JPH10251157A - Medicine containing alpha-fodrin or alpha-fodrin fragment protein - Google Patents

Medicine containing alpha-fodrin or alpha-fodrin fragment protein

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JPH10251157A
JPH10251157A JP9104873A JP10487397A JPH10251157A JP H10251157 A JPH10251157 A JP H10251157A JP 9104873 A JP9104873 A JP 9104873A JP 10487397 A JP10487397 A JP 10487397A JP H10251157 A JPH10251157 A JP H10251157A
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JP
Japan
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fodrin
fragment
protein
mutein
syndrome
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JP9104873A
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Japanese (ja)
Inventor
Yoshio Hayashi
良夫 林
Hiroshi Sugino
弘 杉野
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
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Publication date
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a pharmaceutical composition useful for preventing or treating autoimmune diseases, especially Sjogren's syndrome, by including α- fodrin (mutein), their fragment proteins, or their salts as active ingredients. SOLUTION: This composition contains α-fodrin (mutein), their fragment proteins or their salts. The α-fodrin (mutein), their fragment proteins or their salts include human α-fodrin protein. The protein containing human α-fodrin portion sequence, especially an amino acid sequence of the formula, and having a mol.wt. of 2-240K is preferable. The mutein of the α-fodrin includes proteins in which the mutation, substitution, etc., of one or more amino acids are caused, so long as the amino acids constituting the α-fodrin do not lose their immunological values. The α-fodrin fragment proteins include fragmented proteins produced on the degradation of the α-fodrin with a protease, etc.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【発明の属する技術分野】本発明は、α-フォドリンお
よびα-フォドリン断片蛋白質の新規用途に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel use of α-fodrin and α-fodrin fragment protein.

【０００２】[0002]

【従来の技術】シェーグレン症候群は、乾燥性角結膜
炎、慢性唾液腺炎による乾燥症候群を主特徴とする自己
免疫疾患とされているが、その病因は現在まで不明のま
まである。シェーグレン症候群とされるものには、涙腺
・唾液腺に限局し臨床上いわゆるドライアイ／ドライマ
ウス症状を呈する腺性タイプ（一次性）と、肝・肺・甲
状腺・膵・腎などにわたり多彩な全身症状をきたす腺外
タイプ（二次性）があるとされる。また、腺性タイプの
多くは、腺外性タイプへ移行することや稀に悪性リンパ
腫を発生することが知られている。シェーグレン症候群
において見出される自己抗体として、ＳＳ−Ａ／Ｒｏお
よびＳＳ−Ｂ／Ｌａが知られている。これらに対する抗
原は、すでに同定されているが、これら抗原に対する自
己抗体を持つ患者はシェーグレン症候群患者全体の４０
％〜６０％と特異性が低い。また、ＳＳ−Ａ／ＲｏやＳ
Ｓ−Ｂ／Ｌａ陽性患者は、全身性エリテマトーデスやリ
ュウマチ等の他の疾病を併発していることも多く見られ
る。〔ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲ
ーション（Journal of Clinical Investigation） 第87
巻、p68-p76（1991）及び、ヌークレイック・アシズ・
リサーチ（Nucleic Acids Research）第17巻、p2233ーp2
244（1989）〕 このことから、これらの抗体あるいは抗原は、シェーグ
レン症候群を含む自己免疫疾患全般の指標であると考え
られている。しかしながら、一次性シェーグレンに特異
的な指標となる自己抗原あるいは自己抗体は、現在まで
知られていない。α-フォドリンは、細胞膜直下に存在
する高分子量アクチン結合性蛋白質であるフォドリンの
サブユニットの一つである。フォドリンは、網目構造な
どの高次構造を形成し、細胞の形態形成や分泌顆粒の表
面膜への移動に関与していると考えられている。近年、
細胞がアポトーシス等の制御された細胞死を起こす際、
完全長蛋白質である２４０Ｋのα-フォドリンが、蛋白
質分解酵素により制限的に分解され、断片化したα-フ
ォドリン蛋白質が生成することも報告されている〔ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journa
l of Biological Chemistry）第270巻、p6425-p6428（1
995）〕。また、このような制限的なα-フォドリンの分
解を行う蛋白質分解酵素としては、トリプシン、キモト
リプシン、カルパインなどが知られている〔ジャーナル
・オブ・ニューロサイエンス（Journal of Neuroscienc
e）第8巻、p2640-p2651 （1988）〕。しかし、このα-
フォドリンの制限的分解とシェーグレン症候群との関係
は、未だ明らかになっていない。2. Description of the Related Art Sjogren's syndrome is an autoimmune disease characterized mainly by dry keratoconjunctivitis and dry syndrome caused by chronic salivary glanditis, but its etiology remains to date. Sjogren's syndrome is a glandular type (primary) that is localized in the lacrimal gland and salivary glands and presents clinically so-called dry eye / dry mouse symptoms, and various systemic symptoms in the liver, lungs, thyroid, pancreas, kidney, etc. It is said that there is an extraglandular type (secondary) that causes In addition, it is known that many glandular types shift to extraglandular types and rarely cause malignant lymphoma. SS-A / Ro and SS-B / La are known as autoantibodies found in Sjogren's syndrome. Antigens to these have already been identified, but patients with autoantibodies to these antigens account for 40% of all Sjogren's syndrome patients.
% To 60%. Also, SS-A / Ro and S
SB / La-positive patients are often seen to be accompanied by other diseases such as systemic lupus erythematosus and rheumatism. [Journal of Clinical Investigation # 87
Vol., P68-p76 (1991) and Nuclique Ashes
Research (Nucleic Acids Research) Volume 17, p2233-p2
244 (1989)] From these facts, it is considered that these antibodies or antigens are indicators of all autoimmune diseases including Sjogren's syndrome. However, no autoantigen or autoantibody serving as an index specific to primary Sjogren has been known so far. α-fodrin is one of the subunits of fodrin, which is a high-molecular-weight actin-binding protein located immediately below the cell membrane. Fodrin forms a higher-order structure such as a network structure, and is thought to be involved in cell morphogenesis and migration of secretory granules to the surface membrane. recent years,
When cells undergo controlled cell death such as apoptosis,
It has also been reported that 240K α-fodrin, which is a full-length protein, is restricted by proteolytic enzymes to produce fragmented α-fodrin protein [Journa of Biological Chemistry (Journa).
l of Biological Chemistry) Volume 270, p6425-p6428 (1
995)]. In addition, trypsin, chymotrypsin, calpain, and the like are known as proteolytic enzymes that perform such limited α-fodrin degradation [Journal of Neuroscienc.
e) Volume 8, p2640-p2651 (1988)]. However, this α-
The relationship between restrictive degradation of fodrin and Sjögren's syndrome has not yet been elucidated.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】従って、シェーグレン
症候群、特に一次性シェーグレン症候群に特異的な自己
抗体あるいは自己抗原を見い出すことができれば、シェ
ーグレン症候群の正確な診断が可能になると同時に、発
病前あるいは発病後に該自己抗原に対する寛容性を確立
せしめることでシェーグレン症候群、特に一次性シェー
グレン症候群の予防・治療、さらには二次性シェーグレ
ン症候群への進展の予防が可能となると考えられる。ま
た、シェーグレン症候群の発症機構解明について、詳細
なる解析を可能ならしめる。Therefore, if autoantibodies or autoantigens specific to Sjogren's syndrome, particularly primary Sjogren's syndrome, can be found, accurate diagnosis of Sjogren's syndrome becomes possible, and at the same time, pre-onset or onset of Sjogren's syndrome By later establishing tolerance to the self-antigen, it is thought that prevention and treatment of Sjogren's syndrome, particularly primary Sjogren's syndrome, and further prevention of progression to secondary Sjogren's syndrome can be achieved. In addition, detailed analysis will be possible to elucidate the onset mechanism of Sjogren's syndrome.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み鋭意研究した結果、一次性シェーグレン症候群に
特異的に見い出される自己抗体を発見し、その自己抗原
がα-フォドリンおよびα-フォドリン断片の蛋白質であ
ることを見い出すに至った。さらに、本発明は、該自己
抗原を投与することにより、シェーグレン症候群の発症
を治療または予防することが可能であることも併せて見
い出した。即ち、本発明は、Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in view of the above circumstances, and as a result, have discovered an autoantibody specifically found in primary Sjogren's syndrome, and its autoantigens are α-fodrin and α-fodrin. It was found that it was a protein of a fodrin fragment. Furthermore, the present invention has also found that the onset of Sjogren's syndrome can be treated or prevented by administering the self-antigen. That is, the present invention

【０００５】（１）α-フォドリン、そのムテインある
いはそれらの断片蛋白質、またはそれらの塩を含んでな
る医薬組成物、（２）α-フォドリン、そのムテインあ
るいはそれらの断片蛋白質、またはそれらの塩を含んで
なる自己免疫疾患予防・治療剤、（３）α-フォドリ
ン、そのムテインあるいはそれらの断片蛋白質、または
それらの塩を含んでなるシェーグレン症候群予防・治療
剤、（４）α-フォドリン、そのムテインあるいはそれ
らの断片蛋白質の分子量が２Ｋ〜２４０Ｋである上記
（３）記載のシェーグレン症候群予防・治療剤、（５）
α-フォドリン、そのムテインあるいはそれらの断片蛋
白質が、式Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−
Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕで表されるアミノ酸配列を含有する
上記（３）記載のシェーグレン症候群予防・治療剤、
（６）α-フォドリン、そのムテインあるいはそれらの
断片蛋白質の分子量が１００Ｋ〜１４０Ｋである請求項
５記載のシェーグレン症候群予防・治療剤、（７）α-
フォドリン断片蛋白質がα-フォドリン蛋白質を蛋白質
分解酵素で分解した際生じる断片化α-フォドリン蛋白
質である上記（３）記載のシェーグレン症候群予防・治
療剤、（８）α-フォドリン、そのムテインあるいはそ
れらの断片蛋白質、またはそれらの塩を含んでなる自己
免疫疾患診断薬、（９）α-フォドリン、そのムテイン
あるいはそれらの断片蛋白質、またはそれらの塩を含ん
でなるシェーグレン症候群診断薬、（１０）α-フォド
リン、そのムテインあるいはそれらの断片蛋白質の分子
量が２Ｋ〜２４０Ｋである上記（９）記載のシェーグレ
ン症候群診断薬、（１１）α-フォドリン、そのムテイ
ンあるいはそれらの断片蛋白質が、式Ａｒｇ−Ｇｌｎ−
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａ
ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒ
ｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕで表され
るアミノ酸配列を含有する上記（９）記載のシェーグレ
ン症候群診断薬、（１２）α-フォドリン、そのムテイ
ンあるいはそれらの断片蛋白質の分子量が１００Ｋ〜１
４０Ｋである上記（１１）記載のシェーグレン症候群診
断薬、および（１３）α-フォドリン、そのムテインあ
るいはそれらの断片蛋白質、またはそれらの塩を、α-
フォドリン、そのムテインあるいはそれらの断片蛋白
質、またはそれらの塩に対する抗体に接触させることを
特徴とする該抗体の検出・定量方法などを提供するもの
である。(1) a pharmaceutical composition comprising α-fodrin, its mutein or a fragment protein thereof, or a salt thereof; (2) a pharmaceutical composition comprising α-fodrin, its mutein or fragment protein thereof, or a salt thereof A prophylactic / therapeutic agent for an autoimmune disease comprising: (3) a prophylactic / therapeutic agent for Sjogren's syndrome comprising α-fodrin, its mutein or a fragment protein thereof, or a salt thereof; (4) α-fodrin, its mutein Alternatively, the agent for preventing or treating Sjögren's syndrome according to (3), wherein the molecular weight of the fragment protein is 2K to 240K, (5)
α-fodrin, its mutein or a fragment protein thereof has the formula Arg-Gln-Lys-Leu-Glu-
Asp-Ser-Tyr-Arg-Phe-Gln-P
he-Phe-Gln-Arg-Asp-Ala-Gl
The agent for preventing / treating Sjögren's syndrome according to the above (3), which comprises an amino acid sequence represented by u-Glu-Leu,
(6) The preventive / therapeutic agent for Sjogren's syndrome according to claim 5, wherein the molecular weight of α-fodrin, its mutein or a fragment protein thereof is 100K to 140K.
The agent for preventing or treating Sjogren's syndrome according to the above (3), wherein the fodrin fragment protein is a fragmented α-fodrin protein produced when the α-fodrin protein is degraded with a protease, (8) α-fodrin, its mutein, or a mutein thereof A diagnostic agent for an autoimmune disease comprising a fragment protein or a salt thereof; (9) a diagnostic agent for α-fodrin, a mutein thereof or a fragment protein thereof or a Sjogren's syndrome comprising a salt thereof; The diagnostic agent for Sjogren's syndrome according to the above (9), wherein fodrin, its mutein or a fragment protein thereof has a molecular weight of 2K to 240K, (11) α-fodrin, its mutein or a fragment protein thereof has the formula Arg-Gln-
Lys-Leu-Glu-Asp-Ser-Tyr-A
rg-Phe-Gln-Phe-Phe-Gln-Ar
The diagnostic agent for Sjögren's syndrome according to the above (9), comprising the amino acid sequence represented by g-Asp-Ala-Glu-Glu-Leu, (12) α-fodrin, its mutein or a fragment protein thereof having a molecular weight of 100K to 1
The diagnostic agent for Sjogren's syndrome according to the above (11), which is 40K, and (13) α-fodrin, its mutein or a fragment protein thereof, or a salt thereof,
An object of the present invention is to provide a method for detecting / quantifying an antibody against fodrin, its mutein, a fragment protein thereof, or an antibody thereof, which is characterized by contacting the antibody with the antibody.

【０００６】本発明に用いるα-フォドリン、そのムテ
インあるいはそれらの断片蛋白質、またはそれらの塩と
しては、例えばヒトα-フォドリン蛋白質などが挙げら
れるが、ヒトα-フォドリン蛋白質自体、または該蛋白
質が蛋白質分解酵素により制限的に分解された時に生じ
る断片蛋白質の何れかと免疫化学的に等価で有ればよ
く、特に生物種、分子量などが限定されるものではな
い。「免疫化学的に等価」とは、抗体反応性、抗原性に
おいて生物学的に区別不可能なことを示し、より具体的
には同じ抗体あるいは抗血清で認識されるなどの性質を
持つことが挙げられる。またα-フォドリン、そのムテ
インあるいはそれらの断片蛋白質、またはそれらの塩の
製造法は、各種臓器から精製されたものであっても、遺
伝子工学的手法によってもよい。特に遺伝子工学的手法
を用い製造する場合、免疫化学的等価性を喪失しない限
りアミノ酸の変異、置換、挿入、付加または欠損があっ
てもよい。また、該蛋白質は免疫化学的等価性を喪失し
ない限り分子内のアミノ酸側鎖が適当な保護基［例え
ば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アシル基（好
ましくはＣ1-6アルカノイル基）など］で保護されてい
るものなども含まれる。Examples of the α-fodrin, its mutein, or a fragment thereof, or a salt thereof used in the present invention include human α-fodrin, and the like. It may be immunochemically equivalent to any of the fragment proteins generated when the fragment is restricted by the decomposing enzyme, and the biological species, molecular weight, etc. are not particularly limited. "Immunochemically equivalent" means that antibodies are indistinguishable in terms of antibody reactivity and antigenicity, and more specifically, that they have the property of being recognized by the same antibody or antiserum. No. The method for producing α-fodrin, its mutein, a fragment protein thereof, or a salt thereof may be purified from various organs or by a genetic engineering technique. In particular, when production is performed using genetic engineering techniques, amino acid mutations, substitutions, insertions, additions, or deletions may be made as long as immunochemical equivalence is not lost. In addition, as long as the protein does not lose immunochemical equivalence, the amino acid side chain in the molecule has an appropriate protecting group [for example, a C 1-6 acyl group such as a formyl group or an acetyl group (preferably a C 1-6 alkanoyl group). ) Etc.].

【０００７】より具体的には、本発明のα-フォドリン
断片蛋白質としては、例えば蛋白質分解酵素などにより
ヒトα-フォドリンを分解した際に生成される蛋白質な
どが挙げられ、好ましくは、ヒトα-フォドリン部分配
列、特に配列番号：１で示されるアミノ酸配列あるいは
該配列と免疫化学的に等価なアミノ酸配列を含むものが
よい。用いられる蛋白質分解酵素は、好ましくは、トリ
プシン、キモトリプシン、カルパイン（より好ましくは
カルパインなど）などがよい。これ以外に、温血動物
（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブ
タ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる組織（例え
ば、脳など）または細胞などに由来するα-フォドリン
あるいは該α-フォドリンを上記の蛋白質分解酵素など
により分解した際に生成される蛋白質などで、好ましく
は、ヒトα-フォドリンの配列番号：１で示されるアミ
ノ酸配列あるいは該配列と免疫化学的に等価なアミノ酸
配列を含み、全体として免疫化学的に等価であるもので
あってもよい。該、α-フォドリン蛋白質の蛋白質分解
酵素による分解は、両者を、ｐＨ約６〜８の緩衝液中、
約１０〜５０℃（好ましくは、３０〜４５℃）の温度
で、約３０分〜５時間反応させることによって行われ
る。したがって、α-フォドリンおよびその断片蛋白質
のアミノ酸組成などの量的、質的要素は異なっていても
よいが、分子量としては、２Ｋ〜２４０Ｋであることが
好ましく、さらに１００Ｋ〜１４０Ｋであることが好ま
しく、とりわけ、後述の実施例で示すように、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動による測定で１２０Ｋの分
子量を示すものが好ましい。本発明のα-フォドリンお
よびα-フォドリン断片蛋白質の塩としては、いかなる
塩であってもよいが、なかでも酸付加塩が好ましく、と
りわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この
ような塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン
酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸
（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレ
イン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸
など）との塩などが好ましく用いられる。More specifically, the α-fodrin fragment protein of the present invention includes, for example, a protein produced when human α-fodrin is degraded by a protease, and preferably human α-fodrin. A fodrin partial sequence, particularly one containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence immunochemically equivalent to the sequence is preferred. The protease used is preferably trypsin, chymotrypsin, calpain (more preferably calpain or the like). In addition, α-fodrin or α-fodrin derived from any tissue (eg, brain, etc.) or cells of a warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) Is preferably a protein produced when the above-mentioned protease is degraded by the above protease, and preferably contains an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of human α-fodrin or an amino acid sequence immunochemically equivalent to the sequence. May be immunochemically equivalent as a whole. The degradation of the α-fodrin protein by the protease is carried out in a buffer having a pH of about 6 to 8.
The reaction is performed at a temperature of about 10 to 50 ° C (preferably 30 to 45 ° C) for about 30 minutes to 5 hours. Therefore, although the quantitative and qualitative factors such as the amino acid composition of α-fodrin and its fragment protein may be different, the molecular weight is preferably 2K to 240K, more preferably 100K to 140K. In particular, as shown in the examples below, SDS-
Those exhibiting a molecular weight of 120 K as measured by polyacrylamide electrophoresis are preferred. The salt of the α-fodrin and α-fodrin fragment protein of the present invention may be any salt, and among them, an acid addition salt is preferable, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, etc.) Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid and the like) are preferably used.

【０００８】本発明のα-フォドリン蛋白質のムテイン
としては、α-フォドリン蛋白質を構成するアミノ酸に
免疫学的等価性を喪失しない限りのアミノ酸の変異、置
換、挿入、付加または欠損が生じた蛋白質のことを表
す。ムテインの具体例としては、元の蛋白質のアミノ酸
配列が変異したもの、例えばアミノ酸の付加、構成アミ
ノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換などが生じた蛋白質
などが挙げられる。該アミノ酸の付加としては、少なく
とも１個（好ましくは５個以下）のアミノ酸が付加して
いるものが挙げられる。該構成アミノ酸の欠損として
は、少なくとも１個（好ましくは５個以下）のα-フォ
ドリン構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。
該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個（好
ましくは５個以下）のα-フォドリン構成アミノ酸が別
のアミノ酸で置換されているものが挙げられる。付加さ
れるアミノ酸の数としては、少なくとも１個であるが、
α-フォドリンの特徴、特にα-フォドリン蛋白質に対す
る免疫学的等価性を喪失しない限り何個でもよい。構成
アミノ酸が欠損しているα-フォドリンのムテインにお
ける欠損している構成アミノ酸の数としては、少なくと
も１個であるが、α-フォドリンの特徴、特にα-フォド
リン蛋白質に対する免疫学的等価性を喪失しない限り何
個でもよい。構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されて
いるα-フォドリンのムテインにおける置換される前の
α-フォドリンの構成アミノ酸（被置換アミノ酸）の数
としては、少なくとも１個であるが、α-フォドリンの
特徴、特にα-フォドリン蛋白質に対する免疫学的等価
性を喪失しない限り何個でもよい。置換される構成アミ
ノ酸（被置換アミノ酸）の例としては、システインある
いはシステイン以外のいずれのアミノ酸も対象となり得
るが、システインが特に好ましく置換される。システイ
ン以外の被置換アミノ酸としては、アスパラギン酸、ア
ルギニン、グリシン、バリンなどが挙げられる。被置換
アミノ酸がシステインである場合には、置換するアミノ
酸（置換アミノ酸）としては、例えば中性アミノ酸が好
ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、例えば、グ
リシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、
チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトフ
ァン、セリン、スレオニン、メチオニンなどが挙げられ
る。なかでもセリン、スレオニンが好ましい。被置換ア
ミノ酸がシステイン以外のものである場合には、置換ア
ミノ酸としては、例えば、アミノ酸の親水性、疎水性あ
るいは電荷の点で、被置換アミノ酸とは異なる性質をも
つものを選ぶ。具体的には被置換アミノ酸がアスパラギ
ン酸の場合には、置換アミノ酸としてアスパラギン、ス
レオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンなど
が挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好ま
しい。被置換アミノ酸がアルギニンの場合には置換アミ
ノ酸としてグルタミン、スレオニン、ロイシン、フェニ
ルアラニン、アスパラギン酸が挙げられるが、特にグル
タミンが好ましい。被置換アミノ酸がグリシンである場
合には、置換アミノ酸としては、スレオニン、ロイシ
ン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン酸、アルギ
ニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好ましい。被置
換アミノ酸がセリンである場合には、置換アミノ酸とし
ては、メチオニン、アラニン、ロイシン、システイン、
グルタミン、アルギニン、アスパラギン酸などが挙げら
れ、特にメチオニンが好ましい。被置換アミノ酸がバリ
ンである場合には、置換アミノ酸としては、セリン、ロ
イシン、プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸
などが挙げられ、特にセリンが好ましい。被置換アミノ
酸としては、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、
セリン、バリンなどが好ましく、置換アミノ酸として
は、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、スレオニ
ン、メチオニン、セリン、ロイシンなどが好ましい。上
記の置換においては、２以上の置換を同時に行ってもよ
い。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換されるの
が好ましい。上記ムテインは、上述した付加、欠損、置
換の２つまたは３つが組合わさったものでもよい。該ム
テインを製造するためには、例えば、特定部位指向性変
異誘発技術（Sitedirected mutegenesis）が採用され
る。該技術は周知であり、アール・エフ・レイサー（La
ther, R.F.）およびジェイ・ピー・レコック（Lecoq,
J.P.）、ジェネティック・エンジニアリング（Genetic
Engineering）、アカデミックプレス社（１９８３年）
第３１−５０頁、に示されている。オリゴヌクレオチド
に指示された変異誘導はエム・スミス（Smith, M.）お
よびエス・ギラム（Gillam, S.）、ジェネティック・エ
ンジニアニング：原理と方法、プレナムプレス社（１９
８１年）第３巻 第１−３２頁に示されている。該ムテ
インをコードする構造遺伝子を製造するためには、例え
ば、（ａ）α−フォドリンの構造遺伝子の１本鎖からな
る１本鎖ＤＮＡを突然変異株オリゴヌクレオチドプライ
マーと雑種形成させる（この１本鎖で代替すべきシステ
イン用コドン、または場合によりこのコドンと対合をつ
くるアンチセンス・トリプレットを包含する領域に対し
て上記プライマーは相補的なものである。但し、当該コ
ドンの他のアミノ酸暗号化用コドン、または場合により
アンチセンス・トリプレットとの不一致はこの限りでは
ない）、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを
伸長させ、突然変異性ヘテロ二量体（hetroduplex）を
形成させる、および（ｃ）この突然変異ヘテロ二量体を
複製する。次に突然変異された遺伝子を運搬するファー
ジＤＮＡを単離し、プラスミドへ組み込む。このように
して得られたプラスミドで適当な宿主を形質転換し、得
られた形質転換体を培地に培養することにより、ムテイ
ンを製造することができる。本発明のα-フォドリンお
よびα-フォドリン断片蛋白質またはそれらの塩は、前
述の方法によって製造することもできるが、後述する完
全長α-フォドリンまたはα-フォドリン断片蛋白質をコ
ードするDNA断片を含有する形質転換体を培養すること
によっても製造することができる。さらに、後述のペプ
チド合成法に準じて製造することもできる。本発明に関
するヒトα-フォドリン蛋白質の完全長をコードするＤ
ＮＡ配列は、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー （Journal of BiologicalChemistry）第265
巻、p4427ーp4433（1990）に開示されている。従って、
本発明のα-フォドリンまたはαーフォドリン断片蛋白質
を製造するために、該ＤＮＡ断片を取得し、その全体あ
るいは部分を容易に用いることができる。該ＤＮＡの全
長および断片を取得するには、温血動物（例、ヒトな
ど）のゲノムＤＮＡ、温血動物（例、ヒトなど）のゲノ
ムＤＮＡライブラリー、温血動物（例、ヒトなど）の組
織・細胞由来のｃＤＮＡ、温血動物（例、ヒトなど）の
組織または細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから以下に
示す方法で単離することができる。この場合、該ライブ
ラリーに使用するべクターはバクテリオファージ、プラ
スミド、コスミド、ファージミドなどのいずれであって
もよい。また、組織または細胞よりｍＲＮＡ画分を調製
したものを用いて直接、公知のリバーストランスクリプ
ターゼ・ポリメラーゼ・チェーン・リアクション法（RT
-PCR法）によって増幅することもできる。[0008] The mutein of the α-fodrin protein of the present invention includes a protein in which amino acid mutation, substitution, insertion, addition or deletion of amino acids constituting the α-fodrin protein has occurred as long as immunological equivalence is not lost. It represents that. Specific examples of muteins include those in which the amino acid sequence of the original protein is mutated, for example, proteins in which addition of amino acids, deletion of constituent amino acids, substitution of other amino acids, and the like have occurred. Examples of the addition of the amino acid include those in which at least one (preferably 5 or less) amino acid is added. The deletion of the constituent amino acid includes a deletion of at least one (preferably 5 or less) α-fodrin constituent amino acid.
Examples of the substitution with another amino acid include a substitution of at least one (preferably 5 or less) α-fodrin constituent amino acid with another amino acid. The number of added amino acids is at least one,
Any number may be used as long as the characteristics of α-fodrin, particularly immunological equivalence to α-fodrin protein, are not lost. The number of constituent amino acids that are missing in the mutein of α-fodrin in which the constituent amino acids are deleted is at least one, but the characteristics of α-fodrin, especially immunological equivalence to α-fodrin protein, are lost. Any number may be used unless otherwise specified. The number of constituent amino acids (substituted amino acids) of α-fodrin before substitution in the mutein of α-fodrin in which the constituent amino acids have been replaced by another amino acid is at least one, but the characteristics of α-fodrin Any number may be used as long as immunological equivalence to α-fodrin protein is not lost. As an example of the constituent amino acid to be substituted (substituted amino acid), cysteine or any amino acid other than cysteine can be a target, but cysteine is particularly preferably substituted. Substituted amino acids other than cysteine include aspartic acid, arginine, glycine, valine and the like. When the amino acid to be substituted is cysteine, the amino acid to be substituted (substituted amino acid) is preferably, for example, a neutral amino acid. Specific examples of the neutral amino acid include, for example, glycine, valine, alanine, leucine, isoleucine,
Examples include tyrosine, phenylalanine, histidine, tryptophan, serine, threonine, methionine and the like. Among them, serine and threonine are preferred. When the amino acid to be substituted is other than cysteine, the amino acid having a different property from the amino acid to be substituted is selected, for example, in terms of hydrophilicity, hydrophobicity or charge of the amino acid. Specifically, when the amino acid to be substituted is aspartic acid, examples of the substituted amino acid include asparagine, threonine, valine, phenylalanine, arginine and the like, with asparagine and arginine being particularly preferred. When the amino acid to be substituted is arginine, examples of the substituted amino acid include glutamine, threonine, leucine, phenylalanine and aspartic acid, and glutamine is particularly preferred. When the amino acid to be substituted is glycine, examples of the substituted amino acid include threonine, leucine, phenylalanine, serine, glutamic acid, and arginine, with threonine being particularly preferred. When the amino acid to be substituted is serine, examples of the substituted amino acid include methionine, alanine, leucine, cysteine,
Glutamine, arginine, aspartic acid and the like can be mentioned, and methionine is particularly preferred. When the amino acid to be substituted is valine, examples of the substituted amino acid include serine, leucine, proline, glycine, lysine, and aspartic acid, with serine being particularly preferred. As the substituted amino acids, aspartic acid, arginine, glycine,
Serine, valine and the like are preferable, and as the substituted amino acid, asparagine, glutamine, arginine, threonine, methionine, serine, leucine and the like are preferable. In the above substitution, two or more substitutions may be performed simultaneously. In particular, it is preferred that two or three constituent amino acids are substituted. The mutein may be a combination of two or three of the addition, deletion, and substitution described above. In order to produce the mutein, for example, a site-directed mutegenesis technique is employed. The technology is well known and is available from R.F.
ther, RF) and J.P. Lecoq,
JP), Genetic Engineering
Engineering), Academic Press (1983)
Pages 31-50. Oligonucleotide-directed mutagenesis has been described by M. Smith (M.) and G. Gillam, S., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press (19).
1981), Vol. 3, pp. 1-32. In order to produce a structural gene encoding the mutein, for example, (a) a single-stranded DNA consisting of a single strand of the α-fodrin structural gene is hybridized with a mutant oligonucleotide primer (this one The primers are complementary to the cysteine codon to be replaced in the chain or, optionally, to the region encompassing the antisense triplet that pairs with this codon, provided that the other amino acid encoding of the codon (B) mismatches with codons or, optionally, antisense triplets), (b) extending the primers with a DNA polymerase to form a mutated heteroduplex, and (c) Replicate the mutant heterodimer. The phage DNA carrying the mutated gene is then isolated and integrated into a plasmid. By transforming a suitable host with the thus obtained plasmid and culturing the obtained transformant in a medium, mutein can be produced. The α-fodrin and α-fodrin fragment protein or a salt thereof of the present invention can be produced by the above-described method, but contain a DNA fragment encoding a full-length α-fodrin or α-fodrin fragment protein described below. It can also be produced by culturing a transformant. Furthermore, it can be produced according to the peptide synthesis method described later. D encoding the full length human α-fodrin protein of the present invention
The NA sequence is 265 of the Journal of Biological Chemistry.
Vol., P4427-p4433 (1990). Therefore,
In order to produce the α-fodrin or α-fodrin fragment protein of the present invention, the DNA fragment can be obtained and the whole or part thereof can be easily used. To obtain the full length and fragments of the DNA, genomic DNA of a warm-blooded animal (eg, human), genomic DNA library of a warm-blooded animal (eg, human), It can be isolated from a tissue / cell-derived cDNA or a cDNA library derived from a tissue or cell of a warm-blooded animal (eg, human) tissue or cell by the following method. In this case, the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, a known reverse transcriptase-polymerase chain reaction method (RT
-PCR method).

【０００９】また、部分的な塩基配列をそれぞれ化学的
に合成し、それらを縮合させることによって製造するこ
ともできる。以下により詳細な方法を述べる。本発明の
α-フォドリンおよびα-フォドリン断片蛋白質をコード
するＤＮＡの全長および断片のクローニングの手段とし
ては、α-フォドリン断片蛋白質の部分塩基配列を有す
る合成ＤＮＡプライマーを用いて公知のポリメラーゼ・
チェーン・リアクション法（PCR法）によって増幅する
か、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡ断片をα
-フォドリンまたはα-フォドリン断片蛋白質をコードす
るＤＮＡ断片、もしくはその合成DNAを用いて標識した
ものとのハイブリダイゼーションによって選別する。ハ
イブリダイゼーションの方法は、例えばモレキュラー・
クローニング ２版（Molecular Cloning 2nd ed.）
［J.Sambrook et.al., Cold Spring Harbor Lab.Press,
1989］に記載の方法などに従って行われる。また、市
販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に
記載の方法に従って行う。クローン化されたα-フォド
リンおよびα-フォドリン断片蛋白質をコードするDNA断
片は目的によりそのまま、または所望により制限酵素で
消化したり、リンカーを付加したりして使用することが
できる。該ＤＮＡ断片はその５'末端側に翻訳開始コド
ンとしてのATGを有し、また３'末端側には翻訳終止コド
ンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。こ
れらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当な合成DN
Aアダプターを用いて付加することもできる。Further, it can also be produced by chemically synthesizing partial base sequences and condensing them. A more detailed method will be described below. As a means for cloning the full-length DNA and the fragment encoding the α-fodrin and α-fodrin fragment protein of the present invention, known DNA polymerases using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of α-fodrin fragment protein are used.
The DNA fragment amplified by the chain reaction method (PCR method) or
-Selection is performed by hybridization with a DNA fragment encoding fodrin or α-fodrin fragment protein, or a fragment thereof labeled with a synthetic DNA. Hybridization methods include, for example, molecular
Cloning 2nd edition (Molecular Cloning 2nd ed.)
[J.Sambrook et.al., Cold Spring Harbor Lab.Press,
1989]. When a commercially available library is used, the procedure is performed according to the method described in the attached instruction manual. The DNA fragment encoding the cloned α-fodrin and α-fodrin fragment protein can be used as it is depending on the purpose, or digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired. The DNA fragment may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation start codons and translation stop codons are appropriate synthetic DNs.
It can also be added using an A adapter.

【００１０】α-フォドリンおよびα-フォドリン断片蛋
白質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のα-フ
ォドリンまたはα-フォドリン断片蛋白質をコードする
ＤＮＡから目的とするDNA断片を切り出し、（ロ）該Ｄ
ＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流
に連結することにより製造することができる。ベクター
としては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR3
25，pUC12，pUC13など）、枯草菌由来のプラスミド
（例、pUB110，pTP5，PC194など）、酵母由来のプラス
ミド（例、pSH19，pSH15など）など、λファージなどの
バクテリオフアージ、レトロウイルス、ワクシニアウイ
ルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用い
られる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺
伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター
であればいかなるものでもよい。形質転換する際の宿主
がエシェリヒア属菌である場合は、trpプロモーター、l
acプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモータ
ー、lppプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌であ
る場合は、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penP
プロモーターなど、宿主が酵母である場合は、PH05プロ
モーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプ
ロモーターなどが好ましい。宿主が動物細胞である場合
には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロ
モーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショ
ックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモータ
ー、SRαプロモーターなどがそれぞれ利用できる。な
お、これらのプロモーターと共に該プロモーターに適応
したエンハンサーを用いることも効果的である。The expression vectors for α-fodrin and α-fodrin fragment protein include, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding α-fodrin or α-fodrin fragment protein of the present invention; The D
It can be produced by ligating an NA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. As a vector, a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR3
25, pUC12, pUC13, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, PC194, etc.), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15, etc.), bacteriophage such as λ phage, retrovirus, vaccinia Viruses and animal viruses such as baculovirus are used. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. When the host for transformation is Escherichia, trp promoter, l
ac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, etc., if the host is a Bacillus genus, SP01 promoter, SP02 promoter, penP
When the host is a yeast such as a promoter, a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter and the like are preferable. When the host is an animal cell, an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, a metallothionein promoter, a heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, an SRα promoter, and the like can be used. It is also effective to use an enhancer adapted to the promoter together with these promoters.

【００１１】宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ア
ルカリフオスフアターゼ・シグナル配列、OmpA・シグナ
ル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−
アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配
列などが、宿主が酵母である場合は、メイティングファ
クターα・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配
列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシ
ュリン・シグナル配列、α-インターフェロン・シグナ
ル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用で
きる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列
を、α-フォドリンまたはα-フォドリン断片蛋白質をコ
ードするDNA断片の５’末端側に付加することもでき
る。さらに、必要に応じてグルタチオン Sートランスフ
ェラーゼ（gulutathione S-transferase）等のマーカー
蛋白質の配列をα-フォドリンまたはα-フォドリン断片
蛋白質をコードするＤＮＡ断片の５’末端あるいは３’
末端側に付加することもできる。このマーカー配列は、
α-フォドリン蛋白質の精製の際に有効であり〔ジーン
（Gene）第67巻, 31（1988）〕、また、該マーカー蛋白
質は、必要に応じて精製後、蛋白質分解酵素などの分解
によりα-フォドリンやα-フォドリン断片蛋白質と分け
ることも可能である〔ジーン（Gene）第67巻, 31（198
8）〕。このようにして構築されたα-フォドリンまたは
α-フォドリン断片蛋白質をコードするDNA断片を含有す
るベクターを用いて、形質転換体を製造することがで
き、宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチル
ス属菌、酵母、昆虫、動物細胞などが用いられる。When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, an alkaline phosphatase signal sequence, an OmpA signal sequence, etc. are contained.
Amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc., when the host is yeast, mating factor α signal sequence, invertase signal sequence, etc., when the host is an animal cell, for example, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. can be used. If necessary, a signal sequence suitable for the host can be added to the 5 ′ end of the DNA fragment encoding α-fodrin or α-fodrin fragment protein. Further, if necessary, the sequence of a marker protein such as glutathione S-transferase (gulutathione S-transferase) may be replaced with the 5 ′ end or 3 ′ of the DNA fragment encoding α-fodrin or α-fodrin fragment protein.
It can also be added to the terminal side. This marker sequence
It is effective in the purification of α-fodrin protein [Gene, Vol. 67, 31 (1988)], and the marker protein is purified, if necessary, and then degraded by proteolytic enzymes or the like. It can be separated from fodrin and α-fodrin fragment proteins [Gene, Vol. 67, 31 (198
8)]. A transformant can be produced using a vector containing a DNA fragment encoding the α-fodrin or α-fodrin fragment protein thus constructed. As a host, for example, Escherichia, Bacillus Fungi, yeasts, insects, animal cells and the like are used.

【００１２】エシェリヒア属菌の具体例としては、エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1〔プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー（ Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A）、第60巻，160（196
8）〕、JM103〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，
（Nucleic Acids Research），第9巻，309（1981）〕、
JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー（Journal of Molecular Biology），第120巻，517
（1978）〕、HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー（Journalof Molecular Biology），第4
1巻，459（1969）〕、C600〔ジェネティツクス（Geneti
cs），第39巻，440（1954）〕などが用いられる。バチ
ルス属菌の具体例としては、たとえばバチルス・サチル
ス（Bacillus subtilis）、ML114〔ジーン（Gene），第
24巻，255（1983）〕、２０７−２１〔ジヤーナル・オ
ブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistr
y），第95巻．87（1984）〕などが用いられる。酵母の
具体例としては、たとえばサッカロマイセス・セレビシ
エ（Saccaromyces cerevisiae）AH22、AH22R-、A87-11
A、DXD-5D、20B-12などが用いられる。昆虫の具体例と
しては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチヤー（Nature），第315巻，592（1985）〕。[0012] Specific examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12 DH1 [Processings of the National Academy of Sciences of the USA.
c. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (196
8)], JM103 [Nucleic Acids Research,
(Nucleic Acids Research), Vol. 9, 309 (1981)],
JA221 [Journal of Molecular Biology, Vol. 120, 517]
(1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 4th edition]
1, 459 (1969)], C600 [Geneticus
cs), Vol. 39, 440 (1954)]. Specific examples of Bacillus spp. Include, for example, Bacillus subtilis, ML114 [Gene,
24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistr
y), Vol. 95. 87 (1984)]. Examples of yeast, for example Saccharomyces cerevisiae (Saccaromyces cerevisiae) AH22, AH22R - , A87-11
A, DXD-5D, 20B-12, etc. are used. Specific examples of insects include, for example, silkworm larvae [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].

【００１３】動物細胞の具体例としては、たとえばサル
細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター細胞CHO、DH
FR遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO（dhfr-CH
O細胞）、マウスL細胞，マウスミエローマ細胞，ヒトFL
細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換す
るには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・
ユー・エス・エー（ Proc, Natl, Acad. Sci. USA），
第69巻，2110（1972）や ジーン（Gene），第17巻，107
（1982）などに記載の方法に従って行なわれる。バチル
ス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティツクス（Molecular ＆ G
eneral Genetics）第168巻，111（1979）などに記載の
方法に従って行われる。酵母を形質転換するには、たと
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー・エス
・エー（Proc,Natl, Acad, Sci, USA）第75巻，1929（1
978）に記載の方法に従って行なわれる。昆虫細胞を形
質転換するには、たとえばバイオ／テクノロジー（Bio/
Technology），第6巻，p47-p55（1988）などに記載の方
法に従って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、
たとえばヴィロロジー（Virology），第52巻，456（197
3）に記載の方法に従って行なわれる。このようにし
て、α-フォドリンまたはα-フォドリン断片蛋白質をコ
ードするＤＮＡ断片を含有する発現ベクターで形質転換
された形質転換体が得られる。宿主がエシェリヒア属
菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養
に使用される培地としては液体培地が適当であり、その
中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無
機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たと
えばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖な
ど、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸
塩類、コーン・スチープ・リカー、ペプトン、カゼイ
ン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機ま
たは有機物質など、無機物としてはたとえば塩化カルシ
ウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなど
が挙げられる。また、酵母抽出物、ビタミン類、生長促
進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が
望ましい。Specific examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO, DH
FR gene deficient Chinese hamster cell CHO (dhfr - CH
O cell), mouse L cell, mouse myeloma cell, human FL
Cells and the like are used. To transform Escherichia sp., For example, the Proceedings of the National Academy of Sciences of the
USA (Proc, Natl, Acad. Sci. USA),
Vol. 69, 2110 (1972) and Gene, Vol. 17, 107
(1982). For transformation of Bacillus sp., For example, Molecular & General Genetics (Molecular & G)
Eneral Genetics), Vol. 168, 111 (1979). To transform yeast, see, for example, Procesings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc, Natl, Acad, Sci, USA), Volume 75, 1929 (1
978). To transform insect cells, for example, bio / technology (Bio /
Technology), Vol. 6, p47-p55 (1988). To transform animal cells,
For example, Virology, Vol. 52, 456 (197
This is performed according to the method described in 3). Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA fragment encoding α-fodrin or α-fodrin fragment protein is obtained. When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and a carbon source necessary for growth of the transformant is used therein. Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract. Examples of the inorganic substance such as an inorganic or organic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.

【００１４】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ１９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティツクス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），p431-p43
3，Cold Spring Harbor Laboratory, New York（197
2）〕が好ましい。この培地中に、必要によりプロモー
ターを効率よく働かせるために、たとえば３β-インド
リルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿
主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３
℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や攪拌を加
えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は
通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要によ
り、通気や撹絆を加えることもできる。宿主が酵母であ
る形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバ
ークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian，X.
L.ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー・エ
ス・エー（Proc. Natl. Acad. Sci USA），第77巻，450
5（1980）〕や0.5％カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitt
er, G.A.らプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカテミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユ−・
エス・エー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），第81巻，
5330（1984）〕などが挙げられる。培地のｐＨは約５〜
８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５
℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や攪拌を
加える。宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する
際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.
C.C.，ネイチヤー（Nature），第195巻，788（1962））
に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたも
のなどが用いられる。培地のｐＨは、約６.２〜６.４に
調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５
日間行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。宿主が動
物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、
たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むMEM培地〔サ
イエンス（Science），第122巻，501（1952）〕、DMEM
培地〔ヴィロロジー（Virology），第8巻, 396（195
9）〕，RPMI1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリ
カン・メディカル・アソシエーション〔（The Journal
of the American Medical Association）, 第199巻, 51
9 （1967）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ
・ソサイェティ・フオー・ザ・バイオロジカル・メディ
スン（Proceeding of the Society for the Biological
Medicine），第73巻，1（1950）〕などが用いられる。
ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０
℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気
や攪拌を加える。As a medium for culturing Escherichia bacteria, for example, M19 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics (Journa)
l of Experiments in Molecular Genetics), p431-p43
3. Cold Spring Harbor Laboratory, New York (197
2)] is preferred. If necessary, an agent such as 3β-indolylacrylic acid can be added to the medium in order to make the promoter work efficiently. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, culturing is usually performed at about 15 to 43.
C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, ventilation or stirring may be applied. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or stirring may be added. When culturing a transformant whose host is yeast, for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, X.
L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, Proc. Of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 77, 450.
5 (1980)] or SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitt
er, GA, etc. The Prossings of the National
ACATEMY OF SCIENCES OF THE YOU
Sac (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 81,
5330 (1984)]. The pH of the medium is about 5
Adjustment to 8 is preferred. Culture is usually about 20 ° C to 35
C. for about 24-72 hours, adding aeration and agitation as needed. When culturing a transformant in which the host is an insect cell, Grace's Insect Medium (Grace, T .;
CC, Nature, Vol. 195, 788 (1962))
To which an additive such as 10% bovine serum immobilized is appropriately added. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about
Perform for a day and add aeration and agitation as needed. When culturing a transformant in which the host is an animal cell, as a medium,
For example, MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], DMEM
Medium [Virology, Vol. 8, 396 (195
9)], RPMI1640 medium [Journal of the American Medical Association [(The Journal
of the American Medical Association), Vol. 199, 51
9 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine (Proceeding of the Society for the Biological Medicine)]
Medicine, Vol. 73, 1 (1950)].
Preferably, the pH is between about 6-8. Culture is usually about 30
C. to 40.degree. C. for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.

【００１５】上記培養物からα-フォドリンまたはα-フ
ォドリン断片蛋白質を分離精製するには、例えば下記の
方法により行なうことができる。α-フォドリンまたは
α-フォドリン断片蛋白質を培養菌体あるいは細胞から
抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるい
は細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、
リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あ
るいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によリα-
フォドリンまたはα-フォドリン断片蛋白質の粗抽出液
を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩
酸グアニジンなどの蛋白変性剤や、トリトンＸ−１００
（商品名・シグマ社製）などの界面活性剤などが含まれ
ていてもよい。培養液中にα-フォドリンまたはその断
片蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体
公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清
を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは
抽出液中に含まれるα-フォドリンまたはα-フォドリン
断片蛋白質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に
組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分
離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を
利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およ
びSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主と
して分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグ
ラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティ
ークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差
を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を
利用する方法などが用いられる。The α-fodrin or α-fodrin fragment protein can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method. When extracting α-fodrin or α-fodrin fragment protein from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, ultrasonically treated,
After disrupting the cells or cells by lysozyme and / or freeze-thawing, etc., the cells are centrifuged or filtered to remove α-
A method for obtaining a crude extract of fodrin or α-fodrin fragment protein may be appropriately used. In a buffer, a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or Triton X-100 is used.
(Trade name, manufactured by Sigma) or the like. When α-fodrin or a fragment protein thereof is secreted into the culture solution, after the culture is completed, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected. The α-fodrin or α-fodrin fragment protein contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be purified by appropriately combining known separation and purification methods. As these known separation and purification methods, methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight such as Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, use of difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method utilizing a difference between isoelectric points, such as an isoelectric focusing method, is used.

【００１６】α-フォドリンまたはα-フォドリン断片蛋
白質の化学合成法としては、例えば固相合成法、液相合
成法のいずれによってもよい。すなわち、本発明の蛋白
質を構成しうる部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部
分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基
を脱離することにより目的のペプチドを製造することが
できる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例え
ば、以下の〜に記載された方法が挙げられる。 M.BodanszkyおよびM.A.Ondetti、ペプチド・シンセ
シス（Peptide Synthesis），Interscience Publisher
s，New York（1966） SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド（The Peptid
e），Academic Press. New York（1965） 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善
（株）（1975） 矢鳥治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タン
パク質の化学、２０５、（1977） 矢島治明監修、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合
成 広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを適宜組み合わせて本発明の蛋白質を精製
単離することができる。上記の方法で得られる蛋白質が
遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変
換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知
の方法によって遊離体に変換することができる。The method for chemically synthesizing α-fodrin or α-fodrin fragment protein may be, for example, either solid phase synthesis or liquid phase synthesis. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid that can constitute the protein of the present invention with the remaining portion, and if the product has a protecting group, removing the protecting group. Known methods for condensation and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in (1) to (4) below. M. Bodanszky and MAOndetti, Peptide Synthesis, Interscience Publisher
s, New York (1966) Schroeder and Luebke, The Peptid
e), Academic Press. New York (1965) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975) Haruaki Yatori and Shunpei Sakakibara, Biochemistry Laboratory Course 1, Protein Chemistry, 205, ( 1977) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Continuing Pharmaceuticals, Vol. 14, Peptide Synthesis Hirokawa Shoten After the reaction, the usual purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization are appropriately combined. The protein of the present invention can be purified and isolated. When the protein obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.

【００１７】かくして得られるα-フォドリン、そのム
テインあるいはそれらの断片蛋白質が遊離体で得られた
場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に
よって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合
には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、
遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組
換え体が産生するα-フォドリンまたはα-フォドリン断
片蛋白質に対して、精製前または精製後に適当な蛋白修
飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えた
り、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋
白修飾酵素としては、例えばトリプシン、キモトリプシ
ン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナー
ゼ、、グリコシダーゼなどが用いられる。本発明のα-
フォドリン、そのムテインあるいはそれらの断片蛋白
質、またはそれらの塩は、それを含む医薬組成物とし
て、全身性エリトマトーデス、リューマチ、シェーグレ
ン症候群などの自己免疫疾患予防・治療剤、特にシェー
グレン症候群の予防・治療剤として用いることができ
る。より具体的には、α-フォドリン、そのムテインあ
るいはそれらの断片蛋白質、またはそれらの塩を投与す
ることにより、自己免疫疾患で見られる炎症、特にシェ
ーグレン症候群で見られる涙腺あるいは唾液腺における
炎症を治療または予防することができる。また、本発明
のα-フォドリン、そのムテインあるいはそれらの断片
蛋白質、またはそれらの塩は、それを含む医薬組成物と
して自己免疫疾患予防・治療剤、特にシェーグレン症候
群の予防・治療剤として公知の免疫抑制剤あるいは抗炎
症剤と併用して投与することができる。When the thus obtained α-fodrin, its mutein or its fragment protein is obtained in a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, it can be obtained in a salt form. In the event that it is done, by a method known per se or a method similar thereto,
It can be converted to a free form or other salts. The α-fodrin or α-fodrin fragment protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or partially modified by the action of an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. It can also be removed. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used. Α- of the present invention
Fodrin, its mutein or a fragment protein thereof, or a salt thereof is used as a pharmaceutical composition containing the same as a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus, rheumatism, and Sjogren's syndrome, particularly a prophylactic / therapeutic agent for Sjogren's syndrome. Can be used as More specifically, by administering α-fodrin, its mutein or a fragment protein thereof, or a salt thereof, inflammation seen in an autoimmune disease, particularly inflammation in the lacrimal gland or salivary gland seen in Sjogren's syndrome or Can be prevented. Further, the α-fodrin of the present invention, its mutein or a fragment protein thereof, or a salt thereof may be used as a pharmaceutical composition containing the same, as an agent for preventing or treating autoimmune diseases, in particular, as an agent for preventing or treating Sjogren's syndrome. It can be administered in combination with an inhibitor or an anti-inflammatory agent.

【００１８】本発明のα-フォドリン、そのムテインあ
るいはそれらの断片蛋白質、またはそれらの塩を医薬と
して用いるには、そのまま粉末としてまたは、他の薬理
学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤とともに医薬
組成物（たとえば、注射剤、錠剤、カプセル剤、液剤、
軟膏、坐剤等）として、温血動物（たとえば、ヒトな
ど）に対して非経口または経口的に安全に投与すること
ができる。注射剤の製剤化はたとえば、生理食塩水また
はブドウ糖やその他の補助薬を含む水溶液を用い、常法
に従って行われる。錠剤、カプセル剤等の医薬組成物も
常法に従って調製しうる。本発明のα-フォドリン、そ
のムテインあるいはそれらの断片蛋白質、またはそれら
の塩を上記した医薬として用いる場合には、たとえば上
記した温血動物に、投与ルート、症状等を考慮して、１
日量約１ｎｇ〜１００μｇ/ｋｇ、好ましくは約１０ｎ
ｇ〜１０μｇ/ｋｇの範囲のなかから適当量を選んで投
与される。また本発明のα-フォドリン、そのムテイン
あるいはそれらの断片蛋白質、またはそれらの塩を用い
て、自己免疫疾患、特にシェーグレン症候群の診断に用
いることができる。To use the α-fodrin of the present invention, its mutein or its fragment protein, or a salt thereof as a medicament, it may be used as it is as a powder or as other pharmacologically acceptable carriers, excipients, and diluents. And pharmaceutical compositions (eg, injections, tablets, capsules, liquids,
Ointments, suppositories, etc.) can be safely or parenterally or orally administered to warm-blooded animals (eg, humans). Formulation of an injection is carried out, for example, using a physiological saline solution or an aqueous solution containing glucose and other adjuvants according to a conventional method. Pharmaceutical compositions such as tablets and capsules can also be prepared according to conventional methods. When the α-fodrin of the present invention, its mutein or a fragment protein thereof, or a salt thereof is used as the above-mentioned medicine, for example, the above-mentioned warm-blooded animal is taken into consideration in consideration of the administration route, symptoms and the like.
Daily dose of about 1 ng to 100 μg / kg, preferably about 10 n
An appropriate amount is selected from the range of g to 10 μg / kg and administered. The α-fodrin of the present invention, its mutein or a fragment thereof, or a salt thereof can be used for diagnosing an autoimmune disease, particularly Sjogren's syndrome.

【００１９】具体的には、温血動物の血液中に存在する
α-フォドリンまたはα-フォドリン断片蛋白質の自己抗
体の検出・定量方法を行うことにより、自己免疫疾患、
特にシェーグレン症候群の発症の診断・病期の判定ある
いは、発症予測が可能となる。α-フォドリンおよびα-
フォドリン断片蛋白質の自己抗体の検出・定量方法とし
ては、たとえば、次の様に行うことができる。セルロー
スビーズ等の担体に、α-フォドリンそのムテインある
いはそれらの断片蛋白質、またはそれらの塩（以下、抗
原蛋白質と称することがある。）を常法に従いカップリ
ングさせておき、これに測定したい検体を加え、一定時
間、定温（約４℃〜４０℃を示す。）で反応させる。こ
の後、反応物をよく洗浄し、蛍光物質、発色物質、酵素
あるいは放射性同位元素で標識した検体の動物種の抗体
に特異的に結合する抗体を加え、一定時間、定温（約４
℃〜４０℃を示す。）で反応させる。続いて、反応物を
よく洗った後、必要に応じ、酵素基質を加え、一定時
間、定温（約４℃〜４０℃を示す。）で反応させ、その
後生成発色物を吸光度または蛍光強度、または該反応物
の放射活性をシンチレーションカウンター等で測定す
る。該抗原蛋白質の測定方法において用いられる抗原蛋
白質を保持する担体としては、例えば、ゲル粒子（例、
アガロースゲル〔例、セファロース4B、セファロース6B
（商品名、ファルマシア・ファインケミカル社（スウェ
ーデン）製）など〕、デキストランゲル〔例、セファデ
ックスG-75、セフアテックスG-100、セファデックスG-2
00（登録商標、ファルマシア・ファインケミカル社（ス
ウェーデン）製）など〕、ポリアクリルアミドゲル
〔例、バイオゲルP-30、バイオゲルP-60、バイオゲルP-
100（登録商標、バイオラッド・ラボラトリーズ社（米
国）製）など〕、セルロース粒子〔例、アピセル（登録
商標、旭化成製）、イオン交換セルロース（例、ジエチ
ルアミノエチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
ス）など〕、物埋的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス
球、ガラスロッド、アミノアルキルガラス球、アミノア
ルキルガラスロッドなど）、シリコン片、スチレン系樹
脂（例、ポリスチレン球、ポリスチレン粒子など）、イ
ムノアッセイ用プレート（例、ヌンク社（デンマーク）
製など）など〕、イオン交換樹脂｛（例、弱酸性陽イオ
ン交換樹脂〔例、アンバーライトIRC-5（登録商標、ロ
ーム・アンド・ハース社（米国）製）、ゼオカープ２２
６（商品名、パームチット社（西ドイツ）製）など〕、
弱塩基性陰イオン交換樹脂〔例、アンバーライトIR-4
B、ダウエックス３（登録商標、ダウケミカル社（米
国）製）など〕など｝などが挙げられる。Specifically, by performing a method for detecting and quantifying an autoantibody of α-fodrin or α-fodrin fragment protein present in the blood of a warm-blooded animal, autoimmune diseases,
In particular, it is possible to diagnose and determine the stage of the onset of Sjogren's syndrome, or predict the onset. α-fodrin and α-
A method for detecting and quantifying an autoantibody of a fodrin fragment protein can be performed, for example, as follows. Α-fodrin, its mutein, a fragment protein thereof, or a salt thereof (hereinafter, sometimes referred to as an antigen protein) is coupled to a carrier such as cellulose beads according to a conventional method, and a sample to be measured is added thereto. In addition, the reaction is carried out at a constant temperature (indicating about 4 ° C. to 40 ° C.) for a certain period of time. Thereafter, the reaction product is thoroughly washed, and an antibody that specifically binds to an antibody of an animal species of a specimen labeled with a fluorescent substance, a chromogenic substance, an enzyme, or a radioisotope is added thereto.
C to 40C. ). Subsequently, after thoroughly washing the reaction product, if necessary, an enzyme substrate is added, and the reaction is carried out at a constant temperature (indicating about 4 ° C. to 40 ° C.) for a certain period of time. The radioactivity of the reaction product is measured with a scintillation counter or the like. As the carrier holding the antigen protein used in the method for measuring the antigen protein, for example, gel particles (eg,
Agarose gel (e.g., Sepharose 4B, Sepharose 6B
(Trade name, Pharmacia Fine Chemicals (Sweden), etc.), dextran gel [eg, Sephadex G-75, Sephatex G-100, Sephadex G-2
00 (registered trademark, manufactured by Pharmacia Fine Chemicals (Sweden)), polyacrylamide gel [eg, Biogel P-30, Biogel P-60, Biogel P-
100 (registered trademark, manufactured by Bio-Rad Laboratories, Inc. (USA)), cellulose particles (eg, Apisel (registered trademark, manufactured by Asahi Kasei), ion-exchange cellulose (eg, diethylaminoethylcellulose, carboxymethylcellulose), etc.) Adsorbent [eg, glass (eg, glass sphere, glass rod, aminoalkyl glass sphere, aminoalkyl glass rod, etc.), silicon piece, styrene resin (eg, polystyrene sphere, polystyrene particles, etc.), plate for immunoassay (eg, Nunc (Denmark)
Ion-exchange resin 、 (eg, weakly acidic cation-exchange resin [eg, Amberlite IRC-5 (registered trademark, manufactured by Rohm and Haas Co., USA)), Zeocarp 22
6 (trade name, manufactured by Palm Chit (West Germany)), etc.
Weakly basic anion exchange resin [e.g., Amberlite IR-4
B, Dowex 3 (registered trademark, manufactured by Dow Chemical Co., USA), and the like.

【００２０】担体に抗原蛋白質を保持させるためには、
公知の常套手段を応用し得るが、例えば、“代謝”、第
8巻、696（1971）に記載されているブロムシアン法、グ
ルタールアルデヒド法などが挙げられる。また、より簡
便な方法として物埋的に担体表面に抗原蛋白質を吸着さ
せてもよい。標識剤を結合させた抗体（標識抗体）にお
ける標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物
質、発色物質などが挙げられるが、酵素を用いるのが好
ましい。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好
ましく、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−D−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等
を用いることができるが、ペルオキシダーゼが好まし
い。ペルオキシダーゼとしては、種々の起源のものを用
いることができるが、その例としてはたとえば西洋わさ
び、パイナップル、イチジク、甘藷、ソラマメ、トウモ
ロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙げられ、
特に西洋わさびから抽出されたホースラッディシュペル
オキシダーゼ（horseradish peroxidase）（ＨＲＰ）が
好ましい。ペルオキシダーゼと抗体を結合するにあた
り、抗体分子としてのFab'のチオール基を利用するため
に、あらかじめペルオキシダーゼにマレイミド基を導入
したものを用いると好都合である。マレイミド基をペル
オキシダーゼに導入する方法としては、ペルオキシダー
ゼのアミノ基を介してマレイミド基を導入することがで
きる。そのためには、Ｎ−サクシニミジル−マレイミド
−カルボキシレート誘導体を用いることができ、好まし
くは、Ｎ−（γ−マレイミドプチルオキシ）サクシイミ
ド（ＧＭＢＳと略称することもある）などを用いるのが
よい。従って、マレイミド基とペルオキシダーゼとの間
に一定の基が入っていることとなってもよい。ＧＭＢＳ
をペルオキシダーゼに反応させるには、両者を、ｐＨ約
６〜８の緩衝液中で約１０〜５０℃の温度で約１０分〜
２４時間反応させることによって行われる。該緩衝液と
しては、たとえば、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸緩衝液
などが挙げられる。このようにして得られたマレイミド
化ペルオキシダーゼは、たとえば、ゲル濾過クロマトグ
ラフィーなどによリ精製することがてきる。In order to make the carrier hold the antigen protein,
Known conventional means can be applied, for example, "metabolism",
8, Bromcian method, glutaraldehyde method and the like described in 696 (1971). Further, as a simpler method, the antigen protein may be adsorbed on the surface of the carrier in an embedded manner. Examples of the labeling agent in the antibody (labeled antibody) to which the labeling agent is bound include a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a coloring substance, and the like, and it is preferable to use an enzyme. As the enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable, and a peroxidase, an alkaline phosphatase,
β-D-galactosidase, glucose oxidase and the like can be used, but peroxidase is preferred. As the peroxidase, those of various origins can be used, and examples thereof include peroxidase obtained from horseradish, pineapple, fig, sweet potato, broad bean, corn and the like,
Particularly preferred is horseradish peroxidase (HRP) extracted from horseradish. In order to utilize the thiol group of Fab 'as an antibody molecule when binding the antibody to peroxidase, it is convenient to use a peroxidase in which a maleimide group has been previously introduced into peroxidase. As a method for introducing a maleimide group into peroxidase, a maleimide group can be introduced via an amino group of peroxidase. For this purpose, an N-succinimidyl-maleimide-carboxylate derivative can be used, and N- (γ-maleimidobutyloxy) succinimide (which may be abbreviated as GMBS) or the like is preferably used. Therefore, a certain group may be inserted between the maleimide group and the peroxidase. GMBS
Are reacted with peroxidase at a temperature of about 10 to 50 ° C. for about 10 minutes in a buffer having a pH of about 6 to 8.
The reaction is performed for 24 hours. Examples of the buffer include a 0.1 M phosphate buffer having a pH of 7.0. The maleimidated peroxidase thus obtained can be purified, for example, by gel filtration chromatography.

【００２１】該ゲル濾過クロマトグラフィーを行う際に
用いられる担体としては、例えば、セファデックスG-25
〔登録商標、ファルマシア・ファインケミカル社（スウ
ェーデン）製〕、バイオゲルP-2〔登録商標、バイオラ
ッド・ラボラトリーズ社（米国）製〕などが挙げられ
る。マレイミド化ペルオキシダーゼと抗体分子との反応
は、両者を緩衝液中で約０℃〜４０℃の温度で、約１〜
４８時間反応させることにより行うことができる。該緩
衝液としては、たとえば、ｐＨ６．０の５ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０．１Ｍリン酸緩衝
液などが挙げられる。このようにして得られたペルオキ
シダーゼ標識抗体は、たとえば、ゲル濾過クロマトグラ
フィーなどにより精製することができる。該ゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行う際に用いられる担体としては、
たとえば、セファデックスG-25〔ファルマシア・ファイ
ンケミカル社（スウェーデン）製〕、バイオゲルP-2
〔バイオラッド・ラボラトリーズ社（米国）製〕などが
挙げられる。さらに、ペルオキシダーゼにチオール基を
導入し、マレイミド化された抗体分子と反応させても良
い。ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接給合させ
るには、ペルオキシダーゼの場合に準じて行なうことが
でき、また、自体公知のグルタルアルテヒド法、過ヨウ
素酸法、水溶性カルボジイミド法などが用いられる。本
発明の定量方法の例として、標識剤がペルオキシダーゼ
の場合について以下に具体的に説明するが、本発明に用
いられるものとしては、ペルオキシダーゼに限定される
ものではない。The carrier used for the gel filtration chromatography includes, for example, Sephadex G-25
[Registered trademark, manufactured by Pharmacia Fine Chemicals (Sweden)], Biogel P-2 [registered trademark, manufactured by Bio-Rad Laboratories (USA)], and the like. The reaction between the maleimidated peroxidase and the antibody molecule is carried out in a buffer at a temperature of about 0 ° C. to 40 ° C. for about 1 to 1 minute.
The reaction can be carried out for 48 hours. Examples of the buffer include a 0.1 M phosphate buffer containing 5 mM sodium ethylenediaminetetraacetate having a pH of 6.0. The peroxidase-labeled antibody thus obtained can be purified, for example, by gel filtration chromatography. As a carrier used when performing the gel filtration chromatography,
For example, Sephadex G-25 [Pharmacia Fine Chemicals (Sweden)], Biogel P-2
[Bio-Rad Laboratories (USA)]. Furthermore, a thiol group may be introduced into peroxidase and reacted with a maleimidated antibody molecule. An enzyme other than peroxidase can be directly supplied to the antibody in the same manner as in the case of peroxidase, and a per se known glutaraldehyde method, periodate method, water-soluble carbodiimide method, or the like is used. As an example of the quantification method of the present invention, the case where the labeling agent is peroxidase will be specifically described below, but the method used in the present invention is not limited to peroxidase.

【００２２】まず、 ：担体に保持された抗原蛋白質に、測定すべき検体を
加えて抗原抗体反応を行った後、これに、前記で得られ
たペルオキシダーゼと検体の動物種の抗体に結合する抗
体との結合物（酵素標識抗体）を加えて反応させる。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。 ：上記〜の操作をシェーグレン症候群を発症して
いる患者から採取した血清中に含まれる抗α-フォドリ
ンまたはα-フォドリン断片蛋白質抗体の標準溶液に対
してあらかじめ行い、抗α-フォドリンあるいはα-フォ
ドリン断片蛋白質抗体量と吸光度もしくは蛍光強度との
関係を標準曲線として作成しておく。 ：シェーグレン症候群を発症している、あるいは将来
発症する可能性のある患者から採取した血清に対し、上
記〜の操作を行い得られた吸光度もしくは蛍光強度
を標準曲線にあてはめ、該患者の抗α-フォドリンある
いはα-フォドリン断片蛋白質抗体量を測定する。 この際、抗α-フォドリンあるいはα-フォドリン断片蛋
白質抗体量とシェーグレン症候群との発症程度との関係
をあらかじめ設定しておくことにより、シェーグレン症
候群の診断が可能になる。First, an antigen-antibody reaction is performed by adding a sample to be measured to the antigen protein held by the carrier, and then the antibody binding to the peroxidase obtained above and an antibody of the animal species of the sample is added thereto. And react with it. : A peroxidase substrate is added to the reaction product obtained in step (1), and the enzyme activity of the above reaction product is determined by measuring the absorbance or fluorescence intensity of the resulting substance. : The above-mentioned operations are performed in advance on a standard solution of anti-α-fodrin or α-fodrin fragment protein antibody contained in serum collected from a patient who has Sjogren's syndrome, and anti-α-fodrin or α-fodrin The relationship between the amount of the fragment protein antibody and the absorbance or fluorescence intensity is prepared as a standard curve. : Applying the absorbance or the fluorescence intensity obtained by performing the above operations to a standard curve to serum collected from a patient who has developed or may develop Sjogren's syndrome in a standard curve, and the anti-α- The amount of fodrin or α-fodrin fragment protein antibody is measured. At this time, diagnosis of Sjogren's syndrome can be made by setting in advance the relationship between the amount of anti-α-fodrin or α-fodrin fragment protein antibody and the degree of onset of Sjogren's syndrome.

【００２３】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision
on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。またアミノ酸に関して光学活性体があり得る場
合は、特に明示しない限りL体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＤＥＡＥ ：ジエチルアミノエチル Ａｒｇ ：アルギニン Ｇｌｎ ：グルタミン Ｌｙｓ ：リジン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｓｅｒ ：セリン Ｔｙｒ ：チロシン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ａｌａ ：アラニンIn the present specification and drawings, when bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations, IUPAC-IUB Commision
Abbreviations based on on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are described below. In addition, when there is an optically active form of an amino acid, the L form is shown unless otherwise specified. DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid SDS: sodium dodecyl sulfate EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid DEAE: diethylaminoethyl Arg: arginine Gln: glutamine Lys: lysine Leu: leucine glutamine Serine Tyr: Tyrosine Phe: Phenylalanine Ala: Alanine

【００２４】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕実施例１で示すNFS/sldマウスから得
られた１２０Ｋ自己抗原蛋白質のＮ末端から２０番目ま
でのアミノ酸配列を示す。The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences. [SEQ ID NO: 1] This shows the amino acid sequence of the 120K autoantigen protein obtained from the NFS / sld mouse shown in Example 1 up to the 20th position from the N-terminus.

【００２５】[0025]

【発明の実施の形態】以下に実施例により、本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定さ
れるものではない。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto.

【００２６】[0026]

【実施例】【Example】

実施例１ シェーグレン症候群モデルマウスNFS/sldマ
ウスにおける自己抗体および自己抗原の同定 NFS/sldマウスは、生後３日目に胸腺摘出を行うと、４
週間後〜２０週間後にシェーグレン症候群を発症するこ
とが知られている。また、この時見られる症状は、一次
性シェーグレン症候群の諸状況を良く反映している。
〔林良夫、羽地則雄 臨床免疫、第27巻 p488-p492（1
995）〕、〔林良夫 日本臨牀 第53巻,第10号 p2383ー
p2388（1995）〕あるいは〔羽島ら ジャーナル・オブ
・イムノロジー （Journal of Immunology）、第153
巻、2769（1994）〕。該NFS/sldマウスに生後３日目に
胸腺摘出を行い、４週間後および１２週間後に該NFS/sl
dマウスの血清およびシェーグレン症候群を発症してい
ないマウスとしてBALB/cマウスの血清を用い、シェーグ
レン症候群特異的な自己抗体の存在を調べた。マウス唾
液腺および涙腺組織をポリトロンホモゲナイザーでホモ
ゲナイズし、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム，５ｍＭ ベン
ズアミジン−ＨＣｌ，２ｍＭ フッ化リン酸ジイソプロ
ピル，２ｍＭ Ｎ−エチルマレインイミド，２ｍＭ フェ
ニルメチルスルホニル フルオリド及び２ｍＭ ＥＤＴＡ
を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．２）溶液
に懸濁した。２００００ｇで３０分間遠心した後、上清
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した
後、メンブレンフィルターにトランスファーし、該マウ
ス血清と反応させた。さらに、アルカリフォスファター
ゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ、フォスファ
ターゼ活性を利用して発色させた。その結果、NFS/sld
マウスの唾液腺および涙腺のホモジェネート中にNFS/sl
dマウス血清と反応する６０Ｋ、１２０Ｋ、１６０Ｋお
よび２４０Ｋの自己抗原が存在する事が判明した（図
１）。また、胸腺摘出後１２週を経てシェーグレン症候
群を発症したNFS/sldマウスの血清に１２０Ｋの自己抗
原を認識する自己抗体が存在しすることが判明した（図
２）。引き続き、自己抗体と最も強く反応する120K抗原
蛋白質を同定するために、マウス唾液腺ホモゲネートの
遠心上清を、Superose 12HRカラム（Pharmacia社）、１
Ｍ 塩化ナトリウム, ２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．２）を用いゲル濾過クロ
マトグラフィーを行った（図３）。NFS/sldマウス抗血
清に反応する１２０Ｋの分子が存在する画分を回収し、
続くイオン交換クロマトグフィーに供した（図４）。回
収した画分を、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム, ２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．２）
に対して透析を行った後、DEAE-Cosmogelカラム（半井
化学）に供した。溶出は、０．１５Ｍから０．７５Ｍの
塩化ナトリウム濃度勾配で行った（図５）。NFS/sldマ
ウス抗血清に反応する１２０Ｋの分子が存在する画分を
回収し、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
で再画分し、メンブレンフィルターにトランスファーし
た後、１２０Ｋに相当する部分を切り出しApplied Bios
ystems社製477Aプロテインシークエンサーを用いアミノ
酸配列の解析を行った。その結果、得られた１２０Ｋの
自己抗原蛋白質のＮ末端から２０番目までのアミノ酸配
列は、既知のヒトのα-フォドリンのN末端領域の３７番
目から５６番目のとアミノ酸配列に一致した。Example 1 Identification of autoantibodies and autoantigens in Sjögren's syndrome model mouse NFS / sld mice
It is known to develop Sjogren's syndrome after weeks to 20 weeks. Also, the symptoms seen at this time reflect well the status of primary Sjogren's syndrome.
[Yoshio Hayashi, Norio Hachi, Clinical Immunity, Vol. 27, p488-p492 (1
995)], [Yoshio Hayashi, Japanese Clinical Laboratory, Vol. 53, No. 10, p. 2383-
p2388 (1995)] or [Hashima et al. Journal of Immunology, Journal 153
Vol., 2769 (1994)]. Thymectomy was performed on the NFS / sld mice on the third day after birth, and after 4 and 12 weeks, the NFS / sld mice were resected.
Using the serum of d mice and the serum of BALB / c mice as mice that did not develop Sjogren's syndrome, the presence of Sjogren's syndrome-specific autoantibodies was examined. Mouse salivary gland and lacrimal gland tissue were homogenized with a polytron homogenizer, and 0.15 M sodium chloride, 5 mM benzamidine-HCl, 2 mM diisopropyl fluorophosphate, 2 mM N-ethylmaleimide, 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and 2 mM EDTA were used.
Was suspended in a 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) solution containing After centrifugation at 20,000 g for 30 minutes, the supernatant was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, then transferred to a membrane filter, and reacted with the mouse serum. Furthermore, an alkaline phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG antibody was reacted, and the color was developed using the phosphatase activity. As a result, NFS / sld
NFS / sl in mouse salivary and lacrimal gland homogenates
d It was found that there were 60K, 120K, 160K and 240K autoantigens that react with the mouse serum (FIG. 1). In addition, it was found that serum of NFS / sld mice that developed Sjogren's syndrome 12 weeks after thymectomy contained an autoantibody that recognizes a 120K autoantigen (FIG. 2). Subsequently, in order to identify the 120K antigen protein that reacts most strongly with the autoantibody, the centrifugal supernatant of the mouse salivary gland homogenate was applied to a Superose 12HR column (Pharmacia),
M 20 mM with sodium chloride, 2 mM EDTA
Gel filtration chromatography was performed using Tris-HCl (pH 7.2) (FIG. 3). A fraction containing a 120K molecule that reacts with the NFS / sld mouse antiserum was collected,
It was subjected to the subsequent ion exchange chromatography (FIG. 4). The collected fraction was subjected to 0.15 M sodium chloride, 2 mM E
20 mM Tris-HCl containing DTA (pH 7.2)
After dialysis, the sample was applied to a DEAE-Cosmogel column (Hansui Chemicals). Elution was performed with a 0.15 M to 0.75 M sodium chloride concentration gradient (FIG. 5). The fraction containing the 120K molecule reacting with the NFS / sld mouse antiserum was collected, refractionated by 10% SDS-polyacrylamide electrophoresis, transferred to a membrane filter, and the portion corresponding to 120K was cut out. Applied Bios
The amino acid sequence was analyzed using a 477A protein sequencer manufactured by ystems. As a result, the amino acid sequence from the N-terminus to the 20th position of the obtained 120K autoantigen protein was identical to the amino acid sequence from the 37th to the 56th position in the known N-terminal region of human α-fodrin.

【００２７】実施例２ ヒトα-フォドリン断片蛋白質
の製造 ヒトα-フォドリン蛋白質をコードするＤＮＡは、公知
である〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Journal of Biological Chemistry）第265巻、p4
427ーp4433（1990）〕。このＤＮＡ配列のうち、Ｎ末端
領域をコードするＤＮＡ断片を含むＪＳ−１を用いてヒ
トα-フォドリン断片蛋白質の製造を行った。ＪＳ−１
ＤＮＡ断片（1〜1784bp）を制限酵素EcoRIで完全消化し
大腸菌のpGEX-2Tベクター（ファルマシア社）のEcoRI部
位につなげた。該ベクターの取扱説明に従い大腸菌へ導
入しグルタチオン S-トランスフェラーゼ・α-フォドリ
ン断片蛋白質融合蛋白質を取得した。得られた融合蛋白
質を、取扱説明に従いトロンビンで消化した後、α-フ
ォドリン断片蛋白質とグルタチオン S-トランスフェラ
ーゼに分離精製した。該融合蛋白質と該α-フォドリン
断片蛋白質を用い、実施例１に記載したウエスタンブロ
ット法を用いてシェーグレン症候群発症NFS/sldマウス
の血清およびシェーグレン症候群非発症NFS/sldマウス
の血清との反応性を調べた（図６）。その結果、該融合
蛋白質および該αーフォドリン断片蛋白質ともに、該モ
デルマウスの血清と反応する事が判明した。また、グル
タチオン S-トランスフェラーゼは、温血動物の血清と
は反応しないので、該融合蛋白質は、さらなる処理を必
要とせずに本発明に用いることができることも判明し
た。Example 2 Production of Human α-Fodrin Fragment Protein DNA encoding human α-fodrin protein is known (Journal of Biological Chemistry, vol. 265, p4).
427-p4433 (1990)]. From this DNA sequence, human α-fodrin fragment protein was produced using JS-1 containing a DNA fragment encoding the N-terminal region. JS-1
The DNA fragment (1-1784 bp) was completely digested with the restriction enzyme EcoRI and ligated to the EcoRI site of the pGEX-2T vector (Pharmacia) of E. coli. The vector was introduced into Escherichia coli according to the instructions for use of the vector to obtain a glutathione S-transferase / α-fodrin fragment protein fusion protein. The obtained fusion protein was digested with thrombin according to the instruction manual, and then separated and purified into α-fodrin fragment protein and glutathione S-transferase. Using the fusion protein and the α-fodrin fragment protein, the reactivity of the serum of NFS / sld mice with Sjogren's syndrome and the serum of NFS / sld mice without Sjögren's syndrome was determined using the Western blot method described in Example 1. It was examined (FIG. 6). As a result, it was found that both the fusion protein and the α-fodrin fragment protein reacted with the serum of the model mouse. It was also found that glutathione S-transferase does not react with the serum of warm-blooded animals, so that the fusion protein can be used in the present invention without requiring further processing.

【００２８】実施例３ シェーグレン症候群を発症して
いるヒトにおけるα-フォドリン断片蛋白質自己抗原の
存在 実施例２で取得した融合蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行った後、フィルターメンブレン
にブロットし、シェーグレン症候群を発症している患者
の血清、全身エリスマトーデスを発症している患者の血
清、関節リュウマチを発症している患者の血清、あるい
は健常人の血清を用いて定法に基づいてウエスタン法に
よるα-フォドリン断片蛋白質に対する自己抗体の存在
を調べた（図７）。α-フォドリン断片蛋白質に対する
自己抗体は、全身エリスマトーデスあるいは関節リュウ
マチを発症している患者の血清中には見出されなかっ
た。一方、シェーグレン症候群を発症している患者の血
清中には、本発明のα-フォドリン断片蛋白質に対する
自己抗体が見い出された。したがって、α-フォドリン
断片蛋白質に対する自己抗体の出現は、シェーグレン症
候群に特異的であることが判明した。Example 3 Presence of α-fodrin fragment protein autoantigen in humans with Sjogren's syndrome The fusion protein obtained in Example 2 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and then blotted onto a filter membrane. Western method based on the standard method using serum from patients with Sjogren's syndrome, serum from patients with systemic erythematosus, serum from patients with rheumatoid arthritis, or serum from healthy individuals Was examined for the presence of autoantibodies to α-fodrin fragment protein (Fig. 7). Autoantibodies to the α-fodrin fragment protein were not found in the sera of patients with systemic lupus erythematosus or rheumatoid arthritis. On the other hand, autoantibodies to the α-fodrin fragment protein of the present invention were found in the serum of patients with Sjogren's syndrome. Therefore, the emergence of autoantibodies to the α-fodrin fragment protein was found to be specific to Sjogren's syndrome.

【００２９】実施例４ ヒトα-フォドリン断片蛋白質
によるシェーグレン症候群の発症抑制 実施例２で得られた融合蛋白質のシェーグレン発症群の
発症抑制効果を検討した。生後３日目の胸腺摘出から３
週間経たNFS/sldマウスに、実施例２で得られた融合蛋
白質およびコントロールとしてアルブミン、リゾチーム
またはグルタチオンSートランスフェラーゼを、それぞれ
２５μｇずつ生理食塩水０．１ｍｌに溶解して静脈内投
与した。投与後8週間経過した後、剖検した。病変の程
度はWhite&Casarettの方法〔ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（Journal of Immunology、第112巻、178（197
4）〕による病理学的指標により判定した。結果を表１
に示す。その結果、α-フォドリン断片蛋白質-グルタチ
オンS-トランスフェラーゼ融合蛋白質を投与した群で
は、顎下腺、耳下腺、涙腺いずれの組織においても明ら
かに病変の程度の軽減が観察された。加えて、他の臓器
においては、病理学的変化は、見い出せなかった。Example 4 Inhibition of Onset of Sjogren's Syndrome by Human α-Fodrin Fragment Protein The effect of the fusion protein obtained in Example 2 on the onset of Sjogren's onset group was examined. 3 days after thymectomy on day 3
25 μg each of the fusion protein obtained in Example 2 and a control, albumin, lysozyme, or glutathione S-transferase, were dissolved in 0.1 ml of physiological saline and intravenously administered to the NFS / sld mice after one week. Eight weeks after the administration, necropsy was performed. The degree of lesion was determined by the method of White & Casarett [Journal of Immunology, Vol. 112, 178 (197
4)]. Table 1 shows the results
Shown in As a result, in the group to which the α-fodrin fragment protein-glutathione S-transferase fusion protein was administered, the degree of lesion was clearly reduced in any of the submandibular gland, parotid gland, and lacrimal gland. In addition, no pathological changes were found in other organs.

【表１】 上記の表１は、無処理（Untreated）、グルタチオン S-
トランスフェラーゼ・α-フォドリン断片蛋白質融合蛋
白質（α-fodorin）、アルブミン（albumin）、リゾチ
ーム（lysozyme）、グルタチオンS-トランスフェラーゼ
（Control）を用いたそれぞれのシェーグレン症候群症
状改善効果の結果を示す。[Table 1] Table 1 above shows untreated, glutathione S-
The results of the respective effects of improving Sjogren's syndrome using transferase / α-fodrin fragment protein fusion protein (α-fodorin), albumin (albumin), lysozyme (lysozyme), and glutathione S-transferase (Control) are shown.

【００３０】実施例５ α-フォドリン蛋白質のカルパ
インによる分解 自体公知の方法で精製したマウスα-フォドリン蛋白質
３μｇを５０ｍｇ 塩酸イミダゾール（ｐＨ７．２），
５ｍＭ システインおよび１ｍＭ塩化カルシウムに懸濁
し、０．５Ｕマウスカルパイン（シグマ社製）を用いて
３７℃で６０分間処理した。その後、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分離し、シェーグレン症候群
発症マウス抗体血清を用いてウエスタンブロットを行っ
た（図８）。Example 5 Decomposition of α-fodrin protein by calpain 3 μg of mouse α-fodrin protein purified by a method known per se, 50 mg of imidazole hydrochloride (pH 7.2),
The suspension was suspended in 5 mM cysteine and 1 mM calcium chloride, and treated with 0.5 U mouse calpain (manufactured by Sigma) at 37 ° C. for 60 minutes. Thereafter, the cells were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and subjected to Western blotting using a serum antibody of a mouse with Sjogren's syndrome (FIG. 8).

【００３１】[0031]

【発明の効果】本発明のα-フォドリンまたはその断片
蛋白質の抗体は、自己免疫疾患の一つとして知られるシ
ェーグレン症候群の発症と同じくして見い出される。従
って、本発明の抗原蛋白質は、自己免疫疾患、特にシェ
ーグレン症候群の発症に関する診断薬として有効であ
る。また、本発明の抗原蛋白質は、これをシェーグレン
症候群のモデルマウスに投与することにより、病態の発
症を著明に抑制させたことから、自己免疫疾患、特にシ
ェーグレン症候群の予防・治療剤として有効である。EFFECTS OF THE INVENTION The antibody against α-fodrin or its fragment protein of the present invention is found at the same time as the onset of Sjogren's syndrome, which is known as one of the autoimmune diseases. Therefore, the antigenic protein of the present invention is effective as a diagnostic agent for the development of autoimmune diseases, particularly Sjogren's syndrome. In addition, the antigenic protein of the present invention, by administering it to a model mouse of Sjogren's syndrome, markedly suppressed the onset of the disease state, so that it is effective as a prophylactic / therapeutic agent for autoimmune diseases, particularly Sjogren's syndrome. is there.

【００３２】[0032]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド Arg Gln Lys Leu Glu Asp Ser Tyr Arg Phe Gln Phe Phe Gln Arg Asp Ala Glu Glu Leu SEQ ID NO: 1 Sequence length: 20 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Arg Gln Lys Leu Glu Asp Ser Tyr Arg Phe Gln Phe Phe Gln Arg Asp Ala Glu Glu Leu

【００３３】[0033]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 涙腺（Lacrimal.gl）および唾液腺（Salivar
y.gl）抽出物に見出されたシェーグレン発症NFS/sldマ
ウスの自己抗原の存在を示す電気泳動写真。１２０Ｋお
よび６０Ｋ（←でそれぞれ示す）以外に１６０Ｋおよび
２４０Ｋなど数種の自己抗原が存在する。FIG. 1. Lacrimal gland (Lacrimal.gl) and salivary gland (Salivar)
y.gl) Electrophoretic photographs showing the presence of autoantigens in Sjogren-developed NFS / sld mice found in extracts. In addition to 120K and 60K (indicated by ←), there are several kinds of autoantigens such as 160K and 240K.

【図２】 NFS/sldマウスから生後３日目に胸腺摘出を
行い、４週間後および１２週間後における自己抗原の存
在を示す電気泳動写真。４週間後の該マウスの血清を4w
eek、１２週間後の該マウスの血清を12week、シェーグ
レン症候群を発症していないBALB/cマウスの血清をBALB
/cで示す。FIG. 2 is an electrophoretic photograph showing the presence of autoantigen at 4 weeks and 12 weeks after thymectomy was performed on the third day after birth from an NFS / sld mouse. After 4 weeks, the serum of the mouse was
Week, the serum of the mouse after 12 weeks was used for 12 weeks, and the serum of BALB / c mice not developing Sjogren's syndrome was used for BALB.
Shown by / c.

【図３】 マウス唾液腺組織ホモジェネートのゲル濾過
クロマトグラフィーのチャートを示す（Gel filtratio
n）。回収したフラクションは斜線で示される。FIG. 3 shows a chart of gel filtration chromatography of mouse salivary gland tissue homogenate (Gel filtratio).
n). The collected fractions are indicated by diagonal lines.

【図４】 図３の斜線で示されるマウス唾液腺組織ホモ
ジェネートのゲル濾過クロマトグラフィーを行った後に
回収したフラクションおよびその前後のフラクションに
ついて、シェーグレン発症マウス（Disease）あるいは
非発症マウス（Normal）の血清を用いたウエスタンブロ
ットの結果を示す（Western blot）。FIG. 4 shows the fractions collected after gel filtration chromatography of the mouse salivary gland tissue homogenate shown by hatching in FIG. 3 and the fractions before and after the same, using the sera of Sjogren-developed mice (Disease) or non-developed mice (Normal). The result of the Western blot used is shown (Western blot).

【図５】 マウス唾液腺組織ホモジェネートをゲル濾過
クロマトグラフィーを行った後に回収したフラクション
を、イオン交換クロマトグラフィーに賦した際のチャー
トおよび回収したフラクション（斜線部分）とシェーグ
レン症候群発症マウス血清を用いたウエスタンブロット
法の結果を示す。FIG. 5 is a chart showing a fraction obtained by subjecting a mouse salivary gland tissue homogenate to gel filtration chromatography and subjecting the collected fraction to ion-exchange chromatography, a collected fraction (shaded portion), and a western blot using the serum of a mouse with Sjogren's syndrome. The results of the blot method are shown.

【図６】 実施例２で得られた融合蛋白質（A）とα-フ
ォドリン断片蛋白質（B）およびシェーグレン症候群発
症マウス血清（Disease）または非発症マウス血清（Nor
mal）を用いたウエスタンブロット法の結果を示す。FIG. 6 shows the fusion protein (A) and α-fodrin fragment protein (B) obtained in Example 2 and serum from mice with Sjogren's syndrome (Disease) or non-symptoms (Nor
2 shows the results of Western blotting using mal).

【図７】 実施例２で取得した融合蛋白質とシェーグレ
ン症候群を発症している患者の血清（Sjogren's syndro
me）、全身エリスマトーデスを発症している患者の血清
（SLE）、関節リュウマチを発症している患者の血清（R
A）または健常人（Normal）の血清を用いてウエスタン
ブロット法によるα-フォドリン断片蛋白質に対する自
己抗体の存在を調べた電気泳動写真を示す。FIG. 7 shows the fusion protein obtained in Example 2 and the serum of a patient with Sjogren's syndrome (Sjogren's syndro).
me), serum from patients with systemic erythematosus (SLE), serum from patients with rheumatoid arthritis (R
A) Electrophoretic photographs showing the presence of autoantibodies against α-fodrin fragment protein by Western blotting using serum of normal persons or normal persons.

【図８】 マウスα-フォドリン蛋白質のカルパインに
よる分解を未処理マウスα-フォドリン蛋白質（α-fodr
in)とマウスカルパイン処理後のα-フォドリン蛋白質
（calpain treated）を用いて調べた電気泳動写真
（Ａ）ならびにシェーグレン症候群発症マウス血清を用
いたウエスタン法の結果（Ｂ）を示す。FIG. 8 shows that the degradation of mouse α-fodrin protein by calpain was determined by using untreated mouse α-fodrin protein (α-fodr protein).
(A) shows the results of an electrophoresis photograph (A) examined using α-fodrin protein (calpain treated) after mouse calpain treatment, and the results of a Western method (B) using the serum of a mouse with Sjogren's syndrome.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｚ Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 16/18 33/564 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ // Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ ＡＢＬ 16/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C12P 21/02 G01N 33/564 Z C07K 14/47 ZNA G01N 33/53 16/18 33/564 A61K 37/02 ABA // C07K 14/47 ZNA ABL 16/18 C12N 15/00 A (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 15/09 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:19)

Claims (13)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】α-フォドリン、そのムテインあるいはそ
れらの断片蛋白質、またはそれらの塩を含んでなる医薬
組成物。1. A pharmaceutical composition comprising α-fodrin, its mutein or a fragment thereof, or a salt thereof. 【請求項２】α-フォドリン、そのムテインあるいはそ
れらの断片蛋白質、またはそれらの塩を含んでなる自己
免疫疾患予防・治療剤。2. A prophylactic / therapeutic agent for an autoimmune disease comprising α-fodrin, its mutein or a fragment thereof, or a salt thereof. 【請求項３】α-フォドリン、そのムテインあるいはそ
れらの断片蛋白質、またはそれらの塩を含んでなるシェ
ーグレン症候群予防・治療剤。3. A preventive / therapeutic agent for Sjögren's syndrome comprising α-fodrin, its mutein or a fragment thereof, or a salt thereof. 【請求項４】α-フォドリン、そのムテインあるいはそ
れらの断片蛋白質の分子量が２Ｋ〜２４０Ｋである請求
項３記載のシェーグレン症候群予防・治療剤。4. The preventive / therapeutic agent for Sjögren's syndrome according to claim 3, wherein the molecular weight of α-fodrin, its mutein or a fragment protein thereof is 2K to 240K. 【請求項５】α-フォドリン、そのムテインあるいはそ
れらの断片蛋白質が、式Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ
−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕで表されるアミノ酸配
列を含有する請求項３記載のシェーグレン症候群予防・
治療剤。5. An α-fodrin, its mutein or a fragment protein thereof having the formula Arg-Gln-Lys-Le.
u-Glu-Asp-Ser-Tyr-Arg-Phe
-Gln-Phe-Phe-Gln-Arg-Asp-
4. The method according to claim 3, which comprises an amino acid sequence represented by Ala-Glu-Glu-Leu.
Therapeutic agent. 【請求項６】α-フォドリン、そのムテインあるいはそ
れらの断片蛋白質の分子量が１００Ｋ〜１４０Ｋである
請求項５記載のシェーグレン症候群予防・治療剤。6. The preventive / therapeutic agent for Sjögren's syndrome according to claim 5, wherein the molecular weight of α-fodrin, its mutein or a fragment thereof is 100K to 140K. 【請求項７】α-フォドリン断片蛋白質がα-フォドリン
蛋白質を蛋白質分解酵素で分解した際生じる断片化α-
フォドリン蛋白質である請求項３記載のシェーグレン症
候群予防・治療剤。7. A fragmented α-fodrin fragment protein produced when an α-fodrin protein is digested with a protease.
The agent for preventing or treating Sjogren's syndrome according to claim 3, which is a fodrin protein. 【請求項８】α-フォドリン、そのムテインあるいはそ
れらの断片蛋白質、またはそれらの塩を含んでなる自己
免疫疾患診断薬。8. A diagnostic agent for an autoimmune disease comprising α-fodrin, its mutein or a fragment thereof, or a salt thereof. 【請求項９】α-フォドリン、そのムテインあるいはそ
れらの断片蛋白質、またはそれらの塩を含んでなるシェ
ーグレン症候群診断薬。9. A diagnostic agent for Sjögren's syndrome comprising α-fodrin, its mutein or a fragment thereof, or a salt thereof. 【請求項１０】α−フォドリン、そのムテインあるいは
それらの断片蛋白質の分子量が２Ｋ〜２４０Ｋである請
求項９記載のシェーグレン症候群診断薬。10. The diagnostic agent for Sjogren's syndrome according to claim 9, wherein the molecular weight of α-fodrin, its mutein or a fragment thereof is 2K to 240K. 【請求項１１】α-フォドリン、そのムテインあるいは
それらの断片蛋白質が、式Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕで表されるアミノ酸
配列を含有する請求項９記載のシェーグレン症候群診断
薬。11. An α-fodrin, a mutein thereof or a fragment protein thereof having the formula Arg-Gln-Lys-L
eu-Glu-Asp-Ser-Tyr-Arg-Ph
e-Gln-Phe-Phe-Gln-Arg-Asp
The diagnostic agent for Sjögren's syndrome according to claim 9, which comprises an amino acid sequence represented by -Ala-Glu-Glu-Leu. 【請求項１２】α-フォドリン、そのムテインあるいは
それらの断片蛋白質の分子量が１００Ｋ〜１４０Ｋであ
る請求項１１記載のシェーグレン症候群診断薬。12. The diagnostic agent for Sjogren's syndrome according to claim 11, wherein the molecular weight of α-fodrin, its mutein, or a fragment thereof is 100K to 140K. 【請求項１３】α-フォドリン、そのムテインあるいは
それらの断片蛋白質、またはそれらの塩を、α-フォド
リン、そのムテインあるいはそれらの断片蛋白質、また
はそれらの塩に対する抗体に接触させることを特徴とす
る該抗体の検出・定量方法。 【０００１】13. A method comprising contacting α-fodrin, a mutein or a fragment thereof, or a salt thereof with an antibody against α-fodrin, a mutein, a fragment thereof, or a salt thereof. Antibody detection and quantification method. [0001]
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003507742A (en) * 1999-08-20 2003-02-25 オルゲンテック ディアグノスティカ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Diagnosis of Sjogren's syndrome
WO2003000718A3 (en) * 2001-06-22 2003-08-21 Yoshio Hayashi Polypeptides comprising t cell epitopes from alpha-fodrin and the uses thereof in treatment of sjögren's syndrome
WO2007043103A1 (en) * 2005-09-30 2007-04-19 Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. Method of diagnosing sjoegren’s syndrome and diagnosis kit

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