JPH10146183A - Electrode, detection device and sensor - Google Patents
Electrode, detection device and sensorInfo
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- JPH10146183A JPH10146183A JP9032413A JP3241397A JPH10146183A JP H10146183 A JPH10146183 A JP H10146183A JP 9032413 A JP9032413 A JP 9032413A JP 3241397 A JP3241397 A JP 3241397A JP H10146183 A JPH10146183 A JP H10146183A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を固定化した
電極、核酸を固定化した電極を用いた検出装置および核
酸を固定化した電極を用いたセンサに関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an electrode on which a nucleic acid is immobilized, a detector using the electrode on which the nucleic acid is immobilized, and a sensor using the electrode on which the nucleic acid is immobilized.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年の分子生物学の進歩により、核酸の
塩基配列と疾病との関係が明らかになってきた。そこ
で、特定の塩基配列あるいは特定の遺伝子の存在を検出
することによって、発病の可能性や疾病の進行の程度等
を探る遺伝子診断が、臨床検査の中で重要な位置を占め
るようになってきた。2. Description of the Related Art Recent advances in molecular biology have revealed the relationship between nucleic acid base sequences and diseases. Therefore, genetic diagnosis, which seeks the possibility of onset and the degree of disease progression by detecting the presence of a specific nucleotide sequence or a specific gene, has become an important part of clinical testing. .
【０００３】一般に、特定の塩基配列あるいは特定の遺
伝子の存在を検出する電極は、導電体上にプローブとな
る核酸を固定化した構成をとっており、特定の塩基配列
あるいは特定の遺伝子の存在は、プローブとなる核酸と
試料中の核酸との間で形成されたハイブリッドを電気的
あるいは光学的な信号を測定することで検出する。とこ
ろが、従来の電極は、ワイヤー状の電極を樹脂で抱埋し
た構造をとるために、電極、特に、導電体においてプロ
ーブとなる核酸を固定化する領域の表面積がばらつきや
すい。さらに、物質の結晶構造は、その表面に固定化さ
れる他の物質の量に影響を与えることが知られている
が、従来のワイヤー状の形態を有する電極では結晶構造
を制御することができず、導電体上へ固定化されるプロ
ーブの量を制御することが困難である。したがって、導
電体上へ固定化されるプローブの量が変動しやすく、核
酸の検出に際し再現性が悪く、定量性にも劣るという問
題があった。Generally, an electrode for detecting the presence of a specific base sequence or a specific gene has a structure in which a nucleic acid serving as a probe is immobilized on a conductor. A hybrid formed between a nucleic acid serving as a probe and a nucleic acid in a sample is detected by measuring an electrical or optical signal. However, since the conventional electrode has a structure in which a wire-like electrode is embedded in a resin, the surface area of the electrode, particularly the area of the conductor, on which the nucleic acid serving as a probe is immobilized tends to vary. Furthermore, the crystal structure of a substance is known to affect the amount of other substances immobilized on its surface, but the crystal structure can be controlled with a conventional wire-shaped electrode. Therefore, it is difficult to control the amount of the probe immobilized on the conductor. Therefore, there has been a problem that the amount of the probe immobilized on the conductor is liable to fluctuate, and the reproducibility of nucleic acid detection is poor and the quantification is poor.
【０００４】また、近年、遺伝子診断の分野では検出感
度の高感度化が進行しており、例えば、Ｃ型肝炎ウイル
スの遺伝子診断では、治療あるいは疾病の進行状態の指
標に用いる観点から、１０5 〜１０6 copy／mL程度まで
の核酸を検出可能な感度が要求されている。同様に、Ｈ
ＩＶおよびＨＢＶ等のウイルスや細菌の検査あるいは癌
遺伝子の検出等においても高い検出感度が求められてお
り、さらなる高感度化が求められている。さらに、患者
への負担を軽減するために、採取するサンプルの微量化
が進行しており、血液電解質測定等では既に数マイクロ
リットルのサンプルから測定が行われている。In recent years, the sensitivity of detection has been increased in the field of gene diagnosis. For example, in gene diagnosis of hepatitis C virus, from the viewpoint of use as an indicator of the progress of treatment or disease, 10 5 Sensitivity capable of detecting nucleic acids up to about 10 6 copy / mL is required. Similarly, H
High detection sensitivity is also required in tests for viruses and bacteria such as IV and HBV, detection of oncogenes, and the like, and further higher sensitivity is required. Furthermore, in order to reduce the burden on the patient, the amount of the sample to be collected has been reduced, and in the measurement of blood electrolytes and the like, measurement has already been performed from a sample of several microliters.
【０００５】しかしながら、従来の電極を用いた検出装
置およびセンサでは、電気化学的な活性を有する物質が
電極の表面で直接反応したり、挿入剤や電気化学的な活
性を有するラベル化剤を用いた場合には挿入剤やラベル
化剤のプローブへの結合を防止できないため、バックグ
ランドが大きくなってしまう。したがって、存在量が１
０5 copy／mL程度までの核酸が検出の限界であり（K.Ha
shimoto,Anal.Chem.66,3830,1994）、ＰＣＲ法のように
酵素反応を用いた核酸の検出方法と比較すると検出感度
が低いという問題があった。However, in a conventional detection device and sensor using an electrode, a substance having an electrochemical activity reacts directly on the surface of the electrode, or an intercalating agent or a labeling agent having an electrochemical activity is used. In this case, the binding of the intercalating agent or the labeling agent to the probe cannot be prevented, so that the background becomes large. Therefore, the abundance is 1
Nucleic acid up to about 5 copy / mL is the limit of detection (K. Ha
Shimoto, Anal. Chem. 66, 3830, 1994), and there is a problem that the detection sensitivity is low as compared with a nucleic acid detection method using an enzyme reaction such as a PCR method.
【０００６】さらに、上述したΡＣＲ法、酵素標識した
核酸プローブと化学発光を組み合わせた方法あるいは挿
入剤や電気化学的な活性を有するラベル化剤を用いて核
酸を検出する方法を適用した検出装置およびセンサ等に
よれば、反応系が複雑なことから、核酸の検出に要する
時間が長く、操作が煩雑であり、核酸の検出に要する経
済的な負担も大きいという問題があった。Further, a detection apparatus to which the above-mentioned ΔCR method, a method combining an enzyme-labeled nucleic acid probe and chemiluminescence, or a method for detecting a nucleic acid using an intercalating agent or a labeling agent having electrochemical activity is provided. According to the sensor and the like, the reaction system is complicated, so that the time required for nucleic acid detection is long, the operation is complicated, and the economic burden required for nucleic acid detection is large.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来例
に鑑みてなされたもので、優れた再現性および定量性を
発揮し、経済的に核酸を検出可能な電極を提供すること
を目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned prior art, and has as its object to provide an electrode which exhibits excellent reproducibility and quantitativeness and can detect nucleic acids economically. And
【０００８】また、本発明は、核酸の検出に際し、優れ
た再現性および定量性を発揮するとともに、検出に要す
る時間の短縮と操作性の向上が図られた、検出時の経済
性にも優れる検出装置を提供することを目的とする。In addition, the present invention exhibits excellent reproducibility and quantification in nucleic acid detection, shortens the time required for detection and improves operability, and is also excellent in economical efficiency in detection. It is an object to provide a detection device.
【０００９】さらに、本発明は、核酸の検出に際し、優
れた再現性および定量性を発揮するとともに、検出感度
の高感度化が達成され、検出に要する時間の短縮と操作
性の向上が図られた、検出時の経済性にも優れる検出装
置を提供することを目的とする。Further, the present invention exhibits excellent reproducibility and quantification when detecting nucleic acids, achieves high detection sensitivity, shortens the time required for detection, and improves operability. It is another object of the present invention to provide a detection device which is excellent in economical efficiency at the time of detection.
【００１０】また、本発明は、核酸の検出に際し、優れ
た再現性および定量性を発揮するとともに、検出感度の
高感度化が達成され、検出に要する時間の短縮と操作性
の向上が図られた、検出時の経済性にも優れるセンサを
提供することを目的とする。Further, the present invention exhibits excellent reproducibility and quantification when detecting nucleic acid, achieves high detection sensitivity, shortens the time required for detection, and improves operability. It is another object of the present invention to provide a sensor that is excellent in economy at the time of detection.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】本願第１の発明に係る電
極は、基板と、前記基板上に配置した導電体と、前記導
電体の表面を、外部に対する接続領域を確保しつつ被覆
した絶縁体と、前記導電体を露出するよう前記絶縁体に
設けた開口部と、前記開口部より露出した前記導電体に
固定化した核酸とを具備したことを特徴としている。According to the first aspect of the present invention, there is provided an electrode comprising: a substrate; a conductor disposed on the substrate; A conductor, an opening provided in the insulator so as to expose the conductor, and a nucleic acid fixed to the conductor exposed through the opening.
【００１２】本願第１の発明における電極によれば、基
板上に配置した導電体を被覆した絶縁体の一部に、導電
体が露出するように開口部を設け、該開口部より露出し
た導電体に核酸を固定化したことにより、表面積が制御
された導電体上へ核酸を固定化することができるので、
固定化する核酸の量を制御することが可能となる。ま
た、基板上に導電体を配置したことにより、導電体の特
性を制御することができるので、導電体上に固定化する
核酸の量を制御することが可能となる。According to the electrode of the first aspect of the present invention, an opening is provided in a part of the insulator covering the conductor disposed on the substrate so that the conductor is exposed, and the conductive part exposed from the opening is provided. By immobilizing the nucleic acid on the body, it is possible to immobilize the nucleic acid on a conductor whose surface area is controlled,
It is possible to control the amount of the nucleic acid to be immobilized. In addition, since the properties of the conductor can be controlled by disposing the conductor on the substrate, the amount of the nucleic acid immobilized on the conductor can be controlled.
【００１３】本願第１の発明に係る電極において、基板
の材質はとくに限定されるものではなく、無機絶縁材料
および有機材料等を用いることができる。無機絶縁材料
としては、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイ
ア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化
ケイ素およびその他の金属酸化物等を挙げることができ
る。また、有機材料としては、ポリエチレン、エチレ
ン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレン
テレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、
ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニ
ル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、ア
クリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ア
セタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノ
ール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、
スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリ
ル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポ
リフェニレンオキサイドおよびポリスルホン等を挙げる
ことができる。In the electrode according to the first aspect of the present invention, the material of the substrate is not particularly limited, and an inorganic insulating material and an organic material can be used. Examples of the inorganic insulating material include glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, silicon nitride, and other metal oxides. In addition, as the organic material, polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin,
Polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenolic resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin,
Examples include styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile / butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, and polysulfone.
【００１４】また、基板上に配置する導電体の材質とし
ては、金が好ましいが、その他の材質も使用可能であ
る。例えば、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケ
ル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウムお
よびタングステン等の金属単体またはそれらの合金、グ
ラファイト、グラシーカーボン等の炭素やこれらの酸化
物もしくは化合物を挙げることができる。[0014] The material of the conductor disposed on the substrate is preferably gold, but other materials can also be used. For example, gold alloys, silver, platinum, mercury, nickel, palladium, silicon, germanium, gallium, tungsten and other simple metals or alloys thereof, graphite, carbon such as glassy carbon and oxides or compounds thereof. Can be.
【００１５】さらに、基板上への導電体の配置は、蒸
着、スパッタ、メッキおよび印刷等の方法により行うこ
とができる。蒸着法としては、抵抗加熱法、高周波加熱
法および電子ビーム加熱法等を挙げることができる。ま
た、スパッタとしては、直流二極スパッタリング、バイ
アススパッタリング、非対称交流スパッタリング、ゲッ
タスパッタリングおよび高周波スパッタリング等を挙げ
ることができる。Further, the conductor can be arranged on the substrate by a method such as vapor deposition, sputtering, plating and printing. Examples of the vapor deposition method include a resistance heating method, a high-frequency heating method, and an electron beam heating method. Examples of the sputtering include direct current bipolar sputtering, bias sputtering, asymmetric alternating current sputtering, getter sputtering, and high frequency sputtering.
【００１６】また、基板上へ配置する導電体において
は、結晶構造の（１１１）面の配向指数を大きくするこ
とがより好ましく、これにより導電体上に固定化される
核酸の量を制御することが可能となる。なお、配向指数
は、ウィルソンの方法により、以下の式から求められ
る。In the conductor arranged on the substrate, it is more preferable to increase the orientation index of the (111) plane of the crystal structure, thereby controlling the amount of nucleic acid immobilized on the conductor. Becomes possible. The orientation index is obtained from the following equation by Wilson's method.
【００１７】配向指数（ｈ ｋ ｌ）＝ＩＦ（ｈｋｌ）
／ＩＦＲ（ｈｋｌ） ここで、ｈｋｌは面指数、ＩＦ（ｈｋｌ）は（ｈ ｋ
ｌ）面の相対強度、ΙＦＲ（ｈｋｌ）はＡＳＴＭカード
に記載されている標準金としてのＩＦ（ｈｋｌ）であ
る。[0017] Orientation index (hkl) = IF (hkl)
/ IFR (hkl) where hkl is a surface index and IF (hkl) is (h k
l) The relative strength of the surface, ΔFR (hkl), is IF (hkl) as the standard gold described on the ASTM card.
【００１８】本願第１の発明に係る電極においては、上
記配向指数が１以上３以下であることが好ましく、２以
上３以下であることがより好ましい。導電体の配向指数
を高くするためには、例えば、導電体を蒸着またはスパ
ッタリングで基板上に配置する場合、基板を加熱してお
くことが有効である。加熱温度は特に限定されるもので
はないが、５０℃以上５００℃以下であることが好まし
い。In the electrode according to the first aspect of the present invention, the orientation index is preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 2 or more and 3 or less. In order to increase the orientation index of a conductor, for example, when a conductor is disposed on a substrate by vapor deposition or sputtering, it is effective to heat the substrate. The heating temperature is not particularly limited, but is preferably from 50 ° C to 500 ° C.
【００１９】また、基板上に導電体を配置する際、該基
板と該導電体との間に、該導電体に用いた材質とは異な
った材質からなる接着層を介在させ、導電体が接着層に
なじむように構成すると、導電体の安定性を向上させる
ことが可能となる。接着層の材質としては、チタン、ク
ロム、銅、ニッケルの単体、これら単体の合金およびこ
れら単体もしくは合金を組み合わせたものを挙げること
ができる。この場合にも、導電体を蒸着またはスパッタ
リングで接着層上に配置する際、接着層を加熱しておく
ことが有効である。When arranging the conductor on the substrate, an adhesive layer made of a material different from the material used for the conductor is interposed between the substrate and the conductor, and the conductor is bonded. When configured to conform to the layer, the stability of the conductor can be improved. Examples of the material for the adhesive layer include titanium, chromium, copper, and nickel simple substances, alloys of these simple substances, and combinations of these simple substances or alloys. Also in this case, it is effective to heat the adhesive layer when disposing the conductor on the adhesive layer by vapor deposition or sputtering.
【００２０】さらに、絶縁体の材質としては、好ましく
は樹脂、より好ましくはフォトポリマーおよびフォトレ
ジストを挙げることができる。フォトレジストとして
は、光露光用フォトレジスト、遠紫外用フォトレジス
ト、Ｘ線用フォトレジストおよび電子線用フォトレジス
トを挙げることができる。光露光用フォトレジストとし
ては、環化ゴム、ポリけい皮酸およびノボラック樹脂等
を主原料とするものを挙げることができる。遠紫外用フ
ォトレジストとしては、環化ゴム、フェノール樹脂、ポ
リメチルイソプロペニルケトン（ΡＭΙＰＫ）およびポ
リメチルメタクリレート（ΡＭＭΑ）等を主原料とする
ものを挙げることができる。また、Ｘ線用レジストとし
ては、ＣＯΡおよびメタルアクリレートを主原料とする
ものの他、薄膜ハンドブック（オーム社）に記載され
た、当該技術分野で知られているものを挙げることがで
きる。さらに、電子線用レジストとしては、ΡＭＭΑを
はじめとする、上記ハンドブックに記載されたものを挙
げることができる。なお、絶縁体の膜厚は絶縁性確保の
ために１００オングストローム以上が好ましく、また、
核酸の固定化のために１ｍｍ以下であることが好まし
い。Further, as the material of the insulator, preferably, a resin, more preferably, a photopolymer and a photoresist can be used. Examples of the photoresist include a photoresist for light exposure, a photoresist for far ultraviolet, a photoresist for X-ray, and a photoresist for electron beam. Examples of the photoresist for light exposure include those containing cyclized rubber, polycinnamic acid, novolak resin, and the like as main raw materials. Examples of the far ultraviolet photoresist include cyclized rubber, phenol resin, polymethyl isopropenyl ketone ({M} PK), polymethyl methacrylate ({MM}), and the like as main raw materials. Examples of the X-ray resist include those mainly containing CO の 他 and metal acrylate, and those known in the technical field described in a thin film handbook (Ohm). Further, examples of the electron beam resist include those described in the above handbook, including {MM}. Note that the thickness of the insulator is preferably 100 Å or more to secure insulation.
It is preferably 1 mm or less for immobilizing nucleic acids.
【００２１】さらに、導電体を露出するよう絶縁体に設
けられた開口部は、導電体を絶縁体で被覆した後に、当
該技術分野で知られているリソグラフィーを用いて形成
できる。したがって、開口部の大きさ、換言すれば絶縁
体より露出した導電体の表面積を制御することが可能と
なり、固定化された核酸の量を制御することができる。
なお、絶縁体より露出した導電体の表面の形状は、曲率
変化が連続する形状、例えば、円、楕円あるいは正六角
形以上の多角形であることが望ましい。Further, the opening provided in the insulator so as to expose the conductor can be formed using lithography known in the art after covering the conductor with the insulator. Therefore, the size of the opening, in other words, the surface area of the conductor exposed from the insulator can be controlled, and the amount of the immobilized nucleic acid can be controlled.
Note that the shape of the surface of the conductor exposed from the insulator is preferably a shape in which the curvature changes continuously, for example, a circle, an ellipse, or a polygon having a regular hexagon or more.
【００２２】リソグラフィーを行うに際し、絶縁体の好
ましい態様の一つは上述したレジストである。従来、レ
ジストは最終的に除去するのが一般的であるが、本願第
１の発明である電極の場合には、絶縁体として電極の一
部に用いることが可能であり、上述した耐水性の高い材
質でなければならない。また、レジストの他、ケイ素、
チタン、アルミニウム、亜鉛、鉛、カドミウム、タング
ステン、モリブデン、クロム、タンタル、ニッケル等の
酸化物、窒化物および炭化物、またはその他の合金を用
いて、スパッタ、蒸着またはＣＶＤ等の方法により薄膜
を形成した後に、フォトリソグラフィー等のリソグラフ
ィーを行うことで開口部のパターニングを行って、開口
部の大きさ、換言すれば絶縁体より露出した導電体の表
面積を制御することができる。In performing lithography, one of the preferable embodiments of the insulator is the above-described resist. Conventionally, the resist is generally finally removed. However, in the case of the electrode according to the first invention of the present application, the resist can be used as a part of the electrode as an insulator, and the above-described water resistance The material must be high. In addition to resist, silicon,
Using oxides, nitrides and carbides such as titanium, aluminum, zinc, lead, cadmium, tungsten, molybdenum, chromium, tantalum and nickel, or other alloys, thin films were formed by a method such as sputtering, vapor deposition, or CVD. Later, the opening is patterned by performing lithography such as photolithography, so that the size of the opening, in other words, the surface area of the conductor exposed from the insulator can be controlled.
【００２３】また、開口部に絶縁体より露出した導電体
に対して核酸を固定化する場合には、導電体の表面を活
性化する処理を行うことが望ましい。この処理は、絶縁
体の表面に存在する異物を除去し、絶縁体の表面を完全
に暴露することにより、絶縁体の表面における自由エネ
ルギーを増加させ、核酸の固定化を確実にする目的で行
われる。具体的には、はじめに、導電体を脱イオン水で
洗浄する。洗浄後、０．１〜１０Ｍの硫酸溶液中で−
０．５〜２Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）の範囲で、１〜
１０００００ｖ／ｓの範囲で電位を走査させる。なお、
活性化は、硫酸の溶液だけでなく、混酸、王水、過塩素
酸等を使用して行ってもよい。こうして表面が活性化さ
れた導電体に核酸を固定化するが、固定化に際し、核酸
の５´または３´末端にチオール基を導入しておく。チ
オール化された核酸は、主としてチオール基の酸化を防
ぐ観点から、ＤＴＴ等の還元剤の存在する溶液中に保存
される。ＤＴＴ等の還元剤は、核酸の固定化の直前にゲ
ルろ過又は酢酸エチルによる抽出操作等により除去され
る。チオール基を導入した核酸を、表面が活性化された
導電体に固定化するには、イオン強度が０．０１〜５、
ｐＨが５〜１０の範囲内に調整された緩衝液中に核酸を
溶解し、この緩衝液に活性化した直後の電極を浸漬する
ことにより行う。導電体への核酸の固定化は、緩衝液の
温度を４〜１００℃の範囲とし、１０分から１晩放置し
て行う。チオール基は、金等の導電体の表面に吸着さ
れ、強い相互作用で固定化されるので、チオール基を導
入した核酸は導電体の表面に強固に固定化されることと
なる。導電体に固定化される核酸の量は、上述した緩衝
液に溶解させる核酸の量を調整することにより制御され
るが、一般的には、緩衝液中の核酸の最終濃度が１ｎｇ
／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌとなるように調整される。この条
件のもとでは、核酸は導電体の表面に10 9copy／cm2〜1
014copy／cm2 程度固定化される。核酸を固定化した電
極は、 DNaseや RNase等の核酸分解酵素（ヌクレアー
ゼ）が存在しない条件で保存し、好ましくは遮光するこ
とにより保存することができる。保存期間が比較的短い
場合には、ハイブリダイゼーション溶液、トリス−ＥＤ
ΤＡ緩衝液（ＴＥ）または滅菌した脱イオン水中に浸し
て保存することが可能である。電極の保存温度は４℃以
下が好ましいが、より好ましくは−２０℃程度で保存す
る。なお、長期間にわたり電極を保存する場合には、固
定化された核酸を安定に保つためにドライ条件下で保存
することが好ましい。電極をドライにする方法として
は、凍結乾燥や風乾等を挙げることができ、アルゴン等
の不活性ガス、窒素または乾燥空気等の気相の下、ある
いは真空状態の下で好適に実施することができる。When immobilizing a nucleic acid on a conductor exposed from an insulator in an opening, it is desirable to perform a treatment for activating the surface of the conductor. This treatment is performed for the purpose of removing foreign substances present on the surface of the insulator and completely exposing the surface of the insulator, thereby increasing free energy on the surface of the insulator and ensuring immobilization of nucleic acids. Will be Specifically, first, the conductor is washed with deionized water. After washing, in a 0.1-10 M sulfuric acid solution-
In the range of 0.5 to 2 V (vs Ag / AgCl), 1 to
The potential is scanned in the range of 100,000 v / s. In addition,
The activation may be performed using not only a sulfuric acid solution but also a mixed acid, aqua regia, perchloric acid, or the like. The nucleic acid is immobilized on the conductor whose surface has been activated in this way, and a thiol group is introduced at the 5 'or 3' end of the nucleic acid before immobilization. The thiolated nucleic acid is stored in a solution containing a reducing agent such as DTT, mainly from the viewpoint of preventing oxidation of the thiol group. The reducing agent such as DTT is removed by gel filtration or extraction with ethyl acetate immediately before immobilization of the nucleic acid. To immobilize the thiol group-introduced nucleic acid on a conductor whose surface is activated, the ionic strength is 0.01 to 5,
This is carried out by dissolving the nucleic acid in a buffer solution whose pH is adjusted within the range of 5 to 10, and immersing the electrode immediately after activation in this buffer solution. Immobilization of the nucleic acid on the conductor is performed by setting the temperature of the buffer solution in the range of 4 to 100 ° C. and leaving it for 10 minutes to overnight. Since the thiol group is adsorbed on the surface of a conductor such as gold and is immobilized by strong interaction, the nucleic acid into which the thiol group is introduced is firmly immobilized on the surface of the conductor. The amount of the nucleic acid immobilized on the conductor is controlled by adjusting the amount of the nucleic acid to be dissolved in the buffer described above, but generally, the final concentration of the nucleic acid in the buffer is 1 ng.
/ Ml to 1 mg / ml. Under these conditions, the nucleic acid is deposited on the surface of the conductor at 10 9 copies / cm 2 to 1
0 14 copy / cm 2 is fixed. The electrode on which the nucleic acid is immobilized can be stored under conditions free of nucleases (nucleases) such as DNase and RNase, and preferably can be stored under light shielding. If the storage period is relatively short, the hybridization solution, Tris-ED
浸 It can be stored immersed in A buffer (TE) or sterile deionized water. The electrode is preferably stored at a temperature of 4 ° C. or lower, more preferably at about −20 ° C. When the electrode is stored for a long period of time, it is preferable to store it under dry conditions in order to stably maintain the immobilized nucleic acid. Examples of the method for drying the electrode include freeze-drying and air-drying, which can be suitably performed under an inert gas such as argon, a gaseous phase such as nitrogen or dry air, or under a vacuum. it can.
【００２４】さらに、導電体の表面に固定化される核酸
は、ＤＮＡ（一本鎖）のほかＲＮＡ（一本鎖）でもよ
く、塩基数も限定されるものではない。しかしながら、
特定の核酸をバックグラウンドを生じることなく確実に
検出するために、核酸は１５塩基〜３０００塩基程度の
長さにすることが好ましい。また、導電体の表面に固定
化される核酸の塩基配列は検出する核酸の塩基配列にし
たがって決定されるが、１種類の塩基配列だけでなく複
数種類の塩基配列からなる核酸を導電体の表面に固定化
することができる。検出する核酸としては、種々のウイ
ルス、細菌、寄生虫および真菌等に由来する核酸や腫瘍
をはじめとする種々の疾患を有する細胞に由来する核酸
であってもよい。なお、検出する核酸は、種々のウイル
ス、細菌、寄生虫、真菌および腫瘍をはじめとする種々
の疾患を有する細胞に由来する遺伝子や遺伝子の一部で
あってもよく、また、遺伝子以外の核酸であってもよ
い。ここで、遺伝子とは、ゲノム上のある長さをもった
特定の区画（構造遺伝子）を指すものである。ウイルス
としては、肝炎ウイルス（Ａ、Β、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆおよ
びＧ型）、ヒト免疫不全症ウイルス、インフルエンザウ
イルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポリオー
マウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ム
ンプスウイルス、ロタウイルス、エンテロウイルス、日
本脳炎ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、ヒト
Τ細胞白血病ウイルス、サイトメガロウイルス等を挙げ
ることができる。また、細菌および真菌としては、黄色
ブドウ球菌、溶血性連鎖球菌、病原性大腸菌、腸炎ビブ
リオ菌、ヘリコバクタービロリ菌、カンビロバクター、
コレラ菌、赤痢菌、サルモネラ菌、エルシニア、淋菌、
リステリア菌、レプトスビラ、レジオネラ菌、スピロヘ
ータ、肺炎マイコプラズマ、リッケチア、クラジミア、
マラリア、赤痢アメーバおよび病原真菌等を挙げること
ができる。また、種々の疾患を有する細胞としては、網
膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、家族性大腸ポリポーシ
ス、遺伝性ポリポーシス大腸癌、神経繊維腫症、家族性
乳癌、色素性乾皮症、脳腫瘍、口腔癌、食道癌、胃癌、
大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、甲状腺腫瘍、泌尿器腫
瘍、男性器腫瘍、女性器腫瘍、皮膚腫瘍、骨・軟部腫
瘍、白血病、リンパ腫、固形腫瘍に由来する細胞を挙げ
ることができる。さらに、導電体の表面に固定化される
核酸は、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、***、
唾液、組織、培養細胞および喀痰等の試料から抽出して
もよく、また、ＤＮＡ合成機等により化学合成してもよ
い。上記試料から核酸を抽出する方法としては、特に限
定されるものではなく、フェノール−クロロホルム法等
の液−液抽出法や、担体を用いる固−液抽出法を用いる
ことができ、また、ＱＩＡｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）や
スマイテスト（住友金属社製）等の市販の核酸抽出キッ
トを用いることも可能である。Further, the nucleic acid immobilized on the surface of the conductor may be RNA (single-stranded) in addition to DNA (single-stranded), and the number of bases is not limited. However,
In order to reliably detect a specific nucleic acid without generating a background, it is preferable that the nucleic acid has a length of about 15 to 3000 bases. The base sequence of the nucleic acid immobilized on the surface of the conductor is determined according to the base sequence of the nucleic acid to be detected. Can be immobilized. The nucleic acid to be detected may be a nucleic acid derived from various viruses, bacteria, parasites, fungi and the like, or a nucleic acid derived from cells having various diseases such as tumors. The nucleic acid to be detected may be a gene or a part of a gene derived from a cell having various diseases including various viruses, bacteria, parasites, fungi, and tumors. It may be. Here, the gene refers to a specific section (structural gene) having a certain length on the genome. Viruses include hepatitis virus (A, Β, C, D, E, F and G), human immunodeficiency virus, influenza virus, herpes virus, adenovirus, polyoma virus, papilloma virus, parvovirus, mumps virus , Rotavirus, enterovirus, Japanese encephalitis virus, dengue virus, rubella virus, human Τcell leukemia virus, cytomegalovirus and the like. In addition, as bacteria and fungi, Staphylococcus aureus, hemolytic streptococci, pathogenic Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Helicobacter virori, Cambirobacter,
Vibrio cholerae, Shigella, Salmonella, Yersinia, Neisseria gonorrhoeae,
Listeria monocytogenes, Leptosvira, Legionella, Spirochetes, Mycoplasma pneumonia, Rickettia, Krajemia,
Malaria, dysentery amoeba, pathogenic fungi and the like can be mentioned. In addition, as cells having various diseases, retinoblastoma, Wilms tumor, familial colon polyposis, hereditary polyposis colon cancer, neurofibromatosis, familial breast cancer, xeroderma pigmentosum, brain tumor, oral cancer, Esophageal cancer, gastric cancer,
Examples include cells derived from colorectal cancer, liver cancer, pancreatic cancer, lung cancer, thyroid tumor, urinary tumor, male organ tumor, female organ tumor, skin tumor, bone / soft tissue tumor, leukemia, lymphoma, and solid tumor. Further, nucleic acids immobilized on the surface of the conductor, for example, blood, serum, leukocytes, urine, stool, semen,
It may be extracted from samples such as saliva, tissue, cultured cells and sputum, or may be chemically synthesized using a DNA synthesizer or the like. The method for extracting nucleic acids from the sample is not particularly limited, and a liquid-liquid extraction method such as a phenol-chloroform method, a solid-liquid extraction method using a carrier, and a QIAmp ( It is also possible to use a commercially available nucleic acid extraction kit such as QIAGEN) or Sumy Test (Sumitomo Metals).
【００２５】本願第１の発明による電極は、核酸の検出
が必要であるならば、種々の疾患や疾病の進行の程度を
検出する医療分野のみならず、例えば、食品検査、検
疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業および林業
等の全ての分野に適用することができる。The electrode according to the first invention of the present application is not limited to the medical field for detecting the degree of progress of various diseases and diseases, if it is necessary to detect nucleic acids. It can be applied to all fields such as forensic medicine, agriculture, livestock, fishery and forestry.
【００２６】また、本願第２の発明に係る検出装置は、
基板と、前記基板上に配置した導電体と、前記導電体の
表面を、外部に対する接続領域を確保しつつ被覆した絶
縁体と、前記導電体を露出するよう前記絶縁体に設けた
開口部と、前記開口部より露出した前記導電体に固定化
した第１の核酸とを有する電極と、前記電極に固定化さ
れた第１の核酸と第２の核酸とを共存させ、設定した条
件下でハイブリダイゼーションを実行する反応部と、前
記電極に固定化された第１の核酸に電圧を印加する印加
手段と、前記印加手段の動作によって生じた信号を測定
する測定手段とを具備したことを特徴としている。Further, the detection device according to the second invention of the present application comprises:
A substrate, a conductor disposed on the substrate, an insulator covering the surface of the conductor while securing a connection region to the outside, and an opening provided in the insulator to expose the conductor. An electrode having a first nucleic acid immobilized on the conductor exposed from the opening, and a first nucleic acid and a second nucleic acid immobilized on the electrode coexisting under set conditions. A reaction unit for performing hybridization, an application unit for applying a voltage to the first nucleic acid immobilized on the electrode, and a measurement unit for measuring a signal generated by the operation of the application unit. And
【００２７】本願第２の発明における検出装置によれ
ば、電極に定量的に固定化した第１の核酸と第２の核酸
とを反応部でハイブリダイゼーションさせ、第１の核酸
に電圧を印加して生じた信号を測定することにより、該
信号の測定量と第２の核酸の量とを一義的に対応させる
ことができるので、再現性および定量性に優れるととも
に高い感度で第２の核酸を検出することが可能となる。
また、検出に要する時間の短縮と操作性の向上が達成さ
れるので、第２の核酸を経済的に検出することが可能と
なる。According to the detection device of the second aspect of the present invention, the first nucleic acid and the second nucleic acid that are quantitatively immobilized on the electrode are hybridized in the reaction section, and a voltage is applied to the first nucleic acid. By measuring the resulting signal, the measured amount of the signal and the amount of the second nucleic acid can be uniquely associated with each other, so that the second nucleic acid can be obtained with high sensitivity and excellent reproducibility. It becomes possible to detect.
In addition, since the time required for detection is reduced and the operability is improved, the second nucleic acid can be economically detected.
【００２８】本願第２の発明に係る検出装置において、
電極は、上述した本願第１の発明に係る電極と同等のも
のである。In the detection device according to the second invention of the present application,
The electrode is the same as the electrode according to the first invention described above.
【００２９】また、反応部は、電極に固定化された第１
の核酸と第２の核酸とを共存させ、ハイブリダイゼーシ
ョンを実行可能な構成をとるものであるならば、特に限
定されないが、ハイブリダイゼーションは一般にイオン
強度０．０１〜５、ｐΗ５〜１０の範囲の緩衝液を用
い、１０〜９０℃の温度で１分以上１晩程度反応させる
ので、緩衝液の蒸発を防止するとともに温度管理が可能
な構造を有するものが好ましい。Further, the reaction section is provided with a first electrode fixed to the electrode.
The hybridization is generally carried out in an ionic strength of 0.01 to 5 and pΗ5 to 10 as long as the nucleic acid and the second nucleic acid coexist and have a configuration capable of performing hybridization. Since the reaction is carried out at a temperature of 10 to 90 ° C. for 1 minute or more and overnight using a buffer solution, it is preferable that the buffer solution has a structure capable of preventing evaporation of the buffer solution and controlling the temperature.
【００３０】さらに、電極に固定化された第１の核酸に
電圧を印加する印加手段としては、該電極の第１の核酸
を固定化した領域を作用極とし、該作用極に対応する対
極を設け、作用極と対極との間に電圧を印加するように
構成されていれば限定はされない。また、作用極と対極
との他に、グランドを基準系とする参照電極を設置して
もよい。また、通常、作用極と対極とは液体を介して配
置されており、該液体は核酸を分解するヌクレアーゼを
含まず、第１の核酸に対する電圧の印加と後述する測定
を妨げるものでなければ限定はされない。Further, as an application means for applying a voltage to the first nucleic acid immobilized on the electrode, a region where the first nucleic acid is immobilized on the electrode is used as a working electrode, and a counter electrode corresponding to the working electrode is used as an application electrode. The configuration is not limited as long as it is configured to apply a voltage between the working electrode and the counter electrode. Further, in addition to the working electrode and the counter electrode, a reference electrode using the ground as a reference system may be provided. Further, usually, the working electrode and the counter electrode are arranged via a liquid, the liquid does not contain a nuclease that decomposes nucleic acid, and is limited as long as it does not prevent the application of voltage to the first nucleic acid and the measurement described later. Is not done.
【００３１】また、印加手段の動作によって生じた信号
を測定する測定手段としては、電流値、電気伝導度、電
位、抵抗値、電気容量、インダクタンスおよびインピー
ダンス等の電気的な信号を検出する手段や、蛍光、化学
発光および電気化学発光を検出する手段が挙げられる。
核酸は、電圧を印加すると自身より発光するので、発光
強度を測定することにより、電極に存在する核酸の量、
換言すれば、第１の核酸とハイブリッド形成した第２の
核酸の量を検出することができる。また、第２の核酸の
検出に際し、電気的な信号を得るために、ヘキスト３３
２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイ
シン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等の
ビスインターカレーター、トリスインターカレーターお
よびポリインターカレーター等の挿入剤、フィロセン類
および金属錯体等の電気化学的に活性な物質により電極
上の核酸を標識し、第１の核酸に電圧を印加することに
より該電気化学的に活性な物質に由来する反応電流値等
の電気的な信号を検出して、第１の核酸とハイブリッド
形成した第２の核酸の量を検出することができる。電気
的な測定は、３電極タイプ（参照電極、対極、作用極）
または２電極タイプ（対極、作用極）で行われ、挿入剤
等が電気的に反応するように電圧を印加し、挿入剤等に
由来する電流値等を測定する。この際、電圧は定速で掃
引するか、パルスで印加するか、又は定電圧を印加する
ことができる。測定には、ポテンショスタット、デジタ
ルマルチメータ、フアンクションジェネレータ等の装置
を用いて電流や電圧を制御する。そして、得られた電流
値等をもとに、検量線から第２の核酸の濃度を算出す
る。また、第２の核酸の検出に際し、光学的な信号を増
幅するために発光物質および蛍光物質を添加してもよ
い。蛍光物質としては、ヘキスト３３２５８、アクリジ
ンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロイン
ターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレ
ーター、トリスインターカレーターおよびポリインター
カレーター等の挿入剤を挙げることができる。これらの
挿入剤は、紫外線等の照射により蛍光を発する。また、
ローダミン、フルオレッセイン類等の蛍光物質やルシフ
ェリン、アクリジニウムエステル類等の発光物質により
第２の核酸を標識し、紫外線等の照射や酵素等を添加す
ることにより光子を発生させ、第１の核酸とハイブリッ
ド形成した第２の核酸の量を検出することができる。さ
らに、ルシゲニンおよびルテニウム錯体等の電気化学発
光物質で第２の核酸を標識して発光させることにより、
第１の核酸とハイブリッド形成した第２の核酸の量を検
出することができる。また、アルカリフォスファターゼ
やパーオキシダーゼ等を用いて、第１の核酸とハイブリ
ッド形成した第２の核酸の量を検出することができる。
また、標識に際し、挿入剤、発光物質、電気化学発光物
質、蛍光物質および酵素の濃度はその種類により異なる
が、−般には１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で使用
する。このとき、標識は、イオン強度０．０１〜５、ｐ
Ｈ５から１０の範囲の緩衝液を用いて行うとよい。した
がって、測定手段は、必要に応じ最適なものが単独ある
いは組み合わされて用いられる。なお、挿入剤、発光物
質、電気化学、発光物質、蛍光物質等の標識剤の非特異
吸着を抑制するために、第１の核酸の固定化後あるいは
固定化時に、第１の核酸を固定化する領域の表面を何ら
かの物質で被覆することが望ましい。該物質は、特に限
定される物ではないが、センサが金からなる場合には、
チオール化合物であることがより望ましい。チオール化
合物としては、チオール化核酸を用いることができる。
チオール化核酸にはヌクレオチド、デオキシヌクレオチ
ド、ヌクレオシド、デオキシヌクレオシドがあり、アデ
ニン、チミン、ヒポキサンチン、キサンチン、シトシ
ン、グアニン、ウラシル、イノシン、アデノシン、チミ
ジン、グアノシン、シチジン、ウリジンおよびリボチミ
ジンまたはこれらのオリゴマー等を挙げることができ
る。また、ジチオスレイトール、ジチオビスベンゼン安
息香酸およびアルカンチオールメルカプトエタノール等
のチオール化合物も用いることができる。該物質で第１
の核酸を固定化する領域の表面を被覆すると、該領域に
対する標識剤の非特異的な吸着が抑制され、Ｓ／Ｎが向
上することになる。また、印加手段を動作させ、生じた
信号を測定手段により測定をする場合には、バックグラ
ウンドを低減する目的からハイブリダイゼーション後の
電極をハイブリダイゼーション溶液や滅菌水等で洗浄す
ることが好ましい。The measuring means for measuring a signal generated by the operation of the applying means includes means for detecting an electric signal such as a current value, electric conductivity, potential, resistance value, electric capacity, inductance and impedance. , Fluorescence, chemiluminescence and means for detecting electrochemiluminescence.
Nucleic acid emits light from itself when a voltage is applied, so by measuring the emission intensity, the amount of nucleic acid present at the electrode,
In other words, the amount of the second nucleic acid hybridized with the first nucleic acid can be detected. In addition, in order to obtain an electric signal when detecting the second nucleic acid, Hoechst 33 is used.
258, intercalators such as acridine orange, quinacrine, dounomycin, metallointercalators, bisacridines, intercalators such as trisintercalators and polyintercalators, and electrochemically active substances such as phylocenes and metal complexes on the electrodes. Was labeled, and a voltage was applied to the first nucleic acid to detect an electric signal such as a reaction current value derived from the electrochemically active substance, and hybridized with the first nucleic acid. The amount of the second nucleic acid can be detected. Electrical measurement, 3 electrode type (reference electrode, counter electrode, working electrode)
Alternatively, a two-electrode type (counter electrode, working electrode) is used, a voltage is applied so that the intercalating agent or the like reacts electrically, and a current value derived from the intercalating agent or the like is measured. At this time, the voltage can be swept at a constant speed, applied as a pulse, or a constant voltage can be applied. In the measurement, a current and a voltage are controlled using a device such as a potentiostat, a digital multimeter, and a function generator. Then, the concentration of the second nucleic acid is calculated from the calibration curve based on the obtained current value and the like. When detecting the second nucleic acid, a luminescent substance and a fluorescent substance may be added to amplify an optical signal. Examples of the fluorescent substance include bisintercalators such as Hoechst 33258, acridine orange, quinacrine, dounomycin, metallointercalators, and bisacridines, and intercalators such as tris intercalators and polyintercalators. These intercalating agents emit fluorescence when irradiated with ultraviolet rays or the like. Also,
The second nucleic acid is labeled with a fluorescent substance such as rhodamine or fluorescein or a luminescent substance such as luciferin or acridinium ester, and photons are generated by irradiation with ultraviolet rays or the like and addition of an enzyme or the like. The amount of the second nucleic acid hybridized with the nucleic acid can be detected. Further, by labeling the second nucleic acid with an electrochemiluminescent substance such as lucigenin and ruthenium complex to emit light,
The amount of the second nucleic acid hybridized with the first nucleic acid can be detected. In addition, the amount of the second nucleic acid hybridized with the first nucleic acid can be detected using alkaline phosphatase, peroxidase, or the like.
In addition, when labeling, the concentrations of the intercalating agent, luminescent substance, electrochemical luminescent substance, fluorescent substance and enzyme vary depending on the type, but are generally used in the range of 1 ng / ml to 1 mg / ml. At this time, the label is ionic strength 0.01-5, p
It is preferable to use a buffer in the range of H5 to 10. Therefore, the most suitable measuring means are used alone or in combination as necessary. In order to suppress nonspecific adsorption of a labeling agent such as an intercalating agent, a luminescent substance, an electrochemical substance, a luminescent substance, or a fluorescent substance, the first nucleic acid is immobilized after or during immobilization of the first nucleic acid. It is desirable to coat the surface of the region to be covered with some substance. The substance is not particularly limited, but when the sensor is made of gold,
More preferably, it is a thiol compound. As the thiol compound, a thiolated nucleic acid can be used.
Thiolated nucleic acids include nucleotides, deoxynucleotides, nucleosides, deoxynucleosides, adenine, thymine, hypoxanthine, xanthine, cytosine, guanine, uracil, inosine, adenosine, thymidine, guanosine, cytidine, uridine and ribothymidine or oligomers thereof. Can be mentioned. Further, thiol compounds such as dithiothreitol, dithiobisbenzenebenzoic acid and alkanethiol mercaptoethanol can also be used. First with the substance
When the surface of the region for immobilizing the nucleic acid is coated, non-specific adsorption of the labeling agent to the region is suppressed, and the S / N is improved. When the applying means is operated and the generated signal is measured by the measuring means, the electrode after hybridization is preferably washed with a hybridization solution, sterilized water or the like for the purpose of reducing the background.
【００３２】さらに、本願第３の発明に係る検出装置
は、第１の核酸を、第２の核酸の検出に必要な最小の面
積を有する領域内に固定化した電極と、前記電極に固定
化された第１の核酸と前記第２の核酸とを共存させ、設
定した条件下でハイブリダイゼーションを実行する反応
部と、前記電極に固定化された第１の核酸に電圧を印加
する印加手段と、前記印加手段の動作によって生じた信
号を測定する測定手段とを具備したことを特徴としてい
る。Further, the detection device according to the third invention of the present application comprises an electrode in which the first nucleic acid is immobilized in a region having a minimum area required for detecting the second nucleic acid, and an electrode in which the first nucleic acid is immobilized on the electrode. A reaction unit that causes the first nucleic acid and the second nucleic acid to coexist and performs hybridization under set conditions; and an application unit that applies a voltage to the first nucleic acid immobilized on the electrode. And measuring means for measuring a signal generated by the operation of the applying means.
【００３３】本願第３の発明における検出装置によれ
ば、第２の核酸の検出に必要な最小の面積を有する領域
内に定量的に固定化した第１の核酸と第２の核酸とを反
応部でハイブリダイゼーションさせ、第１の核酸に電圧
を印加して生じた信号を測定することにより、該信号の
測定量と第２の核酸の量とを一義的に対応させるととも
にバックグラウンドを低減することができるので、再現
性および定量性に優れるとともに高い感度で第２の核酸
を検出することが可能となる。また、検出に要する時間
の短縮と操作性の向上が達成されるので、第２の核酸を
経済的に検出することが可能となる。According to the detection device of the third aspect of the present invention, the first nucleic acid and the second nucleic acid which are quantitatively immobilized in the region having the minimum area required for the detection of the second nucleic acid are reacted. The hybridization is performed in the section, and a signal generated by applying a voltage to the first nucleic acid is measured, so that the measured amount of the signal and the amount of the second nucleic acid uniquely correspond to each other, and the background is reduced. Therefore, the second nucleic acid can be detected with high sensitivity and excellent reproducibility and quantification. In addition, since the time required for detection is reduced and the operability is improved, the second nucleic acid can be economically detected.
【００３４】上述したように、現在、Ｃ型肝炎ウイルス
の検査では、治療の指標に最低でも１０5 copy／mLの感
度が要求されている。また、ＨＩＶやＨＢＶ等の検査あ
るいは細菌感染症、癌遺伝子等の検出でも同等あるいは
それ以上の高い検出感度が求められている。一般に、核
酸の検出をハイブリッド形成を行って実行する検出装置
では、挿入剤、光学的および電気化学的に活性な標識物
質等が電極の表面で直接反応してしまったり、挿入剤や
光学的、電気化学的に活性な標識物質等が電極に固定化
された核酸（プローブ）に結合してしまうことで、バッ
クグランドが大きくなってしまう。したがって、非特異
的な信号（バックグランド）により核酸の検出感度を低
下させる原因となっている。核酸の検出感度を向上させ
るためには、非特異的な信号（バックグランド）を低減
させ、ハイブリッドの形成に由来する特異的な信号のみ
を測定することが重要である。すなわち、電極上で形成
したハイブリッドに由来する特異的な信号だけを確実に
検出できれば、核酸の検出に関して高感度化が期待でき
る。上述した非特異的な信号を低減するためには、挿入
剤、光学的および電気化学的に活性な標識物質等が電極
の表面で直接反応してしまったり、挿入剤や光学的、電
気化学的に活性な標識物質等が電極に固定化された核酸
（プローブ）に結合することを抑制すればよい。そし
て、該抑制を達成するためには、核酸を固定化する領域
の面積を小さくすることが有効になる。すなわち、核酸
を固定化する領域の面積を小さくすることで、挿入剤、
光学的および電気化学的に活性な標識物質等が電極の表
面、特に、核酸を固定化する領域に非特異的に結合する
量を減少させるとともに、電極に固定化される核酸の量
も減少することから、結果として、核酸に非特異的に結
合する挿入剤、光学的および電気化学的に活性な標識物
質等の量も減少することになる。したがって、核酸を固
定化する領域の面積を小さくするだけで、挿入剤等に由
来する非特異的な信号を抑制できることになる。ここ
で、基礎的解析より、電気化学的な反応を用いた核酸の
検出方法における検出感度と核酸を固定化する領域の面
積との関係は、式（１）で示されることが判明した。As described above, in the examination for hepatitis C virus, a sensitivity of at least 10 5 copy / mL is currently required as a therapeutic index. In addition, high detection sensitivity equivalent to or higher than that is required for tests such as HIV and HBV and detection of bacterial infectious diseases, cancer genes and the like. In general, in a detection device that performs nucleic acid detection by performing hybridization, an intercalating agent, an optically and electrochemically active labeling substance or the like directly reacts on the surface of the electrode, or the intercalating agent, optically, An electrochemically active label or the like binds to the nucleic acid (probe) immobilized on the electrode, thereby increasing the background. Therefore, the non-specific signal (background) causes a decrease in nucleic acid detection sensitivity. In order to improve the nucleic acid detection sensitivity, it is important to reduce nonspecific signals (background) and measure only specific signals derived from hybrid formation. That is, if only a specific signal derived from the hybrid formed on the electrode can be detected with certainty, higher sensitivity can be expected with respect to nucleic acid detection. In order to reduce the non-specific signals described above, an intercalating agent, an optically and electrochemically active labeling substance, etc. may react directly on the surface of the electrode, or the intercalating agent, optically or electrochemically The binding of a highly active labeling substance or the like to the nucleic acid (probe) immobilized on the electrode may be suppressed. In order to achieve the suppression, it is effective to reduce the area of the region where the nucleic acid is immobilized. That is, by reducing the area of the region for immobilizing nucleic acids,
The amount of optically and electrochemically active labeling substances, etc., which non-specifically binds to the surface of the electrode, particularly to the region where nucleic acid is immobilized, is reduced, and the amount of nucleic acid immobilized on the electrode is also reduced. As a result, the amount of an intercalating agent, a labeling substance that is optically and electrochemically active, and the like that nonspecifically binds to a nucleic acid also decreases. Therefore, only by reducing the area of the region where the nucleic acid is immobilized, non-specific signals derived from the intercalating agent or the like can be suppressed. Here, from the basic analysis, it was found that the relationship between the detection sensitivity in the method for detecting a nucleic acid using an electrochemical reaction and the area of the region where the nucleic acid is immobilized is represented by Formula (1).
【００３５】ｙ＝０．７２ｘ＋８．０……（１） ここで、ｙは核酸を固定化する領域の面積（ｃｍ2 ）の
対数、ｘは検出感度（copy／mL）の対数である。Y = 0.72x + 8.0 (1) where y is the logarithm of the area (cm 2 ) of the region where the nucleic acid is immobilized, and x is the logarithm of the detection sensitivity (copy / mL).
【００３６】よって、式（１）より、例えば、１０5 co
py／mL以下の核酸の検出を達成するためには、電極に核
酸を固定化する領域の面積を７×１０-4ｃｍ2 以下にす
る必要がある。このように、式（１）より、第２の核酸
の検出限界を設定することにより、第１の核酸を固定化
するに必要な最小の面積を算出することができる。とこ
ろで、上述したような微小な領域を均一に作製する手段
として、フォトリソグラフィーが利用できる。式（１）
から明らかなように、検出感度を向上させるためには、
第１の核酸を固定化する領域の面積を更に微小にする必
要がある。しかしながら、フォトリソグラフィーを用い
ても、１０-8ｃｍ2 以下の領域を再現性よく作製するこ
とは困難であり、場合によっては再現性が低下すること
もある。したがって、第１の核酸を固定化する領域の面
積は１０-8ｃｍ2 以上であることが望ましい。ここで、
第１の核酸を固定化する領域の面積を小さくすると、電
極に固定化される核酸（プローブ）の量が減るので、ハ
イブリダイゼーションに要する反応時間が短い場合には
特異的なハイブリッドの形成が少なくなり、得られる信
号の絶対量も減少する可能性がある。この場合には、ハ
イブリダイゼーションを行う時間を長くすることで信号
の絶対量を確保することができる。Therefore, from equation (1), for example, 10 5 co
In order to achieve detection of a nucleic acid of py / mL or less, the area of the region where the nucleic acid is immobilized on the electrode needs to be 7 × 10 −4 cm 2 or less. As described above, by setting the detection limit of the second nucleic acid from Expression (1), the minimum area required for immobilizing the first nucleic acid can be calculated. By the way, photolithography can be used as a means for uniformly forming the above-described minute region. Equation (1)
As is clear from, in order to improve the detection sensitivity,
It is necessary to further reduce the area of the region for immobilizing the first nucleic acid. However, even if photolithography is used, it is difficult to produce a region of 10 −8 cm 2 or less with high reproducibility, and in some cases, reproducibility may decrease. Therefore, the area of the region for immobilizing the first nucleic acid is desirably 10 −8 cm 2 or more. here,
When the area of the region where the first nucleic acid is immobilized is reduced, the amount of the nucleic acid (probe) immobilized on the electrode is reduced. Therefore, when the reaction time required for hybridization is short, formation of a specific hybrid is small. And the absolute amount of the resulting signal may also be reduced. In this case, by increasing the time for performing the hybridization, the absolute amount of the signal can be secured.
【００３７】本願第３の発明に係る検出装置において、
電極は、第１の核酸を固定化する領域の面積が、第２の
核酸の検出限界に対応して求められた面積を有してさえ
いれば特に限定はされず、例えば、本願第１の発明に係
る電極の構成をとることが可能である。また、反応部、
印加手段および測定手段については、上述した本願第２
の発明に係る検出装置と同様の構成および手法をとるこ
とができる。In the detection device according to the third invention of the present application,
The electrode is not particularly limited as long as the area of the region for immobilizing the first nucleic acid has the area determined in accordance with the detection limit of the second nucleic acid. It is possible to take the configuration of the electrode according to the invention. Also, the reaction section,
The application means and the measurement means are described in
The same configuration and method as those of the detection device according to the invention can be adopted.
【００３８】また、本願第４の発明に係る検出装置は、
第１の核酸を固定化した第１の電極と、第２の核酸を固
定化するとともに、前記第１および前記第２の核酸に対
して第３の核酸がハイブリッドを形成できるように配置
された第２の電極と、前記第１および前記第２の電極に
接続された電源と、前記電源の動作によって生じた信号
を測定する測定手段とを具備したことを特徴としてい
る。Further, the detection device according to the fourth invention of the present application,
A first electrode on which a first nucleic acid is immobilized, and a second nucleic acid are immobilized, and a third nucleic acid is arranged so as to form a hybrid with the first and second nucleic acids. It is characterized by comprising a second electrode, a power supply connected to the first and second electrodes, and measuring means for measuring a signal generated by the operation of the power supply.
【００３９】本願第４の発明における検出装置によれ
ば、第１および第２の核酸を固定化した第１および第２
の電極を該第１および前記第２の核酸に対して第３の核
酸がハイブリッドを形成できるように配置し、第１およ
び第２の電極に接続された電源より電圧を印加して生じ
た信号を測定することにより、第３の核酸に由来する信
号をバックグラウンドを低減しつつ確実に得ることがで
きるので、再現性および定量性に優れるとともに高い感
度で第３の核酸を検出することが可能となる。また、検
出に要する時間の短縮と操作性の向上が達成されるの
で、第３の核酸を経済的に検出することが可能となる。According to the detection device of the fourth aspect of the present invention, the first and second nucleic acids having the first and second nucleic acids immobilized thereon are immobilized.
Are arranged such that a third nucleic acid can form a hybrid with the first and second nucleic acids, and a signal generated by applying a voltage from a power supply connected to the first and second electrodes By measuring, the signal derived from the third nucleic acid can be reliably obtained while reducing the background, so that it is possible to detect the third nucleic acid with high sensitivity and excellent reproducibility. Becomes Further, since the time required for the detection is reduced and the operability is improved, the third nucleic acid can be economically detected.
【００４０】本願第４の発明における検出装置は、核酸
を導電体とみなし、核酸に電圧をかけることにより生じ
る電流あるいは光子の放出（発光）を検出して第３の核
酸を検出しようとしたものである。すなわち、第３の核
酸が第１および第２の核酸とハイブリッドを形成する
と、ハイブリッドの形成部を通じて回路が構成される。
ここに、第１および第２の電極に接続された電源より電
圧を印加すると、第３の核酸を通じて電流が流れる。そ
こで、電流値、電気伝導度、電位、抵抗値、電気容量、
インダクタンスおよびインピーダンス等の電気的な信号
を検出すれば、第３の核酸に由来する信号のみを検出し
たことになる。また、第３の核酸を通じて電流が流れる
と、ハイブリッドを形成した第１、第２および第３の核
酸より光子が放出され核酸が発光する。そこで、発光強
度を測定すれば、第３の核酸に由来する信号を検出した
ことになる。したがって、電気的あるいは光学的な信号
を測定することにより、再現性および定量性に優れると
ともに高い感度で第３の核酸を検出することが可能とな
る。The detection device according to the fourth aspect of the present invention is intended to detect a nucleic acid as a conductor, and to detect a current or a photon emission (emission) caused by applying a voltage to the nucleic acid to detect a third nucleic acid. It is. That is, when the third nucleic acid forms a hybrid with the first and second nucleic acids, a circuit is formed through the hybrid forming portion.
When a voltage is applied from a power supply connected to the first and second electrodes, a current flows through the third nucleic acid. Therefore, the current value, electric conductivity, potential, resistance value, electric capacity,
If electrical signals such as inductance and impedance are detected, only signals derived from the third nucleic acid are detected. When an electric current flows through the third nucleic acid, photons are emitted from the first, second, and third nucleic acids that have formed a hybrid, and the nucleic acid emits light. Therefore, if the luminescence intensity is measured, it means that a signal derived from the third nucleic acid has been detected. Therefore, by measuring the electrical or optical signal, it becomes possible to detect the third nucleic acid with high sensitivity and excellent reproducibility and quantification.
【００４１】本願第４の発明に係る検出装置において、
第１および第２の電極は、第１および第２の核酸を固定
化されたものであれば限定されるものではないが、核酸
の検出に際し再現性および定量性を向上させる目的か
ら、本願第１の発明による電極や本願第２の発明に適用
した電極を好適に用いることができる。さらに、バック
グラウンドの発生を防止する観点から、本願第３の発明
に適用した電極を好適に用いることができる。第１およ
び第２の電極に固定化する第１および第２の核酸の配列
は、各々１種類の塩基配列を示すものでもよいし、複数
種類の塩基配列からなるものでもよい。また、一般的に
は、第１および第２の核酸の配列は異なるように選択す
るが、第１および第２の核酸の配列を同じにしてもよ
い。第１および第２の電極の位置関係は、第３の核酸と
ハイブリッドを形成可能な位置に配置されていれば限定
されないが、安定したハイブリッドの形成を促すために
対向して配置することが望ましい。第１および第２の電
極を対向して配置した場合、第１および第２の電極の間
隔は第３の核酸の長さに依存して決定される。すなわ
ち、第３の核酸は、第１および第２の核酸の双方と端部
（５´端および３´端）の領域でハイブリッドを形成す
るので、第１、第２および第３の核酸の長さをＡ、Ｂお
よびＣとすれば、第１および第２の電極の間隔Ｌは、Ｃ
＋２α≦Ｌ＜Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋２α（αは第１および第２の
核酸に導入されたチオール基等による余剰の長さ）の範
囲となるように設定される。しかしながら、第１および
第２の核酸に第３の核酸が安定して結合するためには、
第１および第２の核酸と第３の核酸とが５〜３０塩基程
度に渡ってハイブリッドを形成する必要があり、また、
第１および第２の核酸においてハイブリッドを形成する
領域が３０塩基を越えると非特異的なハイブリッドの形
成を引き起こす可能性が高くなることから、第１および
第２の電極の間隔ＬはＬ＝Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋２α−（１０塩
基〜６０塩基の長さ）の範囲で調整されることが望まし
い。具体的には、第１および第２の電極の間隔Ｌは１０
nm〜１mm、好ましくは、５０nm〜１μm 程度に設定され
る。また、第１および第２の核酸と第３の核酸とがハイ
ブリッドを形成するように第１および第２の電極を配置
するためには、例えば、第１および第２の電極をキャピ
ラリーの内部にフォトリソグラフィーを用いて作り込む
ようにするとよい。このような構成によれば、第１およ
び第２の電極を配置したキャピラリーの内部でハイブリ
ダイゼーションを行うことができ、ハイブリダイゼーシ
ョン後における第１および第２の電極の洗浄や、第１お
よび第２の電極に接続された電源より電圧を印加して生
じた信号の測定も容易に行うことができる。さらに、前
記第１および前記第２の電極に接続された電源として
は、第１および第２の核酸とハイブリッドの形成が行わ
れた第３の核酸に電圧を印加できるものであれば特に限
定はされない。また、電源の動作によって生じた信号を
測定する測定手段としては、上述した本願第２および第
３の発明に係る検出装置と同様の構成および手法をとる
ことができる。In the detection device according to the fourth invention of the present application,
The first and second electrodes are not limited as long as the first and second nucleic acids are immobilized thereon. However, in order to improve reproducibility and quantification in nucleic acid detection, the first and second electrodes are not limited to the first and second electrodes. The electrode according to the first invention and the electrode applied to the second invention of the present application can be suitably used. Further, from the viewpoint of preventing the generation of the background, the electrode applied to the third invention of the present application can be preferably used. The sequences of the first and second nucleic acids to be immobilized on the first and second electrodes may each indicate one type of base sequence, or may include a plurality of types of base sequences. Also, generally, the sequences of the first and second nucleic acids are selected to be different, but the sequences of the first and second nucleic acids may be the same. The positional relationship between the first and second electrodes is not limited as long as they are arranged at a position where a hybrid can be formed with the third nucleic acid. However, it is preferable that the first and second electrodes are arranged to face each other to promote stable hybrid formation. . When the first and second electrodes are arranged facing each other, the distance between the first and second electrodes is determined depending on the length of the third nucleic acid. That is, since the third nucleic acid forms a hybrid with both the first and second nucleic acids at the end region (5 ′ end and 3 ′ end), the length of the first, second and third nucleic acids is reduced Let A, B and C be the distances between the first and second electrodes, C
+ 2α ≦ L <A + B + C + 2α (α is a surplus length due to the thiol group introduced into the first and second nucleic acids). However, in order for the third nucleic acid to stably bind to the first and second nucleic acids,
The first and second nucleic acids and the third nucleic acid need to form a hybrid over about 5 to 30 bases, and
When the region forming a hybrid in the first and second nucleic acids exceeds 30 bases, the possibility of causing nonspecific hybrid formation is increased. Therefore, the interval L between the first and second electrodes is L = A + B + C + 2α. It is desirable to adjust within the range of-(10 bases to 60 bases in length). Specifically, the interval L between the first and second electrodes is 10
nm to 1 mm, preferably about 50 nm to 1 μm. Further, in order to arrange the first and second electrodes so that the first and second nucleic acids and the third nucleic acid form a hybrid, for example, the first and second electrodes are placed inside the capillary. It is good to make it using photolithography. According to such a configuration, hybridization can be performed inside the capillary in which the first and second electrodes are arranged, and the first and second electrodes can be washed after hybridization, and the first and second electrodes can be washed. It is also possible to easily measure a signal generated by applying a voltage from a power supply connected to the electrode. Furthermore, the power source connected to the first and second electrodes is not particularly limited as long as it can apply a voltage to the third nucleic acid that has been hybridized with the first and second nucleic acids. Not done. The measuring means for measuring the signal generated by the operation of the power supply may have the same configuration and technique as those of the detecting devices according to the second and third aspects of the present invention.
【００４２】さらに、本願第５の発明に係るセンサは、
第１の核酸を固定化した第１の電極と、第２の核酸を固
定化するとともに、前記第１および前記第２の核酸に対
して第３の核酸がハイブリッドを形成できるように配置
された第２の電極とを具備したことを特徴としている。Further, the sensor according to the fifth invention of the present application is:
A first electrode on which a first nucleic acid is immobilized, and a second nucleic acid are immobilized, and a third nucleic acid is arranged so as to form a hybrid with the first and second nucleic acids. And a second electrode.
【００４３】本願第５の発明におけるセンサによれば、
第１および第２の核酸を固定化した第１および第２の電
極を、第１および第２の核酸に対して第３の核酸がハイ
ブリッドを形成できるように配置したことにより、第１
および第２の核酸に対して第３の核酸が安定したハイブ
リッドを容易に形成することが可能となる。According to the sensor of the fifth aspect of the present invention,
By arranging the first and second electrodes on which the first and second nucleic acids are immobilized so that the third nucleic acid can form a hybrid with the first and second nucleic acids,
In addition, the third nucleic acid can easily form a stable hybrid with the second nucleic acid.
【００４４】本願第５の発明におけるセンサにおいて、
第１および第２の電極は、第１および第２の核酸を固定
化されたものであれば限定されるものではないが、核酸
の検出に際し再現性および定量性を向上させる目的か
ら、本願第１の発明による電極を好適に用いることがで
きる。さらに、バックグラウンドの発生を防止する観点
から、本願第３の発明に適用した電極を好適に用いるこ
とができる。また、第１および第２の電極の位置関係
は、第１および第２の核酸に対し第３の核酸がハイブリ
ッドを形成可能な位置に配置されていれば限定されない
が、例えば、本願第４の発明に係る検出装置と同様の構
成および手法をとることができる。In the sensor according to the fifth invention of the present application,
The first and second electrodes are not limited as long as the first and second nucleic acids are immobilized thereon. However, in order to improve reproducibility and quantification in nucleic acid detection, the first and second electrodes are not limited to the first and second electrodes. The electrode according to the first aspect can be suitably used. Further, from the viewpoint of preventing the generation of the background, the electrode applied to the third invention of the present application can be preferably used. Further, the positional relationship between the first and second electrodes is not limited as long as the third nucleic acid is arranged at a position where a hybrid can be formed with respect to the first and second nucleic acids. The same configuration and method as the detection device according to the invention can be adopted.
【００４５】次に、検出の対象となる核酸の調整方法に
ついて説明する。Next, a method for preparing a nucleic acid to be detected will be described.
【００４６】一般に、核酸の調整に際しては、全血、血
清、白血球、細胞、組織、喀痰、尿、***、唾液、種々
の食品群、土壌、河川の水や海水等を試料として用いて
いる。そして、いずれの場合でも、微量の核酸を効率よ
く抽出しなければならない。例えば、Ｃ型肝炎の検査等
では血清１mL中に含まれる数個から数十個のウイルスの
核酸を抽出しなければならない。また、病原性大腸菌Ｏ
−１５７は数百個の細菌の存在で感染するので、食品等
に付着した、わずかな細菌に由来する核酸を抽出しなけ
ればならない。通常、微量の核酸を抽出するためには、
抽出効率をあげるため、キャリアとしてダミーの核酸、
例えば、サケ***ＤＮＡや牛胸腺ＤＮＡ等を添加する。
しかしながら、該ＤＮＡの塩基配列は完全には知られて
いないため、本願発明において検出の対象となる核酸と
同じまたは類似の配列が含まれている可能性がある。キ
ャリア核酸が導電体や電極に固定化された核酸（プロー
ブ）と類似の配列を持つ場合には、検出対象となる核酸
ではなく、添加したキャリア核酸が導電体や電極に固定
化された核酸（プローブ）と反応してしまうことにな
る。したがって、実際には検出対象となる核酸が存在し
ない場合（陰性）であっても、誤って、検出対象となる
核酸が存在する（陽性）との判定（偽陽性）を下してし
まう。極めて低濃度に存在する核酸の検出が求められて
いる現在、上記偽陽性の発生は大きな問題となる。ま
た、核酸間でのハイブリッドの形成により核酸の検出を
する際には、検出対象となる核酸自身のセルフハイブリ
ダイゼーションによって、導電体や電極に固定化された
核酸（プローブ）と検出対象となる核酸との反応が阻害
されることが問題となる。すなわち、一部のウイルスを
除いて核酸は互いに相補的に結合した二本鎖のＤＮＡで
あるため、一度、熱またはアルカリにより一本鎖に解離
させても、検出対象となる核酸はハイブリダイゼーショ
ンの際にプローブではなく、元の二本鎖のＤＮＡに復元
してしまうのである。この反応は、検出対象となる核酸
の量が比較的多い場合に起こりやすく、高濃度側の検出
範囲を狭め定量性を低下させる要因となる。そこで、試
料より核酸を抽出する際に、キャリア核酸として、既知
の塩基配列からなる核酸、例えば、polyＡ、polyＴ等の
合成したホモオリゴヌクレオチド、poly（ＡＴ）等をは
じめとする合成したヘテロオリゴヌクレオチド、アデニ
ン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシ
ン（Ｃ）がランダムに配列したオリゴヌクレオチド、一
般に使用されているプラスミドやプラスミドの分解物等
の核酸を０．１ ng/ml〜１００ ng/ml程度となるように
添加して核酸の抽出を行うと、微量の核酸であっても効
率よく試料より抽出することができる。ただし、上記方
法にしたがって抽出した核酸を用いてハイブルダイゼー
ションを行う場合には、試料より核酸を抽出する際に添
加する核酸の配列が、検出の際に使用する核酸（プロー
ブ）の配列と相補的でないことを確認しておかなければ
ならない。また、添加するキャリア核酸は一種類に限定
されるわけではなく、一つの試料に複数種類のキャリア
核酸を添加することができる。また、キャリア核酸の分
子量も特に限定されるものではないが数塩基から数千塩
基程度の範囲が好ましい。試料より核酸を抽出する方法
は特に限定されるものではなく、フェノール−クロロホ
ルム法等の液−液抽出法、担体を用いる固液抽出法ある
いはＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）やスマイテス卜
（住友金属社製）等の市販のキットを利用することも可
能である。In general, when preparing nucleic acids, whole blood, serum, leukocytes, cells, tissues, sputum, urine, semen, saliva, various food groups, soil, river water, seawater, and the like are used as samples. In any case, a very small amount of nucleic acid must be efficiently extracted. For example, in a test for hepatitis C or the like, several to several tens of virus nucleic acids contained in 1 mL of serum must be extracted. In addition, pathogenic E. coli O
Since -157 is infected in the presence of several hundred bacteria, nucleic acids derived from a small number of bacteria attached to food or the like must be extracted. Usually, to extract trace amounts of nucleic acids,
To increase extraction efficiency, dummy nucleic acids as carriers,
For example, salmon sperm DNA, bovine thymus DNA and the like are added.
However, since the base sequence of the DNA is not completely known, there is a possibility that the same or similar sequence as the nucleic acid to be detected in the present invention is contained. When the carrier nucleic acid has a sequence similar to the nucleic acid (probe) immobilized on the conductor or electrode, the added carrier nucleic acid is not the nucleic acid to be detected, but the nucleic acid immobilized on the conductor or electrode ( Probe). Therefore, even when the nucleic acid to be detected does not actually exist (negative), the determination that the nucleic acid to be detected exists (positive) is erroneously made (false positive). At present, the detection of a nucleic acid present at an extremely low concentration is required, and the occurrence of the false positive is a serious problem. When a nucleic acid is detected by forming a hybrid between nucleic acids, the nucleic acid (probe) immobilized on a conductor or an electrode and the nucleic acid to be detected are detected by self-hybridization of the nucleic acid to be detected. A problem is that the reaction with is inhibited. That is, except for some viruses, nucleic acids are double-stranded DNAs complementary to each other, so that even once dissociated into single strands by heat or alkali, the nucleic acids to be detected are not subjected to hybridization. In this case, the DNA is restored to the original double-stranded DNA instead of the probe. This reaction is likely to occur when the amount of the nucleic acid to be detected is relatively large, and becomes a factor that narrows the detection range on the high concentration side and decreases the quantitative property. Therefore, when extracting a nucleic acid from a sample, as a carrier nucleic acid, a nucleic acid having a known base sequence, for example, a synthesized homo-oligonucleotide such as polyA or polyT, or a synthesized hetero-oligonucleotide such as poly (AT) is used. Oligonucleotides in which adenine (A), thymine (T), guanine (G) and cytosine (C) are randomly arranged; When nucleic acid is extracted by adding the nucleic acid to about 100 ng / ml, even a very small amount of nucleic acid can be efficiently extracted from the sample. However, when performing hybridization using the nucleic acid extracted according to the above method, the sequence of the nucleic acid added when extracting the nucleic acid from the sample is complementary to the sequence of the nucleic acid (probe) used for detection. You have to make sure that it is not the target. Further, the carrier nucleic acid to be added is not limited to one kind, and a plurality of kinds of carrier nucleic acids can be added to one sample. Also, the molecular weight of the carrier nucleic acid is not particularly limited, but is preferably in the range of several bases to several thousands bases. The method for extracting nucleic acid from a sample is not particularly limited, and may be a liquid-liquid extraction method such as a phenol-chloroform method, a solid-liquid extraction method using a carrier, a QIAamp (QIAGEN) or a Sumitomo (Sumitomo Metals). ) Can also be used.
【００４７】抽出した核酸は、本願発明のみならず、各
種の用途に用いることができる。例えば、ＲＩや蛍光物
質で標識したプローブを用いたドットブロット法、サザ
ンブロット法、ノ一ザンブロット法およびマイクロプレ
ート法を挙げることができる。また、プローブ側を担体
に固定化するタイプの検出法に用いることもできる。な
お、本法により調整した核酸を本願発明の電極、センサ
あるいは検出装置を用いて検出する場合、検出の対象と
なる核酸は二本鎖であることが多く、この場合、検出の
対象となる核酸間でのセルフハイブリダイゼーションに
より導電体や電極上に固定化された核酸（プローブ）と
の反応が阻害されてしまう。しかし、試料より核酸を抽
出する際に添加したキャリア核酸が検出の対象となる核
酸の一部に相補的な配列または類似の配列を持てば、該
配列の領域でキャリア核酸と検出の対象となる核酸との
間でハイブリッドが形成され、検出の対象となる核酸間
でのセルフハイブリダイゼーションを抑えることができ
る。このとき、キャリア核酸と検出の対象となる核酸と
の間での反応性を考慮して、キャリア核酸は数塩基から
数十塩基程度の長さとすると効果的である。なお、キャ
リア核酸は、導電体や電極上に固定化された核酸（プロ
ーブ）と検出の対象となる核酸間でのハイブリッドの形
成を妨げることのないように選択されるのは当然であ
る。このように、キャリア核酸の塩基配列を、検出の対
象となる核酸に相補的で、導電体や電極上に固定化され
た核酸等（プローブ）とはハイブリッドを形成しない配
列に設定すれば、試料からの核酸の抽出の効率を高める
だけでなく、検出の対象となる核酸間でのハイブリッド
の形成を抑えて定量的な核酸の検出を行うことが可能と
なる。 上述した核酸の抽出方法は、電極、光ファイバ
ーおよび水晶振動子等を用いた核酸の検出に適用すると
非常に効果的である。電極、光ファイバーおよび水晶振
動子等を用いた核酸の検出の原理は、これらに固定化さ
れた核酸（プローブ）によって検出の対象となる核酸が
釣り上げられ、その後の状態変化（一本鎖から二本鎖へ
の変化および重量の変化）を直接的あるいは間接的に測
定して読み取ることである。そこで、検出の対象となる
核酸と相補的な配列（電極、光ファイバーおよび水晶振
動子等に固定化された核酸すなわちプローブとハイブリ
ッドを形成する領域の配列を除く）を持つキャリア核酸
を用いれば、釣り上ってきた検出の対象となる核酸の未
反応部分（通常は一本鎖のまま）にキャリア核酸がハイ
ブリダイズし部分的に二本鎖を形成する。その結果、電
極、光ファイバーおよび水晶振動子等上の核酸の状態を
大きく変化させることになり、検出に要する信号を増大
させる。すなわち、水晶振動子を用いた場合であれば該
水晶振動子上の重量の変化量が大きくなり、検出信号で
ある周波数減少量が増大する。また、電極を用いた場合
であれば、電極上の二本鎖ＤＮＡの増加により測定に用
いる電気化学的な信号が増大する。さらに、標識剤とし
て、核酸の二重鎖にインターカレートする挿入剤、例え
ばヘキスト３３２５８を用いる場合、本剤はＡＴ配列に
結合することが知られているため、ＡＴ−richな領域に
対してキャリア核酸の配列を設定すればヘキスト３３２
５８の結合量を増やすことができ、さらに効果的に測定
時の信号が増幅される。また、キャリア核酸として一部
あるいは全部が標識剤で標識されているものを用いれ
ば、さらに信号の増幅が期待できる。使用する標識剤
は、特に限定されるものではないが、上述した各種の標
識剤を好適に用いることができる。以上から、上述した
方法により試料から核酸を抽出することにより試料から
の核酸の抽出効率を向上させ、該抽出した試料を用いて
ハイブリダイゼーションにより対象とする核酸の存在を
検出する場合には、類似配列の存在による偽陽性を防止
するとともに対象とする核酸自身のセルフハイブリダイ
ゼーションを抑制し、測定に要する信号を増大させるこ
とが可能となる。The extracted nucleic acid can be used not only for the present invention but also for various uses. For example, a dot blot method, a Southern blot method, a Northern blot method, and a microplate method using a probe labeled with RI or a fluorescent substance can be mentioned. It can also be used for a detection method of the type in which the probe side is immobilized on a carrier. When detecting the nucleic acid prepared by this method using the electrode, sensor or detection device of the present invention, the nucleic acid to be detected is often double-stranded, and in this case, the nucleic acid to be detected is The self-hybridization between them hinders a reaction with a nucleic acid (probe) immobilized on a conductor or an electrode. However, if the carrier nucleic acid added when extracting the nucleic acid from the sample has a sequence complementary or similar to a part of the nucleic acid to be detected, the carrier nucleic acid is detected as a carrier nucleic acid in a region of the sequence. A hybrid is formed with the nucleic acid, and self-hybridization between the nucleic acids to be detected can be suppressed. At this time, in consideration of the reactivity between the carrier nucleic acid and the nucleic acid to be detected, it is effective that the carrier nucleic acid has a length of several to several tens of bases. The carrier nucleic acid is naturally selected so as not to prevent the formation of a hybrid between the nucleic acid (probe) immobilized on the conductor or the electrode and the nucleic acid to be detected. As described above, if the base sequence of the carrier nucleic acid is set to a sequence that is complementary to the nucleic acid to be detected and does not form a hybrid with a nucleic acid or the like (probe) immobilized on a conductor or an electrode, the sample In addition to increasing the efficiency of nucleic acid extraction from nucleic acids, it is possible to quantitatively detect nucleic acids by suppressing the formation of hybrids between nucleic acids to be detected. The above-described nucleic acid extraction method is very effective when applied to nucleic acid detection using an electrode, an optical fiber, a quartz oscillator, or the like. The principle of nucleic acid detection using electrodes, optical fibers, quartz oscillators, etc. is that nucleic acids (probes) immobilized on them are used to pick up nucleic acids to be detected, and subsequent state changes (from single-stranded to double-stranded) Chain changes and weight changes), directly or indirectly. Therefore, if a carrier nucleic acid having a sequence complementary to the nucleic acid to be detected (excluding the nucleic acid immobilized on an electrode, an optical fiber, a crystal oscillator, etc., ie, the sequence of a region that forms a hybrid with a probe) is used, The carrier nucleic acid hybridizes to the unreacted portion (usually single-stranded) of the nucleic acid to be detected and forms a partially double-stranded portion. As a result, the state of the nucleic acid on the electrode, the optical fiber, the quartz oscillator or the like is greatly changed, and the signal required for detection is increased. That is, when a quartz oscillator is used, the amount of change in weight on the quartz oscillator increases, and the amount of frequency reduction, which is a detection signal, increases. In the case where an electrode is used, an electrochemical signal used for measurement increases due to an increase in double-stranded DNA on the electrode. Furthermore, when an intercalating agent that intercalates into a nucleic acid duplex, such as Hoechst 33258, is used as a labeling agent, it is known that this agent binds to the AT sequence, If the sequence of the carrier nucleic acid is set, Hoechst 332 can be used.
58 can be increased, and the signal at the time of measurement is more effectively amplified. Further, when a part or all of the carrier nucleic acid is labeled with a labeling agent, further amplification of the signal can be expected. The labeling agent to be used is not particularly limited, but the various labeling agents described above can be suitably used. As described above, when nucleic acid is extracted from a sample by the above-described method to improve the extraction efficiency of the nucleic acid from the sample, and when the presence of the nucleic acid of interest is detected by hybridization using the extracted sample, It is possible to prevent false positives due to the presence of the sequence, suppress self-hybridization of the target nucleic acid itself, and increase the signal required for measurement.
【００４８】次に、本願第２〜第４の発明による検出装
置において、ハイブリダイゼーションを行う際の条件に
ついて説明する。Next, conditions for performing hybridization in the detection apparatus according to the second to fourth aspects of the present invention will be described.
【００４９】ハイブリダイゼーションは、通常、イオン
強度０．０１〜５、ｐΗ５〜１０の範囲の緩衝液中で行
う。緩衝液中にはハイブリダイゼーションの促進剤であ
る硫酸デキストラン、サケ***ＤＮＡやウシ胸腺ＤＮＡ
等のキャリア核酸、核酸の分解を防止するためにＥＤΤ
Αおよび界面活性剤等を添加することが可能である。な
お、上述したように、ハイブリダイゼーションを行う際
にキャリア核酸が混在する場合にはハイブリダイゼーシ
ョンを阻害する可能性があるのでキャリア核酸の添加に
は慎重を期し、必要に応じて既知の塩基配列からなるキ
ャリア核酸を添加するとよい。一方、試料より抽出した
核酸を９０℃以上で熱変性させ緩衝液中に混合する。な
お、試料より抽出した核酸を９０℃以上で熱変性させた
後、０℃で急冷して緩衝液中に混合することもできる。
反応中は、攪拌又は震盪等の操作を行って反応速度を高
めることも可能である。そして、１０〜９０℃の下、１
分以上１晩程度の反応時間でハイブリダイゼーションを
行う。ところで、上述したように、電極に固定された核
酸（プローブ）は、検出対象となる核酸をバックグラウ
ンドを生じることなく確実に検出するために１５塩基〜
３０００塩基程度の長さにすることが多い。そして、電
極に固定された核酸（プローブ）の塩基配列は、該核酸
（プローブ）と検出対象となる核酸とが特異的にハイブ
リッドを形成することができるよう、検出対象となる核
酸に特徴的な塩基配列と相補鎖を形成するように設計す
る。上述した反応温度は、電極に固定された核酸（プロ
ーブ）の塩基配列と検出の対象となる核酸とのホモロジ
ーによって最適値を選択するが、一般に、ハイブリダイ
ゼーションに際する適切な反応温度は、核酸が変性（融
解）する温度（Ｔｍ）より２０〜２５℃低い温度に設定
する。ここで、Ｔｍは、以下の式より算出できる。The hybridization is usually carried out in a buffer having an ionic strength of 0.01 to 5 and pΗ5 to 10. In the buffer, dextran sulfate which is a hybridization promoter, salmon sperm DNA and bovine thymus DNA
EDΤ to prevent carrier nucleic acid and nucleic acid degradation
Α and a surfactant can be added. As described above, when the carrier nucleic acid is mixed during the hybridization, the hybridization may be inhibited. It is preferable to add a carrier nucleic acid. On the other hand, the nucleic acid extracted from the sample is heat denatured at 90 ° C. or higher and mixed in a buffer. In addition, after the nucleic acid extracted from the sample is heat-denatured at 90 ° C. or higher, it can be rapidly cooled at 0 ° C. and mixed with the buffer.
During the reaction, it is also possible to increase the reaction rate by performing operations such as stirring or shaking. Then, at 10 to 90 ° C, 1
Hybridization is performed for a reaction time of about 1 minute to about 1 night. By the way, as described above, the nucleic acid (probe) immobilized on the electrode is 15 bases or more in order to reliably detect the nucleic acid to be detected without generating background.
The length is often about 3000 bases. The base sequence of the nucleic acid (probe) immobilized on the electrode is characteristic of the nucleic acid to be detected so that the nucleic acid (probe) and the nucleic acid to be detected can specifically form a hybrid. It is designed to form a complementary strand with the base sequence. The above-mentioned reaction temperature selects an optimum value according to the homology between the base sequence of the nucleic acid (probe) fixed to the electrode and the nucleic acid to be detected. Is set at a temperature 20 to 25 ° C. lower than the temperature (Tm) at which is denatured (melted). Here, Tm can be calculated from the following equation.
【００５０】Ｔｍ＝81.5＋16.6(log 10[Ci]) ＋0.41(%
G+C) −0.63(% formamide)−(600/n) −1.5(% mismuc
h) ただし、Ciは一価の陽イオンの濃度、 nはプローブの塩
基数である。Tm = 81.5 + 16.6 (log 10 [Ci]) + 0.41 (%
G + C) −0.63 (% formamide) − (600 / n) −1.5 (% mismuc
h) where Ci is the concentration of monovalent cation and n is the number of bases in the probe.
【００５１】また、簡便なＴｍの算出方法として、以下
の計算式を用いることができる。As a simple method of calculating Tm, the following formula can be used.
【００５２】Ｔｍ＝ 2℃(A+T)%＋ 4℃(G+C)%（特に、プ
ローブが18 mer以下の場合） ハイブリダイゼーションに際し、Ｔｍより２０〜２５℃
低い温度に設定した場合には、反応の平衡がほぼ二本鎖
形成側に偏っている。よって、反応時間を長くすること
で、特異的なハイブリッドの形成は経時的に多くなって
いく。また、特異的なハイブリッドの形成を、電気化学
的に促進することも可能である（特開平５−１９９８９
８）。ハイブリダイゼーションの際、核酸（プローブ）
を固定化した電極にプラス電位を印加すると、反応液中
のＤＮＡやＲＮＡは負に帯電していることから、ＤＮＡ
やＲＮＡを電極の近傍に引き寄せることができる。その
ため、電極に固定化した核酸（プローブ）の近傍におい
てＤＮＡやＲＮＡの濃度が高くなる。液相中での核酸の
検出反応は、１９６０年にMarmurらによって解析されて
おり（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,46,456,1960）、核酸の
濃度に対して２次反応であることが示されている。よっ
て、電極の近傍で核酸の濃度が高くなれば、反応速度は
速くなるわけである。すなわち、電気化学的にハイブリ
ダイゼーションを促進することができることになる。な
お、本願第４の発明に係る検出装置においては、第１の
電極にプラス電位を印加してハイブリダイゼーションを
行った後、第２の電極にプラス電位を印加してハイブリ
ダイゼーションを行うようにするとよい。なお、測定時
のバックグラウンドを低減させるため、ハイブリダイゼ
ーションを行った後、測定手段により測定を行う前に、
電極は緩衝液（例えば、ハイブリダイゼーション溶液）
や滅菌した純水等で洗浄することが望ましい。Tm = 2 ° C. (A + T)% + 4 ° C. (G + C)% (especially, when the probe is 18 mer or less).
When the temperature is set to a low temperature, the equilibrium of the reaction is almost biased toward the double strand formation side. Therefore, by increasing the reaction time, the formation of specific hybrids increases with time. It is also possible to electrochemically promote the formation of a specific hybrid (Japanese Patent Laid-Open No. 5-19989).
8). During hybridization, nucleic acids (probes)
When a positive potential is applied to the electrode on which is immobilized, DNA and RNA in the reaction solution are negatively charged.
And RNA can be attracted to the vicinity of the electrode. Therefore, the concentration of DNA or RNA increases near the nucleic acid (probe) immobilized on the electrode. The detection reaction of nucleic acids in the liquid phase was analyzed by Marmur et al. In 1960 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 46, 456, 1960) and may be a secondary reaction to nucleic acid concentration. It is shown. Therefore, the higher the concentration of nucleic acid near the electrode, the faster the reaction rate. That is, hybridization can be promoted electrochemically. In the detection device according to the fourth aspect of the present invention, the hybridization is performed by applying a positive potential to the first electrode and then performing the hybridization by applying a positive potential to the second electrode. Good. In addition, in order to reduce the background at the time of measurement, after performing hybridization, before performing measurement by the measurement means,
The electrode is a buffer (eg, hybridization solution)
It is desirable to wash with sterilized pure water or the like.
【００５３】[0053]
【発明の実施の形態】本願発明の電極およびセンサの構
成および作成法、並びに、検出装置の構成について順次
説明する。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The construction and production method of an electrode and a sensor according to the present invention and the construction of a detection device will be sequentially described.
【００５４】（電極の構成）図１および図２は、本願発
明のひとつの実施形態にかかる電極の構成を示す上面図
（図１（ａ）および図２（ａ））およびＡ−Ｂ線で切断
した場合の断面図（図１（ｂ）および図２（ｂ））であ
る。図１においては、電極の基礎をなす基板１２上に導
電体１１を形成している。そして、導電体１１および基
板１２の一部に絶縁体１４を形成させた後、フォトリソ
グラフィーにより開口して露出した導電体からなる開口
部１３を形成している。また、図２においては、電極の
基礎をなす基板１２上に、まず接着層１５を形成してい
る。そして、接着層１５の上に導電体１１を形成させた
後、フォトリソグラフィーにより開口して露出した導電
体からなる開口部１３を形成させている。さらに、図３
および図４は、本発明の別の実施態様にかかる電極で、
一度に一種類以上のプローブを使った検査または数検体
に対して一種類のプローブを使って同時に行う検査に使
用することが可能な電極である。図３および図４の電極
の基本的な構造は、図１または図２に記載の電極と同じ
であるが、開口部３１を複数有しているものである。図
３に示した電極においては同一径の開口部３１を複数形
成し、同一のサンプルが１つの開口部３１に対応するよ
うにして核酸を検出する構成であるが、図４に示した電
極は定量性を向上させる目的から、２つの径からなる開
口部３１および開口部３２を１つの組とし、同一のサン
プルが２つの開口部３１および開口部３２に対応するよ
うにして核酸を検出する構成である。なお、図４におけ
る電極においては、開口部３１および開口部３２に固定
化される核酸（プローブ）の量は当然異なるようになっ
ている。さらに、図５は、本願発明の更に別の実施態様
にかかる電極で、開口部５１にプローブを固定していな
い参照電極５２を有している、レファレンス電極一体型
の電極である。図５に示した電極の基本的な構造は図１
または図２に記載の電極と同じであるが、参照電極５２
には核酸（プローブ）を固定しておらず、図３に示した
電極と同じように開口部５１を複数個有している。な
お、上述したように、図１〜図５における開口部の表面
積は、検出限界に基づいて式（１）より設定された表面
積、例えば、１０5 copy／mL以下の核酸の検出を達成す
る場合には７×１０-4ｃｍ2 となるように調整されるこ
とはいうまでもない。また、図６は、上記電極を用いた
検出装置の一実施形態を示した図である。図６におい
て、６１はプローブとなる核酸６２を固定化した電極、
６３は反応槽であり、電源６４が電極６１および反応槽
６３を介して回路を形成するように接続されている。ま
た、回路の内部には、電流計６５、電圧計６６および可
変抵抗６７が配置されており、反応槽６３内でハイブリ
ダイゼーションを行った後に電圧を印加して回路に流れ
る電流等を測定するように構成されている。なお、反応
槽６３の内部に保持される溶液は容易に置換することが
でき、測定時には反応槽６３の内部を新鮮なハイブリダ
イゼーション溶液等で置換することが可能である。図６
における検出装置によれば、反応槽６３の内部に上述し
た緩衝液（ハイブリダイゼーション溶液）およびサンプ
ルを保持させ、サンプルと核酸６２とをハイブリダイゼ
ーションさせる。このとき、ハイブリダイゼーションの
温度および時間は上述したように設定されることが望ま
しい。次いで、好ましくは、反応槽６３および電極６１
を洗浄し、反応槽６３の内部に新鮮な溶液（例えばハイ
ブリダイゼーション溶液）を満たして電源６４を動作さ
せ、電流値あるいは電圧値等を電流計６５や電圧計６６
を用いて測定する。そして、測定結果より、サンプル中
に含まれる検出対象とした核酸の量（濃度）が算出され
る。なお、上述したように、各種の標識剤を用いて検出
感度をより向上させることが可能である。(Structure of Electrode) FIGS. 1 and 2 are top views (FIGS. 1A and 2A) showing the structure of an electrode according to an embodiment of the present invention, and FIG. It is sectional drawing (FIG.1 (b) and FIG.2 (b)) when cut. In FIG. 1, a conductor 11 is formed on a substrate 12 which forms the basis of an electrode. Then, after an insulator 14 is formed on a part of the conductor 11 and the substrate 12, an opening 13 made of a conductor which is opened and exposed by photolithography is formed. In FIG. 2, an adhesive layer 15 is first formed on a substrate 12 which forms the basis of an electrode. Then, after the conductor 11 is formed on the adhesive layer 15, an opening 13 made of a conductor that is opened and exposed by photolithography is formed. Further, FIG.
And FIG. 4 shows an electrode according to another embodiment of the present invention,
It is an electrode that can be used for an inspection using one or more types of probes at a time or an inspection for several samples simultaneously using one type of probe. The basic structure of the electrode shown in FIGS. 3 and 4 is the same as that of the electrode shown in FIG. 1 or 2, but has a plurality of openings 31. The electrode shown in FIG. 3 has a configuration in which a plurality of openings 31 having the same diameter are formed, and nucleic acids are detected so that the same sample corresponds to one opening 31. However, the electrode shown in FIG. A configuration in which the opening 31 and the opening 32 each having two diameters are combined into one set for the purpose of improving the quantification, and the nucleic acid is detected such that the same sample corresponds to the two openings 31 and 32. It is. In the electrodes shown in FIG. 4, the amounts of nucleic acids (probes) immobilized in the openings 31 and 32 are naturally different. FIG. 5 shows an electrode according to still another embodiment of the present invention, which is a reference electrode-integrated electrode having a reference electrode 52 in which a probe is not fixed to an opening 51. The basic structure of the electrode shown in FIG.
Alternatively, it is the same as the electrode shown in FIG.
Does not have a nucleic acid (probe) fixed thereto, and has a plurality of openings 51 similarly to the electrode shown in FIG. In addition, as described above, the surface area of the opening in FIGS. 1 to 5 is the surface area set by the formula (1) based on the detection limit, for example, when the detection of nucleic acid of 10 5 copy / mL or less is achieved. Needless to say, it is adjusted to be 7 × 10 −4 cm 2 . FIG. 6 is a diagram showing an embodiment of a detection device using the above-mentioned electrodes. In FIG. 6, reference numeral 61 denotes an electrode on which a nucleic acid 62 serving as a probe is immobilized;
Reference numeral 63 denotes a reaction tank, and a power supply 64 is connected to form a circuit via the electrode 61 and the reaction tank 63. In addition, an ammeter 65, a voltmeter 66, and a variable resistor 67 are arranged inside the circuit so that a voltage is applied after hybridization is performed in the reaction tank 63 to measure a current flowing through the circuit. Is configured. Note that the solution held in the reaction tank 63 can be easily replaced, and the inside of the reaction tank 63 can be replaced with a fresh hybridization solution or the like at the time of measurement. FIG.
According to the detection device described in the above, the buffer (hybridization solution) and the sample described above are held inside the reaction tank 63, and the sample and the nucleic acid 62 are hybridized. At this time, the hybridization temperature and time are desirably set as described above. Then, preferably, the reaction tank 63 and the electrode 61
Is washed, the inside of the reaction tank 63 is filled with a fresh solution (for example, a hybridization solution), the power supply 64 is operated, and the current value or voltage value is measured by an ammeter 65 or a voltmeter 66.
Measure using Then, the amount (concentration) of the nucleic acid to be detected contained in the sample is calculated from the measurement result. As described above, the detection sensitivity can be further improved by using various labeling agents.
【００５５】また、図７および図８は、上記電極を用い
て完全に自動化された検出装置の一実施態様の構成を示
す図である。FIGS. 7 and 8 are views showing the configuration of an embodiment of a detection apparatus which is completely automated using the above-mentioned electrodes.
【００５６】図７および図８において、検出装置は、上
記の電極を具備した電極ホルダーと、上記電極および試
料を反応させるための、温度可変の反応槽を具備した反
応部と、反応（ハイブリダイゼーション）後に電極を洗
浄するための、温度可変の洗浄槽を具備した第一洗浄部
と、反応（ハイブリダイゼーション）後の洗浄済み電極
を挿入剤と反応させるための、温度可変の挿入剤溶液槽
を具備した挿入剤反応部と、挿入剤による反応後に電極
を洗浄するための、温度可変洗浄槽を具備した第二洗浄
部と、挿入剤による反応後の洗浄済み電極の電気化学測
定を行うための電気化学的測定部と、前記の電気化学的
測定により得たデータを分析するための分析ユニット
と、上記の一連の反応（ハイブリダイゼーション）、洗
浄、挿入剤による反応、洗浄、電気化学的測定を制御す
るための操作ユニットと、前記の反応部、第一洗浄部、
挿入剤反応部、第二洗浄部、電気化学的測定部を隣接し
てのせた移動装置とを備えている。なお、上記検出装置
には更に、検出用の試料（検体）を搬入する搬入口と、
試料から電極と反応させるための核酸を抽出するための
試料調整ユニットと、該搬入口と該試料調製ユニットと
の間および該試料調製ユニットと前記反応部との間の、
試料の移動を行う搬送ユニットと、前記の反応（ハイブ
リダイゼーション）、洗浄、挿入剤反応時に生じる廃液
を保管する気ための廃棄物保管ユニットとを備えている
ことが好ましい。In FIG. 7 and FIG. 8, the detection device comprises an electrode holder provided with the above-mentioned electrodes, a reaction unit provided with a variable temperature reaction tank for reacting the electrodes and the sample, and a reaction (hybridization). A) a first washing section provided with a variable temperature washing tank for washing the electrode later, and a variable temperature intercalating agent solution tank for reacting the washed electrode after the reaction (hybridization) with the intercalating agent; An intercalating agent reaction unit provided, a second washing unit equipped with a variable temperature washing tank for washing the electrode after the reaction with the intercalating agent, and an electrochemical measurement of the cleaned electrode after the reaction with the intercalating agent. An electrochemical measurement unit, an analysis unit for analyzing data obtained by the above-described electrochemical measurement, and a reaction by the above-described series of reactions (hybridization), washing, and an intercalating agent. , Washed, and operating unit for controlling the electrochemical measurement, the reaction part of the first cleaning unit,
A moving device having an intercalating agent reaction section, a second cleaning section, and an electrochemical measurement section mounted adjacent to each other. The detection device further includes a loading port for loading a detection sample (sample),
A sample preparation unit for extracting nucleic acids to react with an electrode from a sample, between the carry-in port and the sample preparation unit and between the sample preparation unit and the reaction section,
It is preferable to include a transport unit for moving the sample and a waste storage unit for storing waste liquid generated during the reaction (hybridization), washing, and intercalating agent reaction.
【００５７】図７に示した、検出装置７０は、上記で説
明した電極を保持するための電極固定ホルダ７１、反応
槽７２、第１洗浄槽７３、挿入剤反応槽７４、第２洗浄
槽７５および電気化学測定槽７６、並びに前記の反応槽
７２、洗浄槽７３、挿入剤反応槽７４、洗浄槽７５およ
び電気化学測定槽７６をのせた移動装置７７、並びに分
析ユニット７８および操作ユニット７９を具備してい
る。これらの槽の間での電極の移動は、移動装置７７を
使って反応槽等を動かすことにより達成される。反応槽
７２に、予め試料から抽出しておいた核酸の溶液を入れ
ておき、電極固定ホルダ７１に固定された本願発明の電
極を反応槽７２に浸す。次いで、反応槽７２中で、核酸
の変性工程と、変性した核酸とプローブを固定化した電
極とのハイブリダイゼーションを行う工程と、洗浄工程
と、挿入剤反応工程と、洗浄工程と、電気化学工程とを
順次行う。変性工程では、試料から抽出した核酸を９０
℃以上９８℃以下、好ましくは９５℃以上９８℃以下に
加熱した後、急冷する。次のハイブリダイゼーションを
行う工程では、温度を３０℃から８０℃の間で、±０．
５℃、好ましくは±０．１℃のレベルで制御して反応を
行う。次の第一洗浄槽７３では、電極を２５℃から８０
℃の間で温度制御しながら洗浄する。この工程により、
非特異的に電極に結合した核酸等を取り除くことができ
る。次に挿入剤溶液槽７４で、洗浄済み電極を２５℃か
ら８０℃の間の温度で制御して、挿入剤と電極上に形成
された二本鎖核酸との反応を行わせる。次の第二洗浄槽
７５では、電極を２５℃から８０℃の間で温度制御しな
がら洗浄する。更に、電気化学測定槽７６で、電気的な
測定を行う。測定終了後、分析ユニット７８に予め記録
されている検量線を参考にして試料中の検出対象の核酸
（目的遺伝子等）の濃度がアウトプットされる。以上の
操作を、それぞれの槽及びユニットと電気的につながれ
た操作ユニット７９を通じて行う。また、図８に示した
検出装置８０は図７に示した検出装置に加えて、試料搬
入口８１と、試料調製ユニット８３と、該試料搬入口８
１と該試料調製ユニット８３との間、および該試料調製
ユニット８３と上記した検出装置７０との間を結ぶ試料
搬送ユニット８２、並びに廃棄物保管ユニット８７とを
備えている。この態様においては、試料を試料搬入口８
１に入れた後、試料搬送ユニット８２を通って試料調製
ユニット８３に運ばれ、該試料調製ユニット８３で核酸
の抽出が行われる。抽出された核酸は該試料搬送ユニッ
卜８２を通って上記の検出装置７０に運ばれて、上述し
たように核酸の検出が行われる。なお、廃棄物保管ユニ
ット８５に、洗浄工程等において生じた廃棄物を一時的
に保存する。The detecting device 70 shown in FIG. 7 includes an electrode fixing holder 71 for holding the electrodes described above, a reaction tank 72, a first cleaning tank 73, an intercalating agent reaction tank 74, and a second cleaning tank 75. And an electrochemical measurement tank 76, and a moving device 77 on which the above-described reaction tank 72, washing tank 73, intercalating agent reaction tank 74, washing tank 75 and electrochemical measurement tank 76 are mounted, and an analysis unit 78 and an operation unit 79. doing. The movement of the electrode between these tanks is achieved by moving the reaction tank or the like using the moving device 77. A solution of nucleic acid previously extracted from a sample is put in the reaction tank 72, and the electrode of the present invention fixed to the electrode fixing holder 71 is immersed in the reaction tank 72. Next, in the reaction tank 72, a step of denaturing the nucleic acid, a step of performing hybridization between the denatured nucleic acid and the electrode on which the probe is immobilized, a washing step, an intercalating agent reaction step, a washing step, and an electrochemical step Are sequentially performed. In the denaturation step, 90% of the nucleic acid extracted from the sample is used.
After heating to a temperature of from 98 ° C to 98 ° C, preferably from 95 ° C to 98 ° C, rapid cooling is performed. In the next step of performing hybridization, the temperature was set between 30 ° C. and 80 ° C. and ± 0.2.
The reaction is carried out at a temperature of 5 ° C., preferably at a level of ± 0.1 ° C. In the next first cleaning tank 73, the electrode is heated from 25 ° C to 80 ° C.
Wash while controlling the temperature between ° C. By this process,
Nucleic acids and the like nonspecifically bound to the electrodes can be removed. Next, in the intercalating agent solution tank 74, the washed electrode is controlled at a temperature between 25 ° C. and 80 ° C. to cause a reaction between the intercalating agent and the double-stranded nucleic acid formed on the electrode. In the next second cleaning tank 75, the electrode is cleaned while controlling the temperature between 25 ° C and 80 ° C. Further, electrical measurement is performed in the electrochemical measurement tank 76. After the measurement, the concentration of the nucleic acid (target gene or the like) to be detected in the sample is output with reference to the calibration curve recorded in advance in the analysis unit 78. The above operation is performed through the operation unit 79 which is electrically connected to each tank and unit. Further, in addition to the detection device shown in FIG. 7, the detection device 80 shown in FIG. 8 includes a sample loading port 81, a sample preparation unit 83, and the sample loading port 8
1 and a sample preparation unit 83, and a sample transport unit 82 connecting the sample preparation unit 83 and the detection device 70 described above, and a waste storage unit 87. In this embodiment, the sample is transferred to the sample loading port 8.
After the sample is placed in 1, the sample is transferred to the sample preparation unit 83 through the sample transport unit 82, and nucleic acid is extracted in the sample preparation unit 83. The extracted nucleic acid is conveyed to the detection device 70 through the sample transport unit 82, and the nucleic acid is detected as described above. The waste generated in the cleaning step or the like is temporarily stored in the waste storage unit 85.
【００５８】さらに、図９および図１０は、本願発明に
係るセンサの一実施形態を示した図である。図９および
図１０において、基板９１、基板９２、基板１０１、基
板１０２および基板１０３上に配置された導電体９３、
導電体９４、導電体１０４、導電体１０５および導電体
１０６上には各々核酸（プローブ）９５、核酸９６、核
酸１０７、核酸１０８および核酸１０９が固定化されて
いる。特に、図１０によるセンサは、一度に二種類以上
のプローブを使った検査に使用することが可能である。
図９および図１０のセンサにおける電極の基本的な構造
は、特に限定はされないが、図１〜図４に記載の電極を
好適に用いることができる。そして、図９（ｂ）および
図１０（ｂ）に示したように、検出対象となる核酸１１
０は、核酸１１０の両端部によって核酸９５と核酸９
６、核酸１０７と核酸１０８あるいは核酸１０７と核酸
１０９との間にまたがるようにハイブリッドを形成す
る。また、検出対象となる核酸１１０が核酸９５と核酸
９６、核酸１０７と核酸１０８あるいは核酸１０７と核
酸１０９との間にまたがるようにハイブリッドを形成し
た場合に、図１１に示すように、検出感度を向上させる
目的から標識剤により標識した核酸１１１を検出対象と
なる核酸１１０に結合させることもできる。また、図９
〜図１１において、電極上の核酸を固定化した領域の表
面積を、検出限界に基づいて式（１）より設定された表
面積となるように調整するとより好ましい。さらに、図
１１に示したように、基板９１と基板９２との間隙を一
定となるように確実に保持するために、基板９１と基板
９２との間にスペーサ１１２を設けることが好ましい。
該スペーサは、電極上に導電体を配置する際にフォトリ
ソグラフィーを用いて形成することができる。FIGS. 9 and 10 show an embodiment of the sensor according to the present invention. 9 and 10, a conductor 93 disposed on a substrate 91, a substrate 92, a substrate 101, a substrate 102, and a substrate 103;
Nucleic acid (probe) 95, nucleic acid 96, nucleic acid 107, nucleic acid 108 and nucleic acid 109 are immobilized on conductor 94, conductor 104, conductor 105 and conductor 106, respectively. In particular, the sensor according to FIG. 10 can be used for inspection with more than one probe at a time.
The basic structure of the electrodes in the sensors of FIGS. 9 and 10 is not particularly limited, but the electrodes shown in FIGS. 1 to 4 can be suitably used. Then, as shown in FIG. 9 (b) and FIG. 10 (b), the nucleic acid 11 to be detected is
0 is the nucleic acid 95 and the nucleic acid 9 by the both ends of the nucleic acid 110.
6. A hybrid is formed so as to extend between the nucleic acid 107 and the nucleic acid 108 or between the nucleic acid 107 and the nucleic acid 109. Further, when a nucleic acid 110 to be detected forms a hybrid so as to extend between the nucleic acid 95 and the nucleic acid 96, the nucleic acid 107 and the nucleic acid 108, or the nucleic acid 107 and the nucleic acid 109, the detection sensitivity is reduced as shown in FIG. For the purpose of improvement, the nucleic acid 111 labeled with a labeling agent can be bound to the nucleic acid 110 to be detected. FIG.
11 to 11, it is more preferable that the surface area of the region where the nucleic acid is immobilized on the electrode is adjusted based on the detection limit so as to be the surface area set by the formula (1). Further, as shown in FIG. 11, it is preferable to provide a spacer 112 between the substrate 91 and the substrate 92 in order to reliably hold the gap between the substrate 91 and the substrate 92 constant.
The spacer can be formed using photolithography when arranging a conductor on the electrode.
【００５９】また、図１２は、上記センサを用いた検出
装置の電気的構成を示した図である。図１２において、
プローブとなる核酸１２３および核酸１２４を固定化し
た電極１２１および電極１２２に対して、電源１２５が
電極１２１および電極１２２を介して回路を形成するよ
うに接続されている。また、回路の内部には、電流計１
２６、電圧計１２７および可変抵抗１２８が配置されて
おり、電極１２１および電極１２２を介してハイブリダ
イゼーションを行った後に電圧を印加して回路に流れる
電流値等を測定するように構成されている。さらに、図
１３は、上記センサを用いた本願発明の検出装置の一実
施態様を示した図である。図１３においては、電極１３
１および電極１３２は石英ガラス等からなるキャピラリ
ー１３３の内部に作り込まれており、キャピラリー１３
３の内部でハイブリダイゼーションが行われる構成にな
っている。電極１３１および電極１３２には電源１３４
が電極１３１および電極１３２を介して回路を形成する
ように接続されており、回路の内部には、電流計１３
５、電圧計１３６および可変抵抗１３７が配置されてい
る。なお、図１３における検出装置においては、サンプ
ルの溶液がキャピラリー１３３の内部を一定方向に流通
する構成となっている。そこで、図１４に示すように、
送液ポンプ１４１の動作およびサンプルの注入部１４２
からのサンプルの注入のタイミングを調整可能とし、キ
ャピラリー１３３の内部にサンプルを流通した後、サン
プルの溶液の流通を停止してハイブリダイゼーションを
行い、ハイブリダイゼーションが終了した後にキャピラ
リー１３３の内部を新鮮な溶液が流通するように構成す
ることにより、ハイブリダイゼーション後の電極および
キャピラリー１３３の内部を容易に洗浄することができ
る。したがって、測定装置１４３により、より定量性の
高い核酸の検出を行うことができる。なお、測定装置１
４３は、電気化学的な信号を測定する装置あるいは核酸
より生じる光子を検出する装置でもよく、また、これら
を組み合わせた装置でもよい。また、ハイブリダイゼー
ション時の温度を正確に制御するために、キャピラリー
１３３の周囲にサーモスタット等により制御されるヒー
タ等の加熱手段を配置することも可能である。図１５
は、上記図１３および図１４に示した構成を適用した検
出装置の一実施態様を示した図である。検出装置１５０
は、上記図９および図１０に示したセンサを保持するた
めの固定ホルダ１５１、緩衝液（ハイブリダイゼーショ
ン溶液）を保持する溶液タンク１５２およびサンプルを
保持・注入する注入部１５３を、固定ホルダ１５１を介
してハイブリダイゼーション後の溶液を保存する廃液タ
ンク１５４と接続する送液ライン１５５、センサを保持
した固定ホルダ１５１からの信号を測定する測定ユニッ
ト１５６および測定ユニット１５６より測定された結果
を外部に出力するための出力端子１５７を具備してお
り、サンプルおよび緩衝液（ハイブリダイゼーション溶
液）は送液ポンプ１５８の駆動力により送液ライン１５
５を介して移動する。溶液タンク１５２より、送液ライ
ン１５５を通じ固定ホルダ１５１に向かって緩衝液（ハ
イブリダイゼーション溶液）が送液されるが、その過程
で、注入部１５３より、予め試料から抽出しておいた核
酸の溶液が混合される。試料から抽出された核酸を混合
した緩衝液（ハイブリダイゼーション溶液）が固定ホル
ダ１５１に備えたセンサに到達すると、送液ライン１５
５を介した送液は停止され、固定ホルダ１５１中で、核
酸の変性工程と、該変性した核酸とプローブを固定化し
た電極を有するセンサとの間でハイブリダイゼーション
を行う工程とを順次行う。なお、核酸の変性工程は、核
酸が固定ホルダ１５１に到達する以前に行ってもよく、
例えば、変性した核酸を注入口１５３より注入するよう
にしてもよい。固定ホルダ１５１においてハイブリダイ
ゼーションが終了すると、送液ライン１５５を通じて固
定ホルダ１５１に向かって緩衝液（ハイブリダイゼーシ
ョン溶液）が再び送液され、固定ホルダ１５１に備えた
センサを洗浄するとともに、測定ユニット１５６による
電気化学的あるいは光学的な測定が実行される。なお、
固定ホルダ１５１に備えたセンサを洗浄する前に、挿入
剤による反応工程を実施してもよい。上述したように、
変性工程では、試料から抽出した核酸を９０℃以上９８
℃以下、好ましくは９５℃以上９８℃以下に加熱した
後、急冷する。次のハイブリダイゼーションを行う工程
では、温度を３０℃から８０℃の間で、±０．５℃、好
ましくは±０．１℃のレベルで制御して反応を行う。ま
た、固定ホルダ１５１の洗浄時には、センサを２５℃か
ら８０℃の間で温度制御しながら洗浄する。そのため、
固定ホルダ１５１の内部には、温度制御が可能な加熱手
段が設置されている。さらに、測定ユニット１５６によ
る電気的あるいは光学的な測定結果は出力端子１５７よ
り外部に出力され、予め求められている検量線を参考に
して試料中の検出対象の核酸（目的遺伝子等）の濃度が
算出される。FIG. 12 is a diagram showing an electrical configuration of a detection device using the above-mentioned sensor. In FIG.
A power supply 125 is connected to the electrodes 121 and 122 on which the nucleic acids 123 and 124 serving as probes are immobilized via the electrodes 121 and 122 to form a circuit. Also, inside the circuit, ammeter 1
26, a voltmeter 127 and a variable resistor 128 are arranged. After hybridization is performed via the electrodes 121 and 122, a voltage is applied to measure a current value or the like flowing through the circuit. FIG. 13 is a diagram showing an embodiment of the detection device of the present invention using the above-mentioned sensor. In FIG. 13, the electrode 13
1 and the electrode 132 are formed inside a capillary 133 made of quartz glass or the like.
3 is configured to perform hybridization. A power supply 134 is connected to the electrodes 131 and 132.
Are connected via an electrode 131 and an electrode 132 so as to form a circuit.
5, a voltmeter 136 and a variable resistor 137 are arranged. Note that the detection device in FIG. 13 has a configuration in which the sample solution flows inside the capillary 133 in a certain direction. Therefore, as shown in FIG.
Operation of Liquid Feed Pump 141 and Sample Injection Section 142
The timing of the injection of the sample from the sample is adjustable, and after the sample is circulated inside the capillary 133, the flow of the sample solution is stopped to perform the hybridization. After the hybridization is completed, the inside of the capillary 133 is freshened. By configuring so that the solution flows, the inside of the electrode and the capillary 133 after the hybridization can be easily washed. Accordingly, the measurement device 143 can detect nucleic acids with higher quantification. The measuring device 1
The device 43 may be a device for measuring an electrochemical signal, a device for detecting a photon generated from a nucleic acid, or a device combining these. Further, in order to accurately control the temperature at the time of hybridization, a heating means such as a heater controlled by a thermostat or the like can be arranged around the capillary 133. FIG.
FIG. 15 is a diagram showing an embodiment of a detection device to which the configuration shown in FIGS. 13 and 14 is applied. Detection device 150
The fixed holder 151 for holding the sensor shown in FIGS. 9 and 10 above, the solution tank 152 for holding a buffer solution (hybridization solution), and the injection section 153 for holding and injecting a sample A liquid sending line 155 connected to a waste liquid tank 154 for storing the solution after hybridization, a measuring unit 156 for measuring a signal from a fixed holder 151 holding a sensor, and a result measured by the measuring unit 156 to the outside. An output terminal 157 is provided for supplying a sample and a buffer (hybridization solution) to the liquid supply line 15 by the driving force of the liquid supply pump 158.
Move through 5. A buffer solution (hybridization solution) is sent from the solution tank 152 to the fixed holder 151 through the solution sending line 155. In the process, the solution of the nucleic acid previously extracted from the sample is injected from the injection unit 153. Are mixed. When the buffer (hybridization solution) containing the nucleic acid extracted from the sample reaches the sensor provided in the fixed holder 151, the liquid sending line 15
5 is stopped, and in the fixed holder 151, a step of denaturing the nucleic acid and a step of performing hybridization between the denatured nucleic acid and a sensor having an electrode on which a probe is immobilized are sequentially performed. Note that the nucleic acid denaturation step may be performed before the nucleic acid reaches the fixed holder 151,
For example, the denatured nucleic acid may be injected from the injection port 153. When the hybridization is completed in the fixed holder 151, the buffer solution (hybridization solution) is again sent to the fixed holder 151 through the liquid sending line 155, and the sensor provided in the fixed holder 151 is washed and the measurement unit 156 is used. Electrochemical or optical measurements are performed. In addition,
Before cleaning the sensor provided on the fixed holder 151, a reaction step using an intercalating agent may be performed. As mentioned above,
In the denaturation step, the nucleic acid extracted from the sample is
After heating to 95 ° C. or lower, preferably 95 ° C. or higher to 98 ° C. or lower, rapid cooling is performed. In the next hybridization step, the reaction is performed at a temperature of 30 ° C. to 80 ° C. at a level of ± 0.5 ° C., preferably ± 0.1 ° C. When the fixed holder 151 is washed, the sensor is washed while controlling the temperature between 25 ° C. and 80 ° C. for that reason,
A heating means capable of controlling the temperature is provided inside the fixed holder 151. Further, the electrical or optical measurement result by the measurement unit 156 is output to the outside from the output terminal 157, and the concentration of the nucleic acid (target gene or the like) to be detected in the sample is determined with reference to a previously determined calibration curve. Is calculated.
【００６０】（実施形態のまとめ）実施の形態に示され
た電極、センサおよび検出装置の構成、作用および効果
をまとめると次のとおりである。(Summary of Embodiment) The configurations, operations and effects of the electrodes, sensors and detection devices shown in the embodiment are summarized as follows.
【００６１】（１）実施形態に示された電極（図１〜図
５）は、基板と、該基板上に配置された導電体と、該導
電体の一部の表面を覆って形成された絶縁体と、フォト
リソグラフィーにより前記導電体が露出するように該絶
縁体に形成された開口部と、該開口部より露出した導電
体に固定された核酸（プロ−ブ）とを具備し、該核酸プ
ローブに特異的に結合する所定の配列をもった核酸がプ
ローブに結合したときに生じる電気信号や光学的な信号
等を検出できるようになっている。上記電極は、開口部
がフォトリソグラフィーによって露出されているため
に、開口部の面積が検出対象となる核酸の検出限界にあ
わせて正確に制御されていて、その結果、開口部より露
出した導電体上に固定化される核酸（プローブ）の量が
正確に制御される。さらに、実施形態に示された電極
（図２）は、基板と導電体との間に接着層を有するもの
となっている。該電極においては、電極用の材質として
は優れているが、基板との接着性が悪い導電体を使っ
て、より安定で優れた電極を作成することができる。ま
た、実施形態に示された上記電極は、絶縁体に樹脂を用
いたものとなっており、樹脂のなかでも好ましくはフォ
トポリマーまたはフォトレジストを用いたものとなって
いる。さらに好ましくは、光露光用フォトレジスト、遠
紫外用フォトレジスト、Ｘ線用フォトレジストおよび電
子線用フォトレジストの何れかを用いたものとなつてい
る。上記電極においては、リソグラフィーによるパタ−
ニング後にレジストをそのまま絶縁体として用いること
ができ、電極作成にあたっての工程を少なくすることが
可能である。また、実施形態に示されたセンサ（図９〜
図１１）は、各々核酸が固定化された２つの電極を有し
ており、該電極に固定化された核酸を介して検出対象と
なる核酸がハイブリッドを形成するので、電気的あるい
は光学的な測定により核酸を定量性が高く高感度に検出
することができる。実施形態に示された電極は、電極の
（１１１）の配向指数を、１以上３以下にしたものとな
っており、電極の中でも金を用いたものが好ましい。上
記電極においては、電極の（１１１）面が硫黄原子と相
互作用が強いために、チオール化した核酸プローブを効
率よく電極に固定化することが可能である。(1) The electrode (FIGS. 1 to 5) shown in the embodiment is formed so as to cover a substrate, a conductor disposed on the substrate, and a part of the surface of the conductor. An insulator, an opening formed in the insulator so that the conductor is exposed by photolithography, and a nucleic acid (probe) fixed to the conductor exposed from the opening. An electric signal, an optical signal, and the like generated when a nucleic acid having a predetermined sequence that specifically binds to a nucleic acid probe binds to the probe can be detected. Since the opening of the electrode is exposed by photolithography, the area of the opening is precisely controlled in accordance with the detection limit of the nucleic acid to be detected, and as a result, the conductor exposed from the opening The amount of nucleic acid (probe) immobilized thereon is precisely controlled. Further, the electrode (FIG. 2) shown in the embodiment has an adhesive layer between the substrate and the conductor. The electrode is excellent as a material for the electrode, but a more stable and excellent electrode can be formed by using a conductor having poor adhesion to the substrate. In addition, the above-described electrodes described in the embodiment use a resin for the insulator, and preferably use a photopolymer or a photoresist among the resins. More preferably, any one of a photoresist for light exposure, a photoresist for far ultraviolet, a photoresist for X-ray, and a photoresist for electron beam is used. In the electrode, a pattern formed by lithography is used.
After the polishing, the resist can be used as an insulator as it is, and the number of steps for forming the electrode can be reduced. In addition, the sensors (FIGS.
FIG. 11) has two electrodes on each of which a nucleic acid is immobilized, and a nucleic acid to be detected forms a hybrid via the nucleic acid immobilized on the electrode, so that electrical or optical By the measurement, the nucleic acid can be detected with high quantitativeness and high sensitivity. The electrode shown in the embodiment has an orientation index of (111) of the electrode of 1 or more and 3 or less, and among the electrodes, an electrode using gold is preferable. In the above electrode, since the (111) plane of the electrode has a strong interaction with a sulfur atom, the thiolated nucleic acid probe can be efficiently immobilized on the electrode.
【００６２】（２）実施形態に示された検出装置（図
６、図１３〜図１５）は、上述した電極あるいはセンサ
を用いて核酸の検出が実施される構成をとっているため
に、検出の対象となる核酸を、電気的あるいは光学的な
測定により定量性が高く高感度に検出することができ
る。また、実施形態に示された検出装置（図７）は、所
定の塩基配列を有する核酸を検出するための電極を具備
した検出装置であって、電極と試料とを反応させるため
の、温度可変の反応槽を具備した反応部と、反応（ハイ
ブリダイゼーション）後に電極を洗浄するための、温度
可変の洗浄槽を具備した第一洗浄部と、反応後の洗浄済
み電極を挿入剤と反応させるための、温度可変の挿入剤
溶液槽を具備した挿入剤反応部と、挿入剤との反応後に
電極を洗浄するための、温度可変洗浄槽を具備した第二
洗浄部と、挿入剤との反応後の洗浄済み電極の電気化学
測定を行うための電気化学的測定部と、電気化字的測定
により得たデータを分析するための分析ユニットと、前
記の一連の反応、洗浄、挿入剤反応、洗浄、電気化学的
測定を制御するための操作ユニットと、前記の遺伝子反
応部、第一洗浄部、挿入剤反応部、第二洗浄部、電気化
字的測定部を隣接してのせた移動装置とを具備したもの
となっていて、更に前記の移動装置を用いることで、該
電極上の反応、該電極の洗浄、及び該電極の電気化学的
測定を順次行って、核酸を電気的、自動的に検出するも
のとなっている。上記検出装置は、特定配列を有する核
酸（遺伝子等）の検出に関わる、電極を使った一連の反
応、洗浄等を順次行えるように、反応槽等が移動装置上
に隣接してのせられていて、また各反応等を操作、分析
するためのユニットが接続されているため、所定の塩基
配列を有する核酸の検出を電気的、自動的に行うことが
可能である。また、実施の形態に示された自動遺伝子検
出装置（図８）は、上記の装置に加えて、試料搬入口
と、試料調製ユニットと、該試料搬入口と該試料調製ユ
ニットとの間、および該試料調製ユニットと上記検出装
置との間を結ぶ試料搬送ユニット、並びに廃棄物保管ユ
ニットとを備えたものとなっている。該検出装置は、試
料から核酸を抽出する試料調整ユニットと、試料搬入か
ら遺伝子検出反応槽間での輸送にかかわる試料搬送ユニ
ットと、廃棄物保管ユニットとを備えているため、試料
からの核酸の抽出から核酸の検出反応および分析に至る
までをすべて自動的に連続して、複数の試料に由来する
核酸の解析を行うことが可能である。(2) The detection apparatus (FIGS. 6, 13 to 15) described in the embodiment has a configuration in which nucleic acid is detected using the above-described electrodes or sensors. Can be detected with high quantitativeness and high sensitivity by electrical or optical measurement. Further, the detection device (FIG. 7) shown in the embodiment is a detection device provided with an electrode for detecting a nucleic acid having a predetermined base sequence, and is a variable temperature device for reacting the electrode with a sample. And a first washing unit having a temperature-variable washing tank for washing the electrode after the reaction (hybridization), and for reacting the washed electrode after the reaction with the intercalating agent. An intercalating agent reaction section having a variable temperature intercalating agent solution tank, a second cleaning section having a variable temperature cleaning tank for washing the electrode after the reaction with the intercalating agent, and after the reaction with the intercalating agent. An electrochemical measurement unit for performing an electrochemical measurement of the cleaned electrode, an analysis unit for analyzing data obtained by the electrical measurement, and a series of the above-described reactions, cleaning, intercalating agent reaction, cleaning For controlling electrochemical measurements, Operation unit, said gene reaction unit, the first washing unit, the intercalating agent reaction unit, the second washing unit, and a moving device on which the electric character-like measuring unit is placed adjacent, further comprising By using the moving device, the reaction on the electrode, the cleaning of the electrode, and the electrochemical measurement of the electrode are sequentially performed to electrically and automatically detect the nucleic acid. In the detection device, a reaction tank and the like are placed adjacent to a moving device so that a series of reactions using electrodes, washing, and the like relating to detection of a nucleic acid (a gene or the like) having a specific sequence can be sequentially performed. In addition, since a unit for operating and analyzing each reaction and the like is connected, it is possible to electrically and automatically detect a nucleic acid having a predetermined base sequence. Further, the automatic gene detection device (FIG. 8) described in the embodiment includes, in addition to the above devices, a sample entrance, a sample preparation unit, a portion between the sample entrance and the sample preparation unit, and A sample transport unit that connects the sample preparation unit and the detection device, and a waste storage unit are provided. Since the detection device includes a sample preparation unit for extracting nucleic acids from the sample, a sample transport unit for transporting the sample between the gene detection reaction tanks, and a waste storage unit, the nucleic acid from the sample is removed. It is possible to analyze nucleic acids derived from a plurality of samples automatically and continuously from the extraction to the nucleic acid detection reaction and analysis.
【００６３】[0063]
（実施例１）本実施例では、図２に示された実施の形態
に対応する電極を製造した。Example 1 In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 2 was manufactured.
【００６４】７．６２ｃｍ（３インチ）のパイレックス
（登録商標）ガラス基板１２を硫酸・過酸化水素溶液で
洗浄した後、電子ビーム法により、まず常法によりチタ
ンを５００オングストロームの厚さとなるように蒸着
し、次いで同様に金を５０００オングストロ−ムの厚さ
となるように蒸着した。次に、光露光用フォトレジスト
ＡＺ４６２０を用いて蒸着金属のリソグラフイーを行い
導電体１１を形成した。次いで、同じフォトレジストを
塗布し、露光現像して、導電体１１を露出させる開口部
１３（面積：10-4cm2 ）を持った電極を形成した。After cleaning a Pyrex (registered trademark) glass substrate 12 of 7.62 cm (3 inches) with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, titanium is first formed to a thickness of 500 angstroms by an electron beam method by an ordinary method. Evaporation followed by a similar deposition of gold to a thickness of 5000 Angstroms. Next, lithography of the deposited metal was performed using a photoresist AZ4620 for light exposure to form a conductor 11. Next, the same photoresist was applied and exposed and developed to form an electrode having an opening 13 (area: 10 -4 cm 2 ) for exposing the conductor 11.
【００６５】次いで、この電極にΒ型肝炎ウイルス（Η
ＢＶ）の検出用の核酸（プローブ）を固定化（1012 cop
y/cm2 ）した。また、比較のために、金ワイヤーを樹脂
で抱埋し、本実施例における電極と同一の核酸（プロー
ブ）を固定化（1012 copy/cm2 ）した電極も同様に使用
した。プローブの固定および核酸の検出は、実施の形態
に示す方法により実施した。検出実験の結果、金ワイヤ
ー型の電極の場合、ばらつきは変動係数で１０〜２０％
であったが、本実施例における電極では変動係数が５％
以下であった。Next, hepatitis I virus (Η
Immobilize nucleic acid (probe) for detection of BV) (10 12 cop
y / cm 2 ). For comparison, an electrode in which a gold wire was embedded with a resin and the same nucleic acid (probe) as the electrode in this example was immobilized (10 12 copy / cm 2 ) was also used. The immobilization of the probe and the detection of the nucleic acid were performed by the method described in the embodiment. As a result of the detection experiment, in the case of the gold wire type electrode, the variation was 10 to 20% as a variation coefficient.
However, the coefficient of variation was 5% for the electrode in this example.
It was below.
【００６６】（実施例２）本実施例では、図２に示され
た実施の形態に対応する電極を作成した。Example 2 In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 2 was prepared.
【００６７】７．６２ｃｍ（３インチ）のＨＯＹＡ製Ｎ
Ａ−４０基板１２を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した
後、スパッタリングで、まず常法によりクロムを５００
オングストロームの厚さとなるように成膜し、次に、同
様にして金を５０００オングストロームの厚さとなるよ
うに成膜した。次いで、光露光用フォトレジストＡＺ４
６２０を用いてリソグラフィーを行い、接着層１５およ
び導電体１１を同時に形成した。次いで、同じフォトレ
ジストを塗布し、露光現像して、導電体１１を露出させ
る開口部１３（面積：10-4cm2 ）を持った電極を形成し
た。7.62 cm (3 inch) N made by HOYA
After washing the A-40 substrate 12 with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, chromium is first added in a usual manner by a conventional method.
A film was formed to have a thickness of Å, and then gold was similarly formed to have a thickness of 5000 Å. Next, a photoresist AZ4 for light exposure
Lithography was performed using 620 to form the adhesive layer 15 and the conductor 11 at the same time. Next, the same photoresist was applied and exposed and developed to form an electrode having an opening 13 (area: 10 -4 cm 2 ) for exposing the conductor 11.
【００６８】次いで、この電極に結核菌の検出用の核酸
（プローブ）を固定化（1012 copy/cm2 ）した。プロー
ブの固定は、実施の形態に示す方法により実施した。ま
た、比較のために、金ワイヤーを樹脂で抱埋し、本実施
例における電極と同一の核酸（プローブ）を固定化（10
12 copy/cm2 ）した電極も同様に使用した。Next, a nucleic acid (probe) for detecting Mycobacterium tuberculosis was immobilized (10 12 copy / cm 2 ) on the electrode. The probe was fixed by the method described in the embodiment mode. For comparison, a gold wire was embedded in a resin, and the same nucleic acid (probe) as the electrode in this example was immobilized (10
An electrode with 12 copy / cm 2 ) was used in the same manner.
【００６９】はじめに、キャリアより喀痰を採取し、フ
ェノール−クロロホルム法を用いて核酸の抽出を行っ
た。抽出した核酸は、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１
５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の溶液に溶
解しハイブリダイゼーションに用いた。ハイブリダイゼ
ーションの後、電極を洗浄して挿入剤ヘキスト３３２５
８の溶液に浸漬した後、電気化学的な測定を行った。検
出実験の結果、金ワイヤー型の電極の場合、ばらつきは
変動係数で１０〜２０％であったが、本実施例における
電極では変動係数が５％以下であった。First, sputum was collected from the carrier, and nucleic acid was extracted using the phenol-chloroform method. The extracted nucleic acids were 150 mM sodium chloride, 1
It was dissolved in a solution of 5 mM sodium citrate (pH 7.0) and used for hybridization. After hybridization, the electrodes are washed and the insert Hoechst 3325 is used.
After immersion in the solution of No. 8, an electrochemical measurement was performed. As a result of the detection experiment, the variation was 10 to 20% in the coefficient of variation in the case of the gold wire type electrode, but the coefficient of variation was 5% or less in the electrode in this example.
【００７０】（実施例３）本実施例では、図２に示され
た実施の形態に対応する電極を作成した。Example 3 In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 2 was prepared.
【００７１】７．６２ｃｍ（３インチ）のＳｉＯ2 （１
１１）およびＳｉＯ2 （１００）の基板１２上にスパッ
タリングで、まず常法によりチタンを５００オングスト
ロームの厚さとなるように成膜し、次いで同様にして、
金を５０００オングストロームの厚さとなるように成膜
した。そして、各々の基板上の金（１１１）の配向指数
を測定した結果、ＳｉＯ2 （１１１）上では約２、Ｓｉ
Ｏ2 （１００）上では約１であった。次に、光露光用フ
ォトレジストＡＺ４６２０を用いてリソグラフィーを行
い、接着層１５および導電体１１を同時に形成した。次
いで、同じフォトレジストを塗布し、露光現像して、導
電体１１を露出させる開口部１３（面積：10-4cm2 ）を
持った電極を形成した。Three inches of SiO 2 (1 inch)
11) and a substrate 12 of SiO 2 (100) by sputtering, first, a titanium film is formed to a thickness of 500 Å by a conventional method, and then in the same manner,
Gold was deposited to a thickness of 5000 angstroms. Then, as a result of measuring the orientation index of the gold (111) on each of the substrates, is on SiO 2 (111) about 2, Si
The value was about 1 on O 2 (100). Next, lithography was performed using the photoresist AZ4620 for light exposure, and the adhesive layer 15 and the conductor 11 were simultaneously formed. Next, the same photoresist was applied and exposed and developed to form an electrode having an opening 13 (area: 10 -4 cm 2 ) for exposing the conductor 11.
【００７２】次いで、この電極にＣ型肝炎ウイルス（Η
ＣＶ）のＲＮＡを検出するための核酸（プローブ）を固
定化（1012 copy/cm2 ）した。核酸プローブの固定は、
実施の形態に示す方法により実施した。Next, hepatitis C virus (Η
A nucleic acid (probe) for detecting RNA of CV) was immobilized (10 12 copy / cm 2 ). Immobilization of nucleic acid probe
This was performed by the method described in the embodiment mode.
【００７３】はじめに、キャリアより血清を採取し、フ
ェノール法を用いてＲＮＡの抽出を行った。抽出した核
酸（ＲＮＡ）は、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１５ｍ
Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐΗ７．０）の溶液に溶解し
ハイブリダイゼーションに用いた。ハイブリダイゼーシ
ョンの後、電極を洗浄して挿入剤ヘキスト３３２５８の
溶液に浸漬した後、電気化学的な測定を行った。検出実
験の結果、ＳｉＯ2（１１１）基板を備えた電極の変動
係数が４％であったのに対し、ＳｉＯ2 （１００）基板
を備えた電極では変動係数が８％であった。以上より、
導電体上にプローブを固定化する際には、配向性の高い
導電体を用いたほうが再現性に優れることがわかった。First, serum was collected from the carrier, and RNA was extracted using the phenol method. The extracted nucleic acid (RNA) was 150 mM sodium chloride, 15 m
M was dissolved in a solution of sodium citrate (pΗ7.0) and used for hybridization. After hybridization, the electrodes were washed and immersed in a solution of the intercalating agent Hoechst 33258, and then electrochemical measurements were performed. As a result of the detection experiment, the variation coefficient of the electrode provided with the SiO 2 (111) substrate was 4%, whereas the variation coefficient of the electrode provided with the SiO 2 (100) substrate was 8%. From the above,
It was found that when the probe was immobilized on the conductor, the use of a conductor with high orientation was more excellent in reproducibility.
【００７４】（実施例４）本実施例では、図２に示され
た実施の形態に対応する電極を作成した。Example 4 In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 2 was prepared.
【００７５】７．６２ｃｍ（３インチ）のアルミナ基板
１２を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した後、スパッタリ
ングで、まず常法によりチタンを５００オングストロー
ムの厚さとなるように成膜し、次に、同様にして金を５
０００オングストロームの厚さとなるように成膜した。
次いで、光露光用フォトレジストＡＺ４６２０を用いて
リソグラフィーを行い、接着層１５および導電体１１を
同時に形成した。次いで、同じフォトレジストを塗布
し、露光現像して、導電体１１を露出させる開口部１３
（面積：10-4cm2 ）を持った電極を形成した。After washing a 7.62 cm (3 inch) alumina substrate 12 with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, a titanium film is first formed to a thickness of 500 angstroms by a conventional method by sputtering. In the same way, 5
The film was formed to have a thickness of 000 angstroms.
Next, lithography was performed using the photoresist AZ4620 for light exposure, and the adhesive layer 15 and the conductor 11 were simultaneously formed. Then, the same photoresist is applied, exposed and developed, and the opening 13 exposing the conductor 11 is
(Area: 10 −4 cm 2 ) was formed.
【００７６】次いで、この電極にヒト免疫不全症ウイル
ス（ＨＩＶ）のｅｎｖ遺伝子に結合するＳＫ３８プロー
ブを固定化（1012 copy/cm2 ）した。プローブの固定
は、実施の形態に示す方法により実施した。また、比較
のために、金ワイヤーを樹脂で抱埋し、本実施例におけ
る電極と同一の核酸（プローブ）を固定化（1012 copy/
cm2 ）した電極も同様に使用した。Next, an SK38 probe that binds to the env gene of human immunodeficiency virus (HIV) was immobilized on this electrode (10 12 copy / cm 2 ). The probe was fixed by the method described in the embodiment mode. For comparison, a gold wire was embedded in a resin, and the same nucleic acid (probe) as the electrode in this example was immobilized (10 12 copy /
cm 2 ) was used in the same manner.
【００７７】はじめに、キャリアより血清を採取し、フ
ェノール法を用いてＨＩＶのＲＮＡの抽出を行った。抽
出した核酸（ＲＮＡ）は、１５０ｍＭの塩化ナトリウ
ム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐΗ７．０）の溶
液に溶解しハイブリダイゼーションに用いた。ハイブリ
ダイゼーションの後、電極を洗浄して挿入剤ヘキスト３
３２５８の溶液に浸漬した後、電気化学的な測定を行っ
た。検出実験の結果、金ワイヤー型の電極の場合、ばら
つきは変動係数で１０〜２０％であったが、本実施例に
おける電極では変動係数が５％以下であった。First, serum was collected from the carrier, and HIV RNA was extracted using the phenol method. The extracted nucleic acid (RNA) was dissolved in a solution of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate (pΗ7.0) and used for hybridization. After hybridization, the electrode is washed and the intercalator Hoechst 3
After immersion in the 3258 solution, electrochemical measurements were made. As a result of the detection experiment, the variation was 10 to 20% in the coefficient of variation in the case of the gold wire type electrode, but the coefficient of variation was 5% or less in the electrode in this example.
【００７８】（実施例５）本実施例では、図３に示され
た実施の形態に対応する電極を作成した。Example 5 In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 3 was prepared.
【００７９】７．６２ｃｍ（３インチ）のパイレックス
（登録商標）ガラス基板３４を硫酸・過酸化水素溶液で
洗浄した後、スパッタリングで、まず常法によりチタン
を５００オングストロームの厚さとなるように成膜し、
次いで同様にして金を５０００オングストロームの厚さ
となるように成膜した。次に、光露光用フォトレジスト
ΑＺ４６２０を用いてリソグラフィーを行い、接着層、
導電体およびリード線３３のパターンを形成した。次い
で同じフォトレジストを塗布し、露光現像して、導電体
を露出させる開口部３１（面積：10-4cm2 ）を持ったレ
ジストパターン（絶縁体）を備えた電極を形成した。こ
のリソグラフィーにより、１つの電極上に４つの開口部
３１を作成した。After cleaning a 7.62 cm (3 inch) Pyrex (registered trademark) glass substrate 34 with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, first, a titanium film is formed to a thickness of 500 angstroms by a conventional method. And
Next, similarly, gold was formed to a thickness of 5000 angstroms. Next, lithography is performed using a photoresist for light exposure # Z4620 to form an adhesive layer,
The pattern of the conductor and the lead wire 33 was formed. Next, the same photoresist was applied and exposed and developed to form an electrode having a resist pattern (insulator) having an opening 31 (area: 10 −4 cm 2 ) for exposing the conductor. By this lithography, four openings 31 were formed on one electrode.
【００８０】次いで、ＨＢＶのサブタイプである、 ad
r、 adw、 ayrおよび aywの各々にのみ相補的な２０塩
基の核酸（プローブ）を、電極上の開口部３１にひとつ
づつ（１対１に）固定化（1012 copy/cm2 ）した。プロ
ーブの固定は、実施の形態に示す方法により実施した。Next, ad which is a subtype of HBV
A 20-base nucleic acid (probe) complementary only to each of r, adw, ayr, and ayw was immobilized (10 12 copy / cm 2 ) one by one (one-to-one) in the opening 31 on the electrode. The probe was fixed by the method described in the embodiment mode.
【００８１】上記の実施例と同様にして、キャリアの血
清よりＨＢＶに由来する核酸を抽出した。抽出した核酸
を、上記プローブとハイブリッドを形成可能な領域を含
むようにΡＣＲで増幅した後に、ハイブリダイゼーショ
ンを上記と同様に行った。検出実験の結果、該キャリア
から採取した血清では、サブタイプ adrに相補的なプロ
ーブを固定化した開口部のみにおいて信号が得られた。
したがって、１つの電極を用いることで簡単にＨＢＶの
遺伝子型を決定することができた。In the same manner as in the above example, nucleic acid derived from HBV was extracted from the serum of the carrier. After the extracted nucleic acid was amplified by ΔCR so as to include a region capable of forming a hybrid with the probe, hybridization was carried out in the same manner as described above. As a result of the detection experiment, in the serum collected from the carrier, a signal was obtained only at the opening where the probe complementary to the subtype adr was immobilized.
Therefore, the genotype of HBV could be easily determined by using one electrode.
【００８２】（実施例６）本実施例では、図５に示され
た実施の形態に対応する電極を作成した。Example 6 In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 5 was prepared.
【００８３】７．６２ｃｍ（３インチ）のパイレックス
（登録商標）ガラス基板５４を硫酸・過酸化水素溶液で
洗浄した後、電子ビーム法により、まず常法によりチタ
ンを５００オングストロームの厚さとなるように蒸着
し、次いで同様に金を５０００オングストロームの厚さ
となるように蒸着した。次に、光露光用フォトレジスト
ＡＺ４６２０を用いてリソグラフィーを行い、接着層、
導電体およびリード線５５のパターンを形成した。さら
に、ＣＶＤで窒化ケイ素膜を２０００オングストローム
の厚さとなるように成膜して絶縁体５３を形成させた。
次いで同じフォトレジストを塗布し、露光現像して、導
電体を露出させる開口部４１（面積：10-4cm2 ）を持っ
たレジストパターン（絶縁体）を備えた電極を形成し
た。このリソグラフィーにより、１つの電極上に４つの
開口部５１と１つの参照電極５２とを作成した。After cleaning a 7.62 cm (3 inch) Pyrex (registered trademark) glass substrate 54 with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, titanium is first deposited to a thickness of 500 angstroms by an electron beam method by a conventional method. Evaporation followed by a similar deposition of gold to a thickness of 5000 Angstroms. Next, lithography is performed using a photoresist AZ4620 for light exposure, and an adhesive layer,
The pattern of the conductor and the lead wire 55 was formed. Further, a silicon nitride film was formed to a thickness of 2000 angstroms by CVD to form an insulator 53.
Next, the same photoresist was applied and exposed and developed to form an electrode provided with a resist pattern (insulator) having an opening 41 (area: 10 −4 cm 2 ) for exposing the conductor. By this lithography, four openings 51 and one reference electrode 52 were formed on one electrode.
【００８４】次いで、この電極の４つの開口部５１より
露出した導電体の各々に、Β型肝炎ウイルス（ΗＢＶ）
の検出用の核酸（プローブ）を固定化（1012 copy/c
m2 ）した。プローブの固定および核酸の検出は、実施
の形態に示す方法により実施した。検出実験の結果、一
度に４検体の検出が可能であり、また、すべてにおいて
変動係数が５％以下であった。Next, each of the conductors exposed through the four openings 51 of the electrode was provided with hepatitis ウ イ ル ス virus (ΗBV).
Immobilized nucleic acid (probe) for detection (10 12 copy / c
m 2 ). The immobilization of the probe and the detection of the nucleic acid were performed by the method described in the embodiment. As a result of the detection experiment, four samples could be detected at one time, and the coefficient of variation was 5% or less in all the samples.
【００８５】（実施例７）本実施例では、図３に示され
た実施の形態に対応する電極を作成した。Example 7 In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 3 was prepared.
【００８６】７．６２ｃｍ（３インチ）のパイレックス
（登録商標）ガラス基板３４を硫酸・過酸化水素溶液で
洗浄した後、銀を５０００オングストロームの厚さとな
るように成膜し、次に、ＳｉＯ2 を５０００オングスト
ロームの厚さとなるように成膜して絶縁体３２を形成さ
せ、光露光用フォトレジストＡＺＰ４６２０を用いてＳ
ｉＯ2 のリソグラフィーを行った。このリソグラフィー
により、１つの電極上に４つの開口部３１を作成した。
そして、最後に、ＡＺリムーバを用いてレジストを除去
した。After cleaning a 7.62 cm (3 inch) Pyrex (registered trademark) glass substrate 34 with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, silver was deposited to a thickness of 5000 angstroms, and then SiO 2 was deposited. Is formed to a thickness of 5000 angstroms to form an insulator 32, and a photoresist AZP4620 for light exposure is used to form S
Lithography of iO 2 was performed. By this lithography, four openings 31 were formed on one electrode.
Finally, the resist was removed using an AZ remover.
【００８７】この電極を用いて、実施例５と同様に検出
実験を行った。検出実験の結果、該キャリアから採取し
た血清では、サブタイプ adrに相補的なプローブを固定
化した開口部のみにおいて信号が得られた。したがっ
て、１つの電極を用いることで簡単にＨＢＶの遺伝子型
を決定することができた。Using this electrode, a detection experiment was performed in the same manner as in Example 5. As a result of the detection experiment, in the serum collected from the carrier, a signal was obtained only at the opening where the probe complementary to the subtype adr was immobilized. Therefore, the genotype of HBV could be easily determined by using one electrode.
【００８８】（実施例８）実施の形態に記載の検出装置
８０を用いて、血清中よりＨＣＶの検出を試みた。電極
には、ＨＣＶの非翻訳領域に相補的な５´−ＣＣＴＧＴ
ＧＡＧＧＡΑＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣ−３´をプローブ
として固定した。プローブの固定は、実施の形態に示さ
れた方法によって実施した。ハイブリダイゼーションの
温度は５３℃に設定し、洗浄、ハイブリッドを形成した
領域への挿入剤の挿入、分析工程は３７℃で制御して行
った。その結果、検出装置８０に試料をセットした後、
約１時間３０分でΗＣＶに由来する核酸の濃度を定量す
ることができた。(Example 8) Detection of HCV from serum was attempted using the detection device 80 described in the embodiment. The electrode has 5'-CCTGT complementary to the untranslated region of HCV.
GAGGAΑCTACTACTGTC-3 ′ was immobilized as a probe. The probe was fixed by the method described in the embodiment. The hybridization temperature was set to 53 ° C., and the washing, insertion of the intercalating agent into the region where the hybrid was formed, and the analysis process were performed at 37 ° C. As a result, after setting the sample in the detection device 80,
In about 1 hour 30 minutes, the concentration of the nucleic acid derived from ΔCV could be quantified.
【００８９】（実施例９）本実施例では、図２に示され
た実施の形態に対応する電極を製造した。Example 9 In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 2 was manufactured.
【００９０】７．６２ｃｍ（３インチ）のパイレックス
ガラス基板１２を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した後、
電子ビーム法により、まず常法によりチタンを５００オ
ングストロームの厚さとなるように蒸着し、次いで同様
に金を５０００オングストロ−ムの厚さとなるように蒸
着した。次に、光露光用フォトレジストＡＺ４６２０を
用いてリソグラフィーを行い、開口部１３の直径が、１
mm、０．１mmおよび０．０５mmの三種類の電極を作製し
た。After cleaning a 7.62 cm (3 inch) Pyrex glass substrate 12 with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution,
First, titanium was vapor-deposited to a thickness of 500 angstroms by a conventional method using an electron beam method, and then gold was vapor-deposited to a thickness of 5000 angstroms. Next, lithography is performed using a photoresist AZ4620 for light exposure, and the diameter of the opening 13 is 1
Three types of electrodes of mm, 0.1 mm and 0.05 mm were prepared.
【００９１】次いで、この電極にΒ型肝炎ウイルス（Η
ＢＶ）の検出用の核酸（プローブ）を実施の形態に示す
方法により固定化（順に1012 copy/cm2 、1011 copy/cm
2 および1010 copy/cm2 ）した。プローブの固定および
核酸の検出は、実施の形態に示す方法により実施した。Next, hepatitis virus (ウ イ ル ス) was applied to this electrode.
The nucleic acid (probe) for detection of BV) is immobilized by the method described in the embodiment (10 12 copy / cm 2 , 10 11 copy / cm 2 in order).
2 and 10 10 copy / cm 2 ). The immobilization of the probe and the detection of the nucleic acid were performed by the method described in the embodiment.
【００９２】はじめに、キャリアより血清を採取し、フ
ェノール−クロロホルム法を用いてΗＢＶに由来する核
酸の抽出を行った。抽出した核酸は、１５０ｍＭの塩化
ナトリウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．
０）の溶液に溶解しハイブリダイゼーションに用いた。
ハイブリダイゼーションの後、電極を洗浄して挿入剤ヘ
キスト３３２５８の溶液に浸漬した後、ヘキスト３３２
５８に由来する電気化学的な信号を測定した。なお、ハ
イブリダイゼーションの際には、電極にプラス０．５Ｖ
の電位を生じさせて、ハイブリダイゼーションの反応を
促進させた。そして、三種類の電極について検出感度を
比較したところ、表１に示す結果となり、開口部の面積
が小さい電極で感度が高くなることが分かった。First, serum was collected from the carrier, and nucleic acid derived from ΔBV was extracted using the phenol-chloroform method. The extracted nucleic acids were 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate (pH 7.
It was dissolved in the solution of 0) and used for hybridization.
After hybridization, the electrode was washed and immersed in a solution of the intercalating agent Hoechst 33258, and then Hoechst 332 was used.
The electrochemical signal from 58 was measured. In addition, at the time of hybridization, plus 0.5 V
To generate a potential to promote the hybridization reaction. Then, when the detection sensitivities of the three types of electrodes were compared, the results shown in Table 1 were obtained, and it was found that the sensitivity was increased with an electrode having a small opening area.
【００９３】[0093]
【表１】 （実施例１０）本実施例では、図２に示された実施の形
態に対応する電極を作成した。[Table 1] Example 10 In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 2 was prepared.
【００９４】７．６２ｃｍ（３インチ）のＨＯＹＡ製Ｎ
Ａ−４０基板１２を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した
後、スパッタリングで、まず常法によりクロムを５００
オングストロームの厚さとなるように成膜し、次に、同
様にして金を５０００オングストロームの厚さとなるよ
うに成膜した。次いで、光露光用フォトレジストＡＺ４
６２０を用いてリソグラフィーを行い、接着層１５およ
び導電体１１を同時に形成した。次いで、同じフォトレ
ジストを塗布し、露光現像して、導電体１１を露出させ
る開口部１３を持った電極を形成した。この際、開口部
１３の形状を円形（直径１．６mm、周囲の長さ０．５c
m、面積０．０２cm2 ）、正方形（１．５×１．５mm、
周囲の長さ０．６cm、面積０．０２２５cm2 ）とした２
種類の電極を作製した。7.62 cm (3 inch) N made by HOYA
After washing the A-40 substrate 12 with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, chromium is first added in a usual manner by a conventional method.
A film was formed to have a thickness of Å, and then gold was similarly formed to have a thickness of 5000 Å. Next, a photoresist AZ4 for light exposure
Lithography was performed using 620 to form the adhesive layer 15 and the conductor 11 at the same time. Next, the same photoresist was applied and exposed and developed to form an electrode having an opening 13 for exposing the conductor 11. At this time, the shape of the opening 13 is circular (diameter 1.6 mm, circumference length 0.5 c
m, area 0.02 cm 2 ), square (1.5 × 1.5 mm,
2 with a perimeter of 0.6 cm and an area of 0.0225 cm 2 )
Various kinds of electrodes were produced.
【００９５】次いで、これらの電極にΒ型肝炎ウイルス
（ΗＢＶ）の検出用の核酸（プローブ）を固定化（1012
copy/cm2 および1012 copy/cm2 ）した。プローブの固
定および核酸の検出は、実施の形態に示す方法により実
施した。そして、各々の電極について検出感度を比較し
た。検出実験の結果、表２に示すように、検出感度は各
電極でほぼ同じであったが、円形の開口部を備えた電極
を用いた場合ばらつきが減少することが分かった。Next, a nucleic acid (probe) for detecting hepatitis ウ イ ル ス virus (ΗBV) was immobilized on these electrodes (10 12
copy / cm 2 and 10 12 copy / cm 2 ). The immobilization of the probe and the detection of the nucleic acid were performed by the method described in the embodiment. And the detection sensitivity was compared about each electrode. As a result of the detection experiment, as shown in Table 2, the detection sensitivity was almost the same for each electrode, but it was found that the variation was reduced when an electrode having a circular opening was used.
【００９６】[0096]
【表２】 （実施例１１）本実施例では、図２に示された実施の形
態に対応する電極を作成した。[Table 2] (Example 11) In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 2 was prepared.
【００９７】７．６２ｃｍ（３インチ）のＨＯＹＡ製Ｎ
Ａ−４０基板１２を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した
後、スパッタリングで、まず常法によりチタンを５００
オングストロームの厚さとなるように成膜し、次に、同
様にして金を５０００オングストロームの厚さとなるよ
うに成膜した。次いで、光露光用フォトレジストＡＺ４
６２０を用いてリソグラフィーを行い、接着層１５およ
び導電体１１を同時に形成した。次いで、同じフォトレ
ジストを塗布し、露光現像して、導電体１１を露出させ
る開口部１３を持った電極を形成した。この際、開口部
１３の形状を円形とし、直径が１０mmおよび０．１mmの
２種類の電極を作製した。7.62 cm (3 inch) N made by HOYA
After washing the A-40 substrate 12 with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, the titanium is first sputtered with 500 μm by a conventional method.
A film was formed to have a thickness of Å, and then gold was similarly formed to have a thickness of 5000 Å. Next, a photoresist AZ4 for light exposure
Lithography was performed using 620 to form the adhesive layer 15 and the conductor 11 at the same time. Next, the same photoresist was applied and exposed and developed to form an electrode having an opening 13 for exposing the conductor 11. At this time, the shape of the opening 13 was circular, and two types of electrodes having diameters of 10 mm and 0.1 mm were produced.
【００９８】次いで、これらの電極にΒ型肝炎ウイルス
（ΗＢＶ）の検出用の核酸（プローブ）を固定化（1012
copy/cm2 および1012 copy/cm2 ）した。プローブの固
定および核酸の検出は、実施の形態に示す方法により実
施した。そして、各々の電極について検出感度および測
定に必要なサンプル量を比較した。検出実験の結果、表
３に示すように、開口部（核酸の固定化領域）の面積が
小さい電極で検出感度が高くなるとともに、より少ない
量のサンプルで測定することができた。Next, a nucleic acid (probe) for detecting hepatitis ウ イ ル ス virus (ΗBV) was immobilized on these electrodes (10 12
copy / cm 2 and 10 12 copy / cm 2 ). The immobilization of the probe and the detection of the nucleic acid were performed by the method described in the embodiment. Then, the detection sensitivity and the sample amount required for measurement were compared for each electrode. As a result of the detection experiment, as shown in Table 3, the detection sensitivity was increased with an electrode having a small area of the opening (the region where nucleic acid was immobilized), and the measurement could be performed with a smaller amount of sample.
【００９９】[0099]
【表３】 （実施例１２）本実施例では、図４に示された実施の形
態に対応する電極を作成した。[Table 3] (Example 12) In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 4 was prepared.
【０１００】７．６２ｃｍ（３インチ）のパイレックス
ガラス基板１２を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した後、
電子ビーム法により、まず常法によりチタンを５００オ
ングストロームの厚さとなるように蒸着し、次いで同様
に金を５０００オングストロ−ムの厚さとなるように蒸
着した。次に、光露光用フォトレジストＡＺ４６２０を
用いてリソグラフィーを行い、１つの電極上に面積の異
なる２つの開口部３１（直径０．５mm、面積２×１０-3
cm2 ）および開口部３２（直径０．０５mm、面積２×１
０-5cm2 ）からなる組を２組（ＡおよびＢ）作製した。After cleaning a 7.62 cm (3 inch) Pyrex glass substrate 12 with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution,
First, titanium was vapor-deposited to a thickness of 500 angstroms by a conventional method using an electron beam method, and then gold was vapor-deposited to a thickness of 5000 angstroms. Next, lithography is performed using a photoresist AZ4620 for light exposure, and two openings 31 (diameter 0.5 mm, area 2 × 10 −3) having different areas are formed on one electrode.
cm 2 ) and opening 32 (0.05 mm in diameter, area 2 × 1)
0 -5 cm 2 ) were prepared (A and B).
【０１０１】次いで、この電極にΒ型肝炎ウイルス（Η
ＢＶ）の検出用の核酸（プローブ）を実施の形態に示す
方法により固定化（開口部３１および開口部３２ともに
1012copy/cm2 ）した。プローブの固定および核酸の検
出は、実施の形態に示す方法により実施した。なお、Ａ
側にはＨＢＶのサブタイプ adrを検出するプローブを、
Ｂ側にはＨＢＶのサブタイプ ayrに相補的な２０塩基の
プローブを固定化した。 上記の実施例と同様にして、
キャリアの血清よりＨＢＶに由来する核酸を抽出した。
抽出した核酸に対し、サブタイプ間で共通のプライマー
でΡＣＲを行った後に、段階希釈してハイブリダイゼー
ションを上記と同様に行った。ハイブリダイゼーション
の後、電極を洗浄して挿入剤ヘキスト３３２５８の溶液
に浸漬した後、ヘキスト３３２５８に由来する電気化学
的な信号を測定した。検出実験の結果、 adrに相補的な
プローブを固定化した開口部からのみポジティブな信号
が得られた。したがって、サンプルに含まれたＨＢＶ
は、 adrであることが分かった。また、段階希釈したサ
ンプルを用いた検出実験では、開口部の面積の異なる電
極を用いることで、６桁のダイナミックレンジで測定が
可能であった。Next, hepatitis I virus (Η) was applied to this electrode.
The nucleic acid (probe) for detection of BV) is immobilized by the method described in the embodiment (both the opening 31 and the opening 32).
10 12 copy / cm 2 ). The immobilization of the probe and the detection of the nucleic acid were performed by the method described in the embodiment. Note that A
On the side is a probe that detects the subtype adr of HBV,
On the B side, a 20-base probe complementary to the HBV subtype ayr was immobilized. As in the above embodiment,
Nucleic acids derived from HBV were extracted from the serum of the carrier.
The extracted nucleic acid was subjected to ΔCR using a primer common to the subtypes, and then serially diluted, followed by hybridization in the same manner as described above. After hybridization, the electrodes were washed and immersed in a solution of the intercalating agent Hoechst 33258, and then the electrochemical signal derived from Hoechst 33258 was measured. As a result of the detection experiment, a positive signal was obtained only from the opening where the probe complementary to adr was immobilized. Therefore, the HBV included in the sample
Turned out to be an adr. In a detection experiment using a serially diluted sample, measurement was possible with a dynamic range of 6 digits by using electrodes having different opening areas.
【０１０２】（実施例１３）７．６２ｃｍ（３インチ）
のパイレックスガラス基板を硫酸・過酸化水素溶液で洗
浄した後、スパッタリングでチタンを５００オングスト
ロームの厚さとなるように成膜し、次いで同様に金を５
０００オングストロ−ムの厚さとなるように成膜した。
次に、光露光用フォトレジストＡＺ４６２０を用いてリ
ソグラフィーを行ない、１つの電極上に面積の異なる２
つの開口部（直径０．５mm、面積２×１０-3cm2 ；直径
０．０５mm、面積２×１０-5cm2 ）を備えた電極を作製
した。次いで、この電極の開口部より露出した導電体に
Β型肝炎ウイルス（ΗＢＶ）の検出用の核酸（プロー
ブ）を実施の形態に示す方法により固定化（２つの開口
部ともに1012 copy/cm2 ）した。(Example 13) 3 inches (7.62 cm)
After washing the Pyrex glass substrate with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, a titanium film is formed by sputtering to a thickness of 500 angstroms, and then gold is similarly coated with 5 μm.
The film was formed to have a thickness of 000 angstroms.
Next, lithography is performed using a photoresist AZ4620 for light exposure, and two areas having different areas are formed on one electrode.
An electrode having two openings (diameter 0.5 mm, area 2 × 10 −3 cm 2 ; diameter 0.05 mm, area 2 × 10 −5 cm 2 ) was prepared. Next, a nucleic acid (probe) for detecting hepatitis Β virus (ΗBV) was immobilized on the conductor exposed from the opening of the electrode by the method described in the embodiment (both openings are 10 12 copy / cm 2). )did.
【０１０３】そして、キャリアより血清を採取し、フェ
ノール−クロロホルム法を用いてΗＢＶに由来する核酸
の抽出を行った。抽出した核酸は、１５０ｍＭの塩化ナ
トリウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．
０）の溶液に溶解しハイブリダイゼーションに用いた。
ハイブリダイゼーションの後、電極を洗浄して挿入剤ヘ
キスト３３２５８の溶液に浸漬し、ヘキスト３３２５８
に由来する蛍光を測定して検出感度を比較した。その結
果、１時間程度では両者の間でＳ／Ｎ比に差は認められ
なかったが、時間の経過とともに直径０．０５mmの開口
部の領域において蛍光強度のＳ／Ｎが向上し、２４時間
後には、直径０．５mmの開口部の領域におけるＳ／Ｎの
約３倍にまで向上した。また、検出感度は直径０．５mm
の開口部の領域では５×１０6 copy/mLが限界であった
が、０．０５mmの開口部の領域ではでは１０6 copy/mL
が限界であった。以上から、光学的な信号を検出する場
合も、プローブを固定化する領域の面積が小さい方が検
出感度が高いことがわかった。（実施例１４）本実施例
では、図１１に示された実施の形態に対応する電極を備
えたセンサを作成した。Then, serum was collected from the carrier, and the nucleic acid derived from ΔBV was extracted using the phenol-chloroform method. The extracted nucleic acids were 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate (pH 7.
It was dissolved in the solution of 0) and used for hybridization.
After hybridization, the electrodes were washed and immersed in a solution of the intercalating agent Hoechst 33258, and Hoechst 33258 was used.
And the detection sensitivity was compared. As a result, no difference was observed in the S / N ratio between the two in about one hour. However, the S / N of the fluorescence intensity improved in the area of the opening having a diameter of 0.05 mm with the lapse of time, and the Later, the S / N was improved to about three times the S / N in the area of the opening having a diameter of 0.5 mm. The detection sensitivity is 0.5mm in diameter.
While in the region of the opening 5 × 10 6 copy / mL was limited, than in the region of the opening of 0.05mm 10 6 copy / mL
Was the limit. From the above, it was found that, even when detecting an optical signal, the smaller the area of the region where the probe is immobilized, the higher the detection sensitivity. (Example 14) In this example, a sensor having electrodes corresponding to the embodiment shown in FIG. 11 was prepared.
【０１０４】２×２ｃｍのパイレックスガラス基板９１
および９２を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した後、スパ
ッタリングで、該パイレックスガラス基板９１および９
２上に直径２ｍｍの金からなる電極９４および電極９３
を作製した。そして、電極９３にはＨＢＶのサブタイプ
間で共通の配列（チオール標識−ＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡ
ＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧ）からなる核酸をプローブ９５と
して固定化（1012 copy/cm2 ）し、電極９４には別の共
通配列（チオール標識−ＣＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧＣＧＣ
ＴＧＡＡＴＣ）からなる核酸をプローブ９６として固定
化（1012 copy/cm2 ）した。なお、電極９３および電極
９４において、プローブを固定化した領域の面積は10-2
cm2 である。次に、電極９３および電極９４間に厚さ２
０００オングストロームのスペーサー１１２を挟んで、
電極９３および電極９４間の距離を一定（２０００オン
グストローム）に固定した。また、プローブ９５および
プローブ９６の固定、および核酸の検出は、実施の形態
に示す方法により実施した。 はじめに、キャリアより
血清を採取し、フェノール−クロロホルム法を用いてΗ
ＢＶに由来する核酸の抽出を行った。抽出した核酸は、
１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１５ｍＭのクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７．０）の溶液に溶解してサンプルとし
た。次に、電極９３および電極９４の間に熱変性した該
サンプルを、1000μｌ/ hrの流量で流して１時間のハイ
ブリダイゼーションを行った後、電極９３および電極９
４を超純水で十分に洗浄した。次いで、電極９３および
電極９４の間を超純水で満たして電気伝導度を測定し、
ＨＢＶの検出を行った。なお、ＨＢＶの検出は、段階希
釈した複数のサンプルを用いて行った。その結果、電極
９３および電極９４の間の電気伝導度とＨＢＶのＤＮＡ
の濃度はほぼ比例関係にあることが確かめられた。した
がって、電極間の電気伝導度の測定によりＨＢＶのＤＮ
Ａの濃度を定量できることが確認された。2 × 2 cm Pyrex glass substrate 91
And 92 are washed with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, and then the Pyrex glass substrates 91 and 9 are sputtered.
Electrode 94 and electrode 93 made of gold having a diameter of 2 mm
Was prepared. The electrode 93 has a common sequence between the HBV subtypes (thiol label-ACTTCCTCTCA).
(ATTTTCTAGG) is immobilized (10 12 copy / cm 2 ) as a probe 95, and another common sequence (thiol-labeled-CGTCCCGTCGGCGC
(TGAATC) was immobilized as a probe 96 (10 12 copy / cm 2 ). In the electrodes 93 and 94, the area of the region where the probe was immobilized was 10 −2.
It is cm 2. Next, a thickness 2 between the electrode 93 and the electrode 94.
With a spacer 112 of 000 angstroms in between,
The distance between the electrode 93 and the electrode 94 was fixed (2000 Å). Further, immobilization of the probe 95 and the probe 96 and detection of the nucleic acid were performed by the method described in the embodiment. First, serum was collected from the carrier, and the phenol-chloroform method was used.
Extraction of nucleic acids derived from BV was performed. The extracted nucleic acid is
Samples were dissolved in a solution of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate (pH 7.0). Next, the sample thermally denatured between the electrode 93 and the electrode 94 is flowed at a flow rate of 1000 μl / hr to perform hybridization for 1 hour.
4 was thoroughly washed with ultrapure water. Next, the space between the electrode 93 and the electrode 94 was filled with ultrapure water to measure electric conductivity,
HBV was detected. The detection of HBV was performed using a plurality of serially diluted samples. As a result, the electric conductivity between the electrode 93 and the electrode 94 and the HBV DNA
It was confirmed that the concentrations of were almost proportional. Therefore, by measuring the electric conductivity between the electrodes, the DN of HBV is determined.
It was confirmed that the concentration of A could be quantified.
【０１０５】（実施例１５）２×４ｃｍおよび２×２ｃ
ｍのパイレックスガラス基板１０１および１０２、１０
３を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した後、スパッタリン
グで、該パイレックスガラス基板１０１、１０２および
１０３上に直径２ｍｍの金からなる電極１０４、１０５
および１０６を作製した。そして、電極１０４にはＨＢ
Ｖのサブタイプ間で共通の配列（チオール標識−ＡＣＴ
ＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧ）からなる核酸を
プローブ１０７として固定化（1012 copy/cm2 ）した。
一方、電極１０５にはＨＢＶのサブタイプ ayrに選択的
な配列（チオール標識−ＣＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧＣＧＣ
ＴＧＡＡＴＣ）を固定化（1012 copy/cm2 ）し、電極１
０６にはＨＢＶのサブタイプ adwに選択的な配列（チオ
ール標識−ＣＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴ
Ｃ）を固定化（1012 copy/cm2 ）して、図１０に示すよ
うな構成を備えたセンサを作成した。次に、電極１０４
および電極１０５、電極１０４および電極１０６間に厚
さ２０００Ａのスペーサーを挟んで、電極１０４および
電極１０５、電極１０４および電極１０６の間の距離を
一定（２０００オングストローム）に固定した。また、
プローブ９５およびプローブ９６の固定、および核酸の
検出は、実施の形態に示す方法により実施した。次に、
電極１０４および電極１０５、電極１０４および電極１
０６の間に、実施例１４と同様にして得たサンプルを熱
変性して1000μｌ/ hrの流量で流通させ、１時間のハイ
ブリダイゼーションを行った。なお、ハイブリダイゼー
ションの工程を通じ、電極１０４、電極１０５およ電極
１０６を各々３０分ずつ正に帯電させるようにした。そ
して、電極１０４、電極１０５および電極１０６を超純
水で十分に洗浄した。次いで、電極１０４および電極１
０５、電極１０４および電極１０６の間を超純水で満た
して電気伝導度を測定し、ＨＢＶの検出を行った。その
結果、電極１０４と電極１０５との間では電気伝導度が
低下したが、電極１０４と電極１０６との間では電気伝
導度に変化がなかった。よって、上記サンプルに含まれ
るＨＢＶは、 ayr型であることが確認された。Example 15 2 × 4 cm and 2 × 2c
m Pyrex glass substrates 101 and 102, 10
3 was washed with sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, and then, by sputtering, electrodes 104 and 105 made of gold having a diameter of 2 mm were formed on the Pyrex glass substrates 101, 102 and 103.
And 106 were produced. The electrode 104 has HB
V common sequence (thiol-labeled-ACT
A nucleic acid consisting of TCTCTCAATTTTCTAGGG) was immobilized (10 12 copy / cm 2 ) as a probe 107.
On the other hand, the electrode 105 has a sequence (thiol labeling-CGTCCCGTCGGCGC
TGAATC) (10 12 copy / cm 2 ) and the electrode 1
06 is a sequence selective for HBV subtype adw (thiol-labeled-CGTCCCGTCGGGCGCTGAAT).
C) was immobilized (10 12 copy / cm 2 ) to prepare a sensor having a configuration as shown in FIG. Next, the electrode 104
The distance between the electrodes 104 and 105, and between the electrodes 104 and 106 was fixed at a constant value (2000 angstroms) with a spacer having a thickness of 2000 A interposed between the electrodes 105, 104, and 106. Also,
The immobilization of the probe 95 and the probe 96 and the detection of the nucleic acid were performed by the method described in the embodiment. next,
Electrode 104 and electrode 105, electrode 104 and electrode 1
During 06, the sample obtained in the same manner as in Example 14 was thermally denatured and allowed to flow at a flow rate of 1000 μl / hr, and hybridization was performed for 1 hour. Note that the electrode 104, the electrode 105, and the electrode 106 were each positively charged for 30 minutes throughout the hybridization process. Then, the electrodes 104, 105, and 106 were sufficiently washed with ultrapure water. Next, the electrode 104 and the electrode 1
05, the space between the electrode 104 and the electrode 106 was filled with ultrapure water, the electric conductivity was measured, and HBV was detected. As a result, the electrical conductivity between the electrode 104 and the electrode 105 decreased, but the electrical conductivity between the electrode 104 and the electrode 106 did not change. Therefore, it was confirmed that the HBV contained in the sample was of the ayr type.
【０１０６】（実施例１６）本実施例では、図１１に示
された実施の形態に対応する電極を備えたセンサを作成
した。(Example 16) In this example, a sensor having electrodes corresponding to the embodiment shown in FIG. 11 was manufactured.
【０１０７】２×２ｃｍのパイレックスガラス基板９１
および９２を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した後、スパ
ッタリングで、該パイレックスガラス基板９１および９
２上に直径２ｍｍの金からなる電極９４および９３を作
製した。そして、電極９３にはＨＢＶのサブタイプ間で
共通の配列（チオール標識−ＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴ
ＴＴＴＣＴＡＧＧ）からなる核酸をプローブ９５として
固定化（1012 copy/cm2 ）し、電極９４には別の共通配
列（チオール標識−ＣＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧＣＧＣＴＧ
ＡＡＴＣ）からなる核酸をプローブ９６として固定化
（1012 copy/cm2）した。なお、電極９３および電極９
４において、プローブを固定化した領域の面積は10-2cm
2 である。次に、電極９３および電極９４間に厚さ２０
００オングストロームのスペーサー１１２を挟んで、電
極９３および電極９４間の距離を一定（２０００オング
ストローム）に固定した。また、プローブ９５およびプ
ローブ９６の固定、および核酸の検出は、実施の形態に
示す方法により実施した。2 × 2 cm Pyrex glass substrate 91
And 92 are washed with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, and then the Pyrex glass substrates 91 and 9 are sputtered.
The electrodes 94 and 93 made of gold having a diameter of 2 mm were formed on the substrate 2. The electrode 93 has a common sequence (thiol label-ACTTCTCTCAAT) between HBV subtypes.
(TTTCTAGG) is immobilized (10 12 copy / cm 2 ) as a probe 95, and another common sequence (thiol-labeled-CGTCCCGTCGGGGCTG) is attached to the electrode 94.
AATC) was immobilized (10 12 copy / cm 2 ) as a probe 96. The electrode 93 and the electrode 9
In 4, the area of the region where the probe was immobilized was 10 -2 cm.
2 Next, a thickness of 20 between the electrode 93 and the electrode 94.
The distance between the electrode 93 and the electrode 94 was fixed at a constant value (2000 Å) with the spacer 112 of 00 Å interposed therebetween. Further, immobilization of the probe 95 and the probe 96 and detection of the nucleic acid were performed by the method described in the embodiment.
【０１０８】次に、電極９３および電極９４の間に熱変
性した該サンプルおよびルシゲニンで標識したプローブ
１１１を、1000μL/ hr の流量で流して１時間のハイブ
リダイゼーションを行った後、電極９３および電極９４
を超純水で十分に洗浄した。そして、電極９３および電
極９４の間に電圧を印加して発生した発光強度を測定
し、ＨＢＶの検出を行った。なお、ＨＢＶの検出は、段
階希釈した複数のサンプルを用いて行った。その結果、
測定された発光強度とＨＢＶのＤＮＡの濃度はほぼ比例
関係にあることが確かめられた。したがって、発光強度
の測定によりＨＢＶのＤＮＡの濃度を定量できることが
確認された。Next, the sample denatured between the electrodes 93 and 94 and the probe 111 labeled with lucigenin were flowed at a flow rate of 1000 μL / hr to perform hybridization for 1 hour. 94
Was sufficiently washed with ultrapure water. Then, the emission intensity generated by applying a voltage between the electrode 93 and the electrode 94 was measured, and the HBV was detected. The detection of HBV was performed using a plurality of serially diluted samples. as a result,
It was confirmed that the measured luminescence intensity and the HBV DNA concentration were almost in a proportional relationship. Therefore, it was confirmed that the concentration of HBV DNA can be quantified by measuring the luminescence intensity.
【０１０９】（実施例１７）本実施例では、図１１に示
された実施の形態に対応する電極を備えたセンサを作成
した。Example 17 In this example, a sensor provided with electrodes corresponding to the embodiment shown in FIG. 11 was prepared.
【０１１０】２×２ｃｍのパイレックスガラス基板９１
および９２を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した後、スパ
ッタリングで、該パイレックスガラス基板９１および９
２上に直径２ｍｍの金からなる電極９４および電極９３
を作製した。そして、電極９３にはＨＢＶのサブタイプ
間で共通の配列（チオール標識−ＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡ
ＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧ）からなる核酸をプローブ９５と
して固定化（1012 copy/cm2 ）し、電極９４には別の共
通配列（チオール標識−ＣＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧＣＧＣ
ＴＧＡＡＴＣ）からなる核酸をプローブ９６として固定
化（1012 copy/cm2 ）した。なお、電極９３および電極
９４において、プローブを固定化した領域の面積は10-2
cm2 である。次に、電極９３および電極９４間に厚さ２
０００オングストロームのスペーサー１１２を挟んで、
電極９３および電極９４間の距離を一定（２０００オン
グストローム）に固定した。また、プローブ９５および
プローブ９６の固定、および核酸の検出は、実施の形態
に示す方法により実施した。 次に、電極９３および電
極９４の間に熱変性した実施例１４と同様のサンプルお
よびフィロセンで標識したプローブ１１１を、1000μL/
hr の流量で流して１時間のハイブリダイゼーションを
行った後、電極９３および電極９４を超純水で十分に洗
浄した。次いで、電極９３および電極９４の間を超純水
で満たして電圧を印加するとともに銀／塩化銀電極（参
照電極）を電極９３および電極９４間の超純水中に挿入
し、フェロセン由来の電流値を測定してＨＢＶの検出を
行った。その結果、作用極（電極９３および電極９４）
で得られるフェロセン由来の電流値とＨＢＶのＤＮＡの
濃度はほぼ比例関係にあることが確かめられた。したが
って、電極間に流れる電流値の測定によりＨＢＶのＤＮ
Ａの濃度を定量できることが確認された。Pyrex glass substrate 91 of 2 × 2 cm
And 92 are washed with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, and then the Pyrex glass substrates 91 and 9 are sputtered.
Electrode 94 and electrode 93 made of gold having a diameter of 2 mm
Was prepared. The electrode 93 has a common sequence between the HBV subtypes (thiol label-ACTTCCTCTCA).
(ATTTTCTAGG) is immobilized (10 12 copy / cm 2 ) as a probe 95, and another common sequence (thiol-labeled-CGTCCCGTCGGCGC
(TGAATC) was immobilized as a probe 96 (10 12 copy / cm 2 ). In the electrodes 93 and 94, the area of the region where the probe was immobilized was 10 −2.
It is cm 2. Next, a thickness 2 between the electrode 93 and the electrode 94.
With a spacer 112 of 000 angstroms in between,
The distance between the electrode 93 and the electrode 94 was fixed (2000 Å). Further, immobilization of the probe 95 and the probe 96 and detection of the nucleic acid were performed by the method described in the embodiment. Next, the same sample as in Example 14 thermally denatured between the electrode 93 and the electrode 94 and the probe 111 labeled with phylocene were applied at 1000 μL /
After the hybridization was performed at a flow rate of hr for one hour, the electrodes 93 and 94 were sufficiently washed with ultrapure water. Next, the space between the electrode 93 and the electrode 94 is filled with ultrapure water to apply a voltage, and a silver / silver chloride electrode (reference electrode) is inserted into the ultrapure water between the electrode 93 and the electrode 94 to obtain a current derived from ferrocene. The values were measured to detect HBV. As a result, the working electrode (electrode 93 and electrode 94)
It was confirmed that the current value derived from ferrocene and the concentration of HBV DNA obtained in the above were substantially proportional to each other. Therefore, by measuring the value of the current flowing between the electrodes, the DN of HBV
It was confirmed that the concentration of A could be quantified.
【０１１１】（実施例１８）本実施例では、図１１に示
された実施の形態に対応する電極を備えたセンサを作成
した。Example 18 In this example, a sensor provided with electrodes corresponding to the embodiment shown in FIG. 11 was manufactured.
【０１１２】２×２ｃｍのパイレックスガラス基板９１
および９２を硫酸・過酸化水素溶液で洗浄した後、スパ
ッタリングで、該パイレックスガラス基板９１および９
２上に直径２ｍｍの炭素からなる電極９４および９３を
作製した。そして、電極９３および９４の表面を３−ア
ミノプロピリトリエトキシシランで処理した後、電極９
３にはＨＢＶのサブタイプ間で共通の配列（アミノ基−
ＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧ）からなる
核酸をプローブ９５として固定化（1013 copy/cm2 ）
し、電極９４には別の共通配列（アミノ基−ＣＧＴＣＣ
ＣＧＴＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣ）からなる核酸をプロ
ーブ９６として固定化（1013 copy/cm2 ）した。なお、
電極９３および電極９４において、プローブを固定化し
た領域の面積は10-4cm2 である。次に、電極９３および
電極９４間に厚さ２０００オングストロームのスペーサ
ー１１２を挟んで、電極９３および電極９４間の距離を
一定（２０００オングストローム）に固定した。また、
プローブ９５およびプローブ９６の固定、および核酸の
検出は、グルタルアルデヒドの共存下および実施の形態
に示す方法により実施した。Pyrex glass substrate 91 of 2 × 2 cm
And 92 are washed with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, and then the Pyrex glass substrates 91 and 9 are sputtered.
The electrodes 94 and 93 made of carbon having a diameter of 2 mm were formed on the sample No. 2. Then, after treating the surfaces of the electrodes 93 and 94 with 3-aminopropyltriethoxysilane,
3 has a common sequence between HBV subtypes (amino group-
ACTTCTCTCAATTTTCTAGG) is immobilized as a probe 95 (10 13 copy / cm 2 ).
The electrode 94 has another common arrangement (amino group-CGTCC).
A nucleic acid consisting of CGTCGGGCGCTGAATC) was immobilized (10 13 copy / cm 2 ) as a probe 96. In addition,
In the electrodes 93 and 94, the area of the region where the probe was immobilized was 10 −4 cm 2 . Next, the distance between the electrodes 93 and 94 was fixed at a constant value (2000 angstroms) with a spacer 112 having a thickness of 2000 angstroms interposed between the electrodes 93 and 94. Also,
The immobilization of the probe 95 and the probe 96 and the detection of the nucleic acid were performed in the presence of glutaraldehyde and by the method described in the embodiment.
【０１１３】次に、電極９３および電極９４の間に熱変
性した実施例１４と同様のサンプルを1000μｌ/ hrの流
量で流して１時間のハイブリダイゼーションを行った
後、電極９３および電極９４を超純水で十分に洗浄し
た。次いで、電極９３および電極９４の間を超純水で満
たし、該超純水中に白金電極（対極）および銀／塩化銀
電極（参照電極）を挿入して電極９３および電極９４
（作用極）間に電圧を印加した。そして、核酸から生じ
る微弱な発光を測定してＨＢＶの検出を行った。その結
果、核酸から生じる微弱な発光とＨＢＶのＤＮＡの濃度
はほぼ比例関係にあることが確かめられた。したがっ
て、核酸から生じる微弱な発光の測定によりＨＢＶのＤ
ＮＡの濃度を定量できることが確認された。Next, the same sample as in Example 14, which had been thermally denatured, was flowed between the electrodes 93 and 94 at a flow rate of 1000 μl / hr for 1 hour of hybridization. It was thoroughly washed with pure water. Next, the space between the electrode 93 and the electrode 94 is filled with ultrapure water, and a platinum electrode (counter electrode) and a silver / silver chloride electrode (reference electrode) are inserted into the ultrapure water to form the electrodes 93 and 94.
A voltage was applied between (working electrodes). Then, HBV was detected by measuring weak luminescence generated from the nucleic acid. As a result, it was confirmed that the weak luminescence generated from the nucleic acid and the concentration of the HBV DNA were substantially proportional to each other. Therefore, the measurement of the weak luminescence generated from the nucleic acid allows the measurement of the HBV D
It was confirmed that the concentration of NA could be quantified.
【０１１４】次に、核酸の抽出効率の向上と偽陽性を呈
することなく高感度に核酸の検出を実行した実施例につ
いて詳述する。Next, an example in which the nucleic acid extraction efficiency is improved and the nucleic acid is detected with high sensitivity without exhibiting false positives will be described in detail.
【０１１５】（実施例１９）Ｂ型肝炎の患者に由来する
パネル血清および健常者（ノンキャリア）に由来するＨ
ＢＶ未感染血清の各々１mLに、プロテイナーゼＫおよび
界面活性剤（０．５％ ＳＤＳ）を作用させ、ウイルス
の外殻を壊してＤＮＡを露出させた後、各々に5 〜100m
erからなる合成核酸（poly A）を１００ng/ mLとなるよ
うに添加し、フェノ一ル・クロロホルム法を用いてＤＮ
Ａの抽出を行った。抽出したＤＮＡをアルカリ変性させ
た後、ニトロセルロース膜にブロットし、ＲＩでラベル
したプローブ（ΗＢＶのＸ領域に相補的な５′−ＣＧＴ
ＣＣＣＧＴＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣ−３′）を用いて
ドットブロット法による検出を行った。また、コントロ
ールとして、牛胸腺ＤＮＡを添加して抽出したＤＮＡお
よびキャリア核酸を未添加で抽出したＤＮＡを用いて同
様の操作を行った。なお、上記血清においては、ウイル
ス量は既知であり、低濃度から高濃度までのウイルス量
を示す複数の血清が用意されていた。(Example 19) Panel serum derived from a patient with hepatitis B and H derived from a healthy person (non-carrier)
Proteinase K and a surfactant (0.5% SDS) were allowed to act on 1 mL of each of the BV-uninfected sera to break the outer shell of the virus and expose the DNA.
er), a synthetic nucleic acid (polyA) is added to a concentration of 100 ng / mL, and DN is added using the phenol-chloroform method.
A was extracted. After the extracted DNA was denatured with alkali, it was blotted on a nitrocellulose membrane, and an RI-labeled probe (5'-CGT complementary to the X region of ΗBV) was used.
CCCGTCGGCGCTGAATC-3 ') was used for detection by dot blotting. The same operation was performed using DNA extracted by adding bovine thymus DNA and DNA extracted without adding carrier nucleic acid as controls. In the above serum, the amount of the virus was known, and a plurality of sera indicating the amount of the virus from a low concentration to a high concentration was prepared.
【０１１６】操作の結果、高濃度のウイルス量を示す血
清に対しては、上記いずれの方法でも同等の強度のスポ
ットをフィルム上に確認することができたが、低濃度の
ウイルス量を示す血清に対しては、キャリア核酸を未添
加で抽出したＤＮＡにおいてシグナルの強度が弱かっ
た。また、ＨＢＶ未感染血清については、合成核酸（po
ly A）を添加してＤＮＡの抽出を行った場合には全くス
ポットが見られなかったが、牛胸腺ＤＮＡを添加してＤ
ＮＡの抽出を行った場合には弱くスポットが見られ、低
濃度のウイルス量を示す血清のスポットとの区別がつか
なかった。As a result of the operation, spots of the same intensity could be confirmed on the film by any of the above methods for serum showing a high concentration of virus, but serum showing a low concentration of virus In contrast, the signal intensity was weak in the DNA extracted without adding the carrier nucleic acid. In addition, for non-HBV-infected serum, synthetic nucleic acids (po
When DNA was extracted by adding ly A), no spot was observed at all.
When NA was extracted, a weak spot was observed, and it was indistinguishable from a serum spot showing a low concentration of virus.
【０１１７】以上のことから、キャリア核酸を添加する
ことで、存在量の少ない（低濃度）核酸も効率よく抽出
できることが確かめられた。また、牛胸腺ＤＮＡをキャ
リア核酸として用いた場合には、わずかながらプローブ
との間で反応を起こし（ハイブリッドの形成）、ＨＢＶ
未感染血清を陽性と判定してしまう危険性が示された。
これは、キャリアＤＮＡにＨＢＶに類似の塩基配列が存
在するためと推測される。 また、キャリアＤＮＡとし
てpoly Aを用いた場合には、偽陽性の危険性はないこと
が確認された。From the above, it was confirmed that by adding a carrier nucleic acid, a nucleic acid having a small amount (low concentration) can be efficiently extracted. In addition, when bovine thymus DNA was used as a carrier nucleic acid, a slight reaction occurred with the probe (hybrid formation), and HBV
There was a risk that uninfected sera would be considered positive.
This is presumed to be due to the presence of a base sequence similar to HBV in the carrier DNA. It was also confirmed that there was no risk of false positives when polyA was used as the carrier DNA.
【０１１８】（実施例２０）ΗＢＶ−ＤＮＡをプラスミ
ドpSP 65に組み込んで作製したpYRB 259を用いて以下の
ようなモデル実験を行った。Example 20 The following model experiment was performed using pYRB259 produced by incorporating BV-DNA into plasmid pSP65.
【０１１９】マイクロタイタープレートにΗＢＶのＸ領
域に相補的なプローブ（５′−ＣＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧ
ＣＧＣＴＧＡＡＴＣ−３′）を吸着させた後、紫外線を
照射して、マイクロタイタープレートにプローブを固定
化（1012 copy/cm2 ）した。一方、ターゲットとしてビ
オチンでラベルしたpYRB 259を作製した。次に、ビオチ
ン化したpYRB 259を１００ng/ mLとなるように、また、
キャリア核酸としてＨＢＶ−ＤＮＡに相補的な配列を備
えた合成オリゴマー（５′−ＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴ
ＴＴＴＣＴＡＧＧ−３′、５′−ＣＧＴＣＧＣＡＧΑΑ
ＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣ−３′、５′−ＴＣＧＴＧＴＴＡ
ＣＡＧＧＣＧＧＧＧＴＴＴ−３′および５′−ＣＧＡＡ
ＣＣＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣ−３′）を各々１ng
/ mLとなるようにハイブリダイゼーション溶液（１５０
m mol/ Lの塩化ナ卜リウム、１５m mol/ Lのクエン酸ナ
トリウム、pH７．０）に溶解し、熱変性させた後、プロ
ーブを固定化したプレートのウェルに１００μｌずつ入
れ、４３℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。A probe (5'-CGTCCCGTCGGG) complementary to the X region of ＣBV was placed on a microtiter plate.
After adsorbing CGCTGAATC-3 ′), the probe was immobilized on a microtiter plate (10 12 copy / cm 2 ) by irradiating ultraviolet rays. On the other hand, biotin-labeled pYRB259 was prepared as a target. Next, the biotinylated pYRB259 was adjusted to 100 ng / mL, and
Synthetic oligomer (5'-ACTTCTCTCAAAT having a sequence complementary to HBV-DNA as carrier nucleic acid
TTTCTAGGG-3 ', 5'-CGTCGCAGΑΑ
GATCTCAATC-3 ', 5'-TCGTGTTA
CAGGCGGGGTTT-3 'and 5'-CGAA
CCACTGAACAAATGGC-3 ') at 1 ng each
/ Hybridization solution (150
dissolved in sodium chloride (mmol / L, sodium citrate, 15 mmol / L, pH 7.0), and denatured by heat. Hybridization was performed for hours.
【０１２０】次に、ハイブリダイゼーションを行った
後、反応液中に残存するpYRB 259の量およびプレート上
のプローブとハイブリッドを形成したpYRB 259の量を、
ウサギ抗ビオチン抗体および HRP標識抗ウサギ IgG抗体
を用いて免疫化学的に測定した。また、コントロールと
して、合成オリゴマーを添加しない場合についても、同
様の操作を行った。Next, after hybridization, the amount of pYRB 259 remaining in the reaction solution and the amount of pYRB 259 hybridized with the probe on the plate were determined.
The measurement was performed immunochemically using a rabbit anti-biotin antibody and an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody. In addition, as a control, the same operation was performed when no synthetic oligomer was added.
【０１２１】その結果、表４に示す通り、合成オリゴマ
ーを添加した場合には、マイクロタイタープレート上の
プローブとハイブリッドを形成したターゲット（pYRB 2
59）の量は、合成オリゴマーが未添加であったコントロ
ールと比較して約２．６倍、反応液に残存するターゲッ
ト（pYRB 259）の量は、合成オリゴマーが未添加であっ
たコントロールと比較して約３分の１であった。As a result, as shown in Table 4, when the synthetic oligomer was added, the target (pYRB 2
The amount of the target (pYRB 259) remaining in the reaction solution was about 2.6 times that of the control to which the synthetic oligomer was not added. It was about one third.
【０１２２】[0122]
【表４】 以上から、キャリア核酸の添加によって、ターゲット自
身のセルフハイブリダイゼーションが抑制され、ターゲ
ットがマイクロタイタープレート上のプローブとハイブ
リッドを形成する効率が向上することが確認された。[Table 4] From the above, it was confirmed that the self-hybridization of the target itself was suppressed by the addition of the carrier nucleic acid, and the efficiency of the target forming a hybrid with the probe on the microtiter plate was improved.
【０１２３】（実施例２１）ＡＴカット、振動周波数９
ＭＨｚ、電極面積０．１９６cm2 、電極材料が金である
水晶振動子にΗＢＶのＸ領域に相補的な５′−ＣＧＴＣ
ＣＣＧＴＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣ−３′をチオール基
を介して固定化し、ΗＢＶ−ＤＮＡ検出センサを作製し
た。ターゲットとしてpYRB 259およびキャリア核酸とし
てプラスミドpSP 65の超音波分解物をそれぞれ１００ng
/ mLとなるようハイブリダイゼーション溶液（１５０m
mol/ Lの塩化ナ卜リウム、１５m mol/ Lのクエン酸ナト
リウム、pH７．０）に溶解し、該溶液の５mLを熱変性さ
せた後に上記の水晶振動子を該溶液に挿入し、４３℃で
１時間ハイブリダイゼーションを行った。一方、コント
ロールとして、pSP 65の超音波分解物を添加しない場合
についても同様の操作を行った。(Example 21) AT cut, vibration frequency 9
MHz, the electrode area of 0.196cm 2, complementary to the crystal oscillator electrode material is gold in the X region of ΗBV 5'-CGTC
CCGTCGGGCGCTGAATC-3 ′ was immobilized via a thiol group to prepare a ΔBV-DNA detection sensor. 100 ng each of pYRB 259 as a target and sonicated product of plasmid pSP 65 as a carrier nucleic acid
/ Hybridization solution (150m
mol / L sodium chloride, 15 mmol / L sodium citrate, pH 7.0). For 1 hour. On the other hand, as a control, the same operation was performed when no ultrasonically decomposed product of pSP65 was added.
【０１２４】その結果、pSP 65の超音波分解物を添加し
なかった場合には、水晶振動子の振動数の減少量は約１
００Hzであったが、pSP 65の超音波分解物を添加した場
合では水晶振動子の振動数の減少量は約３５０Hzであっ
た。この結果は、水晶振動子上のプローブとハイブリッ
ドを形成したpYRB 259に対して、さらに、pSP 65の超音
波分解物がハイブリダイズしたために、水晶振動子の振
動数の変化量が増大したことを示しており、キャリア核
酸の添加により検出信号が増大することが確認された。As a result, when the ultrasonically decomposed product of pSP65 was not added, the amount of decrease in the frequency of the quartz oscillator was reduced by about 1
The frequency was 00 Hz, but when the ultrasonically decomposed product of pSP65 was added, the amount of decrease in the frequency of the crystal resonator was about 350 Hz. This result indicates that the amount of change in the frequency of the crystal oscillator increased due to the hybridization of the ultrasonic decomposition product of pSP65 with pYRB 259, which formed a hybrid with the probe on the crystal oscillator. It was confirmed that the detection signal was increased by the addition of the carrier nucleic acid.
【０１２５】（実施例２２）本実施例では、図２に示さ
れた実施の形態に対応する電極を製造した。Example 22 In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 2 was manufactured.
【０１２６】７．６２ｃｍ（３インチ）のパイレックス
（登録商標）ガラス基板１２を硫酸・過酸化水素溶液で
洗浄した後、スパッタリングにより、まず常法によりチ
タンを５００オングストロームの厚さとなるように成膜
し、次いで同様に金を５０００オングストロ−ムの厚さ
となるように成膜した。次に、光露光用フォトレジスト
ＡＺ４６２０を用いて蒸着金属のリソグラフイーを行い
導電体１１を形成した。次いで、同じフォトレジストを
塗布し、露光現像して、導電体１１を露出させる開口部
１３（面積：0.07cm 2 ）を持った電極を形成した。After cleaning a 7.62 cm (3 inch) Pyrex (registered trademark) glass substrate 12 with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, a titanium film is first formed to a thickness of 500 angstroms by a conventional method. Then, similarly, a gold film was formed to have a thickness of 5000 angstroms. Next, lithography of the deposited metal was performed using a photoresist AZ4620 for light exposure to form a conductor 11. Next, the same photoresist was applied and exposed and developed to form an electrode having an opening 13 (area: 0.07 cm 2 ) for exposing the conductor 11.
【０１２７】次いで、この電極に、プローブとしてΒ型
肝炎ウイルス（ΗＢＶ）のＸ領域に相補的な核酸（５′
−ＣＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣ−３′）
をチオール基を介して固定化（1012 copy/cm 2 ）した。Next, as a probe, a nucleic acid (5 ′) complementary to the X region of hepatitis ウ イ ル ス virus (ΗBV) was used as a probe.
-CGTCCCCGTCGGCGCTGAATC-3 ')
Was immobilized via a thiol group (10 12 copy / cm 2 ).
【０１２８】次に、ターゲットとしてpYRB 259およびキ
ャリア核酸としてプラスミドpSP 65の超音波分解物をそ
れぞれ103 copy/ mLとなるようハイブリダイゼーション
溶液（１５０m mol/ Lの塩化ナ卜リウム、１５m mol/ L
のクエン酸ナトリウム、pH７．０）に溶解し、該溶液の
１００μL を加熱してＤＮＡを熱変性させた後に上記の
電極を該溶液中に入れ、４３℃で１時間ハイブリタイゼ
ーションを行った。そして、ハイブリダイゼーションを
行った後、電極を洗浄して挿入剤へキスト３３２５８の
溶液に浸漬した後、電気化学的な測定を行った。一方、
コントロールとして、pSP 65の超音波分解物を添加しな
い以外は上記の場合と同様にして操作を行った。[0128] Next, the hybridization solution to be sonicated of the plasmid pSP 65 a and 10 3 copy / mL respectively as PYRB 259 and carrier nucleic acid as a target (150m mol / L chloride Na Bok potassium in, 15 m mol / L
Was dissolved in sodium citrate, pH 7.0), and 100 μL of the solution was heated to denature the DNA. After that, the above electrode was placed in the solution, and hybridization was performed at 43 ° C. for 1 hour. After the hybridization, the electrodes were washed and immersed in a solution of Kist 33258 in an intercalating agent, and then electrochemical measurements were performed. on the other hand,
As a control, the operation was performed in the same manner as described above except that the ultrasonically decomposed product of pSP65 was not added.
【０１２９】その結果、ヘキスト３３２５８に由来する
電流値は、pSP 65の超音波分解物を添加した場合には、
pSP 65の超音波分解物を添加しないコントロールと比較
して５nAの有意な差が認められた。この結果は、電極上
のプローブにハイブリダイズしたpYRB 259にさらにpSP
65の超音波分解物がハイブリダイズしたために、ヘキス
ト３３２５８の結合量が増大したことを示しており、キ
ャリア核酸の添加により検出信号が増大することが確認
された。As a result, when the current value derived from Hoechst 33258 was added with the ultrasonically decomposed product of pSP65,
A significant difference of 5 nA was observed as compared with the control to which no ultrasonic degradation product of pSP65 was added. This result shows that pYRB259 hybridized to the probe on the electrode
This indicates that the amount of binding of Hoechst 33258 increased due to the hybridization of 65 ultrasonic degradation products, and it was confirmed that the detection signal increased by the addition of the carrier nucleic acid.
【０１３０】（実施例２３）本実施例では、図２に示さ
れた実施の形態に対応する電極を製造した。Example 23 In this example, an electrode corresponding to the embodiment shown in FIG. 2 was manufactured.
【０１３１】７．６２ｃｍ（３インチ）のパイレックス
（登録商標）ガラス基板１２を硫酸・過酸化水素溶液で
洗浄した後、電子ビーム法により、まず常法によりチタ
ンを５００オングストロームの厚さとなるように蒸着
し、次いで同様に金を５０００オングストロームの厚さ
となるように蒸着した。次に、光露光用フォトレジスト
ＡＺ４６２０を用いてリソグラフィーを行い、接着層１
５および導電体１１を同時に形成した。さらに、ＣＶＤ
により窒化ケイ素膜を２０００オングストロームの厚さ
となるように成膜して絶縁体１４を形成させた。次いで
同じフォトレジストを塗布し、露光現像して、導電体を
露出させる開口部１３（面積：0.07cm 2 ）を持ったレジ
ストパターン（絶縁体）を備えた電極を形成した。After cleaning a 7.62 cm (3 inch) Pyrex (registered trademark) glass substrate 12 with a sulfuric acid / hydrogen peroxide solution, titanium is first deposited to a thickness of 500 angstroms by an electron beam method using a conventional method. Evaporation followed by a similar deposition of gold to a thickness of 5000 Angstroms. Next, lithography is performed using a photoresist AZ4620 for light exposure, and an adhesive layer 1 is formed.
5 and the conductor 11 were simultaneously formed. Further, CVD
Thus, a silicon nitride film was formed to a thickness of 2000 angstroms to form the insulator 14. Next, the same photoresist was applied, exposed and developed to form an electrode having a resist pattern (insulator) having an opening 13 (area: 0.07 cm 2 ) for exposing the conductor.
【０１３２】次いで、この電極の開口部１３に露出した
導電体上に、プローブとしてΗＢＶのＸ領域に相補的な
塩基配列５′−ＣＧＴＣＣＣＧＴＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡ
ＴＣ−３′を持つ核酸を、チオール基を介して固定化し
た。Next, as a probe, a base sequence 5′-CGTCCCGTCGGGCGCTGAA complementary to the X region of ΗBV was formed on the conductor exposed at the opening 13 of this electrode.
The nucleic acid having TC-3 'was immobilized via a thiol group.
【０１３３】一方、Ｂ型肝炎の患者に由来する血清５０
０μL をプロテイナーゼΚおよび界面活性剤（０．５％
ＳＤＳ）で処理した後、キャリア核酸として5 〜100m
erからなる合成核酸（poly A）およびΗＢＶに相補的な
塩基配列である合成オリゴマー（５′−ＡＣＴＴＣＴＣ
ＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧ−３′、５′−ＣＧＴＣＧ
ＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣ−３′、５′−ＴＣＧ
ＴＧＴＴＡＣＡＧＧＣＧＧＧＧＴＴＴ−３′および５′
−ＣＧＡＡＣＣＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣ−３′）
を各々０．１ng/ mLとなるように添加し、フェノ一ル・
クロロホルム法を用いてＤＮＡの抽出を行った。そし
て、抽出したＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（１
５０m mol/ Lの塩化ナ卜リウム、１５m mol/ Lのクエン
酸ナトリウム、pH７．０） 500μｌに溶解し、該溶液の
100μｌを加熱してＤＮＡを熱変性させた後に上記の電
極を溶液中に入れ、４３℃で１時間ハイブリタイゼーシ
ョンを行った。そして、ハイブリダイゼーションを行っ
た後、電極を洗浄して挿入剤へキスト３３２５８の溶液
に浸漬した後、電気化学的な測定を行った。さらに、コ
ントロールとして、キャリア核酸を添加しない以外は上
記の場合と同様にして操作を行った。一方、検量線用の
サンプルとして、既知濃度のＨＢＶ−ＤＮＡを血清抽出
液（正常人血清で同様の抽出操作を経たもの）で希釈
し、前述のキャリア核酸を加えたものを用いて同様に測
定した。On the other hand, serum 50 derived from a patient with hepatitis B
0 μL of proteinase Κ and detergent (0.5%
After treatment with SDS), 5-100m as carrier nucleic acid
and a synthetic oligomer (5′-ACTTCTCC) having a base sequence complementary to ΗBV.
TCAATTTTCTAGG-3 ', 5'-CGTCG
CAGAAGATCTCAATC-3 ', 5'-TCG
TGTTACAGGCGGGGTTTT-3 'and 5'
-CGAACCACTGAACAAATGGC-3 ')
Were added to each to a concentration of 0.1 ng / mL.
DNA was extracted using the chloroform method. Then, the extracted DNA is mixed with a hybridization solution (1).
50 mmol / L sodium chloride, 15 mmol / L sodium citrate, pH 7.0)
After heating 100 μl to denature the DNA by heat, the above electrode was put into the solution, and hybridization was performed at 43 ° C. for 1 hour. After the hybridization, the electrodes were washed and immersed in a solution of Kist 33258 in an intercalating agent, and then electrochemical measurements were performed. Further, as a control, the same operation as above was performed except that no carrier nucleic acid was added. On the other hand, as a sample for a calibration curve, a known concentration of HBV-DNA was diluted with a serum extract (the same extraction operation was performed with normal human serum), and the same measurement was performed using the above-mentioned sample to which the carrier nucleic acid was added. did.
【０１３４】その結果、キャリア核酸の添加を行わなか
ったコントロールにおいては、図１６のＢに示すように
検量線の直線範囲が１０5 −１０7 copy/ mLであるた
め、検量線の上限あるいは下限をはずれるサンプルが多
く存在したが、キャリア核酸を添加した場合には、図１
６のＡに示すように検量線の直線範囲が１０3 −１０8c
opy/ mLと広がったため、ＨＢＶ−ＤＮＡを検出可能な
範囲（コピー数）が拡大し、この範囲からはずれるサン
プルは著しく減少した。したがって、キャリア核酸を添
加することにより、検出限界の顕著な向上が達成される
ことが確認された。 なお、上述したすべての電極は、
９０℃以上の熱水処理、あるいは０．２mol/ L程度以上
でのアルカリ溶液処理あるいは尿素等の変性剤による処
理で簡単に再生することができ、繰り返して使用するこ
とが可能である。As a result, in the control in which the carrier nucleic acid was not added, the linear range of the calibration curve was 10 5 -10 7 copy / mL as shown in FIG. Many samples deviated from the above, but when carrier nucleic acid was added,
As shown in 6A, the linear range of the calibration curve is 10 3 -10 8 c
Due to the spread of opy / mL, the range (copy number) in which HBV-DNA can be detected was expanded, and the number of samples outside this range was significantly reduced. Therefore, it was confirmed that the detection limit was significantly improved by adding the carrier nucleic acid. In addition, all the electrodes mentioned above are
It can be easily regenerated by hot water treatment at 90 ° C. or higher, alkali solution treatment at about 0.2 mol / L or higher, or treatment with a denaturant such as urea, and can be used repeatedly.
【０１３５】[0135]
【発明の効果】以上詳述したように、本願第１の発明に
係る電極によれば、基板上に配置した導電体を被覆した
絶縁体の一部に、導電体が露出するように開口部を設
け、該開口部より露出した導電体に核酸を固定化したこ
とにより、表面積が制御された導電体上へ核酸を固定化
することができる。また、基板上に導電体を配置したこ
とにより、導電体の特性を制御することができる。プロ
ーブを固定化する電極の表面積及び結晶楕造を制御する
ことができる。したがって、優れた再現性および定量性
を発揮し、経済的に核酸を検出可能な電極を提供するこ
とができる。As described above in detail, according to the electrode according to the first aspect of the present invention, the opening is formed in a part of the insulator covering the conductor disposed on the substrate so that the conductor is exposed. Is provided, and the nucleic acid is immobilized on the conductor exposed through the opening, so that the nucleic acid can be immobilized on the conductor having a controlled surface area. Further, by arranging the conductor on the substrate, characteristics of the conductor can be controlled. It is possible to control the surface area and the crystal oval of the electrode for immobilizing the probe. Therefore, it is possible to provide an electrode that exhibits excellent reproducibility and quantitativeness and can detect nucleic acids economically.
【０１３６】また、本願第２の発明に係る検出装置によ
れば、電極に定量的に固定化した第１の核酸と第２の核
酸とを反応部でハイブリダイゼーションさせ、第１の核
酸に電圧を印加して生じた信号を測定することにより該
信号の測定量と第２の核酸の量とを一義的に対応させる
ことができ、また、検出に要する時間の短縮と操作性の
向上が達成される。したがって、核酸の検出に際し、優
れた再現性および定量性を発揮するとともに、検出に要
する時間の短縮と操作性の向上が図られた、検出時の経
済性にも優れる検出装置を提供することができる。Further, according to the detection apparatus of the second aspect of the present invention, the first nucleic acid and the second nucleic acid which are quantitatively immobilized on the electrodes are hybridized in the reaction section, and the first nucleic acid is applied with a voltage. By measuring the signal generated by applying the signal, the measured amount of the signal and the amount of the second nucleic acid can be uniquely associated with each other, and the time required for detection and the operability are improved. Is done. Therefore, it is possible to provide a detection device that exhibits excellent reproducibility and quantification when detecting nucleic acids, shortens the time required for detection and improves operability, and is also excellent in economical efficiency during detection. it can.
【０１３７】さらに、本願第３の発明に係る検出装置に
よれば、第２の核酸の検出に必要な最小の面積を有する
領域内に定量的に固定化した第１の核酸と第２の核酸と
を反応部でハイブリダイゼーションさせ、第１の核酸に
電圧を印加して生じた信号を測定することにより、該信
号の測定量と第２の核酸の量とを一義的に対応させると
ともにバックグラウンドを低減することができ、検出に
要する時間の短縮と操作性の向上を達成することができ
る。したがって、核酸の検出に際し、優れた再現性およ
び定量性を発揮するとともに、検出感度の高感度化が達
成され、検出に要する時間の短縮と操作性の向上が図ら
れた、検出時の経済性にも優れる検出装置を提供するこ
とができる。Further, according to the detection device of the third invention of the present application, the first nucleic acid and the second nucleic acid quantitatively immobilized in the region having the minimum area required for the detection of the second nucleic acid. Are hybridized in the reaction section, and a signal generated by applying a voltage to the first nucleic acid is measured, so that the measured amount of the signal and the amount of the second nucleic acid uniquely correspond to each other, and the background Can be reduced, and the time required for detection can be reduced and operability can be improved. Therefore, in the detection of nucleic acids, while exhibiting excellent reproducibility and quantification, high sensitivity of detection was achieved, shortening the time required for detection and improving operability, and economical efficiency at the time of detection It is possible to provide a detection device which is excellent in the above.
【０１３８】また、本願第４の発明に係る検出装置によ
れば、第１および第２の核酸を固定化した第１および第
２の電極を該第１および前記第２の核酸に対して第３の
核酸がハイブリッドを形成できるように配置し、第１お
よび第２の電極に接続された電源より電圧を印加して生
じた信号を測定することにより、第３の核酸に由来する
信号をバックグラウンドを低減しつつ確実に得ることが
できる。したがって、核酸の検出に際し、優れた再現性
および定量性を発揮するとともに、検出感度の高感度化
が達成され、検出に要する時間の短縮と操作性の向上が
図られた、検出時の経済性にも優れる検出装置を提供す
ることができる。According to the detection device of the fourth aspect of the present invention, the first and second electrodes on which the first and second nucleic acids are immobilized are connected to the first and second nucleic acids with respect to the first and second nucleic acids, respectively. The signal derived from the third nucleic acid is measured by measuring the signal generated by applying a voltage from a power supply connected to the first and second electrodes and arranging the third nucleic acid so as to form a hybrid. It can be obtained reliably while reducing the ground. Therefore, in the detection of nucleic acids, while exhibiting excellent reproducibility and quantification, high sensitivity of detection was achieved, shortening the time required for detection and improving operability, and economical efficiency at the time of detection It is possible to provide a detection device which is excellent in the above.
【０１３９】また、本願第５の発明に係る検出装置によ
れば、第１および第２の核酸を固定化した第１および第
２の電極を、第１および第２の核酸に対して第３の核酸
がハイブリッドを形成できるように配置したことによ
り、第３の核酸は第１および第２の核酸に対して安定し
たハイブリッドを容易に形成することができる。したが
って、核酸の検出に際し、優れた再現性および定量性を
発揮するとともに、検出感度の高感度化が達成され、検
出に要する時間の短縮と操作性の向上が図られた、検出
時の経済性にも優れるセンサを提供することができる。Further, according to the detection apparatus of the fifth aspect of the present invention, the first and second electrodes on which the first and second nucleic acids are immobilized are connected to the first and second nucleic acids by the third electrode. The third nucleic acid can easily form a stable hybrid with the first and second nucleic acids by arranging the nucleic acids to form a hybrid. Therefore, in the detection of nucleic acids, while exhibiting excellent reproducibility and quantification, high sensitivity of detection was achieved, shortening the time required for detection and improving operability, and economical efficiency at the time of detection It is possible to provide an excellent sensor.
【図１】本発明の一つの実施形態にかかる電極の概略
図。FIG. 1 is a schematic diagram of an electrode according to one embodiment of the present invention.
【図２】本発明の一つの実施形態にかかる電極の概略
図。FIG. 2 is a schematic diagram of an electrode according to one embodiment of the present invention.
【図３】本発明の別の実施形態にかかる電極の概略図。FIG. 3 is a schematic diagram of an electrode according to another embodiment of the present invention.
【図４】本発明の別の実施形態にかかる電極の概略図。FIG. 4 is a schematic diagram of an electrode according to another embodiment of the present invention.
【図５】本発明の更に別の実施態様にかかる電極の概略
図。FIG. 5 is a schematic view of an electrode according to still another embodiment of the present invention.
【図６】本発明に係る電極を用いた検出装置の一実施態
様を示した図。FIG. 6 is a diagram showing an embodiment of a detection device using electrodes according to the present invention.
【図７】本発明に係る電極を用いて完全に自動化された
検出装置の一実施態様の構成を示した図。FIG. 7 is a diagram showing a configuration of an embodiment of a detection apparatus fully automated using electrodes according to the present invention.
【図８】本発明に係る電極を用いて完全に自動化された
検出装置の一実施態様の構成を示した図。FIG. 8 is a diagram showing a configuration of an embodiment of a detection apparatus completely automated using electrodes according to the present invention.
【図９】本発明に係るセンサの一実施態様を示した図。FIG. 9 is a view showing one embodiment of a sensor according to the present invention.
【図１０】本発明に係るセンサの一実施態様を示した
図。FIG. 10 is a diagram showing one embodiment of a sensor according to the present invention.
【図１１】本発明に係るセンサの一実施態様を示した
図。FIG. 11 is a diagram showing one embodiment of a sensor according to the present invention.
【図１２】本発明に係るセンサを用いた検出装置におけ
る電気的構成の一実施態様を示した図。FIG. 12 is a diagram showing one embodiment of an electrical configuration in a detection device using the sensor according to the present invention.
【図１３】本発明に係るセンサを用いた検出装置を模式
的に示した図。FIG. 13 is a diagram schematically showing a detection device using the sensor according to the present invention.
【図１４】本発明に係るセンサを用いた検出装置を模式
的に示した図。FIG. 14 is a diagram schematically showing a detection device using the sensor according to the present invention.
【図１５】本発明に係るセンサを用いた検出装置の一実
施態様を示した図。FIG. 15 is a diagram showing one embodiment of a detection device using the sensor according to the present invention.
【図１６】実施例２３におけるＨＢＶ−ＤＮＡの検出限
界を示した図。FIG. 16 is a diagram showing the detection limit of HBV-DNA in Example 23.
１０、２０、３０、４０、５０、６１、１３１、１３２
……電極 １１、９３、９４、１０４、１０５、１０６……導電体 １２、３５、５４、９１、９２……基板 １０１、１０２、１０３、１２１、１２２……基板 １３、３１、３２、５１……開口部 １４、３３、５３……絶縁体 １５……接着層 ３４、５５……リード線 ５２……参照電極 ６２、９５、９６、１０７、１０８、１０９、１１０…
…核酸 ６３……反応槽 ６４、１２５……電源 ６５、１２６、１３５……電流計 ６６、１２７、１
３６……電圧計 ６７、１２８、１３７……可変抵抗 ６８……対極 ７０、８０、１５０……検出装置 ７１……電極固定
ホルダ ７２……反応槽 ７３……第１洗浄槽 ７４……挿
入剤溶液槽 ７４……挿入剤溶液槽 ７５……第２洗浄槽 ７６
……電気化学測定槽 ７７……移動装置 ７８……分析ユニット ７９…
…操作ユニット ８１……試料搬入口 ８２……試料搬送ユニット ８３……試料調製ユニット ８４……制御ユニット ８５……廃棄物保管ユニット ８６……廃液保管ユニ
ット ８７……試薬供給ユニット ８８……分析ユニット
１１２……スペーサ １３３……キャピラリー １４１、１５８……送液ポ
ンプ １４２、１５３……注入部 １４３……測定装置 １４４、１５２……溶液タンク １４５、１５４……
廃液タンク １５１……固定ホルダ １５５……送液ライン １
５６……測定ユニット １５７……出力端子10, 20, 30, 40, 50, 61, 131, 132
... Electrode 11, 93, 94, 104, 105, 106 ... Conductor 12, 35, 54, 91, 92 ... Substrate 101, 102, 103, 121, 122 ... Substrate 13, 31, 32, 51 ... ... Openings 14, 33, 53... Insulator 15... Adhesive layers 34, 55... Lead wires 52... Reference electrodes 62, 95, 96, 107, 108, 109, 110.
... Nucleic acid 63 ... Reaction tank 64,125 ... Power supply 65,126,135 ... Ammeter 66,127,1
36 voltmeter 67, 128, 137 variable resistance 68 counter electrode 70, 80, 150 detection device 71 electrode fixing holder 72 reaction tank 73 first cleaning tank 74 insertion agent Solution tank 74 ... Inserting agent solution tank 75 ... Second cleaning tank 76
... Electrochemical measurement tank 77 ... Transfer device 78 ... Analysis unit 79 ...
... Operation unit 81 ... Sample loading port 82 ... Sample transport unit 83 ... Sample preparation unit 84 ... Control unit 85 ... Waste storage unit 86 ... Waste liquid storage unit 87 ... Reagent supply unit 88 ... Analysis unit
112 ... spacer 133 ... capillary 141, 158 ... liquid sending pump 142, 153 ... injection part 143 ... measuring device 144, 152 ... solution tank 145, 154 ...
Waste liquid tank 151 Fixed holder 155 Liquid sending line 1
56: Measurement unit 157: Output terminal
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石森 義雄 神奈川県川崎市幸区小向東芝町１番地 株 式会社東芝研究開発センター内 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing from the front page (72) Inventor Yoshio Ishimori 1 Tokoba, Komukai Toshiba-cho, Saisaki-ku, Kawasaki-shi, Kanagawa Prefecture
Claims (5)
つ被覆した絶縁体と、 前記導電体を露出するよう前記絶縁体に設けた開口部
と、 前記開口部より露出した前記導電体に固定化した核酸
と、を具備したことを特徴とする電極。A substrate, a conductor disposed on the substrate, an insulator covering a surface of the conductor while securing a connection region to the outside, and an insulator covering the conductor so as to expose the conductor. An electrode, comprising: an opening provided; and a nucleic acid immobilized on the conductor exposed from the opening.
と、前記導電体の表面を、外部に対する接続領域を確保
しつつ被覆した絶縁体と、前記導電体を露出するよう前
記絶縁体に設けた開口部と、前記開口部より露出した前
記導電体に固定化した第１の核酸とを有する電極と、 前記電極に固定化された第１の核酸と第２の核酸とを共
存させ、設定した条件下でハイブリダイゼーションを実
行する反応部と、 前記電極に固定化された第１の核酸に電圧を印加する印
加手段と、 前記印加手段の動作によって生じた信号を測定する測定
手段と、を具備したことを特徴とする検出装置。2. A substrate, a conductor disposed on the substrate, an insulator covering a surface of the conductor while securing a connection area to the outside, and an insulator covering the conductor so as to expose the conductor. An electrode having the provided opening, the first nucleic acid immobilized on the conductor exposed from the opening, and the first nucleic acid and the second nucleic acid immobilized on the electrode, A reaction unit that performs hybridization under set conditions, an application unit that applies a voltage to the first nucleic acid immobilized on the electrode, and a measurement unit that measures a signal generated by the operation of the application unit. A detection device comprising:
な最小の面積を有する領域内に固定化した電極と、 前記電極に固定化された第１の核酸と前記第２の核酸と
を共存させ、設定した条件下でハイブリダイゼーション
を実行する反応部と、 前記電極に固定化された第１の核酸に電圧を印加する印
加手段と、 前記印加手段の動作によって生じた信号を測定する測定
手段と、を具備したことを特徴とする検出装置。3. An electrode in which a first nucleic acid is immobilized in a region having a minimum area required for detection of a second nucleic acid; a first nucleic acid immobilized on the electrode; A reaction unit that coexists with nucleic acid and performs hybridization under set conditions; an application unit that applies a voltage to the first nucleic acid immobilized on the electrode; and a signal generated by the operation of the application unit. A detection device comprising: a measuring unit for measuring.
第２の核酸に対して第３の核酸がハイブリッドを形成で
きるように配置された第２の電極と、 前記第１および前記第２の電極に接続された電源と、 前記電源の動作によって生じた信号を測定する測定手段
と、を具備したことを特徴とする検出装置。4. A first electrode on which a first nucleic acid is immobilized, and a second nucleic acid is immobilized, and a third nucleic acid can form a hybrid with the first and second nucleic acids. And a power supply connected to the first and second electrodes, and measuring means for measuring a signal generated by the operation of the power supply. Detection device.
第２の核酸に対して第３の核酸がハイブリッドを形成で
きるように配置された第２の電極と、を具備したことを
特徴とするセンサ。5. A first electrode on which a first nucleic acid is immobilized, and a second nucleic acid is immobilized, and a third nucleic acid can form a hybrid with the first and second nucleic acids. And a second electrode arranged as described above.
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