JPH10276791A - Fermentation process for preparing xylitol by using mutant cell - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To effectively produce xylitol useful as a sugar substitute, etc., by cultivating a specific mutant cell of a microorganism belonging to the genus Candida under the optimization of environmental conditions such as the composition of a culture medium, pH, temperature, dissolved oxygen concentration, etc., and under the control of mutant cell concentration. SOLUTION: This fermentation process for the maximum production of xylitol by using a mutant cell of Candida parapsilosis (deposit number KCCM-10088) is carried out under the following optimum conditions to obtain xylitol at high productivity: the concentration of mutant cell of 15-35 g/L obtained by the centrifugal separation of cells grown in a xylose medium or by the rapid accumulation of cells in fermentation broth; a fermentation medium composition for the maximum production of xylitol composed of 5-12 (w/v)% xylose, 0.2-2.0 (w/v)% yeast extract, 0.2-2.0 (w/v)% ammonium sulfate, 0.2-2.0 (w/v)% KH2 PO4 and 0.01-0.2 (w/v)% MgSO4 .7H2 O; a dissolved oxygen concentration in the medium of O.1-5.0%, an oxidation-reduction potential of 50-150 mV, a pH value of 4.5-5.5 and a fermentation temperature of 27-33 deg.C.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、Candida parasilo
sisの新規な変異細胞を用いて高い産生性でキシリトー
ルを調製するための発酵プロセス、より詳細には、キシ
ロースを含む培地の組成ならびにｐＨ、温度およびＤＯ
濃度のような培養の環境条件を最適化し、そして変異細
胞の濃度を制御することによって、最大キシリトール産
生のための至適発酵条件下でキシリトールを調製するた
めの発酵プロセスに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to Candida parasilo
Fermentation process for preparing xylitol with high productivity using novel mutant cells of sis, more particularly the composition of xylose-containing medium and pH, temperature and DO
It relates to a fermentation process for preparing xylitol under optimal fermentation conditions for maximal xylitol production by optimizing environmental conditions of the culture such as concentration and controlling the concentration of mutant cells.

【０００２】[0002]

【従来の技術】キシリトールは、五炭糖アルコールであ
って、酸形成を生じない抗う食原性特性およびスクロー
スに同等の甘味を有し、そして重量−重量基準に基づい
てスクロースと置換され得る。キシリトールは、溶液に
溶解する場合、実質的により低い粘性および負の熱効果
を有する。これらの特性のため、キシリトールの食品産
業、特に製菓産業において使用が増加している。キシリ
トールはまた、糖尿病またはグルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ欠損者の処置のための糖代替物として臨
床的に使用され得る。何故なら、インスリンは、キシリ
トールの消化に必要ではないからである。BACKGROUND OF THE INVENTION Xylitol is a pentose alcohol having anticariogenic properties that do not result in acid formation and sweetness equivalent to sucrose, and can be substituted for sucrose on a weight-by-weight basis. Xylitol has a substantially lower viscosity and a negative thermal effect when dissolved in a solution. These properties have led to increased use of xylitol in the food industry, especially in the confectionery industry. Xylitol can also be used clinically as a sugar substitute for the treatment of diabetes or glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Insulin is not required for xylitol digestion.

【０００３】キシリトールは、ヒトおよび動物における
炭水化物代謝の正常な中間生成物である。キシリトール
はまた、植物、特に特定の果物および野菜に広く分布し
ている。しかし、これらの供給源には少量しか存在しな
いため、キシリトールの大量抽出は困難であり、経済的
ではない。[0003] Xylitol is a normal intermediate of carbohydrate metabolism in humans and animals. Xylitol is also widely distributed in plants, especially certain fruits and vegetables. However, since only small amounts are present in these sources, large-scale extraction of xylitol is difficult and not economical.

【０００４】従来、キシリトールは、金属触媒の存在下
で、キシロースから水素化反応によって化学的に調製さ
れている。しかし、このような水素化反応は、キシリト
ールを調製するプロセスにおいて危険性を有する。何故
なら、この反応は高温および高圧下で多量の有機溶媒を
必要とするからである。さらに、この反応は、反応混合
物からのキシリトールの分離および精製が困難なため、
良好な収率を示さない。Heretofore, xylitol has been chemically prepared from xylose by hydrogenation in the presence of a metal catalyst. However, such hydrogenation reactions have risks in the process of preparing xylitol. This is because this reaction requires a large amount of organic solvent at high temperature and high pressure. Furthermore, this reaction is difficult to separate and purify xylitol from the reaction mixture,
Does not show good yield.

【０００５】化学調製方法のこのような欠点を克服する
ために、キシリトールを調製するための生物学的発酵プ
ロセスが研究されている。キシロースまたはキシロース
を有するヘミセルロース加水分解物を含む培地から酵母
種を用いてキシリトールを調製する発酵プロセスが開示
されている。特に、Candida blankii、Candida guillie
rmondii、Candida tropicalis、Candida utilis、Sacch
aromyces bailii、Saccharomyces rouxii、Saccharomyc
es uvariumおよびSchizosaccharomyces pombeが、キシ
リトール産生微生物として知られている。しかし、キシ
リトールの産生は、その産生速度が遅いために、あまり
好ましくない。To overcome these disadvantages of chemical preparation methods, biological fermentation processes for preparing xylitol are being investigated. A fermentation process for preparing xylitol from a medium containing xylose or a hemicellulose hydrolyzate having xylose using a yeast species is disclosed. In particular, Candida blankii, Candida guillie
rmondii, Candida tropicalis, Candida utilis, Sacch
aromyces bailii, Saccharomyces rouxii, Saccharomyc
es uvarium and Schizosaccharomyces pombe are known as xylitol producing microorganisms. However, xylitol production is less preferred because of its slow production rate.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】キシロース培地で増殖
した細胞の遠心分離によって、または発酵プロセス中の
細胞の急速な蓄積によって得られた濃縮された細胞を用
いてキシリトールの産生性を改良するために、本発明で
はキシリトールを調製するための良好な収率および最大
キシリトール産生のための至適発酵条件を有する変異細
胞を開発した。In order to improve xylitol productivity by centrifugation of cells grown in xylose medium or by using concentrated cells obtained by rapid accumulation of cells during the fermentation process. In the present invention, a mutant cell having a good yield for preparing xylitol and optimal fermentation conditions for maximum xylitol production has been developed.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、高い産
生性でキシリトールを調製するための、Candida paraｐ
silosisの新規な変異細胞（ブダペスト条約に基づいて1
996年10月21日に寄託番号KCCM-10088でコリアン カル
チャー センター オブ マイクロオーガニズムズに寄
託された）を提供することである。An object of the present invention is to provide a Candida parap for preparing xylitol with high productivity.
Novel mutant cells of silosis (1 based on the Budapest Treaty
(Deposited on October 21, 996 with the Korean Culture Center of Microorganisms under the deposit number KCCM-10088).

【０００８】本発明の他の目的は、以下の条件を制御す
ることによる、変異細胞を用いるキシリトールの最大産
生のための至適発酵条件を提供することである： ｉ）キシロース培地で増殖する細胞の遠心分離によるか
または発酵プロセス中の細胞の急速な蓄積による変異細
胞の濃度が１５〜３５ｇ／Ｌであり； ｉｉ）キシリトールの最大産生のための培地の組成が、
５〜１２（ｗ／ｖ）％のキシロース、０．２〜２．０
（ｗ／ｖ）％の酵母エキス、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％
の硫酸アンモニウム、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）のＫＨ₂
ＰＯ₄および０.０１〜０.２（ｗ／ｖ）％のＭｇＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏからなり； ｉｉｉ）該培地中の溶存酸素濃度が０.１〜５.０（ｗ／
ｖ）％であり； ｉｖ）該培地中の酸化−還元ポテンシャルが５０〜１５
０ｍＶであり； ｖ）培養培地のｐＨが４.５〜５.５であり；そして ｖｉ）培養温度が２７〜３３℃である。Another object of the present invention is to provide optimal fermentation conditions for maximal production of xylitol using mutant cells by controlling the following conditions: i) Cells growing on xylose medium The concentration of mutant cells is 15-35 g / L, either by centrifugation of the cells or by rapid accumulation of cells during the fermentation process; ii) the composition of the medium for maximal production of xylitol is
5-12 (w / v)% xylose, 0.2-2.0
(W / v)% yeast extract, 0.2-2.0 (w / v)%
Ammonium sulfate, 0.2-2.0 (w / v) KH ₂
PO ₄ and 0.01-0.2 (w / v)% MgSO _4.
Consists 7H ₂ O; iii) said medium in the dissolved oxygen concentration is 0.1 to 5.0 (w /
v)%; iv) the oxidation-reduction potential in the medium is 50 to 15;
V) the pH of the culture medium is 4.5-5.5; and vi) the culture temperature is 27-33 ° C.

【０００９】本発明によれば、寄託番号KCCM-10088でコ
リアン カルチャー センター オブ マイクロオーガ
ニズムズに寄託されたCandida parasilosis変異細胞を
用いるキシリトールの最大産生のための発酵プロセスで
あって、 ｉ）以下の発酵条件を制御することによって、キシロー
ス培地を変異細胞を用いて発酵させる工程： ａ）キシロース培地で増殖する細胞の遠心分離によるか
または発酵プロセス中の細胞の急速な蓄積による変異細
胞の濃度が１５〜３５ｇ／Ｌであり； ｂ）キシリトールの最大産生のための培地の組成が、５
〜１２（ｗ／ｖ）％のキシロース、０.２〜２.０（ｗ／
ｖ）％の酵母エキス、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％の硫酸
アンモニウム、０．２〜２．０（ｗ／ｖ）％のＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄および０.０１〜０.２（ｗ／ｖ）％のＭｇＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏからなり； ｃ）該培地中の溶存酸素濃度が０.１〜５.０（ｗ／ｖ）
％であり； ｄ）該培地中の酸化−還元ポテンシャルが５０〜１５０
ｍＶであり； ｅ）発酵培地のｐＨが４.５〜５.５であり；そして ｆ）発酵温度が２７〜３３℃である； ｉｉ）該発酵培地を遠心分離することによって、変異細
胞および他の残渣を取り除く工程；および ｉｉｉ）上清を濾過し、そして透析することによって、
キシリトールを分離し、そして回収する工程を包含す
る、プロセスが提供される。According to the present invention, there is provided a fermentation process for maximal production of xylitol using the Candida parasilosis mutant cells deposited at the Korean Culture Center of Microorganisms under accession number KCCM-10088, comprising: Fermenting xylose medium with the mutant cells by controlling the conditions: a) The concentration of the mutant cells is 15 to 15% by centrifugation of cells growing on xylose medium or by rapid accumulation of cells during the fermentation process. B) the composition of the medium for maximal production of xylitol is 5 g / L;
~ 12 (w / v)% xylose, 0.2 ~ 2.0 (w / v)
v)% of yeast extract, 0.2~2.0 (w / v)% of ammonium sulfate, 0.2~2.0 (w / v)% of KH ₂ P
O ₄ and 0.01~0.2 (w / v)% of MgSO ₄ · 7
Consists H ₂ O; c) said medium in the dissolved oxygen concentration is 0.1~5.0 (w / v)
%) The oxidation-reduction potential in the medium is 50 to 150%;
e) the pH of the fermentation medium is 4.5-5.5; and f) the fermentation temperature is 27-33 ° C .; ii) by centrifuging the fermentation medium, the mutant cells and other Iii) by filtering and dialyzing the supernatant,
A process is provided that includes separating and recovering xylitol.

【００１０】好ましい実施態様においては、前記発酵の
増殖期の間、２０％〜６０％のより高い溶存酸素レベル
を維持することによって、細胞の濃縮が急速に達成され
る。[0010] In a preferred embodiment, cell enrichment is achieved rapidly by maintaining higher dissolved oxygen levels of 20% to 60% during the growth phase of the fermentation.

【００１１】好ましい実施態様においては、前記培地中
の溶存酸素濃度が０.８〜１.２（ｗ／ｖ）％であり、そ
して該培地中の酸化−還元ポテンシャルが８０〜１１０
ｍＶである。In a preferred embodiment, the concentration of dissolved oxygen in the medium is 0.8 to 1.2 (w / v)%, and the oxidation-reduction potential in the medium is 80 to 110.
mV.

【００１２】好ましい実施態様においては、前記発酵の
ために用いられる変異細胞が、凍結（−７０℃）Candid
a parapsilosis (KCCM-10088)を４０〜６０ｍｌのＹＭ
培地（１８〜２２ｇ／Ｌのグルコース、４〜５ｇ／Ｌの
ペプトン、２.５〜３．５ｇ／Ｌの酵母エキス、２.５〜
３.５ｇ／Ｌの麦芽エキス）中、２８〜３２℃で１２〜
１８時間、培養することによって調製される。[0012] In a preferred embodiment, the mutant cells used for the fermentation are frozen (-70 ° C) Candid.
a parapsilosis (KCCM-10088) with 40-60 ml of YM
Medium (18-22 g / L glucose, 4-5 g / L peptone, 2.5-3.5 g / L yeast extract, 2.5-
3.5 g / L malt extract)
It is prepared by culturing for 18 hours.

【００１３】本願発明によれば、Candida parapsilosis
の新規の変異細胞(KCCM-10088)が提供される。According to the present invention, Candida parapsilosis
(KCCM-10088) is provided.

【００１４】本願発明によれば、Candida parapsilosis
(KCCM-10088)の単離方法であって、以下の工程を包含す
る、単離方法： ｉ）０.１％のニトロソメチルグアニジン（ＮＴＧ）を
含む酵母−麦芽エキス（ＹＭ）培地に野生型のCandida
parapsilosis (ATCC-21019)をスプレッドし、そして培
養する工程； ｉｉ）分離方法を３回を超えて繰り返すことによって、
生じたコロニーを分離する工程； ｉｉｉ）得られたコロニーを再度ＹＭ培地に２５０〜２
７０ｎｍのＵＶ照射下でスプレッドし、そして培養する
工程；および ｉｖ）変異細胞として増殖するコロニーを単離する工程
を包含する、単離方法が提供される。According to the present invention, Candida parapsilosis
(KCCM-10088), comprising the following steps: i) A wild-type yeast-malt extract (YM) medium containing 0.1% nitrosomethylguanidine (NTG). Candida
spreading and culturing parapsilosis (ATCC-21019); ii) by repeating the separation method more than three times
Separating the resulting colonies; iii) re-populating the obtained colonies again in YM medium for 250-2.
Spreading and culturing under 70 nm UV irradiation; and iv) isolating colonies that grow as mutant cells.

【００１５】[0015]

【発明の実施の形態】本発明のために使用される変異細
胞は、以下の方法によって単離される。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The mutant cells used for the present invention are isolated by the following method.

【００１６】野生型のCandida parapsilosis (ATCC-210
19)を、０.１％のニトロソメチルグアニジン（ＮＴＧ）
を含む酵母−麦芽エキス（ＹＭ）培地にスプレッドし、
そして培養し、そして分離方法を３回を超えて繰り返す
ことによって、生じたコロニーを分離する。得られたコ
ロニーを再度ＹＭ培地にスプレッドし、そして２５０〜
２７０ｎｍのＵＶ照射下で培養する。最後に、増殖する
コロニーを単離し、そして変異細胞として得る。これら
の変異細胞を寄託番号KCCM-10088でコリアンカルチャー
センター オブ マイクロオーガニズムズに寄託し
た。Wild-type Candida parapsilosis (ATCC-210
19) was replaced with 0.1% nitrosomethylguanidine (NTG)
Spread on a yeast-malt extract (YM) medium containing
The resulting colonies are then separated by culturing and repeating the separation procedure more than three times. The resulting colonies were spread again on YM medium and 250-
Culture under UV irradiation at 270 nm. Finally, growing colonies are isolated and obtained as mutant cells. These mutant cells were deposited at the Korean Culture Center of Microorganisms under the deposit number KCCM-10088.

【００１７】以下は、変異細胞を用いてキシリトールを
産生するための発酵方法である。The following is a fermentation method for producing xylitol using mutant cells.

【００１８】（種培養）Candida parapsilosis (KCCM-1
0088)の凍結（−７０℃）変異細胞を、２５０ｍｌフラ
スコ中、４０〜６０ｍｌのＹＭ培地（１８〜２２ｇ／Ｌ
のグルコース、４〜５ｇ／Ｌのペプトン、２.５〜３．
５ｇ／Ｌの酵母エキス、２.５〜３.５ｇ／Ｌの麦芽エキ
ス）中、２８〜３２℃で１２〜１８時間、培養する。培
養した変異細胞を、キシロース培地上で増殖する細胞の
遠心分離によるかまたは発酵プロセス中の細胞の急速な
蓄積により１５〜３５ｇ／Ｌに濃縮して、主培養におい
てキシリトールを産生するための細胞として使用する。(Seed culture) Candida parapsilosis (KCCM-1
0088) in a 250 ml flask in 40-60 ml of YM medium (18-22 g / L).
Glucose, 4-5 g / L peptone, 2.5-3.
5 g / L yeast extract, 2.5-3.5 g / L malt extract) at 28-32 ° C for 12-18 hours. The cultured mutant cells are concentrated to 15-35 g / L by centrifugation of cells growing on xylose medium or by rapid accumulation of cells during the fermentation process, as cells for producing xylitol in the main culture. use.

【００１９】（主培養）以下の遠心分離方法で得られる
濃縮された変異細胞は、キシリトール産生のための主培
養のための細胞として使用される。種細胞を、３.０％
（ｗ／ｖ）キシロース、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％酵母
エキス、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％ＫＨ₂ＰＯ₄、０.２
〜２.０（ｗ／ｖ）％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄および０．０１〜
０．２（ｗ／ｖ）％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ中、２８〜３２
℃で１６〜２４時間、１０Ｌ発酵槽中で培養し、次いで
培養ブロスを遠心分離し、そして濃縮する。(Main Culture) The concentrated mutant cells obtained by the following centrifugation method are used as cells for main culture for xylitol production. 3.0% seed cells
(W / v) xylose, 0.2 to 2.0 (w / v)% yeast extract, 0.2~2.0 (w / v)% KH 2 PO 4, 0.2
~2.0 (w / v)% ( NH 4) 2 SO 4 and 0.01
0.2 (w / v)% MgSO 4 · 7H during ₂ O, 28-32
Incubate in a 10 L fermentor at 16 ° C. for 16-24 hours, then centrifuge and concentrate the culture broth.

【００２０】濃縮された変異細胞を、２.５Ｌ発酵槽中
の１０（ｗ／ｖ）％キシロース、０.２〜２.０（ｗ／
ｖ）％の酵母エキス、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％の硫酸
アンモニウム、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％のＫＨ₂ＰＯ₄
および０.０１〜０.２（ｗ／ｖ）％のＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏからなるキシリトール最大産生のための培地に接種す
る。主培養物を、１００〜５００ｒｐｍの撹拌速度で、
ｐＨ４.５〜５.５、２７〜３３℃で培養する。The enriched mutant cells were purified from 10 (w / v)% xylose, 0.2-2.0 (w / v) in a 2.5 L fermentor.
v)% of yeast extract, 0.2~2.0 (w / v)% of ammonium sulfate, 0.2~2.0 (w / v)% of KH ₂ PO ₄
And 0.01~0.2 (w / v)% of MgSO ₄ · 7H ₂
The medium for xylitol maximal production consisting of O is inoculated. The main culture is stirred at a stirring speed of 100-500 rpm,
Incubate at pH 4.5-5.5, 27-33 ° C.

【００２１】以下の、発酵プロセス中の細胞の急速蓄積
方法において得られる濃縮された変異細胞はまた、キシ
リトールを産生するための主培養のための細胞として使
用される。細胞を、５〜３０％（ｗ／ｖ）キシロース
（これは発酵中に供給される）、０.２〜２.０（ｗ／
ｖ）％酵母エキス、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄、0.２〜２.０（ｗ／ｖ）％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄および
０．０１〜０．２（ｗ／ｖ）％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含
有する３Ｌの培地を含む５Ｌ発酵槽に接種する。主培養
を１００〜６００ｒｐｍの撹拌速度、２８〜３２℃、ｐ
Ｈ４.５〜５.５で、１６〜２４時間培養する。The enriched mutant cells obtained in the following rapid cell accumulation method during the fermentation process are also used as cells for the main culture to produce xylitol. Cells are grown at 5-30% (w / v) xylose, which is supplied during fermentation, at 0.2-2.0 (w / v).
v)% yeast extract, 0.2~2.0 (w / v)% KH 2 P
O _4, the medium 0.2~2.0 (w / v)% ( NH 4) 2 SO 4 and 0.01~0.2 (w / v)% MgSO 4 · 7H 2 O containing 3L And inoculate the 5 L fermenter containing it. The main culture was stirred at 100-600 rpm, 28-32 ° C, p
Incubate in H4.5-5.5 for 16-24 hours.

【００２２】濃縮された細胞は、発酵の増殖期の間、よ
り高いレベルのＤＯ（溶存酸素）（２０〜６０％）を維
持することによって急速に達成され、そしてＤＯ濃度
は、効果的なキシリトール産生のために低いレベル
（０.８〜１.２％）に低下される。微好気的条件下でキ
シリトールが産生されることから、高レベルから低レベ
ルへのＤＯの変化が、より高いキシリトール産生に必要
である。Enriched cells are rapidly achieved by maintaining higher levels of DO (dissolved oxygen) (20-60%) during the growth phase of the fermentation, and the DO concentration is increased by effective xylitol Reduced to low levels (0.8-1.2%) for production. Since xylitol is produced under microaerobic conditions, a change in DO from high to low levels is required for higher xylitol production.

【００２３】培地中の溶存酸素の濃度は、キシリトール
の産生に極めて重要である。何故なら、発酵には適切な
量の酸素が必要だからである。０.１〜５.０（ｗ／ｖ）
％の溶存酸素濃度下で発酵が実施され得るとしても、溶
存酸素の至適濃度は、０.８〜１.２（ｗ／ｖ）％の溶存
酸素である。溶存酸素の濃度は、発酵中の酸化−還元ポ
テンシャルレベルによって制御され得る。所望され得る
酸化−還元ポテンシャルレベルは、５０〜１００ｍＶで
あり、好ましくは８０〜１１０ｍＶである。[0023] The concentration of dissolved oxygen in the medium is extremely important for the production of xylitol. This is because fermentation requires an appropriate amount of oxygen. 0.1 to 5.0 (w / v)
Although the fermentation can be carried out under a concentration of dissolved oxygen of 0.2%, the optimal concentration of dissolved oxygen is between 0.8 and 1.2 (w / v)% dissolved oxygen. The concentration of dissolved oxygen can be controlled by the level of oxidation-reduction potential during fermentation. The oxidation-reduction potential level which may be desired is between 50 and 100 mV, preferably between 80 and 110 mV.

【００２４】発酵プロセスは、好ましくは流加プロセス
(fed batch process)によって実施される。キシロース
が培地中で完全に消費された後、キシリトールの量を、
Sugar-Pak Iカラムを備えたＨＰＬＣにより測定する。
測定されたキシリトールの収率は、キシロース消費のバ
イオマスに対して６５〜８５％であり、そして容積生産
性は１.７〜４.７ｇ／Ｌ−時間であり、これらは、従来
の発酵収率および生産性と比較して２〜８倍増加してい
る。The fermentation process is preferably a fed-batch process
(fed batch process). After xylose is completely consumed in the medium, the amount of xylitol is
Measured by HPLC equipped with a Sugar-Pak I column.
The measured yields of xylitol are 65-85% based on the biomass of xylose consumption, and the volumetric productivity is 1.7-4.7 g / L-hour, which indicates the conventional fermentation yield And 2 to 8 times the productivity.

【００２５】最後に、細胞および他の残渣を除去するた
めに、発酵培地を遠心分離し、そしてキシリトールを得
るために上清を濾過し、そして透析する。Finally, the fermentation medium is centrifuged to remove cells and other debris, and the supernatant is filtered and dialyzed to obtain xylitol.

【００２６】本発明は、以下の実施例によってより具体
的に説明され得る。しかし、本発明の範囲は、以下の実
施例によって制限され得ない。The present invention can be more specifically explained by the following examples. However, the scope of the present invention cannot be limited by the following examples.

【００２７】[0027]

【実施例】【Example】

（実施例１）Candida parapsilosis (KCCM-10088)の凍
結（−７０℃）変異細胞を、２５０ｍｌフラスコ中、５
０ｍｌのＹＭ培地（１８〜２２ｇ／Ｌのグルコース、４
〜５ｇ／Ｌのペプトン、２.５〜３．５ｇ／Ｌの酵母エ
キス、２.５〜３.５ｇ／Ｌの麦芽エキス）中、３０℃で
１５時間、培養する。種細胞を３.０％（ｗ／ｖ）キシ
ロース培地（０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％酵母エキス、
０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％ＫＨ₂ＰＯ₄、０.２〜２.０
（ｗ／ｖ）％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄および０．０１〜０．２
（ｗ／ｖ）％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）中、２８〜３２℃で
１６〜２４時間、１０Ｌ発酵槽中で培養し、次いで培養
ブロスを遠心分離し、そして濃縮する。培養した変異細
胞を２０ｇ／Ｌに濃縮して、主培養においてキシリトー
ルを産生するための細胞として使用する。(Example 1) Frozen (-70 ° C) mutant cells of Candida parapsilosis (KCCM-10088) were placed in a 250 ml flask in 5 ml.
0 ml YM medium (18-22 g / L glucose, 4
(Peptone of ５5 g / L, yeast extract of 2.5-3.5 g / L, malt extract of 2.5-3.5 g / L) at 30 ° C. for 15 hours. Seed cells were transferred to a 3.0% (w / v) xylose medium (0.2 to 2.0 (w / v)% yeast extract,
0.2~2.0 (w / v)% KH 2 PO 4, 0.2~2.0
(W / v)% (NH 4) 2 SO 4 and 0.01 to 0.2
Incubate (10% fermenter in (w / v)% MgSO ₄ .7H ₂ O) at 28-32 ° C. for 16-24 hours, then centrifuge and concentrate the culture broth. The cultured mutant cells are concentrated to 20 g / L and used as cells for producing xylitol in the main culture.

【００２８】濃縮した変異細胞を、１００ｇ／Ｌのキシ
ロース、５ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／Ｌの硫酸アンモ
ニウム、５ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄および０.２ｇ／ＬのＭ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏからなるキシリトール最大産生のため
の培地に接種する。主培養物を、２.５Ｌ発酵槽中、４
５０ｒｐｍ（酸素移動速度係数＝６０ｈ^-1）の撹拌速度
で、ｐＨ５.０、３０℃で培養する。溶存酸素の濃度
は、１.０（ｗ／ｖ）％の溶存酸素である。The enriched mutant cells were purified from 100 g / L xylose, 5 g / L yeast extract, 5 g / L ammonium sulfate, 5 g / L KH ₂ PO ₄ and 0.2 g / L M
inoculated into the medium for xylitol maximum production consisting gSO ₄ · 7H ₂ O. The main culture was placed in a 2.5 L fermentor for 4
Culture at pH 5.0 and 30 ° C. with a stirring speed of 50 rpm (oxygen transfer rate coefficient = 60 h ⁻¹ ). The concentration of dissolved oxygen is 1.0 (w / v)% dissolved oxygen.

【００２９】２２時間の発酵後、キシリトールの量を、
Sugar-Pak Iカラムを備えたＨＰＬＣにより測定する。
得られるキシリトールは８０ｇ／Ｌであり、そして容積
生産性は３.６ｇ／Ｌ−時間である。After 22 hours of fermentation, the amount of xylitol is
Measured by HPLC equipped with a Sugar-Pak I column.
The xylitol obtained is 80 g / L and the volumetric productivity is 3.6 g / L-hour.

【００３０】（実施例２）Candida parapsilosis (KCCM
-10088)の凍結（−７０℃）変異細胞を、２５０ｍｌフ
ラスコ中、５０ｍｌのＹＭ培地（１８〜２２ｇ／Ｌのグ
ルコース、４〜５ｇ／Ｌのペプトン、２.５〜３．５ｇ
／Ｌの酵母エキス、２.５〜３.５ｇ／Ｌの麦芽エキス）
中、３０℃で１５時間、培養する。種細胞を３.０％
（ｗ／ｖ）キシロース、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％酵母
エキス、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％ＫＨ₂ＰＯ₄、０.２
〜２.０（ｗ／ｖ）％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄および０．０１〜
０．２（ｗ／ｖ）％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ中、２８〜３２
℃で１６〜２４時間、１０Ｌ発酵槽中で培養し、次いで
培養ブロスを遠心分離し、そして濃縮する。培養した変
異細胞を２５ｇ／Ｌに濃縮して、主培養においてキシリ
トールを産生するための細胞として使用する。Example 2 Candida parapsilosis (KCCM
-10088) in 50 ml of YM medium (18-22 g / L glucose, 4-5 g / L peptone, 2.5-3.5 g) in a 250 ml flask.
/ L yeast extract, 2.5-3.5 g / L malt extract)
Incubate at 30 ° C for 15 hours. 3.0% seed cells
(W / v) xylose, 0.2 to 2.0 (w / v)% yeast extract, 0.2~2.0 (w / v)% KH 2 PO 4, 0.2
~2.0 (w / v)% ( NH 4) 2 SO 4 and 0.01
0.2 (w / v)% MgSO 4 · 7H during ₂ O, 28-32
Incubate in a 10 L fermentor at 16 ° C. for 16-24 hours, then centrifuge and concentrate the culture broth. The cultured mutant cells are concentrated to 25 g / L and used as cells for producing xylitol in the main culture.

【００３１】濃縮した変異細胞を、１００ｇ／Ｌのキシ
ロース、６ｇ／Ｌの酵母エキス、６ｇ／Ｌの硫酸アンモ
ニウム、６ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄および０.２ｇ／ＬのＭ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏからなるキシリトールの最大産生のた
めの培地に接種する。主培養物を、２.５Ｌ発酵槽中、
５００ｒｐｍ（酸素移動速度係数＝６５ｈ^-1）の撹拌速
度で、ｐＨ５.０、３０℃で培養する。溶存酸素の濃度
は、１.５（ｗ／ｖ）％の溶存酸素である。The enriched mutant cells were subjected to 100 g / L xylose, 6 g / L yeast extract, 6 g / L ammonium sulfate, 6 g / L KH ₂ PO ₄ and 0.2 g / L M
inoculated into the medium for maximum production of xylitol consisting gSO ₄ · 7H ₂ O. Main culture in 2.5 L fermentor
Culture at pH 5.0 and 30 ° C. at a stirring speed of 500 rpm (oxygen transfer rate coefficient = 65 h ⁻¹ ). The concentration of dissolved oxygen is 1.5 (w / v)% dissolved oxygen.

【００３２】１８時間の発酵後、キシリトールの量を、
Sugar-Pak Iカラムを備えたＨＰＬＣにより測定する。
得られるキシリトールは８１ｇ／Ｌであり、そして容積
生産性は４.５ｇ／Ｌ−時間である。After 18 hours of fermentation, the amount of xylitol was
Measured by HPLC equipped with a Sugar-Pak I column.
The xylitol obtained is 81 g / L and the volumetric productivity is 4.5 g / L-hour.

【００３３】（実施例３）Candida parapsilosis (KCCM
-10088)の凍結（−７０℃）変異細胞を、２５０ｍｌフ
ラスコ中、５０ｍｌのＹＭ培地（１８〜２２ｇ／Ｌのグ
ルコース、４〜５ｇ／Ｌのペプトン、２.５〜３．５ｇ
／Ｌの酵母エキス、２.５〜３.５ｇ／Ｌの麦芽エキス）
中、３０℃で１５時間、培養する。種細胞を３.０％
（ｗ／ｖ）キシロース培地（０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％
酵母エキス、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％ＫＨ₂ＰＯ₄、
０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄および０．
０１〜０．２（ｗ／ｖ）％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）中、２
８〜３２℃で１６〜２４時間、１０Ｌ発酵槽中で培養
し、次いで培養ブロスを遠心分離し、そして濃縮する。
培養した変異細胞を３０ｇ／Ｌに濃縮して、主培養にお
いてキシリトールを産生するための細胞として使用す
る。Example 3 Candida parapsilosis (KCCM
-10088) in 50 ml of YM medium (18-22 g / L glucose, 4-5 g / L peptone, 2.5-3.5 g) in a 250 ml flask.
/ L yeast extract, 2.5-3.5 g / L malt extract)
Incubate at 30 ° C for 15 hours. 3.0% seed cells
(W / v) xylose medium (0.2 to 2.0 (w / v)%
Yeast extract, 0.2-2.0 (w / v)% KH ₂ PO ₄ ,
0.2~2.0 (w / v)% ( NH 4) 2 SO 4 and 0.
01~0.2 (w / v)% MgSO 4 · 7H 2 O) in 2
Incubate in a 10 L fermentor at 8-32 ° C. for 16-24 hours, then centrifuge and concentrate the culture broth.
The cultured mutant cells are concentrated to 30 g / L and used as cells for producing xylitol in the main culture.

【００３４】濃縮した変異細胞を、１００ｇ／Ｌのキシ
ロース、４ｇ／Ｌの酵母エキス、４ｇ／Ｌの硫酸アンモ
ニウム、４ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄および０.２ｇ／ＬのＭ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏからなるキシリトールの最大産生のた
めの培地に接種する。主培養物を、２.５Ｌ発酵槽中、
５５０ｒｐｍ（酸素移動速度係数＝７２ｈ^-1）の撹拌速
度で、ｐＨ５.０、３０℃で培養する。溶存酸素の濃度
は、０.８（ｗ／ｖ）％の溶存酸素である。The concentrated mutant cells were purified from 100 g / L xylose, 4 g / L yeast extract, 4 g / L ammonium sulfate, 4 g / L KH ₂ PO ₄ and 0.2 g / L MH.
inoculated into the medium for maximum production of xylitol consisting gSO ₄ · 7H ₂ O. Main culture in 2.5 L fermentor
Culture at pH 5.0 and 30 ° C. at a stirring speed of 550 rpm (oxygen transfer rate coefficient = 72 h ⁻¹ ). The concentration of dissolved oxygen is 0.8 (w / v)% dissolved oxygen.

【００３５】２０時間の発酵後、キシリトールの量を、
Sugar-Pak Iカラムを備えたＨＰＬＣにより測定する。
得られるキシリトールは８５ｇ／Ｌであり、そして容積
生産性は４.２ｇ／Ｌ−時間である。After fermentation for 20 hours, the amount of xylitol is
Measured by HPLC equipped with a Sugar-Pak I column.
The xylitol obtained is 85 g / L and the volumetric productivity is 4.2 g / L-hour.

【００３６】（実施例４）Candida parapsilosis (KCCM
-10088)の凍結（−７０℃）変異細胞を、２５０ｍｌフ
ラスコ中、５０ｍｌのＹＭ培地（１８〜２２ｇ／Ｌのグ
ルコース、４〜５ｇ／Ｌのペプトン、２.５〜３．５ｇ
／Ｌの酵母エキスおよび２.５〜３.５ｇ／Ｌの麦芽エキ
ス）中、３０℃で１５時間、培養し、次いで、５％（ｖ
／ｖ）の培養ブロスを３０％（ｗ／ｖ）キシロース（発
酵中に補給される）、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％酵母エ
キス、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％ＫＨ₂ＰＯ₄、０.２〜
２.０（ｗ／ｖ）％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄および０．０１〜
０．２（ｗ／ｖ）％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを含有する３Ｌ
の培地を含む５Ｌ発酵槽に移す。主培養物を、１００〜
６００ｒｐｍの撹拌速度で、ｐＨ４.５〜５.５、２８〜
３２℃で１６〜２４時間、培養する。キシロースが完全
に消費される期間の間、培養を行う。Example 4 Candida parapsilosis (KCCM
-10088) in 50 ml of YM medium (18-22 g / L glucose, 4-5 g / L peptone, 2.5-3.5 g) in a 250 ml flask.
/ L yeast extract and 2.5-3.5 g / L malt extract) at 30 ° C for 15 hours and then 5% (v
(V / v) culture broth at 30% (w / v) xylose (supplied during fermentation), 0.2-2.0 (w / v)% yeast extract, 0.2-2.0 (w / v) _{v)% KH 2 PO 4,} 0.2~
2.0 (w / v)% ( NH 4) 2 SO 4 and 0.01
0.2 (w / v)% MgSO 4 · 7H 2 O containing 3L
To a 5 L fermentor containing the medium. Main culture, 100-
At a stirring speed of 600 rpm, pH 4.5-5.5, 28-
Incubate at 32 ° C for 16 to 24 hours. Culture is performed during the period when xylose is completely consumed.

【００３７】キシリトール産生に対する高キシロース濃
度の阻害効果のため、キシロースの流加培養を実施す
る。発酵槽の容積は、３００ｇ含有の５００mlを２回補
給することによって、３００ｇのキシロースを含有する
２Ｌから９００ｇのキシロースを含有する３Ｌへ増加す
る。発酵の初期指数増殖期の間、ＤＯ濃度を高レベルに
維持する。細胞濃度が、細胞の急速な蓄積により２０時
間で約３０ｇ／Ｌに達した後、ＤＯ濃度を、撹拌速度を
調節する（約３５０〜４００ｒｐｍ）ことによって、
０.８〜１.２％の範囲に制御する。６６時間の発酵後に
３００ｇ／Ｌのキシロースから２４０ｇ／Ｌのキシリト
ールが得られ、これはキシロースからのキシリトール収
率８０％に相当する。流加発酵のキシリトール産生速度
は、高濃度の細胞により、３.６３ｇ／Ｌ−時間に増加
した。For the inhibitory effect of high xylose concentration on xylitol production, xylose is fed-batch culture. The volume of the fermenter is increased from 2L containing 300g xylose to 3L containing 900g xylose by replenishing 500ml containing 300g twice. The DO concentration is maintained at a high level during the initial exponential phase of the fermentation. After the cell concentration reaches about 30 g / L in 20 hours due to rapid accumulation of cells, the DO concentration is adjusted by adjusting the agitation speed (about 350-400 rpm).
Control within the range of 0.8 to 1.2%. After 66 hours of fermentation, 300 g / L xylose gives 240 g / L xylitol, which corresponds to a xylitol yield of 80% from xylose. The xylitol production rate of the fed-batch fermentation was increased to 3.63 g / L-hour due to the high concentration of cells.

【００３８】（実施例５）パイロットスケールの発酵槽
システム（Korea Fermentor Co.）において、パイロッ
トプラント実験を実施した。Example 5 A pilot plant experiment was performed in a pilot scale fermenter system (Korea Fermentor Co.).

【００３９】Candida parapsilosis (KCCM-10088)の凍
結（−７０℃）変異細胞を、５００ｍｌフラスコ中、７
５ｍｌのＹＭ培地（１８〜２２ｇ／Ｌのグルコース、４
〜５ｇ／Ｌのペプトン、２.５〜３．５ｇ／Ｌの酵母エ
キスおよび２.５〜３.５ｇ／Ｌの麦芽エキス）中、３０
℃で１５時間、培養し、次いで、培養ブロスを１.５Ｌ
のＹＭ培地を含む２.５Ｌ発酵槽に移し、そして２８〜
３２℃で７〜１２時間、培養する。この種菌を３０Ｌの
発酵培地（５.０％（ｗ／ｖ）キシロース、０.２〜２.
０（ｗ／ｖ）％酵母エキス、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％
ＫＨ₂ＰＯ₄、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％（ＮＨ₄）₂ＳＯ
₄および０．０１〜０．２（ｗ／ｖ）％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏを含む５０Ｌ発酵槽に接種し（２８〜３２℃、１０
〜１４時間）、次いで３０Ｌの培養ブロスを２００Ｌの
発酵培地を含む４００Ｌ発酵槽に移し、そして８時間培
養した。２００Ｌの種菌を１、４００Ｌの発酵培地を含
む３、０００Ｌ主発酵槽に接種した。発酵槽の温度およ
びｐＨを、それぞれ４.５〜５.５および２８〜３０℃に
制御する。種発酵槽のＤＯ濃度を２０％より高く維持
し、そして主発酵槽のＤＯ濃度を、効果的なキシリトー
ル産生のために適切に調節する。通気速度を０.５ｖｖ
ｍに固定する。撹拌速度を４０〜１３０ｒｐｍの範囲内
で徐々に増加させて、増殖期の間２０％のＤＯより高く
維持し、そして産生期の間、６５〜７５ｒｐｍの範囲に
シフトさせる。これは約６０ｈ^-1の酸素移動係数に相当
する。高度に濃縮された細胞は、発酵の増殖期の間、よ
り高いレベルのＤＯを維持することによって、急速に達
成され、そしてＤＯ濃度を、効果的なキシリトール産生
のために低いレベルに低下させる。微好気的条件下でキ
シリトールが産生されるので、高レベルから低レベルへ
のＤＯの変化が、より高いキシリトール産生に必要であ
る。高キシロース濃度からのキシリトールの高産生は、
細胞の急速な蓄積ならびにコントロールパラメーターと
してＤＯおよび酸化−還元ポテンシャルを使用すること
によって、試みられている。[0039] Frozen (-70 ° C) mutant cells of Candida parapsilosis (KCCM-10088) were cultured in 500 ml flasks for 7 days.
5 ml of YM medium (18-22 g / L glucose, 4
-5 g / L peptone, 2.5-3.5 g / L yeast extract and 2.5-3.5 g / L malt extract).
C. for 15 hours and then 1.5 L of culture broth
Transfer to a 2.5 L fermentor containing YM medium of
Incubate at 32 ° C for 7 to 12 hours. This inoculum was treated with 30 L of fermentation medium (5.0% (w / v) xylose, 0.2 to 2.2.
0 (w / v)% yeast extract, 0.2-2.0 (w / v)%
KH ₂ PO ₄ , 0.2-2.0 (w / v)% (NH ₄ ) ₂ SO
₄ and 0.01~0.2 (w / v)% MgSO 4 · 7H
Inoculate a 50 L fermenter containing ₂ O (28-32 ° C., 10
~ 14 hours), then 30 L of culture broth was transferred to a 400 L fermentor containing 200 L of fermentation medium and cultured for 8 hours. 200 L of the inoculum was inoculated into a 3,000 L main fermenter containing 1,400 L of fermentation medium. The temperature and pH of the fermenter are controlled at 4.5-5.5 and 28-30 ° C, respectively. The DO concentration in the seed fermentor is maintained above 20%, and the DO concentration in the main fermenter is adjusted appropriately for effective xylitol production. Ventilation speed 0.5vv
fixed to m. The agitation speed is gradually increased in the range of 40-130 rpm to keep it above 20% DO during the growth phase and shift to a range of 65-75 rpm during the production phase. This corresponds to an oxygen transfer coefficient of about 60 h ^-1 . Highly enriched cells are achieved rapidly by maintaining higher levels of DO during the growth phase of the fermentation, and reduce DO concentrations to lower levels for effective xylitol production. Since xylitol is produced under microaerobic conditions, a change in DO from high to low levels is required for higher xylitol production. High production of xylitol from high xylose concentration
Attempts have been made by using rapid accumulation of cells and using DO and oxidation-reduction potential as control parameters.

【００４０】キシロースの流加培養を、約１７０ｇ／Ｌ
の初期濃度で行う。発酵槽の容積を、１６０ｋｇのキシ
ロース（４００Ｌ）を２回、それぞれ３１時間および４
７時間で補給することによって、２４０ｋｇのキシロー
スを含有する１、４００Ｌから５６０ｇのキシロースを
含有する２、２００Ｌへ増加させる。発酵の指数増殖期
の間、ＤＯ濃度を高レベルで維持する。細胞の濃度が約
２０ｇ／Ｌに急速に達成した後、撹拌速度を調節するこ
とによって、酸化−還元ポテンシャルおよびＤＯを、そ
れぞれ８０〜１１０ｍＶおよび０.５〜１.５％に制御す
る。添加されるキシロースの総濃度は２５４.５ｇ／Ｌ
であり、そして７７時間で完全に消費される。２０８ｇ
／Ｌの最終キシリトール濃度が得られる。キシロースか
らのキシリトール収率は８２％である。細胞濃度が増加
したので、キシリトール産生速度は、２.６９ｇ／Ｌ・
ｈに増加した。A fed-batch culture of xylose was carried out at about 170 g / L.
Perform at an initial concentration of. The volume of the fermentor was adjusted by adding 160 kg xylose (400 L) twice, for 31 hours and 4 times, respectively.
Replenishment in 7 hours increases from 1,400 L containing 240 kg xylose to 2,200 L containing 560 g xylose. DO levels are maintained at high levels during the exponential phase of the fermentation. After the cell concentration rapidly reaches about 20 g / L, the oxidation-reduction potential and DO are controlled to 80-110 mV and 0.5-1.5%, respectively, by adjusting the stirring speed. The total concentration of xylose added is 254.5 g / L
And is completely consumed in 77 hours. 208g
/ L final xylitol concentration is obtained. The xylitol yield from xylose is 82%. The xylitol production rate was 2.69 g / L.
h.

【００４１】（比較例）野生型のCandida parapsilosis
(ATCC-21019）を発酵細胞として使用することを除い
て、実施例１と同様の様式で発酵を行う。得られるキシ
リトールは、５２ｇ／Ｌであり、そして容積生産性は
２.４ｇ／Ｌ−時間である。Comparative Example Wild-type Candida parapsilosis
Fermentation is carried out in the same manner as in Example 1, except that (ATCC-21019) is used as a fermentation cell. The resulting xylitol is 52 g / L and the volumetric productivity is 2.4 g / L-hour.

【００４２】[0042]

【発明の効果】本発明により、Candida parapsilosisの
新規な変異細胞を用いて高い産生性でキシリトールを調
製するための発酵プロセス、より詳細には、キシロース
を含む培地の組成ならびにｐＨ、温度およびＤＯ濃度の
ような培養の環境条件を最適化し、そして変異細胞の濃
度を制御することによって、最大キシリトール産生のた
めの至適発酵条件下でキシリトールを調製するための発
酵プロセスが提供される。Industrial Applicability According to the present invention, a fermentation process for preparing xylitol with high productivity using novel mutant cells of Candida parapsilosis, more specifically, the composition of a medium containing xylose and the pH, temperature and DO concentration Optimizing the environmental conditions of the culture, such as, and controlling the concentration of mutant cells provides a fermentation process for preparing xylitol under optimal fermentation conditions for maximum xylitol production.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:72） (72)発明者 ジン フワン シオイ 大韓民國 ソウル， ヤンチュン−ク， モック−ドン， シンシガジ アパートメ ント， 1215−208 (72)発明者 ソー ユン キム 大韓民國 キュンギ−ド， コヤン−シ, イルサン−ドン， フゴック−マエウ ル， 1403−1301──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification symbol FI C12R 1:72) (C12N 1/16 C12R 1:72) (72) Inventor Jin Huan Shioi Seoul, Yanchung-ku, Mock- Dong, Shin-Shigaji Apartment, 1215-208 (72) Inventor So Yun Kim Kung-Guide, Goyang-Shi, Ilsan-Dong, Hugok-Maeul, 1403-1301

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 寄託番号KCCM-10088でコリアン カルチ
ャー センター オブ マイクロオーガニズムズに寄託
されたCandida parapsilosis変異細胞を用いるキシリト
ールの最大産生のための発酵プロセスであって、以下の
工程を包含する、プロセス： ｉ）以下の発酵条件を制御することによって、キシロー
ス培地を変異細胞を用いて発酵させる工程； ａ）キシロース培地で増殖する細胞の遠心分離によるか
または発酵プロセス中の細胞の急速な蓄積による変異細
胞の濃度が１５〜３５ｇ／Ｌであり； ｂ）キシリトールの最大産生のための培地の組成が、５
〜１２（ｗ／ｖ）％のキシロース、０.２〜２.０（ｗ／
ｖ）％の酵母エキス、０.２〜２.０（ｗ／ｖ）％の硫酸
アンモニウム、０．２〜２．０（ｗ／ｖ）％のＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄および０.０１〜０.２（ｗ／ｖ）％のＭｇＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏからなり； ｃ）該培地中の溶存酸素濃度が０.１〜５.０（ｗ／ｖ）
％であり； ｄ）該培地中の酸化−還元ポテンシャルが５０〜１５０
ｍＶであり； ｅ）発酵培地のｐＨが４.５〜５.５であり；そして ｆ）発酵温度が２７〜３３℃である、 ｉｉ）該発酵培地を遠心分離することによって、変異細
胞および他の残渣を取り除く工程；および ｉｉｉ）上清を濾過し、そして透析することによって、
キシリトールを分離し、そして回収する工程。1. A fermentation process for maximal production of xylitol using the Candida parapsilosis mutant cells deposited at the Korean Culture Center of Microorganisms under accession number KCCM-10088, comprising the following steps: i) fermenting xylose medium with the mutant cells by controlling the following fermentation conditions: a) mutant cells by centrifugation of cells growing on xylose medium or by rapid accumulation of cells during the fermentation process B) the medium composition for maximal production of xylitol is 5 to 35 g / L;
~ 12 (w / v)% xylose, 0.2 ~ 2.0 (w / v)
v)% of yeast extract, 0.2~2.0 (w / v)% of ammonium sulfate, 0.2~2.0 (w / v)% of KH ₂ P
O ₄ and 0.01~0.2 (w / v)% of MgSO ₄ · 7
Consists H ₂ O; c) said medium in the dissolved oxygen concentration is 0.1~5.0 (w / v)
%) The oxidation-reduction potential in the medium is 50 to 150%;
e) the pH of the fermentation medium is 4.5-5.5; and f) the fermentation temperature is 27-33 ° C. ii) by centrifuging the fermentation medium, the mutant cells and other Iii) by filtering and dialyzing the supernatant,
Separating and recovering xylitol. 【請求項２】 前記発酵の増殖期の間、２０％〜６０％
のより高い溶存酸素レベルを維持することによって、細
胞の濃縮が急速に達成される、請求項１に記載の変異細
胞を用いるキシリトールの最大産生のための発酵プロセ
ス。2. 20% to 60% during the growth phase of the fermentation.
A fermentation process for maximal production of xylitol using the mutant cells of claim 1, wherein cell enrichment is rapidly achieved by maintaining a higher dissolved oxygen level of xylitol. 【請求項３】 前記培地中の溶存酸素濃度が０.８〜１.
２（ｗ／ｖ）％であり、そして該培地中の酸化−還元ポ
テンシャルが８０〜１１０ｍＶである、請求項１に記載
の変異細胞を用いるキシリトールの最大産生のための発
酵プロセス。3. The concentration of dissolved oxygen in the medium is 0.8 to 1.
The fermentation process for maximal production of xylitol using the mutant cells according to claim 1, wherein the whey ratio is 2 (w / v)% and the oxidation-reduction potential in the medium is 80 to 110 mV. 【請求項４】 前記発酵のために用いられる変異細胞
が、凍結（−７０℃）Candida parapsilosis (KCCM-100
88)を４０〜６０ｍｌのＹＭ培地（１８〜２２ｇ／Ｌの
グルコース、４〜５ｇ／Ｌのペプトン、２.５〜３．５
ｇ／Ｌの酵母エキス、２.５〜３.５ｇ／Ｌの麦芽エキ
ス）中、２８〜３２℃で１２〜１８時間、培養すること
によって調製される、請求項１に記載の変異細胞を用い
るキシリトールの最大産生のための発酵プロセス。4. The mutant cell used for the fermentation is a frozen (−70 ° C.) Candida parapsilosis (KCCM-100)
88) in 40-60 ml of YM medium (18-22 g / L glucose, 4-5 g / L peptone, 2.5-3.5)
g / L yeast extract, 2.5-3.5 g / L malt extract), which is prepared by culturing at 28-32 ° C. for 12-18 hours. Fermentation process for maximum production of xylitol. 【請求項５】 Candida parapsilosisの新規の変異細胞
(KCCM-10088)。5. A novel mutant cell of Candida parapsilosis
(KCCM-10088). 【請求項６】 請求項４に記載のCandida parapsilosis
(KCCM-10088)の単離方法であって、以下の工程を包含す
る、単離方法： ｉ）０.１％のニトロソメチルグアニジン（ＮＴＧ）を
含む酵母−麦芽エキス（ＹＭ）培地に野生型のCandida
parapsilosis (ATCC-21019)をスプレッドし、そして培
養する工程； ｉｉ）分離方法を３回を超えて繰り返すことによって、
生じたコロニーを分離する工程； ｉｉｉ）得られたコロニーを再度ＹＭ培地に２５０〜２
７０ｎｍのＵＶ照射下でスプレッドし、そして培養する
工程；および ｉｖ）変異細胞として増殖するコロニーを単離する工
程。6. The Candida parapsilosis according to claim 4,
(KCCM-10088), comprising the following steps: i) A wild-type yeast-malt extract (YM) medium containing 0.1% nitrosomethylguanidine (NTG). Candida
spreading and culturing parapsilosis (ATCC-21019); ii) by repeating the separation method more than three times
Separating the resulting colonies; iii) re-populating the obtained colonies again in YM medium for 250-2.
Spreading and culturing under 70 nm UV irradiation; and iv) isolating colonies that grow as mutant cells.