JPH1026623A - Method for differentiating serum of hepar disease patient - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To perform explicit differentiation of a hepar disease patient by measuring the regucalcin in serum. SOLUTION: The measurement of the regucalcin in serum is not especially limited. For example, in the case of an FLISA method, IgG of anti-regucalcin is solidified in an imuno-plate. The regucalcin of various kinds of concentration of calibration curves or the patient' serum is bonded thereto. Furthermore, IgG of the regucalcin for a biotin label and strepto a vidin for peroxidase mark are bonded. Then, coloring is measured by a coloring substrate. The concentration of the patient' serum can be computed by the calibration curves. Furthermore, the anti-regucalcin antibody can use either of a polyclonal antibody and the anti-regucalcin monoclonal antibody, which is formed from hydridoma for forming the anti-regucalcin antibody.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、肝機能マーカーと
して肝臓に局在するCa²⁺結合蛋白質であるレギュカルチ
ンを測定することによる肝疾患患者血清の鑑別方法に関
する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for identifying serum of a liver disease patient by measuring regucalcin, a Ca ²⁺ binding protein localized in the liver, as a liver function marker.

【０００２】[0002]

【従来の技術】肝機能マーカーとしては、従来、GOT、G
PT等の酵素の血中への漏洩を指標としてきた。しかし、
これらの酵素は肝臓に特異的に存在するものではなく、
健常人の血清であってもある程度の数値を示すため、こ
れらのみから明確に判断することは困難で、ときにGOT
やGPTのデータ的には正常値を示す肝疾患患者を見落す
場合などがあった。従って、従来は複数の指標から総合
的に判断せざるを得なかった。2. Description of the Related Art Conventionally, GOT, G
Leakage of enzymes such as PT into the blood has been used as an indicator. But,
These enzymes are not specifically present in the liver,
It is difficult to make a clear judgment from only these, because even a serum from a healthy person shows a certain numerical value.
In some cases, liver disease patients who showed normal values in GPT data were overlooked. Therefore, conventionally, it was necessary to judge comprehensively from a plurality of indices.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】このようなことから、
肝疾患患者の血清を明確に鑑別し得る方法の提供が望ま
れる。SUMMARY OF THE INVENTION
It is desired to provide a method capable of clearly distinguishing the serum of a liver disease patient.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】ところで、レギュカルチ
ンは、ラット肝細胞質から単離された新しいCa²⁺結合蛋
白質であり、等電点はpH5.20、Ca²⁺結合定数は4.19×10
⁵M^-1を示し、６〜７個の高親和性Ca²⁺結合部位を持ち、
α−ヘリックス構造を34％含んでいる。レギュカルチン
は、Ca²⁺が結合すると構造がルーズになるという特徴を
有する。また、レギュカルチンはCa²⁺による肝臓の酵素
の活性化を制御していることが知られており、Ca²⁺によ
る細胞内情報伝達系の制御因子としての役割を果してい
るものである。Meanwhile, regucalcin is a new Ca ²⁺ binding protein isolated from rat liver cytoplasm and has an isoelectric point of pH 5.20 and a Ca ²⁺ binding constant of 4.19 × 10 4
⁵ M ^-1 with 6-7 high affinity Ca ²⁺ binding sites,
It contains 34% of α-helical structure. Regucaltin has the characteristic that its structure becomes loose when Ca ²⁺ binds. Moreover, regucalcin is known to controlling the activation of the enzyme in the liver by Ca ^2+, in which plays a role as a regulator of intracellular signal transduction system by Ca ^2+.

【０００５】このレギュカルチンは、GOT、GPT等の既存
の肝機能マーカーと異なって肝臓に特異的に存在するも
のであり、また上記生理的役割を果たしていることか
ら、本発明者はレギュカルチンの肝機能マーカーとして
の可能性について鋭意検討を重ねた結果、肝疾患患者の
血清ではレギュカルチンが有意に上昇している一方、健
常人の血清ではレギュカルチンはほとんど検出されず、
その測定が肝疾患患者血清の鑑別手段として有用である
ことを見出し、本発明を完成した。[0005] Different from existing liver function markers such as GOT and GPT, this regucalcin is specifically present in the liver, and plays a physiological role as described above. As a result of intensive studies on the potential as a marker, regucalcin was significantly increased in the serum of patients with liver disease, while almost no regucalcin was detected in the serum of healthy individuals.
The present inventors have found that the measurement is useful as a means for distinguishing serum from a liver disease patient, and completed the present invention.

【０００６】すなわち本発明は、血清中のレギュカルチ
ンを測定することを特徴とする肝疾患患者血清の鑑別方
法を提供するものである。[0006] That is, the present invention provides a method for distinguishing serum of a liver disease patient, which comprises measuring regucalcin in the serum.

【０００７】[0007]

【発明の実施の形態】本発明において、血清中のレギュ
カルチンの測定方法は特に限定されず、ELISA法、RIA
法、EIA法等、通常の手段により行うことができる。例
えばELISA法による場合では、抗レギュカルチン抗体を
固相化し、そこに被検血清を結合させ、次いで標識抗レ
ギュカルチン第２抗体を結合させた後、結合した標識抗
体を測定することにより行われる。より具体的には、イ
ムノプレートに抗レギュカルチンIgGを固相化し、そこ
に検量線用の種々の濃度のレギュカルチンあるいは患者
血清を結合させ、更にビオチン標識抗レギュカルチンIg
G及びペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを結合
させた後、発色基質にて発色測定し、検量線より患者血
清の濃度を算出することができる。また、抗レギュカル
チン抗体としては、ポリクローナル抗体、抗レギュカル
チン抗体産生ハイブリドーマから作製された抗レギュカ
ルチンモノクローナル抗体のいずれを用いることもでき
る。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present invention, the method for measuring regucalcin in serum is not particularly limited, and ELISA, RIA
Method, EIA method and the like can be used. For example, in the case of the ELISA method, the method is carried out by immobilizing an anti-regucalcin antibody, binding a test serum thereto, and then binding a labeled anti-regucalcin second antibody, and measuring the bound labeled antibody. More specifically, an anti-regucalcin IgG is immobilized on an immunoplate, and various concentrations of regucalcin or a patient serum for a calibration curve are bound thereto, and a biotin-labeled anti-regucalcin IgG is further added.
After binding G and peroxidase-labeled streptavidin, color development is measured using a chromogenic substrate, and the concentration of patient serum can be calculated from a calibration curve. In addition, as the anti-regucalcin antibody, any of a polyclonal antibody and an anti-regucalcin monoclonal antibody produced from an anti-regucalcin antibody-producing hybridoma can be used.

【０００８】[0008]

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではな
い。なお、実施例に用いた試薬等は全て市販のものであ
る。ただし、抗レギュカルチン抗体は精製したレギュカ
ルチンをウサギに免疫し作製したものである。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, which should not be construed as limiting the invention thereto. The reagents and the like used in the examples are all commercially available. However, the anti-regulartin antibody was prepared by immunizing rabbits with purified regucalcin.

【０００９】実施例１ （抗レギュカルチンIgGの作製）プロテインＡカラムを
0.15Ｍリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2）で平衡化した
後、0.45μｍのフィルターでろ過した抗レギュカルチン
血清を注入した。非吸着画分溶出液の吸光度がベースラ
インに戻るまで0.15Ｍリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2）
で洗浄した。洗浄後、0.1Ｍグリシン緩衝液（pH7.2）で
IgG分画を溶出した。溶出液は１Ｍトリス溶液で中和し
た。得られたIgG分画は蒸留水にて一晩透析後、凍結乾
燥して使用時まで-70℃に保存した。Example 1 (Preparation of anti-regulartin IgG)
After equilibration with 0.15 M phosphate buffered saline (pH 7.2), anti-regucaltin serum filtered through a 0.45 μm filter was injected. 0.15 M phosphate buffered saline (pH 7.2) until the absorbance of the unadsorbed fraction eluate returns to the baseline
And washed. After washing, use 0.1M glycine buffer (pH 7.2)
The IgG fraction was eluted. The eluate was neutralized with a 1 M Tris solution. The obtained IgG fraction was dialyzed overnight against distilled water, freeze-dried and stored at -70 ° C until use.

【００１０】（ビオチン標識抗レギュカルチンIgGの作
製）抗レギュカルチンIgG 10mgを、５mlの0.05Ｍ重炭酸
緩衝液（pH8.5）に溶解後、NHS-LC-Biotion 3.7mgを添
加して37℃で１時間反応することにより、ビオチンを抗
レギュカルチンIgGに結合させた。反応終了後、0.01Ｍ
リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）で一晩透析した後、0.4
％ブロックエースで１mg protein/mlに調整して使用時
まで-70℃で凍結保管した。(Preparation of biotin-labeled anti-regulartin IgG) 10 mg of anti-regulartin IgG was dissolved in 5 ml of 0.05 M bicarbonate buffer (pH 8.5), and 3.7 mg of NHS-LC-Biotion was added. By reacting for a time, biotin was bound to the anti-regucaltin IgG. After the reaction, 0.01M
After dialysis overnight in phosphate buffered saline (pH 7.4), 0.4
The mixture was adjusted to 1 mg protein / ml with% Block Ace and stored frozen at -70 ° C until use.

【００１１】（レギュカルチン濃度の測定）抗レギュカ
ルチンIgGを５mlの蒸留水で溶解後、0.1Ｍ炭酸緩衝液
（pH9.7）で30μg/mlに希釈し、96穴イノムプレートに5
0μlずつ分注後、37℃で２時間インキュベートすること
により、抗レギュカルチンIgGをイムノプレートに固相
化した。固相化終了後、0.05％ Tween20を含む0.01Ｍリ
ン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）（以下、「TPBS」と略
す）で３回洗浄した。次に、１％ブロックエース溶液を
各ウエルに250μlずつ分注し、37℃で１時間インキュベ
ートすることによりブロッキングを行った。ブロッキン
グ終了後、TPBSで３回洗浄し、0.4％ブロックエースで
１〜15ng/mlに調整したレギュカルチン及び２倍又は10
倍に希釈した肝疾患患者血清を50μlずつ分注し、４℃
で一晩インキュベートした。インキュベート終了後、TP
BSで３回洗浄し、ビオチン標識抗レギュカルチンIgGを
0.4％ブロックエース溶液で30μｇ/mlに調整して各ウエ
ルに100μlずつ分注後、37℃で２時間インキュベートを
行った。インキュベート終了後、TBPSで３回洗浄し、0.
4％ブロックエース溶液で10,000倍に希釈したペルオキ
シダーゼ標識ストレプトアビジンを各ウエルに100μlず
つ分注し、37℃でインキュベートした。インキュベート
後、TPBSで５回洗浄し、基質溶液〔o-フェニレンジアミ
ンを0.1Ｍナトリウムリン酸クエン酸緩衝液（pH5.0）で
３mg/mlに希釈し、30％過酸化水素水を20μl/100mlにな
るように加えたもの〕を各ウエルに100μlずつ添加後、
室温で15分間酵素反応を行った。酵素反応の停止は、４
Ｎ硫酸を各ウエルに100μlずつ添加後、プレートミキサ
ーで撹拌することにより行った。吸光度の測定はEIAリ
ーダーにて検出波長492nmで行った。既知の濃度のレギ
ュカルチンで検量線を作成し、肝疾患患者血清中のレギ
ュカルチン濃度を算出した。(Measurement of regucalcin concentration) Anti-regucalcin IgG was dissolved in 5 ml of distilled water, diluted with 0.1 M carbonate buffer (pH 9.7) to 30 μg / ml, and added to a 96-well inom plate.
After dispensing 0 μl each, the mixture was incubated at 37 ° C. for 2 hours to immobilize anti-regucaltin IgG on an immunoplate. After completion of the solid phase immobilization, the membrane was washed three times with 0.01 M phosphate buffered saline (pH 7.4) containing 0.05% Tween20 (hereinafter abbreviated as “TPBS”). Next, 250 μl of a 1% Block Ace solution was dispensed into each well, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour to perform blocking. After blocking was completed, the plate was washed three times with TPBS, adjusted to 1 to 15 ng / ml with 0.4% Block Ace, and 2 or 10 times.
Dispense 50 μl of liver patient serum diluted 1-fold at 4 ° C
For overnight. After the incubation is completed,
Wash three times with BS and add biotin-labeled anti-regulartin IgG
After adjusting to 30 μg / ml with a 0.4% block ace solution, 100 μl was dispensed into each well, and incubated at 37 ° C. for 2 hours. After incubation, wash 3 times with TBPS,
100 μl of peroxidase-labeled streptavidin diluted 10,000-fold with a 4% block ace solution was dispensed to each well and incubated at 37 ° C. After incubation, the plate was washed 5 times with TPBS, and a substrate solution [o-phenylenediamine was diluted to 3 mg / ml with 0.1 M sodium phosphate citrate buffer (pH 5.0), and 30% hydrogen peroxide solution was added at 20 μl / 100 ml. 100 μl to each well, and then add
The enzyme reaction was performed at room temperature for 15 minutes. Stopping the enzyme reaction is 4
After adding 100 μl of N sulfuric acid to each well, the mixture was stirred with a plate mixer. The absorbance was measured with an EIA reader at a detection wavelength of 492 nm. A calibration curve was prepared using a known concentration of regucalcin, and the regucalcin concentration in the serum of a liver disease patient was calculated.

【００１２】かくして得られた健常人及び肝疾患患者の
血清中のレギュカルチン濃度を表１に示す。参考のた
め、GOT値及びGPT値も常法に従い測定し、表１に併せて
示した。Table 1 shows the thus obtained regucalcin concentrations in the sera of healthy individuals and patients with liver diseases. For reference, the GOT value and GPT value were also measured according to a conventional method, and are shown in Table 1.

【００１３】[0013]

【表１】 [Table 1]

【００１４】健常人の血清中のGOT値は10〜38U/l、GPT
値は４〜35U/lであるが、肝疾患患者の中には有意に高
値を示さず正常範囲のものがあった。これに対し、肝疾
患患者の血清中のレギュカルチン濃度は明らかに上昇し
ている一方、健常人の血清中のレギュカルチン濃度は検
出限界（0.5ng/ml）以下であり、肝疾患患者と健常人の
血清を明確に鑑別できた。The GOT value in the serum of a healthy person is 10 to 38 U / l, GPT
The value was 4-35 U / l, but some of the liver disease patients did not show significantly high values and were in the normal range. In contrast, the regucalcin concentration in the serum of patients with liver disease is clearly increasing, while the regucalcin concentration in the serum of healthy subjects is below the detection limit (0.5 ng / ml), indicating that Serum could be clearly distinguished.

【００１５】[0015]

【発明の効果】本発明方法によれば、肝疾患患者の血清
を漏れなく鑑別することが可能である。According to the method of the present invention, it is possible to discriminate serum of a liver disease patient without omission.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 血清中のレギュカルチンを測定すること
を特徴とする肝疾患患者血清の鑑別方法。1. A method for identifying serum of a liver disease patient, which comprises measuring regucalcin in the serum.