JPH1017596A - Removal of antigenic ingredient, nonantigenic peptide composition, nonantigenic stabilizer and physiologically active substance - Google Patents
Removal of antigenic ingredient, nonantigenic peptide composition, nonantigenic stabilizer and physiologically active substanceInfo
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- JPH1017596A JPH1017596A JP8193958A JP19395896A JPH1017596A JP H1017596 A JPH1017596 A JP H1017596A JP 8193958 A JP8193958 A JP 8193958A JP 19395896 A JP19395896 A JP 19395896A JP H1017596 A JPH1017596 A JP H1017596A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、コラーゲンまたは
ゼラチン由来のペプチド組成物から抗原性成分を除去す
る方法ならびにその方法により製造された非抗原性ペプ
チド組成物、非抗原性安定化剤および生理活性物質に関
する。[0001] The present invention relates to a method for removing an antigenic component from a peptide composition derived from collagen or gelatin, a non-antigenic peptide composition produced by the method, a non-antigenic stabilizer and a physiological activity. About the substance.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、抗原性成分またはアレルゲン性成
分を除去する方法として、吸着、アフィニティー、イオ
ン交換などの原理を用いたクロマトグラフィーの技術が
用いられている（特開昭５２−４７００９号公報、特開
昭５２−９０６２０号公報、特開昭５５−１３５５９６
号公報、特開昭５７−５９８１５号公報、特開昭６０−
１２６２１１号公報、特開昭６２−１９１０４１号公
報、特開昭６２−２６６０７２号公報、特開昭６３−２
１２３６９号公報および特開平０７−３９３７５号公報
参照）。また、その他の方法として、限外ろ過、遠心分
離、酵素処理など（特開昭６０−９７９１８号公報およ
び特開昭６０−２１４７３８号公報参照）の方法があ
り、これらの方法は単独または併用することによって抗
原性成分またはアレルゲン性成分の除去に利用される。2. Description of the Related Art Conventionally, as a method for removing an antigenic component or an allergenic component, a chromatography technique using principles such as adsorption, affinity and ion exchange has been used (Japanese Patent Application Laid-Open No. 52-70009). JP-A-52-90620 and JP-A-55-135596.
JP, JP-A-57-59815, JP-A-60-59815
126121, JP-A-62-191041, JP-A-62-266072, JP-A-63-2
No. 12369 and JP-A-07-39375). Other methods include ultrafiltration, centrifugation, and enzyme treatment (see JP-A-60-97918 and JP-A-60-214737), and these methods are used alone or in combination. Thus, it is used for removing antigenic components or allergenic components.
【０００３】一方、コラーゲンやゼラチンあるいはこれ
らを分解したペプチド組成物は、アレルギー反応を引き
起こし難いことが知られている。その経験に基づいて、
これらコラーゲン等は、各種生理活性物質、例えば、ウ
イルス、ワクチン、サイトカイン、バイオ製剤等の安定
化剤として広く使用されるようになった。On the other hand, it is known that collagen, gelatin or a peptide composition obtained by decomposing them is unlikely to cause an allergic reaction. Based on that experience,
These collagens and the like have been widely used as stabilizers for various physiologically active substances, for example, viruses, vaccines, cytokines, and biopharmaceuticals.
【０００４】ところが、抗原性／アレルゲン性がほとん
どないといわれているコラーゲンやゼラチンに対しても
アナフィラキシーなどの副作用を引き起こす患者が最近
少しずつ増えており、社会問題化し始めている。本来、
各種疾病を治療および予防するために使用される生理活
性物質の医薬品製剤が原因で、このような副作用が引き
起こされることはあってはならないことである。しかし
ながら、従来の吸着、アフィニティー、イオン交換など
の原理を用いたクロマトグラフィーの方法や限外ろ過、
遠心分離、酵素処理などの方法では、コラーゲンやゼラ
チンなどの抗原性成分を十分に除去することはできなか
った。[0004] However, patients who cause side effects such as anaphylaxis with respect to collagen and gelatin, which are said to have little antigenicity / allergenicity, are gradually increasing recently, and are beginning to become a social problem. Originally,
Pharmaceutical formulations of bioactive substances used to treat and prevent various diseases should not cause such side effects. However, conventional adsorption, affinity, chromatography methods using principles such as ion exchange and ultrafiltration,
Antigen components such as collagen and gelatin could not be sufficiently removed by methods such as centrifugation and enzyme treatment.
【０００５】この問題を解決するため、本発明者らによ
り、コラーゲンまたはゼラチン由来のペプチド組成物で
あって、抗原性のないものが開発されている（特開平７
−８２２９９号参照）。すなわち、コラーゲン分解酵素
を遊離の状態または各種担体に固定化させた状態で、コ
ラーゲン成分またはゼラチン成分を含む原材料に作用さ
せ、その特異的な酵素分解により、抗原性がなく、コラ
ーゲン本来の特徴的なアミノ酸配列である（Ｇｌｙ−Ｘ
−Ｙ）n を保持した分子量範囲が１，０００以下のペプ
チド組成物を高収率で得ることができる。[0005] In order to solve this problem, the present inventors have developed a peptide composition derived from collagen or gelatin and having no antigenicity (Japanese Patent Application Laid-Open No.
-82299). That is, the collagen-degrading enzyme is allowed to act on a raw material containing a collagen component or a gelatin component in a free state or in a state of being immobilized on various carriers. Amino acid sequence (Gly-X
-Y) A peptide composition having a molecular weight range of 1,000 or less retaining n can be obtained in high yield.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特開平
７−８２２９９号公報に示す技術では、コラーゲンまた
はゼラチンの分解方法が限定されるため、原料の分解方
法にとらわれない抗原性成分の除去方法の開発が要望さ
れている。また、特開平７−８２２９９号公報に示す技
術では、製造されるペプチド組成物の分子量が１，００
０以下のものに限定されるため、分子量が制限されない
非抗原性ペプチド組成物の開発が要望されている。However, according to the technique disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-82299, the method for decomposing collagen or gelatin is limited. Is required. Further, according to the technique disclosed in JP-A-7-82299, the molecular weight of the peptide composition to be produced is 1,000
Since it is limited to 0 or less, the development of a non-antigenic peptide composition having an unlimited molecular weight is desired.
【０００７】本発明は、このような要望に基づいてなさ
れたもので、コラーゲンまたはゼラチン由来のペプチド
組成物について、原料の分解方法を問わず、また、分子
量に制限を受けずに、抗原性成分を除去する方法ならび
にその方法を用いて製造される非抗原性ペプチド組成
物、非抗原性安定化剤および生理活性物質を提供するこ
とを目的としている。[0007] The present invention has been made based on such a demand, and is intended to provide a peptide composition derived from collagen or gelatin, regardless of the method of decomposing the raw materials and without being restricted by the molecular weight. And a non-antigenic peptide composition, a non-antigenic stabilizer and a physiologically active substance produced by the method.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、逆相系担体または疎水系担体を単独または組み
合わせて使用することにより、分子量１，０００以下の
ペプチドだけではなく、抗原性またはアレルゲン性を示
さない分子量５０，０００以下、好ましくは１，０００
〜２０，０００の範囲にあるペプチド組成物も製造可能
であることを見いだした。各種生理活性物質に対する安
定化効果は高分子成分の方が有効であると考えられてお
り、例えばウロキナーゼは分子量１０，０００以下のゼ
ラチンでは安定化効果がほとんどない（特開昭５４−８
０４０６号公報参照）ことなどから、本発明によるペプ
チド組成物は各種生理活性物質の安定化にとってより有
効性を発揮すると言える。Means for Solving the Problems As a result of earnest studies, the present inventors have found that by using a reversed phase carrier or a hydrophobic carrier alone or in combination, not only peptides having a molecular weight of 1,000 or less but also antigens can be obtained. Molecular weight not showing toxic or allergenic properties is 50,000 or less, preferably 1,000
It has been found that peptide compositions in the range of ２０20,000 can be prepared. The stabilizing effect on various physiologically active substances is considered to be more effective with the high molecular weight component. For example, urokinase has almost no stabilizing effect with gelatin having a molecular weight of 10,000 or less (Japanese Patent Application Laid-Open No. 54-8 / 1979).
0406), it can be said that the peptide composition according to the present invention exhibits more effectiveness for stabilizing various physiologically active substances.
【０００９】通常、分子量数千以上のペプチドの場合、
分解する前の原料の抗原性を一部なりとも保持している
のが一般的である。事実、本発明者らはコラーゲンやゼ
ラチンを酸や加熱によって調製したゼラチン分解物の場
合、残存抗原活性が１／１０〜１／５０程度残っている
ことを確認している。また、一般的なプロテアーゼ酵
素、例えば、ペプシン、トリプシン、パパイン、キモト
リプシン、パンクレアチンあるいはアクチナーゼなどを
単独あるいは２種以上混合して酵素分解したゼラチン分
解物の場合も、残存抗原活性が１／２０〜１／２００程
度残っていることを確認している。ところが、本発明に
よる抗原性成分の除去方法をこれらコラーゲンやゼラチ
ンの分解物に使用した結果、酸加水分解したゼラチン分
解物および、一般的なプロテアーゼで酵素分解したゼラ
チン分解物のいずれの場合も、抗原性またはアレルゲン
性をほとんど示さないペプチド組成物を製造可能である
ことを見いだした。Usually, in the case of a peptide having a molecular weight of several thousands or more,
It is common to retain some of the antigenicity of the raw material prior to degradation. In fact, the present inventors have confirmed that in the case of a hydrolyzate of gelatin prepared by preparing collagen or gelatin by acid or heating, about 1/10 to 1/50 of the remaining antigen activity remains. Also, in the case of a gelatin degradation product obtained by enzymatic degradation of common protease enzymes such as pepsin, trypsin, papain, chymotrypsin, pancreatin or actinase alone or in combination of two or more, the residual antigen activity is 1/20 to It has been confirmed that about 1/200 remains. However, as a result of using the method for removing an antigenic component according to the present invention on these collagen and gelatin decomposed products, in both cases of acid hydrolyzed gelatin decomposed products and gelatin degraded products enzymatically decomposed with common proteases, It has been found that peptide compositions showing little antigenicity or allergenicity can be produced.
【００１０】本発明に係る抗原性成分の除去方法は、コ
ラーゲンまたはゼラチン由来のペプチド組成物から抗原
性成分を除去する方法であって、前記ペプチド組成物を
逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーまた
はその両方で処理することを特徴とする。[0010] The method for removing an antigenic component according to the present invention is a method for removing an antigenic component from a peptide composition derived from collagen or gelatin, wherein the peptide composition is subjected to reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography or its chromatography. It is characterized in that both processes are performed.
【００１１】ペプチド組成物の原材料のコラーゲンまた
はゼラチンは、牛や豚、その他の動物由来の新鮮な骨、
皮、腱、軟骨または鮫などの魚皮などを原料として調製
される。[0011] Collagen or gelatin, which is a raw material of the peptide composition, is made of fresh bone derived from cows, pigs, and other animals.
It is prepared using skin, tendon, cartilage or fish skin such as shark as a raw material.
【００１２】前記ペプチド組成物には、コラーゲンまた
はゼラチンを、プロテアーゼ酵素の１種または２種以上
を用いて分解したものを用いることができる。The peptide composition may be obtained by decomposing collagen or gelatin with one or more protease enzymes.
【００１３】その原料の酵素分解に用いるコラーゲン分
解酵素は、プロテアーゼ酵素、例えば、コラゲナーゼ、
ペプシン、トリプシン、パパイン、キモトリプシン、パ
ンクレアチンまたはアクチナーゼなどを単独または２種
以上混合して使用することができるが、好ましくはクロ
ストリジウム・ヒストリチクム（Clostridium histolyt
icum）、ストレプトミセス・パルブルス（Streptomyces
parvulus)などの細菌、放線菌または真菌など由来で、
コラーゲン特有のアミノ酸配列：（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n
のグリシンのアミノ基側を特異的に切断するコラゲナー
ゼを用いた方がよい。また、遺伝子工学的に産生される
プロテアーゼ酵素を用いてもよい。The collagen-degrading enzyme used for the enzymatic degradation of the raw material is a protease enzyme, for example, collagenase,
Pepsin, trypsin, papain, chymotrypsin, pancreatin, actinase and the like can be used alone or in combination of two or more. Preferably, Clostridium histolytum (Clostridium histolytum) is used.
icum), Streptomyces parvulus
parvulus), bacteria, actinomycetes or fungi, etc.
Amino acid sequence specific to collagen: (Gly-XY) n
It is better to use collagenase that specifically cleaves the amino side of glycine. Further, a protease enzyme produced by genetic engineering may be used.
【００１４】コラーゲン分解酵素の使用方法については
限定されず、遊離の形で使用しても、固定化酵素として
使用しても良い。また、これらの酵素をバイオリアクタ
ーに組み込んで使用する場合の型式については（a) 充
填層型、（b) 膜型または（c) 流動層型など、さまざ
まな型式を採用することが可能である。The method of using the collagenase is not limited, and may be used in a free form or as an immobilized enzyme. In addition, as for the type when these enzymes are incorporated into a bioreactor, various types such as (a) packed bed type, (b) membrane type or (c) fluidized bed type can be adopted. .
【００１５】前記ペプチド組成物は、コラーゲンまたは
ゼラチンを酸または加熱によって分解したものであって
もよい。この場合、加水分解に用いる酸は、無機酸、例
えば、塩酸、硫酸など一般的に使用されている強酸であ
ればいずれでも良い。この酸を添加した溶液の加熱温度
は６０〜１２０℃、好ましくは７０〜９０℃であり、加
熱時間は０．５〜２時間が好ましいが、必要とする分解
率に合わせて温度と時間を設定してもかまわない。The peptide composition may be one obtained by decomposing collagen or gelatin by acid or heating. In this case, the acid used for the hydrolysis may be any commonly used strong acid such as an inorganic acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid. The heating temperature of the solution to which the acid is added is 60 to 120 ° C., preferably 70 to 90 ° C., and the heating time is preferably 0.5 to 2 hours, but the temperature and time are set according to the required decomposition rate. It does not matter.
【００１６】本発明に係る方法で、逆相クロマトグラフ
ィーの逆相系担体には、官能基が、オクタデシル基（Ｏ
ＤＳ）、オクチル基（Ｃ８）、ブチル基（Ｃ４）または
トリメチルシリル基（ＴＭＳ）のものを用いることがで
きる。また、疎水クロマトグラフィーの疎水系担体に
は、官能基が、フェニル基またはブチル基（Ｃ４）のも
のを用いることができる。担体の基材は、シリカゲル、
カーボン、ポリマーのいずれでも良く、用途によって使
い分ければよい。逆相系担体の細孔径は特定する必要が
ないが、分離するペプチド成分の分子量によっては８ｎ
ｍ、１２ｎｍまたは３０ｎｍが適している。In the method according to the present invention, the functional group is an octadecyl group (O
DS), octyl group (C8), butyl group (C4) or trimethylsilyl group (TMS). Further, as the hydrophobic carrier for the hydrophobic chromatography, those having a phenyl group or a butyl group (C4) as a functional group can be used. The base material of the carrier is silica gel,
Either carbon or polymer may be used, depending on the purpose. It is not necessary to specify the pore size of the reversed phase carrier, but 8n depends on the molecular weight of the peptide component to be separated.
m, 12 nm or 30 nm are suitable.
【００１７】逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグ
ラフィーまたはその両方で処理する方法は、分解物から
抗原性成分を分離、除去できればいかなる方法であって
もよいが、除去効率を高めるため、カラム式を使用する
のが好ましい。その処理方法は、逆相系担体または疎水
系担体をカラム、シリンジ、ロートまたはタンクに充填
して行ってもよい。逆相クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィーまたはその両方で処理するとき、移動相
には、ｐＨ調整剤としてトリフルオロ酢酸、塩酸、ギ
酸、酢酸、ピリジン、トリメチルアミン、アンモニア、
炭酸アンモニウム、水酸化ナトリウムなどを使用しても
よい。The method of treating by reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography or both methods may be any method as long as the antigenic component can be separated and removed from the degraded product. Is preferred. The treatment method may be performed by filling a column, a syringe, a funnel or a tank with a reversed phase carrier or a hydrophobic carrier. When performing reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, or both, the mobile phase contains trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, formic acid, acetic acid, pyridine, trimethylamine, ammonia, as a pH adjuster.
Ammonium carbonate, sodium hydroxide and the like may be used.
【００１８】逆相クロマトグラフィーで処理する場合、
逆相系担体に保持されたペプチド成分を溶出させる溶離
液としては水、アセトニトリル、エタノール、メタノー
ルを単独または２液以上組み合わせて使用するのが一般
的であるが、これに限るものではない。In the case of processing by reverse phase chromatography,
As an eluent for eluting the peptide component retained on the reversed phase carrier, water, acetonitrile, ethanol, and methanol are generally used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
【００１９】疎水クロマトグラフィーで処理する場合、
疎水系担体にペプチド成分または抗原性成分を保持させ
るために、硫安などを分解物液に添加するのが一般的で
あるが、官能基の種類によって適時、その添加濃度を替
えた方が良い。あるいは、水または低濃度の硫安などの
水溶液によって抗原性成分のみをカラムに保持させても
かまわない。When treated by hydrophobic chromatography,
In order to hold the peptide component or the antigenic component on the hydrophobic carrier, it is common to add ammonium sulfate or the like to the decomposed liquid, but it is better to change the addition concentration as appropriate depending on the type of the functional group. Alternatively, only the antigenic component may be retained on the column by water or an aqueous solution of low-concentration ammonium sulfate or the like.
【００２０】本発明に係る非抗原性安定化剤は、前述の
非抗原性ペプチド組成物を主成分とすることを特徴とす
る。また、本発明に係る生理活性物質は、前述の非抗原
性安定化剤を含有することを特徴とする。The non-antigenic stabilizer according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned non-antigenic peptide composition as a main component. Further, the physiologically active substance according to the present invention is characterized by containing the above-mentioned non-antigenic stabilizer.
【００２１】本発明に係る抗原性成分の除去方法を用い
て製造された非抗原性ペプチド組成物は、アナフィラキ
シー反応を誘発させず、且つ生理活性物質の安定化効果
を有し、非抗原性安定化剤として用いることができる。
本発明に係る非抗原性ペプチド組成物を非抗原性安定化
剤として用いることができる生理活性物質は、例えば、
ウイルス、ワクチン、各種サイトカインまたは抗生物質
である。この「生理活性物質」の概念には、ウイルス、
ワクチン、各種サイトカイン、抗生物質のほか、蛋白
質、酵素、細菌、ホルモン、核酸および抗体などの成
分、またはそれらを有効成分とする治療や予防目的の医
薬製剤が含まれる。この生理活性物質は、遺伝子工学的
手法で調製された抗体または酵素であってもよい。The non-antigenic peptide composition produced by the method for removing an antigenic component according to the present invention does not induce an anaphylactic reaction, has a stabilizing effect on a physiologically active substance, and has a non-antigenic stable It can be used as an agent.
Physiologically active substance that can be used as a non-antigenic stabilizer the non-antigenic peptide composition according to the present invention, for example,
Viruses, vaccines, various cytokines or antibiotics. This concept of "bioactive substance" includes viruses,
In addition to vaccines, various cytokines and antibiotics, components such as proteins, enzymes, bacteria, hormones, nucleic acids and antibodies, or pharmaceutical preparations containing them as active ingredients for treatment or prevention are included. The bioactive substance may be an antibody or an enzyme prepared by a genetic engineering technique.
【００２２】より具体的な生理活性物質の例としては、
インスリン、カリクレイン、アプロチニン、プロラクチ
ン、胎盤性性腺刺激ホルモン、黄体ホルモン、トランス
フォーミング因子類（ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＴＧＦγ
等）、血小板由来因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞成長因
子（ＦＧＦ）、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ
−ＰＡ）、その他刺激因子やサイトカイン類などのホル
モン／蛋白質／サイトカイン；ウロキナーゼ、チトクロ
ームＣ、リボヌクレアーゼ、パパイン、キモトリプシ
ン、ペプシン、トリプシンなどの酵素；プラスミン、ト
ロンビン、アンチトロンビンなどの凝固因子；アデノシ
ントリフォスフェート（ＡＴＰ）、ヌクレオチド、核酸
などの核酸関連物質；セフェム系・ペニシリン系・テト
ラサイクリン系・クロラムフェニコール系・ポリペプチ
ド系などの抗生物質；その他プロスタグランジンなどの
生体成分などが挙げられる。Examples of more specific physiologically active substances include:
Insulin, kallikrein, aprotinin, prolactin, placental gonadotropin, luteinizing hormone, transforming factors (TGFα, TGFβ, TGFγ
Etc.), platelet-derived factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), tissue plasminogen activator (t
-PA) and other hormones / proteins / cytokines such as stimulating factors and cytokines; enzymes such as urokinase, cytochrome C, ribonuclease, papain, chymotrypsin, pepsin and trypsin; clotting factors such as plasmin, thrombin and antithrombin; adenosine triphos Nucleic acid-related substances such as fate (ATP), nucleotides and nucleic acids; antibiotics such as cephem, penicillin, tetracycline, chloramphenicol and polypeptides; and other biological components such as prostaglandins.
【００２３】これら生理活性物質に本発明に係る非抗原
性ペプチド組成物を安定化剤として用いることで、アナ
フィラキシーなどの副作用を引き起こすことのない生理
活性物質などの製剤化が可能となる。By using the non-antigenic peptide composition according to the present invention as a stabilizer for these physiologically active substances, it becomes possible to formulate a physiologically active substance that does not cause side effects such as anaphylaxis.
【００２４】本発明に係る非抗原性ペプチド組成物を非
抗原性安定化剤として用いる場合、全体重量に対し０．
００５〜１５重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％
含有させる。しかしながら、非抗原性安定化剤の生理活
性物質への添加量は、対象となる生理活性物質の種類お
よび剤型などにより異なるので、一様には定まらない。When the non-antigenic peptide composition according to the present invention is used as a non-antigenic stabilizer, it is used in an amount of 0.1% based on the total weight.
005 to 15% by weight, preferably 0.01 to 10% by weight
To be included. However, the amount of the non-antigenic stabilizer added to the physiologically active substance varies depending on the type and dosage form of the target physiologically active substance, and thus cannot be determined uniformly.
【００２５】非抗原性安定化剤の用法は、単独で使用し
ても良いし、目的によっては一般的に使用される他の安
定化剤と併用しても良い。併用される他の一般的な安定
化剤の例としては、ソルビトール、イノシトール、マン
ニトール、サッカロース、乳糖、グルタミン酸ソーダ、
デキストラン、グリセロール、アミノ酸などが挙げられ
る。The non-antigenic stabilizer may be used alone or, depending on the purpose, in combination with other commonly used stabilizers. Examples of other common stabilizers used in combination include sorbitol, inositol, mannitol, saccharose, lactose, sodium glutamate,
Dextran, glycerol, amino acids and the like.
【００２６】本発明に係る非抗原性ペプチド組成物は、
抗原性を消失していると同時にコラーゲンまたはゼラチ
ンに特有のアミノ酸配列を有していることから、各種医
薬品製剤の安定化剤としてだけではなくアレルギー患者
向けの食品のタンパク質源、または外傷性疾患や外科的
治療を受けている患者の輸液製剤成分のひとつとしても
有用である。The non-antigenic peptide composition according to the present invention comprises:
Because it has an amino acid sequence unique to collagen or gelatin at the same time as having lost antigenicity, it is not only a stabilizer for various pharmaceutical preparations, but also a protein source for foods for allergic patients, It is also useful as one of the components of an infusion preparation for patients undergoing surgical treatment.
【００２７】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
るが、これらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限する
ものではない。Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but these examples do not limit the scope of the present invention.
【００２８】[0028]
【実施例１】高純度ゼラチン（宮城化学工業社製）５０
ｇを１，０００ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩
衝液（ｐＨ ７．４）／０．１Ｍ ＮａＣｌに加温しな
がら溶解後、５０℃に冷却した。酵素分解用の固定化酵
素は、１００ｍｇのコラゲナーゼ（ワシントン社製）を
５０ｇのキトパール（富士紡績社製）に結合させて調製
し、バイオリアクターに組み込んで使用した。バイオリ
アクターの形態は、充填層型とし、具体的には本固定化
酵素を２本の恒温制御付カラムに充填し、カラム間を結
ぶ配管中にｐＨセンサーとｐＨの変化に連動してｐＨ調
整剤が流入する装置を接続して準備した。Example 1 High Purity Gelatin (Miyagi Chemical Industry Co., Ltd.) 50
g was dissolved in 1,000 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) /0.1 M NaCl while heating, and then cooled to 50 ° C. The immobilized enzyme for enzymatic degradation was prepared by binding 100 mg of collagenase (manufactured by Washington, Inc.) to 50 g of chitopearl (manufactured by Fuji Boseki Co., Ltd.), and used in a bioreactor. The form of the bioreactor is a packed bed type. Specifically, this immobilized enzyme is packed into two columns with constant temperature control, and a pH sensor and pH adjustment are performed in a pipe connecting the columns in conjunction with a pH sensor and pH change. It was prepared by connecting a device into which the agent flows.
【００２９】このバイオリアクターに準備した高純度ゼ
ラチン液を流速５０〜８０ｍｌ／ｍｉｎで通液し、温度
３８±１℃、ｐＨ７．４±０．２の条件に保ち、酵素分
解を行った。この酵素分解物液、すなわちペプチド混合
物液を噴霧乾燥機で粉末にした後、再溶解し、２０％ペ
プチド混合物水溶液に調製した。次いで、官能基がオク
タデシル基（ＯＤＳ）、基材がシリカゲルである逆相ク
ロマトグラフィー用担体を充填した高速液体クロマトグ
ラフ用カラム（東ソー社製）に、高速液体クロマトグラ
フ（島津製作所社製）を用いて流速１００ｍｌ／ｍｉｎ
で送液し、ペプチド混合物を吸着させた。０〜３０％メ
タノールのリニアグラジェントにより、抗原性またはア
レルゲン性の成分を含まないペプチド画分を溶出した。
この溶出液を減圧濃縮装置（東京理化器械社製）を用い
て濃縮後、脱塩操作を行って分子量２５，０００以下の
抗原性を全く示さないペプチド組成物を得た。The high-purity gelatin solution prepared in this bioreactor was passed at a flow rate of 50 to 80 ml / min, and was maintained at 38 ± 1 ° C. and pH 7.4 ± 0.2 to perform enzymatic degradation. This enzymatic degradation product solution, that is, the peptide mixture solution was powdered with a spray drier and then redissolved to prepare a 20% peptide mixture aqueous solution. Next, a high-performance liquid chromatograph (manufactured by Shimadzu Corporation) was applied to a column for high-performance liquid chromatography (manufactured by Tosoh Corporation) packed with a carrier for reverse phase chromatography in which the functional group was an octadecyl group (ODS) and the base material was silica gel. Flow rate 100ml / min
And the peptide mixture was adsorbed. The peptide fraction containing no antigenic or allergenic components was eluted with a linear gradient of 0-30% methanol.
The eluate was concentrated using a vacuum concentrator (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) and then desalted to obtain a peptide composition having a molecular weight of 25,000 or less and showing no antigenicity.
【００３０】[0030]
【実施例２】実施例１と同様に調製した２０％ペプチド
混合物水溶液を、官能基がオクチル基（Ｃ８）、基材が
シリカゲルである逆相グロマトグラフィー用担体を充填
した高速液体クロマトグラフ用カラム（ワイエムシイ社
製）に、高速液体クロマトグラフ（島津製作所社製）を
用いて流速１００ｍｌ／ｍｉｎで送液し、ペプチド混合
物を吸着させた。０〜２０％メタノールのリニアグラジ
ェントにより、抗原性またはアレルゲン性の成分を含ま
ないペプチド画分を溶出した。この溶出液を減圧濃縮装
置（東京理化器械社製）を用いて濃縮後、脱塩操作を行
って分子量２５，０００以下の抗原性を全く示さないペ
プチド組成物を得た。Example 2 A 20% aqueous peptide mixture solution prepared in the same manner as in Example 1 was used for high-performance liquid chromatography in which an octyl group (C8) functional group and a silica gel base material were packed with a carrier for reversed phase chromatography. The solution was sent to a column (manufactured by YMC) using a high performance liquid chromatograph (manufactured by Shimadzu Corporation) at a flow rate of 100 ml / min to adsorb the peptide mixture. The peptide fraction containing no antigenic or allergenic components was eluted with a linear gradient of 0-20% methanol. The eluate was concentrated using a vacuum concentrator (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) and then desalted to obtain a peptide composition having a molecular weight of 25,000 or less and showing no antigenicity.
【００３１】[0031]
【実施例３】実施例１と同様に調製した２０％ペプチド
混合物水溶液を、官能基がブチル基（Ｃ４）、基材がシ
リカゲルである逆相クロマトグラフィー用担体を充填し
た高速液体クロマトグラフ用カラム（ワイエムシイ社
製）に、高速液体クロマトグラフ（島津製作所社製）を
用いて流速１００ｍｌ／ｍｉｎで送液し、ペプチド混合
物を吸着させた。０〜１５％メタノールのリニアグラジ
ェントにより、抗原性またはアレルゲン性の成分を含ま
ないペプチド画分を溶出した。この溶出液を減圧濃縮装
置（東京理化器械社製）を用いて濃縮後、脱塩操作を行
って分子量２５，０００以下の抗原性を全く示さないペ
プチド組成物を得た。Example 3 A high-performance liquid chromatography column in which a 20% aqueous peptide mixture prepared in the same manner as in Example 1 was packed with a carrier for reversed-phase chromatography having a functional group of butyl group (C4) and a base material of silica gel. The solution was sent to a (YM C.I.) company using a high performance liquid chromatograph (manufactured by Shimadzu Corporation) at a flow rate of 100 ml / min to adsorb the peptide mixture. The peptide fraction containing no antigenic or allergenic components was eluted with a linear gradient of 0-15% methanol. The eluate was concentrated using a vacuum concentrator (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) and then desalted to obtain a peptide composition having a molecular weight of 25,000 or less and showing no antigenicity.
【００３２】[0032]
【実施例４】実施例１と同様に調製した２０％ペプチド
混合物水溶液を、官能基がトリメチルシリル基（ＴＭ
Ｓ）、基材がシリカゲルである逆相クロマトグラフィー
用担体を充填した高速液体クロマトグラフ用カラム（ワ
イエムシイ社製）に、高速液体クロマトグラフ（島津製
作所社製）を用いて流速１００ｍｌ／ｍｉｎで送液し、
ペプチド混合物を吸着させた。０〜１０％メタノールの
リニアグラジェントにより、抗原性またはアレルゲン性
の成分を含まないペプチド画分を溶出した。この溶出液
を減圧濃縮装置（東京理化器械社製）を用いて濃縮後、
脱塩操作を行って分子量２５，０００以下の抗原性を全
く示さないペプチド組成物を得た。Example 4 A 20% aqueous peptide mixture solution prepared in the same manner as in Example 1 was treated with a trimethylsilyl group (TM
S) It was sent at a flow rate of 100 ml / min to a high-performance liquid chromatograph column (manufactured by YMC) using a high-performance liquid chromatograph (manufactured by Shimadzu Corporation) packed in a reversed-phase chromatography carrier having a silica gel base material. Liquid
The peptide mixture was adsorbed. The peptide fraction containing no antigenic or allergenic components was eluted with a linear gradient of 0-10% methanol. After concentrating this eluate using a vacuum concentrator (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.),
By performing a desalting operation, a peptide composition having a molecular weight of 25,000 or less and showing no antigenicity was obtained.
【００３３】[0033]
【実施例５】実施例１と同様に調製した２０％ペプチド
混合物水溶液を、官能基がフェニル基、基材がアガロー
スビーズである疎水クロマトグラフィー用担体が充填さ
れたカラム（ファルマシア バイオテク社製）に、液体
クロマトグラフィーシステム（ファルマシア バイオテ
ク社製）を用いて流速８０ｍｌ／ｍｉｎで送液し、抗原
性成分を吸着させた。次いで水を送液し、このカラムの
通過液中に抗原性またはアレルゲン性の成分を含まない
ペプチド画分を得た。この通過液の後処理は実施例４と
同様に操作し、抗原性を全く示さないペプチド組成物を
得た。Example 5 A 20% aqueous peptide mixture solution prepared in the same manner as in Example 1 was applied to a column (manufactured by Pharmacia Biotech) packed with a hydrophobic chromatography carrier having a phenyl group as a functional group and agarose beads as a base material. The liquid was sent at a flow rate of 80 ml / min using a liquid chromatography system (Pharmacia Biotech) to adsorb the antigenic component. Then, water was sent to obtain a peptide fraction containing no antigenic or allergenic component in the liquid passed through this column. The post-treatment of the flow-through solution was carried out in the same manner as in Example 4 to obtain a peptide composition showing no antigenicity.
【００３４】[0034]
【実施例６】高純度ゼラチン（宮城化学工業社製）５０
ｇを１，０００ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩
衝液（ｐＨ ８．１）に加温しながら溶解後、５０℃に
冷却した。酵素分解用の固定化酵素は、１００ｍｇのパ
ンクレアチン（天野製薬社製）を５０ｇのキトパール
（富士紡績社製）に結合させて調製し、バイオリアクタ
ーに組み込んで使用した。バイオリアクターの形態は、
膜型とし、具体的には本固定化酵素を反応容器（東京理
化器械社製）に入れ、反応液を限外ろ過膜に通液して分
解物と未分解物を分離するものを用いた。Example 6 High purity gelatin (Miyagi Chemical Industry Co., Ltd.) 50
g was dissolved in 1,000 ml of 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.1) while heating, and then cooled to 50 ° C. The immobilized enzyme for enzymatic degradation was prepared by binding 100 mg of pancreatin (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) to 50 g of chitopearl (manufactured by Fuji Boseki Co., Ltd.) and used in a bioreactor. The form of the bioreactor
A membrane type was used. Specifically, the immobilized enzyme was placed in a reaction vessel (manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.), and the reaction solution was passed through an ultrafiltration membrane to separate degraded and undegraded products. .
【００３５】このバイオリアクターに準備した高純度ゼ
ラチン液が常に５００ｍｌ満たされているようにし、温
度５０±２℃、ｐＨ８．１±０．２の条件に保ち、酵素
分解を行った。この酵素分解物液、すなわちペプチド混
合物液を噴霧乾燥機で粉末にした後、１５％ペプチド混
合物水溶液に調製した。次いで、官能基がオクタデシル
基（ＯＤＳ）、基材がメタクリレートポリマーである逆
相クロマトグラフィー用担体が充填されたカラム（ワイ
エムシイ社製）に、液体クロマトグラフィーシステム
（ファルマシア バイオテク社製）を用いて流速８０ｍ
ｌ／ｍｉｎで送液し、ペプチド混合物を吸着させ、２５
％メタノールにより、抗原性またはアレルゲン性の成分
を含まないペプチド画分を溶出した。以下、実施例４と
同様に操作し、抗原性を全く示さないペプチド組成物を
得た。The high-purity gelatin solution prepared in this bioreactor was always filled with 500 ml, and the enzyme was decomposed at a temperature of 50 ± 2 ° C. and a pH of 8.1 ± 0.2. This enzymatic degradation product solution, that is, the peptide mixture solution was pulverized with a spray dryer, and then prepared as a 15% peptide mixture aqueous solution. Next, a liquid chromatography system (manufactured by Pharmacia Biotech) was applied to a column (manufactured by YMC) which was packed with a carrier for reversed phase chromatography in which the functional group was an octadecyl group (ODS) and the base material was a methacrylate polymer. 80m
1 / min to adsorb the peptide mixture,
The peptide fraction containing no antigenic or allergenic components was eluted with% methanol. Thereafter, the same operation as in Example 4 was carried out to obtain a peptide composition showing no antigenicity.
【００３６】[0036]
【実施例７】実施例６と同様に調製した１５％ペプチド
混合物水溶液を、官能基がフェニル基、基材がアガロー
スビーズである疎水クロマトグラフィー用担体が充填さ
れたカラム（ファルマシア バイオテク社製）に、液体
クロマトグラフィーシステム（ファルマシア バイオテ
ク社製）を用いて流速８０ｍｌ／ｍｉｎで送液し、抗原
性成分を吸着させた。次いで水を送液し、このカラムの
通過液中に抗原性またはアレルゲン性の成分を含まない
ペプチドを得た。以下、実施例４と同様に操作し、抗原
性を全く示さないペプチド組成物を得た。Example 7 A 15% aqueous peptide mixture solution prepared in the same manner as in Example 6 was applied to a column (Pharmacia Biotech) packed with a hydrophobic chromatography carrier having a phenyl group as a functional group and agarose beads as a base material. The liquid was sent at a flow rate of 80 ml / min using a liquid chromatography system (Pharmacia Biotech) to adsorb the antigenic component. Then, water was sent to obtain a peptide containing no antigenic or allergenic component in the liquid passed through the column. Thereafter, the same operation as in Example 4 was carried out to obtain a peptide composition showing no antigenicity.
【００３７】[0037]
【実施例８】高純度ゼラチン（宮城化学工業社製）５０
ｇを１，０００ｍｌの１．０％ ＨＣｌ 水溶液に８０
℃で２時間加温しながら分解後、１５％ ＮａＯＨを用
いてｐＨ ６付近にｐＨを調製した。この加水分解液を
噴霧乾燥機で粉末にした後、１５％ペプチド混合物水溶
液にした。以下、実施例６と同様に操作し、抗原性を全
く示さないペプチド組成物を得た。Example 8 High purity gelatin (manufactured by Miyagi Chemical Industry Co., Ltd.) 50
g in 1,000 ml of 1.0% HCl aqueous solution.
After decomposing while heating at 2 ° C. for 2 hours, the pH was adjusted to around pH 6 using 15% NaOH. The hydrolyzed solution was powdered with a spray dryer, and then turned into a 15% peptide mixture aqueous solution. Thereafter, the same operation as in Example 6 was carried out to obtain a peptide composition showing no antigenicity.
【００３８】[0038]
【実施例９】実施例８と同様に調製した１５％ペプチド
混合物水溶液から、実施例７と同じ方法により抗原性ま
たはアレルゲン性の成分を含まないペプチドを得た。Example 9 From an aqueous 15% peptide mixture solution prepared in the same manner as in Example 8, a peptide containing no antigenic or allergenic component was obtained in the same manner as in Example 7.
【００３９】[0039]
【試験１】実施例１〜９で得られたペプチド混合物の分
子量は、高速液体クロマトグラフィーにより測定した。
測定には、ゲルろ過用カラム（商品名：「Ｓｕｐｅｒｄ
ｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ」および「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３
０」（ファルマシア バイオテク社製））を用い、０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）を溶出液として流速１．
０ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。実施例１〜９で得られたペ
プチド組成物の測定結果は、表１に示す通りである。な
お、表１では、実施例１〜９で調製されたペプチド組成
物をそれぞれ試料１〜９として示す。[Test 1] The molecular weights of the peptide mixtures obtained in Examples 1 to 9 were measured by high performance liquid chromatography.
For the measurement, a gel filtration column (trade name: “Superd
ex Peptide "and" Superdex 3
0 "(Pharmacia Biotech).
15 M NaCl, 5 mM CaCl 2 , 10 mM Tr
Using is-HCl (pH 7.4) as an eluent, the flow rate was 1.
Elution was performed at 0 ml / min. The measurement results of the peptide compositions obtained in Examples 1 to 9 are as shown in Table 1. In Table 1, the peptide compositions prepared in Examples 1 to 9 are shown as Samples 1 to 9, respectively.
【００４０】[0040]
【表１】 [Table 1]
【００４１】表１から、ゼラチンの分解方法が同じで
官能基が異なる逆相系担体を使用しても分子量分布はほ
とんど差がないこと、同じ分解方法でも疎水系担体を
使用すると逆相系担体よりも高分子成分の割合が高くな
ること、ゼラチンの分解方法が異なると同じ担体を使
用しても分子量分布が大きく異なること、が判明した。From Table 1, it can be seen that there is almost no difference in the molecular weight distribution even when a reversed phase carrier having the same gelatin decomposition method and different functional groups is used. It was found that the ratio of the polymer component was higher than that of the above, and that the molecular weight distribution was significantly different even when the same carrier was used when the method of decomposing gelatin was different.
【００４２】[0042]
【試験２】実施例１〜５で得られたペプチド組成物のＮ
末端アミノ酸を、アミノ酸配列分析装置（島津製作所社
製）を用いて分析した。実施例１〜５で得られたペプチ
ド組成物の測定結果は、表２に示す通りである。[Test 2] N of the peptide compositions obtained in Examples 1 to 5
The terminal amino acids were analyzed using an amino acid sequence analyzer (manufactured by Shimadzu Corporation). The measurement results of the peptide compositions obtained in Examples 1 to 5 are as shown in Table 2.
【００４３】[0043]
【表２】 [Table 2]
【００４４】表２からわかるように、実施例１〜５で得
られたどのペプチド組成物もＮ末端アミノ酸は、１サイ
クル目はGlycine 、２サイクル目はProline が最も多く
含まれていた。As can be seen from Table 2, all of the peptide compositions obtained in Examples 1 to 5 contained the most N-terminal amino acids in Glycine in the first cycle and Proline in the second cycle.
【００４５】[0045]
【試験３】実施例１〜５で得られたペプチド組成物の残
存抗原活性を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によっ
て検定した。ゼラチン感作イムノボールに抗原試料とし
て実施例１〜５のペプチド組成物（それぞれ試料１〜５
として示す）または対照であるゼラチン（試料１０）を
各２００μｌずつ添加し、リン酸緩衝液で５００倍希釈
したモルモット抗ゼラチン抗血清を２００μｌ加えて３
７℃で３０分間反応させた。次いで洗浄後、山羊抗モル
モットＩｇＧ抗体−西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）標識複合体（コスモ・バイオ社製）を３７℃で１時
間反応させた後、イムノボールに結合して残っているＨ
ＲＰ標識複合体の活性を測定した。[Test 3] The residual antigen activity of the peptide compositions obtained in Examples 1 to 5 was assayed by enzyme immunoassay (ELISA). Peptide compositions of Examples 1 to 5 (samples 1 to 5 respectively) were used as antigen samples on gelatin sensitized immunoballs.
) Or a control gelatin (sample 10) was added in an amount of 200 μl each, and 200 μl of a guinea pig anti-gelatin antiserum diluted 500-fold with a phosphate buffer was added.
The reaction was performed at 7 ° C. for 30 minutes. Then, after washing, goat anti-guinea pig IgG antibody-horseradish peroxidase (HR
P) After reacting the labeled complex (Cosmo Bio Inc.) at 37 ° C. for 1 hour, the remaining H bound to the immunoball was
The activity of the RP-labeled complex was measured.
【００４６】抗原試料を添加していない陽性コントロー
ルのＨＲＰ活性を１００％とした各試料１〜５、１０の
割合（比率）を結合率（％）として算定し、図１にプロ
ットした。結合率が低下するほど残存する抗原性が強い
と判定される。検定結果は、図１に示す通りである。図
１からわかるように、実施例１〜５の、コラゲナーゼで
分解し、逆相系担体または疎水系担体で抗原性またはア
レルゲン性を除去したペプチド組成物の抗原性は、素材
であるゼラチンの１／１０，０００以下であった。The ratio (ratio) of each of samples 1 to 5 and 10 with the HRP activity of the positive control to which no antigen sample was added as 100% was calculated as the binding ratio (%), and plotted in FIG. It is determined that the lower the binding rate, the stronger the remaining antigenicity. The test results are as shown in FIG. As can be seen from FIG. 1, the antigenicity of the peptide compositions of Examples 1 to 5 which were degraded with collagenase and whose antigenicity or allergenicity was removed with a reversed phase carrier or a hydrophobic carrier was 1% of that of the raw material gelatin. / 10,000 or less.
【００４７】[0047]
【試験４】実施例６、７のペプチド組成物の残存抗原活
性を、試験３と同様に酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）
によって検定した。なお、対照であるゼラチンを試料１
０とし、実施例６でパンクレアチン酵素により分解した
だけの、抗原性またはアレルゲン性の成分を除去してい
ないゼラチン分解物を試料１１とした。検定結果は、図
２に示す通りである。図２からわかるように、パンクレ
アチンで分解しただけのゼラチン分解物（試料１１）の
抗原性は、素材であるゼラチンの１／１００程度残存し
ていた。しかし、その分解物から逆相系担体または疎水
系担体で抗原性またはアレルゲン性の成分を除去したペ
プチド組成物（試料６、７）の抗原性は、素材であるゼ
ラチンの１／１，０００以下であった。[Test 4] The residual antigen activity of the peptide compositions of Examples 6 and 7 was measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in the same manner as in Test 3.
Tested by Sample 1 was used as a control gelatin.
Sample No. 11 was a gelatin hydrolyzate which was only degraded by the pancreatin enzyme in Example 6 and did not remove antigenic or allergenic components. The test results are as shown in FIG. As can be seen from FIG. 2, the antigenicity of the gelatin degradation product (sample 11) that had only been degraded with pancreatin remained about 1/100 of that of the raw material gelatin. However, the antigenicity of the peptide composition (samples 6 and 7) obtained by removing the antigenic or allergenic components from the decomposed product with a reversed-phase carrier or a hydrophobic carrier is 1/1000 or less of that of the gelatin used as the material. Met.
【００４８】[0048]
【試験５】実施例８、９のペプチド組成物の残存抗原活
性を、試験３と同様に酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）
によって検定した。なお、対照であるゼラチンを試料１
０とし、実施例８で塩酸により加水分解しただけの、抗
原性またはアレルゲン性の成分を除去していないゼラチ
ン分解物を試料１２とした。検定結果は、図３に示す通
りである。塩酸で加水分解しただけのゼラチン分解物
（試料１２）の抗原性は、素材であるゼラチンの１／５
０程度残存していた。しかし、その分解物から逆相系担
体または疎水系担体で抗原性またはアレルゲン性の成分
を除去したペプチド組成物（試料８、９）の抗原性は、
素材であるゼラチンの１／５００以下であった。[Test 5] The residual antigenic activity of the peptide compositions of Examples 8 and 9 was measured by the enzyme immunoassay (ELISA) in the same manner as in Test 3.
Tested by Sample 1 was used as a control gelatin.
The sample was hydrolyzed with hydrochloric acid in Example 8 and had no antigenic or allergenic components removed. The test results are as shown in FIG. The antigenicity of the gelatin hydrolyzate (sample 12) simply hydrolyzed with hydrochloric acid is 1/5 that of the gelatin used as the material.
About 0 remained. However, the antigenicity of the peptide composition (samples 8 and 9) obtained by removing the antigenic or allergenic component from the degradation product using a reversed-phase carrier or a hydrophobic carrier is as follows:
It was 1/500 or less of the gelatin used as the material.
【００４９】[0049]
【試験６】実施例１で得られたペプチド組成物の残存抗
原活性を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によって検
定した。ゼラチン感作イムノボールに抗原試料として実
施例１のペプチド組成物（試料１）または対照であるゼ
ラチン酸加水分解物（試料１２）を各２００μｌずつ添
加した。これらに、リン酸緩衝液で５倍希釈した、ゼラ
チンに対するIgE 抗体を含むゼラチンアレルギー患者血
清を２００μｌ加えて３７℃で３０分間反応させた。次
いで洗浄後、山羊抗ヒトＩｇＧ抗体−西洋ワサビパーオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）標識複合体を３７℃で１時間反応
させた後、イムノボールに結合して残っているＨＲＰ標
識複合体の活性を測定した。抗原試料を添加していない
陽性コントロールのＨＲＰ活性を１００％とした試料
１、１０の割合（比率）を結合率（％）として算定し、
図４にプロットした。検定結果は、図４に示す通りであ
る。図４からわかるように、ヒト・アレルギー患者血清
を用いた場合も、実施例１の抗原性またはアレルゲン性
を除去したペプチド組成物の抗原性はほとんど認められ
なかった。[Test 6] The residual antigen activity of the peptide composition obtained in Example 1 was assayed by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The peptide composition of Example 1 (sample 1) or the hydrolyzate of gelatin acid as a control (sample 12) was added to each of the gelatin-sensitized immunoballs as an antigen sample in an amount of 200 μl. 200 µl of a gelatin allergy patient's serum containing an IgE antibody against gelatin, diluted 5-fold with a phosphate buffer, was added thereto, and reacted at 37 ° C for 30 minutes. Next, after washing, a goat anti-human IgG antibody-horseradish peroxidase (HRP) -labeled complex was reacted at 37 ° C. for 1 hour, and the activity of the HRP-labeled complex remaining bound to the immunoball was measured. The ratio (ratio) of Samples 1 and 10 with the HRP activity of the positive control to which no antigen sample was added as 100% was calculated as the binding ratio (%),
Plotted in FIG. The test results are as shown in FIG. As can be seen from FIG. 4, even when serum from a human / allergic patient was used, the antigenicity of the peptide composition of Example 1 from which the antigenicity or allergenicity was removed was hardly recognized.
【００５０】[0050]
【発明の効果】本発明に係る抗原性成分の除去方法によ
れば、コラーゲンまたはゼラチン由来のペプチド組成物
について、原料の分解方法を問わず、また、分子量に制
限を受けずに、容易に抗原性成分を除去することがで
き、その方法により製造された非抗原性ペプチド組成
物、非抗原性安定化剤および生理活性物質は抗原性を消
失してアナフィラキシー反応を誘発させず、疾病の治療
用や予防用などに有用である。According to the method for removing an antigenic component of the present invention, a peptide composition derived from collagen or gelatin can be easily used as an antigen regardless of the method of decomposing a raw material and without being limited by molecular weight. The non-antigenic peptide composition, the non-antigenic stabilizer and the bioactive substance produced by the method can eliminate the antigenic component and lose the antigenicity and do not induce an anaphylactic reaction. And is useful for prevention.
【図１】実施例１〜５のペプチド組成物の残存抗原活性
を酵素免疫測定法で検定した試験３の結果を示すグラフ
である。FIG. 1 is a graph showing the results of Test 3 in which the residual antigen activity of the peptide compositions of Examples 1 to 5 was assayed by enzyme immunoassay.
【図２】実施例６、７のペプチド組成物の残存抗原活性
を酵素免疫測定法で検定した試験４の結果を示すグラフ
である。FIG. 2 is a graph showing the results of Test 4 in which the residual antigen activity of the peptide compositions of Examples 6 and 7 was assayed by an enzyme immunoassay.
【図３】実施例８、９のペプチド組成物の残存抗原活性
を酵素免疫測定法で検定した試験５の結果を示すグラフ
である。FIG. 3 is a graph showing the results of Test 5 in which the residual antigen activity of the peptide compositions of Examples 8 and 9 was assayed by enzyme immunoassay.
【図４】実施例１のペプチド組成物の残存抗原活性を、
ヒト・アレルギー患者血清を用いて酵素免疫測定法で検
定した試験６の結果を示すグラフである。FIG. 4 shows the residual antigen activity of the peptide composition of Example 1.
It is a graph which shows the result of the test 6 tested by the enzyme immunoassay using the human / allergic patient serum.
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/16 Ａ６１Ｋ 37/12 Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Reference number in the agency FI Technical display location C07K 1/16 A61K 37/12
Claims (8)
組成物から抗原性成分を除去する方法であって、前記ペ
プチド組成物を逆相クロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィーまたはその両方で処理することを特徴とする
抗原性成分の除去方法。1. A method for removing an antigenic component from a peptide composition derived from collagen or gelatin, wherein the peptide composition is subjected to reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, or both. How to remove sexual components.
ゼラチンを、プロテアーゼ酵素の１種または２種以上を
用いて分解したものであることを特徴とする請求項１記
載の抗原性成分の除去方法。2. The method for removing an antigenic component according to claim 1, wherein the peptide composition is obtained by degrading collagen or gelatin using one or more protease enzymes.
ゼラチンを酸または加熱によって分解したものであるこ
とを特徴とする請求項１記載の抗原性成分の除去方法。3. The method for removing an antigenic component according to claim 1, wherein the peptide composition is obtained by decomposing collagen or gelatin by an acid or heat.
シル基、オクチル基、ブチル基またはトリメチルシリル
基の逆相系担体を用いた逆相クロマトグラフィーで処理
することを特徴とする請求項１，２または３記載の抗原
性成分の除去方法。4. The method according to claim 1, wherein the peptide composition is subjected to reverse phase chromatography using a reverse phase carrier having a functional group of octadecyl, octyl, butyl or trimethylsilyl. Or the method for removing an antigenic component according to 3 above.
基またはブチル基の疎水系担体を用いた疎水クロマトグ
ラフィーで処理することを特徴とする請求項１，２また
は３記載の抗原性成分の除去方法。5. The method according to claim 1, wherein the peptide composition is subjected to hydrophobic chromatography using a hydrophobic carrier having a phenyl group or a butyl group as a functional group. Removal method.
組成物を請求項１，２，３，４または５記載の抗原性成
分の除去方法で処理して製造されたことを特徴とする非
抗原性ペプチド組成物。6. A non-antigenic peptide composition produced by treating a peptide composition derived from collagen or gelatin by the method for removing an antigenic component according to claim 1, 2, 3, 4 or 5. Stuff.
主成分とすることを特徴とする非抗原性安定化剤。7. A non-antigenic stabilizer comprising the non-antigenic peptide composition according to claim 6 as a main component.
ることを特徴とする生理活性物質。8. A physiologically active substance comprising the non-antigenic stabilizer according to claim 7.
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000024267A1 (en) * | 1998-10-23 | 2000-05-04 | Nippon Meat Packers, Inc. | Gelatins with low allergenicity |
| WO2001028571A1 (en) * | 1999-10-22 | 2001-04-26 | Nippi, Incorporated | Stable preparations for treating bedsore, skin ulcer and wound |
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| WO2008066070A1 (en) * | 2006-11-29 | 2008-06-05 | Uha Mikakuto Co., Ltd. | Dipeptidyl peptidase-iv inhibitor |
| US20160222354A1 (en) * | 2015-01-30 | 2016-08-04 | Zhaoqing Dahuanong Biological Medicine Co., Ltd | Medium for culturing the Marc-145 cell and the preparation method thereof |
-
1996
- 1996-07-03 JP JP19395896A patent/JP3197823B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000024267A1 (en) * | 1998-10-23 | 2000-05-04 | Nippon Meat Packers, Inc. | Gelatins with low allergenicity |
| WO2001028571A1 (en) * | 1999-10-22 | 2001-04-26 | Nippi, Incorporated | Stable preparations for treating bedsore, skin ulcer and wound |
| WO2001068672A1 (en) * | 2000-03-13 | 2001-09-20 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Protein hydrolyzates, process for producing the same and drinks and foods containing the protein hydrolyzates |
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| WO2008066070A1 (en) * | 2006-11-29 | 2008-06-05 | Uha Mikakuto Co., Ltd. | Dipeptidyl peptidase-iv inhibitor |
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