JPH10276781A

JPH10276781A - ポリエステル重合酵素及び該酵素をコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH10276781A
Application number: JP9082965A
Authority: JP
Inventors: Yoshiharu Doi; 義治土肥; Toshiaki Fukui; 俊昭福居; Hiromi Matsuzaki; 弘美松崎
Original assignee: Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Kagaku Gijutsu Shinko Jigyodan; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1997-04-01
Filing date: 1997-04-01
Publication date: 1998-10-20
Also published as: EP0897005A1; US5968805A

Abstract

(57)【要約】【課題】ポリエステル重合酵素、ポリエステル重合酵
素遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクタ
ーによって形質転換された形質転換体の提供。【解決手段】配列番号１で表されるアミノ酸配列、又
は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が
欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ポ
リエステル重合酵素活性を有するポリペプチド、該ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含むポリエステル重合酵
素遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該組換え
ベクターによって形質転換された形質転換体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリエステル重合
酵素、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換
えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転
換体及び該形質転換体を用いたポリエステル重合酵素の
製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】微生物が生合成するポリエステル（例え
ばポリ−３−ヒドロキシアルカン酸）は、熱可塑性を有
し、固いものから粘弾性を有するゴム状のものまで多岐
にわたる生分解性プラスチックである。

【０００３】炭素数４のモノマー単位からなるポリ−３
−ヒドロキシブタン酸（P(3HB)) は典型的なポリエステ
ルであるが、堅くてもろい高分子材料であり、その用途
が限定される。このため、培地にプロピオン酸などを添
加するなどして炭素数５のモノマー単位（３ＨＶ）と共
重合させたP(3HB-co-3HV) をはじめとする様々な共重合
ポリエステルの探索が行われており、ポリエステルの物
理的性質を変化させている。一方、炭素数６以上のモノ
マー単位からなるポリエステルは、可塑性を有するやわ
らかい高分子材料である。

【０００４】ポリエステル合成細菌は、炭素数４〜５を
モノマー単位とするポリエステルを合成するものと、炭
素数６〜１２をモノマー単位とするポリエステルを合成
するものとの２つに大別することができる。前者の細菌
は炭素数４〜５のモノマー単位を基質とするポリエステ
ル重合酵素を有し、後者の細菌は炭素数６〜１２のモノ
マー単位を基質とするポリエステル重合酵素を有してい
る。従って、それぞれの微生物によって性質の異なるポ
リエステルが合成される。

【０００５】しかしながら、上記のような公知の微生物
からのポリエステル重合酵素は、それぞれ基質特異性が
異なるため、一種類の酵素によって使用目的に適合した
各種のモノマー単位の組成を有するポリエステル（共重
合体）を合成することは困難である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、幅広い炭素
数のモノマー単位を基質とするポリエステル重合酵素、
該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベク
ター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及
び該形質転換体を用いたポリエステル重合酵素の製造方
法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、土壌より単離したシュ
ードモナス属に属する微生物からポリエステル重合酵素
の遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完
成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、配列番号１で表され
るアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を含み、ポリエステル重合酵素活性を有するポ
リペプチドである。

【０００９】さらに、本発明は、前記ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを含む、ポリエステル重合酵素遺伝子で
ある。ポリエステル重合酵素活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡとしては、例えば配列番号２で表され
るものが挙げられる。

【００１０】さらに、本発明は、配列番号３で表される
塩基配列を含むポリエステル重合酵素遺伝子である。さ
らに、本発明は、前記ポリエステル重合酵素遺伝子を含
む組換えベクターである。

【００１１】さらに、本発明は、前記組換えベクターに
よって形質転換された形質転換体である。さらに、本発
明は、前記形質転換体を培地に培養し、得られる培養物
からポリエステル重合酵素を採取することを特徴とする
ポリエステル重合酵素の製造方法である。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】

【発明の実施の形態】

(1) ポリエステル重合酵素遺伝子のクローニング本発明のポリエステル重合酵素遺伝子は、シュードモナ
ス属に属する微生物の菌体から分離される。

【００１４】まず、ポリエステル重合酵素遺伝子を有す
る菌株から染色体ＤＮＡを作製する。菌株としては、例
えばシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）が
挙げられる。染色体ＤＮＡの調製は公知の方法を用いる
ことができる。例えば、シュードモナス・エスピーをブ
イヨン培地で培養した後、臭化ヘキサデシルトリメチル
アンモニウム法（Currnt Protocols in Molecular Biol
ogy,1巻, 2.4.3 頁, John Wiley & Sons 出版, 1994
年）等により染色体ＤＮＡを調製する。

【００１５】上記の手法により得られたＤＮＡを適当な
制限酵素（例えばSau3AI、BamHI、BglII等）で部分分解
する。これを、制限酵素（例えばBamHI、BglII等）で切
断し、アルカリホスファターゼ処理を行い脱リン酸化し
たベクターとライゲーションを行い、ライブラリーを作
製する。

【００１６】ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖
し得るファージ又はプラスミドが使用される。ファージ
ベクターとしては、例えばEMBL3、M13、λgt11等が挙げ
られ、プラスミドベクターとしては、例えばpBR322、pU
C18、pBluescript II（STRATAGENE社製）等が挙げられ
る。さらに、大腸菌やバチルス・ブレビスなどの２種以
上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、
各種のシャトルベクターを使用することもできる。この
ようなベクターについても、前記制限酵素で切断し、そ
の断片を得ることができる。

【００１７】ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させる
には、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ
断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結さ
せ、組換えベクターを作製する。

【００１８】宿主微生物に組換えベクターを導入するに
は、公知の方法により行うことができる。例えば、宿主
微生物が大腸菌の場合は塩化カルシウム法（Lederberg,
E.M. et al., J. Bacteriol. 119, 1072 (1974)）やエ
レクトロポレーション法（Current Protocols in Molec
ular Biology, 1巻，1.8.4 頁, 1994年）を採用するこ
とができ、宿主微生物がファージＤＮＡの場合はインビ
トロ・パッケージング法（Current Protocols in Molec
ular Biology, 1巻，5.7.1 頁, 1994年）等を採用する
ことができる。本発明では、インビトロ・パッケージン
グ用キット（Gigapack II； STRATAGENE 社製等）を用
いてもよい。

【００１９】次に、シュードモナス・エスピーのポリエ
ステル重合酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るためのプ
ローブを調製する。ポリエステル重合酵素のアミノ酸配
列については、既に何種類かのものが知られている（Pe
oples, O. P. and Sinskey,A. J., J. Biol. Chem., 26
4, 15293 (1989)； Huisman, G. W. et al., J. Biol.
Chem., 266, 2191 (1991)； Pieper,U. et al., FEMS M
icrobiol. Lett., 96, 73 (1992)； Timm, A. and Stei
nbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15 (1992)
他）。そこで、これらのアミノ酸配列のうち、よく保存
されている領域を選択し、それをコードする塩基配列を
推定してオリゴヌクレオチドを設計する。これらオリゴ
ヌクレオチドとしては、Timm, A. and Steinbuchel,
A., Eur. J.Biochem., 209, 15 (1992) により報告され
た以下の配列：5'-CC(G/C)CAGATCAACAAGTT(C/T)TA(C/G)
GAC-3'（配列番号４）が挙げられるが、これに限定され
ない。

【００２０】次に、この合成オリゴヌクレオチドを適当
な試薬を用いて標識し、前記染色体ＤＮＡライブラリー
からコロニーハイブリダイゼーションを行う（Currnt P
rotocols in Molecular Biology,1巻, 6.0.3 頁, 1994
年) 。

【００２１】コロニーハイブリダイゼーションによりス
クリーニングされた大腸菌からアルカリ法（Currnt Pro
tocols in Molecular Biology,1巻,1.6.1頁, 1994年)
によってプラスミドを回収することにより、ポリエステ
ル重合酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られる。上記Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列の決定は、公知方法、例えばサンガ
ー法（Molecular Cloning,2巻, 13.3頁, 1989年）等に
よって行うことができ、塩基配列自動分析装置、例えば
373A・DNAシークエンサー（Applied Biosystems社）等
を用いて行うことができる。

【００２２】なお、上記手法により塩基配列が決定され
た後は、化学合成によって、又は染色体ＤＮＡを鋳型と
したＰＣＲ法によって、あるいは該塩基配列を有するＤ
ＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることに
より、本発明の遺伝子を得ることができる。

【００２３】(2) 形質転換体の作製本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、該
組み換えベクターを作製する際に用いた発現ベクターに
適合する宿主中に導入することにより得られる。宿主と
しては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特
に限定されず、例えば、アルカリゲネス属に属する微生
物、バチルス属に属する微生物、大腸菌等の細菌、サッ
カロミセス属、カンジダ属等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨ
Ｏ細胞等の動物細胞などが挙げられる。

【００２４】アルカリゲネス属に属する微生物、大腸菌
等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の組換え体
ＤＮＡが該宿主中で自立複製可能であると同時に、プロ
モーター、本発明のＤＮＡ、転写終結配列を含む構成で
あることが好ましい。発現ベクターとしては、広範囲の
宿主において複製・保持されるRK2複製起点を有するpLA
2917 (ATCC 37355)やRSF1010複製起点を有するpJRD215
(ATCC 37533)等が挙げられる。

【００２５】プロモーターとしては、宿主中で発現でき
るものであればいずれを用いてもよい。例えば、trp プ
ロモーター、lac プロモーター、ＰL プロモーター、Ｐ
R プロモーター、T7プロモーターなどの大腸菌やファー
ジ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組
換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイ
オンを用いる方法（Current Protocols in Molecular B
iology, 1巻, 1.8.1頁，1994年）やエレクトロポレーシ
ョン法（Current Protocols in Molecular Biology, 1
巻，1.8.4 頁, 1994年）等が挙げられる。

【００２６】酵母を宿主として用いる場合は、発現ベク
ターとして、例えばYEp13、YCp50等が挙げられる。プロ
モーターとしては、例えばgal 1 プロモーター、gal 10
プロモーター等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮＡ
の導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法
（Methods Enzymol.,194,182-187(1990))、スフェロプ
ラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929-193
3 (1978))、酢酸リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163
-168 (1983)）等が挙げられる。

【００２７】動物細胞を宿主として用いる場合は、発現
ベクターとして例えばpcDNAI、pcDNAI/Amp（インビトロ
ジェン社）等が用いられる。動物細胞への組換え体ＤＮ
Ａの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーショ
ン法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。

【００２８】(3) ポリエステル重合酵素の製造本発明のポリエステル重合酵素は、本発明の形質転換体
を培地で培養し、培養物（培養菌体又は培養上清）中に
本発明のポリエステル重合酵素を生成蓄積させ、該培養
物からポリエステル重合酵素を採取することにより行わ
れる。本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿
主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。

【００２９】大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質
転換体を培養する培地としては、完全培地又は合成培
地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、
培養温度は25〜37℃の範囲で好気的に12〜48時間培養す
ることによりポリエステル重合酵素を菌体内に蓄積さ
せ、回収する。炭素源は微生物の増殖に必要であり、例
えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトー
ス等の炭水化物が挙げられる。

【００３０】窒素源としては例えばアンモニア、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー等が挙げられる。また、無
機物としては例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カ
リウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化
ナトリウム等が挙げられる。

【００３１】培養は、通常振盪培養などの好気的条件
下、25〜37℃で発現誘導後２時間以上行う。培養中は、
カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗
生物質を培地に添加してもよい。

【００３２】誘導性のプロモーターを用いた発現ベクタ
ーで形質転換した微生物を培養する場合は、インデュー
サーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG) 、イン
ドールアクリル酸(IAA) 等を培地に添加することができ
る。

【００３３】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、例えばRPMI-1640 、DMEM培地
又はこれらの培地にウシ胎児血清を添加した培地が用い
られる。培養は、通常５％ＣＯ₂存在下、30〜37℃で１
〜７日間行う。培養中はカナマイシン、ペニシリン等の
抗生物質を培地に添加してもよい。

【００３４】ポリエステル重合酵素の精製は、得られる
培養物を遠心して回収し（細胞についてはソニケーター
にて破砕する）、アフィニティークロマトグラフィー、
陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過等を単独で又は適宜組み合わせることによって行うこ
とができる。得られた精製物質が目的の酵素であること
の確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、ウエスタンブロッティング等により行
う。

【００３５】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的
範囲を限定するものではない。

【００３６】(1) シュードモナス・エスピーのポリエス
テル重合酵素遺伝子のクローニング最初に、シュードモナス・エスピーの染色体ＤＮＡライ
ブラリーを作製した。

【００３７】シュードモナス・エスピー JCM 10015株を
100mlのブイヨン培地（１％肉エキス、１％ペプトン、
0.5％塩化ナトリウム、pH 7.2）で、30℃、一晩培養
後、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム法（Curr
nt Protocols in Molecular Biology, 1巻, 2.4.3.頁,
1994年; John Wiley & Sons 出版）により染色体ＤＮＡ
を得た。

【００３８】得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Sau3AIで
部分分解した。またベクタープラスミドについては、コ
スミドベクターであるpLA2917 (ATCC 37355)を使用し
た。このプラスミドを制限酵素BglIIで切断し、脱リン
酸化処理（Molecular Cloning,1巻, 5.7.2 頁，1989年;
Cold Spring Harbar Laboratory 出版）を施した後、
ＤＮＡリガーゼを用いて染色体ＤＮＡの部分分解断片と
連結させた。

【００３９】この連結ＤＮＡ断片を用いたインビトロ・
パッケージング法（Current Protocols in Molecular B
iology, 1巻, 5.7.2 頁, 1994年）によって大腸菌（Esc
heichia coli）S17-1 株を形質転換し、シュードモナス
・エスピーの染色体ＤＮＡライブラリーを得た。

【００４０】次に、シュードモナス・エスピーのポリエ
ステル重合酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るためのプ
ローブを調製した。Timm, A. and Steinbuchel, A., Eu
r. J. Biochem., 209, 15 (1992) で報告されている、
5'-CC(G/C)CAGATCAACAAGTT(C/T)TA(C/G)GAC-3'（配列番
号４）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し
た。このオリゴヌクレオチドをＤＩＧオリゴヌクレオチ
ド・テイリングキット（ベーリンガーマンハイム社製）
によってジゴキシゲニン標識し、プローブとした。

【００４１】得られたプローブを用いてシュードモナス
・エスピー染色体ＤＮＡライブラリーからコロニーハイ
ブリダイゼーション法によってポリエステル重合酵素遺
伝子を含むプラスミドを有する大腸菌を単離した。

【００４２】また、ポリエステル重合酵素遺伝子を含む
プラスミドで、アルカリゲネス・ユートロファスPHB-4
株（DSM541）およびシュードモナス・プチダGPp104（い
ずれもポリエステル合成能欠損株）を接合伝達法により
形質転換したところ、いずれの株もポリエステル合成能
が復帰し、相補性を示した。

【００４３】ポリエステル重合酵素遺伝子を含むプラス
ミドを有する大腸菌からアルカリ法によってプラスミド
を回収することでポリエステル重合酵素遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を得た。

【００４４】この断片のPstI-XbaI 断片についてサンガ
ー法によって塩基配列を決定した。その結果、配列番号
３で表される1.8kbp断片の塩基配列が決定された。さら
に、この塩基配列について相同性検索を行った結果、こ
の1.8kbpの塩基配列の中には、配列番号２で表される塩
基配列（1680bp）を実質的に含むポリエステル重合酵素
遺伝子を同定することができた。また、配列番号２によ
りコードされるアミノ酸配列を配列番号１に示す。

【００４５】配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は
該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパ
ク質がポリエステル重合酵素活性を有する限り、上記タ
ンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子（配列番号２
又は３）は本発明のポリエステル重合酵素遺伝子に含ま
れる。

【００４６】なお、アミノ酸配列又は塩基配列の欠失、
置換、付加等の変異は、公知の部位特異的突然変異導入
法（例えばTOYOBO社の部位特異的突然変異導入キット
“Transformer^TM Site-Directed Mutagenesis Kit”）
により導入することができる。

【００４７】(2) 大腸菌形質転換体の作製ポリエステル重合酵素遺伝子および転写終結領域を含む
1.8kbのPstI-XbaI断片をプラスミドベクターpBluescrip
t II KS+のXbaI, PstI 部位に連結した。得られた組換
えプラスミドで大腸菌（Escherichia coli DH5α）を塩
化カルシウム法により形質転換した。得られた形質転換
体をEscherichia coli PX18と呼ぶ。また、この菌株よ
りプラスミドを抽出することでポリエステル重合酵素遺
伝子を含む1.8kbのPstI-XbaI断片を容易に取得すること
ができる。なお、Escherichia coli PX18は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に、FERM P-16174として寄託
されている。

【００４８】

【発明の効果】本発明により、ポリエステル重合酵素
をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及
び該ベクターによって形質転換された形質転換体が提供
される。本発明の遺伝子は、幅広い炭素数を有するモノ
マーを基質とするポリエステル合成酵素をコードするた
め、種々の物性を有する共重合体ポリエステルを作製す
るために有用である。

【００４９】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Met Ser Asn Lys Asn Ser Asp Asp Leu Asn Arg Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Ile Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Thr Ser Ala Arg Met Val Leu Thr Gln Ala Ile Lys Gln Pro Ile His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Ile Glu Leu Lys Asn Val Met 50 55 60 Phe Gly Lys Ser Lys Leu Gln Pro Glu Ser Asp Asp Arg Arg Phe Asn 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Gly Asn Ser Lys 100 105 110 Leu Ser Glu Gln Asp Ile Asn Arg Ala His Phe Val Ile Thr Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Ser Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Thr 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val Asn Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asp Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Thr Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Arg Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val His Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Ser Asn Asn Gln Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Ala Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Asp 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Ser Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Ile Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Leu Gly Glu Lys Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Gln Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asp Glu Lys Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Met Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Val Arg Ala Asn Ala Leu Glu Val Ser Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Lys Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Asp Met Pro Ala Thr Ala Asn Glu Trp Gln Glu Asn Ser Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Glu 515 520 525 Arg Ser Gly Lys Leu Lys Lys Ser Pro Thr Ser Leu Gly Asn Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ser Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555

【００５０】配列番号：２配列の長さ：１６８０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 配列： ATGAGTAACA AGAATAGCGA TGACTTGAAT CGTCAAGCCT CGGAAAACAC CTTGGGGCTT 60 AACCCTGTCA TCGGCCTGCG TGGAAAAGAT CTGCTGACTT CTGCCCGAAT GGTTTTAACC 120 CAAGCCATCA AACAACCCAT TCACAGCGTC AAGCACGTCG CGCATTTTGG CATCGAGCTG 180 AAGAACGTGA TGTTTGGCAA ATCGAAGCTG CAACCGGAAA GCGATGACCG TCGTTTCAAC 240 GACCCCGCCT GGAGTCAGAA CCCACTCTAC AAACGTTATC TACAAACCTA CCTGGCGTGG 300 CGCAAGGAAC TCCACGACTG GATCGGCAAC AGCAAACTGT CCGAACAGGA CATCAATCGC 360 GCTCACTTCG TGATCACCCT GATGACCGAA GCCATGGCCC CGACCAACAG TGCGGCCAAT 420 CCGGCGGCGG TCAAACGCTT CTTCGAAACC GGCGGTAAAA GCCTGCTCGA CGGCCTCACA 480 CATCTGGCCA AGGACCTGGT AAACAACGGC GGCATGCCGA GCCAGGTGGA CATGGGCGCT 540 TTCGAAGTCG GCAAGAGTCT GGGGACGACT GAAGGTGCAG TGGTTTTCCG CAACGACGTC 600 CTCGAATTGA TCCAGTACCG GCCGACCACC GAACAGGTGC ATGAGCGACC GCTGCTGGTG 660 GTCCCACCGC AGATCAACAA GTTTTATGTG TTTGACCTGA GCCCGGATAA AAGCCTGGCG 720 CGCTTCTGCC TGAGCAACAA CCAGCAAACC TTTATCGTCA GCTGGCGCAA CCCGACCAAG 780 GCCCAGCGTG AGTGGGGTCT GTCGACTTAC ATCGATGCGC TCAAAGAAGC CGTCGACGTA 840 GTTTCCGCCA TCACCGGCAG CAAAGACATC AACATGCTCG GCGCCTGCTC CGGTGGCATT 900 ACCTGCACCG CGCTGCTGGG TCACTACGCC GCTCTCGGCG AGAAGAAGGT CAATGCCCTG 960 ACCCTTTTGG TCAGCGTGCT CGACACCACC CTCGACTCCC AGGTTGCACT GTTCGTCGAT 1020 GAGAAAACCC TGGAAGCTGC CAAGCGTCAC TCGTATCAGG CCGGCGTGCT GGAAGGCCGC 1080 GACATGGCCA AAGTCTTCGC CTGGATGCGC CCTAACGACC TGATCTGGAA CTACTGGGTC 1140 AACAACTACC TGCTGGGTAA CGAGCCACCG GTCTTCGACA TTCTTTTCTG GAACAACGAC 1200 ACCACCCGGT TGCCTGCTGC GTTCCACGGC GATCTGATCG AAATGTTCAA AAATAACCCA 1260 CTGGTGCGCG CCAATGCACT CGAAGTGAGC GGCACGCCGA TCGACCTCAA ACAGGTCACT 1320 GCCGACATCT ACTCCCTGGC CGGCACCAAC GATCACATCA CGCCCTGGAA GTCTTGCTAC 1380 AAGTCGGCGC AACTGTTCGG TGGCAAGGTC GAATTCGTGC TGTCCAGCAG TGGGCATATC 1440 CAGAGCATTC TGAACCCGCC GGGCAATCCG AAATCACGTT ACATGACCAG CACCGACATG 1500 CCAGCCACCG CCAACGAGTG GCAAGAAAAC TCAACCAAGC ACACCGACTC CTGGTGGCTG 1560 CACTGGCAGG CCTGGCAGGC CGAGCGCTCG GGCAAACTGA AAAAGTCCCC GACCAGCCTG 1620 GGCAACAAGG CCTATCCGTC AGGAGAAGCC GCGCCGGGCA CGTATGTGCA TGAACGTTAA 1680

【００５１】配列番号：３配列の長さ：１８２６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic DNA 配列： CTGCAGTGCT CTCTGAACTA GAAAGCAACG TTGTGCAATT AACGGTCACC CGAGCAGTAG 60 TACCTGGCGG TTGCTGTGTG ACTACACAGC TGGTCCCGGT ACTCGTCTCA GGACAATGGA 120 GCGTCGTAGA TGAGTAACAA GAATAGCGAT GACTTGAATC GTCAAGCCTC GGAAAACACC 180 TTGGGGCTTA ACCCTGTCAT CGGCCTGCGT GGAAAAGATC TGCTGACTTC TGCCCGAATG 240 GTTTTAACCC AAGCCATCAA ACAACCCATT CACAGCGTCA AGCACGTCGC GCATTTTGGC 300 ATCGAGCTGA AGAACGTGAT GTTTGGCAAA TCGAAGCTGC AACCGGAAAG CGATGACCGT 360 CGTTTCAACG ACCCCGCCTG GAGTCAGAAC CCACTCTACA AACGTTATCT ACAAACCTAC 420 CTGGCGTGGC GCAAGGAACT CCACGACTGG ATCGGCAACA GCAAACTGTC CGAACAGGAC 480 ATCAATCGCG CTCACTTCGT GATCACCCTG ATGACCGAAG CCATGGCCCC GACCAACAGT 540 GCGGCCAATC CGGCGGCGGT CAAACGCTTC TTCGAAACCG GCGGTAAAAG CCTGCTCGAC 600 GGCCTCACAC ATCTGGCCAA GGACCTGGTA AACAACGGCG GCATGCCGAG CCAGGTGGAC 660 ATGGGCGCTT TCGAAGTCGG CAAGAGTCTG GGGACGACTG AAGGTGCAGT GGTTTTCCGC 720 AACGACGTCC TCGAATTGAT CCAGTACCGG CCGACCACCG AACAGGTGCA TGAGCGACCG 780 CTGCTGGTGG TCCCACCGCA GATCAACAAG TTTTATGTGT TTGACCTGAG CCCGGATAAA 840 AGCCTGGCGC GCTTCTGCCT GAGCAACAAC CAGCAAACCT TTATCGTCAG CTGGCGCAAC 900 CCGACCAAGG CCCAGCGTGA GTGGGGTCTG TCGACTTACA TCGATGCGCT CAAAGAAGCC 960 GTCGACGTAG TTTCCGCCAT CACCGGCAGC AAAGACATCA ACATGCTCGG CGCCTGCTCC 1020 GGTGGCATTA CCTGCACCGC GCTGCTGGGT CACTACGCCG CTCTCGGCGA GAAGAAGGTC 1080 AATGCCCTGA CCCTTTTGGT CAGCGTGCTC GACACCACCC TCGACTCCCA GGTTGCACTG 1140 TTCGTCGATG AGAAAACCCT GGAAGCTGCC AAGCGTCACT CGTATCAGGC CGGCGTGCTG 1200 GAAGGCCGCG ACATGGCCAA AGTCTTCGCC TGGATGCGCC CTAACGACCT GATCTGGAAC 1260 TACTGGGTCA ACAACTACCT GCTGGGTAAC GAGCCACCGG TCTTCGACAT TCTTTTCTGG 1320 AACAACGACA CCACCCGGTT GCCTGCTGCG TTCCACGGCG ATCTGATCGA AATGTTCAAA 1380 AATAACCCAC TGGTGCGCGC CAATGCACTC GAAGTGAGCG GCACGCCGAT CGACCTCAAA 1440 CAGGTCACTG CCGACATCTA CTCCCTGGCC GGCACCAACG ATCACATCAC GCCCTGGAAG 1500 TCTTGCTACA AGTCGGCGCA ACTGTTCGGT GGCAAGGTCG AATTCGTGCT GTCCAGCAGT 1560 GGGCATATCC AGAGCATTCT GAACCCGCCG GGCAATCCGA AATCACGTTA CATGACCAGC 1620 ACCGACATGC CAGCCACCGC CAACGAGTGG CAAGAAAACT CAACCAAGCA CACCGACTCC 1680 TGGTGGCTGC ACTGGCAGGC CTGGCAGGCC GAGCGCTCGG GCAAACTGAA AAAGTCCCCG 1740 ACCAGCCTGG GCAACAAGGC CTATCCGTCA GGAGAAGCCG CGCCGGGCAC GTATGTGCAT 1800 GAACGTTAAG TTGTAGGCAG TCTAGA １８２
６

【００５２】配列番号：４配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列：ＣＣＳＣＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＧＴＴＹＴＡＳＧＡＣ
２４

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者松崎弘美埼玉県和光市新倉１−４−96 フジコーポＩＩＩ203

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列、又
は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が
欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ポ
リエステル重合酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】配列番号１で表されるアミノ酸配列、又
は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が
欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、ポ
リエステル重合酵素活性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡを含む、ポリエステル重合酵素遺伝子。
【請求項３】ポリエステル重合酵素活性を有するタン
パク質をコードするＤＮＡが配列番号２で表されるもの
である請求項２記載のポリエステル重合酵素遺伝子。
【請求項４】配列番号３で表される塩基配列を含むポ
リエステル重合酵素遺伝子。
【請求項５】請求項２〜４のいずれか１項に記載のポ
リエステル重合酵素遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項６】請求項４記載の組換えベクターによって
形質転換された形質転換体。
【請求項７】請求項６記載の形質転換体を培地に培養
し、得られる培養物からポリエステル重合酵素を採取す
ることを特徴とするポリエステル重合酵素の製造方法。