JPH10210991A - トキソプラスマ症のための診断上の遺伝子 - Google Patents
トキソプラスマ症のための診断上の遺伝子Info
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- JPH10210991A JPH10210991A JP10010737A JP1073798A JPH10210991A JP H10210991 A JPH10210991 A JP H10210991A JP 10010737 A JP10010737 A JP 10010737A JP 1073798 A JP1073798 A JP 1073798A JP H10210991 A JPH10210991 A JP H10210991A
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/45—Toxoplasma
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 トキソプラスマ・ゴンジイ（Toxoplasma gon
dii ）のｐ３０及びＢ１ペプチドをコードする遺伝子材
料の提供。 【解決手段】 上記遺伝子材料を単離し、そして特徴付
けした。本発明に係る遺伝子材料は、診断又は免疫感作
において使用されるペプチドの製造を可能にし、又はハ
イブリダイゼーション・アッセイにおいて直接使用され
ることができる。
dii ）のｐ３０及びＢ１ペプチドをコードする遺伝子材
料の提供。 【解決手段】 上記遺伝子材料を単離し、そして特徴付
けした。本発明に係る遺伝子材料は、診断又は免疫感作
において使用されるペプチドの製造を可能にし、又はハ
イブリダイゼーション・アッセイにおいて直接使用され
ることができる。
Description
【０００１】発明の背景 発明の分野 本発明は、遺伝子工学の分野及びより詳しくは、ワクチ
ン開発のために及びハイブリダイゼーション及び免疫学
的アッセイによりトキソプラスマ感染の検出のために有
用なポリヌクレオチド配列及びポリペプチドの同定及び
調製に関する。
ン開発のために及びハイブリダイゼーション及び免疫学
的アッセイによりトキソプラスマ感染の検出のために有
用なポリヌクレオチド配列及びポリペプチドの同定及び
調製に関する。
【０００２】背景の説明 トキソプラスマ症は、原生動物の寄生虫トキソプラスマ
ゴンジイ（Toxoplasma gondii）により引き起こされ
る。この病気は、発育中の胎児に元来関係し、ここでそ
れは、水頭症、精神薄弱又は失明として現われる重大な
神経系問題を引き起こす。健康な成人においては、この
病気は、典型的には軽く、もしあったとしても、ほとん
どの症状を伴わない。最近、トキソプラスマ症の患者の
数が、たとえば移植後治療、腫瘍性疾患又は後天性免疫
不全症候群（ＡＩＤＳ）に起因する免疫欠損している人
々における上昇の結果として劇的に上昇して来た。その
ような免疫欠損患者においては、寄生虫が、脳炎、すな
わち実質的に致命的な形の疾病を引き起こすことができ
る。
ゴンジイ（Toxoplasma gondii）により引き起こされ
る。この病気は、発育中の胎児に元来関係し、ここでそ
れは、水頭症、精神薄弱又は失明として現われる重大な
神経系問題を引き起こす。健康な成人においては、この
病気は、典型的には軽く、もしあったとしても、ほとん
どの症状を伴わない。最近、トキソプラスマ症の患者の
数が、たとえば移植後治療、腫瘍性疾患又は後天性免疫
不全症候群（ＡＩＤＳ）に起因する免疫欠損している人
々における上昇の結果として劇的に上昇して来た。その
ような免疫欠損患者においては、寄生虫が、脳炎、すな
わち実質的に致命的な形の疾病を引き起こすことができ
る。
【０００３】トキソプラスマスを診断するための現段階
での手段は、費用がかかり、手間がかかり、感応に限界
があり、そして患者への実質的な危険を伴う。血清学的
技法を含む従来の方法は、ＡＩＤＳ患者における重い免
疫機能障害のために及びその疾病の再発性質のためにほ
とんど信頼できない。妊娠中に、トキソプラスマスにつ
いて初めて試験される妊婦においては、現在か過去かの
感染を区別することが臨界である（現在は、ある期間に
わたってＩｇＧ及びＩｇＭ力価を比較することによって
行なわれる）。現存する１つの問題は、ワクチンの調整
及び免疫学的アッセイにおける標準液としての使用の両
者のために十分な量の適切な抗原を得ることである。抗
原を供給するための現在の技法は、マウスにおける原生
動物の増殖及び新しいマウスの連続した再感染を必要と
する。ワクチン又は免疫学的標準として使用され得る遺
伝子的に構築されたポリペプチド抗原の有効性は、現在
の抗原源に関する多くの問題を緩和するであろう。
での手段は、費用がかかり、手間がかかり、感応に限界
があり、そして患者への実質的な危険を伴う。血清学的
技法を含む従来の方法は、ＡＩＤＳ患者における重い免
疫機能障害のために及びその疾病の再発性質のためにほ
とんど信頼できない。妊娠中に、トキソプラスマスにつ
いて初めて試験される妊婦においては、現在か過去かの
感染を区別することが臨界である（現在は、ある期間に
わたってＩｇＧ及びＩｇＭ力価を比較することによって
行なわれる）。現存する１つの問題は、ワクチンの調整
及び免疫学的アッセイにおける標準液としての使用の両
者のために十分な量の適切な抗原を得ることである。抗
原を供給するための現在の技法は、マウスにおける原生
動物の増殖及び新しいマウスの連続した再感染を必要と
する。ワクチン又は免疫学的標準として使用され得る遺
伝子的に構築されたポリペプチド抗原の有効性は、現在
の抗原源に関する多くの問題を緩和するであろう。
【０００４】さらに、トキソプラスマ感染の阻止のため
の処理方法は、現在制限されている。トキソプラスマス
の制御のために利用できる市販のワクチンは存在しな
い。その疾病の処置は一般的に、ピリメタミン及びスル
ファジアジンにより開始され、そして維持される。しか
しながら、薬物処理による毒性が重要であり、その結
果、予防薬療法は推薦されない（但し、嚢胞が実際に検
出される場合を除く）。従って、低レベルのトキソプラ
スマ感染を確実に検出する診断アッセイ及びワクチンの
産生のために有用な物質の開発についての必要性が存在
する。
の処理方法は、現在制限されている。トキソプラスマス
の制御のために利用できる市販のワクチンは存在しな
い。その疾病の処置は一般的に、ピリメタミン及びスル
ファジアジンにより開始され、そして維持される。しか
しながら、薬物処理による毒性が重要であり、その結
果、予防薬療法は推薦されない（但し、嚢胞が実際に検
出される場合を除く）。従って、低レベルのトキソプラ
スマ感染を確実に検出する診断アッセイ及びワクチンの
産生のために有用な物質の開発についての必要性が存在
する。
【０００５】発明の要約 本発明は、Ｔ． ゴンジイの細胞表面抗原をコードする
遺伝子物質を供給する。その遺伝子物質は、ワクチン又
は診断試薬として使用するためにポリペプチド又はタン
パク質を産生するために使用され得、又はトキソプラス
マ感染の直接的な検出のために核酸ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイにおけるプローブとして使用され得る。特
定の遺伝子物質及び分析技法は、次の詳細な説明及び次
の例に開示される。
遺伝子物質を供給する。その遺伝子物質は、ワクチン又
は診断試薬として使用するためにポリペプチド又はタン
パク質を産生するために使用され得、又はトキソプラス
マ感染の直接的な検出のために核酸ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイにおけるプローブとして使用され得る。特
定の遺伝子物質及び分析技法は、次の詳細な説明及び次
の例に開示される。
【０００６】図面の簡単な説明 第１図は、親水性対本発明のｐ３０遺伝子配列によりコ
ードされるポリペプチドをプロットするグラフである。
ードされるポリペプチドをプロットするグラフである。
【０００７】特定の態様の説明 本発明者は、原生動物の寄生虫トキソプラスマ ゴンジ
イの特定のタンパク質をコードする遺伝子物質を初めて
同定し、そして得た。その特異的抗原はｐ３０及びＢ１
抗原である。ｐ３０抗原は主要表面抗原であり〔Kasper
など. 、J. Imm. (1983) 130 ：2407〜2412を参照のこ
と〕、そしてワクチン又は診断用標準液の製造のために
使用され得る（後者は、Ｔ． ゴンジイを検出するため
のイムノアッセイに使用するためのものである）。Ｂ１
抗原の機能及び位置は知られていないが、しかしその多
発性ゲノム性質は、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッ
セイのための特に有用な標的にそれをする。従って、特
定された遺伝子物質の同定及び単離は、種々の生化学的
成分、たとえば抗原、診断用核酸プローブ及びそのプロ
ーブを産生するためのシステムの産生を可能にし、そし
てこれらは、種々の有用な生物学的用途に使用される。
イの特定のタンパク質をコードする遺伝子物質を初めて
同定し、そして得た。その特異的抗原はｐ３０及びＢ１
抗原である。ｐ３０抗原は主要表面抗原であり〔Kasper
など. 、J. Imm. (1983) 130 ：2407〜2412を参照のこ
と〕、そしてワクチン又は診断用標準液の製造のために
使用され得る（後者は、Ｔ． ゴンジイを検出するため
のイムノアッセイに使用するためのものである）。Ｂ１
抗原の機能及び位置は知られていないが、しかしその多
発性ゲノム性質は、ＤＮＡハイブリダイゼーションアッ
セイのための特に有用な標的にそれをする。従って、特
定された遺伝子物質の同定及び単離は、種々の生化学的
成分、たとえば抗原、診断用核酸プローブ及びそのプロ
ーブを産生するためのシステムの産生を可能にし、そし
てこれらは、種々の有用な生物学的用途に使用される。
【０００８】ペプチドにおけるアミノ酸とそのペプチド
をコードするＤＮＡ配列との間に既知の一定の関係が存
在するので、天然のＴ． ゴンジイタンパク質（又は、
後で論議される変性されたペプチドのいづれか）をコー
ドするＤＮＡ又はＲＮＡ分子のＤＮＡ配列は、特定のア
ミノ酸配列を示す場合、容易に理解されるであろうし、
そしてそのような典型的なヌクレオチド及びアミノ酸の
配列が第１表に示されている。
をコードするＤＮＡ配列との間に既知の一定の関係が存
在するので、天然のＴ． ゴンジイタンパク質（又は、
後で論議される変性されたペプチドのいづれか）をコー
ドするＤＮＡ又はＲＮＡ分子のＤＮＡ配列は、特定のア
ミノ酸配列を示す場合、容易に理解されるであろうし、
そしてそのような典型的なヌクレオチド及びアミノ酸の
配列が第１表に示されている。
【０００９】 第１表 ────────────────────────────────── 種々のＴ． ゴンジイタンパク質をコードするＤＮＡの一本鎖のヌクレオチ ド配列及び対応するペプチドの配列。その数字は、配列の５′末端で始まる ＤＮＡ配列を言及する。そのＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ配列に対応するであろ う（但し、ｍＲＮＡにおいてＵがＴに取って代わられている）。 ──────────────────────────────────
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【００１０】遺伝子のＤＮＡ配列は十分に同定されたの
で、合成化学により完全にＤＮＡ遺伝子を産生すること
は可能であり、この後、遺伝子は、組換えＤＮＡ技法の
既知技術を用いていづれか多くの利用できるＤＮＡベク
ター中に挿入され得る。従って、本発明は、本特許出願
の提出の時期、公衆が自由に入手できる試薬、プラスミ
ド及び微生物を用いて実施され得る。たとえば、１００
塩基よりも長いヌクレオチド配列は、 Applied Biosyst
emsModel 380A DNA Synthesizerにより、その商業上の
広告により明らかなように容易に合成され得る（たとえ
ば、Genetic Engineering News, １１月／１２月、１９
８４、３ページ）。そのようなオリゴヌクレオチドは、
中でも、オーバーラップする相補的配列（たとえば１〜
１００のコード鎖、０〜５０及び５１〜１５０の相補的
鎖、１０１〜２００のコード鎖、等）を調製する技法を
用いて容易にスプライスされ得、続いてハイブリダイズ
され、そして鎖を連結され得る。
で、合成化学により完全にＤＮＡ遺伝子を産生すること
は可能であり、この後、遺伝子は、組換えＤＮＡ技法の
既知技術を用いていづれか多くの利用できるＤＮＡベク
ター中に挿入され得る。従って、本発明は、本特許出願
の提出の時期、公衆が自由に入手できる試薬、プラスミ
ド及び微生物を用いて実施され得る。たとえば、１００
塩基よりも長いヌクレオチド配列は、 Applied Biosyst
emsModel 380A DNA Synthesizerにより、その商業上の
広告により明らかなように容易に合成され得る（たとえ
ば、Genetic Engineering News, １１月／１２月、１９
８４、３ページ）。そのようなオリゴヌクレオチドは、
中でも、オーバーラップする相補的配列（たとえば１〜
１００のコード鎖、０〜５０及び５１〜１５０の相補的
鎖、１０１〜２００のコード鎖、等）を調製する技法を
用いて容易にスプライスされ得、続いてハイブリダイズ
され、そして鎖を連結され得る。
【００１１】さらに、自動化された装置（本明細書に開
示されるいづれかのペプチドの直接的な合成を容易に入
手可能にする）もまた利用できる。上記のGenetic Engi
neering Newsの同じ号において、９９％を越える結合効
力を有する市販の自動化されたペプチド合成機が広告さ
れている（３４ページ）。そのような装置は、直接的な
合成又は他の既知の技法を用いて結合され得る一連のフ
ラグメントの合成のいづれかにより、本発明のペプチド
への容易な接近を提供する。
示されるいづれかのペプチドの直接的な合成を容易に入
手可能にする）もまた利用できる。上記のGenetic Engi
neering Newsの同じ号において、９９％を越える結合効
力を有する市販の自動化されたペプチド合成機が広告さ
れている（３４ページ）。そのような装置は、直接的な
合成又は他の既知の技法を用いて結合され得る一連のフ
ラグメントの合成のいづれかにより、本発明のペプチド
への容易な接近を提供する。
【００１２】第１表に示される特定のポリペプチド配列
の他に、これらの配列に基づくペプチドフラグメント及
びその小さな変化を表わすフラグメントは、種々のペプ
チドの生物学的活性を有する。たとえば、ｐ３０抗原自
体に対して特異的な免疫グロブリンにより認識され得る
ｐ３０ペプチド配列のフラグメントは、容易に調製さ
れ、そしてスクリーンされ得る。ペプチド合成機は、短
かなペプチドフラグメント（たとえば１００個以下のア
ミノ酸）を調製するために使用され得又は遺伝子工学の
技法は、長いフラグメントを調製するために使用され得
る。適切なポリペプチドフラグメントを同定するであろ
う単純なスクリーニング方法は、ｐ３０抗原に対するモ
ノクローナル抗体を調製し、アフィニティカラムにその
抗体を結合し、そしてその結合される抗体により保持さ
れるペプチドフラグメントを捕獲することから成る。ポ
リクローナル抗血清は、所望により、モノクローナル抗
体の代わりに使用され得る。この技法の適合性は、実験
的に示された。ｐ３０配列のサブ配列がクローン化さ
れ、そしてβ−ガラクトシダーゼ融合生成物（ｐ３０．
５として同定される）として発現されて来た。ｐ３０．
５タンパク質配列をコードするポリヌクレオチド配列
は、第１図において、ヌクレオチドの数５８２に始ま
り、そしてヌクレオチド９９６で終結する。そのｐ３
０．５ポリペプチドは、ポリクローナル抗−ｐ３０血清
と反応する。
の他に、これらの配列に基づくペプチドフラグメント及
びその小さな変化を表わすフラグメントは、種々のペプ
チドの生物学的活性を有する。たとえば、ｐ３０抗原自
体に対して特異的な免疫グロブリンにより認識され得る
ｐ３０ペプチド配列のフラグメントは、容易に調製さ
れ、そしてスクリーンされ得る。ペプチド合成機は、短
かなペプチドフラグメント（たとえば１００個以下のア
ミノ酸）を調製するために使用され得又は遺伝子工学の
技法は、長いフラグメントを調製するために使用され得
る。適切なポリペプチドフラグメントを同定するであろ
う単純なスクリーニング方法は、ｐ３０抗原に対するモ
ノクローナル抗体を調製し、アフィニティカラムにその
抗体を結合し、そしてその結合される抗体により保持さ
れるペプチドフラグメントを捕獲することから成る。ポ
リクローナル抗血清は、所望により、モノクローナル抗
体の代わりに使用され得る。この技法の適合性は、実験
的に示された。ｐ３０配列のサブ配列がクローン化さ
れ、そしてβ−ガラクトシダーゼ融合生成物（ｐ３０．
５として同定される）として発現されて来た。ｐ３０．
５タンパク質配列をコードするポリヌクレオチド配列
は、第１図において、ヌクレオチドの数５８２に始ま
り、そしてヌクレオチド９９６で終結する。そのｐ３
０．５ポリペプチドは、ポリクローナル抗−ｐ３０血清
と反応する。
【００１３】大きなタンパク質から免疫学的に活性的な
適切なフラグメントを調製し、そして選択するための能
力は、当業界において良く知られており、そして多くの
出版物（特許も含む）に記載されている。たとえば、ア
メリカ特許第４，６２９，７８３号（ウィルスタンパク
質の免疫学的に活性的なフラグメントの調製法を記載す
る）を参照のこと。融合されたポリペプチドの形での本
発明のポリペプチドの調製法は、１つの通常の変法であ
る。そのようなペプチドは、典型的には、宿主に発現さ
れることが知られている遺伝子のプロモーター領域を用
いて、そして本発明のアミノ酸配列のすべて又は主要部
分をコードするヌクレオチドを宿主タンパク質のための
遺伝子配列中に挿入することによって調製される。その
ような融合タンパク質の例は、上記のβ−ガラクトシダ
ーゼ融合タンパク質を包含する。
適切なフラグメントを調製し、そして選択するための能
力は、当業界において良く知られており、そして多くの
出版物（特許も含む）に記載されている。たとえば、ア
メリカ特許第４，６２９，７８３号（ウィルスタンパク
質の免疫学的に活性的なフラグメントの調製法を記載す
る）を参照のこと。融合されたポリペプチドの形での本
発明のポリペプチドの調製法は、１つの通常の変法であ
る。そのようなペプチドは、典型的には、宿主に発現さ
れることが知られている遺伝子のプロモーター領域を用
いて、そして本発明のアミノ酸配列のすべて又は主要部
分をコードするヌクレオチドを宿主タンパク質のための
遺伝子配列中に挿入することによって調製される。その
ような融合タンパク質の例は、上記のβ−ガラクトシダ
ーゼ融合タンパク質を包含する。
【００１４】免疫学的に活性的なペプチドフラグメント
を調製するためのもう１つの技法は、長さ（又は、いづ
れかの介在する長さ、たとえば１０，１５又はこの範囲
における２，３、又は５の倍数）５〜１００個のアミノ
酸の一連のアミノ酸を合成し、そして抗血清（又はモノ
クローナル抗体）を用いて免疫学的活性についてスクリ
ーンすることである。そのフラグメントは、交差反応性
を最適にするためにペプチドの完全な長さで選択される
（たとえば長さ２０個のアミノ酸の一連のペプチド及び
ＡＡ1 −ＡＡ20、ＡＡ5 −ＡＡ25、ＡＡ10−ＡＡ30、等
を含んで成る）。その選択されたフラグメントは、本明
細書に記載されるようにして使用するための多量のペプ
チドを製造するために使用される、特に有用な対応する
ヌクレオチド配列に対応するであろう。
を調製するためのもう１つの技法は、長さ（又は、いづ
れかの介在する長さ、たとえば１０，１５又はこの範囲
における２，３、又は５の倍数）５〜１００個のアミノ
酸の一連のアミノ酸を合成し、そして抗血清（又はモノ
クローナル抗体）を用いて免疫学的活性についてスクリ
ーンすることである。そのフラグメントは、交差反応性
を最適にするためにペプチドの完全な長さで選択される
（たとえば長さ２０個のアミノ酸の一連のペプチド及び
ＡＡ1 −ＡＡ20、ＡＡ5 −ＡＡ25、ＡＡ10−ＡＡ30、等
を含んで成る）。その選択されたフラグメントは、本明
細書に記載されるようにして使用するための多量のペプ
チドを製造するために使用される、特に有用な対応する
ヌクレオチド配列に対応するであろう。
【００１５】さらに、前に言及されたペプチド及びＤＮ
Ａ分子の少々の変更はまた、当業者により正しく評価さ
れるであろうように、より詳細に示されるこれらのペプ
チド及びＤＮＡ分子に等しいように企画される。たとえ
ば、イソロイシン又はバリンによるロイシン、グルタメ
ートによるアスパーテート、セリンによるトレオニンの
単独の置換、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミ
ノ酸の類似する置換（すなわち、保存性置換）は、特
に、その置換が生物学的活性の結合部位又は他の部位で
アミノ酸を包含しない場合、その得られた分子の生物学
的活性に主な効果を付与しないであろうことを予測する
ことは適切である。変化が機能するペプチドにもたらさ
れるかどうかは、免疫原性の特異性による免疫化又は診
断試験における機能についての直接的な分析により容易
に決定され得る。この方法の例は、後で詳細に記載され
る。１個以上の置換が起こったペプチドは、同じ方法で
容易に試験され得る。好ましいペプチドは、２０個のア
ミノ酸の連続する群において、１２個よりも多くない、
より好ましくは５個よりも多くないアミノ酸で異なる。
アミノ酸の標準保存群は、一文字のアミノ酸コードを用
いて括弧で示される：非極性（Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ，
Ｍ）；芳香性（Ｆ，Ｔ，Ｗ）；非帯電極性（Ｇ，Ｓ，
Ｔ，Ｃ，Ｎ，Ｑ）；酸性（Ｄ，Ｅ）；塩基性（Ｋ，Ｒ，
Ｈ）。芳香族群は、時々、広定義の非極性（Ｆ，Ｗ）又
は非帯電極性（Ｔ）群に属するように思われる。
Ａ分子の少々の変更はまた、当業者により正しく評価さ
れるであろうように、より詳細に示されるこれらのペプ
チド及びＤＮＡ分子に等しいように企画される。たとえ
ば、イソロイシン又はバリンによるロイシン、グルタメ
ートによるアスパーテート、セリンによるトレオニンの
単独の置換、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミ
ノ酸の類似する置換（すなわち、保存性置換）は、特
に、その置換が生物学的活性の結合部位又は他の部位で
アミノ酸を包含しない場合、その得られた分子の生物学
的活性に主な効果を付与しないであろうことを予測する
ことは適切である。変化が機能するペプチドにもたらさ
れるかどうかは、免疫原性の特異性による免疫化又は診
断試験における機能についての直接的な分析により容易
に決定され得る。この方法の例は、後で詳細に記載され
る。１個以上の置換が起こったペプチドは、同じ方法で
容易に試験され得る。好ましいペプチドは、２０個のア
ミノ酸の連続する群において、１２個よりも多くない、
より好ましくは５個よりも多くないアミノ酸で異なる。
アミノ酸の標準保存群は、一文字のアミノ酸コードを用
いて括弧で示される：非極性（Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ，
Ｍ）；芳香性（Ｆ，Ｔ，Ｗ）；非帯電極性（Ｇ，Ｓ，
Ｔ，Ｃ，Ｎ，Ｑ）；酸性（Ｄ，Ｅ）；塩基性（Ｋ，Ｒ，
Ｈ）。芳香族群は、時々、広定義の非極性（Ｆ，Ｗ）又
は非帯電極性（Ｔ）群に属するように思われる。
【００１６】そのようなペプチドをコードする他のＤＮ
Ａ分子は、第２表におけるコドンの表から容易に決定さ
れ得、そしてさらに、第１表のＤＮＡ配列に等しいよう
に企画されている。事実、ペプチドにおけるＤＮＡコド
ンとアミノ酸との間に一定の関係が存在するので、ペプ
チドにおける置換又は他の変更の本出願における論議
は、対応するＤＮＡ配列又はＤＮＡ分子、組換えベクタ
ー、又は前記配列が位置する形質転換された微生物に同
じように適用され得る（そして逆もまた同様である）。
Ａ分子は、第２表におけるコドンの表から容易に決定さ
れ得、そしてさらに、第１表のＤＮＡ配列に等しいよう
に企画されている。事実、ペプチドにおけるＤＮＡコド
ンとアミノ酸との間に一定の関係が存在するので、ペプ
チドにおける置換又は他の変更の本出願における論議
は、対応するＤＮＡ配列又はＤＮＡ分子、組換えベクタ
ー、又は前記配列が位置する形質転換された微生物に同
じように適用され得る（そして逆もまた同様である）。
【００１７】 第２表 ────────────────────────────────── 遺伝子コード 遺伝子コード ────────────────────────────────── アラニン(Ala) GCL ロイシン(Leu) XTY アルギニン(Arg) WGZ リシン(Lys) AAJ アスパラギン(Asn) AAK メチオニン(Met) ATG アスパラギン酸(Asp) GAK フェニルアラニン(Phe) TTK システイン(Cys) TGK プロリン(Pro) CCL グルタミン酸(Glu) GAJ セリン(Ser) QRS グルタミン(Gln) CAJ トレオニン(Thr) ACL グリシン(Gly) GGL トリプトファン(Trp) TGG ヒスチジン(His) CAK チロシン(Tyr) TAK イソロイシン(Ile) ATM バリン(Val) GTL 終結コドン TAJ 終結コドン TGA ──────────────────────────────────
【００１８】手引き：個々の３文字のトリプレットは、
左で５′端及び右で３′端を有するＤＮＡのトリヌクレ
オチドを表わす。それらの文字は、ヌクレオチド配列を
形成するプリン又はピリミジン塩基を表わす。 Ａ＝アデニン Ｃ＝シトシン Ｇ＝グアニン Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝Ａ，Ｔ，Ｃ、又はＧ Ｍ＝Ａ，Ｃ、又はＴ Ｔ＝チミン Ｘ＝Ｔ又はＣ（ＹがＡ又はＧである場合） Ｘ＝Ｃ（ＹがＣ又はＴである場合） Ｙ＝Ａ，Ｇ，Ｃ、又はＴ（ＸがＣである場合） Ｙ＝Ａ又はＧ（ＸがＴである場合） Ｗ＝Ｃ又はＡ（ＺがＣ又はＴである場合） Ｗ＝Ｃ（ＺがＣ又はＴである場合） Ｚ＝Ａ，Ｇ，Ｃ、又はＴ（ＷがＧである場合） Ｚ＝Ａ又はＧ（ＷがＡである場合） ＱＲ＝ＴＣ（ＳがＡ，Ｇ，Ｃ、又はＴである場合） ＱＲ＝ＡＧ（ＳがＴ又はＣである場合） Ｓ＝Ａ，Ｇ，Ｃ、又はＴ（ＱＲがＴＣである場合） Ｓ＝Ｔ又はＣ（ＱＲがＡＧである場合）
左で５′端及び右で３′端を有するＤＮＡのトリヌクレ
オチドを表わす。それらの文字は、ヌクレオチド配列を
形成するプリン又はピリミジン塩基を表わす。 Ａ＝アデニン Ｃ＝シトシン Ｇ＝グアニン Ｊ＝Ａ又はＧ Ｋ＝Ｔ又はＣ Ｌ＝Ａ，Ｔ，Ｃ、又はＧ Ｍ＝Ａ，Ｃ、又はＴ Ｔ＝チミン Ｘ＝Ｔ又はＣ（ＹがＡ又はＧである場合） Ｘ＝Ｃ（ＹがＣ又はＴである場合） Ｙ＝Ａ，Ｇ，Ｃ、又はＴ（ＸがＣである場合） Ｙ＝Ａ又はＧ（ＸがＴである場合） Ｗ＝Ｃ又はＡ（ＺがＣ又はＴである場合） Ｗ＝Ｃ（ＺがＣ又はＴである場合） Ｚ＝Ａ，Ｇ，Ｃ、又はＴ（ＷがＧである場合） Ｚ＝Ａ又はＧ（ＷがＡである場合） ＱＲ＝ＴＣ（ＳがＡ，Ｇ，Ｃ、又はＴである場合） ＱＲ＝ＡＧ（ＳがＴ又はＣである場合） Ｓ＝Ａ，Ｇ，Ｃ、又はＴ（ＱＲがＴＣである場合） Ｓ＝Ｔ又はＣ（ＱＲがＡＧである場合）
【００１９】第１表に示された特定のヌクレオチドの他
に、本発明のＤＮＡ（又は対応するＲＮＡ）分子は、特
別に列挙されたヌクレオチドの前又は後に追加のヌクレ
オチドを有することができる。たとえば、ポリＡは、
３′−末端に付加され得、短い（たとえば２０個よりも
少ないヌクレオチド）配列は、制限エンドヌクレアーゼ
部位に対応する末端配列を付与するためにいづれかの末
端に付加され得、停止コドンはペプチドは翻訳を終結す
るためにペプチド配列に従えることができる。さらに、
遺伝子の上流にプロモーター領域又は他の制御領域を含
むＤＮＡ分子が生成され得る。本発明の配列を含むすべ
てのＤＮＡ分子は、少なくとも１つの目的のために有用
であろう。なぜならば、すべては、オリゴヌクレオチド
プローブを生成するために及び生物学源からＤＮＡの単
離又は検出に有用であるように最小に断片化され得るか
らである。
に、本発明のＤＮＡ（又は対応するＲＮＡ）分子は、特
別に列挙されたヌクレオチドの前又は後に追加のヌクレ
オチドを有することができる。たとえば、ポリＡは、
３′−末端に付加され得、短い（たとえば２０個よりも
少ないヌクレオチド）配列は、制限エンドヌクレアーゼ
部位に対応する末端配列を付与するためにいづれかの末
端に付加され得、停止コドンはペプチドは翻訳を終結す
るためにペプチド配列に従えることができる。さらに、
遺伝子の上流にプロモーター領域又は他の制御領域を含
むＤＮＡ分子が生成され得る。本発明の配列を含むすべ
てのＤＮＡ分子は、少なくとも１つの目的のために有用
であろう。なぜならば、すべては、オリゴヌクレオチド
プローブを生成するために及び生物学源からＤＮＡの単
離又は検出に有用であるように最小に断片化され得るか
らである。
【００２０】本発明のペプチドは、まず初めに、直接的
な合成又はクローン化された遺伝子又はそのフラグメン
トを用いることによって均質調製物として調製され得
る。ｐ３０ペプチドは、アフィニティークロマトグラフ
ィーにより前もって富化されたが、しかしその得られる
物質は、他のすべてのトキソプラスマ物質を有さなかっ
た。“均質”は、ペプチド又はＤＮＡ配列を言及する場
合、考慮される組成物に存在する実質的にすべての分子
の一次分子構造（すなわち、アミノ酸又はヌクレオチド
の配列）が同一であることを意味する。前記文章に使用
されるような“実質的には”とは、少なくとも９５重量
％、より好ましくは少なくとも９９重量％、及び最っと
も好ましくは少なくとも９９．８重量％を意味する。均
質ペプチド又はＤＮＡ配列の完全な分子に起因するフラ
グメントの存在（５重量％以下、好ましくは１重量％以
下及びより好ましくは０．２重量％以下で存在する場
合）は、均質性の決定に考慮され得ない。なぜならば、
用語“均質”とは、類似する分子量のいくつかの分子
（但し、それらの一次分子構造で異なる）が存在する混
合物に反対するものとして、単一の定義された構造を有
する完全な分子（及びそのフラグメント）の存在に関す
るからである。本明細書に使用される用語“単離され
た”とは、他のペプチドから分離される純粋なペプチ
ド、ＤＮＡ又はＲＮＡ、複数のＤＮＡ又は複数のＲＮＡ
を言及し、そして単に溶媒、緩衝液、又はその同じ生化
学的溶液に通常存在するイオン又は他の成分の存在下で
見出される。“単離された”とは、それらの本来の状態
での天然の物質又は、成分に分離されているが（たとえ
ばアシルアミドゲルにおいて）、しかし純粋な物質又は
溶液のいづれかとして得られなかった、天然の物質のい
づれをも包含しない。用語“純粋”とは、好ましくは、
上記“実質的には”と同じ数学的な限定を有する。句
“〜により置換される”又は“置換”とは、指摘される
“置換”アミノ酸が異なった式に存在すべきことが指摘
されているアミノ酸と同じ位置に存在する場合（たとえ
ば、ロイシンがバリンの代わりにｐ３０のアミノ酸３で
存在する場合）、存在するペプチドに起こるべきいづれ
かの作用を必ずしも言及しない。
な合成又はクローン化された遺伝子又はそのフラグメン
トを用いることによって均質調製物として調製され得
る。ｐ３０ペプチドは、アフィニティークロマトグラフ
ィーにより前もって富化されたが、しかしその得られる
物質は、他のすべてのトキソプラスマ物質を有さなかっ
た。“均質”は、ペプチド又はＤＮＡ配列を言及する場
合、考慮される組成物に存在する実質的にすべての分子
の一次分子構造（すなわち、アミノ酸又はヌクレオチド
の配列）が同一であることを意味する。前記文章に使用
されるような“実質的には”とは、少なくとも９５重量
％、より好ましくは少なくとも９９重量％、及び最っと
も好ましくは少なくとも９９．８重量％を意味する。均
質ペプチド又はＤＮＡ配列の完全な分子に起因するフラ
グメントの存在（５重量％以下、好ましくは１重量％以
下及びより好ましくは０．２重量％以下で存在する場
合）は、均質性の決定に考慮され得ない。なぜならば、
用語“均質”とは、類似する分子量のいくつかの分子
（但し、それらの一次分子構造で異なる）が存在する混
合物に反対するものとして、単一の定義された構造を有
する完全な分子（及びそのフラグメント）の存在に関す
るからである。本明細書に使用される用語“単離され
た”とは、他のペプチドから分離される純粋なペプチ
ド、ＤＮＡ又はＲＮＡ、複数のＤＮＡ又は複数のＲＮＡ
を言及し、そして単に溶媒、緩衝液、又はその同じ生化
学的溶液に通常存在するイオン又は他の成分の存在下で
見出される。“単離された”とは、それらの本来の状態
での天然の物質又は、成分に分離されているが（たとえ
ばアシルアミドゲルにおいて）、しかし純粋な物質又は
溶液のいづれかとして得られなかった、天然の物質のい
づれをも包含しない。用語“純粋”とは、好ましくは、
上記“実質的には”と同じ数学的な限定を有する。句
“〜により置換される”又は“置換”とは、指摘される
“置換”アミノ酸が異なった式に存在すべきことが指摘
されているアミノ酸と同じ位置に存在する場合（たとえ
ば、ロイシンがバリンの代わりにｐ３０のアミノ酸３で
存在する場合）、存在するペプチドに起こるべきいづれ
かの作用を必ずしも言及しない。
【００２１】本明細書に記載されるペプチドのいづれか
の塩は、そのようなペプチドが種々のpHの水溶液中に存
在する（又はその水溶液から単離されて存在する）場
合、天然に存在するであろう。指摘された生物学的活性
を有するペプチドのすべての塩は、本発明の範囲内にあ
ると思われる。例として、カルボン酸残基のアルカリ、
アルカリ土類及び他の金属塩、アミノ残基の酸付加塩
（たとえばＨＣｌ）及び同じ分子内でのカルボン酸とア
ミノ残基との反応により形成された両性イオンを挙げる
ことができる。本発明は、第１表及び第２表に列挙され
た可能性あるコドン選択に基づく組合せを選択すること
によって製造され得るポリヌクレオチドのそれぞれの及
びあらゆる可能性ある変更を特に包含し、そしてすべて
のそのような変更は、特別に開示されるものとして考え
られる。
の塩は、そのようなペプチドが種々のpHの水溶液中に存
在する（又はその水溶液から単離されて存在する）場
合、天然に存在するであろう。指摘された生物学的活性
を有するペプチドのすべての塩は、本発明の範囲内にあ
ると思われる。例として、カルボン酸残基のアルカリ、
アルカリ土類及び他の金属塩、アミノ残基の酸付加塩
（たとえばＨＣｌ）及び同じ分子内でのカルボン酸とア
ミノ残基との反応により形成された両性イオンを挙げる
ことができる。本発明は、第１表及び第２表に列挙され
た可能性あるコドン選択に基づく組合せを選択すること
によって製造され得るポリヌクレオチドのそれぞれの及
びあらゆる可能性ある変更を特に包含し、そしてすべて
のそのような変更は、特別に開示されるものとして考え
られる。
【００２２】遺伝子及び対応するタンパク質は、上記の
完全な合成技法により調製され得るけれども、本発明の
好ましい態様においては、遺伝子情報は天然源から得ら
れ、そして本明細書に記載されているようにして同定さ
れる。遺伝子物質は、多くの存在する技法のいづれかを
用いて、遺伝子ライブラリィーの形で最初に得られる。
次にゲノムＤＮＡをランデムに剪断し、そしてこの剪断
された物質を発現ベクター中に挿入する。十分な組換え
体が生成される場合、対象の抗原に対応する融合タンパ
ク質を発現する少なくとも１つの組換え体をその集団中
に有する良好な可能性が存在する。実際、Ｔ． ゴンジ
イのゲノムサイズ（約７×１０7 bp）のためには、少な
くとも５×１０6 個の独立した組換え体が必要とされ
る。これは、少なくとも１つの挿入体が１０個の塩基対
領域内に存在するその末端の１つで存在するであろう組
換え体により表わされる完全なゲノムを付与する。６回
のそのような挿入のうちたった１回が正しい配向及び読
み枠に整合して存在する場合、機能的な組換え体は、あ
らゆる６０個の塩基対に相当する融合体を有するような
ライブラリィーに存在するにちがいない。
完全な合成技法により調製され得るけれども、本発明の
好ましい態様においては、遺伝子情報は天然源から得ら
れ、そして本明細書に記載されているようにして同定さ
れる。遺伝子物質は、多くの存在する技法のいづれかを
用いて、遺伝子ライブラリィーの形で最初に得られる。
次にゲノムＤＮＡをランデムに剪断し、そしてこの剪断
された物質を発現ベクター中に挿入する。十分な組換え
体が生成される場合、対象の抗原に対応する融合タンパ
ク質を発現する少なくとも１つの組換え体をその集団中
に有する良好な可能性が存在する。実際、Ｔ． ゴンジ
イのゲノムサイズ（約７×１０7 bp）のためには、少な
くとも５×１０6 個の独立した組換え体が必要とされ
る。これは、少なくとも１つの挿入体が１０個の塩基対
領域内に存在するその末端の１つで存在するであろう組
換え体により表わされる完全なゲノムを付与する。６回
のそのような挿入のうちたった１回が正しい配向及び読
み枠に整合して存在する場合、機能的な組換え体は、あ
らゆる６０個の塩基対に相当する融合体を有するような
ライブラリィーに存在するにちがいない。
【００２３】そのうよなライブラリィーは、本発明者の
実験室において生成され、そして感染されたマウスから
の血清によりスクリーンされた。血清と反応性の決定基
を発現する組換え体の中に、平均頻度以上で見出される
組換え体が存在した。この組換え体、すなわち任意に名
づけられたＢ１は、次の通りに特徴づけられた。Ｂ１遺
伝子は２．２キロ塩基（kb）の長さであり、そして頭か
ら尾 (head-to-tail) の態様で約３５回、並んでくり返
えされた。遺伝子の完全な配列に基づいて、広範な読み
取り枠は存在しない。これは、短いポリペプチド生成物
のみがコードされるか、又はこの遺伝子にイントロンが
存在するかを示唆する。
実験室において生成され、そして感染されたマウスから
の血清によりスクリーンされた。血清と反応性の決定基
を発現する組換え体の中に、平均頻度以上で見出される
組換え体が存在した。この組換え体、すなわち任意に名
づけられたＢ１は、次の通りに特徴づけられた。Ｂ１遺
伝子は２．２キロ塩基（kb）の長さであり、そして頭か
ら尾 (head-to-tail) の態様で約３５回、並んでくり返
えされた。遺伝子の完全な配列に基づいて、広範な読み
取り枠は存在しない。これは、短いポリペプチド生成物
のみがコードされるか、又はこの遺伝子にイントロンが
存在するかを示唆する。
【００２４】次の配列で示されるように、ヌクレオチド
４１１で始まり、そしてヌクレオチド１３８４で終結す
るＢ１のｃＤＮＡが単離された：
４１１で始まり、そしてヌクレオチド１３８４で終結す
るＢ１のｃＤＮＡが単離された：
【００２５】 411 AAC ATT CTT GTG...GTG TTC GTC TCC（ポリＡ） 1384
【００２６】次の配列で示されるように、ヌクレオチド
４５６で始まり、そしてヌクレオチド８４３で終結する
ような１つのイントロンがゲノム配列に同定された：
４５６で始まり、そしてヌクレオチド８４３で終結する
ような１つのイントロンがゲノム配列に同定された：
【００２７】
【００２８】従って、ｃＤＮＡクローンの５′−末端で
始まり（フレーム３）、新規エキソンの始まりでフレー
ム１に転換し（これによってＯＲＦを維持し）、そして
ヌクレオチド１０２０で終結する読み取り枠が存在す
る。遺伝子ライブラリィーを調製するための第二の方法
は、寄生体の全ｍＲＮＡ集団の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）のコピーを製造し、そしてこれらを、発現ベクター
における組換え分子としてクローン化することである。
本発明者により実施された他の研究は、イントロンが他
のＴ． ゴンジイ遺伝子のコード領域内に存在したこと
を指摘した。イントロンは剪断されたゲノムＤＮＡの使
用を妨げないけれども、それらは、スクリーンされるべ
き組換え体の数を高め、そしてさらに、分析を実質的に
複雑にする。この結果に基づけば、Ｔ． ゴンジイ遺伝
子を得るためにｃＤＮＡライブラリィーを使用すること
は、好ましい。
始まり（フレーム３）、新規エキソンの始まりでフレー
ム１に転換し（これによってＯＲＦを維持し）、そして
ヌクレオチド１０２０で終結する読み取り枠が存在す
る。遺伝子ライブラリィーを調製するための第二の方法
は、寄生体の全ｍＲＮＡ集団の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）のコピーを製造し、そしてこれらを、発現ベクター
における組換え分子としてクローン化することである。
本発明者により実施された他の研究は、イントロンが他
のＴ． ゴンジイ遺伝子のコード領域内に存在したこと
を指摘した。イントロンは剪断されたゲノムＤＮＡの使
用を妨げないけれども、それらは、スクリーンされるべ
き組換え体の数を高め、そしてさらに、分析を実質的に
複雑にする。この結果に基づけば、Ｔ． ゴンジイ遺伝
子を得るためにｃＤＮＡライブラリィーを使用すること
は、好ましい。
【００２９】ｐ３０に対するポリクローナル抗血清を使
用して、ｐ３０遺伝子を定めるためにｃＤＮＡライブラ
リィーをスクリーンすることができる。この方法で初め
に同定された組換え体は、種々の異なった遺伝子を含む
ことが見出され、これは、抗−ｐ３０血清との少なくと
もいくらかの偶然の交差反応が生じたことを意味する。
正しいｐ３０遺伝子は、初期スクリーンにおいて得られ
る融合タンパク質の個々に対する抗血清を調製すること
によって得られる。次に、これらの血清は、Ｔ． ゴン
ジイの分解物に対してウェスターンブロット分析で使用
される。ｐ３０遺伝子の融合生成物からの抗血清のみ
が、ｐ３０に対する反応性を卓越的且つ独占的に示すで
あろう。
用して、ｐ３０遺伝子を定めるためにｃＤＮＡライブラ
リィーをスクリーンすることができる。この方法で初め
に同定された組換え体は、種々の異なった遺伝子を含む
ことが見出され、これは、抗−ｐ３０血清との少なくと
もいくらかの偶然の交差反応が生じたことを意味する。
正しいｐ３０遺伝子は、初期スクリーンにおいて得られ
る融合タンパク質の個々に対する抗血清を調製すること
によって得られる。次に、これらの血清は、Ｔ． ゴン
ジイの分解物に対してウェスターンブロット分析で使用
される。ｐ３０遺伝子の融合生成物からの抗血清のみ
が、ｐ３０に対する反応性を卓越的且つ独占的に示すで
あろう。
【００３０】上記方法で得られたクローンは、完全に配
列決定された。この配列を用いて、他のｃＤＮＡクロー
ンを単離した。さらに、これらの配列を用いて、第１表
に示されるような遺伝子の完全なタンパク質−コード配
列を予測することができる。その予測されるアミノ酸配
列の疎水性分析は、第１図に示される。一次翻訳生成物
は、３６，２１０KDの予測されるＭｒを有する。それは
また、表面抗原について予測した通りに、そのＮ−末端
で可能性ある疎水性シグナルペプチドを有する。それ
は、ｐ３０タンパク質が糖タンパク質であるかも知れな
いことを指摘しているこれまでの研究者の研究と一致す
る１つの予測されるＮ−グリコシル化部位（残基２６
７）を有する。最後に、それは、いづれか荷電された残
基を後に持たない疎水性Ｃ−末端を有する。これは、明
らかに、トリパノソーマにおける本来、報告されている
工程の診断に役立ち、そしてそれによって、疎水性ポリ
ペプチドセグメントが糖脂質アンカーにより置換され
る。そのような工程は、現在、リーシュマニア (Leishm
ania）及びプラスモジウム（Plasmodium) の主要表面抗
原のために生じることが知られている。
列決定された。この配列を用いて、他のｃＤＮＡクロー
ンを単離した。さらに、これらの配列を用いて、第１表
に示されるような遺伝子の完全なタンパク質−コード配
列を予測することができる。その予測されるアミノ酸配
列の疎水性分析は、第１図に示される。一次翻訳生成物
は、３６，２１０KDの予測されるＭｒを有する。それは
また、表面抗原について予測した通りに、そのＮ−末端
で可能性ある疎水性シグナルペプチドを有する。それ
は、ｐ３０タンパク質が糖タンパク質であるかも知れな
いことを指摘しているこれまでの研究者の研究と一致す
る１つの予測されるＮ−グリコシル化部位（残基２６
７）を有する。最後に、それは、いづれか荷電された残
基を後に持たない疎水性Ｃ−末端を有する。これは、明
らかに、トリパノソーマにおける本来、報告されている
工程の診断に役立ち、そしてそれによって、疎水性ポリ
ペプチドセグメントが糖脂質アンカーにより置換され
る。そのような工程は、現在、リーシュマニア (Leishm
ania）及びプラスモジウム（Plasmodium) の主要表面抗
原のために生じることが知られている。
【００３１】ｐ３０抗原をコードする遺伝子は、単細胞
微生物を操作し、そして増殖する標準技法を用いての完
全な又は変性されたペプチドの産生のために使用され得
る。ワクチン開発及び／又は診断用試薬のための候補体
である抗原は、感染された患者からの血清により認識さ
れるものを含むであろう。さらに、いづれかの遺伝子配
列が、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてプロー
ブとして使用され得る。上記に示された技法は、遺伝子
工学に関係する当業者の知識及び前で言及された概要と
共に使用される場合、所望する遺伝子の単離及び十分な
情報が遺伝子の位置を定めるために提供されている組換
えＤＮＡベクターにおけるその使用を容易に可能にする
であろうけれども、同じ結果を導びく他の方法もまた知
られており、そして本発明の組換えＤＮＡベクターの調
製に使用され得る。
微生物を操作し、そして増殖する標準技法を用いての完
全な又は変性されたペプチドの産生のために使用され得
る。ワクチン開発及び／又は診断用試薬のための候補体
である抗原は、感染された患者からの血清により認識さ
れるものを含むであろう。さらに、いづれかの遺伝子配
列が、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてプロー
ブとして使用され得る。上記に示された技法は、遺伝子
工学に関係する当業者の知識及び前で言及された概要と
共に使用される場合、所望する遺伝子の単離及び十分な
情報が遺伝子の位置を定めるために提供されている組換
えＤＮＡベクターにおけるその使用を容易に可能にする
であろうけれども、同じ結果を導びく他の方法もまた知
られており、そして本発明の組換えＤＮＡベクターの調
製に使用され得る。
【００３２】Ｔ． ゴンジイタンパク質の発現は、形質
転換された宿主における遺伝子の複数コピーを含むこと
によって、宿主中で複製することが知られているベクタ
ーを選択することによって、挿入された外因性ＤＮＡ
（たとえばｐＵＣ８；ｐｔａｃ１２；ｐＩＮ− III−ｏ
ｍｐＡ１，２、又は３；ｐＯＴＳ；ｐＡＳ１；又はｐＫ
Ｋ２２３−３）からの多量のタンパク質を産生すること
によって又はペプチドの発現を高める他のいづれかの既
知手段によって増強され得る。すべての場合、Ｔ． ゴ
ンジイタンパク質は、そのＤＮＡ配列がベクター中に機
能的に挿入される場合、発現されるであろう。“機能的
に挿入された”とは当業者により十分に理解されるよう
に、正しい読み枠及び配向を意味する。所望により、ハ
イブリッドタンパク質としての産生（たぶん、その後、
切断が行なわれる）が使用されるけれども、典型的に
は、遺伝子はプロモーターから下流に挿入され、そして
その後に停止コドンを従えるであろう。
転換された宿主における遺伝子の複数コピーを含むこと
によって、宿主中で複製することが知られているベクタ
ーを選択することによって、挿入された外因性ＤＮＡ
（たとえばｐＵＣ８；ｐｔａｃ１２；ｐＩＮ− III−ｏ
ｍｐＡ１，２、又は３；ｐＯＴＳ；ｐＡＳ１；又はｐＫ
Ｋ２２３−３）からの多量のタンパク質を産生すること
によって又はペプチドの発現を高める他のいづれかの既
知手段によって増強され得る。すべての場合、Ｔ． ゴ
ンジイタンパク質は、そのＤＮＡ配列がベクター中に機
能的に挿入される場合、発現されるであろう。“機能的
に挿入された”とは当業者により十分に理解されるよう
に、正しい読み枠及び配向を意味する。所望により、ハ
イブリッドタンパク質としての産生（たぶん、その後、
切断が行なわれる）が使用されるけれども、典型的に
は、遺伝子はプロモーターから下流に挿入され、そして
その後に停止コドンを従えるであろう。
【００３３】本発明に従って、組換えＤＮＡ分子及び形
質転換された単細胞生物を調製するために使用され得る
上記一般方法の他に、他の既知の技法及びその変法が本
発明の実施に使用され得る。特に、遺伝子工学に関係す
る技法は、最近、爆発的な成長及び開発を受けて来た。
多くの最近のアメリカ特許は、プラスミド、遺伝的構築
微生物及び本発明の実施に使用され得る遺伝子工学を行
なうための方法を開示する。たとえば、アメリカ特許第
４，２７３，８７５号は、プラスミド及びそれを単離す
る方法を開示する。アメリカ特許第４，３０４，８６３
号は、ハイブリッドプラスミドが構成され、そして細菌
宿主を形質転換するために使用される、遺伝子工学によ
り細菌を産生するための方法を開示する。アメリカ特許
第４，４１９，４５０号は、組換えＤＮＡ研究において
クローニングビークルとして有用なプラスミドを開示す
る。アメリカ特許第４，３６２，８６７号は、組換えｃ
ＤＮＡの構成方法及びクローニング工程において有用で
ある、前記方法によって産生されるハイブリッドヌクレ
オチドを開示する。アメリカ特許第４，４０３，０３６
号は、組換えＤＮＡトランスファーベクターを開示す
る。アメリカ特許第４，３５６，２７０号は、組換えＤ
ＮＡクローニングビークルを開示し、そしてこれは、遺
伝子工学の分野に制限された経験を有する人々のために
特に有用な開示である。なぜならば、それは、遺伝子工
学に使用される多くの用語及びその中に使用される基本
方法の多くを定義するからである。アメリカ特許第４，
３３６，３３６号は、融合遺伝子及びそれの製造方法を
開示する。アメリカ特許第４，３４９，６２９号は、プ
ラスミドベクター及びその産生法及び使用法を開示す
る。アメリカ特許第４，３３２，９０１号は、組換えＤ
ＮＡに有用なクローニングベクターを開示する。これら
の特許のいくつかは、本発明の範囲内に存在しない特定
の遺伝子生成物の産生法を言及するけれども、それらの
中に記載される方法は、遺伝子工学に関係する当業者に
より、本明細書に記載される発明の実施に容易に変性さ
れ得る。
質転換された単細胞生物を調製するために使用され得る
上記一般方法の他に、他の既知の技法及びその変法が本
発明の実施に使用され得る。特に、遺伝子工学に関係す
る技法は、最近、爆発的な成長及び開発を受けて来た。
多くの最近のアメリカ特許は、プラスミド、遺伝的構築
微生物及び本発明の実施に使用され得る遺伝子工学を行
なうための方法を開示する。たとえば、アメリカ特許第
４，２７３，８７５号は、プラスミド及びそれを単離す
る方法を開示する。アメリカ特許第４，３０４，８６３
号は、ハイブリッドプラスミドが構成され、そして細菌
宿主を形質転換するために使用される、遺伝子工学によ
り細菌を産生するための方法を開示する。アメリカ特許
第４，４１９，４５０号は、組換えＤＮＡ研究において
クローニングビークルとして有用なプラスミドを開示す
る。アメリカ特許第４，３６２，８６７号は、組換えｃ
ＤＮＡの構成方法及びクローニング工程において有用で
ある、前記方法によって産生されるハイブリッドヌクレ
オチドを開示する。アメリカ特許第４，４０３，０３６
号は、組換えＤＮＡトランスファーベクターを開示す
る。アメリカ特許第４，３５６，２７０号は、組換えＤ
ＮＡクローニングビークルを開示し、そしてこれは、遺
伝子工学の分野に制限された経験を有する人々のために
特に有用な開示である。なぜならば、それは、遺伝子工
学に使用される多くの用語及びその中に使用される基本
方法の多くを定義するからである。アメリカ特許第４，
３３６，３３６号は、融合遺伝子及びそれの製造方法を
開示する。アメリカ特許第４，３４９，６２９号は、プ
ラスミドベクター及びその産生法及び使用法を開示す
る。アメリカ特許第４，３３２，９０１号は、組換えＤ
ＮＡに有用なクローニングベクターを開示する。これら
の特許のいくつかは、本発明の範囲内に存在しない特定
の遺伝子生成物の産生法を言及するけれども、それらの
中に記載される方法は、遺伝子工学に関係する当業者に
より、本明細書に記載される発明の実施に容易に変性さ
れ得る。
【００３４】本発明の包含は、本発明のＴ． ゴンジイ
タンパク質及び遺伝子物質の非制限供給が、診断、免疫
化、治療及び研究において使用するために試薬としてこ
れらの物質を使用するハイブリダイゼーションアッセイ
の開発又はいづれか他のタイプのアッセイに使用するた
めに利用できるようになるであろうことにおいて有意で
ある。ハイブリダイゼーションアッセイに遺伝子物質を
使用する方法は、アメリカ特許出願第０８０，４７９号
（１９８７年７月３１日に提出され、そて通例通りに譲
渡された）に開示され、そしてこれは引用により本明細
書に組込まれる。他の発現ベクターに単離されている
Ｔ． ゴンジイｃＤＮＡのトランスファーは、Ｅ．コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＴ． ゴンジイポリペプチド
の発現又は他の宿主におけるそのポリペプチドの発現を
改良する構造体を産生するであろう。
タンパク質及び遺伝子物質の非制限供給が、診断、免疫
化、治療及び研究において使用するために試薬としてこ
れらの物質を使用するハイブリダイゼーションアッセイ
の開発又はいづれか他のタイプのアッセイに使用するた
めに利用できるようになるであろうことにおいて有意で
ある。ハイブリダイゼーションアッセイに遺伝子物質を
使用する方法は、アメリカ特許出願第０８０，４７９号
（１９８７年７月３１日に提出され、そて通例通りに譲
渡された）に開示され、そしてこれは引用により本明細
書に組込まれる。他の発現ベクターに単離されている
Ｔ． ゴンジイｃＤＮＡのトランスファーは、Ｅ．コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＴ． ゴンジイポリペプチド
の発現又は他の宿主におけるそのポリペプチドの発現を
改良する構造体を産生するであろう。
【００３５】本明細書に開示される主要且つ異なったヌ
クレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを
用いてＴ． ゴンジイタンパク質を発現するこれらの及
び関連する生物体からの遺伝子の単離が特に言及され
る。そのようなプローブは、完全な配列よりも相当に短
かいが、しかし少なくとも１０、好ましくは少なくとも
１４個の長さのヌクレオチドであるべきである。長さ２
０〜５００、特に３０〜２００のヌクレオチドからの中
間のオリゴヌクレオチドが、特に特異的且つ急速に作用
するプローブを供給する。遺伝子の完全な長さまでの長
いオリゴヌクレオチドもまた有用である。
クレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを
用いてＴ． ゴンジイタンパク質を発現するこれらの及
び関連する生物体からの遺伝子の単離が特に言及され
る。そのようなプローブは、完全な配列よりも相当に短
かいが、しかし少なくとも１０、好ましくは少なくとも
１４個の長さのヌクレオチドであるべきである。長さ２
０〜５００、特に３０〜２００のヌクレオチドからの中
間のオリゴヌクレオチドが、特に特異的且つ急速に作用
するプローブを供給する。遺伝子の完全な長さまでの長
いオリゴヌクレオチドもまた有用である。
【００３６】使用法においては、プローブは典型的に
は、検出可能な方法（たとえば32Ｐ、 3Ｈ、ビオチン又
はアビジンによる）によりラベルされ、そして遺伝子が
探究されている生物体の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと共に
インキュベートされる。ハイブリダイゼーションは、一
本鎖及び二本鎖（ハイブリダイズされた）ＤＮＡ（又は
ＤＮＡ／ＲＮＡ）が分離された（典型的にはニトロセル
ロース紙を用いて）後、ラベルによって検出される。オ
リゴヌクレオチドと共に使用するために適切なハイブリ
ダイゼーション技法は良く知られている。Ｂ１遺伝子
は、常に複数コピーで存在するように、特に所望するハ
イブリダイゼーションの標的である。プローブは、容易
な同定を可能にする検出可能なラベルと共に通常使用さ
れるけれども、ラベルされていないオリゴヌクレオチド
もまた、ラベルされたプローブの前駆体として及び二本
鎖ＤＮＡ（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）の直接的な検出法を提
供する方法、たとえばニトロセルロース上での吸収法に
使用するためにも有用てある。従って、用語“オリゴヌ
クレオチドプローブ”は、ラベルされた及びラベルされ
ていない両形を言及する。次の例は、本発明をより理解
するために例示的に与えられているが、しかし本発明を
限定するものではない。
は、検出可能な方法（たとえば32Ｐ、 3Ｈ、ビオチン又
はアビジンによる）によりラベルされ、そして遺伝子が
探究されている生物体の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと共に
インキュベートされる。ハイブリダイゼーションは、一
本鎖及び二本鎖（ハイブリダイズされた）ＤＮＡ（又は
ＤＮＡ／ＲＮＡ）が分離された（典型的にはニトロセル
ロース紙を用いて）後、ラベルによって検出される。オ
リゴヌクレオチドと共に使用するために適切なハイブリ
ダイゼーション技法は良く知られている。Ｂ１遺伝子
は、常に複数コピーで存在するように、特に所望するハ
イブリダイゼーションの標的である。プローブは、容易
な同定を可能にする検出可能なラベルと共に通常使用さ
れるけれども、ラベルされていないオリゴヌクレオチド
もまた、ラベルされたプローブの前駆体として及び二本
鎖ＤＮＡ（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）の直接的な検出法を提
供する方法、たとえばニトロセルロース上での吸収法に
使用するためにも有用てある。従って、用語“オリゴヌ
クレオチドプローブ”は、ラベルされた及びラベルされ
ていない両形を言及する。次の例は、本発明をより理解
するために例示的に与えられているが、しかし本発明を
限定するものではない。
【００３７】例 第１表に示される配列を有する遺伝子物質を、下記のよ
うにして単離した。
うにして単離した。
【００３８】材料及び方法 Ａ．寄生体材料 本明細書に記載されるほとんどの研究は、トキソプラス
マ研究者の間で最っとも日常に使用される株であるトキ
ソプラスマ ゴンジイのＲＨ株を使用する〔 Pfefferko
rnなど. 、Exp. Parasitol. (1976) 39： 365〜376
〕。実験室における連続した継代のその長い歴史によ
れば、それは動物中においてひじょうに毒性であり、そ
して多量の材料を得るために理想的にする培養物中で急
速に増殖する。しかしながら、それは、ネコにおいて、
完全な生殖循環を行なう能力を失った。従って、つい最
近、完全な生物学的機能を保持するが、しかしよりゆっ
くりと増殖する“Ｃ”及び“Ｐ”株の単離体がまた使用
された〔 Pfefferkornなど. 、J. Parasitol. (1977)
63： 158〜159 及びWareなど．、Infect. Immun. (198
7) 55： 778〜783 〕。
マ研究者の間で最っとも日常に使用される株であるトキ
ソプラスマ ゴンジイのＲＨ株を使用する〔 Pfefferko
rnなど. 、Exp. Parasitol. (1976) 39： 365〜376
〕。実験室における連続した継代のその長い歴史によ
れば、それは動物中においてひじょうに毒性であり、そ
して多量の材料を得るために理想的にする培養物中で急
速に増殖する。しかしながら、それは、ネコにおいて、
完全な生殖循環を行なう能力を失った。従って、つい最
近、完全な生物学的機能を保持するが、しかしよりゆっ
くりと増殖する“Ｃ”及び“Ｐ”株の単離体がまた使用
された〔 Pfefferkornなど. 、J. Parasitol. (1977)
63： 158〜159 及びWareなど．、Infect. Immun. (198
7) 55： 778〜783 〕。
【００３９】寄生体は一般的に、培養されたヒト***線
維芽細胞（ＨＦＦ）の単層においてイン ビトロで増殖
された。典型的には、ＲＨ株を用いて感染された培養物
を、４８〜７２時間ごとに、約１：５０の希釈度で感染
されていない単層に接種することによって維持した。こ
れは、感染された培養物の３個のＴ１７５フラスコから
約１０9 個の寄生体を産生する。寄生体を、 Hoshino-S
himizuなど. 、J. Parasitol (1980) 66： 989〜991 に
記載のようにして、注射器を通してのトリプシン化され
た細胞の通過及びカラムクロマトグラフィーによるＨＦ
Ｆ残骸の除去により生じる細胞溶解物として収穫され
た。
維芽細胞（ＨＦＦ）の単層においてイン ビトロで増殖
された。典型的には、ＲＨ株を用いて感染された培養物
を、４８〜７２時間ごとに、約１：５０の希釈度で感染
されていない単層に接種することによって維持した。こ
れは、感染された培養物の３個のＴ１７５フラスコから
約１０9 個の寄生体を産生する。寄生体を、 Hoshino-S
himizuなど. 、J. Parasitol (1980) 66： 989〜991 に
記載のようにして、注射器を通してのトリプシン化され
た細胞の通過及びカラムクロマトグラフィーによるＨＦ
Ｆ残骸の除去により生じる細胞溶解物として収穫され
た。
【００４０】Ｂ．遺伝子ライブラリィー Ｔ． ゴンジイのための３種の遺伝子ライブラリィー
を、本発明者の実験室で構成した。他にことわらないか
ぎり、すべてのライブラリィーは、メチル化された挿入
体にＥｃｏＲＩリンカーを付加し、そしてベクターのＥ
ｃｏＲＩ部位中にクローニングすることによって構成さ
れたλｇｔ１１組換え体を含む。これらは次のものであ
る：
を、本発明者の実験室で構成した。他にことわらないか
ぎり、すべてのライブラリィーは、メチル化された挿入
体にＥｃｏＲＩリンカーを付加し、そしてベクターのＥ
ｃｏＲＩ部位中にクローニングすることによって構成さ
れたλｇｔ１１組換え体を含む。これらは次のものであ
る：
【００４１】１．λＲＨｇ１、すなわちＲＨ株からの針
で剪断されたゲノムＤＮＡのライブラリィー、 ２．ＣＲＨｇ１、すなわちコスミドベクターｃ２ＸＢ
（ Batesなど. 、Gene (1983) 26： 137〜146 ）のＢａ
ｍＨＩ部位中に挿入された一部Ｓａｕ３Ａにより消化さ
れたＲＨゲノムＤＮＡのライブラリィー、及び ３．λＲＨｃ２、すなわち本発明者の実験室で調製され
たＲＨ株タキツォイトｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリィ
ー。ライブラリィーは、 Huynhなど．、In D. M. Glove
r (ed)： DNA Cloning, Oxford : IRL Press (1985) 49
〜78ページに記載されるようにして構成され、そして操
作された。
で剪断されたゲノムＤＮＡのライブラリィー、 ２．ＣＲＨｇ１、すなわちコスミドベクターｃ２ＸＢ
（ Batesなど. 、Gene (1983) 26： 137〜146 ）のＢａ
ｍＨＩ部位中に挿入された一部Ｓａｕ３Ａにより消化さ
れたＲＨゲノムＤＮＡのライブラリィー、及び ３．λＲＨｃ２、すなわち本発明者の実験室で調製され
たＲＨ株タキツォイトｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリィ
ー。ライブラリィーは、 Huynhなど．、In D. M. Glove
r (ed)： DNA Cloning, Oxford : IRL Press (1985) 49
〜78ページに記載されるようにして構成され、そして操
作された。
【００４２】Ｃ．抗体 １．モノクローナル抗−トキソプラスマ Ｔ． ゴンジイのＲＨ株の２種のポリペプチド抗原に対
するモノクローナル抗体を使用した。それらの特異性と
一緒に、これらは次のものである： ａ．７Ｂ８：ｐ３０に対する約３０KDの主要表面抗原
〔Kasperなど. 、J. Imm. (1983) 130 ：2407〜241
2〕。 ２．ポリクローナル抗−トキソプラスマ 本発明者により生ぜしめられた抗血清の他に、共同研究
者は次の抗血清を供給した： ａ．ＨＣ１……ＨＣ１０：Ｔ． ゴンジイにより先天的
に感染された幼児からのヒト血清、 ｂ．ＨＡ：感染された成人からのヒト血清、 ｃ．Ｒｐ３０：精製されたｐ３０に対するウサギ抗血清
（ｍｃＡｂ ７Ｂ８への免疫吸収により調製された）、
及び ｄ．ＲＴＬ１及びＲＴＬ２：Ｔ． ゴンジイＲＨ株タキ
ツォイトの溶解物に対するウサギ抗血清。
するモノクローナル抗体を使用した。それらの特異性と
一緒に、これらは次のものである： ａ．７Ｂ８：ｐ３０に対する約３０KDの主要表面抗原
〔Kasperなど. 、J. Imm. (1983) 130 ：2407〜241
2〕。 ２．ポリクローナル抗−トキソプラスマ 本発明者により生ぜしめられた抗血清の他に、共同研究
者は次の抗血清を供給した： ａ．ＨＣ１……ＨＣ１０：Ｔ． ゴンジイにより先天的
に感染された幼児からのヒト血清、 ｂ．ＨＡ：感染された成人からのヒト血清、 ｃ．Ｒｐ３０：精製されたｐ３０に対するウサギ抗血清
（ｍｃＡｂ ７Ｂ８への免疫吸収により調製された）、
及び ｄ．ＲＴＬ１及びＲＴＬ２：Ｔ． ゴンジイＲＨ株タキ
ツォイトの溶解物に対するウサギ抗血清。
【００４３】結果 Ａ．表面抗原ｐ３０ ｃＤＮＡライブラリィー、λＲＨｃ２をスクリーンする
ためにｐ３０（Ｒｐ３０）に対するポリクローナル抗血
清を用いた。いくつかの組換え体を初めのスクリーンで
同定し、そしてこれらのうち３種を、陽性シグナルの強
度及び再生度に基づいての追加の試験のために選択し
た。これらの３種の組換え体を、挿入体を単離し、そし
て他のものに対するハイブリダイゼーションプローブと
してそれぞれを用いることによって及び消化されたゲノ
ムＤＮＡのサザンブロット分析により比較した。これか
ら、それらの３種の組換え体は異なった遺伝子を表わす
ことが明らかになり、そしてこれは、少なくとも２種の
組換え体が抗−ｐ３０血清と偶然の交差反応によること
をも包含した。配列及びサザンブロット分析は、それら
の明確なコード機能を確認した。正しいｐ３０遺伝子で
あることを確認するために、ウサギ抗血清が、アクリル
アミドゲルからの適切なバンドを切除し、そしてこれを
ウサギ中に注入することによって、個々の融合タンパク
質に調製された。次に、これらの血清を、Ｔ． ゴンジ
イの溶解物に対するウェスターンブロット分析に使用し
た。１つのクローン、すなわちλＴｃ３０．５に対する
抗血清のみが、ｐ３０に対する反応性を示した。この血
清はまた、溶解物における他の物質に対する反応性も示
した。これは、同時移動物質よりもむしろｐ３０であっ
たことが、精製されたｐ３０と抗血清との反応性から明
らかである。他の２種のクローンは、明らかに別々の遺
伝子であり、そてし多分、単に偶然交差反応したに過ぎ
ない。
ためにｐ３０（Ｒｐ３０）に対するポリクローナル抗血
清を用いた。いくつかの組換え体を初めのスクリーンで
同定し、そしてこれらのうち３種を、陽性シグナルの強
度及び再生度に基づいての追加の試験のために選択し
た。これらの３種の組換え体を、挿入体を単離し、そし
て他のものに対するハイブリダイゼーションプローブと
してそれぞれを用いることによって及び消化されたゲノ
ムＤＮＡのサザンブロット分析により比較した。これか
ら、それらの３種の組換え体は異なった遺伝子を表わす
ことが明らかになり、そしてこれは、少なくとも２種の
組換え体が抗−ｐ３０血清と偶然の交差反応によること
をも包含した。配列及びサザンブロット分析は、それら
の明確なコード機能を確認した。正しいｐ３０遺伝子で
あることを確認するために、ウサギ抗血清が、アクリル
アミドゲルからの適切なバンドを切除し、そしてこれを
ウサギ中に注入することによって、個々の融合タンパク
質に調製された。次に、これらの血清を、Ｔ． ゴンジ
イの溶解物に対するウェスターンブロット分析に使用し
た。１つのクローン、すなわちλＴｃ３０．５に対する
抗血清のみが、ｐ３０に対する反応性を示した。この血
清はまた、溶解物における他の物質に対する反応性も示
した。これは、同時移動物質よりもむしろｐ３０であっ
たことが、精製されたｐ３０と抗血清との反応性から明
らかである。他の２種のクローンは、明らかに別々の遺
伝子であり、そてし多分、単に偶然交差反応したに過ぎ
ない。
【００４４】λＴｃ３０．５クローンを完全に配列決定
し、そしてすでに配列決定されている他のｃＤＮＡクロ
ーンを単離するために使用した。これらから、ｐ３０コ
ード領域のための完全な配列が由来された（第１表を参
照のこと）。第１図は、予測されるアミノ酸配列の疎水
性分析を示す。第一次翻訳生成物は、正確なアミノ末端
は直接的なタンパク質配列決定なしには決定され得ない
けれども、予測される３６，２１０KDのＭｒを有する。
それはまた、表面抗原のために予測されるように、その
Ｎ−末端で可能性ある疎水性シグナルペプチドを有す
る。それは、ｐ３０が糖タンパク質であることを指摘す
る従来の結果と一致する１つの予測されるＮ−グリコシ
ル化部位（残基２６７）を有する。最後に、それは、い
づれの荷電された残基をも後に有さない疎水性Ｃ−末端
を有する。これは、明らかに、トクパノソーマにおける
本来、報告されている工程の診断に役立ち、そしてそれ
によって、疎水性ポリペプチドセグメントが糖類脂質ア
ンカーにより置換される。そのような工程は、現在、リ
ーシュマニア及びプラスモジウムの主要表面抗原のため
に生じることが知られている。
し、そしてすでに配列決定されている他のｃＤＮＡクロ
ーンを単離するために使用した。これらから、ｐ３０コ
ード領域のための完全な配列が由来された（第１表を参
照のこと）。第１図は、予測されるアミノ酸配列の疎水
性分析を示す。第一次翻訳生成物は、正確なアミノ末端
は直接的なタンパク質配列決定なしには決定され得ない
けれども、予測される３６，２１０KDのＭｒを有する。
それはまた、表面抗原のために予測されるように、その
Ｎ−末端で可能性ある疎水性シグナルペプチドを有す
る。それは、ｐ３０が糖タンパク質であることを指摘す
る従来の結果と一致する１つの予測されるＮ−グリコシ
ル化部位（残基２６７）を有する。最後に、それは、い
づれの荷電された残基をも後に有さない疎水性Ｃ−末端
を有する。これは、明らかに、トクパノソーマにおける
本来、報告されている工程の診断に役立ち、そしてそれ
によって、疎水性ポリペプチドセグメントが糖類脂質ア
ンカーにより置換される。そのような工程は、現在、リ
ーシュマニア及びプラスモジウムの主要表面抗原のため
に生じることが知られている。
【００４５】予測されたアミノ酸配列を用いて、臭化シ
アンフラグメントの大きさを予測することができる。そ
のデータは、２種の大フラグメントを示し、そしてその
１つはチロシンを有する。 125Ｉによりラベルされたｐ
３０を用いて、臭化シアンは、いくつかの小さなフラグ
メントと共に、予測された大きさ（１１KD）の単一の大
フラグメント（ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り）を生成せしめる。さらに、そのポリペプチド配列
は、電荷−シフト免疫電気泳動によりｐ３０についてこ
れまで指摘されたように、一般的にタンパク質について
の実質的な疎水性を予測する。これらの結果はさらに、
組換え体がｐ３０をコードすることを確認する。
アンフラグメントの大きさを予測することができる。そ
のデータは、２種の大フラグメントを示し、そしてその
１つはチロシンを有する。 125Ｉによりラベルされたｐ
３０を用いて、臭化シアンは、いくつかの小さなフラグ
メントと共に、予測された大きさ（１１KD）の単一の大
フラグメント（ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り）を生成せしめる。さらに、そのポリペプチド配列
は、電荷−シフト免疫電気泳動によりｐ３０についてこ
れまで指摘されたように、一般的にタンパク質について
の実質的な疎水性を予測する。これらの結果はさらに、
組換え体がｐ３０をコードすることを確認する。
【００４６】推定上のｐ３０遺伝子は、一倍体ゲノム当
たり１つのコピーで存在し、そして１．５kbのｍＲＮＡ
をコードする。ノザン分析のシグナル強度（そのバンド
は０．２５時間で容易に明確になる）及びｃＤＮＡライ
ブラリィーにおけるこの遺伝子のためのｃＤＮＡの数
（１０，０００個の組換えファージ当たり少なくとも２
０個のプラーク）に基づけば、それは、合計の細胞タン
パク質の約３％で存在するタンパク質に予測されるよう
に多くの情報である。
たり１つのコピーで存在し、そして１．５kbのｍＲＮＡ
をコードする。ノザン分析のシグナル強度（そのバンド
は０．２５時間で容易に明確になる）及びｃＤＮＡライ
ブラリィーにおけるこの遺伝子のためのｃＤＮＡの数
（１０，０００個の組換えファージ当たり少なくとも２
０個のプラーク）に基づけば、それは、合計の細胞タン
パク質の約３％で存在するタンパク質に予測されるよう
に多くの情報である。
【００４７】Ｂ．反復遺伝子Ｂ１ Ｔ． ゴンジイの溶解物に対して生ぜしめられたマウス
抗血清は、ポリクローナル抗血清の利用の前、可能性あ
る抗原をコードする遺伝子を同定する手段として、剪断
されたゲノムライブラリィー、λＲＨｇ１をスクリーン
するために使用された。いくつかの組換え体が同定さ
れ、このほとんどは、Ｔ． ゴンジイゲノムに２．２kb
の並列反復体として存在する同じ遺伝子（ここでは、Ｂ
１として任意に言及される）を表わした。部分的なｃＤ
ＮＡクローン（ポリＡ末端を含む）は、λＲＨｃ２ライ
ブラリィーから同定され、そして配列決定された。完全
な読み取り枠の一部が同定され（少なくとも１つのイン
トロンがゲノム及びｃＤＮＡ配列を比較することからこ
れまで明らかである）；転写の配向及び転写単位のおお
よその末端点が示される。くり返しての試みにもかかわ
らず、抗血清に対する反応性〔そのような反応性は、フ
ァージリフト上で容易に再現できるが、しかし誘発され
た溶原体（lysogen ）のウェスターンブロットにおいて
は決して観察されなかった〕を担当する組換えファージ
の生成物を同定することはできなかった。この反応性の
欠乏が、イン ビボでの抗原の同定を妨げた。なぜなら
ば、細菌性生成物が精製のために同定され得ず、そして
“抗体選択”が不成功であった（たぶん、血清中の抗−
Ｂ１抗体の不十分な結合活性及び／又は力価のためであ
る）からである。有意には、遺伝子は、分析される他の
すべての４種のＴ． ゴンジイ株（ＡＩＤＳ患者からの
最近の単離物を含む）のゲノム中に維持される（Ｅｃｏ
ＲＩ消化物のサザンブロット分析により評価される場
合）。
抗血清は、ポリクローナル抗血清の利用の前、可能性あ
る抗原をコードする遺伝子を同定する手段として、剪断
されたゲノムライブラリィー、λＲＨｇ１をスクリーン
するために使用された。いくつかの組換え体が同定さ
れ、このほとんどは、Ｔ． ゴンジイゲノムに２．２kb
の並列反復体として存在する同じ遺伝子（ここでは、Ｂ
１として任意に言及される）を表わした。部分的なｃＤ
ＮＡクローン（ポリＡ末端を含む）は、λＲＨｃ２ライ
ブラリィーから同定され、そして配列決定された。完全
な読み取り枠の一部が同定され（少なくとも１つのイン
トロンがゲノム及びｃＤＮＡ配列を比較することからこ
れまで明らかである）；転写の配向及び転写単位のおお
よその末端点が示される。くり返しての試みにもかかわ
らず、抗血清に対する反応性〔そのような反応性は、フ
ァージリフト上で容易に再現できるが、しかし誘発され
た溶原体（lysogen ）のウェスターンブロットにおいて
は決して観察されなかった〕を担当する組換えファージ
の生成物を同定することはできなかった。この反応性の
欠乏が、イン ビボでの抗原の同定を妨げた。なぜなら
ば、細菌性生成物が精製のために同定され得ず、そして
“抗体選択”が不成功であった（たぶん、血清中の抗−
Ｂ１抗体の不十分な結合活性及び／又は力価のためであ
る）からである。有意には、遺伝子は、分析される他の
すべての４種のＴ． ゴンジイ株（ＡＩＤＳ患者からの
最近の単離物を含む）のゲノム中に維持される（Ｅｃｏ
ＲＩ消化物のサザンブロット分析により評価される場
合）。
【００４８】この遺伝子の反復性質は、ハイブリダイゼ
ーションアッセイ、たとえば１９８７年７月３１日に提
出された先願第０８０，４７９号に記載されるアッセイ
による直接的な診断のための標的としてのその利用性を
増強する。本明細書に言及されるすべての出版物及び特
許出願は、本発明が関与する当業者のレベルの表示であ
る。すべての出版物及び特許出願を、引用により本明細
書に組込む。本発明は、十分に説明されたけれども、請
求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
ーションアッセイ、たとえば１９８７年７月３１日に提
出された先願第０８０，４７９号に記載されるアッセイ
による直接的な診断のための標的としてのその利用性を
増強する。本明細書に言及されるすべての出版物及び特
許出願は、本発明が関与する当業者のレベルの表示であ
る。すべての出版物及び特許出願を、引用により本明細
書に組込む。本発明は、十分に説明されたけれども、請
求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
【図１】図１は、親水性対本発明のｐ３０遺伝子配列に
よりコードされるポリペプチドをプロットするグラフで
ある。
よりコードされるポリペプチドをプロットするグラフで
ある。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年２月２３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】
【化２】
【化３】 を含んで成るＤＮＡ分子。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:90） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 バーグ，ジェイムズ エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94404, フォスター シティ，ペガサス レーン 648 (72)発明者 カスパー，ロイド エイチ. アメリカ合衆国，バーモント 05055，ノ ーリッジ，ウィリー ヒル ロード
Claims (13)
- 【請求項１】 ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であって、トキソ
プラスマ ゴンジイのｐ３０又はＢ１ペプチドをコード
するヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ又はＲＮＡ分
子。 - 【請求項２】 前記分子が、下記ｐ３０配列： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 〔配列中、Ａはデオキシアデニルであり；Ｇはデオキシ
グアニルであり；Ｃはデオキシシトシルであり；Ｔはデ
オキシチミジルであり；ＪはＡ又はＧであり；ＫはＴ又
はＣであり；ＬはＡ，Ｔ，Ｃ又はＧであり；ＭはＡ，Ｃ
又はＴであり；続くＹがＡ又はＧである場合、ＸはＴ又
はＣであり、そして続くＹがＣ又はＴである場合、Ｃで
あり；前のＸがＣである場合、ＹはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴで
あり、そして前のＸがＴである場合、Ａ又はＧであり；
続くＺがＧ又はＡである場合、ＷはＣ又はＡであり、そ
して続くＺがＣ又はＴである場合、Ｃであり；前のＷが
Ｃである場合、ＺはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴであり、そして前
のＷがＡである場合、Ａ又はＧであり；続くＳがＡ，
Ｇ，Ｃ又はＴである場合、ＱＲはＴＣであり、そして続
くＳがＴ又はＣである場合、ＡＧであり；前のＱＲがＴ
Ｃである場合、ＳはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴであり、そして前
のＱＲがＡＧである場合、Ｔ又はＣであり；下側の数字
は、ヌクレオチド配列が遺伝子コードに対応するための
ペプチド配列中のアミノ酸位置（該アミノ酸位置はアミ
ノ末端から数えられる）を示し；そして上側の数字は、
５′末端から測定されるヌクレオチド位置を示す〕から
選択される配列を含んで成る請求項１に記載の分子。 - 【請求項３】 前記分子が、下記ｐ３０配列： 【化６】 【化７】 を有する請求項２に記載の分子。
- 【請求項４】 前記分子が前記Ｂ１配列を有する、請求
項２に記載の分子。 - 【請求項５】 前記配列の少なくとも１つのコピーが機
能的な組換えＤＮＡベクター内に存在する、請求項１に
記載の分子。 - 【請求項６】 遺伝子操作された微生物であって、請求
項５に記載のベクターを含む微生物。 - 【請求項７】 単離されたオリゴヌクレオチドであっ
て、請求項２に記載のヌクレオチド配列から選択された
少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む上記オ
リゴヌクレオチド。 - 【請求項８】 請求項１に記載のヌクレオチド配列によ
りコードされた遺伝子操作されたペプチド。 - 【請求項９】 前記ペプチドがグリコシル化されていな
い、請求項８に記載のペプチド。 - 【請求項１０】 請求項２に記載のヌクレオチド配列に
よりコードされた遺伝子操作されたペプチドであって、
トキソプラスマ ゴンジイの抗原と免疫学的に交差反応
性であるペプチド。 - 【請求項１１】 医薬として許容される担体中に請求項
８に記載のペプチドを含むワクチン。 - 【請求項１２】 医薬として許容される担体中に請求項
９に記載のペプチドを含むワクチン。 - 【請求項１３】 医薬として許容される担体中に請求項
１０に記載のペプチドを含むワクチン。
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-
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