JPH10229884A - Production of secretory kex2 derivative - Google Patents
Production of secretory kex2 derivativeInfo
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- JPH10229884A JPH10229884A JP9063953A JP6395397A JPH10229884A JP H10229884 A JPH10229884 A JP H10229884A JP 9063953 A JP9063953 A JP 9063953A JP 6395397 A JP6395397 A JP 6395397A JP H10229884 A JPH10229884 A JP H10229884A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｋｅｘ２プロテア
ーゼ活性を有し、培養液中に大量に分泌されるＫｅｘ２
誘導体及びその製造方法に関する。さらに、本発明は、
前述の分泌型Ｋｅｘ２誘導体の利用法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a Kex2 protein having Kex2 protease activity and secreted in a large amount into a culture solution.
The present invention relates to a derivative and a method for producing the derivative. Further, the present invention provides
The present invention relates to the use of the above-mentioned secretory Kex2 derivative.
【０００２】[0002]
【従来の技術】多くのキメラタンパク質発現法による生
理活性ペプチド生産法が試みられており、目的ペプチド
の遊離方法として、化学的あるいは酵素的切断法が用い
られている。化学的方法としては、亜硝酸によるアスパ
ラギン残基の開裂、ＣＮＢｒによるメチオニン残基の開
裂がある（Itakura et al. Science 198, 1059, 197
7）。しかし、この方法は、目的ペプチドの修飾が避け
らず、精製のコストにも問題がある。2. Description of the Related Art Many methods for producing a physiologically active peptide by a chimeric protein expression method have been attempted, and a chemical or enzymatic cleavage method has been used as a method for releasing a target peptide. Chemical methods include cleavage of asparagine residues by nitrous acid and cleavage of methionine residues by CNBr (Itakura et al. Science 198, 1059, 197).
7). However, in this method, modification of the target peptide is inevitable, and there is a problem in purification cost.
【０００３】酵素的方法には、リジンのＣ末端側のペプ
チド結合を特異的に切断するリシルエンドペプチダーゼ
（アクロモバクタープロテアーゼ−Ｉ）、グルタミン酸
のＣ末端側のペプチド結合を特異的に切断するスタフィ
ロコッカルプロテアーゼＶ８が用いられている（特公平
６−８７７８８）。しかし、前述の化学的方法やエンド
プロテアーゼは１アミノ酸残基を認識するため、目的ペ
プチドを効率的にキメラタンパク質から切り出すために
は目的ペプチドにこれらのアミノ酸残基が含まれないこ
とが前提となり、生産できるペプチドが限定される。こ
のため、複数のアミノ酸残基を認識する汎用性の高い切
断方法が求められている。[0003] Enzymatic methods include lysyl endopeptidase (Achromobacter protease-I), which specifically cleaves a peptide bond at the C-terminal side of lysine, and a stapler, which specifically cleaves a peptide bond at the C-terminal side of glutamic acid. Filococcal protease V8 has been used (Japanese Patent Publication 6-87788). However, since the aforementioned chemical methods and endoproteases recognize one amino acid residue, it is premised that the target peptide does not contain these amino acid residues in order to efficiently excise the target peptide from the chimeric protein. The peptides that can be produced are limited. For this reason, a highly versatile cleavage method that recognizes a plurality of amino acid residues is required.
【０００４】プロホルモン変換酵素は、生体内でペプチ
ドホルモンをその前駆体から生成する酵素であり、イン
ビトロにおいても、タンパク質からペプチドホルモンを
切り出すための酵素として望ましい性質を持つことが期
待される。Ｋｅｘ２プロテアーゼは、サッカロマイセス
・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のプ
ロホルモン変換酵素で、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ配列のＣ末端側のペプチド結合を特
異的に切断する、カルシウム依存性セリンプロテアーゼ
である。Ｋｅｘ２プロテアーゼは、Ｎ末端側にシグナル
配列をＣ末端側に疎水性アミノ酸が連続する膜貫通領域
を持つ８１４アミノ酸残基からなるタンパク質で、細胞
内ではトランスゴルジに局在する。[0004] Prohormone converting enzymes are enzymes that produce peptide hormones from their precursors in vivo, and are expected to have desirable properties in vitro as enzymes for cutting peptide hormones from proteins. Kex2 protease is a prohormone converting enzyme derived from Saccharomyces cerevisiae, and is Lys-Arg, Arg-Ar.
g, a calcium-dependent serine protease that specifically cleaves the peptide bond on the C-terminal side of the Pro-Arg sequence. Kex2 protease is a protein consisting of 814 amino acid residues having a transmembrane region having a signal sequence at the N-terminus and a continuous hydrophobic amino acid at the C-terminus.
【０００５】なお、Ｋｅｘ２プロテアーゼをコードする
塩基配列及び対応のアミノ酸配列を配列表・配列番号１
に示す。サッカロマイセス・セレビジアエを宿主とした
Ｃ末端領域を欠失したＫｅｘ２誘導体の遺伝子発現およ
びその解析の結果、配列番号１のアミノ酸配列１から６
１４までのアミノ酸配列を有するＫｅｘ２誘導体は、Ｋ
ｅｘ２プロテアーゼ活性を保持し、培養液中に分泌され
ることがわかっている（Fuller et al. Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA.,86, 1434-1438, 1989 、特開平１−１９
９５７８）。なお本明細書において、Ｋｅｘ２プロテア
ーゼの誘導体を配列番号１のアミノ酸配列１からのアミ
ノ酸数によって表記する。即ち、配列番号１のアミノ酸
配列１から６１４までのアミノ酸配列を有するＫｅｘ２
誘導体は、Ｋｅｘ２−６１４と表記する。[0005] The nucleotide sequence encoding Kex2 protease and the corresponding amino acid sequence are shown in Sequence Listing and SEQ ID NO: 1
Shown in As a result of gene expression and analysis of a Kex2 derivative deleted from the C-terminal region using Saccharomyces cerevisiae as a host, amino acid sequences 1 to 6 of SEQ ID NO: 1 were obtained.
Kex2 derivatives having up to 14 amino acid sequences
It has been shown to retain ex2 protease activity and be secreted into the culture broth (Fuller et al. Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA., 86, 1434-1438, 1989, JP-A-1-19
9578). In this specification, a derivative of Kex2 protease is represented by the number of amino acids from the amino acid sequence 1 of SEQ ID NO: 1. That is, Kex2 having the amino acid sequence from amino acid sequence 1 to 614 of SEQ ID NO: 1
The derivative is denoted as Kex2-614.
【０００６】今までに、分泌生産が検討されたＫｅｘ２
誘導体に、ｓｓ−Ｋｅｘ２とＫｅｘ２Δp がある。ｓｓ
−Ｋｅｘ２は、Ｋｅｘ２−６１４に３アミノ酸残基のペ
プチドが付加したＫｅｘ２誘導体で、サッカロマイセス
・セレビジアエを宿主として生産が検討された（Brenne
r et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 89, 922-9
26, 1992）。宿主にプロテアーゼ欠損株（ｐｅｐ４）を
用いて発現され（４ｍｇ／Ｌ培養液）、培養上清から精
製効率２０％で精製された。精製したｓｓ−Ｋｅｘ２
は、Ａｓｎ型糖鎖分解酵素EndoH 処理により分子量が低
下することから、Ａｓｎ型糖鎖を持つことが示唆されて
いる。さらに合成基質を用いた酵素活性のｐＨ依存性や
基質特異性についても検討されている。[0006] Kex2 for which secretory production has been studied so far.
Derivatives include ss-Kex2 and Kex2Δp. ss
-Kex2 is a Kex2 derivative in which a peptide of 3 amino acid residues is added to Kex2-614, and its production was examined using Saccharomyces cerevisiae as a host (Brenne
r et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 922-9
26, 1992). It was expressed using a protease-deficient strain (pep4) as a host (4 mg / L culture solution) and purified from the culture supernatant at a purification efficiency of 20%. Purified ss-Kex2
Shows that Asn-type sugar chain has Asn-type sugar chain because the molecular weight is reduced by the treatment with Asn-type sugar chain-degrading enzyme EndoH. Further, the pH dependence and substrate specificity of enzyme activities using synthetic substrates have been studied.
【０００７】Ｋｅｘ２Δp は、本明細書においてはＫｅ
ｘ２−６６６と表されるＫｅｘ２誘導体で、昆虫細胞Ｓ
ｆ９を宿主として生産条件が検討され、活性の９０％が
培養上清に分泌すること、また分泌したＫｅｘ２Δp の
分子量は７０ｋＤａで、細胞内における分子量１２０ｋ
Ｄａに比べ小さいことがわかった（Germain et al. Eu
r. J. Biochem. 204, 121-126, 1992）。さらに、分子
量７０ｋＤａのタンパク質はＫｅｘ２を発現した培養上
清にも見られること、また、Ｋｅｘ２Δp の３８５番目
のセリン残基（Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性の触媒部分）
をアラニン残基に置換させると、培養上清に見られるＫ
ｅｘ２Δp の分子量が細胞内のそれと同じ１２０ｋＤａ
になることから、７０ｋＤａのタンパク質は、培養液中
でＣ末端部分が欠失したＫｅｘ２Δp （１２０ｋＤａ）
の自己分解物と考えられている。[0007] In the present specification, Kex2Δp is Ke
x2-666, a insect cell S
Production conditions were examined using f9 as a host, 90% of the activity was secreted into the culture supernatant, and the molecular weight of the secreted Kex2Δp was 70 kDa, and the molecular weight in the cell was 120 kDa.
Da is smaller than Da (Germain et al. Eu
r. J. Biochem. 204, 121-126, 1992). Furthermore, a protein with a molecular weight of 70 kDa is also found in the culture supernatant expressing Kex2, and the 385th serine residue of Kex2Δp (catalytic portion of Kex2 protease activity)
Is replaced with an alanine residue, K
The molecular weight of ex2Δp is 120 kDa, the same as that in cells.
Therefore, the 70 kDa protein is a Kex2Δp (120 kDa) having a C-terminal part deleted in the culture medium.
It is considered a self-decomposition product.
【０００８】さらに、分解物の分子量およびＫｅｘ２プ
ロテアーゼの基質特異性から予想された切断部位Ｌｙｓ
−Ａｒｇ配列（配列番号１；アミノ酸配列番号５０３−
５０４番目）をＬｙｓ−Ｌｅｕ配列に変えた誘導体Ｋｅ
ｘ２Δ504 の発現が試みられた。しかし、この場合も培
養液中には７０ｋＤａのタンパク質が見られ、Ｋｅｘ２
Δp は自己分解時には必ずしも合成基質から予想される
Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列を切断していないこと、また、Ｋｅ
ｘ２プロテアーゼの認識部位となるような配列が他に存
在しないことから、Ｋｅｘ２Δ504 は合成基質から予想
される配列と全く違う配列を認識して自らを切断してい
る可能性が示唆されている。Further, the cleavage site Lys predicted from the molecular weight of the digest and the substrate specificity of Kex2 protease
-Arg sequence (SEQ ID NO: 1; amino acid sequence ID 503-
Derivative Ke in which 504) is changed to a Lys-Leu sequence
Expression of x2Δ504 was attempted. However, also in this case, a 70 kDa protein was found in the culture solution, and Kex2
Δp indicates that the Lys-Arg sequence expected from the synthetic substrate was not necessarily cleaved during autolysis,
The absence of any other sequence that would serve as a recognition site for the x2 protease suggests that Kex2Δ504 may recognize itself and cleave itself by recognizing a sequence completely different from the sequence expected from the synthetic substrate.
【０００９】このように、Ｋｅｘ２誘導体については、
合成基質を用いた基質特異性の研究は行われているが、
タンパク質を用いた場合の基質特異性はわかっていな
い。また、種々のＫｅｘ２誘導体の分泌生産量に関する
知見も少なく、Ｋｅｘ２−６１４以外のＫｅｘ２誘導体
が安定に分泌生産可能かどうかについてもわかっていな
い。Thus, the Kex2 derivative is
Although research on substrate specificity using synthetic substrates has been conducted,
The substrate specificity when using proteins is not known. In addition, there is little knowledge about the secretory production amounts of various Kex2 derivatives, and it is not known whether Kex2 derivatives other than Kex2-614 can stably produce secretions.
【００１０】[0010]
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者ら
は、Ｋｅｘ２プロテアーゼ酵素活性を有する酵素を大量
に供給する方法を提供することを課題とし、本発明を完
成した。さらに、本発明は、工業スケールでも本酵素が
キメラタンパク質から目的とするペプチドを切り出すた
めに有用な酵素であることを実験的に示すものである。
具体的には、工業的スケールでのキメラタンパク質発現
法による有用ペプチドの製造において、Ｋｅｘ２プロテ
アーゼ酵素活性を有する酵素が利用できるためには、以
下の３点の課題の解決が必要である。Accordingly, the present inventors have made the object of providing a method for supplying a large amount of an enzyme having Kex2 protease enzyme activity, and completed the present invention. Further, the present invention experimentally shows that the present enzyme is an enzyme useful for cleaving a target peptide from a chimeric protein even on an industrial scale.
Specifically, in the production of a useful peptide by the chimeric protein expression method on an industrial scale, the following three problems need to be solved in order to use an enzyme having Kex2 protease enzyme activity.
【００１１】まず第１の課題は、Ｋｅｘ２誘導体の生産
量の向上である。今まで報告されている中でＫｅｘ２プ
ロテアーゼ活性を有する酵素として最も生産量が多いの
はｓｓーＫｅｘ２で、その生産量は培養液１Ｌあたり約
４ｍｇである。しかし、この生産量は、工業スケールで
キメラタンパク質から目的ペプチドを切り出すために用
いる酵素の生産量としては少ない。また、Ｋｅｘ２Δp
のような分泌型Ｋｅｘ２誘導体は、培養液中で自己分解
する可能性が示唆されていて、しかも、その切断部位が
予想できないことから、どのような誘導体をデザインす
れば生産量を上げることができるかわかっていない。The first problem is to improve the production of Kex2 derivatives. Among the reported enzymes having Kex2 protease activity, ss-Kex2 has the highest production amount, and its production amount is about 4 mg per liter of culture solution. However, this production amount is small as the production amount of an enzyme used for cutting out a target peptide from a chimeric protein on an industrial scale. Also, Kex2Δp
It has been suggested that secretory Kex2 derivatives such as described above may degrade in a culture solution, and the cleavage site cannot be predicted. Therefore, any derivative can be designed to increase the production amount. I don't know.
【００１２】従って、自己分解しないＫｅｘ２誘導体の
選出および当該Ｋｅｘ２誘導体の高発現系の構築が必要
になる。なお、本明細書において、自己分解とはＫｅｘ
２プロテアーゼ活性の低下を伴う自分自身の分解を意味
し、Ｋｅｘ２プロテアーゼのＬｙｓ−Ａｒｇ（配列番号
１；アミノ酸配列番号１０８〜１０９）の自己切断に伴
う成熟化（Brenner & Fuller, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89, 922-926, 1992 ）を意味するものではない。[0012] Therefore, it is necessary to select a Kex2 derivative that does not self-decompose and to construct a high expression system of the Kex2 derivative. In this specification, the term “self-decomposition” refers to Kex
Acad, which means degradation of Lys-Arg (SEQ ID NO: 1; amino acids SEQ ID NOs: 108-109) of Kex2 protease by self-cleavage (Brenner & Fuller, Proc. Natl. Acad . Sci.
USA, 89, 922-926, 1992).
【００１３】次に第２の課題には、他のプロテアーゼが
混入していない高純度のＫｅｘ２誘導体の精製方法の確
立が上げられる。今まで報告されているＫｅｘ２誘導体
の活性は、合成基質のみを用い、タンパク質を基質とし
た評価がないため、他のプロテアーゼが混入しているか
否かわかっていない。特に工業スケールでのキメラタン
パク質の切り出しにおいては、反応条件の細かなコント
ロールが困難で、他のプロテアーゼの混入は著しく目的
ペプチドの回収率を低下させる可能性があり、Ｋｅｘ２
プロテアーゼ活性を有する酵素を高純度に精製する必要
がある。[0013] The second problem is to establish a method for purifying a high-purity Kex2 derivative that is not contaminated with other proteases. Since the activity of the Kex2 derivative reported so far uses only a synthetic substrate and has not been evaluated using a protein as a substrate, it is not known whether or not other proteases are contaminated. In particular, in excision of chimeric proteins on an industrial scale, it is difficult to finely control the reaction conditions, and contamination with other proteases may significantly reduce the recovery rate of the target peptide.
It is necessary to purify enzymes having protease activity to high purity.
【００１４】最後に第３の課題として、Ｋｅｘ２プロテ
アーゼ活性を有する酵素によるキメラタンパク質の切断
条件設定が上げられる。タンパク質の高次構造が、酵素
活性、反応条件下における酵素の安定性、あるいは、基
質の認識に影響を及ぼすことは当業者には良く知られて
いる。一方、先述の報告では、これらの点についてほと
んど検討されていない。特に、キメラタンパク質発現法
では、キメラタンパク質が不溶性封入体を形成する場合
が多いので、これを可溶化するために尿素等の変性剤が
用いられる。しかし、一般に酵素がどのような構造を有
していれば尿素存在下で酵素活性を保持できるかはわか
っていない。従って、Ｋｅｘ２プロテアーゼや分泌型Ｋ
ｅｘ２誘導体が、タンパク質から目的とするペプチドを
切り出す酵素として使用可能か否かはわかっていない。Finally, as a third problem, the setting of the conditions for cutting the chimeric protein by an enzyme having Kex2 protease activity is required. It is well known to those skilled in the art that the conformation of a protein affects enzyme activity, stability of the enzyme under reaction conditions, or recognition of a substrate. On the other hand, the above-mentioned report hardly considered these points. In particular, in the chimeric protein expression method, since the chimeric protein often forms an insoluble inclusion body, a denaturant such as urea is used to solubilize the insoluble inclusion body. However, it is generally unknown what structure the enzyme has to maintain the enzyme activity in the presence of urea. Therefore, Kex2 protease and secreted K
It is not known whether the ex2 derivative can be used as an enzyme for cleaving a peptide of interest from a protein.
【００１５】また、他のプロホルモン変換酵素について
も、大量生産には成功しておらず、これらの酵素が試験
管内でキメラタンパク質から目的ペプチドを切り出すた
めの酵素として用いることが可能か否かもわかっていな
い。従って、Ｋｅｘ２プロテアーゼを始めとするプロホ
ルモン変換酵素をキメラタンパク質から目的ペプチドを
遊離させる酵素として用いるためには、効率的な発現方
法と精製方法の確立、さらに、試験管内でタンパク質を
基質としたときの切断条件の設定が必要である。[0015] In addition, mass production of other prohormone converting enzymes has not been successful, and it is known whether these enzymes can be used as enzymes for cleaving a target peptide from a chimeric protein in a test tube. Absent. Therefore, in order to use a prohormone converting enzyme such as Kex2 protease as an enzyme for releasing a target peptide from a chimeric protein, an efficient expression method and a purification method must be established, and further, when a protein is used as a substrate in a test tube, It is necessary to set cutting conditions.
【００１６】[0016]
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前述の課
題の解決方法を検討した結果、Ｎ末端１位から６１８〜
６９８のアミノ酸配列を有するＫｅｘ２誘導体は培養液
中で自己分解することなく分泌生産量が著しく増加する
こと、また、宿主にメタノール資化性酵母を用いればさ
らに生産量が増加することを見いだし、Ｋｅｘ２誘導体
の大量供給を可能にした。また、分泌型Ｋｅｘ２誘導体
を、培養上清濃縮液から、陰イオン交換クロマト、疎水
クロマトの２ステップでＳＤＳ−ＰＡＧＥ上単一バンド
まで精製し、精製したＫｅｘ２誘導体には、キメラタン
パク質から目的ペプチドを切り出す条件では、目的ペプ
チドを分解し、回収率を低下させるような他のプロテア
ーゼ活性が見られないことを確認した。Means for Solving the Problems As a result of studying a method for solving the above-mentioned problem, the present inventors have found that 618 to
It has been found that the Kex2 derivative having the amino acid sequence of 698 significantly increases secretory production without self-decomposition in the culture broth, and further increases the production by using methanol-assimilating yeast as a host. This enabled a large supply of derivatives. In addition, the secreted Kex2 derivative was purified from the culture supernatant concentrate to a single band on SDS-PAGE in two steps of anion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, and the purified Kex2 derivative contained the target peptide from the chimeric protein. Under the conditions for excision, it was confirmed that the target peptide was degraded and no other protease activity that would reduce the recovery rate was observed.
【００１７】さらに、キメラタンパク質から目的ペプチ
ドを切り出す条件において、尿素濃度により分泌型Ｋｅ
ｘ２誘導体の基質特異性が変化することを見いだし、目
的ペプチド内にＫｅｘ２プロテアーゼの認識配列を２カ
所含む場合でも目的ペプチドを７５％の効率でキメラタ
ンパク質から切り出せることを示した。また、中量スケ
ールで、精製したＫｅｘ２−６６０を用いてキメラタン
パク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４からｈＰＴＨ
（１−３４）を切り出すことができること、すなわち、
分泌型Ｋｅｘ２誘導体の生産量、純度、キメラタンパク
質からの目的ペプチドの切り出し効率等が工業スケール
の生産にも適応できることを示し、本発明を完成させ
た。Furthermore, under the conditions for cutting out the target peptide from the chimeric protein, the secretory Ke
It was found that the substrate specificity of the x2 derivative changed, indicating that the target peptide could be cleaved from the chimeric protein with 75% efficiency even when the target peptide contained two Kex2 protease recognition sequences. Further, on a medium scale, the chimeric protein βGal-117S4HPPH34 was converted to hPTH using purified Kex2-660.
(1-34) can be cut out, that is,
It has been shown that the production amount and purity of the secreted Kex2 derivative, the efficiency of excision of the target peptide from the chimeric protein, and the like can be applied to industrial-scale production, and the present invention has been completed.
【００１８】上記の課題を解決するため、本発明は、配
列番号：１に示すＫｅｘ２プロテアーゼのアミノ酸配列
において、アミノ酸番号１のＭｅｔをＮ−末端としアミ
ノ酸番号６１８〜６９８の間のいずれかのアミノ酸をＣ
−末端とする天然のアミノ酸配列、又はこの天然のアミ
ノ酸配列に対して１個もしくは複数個のアミノ酸の置
換、欠失もしくは付加により修飾されているアミノ酸配
列をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでメタノール
資化性酵母を形質転換し、得られた形質転換体を培養
し、該培養物から採取することにより得られるＫｅｘ２
プロテアーゼの酵素活性を有する蛋白質を提供する。な
お、上記の蛋白質を含めて、本明細書では、「Ｋｅｘ２
プロテアーゼ活性を有する酵素」、「Ｋｅｘ２プロテア
ーゼ誘導体」、「分泌型Ｋｅｘ２誘導体」等という場合
がある。In order to solve the above-mentioned problems, the present invention relates to an amino acid sequence of Kex2 protease shown in SEQ ID NO: 1, wherein Met of amino acid number 1 is N-terminal and any amino acid between amino acids 618 to 698 is present. To C
-An expression vector containing a DNA encoding a natural amino acid sequence at the end or an amino acid sequence modified by substitution, deletion or addition of one or more amino acids with respect to the natural amino acid sequence. Kex2 obtained by transforming a transforming yeast, culturing the resulting transformant, and collecting from the culture.
Provided is a protein having an enzymatic activity of a protease. In the present specification, including the above proteins, “Kex2
Enzymes having protease activity "," Kex2 protease derivatives "," secreted Kex2 derivatives "and the like.
【００１９】本発明はまた、前記の蛋白質をコードする
遺伝子、特にＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成るベクター、
特に発現ベクター、及び該ベクターでメタノール資化性
酵母を形質転換することにより得られる形質転換体を提
供する。本発明はさらに、前記蛋白質の製造方法であっ
て、上記発現ベクターにより形質転換されたメタノール
資化性酵母を培養し、該培養物から該蛋白質を採取する
ことを特徴とする方法を提供する。該蛋白質は、培養上
清から、陰イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性ク
ロマトグラフィーを用いて行うのが好ましい。The present invention also relates to a gene encoding the above-mentioned protein, particularly DNA, a vector comprising the DNA,
In particular, the present invention provides an expression vector and a transformant obtained by transforming a methanol-assimilating yeast with the vector. The present invention still further provides a method for producing the protein, which comprises culturing a methanol-assimilating yeast transformed with the expression vector and collecting the protein from the culture. The protein is preferably obtained from the culture supernatant using anion exchange chromatography and hydrophobic chromatography.
【００２０】本発明はまた、前記蛋白質を用いた、キメ
ラタンパク質からの目的ペプチドの切り出し方法を提供
する。キメラ蛋白質は、目的ペプチドに保護ペプチドが
付加されたタンパク質であり、目的ペプチドと保護ペプ
チドの接合部が、前記蛋白質が認識するアミノ酸配列で
あれば、前記蛋白質により目的ペプチドを切り出すこと
ができる。また、目的ペプチドと保護ペプチドとの接合
部位が、前記蛋白質が認識するアミノ酸配列でない場合
においても、目的ペプチドと保護ペプチドの間に前記蛋
白質の認識部位を挿入することにより、前記蛋白質を用
いて目的ペプチドを切り出すことができる。[0020] The present invention also provides a method for cutting out a target peptide from a chimeric protein using the protein. A chimeric protein is a protein in which a protective peptide has been added to a target peptide. If the junction between the target peptide and the protective peptide is an amino acid sequence recognized by the protein, the target peptide can be cut out by the protein. Further, even when the junction site between the target peptide and the protected peptide is not an amino acid sequence recognized by the protein, by inserting the recognition site of the protein between the target peptide and the protected peptide, The peptide can be cut out.
【００２１】[0021]
【発明の実施の形態】本発明の蛋白質は、後記のごとく
蛋白質の長さ、特にＣ−末端の位置により生産分泌効率
が顕著に異る。本発明は、高い生産分泌効率をもたらす
長さを有する蛋白質を提供するものであり、配列番号：
１におけるアミノ酸配列の１位のＭｅｔから６１８〜６
９８位のいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列を有す
るＫｅｘ２プロテアーゼ誘導体である。本発明のＫｅｘ
２プロテアーゼ誘導体のＣ−末端は、好ましくは配列番
号：１のアミノ酸配列の６３０位〜６８８位のいずれか
のアミノ酸であり、さらに好ましくは６３０位〜６８２
位のいずれかのアミノ酸であり、さらに好ましくは６３
０位〜６７９位のいずれかのアミノ酸である。配列番
号：１の前記アミノ酸配列の一部分からなる上記の種々
のアミノ酸配列を、本発明においては天然のアミノ酸配
列と称する場合がある。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION As described below, the production and secretion efficiency of the protein of the present invention is significantly different depending on the length of the protein, particularly the position of the C-terminal. The present invention provides a protein having a length that provides a high production and secretion efficiency, comprising the sequence of SEQ ID NO:
1 to 618-6 from Met at position 1 of the amino acid sequence
It is a Kex2 protease derivative having an amino acid sequence up to any amino acid at position 98. Kex of the present invention
The C-terminal of the 2 protease derivative is preferably any one of amino acids 630 to 688 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and more preferably 630 to 682.
An amino acid at any position, more preferably 63
It is any one of amino acids 0 to 679. In the present invention, the above various amino acid sequences comprising a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be referred to as natural amino acid sequences.
【００２２】しかしながら、酵素タンパク質のアミノ酸
配列中の活性に関与する領域以外の領域において複数個
のアミノ酸の他のアミノ酸による置換、アミノ酸の欠失
又はアミノ酸の付加を行っても、その酵素の活性が維持
されることは当業者によりよく知られている。従って、
本発明は、上記の天然のアミノ酸配列を有するＫｅｘ２
プロテアーゼ誘導体の他に、上記天然のアミノ酸配列に
対して１個又は複数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加
により修飾されているアミノ酸配列を有し、なおＫｅｘ
２プロテアーゼの活性を有している蛋白質も包含する。However, even if substitution of a plurality of amino acids with other amino acids, deletion of amino acids or addition of amino acids is carried out in a region other than the region involved in the activity in the amino acid sequence of the enzyme protein, the activity of the enzyme is not reduced. Maintaining is well known to those skilled in the art. Therefore,
The present invention provides a Kex2 having the above-described natural amino acid sequence.
In addition to the protease derivative, the amino acid sequence has an amino acid sequence modified by substitution, deletion or addition of one or more amino acids with respect to the above natural amino acid sequence.
A protein having the activity of 2 protease is also included.
【００２３】本発明はまた、前記の種々のポリペプチド
をコードする遺伝子、特にＤＮＡを提供する。この様な
ＤＮＡは、例えば配列番号：１に示すような塩基配列、
又は同じアミノ酸配列をコードする他の塩基配列を有す
る全長ＤＮＡ又は目的とするＤＮＡを含有するＤＮＡを
適当な制限酵素により切断し、所望によりオリゴヌクレ
オチドを連結するか、又は前記のＤＮＡの適当な場所に
翻訳終止コドンを導入する等の常法に従って作製するこ
とができる。また、前記の修飾されたアミノ酸配列を有
するＤＮＡは、例えば配列番号：１に記載の塩基配列を
有する天然の全長ＤＮＡ又はその断片を鋳型とし、使用
し、所望の変異を含むプライマーオリゴヌクレオチドを
変異原プライマーとして使用して、部位特定変異誘発法
（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）等の常法を用
いて作製することができる。The present invention also provides genes encoding the above-mentioned various polypeptides, particularly DNA. Such a DNA has, for example, a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 1,
Alternatively, a full-length DNA having another nucleotide sequence encoding the same amino acid sequence or a DNA containing the target DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and an oligonucleotide is ligated if necessary. Can be prepared according to a conventional method such as introducing a translation stop codon. In addition, the DNA having the modified amino acid sequence can be obtained, for example, by using a natural full-length DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof as a template to mutate a primer oligonucleotide containing a desired mutation. Using site-directed mutagenesis as the original primer
s) and the polymerase chain reaction (PCR).
【００２４】本発明の発現ベクターは、使用する宿主に
おいて機能し得るプロモーター等の発現制御領域を含有
する。例えば、メタノール資化性酵母を宿主として使用
する場合には、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素
のプロモーター、グリセロリン酸キナーゼのプロモータ
ー、酸性ホスファターゼのプロモーター、アルコールオ
キシダーゼのプロモーター、ギ酸脱水素酵素のプロモー
ター、メタノールオキシダーゼのプロモーター等が使用
できる。The expression vector of the present invention contains an expression control region such as a promoter which can function in a host to be used. For example, when a methanol-assimilating yeast is used as a host, glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase promoter, glycerophosphate kinase promoter, acid phosphatase promoter, alcohol oxidase promoter, formate dehydrogenase promoter And a methanol oxidase promoter.
【００２５】本発明の宿主としては、メタノール資化性
酵母が使用でき、例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ハン
セヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、キャンディダ（Ｃａｎ
ｄｉｄａ）属等に属するものが好ましく、ピキア・パス
トリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌ
ラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈａ）、キャンディダ・ボイディニイ（Ｃａｎｄｉ
ｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ）種等が挙げられる。特に好ま
しい酵母はキャンディダ属又はピキア属の酵母、例えば
キャンディダ・ボイディニイ、及びピキア・パストリス
である。As the host of the present invention, a methanol-assimilating yeast can be used, and examples thereof include Pichia, Hansenula, and Candida.
and the like belonging to the genus dida), such as Pichia pastoris and Hansenula polymorpho.
rpha), Candida Boyidny (Candi)
da bodinini) species and the like. Particularly preferred yeasts are yeasts of the genus Candida or Pichia, such as Candida voidinii and Pichia pastoris.
【００２６】即ち、本発明者等は、Ｋｅｘ２プロテアー
ゼ活性を有する酵素を、キメラタンパク質からペプチド
を工業スケールで切り出すための酵素として利用可能に
するためには、１）生産量が高く大量に供給できるこ
と、２）高純度で目的ペプチドを切断する他のプロテア
ーゼの混入がないこと、３）タンパク質を基質とした切
断条件が設定できること、の課題の解決が必要であると
考え、以下の検討を行った。That is, in order to make the enzyme having Kex2 protease activity usable as an enzyme for cutting out a peptide from a chimeric protein on an industrial scale, the present inventors have to 1) be able to supply a large amount in a high production amount. We considered that it is necessary to solve the problems of 2) that there is no contamination with other proteases that cleave the target peptide with high purity, and that 3) that the cleavage conditions can be set using a protein as a substrate. .
【００２７】まず、最初の課題であるＫｅｘ２プロテア
ーゼ活性を有する酵素の生産量を上げる条件について検
討した。Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性を有する酵素を工業
スケールで大量に精製するためには、生産量が多いこと
はもちろん、その精製が簡単であることが重要であり、
このためには、Ｋｅｘ２誘導体を他のタンパク質が少な
い培養溶液中への分泌させることが有利であると考え
た。分泌型Ｋｅｘ２誘導体には、前述のようにｓｓＫｅ
ｘ２に関する報告があるが、その生産量は４ｍｇ／Ｌ培
養液で、工業的スケールで用いるためには少ない。そこ
で、種々の分泌型Ｋｅｘ２誘導体をコードする遺伝子を
作製してサッカロマイセス・セレビジアエを宿主として
発現させ、分泌生産量を調べた。First, conditions for increasing the production amount of an enzyme having Kex2 protease activity, which is the first problem, were examined. In order to purify an enzyme having Kex2 protease activity in large quantities on an industrial scale, it is important not only that the production amount is large, but also that the purification is simple.
For this purpose, it was considered advantageous to secrete the Kex2 derivative into a culture solution containing few other proteins. Secreted Kex2 derivatives include ssKe
Although there is a report on x2, its production is 4 mg / L culture, which is low for use on an industrial scale. Therefore, genes encoding various secretory Kex2 derivatives were prepared and expressed using Saccharomyces cerevisiae as a host, and the secretory production was examined.
【００２８】本発明において使用したＫｅｘ２誘導体
は、Ｋｅｘ２−６１４、Ｋｅｘ２−６３０、Ｋｅｘ２−
６４０、Ｋｅｘ２−６５０、Ｋｅｘ２−６６０、Ｋｅｘ
２−６７９、Ｋｅｘ２−６８２、Ｋｅｘ２−６８８及び
Ｋｅｘ２−６９９である。Ｋｅｘ２誘導体の遺伝子の発
現には、サッカロマイセス・セレビジアエのグリセルア
ルデヒドー３ーリン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）遺伝子のプ
ロモーターを用いた。これらの発現ユニットを含むプラ
スミドを導入したサッカロマイセス・セレビジアエを３
０℃で一晩培養し、培養液中のＫｅｘ２プロテアーゼ活
性を合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ
を基質として測定した。The Kex2 derivatives used in the present invention include Kex2-614, Kex2-630 and Kex2-630.
640, Kex2-650, Kex2-660, Kex
2-679, Kex2-682, Kex2-688 and Kex2-699. For expression of the Kex2 derivative gene, a promoter of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) gene of Saccharomyces cerevisiae was used. Saccharomyces cerevisiae transfected with a plasmid containing these expression units
After culturing at 0 ° C. overnight, the Kex2 protease activity in the culture solution was measured using a synthetic substrate Boc-Leu-Arg-Arg-MCA.
Was measured as a substrate.
【００２９】その結果、Ｋｅｘ２−６１４、Ｋｅｘ２−
６３０、Ｋｅｘ２−６４０、Ｋｅｘ２−６５０、Ｋｅｘ
２−６６０、Ｋｅｘ２−６７９、Ｋｅｘ２−６８２及び
Ｋｅｘ２−６８８の遺伝子の発現ユニットを導入した酵
母の培養上清には、Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性が検出さ
れるが、Ｋｅｘ２−６９９の遺伝子の発現ユニットを導
入した酵母の培養上清には、活性は検出されないことが
わかった。このことから、Ｋｅｘ２誘導体を培養上清に
分泌させるためには、Ｎ末端１位からｍ位までのアミノ
酸残基（ｍ＝６１４〜６８８）を有する誘導体の遺伝子
を用いればいいことが明らかになった。As a result, Kex2-614, Kex2-614
630, Kex2-640, Kex2-650, Kex
Kex2 protease activity is detected in the culture supernatant of yeast into which the expression units of the genes 2-660, Kex2-679, Kex2-682, and Kex2-688 are introduced, but the expression unit of the gene Kex2-699 is introduced. It was found that no activity was detected in the culture supernatant of the yeast thus obtained. From this, it is clear that in order to allow the Kex2 derivative to be secreted into the culture supernatant, it is sufficient to use a derivative gene having amino acid residues from the N-terminal position 1 to the m-position (m = 614 to 688). Was.
【００３０】さらに、ＯＤ６６０あたりの分泌生産量
は、実施例１によれば今までに報告があるＫｅｘ２−６
１４に比べ、Ｋｅｘ２−６６０及びＫｅｘ２−６７９で
は有意に多いことも見いだした。また、培養上清を分画
分子量サイズ１０，０００の限外ろ過膜を用いて２０倍
濃縮したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した結
果、Ｋｅｘ２−６６０及びＫｅｘ２−６７９は、Ｋｅｘ
２−６１４に比べ、Ｋｅｘ２活性だけではなく、分泌量
も増加していることが明らかになった。また、これらの
分子量はアミノ酸残基数に対応し大きくなること、すな
わち、今回の培養においては、昆虫細胞Ｓｆ９を宿主と
したＫｅｘ２Δp のように自己分解物が蓄積していない
ことが明らかになった。Further, according to Example 1, the amount of secretory production per OD660 was Kex2-6, which has been reported so far.
Compared to 14, Kex2-660 and Kex2-679 were also found to be significantly more. In addition, as a result of analyzing by SDS-PAGE a sample obtained by concentrating the culture supernatant by 20 times using an ultrafiltration membrane having a cut-off molecular weight of 10,000, Kex2-660 and Kex2-679 were found to be Kex2-679.
Compared with 2-614, it was revealed that not only the Kex2 activity but also the secretion amount was increased. In addition, it has been revealed that these molecular weights increase in accordance with the number of amino acid residues, that is, in this culture, autolysates are not accumulated unlike Kex2Δp using insect cell Sf9 as a host. .
【００３１】さらに、実施例９によれば、Ｋｅｘ２−６
３０、Ｋｅｘ２−６４０、Ｋｅｘ２−６５０、Ｋｅｘ２
−６６０、およびＫｅｘ２−６７９の培養液ＯＤ６６０
あたりのＫｅｘ２活性は、今までに報告されているＫｅ
ｘ２−６１４に比べ１０倍以上高いこと、また、Ｋｅｘ
２−６８２、Ｋｅｘ２−６８８のＫｅｘ２活性は、それ
ぞれＫｅｘ２−６１４の６倍と３．４倍で、Ｋｅｘ２−
６９９のＫｅｘ２活性は検出できないことが明らかにな
った。Further, according to Example 9, Kex2-6
30, Kex2-640, Kex2-650, Kex2
-660, and culture solution OD660 of Kex2-679
Per Kex2 activity is the same as previously reported Ke
10 times higher than x2-614, and Kex
The Kex2 activities of 2-682 and Kex2-688 were 6 times and 3.4 times that of Kex2-614, respectively.
699 Kex2 activity was found to be undetectable.
【００３２】すなわち、培養液のＫｅｘ２活性は、発現
するＫｅｘ２誘導体のＣ−末端のアミノ酸残基がＫｅｘ
２の６３０から６７９番目のアミノ酸残基までであると
き高くなるが、それ以上ではＣ−末端領域が長くなるほ
ど低くなることも明らかになった。また、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ解析から、上記の結果はＫｅｘ２の分泌量が増加し
ていることも確認した。さらに、今回は、Ｋｅｘ２誘導
体のアミノ酸残基が増加するほどその分子量も増加し、
昆虫細胞Ｓｆ９を宿主にしたＫｅｘ２Δp の生産の場合
のように自己分解物が蓄積しないこともわかった。That is, the Kex2 activity of the culture solution is such that the amino acid residue at the C-terminal of the expressed Kex2 derivative is Kex2.
It was also found that when the C-terminal region was longer from 630 to the 679th amino acid residue of 2, it became lower as the C-terminal region became longer. Also, SDS-PA
From GE analysis, the above results also confirmed that the secretion amount of Kex2 was increased. Furthermore, this time, as the amino acid residue of the Kex2 derivative increases, its molecular weight also increases,
It was also found that autolysates did not accumulate as in the case of the production of Kex2Δp using insect cells Sf9 as a host.
【００３３】今回作製した分泌型Ｋｅｘ２誘導体は培養
上清で自己分解を起こすことなく蓄積できることがわか
ったので、発現系をサッカロマイセス・セレビジアエの
系から培養液あたりの生産量が高いメタノール資化性酵
母、例えばキャンディダ・ボイディニイを宿主とした発
現系に換え、Ｋｅｘ２−６６０の生産検討を行った。そ
の結果、生産量を培養上清１Ｌあたり３４０ｍｇまで上
げることができた。この量は、約２００ｇの生理活性ペ
プチドｈＰＴＨ（１−３４）をキメラタンパク質から遊
離させることができる量であり、本発明により、工業ス
ケール量でキメラタンパク質から有用ペプチドを切り出
すために必要な量の酵素を供給できることを示してい
る。従って、メタノール資化性酵母としてキャンディダ
（Candida)属酵母が好ましいことが明らかになった。Since the secreted Kex2 derivative prepared this time was found to be able to accumulate in the culture supernatant without causing self-decomposition, the expression system was changed from the Saccharomyces cerevisiae system to a methanol-assimilating yeast having a high production per culture solution. For example, Kex2-660 production was examined by changing to an expression system using Candida boidinii as a host. As a result, the production amount could be increased to 340 mg / L of the culture supernatant. This amount is an amount capable of releasing about 200 g of the physiologically active peptide hPTH (1-34) from the chimeric protein. According to the present invention, the amount required to excise the useful peptide from the chimeric protein in an industrial scale amount is obtained. This shows that the enzyme can be supplied. Therefore, it was revealed that yeast of the genus Candida is preferable as the methanol-assimilating yeast.
【００３４】次に、２番目の問題点である、分泌型Ｋｅ
ｘ２誘導体の純度について述べる。まず、分泌生産量が
多かったＫｅｘ２−６６０を培養上清から精製した。サ
ッカロマイセス・セレビジアエで細胞外に分泌したＫｅ
ｘ２−６６０を、０．２ｍＭカルシウム存在下で、培養
上清を限外濾過（分子量３０，０００）で濃縮し、その
後陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマ
トグラフィーで単一バンドまで精製した（回収率５７
％）。この回収率は今まで報告されている中で最も高
く、この方法で高純度のＫｅｘ２誘導体を大量に供給で
きることが明らかになった。Next, the second problem, secretory Ke
The purity of the x2 derivative will be described. First, Kex2-660 having a high secretory production amount was purified from the culture supernatant. Ke secreted extracellularly by Saccharomyces cerevisiae
For x2-660, the culture supernatant was concentrated by ultrafiltration (molecular weight 30,000) in the presence of 0.2 mM calcium, and then purified to a single band by anion exchange chromatography and hydrophobic chromatography (recovery). Rate 57
%). This recovery rate is the highest reported so far, and it has been revealed that this method can supply a large amount of high-purity Kex2 derivative.
【００３５】また、Ｋｅｘ２誘導体のタンパク質を基質
としたときの基質特異性、他のプロテアーゼの混入の可
能性について調べるために、キメラタンパク質βＧａｌ
−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４に精製した過剰量のＫｅ
ｘ２−６６０を作用させ、そのとき生じるペプチドの構
造を調べた。なお、βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ
８４は、大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ末端から１３
９アミノ酸残基までのポリペプチドのうち、７６番目と
１２２番目のシステイン残基をセリン残基に置換したβ
Ｇａｌ−１３９Ｓに、Ｐｈｅ−Ｍｅｔ配列及びヒト副甲
状腺ホルモン由来のプロ配列（Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ）を介してｈＰＴＨ（１−８
４）を結合させたキメラタンパク質である。βＧａｌ−
１３９Ｓのアミノ酸の配列を配列番号２に、ｈＰＴＨ
（１−８４）のアミノ酸配列を配列番号３に示す。In order to examine the substrate specificity when using a Kex2 derivative protein as a substrate and the possibility of contamination with other proteases, the chimeric protein βGal was used.
Excess Ke purified to -139S (FM) PPH84
x2-660 was allowed to act, and the structure of the resulting peptide was examined. In addition, βGal-139S (FM) PPH
84 represents 13 from the N-terminus of E. coli β-galactosidase.
Β in which the cysteine residues at positions 76 and 122 of the polypeptide up to 9 amino acid residues have been substituted with serine residues
Gal-139S has a Phe-Met sequence and a prosequence derived from human parathyroid hormone (Lys-Ser-Val).
HPTH (1-8) through -Lys-Lys-Arg).
4) is a chimeric protein to which is bound. βGal-
The amino acid sequence of 139S is shown in SEQ ID NO: 2, and the hPTH
The amino acid sequence of (1-84) is shown in SEQ ID NO: 3.
【００３６】その結果、生じたペプチドのＮ末端の配列
は、Ｋｅｘ２プロテアーゼの基質特異性から予想される
ペプチド断片由来であり、精製したＫｅｘ２−６６０に
は、キメラタンパク質から目的ペプチドを切り出す時に
問題になるような他のプロテアーゼが混入していないこ
とがわかった。精製したＫｅｘ２−６６０を用い、第３
の課題、タンパク質を基質としたときの切断条件につい
て検討した。As a result, the N-terminal sequence of the resulting peptide is derived from a peptide fragment predicted from the substrate specificity of Kex2 protease. It was found that no other protease was contaminated. Using purified Kex2-660, the third
The subject of this study, the cleavage conditions when using a protein as a substrate, were examined.
【００３７】まず、キメラタンパク質から目的ペプチド
を遊離させる際に汎用される尿素の影響について検討し
た。Ｋｅｘ２−６６０を、０〜４．０Ｍ尿素存在下で合
成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡに作用
させた結果、１．０Ｍ、２．０Ｍ及び４．０Ｍ濃度で
は、尿素が存在しない場合に比べ、活性がそれぞれ７０
％、４０％及び１０％に低下することがわかった。一般
的に、不溶性封入体を尿素溶液に溶解後、プロテアーゼ
等を作用させる条件としては２．０〜４．０Ｍの尿素溶
液が用いられる。従って、キメラタンパク質の溶解条件
等を検討すれば、Ｋｅｘ２−６６０はキメラタンパク質
から目的ペプチドを切り出すための酵素として使用可能
と考えた。First, the effect of urea, which is widely used when releasing the target peptide from the chimeric protein, was examined. As a result of allowing Kex2-660 to act on the synthetic substrate Boc-Leu-Arg-Arg-MCA in the presence of 0-4.0 M urea, when there was no urea at the concentrations of 1.0 M, 2.0 M and 4.0 M Activity is 70
%, 40% and 10%. Generally, as a condition for dissolving the insoluble inclusion body in a urea solution and then allowing a protease or the like to act thereon, a 2.0-4.0 M urea solution is used. Therefore, Kex2-660 was considered to be usable as an enzyme for cleaving the target peptide from the chimeric protein, considering the conditions for dissolving the chimeric protein.
【００３８】次に、Ｋｅｘ２−６６０をキメラタンパク
質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４に作用させた
ときの、１．５〜３．０Ｍ尿素の影響について調べた。
Ｋｅｘ２プロテアーゼによって切断が予想される配列
は、Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号２；アミノ酸配列番号１
３−１４、以下切断部位Ａと記す）、Ｌｙｓ−Ａｒｇ
（プロ配列部分、以下切断部位Ｂと記す）、Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ（配列番号３；アミノ酸配列番号４３−４４、５１
−５２、以下、それぞれ切断部位Ｃ及び切断部位Ｄと記
す）の４カ所に存在する。なお、それぞれの部位のＣ末
端側がプロテアーゼによって切断される。Next, the effect of 1.5 to 3.0 M urea when Kex2-660 was allowed to act on the chimeric protein βGal-139S (FM) PPH84 was examined.
The sequence expected to be cleaved by Kex2 protease is Arg-Arg (SEQ ID NO: 2; amino acid SEQ ID NO: 1).
3-14, hereinafter referred to as cleavage site A), Lys-Arg
(Pro sequence portion, hereinafter referred to as cleavage site B), Pro-A
rg (SEQ ID NO: 3; amino acid SEQ ID NOs: 43-44, 51)
-52, hereinafter referred to as cleavage site C and cleavage site D, respectively). The C-terminal side of each site is cleaved by the protease.
【００３９】Ｋｅｘ２プロテアーゼ処理で生じるペプチ
ドフラグメントの構造および量について調べた結果、
１．５〜２．５Ｍの範囲では尿素濃度が高いほうがＫｅ
ｘ２−６６０の切断効率は高いが、尿素濃度２．５Ｍと
３．０Ｍでは、切断効率に差がないことがわかった。さ
らに、尿素の基質特異性に与える影響に関しては、尿素
濃度が上昇するに従い、切断部位Ｂの切断効率は良くな
るが、切断部位Ｃの切断効率は、２．５Ｍ尿素濃度でピ
ークを迎えること、その結果、尿素濃度が高い方が、キ
メラタンパク質からのｈＰＴＨ（１−８４）の回収率が
良いことがわかった。また、切断部位Ｄの切断は観察さ
れなかった。３．０〜４．０Ｍの尿素濃度でも、同様の
傾向が観察された。これらの知見は、合成基質を用いた
場合からは予想できず、本発明により初めて明らかにな
った。As a result of examining the structure and amount of the peptide fragment generated by the Kex2 protease treatment,
In the range of 1.5 to 2.5M, the higher the urea concentration, the higher the Ke
Although the cutting efficiency of x2-660 was high, it was found that there was no difference in the cutting efficiency when the urea concentrations were 2.5 M and 3.0 M. Further, regarding the influence of urea on the substrate specificity, as the urea concentration increases, the cleavage efficiency of the cleavage site B improves, but the cleavage efficiency of the cleavage site C peaks at a 2.5 M urea concentration. As a result, it was found that the higher the urea concentration, the better the recovery of hPTH (1-84) from the chimeric protein. Also, no cleavage at the cleavage site D was observed. A similar tendency was observed at urea concentrations of 3.0 to 4.0M. These findings could not be expected from the case where a synthetic substrate was used, and were first revealed by the present invention.
【００４０】Ｋｅｘ２−６６０を用いてβＧａｌ−１３
９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４からｈＰＴＨ（１−８４）を切
り出す条件についてさらに検討した。キメラタンパク質
からｈＰＴＨ（１−８４）を切り出す条件で、種々の量
比のＫｅｘ２−６６０（キメラタンパク質１ｍｇあたり
Ｋｅｘ２−６６０を２５ｋＵ、５０ｋＵ、１００ｋＵ、
１５０ｋＵ及び２００ｋＵ）を作用させ、生じるペプチ
ドフラグメントの構造と回収率について調べた。５０ｋ
Ｕ／ｍｌのＫｅｘ２−６６０を用いた場合、約７５％の
効率でｈＰＴＨ（１−８４）が切り出された。また、こ
のとき、約１０％のβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ
８４が残っていた。Using Kex2-660, βGal-13
Conditions for extracting hPTH (1-84) from 9S (FM) PPH84 were further studied. Under conditions that hPTH (1-84) is cut out from the chimeric protein, various amounts of Kex2-660 (Kex2-660 per mg of chimeric protein is 25 kU, 50 kU, 100 kU,
150 kU and 200 kU), and the structure and recovery of the resulting peptide fragments were examined. 50k
When U / ml Kex2-660 was used, hPTH (1-84) was cut out with an efficiency of about 75%. At this time, about 10% of βGal-139S (FM) PPH
84 remained.
【００４１】βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４は
Ｋｅｘ２−６６０量を増加させるに従って減少し、２０
０ｋＵ／ｍｌではほぼ完全に消失した。しかし、同時に
ｈＰＴＨ（１−４４）とｈＰＴＨ（４５−８４）の割合
も増加し、ｈＰＴＨ（１−８４）の回収率は増加しない
ことがわかった（図２０）。一方、Ｋｅｘ２−６６０量
を増やしても、ｈＰＴＨ（１−４４）増加分以上にｈＰ
ＴＨ（１−８４）量が減少することはなく、後述の実施
例２で精製されたＫｅｘ２−６６０には、キメラタンパ
ク質からｈＰＴＨ（１−８４）を切り出す条件におい
て、Ｋｅｘ２プロテアーゼと基質特異性が異なる他のプ
ロテアーゼは混入していないことが確認された。ΒGal-139S (FM) PPH84 decreases as the amount of Kex2-660 increases,
It disappeared almost completely at 0 kU / ml. However, at the same time, the ratio of hPTH (1-44) and hPTH (45-84) also increased, indicating that the recovery of hPTH (1-84) did not increase (FIG. 20). On the other hand, even if the amount of Kex2-660 is increased, hPTH (1-44) is increased more than hPTH (1-44).
The amount of TH (1-84) did not decrease, and Kex2-660 purified in Example 2 described below had a Kex2 protease and substrate specificity under the conditions for cutting out hPTH (1-84) from the chimeric protein. It was confirmed that other different proteases were not contaminated.
【００４２】また、反応条件を選べば、目的ペプチドに
Ｋｅｘ２プロテアーゼの切断部位を持つ場合でも、キメ
ラタンパク質から効率良く（切り出し効率７５％）目的
ペプチドを切り出すことができることが判明した。な
お、この切り出し効率は、ファクターＸａを用いた場合
のｈＰＴＨ（１−８４）の切り出し効率５０％（Gardel
la et al. J. Biol. Chem.265, 26, 15854-15859, 199
0）より高い。It has also been found that, if the reaction conditions are selected, even if the target peptide has a Kex2 protease cleavage site, the target peptide can be efficiently cut out from the chimeric protein (exclusion efficiency: 75%). Note that the cutout efficiency is 50% (Gardel
la et al. J. Biol. Chem. 265, 26, 15854-15859, 199
0) higher.
【００４３】Gardellaらは、ファクターＸａの認識部位
Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ配列がｈＰＴＨ（１−
８４）に存在しないにも関わらず、酵素量を増加させた
り反応時間を長くした場合ｈＰＴＨ（１−８４）の回収
率が下がることから、混入するプロテアーゼまたはファ
クターＸａ自身がｈＰＴＨ（１−８４）を分解している
可能性を示唆している。ｈＰＴＨ（１−８４）にはＫｅ
ｘ２プロテアーゼの切断配列が２ヶ所存在するにも関わ
らず、高い回収率でｈＰＴＨ（１−８４）が得られたと
いう事実は、本発明により生産量が増加し、精製された
Ｋｅｘ２誘導体が、キメラタンパク質から目的ペプチド
を切り出すための酵素として有用であることを示してい
る。Gardella et al. Found that the recognition site for factor Xa, the Ile-Glu-Gly-Arg sequence, was hPTH (1-
84), when the amount of enzyme is increased or the reaction time is lengthened, the recovery of hPTH (1-84) is reduced. Therefore, the contaminating protease or factor Xa itself becomes hPTH (1-84). To decompose. hPTH (1-84) has Ke
The fact that hPTH (1-84) was obtained at a high recovery rate despite the presence of two cleavage sequences for x2 protease was attributed to the fact that the production amount of the present invention increased and the purified Kex2 derivative was This indicates that the enzyme is useful as an enzyme for cleaving a target peptide from a protein.
【００４４】さらに、精製したＫｅｘ２−６６０は、尿
素非存在下で可溶性キメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４か
ら、尿素存在下で不溶性キメラタンパク質βＧａｌ−１
１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４から、ｈＰＴＨ（１−３４）を切
り出すことができ、保護ペプチドや切断部位領域が異な
るキメラタンパク質を基質とした場合にも働き、広く工
業的に応用できることがわかった。また、尿素非存在下
でもプロテアーゼの混入は検出できなかった。Further, the purified Kex2-660 was prepared from the soluble chimeric protein CATPH34 in the absence of urea and from the insoluble chimeric protein βGal-1 in the presence of urea.
From 17S4HPPH34, it was found that hPTH (1-34) can be excised, works even when a protective peptide or a chimeric protein having a different cleavage site region is used as a substrate, and can be widely applied industrially. Further, no protease contamination was detected even in the absence of urea.
【００４５】すなわち、生産量が増加し、単一バンドま
で精製された分泌型Ｋｅｘ２誘導体には、キメラタンパ
ク質から目的ペプチドを遊離させる条件では尿素の存在
の有無に関わらず、目的ペプチドを分解し、回収率を下
げるような他のプロテアーゼが混入していないこと、ま
た、このＫｅｘ２誘導体は、目的ペプチドにＫｅｘ２プ
ロテアーゼの認識部位が存在する場合でも、条件を選べ
ば効率良く目的ペプチドを回収できること、さらに、培
養液１Ｌあたりの発現量は、約２００ｇの目的ペプチド
を遊離できる量であり本発明で得られた分泌型Ｋｅｘ２
誘導体が工業的スケールでキメラタンパク質から目的ペ
プチドを切り出すために必要な量を供給できることが明
らかになった。That is, the secreted Kex2 derivative whose production amount has been increased and purified to a single band, decomposes the target peptide regardless of the presence or absence of urea under the condition of releasing the target peptide from the chimeric protein, The Kex2 derivative is not contaminated with other proteases that lower the recovery rate. Further, even when the target peptide has a Kex2 protease recognition site, the target peptide can be efficiently recovered by selecting conditions. The amount of expression per 1 L of the culture solution is such that about 200 g of the target peptide can be released, and the secreted Kex2 obtained by the present invention is obtained.
It has been shown that the derivative can supply the necessary amount to cleave the target peptide from the chimeric protein on an industrial scale.
【００４６】[0046]
【実施例】以下の参考例および実施例等により本発明を
より具体的に説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。まず、本発明のための材料として用いた
プラスミド、大腸菌と酵母および、各実施例に共通な基
本的な実験操作等について述べ、さらに参考例、実施例
の順に述べる。The present invention will be described more specifically with reference to the following reference examples and examples, but the present invention is not limited to these examples. First, plasmids, Escherichia coli and yeast used as materials for the present invention, basic experimental procedures common to the respective examples, and the like will be described. Further, reference examples and examples will be described.
【００４７】プラスミド プラスミドｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］は、β−ガラク
トシダーゼのＮ末端から９７番目までのアミノ酸からな
るペプチド（７６番目のシステイン残基がセリン残基、
４０，４１，７１、と７５番目のグルタミン酸残基がア
スパラギン酸残基に置換されている：βＧａｌ−９７Ｓ
４Ｄと呼ぶ）にグルタミン酸残基を介してｈＣＴ［Ｇ］
（ヒトカルシトニンの３２番目のアミノ酸のＣ末端にグ
リシン残基が付加したペプチド）が結合したキメラタン
パク質を大腸菌ラクトースオペロンのプロモーターによ
り発現できるプラスミドである。 Plasmid Plasmid pG97S4DhCT [G] is a peptide consisting of amino acids from the N-terminus of β-galactosidase to the 97th amino acid (the cysteine residue at the 76th position is a serine residue;
The glutamic acid residues at positions 40, 41, 71, and 75 have been replaced with aspartic acid residues: βGal-97S
4D) via a glutamic acid residue to hCT [G]
This is a plasmid capable of expressing a chimeric protein bound with (a peptide in which a glycine residue is added to the C-terminal of the 32nd amino acid of human calcitonin) using a promoter of the lactose operon of Escherichia coli.
【００４８】目的とするペプチドをコードするＤＮＡ領
域を読み枠を合わせてＥｃｏ ＲＩ−Ｓａｌ IＤＮＡ
フラグメントとして導入すれば、βＧａｌ−９７Ｓ４Ｄ
とのキメラタンパク質を発現することができる。なお、
このプラスミドを含有する大腸菌Ｗ３１１０株は、Esch
erichia coli ＳＢＭ３２３と命名し、工業技術院微生
物工業技術研究所に受託番号：微工研条寄第３５０３号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５０３）として１９９１年８月８
日に寄託されている。The DNA region encoding the peptide of interest is ligated in reading frame with EcoRI-SalI DNA.
If introduced as a fragment, βGal-97S4D
Can be expressed. In addition,
E. coli strain W3110 containing this plasmid was
No. erichia coli SBM323, and received an order number from the Institute of Microbial Industry and Technology of the Agency of Industrial Science and Technology (AIST) on August 8, 1991 as No. 3503 (FERM BP-3503).
Deposited on the day.
【００４９】プラスミドｐｔａｃＣＡＴは、合成プロモ
ーターｔａｃによりクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を発現できるプラスミドである。
このプラスミドを含有する大腸菌ＪＭ１０９株は、Esch
erichia coli ＳＢＭ３３６と命名し、工業技術院生命
工学工業技術研究所に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５４
３６として１９９６年３月１日に寄託されている。ｐＧ
９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］とｐｔａｃＣＡＴは、可溶性ｈ
ＰＴＨ（１−３４）キメラタンパク質発現ベクターｐｔ
ａｃＣＡＴＰＴＨ（１−３４）作製の材料として用いた
（参考例２および図５、図６）。The plasmid ptacCAT is a plasmid capable of expressing the chloramphenicol acetyltransferase gene with the synthetic promoter tac.
E. coli strain JM109 containing this plasmid was
No. erichia coli SBM336, accession number: FERM BP-54
36 was deposited on March 1, 1996. pG
97S4DhCT [G] and ptacCAT are soluble h
PTH (1-34) chimeric protein expression vector pt
It was used as a material for producing acCATPTH (1-34) (Reference Example 2 and FIGS. 5 and 6).
【００５０】プラスミドｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］は、
ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］のβＧａｌ−９７Ｓ４Ｄを
コードする遺伝子をβＧａｌ−２１０Ｓ（β−ガラクト
シダーゼのＮ末端から２１０番目までのアミノ酸からな
るペプチドで７６，１２２および１５４番目のシステイ
ン残基がセリン残基に置換されている）をコードする遺
伝子に置換したプラスミドである。The plasmid pG210ShCT [G]
The gene encoding βGal-97S4D of pG97S4DhCT [G] was replaced with βGal-210S (a peptide consisting of the amino acids from the N-terminal to the 210th amino acid of β-galactosidase, in which the cysteine residues at positions 76, 122 and 154 were replaced with serine residues. Is replaced with a gene encoding
【００５１】ｐＧＨα２１０（Ｓｅｒ）ｒｏｐ- を制限
酵素ＰｖｕIIとＥｃｏＲＩで消化して得られるβＧａｌ
−２１０Ｓをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメン
トとｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］を制限酵素ＰｖｕIIと
ＥｃｏＲＩで消化して得られるベクター部分を含むＤＮ
Ａフラグメントと連結して得ることができる（図２
４）。なお、ｐＧＨα２１０（Ｓｅｒ）ｒｏｐ- の製作
方法については、特公平６−８７７８８に開示されてい
る。ｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］は、合成ヒト副甲状腺ホ
ルモン前駆体（ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４））遺伝子の
クローニングおよびプラスミドｐＧＰ＃１９の作製の材
料として用いた（参考例１および図５）。ΒGal obtained by digesting pGHα210 (Ser) rop - with restriction enzymes PvuII and EcoRI
DNA containing a DNA fragment containing the gene encoding -210S and a vector portion obtained by digesting pG97S4DhCT [G] with restriction enzymes PvuII and EcoRI.
A fragment (FIG. 2)
4). Incidentally, pGHα210 (Ser) rop - For fabrication method is disclosed in KOKOKU 6-87788. pG210ShCT [G] was used as a material for cloning a synthetic human parathyroid hormone precursor (hProPTH (1-84)) gene and for constructing plasmid pGP # 19 (Reference Example 1 and FIG. 5).
【００５２】プラスミドｐＣＲIIは、インビトロジェン
社から購入し、ＰＣＲ産物を直接クローニングするため
に用いた。プラスミドｐＹＥ−２２ｍは、グリセルアル
デヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）遺伝子のプロ
モーターおよびターミネーターを利用し、その間にマル
チクローニング部位（ＭＣＳ：Eco RI → Sal I）を持
つ発現ベクターで、プロモーターはEco RI側にあり、選
択マーカーにＴＲＰ１遺伝子を、複製開始点に２μｍＤ
ＮＡの一部（Inverted Repeats）を持つ。なお、プラス
ミドｐＹＥー２２ｍを有する大腸菌ＪＭ１０９株は、Es
cherichia coli ＳＢＭ３３５と命名し、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５４３５として１９９６年３月１日に工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている（図１２）。The plasmid pCRII was purchased from Invitrogen and used to directly clone the PCR product. Plasmid pYE-22m is an expression vector that uses a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) gene promoter and terminator and has a multiple cloning site (MCS: Eco RI → Sal I) between them. Is on the EcoRI side, the TRP1 gene is selected as the selectable marker, and the 2 μmD
It has a part of NA (Inverted Repeats). The E. coli JM109 strain having the plasmid pYE-22m was obtained from Escherichia coli
cherichia coli SBM335, FERM B
P-5435 was deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology on March 1, 1996 (FIG. 12).
【００５３】プラスミドｐＹＥ−ＫＥＸ２（５．０）ｂ
（Mizuno et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 15
6, 246-254, 1988 ）は、ＰＣＲ法によりＫｅｘ２誘導
体の遺伝子を作製するための鋳型として用いた（図１
２）。プラスミドｐＹＥ−ＫＥＸ２（RI-Pvu II ）（特
開平１−１９９５７８）は、Ｋｅｘ２−６１４のＣ末端
に１４アミノ酸（配列番号４）からなるペプチドが付加
したタンパク質の発現ベクターｐＹＥ−６１４の作製の
ために用いた（図１３）。プラスミドｐＮＯＴｅｌｌ
は、アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーターおよ
びターミネーターを利用し、その間に制限酵素 Not I
部位を持つ発現ベクターで、選択マーカーにＵＲＡ３遺
伝子を持つ（特開平５−３４４８９５）。The plasmid pYE-KEX2 (5.0) b
(Mizuno et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 15
6, 246-254, 1988) was used as a template for preparing a Kex2 derivative gene by PCR (FIG. 1).
2). Plasmid pYE-KEX2 (RI-Pvu II) (Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-199578) was used for preparing an expression vector pYE-614 for a protein in which a peptide consisting of 14 amino acids (SEQ ID NO: 4) was added to the C-terminal of Kex2-614. (FIG. 13). Plasmid pNOTell
Utilizes the alcohol oxidase gene promoter and terminator, during which the restriction enzyme Not I
An expression vector having a site, which has a URA3 gene as a selectable marker (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-344895).
【００５４】大腸菌と酵母 コンピテントセルの大腸菌ＪＭ１０９株は東洋紡（株）
から購入し、プラスミドの調製およびキメラタンパク質
発現に利用した。大腸菌ＪＭ１０１株とＭ２５株（Sugi
mura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 75
3-759, 1988 ）は、それぞれキメラタンパク質ＣＡＴＰ
Ｈ３４およびβＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４の生産
に用いた。Ｋｅｘ２プロテアーゼ分泌発現のための宿主
には、サッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyce
s cerevisiae）Ｋ１６−５７Ｃ株（MAT α leu2 trp1 u
ra3 kex2-8 ：Mizuno et al. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 156, 246-254（1988））およびキャンディダ
・ボイディニイ（Candidaboidinii ）ＴＫ６２株を用
いた。 Escherichia coli and yeast competent cells Escherichia coli JM109 strain was obtained from Toyobo Co., Ltd.
And used for plasmid preparation and chimeric protein expression. E. coli strains JM101 and M25 (Sugi
mura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 75
3-759, 1988) are chimeric proteins CATP, respectively.
H34 and βGal-117S4HPPH34 were used for production. Hosts for Kex2 protease secretion expression include Saccharomyceae.
s cerevisiae) strain K16-57C (MAT α leu2 trp1 u
ra3 kex2-8: Mizuno et al. Biochem. Biophys. Res.
156, 246-254 (1988)) and Candidaboidinii TK62 strain.
【００５５】ＴＫ６２株は、キャンディダ・ボイディニ
イＳ２ＡＯＵ−１株から取得されたＵＲＡ３変異による
ウラシル要求株である（Sakai, Y., et al., J. Bacter
iol., 173,7458〜7463, 1991）。なお、キャンディダ・
ボイディニイＳ２ＡＯＵ−１株は、Candida boidinii
ＳＡＭ１９５８と命名され、工業技術院微生物工業技
術研究所に受託番号：微工研条寄第３７６６号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３７６６）として、１９９２年２月２５日に
寄託されている。The TK62 strain is a uracil auxotroph due to the URA3 mutation obtained from the Candida boidinii S2AOU-1 strain (Sakai, Y., et al., J. Bacter).
iol., 173, 7458-7463, 1991). In addition, Candida
Voidinii S2AOU-1 strain is Candida boidinii
Named SAM1958 and received by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (MIC)
MBP-3766) on February 25, 1992.
【００５６】培地 大腸菌の培地には、ＬＢ培地（０．５％（ｗ／ｖ）酵母
エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／
ｖ）ＮａＣｌ）、ＳＢ培地（１．２％（ｗ／ｖ）酵母エ
キス、２．４％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｖ／
ｖ）グリセロール）、ＳＢ２培地（２％（ｗ／ｖ）酵母
エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｖ／
ｖ）グリセロール、１．２％（ｗ／ｖ）Ｋ2 ＨＰＯ4 、
０．３％（ｗ／ｖ）ＫＨ2 ＰＯ4 ）、およびＮＵ培地
（０．３％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．５％（ｗ／ｖ）
グルコース、０．３％（ｗ／ｖ）ＫＨ2 ＰＯ4 、０．３
％（ｗ／ｖ）Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．２７％（ｗ／ｖ）Ｎａ
2 ＨＰＯ4 、０．１２％（ｗ／ｖ）（ＮＨ4 ）2 ＳＯ
4 、０．２ｇ／Ｌ ＮＨ4 Ｃｌ、０．２％（ｗ／ｖ）Ｍ
ｇＳＯ4 、４０ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、４０
ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ Ｍｎ
ＳＯ4 ・ｎＨ2 Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ ＡｌＣｌ3 ・６Ｈ 2
Ｏ、４ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、２ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ、２ｍｇ／Ｌ Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・
２Ｈ2 Ｏ、１ｍｇ／Ｌ ＣｕＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ、０．５
ｍｇ／Ｌ Ｈ3 ＢＯ3 ）を用いた。[0056]Culture medium The medium of E. coli is LB medium (0.5% (w / v) yeast
Extract, 1% (w / v) tryptone, 0.5% (w / v)
v) NaCl), SB medium (1.2% (w / v) yeast
Kiss, 2.4% (w / v) tryptone, 0.5% (v / v)
v) glycerol), SB2 medium (2% (w / v) yeast
Extract, 1% (w / v) tryptone, 0.5% (v / v)
v) glycerol, 1.2% (w / v) KTwo HPOFour ,
0.3% (w / v) KHTwo POFour ), And NU medium
(0.3% (w / v) yeast extract, 1.5% (w / v)
Glucose, 0.3% (w / v) KHTwo POFour , 0.3
% (W / v) KTwo HPOFour , 0.27% (w / v) Na
Two HPOFour , 0.12% (w / v) (NHFour )Two SO
Four , 0.2 g / L NHFour Cl, 0.2% (w / v) M
gSOFour , 40mg / L FeSOFour ・ 7HTwo O, 40
mg / L CaClTwo ・ 2HTwo O, 10mg / L Mn
SOFour ・ NHTwo O, 10mg / L AlClThree ・ 6H Two
O, 4mg / L CoClTwo ・ 6HTwo O, 2mg / L
ZnSoFour ・ 7HTwo O, 2mg / L NaTwo MoOFour ・
2HTwo O, 1mg / L CuClTwo ・ 7HTwo O, 0.5
mg / L HThree BOThree ) Was used.
【００５７】サッカロマイセス・セレビジアエの培養に
は、ＹＣＤＰ培地（１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％
（ｗ／ｖ）カザミノ酸、２％（ｗ／ｖ）グルコース、１
００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０））を用いた。キ
ャンディダ・ボイディニイ及びピキア・パストリスの培
養には、ＢＭＧＹ培地（１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２
％（ｗ／ｖ）ペプトン、１％（ｖ／ｖ）グリセロール、
１．３４％（ｖ／ｖ）ＹＮＢ ｗ／ｏ ＡＡ：Yeast Ni
trogen Basewithout Amino Acids 、０．４ｍｇ／Ｌビ
オチン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０））、
ＢＭＭＹ培地（１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／
ｖ）ペプトン、０．５％（ｖ／ｖ）メタノール、１．３
４％（ｖ／ｖ）ＹＮＢ ｗ／ｏＡＡ、０．４ｍｇ／Ｌビ
オチン、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０））、
ＹＰＤ培地（１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／
ｖ）ペプトン、２％（ｗ／ｖ）グルコース）、ＹＰＧＭ
培地（１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）ペプ
トン、３％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｖ／ｖ）メ
タノール、１．３４％（ｖ／ｖ）ＹＮＢ ｗ／ｏ Ａ
Ａ、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０））を用い
た。For the culture of Saccharomyces cerevisiae, a YCDP medium (1% (w / v) yeast extract, 2%
(W / v) casamino acid, 2% (w / v) glucose, 1
00 mM potassium phosphate (pH 6.0) was used. For cultivation of Candida voidinii and Pichia pastoris, BMGY medium (1% (w / v) yeast extract,
% (W / v) peptone, 1% (v / v) glycerol,
1.34% (v / v) YNB w / o AA: Yeast Ni
trogen Basewithout Amino Acids, 0.4 mg / L biotin, 100 mM potassium phosphate (pH 6.0))
BMMY medium (1% (w / v) yeast extract, 2% (w / v)
v) Peptone, 0.5% (v / v) methanol, 1.3
4% (v / v) YNB w / oAA, 0.4 mg / L biotin, 100 mM potassium phosphate (pH 6.0),
YPD medium (1% (w / v) yeast extract, 2% (w / v)
v) peptone, 2% (w / v) glucose), YPGM
Medium (1% (w / v) yeast extract, 2% (w / v) peptone, 3% (v / v) glycerol, 1% (v / v) methanol, 1.34% (v / v) YNB w / O A
A, 50 mM potassium phosphate (pH 6.0)) was used.
【００５８】基本的な実験操作 具体的に参考例および実施例に示さない場合は、実験操
作は以下の方法に従った。ＤＮＡプライマーは、フォス
ホアミダイド法による全自動合成機（アプライドバイオ
システムズモデル 380A ）で合成した。ＤＮＡ塩基配列
はジデオキシ法で決定した。制限酵素によるＤＮＡの切
断は購入先の指定する３〜１０倍量の酵素を用いて１時
間反応させた。プラスミド構造の解析は０．５〜１μｇ
ＤＮＡを用いて２０μｌ反応液中で、ＤＮＡの調製には
３〜１０μｇのＤＮＡを用いて５０〜１００μｌ反応液
中で行った。反応温度、反応バッファー等の条件は購入
先の指定に従った。 Basic Experimental Procedures Unless specifically shown in Reference Examples and Examples, experimental procedures were performed according to the following methods. DNA primers were synthesized by a fully automatic synthesizer (Applied Biosystems model 380A) using the phosphoramidite method. The DNA base sequence was determined by the dideoxy method. Cleavage of the DNA with the restriction enzyme was carried out for 1 hour using 3 to 10 times the amount of enzyme specified by the supplier. Analysis of plasmid structure is 0.5-1 μg
The DNA was prepared in a 20 μl reaction solution, and the DNA was prepared in 3 to 10 μg of the DNA in a 50 to 100 μl reaction solution. Conditions such as reaction temperature and reaction buffer were in accordance with the specifications of the supplier.
【００５９】アガロースゲル電気泳動サンプルは、反応
液に１／５容量の色素液（０．２５％（ｗ／ｖ）ブロム
フェノールブルーを含む１５％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌｌ
水溶液）を加え調製した。アガロースゲル電気泳動用バ
ッファーにはＴＡＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
２０ｍＭ酢酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いた。プラスミ
ドの構造解析にはＭｕｐｉｄ−２（コスモバイオ
（株））を用いて１００ボルト１時間の泳動を行ない、
ＤＮＡフラグメント調製のためには水平ゲル（20 cmx 1
5 cm x 0.7 cm）を用いて１５０ボルト４時間または３
５ボルト１３時間の泳動を行なった。ゲルはエチジウム
ブロミド水溶液（０．５μｇ／ｍｌ）で２０分染色した
後、紫外線照射してＤＮＡバンドを検出した。アガロー
スゲル濃度は、分画するＤＮＡフラグメントの大きさに
合わせて、１．０、１．５、２．０％（ｗ／ｖ）を用い
た。The agarose gel electrophoresis sample was prepared by adding 1/5 volume of a dye solution (15% (w / v) Ficoll containing 0.25% (w / v) bromophenol blue) to the reaction solution.
Aqueous solution). The buffer for agarose gel electrophoresis is TAE buffer (10 mM Tris,
20 mM acetic acid, 2 mM EDTA). For structural analysis of the plasmid, electrophoresis was performed at 100 volts for 1 hour using Mupid-2 (Cosmo Bio Co., Ltd.).
For preparation of DNA fragments, a horizontal gel (20 cm x 1)
5 cm x 0.7 cm) using 150 volts for 4 hours or 3
Electrophoresis was performed at 5 volts for 13 hours. The gel was stained with an ethidium bromide aqueous solution (0.5 μg / ml) for 20 minutes, and then irradiated with ultraviolet light to detect a DNA band. Agarose gel concentrations of 1.0, 1.5 and 2.0% (w / v) were used according to the size of the DNA fragment to be fractionated.
【００６０】アガロースゲル中のＤＮＡは、０．１×Ｔ
ＡＥバッファーを満たした透析チューブ内にゲルを入れ
電圧をかけて溶出させるか、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒
造（株））を用いてゲルから抽出した。ＤＮＡ溶液はフ
ェノール処理後、エタノール沈殿を行った。ライゲーシ
ョン反応は、０．０５〜１μｇのＤＮＡフラグメントを
含む反応液（６７ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ Ａ
ＴＰ）３０μｌに１０単位のＴ４酵素ライゲースを加
え、１６℃で１２〜１８時間反応を行うか、TAKARA Lig
ation Kit （宝酒造（株））を用いて行なった。The DNA in the agarose gel was 0.1 × T
The gel was placed in a dialysis tube filled with an AE buffer and eluted by applying a voltage, or extracted from the gel using SUPREC-01 (Takara Shuzo Co., Ltd.). The DNA solution was subjected to phenol treatment and then ethanol precipitation. In the ligation reaction, a reaction solution containing 0.05 to 1 μg of the DNA fragment (67 mM Tris / HCl (pH 7.
5) 5 mM MgCl 2 , 5 mM DTT, 1 mM A
TP) Add 10 units of T4 enzyme ligase to 30 μl and incubate at 16 ° C. for 12 to 18 hours or use TAKARA Lig
ation Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.).
【００６１】大腸菌の形質転換法は塩化カルシウム法で
行い（ＪＭ１０９株はコンピテントな細胞を購入して使
用）、形質転換株は薬剤耐性（アンピシリンまたはテト
ラサイクリン）で選択した。酵母Ｋ１６−５７Ｃ株の形
質転換は、リチウム酢酸法（METHODS IN YEAST GENETIC
S ；A Laboratory Course Manual；Cold Spring Harbor
Laboratory Press ）により行い、形質転換株はトリプ
トファン栄養要求の相補性で選択した。ＴＫ６２株の形
質転換法は、阪井らにより報告されている（Sakai et a
l. J. Bacteriol., 173, 7458 〜7463, 1991）。The transformation of Escherichia coli was performed by the calcium chloride method (JM109 strain was purchased and used for competent cells), and the transformants were selected by drug resistance (ampicillin or tetracycline). The transformation of yeast K16-57C was carried out by the lithium acetic acid method (METHODS IN YEAST GENETIC).
S; A Laboratory Course Manual; Cold Spring Harbor
Laboratory Press), and transformants were selected for complementation of tryptophan auxotrophy. A method for transforming the TK62 strain has been reported by Sakai et al. (Sakai et a).
l. J. Bacteriol., 173, 7458-7463, 1991).
【００６２】Ｋｅｘ２活性測定は水野らの方法に準じた
（Mizuno et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 15
6, 246-254, 1988）。すなわち、２ｍＭ ＣａＣｌ2 、
０．２％（ｗ／ｖ）ルブロール、１００μＭ Ｂｏｃ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（（株）ペプチド研究
所）を含む２００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．
０）溶液１００μｌに、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
（ｐＨ７．０）で希釈したＫｅｘ２ １００μｌを加
え、３７℃に３０分放置した。反応は、２５ｍＭＥＧＴ
Ａ５０μｌを添加し停止させた。遊離した蛍光物質（Ａ
ＭＣ）の蛍光強度は、PANDEX FCA システム（バクスタ
ートラベノール（株）10-015-1 型；（励起波長＝３６
５ｎｍ、基底波長＝４５０ｎｍ））を用いて測定した。
上記の条件で１分間に１ｐｍｏｌのＡＭＣを遊離するＫ
ｅｘ２量を１Ｕと定義した。The Kex2 activity was measured according to the method of Mizuno et al. (Mizuno et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 15
6, 246-254, 1988). That is, 2 mM CaCl 2 ,
0.2% (w / v) Lubrol, 100 μM Boc-
200 mM Tris / HCl (pH 7.0) containing Leu-Arg-Arg-MCA (Peptide Research Laboratories).
0) 100 mM Tris / HCl was added to 100 μl of the solution.
100 μl of Kex2 diluted with (pH 7.0) was added and left at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction was performed at 25 mM EGT.
A 50 μl was added and stopped. The released fluorescent substance (A
The fluorescence intensity of MC) was measured using the PANDEX FCA system (Baxter Labenol Co., Ltd. model 10-015-1; (excitation wavelength = 36).
5 nm, base wavelength = 450 nm)).
K releasing 1 pmol of AMC per minute under the above conditions
The ex2 amount was defined as 1U.
【００６３】ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）は、Laemmli の方法に準じた（Laemml
i et al. Nature 227, 680-685, 1970 ）。すなわち、
試料に１／４容量の４×ＳＤＳサンプルバッファー（３
７５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３０％
（ｖ／ｖ）グリセロール、７％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１５
％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、０．１％（ｗ
／ｖ）ブロムフェノールブルー）を加え、９５℃、５分
間加熱した。１０μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル（55 mm x 85 mm x 1 mmまたはテフコ社）に供し、２
０ｍＡ、８０分間の電気泳動を行った。泳動後、ゲルを
染色液（１０％（ｖ／ｖ）酢酸、４０％（ｖ／ｖ） メ
タノール、０．２５％（ｗ／ｖ）クマジーブリリアント
ブルーＲ２５０）で染色した。SDS-polyacrylamide electrophoresis (S
DS-PAGE) was performed according to the method of Laemmli (Laemml
i et al. Nature 227, 680-685, 1970). That is,
Add に volume of 4 × SDS sample buffer (3
75 mM Tris / HCl (pH 6.8), 30%
(V / v) glycerol, 7% (w / v) SDS, 15
% (V / v) 2-mercaptoethanol, 0.1% (w
/ V) bromophenol blue) and heated at 95 ° C for 5 minutes. 10 μl was applied to SDS-polyacrylamide gel (55 mm × 85 mm × 1 mm or Tefco), and
Electrophoresis was performed at 0 mA for 80 minutes. After the electrophoresis, the gel was stained with a staining solution (10% (v / v) acetic acid, 40% (v / v) methanol, 0.25% (w / v) Coomassie brilliant blue R250).
【００６４】その他、別途表示する以外は基本的な遺伝
子操作は Moleculor cloning（Maniatisら編、Cold Spr
ing Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, New Y
ork, 1982）に記載の方法に従って行った。参考例１ ．キメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（Ｆ
Ｍ）ＰＰＨ８４の調製 １）ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子の作製（図１及
び図２） ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子は、図１に示すよう
にＵ１〜Ｕ７（配列番号５〜１１）およびＬ１〜Ｌ７
（配列番号１２〜１８）の１４本のフラグメントに分
け、合成した。In addition to the above, basic genetic manipulations are described in Moleculor cloning (Edited by Maniatis et al., Cold Spr.
ing Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, New Y
ork, 1982). Reference example 1 . Chimeric protein βGal-139S (F
M) Preparation of PPH84 1) Preparation of hProPTH (1-84) gene (FIGS. 1 and 2) As shown in FIG. 1, hProPTH (1-84) gene comprises ~ L7
It was divided into 14 fragments of (SEQ ID NOS: 12 to 18) and synthesized.
【００６５】ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子は、各
フラグメントを以下のように連結し、作製した（図
２）。まず、ＤＮＡフラグメントＵ１（配列番号５）と
Ｌ７（配列番号１８）（各々約１μｇ）を１６単位のＴ
４ポリヌクレオチドカイネースと０．５ｎＭ（１ＭＢｑ
以上）の［γ−32Ｐ］ｄＡＴＰを含むリン酸化反応液１
５μｌ中（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５ｍＭ ＤＴＴ）で３７
℃、１５分間反応させた。これに５ｍＭ ＡＴＰを含む
リン酸化反応液５μｌを加え、さらに３７℃で４５分間
反応させた。Ｕ２（配列番号６）とＬ６（配列番号１
７）、Ｕ３（配列番号７）とＬ５（配列番号１６）、Ｕ
４（配列番号８）とＬ４（配列番号１５）、Ｕ５（配列
番号９）とＬ３（配列番号１４）、Ｕ６（配列番号１
０）とＬ２（配列番号１３）、およびＵ７（配列番号１
１）とＬ１（配列番号１２）についても同様に行った。The hProPTH (1-84) gene was prepared by ligating each fragment as follows (FIG. 2). First, DNA fragments U1 (SEQ ID NO: 5) and L7 (SEQ ID NO: 18) (each about 1 μg) were converted into 16 units of T
4 polynucleotide kinase and 0.5 nM (1 MBq
Phosphorylation reaction solution 1 containing [γ- 32 P] dATP
In 5 μl (50 mM Tris / HCl (pH 7.
6) 37% with 10 mM MgCl 2 , 5 mM DTT)
The reaction was performed at 15 ° C. for 15 minutes. To this was added 5 μl of a phosphorylation reaction solution containing 5 mM ATP, and the mixture was further reacted at 37 ° C. for 45 minutes. U2 (SEQ ID NO: 6) and L6 (SEQ ID NO: 1)
7), U3 (SEQ ID NO: 7) and L5 (SEQ ID NO: 16), U
4 (SEQ ID NO: 8) and L4 (SEQ ID NO: 15), U5 (SEQ ID NO: 9) and L3 (SEQ ID NO: 14), U6 (SEQ ID NO: 1)
0) and L2 (SEQ ID NO: 13), and U7 (SEQ ID NO: 1)
1) and L1 (SEQ ID NO: 12) were similarly performed.
【００６６】上述の７個の反応液をひとつにまとめ、エ
タノール沈殿を行いＤＮＡを回収した。これを８０μｌ
の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．
５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、３００ｍＭ ＮａＣｌに溶解し
た。このうち４０μｌを９５℃に５分間放置した後、３
０分かけて４３℃まで温度を下げた。氷冷後４０μｌの
ライゲーションＢ液（宝酒造（株））を加え、２６℃に
１５分放置した。このサンプルを５％ポリアクリルアミ
ド電気泳動に供した。泳動後、オートラジオグラフィー
で、連結したＤＮＡフラグメントを検出した。約２８０
ｂｐに対応するＤＮＡフラグメントをゲルから抽出後、
定法に従い精製した。The above seven reaction solutions were combined into one, followed by ethanol precipitation to recover DNA. 80 μl of this
5. 100 mM Tris / HCl (pH 7.6);
It was dissolved in 5 mM MgCl 2 and 300 mM NaCl. After leaving 40 μl at 95 ° C. for 5 minutes,
The temperature was reduced to 43 ° C over 0 minutes. After cooling on ice, 40 μl of Ligation B solution (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added, and the mixture was left at 26 ° C. for 15 minutes. This sample was subjected to 5% polyacrylamide electrophoresis. After the electrophoresis, the ligated DNA fragments were detected by autoradiography. About 280
After extracting the DNA fragment corresponding to bp from the gel,
Purified according to a standard method.
【００６７】２）βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８
４発現プラスミドｐＧＰ＃１９の作製（図３及び図４） 合成ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子を含む約２８０
ｂｐのＤＮＡフラグメントには、５’末端には制限酵素
Eco RI 部位が３’末端には制限酵素Sal I 部位が存在
する。ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝子のクローニン
グはこのEco RI／Sal I ＤＮＡフラグメントをｐＧ２
１０ＳｈＣＴ［Ｇ］のEco RI／Sal I 部位に挿入し、行
った。2) βGal-139S (FM) PPH8
4 Construction of Expression Plasmid pGP # 19 (FIGS. 3 and 4) About 280 containing synthetic hProPTH (1-84) gene
The bp DNA fragment has a restriction enzyme at the 5 'end.
At the 3 'end of the Eco RI site there is a restriction enzyme Sal I site. The cloning of the hProPTH (1-84) gene was carried out using the EcoRI / SalI DNA fragment
Insertion was performed at the EcoRI / SalI site of 10ShCT [G].
【００６８】ｐＧ２１０ＳｈＣＴ［Ｇ］を制限酵素Eco
RIとSal I で切断後、ベクター部分を含む約３．５ｋｂ
ＤＮＡフラグメントを調製した。これと１）で得られた
約２８０ｂｐからなるｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝
子のＤＮＡフラグメントを連結し、プラスミドｐＧ２１
０ＳｈＰｒｏＰＴＨを得た（図３）。ｐＧ２１０ＳｈＰ
ｒｏＰＴＨを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、
ＪＭ１０９［ｐＧ２１０ＳｈＰｒｏＰＴＨ］を得た。さ
らに、ｐＧ２１０ＳｈＰｒｏＰＴＨの制限酵素XhoI ／
EcoRI 部位にリンカーＫＭ０９１（配列番号１９）及び
ＫＭ０９２（配列番号２０）を導入し、プラスミドｐＧ
２１０Ｓ（Ｓ／Ｘ）を作製した（図３）。なお、このリ
ンカーは、両端に制限酵素XhoIとEcoRI 部位を、その間
にSac I 部位を持つ。PG210ShCT [G] was replaced with the restriction enzyme Eco.
After cutting with RI and Sal I, about 3.5 kb including vector part
DNA fragments were prepared. The hProPTH (1-84) gene DNA fragment of about 280 bp obtained in 1) was ligated to the plasmid pG21.
0ShProPTH was obtained (FIG. 3). pG210ShP
E. coli JM109 strain was transformed using roPTH,
JM109 [pG210ShProPTH] was obtained. Furthermore, the restriction enzyme XhoI / of pG210ShProPTH /
The linkers KM091 (SEQ ID NO: 19) and KM092 (SEQ ID NO: 20) were introduced into the EcoRI site, and the plasmid pG
210S (S / X) was produced (FIG. 3). This linker has a restriction enzyme XhoI and EcoRI site at both ends, and a SacI site between them.
【００６９】ｐＧ２１０Ｓ（Ｓ／Ｘ）は、制限酵素Sac
I およびXho I で消化後、Kilo-Sequence 用 Deletion
Kit （宝酒造（株））を用いて、βＧａｌ−２１０Ｓを
コードするＤＮＡ領域を経時的かつ特異的に欠失させ
た。Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで末端修復をおこなった
のち、セルフライゲーションを行ない、βＧａｌ−１３
９ＳとｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）がＰｈｅ−Ｍｅｔを
介して連結されたキメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ
（ＦＭ）ＰＰＨ８４をコードするプラスミドｐＧＰ＃１
９を得た（図４）。ｐＧＰ＃１９を導入した大腸菌ＪＭ
１０９株をＪＭ１０９［ｐＧＰ＃１９］と呼ぶ。PG210S (S / X) is a restriction enzyme Sac
Deletion for Kilo-Sequence after digestion with I and Xho I
Using Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), the DNA region encoding βGal-210S was deleted over time and specifically. After performing terminal repair with the Klenow fragment, self-ligation was performed to obtain βGal-13.
Chimeric protein βGal-139S in which 9S and hProPTH (1-84) are linked via Phe-Met
(FM) Plasmid pGP # 1 encoding PPH84
9 was obtained (FIG. 4). E. coli JM transfected with pGP # 19
The 109 strain is called JM109 [pGP # 19].
【００７０】３）キメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ
（ＦＭ）ＰＰＨ８４の調製 ＪＭ１０９［ｐＧＰ＃１９］は２００ｍｌのＳＢ培地を
含む１Ｌ容三角フラスコに接種、３７℃にて１６時間振
とう培養した。前培養液全量を１０μｇ／ｍｌテトラサ
イクリンを含む３ＬのＮＵ培地に接種し、５Ｌ容ファー
メンター（ミツワ理化学工業（株）、KMJ-5B-4U-FP型）
を用いて、３７℃にて通気撹拌培養した。通気量は３Ｌ
／分とし、溶存酸素量は２．０ｐｐｍ以下にならないよ
うに撹拌速度を変化させ制御した。3) Chimeric protein βGal-139S
(FM) Preparation of PPH84 JM109 [pGP # 19] was inoculated into a 1 L Erlenmeyer flask containing 200 ml of SB medium and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. The whole amount of the preculture solution was inoculated into a 3 L NU medium containing 10 μg / ml tetracycline, and a 5 L fermenter (Mitsuwa Rikagaku Kogyo KK, KMJ-5B-4U-FP type) was used.
, And aerated and stirred at 37 ° C. 3L ventilation
/ Min, and controlled by changing the stirring speed so that the dissolved oxygen amount does not become 2.0 ppm or less.
【００７１】ｐＨは９％（ｖ／ｖ）アンモニア水および
１Ｍリン酸を用いてｐＨ７に制御した。炭素源は培養開
始後３、９および１４時間目にグリセロールを培養液１
Ｌあたり１０ｍｌ、窒素源は培養開始後９．５時間目に
５倍濃度のＳＢ培地を培養液１Ｌあたり１０ｍｌ添加
し、供給した。消泡剤（ディスフォームCC-222、（株）
日本油脂）を培養開始時に３００μｌ／Ｌ添加し、その
後は必要に応じて添加した。The pH was controlled at 7 using 9% (v / v) aqueous ammonia and 1M phosphoric acid. Glycerol was added to the culture solution 1 at 3, 9 and 14 hours after the start of the culture.
At 9.5 hours after the start of the cultivation, 10 ml per liter of the culture medium and 10 ml of a 5-fold concentration SB medium per 1 liter of the culture medium were added and supplied. Defoaming agent (Disform CC-222, Inc.)
(Nippon Oil & Fat) was added at the start of the culture at 300 μl / L, and thereafter added as needed.
【００７２】培養１８時間後のＯＤ６６０は５５で、培
養液１ｍｌ当たり約０．５ｍｇのキメラタンパク質βＧ
ａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４が生産できた。キメ
ラタンパク質は不溶性封入体として生産され、以下のよ
うに精製した。培養液１．５Ｌを、６０００ｒｐｍ、４
℃にて１０分間遠心（日立製作所（株）, 20PR-52D）
し、菌体を回収した。菌体を３２０ｍｌの１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に懸濁し、フレンチプ
レスにて破砕した（１０，０００ｐｓｉ；２回）。The OD660 after 18 hours of culture is 55, and about 0.5 mg of chimeric protein βG per ml of culture solution.
al-139S (FM) PPH84 could be produced. The chimeric protein was produced as an insoluble inclusion body and purified as follows. 1.5 L of the culture solution was added at 6000 rpm, 4
Centrifugation at ℃ for 10 minutes (Hitachi, Ltd., 20PR-52D)
Then, the cells were collected. Bacterial cells in 320 ml of 100 mM
The suspension was suspended in Tris / HCl (pH 7.0) and crushed by a French press (10,000 psi; twice).
【００７３】菌体破砕液を４０００ｒｐｍ、４℃にて１
５分間遠心（日立製作所（株）, 05PR-22 ：５０ｍｌ容
のプラスチックチューブ（住友ベークライト（株）））
した。沈殿を０．５％（ｗ／ｗ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０を含む３０ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ
７．０）に懸濁後、３０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間
遠心し、沈殿を回収した。この操作を４回繰り返し、粗
精製キメラタンパク質とした。The cell lysate was dispersed at 4000 rpm at 4 ° C. for 1 hour.
Centrifuge for 5 minutes (Hitachi, Ltd., 05PR-22: 50 ml plastic tube (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.))
did. Precipitate 0.5% (w / w) Triton X-10
0 containing 30 mM 20 mM Tris / HCl (pH
7.0), and the mixture was centrifuged at 3000 rpm at 4 ° C for 15 minutes to collect a precipitate. This operation was repeated four times to obtain a crudely purified chimeric protein.
【００７４】粗精製キメラタンパク質の純度は約７０％
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見積もり）で、タンパク量は
約６７０ｍｇ（ウシ血清アルブミンをスタンダードと
し、ブラッドフォード法で定量）であった。粗精製キメ
ラタンパク質は、ＹＭＣ Packed カラム（2 cm x 25 c
m, （株）山村化学研究所）を用いた高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ；ミリポア（株） Waters 600E
）に供し、精製した。キメラタンパク質は、アセトニ
トリルの直線濃度勾配（A ：０．１％（ｖ／ｖ）トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）；B ：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
／８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル；％Ｂ＝３０％→６
０％／６０分、流速１０ｍｌ／分）で溶出した。各画分
はＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、純度９５％以上の画分をま
とめ、凍結乾燥した。The purity of the partially purified chimeric protein was about 70%
(Estimated by SDS-PAGE), the protein amount was about 670 mg (quantified by the Bradford method using bovine serum albumin as a standard). The crude chimeric protein was applied to a YMC Packed column (2 cm x 25 c
m, High Performance Liquid Chromatography (HPLC; Millipore Corporation Waters 600E) using Yamamura Chemical Laboratory Co., Ltd.
) And purified. The chimeric protein was prepared using a linear gradient of acetonitrile (A: 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid (TFA); B: 0.1% (v / v) TFA.
/ 80% (v / v) acetonitrile;% B = 30% → 6
(0% / 60 min, flow rate 10 ml / min). Each fraction was subjected to SDS-PAGE, and fractions having a purity of 95% or more were collected and freeze-dried.
【００７５】凍結乾燥したキメラタンパク質は再度０．
１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡに溶解後、ＨＰＬＣに供し、さら
に精製した（条件は、グラジエントの条件を％Ｂ＝４０
％→６０％／６０分とした以外は同じ）。分析用ＨＰＬ
Ｃによる分析で２１０ｎｍの吸光度を指標に、純度９９
％上の画分を集め、凍結乾燥し標準品とした。標準品の
タンパク量はアミノ酸分析から推定した。The freeze-dried chimeric protein was again used for 0.
After dissolving in 1% (v / v) TFA, it was subjected to HPLC and further purified (the conditions were such that the gradient condition was% B = 40).
% → 60% / 60 minutes). HPL for analysis
The purity was determined to be 99% using the absorbance at 210 nm as an index in the analysis by C.
The fractions above% were collected and lyophilized to give a standard. The protein content of the standard was estimated from amino acid analysis.
【００７６】参考例２．可溶性キメラタンパク質ＣＡＴ
ＰＨ３４の調製 １）ＣＡＴＰＨ３４発現プラスミドｐｔａｃＣＡＴＰＴ
Ｈ（１−３４）の作製（図５及び６） ｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ［Ｇ］の制限酵素 Eco RI-Xho I
部位にＲ４リンカー（Ｒ４Ｕ：配列番号２１およびＲ４
Ｌ：配列番号２２）を挿入してｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
［Ｇ］Ｒ４を作製した。得られたｐＧ９７Ｓ４ＤｈＣＴ
［Ｇ］Ｒ４の制限酵素Xho I-Kpn I 部位に、ＰＣＲによ
り調製したＰＴＨ（１−３４）遺伝子および以下に示す
ｐｒｏαリンカー（ｐｒｏαＵ：配列番号２３、ｐｒｏ
αＬ：配列番号２４）を挿入してｐＰＴＨ（１−３４）
ｐｒｏαを作製した。なおＰＴＨ（１−３４）遺伝子
は、ｐＧＰ＃１９を鋳型とし、プライマーＰ１（配列番
号２５）およびＰ２（配列番号２６）を用いたＰＣＲに
より調製した（図５）。 Reference Example 2 Soluble chimeric protein CAT
Preparation of PH34 1) CATPH34 expression plasmid ptacCATPT
Preparation of H (1-34) (FIGS. 5 and 6) EcoRI-XhoI, a restriction enzyme of pG97S4DhCT [G]
An R4 linker (R4U: SEQ ID NO: 21 and R4
L: SEQ ID NO: 22) to insert pG97S4DhCT
[G] R4 was prepared. Obtained pG97S4DhCT
[G] A PTH (1-34) gene prepared by PCR and a proα linker shown below (proαU: SEQ ID NO: 23, pro
αL: SEQ ID NO: 24) to insert pPTH (1-34)
proα was prepared. The PTH (1-34) gene was prepared by PCR using pGP # 19 as a template and primers P1 (SEQ ID NO: 25) and P2 (SEQ ID NO: 26) (FIG. 5).
【００７７】次に、ＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ）の３’末端に制限酵素
Xho I 部位を導入するため、プライマーＣＡＴ１および
ＣＡＴ３（配列番号２７および配列番号２８）を合成し
た。プライマーにＣＡＴ１およびＣＡＴ３を、鋳型ＤＮ
ＡにｐｔａｃＣＡＴを用いたＰＣＲにより、３’末端に
制限酵素Xho I 部位が導入されたＣＡＴ遺伝子を得た。
これを制限酵素Nco IおよびXho I 消化後、ｐｔａｃＣ
ＡＴ由来のSal I -Nco I ＤＮＡフラグメント（３．６
ｋｂｐ）とｐＰＴＨ（１−３４）ｐｒｏα由来のXho I
-Sal I ＤＮＡフラグメント（０．１５ｋｂｐ）と連結
してｐｔａｃＣＡＴＰＴＨ（１−３４）を作製した（図
６）。Next, a restriction enzyme was added to the 3 'end of the CAT gene (chloramphenicol acetyltransferase).
To introduce an Xho I site, primers CAT1 and CAT3 (SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28) were synthesized. CAT1 and CAT3 as primers, template DN
A CAT gene in which a restriction enzyme XhoI site was introduced at the 3 ′ end was obtained by PCR using ptacCAT for A.
After digestion with restriction enzymes NcoI and XhoI, ptacC
SalI-NcoI DNA fragment from AT (3.6
kbp) and Xho I derived from pPTH (1-34) proα
This was ligated with a -Sal I DNA fragment (0.15 kbp) to prepare ptacCATPTH (1-34) (FIG. 6).
【００７８】２）キメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４の調
製（図７参照） ｐｔａｃＣＡＴＰＴＨ（１−３４）を有するＪＭ１０１
株をＬＢ培地にて３７℃で培養した。培養液のＯＤ６６
０値が０．６になった時点でＩＰＴＧ（イソプロピルベ
ータチオガラクトシド）を終濃度２ｍＭとなるように添
加し、さらに３時間培養を継続してキメラタンパク質Ｃ
ＡＴＰＨ３４を生産させた。培養終了後、遠心分離
（８，０００ｒｐｍ、２０分）により菌体を回収し、懸
濁液のＯＤ６６０値が７０となるように溶液Ａ（５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ）を添加した。2) Preparation of chimeric protein CATPH34 (see FIG. 7) JM101 having ptacCATPTH (1-34)
The strain was cultured at 37 ° C. in LB medium. OD66 of culture solution
When the 0 value becomes 0.6, IPTG (isopropyl beta thiogalactoside) was added to a final concentration of 2 mM, and the culture was continued for another 3 hours to obtain chimeric protein C.
ATPH34 was produced. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (8,000 rpm, 20 minutes), and the solution A (50 m
M Tris / HCl (pH 8.0), 2 mM EDT
A, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 m
M PMSF) was added.
【００７９】次にこの菌体懸濁液３ｍｌを超音波処理
し、菌体を破砕後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０
分）で可溶性画分を分離し、溶液Ａで平衡化したクロラ
ムフェニコールカプロエート（ sigma C-8899 ）カラム
（３ｍｌ）にアプライした。１Ｍ ＮａＣｌを含む溶液
Ａでカラムを洗浄後、１０ｍＭクロラムフェニコールお
よび１Ｍ ＮａＣｌを含む溶液Ａでキメラタンパク質を
溶出させた。図７は精製前後の試料についてＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行った結果である。なお、レーン１は分子量マ
ーカーを、レーン２は菌体破砕後の可溶性画分を、レー
ン３は精製後のキメラタンパク質ＣＡＴＰＴＨ（１−３
４）を示す。レーン１の左側の数字は分子量マーカーの
大きさ（ｋＤａ）を示す。キメラタンパク質は可溶性画
分に生産され、クロラムフェニコールカプロエートによ
るアフィニティクロマトグラフィーにより容易に精製さ
れた。Next, 3 ml of the cell suspension was subjected to ultrasonic treatment to disrupt the cells, and then centrifuged (12,000 rpm, 10 rpm).
) And applied to a chloramphenicol caproate (sigma C-8899) column (3 ml) equilibrated with solution A. After washing the column with solution A containing 1 M NaCl, the chimeric protein was eluted with solution A containing 10 mM chloramphenicol and 1 M NaCl. FIG. 7 shows SDS-P for the sample before and after purification.
This is the result of performing AGE. Lane 1 shows a molecular weight marker, lane 2 shows a soluble fraction after disruption of bacterial cells, and lane 3 shows a purified chimeric protein CATPTH (1-3).
4) is shown. The number on the left side of Lane 1 indicates the size (kDa) of the molecular weight marker. The chimeric protein was produced in the soluble fraction and was easily purified by affinity chromatography with chloramphenicol caproate.
【００８０】参考例３．不溶性キメラタンパク質βＧａ
ｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４の調製 １）βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４発現プラスミド
ｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４の作製（図８〜１０） ｐＧＰ＃１９を鋳型にＳ０１（配列番号２９）およびＳ
０２（配列番号３０）をプライマーとして、ＰＣＲ法に
より、ｈＰＴＨ（１−８４）の３５番目のコドンＧＴＴ
を翻訳停止コドンＴＡＡに変換したＤＮＡフラグメント
を増幅後、常法により制限酵素 Aat I I−Sal I ＤＮＡ
フラグメントを単離精製し、ｐＧＰ＃１９の対応する部
分と交換して、ｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３４を作製した（図
８）。 Reference Example 3 Insoluble chimeric protein βGa
Preparation of 1-117S4HPPH34 1) Preparation of βGal-117S4HPPH34 expression plasmid pG117S4HPPH34 (FIGS. 8 to 10) S01 (SEQ ID NO: 29) and S
02 (SEQ ID NO: 30) as a primer and the 35th codon GTT of hPTH (1-84) by PCR
After amplification of the DNA fragment which has been converted to the translation stop codon TAA, the restriction enzyme Aat II-Sal I DNA
The fragment was isolated and purified, and replaced with the corresponding part of pGP # 19 to create pGP # 19PPH34 (FIG. 8).
【００８１】次に、ｐＧ２１０Ｓ（Ｓ／Ｘ）を鋳型にＳ
０３（配列番号３１）とＳ０５（配列番号３２）をプラ
イマーとしてＰＣＲ法により増幅後、制限酵素Sal I と
SmaI で消化したＤＮＡフラグメント、ｐＧＰ＃１９Ｐ
ＰＨ３４を鋳型にＳ０７（配列番号３３）およびＳ０２
（配列番号３０）をプライマーとしてＰＣＲ法により増
幅後、制限酵素 Sal IとSma I で消化したＤＮＡフラグ
メント、並びにｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３４の複製開始起点
を含む制限酵素 Pvu I-Sal I ＤＮＡフラグメントをＴ
４ＤＮＡライゲースで連結し、ｐＧ１１７ＳＰＰＨ３４
を作製した（図９〜１０）。ｐＧ１１７ＳＰＰＨ３４の
制限酵素Sma I 部位に（Ｈｉｓ）4 −Ｐｒｏ−Ｇｌｙを
コードするリンカーＳ０８（配列番号３４）およびＳ０
９（配列番号３５）を挿入し、ｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ
３４を作製した（図１０）。リンカーの方向性は、プラ
スミドを調製後、ＤＮＡ塩基配列を決定し、確認した。Next, using pG210S (S / X) as a template,
03 (SEQ ID NO: 31) and S05 (SEQ ID NO: 32) were used as primers for amplification by the PCR method.
DNA fragment digested with SmaI, pGP # 19P
S07 (SEQ ID NO: 33) and S02 using PH34 as a template
After amplification by PCR using (SEQ ID NO: 30) as a primer, a DNA fragment digested with restriction enzymes Sal I and Sma I and a restriction enzyme Pvu I-Sal I DNA fragment containing the replication origin of pGP # 19PPH34 were digested with T
Ligated with 4 DNA ligase, pG117SPPH34
(FIGS. 9 to 10). Linkers S08 (SEQ ID NO: 34) and S0 encoding (His) 4 -Pro-Gly at the restriction enzyme SmaI site of pG117SPPH34
9 (SEQ ID NO: 35) was inserted into pG117S4HPPH.
34 were produced (FIG. 10). After preparing the plasmid, the DNA base sequence was determined and the directionality of the linker was confirmed.
【００８２】２）キメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ
４ＨＰＰＨ３４の生産 キメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４を
大量に得るため、本キメラタンパク質の発現ベクターを
導入した大腸菌Ｍ２５［ｐＧ１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４］
株を２０Ｌ ＳＢ２培地中、３７℃で培養した。菌体濃
度ＯＤ６６０＝１．０でＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとな
るように添加し、菌体濃度がＯＤ６６０＝１２まで培養
を継続した。消泡剤にはディスフォームCC−222
（（株）日本油脂）を用いた。集菌後、ＴＥ（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ８．０）に
懸濁し、高圧ホモジナイザー(Manton-Gaullin ) による
菌体破砕、遠心分離、ＴＥ及び脱イオン水での懸濁洗浄
を行って、封入体約１００ｇを得た。2) Chimeric protein βGal-117S
Production of 4HPPH34 To obtain a large amount of the chimeric protein βGal-117S4HPPH34, E. coli M25 transfected with the expression vector of the chimeric protein [pG117S4HPPH34]
The strain was cultured at 37 ° C. in 20 L SB2 medium. At a cell concentration of OD660 = 1.0, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the culture was continued until the cell concentration was OD660 = 12. Deform CC-222 for defoamer
(Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) was used. After collection, TE (10 mM
The suspension was suspended in Tris / HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0) and disrupted by a high-pressure homogenizer (Manton-Gaullin), centrifuged, and washed by suspension with TE and deionized water to obtain about 100 g of an inclusion body.
【００８３】実施例１．サッカロマイセス・セレビジア
エを宿主とした分泌型Ｋｅｘ２誘導体の発現 Ｋｅｘ２プロテアーゼ活性を有する酵素を大量に精製す
るためには、生産量が多いことはもちろん、その精製が
簡単であることが重要であり、このためには、他のタン
パク質が少ない培養溶液中へ分泌させることが有利であ
ると考えた。分泌型Ｋｅｘ２誘導体としてｓｓＫｅｘ２
に関する報告があるが、その生産量は４ｍｇ／Ｌ培養液
で、工業的スケールで用いるためには少ない。そこで、
まず、種々の分泌型Ｋｅｘ２誘導体を作製し、サッカロ
マイセス・セレビジアエを宿主として発現させて分泌生
産量を調べ、その中から分泌生産量が多いＫｅｘ２誘導
体を得ることにした。 Embodiment 1 Saccharomyces cerevisia
Expression of secreted Kex2 derivative using D as a host In order to purify an enzyme having Kex2 protease activity in a large amount, it is important not only to produce a large amount but also to purify the enzyme easily. It was considered advantageous to secrete it into a culture solution that is low in other proteins. SsKex2 as a secreted Kex2 derivative
However, the production is 4 mg / L, which is low for use on an industrial scale. Therefore,
First, various secretory Kex2 derivatives were prepared, Saccharomyces cerevisiae was expressed as a host, and the secretory production was examined. Among them, a Kex2 derivative having a high secretory production was decided.
【００８４】１）分泌型Ｋｅｘ２誘導体発現プラスミド
の作製（図１１、１２及び１３） 分泌型ＫＥＸ２遺伝子はＰＣＲ法を用いて作製した。プ
ライマーの配列は図１１（ｂ）に示した。ＫＭ０８５
（配列番号３６）は、５’末端に制限酵素Eco RI部位
（下線部）を、ＫＭ０８８（配列番号３７）、ＫＭ０８
９（配列番号３８）、ＫＭ０９０（配列番号３９）とＫ
Ｍ０９３（配列番号４０）は、それぞれ５’末端に制限
酵素Sal I 部位（下線部）を有する。また、これらのプ
ライマーは、図１１（ａ）に示すＫＥＸ２遺伝子領域に
対応し、ＫＭ０８５は、ＫＥＸ２遺伝子の開始メチオニ
ンをコードする塩基配列を含み、ＫＭ０８８、ＫＭ０８
９、ＫＭ０９０とＫＭ０９３は、それぞれＮ末端から、
６６０番目、６７９番目、６８８番目、および６９９番
目のアミノ酸の直後に翻訳停止コドンＴＡＡが付加した
配列のアンチセンス鎖の塩基配列を有する。1) Preparation of secretory Kex2 derivative expression plasmid (FIGS. 11, 12 and 13) The secretory KEX2 gene was prepared by PCR. The sequences of the primers are shown in FIG. KM085
(SEQ ID NO: 36) has a restriction enzyme EcoRI site (underlined) at the 5 'end, KM088 (SEQ ID NO: 37), KM08
9 (SEQ ID NO: 38), KM090 (SEQ ID NO: 39) and K
M093 (SEQ ID NO: 40) has a restriction enzyme SalI site (underlined) at the 5 ′ end. In addition, these primers correspond to the KEX2 gene region shown in FIG. 11 (a),
9, KM090 and KM093 are each N-terminal,
It has the base sequence of the antisense strand in which a translation stop codon TAA is added immediately after amino acids 660, 679, 688, and 699.
【００８５】制限酵素 Eco RI で切断し直鎖上にしたプ
ラスミドｐＹＥ−ＫＥＸ２（５．０）ｂを鋳型に、ＫＭ
０８５およびＫＭ０８８をプライマーに用い、ＰＣＲ反
応を行った。反応精製物は制限酵素Eco RIおよびSal I
で切断し、Eco RI-Sal I ＤＮＡフラグメントを得た。
このＤＮＡフラグメントは、Ｋｅｘ２−６６０をコード
するＤＮＡ塩基配列（ＫＥＸ２−６６０）を有し、その
上流に制限酵素Eco RI、下流に制限酵素Sal I 部位を有
する。次に、プラスミドｐＹＥ−２２ｍを制限酵素Eco
RIとSal I で切断後、ベクター部分を含む約８．３ｋｂ
のＤＮＡフラグメントを精製した。これと先に得たＫｅ
ｘ２−６６０をコードする遺伝子を含むEco RI-Sal I
ＤＮＡフラグメントをそれぞれ連結し、プラスミドｐＹ
Ｅ−６６０を得た（図１２）。The plasmid pYE-KEX2 (5.0) b, which had been cut into linear form by restriction enzyme EcoRI, was
PCR reaction was performed using 085 and KM088 as primers. The reaction purified product was restriction enzymes Eco RI and Sal I
To obtain EcoRI-SalI DNA fragment.
This DNA fragment has a DNA base sequence (KEX2-660) encoding Kex2-660, and has a restriction enzyme EcoRI upstream and a restriction enzyme SalI site downstream thereof. Next, the plasmid pYE-22m was replaced with the restriction enzyme Eco.
After digestion with RI and Sal I, about 8.3 kb including vector part
Was purified. This and the Ke I got earlier
Eco RI-Sal I containing the gene encoding x2-660
The DNA fragments were each ligated and the plasmid pY
E-660 was obtained (FIG. 12).
【００８６】同様に、プライマーＫＭ０８８の代わりに
ＫＭ０８９、ＫＭ０９０、またはＫＭ０９３を用いて、
それぞれＫｅｘ２−６７９、Ｋｅｘ２−６８８およびＫ
ｅｘ２−６９９をコードする塩基配列（ＫＥＸ２−６７
９、ＫＥＸ２−６８８、ＫＥＸ２−６９９）を含むEco
RI-Sal I ＤＮＡフラグメントを回収し、プラスミドｐ
ＹＥ−２２ｍのEco RI-Sal I断片と連結することによ
り、プラスミドｐＹＥ−６７９、ｐＹＥ−６８８、また
はｐＹＥ−６９９を得ることができる。プラスミドｐＹ
Ｅ−６１４は、ｐＹＥ−ＫＥＸ２（RI-Pvu II ）のＫＥ
Ｘ２遺伝子の一部を含むBgl II - Sal I ＤＮＡフラグ
メントをｐＹＥ−６６０のＫＥＸ２−６６０遺伝子の一
部を含むBgl II - Sal I ＤＮＡフラグメントとを置換
し、作製した（図１３）。Similarly, using KM089, KM090, or KM093 instead of primer KM088,
Kex2-679, Kex2-688 and K, respectively
ex2-699 (KEX2-67)
9, KEX2-688, KEX2-699)
The RI-Sal I DNA fragment was recovered and the plasmid p
By ligating with the EcoRI-SalI fragment of YE-22m, plasmids pYE-679, pYE-688, or pYE-699 can be obtained. Plasmid pY
E-614 is the KE of pYE-KEX2 (RI-Pvu II).
A BglII-SalI DNA fragment containing a part of the X2 gene was prepared by substituting a BglII-SalI DNA fragment containing a part of the KEX2-660 gene of pYE-660 (FIG. 13).
【００８７】２）形質転換および分泌型Ｋｅｘ２誘導体
の発現（図１４および１５参照） プラスミド（ｐＹＥ−２２ｍ、ｐＹＥ−６１４、ｐＹＥ
−６６０、ｐＹＥ−６７９、ｐＹＥ−６８８及びｐＹＥ
−６９９）をそれぞれ、Ｋ１６−５７Ｃ株へ導入し、Ｋ
１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−２２ｍ］、Ｋ１６−５７Ｃ［ｐ
ＹＥ−６１４］、Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６６０］、
Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６７９］、Ｋ１６−５７Ｃ
［ｐＹＥ−６８８］及びＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６９
９］株を得た。Ｋｅｘ２誘導体の培養液への分泌量は、
培養上清のＫｅｘ２活性測定および濃縮液のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより調べた。2) Transformation and expression of secreted Kex2 derivative (see FIGS. 14 and 15) Plasmids (pYE-22m, pYE-614, pYE
-660, pYE-679, pYE-688 and pYE
-699) was introduced into the K16-57C strain, respectively.
16-57C [pYE-22m], K16-57C [p
YE-614], K16-57C [pYE-660],
K16-57C [pYE-679], K16-57C
[PYE-688] and K16-57C [pYE-69]
9] strain was obtained. The secretion amount of the Kex2 derivative into the culture solution is as follows:
Measurement of Kex2 activity of culture supernatant and SDS-P of concentrated solution
Investigated by AGE.
【００８８】コロニーをＹＣＤＰ培地４ｍｌに接種後、
３２℃で一晩振とう培養した。培養液１００μｌをＹＣ
ＤＰ培地４ｍｌに接種後、３２℃で一晩振とう培養し
た。培養液１ｍｌを１２，０００ｒｐｍ、５分、４℃
（トミー精工；MRX-150 ）にて遠心をし、培養上清を得
た。培養上清は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ
７．０）で２〜６４倍希釈後、Ｋｅｘ２活性を測定し
た。結果を図１４に示す。Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６
６０］、Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６７９］およびＫ１
６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６８８］のＯＤ６００あたりのＫ
ｅｘ２活性は、Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６１４］と比
較して、それぞれ２５倍、１５倍と１．２倍であった。
Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−２２ｍ］とＫ１６−５７Ｃ
［ｐＹＥ−６９９］の培養上清にはＫｅｘ２活性は検出
されなかった。After inoculating the colony into 4 ml of YCDP medium,
The cells were cultured with shaking at 32 ° C. overnight. 100 μl of the culture solution was added to YC
After inoculating 4 ml of DP medium, the cells were cultured with shaking at 32 ° C. overnight. 1 ml of the culture solution is 12,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C.
(Tomy Seiko; MRX-150) to obtain a culture supernatant. The culture supernatant was 100 mM Tris / HCl (pH
After 2 to 64 fold dilution in 7.0), Kex2 activity was measured. FIG. 14 shows the results. K16-57C [pYE-6
60], K16-57C [pYE-679] and K1
K per OD600 of 6-57C [pYE-688]
The ex2 activity was 25-fold, 15-fold and 1.2-fold, respectively, compared to K16-57C [pYE-614].
K16-57C [pYE-22m] and K16-57C
No Kex2 activity was detected in the culture supernatant of [pYE-699].
【００８９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルは、培養上
清をウルトラフリーC3GC（ミリポア（株）；分画分子
量：１０，０００）を用いて２０倍濃縮して調製し、レ
ーンあたり培養上清２００μｌ相当を用いた。結果を図
１５に示す。なお、レーン１および７は分子量マーカー
を、レーン２はＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−２２ｍ］を、
レーン３はＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６１４］を、レー
ン４はＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６６０] を、レーン５
はＫ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６７９］を、レーン６はＫ
１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６８８］を示している。レーン
１の左側の数字は分子量マーカーの大きさ（ｋＤａ）を
示す。A sample for SDS-PAGE was prepared by concentrating the culture supernatant 20-fold using Ultrafree C3GC (Millipore, Inc .; molecular weight cut off: 10,000), equivalent to 200 μl of culture supernatant per lane. Was used. FIG. 15 shows the results. Lanes 1 and 7 show molecular weight markers, lane 2 shows K16-57C [pYE-22m],
Lane 3 shows K16-57C [pYE-614], lane 4 shows K16-57C [pYE-660], and lane 5
Shows K16-57C [pYE-679], and lane 6 shows K
16-57C [pYE-688]. The number on the left side of Lane 1 indicates the size (kDa) of the molecular weight marker.
【００９０】Ｋｅｘ２−６６０およびＫｅｘ２−６７９
は、活性同様、Ｋｅｘ２−６１４に比べ分泌量が増加し
ていることが明らかになった。また、これらの分子量は
アミノ酸残基数に対応し大きくなること、すなわち、今
回の培養においては、昆虫細胞Ｓｆ９を宿主としたＫｅ
ｘ２Δp のように自己分解物が蓄積するのではないこと
が明らかになった。Ｋｅｘ２−６６０とＫｅｘ２−６７
９の分泌生産量は、今まで報告されているＫｅｘ２−６
１４の分泌生産量の10倍以上と非常に多いことがわかっ
た。また、培養上清で顕著な自己分解も見られないこと
から、生産方法の検討によりさらに生産量が上昇するこ
とが期待できる。Kex2-660 and Kex2-679
Showed that the amount of secretion increased as compared with Kex2-614, as in the activity. In addition, these molecular weights increase in accordance with the number of amino acid residues.
It became clear that autolysis products did not accumulate as in x2Δp. Kex2-660 and Kex2-67
9 is based on the previously reported Kex2-6.
It was found that the secretory production of 14 was very large, more than 10 times. Further, since no significant autolysis is observed in the culture supernatant, it is expected that the production amount will be further increased by examining the production method.
【００９１】実施例２．Ｋｅｘ２−６６０の精製 Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６６０］株をスケールを上げ
て培養し、培養上清からのＫｅｘ２−６６０の精製を試
みた。Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６６０］をＹＣＤＰ培
地３Ｌで、３２℃で一晩培養した。培養上清２．３Ｌ
は、限外濾過モジュール（UF-LMSII システム；UF2CS-
3000PS；東ソー（株））を用いて、濃縮および緩衝液
（２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．
０）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ2 ）
交換を行なった（最終容量：２７５ｍｌ）。 Embodiment 2 FIG. Purification of Kex2-660 The K16-57C [pYE-660] strain was cultured at a higher scale, and Kex2-660 was tried to be purified from the culture supernatant. K16-57C [pYE-660] was cultured overnight at 32 ° C. in 3 L of YCDP medium. 2.3 L of culture supernatant
Is an ultrafiltration module (UF-LMSII system; UF2CS-
Concentration and buffer solution (20 mM Bis-Tris / HCl (pH 6.
0), 50 mM NaCl, 0.2 mM CaCl 2 )
An exchange was made (final volume: 275 ml).
【００９２】このうち２１０ｍｌをあらかじめ同緩衝液
で平衡化したQ-Sepharose XK16（ファルマシア（株））
カラムに吸着させた。７５ｍｌの同緩衝液で洗浄した
後、同緩衝液で５０〜３５０ｍＭのＮａＣｌ濃度の直線
濃度勾配による溶出（１２０ｍｌ）を行った。流速は３
ｍｌ／分で行った。Ｋｅｘ２活性は１５０〜２５０ｍＭ
のＮａＣｌ濃度の溶出画分２４ｍｌに回収した。この溶
出液に６．６ｇの硫酸アンモニウムを添加した後、１Ｎ
ＨＣｌを用いてｐＨを６．０に調整し、２０ｍＭ Ｂ
ｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、０．２ｍＭ
ＣａＣｌ2 で３０ｍｌにフィルアップした。Of these, 210 ml were Q-Sepharose XK16 (Pharmacia) pre-equilibrated with the same buffer.
The column was adsorbed. After washing with 75 ml of the same buffer, elution (120 ml) was performed with the same buffer using a linear gradient of 50 to 350 mM NaCl. Flow velocity is 3
Performed at ml / min. Kex2 activity is 150-250 mM
Was collected in 24 ml of the eluted fraction having an NaCl concentration of 1. After adding 6.6 g of ammonium sulfate to the eluate, 1N
The pH was adjusted to 6.0 using HCl and 20 mM B
is-Tris / HCl (pH 6.0), 0.2 mM
Filled up to 30 ml with CaCl 2 .
【００９３】このうち１５ｍｌをあらかじめ２Ｍ硫酸ア
ンモニウムを含む２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
（ｐＨ６．０）、０．２ｍＭ ＣａＣｌ2 で平衡化した
Phenylsuperose HR 5/5（ファルマシア（株））カラム
に吸着させた。２．５ｍｌの同緩衝液で洗浄した後、２
０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．０）、
０．２ｍＭ ＣａＣｌ2 で２〜０Ｍの硫酸アンモニウム
の直線濃度勾配による溶出（１５ｍｌ）を行った。流速
は０．５ｍｌ／分で行った。Ｋｅｘ２活性は０．８〜
０．６Ｍの硫酸アンモニウム濃度の溶出画分２．２５ｍ
ｌに回収した。各工程でのＫｅｘ２−６６０の回収率を
表１に示す。回収率は、各工程の回収率を積算して求め
た。15 ml of this was previously filled with 20 mM Bis-Tris / HCl containing 2 M ammonium sulfate.
(PH 6.0), equilibrated with 0.2 mM CaCl 2
It was adsorbed to a Phenylsuperose HR 5/5 (Pharmacia Co., Ltd.) column. After washing with 2.5 ml of the same buffer, 2
0 mM Bis-Tris / HCl (pH 6.0),
Elution (15 ml) was performed with a linear concentration gradient of 2 to 0 M ammonium sulfate using 0.2 mM CaCl 2 . The flow rate was 0.5 ml / min. Kex2 activity is 0.8 ~
2.25m eluted fraction with 0.6M ammonium sulfate concentration
l. Table 1 shows the recovery rate of Kex2-660 in each step. The recovery rate was determined by integrating the recovery rates of each step.
【００９４】[0094]
【表１】 [Table 1]
【００９５】実施例３．Ｋｅｘ２−６６０のＫｅｘ２プ
ロテアーゼ活性に与える尿素の影響 キメラタンパク質発現法では、キメラタンパク質が不溶
性封入体を形成する場合が多く、これを可溶化するため
に尿素等の変性剤が用いられる。今まで、Ｋｅｘ２プロ
テアーゼや分泌型Ｋｅｘ２誘導体の活性に尿素が与える
影響についての報告はない。そこで、Ｋｅｘ２−６６０
のプロテアーゼ活性に与える尿素の影響を、合成基質Ｂ
ｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡおよびキメラタ
ンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４を基質
として調べた。 Embodiment 3 FIG. Kex2-660 Kex2
Effect of Urea on Rotase Activity In the chimeric protein expression method, the chimeric protein often forms an insoluble inclusion body, and a denaturant such as urea is used to solubilize the insoluble inclusion body. Until now, there is no report on the effect of urea on the activity of Kex2 protease and secreted Kex2 derivatives. Therefore, Kex2-660
Effect of urea on protease activity of synthetic substrate B
oc-Leu-Arg-Arg-MCA and chimeric protein βGal-139S (FM) PPH84 were examined as substrates.
【００９６】１）合成基質を基質としたときのＫｅｘ２
−６６０のＫｅｘ２プロテアーゼ活性に与える尿素の影
響 実施例２で精製したＫｅｘ２−６６０（最終濃度８０〜
１２００Ｕ／ｍｌに調整）を用いて、最終尿素濃度０、
１、２、４Ｍでの活性を合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて調べた。反応条件は、尿素
以外は前述のＫｅｘ２活性測定方法に従った。尿素非存
在下の活性を１００％としたとき、尿素濃度１、２、４
Ｍでの活性は、それぞれ、７０％、４０％、１０％であ
ることがわかった（図１６）。不溶性封入体を尿素溶液
に溶解後、プロテアーゼ等を作用させる場合には、一般
的には２〜４Ｍの尿素濃度で行われる。従って、キメラ
タンパク質の溶解条件等を検討すれば、Ｋｅｘ２ー６６
０はキメラタンパク質から目的ペプチドを切り出すため
の酵素として使用可能と考えた。1) Kex2 using synthetic substrate as substrate
Effect of urea on Kex2 protease activity of -660 Kex2-660 purified in Example 2 (final concentration 80-
Adjusted to 1200 U / ml) using a final urea concentration of 0,
The activity at 1, 2, and 4M was determined using the synthetic substrate Boc-Leu-Ar.
It examined using g-Arg-MCA. The reaction conditions followed the Kex2 activity measurement method described above, except for urea. Assuming that the activity in the absence of urea is 100%, urea concentrations of 1, 2, 4
The activity at M was found to be 70%, 40% and 10%, respectively (FIG. 16). When a protease or the like is allowed to act after dissolving the insoluble inclusion body in a urea solution, it is generally performed at a urea concentration of 2 to 4M. Therefore, considering the conditions for dissolving the chimeric protein, Kex2-66
0 was considered to be usable as an enzyme for cutting out the target peptide from the chimeric protein.
【００９７】２）タンパク質を基質としたときのＫｅｘ
２−６６０のＫｅｘ２プロテアーゼ活性に与える尿素の
影響 参考例１で調製したβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ
８４と実施例２で精製したＫｅｘ２−６６０を用い、Ｋ
ｅｘ２ー６６０のプロテアーゼ活性に与える尿素の影響
について調べた。まず、尿素濃度１．５〜３．０Ｍにつ
いて、以下の条件で、３７℃、３０分間反応させた。反
応液は、４倍容量の５Ｎ酢酸を添加後、５０μｌをYMC-
ODS-A302カラム（d 4.6 mm x 150 mm ；（株）山村化学
研究所）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ； 島津製作所（株） LC6A ）に供し、直線濃度勾配
（Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）；B ：０．０９４％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／８０％
（ｖ／ｖ）アセトニトリル；％Ｂ＝３０％→６０％／３
０分； 流速１ｍｌ／分）で溶出した。2) Kex using protein as substrate
Effect of urea on Kex2 protease activity of 2-660 βGal-139S (FM) PPH prepared in Reference Example 1
84 and Kex2-660 purified in Example 2,
The effect of urea on the protease activity of ex2-660 was examined. First, a urea concentration of 1.5 to 3.0 M was reacted at 37 ° C. for 30 minutes under the following conditions. After adding 4 volumes of 5N acetic acid, 50 μl of the reaction solution was added to YMC-
High performance liquid chromatography (HPL) using an ODS-A302 column (d 4.6 mm x 150 mm; Yamamura Chemical Laboratory Co., Ltd.)
C; Shimadzu Corporation LC6A) and a linear concentration gradient (A: 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid (TF
A); B: 0.094% (v / v) TFA / 80%
(V / v) acetonitrile;% B = 30% → 60% / 3
0 min; flow rate 1 ml / min).
【００９８】 ２ｍｇ／ｍｌ βＧａｌ- １３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０） １．５〜３．０Ｍ 尿素 １ｍＭ ＣａＣｌ2 ５０ｋＵ／ｍｌ Ｋｅｘ２−６６０2 mg / ml βGal-139S (FM) PPH84 100 mM Tris / HCl (pH 7.0) 1.5 to 3.0 M urea 1 mM CaCl 2 50 kU / ml Kex2-660
【００９９】Ｋｅｘ２−６６０処理後新たに生じるピー
クを分取し、Ｎ末端からのアミノ酸配列の決定およびア
ミノ酸組成分析を行い、βＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴ
Ｈ（１−８４）およびｈＰＴＨ（１−４４）を同定し
た。βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４には、Ｋｅ
ｘ２プロテアーゼによって切断が予想される配列は、Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ（切断部位Ａ）、Ｌｙｓ−Ａｒｇ（切断部
位Ｂ）、Ｐｒｏ−Ａｒｇ（切断部位Ｃ、切断部位Ｄ）の
４カ所存在する。同定したペプチドフラグメントから、
切断部位Ａ、切断部位Ｂ、切断部位Ｃの切断が確認でき
たが、切断部位Ｄの切断は確認できなかった。The peak newly generated after the treatment with Kex2-660 was collected, the amino acid sequence was determined from the N-terminus, and the amino acid composition was analyzed. ΒGal (1-14), hPT
H (1-84) and hPTH (1-44) were identified. βGal-139S (FM) PPH84 contains Ke
The sequence predicted to be cleaved by the x2 protease is A
rg-Arg (cleavage site A), Lys-Arg (cleavage site B), and Pro-Arg (cleavage site C, cleavage site D). From the identified peptide fragment,
Cleavage of cleavage site A, cleavage site B, and cleavage site C was confirmed, but cleavage of cleavage site D was not confirmed.
【０１００】Ｋｅｘ２−６６０処理後生じる各ペプチド
フラグメントの回収率は、以下のようにして決定した。 回収率（％）＝ＦＰＡ×ＣＡＡ×１００／（ＣＰＡ×Ｆ
ＡＡ） ＦＰＡ；Ｋｅｘ２−６６０処理を行った後の各ペプチド
フラグメントのピークエリア面積 ＣＡＡ；βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４のアミ
ノ酸数（２３１アミノ酸） ＣＰＡ；Ｋｅｘ２−６６０処理を行う前のβＧａｌ−１
３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４のピークエリア面積 ＦＡＡ；各ペプチドフラグメントのアミノ酸数The recovery of each peptide fragment generated after Kex2-660 treatment was determined as follows. Recovery rate (%) = FPA × CAA × 100 / (CPA × F
AA) FPA; peak area of each peptide fragment after Kex2-660 treatment CAA; βGal-139S (FM) PPH84 amino acid number (231 amino acids) CPA; βGal-1 before Kex2-660 treatment
39A (FM) PPH84 peak area area FAA; number of amino acids in each peptide fragment
【０１０１】結果を図１７に示す。なお、□、○、●、
および△は、それぞれ、βＧａｌ−（１−１４）、ｈＰ
ＴＨ（１−８４）、ｈＰＴＨ（１−４４）およびｈＰＴ
Ｈ（１−８４）＋ｈＰＴＨ（１−４４）の回収率を示
す。尿素濃度１．５〜２．５Ｍの範囲では尿素濃度が上
昇するに従い、Ｋｅｘ２−６６０により切り出されるペ
プチドの回収率が増加すること、すなわち、切断部位Ａ
切断部位Ｂおよび切断部位Ｃの切断効率が上昇すること
がわかった。The results are shown in FIG. In addition, □, ○, ●,
And 、 are βGal- (1-14), hP
TH (1-84), hPTH (1-44) and hPT
The recovery rate of H (1-84) + hPTH (1-44) is shown. In the range of urea concentration of 1.5 to 2.5 M, as the urea concentration increases, the recovery rate of the peptide cleaved by Kex2-660 increases, that is, the cleavage site A
It was found that the cleavage efficiency of the cleavage sites B and C increased.
【０１０２】一方、２．５〜３．０Ｍの尿素濃度では、
βＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴＨ（１−４４）の回収率
が低下し、［ｈＰＴＨ（１−８４）＋ｈＰＴＨ（１−４
４）］の回収率はほとんど変わらず、ｈＰＴＨ（１−８
４）が増加することから、切断部位Ｂの切断効率は変わ
らないが、切断部位Ａおよび切断部位Ｃの切断効率が低
下することがわかった。すなわち、Ｋｅｘ２−６６０に
よるβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４の切断にお
いて、２．５Ｍまでの濃度なら尿素濃度は高い方が切断
効率が上がるが、２．５〜３．０Ｍの尿素濃度ではその
配列により切断効率に差が出ることがわかった。On the other hand, at a urea concentration of 2.5 to 3.0 M,
The recovery rate of βGal (1-14) and hPTH (1-44) decreased, and [hPTH (1-84) + hPTH (1-4)
4)] was almost unchanged, and hPTH (1-8
4), it was found that the cleavage efficiency of the cleavage site B was not changed, but the cleavage efficiency of the cleavage site A and the cleavage site C was reduced. That is, in the cleavage of βGal-139S (FM) PPH84 by Kex2-660, if the concentration is up to 2.5M, the higher the urea concentration is, the higher the cleavage efficiency is. It was found that there was a difference in cutting efficiency.
【０１０３】そこで、より高い尿素濃度３．０〜４．０
Ｍについて、以下の実験を行い、各ペプチドフラグメン
トの回収率等を調べた。 ２ｍｇ／ｍｌ βＧａｌ- １３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０） ３．０〜４．０Ｍ 尿素 １ｍＭ ＣａＣｌ2 ２０ｋＵ／ｍｌ Ｋｅｘ２−６６０ 結果を図１８に示す。なお、シンボル及び回収率の算出
は前述の通りである。Therefore, a higher urea concentration of 3.0-4.0
For M, the following experiment was performed to examine the recovery rate of each peptide fragment and the like. 2 mg / ml βGal-139S (FM) PPH84 100 mM Tris / HCl (pH 7.0) 3.0 to 4.0 M urea 1 mM CaCl 2 20 kU / ml Kex2-660 The results are shown in FIG. 18. The calculation of the symbol and the collection rate is as described above.
【０１０４】その結果、尿素濃度３．０〜４．０Ｍにお
いては、すべてのペプチドフラグメントの回収率に顕著
な差は見られなかったが、尿素濃度が上昇するに従い、
βＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴＨ（１−４４）の回収率
が低下し、ｈＰＴＨ（１−８４）が増加する傾向が見ら
れた。すなわち、尿素濃度が上昇するに従い、切断部位
Ｂの切断効率が若干増加し、切断部位Ｃの切断効率は減
少することがわかった。As a result, when the urea concentration was 3.0 to 4.0 M, no remarkable difference was observed in the recovery rates of all the peptide fragments.
The recovery rates of βGal (1-14) and hPTH (1-44) decreased, and the tendency of hPTH (1-84) increased. That is, it was found that as the urea concentration increases, the cleavage efficiency of the cleavage site B slightly increases, and the cleavage efficiency of the cleavage site C decreases.
【０１０５】以上、１．５〜４．０Ｍ尿素濃度でのＫｅ
ｘ２−６６０によるβＧａｌ- １３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ
８４の切断についてまとめると、尿素濃度１．５〜２．
５Ｍの範囲では尿素濃度が上昇するに従い、切断部位Ａ
切断部位Ｂおよび切断部位Ｃの切断効率が上昇するこ
と、尿素濃度２．５〜３．５Ｍの範囲では、切断部位Ｂ
の切断効率が上昇するが、切断部位Ｃの切断効率は低下
することがわかった。これらの知見は、合成基質を用い
た場合からは予想できず、本発明により初めて明らかに
なった。キメラタンパク質からのｈＰＴＨ（１−８４）
の切り出しという観点からは、切断部位Ｂの切断効率が
高く、切断部位Ｃの切断効率が低い、３．５〜４．０Ｍ
の尿素濃度が望ましいことが明らかになった。As described above, Ke at a urea concentration of 1.5 to 4.0 M was used.
βGal-139S (FM) PPH with x2-660
In summary, the urea concentration is 1.5-2.
In the range of 5M, as the urea concentration increases, the cleavage site A
When the cleavage efficiency of the cleavage site B and the cleavage site C is increased and the urea concentration is in the range of 2.5 to 3.5 M, the cleavage site B
Was found to increase, but the cleavage efficiency of the cleavage site C decreased. These findings could not be expected from the case where a synthetic substrate was used, and were first revealed by the present invention. HPTH (1-84) from chimeric protein
From the viewpoint of excision, the cleavage efficiency of the cleavage site B is high, and the cleavage efficiency of the cleavage site C is low, 3.5 to 4.0 M.
It has been found that a urea concentration of is desirable.
【０１０６】実施例４．Ｋｅｘ２−６６０によるβＧａ
ｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４からのｈＰＴＨ（１−
８４）の切り出し 実施例３において、βＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴＨ
（１−８４）およびｈＰＴＨ（１−４４）を同定し、こ
れらのペプチドの回収率から、Ｋｅｘ２−６６０による
βＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４の切断効率に尿
素が与える影響について検討した。しかし、ｈＰＴＨ
（４５−８４）由来のペプチドフラグメントの同定はで
きていなかった。そこで、ｈＰＴＨ（１−８４）をＫｅ
ｘ２−６６０処理したサンプルを、溶出条件を変えたＨ
ＰＬＣにて分離、解析してｈＰＴＨ（４５−８４）を同
定し、前述の条件による溶出では素通り画分に溶出して
いることを確認した。また、この結果から、切断部位Ｄ
はほとんど切断を受けないことが明らかになった。 Embodiment 4 FIG. ΒGa by Kex2-660
hPTH from 1-139S (FM) PPH84 (1-
84) In Example 3, βGal (1-14), hPTH
(1-84) and hPTH (1-44) were identified, and the effect of urea on the cleavage efficiency of βGal-139S (FM) PPH84 by Kex2-660 was examined based on the recovery of these peptides. However, hPTH
The peptide fragment derived from (45-84) could not be identified. Therefore, hPTH (1-84) is replaced with Ke.
x2-660 treated sample was treated with H
Separation and analysis were performed by PLC to identify hPTH (45-84), and it was confirmed that elution under the above-mentioned conditions eluted in the fraction without any change. Also, from this result, the cleavage site D
Turned out to be hardly amputated.
【０１０７】次に、キメラタンパク質に対して、 種々
の量比のＫｅｘ２−６６０（キメラタンパク質１ｍｇあ
たりＫｅｘ２−６６０を２５ｋＵ、５０ｋＵ、１００ｋ
Ｕ、１５０ｋＵおよび２００ｋＵ）を作用させ、３０分
後、各ペプチドフラグメントの回収率を調べた。生じる
ペプチドフラグメントの解析は、前述の結果からグラジ
エント条件を％Ｂ＝０％→８０％／８０分に変更し、そ
れ以外は実施例３と同様に行った。 １ｍｇ／ｍｌ βＧａｌ- １３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０） ４Ｍ 尿素 １ｍＭ ＣａＣｌ2 ２５〜２００ｋＵ／ｍｌ Ｋｅｘ２−６６０Next, various amounts of Kex2-660 (Kex2-660 per 25 mg, 50 kU, 100 k
U, 150 kU and 200 kU), and after 30 minutes, the recovery of each peptide fragment was examined. Analysis of the resulting peptide fragment was performed in the same manner as in Example 3 except that the gradient conditions were changed from% B = 0% to 80% / 80 minutes based on the above results. 1 mg / ml βGal-139S (FM) PPH84 100 mM Tris / HCl (pH 7.0) 4 M urea 1 mM CaCl 2 25 to 200 kU / ml Kex2-660
【０１０８】Ｋｅｘ２−６６０未処理および５０ｋＵの
Ｋｅｘ２−６６０で処理したサンプルのチャートを図１
９に示した。ピーク１、２、３、４、７は、それぞれ、
ｈＰＴＨ（４５−８４）（切断部位Ｃの次のアミノ酸か
らｈＰＴＨ１−８４のＣ−末端まで）、βＧａｌ（１−
１４）（β−Ｇａｌ−１３９ＳのＮ−末端から切断部位
Ａまで）、ｈＰＴＨ（１−８４）、ｈＰＴＨ（１−４
４）（切断部位Ｂの次のアミノ酸から切断部位Ｃまで）
およびβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４（キメラ
タンパク質の全長）である。FIG. 1 is a chart showing samples of Kex2-660 untreated and samples treated with 50 kU of Kex2-660.
The results are shown in FIG. Peaks 1, 2, 3, 4, and 7 are respectively
hPTH (45-84) (from the amino acid next to the cleavage site C to the C-terminus of hPTH1-84), βGal (1-
14) (from N-terminus of β-Gal-139S to cleavage site A), hPTH (1-84), hPTH (1-4)
4) (from amino acid next to cleavage site B to cleavage site C)
And βGal-139S (FM) PPH84 (full length of chimeric protein).
【０１０９】ピーク６、７は、Ｋｅｘ２−６６０量が少
ないときに多く、多いときは少なく、ピーク６、７の減
少に伴いピーク５が増加することから、ピーク５はキメ
ラタンパク質の切断部位Ａの次のアミノ酸から切断部位
Ｂまでのペプチドで、ピーク６はβＧａｌ−１３９のＮ
−末端から切断部位Ｂまでまたは切断部位Ａの次のアミ
ノ酸からｈＰＴＨ（１−８４）のＣ−末端までであると
思われる（ピーク６はβＧａｌ−１３９ＳのＮ−末端か
ら切断部位Ｃまでの可能性もあるが、Ａｒｇ−Ａｒｇの
方がＰｒｏ−Ａｒｇより切れやすいのでこの可能性は低
い）。Peaks 6 and 7 are large when the amount of Kex2-660 is small, small when the amount is large, and increased with decreasing peaks 6 and 7. Peak 5 is located at the cleavage site A of the chimeric protein. The peptide from the next amino acid to the cleavage site B, peak 6 is the N of βGal-139
From the end to the cleavage site B or from the amino acid next to the cleavage site A to the C-terminus of hPTH (1-84) (peak 6 is possible from the N-terminus of βGal-139S to the cleavage site C) Although Arg-Arg is easier to cut than Pro-Arg, this possibility is low).
【０１１０】また、２５〜２００ｋＵ／ｍｌの範囲でピ
ーク１、４、５、６、７の大きさは変化するが、ピーク
２、３の大きさはほとんど変わらない。また、２００ｋ
Ｕ／ｍｌのＫｅｘ２−６６０を用いた場合でも、新たな
ピークは生じなかった。すなわち、ｈＰＴＨ（１−８
４）を切り出すために必要なＫｅｘ−６６０量（２５ｋ
Ｕ／ｍｌ）の８倍量（２００ｋＵ／ｍｌ）を用いても、
Ｋｅｘ２プロテアーゼ以外のプロテアーゼ活性は検出さ
れず、実施例２で精製されたＫｅｘ２−６６０には、キ
メラタンパク質からｈＰＴＨ（１−８４）を切り出す条
件において、問題になる他のプロテアーゼは混入してい
ないことが確認された。The magnitude of peaks 1, 4, 5, 6, and 7 changes in the range of 25 to 200 kU / ml, but the magnitude of peaks 2 and 3 hardly changes. Also, 200k
Even when U / ml Kex2-660 was used, no new peak was generated. That is, hPTH (1-8
4) Kex-660 amount required to cut out (25 k
U / ml) (200 kU / ml),
No protease activity other than Kex2 protease was detected, and Kex2-660 purified in Example 2 did not contain any other proteases that would cause a problem under the conditions for cutting out hPTH (1-84) from the chimeric protein. Was confirmed.
【０１１１】２５〜２００ｋＵ／ｍｌの範囲におけるｈ
ＰＴＨ（１−８４）由来のペプチドフラグメントの回収
率を図２０にまとめた。５０ｋＵ／ｍｌのＫｅｘ２−６
６０を用いた場合、ｈＰＴＨ（１−８４）は約７５％回
収されることがわかった。このとき、約１０％のβＧａ
ｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４が残っていたが、Ｋｅ
ｘ２−６６０量を増加させるに従って減少し、２００ｋ
Ｕ／ｍｌではほぼ完全に消失した。しかし、同時にｈＰ
ＴＨ（１−４４）の割合も増加し、ｈＰＴＨ（１−８
４）の回収率は増加していない。Ｋｅｘ２−６６０量を
増やした場合も、ｈＰＴＨ（１−８４）の分解物ｈＰＴ
Ｈ（１−４４）とｈＰＴＨ（４５−８４）増加は緩やか
であり、２５〜２００ｋＵ／ｍｌの範囲でｈＰＴＨ（１
−８４）の回収率は６５〜７５％であった。H in the range of 25 to 200 kU / ml
FIG. 20 shows the recovery rates of the peptide fragments derived from PTH (1-84). 50 kU / ml Kex2-6
Using 60, it was found that about 75% of hPTH (1-84) was recovered. At this time, about 10% of βGa
1-139S (FM) PPH84 remained, but Ke
x2-660 Decrease with increasing amount, 200k
It disappeared almost completely at U / ml. However, at the same time hP
The ratio of TH (1-44) also increased and hPTH (1-8
The recovery rate in 4) has not increased. When the amount of Kex2-660 was increased, the degradation product of hPTH (1-84) hPT
H (1-44) and hPTH (45-84) increases slowly, and hPTH (1
-84) was 65 to 75%.
【０１１２】以上の結果から、Ｋｅｘ２−６６０は目的
ペプチドにＫｅｘ２プロテアーゼの切断部位を持つ場合
でも、キメラタンパク質から効率良く（切り出し効率７
５％）目的ペプチドを切り出すことができることが判明
した。なお、この切り出し効率は、ファクターＸａを用
いた場合のｈＰＴＨ（１−８４）の切り出し効率５０％
（Gardella et al. J. Biol. Chem., 265(26), 15854-1
5859, 1990）より高い。Gardella らは、ファクターＸ
ａの認識部位Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ配列がｈ
ＰＴＨ（１−８４）にないにも関わらず、酵素量を増加
させたり反応時間を長くしたりするとｈＰＴＨ（１−８
４）の回収率が下がることから、混入するプロテアーゼ
またはファクターＸａがｈＰＴＨ（１−８４）を分解し
ている可能性を示唆している。From the above results, it can be seen that Kex2-660 can be efficiently obtained from the chimeric protein even if the target peptide has a Kex2 protease cleavage site (exclusion efficiency: 7).
5%) It was found that the target peptide could be cut out. Note that the cutout efficiency is 50% for hPTH (1-84) when the factor Xa is used.
(Gardella et al. J. Biol. Chem., 265 (26), 15854-1
5859, 1990). Gardella et al., Factor X
The recognition site Ia-Glu-Gly-Arg sequence of a is h
Despite the absence of PTH (1-84), hPTH (1-8) increases when the amount of enzyme is increased or the reaction time is increased.
The decrease in the recovery rate in 4) suggests that the contaminating protease or factor Xa may degrade hPTH (1-84).
【０１１３】ｈＰＴＨ（１−８４）にはＫｅｘ２プロテ
アーゼの切断配列が２ヶ所存在するにも関わらず、高い
回収率でｈＰＴＨ（１−８４）が得られたという事実
は、本発明により生産量が増加し、精製されたＫｅｘ２
誘導体が、キメラタンパク質から目的ペプチドを切り出
すための酵素として有用であることを示している。ま
た、Ｋｅｘ２−６６０量を増やした場合もＫｅｘ２プロ
テアーゼ部位以外の切断により生じるペプチドフラグメ
ントは検出されず、実施例２で精製したＫｅｘ２の基質
特異性は高く、また、キメラタンパク質から目的ペプチ
ドを切り出す条件では他のプロテアーゼ活性は検出され
なかった。The fact that hPTH (1-84) was obtained at a high recovery rate despite the presence of two Kex2 protease cleavage sequences in hPTH (1-84) means that the production amount was reduced by the present invention. Increased and purified Kex2
This shows that the derivative is useful as an enzyme for cleaving a target peptide from a chimeric protein. Further, even when the amount of Kex2-660 was increased, peptide fragments generated by cleavage at sites other than the Kex2 protease site were not detected, and the substrate specificity of Kex2 purified in Example 2 was high. No other protease activity was detected.
【０１１４】実施例６．Ｋｅｘ２−６６０によるＣＡＴ
ＰＨ３４からｈＰＴＨ（１−３４）の切り出し キメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４よりｈＰＴＨ（１−３
４）を切り出すため、参考例２の溶出液より６０μｌを
採取しこれに脱イオン水２３９μｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2
を１．３２μｌ、およびＫｅｘ２−６６０ ３０ｋＵを
加え３７℃で１時間加温した。反応後に出現したピーク
についてアミノ酸分析を行ったところ、ｈＰＴＨ（１−
３４）のアミノ酸組成に一致した（図２１）。 Embodiment 6 FIG. CAT by Kex2-660
Cleavage of hPTH (1-34) from PH34 hPTH (1-3)
In order to cut out 4), 60 μl was collected from the eluate of Reference Example 2, and 239 μl of deionized water and 1 M CaCl 2 were added thereto.
Was added and 30 kU of Kex2-660 were added, and the mixture was heated at 37 ° C. for 1 hour. When amino acid analysis was performed on the peak that appeared after the reaction, hPTH (1-
34) (FIG. 21).
【０１１５】すなわち、反応溶液に尿素が存在しない状
態でも、他のプロテアーゼ活性が検出されず、Ｋｅｘ２
−６６０を用いてキメラタンパク質からｈＰＴＨ（１−
３４）が切り出せることが判明した。また、Ｋｅｘ２−
６６０はキメラタンパク質の保護ペプチドおよび切断部
位領域が異なっても目的ペプチドを切り出すことが可能
で、工業的に広く使用できることが期待される。That is, even when urea was not present in the reaction solution, no other protease activity was detected and Kex2
-660 was used to convert hPTH (1-
34) was found to be cut out. Also, Kex2-
660 can excise the target peptide even if the chimeric protein has a different protective peptide and cleavage site region, and is expected to be widely used industrially.
【０１１６】実施例７．キメラタンパク質βＧａｌ−１
１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４からのｈＰＴＨ（１−３４）の切
り出し 参考例３で調製したβＧａｌ−１１７Ｓ４ＨＰＰＨ３４
の封入体懸濁液（１６０ｇ／Ｌ）２５０ｍｌに、１Ｍ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．２）１００ｍｌ、５Ｍ Ｎ
ａＣｌ ５０ｍｌ、脱イオン水５００ｍｌ、尿素９００
ｇを加えて３０℃の恒温槽中３０分撹拌溶解し、暖めた
脱イオン水で希釈し、３０℃で５Ｌとした。 Embodiment 7 FIG. Chimeric protein βGal-1
Cleavage of hPTH (1-34) from 17S4HPPH34
Ri out βGal-117S4HPPH34 prepared in Reference Example 3
1M in 250 ml of the inclusion body suspension (160 g / L)
Tris / HCl (pH 8.2) 100 ml, 5M N
aCl 50ml, deionized water 500ml, urea 900
g was added and dissolved by stirring in a thermostat at 30 ° C. for 30 minutes, and diluted with warm deionized water to make 5 L at 30 ° C.
【０１１７】これに２５０ｍＭ ＣａＣｌ2 溶液５０ｍ
ｌを撹拌しながら穏やかに添加し、さらにＫｅｘ２−６
６０を２０ｋＵ／ｍｌとなるように加えた。２時間後、
９０％以上の効率で７ｇのｈＰＴＨ（１−３４）が切り
出された。用いたＫｅｘ２−６６０量は、キメラタンパ
ク質の１／２０，０００（重量比）以下であり、ｈＰＴ
Ｈ（１−３４）がキメラタンパク質から効率良く切り出
されることがわかった。To this, 50 mM of a 250 mM CaCl 2 solution was added.
gently while stirring, and further add Kex2-6.
60 was added to 20 kU / ml. Two hours later,
7 g of hPTH (1-34) was cut out with an efficiency of 90% or more. The amount of Kex2-660 used was 1/20000 (weight ratio) or less of the chimeric protein,
It was found that H (1-34) was efficiently cleaved from the chimeric protein.
【０１１８】実施例８．キャンディダ・ボイディニイを
宿主とした分泌型Ｋｅｘ２誘導体の発現 実施例１の結果から、Ｋｅｘ２−６６０は、培養液中で
顕著な自己分解を起こさないことがわかった。このた
め、より効率的な発現系を用いれば、生産量の増加が期
待できる。メタノール資化性酵母キャンディダ・ボイデ
ィニイを宿主とした発現系でＫｅｘ２−６６０の生産を
試みた。 Embodiment 8 FIG. Candida Boyidny
Expression of secreted Kex2 derivative as host From the results of Example 1, it was found that Kex2-660 did not cause significant autolysis in the culture solution. Therefore, if a more efficient expression system is used, an increase in production can be expected. Production of Kex2-660 was attempted in an expression system using methanol-assimilating yeast Candida voidinii as a host.
【０１１９】１）キャンディダ・ボイディニイを宿主と
した発現プラスミドの作製（図１１及び図２２） ＮＫＥＸ２−６６０遺伝子は、プライマーにＮＫＥＸ２
（配列番号４１）とＫＭ０８８を用いた以外は、実施例
１の１）と同様にＰＣＲ法を用いて作製した。ＮＫＥＸ
２は、５’末端に制限酵素Not I 部位の塩基配列（下線
部）を有し、ＫＥＸ２遺伝子の開始メチオニンの上流−
１０７〜−１３２塩基の配列を含む（図１１）。ＮＫＥ
Ｘ２−６６０遺伝子（ＫＥＸ２遺伝子の５’非翻訳領域
１３２塩基対を有するＫＥＸ２遺伝子）は、ｐＣＲIIに
クローニング後、制限酵素Not Iを用いて切り出した。
ＮＫＥＸ２−６６０遺伝子を含むNot I ＤＮＡフラグ
メントは、プラスミドｐＮＯＴｅｌＩのNot I 部位にプ
ロモーター支配下にＫＥＸ２−６６０遺伝子が発現でき
るように挿入し、ｐＣＵ６６０を作製した（図２２）。1) Preparation of Expression Plasmid Using Candida voidinii as Host (FIGS. 11 and 22) The NKEX2-660 gene has NKEX2 as a primer.
Except for using (SEQ ID NO: 41) and KM088, it was prepared using the PCR method in the same manner as 1) of Example 1). NKEX
No. 2 has a base sequence of a restriction enzyme Not I site (underlined) at the 5 'end, and is-upstream of the starting methionine of the KEX2 gene.
It contains a sequence of 107 to -132 bases (FIG. 11). NKE
The X2-660 gene (KEX2 gene having 132 base pairs of the 5 ′ untranslated region of the KEX2 gene) was cloned into pCRII and then cut out using the restriction enzyme NotI.
The NotI DNA fragment containing the NKEX2-660 gene was inserted into the NotI site of the plasmid pNOTElI so that the KEX2-660 gene could be expressed under the control of the promoter, thereby preparing pCU660 (FIG. 22).
【０１２０】２）キャンディダ・ボイディニイを宿主と
した分泌型Ｋｅｘ２誘導体の生産（図２３） ＵＲＡ３遺伝子上に存在する制限酵素Bam HIで切断し直
鎖上にしたプラスミドｐＣＵ６６０を、ＴＫ６２に導入
し、形質転換株ＴＫ６２／ｐＣＵ６６０を選択した。Ｔ
Ｋ６２［ｐＣＵ６６０］２０株（＃１〜＃２０）をＢＭ
ＧＹ培地で、２７℃で振とう培養した。２日後、前培養
液１０ＯＤ・ｍｌ相当を１ｍｌのＢＭＭＹ培地に接種
し、２７℃でさらに振とう培養した。３０時間後、培養
上清のＫｅｘ２活性を測定した。活性が高い５株につい
て同様に培養し、再現よくＫｅｘ２活性が高かったＴＫ
６２［ｐＣＵ６６０］＃１０株を選び、ファーメンター
を用いて培養した。2) Production of secreted Kex2 derivative using Candida voidinii as a host (FIG. 23) Plasmid pCU660, which had been linearized by cutting with a restriction enzyme BamHI present on the URA3 gene, was introduced into TK62, The transformant TK62 / pCU660 was selected. T
K20 [pCU660] 20 strains (# 1 to # 20)
Shaking culture was performed at 27 ° C. in GY medium. Two days later, 10 OD · ml of the preculture was inoculated into 1 ml of BMMY medium, and cultured at 27 ° C. with shaking. After 30 hours, the Kex2 activity of the culture supernatant was measured. 5 strains with high activity were cultured in the same manner, and TK with high reproducible Kex2 activity
62 [pCU660] # 10 strain was selected and cultured using a fermenter.
【０１２１】グリセロール凍結ストックＴＫ６２［ｐＣ
Ｕ６６０］＃１０株１ｍｌを２５ｍｌのＹＰＤ培地を含
む、３００ｍｌ容三角フラスコに接種、２７℃にて１６
時間前培養した。１０．５ｍｌの前培養液（ＯＤ６００
＝３８）を２ＬのＹＰＧＭ培養用培地に接種し、５Ｌ容
ファーメンター（ミツワ理化、KMJ-5B-4U-FP型）を用い
て、２７℃にて通気撹拌培養した。通気量は４Ｌ／分と
し、溶存酸素量は２．５ｐｐｍ以下にならないように撹
拌速度を変化させ制御した。メタノール、グリセロール
および窒素源（５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１０％（ｗ
／ｖ）ペプトン、６．７％（ｖ／ｖ）ＹＮＢ ｗ／ｏ
ＡＡ；１／２５容量／回）は、適宜補充した。Glycerol frozen stock TK62 [pC
U660] 1 ml of # 10 strain was inoculated into a 300 ml Erlenmeyer flask containing 25 ml of YPD medium, and incubated at 27 ° C. for 16 hours.
Incubated for hours. 10.5 ml of preculture (OD600
= 38) was inoculated into 2 L of YPGM culture medium, and cultured with aeration and stirring at 27 ° C. using a 5 L fermenter (Mitsuwa Rika, KMJ-5B-4U-FP type). The aeration rate was 4 L / min, and the stirring rate was changed and controlled so that the dissolved oxygen amount did not become 2.5 ppm or less. Methanol, glycerol and nitrogen source (5% (w / v) yeast extract, 10% (w
/ V) peptone, 6.7% (v / v) YNB w / o
AA; 1/25 volume / time) was supplemented as appropriate.
【０１２２】ｐＨは７．５％（ｖ／ｖ）アンモニア水を
添加し、ｐＨ５．５以下にならないように制御した。消
泡剤（ディスフォーム CC-222 、（株）日本油脂）を培
養開始時に０．５ｍｌ／Ｌ添加し、その後は必要に応じ
て添加した。図２３に各培養時間の培養上清のＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果を示した。培養４８時間後のＯＤ６００
は３５３で、この培養により培養上清１Ｌ当たり、約２
８００ＭＵのＫｅｘ２−６６０（約３４０ｍｇに相当）
が生産できた。この生産量は、実施例７において、ｈＰ
ＴＨ（１−３４）２００ｇを切り出すことが可能な量で
あり、本発明のＫｅｘ２誘導体が実際に工業スケールで
キメラタンパク質からの目的ペプチド切りだしに利用可
能であることを明らかにした。The pH was controlled by adding 7.5% (v / v) aqueous ammonia so that the pH did not fall below 5.5. An antifoaming agent (Disform CC-222, Nippon Oil & Fat Co., Ltd.) was added at the start of the culture at 0.5 ml / L, and thereafter, as needed. FIG. 23 shows the SDS- of the culture supernatant at each culture time.
The results of PAGE are shown. OD600 after 48 hours of culture
Is 353, and about 2 per liter of culture supernatant is obtained by this culture.
800 MU Kex2-660 (equivalent to about 340 mg)
Could be produced. This production amount was determined in Example 7 by hP
TH (1-34) was an amount capable of cutting out 200 g, and it was revealed that the Kex2 derivative of the present invention can actually be used for cutting out a target peptide from a chimeric protein on an industrial scale.
【０１２３】実施例９．サッカロマイセス・セルビジア
エを宿主とした分泌型Ｋｅｘ２誘導体の発現（２） 実施例１において、Ｃ−末端領域を欠失させたＫｅｘ２
プロテアーゼ（Ｋｅｘ２−６６０およびＫｅｘ２−６７
９）の生産量が、Ｋｅｘ２−６１４、Ｋｅｘ２−６９
９、およびに比べ、著しく増大していること示した。本
実施例においては、さらに多くのＣ−末端領域を欠失さ
せたＫｅｘ２プロテアーゼ（Ｋｅｘ２−６３０、Ｋｅｘ
２−６４０、Ｋｅｘ２−６５０、およびＫｅｘ２−６８
２）を作製し、Ｃ−末端領域とＫｅｘ２プロテアーゼの
生産量の関係について調べた。 Embodiment 9 FIG. Saccharomyces Servisia
(2) Expression of secretory Kex2 derivative using D as host (2)
Proteases (Kex2-660 and Kex2-67)
9) The production amount is Kex2-614, Kex2-69.
9, and significantly increased. In this example, Kex2 protease (Kex2-630, Kex2
2-640, Kex2-650, and Kex2-68
2) was prepared, and the relationship between the C-terminal region and the production amount of Kex2 protease was examined.
【０１２４】１）分泌型Ｋｅｘ２誘導体発現プラスミド
の作製 分泌型Ｋｅｘ２遺伝子は実施例１、１）の方法に準じて
作製した。即ち、プライマーの配列ＫＭ１００（配列番
号４２）、ＫＭ１０２（配列番号４３）、ＫＭ１０３
（配列番号４４）とＫＭ１０４（配列番号４５）は、そ
れぞれＮ末端から、６３０番目、６４０番目、６５０番
目、および６８２番目のアミノ酸の直後に翻訳停止コド
ンＴＡＡが付加した配列のアンチセンス鎖の塩基配列を
有し、５’末端に制限酵素Sal I 部位を持つ。1) Preparation of secretory Kex2 derivative expression plasmid The secretory Kex2 gene was prepared according to the method of Examples 1 and 1). That is, primer sequences KM100 (SEQ ID NO: 42), KM102 (SEQ ID NO: 43), KM103
(SEQ ID NO: 44) and KM104 (SEQ ID NO: 45) are the bases of the antisense strand of the sequence in which the translation stop codon TAA is added immediately after the 630th, 640th, 650th, and 682th amino acids from the N-terminus, respectively. It has a sequence and a restriction enzyme Sal I site at the 5 'end.
【０１２５】分泌型Ｋｅｘ２誘導体遺伝子をコードする
Eco RI-Sal I ＤＮＡフラグメントおよびこれらを含む
発現ベクターの作製は実施例１、１）の方法にしたがっ
た。なお、Ｋｅｘ２プロテアーゼのＮ末端から６３０番
目、６４０番目、６５０番目、または６８２番目までの
ポリペプチドをそれぞれＫｅｘ２−６３０、Ｋｅｘ２−
６４０、Ｋｅｘ２−６５０、Ｋｅｘ２−６８２と呼び、
これらをコードする遺伝子をそれぞれＫＥＸ２−６３
０、ＫＥＸ２−６４０、ＫＥＸ２−６５０、ＫＥＸ２−
６８２と呼ぶ。Encodes a secretory Kex2 derivative gene
Preparation of the Eco RI-Sal I DNA fragment and the expression vector containing the same was carried out according to the methods of Examples 1 and 1). In addition, the 630th, 640th, 650th, or 682nd polypeptides from the N-terminus of Kex2 protease were respectively expressed as Kex2-630 and Kex2-630.
640, Kex2-650, Kex2-682,
The genes encoding these were respectively named KEX2-63.
0, KEX2-640, KEX2-650, KEX2-
682.
【０１２６】２）形質転換および分泌型Ｋｅｘ２誘導体
の生産（図２５および２６参照） プラスミド（ｐＹＥ−６３０、ｐＹＥ−６４０、ｐＹＥ
−６５０、ｐＹＥ−６８２）を、Ｋ１６−５７Ｃ株へ導
入し、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６３０] 、Ｋ１６−５
７Ｃ[ ｐＹＥ−６４０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６
５０] とＫ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６８２] 株を得た。
次にこれらの形質転換株、さらに実施例１、２）で調製
した分泌型Ｋｅｘ２誘導体生産株についても培養し、Ｋ
ｅｘ２の生産量（培養液へ分泌されるＫｅｘ２量）を、
培養上清のＫｅｘ２活性測定および培養上清濃縮液のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。2) Transformation and production of secreted Kex2 derivative (see FIGS. 25 and 26) Plasmids (pYE-630, pYE-640, pYE
-650, pYE-682) was introduced into the K16-57C strain, and K16-57C [pYE-630] and K16-5 were introduced.
7C [pYE-640], K16-57C [pYE-6]
50] and K16-57C [pYE-682] strain.
Next, these transformants, and also the secretory Kex2 derivative-producing strain prepared in Examples 1 and 2) were cultured, and
ex2 production (the amount of Kex2 secreted into the culture solution)
Measurement of Kex2 activity of culture supernatant and S of culture supernatant concentrate
It was examined by DS-PAGE.
【０１２７】培養は、まず、コロニーをＹＣＤＰ培地に
懸濁後、３０℃で振とう培養し、対数増殖期の菌を調製
した。次にこの菌を、ＯＤ６６０の吸光度が約０．０２
になるようにＹＣＤＰ培地に継代し、さらに約１６時
間、３０℃で培養した。Ｋｅｘ２活性測定の結果を図２
５に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２６に示す。培養液
ＯＤ６６０あたりのＫｅｘ２活性は、Ｋ１６−５７Ｃ[
ｐＹＥ−６３０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６４０]
、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６５０] 、Ｋ１６−５７
Ｃ[ ｐＹＥ−６６０] 、およびＫ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ
−６７９]は、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６１４] のほ
ぼ１２倍で、ＫＥＸ２−６３０からＫＥＸ２−６７９の
範囲において、Ｋｅｘ２生産量に差がないことが分かっ
た。In the culture, first, colonies were suspended in a YCDP medium, and cultured with shaking at 30 ° C. to prepare bacteria in a logarithmic growth phase. Next, this bacterium was treated with an OD660 of about 0.02.
And then cultured at 30 ° C. for about 16 hours. FIG. 2 shows the results of Kex2 activity measurement.
FIG. 26 shows the results of SDS-PAGE in FIG. The Kex2 activity per culture OD660 was K16-57C [
pYE-630], K16-57C [pYE-640]
, K16-57C [pYE-650], K16-57
C [pYE-660], and K16-57C [pYE
-679] is almost 12 times that of K16-57C [pYE-614], and it was found that there is no difference in Kex2 production in the range of KEX2-630 to KEX2-679.
【０１２８】また、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６８２]
、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６８８] のＫｅｘ２の生
産量は、それぞれＫ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６１４] の
６倍、３．４倍で、Ｃ−末端領域が長くなるほど低下し
た（図２５）。Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−２２ｍ] とＫ
１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ−６９９] の培養上清にはＫｅｘ
２活性は検出されなかった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの
結果から、Ｋｅｘ２−６３０、Ｋｅｘ２−６４０、Ｋｅ
ｘ２−６５０、Ｋｅｘ２−６６０、Ｋｅｘ２−６７９、
Ｋｅｘ２−６８２、Ｋｅｘ２−６８８の生産量は、Ｋｅ
ｘ２活性と同様に、Ｋｅｘ２−６１４に比べ増加してい
ることも明らかになった（図２６）。In addition, K16-57C [pYE-682]
, K16-57C [pYE-688] produced 6 times and 3.4 times the Kex2 of K16-57C [pYE-614], respectively, and decreased as the C-terminal region became longer (FIG. 25). K16-57C [pYE-22m] and K
The culture supernatant of 16-57C [pYE-699] contains Kex
No activity was detected. Also, from the results of SDS-PAGE, Kex2-630, Kex2-640, Ke
x2-650, Kex2-660, Kex2-679,
The production amount of Kex2-682 and Kex2-688 is Ke
As in the case of x2 activity, it was also revealed that the activity was increased as compared with Kex2-614 (FIG. 26).
【０１２９】実施例１０. ピキア・パストリスを宿主と
した分泌型Ｋｅｘ２誘導体の発現 実施例８の結果から、分泌型Ｋｅｘ２誘導体Ｋｅｘ２−
６６０はキャンディダ・ボイディニイを宿主とした発現
系で大量に生産できることがわかった。Ｋｅｘ２−６６
０が他のメタノール資化性酵母でも生産可能なことを、
ピキア・パストリス（Pichia pastoris)を宿主とした発
現系（ピキアエクスプレッションキット（Pichia Expre
ssion Kit)；インビトロジェン社）を用いて調べた。 Example 10. Pichia pastoris as host
Expression of the secreted Kex2 derivative obtained From the results of Example 8, the secreted Kex2 derivative Kex2-
660 was found to be produced in large amounts by an expression system using Candida voidinii as a host. Kex2-66
That 0 can be produced by other methanol-assimilating yeasts,
Expression system using Pichia pastoris (Pichia Expression Kit)
ssion Kit) (Invitrogen).
【０１３０】１）ピキア・パストリスを宿主とした分泌
型Ｋｅｘ２誘導体発現プラスミドの作製（図１１および
図２７参照） 制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し直鎖上にしたプラスミドｐ
ＹＥ−６６０を鋳型に、ＫＭ０８５（配列番号３６）お
よびＫＭ０８８（配列番号３７）をプライマーに用い、
ＰＣＲ反応を行った。反応精製物はｐＣＲII（インビト
ロジェン社）にクローニングした。得られたプラスミド
を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ＫＥＸ２−６６０遺伝
子の両端に制限酵素ＥｃｏＲＩ部位を有するＤＮＡフラ
グメントを得た。プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２（ピキアエ
クスプレッションキット）の制限酵素ＥｃｏＲＩ部位
に、ＫＥＸ２−６６０遺伝子を含むＤＮＡフラグメント
を挿入し、ＫＥＸ２−６６０遺伝子がＡＯＸプロモータ
ーにより発現できる向きに挿入されたプラスミドｐＨＩ
Ｌ−６６０を得た（図２７）。1) Preparation of a secretory Kex2 derivative expression plasmid using Pichia pastoris as a host (see FIGS. 11 and 27) Plasmid p cut into a linear form by restriction with EcoRI
Using YE-660 as a template and KM085 (SEQ ID NO: 36) and KM088 (SEQ ID NO: 37) as primers,
A PCR reaction was performed. The reaction purified product was cloned into pCRII (Invitrogen). The resulting plasmid was cut with a restriction enzyme EcoRI to obtain a DNA fragment having a restriction enzyme EcoRI site at both ends of the KEX2-660 gene. A DNA fragment containing the KEX2-660 gene was inserted into the restriction enzyme EcoRI site of the plasmid pHIL-D2 (Pichia Expression Kit), and the plasmid pHI was inserted so that the KEX2-660 gene could be expressed by the AOX promoter.
L-660 was obtained (FIG. 27).
【０１３１】２）ピキア・パストリスを宿主とした分泌
型Ｋｅｘ２誘導体の生産 プラスミドｐＨＩＬ−６６０を制限酵素ＮｏｔＩで切断
して得られるＫＥＸ２−６６０遺伝子を含む断片を、ピ
キア・パストリスＧＳ１１５株（ｈｉｓ- ，ＡＯＸ+ ；
ピキアエクスプレッションキット）に導入し、ヒスチジ
ンを含まない培地で生育する形質転換株ＧＳ１１５〔ｐ
ＨＩＬ−６６０〕を選択した。これらの中から、メタノ
ールのみを炭素源とした場合に生育できないＧＳ１１５
〔ｐＨＩＬ−６６０〕（ＡＯＸ- ）５株を得た。これら
をＢＭＭＹ培地で培養し、Ｋｅｘ２生産量が多いＧＳ１
１５〔ｐＨＩＬ−６６０〕＃２３を得た。[0131] 2) a fragment containing the KEX2-660 gene obtained by Pichia pastoris was cut with production plasmid pHIL-660 with restriction enzyme NotI a secretory Kex2 derivative as a host, Pichia pastoris GS115 strain (his--, AOX + ;
Pichia Expression Kit) and grown in a histidine-free medium.
HIL-660] was selected. Among these, GS115 which cannot grow when only methanol is used as a carbon source.
[PHIL-660] (AOX -) to give a 5 strain. These were cultured in BMMY medium, and GS1 with high Kex2 production was
15 [pHIL-660] # 23 was obtained.
【０１３２】ＧＳ１１５〔ｐＨＩＬ−６６０〕＃２３の
Ｋｅｘ２の生産量を調べた。まず、コロニーを１０ｍｌ
のＢＭＧＹ培地に接種し、３０℃で２日間振とう培養し
た。培養液１０ｍｌから遠心して得た菌を２ｍｌのＢＭ
ＭＹ培地に懸濁し、２５℃でさらに２日間振とう培養
後、培養上清のＫｅｘ２活性を測定した。その結果、培
養上清１ｍｌ当たり約１３５０ＫＵ（約１６０μｇ相
当）のＫｅｘ２−６６０が生産していることがわかっ
た。従って、キャンディダ・ボイディニイ以外のメタノ
ール資化酵母ピキア・パストリスを宿主とした発現系で
もＫｅｘ２−６６０は大量に生産できることがわかっ
た。The amount of Kex2 produced by GS115 [pHIL-660] # 23 was examined. First, 10 ml colonies
Was inoculated into a BMGY medium and shake-cultured at 30 ° C. for 2 days. Bacteria obtained by centrifugation from 10 ml of culture solution were added to 2 ml of BM
The cells were suspended in MY medium and cultured with shaking at 25 ° C. for 2 days, and the Kex2 activity of the culture supernatant was measured. As a result, it was found that about 1350 KU (equivalent to about 160 μg) of Kex2-660 was produced per 1 ml of the culture supernatant. Therefore, it was found that Kex2-660 can be produced in large amounts even in an expression system using a methanol-assimilating yeast Pichia pastoris other than Candida boidinii as a host.
【０１３３】[0133]
配列番号：１ 配列の長さ：２８４８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：サッカロマイセス・セレビシエ 株名：Ｘ２１８０−ＩＢ 配列 TGCATAATTC TGTCATAAGC CTGTTCTTTT TCCTGGCTTA AACATCCCGT TTTGTAAAAG 60 AGAAATCTAT TCCACATATT TCATTCATTC GGCTACCATA CTAAGGATAA ACTAATCCCG 120 TTGTTTTTTG GCCTCGTCAC ATAATTATAA ACTACTAACC CATTATCAG ATG AAA GTG 178 Met Lys Val 1 AGG AAA TAT ATT ACT TTA TGC TTT TGG TGG GCC TTT TCA ACA TCC GCT 226 Arg Lys Tyr Ile Thr Leu Cys Phe Trp Trp Ala Phe Ser Thr Ser Ala 5 10 15 CTT GTA TCA TCA CAA CAA ATT CCA TTG AAG GAC CAT ACG TCA CGA CAG 274 Leu Val Ser Ser Gln Gln Ile Pro Leu Lys Asp His Thr Ser Arg Gln 20 25 30 35 TAT TTT GCT GTA GAA AGC AAT GAA ACA TTA TCC CGC TTG GAG GAA ATG 322 Tyr Phe Ala Val Glu Ser Asn Glu Thr Leu Ser Arg Leu Glu Glu Met 40 45 50 CAT CCA AAT TGG AAA TAT GAA CAT GAT GTT CGA GGG CTA CCA AAC CAT 370 His Pro Asn Trp Lys Tyr Glu His Asp Val Arg Gly Leu Pro Asn His 55 60 65 TAT GTT TTT TCA AAA GAG TTG CTA AAA TTG GGC AAA AGA TCA TCA TTA 418 Tyr Val Phe Ser Lys Glu Leu Leu Lys Leu Gly Lys Arg Ser Ser Leu 70 75 80 GAA GAG TTA CAG GGG GAT AAC AAC GAC CAC ATA TTA TCT GTC CAT GAT 466 Glu Glu Leu Gln Gly Asp Asn Asn Asp His Ile Leu Ser Val His Asp 85 90 95 TTA TTC CCG CGT AAC GAC CTA TTT AAG AGA CTA CCG GTG CCT GCT CCA 514 Leu Phe Pro Arg Asn Asp Leu Phe Lys Arg Leu Pro Val Pro Ala Pro 100 105 110 115 CCA ATG GAC TCA AGC TTG TTA CCG GTA AAA GAA GCT GAG GAT AAA CTC 562 Pro Met Asp Ser Ser Leu Leu Pro Val Lys Glu Ala Glu Asp Lys Leu 120 125 130 AGC ATA AAT GAT CCG CTT TTT GAG AGG CAG TGG CAC TTG GTC AAT CCA 610 Ser Ile Asn Asp Pro Leu Phe Glu Arg Gln Trp His Leu Val Asn Pro 135 140 145 AGT TTT CCT GGC AGT GAT ATA AAT GTT CTT GAT CTG TGG TAC AAT AAT 658 Ser Phe Pro Gly Ser Asp Ile Asn Val Leu Asp Leu Trp Tyr Asn Asn 150 155 160 ATT ACA GGC GCA GGG GTC GTG GCT GCC ATT GTT GAT GAT GGC CTT GAC 706 Ile Thr Gly Ala Gly Val Val Ala Ala Ile Val Asp Asp Gly Leu Asp 165 170 175 TAC GAA AAT GAA GAC TTG AAG GAT AAT TTT TGC GCT GAA GGT TCT TGG 754 Tyr Glu Asn Glu Asp Leu Lys Asp Asn Phe Cys Ala Glu Gly Ser Trp 180 185 190 195 GAT TTC AAC GAC AAT ACC AAT TTA CCT AAA CCA AGA TTA TCT GAT GAC 802 Asp Phe Asn Asp Asn Thr Asn Leu Pro Lys Pro Arg Leu Ser Asp Asp 200 205 210 TAC CAT GGT ACG AGA TGT GCA GGT GAA ATA GCT GCC AAA AAA GGT AAC 850 Tyr His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Ile Ala Ala Lys Lys Gly Asn 215 220 225 AAT TTT TGC GGT GTC GGG GTA GGT TAC AAC GCT AAA ATC TCA GGC ATA 898 Asn Phe Cys Gly Val Gly Val Gly Tyr Asn Ala Lys Ile Ser Gly Ile 230 235 240 AGA ATC TTA TCC GGT GAT ATC ACT ACG GAA GAT GAA GCT GCG TCC TTG 946 Arg Ile Leu Ser Gly Asp Ile Thr Thr Glu Asp Glu Ala Ala Ser Leu 245 250 255 ATT TAT GGT CTA GAC GTA AAC GAT ATA TAT TCA TGC TCA TGG GGT CCC 994 Ile Tyr Gly Leu Asp Val Asn Asp Ile Tyr Ser Cys Ser Trp Gly Pro 260 265 270 275 GCT GAT GAC GGA AGA CAT TTA CAA GGC CCT AGT GAC CTG GTG AAA AAG 1042 Ala Asp Asp Gly Arg His Leu Gln Gly Pro Ser Asp Leu Val Lys Lys 280 285 290 GCT TTA GTA AAA GGT GTT ACT GAG GGA AGA GAT TCC AAA GGA GCG ATT 1090 Ala Leu Val Lys Gly Val Thr Glu Gly Arg Asp Ser Lys Gly Ala Ile 295 300 305 TAC GTT TTT GCC AGT GGA AAT GGT GGA ACT CGT GGT GAT AAT TGC AAT 1138 Tyr Val Phe Ala Ser Gly Asn Gly Gly Thr Arg Gly Asp Asn Cys Asn 310 315 320 TAC GAC GGC TAT ACT AAT TCC ATA TAT TCT ATT ACT ATT GGG GCT ATT 1186 Tyr Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile Tyr Ser Ile Thr Ile Gly Ala Ile 325 330 335 GAT CAC AAA GAT CTA CAT CCT CCT TAT TCC GAA GGT TGT TCC GCC GTC 1234 Asp His Lys Asp Leu His Pro Pro Tyr Ser Glu Gly Cys Ser Ala Val 340 345 350 355 ATG GCA GTC ACG TAT TCT TCA GGT TCA GGC GAA TAT ATT CAT TCG AGT 1282 Met Ala Val Thr Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Glu Tyr Ile His Ser Ser 360 365 370 GAT ATC AAC GGC AGA TGC AGT AAT AGC CAC GGT GGA ACG TCT GCG GCT 1330 Asp Ile Asn Gly Arg Cys Ser Asn Ser His Gly Gly Thr Ser Ala Ala 375 380 385 GCT CCA TTA GCT GCC GGT GTT TAC ACT TTG TTA CTA GAA GCC AAC CCA 1378 Ala Pro Leu Ala Ala Gly Val Tyr Thr Leu Leu Leu Glu Ala Asn Pro 390 395 400 AAC CTA ACT TGG AGA GAC GTA CAG TAT TTA TCA ATC TTG TCT GCG GTA 1426 Asn Leu Thr Trp Arg Asp Val Gln Tyr Leu Ser Ile Leu Ser Ala Val 405 410 415 GGG TTA GAA AAG AAC GCT GAC GGA GAT TGG AGA GAT AGC GCC ATG GGG 1474 Gly Leu Glu Lys Asn Ala Asp Gly Asp Trp Arg Asp Ser Ala Met Gly 420 425 430 435 AAG AAA TAC TCT CAT CGC TAT GGC TTT GGT AAA ATC GAT GCC CAT AAG 1522 Lys Lys Tyr Ser His Arg Tyr Gly Phe Gly Lys Ile Asp Ala His Lys 440 445 450 TTA ATT GAA ATG TCC AAG ACC TGG GAG AAT GTT AAC GCA CAA ACC TGG 1570 Leu Ile Glu Met Ser Lys Thr Trp Glu Asn Val Asn Ala Gln Thr Trp 455 460 465 TTT TAC CTG CCA ACA TTG TAT GTT TCC CAG TCC ACA AAC TCC ACG GAA 1618 Phe Tyr Leu Pro Thr Leu Tyr Val Ser Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu 470 475 480 GAG ACA TTA GAA TCC GTC ATA ACC ATA TCA GAA AAA AGT CTT CAA GAT 1666 Glu Thr Leu Glu Ser Val Ile Thr Ile Ser Glu Lys Ser Leu Gln Asp 485 490 495 GCT AAC TTC AAG AGA ATT GAG CAC GTC ACG GTA ACT GTA GAT ATT GAT 1714 Ala Asn Phe Lys Arg Ile Glu His Val Thr Val Thr Val Asp Ile Asp 500 505 510 515 ACA GAA ATT AGG GGA ACT ACG ACT GTC GAT TTA ATA TCA CCA GCG GGG 1762 Thr Glu Ile Arg Gly Thr Thr Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Ala Gly 520 525 530 ATA ATT TCA AAC CTT GGC GTT GTA AGA CCA AGA GAT GTT TCA TCA GAG 1810 Ile Ile Ser Asn Leu Gly Val Val Arg Pro Arg Asp Val Ser Ser Glu 535 540 545 GGA TTC AAA GAC TGG ACA TTC ATG TCT GTA GCA CAT TGG GGT GAG AAC 1858 Gly Phe Lys Asp Trp Thr Phe Met Ser Val Ala His Trp Gly Glu Asn 550 555 560 GGC GTA GGT GAT TGG AAA ATC AAG GTT AAG ACA ACA GAA AAT GGA CAC 1906 Gly Val Gly Asp Trp Lys Ile Lys Val Lys Thr Thr Glu Asn Gly His 565 570 575 AGG ATT GAC TTC CAC AGT TGG AGG CTG AAG CTC TTT GGG GAA TCC ATT 1954 Arg Ile Asp Phe His Ser Trp Arg Leu Lys Leu Phe Gly Glu Ser Ile 580 585 590 595 GAT TCA TCT AAA ACA GAA ACT TTC GTC TTT GGA AAC GAT AAA GAG GAG 2002 Asp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Phe Val Phe Gly Asn Asp Lys Glu Glu 600 605 610 GTT GAA CCA GCT GCT ACA GAA AGT ACC GTA TCA CAA TAT TCT GCC AGT 2050 Val Glu Pro Ala Ala Thr Glu Ser Thr Val Ser Gln Tyr Ser Ala Ser 615 620 625 TCA ACT TCT ATT TCC ATC AGC GCT ACT TCT ACA TCT TCT ATC TCA ATT 2098 Ser Thr Ser Ile Ser Ile Ser Ala Thr Ser Thr Ser Ser Ile Ser Ile 630 635 640 GGT GTG GAA ACG TCG GCC ATT CCC CAA ACG ACT ACT GCG AGT ACC GAT 2146 Gly Val Glu Thr Ser Ala Ile Pro Gln Thr Thr Thr Ala Ser Thr Asp 645 650 655 CCT GAT TCT GAT CCA AAC ACT CCT AAA AAA CTT TCC TCT CCT AGG CAA 2194 Pro Asp Ser Asp Pro Asn Thr Pro Lys Lys Leu Ser Ser Pro Arg Gln 660 665 670 675 GCC ATG CAT TAT TTT TTA ACA ATA TTT TTG ATT GGC GCC ACA TTT TTG 2242 Ala Met His Tyr Phe Leu Thr Ile Phe Leu Ile Gly Ala Thr Phe Leu 680 685 690 GTG TTA TAC TTC ATG TTT TTT ATG AAA TCA AGG AGA AGG ATC AGA AGG 2290 Val Leu Tyr Phe Met Phe Phe Met Lys Ser Arg Arg Arg Ile Arg Arg 695 700 705 TCA AGA GCG GAA ACG TAT GAA TTC GAT ATC ATT GAT ACA GAC TCT GAG 2338 Ser Arg Ala Glu Thr Tyr Glu Phe Asp Ile Ile Asp Thr Asp Ser Glu 710 715 720 TAC GAT TCT ACT TTG GAC AAT GGA ACT TCC GGA ATT ACT GAG CCC GAA 2386 Tyr Asp Ser Thr Leu Asp Asn Gly Thr Ser Gly Ile Thr Glu Pro Glu 725 730 735 GAG GTT GAG GAC TTC GAT TTT GAT TTG TCC GAT GAA GAC CAT CTT GCA 2434 Glu Val Glu Asp Phe Asp Phe Asp Leu Ser Asp Glu Asp His Leu Ala 740 745 750 755 AGT TTG TCT TCA TCA GAA AAC GGT GAT GCT GAA CAT ACA ATT GAT AGT 2482 Ser Leu Ser Ser Ser Glu Asn Gly Asp Ala Glu His Thr Ile Asp Ser 760 765 770 GTA CTA ACA AAC GAA AAT CCA TTT AGT GAC CCT ATA AAG CAA AAG TTC 2530 Val Leu Thr Asn Glu Asn Pro Phe Ser Asp Pro Ile Lys Gln Lys Phe 775 780 785 CCA AAT GAC GCC AAC GCA GAA TCT GCT TCC AAT AAA TTA CAA GAA TTA 2578 Pro Asn Asp Ala Asn Ala Glu Ser Ala Ser Asn Lys Leu Gln Glu Leu 790 795 800 CAG CCT GAT GTT CCT CCA TCT TCC GGA CGA TCG 2611 Gln Pro Asp Val Pro Pro Ser Ser Gly Arg Ser 805 810 814 TGATTCGATA TGTACAGAAA GCTTCAAATT ACAAAATAGC ATTTTTTTCT TATAGATTAT 2671 AATACTCTCT CATACGTATA CGTATATGTG TATATGATAT ATAAACAAAC ATTAATATCC 2731 TATTCCTTCC GTTTGAAATC CCTATGATGT ACTTTGCATT GTTTGCACCC GCGAATAAAA 2791 TGAAAACTCC GAACCGATAT ATCAAGCACA TAAAAGGGGA GGGTCCAATT AATGCAT 2848 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 2848 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double strand Topology: linear Sequence type: cDNA Origin Organism name: Saccharomyces cerevisiae Strain name: X2180-IB Sequence TGCATAATTC TGTCATAAGC CTGTTCTTTT TCCTGGCTTA AACATCCCGT TTTGTAAAAG 60 AGAAATCTAT TCCACATATT TCATTCATTC GGCTACCATA CTAAGGATAA ACTAATCCCG 120 TTGTTTTTTG GCCTCGTCAC ATAATTATAA ACTACTAACC CATTATCAG ATG AAA GTG 178 Met Lys Val 1 AGG AAA TAT ATT ACT TTA TGC TTC TTG TCA TTC TTG TCA TTG TTC TGG TTT TGG TTT TGG TTC Ala Phe Ser Thr Ser Ala 5 10 15 CTT GTA TCA TCA CAA CAA ATT CCA TTG AAG GAC CAT ACG TCA CGA CAG 274 Leu Val Ser Ser Gln Gln Ile Pro Leu Lys Asp His Thr Ser Arg Gln 20 25 30 35 TAT TTT GCT GTA GAA AGC AAT GAA ACA TTA TCC CGC TTG GAG GAA ATG 322 Tyr Phe Ala Val Glu Ser Asn Glu Thr Leu Ser Arg Leu Glu Glu Met 40 45 50 CAT CCA AAT TGG AAA TAT GAA CAT GAT GTT CGA GGG CTA CCA AAC CAT 370 His Pro Asn Trp Lys Tyr Glu His Asp Val Arg Gly Leu Pro Asn His 55 60 65 TAT GTT TTT TCA AAA GAG TTG CTA AAA TTG GGC AAA AGA TCA TCA TTA 418 Tyr Val Phe Ser Lys Glu Leu Leu Lys Leu Gly Lys Arg Ser Ser Leu 70 75 80 GAA GAG TTA CAG GGG GAT AAC AAC GAC CAC ATA TTA TCT GTC CAT GAT 466 Glu Glu Leu Gln Gly Asp Asn Asn Asp His Ile Leu Ser Val His Asp 85 90 95 TTA TTC CCG CGT AAC GAC CTA TTT AAG AGA CTA CCG GTG CCT GCT CCA 514 Leu Phe Pro Arg Asn Asp Leu Phe Lys Arg Leu Pro Val Pro Ala Pro 100 105 110 115 CCA ATG GAC TCA AGC TTG TTA CCG GTA AAA GAA GCT GAG GAT AAA CTC 562 Pro Met Asp Ser Ser Leu Leu Pro Val Lys Glu Ala Glu Asp Lys Leu 120 125 130 AGC ATA AAT GAT CCG CTT TTT GAG AGG CAG TGG CAC TTG GTC AAT CCA 610 Ser Ile Asn Asp Pro Leu Phe Glu Arg Gln Trp His Leu Val Asn Pro 135 140 145 AGT TTT CCT GGC AGT GAT ATA AAT GTT CTT GAT CTG TGG TAC AAT AAT 658 Ser Phe Pro Gly Ser Asp Ile Asn Val Leu Asp Leu Trp Tyr Asn Asn 150 155 160 ATT ACA GGC GCA GGG GTC GTG GCT GCC ATT GTT GAT GAT GGC CTT GAC 706 Ile Thr Gly Ala Gly Val V al Ala Ala Ile Val Asp Asp Gly Leu Asp 165 170 175 TAC GAA AAT GAA GAC TTG AAG GAT AAT TTT TGC GCT GAA GGT TCT TGG 754 Tyr Glu Asn Glu Asp Leu Lys Asp Asn Phe Cys Ala Glu Gly Ser Trp 180 185 190 195 GAT TTC AAC GAC AAT ACC AAT TTA CCT AAA CCA AGA TTA TCT GAT GAC 802 Asp Phe Asn Asp Asn Thr Asn Leu Pro Lys Pro Arg Leu Ser Asp Asp 200 205 210 TAC CAT GGT ACG AGA TGT GCA GGT GAA ATA GCT GCC AAA AAA GGT AAC 850 Tyr His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Ile Ala Ala Lys Lys Gly Asn 215 220 225 AAT TTT TGC GGT GTC GGG GTA GGT TAC AAC GCT AAA ATC TCA GGC ATA 898 Asn Phe Cys Gly Val Gly Val Gly Tyr Asn Ala Lys Ile Ser Gly Ile 230 235 240 AGA ATC TTA TCC GGT GAT ATC ACT ACG GAA GAT GAA GCT GCG TCC TTG 946 Arg Ile Leu Ser Gly Asp Ile Thr Thr Glu Asp Glu Ala Ala Ser Leu 245 250 255 ATT TAT GGT CTA GAC GTA AAC GAT ATA TAT TCA TGC TCA TGG GGT CCC 994 Ile Tyr Gly Leu Asp Val Asn Asp Ile Tyr Ser Cys Ser Trp Gly Pro 260 265 270 270 275 GCT GAT GAC GGA AGA CAT TTA CAA GGC CCT AGT GAC CTG GTG AAA AAG 1042 Ala AspAsp Gly Arg His Leu Gln Gly Pro Ser Asp Leu Val Lys Lys 280 285 290 GCT TTA GTA AAA GGT GTT ACT GAG GGA AGA GAT TCC AAA GGA GCG ATT 1090 Ala Leu Val Lys Gly Val Thr Glu Gly Arg Asp Ser Lys Gly Ala Ile 295 300 305 TAC GTT TTT GCC AGT GGA AAT GGT GGA ACT CGT GGT GAT AAT TGC AAT 1138 Tyr Val Phe Ala Ser Gly Asn Gly Gly Thrly Arg Gly Asp Asn Cys Asn 310 315 320 TAC GAC GGC TAT ACT AAT TCC ATA TAT TCT ATT ACT ATT GGG GCT ATT 1186 Tyr Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile Tyr Ser Ile Thr Ile Gly Ala Ile 325 330 335 GAT CAC AAA GAT CTA CAT CCT CCT TAT TCC GAA GGT TGT TCC GCC GTC 1234 Asp His Lys Asp Leu His Pro Pro Tyr Ser Glu Gly Cys Ser Ala Val 340 345 350 355 ATG GCA GTC ACG TAT TCT TCA GGT TCA GGC GAA TAT ATT CAT TCG AGT 1282 Met Ala Val Thr Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Glu Tyr Ile His Ser Ser 360 365 370 GAT ATC AAC GGC AGA TGC AGT AAT AGC CAC GGT GGA ACG TCT GCG GCT 1330 Asp Ile Asn Gly Arg Cys Ser Asn Ser His Gly Gly Thr Ser Ala Ala 375 380 385 385 GCT CCA TTA GCT GCC GGT GTT TAC ACT TTG TTA CTA GAA GCC A AC CCA 1378 Ala Pro Leu Ala Ala Gly Val Tyr Thr Leu Leu Leu Glu Ala Asn Pro 390 395 400 AAC CTA ACT TGG AGA GAC GTA CAG TAT TTA TCA ATC TTG TCT GCG GTA 1426 Asn Leu Thr Trp Arg Asp Val Gln Tyr Leu Ser Ile Leu Ser Ala Val 405 410 415 GGG TTA GAA AAG AAC GCT GAC GGA GAT TGG AGA GAT AGC GCC ATG GGG 1474 Gly Leu Glu Lys Asn Ala Asp Gly Asp Trp Arg Asp Ser Ala Met Gly 420 425 430 435 435 AAG AAA TAC TCT CAT CGC TAT GGC TTT GGT AAA ATC GAT GCC CAT AAG 1522 Lys Lys Tyr Ser His Arg Tyr Gly Phe Gly Lys Ile Asp Ala His Lys 440 445 450 TTA ATT GAA ATG TCC AAG ACC TGG GAG AAT GTT AAC GCA CAA ACC TGG 1570 Leu Ile Glu Met Ser Lys Thr Trp Glu Asn Val Asn Ala Gln Thr Trp 455 460 465 TTT TAC CTG CCA ACA TTG TAT GTT TCC CAG TCC ACA AAC TCC ACG GAA 1618 Phe Tyr Leu Pro Thr Leu Tyr Val Ser Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu 470 475 480 GAG ACA TTA GAA TCC GTC ATA ACC ATA TCA GAA AAA AGT CTT CAA GAT 1666 Glu Thr Leu Glu Ser Val Ile Thr Ile Ser Glu Lys Ser Leu Gln Asp 485 490 495 GCT AAC TTC AAG AGA ATT GAG CAC GTC AC G GTA ACT GTA GAT ATT GAT 1714 Ala Asn Phe Lys Arg Ile Glu His Val Thr Val Thr Val Asp Ile Asp 500 505 510 510 515 ACA GAA ATT AGG GGA ACT ACG ACT GTC GAT TTA ATA TCA CCA GCG GGG 1762 Thr Glu Ile Arg Gly Thr Thr Thr Val Asp Leu Ile Ser Pro Ala Gly 520 525 530 530 ATA ATT TCA AAC CTT GGC GTT GTA AGA CCA AGA GAT GTT TCA TCA GAG 1810 Ile Ile Ser Asn Leu Gly Val Val Arg Pro Arg Asp Val Ser Ser Glu 535 540 545 GGA TTC AAA GAC TGG ACA TTC ATG TCT GTA GCA CAT TGG GGT GAG AAC 1858 Gly Phe Lys Asp Trp Thr Phe Met Ser Val Ala His Trp Gly Glu Asn 550 555 560 GGC GTA GGT GAT TGG AAA ATC AAG GTT AAG ACA ACA GAA AAT GGA CAC 1906 Gly Val Gly Asp Trp Lys Ile Lys Val Lys Thr Thr Glu Asn Gly His 565 570 575 AGG ATT GAC TTC CAC AGT TGG AGG CTG AAG CTC TTT GGG GAA TCC ATT 1954 Arg Ile Asp Phe His Ser Trp Arg Leu Lys Leu Phe Gly Glu Ser Ile 580 585 590 595 595 GAT TCA TCT AAA ACA GAA ACT TTC GTC TTT GGA AAC GAT AAA GAG GAG 2002 Asp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Phe Val Phe Gly Asn Asp Lys Glu Glu 600 605 610 GTT GAA CCA GC T GCT ACA GAA AGT ACC GTA TCA CAA TAT TCT GCC AGT 2050 Val Glu Pro Ala Ala Thr Glu Ser Thr Val Ser Gln Tyr Ser Ala Ser 615 620 625 TCA ACT TCT ATT TCC ATC AGC GCT ACT TCT ACA TCT TCT ATC TCA ATT 2098 Ser Thr Ser Ile Ser Ile Ser Ala Thr Ser Thr Ser Ser Ile Ser Ile 630 635 640 GGT GTG GAA ACG TCG GCC ATT CCC CAA ACG ACT ACT GCG AGT ACC GAT 2146 Gly Val Glu Thr Ser Ala Ile Pro Gln Thr Thr Thr Ala Ser Thr Asp 645 650 655 CCT GAT TCT GAT CCA AAC ACT CCT AAA AAA CTT TCC TCT CCT AGG CAA 2194 Pro Asp Ser Asp Pro Asn Thr Pro Lys Lys Leu Ser Ser Pro Arg Gln 660 665 670 675 675 GCC ATG CAT TAT TTT TTA ACA ATA TTT TTG ATT GGC GCC ACA TTT TTG 2242 Ala Met His Tyr Phe Leu Thr Ile Phe Leu Ile Gly Ala Thr Phe Leu 680 685 690 GTG TTA TAC TTC ATG TTT TTT ATG AAA TCA AGG AGA AGG ATC AGA AGG 2290 Val Leu Tyr Phe Met Phe Phe Met Lys Ser Arg Arg Arg Ile Arg Arg 695 700 705 TCA AGA GCG GAA ACG TAT GAA TTC GAT ATC ATT GAT ACA GAC TCT GAG 2338 Ser Arg Ala Glu Thr Tyr Glu Phe Asp Ile Ile Asp Thr Asp Ser Glu 710 715 720 TAC GAT TCT ACT TTG GAC AAT GGA ACT TCC GGA ATT ACT GAG CCC GAA 2386 Tyr Asp Ser Thr Leu Asp Asn Gly Thr Ser Gly Ile Thr Glu Pro Glu 725 730 735 GAG GTT GAG GAC TTC GAT TTT GAT TTG TCC GAT GAA GAC CAT CTT GCA 2434 Glu Val Glu Asp Phe Asp Phe Asp Leu Ser Asp Glu Asp His Leu Ala 740 745 750 755 AGT TTG TCT TCA TCA GAA AAC GGT GAT GCT GAA CAT ACA ATT GAT AGT 2482 Ser Leu Ser Ser Ser Glu Asn Gly Asp Ala Glu His Thr Ile Asp Ser 760 765 770 GTA CTA ACA AAC GAA AAT CCA TTT AGT GAC CCT ATA AAG CAA AAG TTC 2530 Val Leu Thr Asn Glu Asn Pro Phe Ser Asp Pro Ile Lys Gln Lys Phe 775 780 785 785 CCA AAT GAC GCC AAC GCA GAA TCT GCT TCC AAT AAA TTA CAA GAA TTA 2578 Pro Asn Asp Ala Asn Ala Glu Ser Ala Ser Asn Lys Leu Gln Glu Leu 790 795 800 CAG CCT GAT GTT CCT CCA TCT TCC GGA CGA TCG 2611 Gln Pro Asp Val Pro Pro Ser Ser Gly Arg Ser 805 810 814 TGATTCGATA TGTACAGAAA GCTTCAAATT ACAAAATAGC ATTTTTTTCT TATAGATTAT 2671 AATACTCTCT CATACGTATA CGTATATGTG TATATGATAT ATAAACAAAC ATTAATATCC 2731 TATTCCTTCC GTTTGAAA TC CCTATGATGT ACTTTGCATT GTTTGCACCC GCGAATAAAA 2791 TGAAAACTCC GAACCGATAT ATCAAGCACA TAAAAGGGGA GGGTCCAATT AATGCAT 2848
【０１３４】配列番号：２ 配列の長さ：１３９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro 20 25 30 Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser 35 40 45 Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro 50 55 60 Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Glu Ser Asp Leu Pro Glu 65 70 75 80 Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp 85 90 95 Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro 100 105 110 Phe Val Pro Thr Glu Asn Pro Thr Gly Ser Tyr Ser Leu Thr Phe Asn 115 120 125 Val Asp Glu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Gln Thr 130 135 SEQ ID NO: 2 Sequence length: 139 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide sequence Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro Pro 20 25 30 Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Glu Glu Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser 35 40 45 Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro 50 55 60 Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Glu Ser Asp Leu Pro Glu 65 70 75 80 Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr Asp 85 90 95 Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro 100 105 110 Phe Val Pro Thr Glu Asn Pro Thr Gly Ser Tyr Ser Leu Thr Phe Asn 115 120 125 Val Asp Glu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Gln Thr 130 135
【０１３５】配列番号：３ 配列の長さ：８４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Ser Gln 84 SEQ ID NO: 3 Sequence length: 84 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide sequence Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser 35 40 45 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Ser Gln 84
【０１３６】配列番号：４ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Gly Ser Ser Arg Val Ile Leu Gln Ala Cys Leu Ile Asn 1 5 10 14 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 14 Sequence type: amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide sequence Gly Gly Ser Ser Arg Val Ile Leu Gln Ala Cys Leu Ile Asn 1 5 10 14
【０１３７】配列番号：５ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCATGAA ATCTGTTAAA AAGCGTTCTG TTTCTGAAAT 40SEQ ID NO: 5 Sequence length: 40 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence AATTCATGAA ATCTGTTAAA AAGCGTTCTG TTTCTGAAAT 40
【０１３８】配列番号：６ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCAGCTGATG CATAACCTGG GCAAACACCT GAATAGCATG G 41SEQ ID NO: 6 Sequence length: 41 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TCAGCTGATG CATAACCTGG GCAAACACCT GAATAGCATG G 41
【０１３９】配列番号：７ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AACGCGTCGA GTGGCTGCGT AAGAAACTGC AGGACGTCCA C 41SEQ ID NO: 7 Sequence length: 41 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence AACGCGTCGA GTGGCTGCGT AAGAAACTGC AGGACGTCCA C 41
【０１４０】配列番号：８ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AACTTCGTTG CGCTGGGTGC ACCGCTGGCT CCACGTGATG C 41SEQ ID NO: 8 Sequence length: 41 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence AACTTCGTTG CGCTGGGTGC ACCGCTGGCT CCACGTGATG C 41
【０１４１】配列番号：９ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGGATCCCAA CGTCCGCGTA AGAAAGAAGA TAACGTACT 39SEQ ID NO: 9 Sequence length: 39 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence AGGATCCCAA CGTCCGCGTA AGAAAGAAGA TAACGTACT 39
【０１４２】配列番号：１０ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGTTGAATCT CATGAGAAAT CCCTGGGCGA AGCTGACAAA 40SEQ ID NO: 10 Sequence length: 40 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence GGTTGAATCT CATGAGAAAT CCCTGGGCGA AGCTGACAAA 40
【０１４３】配列番号：１１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCGATGTTA ACGTGCTGAC CAAAGCGAAA AGCCAGTAAG 40SEQ ID NO: 11 Sequence length: 40 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence GCCGATGTTA ACGTGCTGAC CAAAGCGAAA AGCCAGTAAG 40
【０１４４】配列番号：１２ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGACTTACT GGCTTTTCGC TTTGGTCAGC ACG 33SEQ ID NO: 12 Sequence length: 33 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TCGACTTACT GGCTTTTCGC TTTGGTCAGC ACG 33
【０１４５】配列番号：１３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTAACATCGG CTTTGTCAGC TTCGCCCAGG GATTTCTCAT 40SEQ ID NO: 13 Sequence length: 40 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TTAACATCGG CTTTGTCAGC TTCGCCCAGG GATTTCTCAT 40
【０１４６】配列番号：１４ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAGATTCAAC CAGTACGTTA TCTTCTTTCT TACGCGGACG 40SEQ ID NO: 14 Sequence length: 40 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence GAGATTCAAC CAGTACGTTA TCTTCTTTCT TACGCGGACG 40
【０１４７】配列番号：１５ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTGGGATCCT GCATCACGTG GAGCCAGCGG TGCACCCAGC G 41SEQ ID NO: 15 Sequence length: 41 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TTGGGATCCT GCATCACGTG GAGCCAGCGG TGCACCCAGC G 41
【０１４８】配列番号：１６ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CAACGAAGTT GTGGACGTCC TGCAGTTTCT TACGCAGCCA C 41SEQ ID NO: 16 Sequence length: 41 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence CAACGAAGTT GTGGACGTCC TGCAGTTTCT TACGCAGCCA C 41
【０１４９】配列番号：１７ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGACGCGTT CCATGCTATT CAGGTGTTTG CCCAGGTTAT G 41SEQ ID NO: 17 Sequence length: 41 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TCGACGCGTT CCATGCTATT CAGGTGTTTG CCCAGGTTAT G 41
【０１５０】配列番号：１８ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CATCAGCTGA ATTTCAGAAA CAGAACGCTT TTTAACAGAT TTCATG 46SEQ ID NO: 18 Sequence length: 46 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence CATCAGCTGA ATTTCAGAAA CAGAACGCTT TTTAACAGAT TTCATG 46
【０１５１】配列番号：１９ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGAGGTCGA CGGTACCGAG CTCG 24SEQ ID NO: 19 Sequence length: 24 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TCGAGGTCGA CGGTACCGAG CTCG 24
【０１５２】配列番号：２０ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCGTGCT CGGTACCGTC GACC 24SEQ ID NO: 20 Sequence length: 24 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence AATTCGTGCT CGGTACCGTC GACC 24
【０１５３】配列番号：２１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCGAGCT CGGTACCGTC GACC 24SEQ ID NO: 21 Sequence length: 24 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence AATTCGAGCT CGGTACCGTC GACC 24
【０１５４】配列番号：２２ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGAGGTCGA CGGTACCGAG CTCG 24SEQ ID NO: 22 Sequence length: 24 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TCGAGGTCGA CGGTACCGAG CTCG 24
【０１５５】配列番号：２３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGAGAAAGA AGAAGGCGTA AGCTTGGAAA AACGAT 36SEQ ID NO: 23 Sequence length: 36 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TCGAGAAAGA AGAAGGCGTA AGCTTGGAAA AACGAT 36
【０１５６】配列番号：２４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CGTTTTTCCA AGCTTACGCC TTCTTCTTTC 30SEQ ID NO: 24 Sequence length: 30 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence CGTTTTTCCA AGCTTACGCC TTCTTCTTTC 30
【０１５７】配列番号：２５ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GTTAAAAAGC GATCGGTTTC TGAAATTCAG CTG 33SEQ ID NO: 25 Sequence length: 33 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence GTTAAAAAGC GATCGGTTTC TGAAATTCAG CTG 33
【０１５８】配列番号：２６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCACCGGTAC CTTAGAAGTT GTGGACGTCC TGCA 34SEQ ID NO: 26 Sequence length: 34 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence GCACCGGTAC CTTAGAAGTT GTGGACGTCC TGCA 34
【０１５９】配列番号：２７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCTAAGGAAG AATTCATGGA GAAAAAAATC 30SEQ ID NO: 27 Sequence length: 30 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence GCTAAGGAAG AATTCATGGA GAAAAAAATC 30
【０１６０】配列番号：２８ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTGCCTTAAA ACTCGAGCGC CCCG 24SEQ ID NO: 28 Sequence length: 24 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence CTGCCTTAAA ACTCGAGCGC CCCG 24
【０１６１】配列番号：２９ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AAACTGCAGG ACGTCCACAA CTTCTAAGCG CTGGGTGCAC CGCGT 45SEQ ID NO: 29 Sequence length: 45 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence AAACTGCAGG ACGTCCACAA CTTCTAAGCG CTGGGTGCAC CGCGT 45
【０１６２】配列番号：３０ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CATTAAAGCT TTGCGATGAT AAGC 24SEQ ID NO: 30 Sequence length: 24 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence CATTAAAGCT TTGCGATGAT AAGC 24
【０１６３】配列番号：３１ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CGCACCGATC GCCCTTCCCA ACAGTT 26SEQ ID NO: 31 Sequence length: 26 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence CGCACCGATC GCCCTTCCCA ACAGTT 26
【０１６４】配列番号：３２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTTCCCGGGC CTCCGTGGGA ACAAACGGCG GATTG 35SEQ ID NO: 32 Sequence length: 35 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TTTCCCGGGC CTCCGTGGGA ACAAACGGCG GATTG 35
【０１６５】配列番号：３３ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTTCCCGGGA GGCCTTCTGT TAAAAAGCGG TCTGTTTCTG AA 42SEQ ID NO: 33 Sequence length: 42 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TTTCCCGGGA GGCCTTCTGT TAAAAAGCGG TCTGTTTCTG AA 42
【０１６６】配列番号：３４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CACCATCATC ACCCTGGA 18SEQ ID NO: 34 Sequence length: 18 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence CACCATCATC ACCCTGGA 18
【０１６７】配列番号：３５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCCAGGGTGA TGATGGTG 18SEQ ID NO: 35 Sequence length: 18 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TCCAGGGTGA TGATGGTG 18
【０１６８】配列番号：３６ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAAGAATTCA TGAAAGTGAG GAAATATATT ACTTTAT 37SEQ ID NO: 36 Sequence length: 37 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TAAGAATTCA TGAAAGTGAG GAAATATATT ACTTTAT 37
【０１６９】配列番号：３７ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAAGTCGACT TAAGGATCGG TACTCGCAGT AGTCG 35SEQ ID NO: 37 Sequence length: 35 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TAAGTCGACT TAAGGATCGG TACTCGCAGT AGTCG 35
【０１７０】配列番号：３８ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAAGTCGACT TAATAATGCA TGGCTTGCCT AGGAG 35SEQ ID NO: 38 Sequence length: 35 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TAAGTCGACT TAATAATGCA TGGCTTGCCT AGGAG 35
【０１７１】配列番号：３９ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAAGTCGACT TAGGCGCCAA TCAAAAATAT TGTTAAAAA 39SEQ ID NO: 39 Sequence length: 39 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TAAGTCGACT TAGGCGCCAA TCAAAAATAT TGTTAAAAA 39
【０１７２】配列番号：４０ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAAGTCGACT TACATAAAAA ACATGAAGTA TAACACCAA 39SEQ ID NO: 40 Sequence length: 39 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence TAAGTCGACT TACATAAAAA ACATGAAGTA TAACACCAA 39
【０１７３】配列番号：４１ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCGGCCGCTT AAACATCCCG TTTTGTAAAA AGAGA 35SEQ ID NO: 41 Sequence length: 35 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence GCGGCCGCTT AAACATCCCG TTTTGTAAAA AGAGA 35
【０１７４】配列番号：４２ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGGGTCGACT TAAGAAGTTG AACTGGCAGA A 31SEQ ID NO: 42 Sequence length: 31 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence GGGGTCGACT TAAGAAGTTG AACTGGCAGA A 31
【０１７５】配列番号：４３ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGGGTCGACT TAAGAAGATG TAGAAGTAGC G 31SEQ ID NO: 43 Sequence length: 31 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence GGGGTCGACT TAAGAAGATG TAGAAGTAGC G 31
【０１７６】配列番号：４４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGGGTCGACT TAAATGGCCG ACGTTTCCAC 30SEQ ID NO: 44 Sequence length: 30 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence GGGGTCGACT TAAATGGCCG ACGTTTCCAC 30
【０１７７】配列番号：４５ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGGGTCGACT TATGTTAAAA AATAATGCAT GGC 33SEQ ID NO: 45 Sequence length: 33 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: synthetic DNA sequence GGGGTCGACT TATGTTAAAA AATAATGCAT GGC 33
【図１】図１は、合成ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝
子作製に用いた合成オリゴマーの配列を示す図である。FIG. 1 is a view showing the sequence of a synthetic oligomer used for production of a synthetic hProPTH (1-84) gene.
【図２】図２は、合成ｈＰｒｏＰＴＨ（１−８４）遺伝
子の作製方法を示す図である。FIG. 2 is a diagram illustrating a method for producing a synthetic hProPTH (1-84) gene.
【図３】図３は、プラスミドｐＧ２１０Ｓ（Ｓ／Ｘ）の
作製方法を示す図である。Ｐｌａｃは大腸菌のラクトー
スオペロンのプロモーターをＴｔｒｐは、大腸菌のＴｒ
ｐＥのアテニュエーターターミネーターを示す。FIG. 3 is a diagram showing a method for producing plasmid pG210S (S / X). Plac is the promoter of the lactose operon of E. coli, and Ttrp is the Tr of E. coli.
The attenuator terminator of pE is shown.
【図４】図４は、キメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ
（ＦＭ）ＰＰＨ８４を発現するプラスミドｐＧＰ＃１９
の作製方法を示す図である。FIG. 4 shows the chimeric protein βGal-139S.
(FM) Plasmid pGP # 19 expressing PPH84
It is a figure which shows the manufacturing method of.
【図５】図５は、プラスミドｐＰＴＨ（１−３４）ｐｒ
ｏαの作製方法を示す図である。FIG. 5 shows the plasmid pPTH (1-34) pr
It is a figure which shows the manufacturing method of o (alpha).
【図６】図６は、キメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４を発
現するプラスミドｐｔａｃＣＡＴＰＴＨ（１−３４）の
作製方法を示す図である。Ｐｔａｃは、ｔｒｐプロモー
ターの−３５領域とＰｌａｃの−１０領域の合成プロモ
ーターを示す。FIG. 6 is a diagram showing a method for preparing a plasmid ptacCATPTH (1-34) expressing the chimeric protein CATPH34. Ptac indicates a synthetic promoter of the −35 region of the trp promoter and the −10 region of Plac.
【図７】図７は、大腸菌で発現させたキメラタンパク質
ＣＡＴＰＨ３４の精製前後の試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥの
写真を示した図であり、電気泳動図を示す図面代用写真
である。FIG. 7 shows SDS-PAGE photographs of a sample before and after purification of chimeric protein CATPH34 expressed in Escherichia coli, which is a drawing substitute photograph showing an electropherogram.
【図８】図８は、キメラタンパク質βＧａｌ−１３９Ｓ
ＰＰＨ３４を発現するプラスミドｐＧＰ＃１９ＰＰＨ３
４の作製方法を示した図である。FIG. 8 shows the chimeric protein βGal-139S.
Plasmid pGP # 19PPH3 expressing PPH34
FIG. 4 is a view showing a manufacturing method of No. 4;
【図９】図９は、キメラタンパク質βＧａｌ−１１７Ｓ
４ＨＰＰＨ３４を発現するプラスミドｐＧ１１７Ｓ４Ｈ
ＰＰＨ３４の作製方法の前半部分を示した図である。FIG. 9 shows the chimeric protein βGal-117S.
Plasmid pG117S4H expressing 4HPPH34
It is the figure which showed the first half of the manufacturing method of PPH34.
【図１０】図１０は、キメラタンパク質βＧａｌ−１１
７Ｓ４ＨＰＰＨ３４を発現するプラスミドｐＧ１１７Ｓ
４ＨＰＰＨ３４の作製方法の後半部分を示した図であ
る。FIG. 10 shows the chimeric protein βGal-11.
Plasmid pG117S expressing 7S4HPPH34
It is the figure which showed the latter half part of the manufacturing method of 4HPPH34.
【図１１】図１１は、ＫＥＸ２遺伝子の構成と分泌型Ｋ
ｅｘ２誘導体の遺伝子を作製するために合成したプライ
マーの配列およびそれぞれのアニーリング部位を示す図
である。FIG. 11 shows the composition of KEX2 gene and secreted K
FIG. 3 is a diagram showing the sequences of primers synthesized to prepare ex2 derivative genes and their respective annealing sites.
【図１２】図１２は、分泌型Ｋｅｘ２誘導体を発現する
プラスミドｐＹＥ−６６０の作製方法を示す図である。
P ＫＥＸ２は、サッカロマイセス・セレビジアエのＫＥ
Ｘ２遺伝子のプロモーターを示す。FIG. 12 is a diagram showing a method for preparing a plasmid pYE-660 expressing a secretory Kex2 derivative.
P KEX2 is KE of Saccharomyces cerevisiae
The X2 gene promoter is shown.
【図１３】図１３は、Ｋｅｘ２−６１４を発現するプラ
スミドｐＹＥ−６１４の作製方法を示す図である。FIG. 13 is a diagram showing a method for preparing a plasmid pYE-614 that expresses Kex2-614.
【図１４】図１４は、分泌型Ｋｅｘ２誘導体のＯＤ６６
０あたりのＫｅｘ２活性を合成基質を用いて比較した図
である。Ｋ１６−５７Ｃ［ｐＹＥ−６１４］の活性を１
として各分泌型Ｋｅｘ２誘導体生産株の培養液の相対活
性を示している。FIG. 14 shows OD66 of a secreted Kex2 derivative.
FIG. 2 is a diagram comparing Kex2 activity per 0 using a synthetic substrate. The activity of K16-57C [pYE-614] was 1
Indicates the relative activity of the culture solution of each secretory Kex2 derivative-producing strain.
【図１５】図１５は、分泌型Ｋｅｘ２誘導体の培養上清
２００μｌあたりの生産量を比較した図であり、電気泳
動図を表わす図面に代る写真である。FIG. 15 is a view comparing the production amounts of secretory Kex2 derivatives per 200 μl of culture supernatant, and is a photograph instead of a drawing showing an electrophoretogram.
【図１６】図１６は、Ｋｅｘ２−６６０の各尿素濃度で
の活性を合成基質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍ
ＣＡを基質に用いて検討した図である。尿素非存在下に
おけるＫｅｘ２−６６０の活性を１００％として各尿素
濃度における相対活性を示している。FIG. 16 shows the activity of Kex2-660 at each urea concentration, as measured by the synthetic substrate Boc-Leu-Arg-Arg-M.
FIG. 3 is a diagram in which CA was used as a substrate and examined. The relative activity at each urea concentration is shown with the activity of Kex2-660 in the absence of urea as 100%.
【図１７】図１７は、Ｋｅｘ２−６６０の各尿素濃度
（１．５〜３．０Ｍ）におけるβＧａｌ−１３９Ｓ（Ｆ
Ｍ）ＰＰＨ８４からのβＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴＨ
（１−８４）、ｈＰＴＨ（１−４４）および［ｈＰＴＨ
（１−８４）＋ｈＰＴＨ（１−１４）］の回収率の比較
を示した図である。FIG. 17 shows βGal-139S (F) at various urea concentrations (1.5 to 3.0 M) of Kex2-660.
M) βGal (1-14) from PPH84, hPTH
(1-84), hPTH (1-44) and [hPTH
It is the figure which showed the comparison of the recovery of (1-84) + hPTH (1-14)].
【図１８】図１８は、Ｋｅｘ２−６６０の各尿素濃度
（３．０〜４．０Ｍ）におけるβＧａｌ−１３９Ｓ（Ｆ
Ｍ）ＰＰＨ８４からのβＧａｌ（１−１４）、ｈＰＴＨ
（１−８４）、ｈＰＴＨ（１−４４）および［ｈＰＴＨ
（１−８４）＋ｈＰＴＨ（１−４４）］の回収率の比較
を示した図である。FIG. 18 shows βGal-139S (F) at various urea concentrations (3.0 to 4.0 M) of Kex2-660.
M) βGal (1-14) from PPH84, hPTH
(1-84), hPTH (1-44) and [hPTH
It is the figure which showed the comparison of the recovery of (1-84) + hPTH (1-44)].
【図１９】図１９は、キメラタンパク質βＧａｌ−１３
９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４のＫｅｘ２−６６０処理前と処
理後のＨＰＬＣチャートおよび同定したペプチドフラグ
メントとβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４の関係
を模式的に示した図である。チャートのピーク番号と図
中のフラグメントの番号とは一致している。なお、フラ
グメント１、２、３および４はアミノ酸配列決定により
同定した。７は溶出時間からの推定、５はβＧａｌ（１
−１４）およびｈＰＴＨ（１−８４）の相関からの推定
である。また、６については溶出される可能性のあるフ
ラグメントを図中で６として表記した。FIG. 19 shows the chimeric protein βGal-13.
It is the figure which showed typically the HPLC chart before and after Kex2-660 processing of 9S (FM) PPH84, and the relationship between the identified peptide fragment and (beta) Gal-139S (FM) PPH84. The peak number in the chart matches the fragment number in the figure. The fragments 1, 2, 3, and 4 were identified by amino acid sequencing. 7 is estimated from the elution time, 5 is βGal (1
−14) and hPTH (1-84). In the case of 6, a fragment that may be eluted is indicated as 6 in the figure.
【図２０】図２０は、Ｋｅｘ２−６６０の各酵素濃度に
おけるβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４からのｈ
ＰＴＨ（１−８４）、ｈＰＴＨ（１−４４）およびｈＰ
ＴＨ（４５−８４）の回収率の比較を示した図である。
■、○、●、および▲は、それぞれ、βＧａｌ−１３９
Ｓ（ＦＭ）ＰＰＨ８４、ｈＰＴＨ（１−８４）、ｈＰＴ
Ｈ（１−４４）およびｈＰＴＨ（４５−８４）の回収率
を示す。回収率の算出は、以下のようにして決定した。
ｈＰＴＨ（１−８４）とβＧａｌ−１３９Ｓ（ＦＭ）Ｐ
ＰＨ８４とに関しては濃度既知の標準品とのピーク面積
比から、またｈＰＴＨ（１−４４）とｈＰＴＨ（４５−
８４）に関しては濃度既知のｈＰＴＨ（１−８４）のピ
ーク面積比をそれぞれのアミノ酸残基数で補正して求め
た。FIG. 20 shows h from βGal-139S (FM) PPH84 at each enzyme concentration of Kex2-660.
PTH (1-84), hPTH (1-44) and hP
It is the figure which showed the comparison of the recovery of TH (45-84).
■, ○, ●, and ▲ are βGal-139, respectively.
S (FM) PPH84, hPTH (1-84), hPT
The recovery of H (1-44) and hPTH (45-84) is shown. The calculation of the recovery rate was determined as follows.
hPTH (1-84) and βGal-139S (FM) P
Regarding PH84, the ratio of hPTH (1-44) and hPTH (45-
84) was determined by correcting the peak area ratio of hPTH (1-84) having a known concentration by the number of amino acid residues.
【図２１】図２１は、キメラタンパク質ＣＡＴＰＨ３４
のＫｅｘ２−６６０処理前と処理後のＨＰＬＣチャート
示した図である。FIG. 21 shows the chimeric protein CATPH34.
It is the figure which showed the HPLC chart before and after processing of Kex2-660.
【図２２】図２２は、Ｋｅｘ２−６６０発現プラスミド
ｐＣＵ６６０の作製方法を示す図である。FIG. 22 is a diagram showing a method for preparing a Kex2-660 expression plasmid pCU660.
【図２３】図２３は、ＴＫ６２／ｐＣＵ６６０＃１０株
の各培養時間におけるＫｅｘ２−６６０の培養上清への
分泌の様子を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥであり電気泳動図を
示す図面に代る写真である。FIG. 23 is a SDS-PAGE showing the state of secretion of Kex2-660 into the culture supernatant at each culture time of the TK62 / pCU660 # 10 strain, and is a photograph instead of a drawing showing an electrophoretogram. .
【図２４】図２４は、プラスミドｐＧ２１０ＳｈＣＴ
［Ｇ］の作製方法を示す図である。FIG. 24 shows the plasmid pG210ShCT.
It is a figure showing the manufacturing method of [G].
【図２５】各分泌型Ｋｅｘ２誘導体の培養液ＯＤ６６０
あたりの生産量を、合成基質を用いたＫｅｘ２活性によ
り比較した図である。Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６
１４] の生産量を１として各分泌型Ｋｅｘ２誘導体の生
産量を示している。FIG. 25: Culture solution OD660 of each secretory Kex2 derivative
FIG. 4 is a diagram comparing production amounts per unit by Kex2 activity using a synthetic substrate. K16-57C [pYE22-6
14], the production amount of each secreted Kex2 derivative is shown with the production amount of 1 as 1.
【図２６】分泌型Ｋｅｘ２誘導体の培養上清２００μｌ
あたりの生産量を比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した図
である。レーン１および１２は分子量マーカーを、レー
ン２〜１１はそれぞれ、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２
ｍ] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６１４] 、Ｋ１６
−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６３０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ｐ
ＹＥ２２−６４０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６
５０] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６６０] 、Ｋ１
６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６７９] 、Ｋ１６−５７Ｃ[
ｐＹＥ２２−６８２] 、Ｋ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−
６８８] 、またはＫ１６−５７Ｃ[ ｐＹＥ２２−６９
９] の培養上清の濃縮液を展開した。レーン１の左側の
数字は分子量マーカーの大きさ（kDa ）を示す、電気泳
動の結果を示す図面代用写真である。FIG. 26: 200 μl of culture supernatant of secreted Kex2 derivative
FIG. 4 is a diagram showing SDS-PAGE comparing production amounts per unit. Lanes 1 and 12 show molecular weight markers, and lanes 2 to 11 show K16-57C [pYE22, respectively.
m], K16-57C [pYE22-614], K16
-57C [pYE22-630], K16-57C [p
YE22-640], K16-57C [pYE22-6]
50], K16-57C [pYE22-660], K1
6-57C [pYE22-679], K16-57C [
pYE22-682], K16-57C [pYE22-
688], or K16-57C [pYE22-69]
9] was developed. The number on the left side of Lane 1 is a photograph as a substitute for a drawing showing the size (kDa) of the molecular weight marker and showing the result of electrophoresis.
【図２７】ピキア・パストリスを宿主としたときのＫｅ
ｘ２−６６０発現プラスミドｐＨＩＬ−６６０の作製方
法を示す図である。FIG. 27. Ke when Pichia pastoris is used as a host
It is a figure which shows the manufacturing method of x2-660 expression plasmid pHIL-660.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/60 Ｃ１２Ｎ 9/60 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 9/60 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 9/60 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 9/60 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 鈴木 雄司 群馬県邑楽郡千代田町大字赤岩字くらかけ 2716番地１ サントリー株式会社医薬開発 研究所内 (72)発明者 薮田 雅之 群馬県邑楽郡千代田町大字赤岩字くらかけ 2716番地１ サントリー株式会社医薬開発 研究所内──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C12N 9/60 C12N 9/60 C12P 21/02 C12P 21/02 C // (C12N 1/19 C12R 1:78) (C12N 1 / 19 C12R 1:72) (C12N 1/19 C12R 1:84) (C12N 9/60 C12R 1:78) (C12N 9/60 C12R 1:72) (C12N 9/60 C12R 1:84) (C12P 21 / 02 C12R 1:78) (C12P 21/02 C12R 1:72) (C12P 21/02 C12R 1:84) (72) Inventor Yuji Suzuki 2716, 1 Akaiwa-ku Kurakake, Chiyoda-cho, Oraku-gun, Gunma Pref. (72) Inventor Masayuki Yabuta Chiyoda-cho, Gunma-ken, Chiyoda-cho Oka Akaiwa, Kurakake 2716-1 Suntory Limited Pharmaceutical Development Laboratory
Claims (12)
をＮ−末端とし、アミノ酸番号６１８〜６９８の間のい
ずれかのアミノ酸をＣ−末端とする天然のアミノ酸配
列、又はこの天然のアミノ酸配列に対して１個もしくは
複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加により修飾
されているアミノ酸配列をコードするDNA を含む発現ベ
クターでメタノール資化性酵母を形質転換し、得られた
形質転換体を培養し、該培養物から採取することにより
得られる、Ｋｅｘ２プロテアーゼの酵素活性を有する蛋
白質。1. Met of amino acid number 1 of SEQ ID NO: 1.
Is the N-terminus, a natural amino acid sequence having any of amino acids 618 to 698 as the C-terminus, or substitution or deletion of one or more amino acids with respect to this natural amino acid sequence Alternatively, Kex2 obtained by transforming a methanol-assimilating yeast with an expression vector containing a DNA encoding the amino acid sequence modified by addition, culturing the resulting transformant, and collecting from the culture. A protein having the enzymatic activity of a protease.
ミノ酸が配列番号：１におけるアミノ酸番号６３０〜６
８８のいずれかのアミノ酸である、請求項１に記載の蛋
白質。2. The amino acid at the C-terminus of the natural amino acid sequence is amino acid numbers 630 to 6 in SEQ ID NO: 1.
The protein according to claim 1, which is any one of 88 amino acids.
ミノ酸が配列番号：１におけるアミノ酸番号６３０〜６
８２のいずれかのアミノ酸である、請求項１に記載の蛋
白質。3. The amino acid at the C-terminus of the natural amino acid sequence is amino acid number 630-6 in SEQ ID NO: 1.
2. The protein according to claim 1, which is any one of 82 amino acids.
ミノ酸配列が、配列番号：１におけるアミノ酸番号６３
０〜６７９のいずれかのアミノ酸である、請求項１に記
載の蛋白質。4. The amino acid sequence at the C-terminus of the natural amino acid sequence is amino acid number 63 in SEQ ID NO: 1.
The protein according to claim 1, which is any one of amino acids 0 to 679.
白質をコードするＤＮＡ。A DNA encoding the protein according to any one of claims 1 to 4.
現ベクター。6. An expression vector comprising the DNA according to claim 5.
ール資化性酵母を形質転換することにより得られる形質
転換体。7. A transformant obtained by transforming a methanol-assimilating yeast with the expression vector according to claim 6.
ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）又はキャンディダ
（Ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母である、請求項７に記載の
形質転換体。8. The method according to claim 1, wherein the yeast is Pichia,
The transformant according to claim 7, which is a yeast belonging to the genus Hansenula or Candida.
ｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルフ
ァ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）又は
キャンディダ・ボイディニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉ
ｄｉｎｉｉ）種である、請求項８に記載の形質転換体。9. The method according to claim 9, wherein the yeast is Pichia pastoris (Pic.
ia pastoris, Hansenula polymorpha or Candida boi
9. The transformant according to claim 8, which is a genus dinii) species.
蛋白質の製造方法において、請求項７〜９のいずれか１
項に記載の形質転換体を培養し、該培養物から該ペプチ
ドを採取することを特徴とする方法。10. The method for producing a protein according to any one of claims 1 to 8, wherein the method for producing a protein is any one of claims 7 to 9.
13. A method comprising culturing the transformant described in the above section and collecting the peptide from the culture.
から、陰イオン交換クロマトグラフィー又は疎水性クロ
マトグラフィーにより行うことを特徴とする、請求項１
０に記載の方法。11. The method according to claim 1, wherein the polypeptide is collected from the culture supernatant by anion exchange chromatography or hydrophobic chromatography.
The method according to 0.
の切り出し方法において、目的ペプチドのＮ末端に隣接
して位置するＡｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−Ａｒｇもしくは
Ｐｒｏ−Ａｒｇ配列及び目的ペプチドを有するキメラタ
ンパク質に、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白
質を作用させ、目的ペプチドを得ることを特徴とする方
法。12. The method for excising a target peptide from a chimeric protein, wherein the chimeric protein has an Arg-Arg, Lys-Arg or Pro-Arg sequence and a target peptide located adjacent to the N-terminus of the target peptide. A method characterized in that the target peptide is obtained by allowing the protein according to any one of claims 1 to 4 to act.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06395397A JP3982866B2 (en) | 1996-03-04 | 1997-03-04 | Method for producing secreted Kex2 derivative |
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|---|---|---|---|
| JP8-73217 | 1996-03-04 | ||
| JP7321796 | 1996-03-04 | ||
| JP8-352580 | 1996-12-16 | ||
| JP35258096 | 1996-12-16 | ||
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| JPH10229884A true JPH10229884A (en) | 1998-09-02 |
| JP3982866B2 JP3982866B2 (en) | 2007-09-26 |
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| JP (1) | JP3982866B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2119785A1 (en) | 1999-07-23 | 2009-11-18 | Kenji Kangawa | Novel peptides |
-
1997
- 1997-03-04 JP JP06395397A patent/JP3982866B2/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2119785A1 (en) | 1999-07-23 | 2009-11-18 | Kenji Kangawa | Novel peptides |
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|---|---|
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