JPH10248582A - New membrane seven-transmembrane type receptor protein jeg18 - Google Patents
New membrane seven-transmembrane type receptor protein jeg18Info
- Publication number
- JPH10248582A JPH10248582A JP9076494A JP7649497A JPH10248582A JP H10248582 A JPH10248582 A JP H10248582A JP 9076494 A JP9076494 A JP 9076494A JP 7649497 A JP7649497 A JP 7649497A JP H10248582 A JPH10248582 A JP H10248582A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- jeg18
- receptor protein
- transmembrane receptor
- salt
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、白血球に発現する
新規な７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８、それを構
成している部分ペプチドまたはこれらの塩に関する。ま
た、本発明は、前記７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１
８、それを構成している部分ペプチドをコードする核酸
あるいはその誘導体に関する。さらに、本発明は、この
核酸を用いて遺伝子操作により７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８を発現させる７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ１８の製造方法、及びそれに使用される発現ベクタ
ー及び形質転換体に関する。また、さらに本発明は、７
回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を用いて、この蛋白
質に対するリガンドを決定する方法、この蛋白質との結
合を阻害する化合物をスクリーニングする方法あるいは
この蛋白質に対する抗体に関する。本発明では、７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を用いて白血球の機能を
抑制する医薬品を開発することができる。[0001] The present invention relates to a novel seven-transmembrane receptor protein JEG18 expressed on leukocytes, a partial peptide constituting the protein, or a salt thereof. Further, the present invention provides the above seven-transmembrane receptor protein JEG1.
8. The present invention relates to a nucleic acid encoding a partial peptide constituting the nucleic acid or a derivative thereof. Furthermore, the present invention provides a seven-transmembrane receptor protein J expressing the seven-transmembrane receptor protein JEG18 by genetic manipulation using this nucleic acid.
The present invention relates to a method for producing EG18, and an expression vector and a transformant used therein. In addition, the present invention further provides:
The present invention relates to a method for determining a ligand for this protein using a transmembrane receptor protein JEG18, a method for screening for a compound that inhibits binding to this protein, or an antibody against this protein. In the present invention, a drug capable of suppressing the function of leukocytes can be developed using the seven-transmembrane receptor protein JEG18.
【０００２】[0002]
【従来の技術】白血球は血液細胞の一種であり、免疫・
炎症の種々の機能を司る。特に、感染の際には、種々の
有益な免疫・炎症反応のメカニズムによって、生体を防
御する（麻生芳郎 訳、一目でわかる免疫学、メディカ
ル・サイエンス・インターナショナル発行、48-61,1933
年) 。しかし、その一方で自己免疫など望ましくない免
疫・炎症作用をも引き起こす（麻生芳郎 訳、一目でわ
かる免疫学、メディカル・サイエンス・インターナショ
ナル発行、62-73,1993年) 。従って、白血球の機能を制
御する方法を得ることによって、有益な免疫応答を引き
起こし、感染や腫瘍の治癒をもたらしたり、あるいは有
害な免疫応答を減退させることにより、自己免疫性疾患
などを治療したりすることが可能になると予想される。2. Description of the Related Art Leukocytes are a type of blood cells,
Controls various functions of inflammation. In particular, during infection, the body is protected by various beneficial mechanisms of immune and inflammatory reactions (translated by Yoshio Aso, immunology at a glance, published by Medical Science International, 48-61,1933).
Year) . However, it also causes undesirable immunity and inflammatory effects such as autoimmunity (translated by Yoshio Aso, at-a-glance immunology, published by Medical Science International, 62-73, 1993). Therefore, obtaining a method to control the function of leukocytes can provoke a beneficial immune response, lead to healing of infections and tumors, or treat autoimmune diseases, etc., by reducing harmful immune responses. Is expected to be possible.
【０００３】白血球の機能、すなわち、その増殖、分
化、活性化、化学遊走等は白血球に発現している様々な
受容体蛋白質によって制御されている。受容体とは、細
胞表面に存在し、他の細胞の表面や体液中に存在するシ
グナル分子と高い親和性で結合するものである。そして
その結合という細胞外の出来事を細胞内シグナルに変換
して細胞の応答を引き起こす（中村桂子・松原健一監
修、細胞の分子生物学（第２版）、教育社、693,1990
年) 。従って、これらの受容体の機能を変化させるも
の、すなわちその受容体と結合して刺激するものや、受
容体と結合して刺激を遮るもの、その刺激が細胞内に伝
達されることを阻害するものを得ることができれば、白
血球の機能を正や負に制御し、さらには、白血球の機能
の不足や過剰に起因する疾患の治療に役立つ物質を得ら
れることが予想される。[0003] The functions of leukocytes, that is, their proliferation, differentiation, activation, chemotaxis and the like are controlled by various receptor proteins expressed in leukocytes. Receptors exist on the cell surface and bind with high affinity to signal molecules present on the surface of other cells or in body fluids. Then, the extracellular event of the binding is converted into an intracellular signal to cause the cell to respond (supervised by Keiko Nakamura and Kenichi Matsubara, Molecular Biology of Cell (2nd edition), Kyoikusha, 693, 1990)
Year) . Therefore, those that change the function of these receptors, that is, those that bind to and stimulate the receptor, those that bind to the receptor and block the stimulation, and inhibit the stimulation from being transmitted into cells It is anticipated that if a product can be obtained, a substance that controls the function of white blood cells to be positive or negative and that is useful for treating a disease caused by insufficient or excessive function of white blood cells can be obtained.
【０００４】白血球の受容体としては、サイトカイン受
容体ファミリー、ＥＧＦ (Epidermal Growth Factor)
受容体ファミリー、７回膜貫通型受容体ファミリーなど
種々の受容体蛋白質が知られており(The Leucocyte Ant
igen FactsBook、アカデミックプレス、38-49,1993年)
、その機能は多岐にわたっている。７回膜貫通型受容
体蛋白質ファミリーは、このような受容体ファミリーの
一つであり、Ｇ蛋白質共役型受容体(G-protein coupled
receptor)、ロドプシン型受容体などとも呼ばれる。白
血球における７回膜貫通型受容体蛋白質の研究は比較的
新しく開始されており、いまだ数多くの未知の７回膜貫
通型受容体蛋白質が存在すると考えられている。[0004] Leukocyte receptors include cytokine receptor family, EGF (Epidermal Growth Factor).
Various receptor proteins such as the receptor family and the seven-transmembrane receptor family are known (The Leucocyte Ant
(igen FactsBook, Academic Press, 38-49, 1993)
, Its functions are diverse. The seven-transmembrane receptor protein family is one such family of receptors, and is a G-protein coupled receptor.
receptor) and rhodopsin-type receptor. The study of seven transmembrane receptor proteins in leukocytes has been relatively new and it is believed that there are still many unknown seven transmembrane receptor proteins.
【０００５】現在までに白血球に存在する７回膜貫通型
受容体蛋白質として同定されたものとしては、アナフィ
ラトキシンと結合する受容体群、ケモカインと結合する
受容体群、ＰＡＦ（血小板活性化因子）と結合する受容
体などがある。例えば、アナフィラトキシンの受容体
は、好中球やマクロファージの機能、例えば、活性酸素
の産生、化学遊走、細胞接着の活性化に関与している
(Bouley,F.ら、 Biochemistry 30, 2993-2999,1991年)
。ケモカインと結合する受容体群の一つ、マウスのＩ
Ｌ―８（インターロイキン８）受容体ホモログの欠損マ
ウスでは、炎症誘導物質の腹腔内投与による好中球浸潤
が減少したと同時に好中球増加症、骨髄やリンパ節での
顆粒球、形質細胞の増加が観察された（飯笹久、松島綱
治、臨床免疫、28, 731-737,1996年) 。従って、これら
の７回膜貫通型受容体蛋白質は、白血球の増殖、分化、
活性化、化学遊走等を制御している。The seven transmembrane receptor proteins that have been identified so far in leukocytes include a group of receptors that bind to anaphylatoxin, a group of receptors that bind to chemokines, and PAF (platelet activating factor). There are receptors that bind to and the like. For example, anaphylatoxin receptors are involved in neutrophil and macrophage functions, such as active oxygen production, chemotaxis, and activation of cell adhesion
(Bouley, F. et al., Biochemistry 30, 2993-2999, 1991)
. One of a group of receptors that bind to chemokines, mouse I
In mice deficient in the L-8 (interleukin 8) receptor homolog, neutrophil infiltration due to intraperitoneal administration of an inflammation-inducing substance was reduced, as well as neutrophilia, granulocytes in bone marrow and lymph nodes, and plasma cells. (Hisashi Iizasa, Tsunaharu Matsushima, Clinical Immunity, 28, 731-737, 1996). Therefore, these seven transmembrane receptor proteins are responsible for leukocyte proliferation, differentiation,
Activation, chemical migration, etc. are controlled.
【０００６】これらの受容体に作用する化合物のうち、
疾患の治療剤として可能性があると考えられているもの
の中には、ＩＬ−８、ＭＣＰ１(Monocyte Chemotactic
Protein 1)のように受容体に結合して刺激するものや、
ＩＬ−８変異体のように受容体と結合して刺激を遮るも
のがある(Howard, O. M. Z. ら、TIBTECH,14, 46-51,19
96年）。[0006] Among the compounds acting on these receptors,
Among the potential therapeutic agents for diseases, IL-8, MCP1 (Monocyte Chemotactic
It stimulates by binding to receptors like Protein 1),
Some, such as IL-8 mutants, bind to receptors and block stimulation (Howard, OMZ et al., TIBTECH, 14, 46-51, 19).
96).
【０００７】７回膜貫通型受容体においては、多くの場
合、受容体とシグナル分子の関係は１対１対応に対応し
ているのではない。従って、疾患の治療を考えた場合に
はシグナル分子を知ることだけでは不十分である。例え
ば、セロトニンの場合には、セロトニンという単一のシ
グナル分子に対し、イオンチャンネル型受容体という全
く異なるシグナル伝達経路の受容体を含む１４種の受容
体が知られており、さらに、個々の受容体に特異的に結
合する化合物も知られており(1996 Receptor &Ion Chan
nel Nomenclature Supplement、Trends Phamacol. Sc
i.,1996年) 、それぞれ異なる疾患の治療への応用も考
えられている。また、ケモカイン群の場合には、単一の
シグナル分子が多数の受容体と反応すると同時に、単一
の受容体が多数のシグナル分子と反応する例も多く知ら
れている(C. A. Powerら、Trends Pharmacol. Sci. 17,
209-213, 1996年）。In the seven-transmembrane receptor, in many cases, the relationship between the receptor and the signal molecule does not correspond to one-to-one correspondence. Therefore, when considering treatment of a disease, it is not sufficient to know only a signal molecule. For example, in the case of serotonin, 14 kinds of receptors including a receptor of a completely different signal transduction pathway called an ionotropic receptor are known for a single signal molecule of serotonin. Compounds that specifically bind to the body are also known (1996 Receptor & Ion Chan
nel Nomenclature Supplement, Trends Phamacol. Sc
i., 1996), and application to treatment of different diseases is also considered. Also, in the case of chemokines, there are many known cases in which a single signal molecule reacts with many receptors and a single receptor reacts with many signal molecules (CA Power et al., Trends Pharmacol. Sci. 17,
209-213, 1996).
【０００８】従って、仮に単一のシグナル分子が疾患の
原因であるとしても、細胞の種類によって異なる受容体
が場合によっては複数存在し、疾患の原因である特定の
細胞群の機能を特異的に制御する場合には、その細胞に
作用するシグナル分子の特定よりもその細胞に発現して
いる受容体を特定することが重要となる。例えば、白血
球に作用するシグナル分子群ケモカイン群の場合、シグ
ナル分子ＲＡＮＴＥＳ(Regulated on Activation、Norm
al T expressed and secreted)に対しては種々の白血球
が反応するが、好酸球にはケモカイン受容体の一つＣＣ
Ｒ３が特異的に発現しており、好酸球を特異的に制御す
る方法を検索する際には受容体ＣＣＲ３が必要となる
(Howard, O. M. Z.ら、TIBTECH, 14, 46-51,1996
年）。[0008] Therefore, even if a single signal molecule is the cause of a disease, a plurality of receptors differing depending on the cell type may exist in some cases, and the function of a specific cell group causing the disease is specifically determined. When controlling, it is more important to specify the receptor expressed in the cell than to specify the signal molecule acting on the cell. For example, in the case of a signal molecule group chemokine group acting on leukocytes, the signal molecule RANTES (Regulated on Activation, Norm
al T expressed and secreted), eosinophils have one of the chemokine receptors CC.
R3 is specifically expressed and receptor CCR3 is required when searching for a method to specifically regulate eosinophils
(Howard, OMZ et al., TIBTECH, 14, 46-51, 1996
Year).
【０００９】現在に至るまで、白血球に作用するシグナ
ル分子のうち、例えばロイコトリエンＢ４および既知の
ケモカインのうちＰＦ４、ＨＣＣ１などの受容体につい
ては７回膜貫通型受容体蛋白質であると推定されている
ものの、受容体タンパク質は同定されていない(Premack
B. A.ら、Nature Medicine 2, 1174-1178, 1996年；Lo
etscher M. ら、J. Exp. Med. 184, 963-969, 1996
年）。特にケモカイン群については、さらに多くの新規
ケモカインが存在すると推定されており(Howard,O. M.
Z. ら、TIBTECH, 14, 46-51, 1996年) 、さらに多くの
受容体が存在することが期待される。以上のように、白
血球に作用する分子の受容体はすべて理解されたわけで
はなく、白血球にはさらに多くの７回膜貫通型受容体蛋
白質が存在し、かつ、それらの受容体の作用を変化させ
るものを得ることによって、白血球の機能を制御し、ひ
いては、疾患を制御する方法が得られると期待される。Up to the present, among the signal molecules acting on leukocytes, for example, leukotriene B4 and receptors such as PF4 and HCC1 among known chemokines are estimated to be seven-transmembrane receptor proteins. However, no receptor protein has been identified (Premack
BA et al., Nature Medicine 2, 1174-1178, 1996; Lo
etscher M. et al., J. Exp.Med. 184, 963-969, 1996.
Year). Particularly in the chemokine group, it is estimated that more new chemokines exist (Howard, OM
Z. et al., TIBTECH, 14, 46-51, 1996), it is expected that more receptors will be present. As described above, all the receptors of the molecules acting on leukocytes have not been understood, and leukocytes have more seven transmembrane receptor proteins and alter the actions of those receptors. It is hoped that obtaining them will provide a way to control the function of leukocytes and thus control disease.
【００１０】７回膜貫通型受容体蛋白質に作用する内因
性の物質は様々な受容体に対し様々な物質が知られてい
る。例えば、生理アミンであるグルタミン酸、ドーパミ
ンはそれぞれグルタミン酸受容体群、ドーパミン受容体
群に結合する。また、ペプチドである神経ペプチドＹ、
エンドセリンはそれぞれ神経ペプチドＹ受容体群、エン
ドセリン受容体群に結合する (Watson, S.および Steve
Arkinstall 著、TheG-protein linked receptor Facts
Book, Academic Press Inc., 1994 年) 。これらの中
には、ケモカイン群、ＰＡＦのように白血球に作用する
ことが知られているものとそうでないものがある。Various endogenous substances acting on the seven-transmembrane receptor protein are known for various receptors. For example, the physiological amines glutamate and dopamine bind to the glutamate receptor group and the dopamine receptor group, respectively. Further, a neuropeptide Y which is a peptide,
Endothelin binds to neuropeptide Y receptors and endothelin receptors, respectively (Watson, S. and Steve
Arkinstall, TheG-protein linked receptor Facts
Book, Academic Press Inc., 1994). Some of these are known to act on leukocytes, such as the chemokine group and PAF, while others are not.
【００１１】これらの７回膜貫通型受容体蛋白質を活性
化する物質は、天然・非天然を問わず、その物質と７回
膜貫通型受容体蛋白質、受容体を発現している細胞の３
者に依存して様々な細胞内シグナル分子の変動を引き起
こす。そのシグナル分子の変動は、例えば、細胞内ｃＡ
ＭＰ濃度の上昇・下降、イノシトールリン酸濃度の上
昇、細胞内カルシウム濃度の上昇、といった反応があり
(Watson, S.および Steve Arkinstall 著、The G-prot
ein linked receptor FactsBook, Academic Press In
c., 1994年）、そのそれぞれを測定する方法も開発され
ている。従って、これらの反応を測定することにより、
特定の物質が特定の７回膜貫通型受容体蛋白質を活性化
するかどうかあるいはその活性化を妨げるかどうかを判
断する事ができる。このような物質が７回膜貫通型受容
体蛋白質と結合して生じる、増殖・遺伝子発現の変動・
化学遊走などの生理学的な現象を観察する方法も知られ
ており、同じく、特定の物質が特定の７回膜貫通型受容
体蛋白質を活性化するかどうかあるいはその活性化を妨
げるかどうかを判断することができる。The substance that activates the seven-transmembrane receptor protein, whether natural or non-natural, may be the substance, the seven-transmembrane receptor protein, or a cell that expresses the receptor.
Causes various intracellular signaling molecules depending on the individual. The fluctuation of the signal molecule is, for example, the intracellular cA
There are reactions such as increasing / decreasing MP concentration, increasing inositol phosphate concentration, and increasing intracellular calcium concentration.
(Watson, S. and Steve Arkinstall, The G-prot
ein linked receptor FactsBook, Academic Press In
c., 1994), and methods for measuring each of them have been developed. Therefore, by measuring these reactions,
It can be determined whether a specific substance activates a specific seven-transmembrane receptor protein or prevents its activation. Such a substance binds to a seven-transmembrane receptor protein, resulting in growth, fluctuations in gene expression,
Methods for observing physiological phenomena such as chemotaxis are also known. Similarly, it is determined whether a specific substance activates a specific seven-transmembrane receptor protein or prevents its activation. can do.
【００１２】このように７回膜貫通型受容体蛋白質に作
用する物質の同定方法としては種々の方法が知られてお
り、これらの方法を利用するためには、７回膜貫通型受
容体蛋白質を同定することが肝要である。以上のことを
考えると、白血球の機能を制御し、疾患の制御を行うた
めには、これまで知られていない７回膜貫通型受容体を
取得することが大きな課題である。As described above, various methods are known for identifying a substance that acts on the seven-transmembrane receptor protein. In order to utilize these methods, the seven-transmembrane receptor protein must be identified. It is important to identify In view of the above, in order to control the function of leukocytes and control diseases, it is a major issue to obtain a seven-transmembrane receptor which has not been known so far.
【００１３】[0013]
【発明が解決しようとする課題】上記のように、白血球
の機能を制御し、疾患をコントロールする手法はいまだ
完成されていない。その最大の原因は、疾患と関連した
白血球の機能を制御している受容体蛋白質、特に７回膜
貫通型受容体蛋白質が同定されていない点にある。本発
明の課題は、新規な７回膜貫通型受容体蛋白質、またそ
の蛋白質をコードするｃＤＮＡ、その蛋白質の発現系、
この蛋白質の応用、さらにその蛋白質の抗体を提供する
ことにある。As described above, a method for controlling the function of leukocytes and controlling diseases has not yet been completed. The greatest cause is that a receptor protein that controls the function of leukocytes associated with the disease, particularly a seven-transmembrane receptor protein, has not been identified. An object of the present invention is to provide a novel seven-transmembrane receptor protein, a cDNA encoding the protein, an expression system for the protein,
An object of the present invention is to provide an application of the protein and an antibody of the protein.
【００１４】[0014]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、白血球に
新規７回膜貫通型受容体が存在することを予想し、これ
らが白血球の機能を制御する医薬品の探索に役立つと考
えた。そこで実際に白血球に発現している新規な７回膜
貫通型受容体蛋白質ｃＤＮＡを取得するために、Differ
ential Display法（例えば、Liang, P. ら、Curr. Bio
l. 7, 274-280,1995年）、ＲＤＡ法(Lisitsyn, N. ら、
Science 259, 946-951, 1993年) 、degenerative ＰＣ
Ｒ法(Innis M. A.ら、ＰＣＲ Protocols, pp39-53, 19
90年）など種々の方法を、種々のヒト組織、白血球、白
血球細胞株などを材料に検討した。特にdegenerative
ＰＣＲ法については、実施例１に示すプライマーを一例
とする２０種以上のプライマーを試験した。このような
鋭意努力の結果、白血球細胞株 Jurkat より、本発明の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のｃＤＮＡ断片を
取得した。そののち、そのｃＤＮＡコード領域全長を取
得し、それをコードする新規タンパク質の発現系を作成
し、さらにその抗体を作成することにより、本発明を完
成した。Means for Solving the Problems The present inventors anticipated the existence of a novel seven-transmembrane receptor in leukocytes, and thought that these would be useful in the search for drugs that control the function of leukocytes. In order to obtain a novel seven-transmembrane receptor protein cDNA actually expressed in leukocytes, Differ
ential Display method (eg, Liang, P. et al., Curr. Bio
l. 7, 274-280, 1995), RDA method (Lisitsyn, N. et al.,
Science 259, 946-951, 1993), degenerative PC
R method (Innis MA et al., PCR Protocols, pp39-53, 19
1990) using various human tissues, leukocytes, leukocyte cell lines, and the like as materials. Especially degenerative
As for the PCR method, 20 or more types of primers, for example, the primers shown in Example 1 were tested. As a result of such efforts, a cDNA fragment of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention was obtained from the leukocyte cell line Jurkat. Thereafter, the present invention was completed by obtaining the full length of the cDNA coding region, creating an expression system for a novel protein encoding the same, and further creating the antibody.
【００１５】すなわち、本発明は配列表配列番号１に記
載のアミノ酸配列を含有する７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ１８に関する。また、配列表配列番号１に記載の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードする核
酸、これら核酸群の中から選ばれる核酸と、宿主細胞中
で発現可能なベクター核酸とを連結してなる組み換えＤ
ＮＡ体ベクター、これら組み換えＤＮＡ体ベクターによ
り形質転換された７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
発現細胞、これらの細胞を培養し培養細胞から生産され
た化合物を採取する配列表配列番号１に記載のアミノ酸
配列を含有するポリペプチド（７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８）の製造方法に関する。また、本発明は、
この７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８に対するリガ
ンドのスクリーニング方法に関する。さらに、本発明
は、この７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を特異的
に認識する抗体に関する。That is, the present invention relates to a seven-transmembrane receptor protein JEG18 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. A nucleic acid encoding a polypeptide containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, a recombinant D obtained by linking a nucleic acid selected from these nucleic acid groups and a vector nucleic acid that can be expressed in a host cell.
NA-body vector, seven-transmembrane receptor protein JEG18 transformed with these recombinant DNA-body vectors
The present invention relates to a method for producing a polypeptide (seven-transmembrane receptor protein JEG18) containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in which expression cells are cultured and a compound produced from the cultured cells is collected from the cultured cells. Also, the present invention
The present invention relates to a method for screening a ligand for the seven-transmembrane receptor protein JEG18. Furthermore, the present invention relates to an antibody that specifically recognizes the seven-transmembrane receptor protein JEG18.
【００１６】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８のアミノ酸配列を、配列表配列番号１に示し、それ
らをコードするＤＮＡ配列を配列表配列番号２に示し
た。これらの配列をデータベース (Genbank リリース9
7.0、October,1996年) で比較したところ、これらは新
規な配列であった。また該７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ１８の部分ペプチドを免疫原として各々に対する抗
体（抗体を含有する抗血清も含む）を作製し、この７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の精製法を確立し、本
発明を完成した。The seven-transmembrane receptor protein JEG of the present invention
The amino acid sequence of 18 was shown in SEQ ID NO: 1, and the DNA sequence encoding them was shown in SEQ ID NO: 2. These sequences are stored in a database (Genbank release 9
7.0, October, 1996), these were novel sequences. The seven-transmembrane receptor protein J
Using the partial peptide of EG18 as an immunogen, an antibody (including an antiserum containing an antibody) was prepared for each, and a method for purifying the seven-transmembrane receptor protein JEG18 was established, thus completing the present invention.
【００１７】以下、本発明を詳細に説明する。配列表に
おいて、配列番号１のアミノ酸配列は、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のアミノ酸配列である。
また、配列番号２の配列は本発明の７回膜貫通型受容体
蛋白質ＪＥＧ１８の全アミノ酸配列及びそれをコードし
ているｃＤＮＡ配列であり、配列番号３の配列は本発明
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８に相補的なｃＤ
ＮＡ配列である。なお、配列表に記載されたアミノ酸配
列の左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下、Ｎ末
という）及びカルボキシル基末端（以下、Ｃ末という）
であり、また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ5'末端
及び3'末端である。Hereinafter, the present invention will be described in detail. In the sequence listing, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention.
The sequence of SEQ ID NO: 2 is the entire amino acid sequence of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention and the cDNA sequence encoding the same, and the sequence of SEQ ID NO: 3 is the seven-transmembrane receptor protein of the present invention. CD complementary to the receptor protein JEG18
This is an NA sequence. In addition, the left end and the right end of the amino acid sequence described in the sequence listing are amino terminal (hereinafter referred to as N-terminal) and carboxyl terminal (hereinafter referred to as C-terminal), respectively.
And the left and right ends of the base sequence are the 5 'end and the 3' end, respectively.
【００１８】また、図に関しては、図１は本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のNorthern 解析の結
果である。また、表に関しては、表１は本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８と既知の遺伝子とをアミ
ノ酸配列での相同性を比較したものである。Genetyx-Ma
c/CD ver.35. 0.0(Software Development Co.,Ltd.) を
用いて Swiss-Prot(リリース33.0、Feburuary 1996年)
をサーチしたのち、上位１０種について Genetyx-Mac(S
oftware Development Co.,Ltd.)ver.8.0を用いてアミノ
酸の同一度を計算させた結果である。表２は本発明の７
回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８と既知の遺伝子とを
ｃＤＮＡ配列での相同性を比較したものである。Genety
x-Mac(Software Development Co.,Ltd.)/CD ver.35. 0.
0 を用いて GenBank (リリース97.0、October, 1996
年) をサーチしたのち、上位２０種についてGenetyx-Ma
c ver.8.0 を用いてｃＤＮＡ配列の同一度を計算した結
果である。FIG. 1 shows the results of Northern analysis of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention. Table 1 compares the amino acid sequence homology between the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention and a known gene. Genetyx-Ma
Swiss-Prot using c / CD ver.35.0.0 (Software Development Co., Ltd.) (Release 33.0, February 1996)
After searching for Genetyx-Mac (S
This is the result of calculating the degree of amino acid identity using oftware Development Co., Ltd.) ver. Table 2 shows the results of 7 of the present invention.
This is a comparison of homology in cDNA sequence between the transmembrane receptor protein JEG18 and a known gene. Genety
x-Mac (Software Development Co., Ltd.) / CD ver.35.0.
GenBank (Release 97.0, October, 1996
Year), and Genetyx-Ma for the top 20 species
c This is the result of calculating the identity of cDNA sequences using ver. 8.0.
【００１９】また、本発明で述べられる遺伝子操作に必
要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検
討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組
換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡ
ライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通
常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前
記の通常の実験書としては、たとえば、 Molecular Clo
ning, A laborartorymanual, 1989年, Eds., Sambrook,
J., Fritsch, E. F.,and Maniatis,T., ColdSpring Ha
rbor Loboratory Press を挙げることができる。Further, preparation of cDNA required for the genetic manipulation described in the present invention, examination of expression by Northern blot, screening by hybridization, preparation of recombinant DNA, determination of DNA base sequence, cDNA
A series of molecular biology experiments, such as the preparation of a library, can be performed by the method described in an ordinary experiment manual. Examples of the ordinary test book include, for example, Molecular Clo
ning, A laborartorymanual, 1989, Eds., Sambrook,
J., Fritsch, EF, and Maniatis, T., ColdSpring Ha
rbor Loboratory Press.
【００２０】本発明のポリペプチドは、少なくとも配列
表配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有
するが、自然界で生じることが知られている生物種内変
異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点
変異による変異によって生じる改変体も、配列表配列番
号１のポリペプチドの性質を失わない限り配列表配列番
号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸
配列を含有するものとして本発明の新規化合物に含まれ
る。そのアミノ酸の改変、置換に関しては例えば Benne
ttらの特許出願(WO 96/2645)などに詳しく記載されてお
り、これらを参考にして作製することができ、これらの
方法によって改変、置換されたポリペプチドも本発明に
含まれる。Although the polypeptide of the present invention has at least a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, mutations such as intra-species mutations, allelic mutations and the like, which are known to occur in nature, and artificial mutations The variant produced by the point mutation that can be prepared in the above also contains an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 unless the properties of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 are lost. As such, they are included in the novel compounds of the present invention. For modification and substitution of the amino acid, see, for example, Benne
It is described in detail in the patent application of tt et al. (WO 96/2645) and the like, and can be prepared with reference to these. Polypeptides modified or substituted by these methods are also included in the present invention.
【００２１】配列表配列番号１のアミノ酸配列から予想
されることとして、糖鎖が付加される部分がある。Ｎ-
グリコシド結合の共通配列は、Asn-X-Ser/Thr であるこ
とが知られているが、配列番号１で４番目の Asn(Asn-T
yr-Thr) 及び、164 番目の Asn(Asn-Arg-Thr) がそれと
同等な配列を有しＮ−グリコシド修飾を受けている可能
性がある。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンの
Ｏ−グリコシド結合を推定する部分として、セリンまた
はスレオニン残基が頻出する部分が考えられる。これら
の糖鎖が付加されたタンパクの方がポリペプチドそのも
のよりも一般に生体内での分解に対して安定であり、ま
た強い生理活性を有していると考えられる。したがっ
て、配列番号１の配列を含有するポリペプチドのアミノ
酸配列の中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンやＮ−グ
ルコシドやＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖
鎖がＮ−グルコシドあるいはＯ−グルコシド結合してな
るポリペプチドも本発明に含まれる。As expected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, there is a portion to which a sugar chain is added. N-
It is known that the common sequence of the glycosidic bond is Asn-X-Ser / Thr, but the fourth Asn (Asn-T
yr-Thr) and Asn at position 164 (Asn-Arg-Thr) may have an equivalent sequence and may be N-glycoside modified. In addition, a portion where serine or threonine residues frequently appear may be considered as a portion for presuming the O-glycoside bond of N-acetyl-D-galactosamine. It is considered that the protein to which these sugar chains have been added is generally more stable to degradation in vivo than the polypeptide itself and has a strong physiological activity. Therefore, a sugar chain such as N-acetyl-D-glucosamine, N-glucoside or N-acetyl-D-galactosamine has an N-glucoside or O-glucoside bond in the amino acid sequence of the polypeptide containing the sequence of SEQ ID NO: 1. The present invention also includes a polypeptide comprising the polypeptide.
【００２２】また、実施例1, 2及び３に示すように、本
発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の天然のｃ
ＤＮＡ断片は白血病細胞 Jurkat およびその亜株 Jurka
t Z18に由来するｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡ
から取得された（亜株JurkatZ18は受託番号：ＦＥＲＭ
ＢＰ−５８６６として平成９年３月11日に日本国通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる) 。従って、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ１８のｍＲＮＡは白血球細胞に発現していることが
示された。また、実施例４に示したように本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の天然のｍＲＮＡは白
血球の多いと考えられるヒト組織、胸腺および脾臓に検
出された。従って、これらの材料を用いても、本発明の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の天然のｃＤＮＡ
を取得することができる。ｍＲＮＡは、細胞内のメカニ
ズムにより蛋白質へと翻訳されるので、白血球における
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の天然の
ｍＲＮＡの検出は７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
の発現と同等と考えられる。As shown in Examples 1, 2 and 3, the natural c-protein of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention
The DNA fragment was obtained from the leukemia cell Jurkat and its substrain Jurka.
cDNA library or cDNA derived from tZ18
(Sub-strain JurkatZ18 has accession number: FERM
BP-5866 was deposited on March 11, 1997, with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan.) Therefore, the seven-transmembrane receptor protein J of the present invention
EG18 mRNA was shown to be expressed in white blood cells. Further, as shown in Example 4, natural mRNA of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention was detected in human tissues, thymus and spleen, which are considered to be rich in leukocytes. Therefore, even if these materials are used, the natural cDNA of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention can be used.
Can be obtained. Since mRNA is translated into a protein by an intracellular mechanism, the detection of natural mRNA of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention in leukocytes can be performed by detecting the seven-transmembrane receptor protein JEG18.
Is considered to be equivalent to the expression of
【００２３】これら配列番号１で表されるアミノ酸配列
を含有する７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８または
その塩、または、その蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩は、診断を目的とした抗体の作成や、治療を目的とし
た医薬品の検索に有用である。配列番号１のアミノ酸配
列をデータベース(Swiss-Prot リリース33.0、Feburuar
y 1996、 GenBank リリース97.0、October 、1996) で比
較したところ、これらは新規な配列であった。該アミノ
酸配列を Kyte-Doolittle の方法(J. Mol.Biol.157:10
5, 1982) に従って、アミノ酸配列から疎水性部分、親
水性部分を解析した。その結果、本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ１８は細胞膜通過部分を７つ有する
細胞膜蛋白質として、細胞上に発現されることが明らか
となった。The seven-transmembrane receptor protein JEG18 containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a salt thereof, or a partial peptide of the protein or a salt thereof can be used for preparing an antibody for diagnostic purposes. It is useful for searching for therapeutic drugs. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is stored in a database (Swiss-Prot Release 33.0, February
y 1996, GenBank release 97.0, October, 1996), these were new sequences. The amino acid sequence was prepared according to the method of Kyte-Doolittle (J. Mol. Biol.
5, 1982), the hydrophobic portion and the hydrophilic portion were analyzed from the amino acid sequence. As a result, it was revealed that the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention was expressed on cells as a cell membrane protein having seven cell membrane transit portions.
【００２４】表１に本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ１８と上記データベースとの比較で類似度が高い
とされた、これまで知られている７回膜貫通型受容体蛋
白質の配列の相同性の比較を示した。本発明の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８は、既知のヒトおよびその
他のほ乳類の７回膜貫通型受容体蛋白質と30％程度の相
同性を示し、新規なヒト７回膜貫通型受容体蛋白質であ
ることが示された（表１）。既知の受容体の種間の相同
性は、例えば、アンジオテンシン受容体１ａの場合、ヒ
ト(Swiss-Prot Entry AG2R-Human) とラット(Swiss-Pro
t Entry AG22-Rat)間で90％を越える。従って、本発明
の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８はこれまでヒト
以外の種で知られている受容体蛋白質のヒトにおける対
応物ではないと考えられる。しかし、ほかの７回膜貫通
型受容体蛋白質との相同性が30％であり、本発明のペプ
チドＪＥＧ１８が７回膜貫通型受容体に属する蛋白質で
あることがこのことからも示された。これらの相同性か
ら期待される既知のリガンドとしては、例えば、アンジ
オテンシン、ブラディキニンなどの小ペプチドのホルモ
ンなどが挙げられる。Table 1 shows the sequences of known seven-transmembrane receptor proteins, which were determined to have a high degree of similarity by comparison of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention with the above database. A comparison of homology was shown. The seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention shows about 30% homology with known human and other mammalian seven-transmembrane receptor proteins, and is a novel human seven-transmembrane receptor. It was shown to be a protein (Table 1). The homology between the known receptor species is, for example, that for human angiotensin receptor 1a (Swiss-Prot Entry AG2R-Human) and rat (Swiss-Prot Entry AG2R-Human).
t Entry AG22-Rat) exceeds 90%. Therefore, it is considered that the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention is not a human counterpart of the receptor protein known so far in species other than human. However, the homology with other seven-transmembrane receptor proteins was 30%, indicating that the peptide JEG18 of the present invention belongs to the seven-transmembrane receptor. Known ligands expected from these homologies include, for example, small peptide hormones such as angiotensin and bradykinin.
【００２５】[0025]
【表１】 [Table 1]
【００２６】また、配列表配列番号１のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドをコードする本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質の天然のｃＤＮＡ配列については，配列表
配列番号２にアミノ酸配列とともに示した。これらの遺
伝子配列に関し、アミノ酸レベルの変異がなくとも、自
然界から分離した、染色体ＤＮＡ、またはｃＤＮＡにお
いて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコードす
るアミノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配列
が変異した例はしばしば認められる。また、5'非翻訳領
域及び3'非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸配列の規
定には関与しないので、それらの領域のＤＮＡ配列は変
異しやすい。このような変異や遺伝コードの縮重によっ
て得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれる。以
下、これらＤＮＡ群を本発明のＤＮＡとよぶ。The natural cDNA sequence of the seven-transmembrane receptor protein of the present invention encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2 of the Sequence Listing together with the amino acid sequence. . Regarding these gene sequences, even if there is no mutation at the amino acid level, the base sequence of the DNA can be changed in the chromosomal DNA or cDNA isolated from nature without changing the amino acid sequence encoded by the DNA due to the degeneracy of the genetic code. Mutated cases are often observed. In addition, since the 5 'untranslated region and the 3' untranslated region do not contribute to the definition of the amino acid sequence of the polypeptide, the DNA sequences of these regions are easily mutated. Nucleotide sequences obtained by such mutations and degeneracy of the genetic code are also included in the DNA of the present invention. Hereinafter, these DNAs are referred to as DNAs of the present invention.
【００２７】配列表配列番号１で表されるアミノ酸配列
と実質的に同等なポリペプチドをコードする本発明のＤ
ＮＡは、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
を製造する上で有用である。配列表配列番号２のＤＮＡ
配列をデータベース (GenBank リリース97.0、October,
1996)で比較したところ、これは新規な配列であった。
表２に配列番号２の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１
８のｃＤＮＡ配列とこれまで知られている７回膜貫通型
受容体蛋白質のｃＤＮＡの配列の相同性の比較を示し
た。本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のｃ
ＤＮＡは、既知のヒトおよびその他のほ乳類の受容体と
50％以下の相同性を示し、新規なヒトの７回膜貫通型受
容体蛋白質ｃＤＮＡであることが示された。既知の受容
体ｃＤＮＡの種間の相同性は、例えば、アンジオテンシ
ン受容体の場合、ヒト(GenBank Entry HSU20860)とラッ
ト(GenBank Entry S67465)間で８４％程度である。従っ
て、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８はｃ
ＤＮＡ配列からみてもこれまでヒト以外の種で知られて
いる受容体蛋白質のヒトにおける対応物ではないと考え
られる。また、他の遺伝子との相同性が50％以下である
ので、他の既知の遺伝子を用いて一般的に行われている
クロスハイブリダイセーションを用いたスクリーニング
でクローニングすることは困難であると考えられる。The D of the present invention encoding a polypeptide substantially equivalent to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
NA is the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention.
It is useful in manufacturing. DNA of Sequence Listing SEQ ID NO: 2
Sequences to database (GenBank release 97.0, October,
1996), which was a novel sequence.
Table 2 shows the seven-transmembrane receptor protein JEG1 of SEQ ID NO: 2.
The comparison of the homology between the cDNA sequence of No. 8 and the cDNA sequence of the previously known seven-transmembrane receptor protein was shown. C of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention
DNA interacts with known human and other mammalian receptors.
It showed a homology of 50% or less and was shown to be a novel human seven-transmembrane receptor protein cDNA. The homology between known receptor cDNA species is, for example, about 84% between human (GenBank Entry HSU20860) and rat (GenBank Entry S67465) in the case of angiotensin receptor. Therefore, the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention has c
From the viewpoint of the DNA sequence, it is considered that the receptor protein known so far in non-human species is not a human counterpart. In addition, since the homology with other genes is 50% or less, it is considered that cloning is difficult by general screening using cross-hybridization using other known genes. Can be
【００２８】[0028]
【表２】 [Table 2]
【００２９】実際に、クロスハイブリダイゼーションの
アプローチを用いた例も数多くあるが、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８はクローニングされてい
ない（例えば、Murphy, P. M. ら、Science 253, 1280-
1283、1991年；Combadiere C. ら、J. Biol. Chem. 27
0, 16491-16494, 1995 年）。実施例４に示すように、
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のｃＤＮ
Ａ配列の一部を用いて Northern 解析を行ったところ、
既知の受容体遺伝子と考えられる転写産物は検出されな
かった。また、実施例２に示すように、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のｃＤＮＡ配列の一部を
用いてｃＤＮＡライブラリースクリーニングを行ったと
ころ、既知の受容体遺伝子と考えられるクローンは検出
されなかった。このことから、実際に既知の遺伝子を用
いたクロスハイブリダイセーションを用いたスクリーニ
ングでクローニングすることは困難であることが示され
た。配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡは、
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を作成す
る上で、また、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥ
Ｇ１８の詳細な機能を検討する上で有用である。In fact, there are many examples using a cross-hybridization approach, but the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention has not been cloned (for example, Murphy, PM et al., Science 253, 1280-1280).
1283, 1991; Combadiere C. et al., J. Biol. Chem. 27
0, 16491-16494, 1995). As shown in Example 4,
CDN of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention
When Northern analysis was performed using a part of the A sequence,
Transcripts that were considered to be known receptor genes were not detected. Further, as shown in Example 2, when a cDNA library screening was performed using a part of the cDNA sequence of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention, a clone considered to be a known receptor gene was found to be Not detected. This indicated that it was difficult to actually clone by screening using cross-hybridization using a known gene. DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is
In preparing the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention, the seven-transmembrane receptor protein JE of the present invention was used.
This is useful in examining the detailed functions of G18.
【００３０】さらに、配列表配列番号２の遺伝子配列の
少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merから 16mer
以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及びその誘
導体、および／または、配列表配列番号３の遺伝子配列
の少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merから 16m
er以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及びその
誘導体、を用いれば、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８のｃＤＮＡクローン、ｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡ、ゲノム遺伝子クローンなどを検出することができ
る。必要な核酸の長さはその配列の特異性、検出しよう
としている核酸との結合の安定性によって異なるが、Ｄ
ＮＡを用いてＰＣＲによって検出する場合には、Ｔｍ
（２本鎖解離温度）が45℃以上であることが望ましい。
ＰＣＲのようにＤＮＡ同志が結合する場合には、一つの
ＧＣ結合を４度とし、一つのＡＴ結合を２度として合算
し、Ｔｍを推定することができる。従って、ＧＣコンテ
ントが高い場合には 12merの、一般的な50％ぐらいのＧ
Ｃコンテント領域で16mer の核酸が必要となる。よりＤ
ＮＡとの結合が安定な核酸誘導体を用いる場合にはさら
に短い核酸を用いて検出することが可能である。ハイブ
リダイゼーションによるｃＤＮＡクローンの検出の例
は、実施例２に示し、20mer 以上の核酸を用いたＰＣＲ
によるｃＤＮＡの検出の例を実施例３，５に示した。例
えば、遺伝子診断を目的としてこれらの遺伝子を調べる
方法として、配列表配列番号２および３の一部の遺伝子
配列を有する12mer から 16mer以上、さらに望ましくは
20mer以上の核酸、つまりＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれら
がメチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、ま
たはチオフォスフェート化された誘導体を用い、ハイブ
リダイゼーション、ＰＣＲ等の手法によって行うことが
あげられる。同様な方法でマウス等の他の生物の本発明
の遺伝子のホモログの検出や遺伝子クローニングができ
る。さらに、ヒトを含めたゲノム上の遺伝子のクローニ
ングも同様に可能である。従って、そのようにしてクロ
ーニングされたこれら遺伝子を用いれば、本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の更に詳細な機能も明
らかにすることが出来る。例えば、近年の遺伝子操作技
術を用いれば、トランスジェニックマウス、ジーンター
ゲッティングマウス、また、本発明の遺伝子と関連する
遺伝子を共に不活化したダブルノックアウトなどのあら
ゆる方法を用いることが出来る。また、本発明の遺伝子
のゲノム上の異常があれば、遺伝子診断、遺伝子治療へ
の応用も可能である。Further, a 12-mer to a 16-mer having at least a part of the gene sequence of SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing
More preferably, a nucleic acid of 20 mer or more, and a derivative thereof, and / or a 12 mer to 16 m having at least a part of the gene sequence of SEQ ID NO: 3
er or more, more preferably 20-mer or more nucleic acid, and its derivative, the cDNA clone, cDNA and genome D of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention can be used.
NA, genomic gene clone, etc. can be detected. The length of the required nucleic acid depends on the specificity of the sequence and the stability of binding to the nucleic acid to be detected.
When detection is performed by PCR using NA, Tm
(Double-chain dissociation temperature) is desirably 45 ° C or higher.
When DNAs bind to each other as in PCR, one GC bond is set to four times and one AT bond is set to two times, so that the Tm can be estimated. Therefore, when the GC content is high, the G of about 12% of the general 50%
A 16-mer nucleic acid is required in the C content region. More D
When a nucleic acid derivative having stable binding to NA is used, it is possible to detect using a shorter nucleic acid. An example of detection of a cDNA clone by hybridization is shown in Example 2, and PCR using a 20-mer or more nucleic acid is performed.
Examples 3 and 5 show examples of cDNA detection by the method described above. For example, as a method for examining these genes for the purpose of genetic diagnosis, a 12-mer to a 16-mer or more having a partial gene sequence of SEQ ID NOs: 2 and 3 in the Sequence Listing is more preferable.
Using a nucleic acid of 20 mer or more, that is, DNA, RNA, and a derivative in which they are methylated, methylphosphated, deaminated, or thiophosphated, are performed by a technique such as hybridization or PCR. In a similar manner, the homolog of the gene of the present invention in other organisms such as mice can be detected and the gene can be cloned. Furthermore, cloning of genes on the genome including humans is also possible. Therefore, by using these cloned genes, more detailed functions of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention can be clarified. For example, if a recent gene manipulation technique is used, all methods such as a transgenic mouse, a gene targeting mouse, and a double knockout in which the gene related to the gene of the present invention is inactivated can be used. Further, if there is a genomic abnormality of the gene of the present invention, application to gene diagnosis and gene therapy is also possible.
【００３１】配列表配列番号３の遺伝子配列の少なくと
も一部の遺伝子配列を有する 12merから 16mer以上、さ
らに望ましくは 20mer以上の核酸、及びその誘導体、を
コードするＤＮＡを用いれば、実施例４に示したように
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８ ｍＲＮ
Ａの検出が可能である。たとえば、診断を目的としてこ
れらの遺伝子の発現を調べる方法として、配列表配列番
号３の一部の遺伝子配列を有する 12merから 16mer以
上、さらに望ましくは 20mer以上の相補し得る核酸、つ
まりアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらがメチル
化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、またはチオ
フォスフェート化された誘導体すなわちアンチセンス核
酸を用い、ハイブリダイゼーション、プライマーエクス
テンション、ヌクレアーゼ・プロテクション・アッセイ
等の手法によって行うことが出来る。また、本発明の７
回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の更に詳細な機能を
明らかにすることを目的として、細胞や生体へのアンチ
センス核酸の投与も考えられる利用法である。本発明の
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の過剰な反応が病
態となっている疾患については、これらアンチセンス核
酸により遺伝子の発現を押さえることによって、治療を
行うことも可能である。また、アンチセンス核酸を適当
なベクターに組み込み、そのベクターを用いることも可
能である。これらアンチセンス核酸の作成例・使用例に
ついては Murray, J. A. H. 編、ANTISENSE RNA AND DN
A 、Wiley-Liss, Inc., 1992年、に詳しい。If a DNA encoding a nucleic acid of 12 mer to 16 mer or more, more preferably 20 mer or more, and a derivative thereof having at least a part of the gene sequence of SEQ ID NO: 3 is shown in Example 4, As described above, the seven-transmembrane receptor protein JEG18 mRN of the present invention
A can be detected. For example, as a method of examining the expression of these genes for the purpose of diagnosis, a complementary nucleic acid of 12 mer to 16 mer or more, more preferably 20 mer or more, having a partial gene sequence of SEQ ID NO: 3, that is, antisense DNA, Using RNA, and derivatives thereof in which the RNA is methylated, methylphosphated, deaminated, or thiophosphated, that is, an antisense nucleic acid, can be performed by a technique such as hybridization, primer extension, and nuclease protection assay. . In addition, 7 of the present invention
For the purpose of clarifying the more detailed function of the transmembrane receptor protein JEG18, administration of an antisense nucleic acid to a cell or a living body is also a possible use. For diseases in which an excessive reaction of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention is in a pathological state, treatment can be performed by suppressing gene expression with these antisense nucleic acids. It is also possible to incorporate an antisense nucleic acid into an appropriate vector and use that vector. For examples of the preparation and use of these antisense nucleic acids, see Murray, JAH, ANTISENSE RNA AND DN
A, Wiley-Liss, Inc., 1992.
【００３２】以上のように、配列表配列番号２の遺伝子
配列の少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merから
16mer以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及び
その誘導体、及び配列表配列番号３の遺伝子配列の少な
くとも一部の遺伝子配列を有する 12merから 16mer以
上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及びその誘導
体、は診断などに有用であり、配列表配列番号３の遺伝
子配列の少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merか
ら 16mer以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及
びその誘導体は診断、治療などに有用である。As described above, from a 12mer having at least a part of the gene sequence of SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing
16-mer or more, more preferably 20-mer or more nucleic acid, and a derivative thereof, and 12-mer to 16-mer or more, more preferably 20-mer or more nucleic acid, and a derivative thereof having a gene sequence of at least a part of the gene sequence of SEQ ID NO: 3, Is useful for diagnosis and the like, and a nucleic acid having at least a part of the gene sequence of SEQ ID NO: 3 to 12 mer to 16 mer or more, more preferably 20 mer or more, and derivatives thereof are useful for diagnosis, treatment and the like. .
【００３３】本発明の核酸を含有するベクターとして
は、例えば大腸菌由来の pBR322, pUC18, pUC19, pUC11
8, pUC119(いずれも日本国宝酒造社製）などが挙げられ
るが、その他のものであっても宿主内で複製増殖できる
ものであればいずれも用いることができる。実施例５に
ベクターとしてｐｃＤＮＡ３を、宿主として大腸菌を用
いた例を示した。また本発明のＤＮＡを含有するファー
ジベクターとしては、例えばλｇｔ10、λｇｔ11 (米国
Stratagene社製) などが挙げられるが、その他のもので
あっても宿主内で増殖できるものであれば用いることが
できる。このようにして、得られたベクターは適当な宿
主、例えばエシェリヒア(Escherichia) 属菌、バチルス
(Bacillus)属菌、などにカルシウムクロライド法等を用
いて導入し、本発明のＤＮＡを含有するベクターを保持
する形質転換体を作成することができる上記エシェリヒ
ア属菌の例としては、のエシェリヒア コリＫ12ＨＢ10
1 、ＭＣ1061、ＬＥ392 、ＪＭ109 などが挙げられる。
上記バチルス属菌の例としてはバチルス サチリスＭＩ
114 等が挙げられる。また、ファージベクターは、例え
ば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法 (Pr
oc. Natl. Acad. Sci., 71:2442-, 1978) を用いて導入
することができる。尚、本発明の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＪＥＧ１８の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
を含むプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＪＥＧ１８を大腸菌Ｄ
Ｈ５に遺伝子導入した形質転換細胞（実施例５）E.col
i：DH5-pJEG18は、日本国通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所に平成９年３月11日に受託番号：ＦＥ
ＲＭＢＰ−５８６５として寄託されている。Examples of the vector containing the nucleic acid of the present invention include, for example, pBR322, pUC18, pUC19, and pUC11 derived from Escherichia coli.
8, pUC119 (all manufactured by Japan National Treasure Shuzo Co., Ltd.) and the like, but any other materials can be used as long as they can be replicated and propagated in a host. Example 5 shows an example using pcDNA3 as a vector and Escherichia coli as a host. Phage vectors containing the DNA of the present invention include, for example, λgt10, λgt11 (US
Stratagene), etc., but any other one can be used as long as it can be propagated in the host. The vector thus obtained can be used in a suitable host, such as a bacterium of the genus Escherichia or Bacillus.
(Bacillus) genus, etc., by using the calcium chloride method or the like, and can be used to produce a transformant carrying the vector containing the DNA of the present invention. K12HB10
1, MC1061, LE392, JM109 and the like.
Examples of the Bacillus genus include Bacillus subtilis MI
114 and the like. In addition, a phage vector can be used, for example, by in vitro packaging (Pr
oc. Natl. Acad. Sci., 71: 2442-, 1978). CDNA encoding the entire amino acid sequence of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention
The plasmid pcDNA3-JEG18 containing
Transformed cells transfected with H5 (Example 5)
i: DH5-pJEG18 was received by the Research Institute of Biotechnology, Industrial Technology Institute of the Ministry of International Trade and Industry of Japan on March 11, 1997, accession number: FE
Deposited as RMBP-5865.
【００３４】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８をコードする塩基配列を有する核酸を含有するベク
ターは、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
をコードする塩基配列を有する核酸を製造する上で、ま
た、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の核
酸を保持する形質転換体を作成する上で有用である。上
記の方法にて作成した本発明の核酸を用いた７回膜貫通
型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の発現には、成書によって知
られている(Kriegler, Gene Transfer and Expression-
A Laboratory Manual Stockton Pres, 1990. および横
田ら、バイオマニュアルシリーズ４, 遺伝子導入と発現
・解析法, 羊土社、1994) 多数の方法が用いられる。す
なわち、分離した７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベク
ターにつなぎ、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞、バ
クテリアなどの原核細胞を宿主として生産させることが
できる。The seven-transmembrane receptor protein JEG of the present invention
The vector containing the nucleic acid having the nucleotide sequence encoding No. 18 is the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention.
It is useful for producing a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding, and for preparing a transformant which retains the nucleic acid of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention. Expression of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 using the nucleic acid of the present invention prepared by the above-mentioned method is known from Seisho (Kriegler, Gene Transfer and Expression-
A Laboratory Manual Stockton Pres, 1990. and Yokota et al., Biomanual Series 4, Gene Transfer and Expression / Analysis Methods, Yodosha, 1994) A number of methods are used. That is, the isolated seven-transmembrane receptor protein JEG18
The cDNA encoding the amino acid sequence of the above can be ligated to an appropriate expression vector to produce eukaryotic cells such as animal cells and insect cells and prokaryotic cells such as bacteria as hosts.
【００３５】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８を発現させる際に、本発明のポリペプチドをコード
する核酸はその5'末端に翻訳開始コドンを有し、また、
3'末端には翻訳終止コドンを有していてもよい。これら
の翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当な合成核酸ア
ダプターを用いて付加することもできる。更に該ＤＮＡ
を発現させるには上流にプロモーターを接続する。ベク
ターとしては上記の大腸菌由来プラスミド、枯草菌由来
プラスミド、酵母由来プラスミド、あるいはλファージ
などのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワク
シニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。The seven-transmembrane receptor protein JEG of the present invention
Upon expression of 18, the nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention has a translation initiation codon at its 5 'end,
The 3 'end may have a translation stop codon. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic nucleic acid adapter. Further, the DNA
Is connected to a promoter upstream. Examples of the vector include the aforementioned Escherichia coli-derived plasmid, Bacillus subtilis-derived plasmid, yeast-derived plasmid, bacteriophage such as λ phage, and animal viruses such as retrovirus and vaccinia virus.
【００３６】本発明に用いられるプロモーターとして
は、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー
ターであればいかなるものでもよい。形質転換する際の
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔａｃプロモー
ター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが
好ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１
プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、
宿主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰ
プロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿
主が原核細胞である場合には、プロモーターとともにリ
ボゾーム結合部位をもつことが好ましい。宿主が動物細
胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レト
ロウィルスのプロモーター、メタルチオネインプロモー
ター、ヒートショックプロモーターなどが利用できる。The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. When the host used for the transformation is Escherichia, a tac promoter, a trp promoter, a lac promoter or the like is preferable. When the host is a Bacillus, SPO1 is used.
Promoters, SPO2 promoters and the like are preferred,
When the host is yeast, PGK promoter, GAP
Promoters and ADH promoters are preferred. When the host is a prokaryotic cell, it preferably has a ribosome binding site together with a promoter. When the host is an animal cell, an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, a metal thionein promoter, a heat shock promoter and the like can be used.
【００３７】本発明のポリペプチドを発現させる時、配
列表配列番号１のアミノ酸配列と実質的に同等な蛋白質
をコードする核酸のみでもよいが、膜表面への発現を保
証する必要のある場合には、既知シグナルペプチドをコ
ードする核酸をＮ末に付加したり、産生されたポリペプ
チドの検出を容易にするための既知抗原エピトープをコ
ードする核酸を付加することで、特別の機能を付加した
蛋白質を生産させることもできる。このような技術の一
つの例として、Choe, H.ら、Cell, 85, 1135-1148, 199
6 年を挙げることができる。When expressing the polypeptide of the present invention, only a nucleic acid encoding a protein substantially equivalent to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing may be used, but it is necessary to guarantee expression on the membrane surface. Is a protein to which a special function has been added by adding a nucleic acid encoding a known signal peptide to the N-terminus or by adding a nucleic acid encoding a known antigen epitope for facilitating detection of the produced polypeptide. Can also be produced. One example of such a technique is described in Choe, H. et al., Cell, 85, 1135-1148, 199.
Six years can be mentioned.
【００３８】本発明者らは、実施例５に示したごとく、
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を発現する発現ベ
クターとして配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３(Invitro
gen 社）につなぎ、本発明のＤＮＡを含む発現ベクター
を作製した。このようにして構築された７回膜貫通型受
容体蛋白質ＪＥＧ１８をコードするＤＮＡを含有する発
現ベクターを用いて、本発明のＤＮＡを含むベクターを
保持する形質転換体を製造する。宿主としては例えばエ
シェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが
挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細胞である
ＣＯＳ−７、Vero細胞、チャイニーズハムスター細胞Ｃ
ＨＯ、カイコ細胞ＳＦ９などが挙げられる。As shown in Example 5, the present inventors
As an expression vector for expressing the seven-transmembrane receptor protein JEG18, a DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing is used as an expression vector pcDNA3 (Invitro
Gen.) to prepare an expression vector containing the DNA of the present invention. Using the thus constructed expression vector containing the DNA encoding the seven-transmembrane receptor protein JEG18, a transformant carrying the vector containing the DNA of the present invention is produced. Examples of the host include Escherichia, Bacillus, yeast, animal cells and the like. Examples of animal cells include monkey cells such as COS-7, Vero cells, and Chinese hamster cells C
HO and silkworm cell SF9.
【００３９】このようにして得られる本発明の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８をコードする塩基配列を有
する核酸を含有するベクターは、本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ１８を産生する上で有用である。実
施例６，７に示したごとく、上記の発現ベクターを遺伝
子導入し、７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８をＣＨ
Ｏ細胞、２９３細胞などで発現させ、これら発現プラス
ミドで形質転換された形質転換体が得られる。これらの
形質転換体は本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８を産生する上で有用である。本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ１８と実質的に同等な蛋白質をコー
ドする塩基配列を有する核酸を含有するベクターを保持
した形質転換体を作成し、それぞれ公知の方法により、
適当な培地中で適当な培養条件により培養することによ
って、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８ま
たはその塩を製造することができる。例えば実施例６の
ようにWestern blottingを用いたり、また、ＦＡＣＳに
よって検査することにより、７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ１８の生産を確認することができる。The thus obtained vector containing a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention produces the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention. Useful on As shown in Examples 6 and 7, the above-described expression vector was transfected, and the seven-transmembrane receptor protein JEG18 was converted to CH.
Transformants which are expressed in O cells, 293 cells and the like and transformed with these expression plasmids are obtained. These transformants are the seven-transmembrane receptor protein JEG of the present invention.
It is useful in producing 18. A transformant containing a vector containing a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a protein substantially equivalent to the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention was prepared, and each was prepared by a known method.
The seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention or a salt thereof can be produced by culturing in a suitable medium under suitable culture conditions. For example, the production of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 can be confirmed by using Western blotting as described in Example 6 or by performing an FACS test.
【００４０】このようにして作成した、本発明の７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８またはその塩を用いて、
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８のリガン
ドを決定することができる。そのためには、まず、リガ
ンド候補である試験化合物を、純化したまたは、未精製
の、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８と接
触させ、試験化合物の本発明の７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８に対する結合もしくはその結合により引き
起こされる反応を測定する。試験化合物の本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８に対する結合を測定す
る場合には、純化した、または、未精製の本発明の７回
膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８と試験化合物を接触さ
せ、複合体量および／または未結合の試験化合物量を測
定する。複合体量および／または未結合の試験化合物量
を測定する方法としては、例えば、放射性化合物や色素
などを用いて試験化合物を標識し、複合体と未結合の試
験化合物を分離し、標識を用いて複合体量および／また
は未結合の試験化合物量を測定する。この一つの例を実
施例７に示した。Using the thus-prepared seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention or a salt thereof,
The ligand of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention can be determined. For this purpose, first, a test compound which is a candidate ligand is contacted with a purified or unpurified seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention, and the test compound is subjected to the seven-transmembrane receptor of the present invention. The binding to the body protein JEG18 or the reaction caused by the binding is measured. When measuring the binding of the test compound to the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention, the purified or unpurified seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention is brought into contact with the test compound. , And / or the amount of unbound test compound. As a method for measuring the amount of the complex and / or the amount of the unbound test compound, for example, the test compound is labeled with a radioactive compound or a dye, the complex is separated from the unbound test compound, and the label is used. To determine the amount of complex and / or the amount of unbound test compound. One example of this is shown in Example 7.
【００４１】受容体と結合する化合物が知られている場
合には、その化合物を標識し、試験化合物が標識化合物
と競合するかどうかをもって、試験化合物の結合を測定
することもできる。これらの方法の例として、浅沼幹人
ら、実験医学 11, 22-29,1993 年に挙げられている方法
がある。そのほかにも、ＳＰＡ(Scintillation Proximi
ty Assay) のように複合体と未結合の試験化合物を分離
せずに測定する方法もある。When a compound that binds to the receptor is known, the compound can be labeled, and the binding of the test compound can be determined based on whether or not the test compound competes with the labeled compound. Examples of these methods include the method described in Mikito Asanuma et al., Experimental Medicine 11, 22-29, 1993. In addition, SPA (Scintillation Proximi
(Ty Assay) to measure the complex and unbound test compound without separating them.
【００４２】一方、試験化合物と本発明の７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ１８の結合によりひき起こされる反
応を測定する場合には、本発明の７回膜貫通型受容体蛋
白質ＪＥＧ１８の共役しているシグナル伝達系によって
様々な方法が考えられる。このような方法として、例え
ば唐木英明ら編、実験医学 7, pp26-109, 1989年のよう
に細胞内カルシウムを測定する方法、Samson, M.ら、Bi
ochem. 35, pp3362-3367, 1996年のようにマイクロフィ
ジオメーターを用いる方法、細胞内ｃＡＭＰの量を測定
する方法、などがある。リガンドとの結合によって引き
起こされる反応を測定する１つの例を実施例８に示し
た。これらＪＥＧ１８蛋白質もしくはその塩、または、
その部分ペプチドまたはその塩と試験化合物を接触させ
るＪＥＧ１８蛋白質に対するリガンドを決定する方法は
７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８に結合して白血球
細胞の反応を制御する、疾患の治療を行う物質を検索す
る上で有用である。On the other hand, when the reaction caused by the binding between the test compound and the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention is measured, the reaction is carried out by coupling the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention. Various methods can be considered depending on the signaling system used. As such a method, for example, a method for measuring intracellular calcium as described in Experimental Medicine 7, pp 26-109, 1989, edited by Hideaki Karaki et al., Samson, M. et al., Bi
ochem. 35, pp3362-3367, a method using a microphysiometer as in 1996, a method for measuring the amount of intracellular cAMP, and the like. One example of measuring the response caused by binding to a ligand is given in Example 8. These JEG18 proteins or salts thereof, or
A method for determining a ligand for the JEG18 protein, in which the test compound is brought into contact with the partial peptide or a salt thereof, searches for a substance that binds to the seven-transmembrane receptor protein JEG18, regulates the response of leukocyte cells, and treats a disease. It is useful in doing.
【００４３】さらに上記のようにして、リガンド、すな
わち、７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８に作用する
ものを発見した場合には、その作用の変化、すなわち、
その活性化を行ったり、活性化を阻害したりする物質を
検索することが可能である。そのことは、(i) ７回膜貫
通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８もしくはその塩またはその
部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触させた
場合と(ii)７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８もしく
はその塩またはその部分ペプチドもしくはその塩に、リ
ガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行
うことによって行うことができる。その一つの例を実施
例９に示した。この方法は、７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ１８に作用して白血球細胞の反応を制御する、疾
患の治療を行う物質を検索する上で有用である。Further, as described above, when a ligand, that is, a ligand that acts on the seven-transmembrane receptor protein JEG18, is found, the change in its action, that is,
It is possible to search for a substance that activates or inhibits activation. That is, (i) the case where the ligand is brought into contact with the seven-transmembrane receptor protein JEG18 or its salt or its partial peptide or its salt, and (ii) the seven-transmembrane receptor protein JEG18 or its salt. Alternatively, it can be performed by comparing with a case where a ligand and a test compound are brought into contact with a partial peptide thereof or a salt thereof. One example is shown in Example 9. This method is useful for searching for a substance that acts on the seven-transmembrane receptor protein JEG18 to control the response of white blood cells and that is used for treating a disease.
【００４４】７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を特
異的に認識する抗体は実施例１０に示したようにして作
製することができる。抗体を作製するためのペプチドの
長さは特に限定されないが、ＪＥＧ18蛋白質を特徴づけ
られる長さがあればよく、好ましくは６アミノ酸以上、
特に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いれぱよ
い。このペプチドをそのまま、またはＫＬＨ(keyhole-l
impet hemocyanin) やＢＳＡ(bovine serum albumin)と
いったキャリア蛋白質と架橋した後に必要に応じてアジ
ュバントと共に動物へ接種せしめ、その血清を回収する
ことでＪＥＧ18蛋白質を認識する抗体 (ポリクローナル
抗体) を含む抗血清を得ることができる。また、抗血清
より抗体を精製して使用することも可能である。接種す
る動物としては、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウ
ス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製には
ヒツジ、ウサギが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞
を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得る
ことも可能であるが、この場合にはマウスが好ましい。
また、配列番号１に示したアミノ酸の全長または６残基
以上、望ましくは８残基以上のアミノ酸配列をＧＳＴ
（グルタチオン Ｓ―トランスフェラーゼ）などと融合
させたものを精製して、または未精製のまま、抗原とし
て用いることもできる。成書(Antibodies a laboratory
manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Labo
ratory) に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニ
ング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を
用いて、細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によって
も作製することができる。このように作製された抗体は
本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の精製に
利用できる。An antibody that specifically recognizes the seven-transmembrane receptor protein JEG18 can be prepared as described in Example 10. The length of the peptide for preparing the antibody is not particularly limited, but may be any length that is characteristic of the JEG18 protein, and is preferably at least 6 amino acids,
Particularly preferably, a peptide having 8 or more amino acids may be used. This peptide can be used as is or KLH (keyhole-l
After cross-linking with a carrier protein such as impet hemocyanin) or BSA (bovine serum albumin), the animal is inoculated with an adjuvant, if necessary, and the serum is collected to obtain an antiserum containing an antibody (polyclonal antibody) that recognizes the JEG18 protein. Obtainable. It is also possible to purify the antibody from the antiserum before use. The animals to be inoculated include sheep, cows, goats, rabbits, mice, rats, and the like. Particularly, sheep and rabbits are preferable for preparing polyclonal antibodies. It is also possible to obtain a monoclonal antibody by a known method for producing a hybridoma cell. In this case, a mouse is preferable.
In addition, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has the full length or 6 or more residues, preferably 8 or more
(Glutathione S-transferase) and the like can be purified or used as an antigen without purification. Antibodies a laboratory
manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Labo
(Ratory), immunoglobulin genes isolated by the gene cloning method, etc., can also be used to produce recombinant antibodies expressed in cells. The antibody thus prepared can be used for purification of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention.
【００４５】また、実施例１０に示したこれらの７回膜
貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８を特異的に認識する抗体
を用いれば、本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８の検出、測定が可能であり、細胞の分化異常を伴う
疾患、例えば悪性腫瘍、ウイルス感染などの疾患の診断
薬として使用でき得る。また、実施例６に示すように、
この検出、測定には、Western Blotting, FACS (Fluore
scence Activated Cell Sorter) などを用いることがで
きる。ＦＡＣＳを用いた臨床診断の例は、例えば、天神
美夫ら編、フローサイトメトリーハンドブック、サイエ
ンスフォーラム社、1984年、の第４部 フローサイトメ
トリーの臨床医学への応用、に示されている。これら検
出、測定については、Western Blotting (Immunoblotti
ng) に関してはAntibodies laboratory manual, E.Harl
ow et al., Cold Spring HarborLaboratory, pp471-510
にその方法の詳細が、免疫沈降、免疫測定などに関し
ては、同書pp421-470, pp553-612にそれぞれ詳細が記さ
れている。ＦＡＣＳの際の細胞の染色については、高津
聖志、瀧伸介、免疫研究の基礎技術、羊土社、1995年、
pp16-61 に、ＦＡＣＳの操作については、天神美夫ら
編、フローサイトメトリーハンドブック、サイエンスフ
ォーラム社、1984年に詳細が示されている。Further, by using the antibody which specifically recognizes the seven-transmembrane receptor protein JEG18 shown in Example 10, the seven-transmembrane receptor protein JEG of the present invention can be used.
18 can be detected and measured, and can be used as a diagnostic agent for diseases associated with abnormal cell differentiation, for example, diseases such as malignant tumors and viral infections. Also, as shown in Example 6,
For this detection and measurement, Western Blotting, FACS (Fluore
scence Activated Cell Sorter) can be used. Examples of clinical diagnosis using FACS are shown, for example, in Part 4 of Flow Cytometry to Clinical Medicine, edited by Mio Tenjin et al., Flow Cytometry Handbook, Science Forum, 1984. For detection and measurement, see Western Blotting (Immunoblotti
ng) for Antibodies laboratory manual, E. Harl
ow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, pp471-510
For details of the method, immunoprecipitation, immunoassay and the like are described in detail in pp421-470 and pp553-612 of the same book, respectively. For the staining of cells during FACS, see Seiji Takatsu and Shinsuke Taki, Basic Techniques for Immunological Research, Yodosha, 1995,
pp16-61, FACS operation is described in detail in Flow Cytometry Handbook, Science Forum, 1984, edited by Mio Tenjin et al.
【００４６】以上のように、配列表配列番号１で表され
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す
ることを特徴とする７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１
８またはその塩、またはその部分ペプチドもしくはその
塩に対する抗体は本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ１８を発現している細胞を同定する上で有用であ
る。As described above, the seven-transmembrane receptor protein JEG1 containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
8 or a salt thereof, or a partial peptide or a salt thereof, is an antibody against the seven-transmembrane receptor protein J of the present invention.
It is useful for identifying cells expressing EG18.
【００４７】[0047]
【発明の実施の形態】以下に発明を実施する形態につい
て例を示すが、必ずしもこれらに限定されるものではな
い。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Embodiments of the present invention will be described below by way of example, but the present invention is not necessarily limited thereto.
【実施例１】新規７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８断片の取得 白血球細胞Jurkat E6-1 (ATCC TIB-152)はＡＴＣＣ(Ame
rican Type Cell Culture Collection) より入手し、Ｉ
Ｌ−２（インターロイキン２) 産生能の高い亜株をさら
に選択し、Jurkat Z18株と命名した。この細胞株は、前
述のように日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６６として
寄託されている。これを拡大培養して保存し実験に用い
た。細胞はセルバンカー（十慈化学工業（株))に１mlあ
たり約107 の濃度で懸濁し、液体窒素液漕にて凍結保存
した。通常の培養の際には、培地はＲＰＭＩ1640 (GIBC
OBRL Cat.No.22400-071) を用い、最終濃度10％のＦＢ
Ｓ (Fetal Bovine Serum;GIBCO BRL Cat.No.10099-141;
56℃20分間熱処理して非働化した）、100 分の１量の
Penicillin-Streptomycin溶液（大日本製薬（株)Cat.N
o.16-70D-49DN)を加えた。104 細胞／mlから105 細胞／
mlになるように細胞を加え、37℃、５％二酸化炭素、湿
度 100％で培養し、106 細胞／ml前後になった時点でピ
ペットでよく混合した後に新しい培地に植え替えた。Example 1 Acquisition of a Novel Seven Transmembrane Receptor Protein JEG18 Fragment Leukocyte Jurkat E6-1 (ATCC TIB-152) was obtained from ATCC (Ame
rican Type Cell Culture Collection)
A substrain having a high L-2 (interleukin 2) producing ability was further selected and named Jurkat Z18 strain. This cell line has been deposited with the Ministry of International Trade and Industry of Japan, as described above, under the accession number: FERM BP-5866 at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology. This was expanded, preserved, and used for experiments. The cells were suspended in a cell banker (Juji Chemical Industry Co., Ltd.) at a concentration of about 10 7 per ml and frozen and stored in a liquid nitrogen liquid tank. During normal culture, the medium was RPMI1640 (GIBC
OBRL Cat.No.22400-071), FB of final concentration 10%
S (Fetal Bovine Serum; GIBCO BRL Cat.No.10099-141;
Inactivated by heat treatment at 56 ° C for 20 minutes),
Penicillin-Streptomycin solution (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Cat.N
o.16-70D-49DN). 10 4 cells / ml to 10 5 cells / ml
The cells were added to a volume of 37 ml, cultured at 37 ° C., 5% carbon dioxide, and 100% humidity. When the concentration reached about 10 6 cells / ml, the cells were mixed well with a pipette and then replaced with a new medium.
【００４８】全体で約５×107 個の細胞を培養し、1000
rpm で15分の遠心(KS-8300型、久保田製作所、RS3000/6
型ローター）後、上清を吸引・廃棄し、ＰＢＳ (Phosph
ateBuffered Salts；大日本製薬（株) 製 Cat.No. 28-1
03-05) を30ml加え懸濁後、再度同じ条件で遠心した。
以下、Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia
Biotech 製) を用い、製造者のプロトコル (Rev.4. XY-
025-00-07)11〜14頁に従って(second column purificat
ion は行わなかった）、ｍＲＮＡを抽出した。エタノー
ル沈殿後、Molecular Cloning, A laborartory manual,
1989, Eds.,Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,
T.,Cold Spring Harbor Loboratory Press のE5、Spect
rophotometric Determination of the Amount of DNA o
rRNA に従って定量した。１μg の mＲＮＡを用い、Sup
erScript Choice System for cDNASynthesis(Life Tech
nologies製) を用いてｃＤＮＡ合成を行った。プロトコ
ル11〜17頁(Protocol １および２）に従い、oligo(dT)
プライマーを用いて２重鎖（ds）ＤＮＡを合成した。そ
の後、フェノール・クロロフォルム抽出、エタノール沈
殿後、40μl の滅菌水に溶解した（これをｃＤＮＡサン
プルと呼ぶ）。Culturing about 5 × 10 7 cells in total, 1000
Centrifuge for 15 minutes at rpm (KS-8300, Kubota Seisakusho, RS3000 / 6
After removing the supernatant, aspirate and discard the supernatant, and use PBS (Phosph
ateBuffered Salts; Cat.No. 28-1 manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
03-05) was added and suspended, and then centrifuged again under the same conditions.
Below, Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia
Biotech) and the manufacturer's protocol (Rev. 4.
025-00-07) (second column purificat)
ion was not performed), and mRNA was extracted. After ethanol precipitation, Molecular Cloning, A laborartory manual,
1989, Eds., Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis,
T., Cold Spring Harbor Loboratory Press E5, Spect
rophotometric Determination of the Amount of DNA o
Quantification was performed according to rRNA. Using 1 μg of mRNA, Sup
erScript Choice System for cDNA Synthesis (Life Tech
nologies). According to protocol pages 11 to 17 (Protocols 1 and 2), oligo (dT)
Duplex (ds) DNA was synthesized using the primers. Then, after phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, it was dissolved in 40 μl of sterile water (this is called cDNA sample).
【００４９】このｃＤＮＡサンプルのうち４μl を用い
てＰＣＲ (polymerase chain reaction)を行った。ＰＣ
ＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードR001A)を
用いた。酵素に添付のバッファーを５μl 、酵素に添付
の dNTP mixture 4μl と合成オリゴヌクレオチド A:
5'ATC TTA AGC TTG AAC CTI GCC ITI GC(GTA) GAC 、お
よび、合成オリゴヌクレオチド B: 5' CCC AAC GAA TTC
(AG)TA GAT (GC)A(AGCT) IGG (AG)TT IA(AGC) (AG)CA
、（かっこ内はその位置に複数の残基の混合物を反応
させたことを示し、Ｉはイノシンヌクレオチドを示す）
をそれぞれ 200 pmol を加え、最終容量50μl とした。PCR (polymerase chain reaction) was performed using 4 μl of this cDNA sample. PC
For R, Taq polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd., code R001A) was used. 5 μl of the buffer attached to the enzyme, 4 μl of the dNTP mixture attached to the enzyme, and synthetic oligonucleotide A:
5'ATC TTA AGC TTG AAC CTI GCC ITI GC (GTA) GAC and synthetic oligonucleotide B: 5 'CCC AAC GAA TTC
(AG) TA GAT (GC) A (AGCT) IGG (AG) TT IA (AGC) (AG) CA
, (In parentheses indicates that a mixture of residues was reacted at that position, and I indicates an inosine nucleotide)
Was added to each to give a final volume of 50 μl.
【００５０】この混合物を、TaKaRa PCR thermal Cycle
r 480 を用いて、95℃１分, 40℃２分, 72℃３分を５サ
イクル行ったのち、95℃１分, 50℃２分, 72℃３分を25
サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を1.5 ％アガロ
ース・ゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド
（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約
700bp のｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。こ
のバンドをゲルから切り出してSuprec01 (宝酒造社製)
で精製後、ＴＡ cloningキット (Invitorogen社製) を
用いてクローニングした。This mixture was subjected to TaKaRa PCR thermal Cycle
Five cycles of 95 ° C for 1 minute, 40 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes were performed using r480, and then 95 ° C for 1 minute, 50 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes for 25 cycles.
Cycled. A part of this PCR product was subjected to electrophoresis in 1.5% agarose gel, stained with ethidium bromide (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), and observed under ultraviolet light.
It was confirmed that 700 bp cDNA was amplified. Cut out this band from the gel and Suprec01 (Takara Shuzo)
After that, the clone was cloned using a TA cloning kit (manufactured by Invitorogen).
【００５１】すなわち、ベクターとして pCRII Vector
(Invitorogen 社製、以下pCRII という）を用い、ベク
ターと先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるように
混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(Invitorogen社
製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み
込まれたベクター pCRIIを大腸菌One Shot Competent C
ells (Invitrogen社製）に遺伝子導入し、アンピシリン
(Sigma社製）を50μg/ml含むＬ−Broth(宝酒造社製）半
固型培地のプレートに蒔き、12時間程度37℃に放置し、
現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシ
リンを含むＬ−Broth 液体培地２mlに植え付け、18時間
程度37℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニ
プレップ(Promega社製）を用いて添付の説明書に従って
プラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素 EcoRI
にて消化して、約 700bpのＤＮＡが切り出されてくるこ
とで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確
認されたクローンについて、組み込まれているｃＤＮＡ
の塩基配列決定を行った。That is, as a vector, pCRII Vector
(Invitorogen, hereinafter referred to as pCRII), the vector and the DNA were mixed at a molar ratio of 1: 3, and the DNA was incorporated into the vector with T4 DNA ligase (Invitorogen). . Escherichia coli One Shot Competent C
ells (Invitrogen) and transfected with ampicillin
(Sigma) was seeded on a plate of L-Broth (Takara Shuzo) semi-solid medium containing 50 μg / ml and left at 37 ° C. for about 12 hours.
The appearing colony was randomly selected, inoculated in 2 ml of L-Broth liquid medium containing the same concentration of ampicillin, cultured with shaking at 37 ° C. for about 18 hours, the cells were collected, and Wizard Mini Prep (manufactured by Promega) was collected. Using the restriction enzyme EcoRI.
Digestion was performed to confirm that the PCR product had been incorporated by cutting out a DNA of about 700 bp.
Was determined.
【００５２】挿入ｃＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ap
plied Biosystems社製の蛍光シークエンサーを用いて実
施した。シークエンスサンプルの調製はPRISM 、Ready
Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Appli
ed Biosystems 社製）を用いて行なった。0.5 ml容のマ
イクロチューブに9.5 μl の反応ストック液、4.0 μl
の0.8pmol/μl のＴ７プロモータープライマー(GIBCO B
RL社製）および 6.5μl の0.16μg/μl のシークエンス
用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、100 μl のミネラルオイ
ルを重層後、96℃30秒、55℃15秒および60℃４分を１サ
イクルとするＰＣＲ増幅反応を25サイクル行ない、４℃
で５分間保温した。反応後、80μl の滅菌精製水を加え
て撹拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・
クロロホルム抽出を行なった。 100μl の水層に10μl
の３Ｍ酢酸ナトリウム (pH5.2)および 300μl のエタノ
ールを加えて撹拌後、室温、14,000rpm にて15分間の遠
心を行ない沈殿を回収した。沈殿を75％エタノールで洗
浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス
用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μl の
10mMのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して90℃、２
分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。The nucleotide sequence of the inserted cDNA fragment was determined by Ap
This was performed using a fluorescent sequencer manufactured by plied Biosystems. Preparation of sequence samples is available from PRISM and Ready
Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Appli
ed Biosystems). 9.5 μl reaction stock, 4.0 μl in 0.5 ml microtube
0.8 pmol / μl T7 promoter primer (GIBCO B
RL) and 6.5 μl of 0.16 μg / μl sequencing template DNA were added, mixed, and overlaid with 100 μl of mineral oil. One cycle of 96 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 4 minutes was performed. 25 cycles of PCR amplification
For 5 minutes. After the reaction, add 80 μl of sterilized purified water, stir and centrifuge.
Chloroform extraction was performed. 10 μl in 100 μl aqueous layer
After adding 3M sodium acetate (pH 5.2) and 300 μl of ethanol and stirring, the mixture was centrifuged at room temperature at 14,000 rpm for 15 minutes to collect a precipitate. After the precipitate was washed with 75% ethanol, it was allowed to stand under vacuum for 2 minutes and dried to obtain a sample for sequencing. 4 μl of the sequence sample
Dissolve in formamide containing 10 mM EDTA, 90 ℃, 2
After denaturation for 5 minutes, the mixture was cooled in ice and subjected to a sequence.
【００５３】116 のクローンについてＤＮＡ配列決定を
行ったところ、２個のクローンが配列表配列番号２のＤ
ＮＡ配列の 303番目から1025番目に対応する配列を有し
ていた（両端のプライマーの配列を含む）。GenBank リ
リース97.0、October,1996のサーチの結果、この配列は
７回膜貫通型受容体群と類似していることが判明した
（以下、この断片をＪＥＧ(Jurkat Expressed G-protei
n coupled Receptor) 18断片とよぶ）。The DNA of 116 clones was subjected to DNA sequencing.
It had a sequence corresponding to positions 303 to 1025 of the NA sequence (including the sequences of the primers at both ends). A search for GenBank release 97.0, October, 1996 revealed that this sequence was similar to the seven transmembrane receptor group (hereinafter, this fragment was referred to as JEG (Jurkat Expressed G-protei).
n coupled Receptor) 18 fragments).
【００５４】[0054]
【実施例２】新規７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８Ｃ末端断片の
取得 Jurkat由来のｃＤＮＡライブラリー（CLONTECH社、コー
ドHL5 0086) からプラークハイブリダイゼーションにて
全長ｃＤＮＡを持ったクローンの検索を行った。106 個
相当のプラークをMolecular Cloning,A laborartory ma
nual,1989, Eds., Sambrook,J., Fritsch,E.F.,and Man
iatis,T., Cold Spring Harbor Loboratory Press の
2. 109-111 、Immobilization of bacteriophage λ pl
aques onnitrocellulose filters に従ってプレート
し、出現したプラークをナイロンフィルター(Hybond N
+ ; Amersham社製）に転写し、転写したナイロンフィル
ターをアルカリ処理（1.5M NaCl,0.5M NaOHを染み込ま
せた濾紙上に５分間放置）し、次いで中和処理 (0.5M N
aCl, 0.5MTris-HCl (pH7.5) を染み込ませた濾紙上に５
分間放置）を２回行い、次に２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳ
Ｃ溶液は 0.15M NaCl、15mMクエン酸 pH7.0) 中で５分
間、２度振とう洗浄し風乾した。その後、ＵＶクロスリ
ンカー（フナコシ社製、モデルＣＬー1000) を用いて、
このフィルターの紫外線照射を1200×160 マイクロジュ
ール/cm2で行った。このフィルターを用いて放射性同位
元素P32 にて標識されたヒト７回膜貫通型受容体蛋白質
遺伝子ＪＥＧ１８断片をプローブにしてハイブリダイゼ
ーションを行った。[Example 2] Novel seven-transmembrane receptor protein JEG18 C-terminal fragment
A clone having the full-length cDNA was searched for by plaque hybridization from a cDNA library obtained from Jurkat (CLONTECH, code HL50086). 10 6 plaques were removed by Molecular Cloning, A laborartory ma
nual, 1989, Eds., Sambrook, J., Fritsch, EF, and Man
iatis, T., Cold Spring Harbor Loboratory Press
2.109-111, Immobilization of bacteriophage λ pl
Plate according to aques onnitrocellulose filters, and filter the resulting plaques with nylon filters (Hybond N
+ ; Manufactured by Amersham), and the transferred nylon filter was subjected to an alkali treatment (left on a filter paper impregnated with 1.5 M NaCl and 0.5 M NaOH for 5 minutes), followed by a neutralization treatment (0.5 MN
aCl, 0.5 MTris-HCl (pH7.5) on filter paper impregnated with
2 minutes), then 2 × SSC solution (1 × SS
The solution C was washed by shaking twice in 0.15 M NaCl, 15 mM citric acid (pH 7.0) for 5 minutes and air-dried. Then, using a UV crosslinker (Model CL-1000, manufactured by Funakoshi),
The filter was irradiated with ultraviolet light at 1200 × 160 microjoules / cm 2 . Labeled human 7-transmembrane receptor protein gene JEG18 fragment at radioisotope P 32 using the filter hybridization was performed with the probe.
【００５５】放射性同位元素P32 にて標識されたＪＥＧ
１８断片プローブは以下のように作製した。すなわち、
ＪＥＧ１８断片が組み込まれたベクターpCRII より、制
限酵素EcoRI にてベクターより切り出し、0.8 ％アガロ
ース・ゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド
（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、こ
のバンドをゲルから切り出して Suprec 01（宝酒造社
製）を用いて精製した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラ
ベリングキット(Megaprime DNA labeling system：Amer
sham社製コードＲＰＮ1607）を用いて標識した。すなわ
ち、ＤＮＡ50ngにプライマー液５μl 、５×反応緩衝溶
液10μl 及び脱イオン水を加えて全量を43μl として沸
騰水浴を５分間行い、その後、α-P32-dCTP(アマーシャ
ム社製、コード AA 0005) ５μl 、及び Klenow 酵素溶
液２μl を加えて、37℃で10分間水浴し、放射標識した
ＪＥＧ１８断片を合成した。更にその後、セファデック
スカラム(Quick Spin Column Sephadex G-50: 独逸国ベ
ーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰水浴
をしたのち、２分間氷冷後使用した。JEG labeled with radioactive isotope P 32
The 18 fragment probe was prepared as follows. That is,
The vector pCRII in which the JEG18 fragment was incorporated was excised from the vector with the restriction enzyme EcoRI, subjected to electrophoresis in 0.8% agarose gel, stained with ethidium bromide (manufactured by Nippon Gene), and observed under ultraviolet light. This band was excised from the gel and purified using Suprec 01 (Takara Shuzo). A DNA labeling kit (Megaprime DNA labeling system: Amer
Labeling was performed using sham code RPN1607). That is, the primer solution 5 [mu] l to 50 ng, a boiling water bath for for 5 minutes added to bring the total amount to 5 × reaction buffer solution 10μl and deionized water as a 43 [mu] l, then, α-P 32 -dCTP (Amersham, code AA 0005) 5 [mu] l And Klenow enzyme solution (2 μl) were added thereto, followed by water bathing at 37 ° C. for 10 minutes to synthesize a radiolabeled JEG18 fragment. Further, after that, purification was carried out using a Sephadex column (Quick Spin Column Sephadex G-50: manufactured by Boehringer Mannheim, Germany), followed by a boiling water bath for 5 minutes, followed by ice cooling for 2 minutes before use.
【００５６】前述の方法にて作成したフィルターを、各
々の成分の最終濃度が６倍濃度のＳＳＣ溶液、５倍濃度
のデンハルト液（和光純薬社製）、0.5 ％ＳＤＳ（ドデ
シル硫酸ナトリウム、和光純薬社製）、及び 100μl/ml
の沸騰水浴により変性したサケ***ＤＮＡ(Sigma社製）
を含むハイブリダイゼーション液中に浸し、65℃にて２
時間振とうしたのち、前述の方法でP32 標識されたプロ
ーブをハイブリダイゼーション液に添加し、65℃にて16
時間振盪し、ハイブリダイゼーションを行った。The filter prepared by the above-described method was applied to an SSC solution having a final concentration of 6 times each component, a Denhardt solution having a 5 times concentration (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), a 0.5% SDS (sodium dodecyl sulfate, 100μl / ml
Salmon sperm DNA denatured by boiling water bath (Sigma)
Immersed in a hybridization solution containing
After shaking time, the addition of probes P 32 labeled by the method described above in a hybridization solution, 16 at 65 ° C.
After shaking for a time, hybridization was performed.
【００５７】次に、フィルターを0.1 ％ＳＤＳを含む、
各々の成分の最終濃度が２倍濃度のＳＳＣ溶液に浸し、
室温で３回洗浄後、さらに同溶液で室温15分洗浄した。
洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用し
て、−85℃でオートラジオグラフィーを行った。その結
果、強く露光された部分のクローンを拾い、再度プラー
クを蒔き直し前述の方法にてスクリーニングを行い、完
全に単独のクローンを分離した。Next, a filter containing 0.1% SDS was prepared.
Dipping the SSC solution at a final concentration of each component of 2 times,
After washing three times at room temperature, it was further washed with the same solution at room temperature for 15 minutes.
After the washing, the filter was subjected to autoradiography at -85 ° C using an intensifying screen. As a result, a strongly exposed clone was picked up, plaque was replated again, and screening was performed by the above-mentioned method, and a single clone was completely separated.
【００５８】単離されたファージクローンのうち３クロ
ーンを以降の遺伝子配列決定に供した。Molecular Clon
ing, A laborartory manual,1989,Eds., Sambrook,J.,
Fritsch,E.F., and Maniatis,T., Cold Spring Harbor
Loboratory Pressの2.70、の方法に従い、これらのすべ
てのクローンのファージを約109 pfu(plaque formingun
it)調製し、Wizard lambda preps (Promega) を用いて
ファージＤＮＡを精製し、制限酵素 NotI にて消化し、
同様に制限酵素 NotI で消化したプラスミド pBluescri
ptII SK(−) (Stratagene 社製）に組み込んだ。これら
のクローンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサー
により解析し、配列表配列番号２にあるＤＮＡ配列で 2
81番目のＧまで、アミノ酸配列で49番目のＬｙｓまで決
定した。Three of the isolated phage clones were subjected to subsequent gene sequencing. Molecular Clon
ing, A laborartory manual, 1989, Eds., Sambrook, J.,
Fritsch, EF, and Maniatis, T., Cold Spring Harbor
According to the method described in 2.70 of Loboratory Press, phage of all these clones were transferred to about 10 9 pfu (plaque forming
it) prepared, purified phage DNA using Wizard lambda preps (Promega), digested with restriction enzyme NotI,
Similarly, plasmid pBluescri digested with restriction enzyme NotI
It was incorporated into ptII SK (−) (Stratagene). The DNA sequences at both ends of these clones were analyzed using a DNA sequencer,
The determination was made up to the 81st G and up to the 49th Lys in the amino acid sequence.
【００５９】[0059]
【実施例３】ヒト７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８ｃＤＮＡの5'
RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 実施例１に示したようにして、白血球細胞JurkatのｍＲ
ＮＡを調製した。5'RACE system for Rapid Amplificat
ion of cDNA Ends, Version 2.0 (Gibco社製、コード:
18374-058)を用い、添付のプロトコール pp10-15に従っ
た。ＧＳＰ１には 5' GGT AGA AAC AGA ACA TGC AG 3'
(配列表配列番号３の 758番目のＧから 779番目のＧま
での20mer)、また GSP2 には 5' GTA AGT CAG CAA TGG
CTA AG 3'(配列表配列番号３の 848番目のＧから 867番
目のＧまでの20mer)の配列をもつ、化学合成ＤＮＡをプ
ライマーとして用いた。ＧＳＰ１プライマーを用い逆転
写酵素によりJurkat mRNA から１本鎖ｃＤＮＡを合成し
た後、ターミナルデオキシトランスフェラーゼによりポ
リＣを5'末端に付加したものを (以下、dC-tailedcDNA
とよぶ）以降のＰＣＲ (Polymerase chain Reaction)反
応に用いた。第１回目のＰＣＲ反応は脱イオン水 31.5
μl 、ＰＣＲ反応緩衝溶液（ベーリンガマンハイム社
製）５μl 、2.5mM ｄＮＴＰ溶液（宝酒造社製）４μl
、10μmol ＧＳＰ１プライマー２μl 、10μmol abrid
ged Anchorプライマー（ベーリンガマンハイム社製）
２μl 、dC-tailed cDNA 5μl 、High Fedelity Taq ポ
リメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を 0.5μl
加え、94℃で２分処理した後、94℃１分、55℃１分、72
℃２分を１サイクルとした反応を35サイクルを行った。
ＰＣＲ反応は、TaKaRa PCR thermal Cycler 480 を用い
て行った。Example 3 5 ′ of human seven-transmembrane receptor protein JEG18 cDNA
RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) As shown in Example 1, mR of leukocyte cells Jurkat
NA was prepared. 5'RACE system for Rapid Amplificat
ion of cDNA Ends, Version 2.0 (Gibco, code:
18374-058) and according to the attached protocol pp10-15. GSP1 has 5 'GGT AGA AAC AGA ACA TGC AG 3'
(20mer from G at position 758 to G at position 779 in SEQ ID NO: 3) and GSP2 contains 5 'GTA AGT CAG CAA TGG
A chemically synthesized DNA having a sequence of CTA AG 3 '(20 mer from G at position 848 to G at position 867 in SEQ ID NO: 3) was used as a primer. After synthesizing single-stranded cDNA from Jurkat mRNA by reverse transcriptase using GSP1 primer, poly C was added to the 5 ′ end by terminal deoxytransferase (hereinafter referred to as dC-tailed cDNA).
This was used for the subsequent PCR (Polymerase chain Reaction) reaction. The first PCR reaction was deionized water 31.5
μl, PCR reaction buffer solution (Boehringer Mannheim) 5 μl, 2.5 mM dNTP solution (Takara Shuzo) 4 μl
, 10 μmol GSP1 primer 2 μl, 10 μmol abrid
ged Anchor primer (Boehringer Mannheim)
2 μl, dC-tailed cDNA 5 μl, High Fedelity Taq polymerase (Boehringer Mannheim) 0.5 μl
In addition, after treating at 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C
The reaction was carried out for 35 cycles with 2 cycles of 1 minute at a temperature of 2 minutes.
The PCR reaction was performed using TaKaRa PCR thermal Cycler 480.
【００６０】この反応溶液５μl を用い、第２回目のＰ
ＣＲ反応は脱イオン水 31.5 μl 、ＰＣＲ反応緩衝溶液
（ベーリンガーマンハイム社製）５μl 、2.5mM mMｄＮ
ＴＰ溶液（宝酒造社製）４μl 、10μmol ＧＳＰ２プラ
イマー２μl 、10μmol ＡＵＡＰ プライマー（ベーリ
ンガーマンハイム社製）２μl 、High Fedelity Taqポ
リメラーゼ（ベーリンガーマンハイム社製)0.5μl を加
え、同様に94℃で２分処理した後、94℃１分、50℃１
分、72℃１分を１サイクルとした反応を34サイクルを行
い、最後に94℃１分、50℃１分、72℃７分の反応を行っ
た。ＰＣＲ反応により生成したＤＮＡを0.7 ％低融点ア
ガロース上の電気泳動で分離した後、ＤＮＡのバンドを
切り出し、GENE CleanII (バイオ101 社製、コード GL-
1131-05))のプロトコールに従いＤＮＡを精製した。こ
の精製ＤＮＡをＴＡクローニングｋｉｔ（米国、インビ
トロージェン社製、コード K2000-01)を用い、添付のプ
ロトコールに従って、ｐＣＲ2.1 ベクターに組み込ん
だ。これらのクローンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシー
クエンサーにより解析してヒト７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８とその遺伝子の全構造を決定した（配列表
配列番号１, 2, 3) 。Using 5 μl of this reaction solution, the second P
For the CR reaction, 31.5 μl of deionized water, 5 μl of a PCR reaction buffer (Boehringer Mannheim), 2.5 mM mM dN
After adding 4 μl of TP solution (Takara Shuzo), 2 μl of 10 μmol GSP2 primer, 2 μl of 10 μmol AUAP primer (Boehringer Mannheim), and 0.5 μl of High Fedelity Taq polymerase (Boehringer Mannheim), the mixture was similarly treated at 94 ° C. for 2 minutes. , 94 ° C for 1 minute, 50 ° C for 1 minute
The reaction was carried out for 34 cycles with 1 cycle at 72 ° C. and 1 minute at 72 ° C. Finally, the reaction was carried out at 94 ° C. for 1 minute, 50 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 7 minutes. After the DNA generated by the PCR reaction was separated by electrophoresis on a 0.7% low melting point agarose, the DNA band was cut out, and GENE CleanII (Bio 101, code GL-
The DNA was purified according to the protocol of 1131-05)). This purified DNA was incorporated into a pCR2.1 vector using a TA cloning kit (manufactured by Invitrogen, USA, code K2000-01) according to the attached protocol. The DNA sequences at both ends of these clones were analyzed with a DNA sequencer to determine the entire structure of the human seven-transmembrane receptor protein JEG18 and its gene (SEQ ID NOS: 1, 2, 3).
【００６１】[0061]
【実施例４】Northern 解析 実施例１, 2, 3で得られた白血球細胞 Jurkat E6-1細胞
株由来ヒト７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８の各臓
器における遺伝子発現を Northern で解析した。Multip
le Tissue Northern (MTN) Blots フィルター(CLONTEC
H 社製、コード＃ 7759-1 及び＃7760-1) を用い、５倍
濃度のＳＳＰＥ溶液（１倍濃度のＳＳＰＥ溶液は 0.15M
NaCl、10mM NaH2PO4、1mM EDTA、pH7.4)、10倍濃度の
デンハルト液（和光純薬社製）、２％ＳＤＳ（ドデシル
硫酸ナトリウム、和光純薬社製）、終濃度50％ホルムア
ミド（和光純薬社製）、及び 100μg/mlの沸騰水浴によ
り変性したサケ***ＤＮＡ(Sigma社製）を含むハイブリ
ダイゼーション液中に浸し、42℃にて２時間振とうした
のち、実施例２と同様の方法でP32 標識されたＪＥＧ１
８遺伝子断片プローブをハイブリダイゼーション液に添
加し、42℃にて16時間振盪し、ハイブリダイゼーション
を行った。Example 4 Northern Analysis The gene expression of the human seven-transmembrane receptor protein JEG18 derived from the Jurkat E6-1 cell line obtained in Examples 1, 2 and 3 in each organ was analyzed in Northern. Multip
le Tissue Northern (MTN) Blots filter (CLONTEC
H Co., Code # 7759-1 and # 7760-1) using a 5x SSPE solution (1x SSPE solution is 0.15M
NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, pH 7.4), 10-fold concentration of Denhardt's solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2% SDS (sodium dodecyl sulfate, manufactured by Wako Pure Chemical Industries), final concentration 50% formamide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Immersion in a hybridization solution containing denatured salmon sperm DNA (manufactured by Sigma) in a boiling water bath of 100 μg / ml, and shaking at 42 ° C. for 2 hours. in is P 32 labeled JEG1
Eight gene fragment probes were added to the hybridization solution, and shaken at 42 ° C. for 16 hours to perform hybridization.
【００６２】次に、フィルターを 0.1％ＳＤＳを含む、
各々の成分の最終濃度が２倍濃度のＳＳＣ溶液に浸し、
室温で３回洗浄後、さらに同溶液で室温15分洗浄した。
さらに、0.1 ％ＳＤＳを含む、各々の成分の最終濃度が
0.2倍濃度のＳＳＣ溶液で室温15分間洗浄を行った。洗
浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用して、
−85℃でオートラジオグラフィーを行った。図１に示す
ように、ＪＥＧ１８は、胸腺、脾臓に約 5-6kbのバンド
が認められた。小腸、末梢血でも弱いバンドが認められ
た。Next, a filter containing 0.1% SDS was prepared.
Dipping the SSC solution at a final concentration of each component of 2 times,
After washing three times at room temperature, it was further washed with the same solution at room temperature for 15 minutes.
In addition, the final concentration of each component, including 0.1% SDS, was
Washing was performed at room temperature for 15 minutes with a 0.2-fold concentration SSC solution. Use the intensifying screen to clean the filter after cleaning.
Autoradiography was performed at -85 ° C. As shown in FIG. 1, about 5-6 kb of JEG18 was observed in the thymus and spleen. Weak bands were also observed in the small intestine and peripheral blood.
【００６３】[0063]
【実施例５】７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８発現ベクターの作
製 白血球細胞Jurkat Z18株のｍＲＮＡ、１μg を用い、Su
perScript Choice System for ｃＤＮＡ Synthesis (Li
fe Technologies 、コード8090RT) を用いてｃＤＮＡ合
成を行った。製造者のプロトコル11ページから17ページ
(Protocol１および２）に従い、5'GCA TTT CAG GTC AC
A TTC AG3' (配列表配列番号３の11番目のＧから30番目
Ｇまでの20mer である) の配列を持つブライマーを用い
て１本鎖(ss)DNA を合成した。その後フェノール・クロ
ロフォルム抽出、エタノール沈殿後、40μl の滅菌水に
溶解した (これをｃＤＮＡサンプルと呼ぶ) 。このｃＤ
ＮＡサンプルのうち４μl を用いてＰＣＲ(polymerase
chain reaction) を行った。ＰＣＲはHigh Fidelity Ta
q ポリメラーゼ (ベーリンガーマンハイム社製）を用い
た。酵素に添付のバッファーを５μl 、2.5mM ｄＮＴＰ
mixture (宝酒造社製) ４μl と、オリゴヌクレオチド
Ａ：5' CGC GGA TCC CAT GCC TGC TAA TTA CAC GTG TA
C C3'(配列表配列番号２の137 番目のＣから161 番目の
Ｃの25残基の5'末端にスペーサー配列CGC と制限酵素Ba
mHI の酵素配列GGA TCCを加えたもの) 、およびオリゴ
ヌクレオチドＢ：5'TGC TCT AGA GCA TTA GCA TAA TTC
AGG TGT CAT G3'(配列表配列番号３の45番目のＧから66
番目のＣの22残基の5'末端にスペーサー配列TGC と制限
酵素XbaIの認識配列TCT AGA およびスペーサー配列GCA
を加えたもの）を、それぞれ20ピコモルを加え、最終容
量50μl とした。Example 5 Construction of a seven-transmembrane receptor protein JEG18 expression vector
Ltd. white blood cells Jurkat Z18 strain mRNA of, using a 1 [mu] g, Su
perScript Choice System for cDNA Synthesis (Li
cDNA synthesis was performed using fe Technologies, code 8090RT). Manufacturer's Protocol Pages 11-17
5'GCA TTT CAG GTC AC according to (Protocol1 and 2)
A single-stranded (ss) DNA was synthesized using a primer having a sequence of A TTC AG3 ′ (20 mer from the 11th G to the 30th G in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing). Then, after phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, it was dissolved in 40 μl of sterilized water (this is called a cDNA sample). This cD
PCR (polymerase) using 4 μl of NA sample
chain reaction). PCR is High Fidelity Ta
q Polymerase (Boehringer Mannheim) was used. 5 μl of the buffer attached to the enzyme, 2.5 mM dNTP
mixture (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and oligonucleotide A: 5 'CGC GGA TCC CAT GCC TGC TAA TTA CAC GTG TA
C C3 '(spacer sequence CGC and restriction enzyme Ba are added at the 5' end of 25 residues from 137th C to 161st C in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
mHI enzyme sequence GGA TCC) and oligonucleotide B: 5 'TGC TCT AGA GCA TTA GCA TAA TTC
AGG TGT CAT G3 '(from the 45th G of SEQ ID NO: 3 to 66
A spacer sequence TGC, a recognition sequence TCT AGA of the restriction enzyme XbaI and a spacer sequence GCA
) Were added in 20 pmol each to a final volume of 50 μl.
【００６４】この混合物を、TaKaRa PCR thermal Cycle
r 480 を用いて、95℃３分、55℃１分、72℃２分を１サ
イクル行ったのち、95℃１分、55℃１分、72℃２分を２
サイクル、94℃１分、65℃１分、72℃２分を24サイクル
行って、最後に94℃１分、65℃１分、72℃７分の反応を
行った。このＰＣＲ産物の一部を0.8 ％アガロース・ゲ
ル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド (日本ジ
ーン社製) にて染色後、紫外線下で観察し、約1000bpの
ｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。This mixture was subjected to TaKaRa PCR thermal Cycle
One cycle of 95 ° C for 3 minutes, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes was performed using r480, and then 95 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes for 2 cycles.
A cycle of 94 ° C. for 1 minute, 65 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes was performed 24 times, and finally a reaction was performed at 94 ° C. for 1 minute, 65 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 7 minutes. A part of this PCR product was subjected to electrophoresis in 0.8% agarose gel, stained with ethidium bromide (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), and observed under ultraviolet light to confirm that a cDNA of about 1000 bp was amplified. did.
【００６５】残りのＰＣＲ反応溶液を0.8 ％アガロース
ゲル上で分離し、目的とする遺伝子産物をゲルから切り
出し、GENE CleanIIを用いて、ＤＮＡの精製を行った。
この精製ＤＮＡをＴＡクローニングkit を用い、添付の
プロトコールに従って、ｐＣＲ2.1 ベクターに組み込ん
だ。これらのクローンを制限酵素BamHI 、XbaIで消化
し、電気泳動で約1000bpの断片と、ｐＣＲ2.1 ベクター
である約3.9kb の断片を生ずるクローンを選択した。こ
のクローンを制限酵素XbaI、及び制限酵素BamHIで消化
し、その反応液全量を0.8 ％低融点アガロース・ゲル中
で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド (日本ジーン
社製) にて染色後、紫外線下で観察し、約1000bpのＤＮ
Ａのバンドをゲルから切り出してGENE CleanIIで精製
後、ベクターpcＤＮＡ３にXbaI、BamHI サイトを用いて
クローニングした。ベクターpcＤＮＡ３は以下のように
調製した。５μg のベクターpcＤＮＡ３、５μl 、脱イ
オン水36μl 、制限酵素緩衝液 (NEB 社製）５μl 、制
限酵素XbaI、及び制限酵素BamHI 各々２μl を加え全量
を50μl として、37℃で１時間水浴した。この反応液全
量を0.8 ％低融点アガロース・ゲル中で電気泳動を行
い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色
液、紫外線下で観察し、約5.4kbpのＤＮＡのバンドをゲ
ルから切り出してGENE CleapIIで精製した。ベクターと
先のＤＮＡのモル比が１：３となるように混ぜ合わせ
て、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社製）にてベクター
にＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたpcＤＮＡ
３を大腸菌ＤＨ５ Competont Cells (東洋紡社製、コー
ドＤＮＡ-901) に遺伝子導入し、アンピシリン(Sigma社
製) を50μg/ml含むＬ−Broth(宝酒造社製) 半固型培地
のブレートに蒔き、12時間程度37℃に放置し、現れてき
たコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含
むＬ−Broth 液体培地２mlに植え付け、18時間程度37℃
で振盪培養し、菌体を回収し、ウイザードミニブレップ
(Promega社製) を用いて添付の説明書に従ってプラスミ
ドを分離し、このプラスミドを制限酵素XbaI、BamHI に
て消化して、約1000bpのＤＮＡが切り出されたクローン
について、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行
った。The remaining PCR reaction solution was separated on a 0.8% agarose gel, the target gene product was cut out of the gel, and the DNA was purified using GENE Clean II.
This purified DNA was incorporated into a pCR2.1 vector using a TA cloning kit according to the attached protocol. These clones were digested with restriction enzymes BamHI and XbaI, and clones which yielded a fragment of about 1000 bp by electrophoresis and a fragment of about 3.9 kb which is a pCR2.1 vector were selected. This clone is digested with restriction enzymes XbaI and BamHI, the whole reaction mixture is subjected to electrophoresis in a 0.8% low-melting-point agarose gel, stained with ethidium bromide (manufactured by Nippon Gene), and then exposed to ultraviolet light. Observe, about 1000 bp DN
The band of A was cut out from the gel, purified by GENE CleanII, and cloned into the vector pcDNA3 using XbaI and BamHI sites. Vector pcDNA3 was prepared as follows. 5 μg of vector pcDNA3, 5 μl, deionized water 36 μl, restriction enzyme buffer (manufactured by NEB) 5 μl, restriction enzyme XbaI and restriction enzyme BamHI 2 μl each were added to make a total volume of 50 μl, followed by a 1 hour water bath at 37 ° C. The entire amount of the reaction solution was subjected to electrophoresis in a 0.8% low-melting point agarose gel, stained with ethidium bromide (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), observed under ultraviolet light, and a DNA band of about 5.4 kbp was cut out from the gel. Purified by GENE CleapII. The vector and the above DNA were mixed at a molar ratio of 1: 3, and the DNA was incorporated into the vector using T4 DNA ligase (manufactured by NEB). PcDNA with integrated DNA
3 was introduced into Escherichia coli DH5 Competont Cells (manufactured by Toyobo, code DNA-901), and sown on a plate of L-Broth (manufactured by Takara Shuzo) semi-solid medium containing 50 μg / ml of ampicillin (manufactured by Sigma). The mixture was allowed to stand at 37 ° C for about an hour, and the appeared colonies were randomly selected, inoculated in 2 ml of L-Broth liquid medium containing the same concentration of ampicillin, and kept at 37 ° C for about 18 hours.
Culture with shaking, recover cells, and use Wizard Mini Brep
(Promega) to separate the plasmid according to the attached instructions, digest the plasmid with restriction enzymes XbaI and BamHI, and extract the DNA of about 1000 bp. Sequencing was performed.
【００６６】ＤＮＡ塩基配列決定は、Applied Biosyete
ms社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シーク
エンスサンプルの精製は、PRISM 、Ready Reaction Dye
Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosyete
ms社製) を用いて行なった。0.5ml 容のマイクロチュー
ブに 9.5μl の反応ストック液、4.0 μl の0.8pmol/μ
l のＴ７プロモータープライマー（GIBCO BRL 社製) お
よび6.5 μl の0.16μg/μl シークエンス用鋳型ＤＮＡ
を加えて混合し、100 μl のミネラルオイルを重層後、
96℃30秒、55℃15秒および60℃４分を１サイクルとする
ＰＣＲ増幅反応を25サイクル行ない、４℃で５分間保温
した。反応後、80μl の滅菌精製水を加えて攪拌し、遠
心分離後の水層を３回のフェノール・クロホルム抽出を
行なった。100 μl の水層に10μl の３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（pH5.2)および300 μl エタノールを加えて攪拌後、
室温、14,000rpm にて15分間の遠心を行ない沈殿を回収
した。沈殿を75％エタノールで洗浄後、真空下に２分間
静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シ
ークエンスサンプルは、４μｌの10mMのＥＤＴＡを含む
ホルムアミドに溶解して90℃、２分間で変性後、氷中で
冷却してシークエンスに供した。これによって得られた
発現プラスミドをｐＪＥＧ18と命名した。なお、発現プ
ラスミドpJEG18を大腸菌ＤＨ５株に導入した菌株E.col
i：DH5-pJEG18は日本国通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５８６５
として寄託されている。DNA sequencing was performed using Applied Biosyete
This was performed using a fluorescence sequencer manufactured by ms. For purification of sequence samples, use PRISM, Ready Reaction Dye
Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosyete
ms). In a 0.5 ml microtube, 9.5 μl of the reaction stock solution and 4.0 μl of 0.8 pmol / μl
l of T7 promoter primer (GIBCO BRL) and 6.5 μl of 0.16 μg / μl template DNA for sequencing
And mix with 100 μl of mineral oil.
A PCR amplification reaction was performed for 25 cycles, each cycle consisting of 96 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 4 minutes, and kept at 4 ° C. for 5 minutes. After the reaction, 80 μl of sterile purified water was added and stirred, and the aqueous layer after centrifugation was subjected to phenol / chloroform extraction three times. After adding 10 μl of 3M sodium acetate (pH 5.2) and 300 μl of ethanol to the 100 μl aqueous layer and stirring,
The precipitate was collected by centrifugation at 14,000 rpm for 15 minutes at room temperature. After the precipitate was washed with 75% ethanol, it was allowed to stand under vacuum for 2 minutes and dried to obtain a sample for sequencing. The sequence sample was dissolved in 4 μl of formamide containing 10 mM EDTA, denatured at 90 ° C. for 2 minutes, cooled on ice and subjected to a sequence. The expression plasmid thus obtained was named pJEG18. The strain E.col obtained by introducing the expression plasmid pJEG18 into the E. coli DH5 strain was used.
i: DH5-pJEG18 is a deposit number of FERM BP-5865 at the Research Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan.
Has been deposited as
【００６７】[0067]
【実施例６】発現ベクターの細胞への遺伝子導入と発現 実施例５で作製した発現ベクターを２９３細胞（大日本
製薬（株）から入手可能、原ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ-1573)
に遺伝子導入した。遺伝子導入前の細胞の継代は、MEM
with Earles Salts (MEMアール液体培地、大日本製薬
（株) Cat. No.12-102-54GN)を用い、１０％馬血清（56
℃20分間熱処理して非働化した；ICN Biomedicals,Inc.
Cat.No.2921149) 、100 分の１量の Penicillin-Strept
omycin溶液（大日本製薬（株) Cat.No.16-70D-49DN) を
加えた。細胞は、 5×104 個／mlから 5×105 個／mlの
濃度で培地中に植え付け、37℃、５％二酸化炭素、湿度
100％で培養し、コンフルエントになるまで培養した。
培地を吸引・廃棄し、ＥＤＴＡトリプシン液(Cosmo Bio
Co.,Ltd.)処理により、細胞をプレート底面よりはがし
た。前記の培地（血清を含む）を加えて反応を停止させ
た。その後、ピペッティングによって細胞を均一に懸濁
し、遠心して(1000rpm 15分； KS-8300型、久保田製作
所、RS3000/6型ローター）回収し、新しい培地に再度懸
濁し継代した。遺伝子導入は、 Invitrogen 社のキット
(Cat.No.IV2780-1) を用いリン酸カルシウム共沈法にて
行い（添付のプロトコル６ページ）、本発明の７回膜貫
通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８をコードするＤＮＡを保持
する形質転換体を作成した。ＤＮＡは３５mmプレートあ
たり５μg を用いた。Example 6 Gene Transfer into Cell and Expression of Expression Vector The expression vector prepared in Example 5 was used for 293 cells (available from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., original ATCC No. CRL-1573).
Was introduced. Passage of cells before gene transfer was performed using MEM
10% horse serum (56%) using Earles Salts (MEM Earl's liquid medium, Dainippon Pharma Co., Ltd. Cat. No. 12-102-54GN)
Inactivated by heat treatment at 20 ° C. for 20 minutes; ICN Biomedicals, Inc.
Cat.No.2921149), 1/100 amount of Penicillin-Strept
omycin solution (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Cat. No. 16-70D-49DN) was added. Cells are seeded in culture at a concentration of 5 × 10 4 cells / ml to 5 × 10 5 cells / ml, at 37 ° C., 5% carbon dioxide, humidity
The cells were cultured at 100% and cultured until confluent.
The medium is aspirated and discarded, and EDTA trypsin solution (Cosmo Bio
(Co., Ltd.) treatment, the cells were detached from the bottom of the plate. The reaction was stopped by adding the above-mentioned medium (including serum). Thereafter, the cells were uniformly suspended by pipetting, collected by centrifugation (1000 rpm, 15 minutes; KS-8300, Kubota Seisakusho, RS3000 / 6 rotor), resuspended in a new medium, and subcultured. For gene transfer, Invitrogen kit
(Cat.No.IV2780-1) by calcium phosphate coprecipitation method (Attached protocol page 6) to prepare a transformant carrying DNA encoding the seven-transmembrane receptor protein JEG18 of the present invention did. 5 μg of DNA was used per 35 mm plate.
【００６８】膜画分の調製は、以下のように行った。遺
伝子導入した細胞およびｐｃＤＮＡ３プラスミドを導入
した細胞を24〜48時間培養した。その後、培地はアスピ
レータで吸引し廃棄し、ＰＢＳ (大日本製薬（株）Cat.
No. 28-103-05)を用いて細胞を洗浄し、その後１ml／プ
レートのＰＢＳを加え、Cell Scraper-L (住友ベークラ
イト、Cat.No.MS-93300)を用いてプレートからはがし
た。その後、１ml／３プレートのＰＢＳを加え、プレー
トを洗浄し、回収した細胞に加えた。この細胞懸濁液を
Polytron (KINEMATIKA 社製、PT10-SK)で破砕し、マイ
クロチューブ用遠心機（トミー精工、MRX-150 型）で４
℃、13000xg で１５分間遠心した。上清を捨て、さらに
２度ＰＢＳを加え懸濁後、同じ条件で遠心した。バイオ
・ラッド社のプロテインアッセイキットを用いて蛋白質
を定量し、蛋白質量が、１mg／mlになるようＰＢＳを加
えて調製した。この懸濁液を膜画分調製液とした。The preparation of the membrane fraction was carried out as follows. The cells into which the gene had been introduced and the cells into which the pcDNA3 plasmid had been introduced were cultured for 24-48 hours. Thereafter, the medium was aspirated with an aspirator and discarded, and PBS (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
The cells were washed using No. 28-103-05), then 1 ml / plate of PBS was added, and the cells were detached from the plate using Cell Scraper-L (Sumitomo Bakelite, Cat. No. MS-93300). Thereafter, 1 ml / 3 plate of PBS was added, the plate was washed and added to the recovered cells. This cell suspension
Crush with Polytron (KINEMATIKA, PT10-SK), and centrifuge with a microtube centrifuge (Tomy Seiko, MRX-150).
The mixture was centrifuged at 13,000 xg for 15 minutes. The supernatant was discarded, and PBS was further added and suspended twice, followed by centrifugation under the same conditions. The protein was quantified using a Bio-Rad protein assay kit, and the protein was prepared by adding PBS to a protein amount of 1 mg / ml. This suspension was used as a membrane fraction preparation.
【００６９】こうして得られた膜画分調製液を用いてウ
ェスタンブロッティング法にて７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８の発現を確認した。すなわち、膜画分をＡ
ＣＩジャパン社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動槽及び
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラジエ
ントゲル５〜15％）を用い、添付の取扱い説明書に従っ
てＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。サンプルは２−メル
カプトエタノール（２−ＭＥ）を加えて５分間の沸騰水
浴加熱処理により還元処理を行った。マーカーとしては
Amersham 社製レインボーマーカー（高分子量用）を用
い、サンプルバッファー、泳動バッファーについては添
付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブランフィ
ルター (BioRad社製）に同社製ミニトランスブロットセ
ルにより転写した。Using the membrane fraction preparation thus obtained, expression of the transmembrane receptor protein JEG18 was confirmed seven times by Western blotting. That is, the membrane fraction is A
SDS-PAGE was performed using an electrophoresis tank for SDS-PAGE and a polyacrylamide gel for SDS-PAGE (gradient gel 5 to 15%) manufactured by CI Japan in accordance with the attached instruction manual. The sample was reduced by adding 2-mercaptoethanol (2-ME) and heating in a boiling water bath for 5 minutes. As a marker
Using a rainbow marker (for high molecular weight) manufactured by Amersham, a sample buffer and an electrophoresis buffer were prepared according to the attached instruction manual. SDS-PAGE
After the completion, the acrylamide gel was transferred to a PVDF membrane filter (manufactured by BioRad) using a mini-trans blot cell manufactured by the company.
【００７０】このように作製されたフィルターをブロッ
クエース（大日本製薬社製）、ＴＢＳ−Ｔ(20mM Tris、
137mM NaCl(pH7.6) 、0.1 ％ Tween 20)に４℃で一晩振
盪してブロッキングした。ＥＣＬウェスタンブロッティ
ング検出システム（Amersham社）に添付の説明書に従
い、一次抗体として実施例１０に記載した抗ＪＥＧ１８
抗血清を用い、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗
マウスＩｇ羊抗体（Amersham社製）を反応させた。。The filter thus prepared was subjected to Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), TBS-T (20 mM Tris,
Blocking was carried out by shaking overnight at 4 ° C. in 137 mM NaCl (pH 7.6), 0.1% Tween 20). According to the instructions attached to the ECL western blotting detection system (Amersham), anti-JEG18 described in Example 10 was used as the primary antibody.
Using an antiserum, a peroxidase-labeled anti-mouse Ig sheep antibody (Amersham) was reacted as a secondary antibody. .
【００７１】抗体の反応時間は各々室温で一時間反応さ
せ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて10分間室温で振盪洗浄す
る操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィルタ
ーをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム(Ame
rsham 社製）の反応液に５分間浸し、ポリ塩化ビニリデ
ンラップに包んでＸ線フィルムに感光させた。分子量マ
ーカーとの比較の結果、約38〜42kDのバンドが遺伝子導
入をしたものについてのみ得られ、遺伝子導入をしてい
ない細胞には観察されなかった。The reaction time of each antibody was 1 hour at room temperature. During each reaction, the operation of shaking and washing with TBS-T for 10 minutes at room temperature was repeated three times. After the last wash, filters were removed using the ECL Western Blotting Detection System (Ame
rsham) for 5 minutes, wrapped in polyvinylidene chloride wrap and exposed to X-ray film. As a result of comparison with the molecular weight marker, a band of about 38 to 42 kD was obtained only for the transfected cells, and was not observed in the non-transfected cells.
【００７２】[0072]
【実施例７】リガンドのスクリーニング 遺伝子導入を行わない２９３細胞とＪＥＧ１８形質転換
体 293細胞の膜画分を実施例６と同様にして調製した。
膜画分調製液50μl もしくはＰＢＳ（大日本製薬（株)C
at.No. 28-103-05) と放射性標識された候補化合物 CGS
21680 (DupontNEN社、カタログ番号 NET-1021) 50μl
(終濃度100nM)、 PBS 50μl を加え、全量を 150μl と
した。混合して候補化合物と７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ１８を接触させ、37℃で30分間保温した後、マイ
クロチューブ用遠心機（トミー精工、MRX-150 型）で室
温、15000xg で15分間遠心し、ＪＥＧ１８蛋白質と結合
した候補化合物と結合していないものを分離した。その
上清を１μl とり、10mlの液体シンチレーター用カクテ
ル (Dupont NEN、ECONOFLU OR-2)に加え、混合した。そ
の後、Beckman LS6000LL型シンチレーションカウンター
を使用して放射活性をカウントし、ＪＥＧ１８遺伝子導
入の有無で得られた放射活性を比較した。その結果、得
られた放射活性はＪＥＧ１８遺伝子導入の有無で差がな
かった。Example 7 Screening of Ligands Membrane fractions of 293 cells without transfection and 293 JEG18 transformants were prepared in the same manner as in Example 6.
50 μl of membrane fraction preparation or PBS (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. C
at.No. 28-103-05) and radiolabeled candidate compound CGS
21680 (DupontNEN, catalog number NET-1021) 50 μl
(Final concentration 100 nM) and 50 μl of PBS were added to make a total volume of 150 μl. After mixing and contacting the candidate compound with the transmembrane receptor protein JEG18 seven times, keeping the mixture at 37 ° C for 30 minutes, centrifuge at 15,000 xg for 15 minutes at room temperature in a microtube centrifuge (Tomy Seiko, MRX-150). Then, those which did not bind to the candidate compound bound to the JEG18 protein were separated. 1 μl of the supernatant was taken, added to 10 ml of a cocktail for liquid scintillator (Dupont NEN, ECONOFLU OR-2) and mixed. Thereafter, the radioactivity was counted using a Beckman LS6000LL type scintillation counter, and the radioactivity obtained with and without the introduction of the JEG18 gene was compared. As a result, the obtained radioactivity did not differ depending on whether the JEG18 gene was introduced or not.
【００７３】[0073]
【実施例８】リガンドのスクリーニング 実施例５で作製した発現ベクターをＣＨＯ細胞（大日本
製薬（株）から入手可能、原ＡＴＣＣ番号CCL-61) に遺
伝子導入した。遺伝子導入前の細胞の継代は、F-12 Nut
rient Mixture(ＨＡＭ培地、GIBCO BRL カタログ番号 1
1765-047) を用い、最終濃度10％のＦＢＳ(Fetal Bovin
e Serum; GIBCO BRL Cat.No.10099-141; 56 ℃20分間熱
処理して非働化した) 、100 分の１量の Penicillin-St
reptomycin溶液（大日本製薬（株）Cat.No.16-70D-49D
N) を加えた。細胞は、 5×104 個／mlから 5×105 個
／mlの濃度で培地中に植え付け、37℃５％２酸化炭素、
湿度 100％で培養し、コンフルエントになるまで培養し
た。培地は吸引・廃棄し、ＥＤＴＡトリプシン液(Cosmo
Bio Co.,Ltd.)処理により、細胞をプレート底面よりは
がした。前記の培地（血清を含む）を加えて反応を停止
させた。その後、ピペッティングによって細胞を均一に
懸濁し、遠心して(1000rpm 15 分； KS-8300型、久保田
製作所、RS3000/6型ローター) 回収した。新しい培地に
再度懸濁し、継代した。Example 8 Ligand Screening The expression vector prepared in Example 5 was transfected into CHO cells (available from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., original ATCC No. CCL-61). Passage of cells before gene transfer is performed using F-12 Nut
rient Mixture (HAM medium, GIBCO BRL Catalog No. 1
1765-047) and a final concentration of 10% FBS (Fetal Bovin
e Serum; GIBCO BRL Cat.No.10099-141; inactivated by heat treatment at 56 ° C for 20 minutes), 1/100 amount of Penicillin-St
reptomycin solution (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Cat.No.16-70D-49D
N) was added. Cells were seeded at 5 × 10 4 cells / ml to 5 × 10 5 cells / ml in culture at 37 ° C., 5% carbon dioxide,
The cells were cultured at 100% humidity and cultured until confluent. The medium is aspirated and discarded, and EDTA trypsin solution (Cosmo
(Bio Co., Ltd.) treatment to detach the cells from the bottom of the plate. The reaction was stopped by adding the above-mentioned medium (including serum). Thereafter, the cells were uniformly suspended by pipetting and centrifuged (1000 rpm, 15 minutes; KS-8300, Kubota Seisakusho, RS3000 / 6 rotor) and collected. It was resuspended in fresh medium and subcultured.
【００７４】遺伝子導入は、 Invitrogen 社のキット(C
at.No.IV2780-1) を用いリン酸カルシウム共沈法にて行
った（添付のプロトコル６ページ）。ＤＮＡは35mmプレ
ートあたり５μg 用いた。遺伝子導入後、約６時間後に
培地を新しいものと交換しさらに約４８時間培養した。
さらに培養上清を、種種の細胞濃度で 400μg/mlの濃度
のネオマイシン(Geneticin、 GIBCO BRL 11811-023)を含
む培地に植え替えた。その後、２週間前後培養し増殖し
た細胞を発現細胞とした。The gene transfer was carried out using a kit (C
at.No.IV2780-1) by the calcium phosphate coprecipitation method (attached protocol page 6). 5 μg of DNA was used per 35 mm plate. About 6 hours after the gene transfer, the medium was replaced with a new one, and the cells were further cultured for about 48 hours.
Furthermore, the culture supernatant was replaced with a medium containing neomycin (Geneticin, GIBCO BRL 11811-023) at a concentration of 400 μg / ml at various cell concentrations. Thereafter, the cells grown and cultured for about 2 weeks were used as expression cells.
【００７５】以上のように作成した７回膜貫通型受容体
蛋白質ＪＥＧ１８発現細胞を用いて、化学遊走の測定を
行った。リガンド候補物質としては、ＬＰＳ（リポポリ
サッカライド）投与ラット血清を用いた。７週令の Wis
tar ラットを (株) 日本生物材料より購入した。サルモ
ネラミネソタＲＥ595 由来ＬＰＳ(Sigma社製) を日本薬
局方生理食塩水に最終濃度１mg／mlになるように懸濁し
た。懸濁液をソニケーター(Branson) でソニケートし、
透明な液とした。これを日本薬局方生理食塩水で10倍に
希釈し、 400μl 、尾静脈より投与した。投与後約２２
時間後のラットをエーテル麻酔し開腹して心臓より採血
した。マイクロチューブ用遠心機（トミー精工、MRX-15
0 型）で４℃、13000xg で15分間遠心し、その上清を−
20℃で保存した。これを被検物質溶液とした。Using the seven-transmembrane receptor protein JEG18-expressing cells prepared as described above, the measurement of the chemotaxis was performed. LPS (lipopolysaccharide) -administered rat serum was used as a ligand candidate substance. 7 weeks old Wis
Tar rats were purchased from Nippon Biological Materials. LPS derived from Salmonella minnesota RE595 (manufactured by Sigma) was suspended in physiological saline in the Japanese Pharmacopoeia to a final concentration of 1 mg / ml. Sonicate the suspension with a sonicator (Branson),
A clear liquid was obtained. This was diluted 10-fold with physiological saline solution of the Japanese Pharmacopoeia, and 400 μl was administered through the tail vein. About 22 after administration
After a lapse of time, the rats were anesthetized with ether, laparotomized, and blood was collected from the heart. Microtube centrifuge (Tomy Seiko, MRX-15
0) at 13000 xg for 15 minutes at 4 ° C.
Stored at 20 ° C. This was used as a test substance solution.
【００７６】96穴マイクロプレートチャンバー（フナコ
シ（株）カタログ番号ＦＥ−2292-96)に96穴マイクロプ
レート（フナコシ（株）カタログ番号ＦＥ−2300-02)お
よび15μg/mlのフィブロネクチン(Sigma、ＰＢＳ（大日
本製薬（株）カタログ番号28-103-05)中に溶解した）で
処理した８μm のポアサイズのフレームフィルター（フ
ナコシ（株）カタログ番号ＦＥ-2340-08) を据え付け
た。下室には0.15％ＢＳＡ(Sigma社製) を含む RPMI 16
40 (GIBCO BRL カタログ番号 22400-071) で被検物質溶
液を10倍希釈して加えた。上室には0.15％ＢＳＡを含む
RPMI 1640に懸濁した７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ
１８発現細胞を加え，被検物質とＪＥＧ１８蛋白質を接
触させた。この状態の96穴マイクロプレートチャンバー
を５％二酸化炭素、37℃で５時間保温した。フィルター
を固定・染色して顕微鏡下で観察した。その結果、化学
遊走している細胞が観察された。In a 96-well microplate chamber (Funakoshi Co., Ltd., catalog number FE-2292-96), a 96-well microplate (Funakoshi Co., catalog number FE-2300-02) and 15 μg / ml fibronectin (Sigma, PBS ( An 8 μm pore size flame filter (Funakoshi Co., Ltd., catalog number FE-2340-08) treated with Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., catalog number 28-103-05) was installed. The lower chamber contains RPMI 16 containing 0.15% BSA (Sigma).
The test substance solution was diluted 10-fold with 40 (GIBCO BRL Catalog No. 22400-071) and added. Upper room contains 0.15% BSA
7-transmembrane receptor protein JEG suspended in RPMI 1640
18-expressing cells were added, and the test substance was brought into contact with the JEG18 protein. The 96-well microplate chamber in this state was kept at 5% carbon dioxide and 37 ° C. for 5 hours. The filter was fixed and stained and observed under a microscope. As a result, chemi-migrating cells were observed.
【００７７】[0077]
【実施例９】リガンドと拮抗する物質のスクリーニング ＪＥＧ１８形質転換ＣＨＯ細胞を用い形質転換体の化学
遊走試験を行った。(i)実施例５で作製したＪＥＧ１８
形質転換ＣＨＯ細胞に発現する７回膜貫通型受容体蛋白
質ＪＥＧ１８とリガンドと実施例８に示したＬＰＳ投与
ラット血清をリガンドとして用いて実施例８と同様に化
学遊走している細胞を観察した。さらに、(ii)実施例８
の実験の際に上室および下室に含まれる溶液に最終濃度
100μmolのＮＥＣＡを加えて実施例８と同様に化学遊
走している細胞を観察した。そののち、(i)(ii) を比較
したが、両者に差はなかった。Example 9 Screening of a substance that antagonizes a ligand A chemotaxis test of a transformant was performed using JEG18-transformed CHO cells. (i) JEG18 produced in Example 5
Using the seven transmembrane receptor protein JEG18 expressed in the transformed CHO cells, the ligand, and the serum of the LPS-administered rat shown in Example 8 as the ligand, cells that had undergone chemical migration were observed as in Example 8. Further, (ii) Example 8
The final concentration of the solution in the upper and lower chambers during the experiment
100 μmol of NECA was added, and the chemi-migrating cells were observed as in Example 8. After that, (i) and (ii) were compared, but there was no difference between the two.
【００７８】[0078]
【実施例１０】ＪＥＧ１８蛋白質を認識する抗体の作成 配列表配列番号１の１番目から19番目のペプチドを合成
し、免疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測定後、
全血の採血を行い、血清を採取して、米国 BioRad 社製
のエコノパック血清ＩｇＧ精製キットを用いて、添付の
取扱い説明書に従って、抗ヒトＪＥＧ１８蛋白質ウサギ
ポリクローナル抗体を精製して作製した。ペプチド合成
は、Fmoc固相合成法 (新生化学実験講座１・タンパク質
ＶＩ合成及び発現、東京化学同人発行）にて行ない、そ
の２mgの合成ペプチドを等量のキャリア蛋白質ＫＬＨ(k
eyhole-limpet hemocyanin) とマレイミド法にてコンジ
ュゲートしたものを抗原として使用した。約2.5 kgのウ
サギ１羽に 0.5mgの抗原を背部皮下投与し、その21日
後、42日後および63日後にもそれぞれ等量の抗原を同様
に投与した。最初の投与から73日目にウサギより血液を
麻酔下頸動脈採血により採取後、血清を分離し抗血清と
した。Example 10 Preparation of Antibody Recognizing JEG18 Protein The first to 19th peptides of SEQ ID NO: 1 were synthesized, immunized to rabbits as an immunogen, and the antibody titer was measured.
Whole blood was collected, serum was collected, and an anti-human JEG18 protein rabbit polyclonal antibody was purified using an Econopack serum IgG purification kit manufactured by BioRad, USA, according to the attached instruction manual. Peptide synthesis was performed by the Fmoc solid phase synthesis method (Shinsei Kagaku Jikken Kozai 1 ・ Protein VI synthesis and expression, published by Tokyo Chemical Dojin), and 2 mg of the synthetic peptide was added to an equal amount of the carrier protein KLH (k
A conjugate with eyhole-limpet hemocyanin) by the maleimide method was used as an antigen. One rabbit weighing about 2.5 kg was subcutaneously administered with 0.5 mg of the antigen at the back, and the same amount of the antigen was similarly administered at 21 days, 42 days and 63 days thereafter. On the 73rd day after the first administration, blood was collected from the rabbit by carotid blood sampling under anesthesia, and the serum was separated and used as antiserum.
【００７９】[0079]
【発明の効果】本発明の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥ
Ｇ１８は、白血球の機能を制御する医薬品を検索するこ
とに使用が可能である。The seven-transmembrane receptor protein JE of the present invention
G18 can be used to search for drugs that control the function of leukocytes.
【００８０】[0080]
配列番号：1 配列の長さ：333 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Pro Ala Asn Tyr Thr Cys Thr Arg Pro Asp Gly Asp Asn Thr 5 10 15 Asp Phe Arg Tyr Phe Ile Tyr Ala Val Thr Tyr Thr Val Ile Leu 20 25 30 Val Pro Gly Leu Ile Gly Asn Ile Leu Ala Leu Trp Val Phe Tyr 35 40 45 Gly Tyr Met Lys Glu Thr Lys Arg Ala Val Ile Phe Met Ile Asn 50 55 60 Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Arg 65 70 75 Ile Phe Tyr Tyr Leu Asn His Asp Trp Pro Phe Gly Pro Gly Leu 80 85 90 Cys Met Phe Cys Phe Tyr Leu Lys Tyr Val Asn Met Tyr Ala Ser 95 100 105 Ile Tyr Phe Leu Val Cys Ile Ser Val Arg Arg Phe Trp Phe Leu 110 115 120 Met Tyr Pro Phe Arg Phe His Asp Cys Lys Gln Lys Tyr Asp Leu 125 130 135 Tyr Ile Ser Ile Ala Gly Trp Leu Ile Ile Arg Leu Ala Cys Val 140 145 150 Leu Phe Pro Leu Leu Arg Thr Ser Asp Asp Thr Ser Gly Asn Arg 155 160 165 Thr Lys Cys Phe Val Asp Leu Pro Thr Arg Asn Val Asn Leu Ala 170 175 180 Gln Ser Val Val Met Met Thr Ile Gly Glu Leu Ile Gly Phe Val 185 190 195 Thr Pro Leu Leu Ile Val Leu Tyr Cys Thr Trp Lys Thr Val Leu 200 205 210 Ser Leu Gln Asp Lys Tyr Pro Met Ala Gln Asp Leu Gly Glu Lys 215 220 225 Gln Lys Ala Leu Lys Met Ile Leu Thr Cys Ala Gly Val Phe Leu 230 235 240 Ile Cys Phe Ala Pro Tyr His Phe Ser Phe Pro Leu Asp Phe Leu 245 250 255 Val Lys Ser Asn Glu Ile Lys Ser Cys Leu Ala Arg Arg Val Ile 260 265 270 Leu Ile Phe His Ser Val Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Asn Ser 275 280 285 Cys Leu Asp Pro Val Ile Tyr Tyr Phe Ser Thr Asn Glu Phe Arg 290 295 300 Arg Arg Leu Ser Arg Gln Asp Leu His Asp Ser Ile Gln Leu His 305 310 315 Ala Lys Ser Phe Val Ser Asn His Thr Ala Ser Thr Met Thr Pro 320 325 330 Glu Leu Cys SEQ ID NO: 1 Sequence length: 333 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Protein Sequence Met Pro Ala Asn Tyr Thr Cys Thr Arg Pro Asp Gly Asp Asn Thr 5 10 15 Asp Phe Arg Tyr Phe Ile Tyr Ala Val Thr Tyr Thr Val Ile Leu 20 25 30 Val Pro Gly Leu Ile Gly Asn Ile Leu Ala Leu Trp Val Phe Tyr 35 40 45 Gly Tyr Met Lys Glu Thr Lys Arg Ala Val Ile Phe Met Ile Asn 50 55 60 Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Arg 65 70 75 Ile Phe Tyr Tyr Leu Asn His Asp Trp Pro Phe Gly Pro Gly Leu 80 85 90 Cys Met Phe Cys Phe Tyr Leu Lys Tyr Val Asn Met Tyr Ala Ser 95 100 105 Ile Tyr Phe Leu Val Cys Ile Ser Val Arg Arg Phe Trp Phe Leu 110 115 120 Met Tyr Pro Phe Arg Phe His Asp Cys Lys Gln Lys Tyr Asp Leu 125 130 135 Tyr Ile Ser Ile Ala Gly Trp Leu Ile Ile Arg Leu Ala Cys Val 140 145 150 Leu Phe Pro Leu Leu Arg Thr Ser Asp Asp Thr Ser Gly Asn Arg 155 160 165 Thr Lys Cys Phe Val Asp Leu Pro Thr Arg Asn Val Asn Leu Ala 170 175 180 180 Gln Ser Val Val Met Met Thr Ile Gly Glu Leu Ile Gly Phe Val 185 190 195 Thr Pro Leu Leu Ile Val Leu Tyr Cys Thr Trp Lys Thr Val Leu 200 205 210 Ser Leu Gln Asp Lys Tyr Pro Met Ala Gln Asp Leu Gly Glu Lys 215 220 225 Gln Lys Ala Leu Lys Met Ile Leu Thr Cys Ala Gly Val Phe Leu 230 235 240 Ile Cys Phe Ala Pro Tyr His Phe Ser Phe Pro Leu Asp Phe Leu 245 250 255 Val Lys Ser Asn Glu Ile Lys Ser Cys Leu Ala Arg Arg Val Ile 260 265 270 Leu Ile Phe His Ser Val Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Asn Ser 275 280 285 Cys Leu Asp Pro Val Ile Tyr Tyr Phe Ser Thr Asn Glu Phe Arg 290 295 300 Arg Arg Leu Ser Arg Gln Asp Leu His Asp Ser Ile Gln Leu His 305 310 315 Ala Lys Ser Phe Val Ser Asn His Thr Ala Ser Thr Met Thr Pro 320 325 330 Glu Leu Cys
【００８１】配列番号：2 配列の長さ：1183 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GTGGTAAAAA GAAGAAGGTT ATTTTATACT TCGTATCTCC AACCCACTGG CAATCAATCT 60 TTTGGAAGGA ACAGCAGTTG ATTGTGAATT TAGTTTTGAA CCACCATTAG GCAAAGATAG 120 TTTCTCTAGA GAGAATC 137 ATG CCT GCT AAT TAC ACG TGT ACC AGG CCA GAT GGA GAC AAT ACA 182 Met Pro Ala Asn Tyr Thr Cys Thr Arg Pro Asp Gly Asp Asn Thr 5 10 15 GAT TTT CGA TAC TTT ATT TAT GCA GTG ACA TAC ACT GTC ATT CTT 227 Asp Phe Arg Tyr Phe Ile Tyr Ala Val Thr Tyr Thr Val Ile Leu 20 25 30 GTG CCA GGT CTC ATA GGG AAT ATA TTA GCC CTG TGG GTA TTC TAT 272 Val Pro Gly Leu Ile Gly Asn Ile Leu Ala Leu Trp Val Phe Tyr 35 40 45 GGT TAT ATG AAA GAA ACA AAA CGA GCT GTG ATA TTT ATG ATA AAC 317 Gly Tyr Met Lys Glu Thr Lys Arg Ala Val Ile Phe Met Ile Asn 50 55 60 TTA GCC ATT GCT GAC TTA CTA CAA GTT CTT TCC TTG CCA CTG AGG 362 Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Arg 65 70 75 ATC TTC TAC TAC TTG AAT CAT GAC TGG CCA TTT GGG CCT GGT CTC 407 Ile Phe Tyr Tyr Leu Asn His Asp Trp Pro Phe Gly Pro Gly Leu 80 85 90 TGC ATG TTC TGT TTC TAC CTG AAG TAT GTC AAC ATG TAT GCA AGC 452 Cys Met Phe Cys Phe Tyr Leu Lys Tyr Val Asn Met Tyr Ala Ser 95 100 105 ATC TAC TTC TTG GTC TGC ATC AGT GTG CGA CGA TTT TGG TTT CTC 497 Ile Tyr Phe Leu Val Cys Ile Ser Val Arg Arg Phe Trp Phe Leu 110 115 120 ATG TAC CCC TTT CGC TTC CAT GAC TGC AAA CAG AAA TAT GAC CTG 542 Met Tyr Pro Phe Arg Phe His Asp Cys Lys Gln Lys Tyr Asp Leu 125 130 135 TAC ATC AGC ATT GCT GGC TGG CTG ATC ATC CGC CTT GCC TGT GTA 587 Tyr Ile Ser Ile Ala Gly Trp Leu Ile Ile Arg Leu Ala Cys Val 140 145 150 CTC TTT CCA CTC CTC AGA ACC AGT GAT GAT ACC TCT GGC AAT AGG 632 Leu Phe Pro Leu Leu Arg Thr Ser Asp Asp Thr Ser Gly Asn Arg 155 160 165 ACC AAA TGC TTT GTG GAT CTT CCT ACC AGG AAT GTC AAC CTG GCC 677 Thr Lys Cys Phe Val Asp Leu Pro Thr Arg Asn Val Asn Leu Ala 170 175 180 CAG TCC GTT GTT ATG ATG ACC ATT GGC GAG TTG ATT GGG TTT GTA 722 Gln Ser Val Val Met Met Thr Ile Gly Glu Leu Ile Gly Phe Val 185 190 195 ACT CCG CTT CTG ATT GTC CTA TAT TGT ACC TGG AAG ACG GTT TTA 767 Thr Pro Leu Leu Ile Val Leu Tyr Cys Thr Trp Lys Thr Val Leu 200 205 210 TCA CTG CAA GAT AAA TAT CCC ATG GCC CAA GAT CTT GGA GAG AAA 812 Ser Leu Gln Asp Lys Tyr Pro Met Ala Gln Asp Leu Gly Glu Lys 215 220 225 CAG AAA GCC TTG AAG ATG ATT CTA ACC TGT GCA GGG GTA TTC CTA 857 Gln Lys Ala Leu Lys Met Ile Leu Thr Cys Ala Gly Val Phe Leu 230 235 240 ATT TGC TTT GCA CCT TAT CAT TTC AGT TTT CCT TTA GAT TTC CTG 902 Ile Cys Phe Ala Pro Tyr His Phe Ser Phe Pro Leu Asp Phe Leu 245 250 255 GTG AAG TCC AAT GAA ATT AAA AGC TGC CTA GCC AGA AGG GTG ATT 947 Val Lys Ser Asn Glu Ile Lys Ser Cys Leu Ala Arg Arg Val Ile 260 265 270 CTA ATA TTT CAT TCT GTG GCA TTG TGT CTT GCT AGT CTG AAT TCA 992 Leu Ile Phe His Ser Val Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Asn Ser 275 280 285 TGT CTT GAC CCA GTC ATA TAC TAC TTT TCC ACT AAT GAG TTC CGA 1037 Cys Leu Asp Pro Val Ile Tyr Tyr Phe Ser Thr Asn Glu Phe Arg 290 295 300 AGA CGG CTT TCA AGA CAA GAT TTG CAT GAC AGC ATC CAA CTC CAT 1082 Arg Arg Leu Ser Arg Gln Asp Leu His Asp Ser Ile Gln Leu His 305 310 315 GCA AAA TCC TTT GTG AGT AAC CAT ACA GCT TCC ACC ATG ACA CCT 1127 Ala Lys Ser Phe Val Ser Asn His Thr Ala Ser Thr Met Thr Pro 320 325 330 GAA TTA TGC 1136 Glu Leu Cys TAAAACAAAA AACCAAACTG AATGTGACCT GAAATGCAAG TACATCA 1183Sequence number: 2 Sequence length: 1183 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA to mRNA sequence GTGGTAAAAA GAAGAAGGTT ATTTTATACT TCGTATCTCC AACCCACTGG CAATCAATCT 60 TTTGGAAGGA ACAGCAGTTG ATTGTGAATT TAGTTGA GCAAAGATAG 120 TTTCTCTAGA GAGAATC 137 ATG CCT GCT AAT TAC ACG TGT ACC AGG CCA GAT GGA GAC AAT ACA 182 Met Pro Ala Asn Tyr Thr Cys Thr Arg Pro Asp Gly Asp Asn Thr 5 10 15 GAT TTT CGA TAC TTT ATT TAT GTAC GTG AGA ACT GTC ATT CTT 227 Asp Phe Arg Tyr Phe Ile Tyr Ala Val Thr Tyr Thr Val Ile Leu 20 25 30 GTG CCA GGT CTC ATA GGG AAT ATA TTA GCC CTG TGG GTA TTC TAT 272 Val Pro Gly Leu Ile Gly Asn Ile Leu Ala Leu Trp Val Phe Tyr 35 40 45 GGT TAT ATG AAA GAA ACA AAA CGA GCT GTG ATA TTT ATG ATA AAC 317 Gly Tyr Met Lys Glu Thr Lys Arg Ala Val Ile Phe Met Ile Asn 50 55 60 TTA GCC ATT GCT GAC TTA CTA CAA GTT CTT TCC TTG CCA CTG AGG 362 Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Arg 65 70 75 ATC TT C TAC TAC TTG AAT CAT GAC TGG CCA TTT GGG CCT GGT CTC 407 Ile Phe Tyr Tyr Leu Asn His Asp Trp Pro Phe Gly Pro Gly Leu 80 85 90 TGC ATG TTC TGT TTC TAC CTG AAG TAT GTC AAC ATG TAT GCA AGC 452 Cys Met Phe Cys Phe Tyr Leu Lys Tyr Val Asn Met Tyr Ala Ser 95 100 105 ATC TAC TTC TTG GTC TGC ATC AGT GTG CGA CGA TTT TGG TTT CTC 497 Ile Tyr Phe Leu Val Cys Ile Ser Val Arg Arg Phe Trp Phe Leu 110 115 120 ATG TAC CCC TTT CGC TTC CAT GAC TGC AAA CAG AAA TAT GAC CTG 542 Met Tyr Pro Phe Arg Phe His Asp Cys Lys Gln Lys Tyr Asp Leu 125 130 135 TAC ATC AGC ATT GCT GGC TGG CTG ATC ATC CGC CTT GCC TGT GTA 587 Tyr Ile Ser Ile Ala Gly Trp Leu Ile Ile Arg Leu Ala Cys Val 140 145 150 CTC TTT CCA CTC CTC AGA ACC AGT GAT GAT ACC TCT GGC AAT AGG 632 Leu Phe Pro Leu Leu Arg Thr Ser Asp Asp Thr Ser Gly Asn Arg 155 160 165 ACC AAA TGC TTT GTG GAT CTT CCT ACC AGG AAT GTC AAC CTG GCC 677 Thr Lys Cys Phe Val Asp Leu Pro Thr Arg Asn Val Asn Leu Ala 170 175 180 CAG TCC GTT GTT ATG ATG ACC ATT GGC GAG TTG ATT GGG TTT G TA 722 Gln Ser Val Val Met Met Thr Ile Gly Glu Leu Ile Gly Phe Val 185 190 195 ACT CCG CTT CTG ATT GTC CTA TAT TGT ACC TGG AAG ACG GTT TTA 767 Thr Pro Leu Leu Ile Val Leu Tyr Cys Thr Trp Lys Thr Val Leu 200 205 210 TCA CTG CAA GAT AAA TAT CCC ATG GCC CAA GAT CTT GGA GAG AAA 812 Ser Leu Gln Asp Lys Tyr Pro Met Ala Gln Asp Leu Gly Glu Lys 215 220 225 CAG AAA GCC TTG AAG ATG ATT CTA ACC TGT GCA GGG GTA TTC CTA 857 Gln Lys Ala Leu Lys Met Ile Leu Thr Cys Ala Gly Val Phe Leu 230 235 240 ATT TGC TTT GCA CCT TAT CAT TTC AGT TTT CCT TTA GAT TTC CTG 902 Ile Cys Phe Ala Pro Tyr His Phe Ser Phe Pro Leu Asp Phe Leu 245 250 255 GTG AAG TCC AAT GAA ATT AAA AGC TGC CTA GCC AGA AGG GTG ATT 947 Val Lys Ser Asn Glu Ile Lys Ser Cys Leu Ala Arg Arg Val Ile 260 265 270 CTA ATA TTT CAT TCT GTG GCA TTG TGT CTT GCT AGT CTG AAT TCA 992 Leu Ile Phe His Ser Val Ala Leu Cys Leu Ala Ser Leu Asn Ser 275 280 285 TGT CTT GAC CCA GTC ATA TAC TAC TTT TCC ACT AAT GAG TTC CGA 1037 Cys Leu Asp Pro Val Ile Tyr Tyr Phe SerThr Asn Glu Phe Arg 290 295 300 AGA CGG CTT TCA AGA CAA GAT TTG CAT GAC AGC ATC CAA CTC CAT 1082 Arg Arg Leu Ser Arg Gln Asp Leu His Asp Ser Ile Gln Leu His 305 310 315 GCA AAA TCC TTT GTG AGT AAC CAT ACA GCT TCC ACC ATG ACA CCT 1127 Ala Lys Ser Phe Val Ser Asn His Thr Ala Ser Thr Met Thr Pro 320 325 330 GAA TTA TGC 1136 Glu Leu Cys TAAAACAAAA AACCAAACTG AATGTGACCT GAAATGCAAG TACATCA 1183
【００８２】配列番号：3 配列の長さ：1183 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA アンチセンス：YES 配列 TGATGTACTT GCATTTCAGG TCACATTCAG TTTGGTTTTT TGTTTTAGCA TAATTCAGGT 60 GTCATGGTGG AAGCTGTATG GTTACTCACA AAGGATTTTG CATGGAGTTG GATGCTGTCA 120 TGCAAATCTT GTCTTGAAAG CCGTCTTCGG AACTCATTAG TGGAAAAGTA GTATATGACT 180 GGGTCAAGAC ATGAATTCAG ACTAGCAAGA CACAATGCCA CAGAATGAAA TATTAGAATC 240 ACCCTTCTGG CTAGGCAGCT TTTAATTTCA TTGGACTTCA CCAGGAAATC TAAAGGAAAA 300 CTGAAATGAT AAGGTGCAAA GCAAATTAGG AATACCCCTG CACAGGTTAG AATCATCTTC 360 AAGGCTTTCT GTTTCTCTCC AAGATCTTGG GCCATGGGAT ATTTATCTTG CAGTGATAAA 420 ACCGTCTTCC AGGTACAATA TAGGACAATC AGAAGCGGAG TTACAAACCC AATCAACTCG 480 CCAATGGTCA TCATAACAAC GGACTGGGCC AGGTTGACAT TCCTGGTAGG AAGATCCACA 540 AAGCATTTGG TCCTATTGCC AGAGGTATCA TCACTGGTTC TGAGGAGTGG AAAGAGTACA 600 CAGGCAAGGC GGATGATCAG CCAGCCAGCA ATGCTGATGT ACAGGTCATA TTTCTGTTTG 660 CAGTCATGGA AGCGAAAGGG GTACATGAGA AACCAAAATC GTCGCACACT GATGCAGACC 720 AAGAAGTAGA TGCTTGCATA CATGTTGACA TACTTCAGGT AGAAACAGAA CATGCAGAGA 780 CCAGGCCCAA ATGGCCAGTC ATGATTCAAG TAGTAGAAGA TCCTCAGTGG CAAGGAAAGA 840 ACTTGTAGTA AGTCAGCAAT GGCTAAGTTT ATCATAAATA TCACAGCTCG TTTTGTTTCT 900 TTCATATAAC CATAGAATAC CCACAGGGCT AATATATTCC CTATGAGACC TGGCACAAGA 960 ATGACAGTGT ATGTCACTGC ATAAATAAAG TATCGAAAAT CTGTATTGTC TCCATCTGGC 1020 CTGGTACACG TGTAATTAGC AGGCATGATT CTCTCTAGAG AAACTATCTT TGCCTAATGG 1080 TGGTTCAAAA CTAAATTCAC AATCAACTGC TGTTCCTTCC AAAAGATTGA TTGCCAGTGG 1140 GTTGGAGATA CGAAGTATAA AATAACCTTC TTCTTTTTAC CAC 1183Sequence number: 3 Sequence length: 1183 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: cDNA to mRNA Antisense: YES sequence TGATGTACTT GCATTTCAGG TCACATTCAG TTTGGTTTTT TGTTTTAGCA TAATTCAGGT 60 GTCATGGTGG AAGCTGTATG GTTACTCACA AAGGATTTTG CATGGAGTTG GATGCTGTCA 120 TGCAAATCTT GTCTTGAAAG CCGTCTTCGG AACTCATTAG TGGAAAAGTA GTATATGACT 180 GGGTCAAGAC ATGAATTCAG ACTAGCAAGA CACAATGCCA CAGAATGAAA TATTAGAATC 240 ACCCTTCTGG CTAGGCAGCT TTTAATTTCA TTGGACTTCA CCAGGAAATC TAAAGGAAAA 300 CTGAAATGAT AAGGTGCAAA GCAAATTAGG AATACCCCTG CACAGGTTAG AATCATCTTC 360 AAGGCTTTCT GTTTCTCTCC AAGATCTTGG GCCATGGGAT ATTTATCTTG CAGTGATAAA 420 ACCGTCTTCC AGGTACAATA TAGGACAATC AGAAGCGGAG TTACAAACCC AATCAACTCG 480 CCAATGGTCA TCATAACAAC GGACTGGGCC AGGTTGACAT TCCTGGTAGG AAGATCCACA 540 AAGCATTTGG TCCTATTGCC AGAGGTATCA TCACTGGTTC TGAGGAGTGG AAAGAGTACA 600 CAGGCAAGGC GGATGATCAG CCAGCCAGCA ATGCTGATGT ACAGGTCATA TTTCTGTTTG 660 CAGTCATGAGAGAGAGAGA AAATC GTCGCACACT GATGCAGACC 720 AAGAAGTAGA TGCTTGCATA CATGTTGACA TACTTCAGGT AGAAACAGAA CATGCAGAGA 780 CCAGGCCCAA ATGGCCAGTC ATGATTCAAG TAGTAGAAGA TCCTCAGTGG CAAGGAAAGA 840 ACTTGTAGTA AGTCAGCAAT GGCTAAGTTT ATCATAAATA TCACAGCTCG TTTTGTTTCT 900 TTCATATAAC CATAGAATAC CCACAGGGCT AATATATTCC CTATGAGACC TGGCACAAGA 960 ATGACAGTGT ATGTCACTGC ATAAATAAAG TATCGAAAAT CTGTATTGTC TCCATCTGGC 1020 CTGGTACACG TGTAATTAGC AGGCATGATT CTCTCTAGAG AAACTATCTT TGCCTAATGG 1080 TGGTTCAAAA CTAAATTCAC AATCAACTGC TGTTCCTTCC AAAAGATTGA TTGCCAGTGG 1140 GTTGGAGATA CGAAGTATAA AATAACCTTC TTCTTTTTAC CAC 1183
【図１】臓器中の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８
のNorthern解析結果を示す。FIG. 1. Seven-transmembrane receptor protein JEG18 in organs
2 shows the results of Northern analysis.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI G01N 33/566 C12N 5/00 B // (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91)
Claims (14)
列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する７回膜貫通
型受容体蛋白質ＪＥＧ１８またはその塩。1. A seven-transmembrane receptor protein JEG18 or a salt thereof having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
質ＪＥＧ１８の部分ペプチドまたはその塩。2. A partial peptide of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 according to claim 1, or a salt thereof.
部分ペプチドが配列表配列番号１のアミノ酸配列で１番
目のMet から１９番目のTyr までのペプチドである請求
項２記載の部分ペプチドまたはその塩。3. The partial peptide according to claim 2, wherein the partial peptide of the seven-transmembrane receptor protein JEG18 is a peptide from Met at position 1 to Tyr at position 19 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. salt.
質ＪＥＧ１８をコードする塩基配列を有する核酸を含有
する核酸。4. A nucleic acid comprising a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the seven-transmembrane receptor protein JEG18 according to claim 1.
有する請求項６記載の核酸。5. The nucleic acid according to claim 6, which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
うち少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merから 1
6mer以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及びそ
の誘導体。6. A 12-mer to a 1-mer having at least a part of the gene sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2
Nucleic acids of 6 mer or more, more preferably 20 mer or more, and derivatives thereof.
うち少なくとも一部の遺伝子配列を有する核酸が 138番
目のＡから1139番目のＡまでの核酸である請求項６記載
の核酸、及びその誘導体。7. The nucleic acid according to claim 6, wherein the nucleic acid having at least a part of the gene sequence in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a nucleic acid from A at position 138 to A at position 1139, and Its derivatives.
うち少なくとも一部の遺伝子配列を有する 12merから 1
6mer以上、さらに望ましくは 20mer以上の核酸、及びそ
の誘導体。8. From a 12mer having at least a part of the gene sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 to 1
Nucleic acids of 6 mer or more, more preferably 20 mer or more, and derivatives thereof.
ー。9. A vector containing the nucleic acid according to claim 6.
回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１８発現形質転換体。10. A vector carrying the vector according to claim 6.
Transformant expressing gyrus transmembrane receptor protein JEG18.
し、形質転換体の細胞膜に７回膜貫通型受容体蛋白質Ｊ
ＥＧ１８を生成せしめることを特徴とする７回膜貫通型
受容体蛋白質ＪＥＧ１８またはその塩の製造方法。11. The transformant according to claim 10, which is cultured, and the transmembrane receptor protein J is added to the cell membrane of the transformant seven times.
A method for producing a seven-transmembrane receptor protein JEG18 or a salt thereof, which comprises producing EG18.
白質ＪＥＧ１８もしくはその塩または請求項２記載の部
分ペプチドもしくはその塩と、試験化合物とを接触させ
ることを特徴とする７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１
８に対するリガンドの決定方法。12. A seven-transmembrane transmembrane receptor, wherein the seven-transmembrane receptor protein JEG18 or its salt or the partial peptide or its salt according to claim 2 is brought into contact with a test compound. Type receptor protein JEG1
Method for determining ligand for 8.
体蛋白質ＪＥＧ１８もしくはその塩または請求項２記載
の部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触させ
た場合と(ii)請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白質
ＪＥＧ１８もしくはその塩または請求項２記載の部分ペ
プチドもしくはその塩に、リガンドおよび試験化合物を
接触させた場合との比較を行うことを特徴とするリガン
ドと請求項１記載の７回膜貫通型受容体蛋白質ＪＥＧ１
８との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
ング方法。13. A case where a ligand is brought into contact with the seven-transmembrane receptor protein JEG18 or a salt thereof according to claim 1 or a partial peptide or a salt thereof according to claim 2, and (ii). A ligand and a compound, which are compared with a case where a ligand and a test compound are brought into contact with the seven-transmembrane receptor protein JEG18 or a salt thereof according to item 1 or the partial peptide or a salt thereof according to item 2. Item 7. The seven-transmembrane receptor protein JEG1 according to Item 1.
A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits binding to No. 8.
白質ＪＥＧ１８もしくはその塩または請求項２記載の部
分ペプチドもしくはその塩に対する抗体。14. An antibody against the seven-transmembrane receptor protein JEG18 according to claim 1 or a salt thereof, or the partial peptide according to claim 2 or a salt thereof.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9076494A JPH10248582A (en) | 1997-03-12 | 1997-03-12 | New membrane seven-transmembrane type receptor protein jeg18 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9076494A JPH10248582A (en) | 1997-03-12 | 1997-03-12 | New membrane seven-transmembrane type receptor protein jeg18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10248582A true JPH10248582A (en) | 1998-09-22 |
Family
ID=13606782
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9076494A Withdrawn JPH10248582A (en) | 1997-03-12 | 1997-03-12 | New membrane seven-transmembrane type receptor protein jeg18 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10248582A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003000893A3 (en) * | 2001-06-26 | 2003-10-02 | Decode Genetics Ehf | Nucleic acids encoding g protein-coupled receptors |
| WO2005103709A1 (en) * | 2004-04-24 | 2005-11-03 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human g-protein coupled receptor fksg79 (fksg79) |
-
1997
- 1997-03-12 JP JP9076494A patent/JPH10248582A/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003000893A3 (en) * | 2001-06-26 | 2003-10-02 | Decode Genetics Ehf | Nucleic acids encoding g protein-coupled receptors |
| WO2005103709A1 (en) * | 2004-04-24 | 2005-11-03 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human g-protein coupled receptor fksg79 (fksg79) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100391227B1 (en) | Dna | |
| KR100631766B1 (en) | Polypeptides, cDNAs encoding the polypeptides and uses thereof | |
| JPH11502420A (en) | Mammalian chemokines CCF8 and chemokine receptor CCKR3 | |
| US20030027998A1 (en) | Novel genes encoding proteins having prognostic, diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses | |
| JP2002539773A (en) | Secreted proteins and nucleic acids encoding them | |
| WO1999007738A2 (en) | Human orphan receptor ntr-1 | |
| US20100291579A1 (en) | Novel genes encoding proteins having prognostic, diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses | |
| WO2000058463A1 (en) | Polynucleotide and deduced amino acid sequences from stromal cells | |
| US20030143676A1 (en) | Fibroblast growth factor receptors and methods for their use | |
| JPH10511936A (en) | Human somatostatin-like receptor | |
| US5688927A (en) | Macrophage derived chemokine | |
| WO2000014229A1 (en) | Novel receptor protein and method for diagnosing inflammatory diseases by using the same | |
| JP2002241399A (en) | Seven-transmembrane type receptor protein et240 | |
| EP1283214B1 (en) | Novel collectins | |
| JP2000023676A (en) | Seven-pass transmembrane receptor protein erg 5 | |
| JP2003530833A (en) | Organic compounds | |
| JPH10248582A (en) | New membrane seven-transmembrane type receptor protein jeg18 | |
| JPH1132770A (en) | Seven-transmembrane type receptor protein jeg62 | |
| JP2000023677A (en) | Seven-pass transmembrane receptor protein erg 9 | |
| US7749758B2 (en) | Human and mammalian stem cell-derived neuron survival factors | |
| JPH10210993A (en) | Cdna clone he8ch90 coding new 7-transmembrane receptor | |
| JPH11155573A (en) | 7 transmembrane receptor protein et 60 | |
| JP4042923B2 (en) | Immune related factors | |
| US20020165350A1 (en) | Novel polypeptide, a method of producing it, and utility of the polypeptide | |
| JPWO2003048358A1 (en) | Adipocyte differentiation-related genes and proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20040601 |