のｃＤＮＡを得ることができる。当該合成に用いる逆転
写酵素及び詳細なｃＤＮＡ鎖の伸長方法は通常公知の方
法に従う。The primer for cDNA synthesis is mRN
A is annealed, and then reverse transcriptase is acted upon.
By synthesizing a DNA strand complementary to the RNA, a desired cDNA can be obtained. The reverse transcriptase used for the synthesis and the method for elongating the cDNA chain in detail follow generally known methods.
【００６１】得られたｃＤＮＡ鎖の５’側に前記のアダ
プター、好ましくは当該アダプターに相補的な塩基配列
を有する遺伝子増幅用プライマーを当該アダプターにア
ニールさせた二本鎖を連結する。当該連結方法も、公知
のＤＮＡ鎖同士の連結方法に準ずる。前記のようにして
合成したｃＤＮＡを鋳型とし抗体遺伝子増幅用プライマ
ーによって抗体遺伝子を増幅するためには、用いる遺伝
子増幅法に応じた公知の方法に従う。A double strand obtained by annealing the adapter, preferably a primer for gene amplification having a nucleotide sequence complementary to the adapter, to the 5 ′ side of the obtained cDNA strand is ligated to the adapter. The ligation method also conforms to a known ligation method between DNA strands. In order to amplify an antibody gene using the cDNA synthesized as described above as a template and an antibody gene amplification primer, a known method according to the gene amplification method to be used is used.
【００６２】すなわち、前記鋳型ＤＮＡと前記抗体遺伝
子増幅用プライマーをアニーリングさせて、ＰＣＲ法に
より所望の抗体遺伝子を増幅することができる。なお、
当該ＰＣＲ法の実施に際しては市販のＰＣＲキットを用
いることができる。このようにして得た抗体遺伝子増幅
産物に、組み込みを企図するベクターが有するクローニ
ングサイトに対応した制限酵素を作用させて所望の遺伝
子断片を得、当該断片を前記クローニングベクターに組
み込み、当該ベクターで適当な宿主を形質転換して、抗
体遺伝子のベクターライブラリーを得ることができる。That is, the desired antibody gene can be amplified by PCR by annealing the template DNA and the primer for amplifying the antibody gene. In addition,
When performing the PCR method, a commercially available PCR kit can be used. The antibody gene amplification product thus obtained is reacted with a restriction enzyme corresponding to a cloning site of the vector to be integrated to obtain a desired gene fragment, and the fragment is incorporated into the cloning vector, and the fragment is appropriately used with the vector. By transforming a suitable host, a vector library of antibody genes can be obtained.
【００６３】また、前記ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法にお
いて用いられる鋳型となるＤＮＡは、各種抗体産生細胞
または、機能性蛋白質に由来するｃＤＮＡを用いること
が、効率よく所望の遺伝子増幅産物を得ることが可能で
あるという点において好ましい。具体的には、抗体遺伝
子の場合はモノクローナル抗体を産生する各種ハイブリ
ドーマ、末梢血リンパ球または脾臓細胞等を例示するこ
とができる。また、患者の末梢血やｉｎ ｖｉｔｒｏ免
疫感作により得たリンパ細胞から抗体遺伝子を得ること
も可能である。As a DNA used as a template in the gene amplification method such as the PCR method, cDNA derived from various antibody-producing cells or functional proteins can be used to obtain a desired gene amplification product efficiently. It is preferable in that it is possible. Specifically, in the case of an antibody gene, various hybridomas producing peripheral antibodies, peripheral blood lymphocytes, spleen cells and the like can be exemplified. It is also possible to obtain an antibody gene from peripheral blood of a patient or from lymphocytes obtained by in vitro immunization.
【００６４】また、ヒトでは得ることが困難なヒトの蛋
白質に対する抗体の可変領域遺伝子は、ヒト以外の動
物、例えばモノクローナル抗体の作成技術が既に蓄積さ
れているマウスからクローニングすることも可能であ
る。The variable region gene of an antibody against a human protein, which is difficult to obtain in humans, can be cloned from animals other than humans, for example, mice in which techniques for preparing monoclonal antibodies have already been accumulated.
【００６５】機能性蛋白質遺伝子増幅用プライマーの作
成 機能性蛋白質遺伝子増幅用のプライマーは、個々の機能
性蛋白質の遺伝子の塩基配列をもとにして抗体遺伝子の
場合と同様に、ｃＤＮＡ合成用のプライマーと遺伝子増
幅用のプライマーを設定する。クローニング用ベクター
のクローニングサイトに応じた制限酵素部位をプライマ
ーの末端に有する必要がある点も抗体遺伝子用のプライ
マーと同じである。Preparation of Primers for Amplifying Functional Protein Genes Primers for amplifying functional protein genes are primers for cDNA synthesis based on the nucleotide sequence of each functional protein gene in the same manner as in the case of antibody genes. And primers for gene amplification. It is the same as the primer for the antibody gene in that a restriction enzyme site corresponding to the cloning site of the cloning vector must be provided at the end of the primer.
【００６６】機能性蛋白質遺伝子は、ヒト、あるいはヒ
ト以外の生物に由来する各種の酵素、サイトカイン、ホ
ルモン、毒素、レセプター、シグナル伝達因子、ＤＮＡ
結合蛋白質、構造蛋白質、またはその断片を用いること
が可能である。遺伝子増幅法の代表的な手法であるＰＣ
Ｒ法の条件は、通常当該方法に採用される諸条件が採用
される。Functional protein genes include various enzymes, cytokines, hormones, toxins, receptors, signaling factors, DNAs derived from human or non-human organisms.
It is possible to use binding proteins, structural proteins, or fragments thereof. PC, a typical method for gene amplification
As the conditions of the R method, various conditions usually employed in the method are employed.
【００６７】本発明のベクターと共に使用される軽鎖用
のクローニングベクターは、イムノグロブリンの可変領
域全体と軽鎖の定常領域の全体、または一部を含んで、
発現した際にＦａｂ類似分子、あるいはＦ（ａｂ’）２
類似分子を構成できるものであれば、どのようなもので
もかまわない。一例として特開平７−１３５９７８にお
いて開示されている軽鎖用のクローニングベクターを挙
げることができる（図１）。また、遺伝子導入の方法
は、本発明のベクターと軽鎖用のベクターを別々にco-t
ransfectionにより導入してもよいが、本発明のベクタ
ーを使用して得られる融合蛋白質遺伝子を軽鎖用のベク
ターのイムノグロブリン定常領域遺伝子の下流に組み込
んで、一本のベクターで遺伝子導入する方がより好まし
い。The cloning vector for the light chain used with the vector of the present invention contains the entire variable region of the immunoglobulin and the whole or a part of the constant region of the light chain.
When expressed, Fab-like molecule or F (ab ') 2
Any substance that can constitute a similar molecule may be used. An example is a cloning vector for a light chain disclosed in JP-A-7-135978 (FIG. 1). In addition, the method of gene transfer is carried out by separately co-tipping the vector of the present invention and the vector for the light chain.
Although it may be introduced by ransfection, it is better to incorporate the fusion protein gene obtained using the vector of the present invention downstream of the immunoglobulin constant region gene of the light chain vector, and to introduce the gene with one vector. More preferred.
【００６８】本発明に示す可変領域遺伝子クローニング
のためのベクターの構成は、たとえば図２および３で示
される遺伝子地図によって定義される。当該構成要素に
ついて以下に説明する。なお図２および３では、本発明
の実施例として抗ＣＥＡモノクローナル抗体の可変領域
とヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ遺伝子を挿入し
たものを示しているが、このベクターをもとにして他の
抗体の可変領域や機能性蛋白質を容易に組み換えること
が可能である。つまり本発明の実施例、並びに本明細書
中に引用した先行技術文献に基づいて各構成要素を機能
的に組み合わせ最終的に本発明のベクターに導くことが
可能である。また本発明によって提供されるベクター
は、適当な宿主に導入し形質転換させることによって発
現させることができる。たとえば実施例に示したベクタ
ーは動物細胞において発現可能な構成要素を備えている
ので、エレクトロポレーション等の操作によって動物細
胞に導入し形質転換体とすれば本発明に基づく融合蛋白
質を発現させることができる。The construction of the vector for cloning the variable region gene shown in the present invention is defined, for example, by the gene maps shown in FIGS. The components will be described below. FIGS. 2 and 3 show an example of the present invention in which the variable region of an anti-CEA monoclonal antibody and a human placenta-derived alkaline phosphatase gene are inserted. And functional proteins can be easily recombined. That is, based on the examples of the present invention and the prior art documents cited in the present specification, it is possible to functionally combine each component and finally lead to the vector of the present invention. The vector provided by the present invention can be expressed by introducing it into a suitable host and transforming it. For example, since the vectors shown in the examples have components that can be expressed in animal cells, if the transformants are introduced into animal cells by electroporation or the like and used as transformants, the fusion protein according to the present invention can be expressed. Can be.
【００６９】１）ＳＶ４０ｏｒｉ この遺伝子は、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（Mol.Cell.Bio
l. Vol.8,page466(1988))やｐＭＥ１８Ｓ（Medical Imm
unology Vol.20,page27(1990))等のベクターを出発材料
として本発明のベクターに組み込むことができ、動物細
胞における外来遺伝子の発現に必要なＳＲαプロモータ
ーを与える。1) SV40ori This gene is expressed in pcDL-SRα296 (Mol. Cell. Bio).
l. Vol.8, page466 (1988)) and pME18S (Medical Imm
Unology Vol. 20, page 27 (1990)) can be incorporated as a starting material into the vectors of the present invention, providing the SRα promoter required for expression of foreign genes in animal cells.
【００７０】２）ＳＶ４０ｏｒｉ下流のXhoI/EcoRIクロ
ーニングサイト XhoI/EcoRIクローニングサイトは、本発明のプライマー
によって増幅した可変領域遺伝子を組み込むためのもの
である。図２および３では、本発明の実施例としてこの
サイトに抗ＣＥＡモノクローナル抗体の可変領域を挿入
したものを示している。2) XhoI / EcoRI Cloning Site Downstream of SV40 ori The XhoI / EcoRI cloning site is for incorporating the variable region gene amplified by the primer of the present invention. FIGS. 2 and 3 show an example of the present invention in which the variable region of an anti-CEA monoclonal antibody has been inserted into this site.
【００７１】３）XhoI/EcoRIサイト−ClaI サイト間の
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする遺伝子 この遺伝子は文字通りＩｇＧ重鎖定常領域の一部をコー
ドするもので、本発明により増幅した重鎖可変領域遺伝
子と共にＦａｂ類似分子、あるいはＦ（ａｂ’）２類似
分子の重鎖側部分を構成する。重鎖定常領域の一部はヒ
トやヒト以外の動物のものを利用することができるが、
たとえばヒト定常領域のクローニングについては、前述
の特開平４−１６６０８９号公報に記載された技術を利
用することができる。3) Gene encoding IgG heavy chain constant region between XhoI / EcoRI site and ClaI site This gene literally encodes a part of IgG heavy chain constant region, and heavy chain variable region amplified according to the present invention. Together with the gene, it constitutes the Fab-like molecule or the heavy chain side portion of the F (ab ') 2-like molecule. Some of the heavy chain constant regions can be those of humans or non-human animals,
For example, for the cloning of a human constant region, the technique described in the above-mentioned JP-A-4-16689 can be used.
【００７２】さらには抗体遺伝子を増幅する際に、定常
領域の中の軽鎖とＳ−Ｓ結合をなすシステインをコード
する領域と重鎖同士がＳ−Ｓ結合をなすシステインをコ
ードする領域の間でプライマーを選択して、Ｆａｂ類似
分子をコードする遺伝子全体を増幅するようにすれば、
前記のＩｇＧ重鎖定常領域をコードする遺伝子は不要で
ある。同じことが定常領域の重鎖同士がＳ−Ｓ結合をな
すシステインをコードする領域よりも下流でプライマー
を選択してＦ（ａｂ’）２類似分子をコードする遺伝子
全体を増幅する場合にもいえる。Further, when amplifying an antibody gene, a region between a region encoding a cysteine forming an SS bond with the light chain in the constant region and a region encoding a cysteine forming an SS bond between the heavy chains. By selecting primers in the above to amplify the entire gene encoding Fab-like molecule,
The gene encoding the IgG heavy chain constant region is not required. The same can be said when a primer is selected downstream of a region encoding a cysteine in which the heavy chains of the constant region form an SS bond to amplify the entire gene encoding the F (ab ') 2 analog molecule. .
【００７３】４）ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする遺伝
子の下流のEcoT22I/ClaIクローニングサイト EcoT22I/ClaIクローニングサイトは、機能性蛋白質の遺
伝子を組み込むためのものである。図２および３では、
本発明の実施例としてこのサイトにヒト胎盤由来のアル
カリホスファターゼ遺伝子を挿入したものを示してい
る。4) The EcoT22I / ClaI Cloning Site Downstream of the Gene Encoding the IgG Heavy Chain Constant Region The EcoT22I / ClaI cloning site is for incorporating a functional protein gene. 2 and 3,
As an example of the present invention, a site obtained by inserting an alkaline phosphatase gene derived from human placenta into this site is shown.
【００７４】５）ｐＢＲ３２２またはｐＵＣ由来のｏｒ
ｉ配列 この遺伝子は、大腸菌を形質転換するのに必要な遺伝子
である。5) or derived from pBR322 or pUC
i-sequence This gene is a gene necessary for transforming E. coli.
【００７５】６）アンピシリン耐性遺伝子 この遺伝子は、大腸菌に薬剤耐性能を与えるセレクショ
ンマーカーとして機能する。大腸菌を宿主とするベクタ
ーのクローニングに必要な薬剤耐性マーカーである。6) Ampicillin resistance gene This gene functions as a selection marker that gives drug resistance to Escherichia coli. It is a drug resistance marker required for cloning a vector using Escherichia coli as a host.
【００７６】７）Ｔｋプロモーター及びＴｋポリＡ領域 これらの遺伝子は、ネオマイシン耐性遺伝子を哺乳動物
細胞において発現し、形質転換細胞のセレクションマー
カーとして機能する。本発明のベクターを使用して得ら
れる融合蛋白質遺伝子を軽鎖用のベクターのイムノグロ
ブリン定常領域遺伝子の下流に組み込んで、一本のベク
ターとして遺伝子導入する場合には、軽鎖クローニング
用ベクターが最終的な発現ベクターの材料として利用さ
れるので、例えば次のような使い方が可能になる。7) Tk Promoter and Tk Poly A Region These genes express the neomycin resistance gene in mammalian cells and function as a selection marker for transformed cells. When the fusion protein gene obtained by using the vector of the present invention is incorporated into the light chain vector downstream of the immunoglobulin constant region gene and the gene is introduced as a single vector, the light chain cloning vector is Since it is used as a material for a typical expression vector, for example, the following usage is possible.
【００７７】すなわち、ＩｇＧの抗原結合活性は、重鎖
側の可変領域のみを組み換えれば目的を達成することが
できる。かかるＩｇＧの特徴を利用して、重鎖クローニ
ング用ベクターのみで可変領域遺伝子のライブラリーを
作成し、順次軽鎖クローニング用ベクターに組み込んで
いくことによって、より多様なＩｇＧを容易に構築する
ことが可能である。同様にベクターのＩｇＧ重鎖定常領
域をコードする遺伝子の下流のクローニングサイトに任
意の機能性蛋白質の遺伝子を組み込むことができる。こ
の方法は、軽鎖クローニングベクターと組み合わせるこ
とにより、任意の抗体活性を持つＦａｂ類似分子、ある
いはＦ（ａｂ’）２類似分子と任意の機能性蛋白質との
融合蛋白質を作成することを可能にする画期的な技術で
ある。That is, the antigen binding activity of IgG can be achieved by recombining only the variable region on the heavy chain side. By utilizing such characteristics of IgG, a library of variable region genes is prepared using only a heavy chain cloning vector, and sequentially incorporated into a light chain cloning vector, whereby a more diverse IgG can be easily constructed. It is possible. Similarly, an arbitrary functional protein gene can be incorporated into a cloning site downstream of the gene encoding the IgG heavy chain constant region of the vector. This method makes it possible to create a Fab-like molecule having any antibody activity or a fusion protein of an F (ab ') 2 analog and an arbitrary functional protein by combining with a light chain cloning vector. This is a revolutionary technology.
【００７８】なお、本発明のベクターがＳＲαプロモー
ターを含む態様においては、前記発現用宿主としてＳＶ
４０Large Ｔ抗原産生細胞との組み合わせにより一過性
ではあるが多量の発現を期待できる。一過性ではあって
も強力な発現能を持つこの種のホスト−ベクター系を利
用することによって、安定な形質転換体を樹立するより
もはるかに迅速に有用な融合蛋白質発現ベクターをスク
リーニングしクローニングすることが可能となる。かか
るＳＶ４０Large Ｔ抗原産生細胞としては、例えばＣｏ
ｓ７細胞、Ｃｏｓ１細胞、またはＳＶ４０Large Ｔ抗原
非産生細胞にＳＶ４０Large Ｔ抗原産生遺伝子を導入し
た細胞等を例示することができる。また、これらの中で
も形質転換効率が高いという点においてＣｏｓ７細胞は
特に好ましい細胞である。一方、安定な形質転換体を得
るためにはＳＶ４０Large Ｔ抗原非産生細胞が適切であ
る。ＳＶ４０Large Ｔ抗原非産生細胞には、例えばＸ６
３Ａｇ８．６５３細胞やＣＨＯ細胞等を例示することが
できる。このようにして、調製した抗体産生発現用形質
転換細胞より、所望の融合蛋白質を産生させることがで
きる。なお本発明のベクターを発現させると、融合蛋白
質は１本のペプチドとして発現されるものの、他の蛋白
質は別の分子として発現する。たとえば［抗体重鎖−酵
素］と［抗体軽鎖］とは別のペプチド分子となる。しか
し通常の条件で発現させた場合には、これらの分子は重
鎖−軽鎖間のＳ−Ｓ結合により接合体となって分泌され
る。抗体分子部分が重鎖−重鎖間のＳ−Ｓ結合を含む構
造をもっておれば、このＳ−Ｓ結合も同じように構成さ
れる。同じＳ−Ｓ結合であればヒンジ領域のシステイン
とＣＨ１のシステインにより、望まないＳ−Ｓ結合が生
じる可能性が心配されるが、通常はこのような不自然な
結合は生じないとされている。抗体分子のみならず酵素
が多量体構造を持つ場合にも、多くの場合は特別な処理
を施さなくとも構造的な障害が無い限り多量体構造は自
然に構成される。In an embodiment in which the vector of the present invention contains the SRα promoter, the host for expression is SV
Transient but large amounts of expression can be expected in combination with 40 Large T antigen producing cells. By utilizing this kind of host-vector system, which has a transient but strong expression ability, it is possible to screen and clone a useful fusion protein expression vector much more quickly than establishing a stable transformant. It is possible to do. Such SV40 Large T antigen producing cells include, for example, Co
Examples thereof include s7 cells, Cos1 cells, and cells in which an SV40 Large T antigen-producing gene has been introduced into SV40 Large T antigen non-producing cells. Among them, Cos7 cells are particularly preferable cells in that the transformation efficiency is high. On the other hand, in order to obtain a stable transformant, cells that do not produce SV40 Large T antigen are suitable. SV40 Large T antigen non-producing cells include, for example, X6
Examples include 3Ag8.653 cells and CHO cells. The desired fusion protein can be produced from the thus prepared transformed cells for antibody production and expression. When the vector of the present invention is expressed, the fusion protein is expressed as one peptide, but the other proteins are expressed as different molecules. For example, [antibody heavy chain-enzyme] and [antibody light chain] are different peptide molecules. However, when expressed under normal conditions, these molecules are secreted as a conjugate by the SS bond between the heavy and light chains. If the antibody molecule portion has a structure including an SS bond between heavy chains, the SS bond is similarly configured. In the case of the same SS bond, there is a concern that cysteine in the hinge region and cysteine in CH1 may cause an undesired SS bond, but such an unnatural bond is usually not generated. . Even in the case where not only an antibody molecule but also an enzyme has a multimeric structure, in many cases, the multimeric structure is naturally formed without any special treatment as long as there is no structural obstacle.
【００７９】[0079]
【作用】本発明のベクターに設けた抗体分子をコードす
る遺伝子を挿入するための制限酵素サイトにより、任意
の抗体遺伝子を自由に組み換えることができる。５’側
のアダプター配列と、３’側のＪ領域で保存性の高い配
列とを選択して抗体の可変領域遺伝子を増幅し、増幅生
成物をベクターに組みこんで発現させる技術は公知（特
開平７−１３５９７８）である。本発明は、この技術を
抗体分子と機能性蛋白質との融合蛋白質として発現させ
るために応用した点において新規である。更に好ましい
態様においては、機能性蛋白質として多量体構造を取る
酵素を選択した時に問題となる活性の低下という問題
を、特殊な抗体分子を組み合わせることによって回避す
るものである。The restriction enzyme site for inserting the gene encoding the antibody molecule provided in the vector of the present invention allows any antibody gene to be freely recombined. Techniques for amplifying the variable region gene of an antibody by selecting a 5'-side adapter sequence and a sequence highly conserved in the 3'-side J region, and incorporating the amplified product into a vector for expression are known (particularly, Kaihei 7-135978). The present invention is novel in that it is applied to express this technology as a fusion protein of an antibody molecule and a functional protein. In a further preferred embodiment, the problem of reduced activity, which is a problem when an enzyme having a multimeric structure is selected as a functional protein, is avoided by combining a special antibody molecule.
【００８０】[0080]
１．アルカリホスファターゼ遺伝子のクローニング 抗体遺伝子の可変領域とともに、融合蛋白質として発現
させる機能性蛋白質として、ヒト胎盤由来のアルカリホ
スファターゼを選択し、その遺伝子を以下のようにして
クローニングした。かかる遺伝子のクローニングの工程
は図４に示した。1. Cloning of Alkaline Phosphatase Gene Alkaline phosphatase derived from human placenta was selected as a functional protein to be expressed as a fusion protein together with the variable region of the antibody gene, and the gene was cloned as follows. The process of cloning such a gene is shown in FIG.
【００８１】ヒト胎盤より常法にしたがってトータル
ＲＮＡを抽出し、アルカリホスファターゼ遺伝子の膜貫
通領域に相補的なプライマー（配列１）を用いて１ｓｔ
ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成し、さらに常法に従っ
て２ｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成し２本鎖ｃＤ
ＮＡとした。二本鎖ｃＤＮＡを低融点アガロースゲルを
用いて電気泳動し、１．６−１．７ｋｂｐの長さの断片
を分取した。このゲルを７４℃で溶解し、その一部を用
いてゲル内でＰＣＲを行った。ＰＣＲに用いたプライマ
ーは、５’側は、アルカリホスファターゼのリーダー配
列の３’下流に相補的な配列（配列２）で、３’側は、
膜貫通領域の５’上流に相補的な配列にストップコドン
を付加した配列（配列３）である。また、各々のプライ
マーには、EcoT22I, ClaIの制限酵素部位がそれぞれ導
入してある。ＰＣＲの条件は、ゲル５μｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、
０．１ｍｇ／ｍｌ ゼラチン、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２５ｐｍｏｌ プライマーで
反応量を５０μｌとし、これを９５℃５ｍｉｎ、５５℃
５ｍｉｎ、７２℃５ｍｉｎで反応後、２．５μｌのＴａ
ｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加えて９４℃２ｍｉｎ、６
５℃１ｍｉｎ、７２℃２ｍｉｎで３０サイクル行った。The total amount was obtained from the human placenta according to a standard method.
RNA was extracted, and the 1st was extracted using a primer (sequence 1) complementary to the transmembrane region of the alkaline phosphatase gene.
A second strand cDNA was synthesized according to a conventional method, and a second strand cDNA was synthesized.
NA. The double-stranded cDNA was subjected to electrophoresis using a low-melting point agarose gel, and a fragment having a length of 1.6 to 1.7 kbp was collected. This gel was melted at 74 ° C., and PCR was performed in the gel using a part thereof. The primer used for PCR was a sequence complementary to the 3 ′ downstream of the leader sequence of alkaline phosphatase (sequence 2) on the 5 ′ side, and the 3 ′ side was
This is a sequence (sequence 3) obtained by adding a stop codon to a sequence complementary to the 5 'upstream of the transmembrane region. In addition, restriction primer sites of EcoT22I and ClaI were introduced into each primer. PCR conditions were gel 5 μl, 10 mM
Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl,
0.1 mg / ml gelatin, 1 mM MgCl2,
The reaction volume was adjusted to 50 μl with 0.2 mM dNTPs and 25 pmol primer, and the reaction was performed at 95 ° C. for 5 min and 55 ° C.
After reacting for 5 min at 72 ° C. for 5 min, 2.5 μl of Ta
q Polymerase was added and 94 ° C for 2 min, 6
30 cycles were performed at 5 ° C. for 1 min and at 72 ° C. for 2 min.
【００８２】２．融合蛋白質発現用のベクターの構築 ヒト定常領域をコードする遺伝子を組み込んだ公知のベ
クターｐＳＲＨ（特開平７−１３５９７８を参照のこ
と）を出発原料プラスミドとして、本発明の抗体可変領
域−機能性蛋白質の融合蛋白質発現ベクターｐＳＲｍｔ
ＨＣＥＡ−ＡＰならびにｐＳＲｍｔＣＨ２ＣＥＡ−ＡＰ
を構築した。なお、以下の操作において用いた制限酵
素、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼは全て宝
酒造社製である。当該クローニングベクターｐＳＲｍｔ
ＨＣＥＡ−ＡＰ（Ｆａｂ用）、ｐＳＲｍｔＣＨ２ＣＥＡ
−ＡＰ（Ｆ（ａｂ’）２用）の構築工程は図５から７に
示した。2. Construction of Vector for Expression of Fusion Protein Using the known vector pSRH (see JP-A-7-135978) incorporating a gene encoding a human constant region as a starting material plasmid, the antibody variable region-functional protein of the present invention was prepared. Fusion protein expression vector pSRmt
HCEA-AP and pSRmtCH2CEA-AP
Was built. The restriction enzymes, DNA polymerase, and Taq polymerase used in the following operations are all manufactured by Takara Shuzo. The cloning vector pSRmt
HCEA-AP (for Fab), pSRmtCH2CEA
The construction steps of -AP (for F (ab ') 2) are shown in FIGS.
【００８３】ｐＳＲＨ（特開平７−１３５９７８参照）
をClaIで消化しＫｌｅｎｏｗとｄＮＴＰｓを用いて平滑
末端化してさらに、セルフライゲーションすることによ
りClaIサイトを消去した。ClaIサイトを消去したｐＳＲ
ＨをBamHIで消化し、ＫｌｅｎｏｗとｄＮＴＰｓを用い
て平滑末端化した。これにClaIリンカーを付加し、ｐＳ
ＲＨのBamHIサイトをClaIサイトに変換した（ｐＳＲＨ
Ｃ）。抗ＣＥＡ抗体産生ハイブリドーマより抗体Ｖｈ遺
伝子を増幅し（特開平７−１３５９７８参照）、ｐＳＲ
ＨＣのXhoI/EcoRIサイトに導入した（ｐＳＲＨＣＥ
Ａ）。一方ｐＳＲＨＣをXbaI/ClaIで消化し、抗体Ｃγ
１遺伝子を含む約２．０ｋｂの断片を切り出して、次の
定常領域遺伝子の調製に用いた（図５）。PSRH (see JP-A-7-135978)
Was digested with ClaI, blunt-ended with Klenow and dNTPs, and further self-ligated to eliminate the ClaI site. PSR with ClaI site deleted
H was digested with BamHI and blunt-ended using Klenow and dNTPs. A ClaI linker was added to this, and pS
The BamHI site of RH was converted to a ClaI site (pSRH
C). An antibody Vh gene was amplified from an anti-CEA antibody producing hybridoma (see JP-A-7-135978), and pSR
Introduced into the XhoI / EcoRI site of HC (pSRHCE
A). On the other hand, pSRHC was digested with XbaI / ClaI, and antibody Cγ
A fragment of about 2.0 kb containing one gene was cut out and used for preparing the next constant region gene (FIG. 5).
【００８４】ｐＵＣ１９をHincIIで消化し、ClaIリンカ
ーを付加することによりｐＵＣ１９のHincIIサイトをCl
aIサイトに変換した（ｐＵＣｌａ）。ｐＳＲＨＣから切
り出した抗体Ｃγ１遺伝子を含む約２．０ｋｂの断片を
ｐＵＣｌａのXbaI/ClaIサイトに導入し、さらに２箇所
存在するBstXIサイトのうちＣＨ３領域をコードするエ
クソンの３’下流にあるBstXIサイトを消去した（ｐＵ
Ｃγ１）。抗体Ｃγ１遺伝子を含む約２．０ｋｂ XbaI/
ClaI断片をテンプレートとして、ＣＨ１領域をコードす
るエクソンの中でBstXIサイトを含む領域に相補的なプ
ライマー（配列４）とヒンジ領域をコードするエクソン
に相補的でEcoT22Iサイトを有するプライマー（配列
５）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの温度条件は、９
５℃５ｍｉｎ、４５℃５ｍｉｎ、７２℃５ｍｉｎで反応
後、２．５ｕｌのＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え
て９４℃２ｍｉｎ、５５℃１ｍｉｎ、７２℃２ｍｉｎで
３０サイクル行った。増幅したＤＮＡをBstXI/EcoT22I
で消化後、ｐＵＣγ１のBstXI/EcoT22Iサイトに導入し
た（ｐＵＣｍｔＨ）。同様にＣＨ１領域をコードするエ
クソンの中でBstXIサイトを含む領域に相補的なプライ
マー（配列４）とＣＨ２領域をコードするエクソンに相
補的でEcoT22Iサイトを有するプライマー（配列６）を
用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡをBstXI/EcoT22I
で消化後、ｐＵＣγ１のBstXI/EcoT22Iサイトに導入し
ｐＵＣｍｔＣＨ２を作製した（図６）。PUC19 was digested with HincII, and the HincII site of pUC19 was added with Clal linker to add ClCl.
Converted to aI site (pUCLa). An approximately 2.0 kb fragment containing the antibody Cγ1 gene excised from pSRHC was introduced into the XbaI / ClaI site of pUCLa, and the BstXI site located 3 ′ downstream of the exon encoding the CH3 region among the two BstXI sites was further inserted. Deleted (pU
Cγ1). About 2.0 kb XbaI / containing antibody Cγ1 gene
Using the ClaI fragment as a template, a primer (sequence 4) complementary to the region containing the BstXI site in the exon encoding the CH1 region and a primer (sequence 5) complementary to the exon encoding the hinge region and having an EcoT22I site were used. Was used to perform PCR. The PCR temperature condition is 9
After reacting at 5 ° C. for 5 min, 45 ° C. for 5 min, and 72 ° C. for 5 min, 2.5 ul of Taq polymerase was added, followed by 30 cycles at 94 ° C. for 2 min, 55 ° C. for 1 min and 72 ° C. for 2 min. BstXI / EcoT22I
After digestion with pUCγ1, it was introduced into the BstXI / EcoT22I site of pUCγ1 (pUCmtH). Similarly, PCR was performed using a primer complementary to the region containing the BstXI site in the exon encoding the CH1 region (sequence 4) and a primer complementary to the exon encoding the CH2 region and having an EcoT22I site (sequence 6). The amplified DNA was transferred to BstXI / EcoT22I
After digestion with pUCγ1, the fragment was introduced into the BstXI / EcoT22I site of pUCγ1 to prepare pUCmtCH2 (FIG. 6).
【００８５】ｐＳＲＨＣＥＡをXbaI/ClaIで消化し、抗
体Ｃγ１遺伝子を除去した後にこのサイトへｐＵＣｍｔ
Ｈの抗体Ｃγ１遺伝子断片を含むXbaI/ClaI断片を導入
した（ｐＳＲｍｔＨＣＥＡ）。同様にして、ｐＵＣｍｔ
ＣＨ２のXbaI/ClaI断片を導入し、ｐＳＲｍｔＣＨ２Ｃ
ＥＡを作製した。ｐＳＲｍｔＨＣＥＡ、ｐＳＲｍｔＣＨ
２ＣＥＡをEcoT22Iで部分消化しさらにClaIで消化して
抗体Ｖｈ及び抗体Ｃ領域遺伝子の一部を含む断片を調製
し、ここへ増幅したヒト胎盤由来アルカリホスファター
ゼ遺伝子をそれぞれ導入し、ｐＳＲｍｔＨＣＥＡ−Ａ
Ｐ、ｐＳＲＨｍｔＣＨ２ＣＥＡ−ＡＰを作製した（図
７）。PSRHCEA was digested with XbaI / ClaI to remove the antibody Cγ1 gene.
An XbaI / ClaI fragment containing the antibody Cγ1 gene fragment of H was introduced (pSRmtHCEA). Similarly, pUCmt
The XbaI / ClaI fragment of CH2 was introduced and pSRmtCH2C
EA was prepared. pSRmtHCEA, pSRmtCH
2CEA was partially digested with EcoT22I and further digested with ClaI to prepare a fragment containing the antibody Vh and a part of the antibody C region gene, into which the amplified human placenta-derived alkaline phosphatase gene was introduced, and pSRmtHCEA-A was introduced.
P, pSRHmtCH2CEA-AP was produced (FIG. 7).
【００８６】かかるベクターのうちｐＳＲｍｔＨＣＥＡ
−ＡＰは、Escherichia coli K12 (JM110)を宿主として
形質転換され、当該形質転換体は、ｐＳＲｍｔＨＣＥＡ
−ＡＰ（ＪＭ１１０）として工業技術院生命工学技術研
究所に平成９年５月２２日に、受託番号FERM P-16239と
して寄託されている。Among such vectors, pSRmtHCEA
-AP is transformed using Escherichia coli K12 (JM110) as a host, and the transformant is pSRmtHCEA.
-Deposited under the accession number FERM P-16239 on May 22, 1997 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as AP (JM110).
【００８７】３．軽鎖用ベクターの調製 ｐＳＲＬ−ｎｅｏ（特開平７−１３５９７８参照、図
１）のBamHIサイトはｐＳＲＬＨと同様にしてClaIサイ
トに変換した（ｐＳＲＬＣ−ｎｅｏ）後に、抗ＣＥＡ抗
体産生ハイブリドーマより抗体Ｖκ遺伝子を増幅し（特
開平７−１３５９７８参照）、それぞれｐＳＲＬＣ−ｎ
ｅｏのXhoI/EcoRIサイトに導入した（ｐＳＲＬＣＥＡ−
ｎｅｏ）。当該クローニングベクターｐＳＲＬＣＥＡ−
ｎｅｏの構築工程は図８に示した。3. Preparation of Light Chain Vector The BamHI site of pSRL-neo (see JP-A-7-135978, FIG. 1) was converted to a ClaI site in the same manner as pSRLH (pSRLC-neo), and then an antibody Vκ gene was obtained from an anti-CEA antibody-producing hybridoma. (See JP-A-7-135978), and pSRLC-n
eo XhoI / EcoRI site (pSRLCEA-
neo). The cloning vector pSRLCEA-
The construction process of neo is shown in FIG.
【００８８】かかるベクターのうちｐＳＲＬＣＥＡ−ｎ
ｅｏは、Escherichia coli K12 （ＩＮＶαＦ’）を宿
主として形質転換され、当該形質転換体は、ｐＳＲＬＣ
ＥＡ−ｎｅｏ（ＩＮＶαＦ’）として工業技術院生命工
学技術研究所に平成９年５月２２日に、受託番号FERM P
-16240として寄託されている。[0088] Among such vectors, pSRLCEA-n
eo was transformed using Escherichia coli K12 (INVαF ′) as a host.
EA-neo (INVαF ') was submitted to the Institute of Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on May 22, 1997, under the accession number FERM P.
Deposited as -16240.
【００８９】４．ベクターの発現方法及び酵素活性の測
定法方とその結果 重鎖−アルカリホスファターゼ融合蛋白質をコードする
遺伝子を含むベクターに、軽鎖をコードする遺伝子を組
み込むことにより、最終的に本発明による融合蛋白質発
現ベクターを構築した。すなわち、ｐＳＲｍｔＨＣＥＡ
−ＡＰ、ｐＳＲＨｍｔＣＨ２ＣＥＡ−ＡＰをHindIII/Cl
aIで消化し、抗体−アルカリホスファターゼ遺伝子を含
む断片を調製しｐＳＲＬＣＥＡ−ｎｅｏのHindIII/ClaI
サイトへそれぞれ導入し、ｐＦａｂＣＥＡ−ＡＰｎｅ
ｏ、ｐＦ（ａｂ’）２ＣＥＡ−ＡＰｎｅｏを作製した。
各ベクターを発現して得ることができる融合蛋白質の構
造をＩｇＧ分子の構造とともに図１１に模式的に示し
た。ｐＦａｂＣＥＡ−ＡＰｎｅｏ、ｐＦ（ａｂ’）２Ｃ
ＥＡ−ＡＰｎｅｏをエレクトロポレーションによりＣｏ
ｓ７へ導入し、その７２ｈｒ後の培養上清１０μｌとｐ
−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＮ
ＰＰ）溶液１００μｌを加えてアルカリホスファターゼ
活性を測定した。その結果、図９に示す通りｐＦａｂＣ
ＥＡ−ＡＰｎｅｏ、ｐＦ（ａｂ’）２ＣＥＡ−ＡＰｎｅ
ｏを導入したＣｏｓ７の培養上清はともにアルカリホス
ファターゼ活性が検出された。4. Method for measuring vector expression and method for measuring enzyme activity and its results By integrating a gene encoding a light chain into a vector containing a gene encoding a heavy chain-alkaline phosphatase fusion protein, the fusion protein expression according to the present invention is finally achieved. The vector was constructed. That is, pSRmtHCEA
-AP, pSRHmtCH2CEA-AP with HindIII / Cl
digestion with aI to prepare a fragment containing the antibody-alkaline phosphatase gene, and HindIII / ClaI of pSRLCEA-neo
Introduced into each site, pFabCEA-APne
o, pF (ab ') 2CEA-APneo was prepared.
The structure of the fusion protein obtained by expressing each vector is schematically shown in FIG. 11 together with the structure of the IgG molecule. pFabCEA-APneo, pF (ab ') 2C
EA-APneo is electroporated with Co
s7, and 10 μl of the culture supernatant 72 hr after the introduction into p7.
-Nitrophenyl Phosphate (PN
100 μl of the PP) solution was added and the alkaline phosphatase activity was measured. As a result, as shown in FIG.
EA-APneo, pF (ab ') 2CEA-APne
In both cases, the alkaline phosphatase activity was detected in the culture supernatant of Cos7 into which o was introduced.
【００９０】ただし、両者の活性を比較した場合、抗体
分子の重鎖−重鎖間のＳ−Ｓ結合を保持しているＦ（ａ
ｂ）’２−ＡＰ［ｐＦ（ａｂ’）２ＣＥＡ−ＡＰｎｅｏ
の発現産物］ではアルカリホスファターゼ活性が低くな
っている。このことからアルカリホスファターゼのよう
な多量体構造を持つ機能性蛋白質では、融合された抗体
分子における重鎖−重鎖間のＳ−Ｓ結合によって活性が
抑制されてしまう可能性が示唆された。抗体分子がＳ−
Ｓ結合で接合することで、酵素のサブユニットの接合を
うまく構成できず十分な活性を発現できないものと思わ
れる。一方で、重鎖間のＳ−Ｓ結合が存在しないＦａｂ
−ＡＰ［ｐＦａｂＣＥＡ−ＡＰｎｅｏの発現産物］で
は、アルカリホスファターゼ活性が高度に維持されてい
る。重鎖−重鎖間のＳ−Ｓ結合を持たない抗体分子を組
み合わせることで、融合された機能性蛋白質の活性を高
度に維持できることがわかる。あるいは融合蛋白質が互
いに接合することによって生じる立体障害の機能性蛋白
質に対する影響を抑制するために、リンカーを介して融
合した構造が有効であることも推測された。However, when the two activities were compared, F (a) retaining the SS bond between the heavy chains of the antibody molecule was
b) '2-AP [pF (ab') 2CEA-APneo
Expression product] has a low alkaline phosphatase activity. This suggests that the activity of a functional protein having a multimeric structure such as alkaline phosphatase may be suppressed by SS bond between heavy chains in the fused antibody molecule. The antibody molecule is S-
It seems that by joining by S bond, the joining of enzyme subunits cannot be formed well and sufficient activity cannot be expressed. On the other hand, Fab in which there is no SS bond between heavy chains
In -AP [expression product of pFabCEA-APneo], alkaline phosphatase activity is highly maintained. It can be seen that the activity of the fused functional protein can be maintained at a high level by combining antibody molecules having no SS bond between heavy chains. Alternatively, it has been speculated that a structure fused via a linker is effective in suppressing the effect of steric hindrance caused by fusion proteins joining each other on a functional protein.
【００９１】次にｐＦａｂＣＥＡ−ＡＰｎｅｏを導入し
たＣｏｓ７の培養上清を希釈し、ＣＥＡ抗原固相化ビー
ズと反応後ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ（ＰＮＰＰ）溶液を用いて抗体の抗原結合活性を
測定した。その結果、図１０に示すとおり抗体−アルカ
リホスファターゼ融合蛋白質の抗原結合活性確認され
た。Next, the culture supernatant of Cos7 into which pFabCEA-APneo had been introduced was diluted and reacted with beads having immobilized CEA antigen, and then reacted with p-Nitrophenyl Phosphate.
The antigen binding activity of the antibody was measured using the ate (PNPP) solution. As a result, the antigen-binding activity of the antibody-alkaline phosphatase fusion protein was confirmed as shown in FIG.
【００９２】以上より作製した抗体−アルカリホスファ
ターゼ融合蛋白質は抗体活性、酵素活性ともに機能して
おり、今回作製したｐＳＲｍｔＨＣＥＡ−ＡＰ、ｐＳＲ
ＨｍｔＣＨ２ＣＥＡ−ＡＰベクターはともに機能的であ
ることが示された。The antibody-alkaline phosphatase fusion protein prepared as described above functions both in antibody activity and enzyme activity, and the pSRmtHCEA-AP, pSR
Both HmtCH2CEA-AP vectors were shown to be functional.
【００９３】さらに、ｐＦａｂＣＥＡ−ＡＰｎｅｏ、ｐ
Ｆ（ａｂ’）２ＣＥＡ−ＡＰｎｅｏをリポフェクチンに
よりＣＨＯへ導入し、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選
択培地で培養し、セレクションをした。Ｇ４１８耐性コ
ロニーは、培養上清中のアルカリホスファターゼ活性で
スクリーニングし、活性の高いコロニーについてクロー
ニングし、安定形質転換細胞を樹立した。Further, pFabCEA-APneo, p
F (ab ') 2CEA-APneo was introduced into CHO by lipofectin, cultured in a selection medium containing 1 mg / ml G418, and selected. G418-resistant colonies were screened for alkaline phosphatase activity in the culture supernatant, clones with high activity were cloned, and stable transformed cells were established.
【００９４】[0094]
【発明の効果】本発明により、抗体可変領域の遺伝子の
下流に機能性蛋白質の遺伝子が連結された融合蛋白質製
造用ベクター、当該ベクターの製造方法、当該ベクター
で形質転換を行った組換え細胞を用いた融合蛋白質の発
現方法、が提供される。Industrial Applicability According to the present invention, a vector for producing a fusion protein in which a gene for a functional protein is linked downstream of a gene for an antibody variable region, a method for producing the vector, and a recombinant cell transformed with the vector are provided. And a method for expressing the fusion protein used.
【００９５】本発明のベクターを軽鎖用のベクターとと
もに、あるいはさらに軽鎖発現ベクターに組み込んで製
造される抗体と機能性蛋白質との融合蛋白質は、抗体の
部分が、Ｆａｂ類似分子、あるいはＦ（ａｂ’）２類似
分子であり、定常領域の抗原性の高い領域を欠いている
ために、ヒト体内での抗原性を低く抑制することが可能
である。A fusion protein of an antibody and a functional protein produced by incorporating the vector of the present invention together with a vector for a light chain, or further into a light chain expression vector, has a portion of the antibody similar to a Fab-like molecule or F ( ab ′) 2 similar molecule, which lacks a constant region with high antigenicity, and thus can suppress antigenicity in a human body to a low level.
【００９６】抗体可変領域遺伝子のクローニングは、変
異性の高い５’側にはアダプターを付加した上で制限酵
素切断部位を持つプライマーを用いて核酸増幅法により
行うため、クローニングベクターへの組み込みが極めて
容易である。Since the cloning of the antibody variable region gene is performed by a nucleic acid amplification method using a primer having a restriction enzyme cleavage site after adding an adapter to the highly variable 5 'side, integration into a cloning vector is extremely difficult. Easy.
【００９７】同様に機能性蛋白質の遺伝子を組み込むた
めのサイトを設けた場合には、制限酵素切断部位を持つ
プライマーを用いて核酸増幅を行った上でベクターに組
み込むため、クローニングは容易であり、ヒト由来の機
能性蛋白質のように微量の遺伝子しか得られないような
場合でも使用可能である。したがって、抗体可変領域と
機能性蛋白質の組み合わせには制限がなく、無限の組み
合わせが可能であると言ってもよい。Similarly, when a site for incorporating a gene of a functional protein is provided, cloning is easy because the nucleic acid is amplified using a primer having a restriction enzyme cleavage site and then incorporated into a vector. It can be used even when only a small amount of genes can be obtained, such as a functional protein of human origin. Therefore, the combination of the antibody variable region and the functional protein is not limited, and it may be said that an infinite number of combinations are possible.
【００９８】機能性蛋白質に酵素を用いて発現させた融
合蛋白質をエンザイムイムノアッセイの酵素標識抗体と
して用いた場合、従来の架橋剤で化学的に標識した酵素
標識抗体に比べて、酵素と抗体の結合は安定かつ均一で
あり、結合比率も一定である。また、架橋反応によるダ
メージを受けることもないので、酵素標識抗体を安定、
かつ大量に供給することが可能である。When a fusion protein expressed by using an enzyme on a functional protein is used as an enzyme-labeled antibody in an enzyme immunoassay, the binding of the enzyme to the antibody is higher than that of a conventional enzyme-labeled antibody chemically labeled with a crosslinking agent. Is stable and uniform, and the binding ratio is also constant. In addition, the enzyme-labeled antibody is stable because it is not damaged by the crosslinking reaction.
And it can be supplied in large quantities.
【００９９】このようにして得られる抗体断片と機能性
蛋白質の融合蛋白質の用途としては、先にあげたエンザ
イムイムノアッセイや免疫組織染色用の酵素標識抗体ば
かりではない。抗体の反応特異性を生かして融合した各
種機能性蛋白質の精製に用いれば、簡便かつ安価に機能
性蛋白質の生産と精製が可能になる。The fusion protein of the antibody fragment and the functional protein thus obtained is used not only for the enzyme-labeled antibody for enzyme immunoassay or immunohistological staining described above. If used for the purification of various functional proteins fused by utilizing the reaction specificity of the antibody, the production and purification of the functional protein can be carried out easily and at low cost.
【０１００】また、抗体断片とヒスチジンの様な酸性
の、あるいはリジンの様な塩基性のアミノ酸からなるポ
リペプチドとの融合蛋白質を担体に結合させアフィニテ
ィー精製に用いれば、従来のものよりも強固に担体に結
合させることができるので、より純度の高い精製が可能
になる。Further, when a fusion protein of an antibody fragment and a polypeptide comprising an acidic amino acid such as histidine or a basic amino acid such as lysine is bound to a carrier and used for affinity purification, it becomes stronger than conventional ones. Since it can be bound to a carrier, purification with higher purity becomes possible.
【０１０１】融合蛋白質をｉｎ ｖｉｖｏに用いた場合
にはさらに効果が期待できる。ホルモンやサイトカイン
をそれらの作用部位の近傍に対する抗体の断片と結合し
た融合蛋白質を作成して投与し、作用部位に機能性蛋白
質を誘導することも可能である。When the fusion protein is used in vivo, further effects can be expected. It is also possible to induce a functional protein at the site of action by producing and administering a fusion protein in which a hormone or cytokine is linked to a fragment of an antibody directed to the vicinity of the site of action.
【０１０２】また、本発明のような融合蛋白質を製造す
ることが不可能なペプチド以外の物質でも、融合蛋白質
と組み合わせて使用すれば従来よりも効果を上げること
が可能である。たとえば、抗腫瘍抗体と抗腫瘍剤の前駆
体を代謝して活性化するような酵素とで融合蛋白質を作
成し、抗腫瘍剤の前駆体と組み合わせて使用すれば、腫
瘍部位においてのみ抗腫瘍剤が活性化されるので正常組
織に対する副作用を減ずることができる。[0102] Even if a substance other than the peptide which cannot produce a fusion protein as in the present invention is used in combination with the fusion protein, the effect can be improved as compared with the conventional one. For example, if a fusion protein is prepared with an anti-tumor antibody and an enzyme that metabolizes and activates a precursor of the anti-tumor agent, and used in combination with the precursor of the anti-tumor agent, the anti-tumor agent can be used only at the tumor site Is activated, so that side effects on normal tissues can be reduced.
【０１０３】融合蛋白質に限らず生物製剤をｉｎ ｖｉ
ｖｏに用いる場合には安全性が重要なポイントとなる。
本発明によるの融合蛋白質は、抗体側をＦａｂ断片とす
ればヒトに対して抗原性が低く、抗体産生を誘導しにく
い。あるいはヒトの抗体産生細胞から得られた抗体遺伝
子をクローニングすれば、完全にヒトの遺伝子だけで融
合蛋白質を構成することも可能である。また、機能性蛋
白質もヒト由来のものを用いることが可能である。さら
に融合蛋白質自体も動物細胞で発現されるので、他の発
現系により生産される物質よりもｉｎ ｖｉｖｏでの安
全性は高く、機能性蛋白質の活性も安定していると考え
られる。特にＦａｂと多量体構造に基づいて活性を発現
する機能性蛋白質の組み合わせは、機能性蛋白質の活性
を高く維持できるので有利である。Not only fusion proteins but also biologics can be used in vivo
When used for vo, safety is an important point.
The fusion protein according to the present invention has low antigenicity to humans when the antibody side is a Fab fragment, and hardly induces antibody production. Alternatively, by cloning an antibody gene obtained from a human antibody-producing cell, a fusion protein can be composed entirely of human genes. In addition, a human-derived functional protein can also be used. Furthermore, since the fusion protein itself is also expressed in animal cells, it is considered that the safety in vivo is higher than the substances produced by other expression systems, and the activity of the functional protein is also stable. In particular, a combination of Fab and a functional protein that expresses an activity based on a multimeric structure is advantageous because the activity of the functional protein can be maintained at a high level.
【０１０４】[0104]
配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：アルカリホスファターゼ遺伝子の膜貫通領
域に相補的なｃＤＮＡ合成用プライマー 配列：CAGCAGGGTC CCGGCCAGCA GAGGAAGCAA ３０SEQ ID NO: 1 Sequence length: 30 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics: complementary to the transmembrane region of alkaline phosphatase gene Primer for cDNA synthesis: CAGCAGGGTC CCGGCCAGCA GAGGAAGCAA 30
【０１０５】配列番号：２ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：アルカリホスファターゼのリーダー配列の
３’下流に相補的な配列 配列：ACGTATGCAT ATCATCATCC CAGTTGAGGA GGA ３３SEQ ID NO: 2 Sequence length: 33 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics: alkaline phosphatase leader sequence 3 'Downstream complementary sequence Sequence: ACGTATGCAT ATCATCATCC CAGTTGAGGA GGA 33
【０１０６】配列番号：３ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：膜貫通領域の５’上流に相補的な配列にス
トップコドンを付加した配列 配列：ATATATCGAT CACCGCCCCG GGTGCGCGGC G ３１SEQ ID NO: 3 Sequence length: 31 Sequence type: number of nucleic acid chains: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics: 5 ′ upstream of transmembrane region Sequence with a stop codon added to the sequence complementary to: Sequence: ATATATCGAT CACCGCCCCG GGTGCGCGGC G31
【０１０７】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＣＨ１領域をコードするエクソンの中でBs
tXIサイトを含む領域に相補的なプライマー 配列：GCCCTCCAGC AGCTTGGGCA CCCAG ２５SEQ ID NO: 4 Sequence length: 25 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics: exon encoding CH1 region Bs in
Primer complementary to the region containing the tXI site Sequence: GCCCTCCAGC AGCTTGGGCA CCCAG25
【０１０８】配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ヒンジ領域をコードするエクソンに相補的
でEcoT22Iサイトを有するプライマー 配列：GGTGGATGCA TGTGAGTTTT GTCAC ２５SEQ ID NO: 5 Sequence length: 25 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA Sequence features: Exon encoding hinge region Complementary primer having EcoT22I site Sequence: GGTGGATGCA TGTGAGTTTT GTCAC 25
【０１０９】配列番号：６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＣＨ２領域をコードするエクソンに相補的
でEcoT22Iサイトを有するプライマー 配列：AGGGTATGCA TGGGTTTTGG GGGGA ２５SEQ ID NO: 6 Sequence length: 25 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics: Exon encoding CH2 region Complementary primer having EcoT22I site Sequence: AGGGTATGCA TGGGTTTTGG GGGGA 25
【図１】軽鎖発現用のベクターの例、ｐＳＲＬ−ｎｅｏ
の遺伝子地図である。FIG. 1. Example of vector for light chain expression, pSRL-neo
FIG.
【図２】融合蛋白質発現用ベクターｐＳＲｍｔＨＣＥＡ
−ＡＰの遺伝子地図である。FIG. 2 is a vector for expressing a fusion protein, pSRmtHCEA.
-It is a genetic map of AP.
【図３】融合蛋白質発現用ベクターｐＳＲｍｔＣＨ２Ｃ
ＥＡ−ＡＰの遺伝子地図である。FIG. 3 is a vector pSRmtCH2C for expressing a fusion protein.
It is a genetic map of EA-AP.
【図４】ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ遺伝子を
得るための工程図である。FIG. 4 is a process chart for obtaining a human placenta-derived alkaline phosphatase gene.
【図５】融合蛋白質発現用ベクターｐＳＲＨｍｔＨＣＥ
Ａ−ＡＰ、ならびにｐＳＲＨｍｔＣＨ２ＣＥＡ−ＡＰの
構築図である。FIG. 5: Fusion protein expression vector pSRHmtHCE
It is a construction drawing of A-AP and pSRHmtCH2CEA-AP.
【図６】融合蛋白質発現用ベクターｐＳＲＨｍｔＨＣＥ
Ａ−ＡＰ、ならびにｐＳＲＨｍｔＣＨ２ＣＥＡ−ＡＰの
構築図である。FIG. 6: Fusion protein expression vector pSRHmtHCE
It is a construction drawing of A-AP and pSRHmtCH2CEA-AP.
【図７】融合蛋白質発現用ベクターｐＳＲＨｍｔＨＣＥ
Ａ−ＡＰ、ならびにｐＳＲＨｍｔＣＨ２ＣＥＡ−ＡＰの
構築図である。FIG. 7: Fusion protein expression vector pSRHmtHCE
It is a construction drawing of A-AP and pSRHmtCH2CEA-AP.
【図８】軽鎖発現用ベクター、ｐＳＲＬＣＥＡ−ｎｅｏ
の構築図である。FIG. 8: Light chain expression vector, pSRLCEA-neo
FIG.
【図９】アルカリホスファターゼ活性の測定結果であ
る。FIG. 9 shows the measurement results of alkaline phosphatase activity.
【図１０】抗体−アルカリホスファターゼ融合蛋白質の
抗原結合活性測定結果である。FIG. 10 shows the results of measuring the antigen-binding activity of the antibody-alkaline phosphatase fusion protein.
【図１１】実施例で得た本発明に基づく融合蛋白質の構
造を模式的に表した図。FIG. 11 is a diagram schematically showing the structure of a fusion protein according to the present invention obtained in the examples.
Claims (27)
性蛋白質とで構成される融合蛋白質を発現するベクター
であって、抗体分子をコードする遺伝子を組み込むため
の制限酵素サイトを有し、前記制限酵素サイトが遺伝子
増幅反応用のプライマーによって規定される塩基配列に
対応しており、可変領域を含む領域をコードする遺伝子
の下流に機能性蛋白質をコードする遺伝子が連結されて
１つの読み取り枠を構成しているベクター1. A vector for expressing a fusion protein composed of an antibody molecule containing at least a variable region and a functional protein, said vector having a restriction enzyme site for incorporating a gene encoding the antibody molecule, The enzyme site corresponds to the base sequence defined by the primer for the gene amplification reaction, and the gene encoding the functional protein is linked downstream of the gene encoding the region containing the variable region to form one open reading frame. Vector
するための３’側のプライマーが、ＩｇＧのＪ領域にお
いて高度の保存性を有する領域に対して相補的であり、
かつ制限酵素の切断部位を含む塩基配列、またはＩｇＧ
のＪ領域において高度の保存性を有する領域に対して相
補的であり、かつ制限酵素の切断部位を付加した塩基配
列を含む塩基配列から選択される請求項１のベクター2. The 3′-side primer for amplifying a gene encoding a variable region of an antibody is complementary to a highly conserved region in the IgG J region,
And a nucleotide sequence containing a restriction enzyme cleavage site, or IgG
2. The vector according to claim 1, wherein the vector is selected from a nucleotide sequence that is complementary to a highly conserved region in the J region and contains a nucleotide sequence to which a restriction enzyme cleavage site has been added.
するための５’側のプライマーが、塩基配列中に少なく
とも一か所の制限酵素の切断部位を含むｃＤＮＡの５’
末端結合用アダプターである請求項１のベクター3. The 5′-side primer for amplifying a gene encoding a variable region of an antibody comprises a 5′-end of a cDNA containing at least one restriction enzyme cleavage site in the base sequence.
The vector according to claim 1, which is an adapter for terminal binding.
項１のベクター4. The vector according to claim 1, wherein the variable region of the antibody is a heavy chain variable region.
て重鎖可変領域と軽鎖可変領域を備え、このうち重鎖可
変領域が機能性蛋白質と融合している請求項１のベクタ
ー5. The vector according to claim 1, wherein a heavy chain variable region and a light chain variable region are provided as antibody variable regions on the same vector, wherein the heavy chain variable region is fused to a functional protein.
備えている請求項１のベクター6. The vector according to claim 1, further comprising a gene encoding a constant region of the antibody.
間のＳ−Ｓ結合に関与するシステインを含むが、重鎖−
重鎖間のＳ−Ｓ結合に関与するシステインを含まない領
域をコードするものであり、ＩｇＧの軽鎖を組み込んだ
別のベクターとともに宿主細胞に導入し形質転換させる
ことによってＦａｂ類似の分子を発現する請求項６のベ
クター7. The gene encoding the constant region contains a cysteine involved in the SS bond between the light chain and the heavy chain.
It encodes a cysteine-free region involved in the SS bond between heavy chains, and expresses a Fab-like molecule by introducing into another host cell and transforming it with another vector incorporating an IgG light chain. The vector of claim 6
間のＳ−Ｓ結合に関与するシステインと重鎖−重鎖間の
Ｓ−Ｓ結合に関与するシステインを含む領域をコードす
るものであり、ＩｇＧの軽鎖を組み込んだ別のベクター
とともに宿主細胞に導入し形質転換させることによって
Ｆ（ａｂ’）２類似の分子を発現する請求項６のベクタ
ー8. A gene encoding a constant region encoding a cysteine involved in the SS bond between the light chain and the heavy chain and a cysteine involved in the SS bond between the heavy chain and the heavy chain. 7. The vector according to claim 6, which expresses a molecule similar to F (ab ') 2 by being introduced into a host cell together with another vector into which an IgG light chain has been incorporated and transformed.
して機能性蛋白質をコードする遺伝子が連結されている
請求項８のベクター9. The vector according to claim 8, wherein a gene encoding a functional protein is linked downstream of the antibody-derived gene via a linker.
組み込むための制限酵素サイトを持ち、前記制限酵素サ
イトが機能性蛋白質をコードする遺伝子を増幅するため
のプライマーによって規定される塩基配列に対応してい
る請求項１のベクター(10) a restriction enzyme site for incorporating a gene encoding a functional protein, wherein the restriction enzyme site corresponds to a base sequence defined by a primer for amplifying a gene encoding the functional protein; The vector of claim 1, wherein
ホルモン、毒素、レセプター、シグナル伝達因子、ＤＮ
Ａ結合蛋白質、構造蛋白質、またはその断片、あるいは
誘導体で構成される群から選択される生理活性物質であ
る請求項１のベクター11. The functional protein may be an enzyme, a cytokine,
Hormones, toxins, receptors, signaling factors, DN
The vector according to claim 1, which is a physiologically active substance selected from the group consisting of an A-binding protein, a structural protein, or a fragment or derivative thereof.
ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダー
ゼ、またはそれらの断片、あるいは誘導体で構成される
群から選択される請求項１１のベクター12. The enzyme, wherein the enzyme is alkaline phosphatase, β-
The vector according to claim 11, which is selected from the group consisting of galactosidase, luciferase, peroxidase, or a fragment or derivative thereof.
グロブリンのリーダー配列を備え、これらの構成要素は
前記抗体分子および／または融合蛋白質をコードする遺
伝子に対して機能的に配置され、動物細胞を宿主として
発現させるものである請求項１のベクター13. A vector comprising an SRα promoter and an immunoglobulin leader sequence, wherein these components are operably arranged with respect to the gene encoding the antibody molecule and / or the fusion protein, and expressed using animal cells as a host. 2. The vector according to claim 1,
る請求項１３のベクター14. The vector according to claim 13, wherein the functional protein is derived from an animal.
ン、ポリ−Ｌ−リジン、またはビオチン結合性蛋白質で
ある請求項１のベクター15. The vector according to claim 1, wherein the functional protein is poly-L-histidine, poly-L-lysine, or a biotin-binding protein.
あり、この多量体構造を構成するサブユニット、または
その断片が抗体分子と融合している請求項１のベクター16. The vector according to claim 1, wherein the functional protein has a multimeric structure, and the subunit constituting the multimeric structure or a fragment thereof is fused to an antibody molecule.
複数のサブユニットから構成される多量体構造を取るこ
とによって活性を発現する機能性蛋白質を構成するサブ
ユニットとの融合蛋白質であって、融合蛋白質同志が接
合することによって機能性蛋白質の活性を発現するとと
もに、前記抗体分子の抗原結合活性も維持されている融
合蛋白質17. An antibody molecule comprising at least a variable region,
A fusion protein with a subunit that constitutes a functional protein that expresses activity by taking a multimeric structure composed of multiple subunits, and expresses the activity of a functional protein when fusion proteins join together And a fusion protein wherein the antigen-binding activity of the antibody molecule is maintained.
も重鎖が前記機能性蛋白質のサブユニットと融合してお
り、前記重鎖が軽鎖との間に存在するＳ−Ｓ結合を与え
るシステインを含むが重鎖−重鎖間に存在するＳ−Ｓ結
合を与えるシステインは含まず、前記機能性蛋白質のサ
ブユニットが会合することによって多価の抗体様の構造
を取る請求項１７の融合蛋白質18. An antibody molecule comprising a variable region, wherein at least a heavy chain is fused to a subunit of the functional protein, and the cysteine which gives an SS bond existing between the heavy chain and a light chain is provided. The fusion protein according to claim 17, which contains a cysteine that provides an SS bond existing between heavy chains but does not have a polyvalent antibody-like structure by associating the subunits of the functional protein.
えるシステインを含まない抗体分子が、ＦａｂまたはＦ
ａｂ類似の分子である請求項１８の融合蛋白質19. A cysteine-free antibody molecule that provides an SS bond existing between heavy chains, wherein the antibody molecule is Fab or F.
19. The fusion protein of claim 18, which is a molecule similar to ab.
えるシステインを含まない抗体分子が、このシステイン
を欠損するか、または他のアミノ酸に置換した変異体分
子である請求項１８の融合蛋白質20. An antibody molecule which does not contain a cysteine which gives an SS bond existing between heavy chains, and which is a mutant molecule in which the cysteine is deleted or substituted with another amino acid. Fusion proteins
と、少なくとも可変領域を含む抗体の重鎖分子とからな
る融合蛋白質であって、前記重鎖が軽鎖との間に存在す
るＳ−Ｓ結合を与えるシステインと、重鎖−重鎖間に存
在するＳ−Ｓ結合を与えるシステインのいずれをも含
み、前記機能性蛋白質のサブユニットの接合とともに抗
体分子の間にもＳ−Ｓ結合を構成することによって多価
の抗体様の構造を取る請求項１７の融合蛋白質21. A fusion protein comprising a subunit constituting a functional protein and a heavy chain molecule of an antibody containing at least a variable region, wherein the heavy chain exists between the light chain and the SS bond. And a cysteine that provides an SS bond existing between heavy and heavy chains, and forms an SS bond between the antibody molecules together with the subunit junction of the functional protein. 18. The fusion protein of claim 17, which thereby has a multivalent antibody-like structure.
に影響を与えないアミノ酸配列からなるリンカーを介し
て融合されている請求項２１の融合蛋白質22. The fusion protein according to claim 21, wherein the antibody molecule and the functional protein are fused via a linker comprising an amino acid sequence that does not affect the activities of both.
現する機能性蛋白質が、アルカリホスファターゼ、また
はβガラクトシダーゼである請求項１７の融合蛋白質23. The fusion protein according to claim 17, wherein the functional protein that expresses its activity by taking a multimeric structure is alkaline phosphatase or β-galactosidase.
複数のサブユニットから構成される多量体構造を取るこ
とによって活性を発現する機能性蛋白質を構成するサブ
ユニットとの融合蛋白質において、前記抗体分子が重鎖
−重鎖間のＳ−Ｓ結合を与えるシステインを含まないも
のとすることによって機能性蛋白質の活性を増強する方
法24. an antibody molecule comprising at least a variable region;
In a fusion protein with a subunit constituting a functional protein that expresses an activity by taking a multimeric structure composed of a plurality of subunits, the antibody molecule provides an SS bond between heavy chains. Method for enhancing the activity of a functional protein by eliminating cysteine
を備えた抗体分子と機能性蛋白質とで構成される融合蛋
白質を発現するベクターを構築する方法 １）目的とする抗体の可変領域をコードする遺伝子を制
限酵素の認識配列を含むプライマーによって増幅する工
程 ２）工程１のプライマーによって規定される制限酵素認
識配列を備えたベクターに、当該制限酵素を利用して抗
体の可変領域をコードする遺伝子を組み込む工程 ３）工程２によって得られるベクターライブラリーを抗
体活性を指標としてクローニングした後に、または前に
融合させるべき機能性蛋白質をコードする遺伝子を組み
込む工程、ただし工程２のベクター上において抗体の可
変領域をコードする遺伝子の上流には蛋白質の発現に必
要な制御領域を持ち、下流には機能性蛋白質をコードす
る遺伝子が連結されて１つの読み取り枠を構成しており
１本のポリペプチドとして翻訳される25. A method for constructing a vector expressing a fusion protein composed of an antibody molecule having at least a variable region and a functional protein, comprising the following steps: 1) Encoding the variable region of the antibody of interest Amplifying the gene with a primer containing a recognition sequence for a restriction enzyme 2) placing a gene encoding the variable region of the antibody using the restriction enzyme into a vector having a restriction enzyme recognition sequence defined by the primer in step 1; Incorporation step 3) A step of incorporating a gene encoding a functional protein to be fused after or before cloning the vector library obtained in Step 2 using the antibody activity as an index, provided that the variable region of the antibody Has a regulatory region required for protein expression upstream of the gene encoding And the gene encoding the protein is linked is translated as a single polypeptide constitutes one reading frame
おり、Large Ｔ抗原産生細胞を宿主としてベクターを発
現させ、得られる発現産物を抗体活性のスクリーニング
に用いる請求項２５のベクターを構築する方法26. The method for constructing a vector according to claim 25, wherein the vector has an SV40 ori region, the vector is expressed using Large T antigen-producing cells as a host, and the resulting expression product is used for screening for antibody activity.
が免疫学的な分析に用いるためのものであり、抗体活性
のスクリーニングにあたって抗体を介して免疫学的な結
合によって固相化した抗原を用いる請求項２６のベクタ
ーを構築する方法27. An antibody variable region-functional protein fusion protein for use in immunological analysis, wherein an antigen immobilized by immunological binding via an antibody is used in screening for antibody activity. A method for constructing a vector according to claim 26.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15297397A JPH10323187A (en) | 1997-03-27 | 1997-05-27 | Expression vector for fused protein derived from antibody variable region and functional protein |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9319797 | 1997-03-27 | ||
| JP9-93197 | 1997-03-27 | ||
| JP15297397A JPH10323187A (en) | 1997-03-27 | 1997-05-27 | Expression vector for fused protein derived from antibody variable region and functional protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10323187A true JPH10323187A (en) | 1998-12-08 |
Family
ID=26434627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15297397A Pending JPH10323187A (en) | 1997-03-27 | 1997-05-27 | Expression vector for fused protein derived from antibody variable region and functional protein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10323187A (en) |
-
1997
- 1997-05-27 JP JP15297397A patent/JPH10323187A/en active Pending
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