JPH10158196A - Carrier for stabilization of nucleic acid - Google Patents
Carrier for stabilization of nucleic acidInfo
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- JPH10158196A JPH10158196A JP9130448A JP13044897A JPH10158196A JP H10158196 A JPH10158196 A JP H10158196A JP 9130448 A JP9130448 A JP 9130448A JP 13044897 A JP13044897 A JP 13044897A JP H10158196 A JPH10158196 A JP H10158196A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸安定化用キャ
リアー、及びそれを用いた核酸安定化用キャリアーによ
る核酸安定化方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a carrier for stabilizing a nucleic acid and a method for stabilizing a nucleic acid by using the carrier for stabilizing a nucleic acid.
【０００２】[0002]
【従来の技術】遺伝子工学の急速な発展により、様々な
分子生物学的手法の開発が行われ、遺伝子情報の解析お
よび遺伝子の機能解明がなされている。さらに、得られ
た成果を治療方法等に応用する試みが数多く行われてい
る。2. Description of the Related Art With the rapid development of genetic engineering, various molecular biological techniques have been developed, and genetic information has been analyzed and gene functions have been elucidated. Further, many attempts have been made to apply the obtained results to treatment methods and the like.
【０００３】その中でも、最も進歩の著しい分野の１つ
として遺伝子治療があげられる。種々の遺伝性疾患にお
ける原因遺伝子の発見、解読が行われ、遺伝子治療は基
礎的実験の段階から、実際の臨床応用の段階までに発展
しつつある。例えば、米国においては、１９９５年６月
までに８１の遺伝子治療プロトコールがＮＩＨの組換え
ＤＮＡ委員会（ＲＡＣ）で承認され、先天性免疫不全
症、家族性高コレステロール血症、嚢胞性線維症等の遺
伝性疾患および各種の癌を対象とし、既に２００人以上
の患者に対して臨床試験が行われている（実験医学Ｖｏ
ｌ．１２， Ｎｏ．３， ３０３−３０７（１９９
４））。[0003] Among them, gene therapy is one of the most remarkable fields. With the discovery and decoding of the causative genes in various hereditary diseases, gene therapy is evolving from the stage of basic experimentation to the stage of actual clinical application. For example, in the United States, by June 1995, 81 gene therapy protocols had been approved by the NIH Recombinant DNA Committee (RAC), and congenital immunodeficiency disorders, familial hypercholesterolemia, cystic fibrosis, etc. Clinical trials have already been conducted on more than 200 patients targeting hereditary diseases and various types of cancer (Experimental Medicine Vo
l. 12, No. 3, 303-307 (199
4)).
【０００４】遺伝子治療は病気を細胞レベルの根本から
治療できる方法ではあるが、臨床応用における大きな技
術的課題の１つとして、外来遺伝子を効率良く安全に標
的細胞へ導入する方法についてはいくつかの問題が指摘
されている。即ち、遺伝子治療は、異常（病原）遺伝子
をそのままにして、新しい（正常）遺伝子を付け加える
付加遺伝子療法（Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ）と、異常遺伝子を正常遺伝子で置き
換える置換遺伝子療法（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）に大別されるが、いずれの療法
の場合にも、正常遺伝子を効率良く安全に標的細胞へ導
入する方法が必要とされる。[0004] Gene therapy is a method capable of treating diseases from the root of the cell level. One of the major technical problems in clinical application is a method for efficiently and safely introducing a foreign gene into target cells. The problem has been pointed out. That is, in gene therapy, an augmentation gene therapy (Augmentation Gene) in which an abnormal (pathogenic) gene is left as it is and a new (normal) gene is added.
Therapy) and replacement gene therapy (Replacement Ge) which replaces abnormal genes with normal genes.
Neither therapies are generally classified into ne therapies, and any of the therapies requires a method for efficiently and safely introducing a normal gene into target cells.
【０００５】例えば、１９８０年代初期にはマイクロイ
ンジェクションなど物理的手法の応用が試みられたが、
遺伝子の導入効率が低く、安定に導入することができ
ず、さらには大量細胞培養技術の限界等の問題点があっ
た。For example, in the early 1980's, application of physical methods such as microinjection was attempted.
There were problems such as low gene transfer efficiency, inability to stably transfer the gene, and limitations of large-scale cell culture technology.
【０００６】また、外来遺伝子を効率良く標的細胞に導
入するためのキャリアーとなる組換えウイルス（ウイル
スベクター）が開発され、初めて遺伝子治療の臨床応用
が可能となった。現在、遺伝子治療への使用が検討され
ているウイルスベクターには、以下に示すようにいくつ
かの種類が知られているが、これらは一般的に生産方法
が非常に複雑であると同時に、それぞれの安全性を保証
する方法が確立されていないという問題点がある。例え
ば、遺伝子治療に使用可能なウイルスベクターとして、
現在最も注目されているウイルスベクターは、マウス白
血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ：Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉ
ｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）由来のレトロウ
イルスベクターであり、本ウイルスの増殖様式の利点を
利用したものである。レトロウイルスは、エンベロープ
をもつＲＮＡウイルスであり、そのエンベロープ蛋白と
宿主細胞側のレセプターが結合することにより細胞内に
侵入する。侵入後、単一鎖ウイルスＲＮＡが逆転写酵素
により二重鎖ＤＮＡに変換され、感染細胞ゲノムＤＮＡ
に組み込まれる。しかしながら、このような組み込みが
起こるためには、細胞が***増殖していなければならな
い。従って、実用的に一番問題となるのは、非***細胞
に遺伝子導入できない点である。そのため、多くの先天
性代謝異常症で問題となる神経細胞の遺伝子修復が行え
ない。神経細胞以外にも、遺伝子治療の対象細胞となっ
ている造血幹細胞、肝細胞、筋細胞なども、通常はほと
んど静止期にあるため、遺伝子導入効率は低い。体外に
取り出した細胞については、遺伝子導入効率を高めるた
めに***を促進するような処理が行われているが、生体
内でこれらの細胞に遺伝子導入を行うことは難しいと考
えられている。また、アデノウイルスベクターは非***
細胞へも遺伝子が導入できるものとして最近注目されて
いる。しかし、アデノウイルスベクターでは外来遺伝子
が標的細胞ゲノムＤＮＡ内に組み込まれないため、数週
間から長くても数カ月で遺伝子導入の効果はなくなって
しまう。そのため遺伝子導入を頻回に繰り返す必要があ
り、患者への肉体的、身体的な負担の増加、抗アデノウ
イルス抗体が産生されることによる遺伝子導入効率の低
下などが問題となっている。現在、嚢胞性線維症の治療
のためにアデノウイルスベクターを経気管支鏡的に肺に
投与する臨床試験が開始されているが、アデノウイルス
粒子の免疫原性および細胞毒性に起因するとみられる炎
症反応が発生したといわれている。また、へルペスウイ
ルスベクターは神経細胞への外来遺伝子導入が可能なベ
クターとして期待されているが、細胞毒性が強く、さら
にウイルス自体のゲノムサイズが１５０ｋｂと非常に大
きいために開発は進んでいない。さらに、ＨＩＶベクタ
ーはウイルス自体の宿主特性により、ＣＤ４陽性Ｔリン
パ球に対して特異的遺伝子導入を可能とするベクターと
して開発された（Ｓｈｉｍａｄａ Ｔ．， ｅｔ ａ
ｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．
８８， １０４３（１９９１））。ＨＩＶベクターに
は、最大の欠点として野生株混入の可能性という問題が
ある。また、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ‐Ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｄ Ｖｉｒｕｓ）ベクターは、野生型のＡＡＶは第１９
染色体の特定の位置に組み込まれることが発見され、遺
伝子組み込み位置をターゲティングできるベクターとし
て注目された。しかし最近の研究によると、組換えＡＡ
Ｖベクターはこの特性を失っており、外来遺伝子は染色
体の非特異的位置に組み込まれるといわれている。さら
にＡＡＶベクターは導入できる外来遺伝子のサイズに限
界があり、５ｋｂ以下の遺伝子しかベクター内にパッケ
ージングできないという欠点もある。[0006] In addition, a recombinant virus (virus vector) as a carrier for efficiently introducing a foreign gene into target cells has been developed, and clinical application of gene therapy has become possible for the first time. At present, several types of viral vectors that are being considered for use in gene therapy are known, as described below. However, there is a problem that a method for assuring the safety of the device has not been established. For example, as a viral vector that can be used for gene therapy,
Currently, the virus vector that has received the most attention is mouse leukemia virus (MoMLV: Moloney Muri).
ne Leukemia Virus), utilizing the advantages of the growth mode of the virus. A retrovirus is an RNA virus having an envelope, and enters a cell by binding an envelope protein to a receptor on a host cell side. After invasion, the single-stranded viral RNA is converted to double-stranded DNA by reverse transcriptase and the infected cell genomic DNA
Incorporated in However, for such integration to occur, the cells must be dividing and proliferating. Therefore, the most problematic point in practice is that the gene cannot be introduced into non-dividing cells. Therefore, gene repair of nerve cells, which is a problem in many congenital metabolic disorders, cannot be performed. In addition to nerve cells, hematopoietic stem cells, hepatocytes, muscle cells, and the like, which are the target cells for gene therapy, are usually in a quiescent phase, and therefore have low gene transfer efficiency. Cells taken out of the body are treated to promote division in order to increase the efficiency of gene transfer, but it is considered difficult to transfer genes to these cells in vivo. In addition, adenovirus vectors have recently received attention as being capable of introducing genes into non-dividing cells. However, since the adenovirus vector does not incorporate a foreign gene into the genomic DNA of the target cell, the effect of gene transfer is lost in a few weeks to a few months. For this reason, gene transfer must be repeated frequently, which causes problems such as an increase in physical and physical burden on the patient and a decrease in gene transfer efficiency due to the production of anti-adenovirus antibodies. Clinical trials of transbronchially administering adenovirus vectors to the lung to treat cystic fibrosis are currently underway, but the inflammatory response may be due to the immunogenicity and cytotoxicity of the adenovirus particles Is said to have occurred. The herpes virus vector is expected as a vector capable of introducing a foreign gene into nerve cells, but its development is not progressing because of its strong cytotoxicity and the very large genome size of the virus itself of 150 kb. Furthermore, HIV vectors have been developed as vectors that allow specific gene transfer to CD4-positive T lymphocytes due to the host characteristics of the virus itself (Shimada T., et a).
l. , J. et al. Clin. Invest. , Vol.
88, 1043 (1991)). The biggest drawback of HIV vectors is the potential for contamination with wild strains. AAV (Adeno-Associate)
d Virus) vector is the wild-type AAV
It was found to be integrated at a specific position on the chromosome, and was noted as a vector capable of targeting the gene integration position. However, recent studies have shown that recombinant AA
V-vectors have lost this property, and foreign genes are said to integrate at non-specific locations on the chromosome. Further, the AAV vector has a drawback that the size of a foreign gene that can be introduced is limited, and that only a gene of 5 kb or less can be packaged in the vector.
【０００７】一方、ウイルスベクター以外にも、各種の
人工的な遺伝子導入システムを用いて遺伝子治療を行お
うとする試みが多くなされている。例えば、正電荷を有
する脂質による遺伝子−脂質複合体が遺伝子治療用非ウ
イルスキャリアーとして開発されている。しかしなが
ら、これらのキャリアーは、大量に用いた場合に細胞毒
性が高い等の問題点が指摘されている（Ｂｉｏｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．３， ３２３‐３
２７（１９９２）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．１
７、７９３４‐７９３８（１９９２）、Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２６９， １２９１８‐
１２９２４（１９９４）、特表平 ６‐５０５９８０、
特表平 ６‐５０７１５８）。また、核酸およびその誘
導体が負電荷を有することを利用し、正電荷を有する合
成高分子誘導体との間で静電的複合体を形成させること
により、標的となる細胞もしくは細胞内へ遺伝子を送達
させることを試みた研究報告も多く見られる（Ｂｉｏｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ３， ３２３‐３２
７（１９９２）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ．８９，７９３４‐７９
３８ （１９９２）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，
Ｖｏｌ．２６９， １２９１８‐１２９２４（１９９
４）、特表平 ６‐５０５９８０、特表平 ６‐５０７
１５８）。しかしながら、正電荷を有する合成高分子
は、単独で用いた場合には細胞毒性が高いことが以前よ
り指摘されている（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅ
ｍ．， Ｖｏｌ．１， １４９‐１５３（１９９
０））。それと同時に、これら合成高分子の誘導体が生
体内へ投与された場合は、異物として認識されることに
より、アナフィラキシーショック等の免疫系への影響も
問題点とされている。On the other hand, many attempts have been made to carry out gene therapy using various artificial gene transfer systems other than viral vectors. For example, gene-lipid complexes with positively charged lipids have been developed as non-viral carriers for gene therapy. However, it has been pointed out that these carriers have high cytotoxicity when used in a large amount (Bioconj).
ugate Chem. , Vol. 3, 323-3
27 (1992), Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, Vol. 89, no. 1
7, 7934-7938 (1992); Bio
l. Chem. , Vol. 269, 12918-
12924 (1994), Tokiohei 6-505980,
Tokiohei 6-507158). Also, by utilizing the fact that nucleic acids and their derivatives have a negative charge, an electrostatic complex is formed with a positively charged synthetic polymer derivative to deliver a gene to a target cell or cell. There are many research reports that tried to make this happen (Bioc
onjugate Chem. , 3, 323-32
7 (1992), Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Vol. 89, 7934-79
38 (1992); Biol. Chem. ,
Vol. 269, 12918-12924 (199
4), Tokiohei 6-505980, Tokiohei 6-507
158). However, it has been previously pointed out that a synthetic polymer having a positive charge has high cytotoxicity when used alone (Bioconjugate Chem.).
m. , Vol. 1, 149-153 (199
0)). At the same time, when these synthetic polymer derivatives are administered into a living body, they are recognized as foreign substances, and the influence on the immune system such as anaphylactic shock is also a problem.
【０００８】さらには、異物として認識されにくいとい
う理由から、生体由来の核タンパク質を用いた試みも検
討されている。核タンパク質は、核酸およびその誘導体
と特異的に結合する性質を有していることから、静電的
複合体を形成することにより、遺伝子導入用ベクターと
なり得る可能性がある。核タンパク質であるヒストンタ
ンパク質を用い、それらをプラスミドＤＮＡ用のキャリ
アーとして研究をおこなっている例がある（Ｙａｓｕｆ
ｕｍｉ Ｋａｎｅｄａ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ， Ｖｏｌ．２４３， ３７５‐３７８（１９８
９）、Ｍｉｒｊａｍ Ｂｒｅｅｕｗｅｒ ａｎｄ Ｄａ
ｖｉｄ Ｓ．Ｇｏｌｄｆａｒｂ， Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．
６０， ９９９‐１００８（１９９０）、Ｊｉａｎ Ｃ
ｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ， Ｖｏｌ．５， ４２９‐４３５（１９９
４））。しかし、これらの例においても、遺伝子を細胞
に取り込ませる方法についてのみ検討されており、必ず
しも多くの細胞種において遺伝子の発現効率を向上させ
ることを目的としているわけではなく、多くの細胞種に
おいて遺伝子を効率よく細胞質内に導入するためのベク
ターとしての応用可能性において問題がある。[0008] Furthermore, attempts to use nuclear proteins derived from living organisms have been studied because they are hardly recognized as foreign substances. Since a nucleoprotein has a property of specifically binding to a nucleic acid and a derivative thereof, there is a possibility that the nucleoprotein can be a vector for gene transfer by forming an electrostatic complex. There are examples of studies using histone proteins, which are nuclear proteins, and using them as carriers for plasmid DNA (Yasuf).
Umi Kaneda, et al. , Science
ce, Vol. 243, 375-378 (198
9) 、 Mirjam Breuer and Da
vid S.D. Goldfarb, Cell, Vol.
60, 999-1008 (1990), Jian C
hen, et al. , Human Gene Th
erapy, Vol. 5, 429-435 (199
4)). However, even in these examples, only a method for incorporating a gene into a cell has been studied, and it is not necessarily aimed at improving the expression efficiency of the gene in many cell types. There is a problem in its applicability as a vector for efficiently introducing E. coli into the cytoplasm.
【０００９】いわゆる細胞内に存在するワトソンクリッ
ク二重らせんに３番目の外来遺伝子が加わったＤＮＡの
三重鎖形成は、その外来遺伝子により特定の遺伝子発現
を制御し得るものであり遺伝子の永久的な不活化も可能
とするものである。The so-called Watson-Crick double helix present in a cell, to which a third foreign gene has been added to form a triplex of DNA, can control the expression of a specific gene by the foreign gene. Inactivation is also possible.
【００１０】ワトソンクリック二重鎖は、グアニン
（Ｇ）とシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）とチミン
（Ｔ）の間に水素結合により２本鎖のらせん構造を安定
化しており、三重鎖は、Hoogsteen型水素結合によりＴ
ＡＴのように二重鎖に結合していることが知られてい
る。[0010] The Watson-Crick duplex stabilizes a double-stranded helical structure by hydrogen bonding between guanine (G) and cytosine (C), and adenine (A) and thymine (T). By Hoogsteen type hydrogen bond
It is known that it binds to a duplex like AT.
【００１１】外来遺伝子が細胞内の二重鎖ＤＮＡに結合
してなる三重鎖ＤＮＡ形成の応用としては、外来遺伝子
に金属イオンをキレートするような分子（ＥＤＴＡ、フ
ェナントロリンなど）を修飾して、二重鎖ＤＮＡに損傷
を与えることによって切断することができることが知ら
れている（Ｐｅｔｅ Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｂｉｏ
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２， Ｎ
ｏ．１， １−１２（１９９１））。また、外来遺伝子
に架橋剤を修飾し、特定の細胞内遺伝子の永久的な発現
制御も可能である。さらに三重鎖ＤＮＡ形成を用いた細
胞内ＤＮＡの特異的切断法は、ゲノムプロジェクトなど
の巨大ＤＮＡを扱う分野への応用も可能とする。また遣
伝子の発現制御という点では、エイズ（ Ｗ．Ｍｉｃｈ
ａｅｌＭｃＳｈａｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．， Ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．８， ５７１２‐５
７２１ （１９９２））やがんの治療への応用も注目さ
れている。実際に、ヒトがん遣伝子ｃ‐ｍｙｃのポリプ
リン、ポリピリミジン配列部分に注目し、外からこの部
分に対応するヌクレオチドのポリプリン鎖を加えること
により三重鎖を形成させ、ｃ‐ｍｙｃの発現をｉｎ ｖ
ｉｔｒｏさらに、ｉｎ ｖｉｖｏでも抑制することに成
功している （ Ｅ． Ｈ． Ｐｏｓｔｅｌ， Ｓ．
Ｊ． Ｆｌｉｎｔ， Ｄ． Ｊ． Ｋｅｓｓｌｅｒ，
ａｎｄＭ． Ｅ． Ｈｏｇａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ， Ｖｏｌ．８８，
８２２７−８２３１ （１９９１））。As an application of triple-stranded DNA formation in which a foreign gene binds to intracellular double-stranded DNA, the foreign gene is modified by modifying a molecule (such as EDTA or phenanthroline) that chelates a metal ion to the foreign gene. It is known that heavy chain DNA can be cleaved by damaging it (Pete E. Nielsen, Bio).
Conjugate Chem. , Vol. 2, N
o. 1, 1-12 (1991)). Further, by modifying a foreign gene with a crosslinking agent, it is possible to permanently control the expression of a specific intracellular gene. Furthermore, the specific cutting method of intracellular DNA using triple-stranded DNA formation can be applied to fields dealing with huge DNA such as genome projects. In terms of controlling gene expression, AIDS (W. Mich.
aelMcShan, et al. , Biol. Ch
em. , Vol. 267, no. 8, 5712-5
721 (1992)) and its application to cancer treatment. In fact, we focused on the polypurine and polypyrimidine sequence portions of the human oncogene c-myc, and added a polypurine chain of nucleotides corresponding to this portion from outside to form a triplex, thereby expressing c-myc expression. in v
It has also been successfully suppressed in vitro and in vivo (EH Postel, S. et al.
J. Flint, D.S. J. Kessler,
andM. E. FIG. Hogan, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, Vol. 88,
8227-8231 (1991)).
【００１２】しかしながら、該三重鎖ＤＮＡ形成はＤＮ
Ａどうしのアニオン間の静電的反発のため、生理条件下
では非常に不安定であり、形成が困難であるという問題
点がある。However, the formation of the triple-stranded DNA is caused by DN
Due to the electrostatic repulsion between the anions of A, it is very unstable under physiological conditions and has a problem that it is difficult to form.
【００１３】従って、このような問題点を解決するため
には、外来遺伝子を目的の場所へ運ぶ運搬体の開発と三
重鎖形成を促進し、安定化するような安定化剤の開発が
必須である。従来知られているＤＮＡの二重鎖形成、三
重鎖形成の安定化剤としては、低分子ポリアミン、イン
ターカレーターがある。スペルミンとスペルミジンなど
の低分子ポリアミンは、プロトン化した多価のポリアミ
ンが、ＤＮＡ間のイオン反発を抑制することにより安定
化することが知られている（ ＴｈｒｅｓｉａＴｈｏｍ
ａｓ ａｎｄ Ｔ． Ｊ． Ｔｈｏｍａｓ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．３２， Ｎｏ．５０ １４
０６８‐１４０７４ （１９９３）、Ｃｈｉｎｇ−Ｈｓ
ｕａｎ Ｔｕｎｇ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｊ ． Ｂｒｅｓ
ｌａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ Ｓｔｅｉｎ，
Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏ
ｌ．２１，Ｎｏ．２３， ５４８９−５４９４ （１９
９３））。しかしながら、実際には、生理的条件下で
は、他のイオンと置き変わり、安定化効果が弱いという
問題点がある。また、アクリジン、ソラレン等は塩基対
間にインターカレートし安定化することが知られている
（Ｍｉｋｈａｉｌ Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖ， ｅｔ ａ
ｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ．９０， ３５０１−３５０５
（１９９３））。ソラレンは、光架橋により二重鎖に
結合することができるものである。ベンゾ［ｅ］ピリド
インドール誘導体は、インターカレーターとポリアミン
の両方の性質を持ち三重鎖特異的に安定化することは知
られている（Ｊ． Ｌ ．Ｍｅｒｇｎｙ， ｅｔ ａ
ｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．２５６， １６８
１−１６８４ （１９９２））。しかしながら、これら
インターカレーターも一般的には、主に二重鎖を安定化
するが三重鎖に対し安定化効果が弱く、また癌誘発性を
有するなど毒性面でも問題がある。[0013] Therefore, in order to solve such problems, it is essential to develop a carrier that carries a foreign gene to a target site and a stabilizer that promotes and stabilizes triplex formation. is there. Conventionally known stabilizers for the formation of double and triple strands of DNA include low molecular weight polyamines and intercalators. It is known that protonated polyvalent polyamines such as spermine and spermidine are stabilized by suppressing ionic repulsion between DNAs (ThresiaThom).
as and T.S. J. Thomas Bioch
chemistry, Vol. 32, no. 50 14
068-14074 (1993), Ching-Hs
uan Tung, Kenneth J. Bres
lauer and Stanley Stein,
Nucleic Acids Research, Vo
l. 21, No. 23, 5489-5494 (19
93)). However, in practice, there is a problem that under physiological conditions, the ions are replaced with other ions, and the stabilizing effect is weak. Also, it is known that acridine, psoralen, and the like are intercalated between base pairs and are stabilized (Mikhal Grigoriev, et a).
l. , Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, Vol. 90, 3501-3505
(1993)). Psoralens are those that can be linked to a duplex by photocrosslinking. Benzo [e] pyridindole derivatives are known to have properties of both intercalators and polyamines and to stabilize triplex specifically (JL Mergny, et a).
l. , Science, Vol. 256, 168
1-11684 (1992)). However, these intercalators also generally stabilize mainly the duplex, but have a weak stabilizing effect on the triplex, and also have problems in toxicity, such as being cancer-inducing.
【００１４】さらに、高分子ポリカチオンであるポリリ
ジンは、ＤＮＡと強く結合し、ＤＮＡのリン酸基間のイ
オン反発を和らげ安定化することが知られている。しか
しながら、ポリリジン単独でＤＮＡと複合体を形成させ
ると、凝縮、沈殿がおこり、もはや特定のＤＮＡを認識
し、二重鎖、三重鎖形成することができないという問題
がある。Furthermore, it is known that polylysine, which is a high molecular weight polycation, strongly binds to DNA and reduces and stabilizes ion repulsion between phosphate groups of DNA. However, when polylysine alone forms a complex with DNA, condensation and precipitation occur, and there is a problem that a specific DNA can no longer be recognized and a double or triple strand cannot be formed.
【００１５】[0015]
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、以上説
明した従来技術において指摘される問題点、すなわち、
(1) 従来のプロトン多価ポリアミン、アグリジン、ソラ
レン等のインターカレーターは二重鎖ＤＮＡ形成は安定
化できるが、三重鎖ＤＮＡ形成に対しては生理的条件下
では安定化する効果が弱いという問題点、(2) 高分子ポ
リカチオンであるポリリジンは、細胞内に導入するため
のＤＮＡと強く結合し該ＤＮＡ間で凝縮、沈殿がおこ
り、このため、細胞内に該ＤＮＡを導入したときに特定
の遺伝子を認識し、二重鎖ＤＮＡ、三重鎖ＤＮＡを形成
することができないという問題点、に鑑み、鋭意研究を
重ねた結果、これらの問題点を解決した新規の核酸安定
化用キャリアーを見出すことに成功し本発明を完成する
に至ったものである。SUMMARY OF THE INVENTION The present inventors have identified the problems pointed out in the prior art described above, namely,
(1) Conventional intercalators such as polyvalent polyamines, agglidine, and psoralen can stabilize the formation of double-stranded DNA, but have a weak effect of stabilizing the formation of triple-stranded DNA under physiological conditions. (2) Polylysine, which is a high molecular weight polycation, strongly binds to DNA to be introduced into cells and condenses and precipitates between the DNAs. Therefore, when polylysine is introduced into cells, it is identified. In view of the problem that it is not possible to recognize the gene of interest and form double-stranded DNA and triple-stranded DNA, as a result of intensive research, a new carrier for stabilizing nucleic acids that solves these problems has been found. The present invention has been successfully completed and the present invention has been completed.
【００１６】すなわち、本発明の目的は、細胞内に導
入する遺伝子と複合体にしたとき容易に可溶化できるキ
ャリアー、外来遺伝子の構造変化を抑制し、優れた外
来遺伝子の可逆性保持機能を有するキャリアー、外来
遺伝子を細胞内に導入することにより形成されるＤＮＡ
二重鎖、ＤＮＡ三重鎖の安定化効果を有する核酸安定化
用キャリアーを得ることである。That is, an object of the present invention is to provide a carrier which can be easily solubilized when complexed with a gene to be introduced into cells, suppress the structural change of the foreign gene, and have an excellent function of maintaining the reversibility of the foreign gene. DNA formed by introducing a carrier or foreign gene into cells
An object of the present invention is to obtain a carrier for stabilizing a nucleic acid having an effect of stabilizing a double strand or a DNA triplex.
【００１７】[0017]
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は、ポリ（カチオン性アミノ酸）を主鎖と
し、かつ前記ポリ（カチオン性アミノ酸）に対して櫛型
に化学的に結合している親水性基を側鎖として有する核
酸安定化用キャリアーを提供するものである。In order to achieve the above-mentioned object, the present invention provides a poly (cationic amino acid) having a main chain and chemically bonding to the poly (cationic amino acid) in a comb-like manner. The present invention provides a carrier for stabilizing a nucleic acid having a hydrophilic group as a side chain.
【００１８】また、本発明は、前記ポリ（カチオン性ア
ミノ酸）が、ポリ（リジン）であることを特徴とする核
酸安定化用キャリアーを提供するものである。The present invention also provides a carrier for stabilizing a nucleic acid, wherein the poly (cationic amino acid) is poly (lysine).
【００１９】さらに、本発明は、前記親水性基が、ポリ
エチレングリコール、ポリエチレングリコール誘導体、
及び糖類からなる群から選択される少なくとも１つであ
ることを特徴とする核酸安定化用キャリアーを提供する
ものである。Further, the present invention provides the method, wherein the hydrophilic group is polyethylene glycol, a polyethylene glycol derivative,
And at least one selected from the group consisting of saccharides.
【００２０】また、本発明は、前記親水性基が、グリコ
サミノグリカン、デキストラン及びポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）またはその誘導体からなる群から選択さ
れる少なくとも１つであることを特徴とする核酸安定化
用キャリアーを提供するものである。Further, the present invention provides the nucleic acid stabilizing method, wherein the hydrophilic group is at least one selected from the group consisting of glycosaminoglycan, dextran and polyethylene glycol (PEG) or a derivative thereof. To provide a carrier for
【００２１】さらに、本発明は、前記親水性基が、ヒア
ルロン酸又はヒアルロン酸塩であることを特徴とする核
酸安定化用キャリアーを提供するものである。Further, the present invention provides a carrier for stabilizing a nucleic acid, wherein the hydrophilic group is a hyaluronic acid or a hyaluronic acid salt.
【００２２】また、本発明は、前記ポリ（カチオン性ア
ミノ酸）と前記親水性基とが、グラフト重合（またはグ
ラフト共重合も含む）していることを特徴とする核酸安
定化用キャリアーを提供するものである。Further, the present invention provides a carrier for stabilizing a nucleic acid, wherein the poly (cationic amino acid) and the hydrophilic group are graft-polymerized (or graft-copolymerized). Things.
【００２３】また、本発明は、前記核酸安定化用キャリ
アーの１０重量％〜９５重量％が前記親水性基であるこ
とを特徴とする核酸安定化用キャリアーを提供するもの
である。The present invention also provides a carrier for stabilizing a nucleic acid, wherein 10% to 95% by weight of the carrier for stabilizing a nucleic acid is the hydrophilic group.
【００２４】また、本発明は、前記ポリ（カチオン性ア
ミノ酸）を構成するカチオン性アミノ酸基の数（Ｘ）
と、前記核酸安定化用キャリアーと複合体を形成するべ
きＤＮＡに含まれるリン酸基の数（Ｙ）との比（Ｘ／
Ｙ）が、０．５〜２の範囲であることを特徴とする核酸
安定化用キャリアーを提供するものである。The present invention also relates to the present invention, wherein the number of cationic amino acid groups constituting the poly (cationic amino acid) (X)
And the number (Y) of the number of phosphate groups (Y) contained in the DNA to form a complex with the carrier for stabilizing nucleic acid (X /
Y) is in the range of 0.5 to 2, and provides a carrier for stabilizing a nucleic acid.
【００２５】さらに、本発明は、ポリ（カチオン性アミ
ノ酸）を主鎖とし、かつ前記ポリ（カチオン性アミノ
酸）に対して櫛型に化学的に結合している親水性基を側
鎖として有する核酸安定化用キャリアーを用いることを
特徴とする核酸生体内安定化方法を提供するものであ
る。Further, the present invention provides a nucleic acid having a poly (cationic amino acid) as a main chain and a side chain having a hydrophilic group chemically bonded to the poly (cationic amino acid) in a comb shape. It is intended to provide a method for stabilizing a nucleic acid in a living body, which comprises using a stabilizing carrier.
【００２６】また、前記核酸安定化用キャリアーが、前
記ポリ（カチオン性アミノ酸）を構成するカチオン性ア
ミノ酸基の数（Ｘ）と、前記核酸安定化用キャリアーと
複合体を形成するべきＤＮＡに含まれるリン酸基の数
（Ｙ）との比（Ｘ／Ｙ）が、０．５〜２の範囲であるこ
とを特徴とする、前記に記載の核酸の生体内安定化方法
を提供するものである。Further, the carrier for stabilizing nucleic acid is included in the number of cationic amino acid groups (X) constituting the poly (cationic amino acid) and in DNA to be complexed with the carrier for stabilizing nucleic acid. The ratio (X / Y) to the number (Y) of the phosphate groups to be prepared is in the range of 0.5 to 2, and the method for stabilizing a nucleic acid in vivo as described above is provided. is there.
【００２７】以下、本発明を実施の形態に即してさらに
詳しく説明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to embodiments.
【００２８】[0028]
（核酸安定化用キャリアー）本発明の核酸安定化用キャ
リアーは、その主鎖が、いわゆるカチオン性アミノ酸の
ポリマーであるものであり、さらに、該主鎖に対し化学
修飾又は化学結合により側鎖を有するものである。具体
的には、上記ポリ（カチオン性アミノ酸）の構造を主鎖
として有し、かつグラフト重合による側鎖を有するもの
である。 ここで、ポリ（カチオン性アミノ酸）として
は、例えば、ポリ（リジン）、ポリ（オルニチン）、
（オルニチン−セリン）のコポリマー、ポリ（リジン）
とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのブロックコポ
リマー、ポリ（オルニチン）とＰＥＧとのブロックコポ
リマー、ポリ（オルニチン−セリン）とＰＥＧブロック
コポリマー等が挙げられる。これらのポリ（カチオン性
アミノ酸）の合成は、望ましい重合度等にも依存する
が、通常公知の重合方法により実施可能である。例え
ば、ε−カルボベンゾキシ−リジン−Ｎ−カルボン酸無
水物およびベンジル−セリン−Ｎ−カルボン酸無水物
を、片末端アミノ基のポリエチレンオキシド（分子量２
００−２５０，０００）等の第１級アミンを開始剤とし
て重合させることにより合成可能である。このポリエチ
レンオキシド−ポリアミノ酸ブロックコポリマーにおけ
るポリアミノ酸部分の分子量は、特には限定されないが
２００〜５０，０００であることが好ましい。(Carrier for Stabilizing Nucleic Acid) The carrier for stabilizing nucleic acid of the present invention has a main chain of a polymer of a so-called cationic amino acid, and further has a side chain formed by chemical modification or chemical bonding to the main chain. Have Specifically, it has the structure of the above-mentioned poly (cationic amino acid) as a main chain and has a side chain by graft polymerization. Here, as the poly (cationic amino acid), for example, poly (lysine), poly (ornithine),
(Ornithine-serine) copolymer, poly (lysine)
And polyethylene glycol (PEG), a block copolymer of poly (ornithine) and PEG, and a block copolymer of poly (ornithine-serine) and PEG. The synthesis of these poly (cationic amino acids) depends on the desired degree of polymerization and the like, but can be usually carried out by a known polymerization method. For example, ε-carbobenzoxy-lysine-N-carboxylic acid anhydride and benzyl-serine-N-carboxylic acid anhydride are converted to polyethylene oxide (molecular weight 2) having an amino group at one terminal.
(00-250,000) and the like. The molecular weight of the polyamino acid moiety in the polyethylene oxide-polyamino acid block copolymer is not particularly limited, but is preferably from 200 to 50,000.
【００２９】さらに、本発明の核酸安定化用キャリアー
は、上記ポリ（カチオン性アミノ酸）の主鎖に、さらに
側鎖として、親水性基がいわゆる櫛型状に導入（結合）
されたものである。導入方法としては特に制限されない
が、グラフト重合による方法が好ましい。具体的にはグ
ラフト重合によって櫛型に導入される親水性基として
は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ
誘導体（例えばメトキシポリエチレングリコールのアル
デヒド誘導体、アミノ酸誘導体、カルボキシメチル誘導
体）、グリコサミノグリカン（例えばヒアルロン酸、ヘ
パリン、コンドロイチン硫酸）、単糖、オリゴ糖、多糖
類等の糖類（例えばデキストラン、アミロース）、ポリ
アクリルアミド、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰ
Ｃ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭ
Ｃ）、合成水溶性高分子などが可能である。特に、本発
明において好ましい側鎖となる親水性基としては、デキ
ストラン（Ｄｅｘ）、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）またはその誘導体、またはヒアルロン酸（ＨＡ）、
ヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム塩、
ヒアルロン酸カリウム塩）である。Further, in the carrier for stabilizing nucleic acid of the present invention, a so-called comb-like hydrophilic group is introduced (bonded) into the main chain of the above-mentioned poly (cationic amino acid) and further as a side chain.
It was done. The method of introduction is not particularly limited, but a method by graft polymerization is preferred. Specifically, examples of the hydrophilic group introduced into the comb by graft polymerization include polyethylene glycol (PEG), PEG
Derivatives (eg, aldehyde derivatives of methoxypolyethylene glycol, amino acid derivatives, carboxymethyl derivatives), glycosaminoglycans (eg, hyaluronic acid, heparin, chondroitin sulfate), sugars such as monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides (eg, dextran, amylose) , Polyacrylamide, hydroxypropylcellulose (HP
C), hydroxypropyl methylcellulose (HPM
C) and synthetic water-soluble polymers. In particular, preferred hydrophilic groups as side chains in the present invention include dextran (Dex) and polyethylene glycol (PE).
G) or a derivative thereof, or hyaluronic acid (HA);
Hyaluronic acid salt (eg, hyaluronic acid sodium salt,
Hyaluronic acid potassium salt).
【００３０】上記、ポリ（カチオン性アミノ酸）を主鎖
とし、親水性基を側鎖にもつグラフト共重合体の合成方
法についても特に制限はなく、通常の公知の有機合成法
により実施することが可能である。すなわち、主鎖重合
体の官能基へ適当な結合生成反応により導入することが
可能となる。この例として本発明では、多糖鎖を側鎖と
する場合、糖鎖還元末端とポリアミノ酸のアミノ基との
反応に基づく結合生成、特にシッフ塩基形成を経由し、
さらに還元することでアミノ結合を生成することが好ま
しい。さらに、別の方法として、デキストランまたはヒ
アルロン酸等の多糖類を親水性の側鎖とする場合は、多
糖の還元末端をポリ（リジン）等のアミノ基とカップリ
ングさせるために、多糖の還元末端をヨウ素等で酸化し
カルボン酸化した後にラクトン化し、アミノ基とカップ
リングさせる方法も可能である。また、多糖の末端では
なく不特定の部分をポリ（リジン）等と結合させること
もでき、この時の合成方法としては、多糖を過ヨウ素酸
で酸化しアルデヒド基を生成させた後に、ポリ（リジ
ン）等のアミノ基と還元アミノ化させる方法などがあ
る。The method for synthesizing the graft copolymer having a poly (cationic amino acid) as a main chain and a hydrophilic group as a side chain is not particularly limited, and may be carried out by a known organic synthesis method. It is possible. That is, it can be introduced into the functional group of the main chain polymer by a suitable bond forming reaction. As an example, in the present invention, when a polysaccharide is used as a side chain, bond formation based on a reaction between a sugar chain reducing terminal and an amino group of a polyamino acid, particularly via Schiff base formation,
It is preferable to generate an amino bond by further reduction. Furthermore, as another method, when a polysaccharide such as dextran or hyaluronic acid is used as a hydrophilic side chain, the reducing end of the polysaccharide is coupled with an amino group of poly (lysine) or the like. Can be oxidized with iodine or the like, carboxylated, then lactonized, and coupled to an amino group. In addition, an unspecified portion instead of the terminal of the polysaccharide can be bound to poly (lysine) or the like. As a synthesis method at this time, after oxidizing the polysaccharide with periodic acid to generate an aldehyde group, And reductive amination with an amino group such as lysine.
【００３１】さらに、ポリエチレングリコールを親水性
の側鎖とするグラフト重合体についても、例えばメトキ
シポリエチレングリコールのアルデヒド誘導体を用いて
同じくシッフ塩基を形成することで実施可能である。
この場合、ポリエチレングリコールをそのまま側鎖とし
て用いることも可能であるが、ポリエチレングリコール
の一方の水酸基を、特に限定はしないが、メトキシ基、
アルキルチオエチレンスルホニル基等で置換して保護
し、他方の水酸基を、特に限定はしないが、アミノ基、
サクシニル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、
チオール基、ジメトキシトリチル基に置換した誘導体を
用いることも可能である。また、実施可能なポリエチレ
ングリコールまたはその誘導体の分子量としては特に限
定されないが、好ましくは３００〜２０、０００、さら
に好ましくは１、０００〜８、０００の平均分子量が最
適である。Further, a graft polymer having polyethylene glycol as a hydrophilic side chain can also be carried out by forming a Schiff base similarly using an aldehyde derivative of methoxy polyethylene glycol, for example.
In this case, it is possible to use polyethylene glycol as it is as a side chain, but one hydroxyl group of polyethylene glycol is not particularly limited, but a methoxy group,
Substituted and protected with an alkylthioethylenesulfonyl group or the like, and the other hydroxyl group is not particularly limited, but may be an amino group,
Succinyl group, carboxyl group, carboxymethyl group,
It is also possible to use a derivative substituted with a thiol group or a dimethoxytrityl group. The molecular weight of polyethylene glycol or a derivative thereof that can be used is not particularly limited, but an average molecular weight of preferably 300 to 20,000, more preferably 1,000 to 8,000 is optimal.
【００３２】また、核酸安定化用キャリアーに対する親
水基の割合は、特に限定されないが、該親水基の種類及
び該キャリアーの使用目的に応じて選択され得る。通常
は核酸安定化用キャリアーに対する親水基の割合は、該
キャリアーの１０重量％〜９５重量％であり、好ましく
は２０重量％〜９５重量％、さらに好ましくは３０重量
％〜９５重量％であればよい。かかる範囲より少ない場
合には、主に親水性基に基づく、十分な可溶化の効果が
得られないし、かかる範囲より大きい場合には、十分な
カチオン性を保持することができずＤＮＡとの凝縮効果
による安定化が得られないこととなる。The ratio of the hydrophilic group to the nucleic acid stabilizing carrier is not particularly limited, but can be selected according to the kind of the hydrophilic group and the purpose of use of the carrier. Usually, the ratio of the hydrophilic group to the nucleic acid stabilizing carrier is 10% to 95% by weight of the carrier, preferably 20% to 95% by weight, more preferably 30% to 95% by weight. Good. When the amount is less than the above range, a sufficient solubilizing effect based mainly on the hydrophilic group cannot be obtained, and when the amount is larger than the above range, sufficient cationicity cannot be maintained and condensation with DNA occurs. Stabilization by the effect cannot be obtained.
【００３３】（本発明に係る新規核酸安定化用キャリア
ーの使用態様）本発明に係る核酸安定化用キャリアーは
主に以下の効果を有するものである。すなわち、細胞
内に導入する遺伝子と複合体にしたとき容易に可溶化で
きるものであること、外来遺伝子の構造変化を抑制
し、優れた外来遺伝子の可逆性保持機能を有するもので
あること、外来遺伝子を細胞内に導入することにより
形成されたＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ三重鎖の安定化効果を
有するものであることである。(Usage of the novel carrier for stabilizing nucleic acid according to the present invention) The carrier for stabilizing nucleic acid according to the present invention mainly has the following effects. That is, it should be one that can be easily solubilized when complexed with the gene to be introduced into the cell, suppress the structural change of the foreign gene, and have an excellent reversibility-retaining function of the foreign gene. It has a stabilizing effect on DNA double strands and DNA triple strands formed by introducing genes into cells.
【００３４】本発明に係る核酸安定化用キャリアーによ
って細胞内に導入可能な核酸の大きさ、種類等は特に限
定されないが、例えば、線状二本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖
ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ等が可能である。
また、本発明に係るキャリアーを使用することにより、
細胞に有用なタンパク質をコードする構造遺伝子を導入
して、該遺伝子を発現させることが可能となる。例え
ば、アンチセンスを導入して特定の遺伝子の発現の制御
を行うことが可能となる。さらに、本発明に係る核酸安
定化用キャリアーは、リボザイム、トリプレックス、ア
プタマー等のキャリアーとしても利用可能である。該オ
リゴヌクレオチドとしては、ホスホジエステル体、ホス
フォロチオエート体、またはその他の誘導体等が使用で
きる。The size and type of nucleic acid that can be introduced into cells by the carrier for stabilizing nucleic acid according to the present invention are not particularly limited. For example, linear double-stranded DNA, circular double-stranded DNA, oligonucleotide, RNA and the like are possible.
Also, by using the carrier according to the present invention,
By introducing a structural gene encoding a useful protein into a cell, the gene can be expressed. For example, it becomes possible to control the expression of a specific gene by introducing antisense. Further, the carrier for stabilizing a nucleic acid according to the present invention can also be used as a carrier for ribozymes, triplexes, aptamers and the like. As the oligonucleotide, a phosphodiester form, a phosphorothioate form, or other derivatives can be used.
【００３５】本発明に係る核酸安定化用キャリアーの核
酸に対する使用量については特に限定されることなく、
使用目的に応じて最適化することは容易である。例え
ば、核酸１μｍｏｌに対して約０．１〜１０００μｍｏ
ｌのキャリアーを使用することが好ましい。The amount of the nucleic acid stabilizing carrier according to the present invention to be used for nucleic acid is not particularly limited.
It is easy to optimize according to the purpose of use. For example, about 0.1 to 1000 μmo per 1 μmol of nucleic acid
It is preferred to use 1 carrier.
【００３６】また、本発明に係る核酸安定化用キャリア
ーを用いた複合体形成における核酸とのチャージ比（す
なわち、キャリアーのカチオン性アミノ酸の数と核酸の
リン酸基の数との比、［キャリアーのカチオン性アミノ
酸基］／［核酸のリン酸基］）については、使用目的に
応じて最適化することが可能である。例えば、該核酸安
定化用キャリアーとＤＮＡは、カチオン性ポリアミノ酸
への親水性基の導入率が低い（２０ｍｏｌ％以下）場
合、上記チャージ比が１付近であれば凝縮するが、ポリ
リジン等のカチオン性ホモポリマーとＤＮＡでは、チャ
ージ比１付近では凝縮するのみならず、沈殿を形成す
る。すなわち、本発明にかかるＤＮＡ生体内キャリアー
とＤＮＡとの複合体においては、凝縮を生じるが、該キ
ャリアー分子の親水性基の存在により沈殿が起こらず、
例えばコロイド状粒子として溶液中に安定に存在すると
いう機能を示す。本発明に係る核酸安定化用キャリアー
においては、上記チャージ比の好ましい範囲は、チャー
ジ比０．５〜２の範囲であり、より好ましくは０．５〜
１．５の範囲である。これらの範囲外にあっては、凝縮
を維持した可溶化ができない。The charge ratio with the nucleic acid in forming a complex using the carrier for stabilizing nucleic acid according to the present invention (ie, the ratio of the number of cationic amino acids in the carrier to the number of phosphate groups in the nucleic acid, [carrier Can be optimized according to the purpose of use. For example, the carrier for stabilizing nucleic acid and DNA condenses when the charge ratio is close to 1 when the introduction ratio of hydrophilic groups into the cationic polyamino acid is low (20 mol% or less), but the cation such as polylysine or the like is condensed. In the case of a homopolymer and DNA, not only condensing but also a precipitate is formed at a charge ratio of around 1. That is, in the complex of the DNA in vivo carrier and DNA according to the present invention, condensation occurs, but precipitation does not occur due to the presence of the hydrophilic group of the carrier molecule.
For example, it exhibits a function of being stably present in a solution as colloidal particles. In the carrier for stabilizing nucleic acid according to the present invention, a preferable range of the charge ratio is a range of 0.5 to 2, more preferably 0.5 to 2.
The range is 1.5. Outside these ranges, solubilization while maintaining condensation cannot be achieved.
【００３７】本発明に係るキャリアーは、さらに、患者
から標的細胞を体外に取り出し、目的とする遺伝子を導
入した後に再びその細胞を患者の体内に戻すという自家
移植による遺伝子治療（ｅｘ ｖｉｖｏ 遺伝子治療）
にも、遺伝子を直接患者に投与する遺伝子治療（ ｉｎ
ｖｉｖｏ 遺伝子治療）にも好ましく使用できるもの
である。また、遺伝子治療方法として、異常（原因）遺
伝子をそのままにして、新しい（正常）遺伝子を付け加
える方法（Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ）と、異常遺伝子を正常遺伝子で置き換える
方法（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ）があるが、どちらにも好ましく使用できる。The carrier according to the present invention further comprises a gene therapy by autotransplantation (ex vivo gene therapy) in which target cells are taken out of the patient, the target gene is introduced, and then the cells are returned to the patient.
In addition, gene therapy in which genes are directly administered to patients (in
Vivo gene therapy). As a gene therapy method, a method of adding a new (normal) gene while leaving the abnormal (cause) gene as it is (Augmentation Gene Th)
erapy) and a method of replacing an abnormal gene with a normal gene (Replacement Gene Thera)
py), but both can be preferably used.
【００３８】また、本発明によれば、ＤＮＡの生体内安
定化のみならず肝臓への臓器特異性を兼ね備えた遺伝子
キャリアーを得ることが可能になる。肝臓を構成する細
胞を対象にした遺伝子の導入は重症肝疾患の治療にとっ
て極めて重要な課題となっている。細胞外マトリックス
の成分として知られているヒアルロン酸の機能の一つと
して、肝臓の内皮細胞がレセプターを介したエンドサイ
トーシスを行うことにより、循環系から極めて効率よく
除かれることが知られている。従って、ＤＮＡとの結合
サイトを持つポリリジンに、肝類洞内皮細胞に特異的に
取り込まれるヒアルロン酸をグラフト化することによ
り、ＤＮＡの生体内安定化のみならず臓器特異性を兼ね
備えた遺伝子キャリアーを得ることができる。Further, according to the present invention, it is possible to obtain a gene carrier having not only stabilization of DNA in vivo but also organ specificity to the liver. Introduction of a gene into cells constituting the liver has become a very important issue for the treatment of severe liver disease. One of the functions of hyaluronic acid, which is known as a component of the extracellular matrix, is that it is known that liver endothelial cells are extremely efficiently removed from the circulatory system by performing receptor-mediated endocytosis. . Therefore, by grafting hyaluronic acid, which is specifically taken up by hepatic sinusoidal endothelial cells, to polylysine having a DNA binding site, a gene carrier having not only in vivo stabilization of DNA but also organ specificity can be obtained. Obtainable.
【００３９】また、本発明に係る核酸安定化用キャリア
ーを用いた調製剤の投与方法は特に限定されないが、非
経口的に行うことが可能であり、また注射投与すること
により好ましく実施できるものである。この場合、本発
明に係る核酸安定化用キャリアーの使用量は、その使用
方法、使用目的等により異なるが、例えば、核酸を含む
キャリアーとして注射投与して用いる場合には、１日量
約０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇを投与するのが
好ましく、より好ましくは、１日量約１μｇ／ｋｇ〜５
０ｍｇ／ｋｇである。The method of administering the preparation using the carrier for stabilizing nucleic acids according to the present invention is not particularly limited, but it can be performed parenterally and can be preferably carried out by injection. is there. In this case, the amount of the carrier for stabilizing nucleic acid according to the present invention varies depending on the method of use, purpose of use, and the like. It is preferred to administer 1 μg / kg to 100 mg / kg, more preferably a daily dose of about 1 μg / kg to 5 mg / kg.
0 mg / kg.
【００４０】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説
明するが、この発明は以下の例に限定されるものではな
い。Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
【００４１】合成例１〜１４（デキストラン修飾による
重合体の合成） （合成例１、２）ポリ-Ｌ-リジン（ＰＬＬ・ＨＢｒ Ｍ
ｎ＝５．１×１０4 、シグマ社製）５０ｍｇ（０．２４
ｍｍｏｌ）を２ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解した
ポリ-Ｌ-リジン溶液を２つ用意した。デキストラン（Ｄ
ｅｘｔｒａｎ Ｔ１０ Ｍｎ＝５．８×１０3 、ファル
マシア社製）３００ｍｇ（５．１７×１０2 ｍｍｏｌ）
を３ｍｌのジメチルスルホキシド（関東化学社製）に溶
解して第１のデキストリン溶液を得た（合成例１）。同
じく、デキストラン４５０ｍｇ（７．７５×１０2ｍｍ
ｏｌ）を４．５ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解して
第２のデキストリン溶液を得た（合成例２）。上記ポリ
-Ｌ-リジン溶液に第１及び第２のデキストラン溶液をそ
れぞれ加え、デキストラン導入率が仕込みで、約２０ｍ
ｏｌ％、約３０ｍｏｌ％の混合溶液にした。それぞれに
酢酸（関東化学社製）３０μｌを加え、撹絆しながら、
２０ｍｏｌ％の混合溶液にはシアノ水素化ホウ素ナトリ
ウム（ＮａＢＨ3 ＣＮ、アルドリッチ化学社製）１５ｍ
ｇを、３０ｍｏｌ％混合溶液にはシアノ水素化ホウ素ナ
トリウム２．５ｍｇをそれぞれ加え、溶液中のポリ-Ｌ-
リジンとデキストランとをグラフト化反応せしめた。４
０℃条件下で２日間撹件した後、透祈膜（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃｕｔ Ｏｆｆ＝１０，００
０、スペクトラム社製）で精製を行い、得られた生成物
を凍結乾燥した。 Synthesis Examples 1 to 14 (by dextran modification)
(Synthesis of Polymer) (Synthesis Examples 1 and 2) Poly-L-lysine (PLL · HBr M
n = 5.1 × 10 4 , Sigma) 50 mg (0.24
mmol) in 2 ml of dimethyl sulfoxide to prepare two poly-L-lysine solutions. Dextran (D
extran T10 Mn = 5.8 × 10 3 (Pharmacia) 300 mg (5.17 × 10 2 mmol)
Was dissolved in 3 ml of dimethyl sulfoxide (manufactured by Kanto Kagaku) to obtain a first dextrin solution (Synthesis Example 1). Similarly, dextran 450 mg (7.75 × 10 2 mm
ol) was dissolved in 4.5 ml of dimethyl sulfoxide to obtain a second dextrin solution (Synthesis Example 2). Above poly
The first and second dextran solutions were added to the -L-lysine solution, and the dextran introduction rate was about 20 m.
ol%, a mixed solution of about 30 mol%. Add 30 μl of acetic acid (Kanto Chemical Co., Ltd.) to each, and stir,
Sodium cyanoborohydride (NaBH 3 CN, manufactured by Aldrich Chemical Co., Ltd.) is 15 m in the 20 mol% mixed solution.
g, and 2.5 mg of sodium cyanoborohydride were added to the 30 mol% mixed solution, and the poly-L-
Lysine and dextran were subjected to a grafting reaction. 4
After stirring at 0 ° C. for 2 days, the permeable membrane (Molecu)
lar Weight Cut Off = 10,00
0, manufactured by Spectrum Inc.), and the obtained product was lyophilized.
【００４２】デキストラン導入率２０モル％のデキスト
ラン修飾重合体の収量は０．２３１４ｇ（収率６９
％）、３０モル％の収量は０．３５７６ｇ（収率７４
％）であった。The yield of the dextran-modified polymer having a dextran introduction rate of 20 mol% was 0.2314 g (yield 69).
%), The yield of 30 mol% was 0.3576 g (74 yield).
%)Met.
【００４３】また、単一物質としての確認は、ゲルパー
ミエイションクロマトグラフ（ＧＰＣ）により行った。
これにより純度は９５％以上であることが確認された。
デキストラン導入率と構造の確認はＮＭＲ（図２参
照）、ＧＰＣ、静的光散乱法による分子量解析により行
った。Further, confirmation as a single substance was carried out by gel permeation chromatography (GPC).
This confirmed that the purity was 95% or more.
The dextran introduction rate and the structure were confirmed by NMR (see FIG. 2), GPC, and molecular weight analysis by static light scattering.
【００４４】（合成例３〜１４）また、合成例３〜１４
において、表１及び表２で示した条件（反応原料として
のデキストランの数平均分子量（Ｍｎ）及びその仕込
量、ＮａＢＨ3ＣＮの仕込量）とした以外は上記合成例
で示した条件と同じ条件でデキストラン修飾による重合
体を合成した。(Synthesis Examples 3 to 14)
, Except that the conditions shown in Tables 1 and 2 (number average molecular weight (Mn) of dextran as a reaction raw material and its charged amount, charged amount of NaBH 3 CN) were used. Was used to synthesize a dextran-modified polymer.
【００４５】[0045]
【表１】 [Table 1]
【００４６】[0046]
【表２】 [Table 2]
【００４７】合成例１５〜２０（ヒアルロン酸修飾重合
体の合成） （合成例１５）上記説明した合成例１の合成条件と、デ
キストランの代わりにヒアルロン酸を使用した以外は同
じ条件で、ポリ‐L-リジンとの反応及び還元アミノ化法
により以下の合成方法により合成した（図３参照）。 Synthesis Examples 15 to 20 (hyaluronic acid-modified polymerization
(Synthesis of isomer) (Synthesis Example 15) Under the same conditions as in Synthesis Example 1 described above except that hyaluronic acid was used in place of dextran, the following was performed by the reaction with poly-L-lysine and the reductive amination method. (See FIG. 3).
【００４８】低分子量のヒアルロン酸は、ヒアルロン酸
ナトリウム塩（分子量59万相当、電気化学工業製）をヒ
アルロニダーゼ（Type I‐S 、シグマ社製）で酵素分解
して調製した。ポリ-Ｌ-リジン（ＰＬＬ‐ＨＢｒ塩、分
子量５万、ペブチド研）１００ｍｇに対して、低分子量
ヒアルロン酸を１００ｍｇまたは２００ｍｇ仕込み、グ
ラフト化した。反応は、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ＝
８．５）１５ｍｌ中で、０．３Ｍシアノ水素化ホウ素ナ
トリウム（ＮａＢＨ3 ＣＮ）、０．５Ｍ塩化ナトリウム
を加えて、３７℃、２日間行った。反応後、塩化ナトリ
ウム水溶液中で透析（分画分子量＝３，５００または１
０，０００の透析膜（フナコシ：スペクトラ／ポア
７））し、末反応のヒアルロン酸を除いた。さらに純水
中で透析することで塩化ナトリウムを除き、凍結乾燥し
た。単一物質としての確認は、ゲルパーミエイションク
ロマトグラフ（ＧＰＣ）により行った。これにより純度
は９５％以上であることが確認された。得られたヒアル
ロン酸修飾重合体はＧＰＣを用いて分子量を測定し、1
Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）によりヒアルロン酸修飾重
合体 の生成の確認を行った（図４参照）。The low molecular weight hyaluronic acid was prepared by enzymatically decomposing hyaluronic acid sodium salt (molecular weight: 590,000, manufactured by Denki Kagaku Kogyo) with hyaluronidase (Type IS, manufactured by Sigma). To 100 mg of poly-L-lysine (PLL-HBr salt, molecular weight: 50,000, Laboratories of Peptide), 100 mg or 200 mg of low molecular weight hyaluronic acid was charged and grafted. The reaction was performed in a 0.1 M borate buffer (pH =
8.5) In 15 ml, 0.3 M sodium cyanoborohydride (NaBH 3 CN) and 0.5 M sodium chloride were added, and the reaction was performed at 37 ° C. for 2 days. After the reaction, the solution is dialyzed in an aqueous sodium chloride solution (molecular weight cut off = 3,500 or 1).
A dialysis membrane of 000 (Funakoshi: Spectra / Pore 7) was used to remove hyaluronic acid from the end reaction. Furthermore, sodium chloride was removed by dialysis in pure water and freeze-dried. Confirmation as a single substance was performed by gel permeation chromatography (GPC). This confirmed that the purity was 95% or more. The molecular weight of the obtained hyaluronic acid-modified polymer was measured using GPC, and 1
The formation of the hyaluronic acid-modified polymer was confirmed by H-NMR (400 MHz) (see FIG. 4).
【００４９】（合成例１６〜２０）同様に他の実験条件
（原料ヒアルロン酸の数平均分子量、及び仕込量）にて
行った合成例１６〜２０で得たのヒアルロン酸修飾重合
体の合成の結果を以下の表３にまとめた。(Synthesis Examples 16 to 20) Similarly, the synthesis of the hyaluronic acid-modified polymer obtained in Synthesis Examples 16 to 20 was performed under other experimental conditions (number-average molecular weight of raw material hyaluronic acid and amount charged). The results are summarized in Table 3 below.
【００５０】[0050]
【表３】 [Table 3]
【００５１】合成例２１〜２３（ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧの
合成法） ３個の別のフラスコ中に、それぞれ４００ｍｇのポリ−
Ｌ−リジン（分子量５０００−１００００）を４ｍｌの
ジメチルスルホキシドに溶解した。これにメトキシポリ
エチレングリコールのアルデヒド誘導体（分子量５００
０、ＰＥＧ−Ａｌｄｅｈｙｄｅ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ
社）のジメチルスルホキシド溶液（２３０ｍｇ／ｍｌ）
をそれぞれ２、４あるいは８ｍｌ加えて混合した。さら
に、シアノホウ素ナトリウムをそれぞれ３５、７０及び
１４０ｍｇ加えて溶解し混合した。各フラスコに３０μ
ｌの酢酸を加え、４０℃で７日間反応した。反応終了
後、反応液を透析および限外ろ過により、生成ポリマー
を単離した。得られた生成物の物性を表４にまとめた。
得られたポリマーの重水中での１Ｈ−ＮＭＲの典型的ス
ペクトルを図９に示す。以下、１Ｈ−ＮＭＲの測定は以
下の装置を使用した：Varian社製、UNITY400Plusspectr
ometer。 Synthesis Examples 21 to 23 (of PLL-g-PEG
Synthesis method) In three separate flasks, 400 mg of poly-
L-Lysine (molecular weight 5000-10000) was dissolved in 4 ml of dimethyl sulfoxide. An aldehyde derivative of methoxypolyethylene glycol (molecular weight 500
0, PEG-Aldehyde, Shearwater
Dimethylsulfoxide solution (230mg / ml)
Was added and mixed, respectively. Further, 35, 70 and 140 mg of sodium cyanoboronate were added and dissolved and mixed. 30μ in each flask
l of acetic acid was added and reacted at 40 ° C. for 7 days. After completion of the reaction, the reaction solution was dialyzed and ultrafiltrated to isolate the produced polymer. Table 4 summarizes the physical properties of the obtained product.
FIG. 9 shows a typical spectrum of 1H-NMR of the obtained polymer in heavy water. Hereinafter, the following apparatus was used for 1H-NMR measurement: manufactured by Varian, UNITY400Plusspectr
ometer.
【００５２】[0052]
【表４】 [Table 4]
【００５３】実施例１〜６（ヒアルロン酸修飾重合体の
イオン強度変化に対する濁度滴定） 実施例１〜６は、合成例１５〜２０でそれぞれ合成して
得たヒアルロン酸修飾重合体を用いて行った。得られた
ヒアルロン酸修飾重合体を水溶液にし、ＮａＣｌ溶液を
加えることでイオン強度を変化させ、その濁度変化を測
定した。 Examples 1 to 6 (of hyaluronic acid-modified polymer
Turbidity titration with respect to ionic strength change) Examples 1 to 6 were carried out using the hyaluronic acid-modified polymers obtained in Synthesis Examples 15 to 20, respectively. The obtained hyaluronic acid-modified polymer was made into an aqueous solution, and the ionic strength was changed by adding a NaCl solution, and the change in turbidity was measured.
【００５４】実験は、ヒアルロン酸修飾重合体を純水３
ｍｌ（または１．５ｍｌ）に溶解させてからすぐに５Ｍ
塩化ナトリウム水溶液を３０秒おきに５μｌずつ加え
て、５００ｎｍにおける吸光度を測定することで行っ
た。吸光度は以下の装置：ベックマン社製、ＤＵ Ｓｅ
ｒｉｅｓ ６００で測定した。In the experiment, the hyaluronic acid-modified polymer was purified with pure water 3
Immediately after dissolving in 5 ml (or 1.5 ml)
The measurement was carried out by adding 5 μl of an aqueous solution of sodium chloride every 30 seconds and measuring the absorbance at 500 nm. The absorbance was measured using the following equipment: DU Se, manufactured by Beckman.
ries 600.
【００５５】合成されたヒアルロン酸修飾重合体は、同
一分子内にポリカチオンとポリアニオンが存在するポリ
マーであり、分子間および分子内でポリイオンコンプレ
ックスが形成され得る。そこで、分子内ポリイオンコン
プレックスの効果を調べるため、イオン強度を変化させ
てヒアルロン酸修飾重合体の溶解性を測定し、ヒアルロ
ン酸／ポリ-Ｌ-リジン混合系のそれと比較した。その結
果を図５に示す。The synthesized hyaluronic acid-modified polymer is a polymer in which a polycation and a polyanion are present in the same molecule, and a polyion complex can be formed between molecules and within the molecule. Therefore, in order to investigate the effect of the intramolecular polyion complex, the solubility of the hyaluronic acid-modified polymer was measured by changing the ionic strength, and compared with that of the hyaluronic acid / poly-L-lysine mixed system. The result is shown in FIG.
【００５６】イオン強度が０に近い点で濁りは見られな
いが、これは用いたポリマーに含有されるポリ-Ｌ-リジ
ンが多く、結果的にカチオンが多く（チャージ比で０．
３〜０．７）なり、過剰のカチオンが溶解性の向上に寄
与したためである。この条件では、該ポリマーはコロイ
ド粒子、またはコアセルベート粒子として存在している
と推定される。さらに、ＮａＣｌを加えてイオン強度を
上げた場合に急激な濁度の上昇が観察された。これは一
種の塩析効果であり、上記コロイド粒子が凝集して沈殿
が生じた結果であると推定される。さらにＮａＣｌを加
えてイオン強度を上げた場合、ある特定のイオン強度に
おいて急激な濁度の低下が観察された。これは、ヒアル
ロン酸修飾重合体系では、ある特定のイオン強度では分
子間ポリイオンコンプレックスの解離も生じるが、分子
内ポリイオンコンプレックスの解離も生じるためであ
る。No turbidity is observed at a point where the ionic strength is close to 0, but this is because the polymer used contains a large amount of poly-L-lysine, and consequently a large amount of cations (a charge ratio of 0.1%).
This is because the excess cations contributed to the improvement of solubility. Under these conditions, the polymer is presumed to be present as colloid particles or coacervate particles. Further, when ionic strength was increased by adding NaCl, a sharp increase in turbidity was observed. This is a kind of salting-out effect, and is presumed to be a result of the aggregation of the colloid particles and the precipitation. When the ionic strength was further increased by adding NaCl, a sharp decrease in turbidity was observed at a specific ionic strength. This is because in the hyaluronic acid-modified polymer system, at a certain ionic strength, dissociation of the intermolecular polyion complex occurs, but also dissociation of the intramolecular polyion complex.
【００５７】比較例１ 比較例として、実施例１〜６と同様の方法により、ヒア
ルロン酸修飾重合体と等しい組成で単純に混合したのみ
のヒアルロン酸／ポリ-Ｌ-リジン混合物を用いた系の濁
度を測定した。COMPARATIVE EXAMPLE 1 As a comparative example, a system using a hyaluronic acid / poly-L-lysine mixture simply mixed with the same composition as the hyaluronic acid-modified polymer was prepared in the same manner as in Examples 1 to 6. Turbidity was measured.
【００５８】この混合系でもヒアルロン酸修飾重合体系
と同様に、イオン強度が０に近い点では濁りは見られな
かった。ＮａＣｌを加えてイオン強度を上げると急激に
濁度が上昇し、さらにＮａＣｌを加えてイオン強度を上
げると、イオン強度に対応して濁度が直線的に低下する
ことが観察された。従って、この混合系では、ミクロ的
には分子間ポリイオンコンプレックスの解離と形成が絶
えず生じているが、全体としてはイオン強度の増加の為
に解離が進み、濁度の低下が段階的におきている。As in the case of the hyaluronic acid-modified polymer system, no turbidity was observed at a point where the ionic strength was close to 0 in this mixed system. It was observed that when the ionic strength was increased by adding NaCl, the turbidity increased sharply, and when the ionic strength was further increased by adding NaCl, the turbidity decreased linearly in accordance with the ionic strength. Therefore, in this mixed system, the dissociation and formation of the intermolecular polyion complex are constantly occurring microscopically, but as a whole, the dissociation proceeds due to the increase in ionic strength, and the turbidity decreases gradually. I have.
【００５９】実施例７〜９（ヒアルロン酸修飾重合体の
ｐＨ変化に対する濁度滴定） 合成例１５、１６、１９で合成して得られた３種類のヒ
アルロン酸修飾重合体について、ｐＨを変化させて濁度
滴定を行った。実験は、一定のＮａＣｌ濁度下で（０、
１５０、３００ｍＭ）高ｐＨから１Ｍ ＨＣｌを加えて
ｐＨを下げるか、低ｐＨから１Ｍ ＮａＯＨを加えてｐ
Ｈを上げ、５００ｎｍにおける吸光度を測定することに
より行った。 Examples 7 to 9 (of hyaluronic acid-modified polymer
Turbidity titration with respect to pH change) The turbidity titration was carried out for three types of hyaluronic acid-modified polymers obtained in Synthesis Examples 15, 16 and 19 while changing the pH. The experiments were performed under constant NaCl turbidity (0,
150, 300 mM) Add pH 1M from high pH to lower pH, or add pH 1M from low pH to add 1M NaOH.
H was raised and the absorbance at 500 nm was measured.
【００６０】また、ヒアルロン酸修飾重合体がイオン強
度によって３つのコンフォメーションをとることが示唆
されたので、さらに濁度変化のｐＨ依存性について異な
るイオン強度で測定した（図６、７、８参照）。その結
果、高イオン強度ほど濁度が低下することがわかった。
これは図５の結果とも一致しているものである。また、
ヒアルロン酸修飾重合体のＮａＣｌ濃度が０ｍＭの曲線
を除き、全体的に中性ｐＨ領域では濁りが見られ、両側
の高ｐＨと低ｐＨ領域では濁りが消えることがわかっ
た。すなわち、ヒアルロン酸修飾重合体系では、中性ｐ
Ｈ領域では分子内ポリイオンコンプレックスを形成して
沈殿が生じるが、高ｐＨ領域では、ポリリジンのイオン
の状態が不安定となり、分子内ポリイオンコンプレック
スが解離し、ポリリジン間で凝集して疎水的コアを形成
し、そのまわりをヒアルロン酸が覆うような形で存在し
ているため溶解性が増すことによるものである。一方低
ｐＨ領域ではヒアルロン酸のイオン化が不安定となる代
わりに、ポリリジンが溶解性の向上に寄与する。Since it was suggested that the hyaluronic acid-modified polymer takes three conformations depending on the ionic strength, the pH dependence of the turbidity change was further measured at different ionic strengths (see FIGS. 6, 7 and 8). ). As a result, it was found that the higher the ionic strength, the lower the turbidity.
This is also consistent with the result of FIG. Also,
Except for the curve in which the NaCl concentration of the hyaluronic acid-modified polymer was 0 mM, turbidity was observed in the neutral pH region as a whole, and turbidity disappeared in the high pH and low pH regions on both sides. That is, in the hyaluronic acid-modified polymer system, neutral p
In the H region, precipitation occurs by forming an intramolecular polyion complex, but in the high pH region, the state of polylysine ions becomes unstable, and the intramolecular polyion complex dissociates and aggregates between polylysines to form a hydrophobic core. However, this is because hyaluronic acid is present in such a form that the hyaluronic acid covers the periphery thereof, so that the solubility increases. On the other hand, in the low pH region, ionization of hyaluronic acid becomes unstable, and polylysine contributes to improvement in solubility.
【００６１】ここで、ヒアルロン酸修飾重合体のＮａＣ
ｌ濁度が０ｍＭの曲線が、中性ｐＨ領域ではなく高ｐＨ
領域で上昇した理由としては、イオン強度が０に近い点
で測定した結果であり、すなわち、イオン強度が０に近
い点では、ヒアルロン酸修飾重合体はコロイド粒子とし
て存在するが、わずかなイオン強度の増加により凝集す
るため実験操作の際のわずかなＮａＣｌ濃度の増加が影
響したものと推定される。Here, the hyaluronic acid-modified polymer NaC
The curve with a turbidity of 0 mM shows a high pH instead of a neutral pH range.
The reason for the increase in the region is the result of measurement at a point where the ionic strength is close to 0, that is, at the point where the ionic strength is close to 0, the hyaluronic acid-modified polymer exists as colloidal particles, but a small It is presumed that a slight increase in the NaCl concentration during the experimental operation had an effect due to aggregation due to an increase in the concentration.
【００６２】比較例２ 比較のため、実施例７〜９と同様の方法により、ヒアル
ロン酸修飾重合体と等しい組成で単純に混合したのみの
ヒアルロン酸／ポリ-Ｌ-リジン混合物を用いた系でもｐ
Ｈ変化に対する濁度を測定した。ヒアルロン酸／ポリ-
Ｌ-リジン混合物を用いた系でｐＨ変化に対する濁度を
測定した結果を図６、図７、及び図８に示した。一般的
に高イオン強度ほど濁度が低下しており、これは図５の
結果とも一致する。この混合系では上記ヒアルロン酸修
飾重合体系とは異なった溶解性を示す。すなわち、ヒア
ルロン酸とポリリジンそれぞれ単独では溶解して濁度変
化はないが、混合することにより両者がイオン状態で存
在するため中性ｐＨ領域で分子間ポリイオンコンプレッ
クスを形成し、濁度が増加する。 Comparative Example 2 For comparison, a system using a hyaluronic acid / poly-L-lysine mixture simply mixed with the same composition as the hyaluronic acid-modified polymer was prepared in the same manner as in Examples 7 to 9. p
The turbidity for the H change was measured. Hyaluronic acid / poly-
The results of measuring the turbidity with respect to the pH change in the system using the L-lysine mixture are shown in FIGS. 6, 7, and 8. Generally, the turbidity decreases as the ionic strength increases, which is also consistent with the results in FIG. This mixed system shows different solubility from the hyaluronic acid-modified polymer system. That is, hyaluronic acid and polylysine alone dissolve and do not change in turbidity, but when mixed, both exist in an ionic state, so that an intermolecular polyion complex is formed in a neutral pH region, and turbidity increases.
【００６３】実施例１０（デキストラン修飾重合体とＤ
ＮＡとの複合体形成） 合成例１４で合成して得られたデキストラン導入率２０
ｍｏｌ％、９０ｗｔ％のポリ-Ｌ-リジン−デキストラン
修飾重合体（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ）を用いてＤＮＡとの
イオン性複合体形成による濁りもしくは沈殿物生成を、
溶液の５００ｎｍにおける吸光度測定により分光学的に
行い評価した。 Example 10 (Dextran-modified polymer and D
Complex formation with NA) Dextran introduction rate 20 obtained by synthesis in Synthesis Example 14
turbidity or precipitate formation due to ionic complex formation with DNA using mol-%, 90 wt-% poly-L-lysine-dextran modified polymer (PLL-g-Dex).
The solution was evaluated spectrophotometrically by measuring the absorbance at 500 nm.
【００６４】ＰＢＳまたは１０分の１に希釈したＰＢＳ
で１００μｇ／ｍｌ（０．３０３μｍｏｌ／ｍｌ）にな
るよう調製したＤＮＡ（Ｃａｌｆ ｔｈｙｍｕｓ 、シ
グマ社製）溶液１ｍｌにデキストラン修飾重合体溶液を
ＤＮＡに対しチャージ比が変わるように加え全量を２．
５ｍｌにした。ここでチャージ比とは、（重合体のアミ
ノ基のモル数）／（ＤＮＡのリン酸基のモル数）を意味
する。ＰＢＳ中およびイオン強度の低いＰＢＳ×１／１
００中での複合体の濁度を測定した。PBS or PBS diluted 1/10
A dextran-modified polymer solution was added to 1 ml of a DNA (Calthymus, Sigma) solution prepared so as to have a concentration of 100 μg / ml (0.303 μmol / ml) by adding the total amount of the solution to 2.
Make up to 5 ml. Here, the charge ratio means (mol number of amino group of polymer) / (mol number of phosphate group of DNA). PBS x 1/1 in PBS and low ionic strength
The turbidity of the complex in 00 was measured.
【００６５】デキストラン導入率２０モル％のデキスト
ラン修飾重合体とＤＮＡとの複合体のＰＢＳ中での溶解
性とポリリジンとＤＮＡとの複合体の溶解性の結果を図
１０に示した。縦軸は、濁度を５００ｎｍにおける吸光
度で示し、横軸は、ポリマーとＤＮＡのチャージ比を表
す。デキストラン櫛型共重合体では、チャージ比を０〜
８まで変えて測定した。デキストラン修飾重合体では、
等モル量および、過剰のＤＮＡを加えても、濁度の上昇
は見られず、沈殿が形成されずに高い溶解性を確認し
た。すなわち、これはＤＮＡと該重合体を混合した際に
形成される複合体が、親水性デキストラン鎖を導入する
ことにより可溶性となったためである。FIG. 10 shows the results of the solubility of the complex of dextran-modified polymer and DNA having a dextran introduction rate of 20 mol% in PBS in PBS and the solubility of the complex of polylysine and DNA in PBS. The vertical axis indicates turbidity by absorbance at 500 nm, and the horizontal axis indicates the charge ratio between the polymer and DNA. In the dextran comb copolymer, the charge ratio is 0 to 0.
The measurement was carried out by changing up to 8. For dextran-modified polymers,
Even when an equimolar amount and an excessive amount of DNA were added, no increase in turbidity was observed, and high solubility was confirmed without forming a precipitate. That is, this is because the complex formed when the DNA and the polymer are mixed becomes soluble by introducing a hydrophilic dextran chain.
【００６６】比較例３ 比較のため実施例１０と同一の方法により、ポリ-Ｌ-リ
ジン（ＰＬＬ・ＨＢｒ、ペプチド研究所製）溶液を用い
てＤＮＡとのイオン性複合体形成による濁りもしくは沈
殿物生成の検討を行った。ポリリジンについてはチャー
ジ比は、０〜１５８まで変えて測定した。COMPARATIVE EXAMPLE 3 For comparison, turbidity or precipitate due to the formation of an ionic complex with DNA using poly-L-lysine (PLL / HBr, manufactured by Peptide Research Institute) solution in the same manner as in Example 10. The generation was examined. For polylysine, the charge ratio was changed from 0 to 158 and measured.
【００６７】ポリリジンとＤＮＡをチャージ比１付近で
混合すると凝縮し、生理条件的イオン強度下では、沈殿
する。図示されていないが、ＰＢＳ×ｌ／１００では、
沈殿は見られなかったが、ポリリジンおよびＤＮＡ過剰
の状態では、沈殿が生じた。When polylysine and DNA are mixed at a charge ratio of about 1, they condense and precipitate under ionic strength under physiological conditions. Although not shown, in PBS × 1/100,
No precipitation was observed, but in the presence of excess polylysine and DNA, precipitation occurred.
【００６８】実施例１１（ヒアルロン酸修飾重合体とＤ
ＮＡとの複合体形成） 合成例１９で合成して得られたヒアルロン酸修飾重合体
と、ＤＮＡ（Ｐｏｌｙ（ｄＡ）、Ｐｏｌｙ（ｄＴ））
（それぞれ約２００塩基のポリデオキシアデニンとポリ
デオキシチミジンのホモポリマー、ファルマシア製）と
の複合体を形成させるため、１Ｍ ＮａＣｌ溶液中で上
記ヒアルロン酸修飾重合体の分子内ポリイオンコンプレ
ックスを解離させた後、その溶液に上記ＤＮＡを加える
ことで行った。 Example 11 (Hyaluronic acid-modified polymer and D
Formation of Complex with NA) Hyaluronic acid-modified polymer synthesized in Synthesis Example 19 and DNA (Poly (dA), Poly (dT))
(A homopolymer of polydeoxyadenine and polydeoxythymidine of about 200 bases each, manufactured by Pharmacia), after dissociating the intramolecular polyion complex of the hyaluronic acid-modified polymer in a 1 M NaCl solution. The above DNA was added to the solution.
【００６９】ヒアルロン酸修飾重合体のポリリジン部位
はポリカチオンであるため、ポリアニオンであるＤＮＡ
とイオンコンプレックスを作ることが予想されるが、ヒ
アルロン酸修飾重合体のヒアルロン酸もポリアニオンな
ので、ＤＮＡとポリリジンの複合体形成を阻害すること
も考えられるため、エチジウムブロミド（Ethidium Bro
mide）を用いた蛍光測定でヒアルロン酸修飾重合体とＤ
ＮＡの複合体形成を以下のように確認した。Since the polylysine site of the hyaluronic acid-modified polymer is a polycation, the polyanion DNA
Although it is expected that an ion complex is formed, the hyaluronic acid of the hyaluronic acid-modified polymer is also a polyanion, which may inhibit the formation of a complex between DNA and polylysine.
hyeuronic acid modified polymer and D
The complex formation of NA was confirmed as follows.
【００７０】（蛍光測定によるヒアルロン酸修飾重合体
とＤＮＡの複合体形成の確認）ＤＮＡに対してチャージ
比（ヒアルロン酸修飾重合体のアミノ基のカチオン／Ｄ
ＮＡのリン酸基のアニオン）で０〜３倍になるようにヒ
アルロン酸修飾重合体を１Ｍ−ＮａＣｌ＋ＰＢＳ（−）
（２．６８ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ
4 、１．４７ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 ）溶液に溶解させた。
そこに牛胸腺由来ＤＮＡ（２．５ｘ１０-5g）を撹拌し
ながら加えた。３０分静置後、ＮａＣｌ濃度が１５０ｍ
ＭになるようにＤＮＡ複合体溶液を希釈した。そして、
ＤＮＡのリン酸基に対して２％モルのエチジウムブロミ
ド（Ethidium Bromide）を加え、添加後すぐに蛍光光度
計（ジャスコ社製、ＦＰ−７７７型）により蛍光強度を
励起光２６０ｎｍ、蛍光６００ｎｍで測定した。(Confirmation of Complex Formation between Hyaluronic Acid-Modified Polymer and DNA by Fluorescence Measurement) The charge ratio (cation of amino group of hyaluronic acid-modified polymer / D
Hyaluronic acid-modified polymer in 1M-NaCl + PBS (-) so that the amount of the hyaluronic acid-modified polymer becomes 0 to 3 times with the anion of the phosphate group of NA.
(2.68 mM KCl, 8.1 mM Na 2 HPO
4 and 1.47 mM KH 2 PO 4 ) solution.
Bovine thymus-derived DNA (2.5 × 10 −5 g) was added thereto with stirring. After standing for 30 minutes, the NaCl concentration is 150 m
The DNA complex solution was diluted to M. And
2% mol of ethidium bromide was added to the phosphoric acid group of DNA, and immediately after the addition, the fluorescence intensity was measured with a fluorometer (FP-777, manufactured by Jusco) at an excitation light of 260 nm and a fluorescence of 600 nm. did.
【００７１】エチジウムブロミド（Ethidium Bromide）
はＤＮＡのインターカレー夕ーで、ＤＮＡに対して塩基
間にインターカレートして発蛍光性となり蛍光が観察さ
れることが知られている。一方、ポリリジンのようなポ
リカチオンとＤＮＡが相互作用するとＤＮＡのアニオン
が相殺されてエチジウムブロミド（Ethidium Bromide）
が塩基間に入りにくくなり、かつＤＮＡの凝縮（ｃｏｍ
ｐａｃｔｉｏｎ）がおきることでエチジウムブロミド
（Ethidium Bromide）が塩基間にインターカレートせ
ず、蛍光が観察されないことが知られている（Ｈｅｚｉ
Ｇｅｒｓｈｏｎｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ， Ｖｏｌ．３２， ７１４３，（１９９
３））。そこでヒアルロン酸修飾重合体／ＤＮＡ複合体
にエチジウムブロミド（Ethidium Bromide）を添加し、
その蛍光強度変化をチャージ比に対してプロットした結
果を図１１に示した。Ethidium Bromide
Is a DNA intercalation, and it is known that DNA is intercalated between bases and becomes fluorescent so that fluorescence is observed. On the other hand, when a DNA interacts with a polycation such as polylysine, the anion of the DNA is offset and ethidium bromide is removed.
Is difficult to enter between bases, and DNA condensation (com)
It is known that the occurrence of E. coli does not cause intercalation of Ethidium Bromide between bases and no fluorescence is observed (Hezi).
Gershonet al. , Biochemis
try, Vol. 32, 7143, (199
3)). Then, ethidium bromide (Ethidium Bromide) was added to the hyaluronic acid-modified polymer / DNA complex,
FIG. 11 shows the result of plotting the change in the fluorescence intensity with respect to the charge ratio.
【００７２】ヒアルロン酸修飾重合体の割合が増すと蛍
光強度が低下することが見られた。この結果は明らか
に、ＤＮＡがヒアルロン酸修飾重合体のポリリジン部位
と相互作用していることを示し、さらに、チャージ比が
１以上で蛍光強度が一定となることは、ヒアルロン酸修
飾重合体のポリリジン部位とＤＮＡがチャージ比１：１
で相互作用していることを示している。従ってこの条件
では、ヒアルロン酸が結合し得るポリリジンのカチオン
が相殺されるため、ヒアルロン酸修飾重合体のヒアルロ
ン酸部位がポリリジンとコンプレックスを形成せず、ま
た蛍光強度の大きな減少は見られないことから、ヒアル
ロン酸修飾重合体がＤＮＡを安定化していること、ポリ
リジンを単独で使用した場合ほどＤＮＡの構造変化を引
き起こさないことがわかる。It was found that the fluorescence intensity decreased as the proportion of the hyaluronic acid-modified polymer increased. This result clearly shows that the DNA interacts with the polylysine site of the hyaluronic acid-modified polymer, and that the fluorescence intensity is constant at a charge ratio of 1 or more, indicating that the polylysine of the hyaluronic acid-modified polymer is constant. 1: 1 charge ratio between site and DNA
Indicates that they are interacting. Therefore, under these conditions, the cation of polylysine to which hyaluronic acid can bind is offset, so that the hyaluronic acid site of the hyaluronic acid-modified polymer does not form a complex with polylysine, and there is no significant decrease in fluorescence intensity. It can be seen that the hyaluronic acid-modified polymer stabilizes the DNA and that the polylysine does not cause the structural change of the DNA as much as when used alone.
【００７３】比較例４ 比較のため実施例１１と同様の方法によりポリ-Ｌ-リジ
ンとＤＮＡとの複合体を形成し、エチジウムブロミド
（Ethidium Bromide）を用いて蛍光を測定した。該ポリ
マーの割合が増すと蛍光強度の低下が観察され、ＤＮＡ
に対してチャージ比で１／３以上で蛍光強度がほとんど
消失した。このことは、ポリリジン／ＤＮＡ複合体が非
常に強い相互作用をするためにＤＮＡが強く凝縮（ｃｏ
ｍｐａｃｔｉｏｎ）される結果、エチジウムブロミド
（Ethidium Bromide）が塩基間にインターカレートでき
ないことを示している。さらにポリマーの割合が増える
とチャージ比１で蛍光強度が最小になり、それ以降は蛍
光強度の上昇が観察されることより（図１１）、ポリリ
ジン／ＤＮＡ複合体が最も強い相互作用を示すのはチャ
ージ比１のときであり、この条件下では、相互作用が強
すぎて測定ができないことがわかった。 Comparative Example 4 For comparison, a complex of poly-L-lysine and DNA was formed in the same manner as in Example 11, and the fluorescence was measured using ethidium bromide. When the proportion of the polymer increases, a decrease in the fluorescence intensity is observed,
When the charge ratio was 1/3 or more, the fluorescence intensity almost disappeared. This indicates that the DNA is strongly condensed (co) due to the very strong interaction of the polylysine / DNA complex.
The results show that ethidium bromide cannot intercalate between bases. When the proportion of the polymer further increases, the fluorescence intensity becomes minimum at a charge ratio of 1, and thereafter, the increase in the fluorescence intensity is observed (FIG. 11). Therefore, the polylysine / DNA complex exhibits the strongest interaction. At a charge ratio of 1, it was found that under these conditions, the interaction was too strong to measure.
【００７４】実施例１２（円二色性（ＣＤ）測定） ＤＮＡと本発明に係るデキストラン修飾重合体との複合
体中のＤＮＡの構造変化をＣＤスペクトルにより評価し
た。以下、円二色性（ＣＤ）の測定はJASCO社製、J-600
spectropolarimeterを使用した。ここで測定はすべて濁
度測定に使ったサンプル（合成例１で合成して得られた
デキストラン修飾重合体）を用いて行った。ＣＤスペク
トルの結果を図１２に示す。ＰＢＳ×１／１００中のデ
キストラン修飾重合体とＤＮＡの複合体、及びＰＢＳ中
のデキストラン修飾重合体とＤＮＡの複合体のポリマー
のＣＤスペクトル変化を表した。デキストラン修飾重合
体を加えても、ＣＤスペクトルはほとんど変化しない。
生理的イオン強度下でも同様である。すなわち、デキス
トラン修飾重合体はＤＮＡは該重合体と弱く相互作用す
るのみであり、ＤＮＡの構造に強い変化を引き起こさな
いことを示している。該重合体とＤＮＡの複合体は、図
１３で模式的に示したようように、ＤＮＡの構造に大き
な変化を与えず、相互作用によりＤＮＡを可溶化しうる
ものである。また、以下で説明するように、ＤＮＡの構
造が大きく変化せずに結合しているにもかかわらず、血
清中の酵素に対しＤＮＡが分解されない。このことは、
デキストランの導入率が２０ｍｏｌ％（ポリリジンのア
ミノ基５個のうち１つにデキストラン鎖が導入されてい
る。）と高いため、ポリリジンとＤＮＡの強い相互作用
を抑制し、ＤＮＡの構造を維持でき、さらにそのデキス
トラン基が、酵素反応によるＤＮＡの分解を抑制してい
ることを示している。これらの結果は本発明に係る重合
体はＤＮＡと結合し、ＤＮＡの二重鎖または三重鎖にお
けるアニオン間の反発を、ポリリジンのカチオンで抑制
し、安定化させ、さらには、ＤＮＡの構造を維持する複
合体を形成するため、一本鎖ＤＮＡが他の一本鎖、二重
鎖を認識し、二重鎖、三重鎖形成を促進することを示し
ている。 Example 12 (Measurement of Circular Dichroism (CD)) The structural change of DNA in a complex of DNA and the dextran-modified polymer according to the present invention was evaluated by CD spectrum. Hereinafter, measurement of circular dichroism (CD) is made by JASCO, J-600.
A spectropolarimeter was used. Here, all measurements were performed using the sample used for turbidity measurement (dextran-modified polymer obtained by synthesis in Synthesis Example 1). FIG. 12 shows the results of the CD spectrum. The CD spectrum changes of the complex of the dextran-modified polymer and DNA in PBS × 1/100 and the polymer of the complex of the dextran-modified polymer and DNA in PBS are shown. The addition of the dextran-modified polymer causes little change in the CD spectrum.
The same applies under physiological ionic strength. That is, the dextran-modified polymer indicates that DNA only weakly interacts with the polymer and does not cause a strong change in the structure of DNA. As shown schematically in FIG. 13, the complex of the polymer and the DNA is capable of solubilizing the DNA by interaction without causing a significant change in the structure of the DNA. Further, as described below, the DNA is not degraded by the enzyme in the serum, despite the fact that the DNA structure is bound without largely changing. This means
Since the introduction ratio of dextran is as high as 20 mol% (a dextran chain is introduced into one of five amino groups of polylysine), strong interaction between polylysine and DNA can be suppressed, and the structure of DNA can be maintained. Furthermore, it shows that the dextran group suppresses the degradation of DNA by an enzymatic reaction. These results indicate that the polymer according to the present invention binds to DNA, suppresses repulsion between anions in the double or triple strand of DNA with the cation of polylysine, stabilizes it, and further maintains the structure of DNA. This indicates that the single-stranded DNA recognizes other single-stranded and double-stranded DNAs and promotes the formation of double- and triple-stranded DNAs to form a complex.
【００７５】比較例５ 比較として、実施例１２と同様に、ＤＮＡとポリ-Ｌ-リ
ジンとの複合体中のＤＮＡの構造変化をＣＤスペクトル
により評価した。そのＣＤスペクトルの結果を図１２に
示す。ＰＢＳ×１／１００中のポリ-Ｌ-リジンとＤＮＡ
の複合体のポリマーのＣＤスペクトル変化を表した。Ｐ
ＢＳ中では、ボリ-Ｌ-リジンとＤＮＡの複合体は沈殿形
成するため、沈殿の生じない１００倍希釈ＰＢＳ中で測
定した。ＤＮＡ単独は、点線で示した。このＤＮＡは、
２６０〜３００ｎｍでは正の値、２２０〜２６０ｎｍで
は負の値を示しているのでＢ型ＤＮＡである。ここにポ
リ-Ｌ-リジンを加えると、右にシフトし、２２０〜２６
０ｎｍの負の値は大きく、２６０〜３００ｎｍの正の値
が小さくなり、ＣＤスペクトルは大きく変化した。この
ことは、ＤＮＡがＢ型からＣ型ＤＮＡに近い形に変化し
たことを示す（Ｄｅｘｔｅｒ Ｓ． Ｍｏｏｒｅ ａｎ
ｄ Ｔｈｏｍａｓ Ｅ． Ｗａｇｎｅｒ，Ｂｉｏｐｏｌ
ｙｍｅｒｓ， Ｖｏｌ．１３， ９７７−９８６（１９
７４） ）。すなわち、ポリリジンとＤＮＡの複合体
は、凝縮により大きな構造変化を起こし、ポリリジンと
ＤＮＡの複合体は、図１３に模式的に示されるように凝
縮し、生理的イオン条件下では沈殿することがわかっ
た。 Comparative Example 5 As a comparison, as in Example 12, the change in the structure of the DNA in the complex of DNA and poly-L-lysine was evaluated by CD spectrum. FIG. 12 shows the result of the CD spectrum. Poly-L-lysine and DNA in PBS × 1/100
2 shows the change in CD spectrum of the polymer of the conjugate. P
Since the complex of poly-L-lysine and DNA precipitates in BS, the measurement was carried out in 100-fold diluted PBS without precipitation. DNA alone is indicated by the dotted line. This DNA is
Since it shows a positive value at 260 to 300 nm and a negative value at 220 to 260 nm, it is a B-type DNA. When poly-L-lysine is added here, it shifts to the right, 220-26
The negative value of 0 nm was large, the positive value of 260 to 300 nm was small, and the CD spectrum changed significantly. This indicates that the DNA changed from B-type to a form close to C-type DNA (Dexter S. Moore and Anne).
d Thomas E.C. Wagner, Biopol
ymers, Vol. 13, 977-986 (19
74)). That is, the complex of polylysine and DNA causes a large structural change by condensation, and the complex of polylysine and DNA condenses as shown schematically in FIG. 13 and precipitates under physiological ionic conditions. Was.
【００７６】実施例１３（デキストラン櫛型共重合体の
安定化効果） 本発明にかかるデキストラン修飾重合体の二重鎖ＤＮＡ
に与える安定化効果をＤＮＡの融解曲線により調べた。
デキストラン修飾重合体とＤＮＡ（ｐｏｌｙ（ｄＡ）、
ｐｏｌｙ（ｄＴ））（それぞれ約２００塩基のホモポリ
マー、ファルマシア社製）をＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ＝
７．２、０〜１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，リン酸緩衝液）でチャージ比を０、０．２、０．
５、１、２、１０と変えて、ＰＢＳ中で複合体を形成さ
せた。これらの溶液中のＤＮＡ濃度は、０．４ｕｎｉｔ
ｓ／ｍｌとなるようにした。複合体の溶液を０．２℃／
分、または、０．５℃／分の速さで温度を１１０℃まで
上げた後、下げていき、その時の２６０ｎｍにおける吸
光度を吸光光度計（ＤＵ Ｓｅｒｉｅｓ ６００ ベッ
クマン社）で測定した。 Example 13 (Dextran comb copolymer)
Stabilizing effect) Double-stranded DNA of dextran-modified polymer according to the present invention
The stabilizing effect on DNA was examined by a melting curve of DNA.
Dextran-modified polymer and DNA (poly (dA),
poly (dT)) (a homopolymer of about 200 bases each, manufactured by Pharmacia) in PBS (10 mM, pH =
7.2, 0-150 mM NaCl, 0.5 mM ED
TA, phosphate buffer) to charge ratios of 0, 0.2, 0.
Complexes were formed in PBS, changing to 5,1,2,10. The DNA concentration in these solutions was 0.4 unit
s / ml. 0.2 ° C /
After the temperature was raised to 110 ° C. at a rate of 0.5 ° C./minute or 110 ° C./minute, the temperature was lowered, and the absorbance at 260 nm was measured with an absorptiometer (DU Series 600 Beckman).
【００７７】また、ＰＢＳ中のＮａＣｌ濃度を０ｍＭ、
５０ｍＭ、１５０ｍＭ、１０００ｍＭと変えデキストラ
ン修飾重合体とＤＮＡとの複合体について同様な測定を
行った。図１４は、ｐｏｌｙ（ｄＡ）、ｐｏｌｙ（ｄ
Ｔ）から成る二重鎖ＤＮＡの測定の結果を示したもので
ある。実線は、温度を変化させたときの吸光度変化、点
線はそのときの一次微分の値を示す。図はすべて１５０
ｍＭ ＮａＣｌのＰＢＳ中で測定した。一般に、二重鎖
ＤＮＡ溶液の温度を上げていくと一定温度以上では、二
重らせんの相補鎖が分離し、ランダムコイルになること
が知られており、この変性によってＵＶ吸収は、約４０
％増大する。これを濃色効果と言い、近接塩基間の電子
相互作用がなくなるためにおこるとされている。このＤ
ＮＡの変性は協同現象で、構造が一部壊れると残りが不
安定化するため、２６０ｎｍにおける濃色効果は、非常
に狭い温度範囲で起こる。ここで、上記の変化を示す曲
線をＤＮＡの融解曲線とし、その時の転移点を融点Ｔｍ
とし、一次微分より求めた。The concentration of NaCl in PBS was 0 mM,
The same measurement was performed for the complex of the dextran-modified polymer and DNA, changing to 50 mM, 150 mM, and 1000 mM. FIG. 14 shows poly (dA) and poly (d
5 shows the results of measurement of double-stranded DNA consisting of T). The solid line shows the change in absorbance when the temperature is changed, and the dotted line shows the value of the first derivative at that time. All figures are 150
Measured in PBS with mM NaCl. In general, it is known that when the temperature of a double-stranded DNA solution is increased, at a certain temperature or higher, the complementary strand of the double helix separates to form a random coil.
% Increase. This is called a dark color effect, and is considered to occur because there is no electron interaction between adjacent bases. This D
The darkening effect at 260 nm occurs over a very narrow temperature range, as the denaturation of NA is a cooperative phenomenon, with the partial destruction of the structure destabilizing the rest. Here, a curve showing the above change is defined as a melting curve of DNA, and a transition point at that time is defined as a melting point Tm.
And was determined from the first derivative.
【００７８】ＤＮＡの二重らせんのＴｍは安定性とも解
釈できるが、これは溶媒、溶液中のイオンの種類と濃
度、ｐＨなどのより変化する。また、Ｔｍは水素結合３
つのＧ・Ｃ塩基対のほうが、２つのＡ・Ｔ塩基対よりも
安定であるため、Ｇ・Ｃ塩基対のモル分率が大きいほど
増加する。従って、本発明にかかる重合体の安定化効果
を確認しやすくするため、不安定で融点の低いｐｏｌｙ
（ｄＡ）、ｐｏｌｙ（ｄＴ）を用いた。The Tm of the double helix of DNA can be interpreted as stability, but this varies depending on the solvent, the type and concentration of ions in the solution, pH, and the like. Tm is hydrogen bond 3
Since two GC base pairs are more stable than two AT base pairs, they increase as the molar fraction of GC base pairs increases. Therefore, in order to make it easier to confirm the stabilizing effect of the polymer according to the present invention, the polymer is unstable and has a low melting point.
(DA) and poly (dT) were used.
【００７９】変性したＤＮＡ溶液をＴｍ以下に徐々に温
度を下げていくと、二重らせんは再生する。これは、Ｄ
ＮＡのアニーリングとして知られている。アニーリング
に最適な温度は、Ｔｍより約２５℃低い温度であること
が知られている（ヴォート生化学（下）Ｄｏｎａｌｄ
Ｖｏｅｔ著 田宮信雄ら訳 東京化学同人）。 図１３
においてＤＮＡ単独の融点は１５０ｍＭ ＮａＣｌ存在
下のＰＢＳ中では７２℃であり、温度を下げると二重ら
せんの巻き戻しもみられた。最下断のグラフはＤＮＡと
のチャージ比が２となるようにデキストラン修飾重合体
を加えた溶液での結果を示すものである。融点Ｔｍは８
９℃にみられた。比較例で示すポリリジンとは異なり、
巻き戻しがみられることから、本発明に係る重合体は、
一本鎖から二重鎖の形成を阻害しないことが示された。
この結果から、ポリリジンが二重鎖を大きく安定化する
こと、さらにポリリジンに導入されたデキストラン基に
より若干安定化効果が弱まるものの、以下で説明するポ
リリジンではみられない一本鎖から二重鎖への巻き戻し
が可能であることが示された。When the temperature of the denatured DNA solution is gradually lowered below Tm, the double helix is regenerated. This is D
Also known as NA annealing. The optimal temperature for annealing is known to be about 25 ° C. below Tm (Vault Biochemistry (bottom) Donald).
Voet, translated by Nobuo Tamiya and others. FIG.
The melting point of DNA alone was 72 ° C. in PBS in the presence of 150 mM NaCl, and when the temperature was lowered, unwinding of the double helix was also observed. The graph at the bottom shows the result of a solution containing a dextran-modified polymer so that the charge ratio with DNA becomes 2. Melting point Tm is 8
It was found at 9 ° C. Unlike polylysine shown in the comparative example,
Since unwinding is seen, the polymer according to the present invention is:
It was shown not to inhibit the formation of a duplex from a single strand.
From these results, it can be seen that polylysine greatly stabilizes the duplex, and although the stabilizing effect is slightly weakened by the dextran group introduced into the polylysine, the single stranded to double stranded not seen in polylysine described below. It was shown that rewinding was possible.
【００８０】比較例６ 比較として実施例１３と同一の方法で、ポリリジンの二
重鎖ＤＮＡに与える安定化効果をＤＮＡの融解曲線によ
り調べた。ポリリジン（ＰＬＬ−ＨＢｒ、ペプチド研究
所製）とＤＮＡ（ｐｏｌｙ（ｄＡ）、ｐｏｌｙ（ｄ
Ｔ））（それぞれ約２００塩基のホモポリマー、ファル
マシア社製）をＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．２、０〜
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，リン酸
緩衝液）で、沈殿を生じない程度でＤＮＡ過剰になるよ
うに複合体を形成させた。図１４の中段の融解曲線は、
チャージ比０．２になるようにポリリジンを加えた結果
を示すものである。７０℃付近の転移はポリリジンと相
互作用しないＤＮＡのみの転移を示す。より高温側のｌ
００℃（丸をつけた部分）での微分曲線から示されるよ
うに、ポリリジンとＤＮＡ複合体の融点がみられ、ポリ
リジンは二重鎖を大きく安定化するが、温度を下げた際
には、巻戻しは起こらず、１本鎖ＤＮＡがポリリジンと
凝縮し二重鎖を形成できなくなることが観察された。図
示されていないが、このようなことは二重鎖の融解曲線
でもみられた。 Comparative Example 6 As a comparison, the stabilizing effect of polylysine on double-stranded DNA was examined by a melting curve of DNA in the same manner as in Example 13. Polylysine (PLL-HBr, manufactured by Peptide Research Institute) and DNA (poly (dA), poly (d
T)) (Homopolymer of about 200 bases each, manufactured by Pharmacia) in PBS (10 mM, pH = 7.2, 0 to 0)
A complex was formed with 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, phosphate buffer) so that the DNA was excessive without causing precipitation. The melting curve in the middle of FIG.
It shows the result of adding polylysine to a charge ratio of 0.2. Transfer around 70 ° C. indicates transfer of only DNA that does not interact with polylysine. Higher temperature l
As shown by the differential curve at 00 ° C. (circled portion), the melting point of polylysine and the DNA complex was observed, and polylysine greatly stabilized the duplex, but when the temperature was lowered, Unwinding did not occur, and it was observed that single-stranded DNA condensed with polylysine and could not form a double strand. Although not shown, this was also seen in the duplex melting curve.
【００８１】実施例１４（ＤＮＡ三重鎖に与える本発明
に係る重合体の安定化効果） ｐｏｌｙ（ｄＡ）、とその２倍のモル量のｐｏｌｙ（ｄ
Ｔ）でＤＮＡ三重鎖を形成させ、同様に融解曲線によ
り、櫛型共重合体が三重鎖に与える安定化効果を調べ
た。 Example 14 (Invention given to DNA triplex)
Polymer stabilization effect) poly according to (dA), and twice the molar amount of poly (d
A DNA triplex was formed in T), and the stabilizing effect of the comb-type copolymer on the triplex was similarly examined using a melting curve.
【００８２】ｐｏｌｙ（ｄＡ）（ファルマシア社製）と
ｐｏｌｙ（ｄＴ）（ファルマシア社製）の正確な濃度
は、モル吸光係数より求めた。ｐｏｌｙ（ｄＡ）の２５
７ｎｍにおけるモル吸光係数は８９００、ｐｏｌｙ（ｄ
Ｔ）の２６５ｎｍにおけるモル吸光係数は９０００であ
る。正確に測ったモル濃度で、ｐｏｌｙ（ｄＡ）：ｐｏ
ｌｙ（ｄＴ）のモル比を１：２にし、ＰＢＳ中に入れ、
本発明に係るデキストラン修飾重合体をＤＮＡに対しチ
ャージ比 ０、０．２、０．５、１、２、１０と変えて
加えた。その溶液を９０℃で１０分、後室温で一晩放置
した。The exact concentrations of poly (dA) (Pharmacia) and poly (dT) (Pharmacia) were determined from the molar extinction coefficient. 25 of poly (dA)
The molar extinction coefficient at 7 nm is 8900, and poly (d
The molar extinction coefficient at 265 nm of T) is 9000. Poly (dA): po is the exact measured molarity
The molar ratio of ly (dT) is 1: 2, put in PBS,
The dextran-modified polymer according to the present invention was added to DNA at a charge ratio of 0, 0.2, 0.5, 1, 2, 10, and 10. The solution was left at 90 ° C. for 10 minutes and then at room temperature overnight.
【００８３】溶液の温度を１１０℃まで、０．２℃／
分、または、０．５℃／分の速さで、温度を上げた後、
さらに温度を下げたときの吸光度を測定した（Ｔｈｒｅ
ｓｉａＴｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｔ． Ｊ． Ｔｈｏｍａ
ｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．３２，
Ｎｏ．５０， １４０６８−１４０７４（１９９
３））。二重鎖と同様に、ＰＢＳ中のＮａＣｌ濃度を０
ｍＭ、５０ｍＭ、１５０ｍＭ、１０００ｍＭと変えて同
様な測定を行った。ここでは、該重合体の三重鎖に対す
る安定化効果の比較のため、低分子ポリアミンであるス
ペルミン（和光純薬工業社製）について同様にチャージ
比（［スペルミンのアミノ基］／［ＤＮＡのリン酸
基］）を変えて測定した。The temperature of the solution was raised to 110 ° C. and 0.2 ° C. /
Minute, or after increasing the temperature at a rate of 0.5 ° C./minute,
The absorbance when the temperature was further reduced was measured (Thre
siaThomas and T.A. J. Thomas
s, Biochemistry, Vol. 32,
No. 50, 14068-14074 (199
3)). As with the duplex, the NaCl concentration in PBS was
The same measurement was performed by changing to mM, 50 mM, 150 mM, and 1000 mM. Here, in order to compare the stabilizing effect of the polymer on the triple chain, a charge ratio ([amino group of spermine] / [phosphate of DNA] was similarly determined for spermine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) which is a low molecular weight polyamine. Group]).
【００８４】図１５にＤＮＡ三重鎖の融解曲線を示し
た。点線がＤＮＡ単独を表している。ＤＮＡ単独では、
３７℃と７３℃に転移点が観られた。このことは、温度
を上げていくことにより三重鎖から、まず二重鎖へ、さ
らに一重鎖へと転移することを示している。本発明に係
る重合体をＤＮＡとのチャージ比を０．２、２倍と変え
た場合、転移点はより高温側にシフトし、チャージ比２
倍のデキストラン修飾重合体を加えた時では、８９℃に
転移が一つみられた。この時の吸光度変化がＤＮＡ単独
の吸光度変化とほぼ等しいことから、本発明に係る重合
体では、融点Ｔｍで三重鎖から一度に一本鎖になること
がわかった。以上の結果は、本発明に係る重合体を加え
ることによりＤＮＡの二重鎖および三重鎖の可逆性を保
ちながら共に安定化することを示しており、特にＤＮＡ
の三重鎖に対しては、融点を５０℃以上上昇させること
からも、その効果が高いことが示される。FIG. 15 shows the melting curve of the DNA triplex. The dotted line represents DNA alone. With DNA alone,
Transition points were observed at 37 ° C and 73 ° C. This indicates that as the temperature is increased, the transition from the triplex to the double strand and then to the single strand occurs. When the charge ratio of the polymer according to the present invention to DNA was changed to 0.2 or 2 times, the transition point was shifted to a higher temperature side, and the charge ratio was changed to 2 times.
When double the dextran modified polymer was added, one transition was observed at 89 ° C. Since the change in absorbance at this time was almost equal to the change in absorbance of DNA alone, it was found that the polymer according to the present invention changed from a triple strand to a single strand at a time at the melting point Tm. The above results indicate that the addition of the polymer according to the present invention stabilizes both DNA while maintaining the reversibility of the double-stranded and triple-stranded DNA.
With respect to the triple chain, increasing the melting point by 50 ° C. or more also indicates that the effect is high.
【００８５】図１６に三重鎖の融点Ｔｍの、デキストラ
ン修飾重合体の濃度依存性の結果を示した。縦軸は融
点、横軸は、櫛型共重合体とＤＮＡのチャージ比を示
す。ここでは、低分子ポリアミンの中で最も三重鎖を安
定化するといわれているスペルミンと比較した（Ｔｈｒ
ｅｓｉａ Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｔ． Ｊ． Ｔｈｏ
ｍａｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．３
２， Ｎｏ．５０， １４０６８−１４０７４（１９９
３））。スペルミンは、２つの融点、Ｔｍ１、Ｔｍ２を
有する。三重鎖の融点Ｔｍ１は、ＤＮＡとのチャージ比
３３倍のスペルミンで、約２０℃高くなることがわか
る。一方、本発明に係るデキストラン修飾重合体では、
チャージ比でわずか１〜２倍で、５０℃も高くなること
が示され、スペルミンと比較して極めて優れた安定化効
果を有することが示される。これは、本発明に係る修飾
重合体が多価の高分子カチオンであることによると推定
される。FIG. 16 shows the results of the dependency of the melting point Tm of the triplex on the concentration of the dextran-modified polymer. The vertical axis indicates the melting point, and the horizontal axis indicates the charge ratio between the comb copolymer and DNA. Here, comparison was made with spermine, which is said to stabilize the triple chain among the low molecular weight polyamines (Thr.
esia Thomas and T.E. J. Th
mas, Biochemistry, Vol. 3
2, No. 50, 14068-14074 (199
3)). Spermine has two melting points, Tm1 and Tm2. It can be seen that the melting point Tm1 of the triplex increases by about 20 ° C. with spermine at a charge ratio of 33 times that of DNA. On the other hand, in the dextran-modified polymer according to the present invention,
It is shown that the charge ratio is as high as 50 ° C. when the charge ratio is only 1-2 times, which indicates that the compound has an extremely excellent stabilizing effect as compared with spermine. This is presumably because the modified polymer according to the present invention is a polyvalent high molecular cation.
【００８６】図１７は、ＤＮＡ三重鎖の融点のＮａＣｌ
濃度依存性の結果を示す。縦軸は融点、横軸はＰＢＳ中
のＮａＣｌ濃度を表す。デキストラン修飾重合体をＤＮ
Ａに対し、チャージ比で２倍加えたものと、ＤＮＡ単独
を比較した。ＤＮＡ単独では、図１５のように融点がＴ
ｍ１、Ｔｍ２と２つ存在し、１５０ｍＭ ＮａＣｌ以下
では、Ｔｍ１が存在しないことから三重鎖が形成されな
いことが示される。すなわち、イオンが多く存在するこ
とにより、ＤＮＡのアニオン間の反発が弱まり、ＤＮＡ
の二重鎖、三重鎖が安定化されることを示すものであ
る。また降温測定から、二重鎖、三重鎖の巻き戻しにつ
いては、高イオン強度下では、巻き戻しがみられるが、
低イオン強度下では、巻き戻しが非常に起こりにくくな
っていることが示される。すなわち、ＮａＣｌなどのイ
オンは、ＤＮＡの二重鎖、三重鎖形成を促進し、安定化
する（Ｔｈｒｅｓｉａ Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｔ．
Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖ
ｏｌ．３２， Ｎｏ．５０， １４０６８−１４０７４
（１９９３））。FIG. 17 shows the melting point NaCl of the DNA triplex.
The results of the concentration dependence are shown. The vertical axis represents the melting point, and the horizontal axis represents the NaCl concentration in PBS. Dextran-modified polymer is DN
A was compared to A, which was added twice in charge ratio, and DNA alone. For DNA alone, the melting point is T as shown in FIG.
There are two, m1 and Tm2, and at 150 mM NaCl or less, the absence of Tm1 indicates that no triplex is formed. That is, due to the presence of many ions, repulsion between anions of DNA is weakened,
It is shown that the double and triple chains of are stabilized. In addition, from the measurement of temperature drop, unwinding of double and triple chains was observed under high ionic strength.
It shows that unwinding is very unlikely to occur under low ionic strength. That is, ions such as NaCl promote and stabilize the formation of double and triple strands of DNA (Thresia Thomas and T. et al.
J. Thomas, Biochemistry, V
ol. 32, no. 50, 14068-14074
(1993)).
【００８７】デキストラン修飾重合体との複合体は、二
重鎖及び三重鎖の融点は、８９℃の１つのみである（図
１６）。また、ＤＮＡ単独と異なり、低イオン強度下で
二重鎖、三重鎖の巻き戻しもみられた（図示せず）。さ
らにＮａＣｌ含量が高い条件下でも複合体は非常に安定
化されていることが観察された。この結果は、本発明に
かかる重合体は、イオン強度の変化にかかわらず、ＤＮ
Ａの二重鎖、三重鎖形成を促進し、また大きく安定化す
る優れた生体内安定化キャリアーであることが示され
る。The complex with the dextran-modified polymer has a single melting point of 89 ° C. for the duplex and the triplex (FIG. 16). In addition, unlike DNA alone, unwinding of double-stranded and triple-stranded under low ionic strength was also observed (not shown). Furthermore, it was observed that the complex was very stabilized even under the condition of high NaCl content. This result indicates that the polymer of the present invention has a DN
It is shown to be an excellent in vivo stabilized carrier that promotes the formation of double and triple chains of A and greatly stabilizes it.
【００８８】比較例７ 実施例１４と同一の方法で、ｐｏｌｙ（ｄＡ）とその２
倍のモル量のｐｏｌｙ（ｄＴ）でＤＮＡ三重鎖を形成さ
せ、同様に融解曲線により、三重鎖に与える安定化効果
を調べた。 Comparative Example 7 In the same manner as in Example 14, poly (dA) and
A DNA triplex was formed with twice the molar amount of poly (dT), and the stabilizing effect on the triplex was similarly examined by a melting curve.
【００８９】ここでは、本発明に係る重合体の三重鎖に
対する安定化効果の比較のため、低分子ポリアミンであ
るスペルミン（和光純薬工業社製）について同様にチャ
ージ比（［スペルミンのアミノ基］／［ＤＮＡのリン酸
基］）を変えて測定した。Here, in order to compare the stabilizing effect of the polymer according to the present invention on the triple chain, the charge ratio ([amino group of spermine]) of spermine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), which is a low molecular weight polyamine, was similarly determined. / [Phosphate group of DNA]).
【００９０】図１６に三重鎖の融点Ｔｍのチャージ比依
存性の結果を示した。縦軸は融点、横軸はチャージ比を
示す。ここでは、低分子ポリアミンの中で最も三重鎖を
安定化するといわれているスペルミンと比較した（Ｔｈ
ｒｅｓｉａ Ｔｈｏｍａｓａｎｄ Ｔ． Ｊ． Ｔｈｏ
ｍａｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．３
２， Ｎｏ．５０， １４０６８−１４０７４（１９９
３））。スペルミンでは、融点Ｔｍ１とＴｍ２である。
三重鎖の融点Ｔｍ１は、ＤＮＡとのチャージ比３３倍の
スペルミンで、約２０℃高くなる。FIG. 16 shows the result of the dependence of the melting point Tm of the triple chain on the charge ratio. The vertical axis indicates the melting point, and the horizontal axis indicates the charge ratio. Here, a comparison was made with spermine, which is said to stabilize the triple chain among the low molecular weight polyamines most (Th
resia Thomasando T .; J. Th
mas, Biochemistry, Vol. 3
2, No. 50, 14068-14074 (199
3)). For spermine, the melting points are Tm1 and Tm2.
The melting point Tm1 of the triplex increases by about 20 ° C. with spermine at a charge ratio of 33 times to DNA.
【００９１】実施例１５（ＤＮＡ複合体のＴｍ測定と吸
光度変化） ＤＮＡ（Ｐｏｌｙ（ｄＡ）、Ｐｏｌｙ（ｄＴ））に対し
てチャージ比で０〜３倍になるようにヒアルロン酸修飾
重合体（１．６ｋ、１００ｍｇ）との複合体を形成さ
せ、実施例３と同様にしてヒアルロン酸修飾重合体のＤ
ＮＡに対する安定化効果をＤＮＡの融解曲線により調べ
た（図１８）。また、比較のためにＤＮＡのみでも同様
の実験を行った。さらに、３０℃における吸光度をチャ
ージ比に対してプロットした（図１９）。 Example 15 (Tm measurement of DNA complex and absorption
Light intensity change) DNA (Poly (dA), Poly (dT)) was formed into a complex with a hyaluronic acid-modified polymer (1.6 k, 100 mg) so as to have a charge ratio of 0 to 3 times, which was then carried out. D of hyaluronic acid-modified polymer in the same manner as in Example 3
The stabilizing effect on NA was examined by the melting curve of DNA (FIG. 18). For comparison, a similar experiment was performed using only DNA. Further, the absorbance at 30 ° C. was plotted against the charge ratio (FIG. 19).
【００９２】ＤＮＡのみのＴｍ測定では、７０℃で２本
鎖ＤＮＡが１本鎖に解離することが示される。そして、
一定量のＤＮＡに対してチャージ比が０．５、１倍にな
るようにヒアルロン酸修飾重合体を加えて、ポリマーの
割合の違いによるＤＮＡの安定化効果を比較した。チャ
ージ比が０．５のヒアルロン酸修飾重合体／ＤＮＡ複合
体では７０℃の転移は観察されず、９５℃でのみ転移が
みられ、さらに、吸光度が低下した。この傾向はポリマ
ーの割合が増すとより顕著になり、チャージ比１以上で
は９５℃における転移はみられなくなる。この結果か
ら、本発明にかかる重合体／ＤＮＡ複合体が極めて安定
に形成されることがわかる。The Tm measurement of DNA alone shows that double-stranded DNA is dissociated into single-stranded at 70 ° C. And
A hyaluronic acid-modified polymer was added so that the charge ratio became 0.5 and 1 fold relative to a certain amount of DNA, and the DNA stabilizing effects due to differences in the ratio of the polymers were compared. In the case of the hyaluronic acid-modified polymer / DNA complex having a charge ratio of 0.5, no transition at 70 ° C. was observed, the transition was observed only at 95 ° C., and the absorbance was further reduced. This tendency becomes more remarkable as the proportion of the polymer increases, and no transition at 95 ° C. is observed at a charge ratio of 1 or more. From this result, it is understood that the polymer / DNA complex according to the present invention is formed extremely stably.
【００９３】３０℃における吸光度をヒアルロン酸修飾
重合体／ＤＮＡチャージ比に対してプロットし、チャー
ジ比が１に上がるにつれて急激に吸光度が低下した（図
１９）。この結果は、均一に溶解していたＤＮＡが、ポ
リマーを加えることで不均一に濃縮された相が形成さ
れ、極めて小さなＤＮＡ複合体が形成されたこと、ま
た、凝集が生じないことからヒアルロン酸がＤＮＡ‐ポ
リリジン疎水コアのまわりを覆い、親水性を向上しさら
に分散性を向上することを示すものである。すなわち、
ヒアルロン酸修飾重合体／ＤＮＡ複合体が形成されたこ
とを示すものである。The absorbance at 30 ° C. was plotted against the hyaluronic acid-modified polymer / DNA charge ratio, and the absorbance sharply decreased as the charge ratio increased to 1 (FIG. 19). This result indicates that the homogeneously dissolved DNA was added to the polymer to form a non-uniformly concentrated phase, an extremely small DNA complex was formed, and that no aggregation occurred. Shows that the DNA covers the hydrophobic core of DNA-polylysine, thereby improving the hydrophilicity and further improving the dispersibility. That is,
FIG. 4 shows that a hyaluronic acid-modified polymer / DNA complex was formed.
【００９４】実施例１６（電気泳動） 本発明にかかる核酸安定化用キャリアーとＤＮＡとの複
合体中の、ＤＮＡに対する血清中の酵素等による分解を
抑制する作用を以下の実験により確認した。すなわち、
本発明にかかる重合体とＤＮＡとの複合体の血清中での
安定性を電気泳動で調べた。 Example 16 (Electrophoresis) The effect of suppressing the degradation of DNA in a complex of a nucleic acid stabilizing carrier and DNA according to the present invention by serum enzymes was confirmed by the following experiment. That is,
The stability of the complex of the polymer of the present invention and DNA in serum was examined by electrophoresis.
【００９５】プラスミドＤＮＡ ５００ｎｇ／０．４μ
ｌにＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ ＣａｌｆＳｅｒｕｍ、ギブコ
社製）２５μｌを加え、３７℃で、１時間、２時間、６
時間おいて、プラスミドＤＮＡの分解後のサンプルとし
て調製した。Plasmid DNA 500ng / 0.4μ
25 μl of FCS (Fetal CalSerum, manufactured by Gibco) was added to the mixture, and the mixture was added at 37 ° C. for 1 hour, 2 hours, and 6 hours.
At a later time, a sample was prepared after the digestion of the plasmid DNA.
【００９６】また、血清中のプラスミドＤＮＡに対しチ
ャージ比で１の本発明に係るデキストラン修飾重合体を
加えたものを調製した。Further, a dextran-modified polymer according to the present invention having a charge ratio of 1 to plasmid DNA in serum was prepared.
【００９７】さらに、同量のプラスミドＤＮＡとプラス
ミドＤＮＡに対しチャージ比で１のデキストラン修飾重
合体の複合体をＰＢＳ中で形成させ、ＦＣＳ ２５μｌ
を加え、さらに、３７℃で、１時間、２時間、６時間お
いたものを調製した。ＦＣＳ濃度は９７％とする。Further, a dextran-modified polymer complex having the same amount of plasmid DNA and plasmid DNA at a charge ratio of 1 was formed in PBS, and 25 μl of FCS was added.
Was further added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour, 2 hours, and 6 hours. The FCS concentration is 97%.
【００９８】それぞれ調製したものを、２％アガロース
ゲル板（エチジウムブロマイド含）に流し電気泳動を行
った。血清中での本発明に係るキャリアーとＤＮＡ複合
体の安定性を調べた電気泳動の結果を図２０に示す。レ
ーン１及びレーン９はマーカー、レーン２とレーン１０
は未処理のプラスミドＤＮＡを示す。レーン３は、プラ
スミドＤＮＡを血清中に３７℃の状態で、１時間置き、
プラスミドＤＮＡを血清中の酵素によって分解させたも
の、レーン４は、同様に、３７℃、１時間血清中に置い
たプラスミドＤＮＡにチャージ比で１のデキストラン修
飾重合体を加えたものを示す。レーン５は、はじめにチ
ャージ比１でデキストラン修飾重合体とプラスミドＤＮ
Ａと複合体を形成させてから、同様に、３７℃で１時間
血清中で置いたものを示す。レーン６、７、８は、同様
な方法で、３７℃、１時間を２時間に変えて置いたも
の、レーン１１、１２、１３も同様に６時間置いた試験
結果である。レーン３、６では、未処理のプラスミドＤ
ＮＡで検出されたバンドが消失し、低分子量側にバンド
が検出されるようになった。このことは、血清中の酵素
により、プラスミドＤＮＡが分解されたことを示してい
る。レーン４、７では、バンドは消失し、やや低分子側
にバンドが検出されるようになった。レーン３、６と異
なり、やや上にあることから、分解された小さなＤＮＡ
と本発明に係る重合体が何らかの複合体を形成し、分子
量が高くなったことを示す。一方、レーン５、８及び１
３では、動かないバンドがみられた。レーン３、４、
６、７と異なり、他の部分にバンドが検出されなかった
ことより、本発明に係る重合体とＤＮＡの複合体中のＤ
ＮＡは血清中の酵素に対し安定であり分解されないこと
が示される。未処理のプラスミドＤＮＡよりも高分子量
側にバンドが現れたのは、分解されていないプラスミド
ＤＮＡとデキストラン修飾重合体が、複合体を形成し
て、分子量が高くなっていることを示す。The thus prepared products were applied to a 2% agarose gel plate (containing ethidium bromide) and subjected to electrophoresis. FIG. 20 shows the results of electrophoresis in which the stability of the carrier and the DNA complex according to the present invention in serum was examined. Lanes 1 and 9 are markers, lanes 2 and 10
Indicates an untreated plasmid DNA. Lane 3 shows plasmid DNA in serum at 37 ° C. for 1 hour,
Similarly, lane 4 shows the plasmid DNA degraded by the enzyme in the serum, and lane 4 shows the plasmid DNA placed in the serum at 37 ° C. for 1 hour and a dextran-modified polymer at a charge ratio of 1 added thereto. Lane 5 shows dextran-modified polymer and plasmid DN at a charge ratio of 1
A shows a complex formed with A and also placed in serum for 1 hour at 37 ° C. Lanes 6, 7, and 8 show the test results obtained in the same manner except that 1 hour was changed to 37 hours at 37 ° C., and lanes 11, 12, and 13 were similarly placed for 6 hours. In lanes 3 and 6, untreated plasmid D
The band detected by NA disappeared and a band was detected on the low molecular weight side. This indicates that the plasmid DNA was degraded by the enzyme in the serum. In lanes 4 and 7, the band disappeared, and a band was detected on the side of a slightly lower molecule. Unlike lanes 3 and 6, it is slightly above, so the degraded small DNA
This shows that the polymer according to the present invention formed some complex and the molecular weight was increased. On the other hand, lanes 5, 8 and 1
In 3, there were bands that did not move. Lanes 3, 4,
Unlike the cases 6 and 7, no bands were detected in other portions, indicating that D in the polymer-DNA complex of the present invention
NA is shown to be stable to enzymes in serum and not degraded. The appearance of a band on the higher molecular weight side than the untreated plasmid DNA indicates that the undegraded plasmid DNA and the dextran-modified polymer form a complex and have a higher molecular weight.
【００９９】実施例１７（デキストラン含量の低いデキ
ストラン修飾重合体とＤＮＡとの複合体） 実施例１０においては、ポリ-Ｌ-リジンはチャージ比１
でＤＮＡと複合化させると沈殿を生じて濁度があがり、
一方デキストラン含量の高い（２０ｍｏｌ％）デキスト
ラン修飾重合体とＤＮＡの複合体は全く沈殿を生じず、
濁らないことが示された（図１０参照）。 Example 17 (dex with low dextran content)
Complex of Strand Modified Polymer and DNA) In Example 10, poly-L-lysine had a charge ratio of 1
When complexed with DNA at, turbidity rises due to precipitation,
On the other hand, the complex of the dextran-modified polymer having a high dextran content (20 mol%) and DNA did not produce any precipitate,
No turbidity was shown (see FIG. 10).
【０１００】デキストラン含量の低いデキストラン修飾
重合体とＤＮＡの複合体について、種々のチャージ比の
条件で吸光度（２６０ｎｍで）と、濁り（３４０ｎｍで
の吸光度）を測定した。The dextran-modified polymer-DNA complex having a low dextran content was measured for absorbance (at 260 nm) and turbidity (at 340 nm) under various charge ratio conditions.
【０１０１】分子量２．６ｋ（以下、Ｄｅｘ２６００と
する）及び５．９ｋ（以下、Ｄｅｘ５９００とする）の
デキストランをポリ-Ｌ-リジンにグラフト重合させたデ
キストラン修飾重合体であって、デキストラン含量が４
ｍｏｌ％から３４ｍｏｌ％の間のものを使用した。緩衝
液は１０ｍＭ ＰＢＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５
ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を用いた。A dextran-modified polymer obtained by graft-polymerizing dextran having a molecular weight of 2.6 k (hereinafter referred to as Dex 2600) and 5.9 k (hereinafter referred to as Dex 5900) to poly-L-lysine, and having a dextran content of 4
Those between mol% and 34 mol% were used. The buffer was 10 mM PBS, 150 mM NaCl, 0.5 mM
mM EDTA (pH 7.2) was used.
【０１０２】ＤＮＡとしてｐｏｌｙ（ｄＡ）、ｐｏｌｙ
（ｄＴ）（それぞれ約２００塩基のホモポリマー）を用
いた結果を図２１に示した。またＤＮＡとしてオリゴヌ
クレオチド（３０ｍｅｒの合成ランダムオリゴヌクレオ
チド、日本製粉製）を用いた結果を図２２に示した。さ
らに、プラスミド（ｐＳＶ（６．８ｋ）、プロメガ社
製）を用いた結果を図２２にそれぞれ示した。As DNA, poly (dA), poly (dA)
The result using (dT) (a homopolymer of about 200 bases each) is shown in FIG. FIG. 22 shows the results obtained by using an oligonucleotide (30-mer synthetic random oligonucleotide, manufactured by Nippon Flour Mill) as DNA. Furthermore, the results obtained using the plasmid (pSV (6.8 k), manufactured by Promega) are shown in FIG.
【０１０３】図２１に示されるように、共通してチャー
ジ比１付近で吸光度の低下が見られた。さらに、チャー
ジ比１においては、どのサンプルも肉眼観察でも濁りは
確認できず、３４０ｎｍでの吸収からも濁りは生じてい
ないことが示された。この結果は、オリゴヌクレオチド
及びプラスミドを用いた場合でも同様であった。As shown in FIG. 21, a decrease in absorbance was observed at around a charge ratio of 1 in common. Further, at a charge ratio of 1, no turbidity could be confirmed by visual observation of any of the samples, and no turbidity was observed from the absorption at 340 nm. This result was the same when the oligonucleotide and the plasmid were used.
【０１０４】チャージ比１付近でＤＮＡに基づく２６０
ｎｍの吸光度が低下する理由は、ＤＮＡとデキストラン
修飾重合体のポリリジン部分が凝縮を形成するためと考
えられるが、その一方でポリリジンとＤＮＡの複合体に
みられるような凝集・沈殿がおこらず水中で安定に存在
（分散等）し得る理由としては、重合体のデキストラン
部分が凝縮体の表面に存在するためと考えられる。At a charge ratio of around 1, DNA
The reason why the absorbance at nm decreases is thought to be that DNA and the polylysine portion of the dextran-modified polymer form condensation, but on the other hand, aggregation and precipitation as seen in the complex of polylysine and DNA do not occur and water The reason why the polymer can be stably present (dispersion, etc.) is considered to be that the dextran portion of the polymer exists on the surface of the condensate.
【０１０５】[0105]
【発明の効果】以上、説明したように、本発明に係る核
酸安定化用キャリアーは、細胞内に導入する遺伝子と
複合体にしたときに容易に可溶化でき、外来遺伝子の
構造変化を抑制し、優れた外来遺伝子の可逆性保持機能
を有し、外来遺伝子を細胞内に導入することにより形
成されたＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡ三重鎖の安定化効果を有
するものである。As described above, the carrier for stabilizing a nucleic acid according to the present invention can be easily solubilized when complexed with a gene to be introduced into cells, and suppresses the structural change of a foreign gene. It has an excellent function of maintaining the reversibility of a foreign gene and has a stabilizing effect on a DNA double strand and a DNA triple strand formed by introducing the foreign gene into cells.
【０１０６】従って、本発明に係る核酸安定化用キャリ
アーは、各種遺伝子疾患、あるいはエイズ等のウイルス
病に対するオリゴヌクレオチド遺伝子治療薬の生体内運
搬体として、特にＤＮＡの三重鎖形成による遺伝子治療
薬の生体内運搬体として有用である。Accordingly, the carrier for stabilizing a nucleic acid according to the present invention can be used as an in vivo carrier for an oligonucleotide gene therapy drug against various genetic diseases or a viral disease such as AIDS, and particularly as a gene therapy drug by triplex formation of DNA. Useful as an in vivo carrier.
【０１０７】また、ウイルス耐性植物をはじめとして、
遺伝子工学技術による種々の有用動植物の創出にも大き
く寄与するものである。In addition to virus-resistant plants,
It greatly contributes to the creation of various useful animals and plants by genetic engineering technology.
【図１】本発明に係るポリリジン、デキストラン、ポリ
リジン−デキストラン修飾重合体（ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅ
ｘ）の化学式を示す図である。FIG. 1 shows a polylysine, dextran and polylysine-dextran modified polymer (PLL-g-De) according to the present invention.
It is a figure which shows the chemical formula of x).
【図２】（ａ）は本発明にかかるデキストラン修飾重合
体の合成経路を模式的に示す図である。（ｂ）は本発明
に係るポリ（Ｌ−リジン）-g-デキストランのＮＭＲ測
定結果を示す図であり、デキストランによるシグナルは
細かい斜線で示され、またポリリジンによるシグナルは
太い斜線で示される。FIG. 2 (a) is a diagram schematically showing a synthesis route of a dextran-modified polymer according to the present invention. (B) is a diagram showing the results of NMR measurement of poly (L-lysine) -g-dextran according to the present invention, where the signal due to dextran is indicated by a thin hatched line, and the signal due to polylysine is indicated by a thick hatched line.
【図３】ポリリジンと、ヒアルロン酸から、本発明に係
るポリリジン−ヒアルロン酸修飾重合体（ＰＬＬ−ｇ−
ＨＡ）の合成方法を模式的に示す図である。FIG. 3 shows a polylysine-hyaluronic acid-modified polymer (PLL-g-) according to the present invention prepared from polylysine and hyaluronic acid.
It is a figure which shows the synthesis | combining method of HA) typically.
【図４】（ａ）は、本発明に係るヒアルロン酸修飾重合
体の分子構造を示すものであり、（ｂ）は、本発明に係
るヒアルロン酸修飾重合体のＮＭＲ測定結果を示す図で
ある。FIG. 4 (a) shows the molecular structure of the hyaluronic acid-modified polymer according to the present invention, and FIG. 4 (b) shows the NMR measurement results of the hyaluronic acid-modified polymer according to the present invention. .
【図５】ヒアルロン酸修飾重合体のイオン強度変化に対
する濁度滴定を示す図であり、（ａ）はＰＬＬ−ｇ−Ｈ
Ａを用いた場合、（ｂ）はＰＬＬ／ＨＡ混合物を用いた
の結果を示す図である。FIG. 5 is a diagram showing turbidity titration with respect to a change in ionic strength of a hyaluronic acid-modified polymer, wherein (a) shows PLL-g-H
In the case of using A, (b) is a diagram showing the results of using a PLL / HA mixture.
【図６】ヒアルロン酸修飾重合体のｐＨ変化に対する濁
度滴定を示す図であり、（ａ）は合成例１９と等しい組
成のＰＬＬ／ＨＡ混合物を使用した場合、（ｂ）は合成
例１９のＰＬＬ−ｇ−ＨＡを使用した場合の結果を示す
図である。6 is a diagram showing turbidity titration with respect to a change in pH of a hyaluronic acid-modified polymer. FIG. 6 (a) shows a case where a PLL / HA mixture having the same composition as in Synthesis Example 19 was used, and FIG. It is a figure showing a result at the time of using PLL-g-HA.
【図７】ヒアルロン酸修飾重合体のｐＨ変化に対する濁
度滴定を示す図であり、（ａ）は合成例１６と等しい組
成のＰＬＬ／ＨＡ混合物を使用した場合、（ｂ）は合成
例１６のＰＬＬ−ｇ−ＨＡを使用した場合の結果を示す
図である。7A and 7B are diagrams showing turbidity titration of a hyaluronic acid-modified polymer with respect to a change in pH. FIG. 7A shows a case where a PLL / HA mixture having the same composition as in Synthesis Example 16 is used, and FIG. It is a figure showing a result at the time of using PLL-g-HA.
【図８】ヒアルロン酸修飾重合体のｐＨ変化に対する濁
度滴定を示す図であり、（ａ）は合成例１５と等しい組
成のＰＬＬ／ＨＡ混合物を使用した場合、（ｂ）は合成
例１５のＰＬＬ−ｇ−ＨＡを使用した場合の結果を示す
図である。8 is a diagram showing turbidity titration with respect to a change in pH of a hyaluronic acid-modified polymer. FIG. 8 (a) shows a case where a PLL / HA mixture having the same composition as in Synthesis Example 15 is used, and FIG. It is a figure showing a result at the time of using PLL-g-HA.
【図９】本発明に係るＰＥＧ修飾重合体のＮＭＲ測定結
果を示す図である。FIG. 9 is a view showing an NMR measurement result of a PEG-modified polymer according to the present invention.
【図１０】デキストラン修飾重合体、またはポリリジン
とＤＮＡとの複合体のチャージ比と吸光度（溶解性、濁
度）の関係を示す図である。FIG. 10 is a graph showing the relationship between the charge ratio of a dextran-modified polymer or a complex of polylysine and DNA and absorbance (solubility, turbidity).
【図１１】蛍光測定によるヒアルロン酸修飾重合体とＤ
ＮＡの複合体形成の確認を示す図である。FIG. 11 shows hyaluronic acid-modified polymer and D by fluorescence measurement
It is a figure which shows confirmation of the complex formation of NA.
【図１２】デキストラン修飾重合体、またはポリリジン
とＤＮＡのチャージ比を変えた複合体のＣＤスペクトル
変化を表した図である。（ａ）は１／１００ＰＢＳ中で
の結果を、また（ｂ）はＰＢＳ中での結果を示す。FIG. 12 is a diagram showing a change in the CD spectrum of a dextran-modified polymer or a complex in which the charge ratio between polylysine and DNA is changed. (A) shows the results in 1/100 PBS, and (b) shows the results in PBS.
【図１３】（ａ）は、又はポリリジンとＤＮＡとの複合
体形成による凝集形成を示す図であり、（ｂ）は、本発
明に係るデキストラン修飾重合体とＤＮＡとから形成さ
れる複合体が、親水性基の存在により可溶化することを
示す図である。FIG. 13 (a) is a diagram showing aggregation formation by forming a complex between polylysine and DNA, and FIG. 13 (b) is a diagram showing a complex formed from the dextran-modified polymer according to the present invention and DNA. FIG. 3 shows that the compound is solubilized by the presence of a hydrophilic group.
【図１４】（ａ）は、温度による二重鎖ＤＮＡと１重鎖
の変化を示す図である。（ｂ）は、poly(dA)・poly(dT)
のみの場合、（ｃ）は、ＰＬＬ／ＤＮＡ＝０．２の場
合、（ｄ）は、ＰＬＬ-g-Dex／ＤＮＡ＝２の場合の、温
度を変化させたときの吸光度変化（融解曲線、デキスト
ラン修飾重合体、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮ
ａＣｌ、ｐＨ＝７．２ナトリウムリン酸緩衝液）、及び
その一次微分の値を示す図である。FIG. 14 (a) shows changes in double-stranded DNA and single-stranded DNA depending on temperature. (B) is poly (dA) / poly (dT)
(C) is the case where PLL / DNA = 0.2, (d) is the case where PLL-g-Dex / DNA = 2, the change in absorbance when the temperature is changed (melting curve, Dextran modified polymer, 0.5 mM EDTA, 150 mM N
FIG. 3 is a diagram showing aCl, pH = 7.2 sodium phosphate buffer) and the value of its first derivative.
【図１５】（ａ）は、ＤＮＡ三重鎖の融解曲線（デキス
トラン修飾重合体、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮ
ａＣｌ、ｐＨ＝７．２ナトリウムリン酸緩衝液）および
融解現象を模式的に示す図である。（ｂ）は、PLL-g-De
xが存在しない条件下での三重鎖ＤＮＡが、温度により
２段階で１本鎖及び２重鎖を経て１本鎖になる変化を示
す図であり、（ｃ）は、PLL-g-Dexが存在下では、三重
鎖ＤＮＡが、温度により１本鎖になる変化を示す図であ
る。る。FIG. 15 (a) is a melting curve of DNA triplex (dextran-modified polymer, 0.5 mM EDTA, 150 mM N
FIG. 3 is a diagram schematically showing (aCl, pH = 7.2 sodium phosphate buffer) and a melting phenomenon. (B) is PLL-g-De
FIG. 3C is a diagram showing a change in triple-stranded DNA under conditions where x does not exist into single-stranded via single-stranded and double-stranded in two steps depending on the temperature. FIG. 3 is a diagram showing a change in a triple-stranded DNA into a single strand depending on temperature in the presence. You.
【図１６】ＤＮＡ三重鎖の融点Ｔｍのデキストラン修飾
重合体、及びスペルミン濃度依存性（０．５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ＝７．２ナトリウムリ
ン酸緩衝液）を示す図である。FIG. 16: Dependence of melting point Tm of DNA triplex on dextran-modified polymer and spermine concentration (0.5 mM ED
FIG. 4 is a diagram showing TA, 150 mM NaCl, pH = 7.2 sodium phosphate buffer).
【図１７】ＤＮＡ三重鎖のデキストラン修飾重合体複合
体、及びＤＮＡ三重鎖単独の融点ＴｍのＮａＣｌ濃度依
存性（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝７．２リン酸緩衝
液）の結果を示す図である。FIG. 17 is a graph showing the results of the NaCl concentration dependency (0.5 mM EDTA, pH = 7.2 phosphate buffer) of the melting point Tm of the DNA dextran-modified polymer complex of the DNA triplex and the DNA triplex alone. is there.
【図１８】二重鎖ＤＮＡ、及びヒアルロン酸修飾重合体
とＤＮＡとの複合体の温度を変化させたときの吸光度変
化（融解曲線）を示す図である。FIG. 18 is a diagram showing a change in absorbance (melting curve) when the temperature of a complex of a double-stranded DNA and a hyaluronic acid-modified polymer and DNA is changed.
【図１９】ヒアルロン酸修飾重合体のチャージ比と吸光
度（溶解性、濁度）の関係を示す図である。FIG. 19 is a graph showing the relationship between the charge ratio and absorbance (solubility, turbidity) of a hyaluronic acid-modified polymer.
【図２０】デキストラン修飾重合体、またはポリリジン
とＤＮＡとの複合体の血清中での安定性を調べた電気泳
動を示す写真である。FIG. 20 is a photograph showing electrophoresis in which the stability of a dextran-modified polymer or a complex of polylysine and DNA in serum was examined.
【図２１】デキストラン修飾重合体とＤＮＡ（Ｐｏｌｙ
（ｄＡ）、Ｐｏｌｙ（ｄＴ））との複合体のチャージ比
と吸光度の関係を示す図である。（ａ）は、Ｄｅｘ２６
００を使用した場合、（ｂ）は、Ｄｅｘ５９００を使用
した場合の結果を示す。FIG. 21. Dextran-modified polymer and DNA (Poly
FIG. 4 is a diagram showing a relationship between a charge ratio of a complex with (dA) and Poly (dT)) and absorbance. (A) shows Dex26
(B) shows the result when Dex5900 is used.
【図２２】デキストラン修飾重合体とＤＮＡ（オリゴヌ
クレオチド）との複合体のチャージ比と吸光度の関係を
示す図である。FIG. 22 is a diagram showing the relationship between the charge ratio and the absorbance of a complex of a dextran-modified polymer and DNA (oligonucleotide).
【図２３】デキストラン修飾重合体とＤＮＡ（プラスミ
ド）との複合体のチャージ比と吸光度の関係を示す図で
ある。FIG. 23 is a diagram showing the relationship between the charge ratio of a complex of a dextran-modified polymer and DNA (plasmid) and absorbance.
フロントページの続き (72)発明者 米村 圭史 茨城県つくば市観音台１丁目25番11号 久 光製薬株式会社筑波研究所内Continued on the front page (72) Inventor Keishi Yonemura 1-25-11 Kannondai, Tsukuba, Ibaraki Pref. Hisamitsu Pharmaceutical Co., Ltd. Tsukuba Research Laboratories
Claims (10)
し、かつ前記ポリ（カチオン性アミノ酸）に対して櫛型
に化学的に結合している親水性基を側鎖として有する核
酸安定化用キャリアー。1. A nucleic acid stabilizing carrier having a poly (cationic amino acid) as a main chain and a side chain having a hydrophilic group chemically bonded to the poly (cationic amino acid) in a comb shape. .
リ（リジン）であることを特徴とする請求項１に記載の
核酸安定化用キャリアー。2. The carrier according to claim 1, wherein the poly (cationic amino acid) is poly (lysine).
ル、ポリエチレングリコール誘導体、及び糖類からなる
群から選択される少なくとも１つであることを特徴とす
る請求項１又は２に記載の核酸安定化用キャリアー。3. The nucleic acid stabilizing carrier according to claim 1, wherein the hydrophilic group is at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol, a polyethylene glycol derivative, and a saccharide. .
ン、デキストラン、ポリエチレングリコール、及びポリ
エチレングリコール誘導体からなる群から選択される少
なくとも１つであることを特徴とする請求項１又は２に
記載の核酸安定化用キャリアー。4. The method according to claim 1, wherein the hydrophilic group is at least one selected from the group consisting of glycosaminoglycan, dextran, polyethylene glycol, and a polyethylene glycol derivative. Carrier for stabilizing nucleic acids.
ルロン酸塩であることを特徴とする請求項１又は２に記
載の核酸安定化用キャリアー。5. The nucleic acid stabilizing carrier according to claim 1, wherein the hydrophilic group is hyaluronic acid or a hyaluronic acid salt.
親水性基とが、グラフト重合していることを特徴とする
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸安定化用キャ
リアー。6. The nucleic acid stabilizing carrier according to claim 1, wherein the poly (cationic amino acid) and the hydrophilic group are graft-polymerized.
％〜９５重量％が前記親水性基であることを特徴とする
請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸安定化用キャ
リアー。7. The carrier for stabilizing a nucleic acid according to claim 1, wherein 10% to 95% by weight of the carrier for stabilizing a nucleic acid is the hydrophilic group.
するカチオン性アミノ酸基の数（Ｘ）と、前記核酸安定
化用キャリアーと複合体を形成するべき核酸に含まれる
リン酸基の数（Ｙ）との比（Ｘ／Ｙ）が、０．５〜２の
範囲であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか
１項に記載の核酸安定化用キャリアー。8. The number (X) of cationic amino acid groups constituting the poly (cationic amino acid) and the number of phosphate groups (Y) contained in a nucleic acid to be complexed with the nucleic acid stabilizing carrier. The carrier for stabilizing nucleic acid according to any one of claims 1 to 6, wherein the ratio (X / Y) to the carrier is in the range of 0.5 to 2.
し、かつ前記ポリ（カチオン性アミノ酸）に対して櫛型
に化学的に結合している親水性基を側鎖として有する核
酸安定化用キャリアーにより核酸と複合体を形成するこ
とを特徴とする核酸安定化方法。9. A nucleic acid stabilizing carrier having a poly (cationic amino acid) as a main chain and a side chain having a hydrophilic group chemically bonded to the poly (cationic amino acid) in a comb shape. A method for stabilizing a nucleic acid, comprising forming a complex with a nucleic acid by the method described above.
成するカチオン性アミノ酸基の数（Ｘ）と、前記核酸安
定化用キャリアーと複合体を形成するべき核酸に含まれ
るリン酸基の数（Ｙ）との比（Ｘ／Ｙ）が、０．５〜２
の範囲であることを特徴とする、請求項９に記載の核酸
安定化方法。10. The number (X) of cationic amino acid groups constituting the poly (cationic amino acid) and the number of phosphate groups (Y) contained in a nucleic acid to be complexed with the nucleic acid stabilizing carrier. ) Is 0.5 to 2 (X / Y).
10. The method for stabilizing nucleic acid according to claim 9, wherein
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9130448A JPH10158196A (en) | 1996-05-16 | 1997-05-02 | Carrier for stabilization of nucleic acid |
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| JP8-146825 | 1996-10-04 | ||
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| JP8-283259 | 1996-10-04 | ||
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| JPH10158196A true JPH10158196A (en) | 1998-06-16 |
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| JP (1) | JPH10158196A (en) |
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