JPH10117793A - Production of adenosine-5'-phosphosulfate or its derivative - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject compound useful as a raw material for medicines in high yield by reacting an adenosine-5'-triphosphate(ATP) with a sulfate as a reactant in the presence of an ATP sulfurylase and a pyrophosphatase. SOLUTION: An adenosine-5'-triphosphate of the formula (R1 and R2 are each H, an alkyl, a carboxyalkyl, benzoyl or carboxybenzoyl; R3 is H or OH; R4 and R5 are each H, OH or a halogen; R1 -N-R2 may be H, OH or a halogen), etc., or its derivative is reacted with a sulfate as a reactant in the presence of an adenosine-5'-triphosphate sulfurylase and a pyrophosphatase at >=55 deg.C to give the objective high-purity adenosine-5'-triphosphate or its derivative in high yield and on an industrial scale.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品又はその原
料として有用なアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその
誘導体の製造方法に関するものである。The present invention relates to a method for producing adenosine-5'-phosphosulfate or a derivative thereof useful as a drug or a raw material thereof.

【０００２】[0002]

【従来の技術】３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ
硫酸（以下ＰＡＰＳという。）は、糖やプロテオグルカ
ン、タンパク質の硫酸化の硫酸基供与体としての役割、
生体内に侵入した異物を硫酸抱合により***する際の硫
酸基供与体としての役割等が知られている。このＰＡＰ
Ｓの前駆体であるアデノシン−５’−ホスホ硫酸（以下
ＡＰＳという。）及びその誘導体は、医薬品又はその原
料としての利用が期待されている。このＡＰＳを得る方
法としては、アデノシン−５’−一リン酸（以下ＡＭＰ
という。）と三酸化硫黄ピリジン錯塩から合成する方法
〔ジャーナル オブ ケミカル ソサイエティー (J.Ch
em.Soc.),1067(1957) 〕やＰＡＰＳを３’−ヌクレオチ
ダーゼとインキュベートする方法〔アナリティカル バ
イオケミストリー(Analytical Biochemistry),74,623-6
26(1976)〕等が知られている。BACKGROUND OF THE INVENTION 3'-Phosphoadenosine-5'-phosphosulfate (hereinafter referred to as PAPS) plays a role as a sulfate group donor for sulfation of sugars, proteoglycans and proteins,
It is known that it functions as a sulfate group donor when excreting foreign substances that have entered the living body by sulfate conjugation. This PAP
Adenosine-5'-phosphosulfate (hereinafter referred to as APS), which is a precursor of S, and its derivatives are expected to be used as pharmaceuticals or raw materials thereof. As a method for obtaining this APS, adenosine-5'-monophosphate (hereinafter referred to as AMP) is used.
That. ) And sulfur trioxide pyridine complex [Journal of Chemical Society (J.Ch
em. Soc.), 1067 (1957)] and a method of incubating PAPS with 3'-nucleotidase (Analytical Biochemistry, 74, 623-6).
26 (1976)].

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の方法の
うちのＡＭＰと三酸化硫黄ピリジン錯塩とを用いる方法
では、副生成物が生じることから反応及び精製の収率が
悪く、さらに、高純度のＡＰＳを得ることが困難であっ
た。また、ＰＡＰＳから合成する方法では、原料のＰＡ
ＰＳが高価で不安定なため工業的なＡＰＳの製造法とは
ならなかった。本発明は、ＡＰＳ又はその誘導体を高収
率で、かつ高純度で、しかも工業的スケールで製造する
ことのできるＡＰＳ又はその誘導体の製造方法を提供す
ることを目的とするものである。However, in the above-mentioned method using AMP and sulfur trioxide pyridine complex salt, the yield of the reaction and purification is low due to the formation of by-products. It was difficult to obtain APS. In the method of synthesizing from PAPS, PA
Since PS was expensive and unstable, it did not become an industrial method for producing APS. An object of the present invention is to provide a method for producing APS or a derivative thereof, which can produce APS or a derivative thereof with high yield and high purity on an industrial scale.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意検討の結果、アデノシン−
５’−三リン酸（以下ＡＴＰという。）又はその誘導体
と、スルフェートとを反応基質として用い、ＡＴＰスル
フリラーゼとピロホスファターゼとを共存させて反応を
行うことによりＡＰＳ又はその誘導体を収率よく製造す
ることができ、さらに精製が容易となるため、工業的ス
ケールで高純度でＡＰＳ及びその誘導体を得ることがで
きるということを見出し、本発明に到達した。すなわ
ち、第１の発明は、ＡＴＰ又はその誘導体と、スルフェ
ートとを反応基質として用い、ＡＴＰスルフリラーゼと
ピロホスファターゼとを共存させて反応を行うことを特
徴とするＡＰＳ又はその誘導体の製造方法を要旨とする
ものである。また、第２の発明は、反応を５５℃以上で
行う上記のＡＰＳ又はその誘導体の製造方法を要旨とす
るものである。さらに、第３の発明は、ＡＴＰスルフリ
ラーゼとピロホスファターゼを担体に固定化して用いる
上記のＡＰＳ又はその誘導体の製造方法を要旨とするも
のである。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in order to solve such problems, and as a result, have found that adenosine-
Using ATP sulfurylase and pyrophosphatase in the coexistence of 5′-triphosphate (hereinafter referred to as ATP) or a derivative thereof and sulfate as a reaction substrate, APS or a derivative thereof is produced in good yield. The present inventors have found that APS and its derivatives can be obtained with high purity on an industrial scale because the purification can be easily performed, and the present invention has been achieved. That is, the first invention provides a method for producing APS or a derivative thereof, which comprises using ATP or a derivative thereof and sulfate as a reaction substrate, and performing the reaction in the presence of ATP sulfurylase and pyrophosphatase. Is what you do. In addition, a second invention is directed to a method for producing APS or a derivative thereof in which the reaction is performed at 55 ° C. or higher. Further, the third invention provides a method for producing APS or a derivative thereof using ATP sulfurylase and pyrophosphatase immobilized on a carrier.

【０００５】[0005]

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるＡＴＰの誘導体としては、下記一般
式で示されるような誘導体（但し、Ｒ₁,Ｒ₂,Ｒ₄,Ｒ₅ が
Ｈで、Ｒ₃ がＯＨのときはＡＴＰである。）が挙げら
れ、具体的には、デオキシアデノシン−５’−三リン酸
（以下ｄＡＴＰという。）、Ｎ⁶ −メチルアデノン−
５’−三リン酸、Ｎ⁶,Ｎ⁶ −ジメチルアデノシン−５’
−三リン酸、Ｎ⁶ −カルボキシメチルアデノシン−５’
−三リン酸、Ｎ⁶ −ベンゾイルアデノシン−５’−三リ
ン酸、８−ブロモアデノシン−５’−三リン酸、２−ク
ロロアデノシン−５’−三リン酸、Ｎ⁶ −メチルデオキ
シアデノシン−５’−三リン酸、Ｎ⁶ −カルボキシメチ
ルデオキシアデノシン−５’−三リン酸、Ｎ⁶ −ベンゾ
イルデオキシアデノシン−５’−三リン酸、８−ブロモ
デオキシアデノシン−５’−三リン酸、２−クロロデオ
キシアデノシン−５’−三リン酸等が挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The derivative of ATP used in the present invention is a derivative represented by the following general formula (however, when R ₁ , R ₂ , R ₄ and R ₅ are H and R ₃ is OH, it is ATP). Specifically, deoxyadenosine-5'-triphosphate (hereinafter referred to as dATP), N ⁶ -methyladenone-
5'-triphosphate, N ^6, N ⁶ - dimethyl adenosine 5 '
- triphosphate, N ⁶ - carboxymethyl adenosine 5 '
- triphosphate, N ⁶ - benzoyl-5'-triphosphate, 8-bromo-5'-triphosphate, 2-chloro-adenosine-5'-triphosphate, N ⁶ - methyl deoxyadenosine -5 '- triphosphate, N ⁶ - carboxymethyl-deoxyadenosine-5'-triphosphate, N ⁶ - benzoyl-deoxyadenosine-5'-triphosphate, 8-bromo-deoxyadenosine-5'-triphosphate, 2 Chlorodeoxyadenosine-5'-triphosphate and the like.

【０００６】[0006]

【化１】 Embedded image

【０００７】（Ｒ₁,Ｒ₂ ：Ｈ又はアルキル基、カルボキ
シアルキル基、ベンゾイル基、カルボキシベンゾイル
基、 Ｒ₃ ：Ｈ又はＯＨ、 Ｒ₄,Ｒ₅ ：Ｈ又はＯＨ、ハロゲンを表す。Ｒ₁ −Ｎ−Ｒ
₂ はＨ又はＯＨ、ハロゲンであってもよい。）[0007] (R _1, R _2: H or an alkyl group, carboxyalkyl group, a benzoyl group, carboxy benzoyl group, R _3: H or _{OH, R 4, R 5:} H or OH, halogen .R ₁ - NR
₂ may be H, OH, or halogen. )

【０００８】また、本発明に用いられるスルフェートと
しては、硫酸イオンを遊離する化合物であれば特に限定
されるものではなく、例えば硫酸マグネシウム、硫酸ア
ンモニウム、硫酸ナトリウム等が挙げられる。[0008] The sulfate used in the present invention is not particularly limited as long as it is a compound capable of releasing sulfate ions, and examples thereof include magnesium sulfate, ammonium sulfate and sodium sulfate.

【０００９】本発明に用いられるＡＴＰスルフリラーゼ
（硫酸アデニルトランスフェラーゼEC2.7.7.4 ）とし
ては、スルフェートの存在下でＡＴＰ又はその誘導体の
５’−リン酸を硫酸化し得るものであればどのようなＡ
ＴＰスルフリラーゼでもよく、酵素の特異性や由来等に
よらず適用できる。このようなＡＴＰスルフリラーゼと
しては、例えば、バチルス・ステアロサーモフィラス
（B.stearothermophillus)や酵母菌（Yeast)等から、抽
出、精製して得ることができる。As the ATP sulfurylase (adenyl sulfate transferase EC 2.7.7.4) used in the present invention, any ATP sulfurylase capable of sulfating 5′-phosphate of ATP or its derivative in the presence of sulfate can be used.
TP sulfurylase may be used and can be applied regardless of the specificity or origin of the enzyme. Such ATP sulfurylase can be obtained by, for example, extracting and purifying from Bacillus stearothermophillus, yeast, and the like.

【００１０】また、本発明に用いられるピロホスファタ
ーゼ（ピロリン酸ホスホハイドロラーゼ EC 3.6.1.1 ）
としては、ピロリン酸をリン酸に加水分解し得るもので
あればどのようなピロホスファターゼでもよく、酵素の
特異性や由来等によらず適用できる。このようなピロホ
スファターゼとしては、例えば、バチルス・ステアロサ
ーモフィラス（B.stearothermophillus)、酵母菌（Yeas
t)等より、抽出、精製して得ることができる。The pyrophosphatase (pyrophosphate phosphohydrolase EC 3.6.1.1) used in the present invention
Any pyrophosphatase may be used as long as it can hydrolyze pyrophosphate into phosphoric acid, and can be applied regardless of the specificity or origin of the enzyme. Examples of such a pyrophosphatase include Bacillus stearothermophillus and yeast (Yeas).
It can be obtained by extraction and purification according to t) and the like.

【００１１】本発明のＡＰＳ又はその誘導体の製造方法
は、ＡＴＰスルフリラーゼの触媒作用によりＡＴＰ又は
その誘導体の５’−リン酸を硫酸化させる反応（式１）
と、生成したピロリン酸をピロホスファターゼの触媒作
用によりリン酸に加水分解させる反応（式２）からな
る。本発明においては、生成したピロリン酸を加水分解
することにより、反応の平衡がＡＰＳ又はその誘導体の
生成に傾くため、ＡＰＳ又はその誘導体を高収率で製造
することができる。The process for producing APS or a derivative thereof according to the present invention comprises a reaction for sulfated 5′-phosphate of ATP or a derivative thereof by the catalytic action of ATP sulfurylase (formula 1).
And a reaction (formula 2) for hydrolyzing the generated pyrophosphate to phosphoric acid by the catalytic action of pyrophosphatase. In the present invention, by hydrolyzing the generated pyrophosphoric acid, the reaction equilibrium tends to produce APS or a derivative thereof, so that APS or a derivative thereof can be produced in high yield.

【００１２】[0012]

【化２】 Embedded image

【００１３】本発明のＡＰＳ又はその誘導体の製造方法
としては、同一の反応器の中にＡＴＰ又はその誘導体
と、スルフェートと、ＡＴＰスルフリラーゼ及びピロホ
スファターゼとを共存させて反応させればよい。In the method for producing APS or a derivative thereof according to the present invention, ATP or a derivative thereof, sulfate, ATP sulfurylase and pyrophosphatase are allowed to react in the same reactor.

【００１４】ＡＴＰスルフリラーゼ及びピロホスファタ
ーゼの量としては、合成を終了するまでの時間と関連し
て変動するが、特に限定されるものではなく、最大５０
０ｕ／ミリリットル程度の範囲で使用できる。通常は
０．１ｍｕ／ミリリットル〜１００ｕ／ミリリットル、
さらに実用的には５ｍｕ／ミリリットル〜１０ｕ／ミリ
リットルの範囲で使用することが好ましい。また、ＡＴ
Ｐスルフリラーゼ及びピロホスファターゼの比率として
は、ピロホスファターゼ／ＡＴＰスルフリラーゼの活性
比が、０．１以上が好ましく、特に１〜５０が好まし
い。The amounts of ATP sulfurylase and pyrophosphatase vary depending on the time until completion of the synthesis, but are not particularly limited.
It can be used in a range of about 0 u / milliliter. Usually 0.1 mu / ml to 100 u / ml,
More practically, it is preferable to use in the range of 5 mu / milliliter to 10 u / milliliter. Also, AT
As the ratio of P sulfurylase and pyrophosphatase, the activity ratio of pyrophosphatase / ATP sulfurylase is preferably 0.1 or more, particularly preferably 1 to 50.

【００１５】ＡＴＰ又はその誘導体の濃度としては、特
に限定されるものではないが、１μＭ以上、実用的には
１００μＭ以上が適当である。スルフェートの濃度とし
ては、１μＭ以上、実用的には１００μＭ以上が適当で
あり、ＡＴＰ及びその誘導体の濃度の当量以上が好まし
い。The concentration of ATP or a derivative thereof is not particularly limited, but is suitably 1 μM or more, and practically 100 μM or more. The concentration of sulfate is suitably 1 μM or more, and practically 100 μM or more, and is preferably equal to or more than the concentration of ATP and its derivatives.

【００１６】また、反応時には、ＡＴＰと相互作用し、
反応を効率的に進めるために、マグネシウムイオンを添
加することが好ましく、その量としては、ＡＴＰ又はそ
の誘導体の当量以上が好ましく、特に１〜３当量が好ま
しい。At the time of the reaction, it interacts with ATP,
To promote the reaction efficiently, it is preferable to add magnesium ion, and the amount is preferably equal to or more than the equivalent of ATP or a derivative thereof, and particularly preferably 1 to 3 equivalents.

【００１７】反応時のｐＨとしては、酵素によって異な
るが、中性付近、すなわち、ｐＨ５〜１１が好ましく、
特にｐＨ６〜９が好ましい。通常はこれらのｐＨの緩衝
液を用いてｐＨを調整すればよい。緩衝液としては、こ
れらｐＨに適した通常のものを使用することができ、具
体的には、トリス塩酸、リン酸、イミダゾール、グリシ
ン等が挙げられる。The pH at the time of the reaction varies depending on the enzyme, but is preferably around neutral, that is, pH 5 to 11,
Particularly, pH 6 to 9 is preferable. Usually, the pH may be adjusted by using a buffer having such a pH. As the buffer, a normal buffer suitable for these pHs can be used, and specific examples include Tris-HCl, phosphoric acid, imidazole, glycine and the like.

【００１８】また、反応時の温度としては、酵素の失活
が起こらず、反応がスムーズに進行する範囲であれば特
に限定されるものではなく、通常２０〜８０℃で行えば
よいが、本発明においては、５５℃以上で行うとＡＰＳ
の生成量が著しく多くなる。特に５５〜８０℃で行うこ
とが好ましく、さらには６０〜７５℃で行うことが好ま
しい。The temperature during the reaction is not particularly limited as long as the enzyme does not deactivate and the reaction proceeds smoothly. Usually, the temperature may be 20 to 80 ° C. In the present invention, APS is performed at 55 ° C. or more.
Is significantly increased. In particular, it is preferably performed at 55 to 80 ° C, and more preferably at 60 to 75 ° C.

【００１９】本発明においてはＡＴＰスルフリラーゼ及
びピロホスファターゼを適当な担体、例えばセルロー
ス、デキストラン、アガロース等のような多糖類の誘導
体、ポリスチレン、エチレン−マレイン酸共重合体、架
橋ポリアクリルアミド等のようなビニルポリマーの誘導
体、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸共重合体、ポリア
スパラギン酸等のようなポリアミノ酸又はアミドの誘導
体、ガラス、アルミナ、ヒドロキシアパタイト等のよう
な無機物の誘導体等に結合、包含あるいは吸着させて、
いわゆる固定化酵素として用いると、効率的かつ連続的
にＡＰＳ及びその誘導体を製造することができるので好
ましい。特にガラスビーズにグルタルアルデヒドを用い
て固定化すると酵素の失活が少なく、効率的に固定化す
ることができるので好ましい。このとき、アデノシン−
５’−三リン酸スルフリラーゼとピロホスファターゼと
を混合して同じ担体に固定化して用いてもよく、アデノ
シン−５’−三リン酸スルフリラーゼとピロホスファタ
ーゼとを別々の担体に固定化し、混合して用いてもよ
い。In the present invention, ATP sulfurylase and pyrophosphatase are converted to a suitable carrier, for example, a polysaccharide derivative such as cellulose, dextran or agarose, or a vinyl such as polystyrene, ethylene-maleic acid copolymer or cross-linked polyacrylamide. Binding, inclusion or adsorption to derivatives of polymers, derivatives of polyamino acids or amides such as L-alanine, L-glutamic acid copolymer, polyaspartic acid, etc., and inorganic derivatives such as glass, alumina, hydroxyapatite, etc. hand,
It is preferable to use it as a so-called immobilized enzyme because APS and its derivatives can be produced efficiently and continuously. In particular, it is preferable to immobilize glass beads using glutaraldehyde because the enzyme is less inactivated and the immobilization can be performed efficiently. At this time, adenosine-
5′-Triphosphate sulphurylase and pyrophosphatase may be mixed and immobilized on the same carrier for use, or adenosine-5′-triphosphate sulphurylase and pyrophosphatase may be immobilized on separate carriers and mixed. May be used.

【００２０】固定化の方法としては、例えば担体として
ガラスビーズを用いる場合には、ガラスビーズとグルタ
ルアルデヒドとを反応させた後、酵素を添加することに
より固定化することができる。このときのガラスビーズ
としては、グルタルアルデヒドと反応する官能基を有し
ていれば特に限定されるものではなく、このような官能
基としては、アミノ基が挙げられ、具体的には、アミノ
プロピル基、アミノエチル基、ジエチルアミノエチル
基、アミノシラン誘導体等が挙げられる。また、ガラス
ビーズとしては、多孔性のものが好ましい。グルタルア
ルデヒドとしては、特に限定されるものではなく市販の
２５重量％水溶液を用いればよい。As a method of immobilization, for example, when glass beads are used as a carrier, the glass beads can be reacted with glutaraldehyde and then immobilized by adding an enzyme. The glass beads at this time are not particularly limited as long as they have a functional group that reacts with glutaraldehyde. Examples of such a functional group include an amino group, and specifically, aminopropyl. Group, aminoethyl group, diethylaminoethyl group, aminosilane derivative and the like. Further, the glass beads are preferably porous. Glutaraldehyde is not particularly limited, and a commercially available 25% by weight aqueous solution may be used.

【００２１】グルタルアルデヒドの量としては、ガラス
ビーズのグルタルアルデヒドと反応する官能基の等モル
以上であることが好ましく、特に、２〜５０倍が好まし
い。また、反応の温度としては、０〜８０℃で行うこと
が好ましく、室温で行えばよい。また、反応時には反応
液を攪拌することが好ましい。担体に固定化する酵素量
としては、アデノシン−５’−三リン酸スルフリラーゼ
とピロホスファターゼとを同時に固定化する場合は、担
体１ｇに対して、アデノシン−５’−三リン酸スルフリ
ラーゼを５０〜５０００ｕ、好ましくは１００〜１００
０ｕと、ピロホスファターゼをアデノシン−５’−三リ
ン酸スルフリラーゼのユニット数の１／２〜１００量、
好ましくは１〜２０量を加えて攪拌し固定化すればよ
い。また、別々に固定化する場合は、担体０．５ｇに対
して、アデノシン−５’−三リン酸スルフリラーゼを５
０〜５０００ｕ、好ましくは１００〜１０００ｕと、別
に、担体０．５ｇに対して、ピロホスファターゼをアデ
ノシン−５’−三リン酸スルフリラーゼのユニット数の
１／２〜１００量、好ましくは１〜２０量を加えて攪拌
し固定化すればよい。The amount of glutaraldehyde is preferably at least equimolar to the functional group which reacts with glutaraldehyde of the glass beads, and particularly preferably 2 to 50 times. The reaction is preferably performed at a temperature of 0 to 80 ° C., and may be performed at room temperature. It is preferable to stir the reaction solution during the reaction. When adenosine-5'-triphosphate sulfurylase and pyrophosphatase are simultaneously immobilized on the carrier, the amount of enzyme to be immobilized on the carrier is 50 to 5000 u / a of adenosine-5'-triphosphate sulfurylase per 1 g of the carrier. , Preferably 100 to 100
0u, the pyrophosphatase is １ ／ to 100 times the number of units of adenosine-5′-triphosphate sulfurylase,
Preferably, 1 to 20 volumes may be added, and the mixture may be stirred and fixed. When immobilized separately, 5 g of adenosine-5'-triphosphate sulfurylase is added to 0.5 g of the carrier.
0 to 5000 u, preferably 100 to 1000 u, and separately, 0.5 g of the carrier, the amount of pyrophosphatase is 1/2 to 100, preferably 1 to 20 of the number of units of adenosine-5'-triphosphate sulfurylase. May be added, stirred and fixed.

【００２２】反応に用いられる反応器としては、反応を
スムーズに進行させるものであればいかなるものでもよ
く、各々の酵素量、基質液の濃度、ｐＨ及び供給速度、
反応温度等によって反応器の大きさ及び形状を選定すれ
ばよい。その反応器の形状としては、例えば、膜型の反
応器、カラム型の反応器を使用することができる。カラ
ム型の反応器を用いる場合の反応基質液の通液速度とし
ては、カラム型反応器の形状及び固定化単体の体積当た
りの酵素量などに依存し、転化率を調整することができ
るが、線速度で０．０１〜１００ｃｍ／分、好ましくは
０・１〜１０ｃｍ／分であり、体積速度では、０．００
１〜１００ミリリットル／分、好ましくは０．０５〜１
０ミリリットル／分である。The reactor used for the reaction may be any reactor as long as the reaction proceeds smoothly. The amount of each enzyme, the concentration of the substrate solution, the pH and the supply rate,
The size and shape of the reactor may be selected according to the reaction temperature and the like. As the shape of the reactor, for example, a membrane reactor or a column reactor can be used. The flow rate of the reaction substrate solution when using a column-type reactor depends on the shape of the column-type reactor and the amount of enzyme per volume of the immobilized substance, and the conversion can be adjusted. The linear velocity is 0.01 to 100 cm / min, preferably 0.1 to 10 cm / min, and the volume velocity is 0.00
1 to 100 ml / min, preferably 0.05 to 1
0 ml / min.

【００２３】上述の反応器は、連続的に操作することを
前提として説明したものであるが、このような思想に基
づいて他の反応器を用いることもできるし、場合によっ
ては、バッチ式の反応器を使用してバッチ式に操作して
反応させることもできる。The above-described reactor has been described on the assumption that it is operated continuously. However, other reactors can be used based on such a concept, and in some cases, a batch-type reactor is used. The reaction can also be carried out in a batch manner using a reactor.

【００２４】以下に本発明において用いられる測定法及
び使用酵素の活性測定法を解説する。 （１）ＡＴＰスルフリラーゼの活性測定 以下に示す組成の反応液を３０℃に保ち、適量の酵素試
料液を加えて以下に示す反応を開始する。１０分後に３
Ｎの硫酸を０．０５ミリリットル加え反応を停止する。
反応終了後のリン酸濃度を、和光純薬工業株式会社製無
機リン酸測定試薬ホスファＣ−テストワコーにより定量
する。１分間に２μmol のリン酸、すなわち１μmol の
ピロリン酸が生成するＡＴＰスルフリラーゼの量を１ｕ
とする。The measuring method used in the present invention and the method for measuring the activity of the enzyme used are described below. (1) Measurement of ATP sulfurylase activity A reaction solution having the composition shown below is kept at 30 ° C., and an appropriate amount of an enzyme sample solution is added to initiate a reaction shown below. 3 after 10 minutes
The reaction is stopped by adding 0.05 ml of N sulfuric acid.
The phosphoric acid concentration after the completion of the reaction is quantified using Wako Pure Chemical Industries, Ltd., inorganic phosphoric acid measuring reagent Phospha C-Test Wako. The amount of ATP sulfurylase that produces 2 μmol of phosphoric acid per minute, ie 1 μmol of pyrophosphate, is reduced to 1 u
And

【００２５】 反応液組成（総量０．５ミリリットルとする） トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８） １００ｍＭ 塩化マグネシウム １０ｍＭ モリブデン酸ナトリウム １０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ピロホスファターゼ（シグマ社製） ０．４ｕ／ミリリットル 試料（ＡＴＰスルフリラーゼ溶液） 適量Reaction solution composition (total volume 0.5 ml) Tris-HCl buffer (pH 8) 100 mM magnesium chloride 10 mM sodium molybdate 10 mM ATP 10 mM pyrophosphatase (Sigma) 0.4 u / milliliter Sample (ATP sulfurylase solution) ) Appropriate amount

【００２６】[0026]

【化３】 Embedded image

【００２７】（２）ピロホスファターゼの活性測定 以下に示す組成の反応液を３０℃に保ち適量の酵素試料
液を加えて以下に示す反応を開始する。１０分後に３Ｎ
の硫酸を０．０５ミリリットル加え反応を停止する。反
応終了後のリン酸濃度を、和光純薬工業株式会社製無機
リン酸測定試薬ホスファＣーテストワコーにより定量す
る。１分間に２μmol のリン酸、すなわち１μmol のピ
ロリン酸が生成するピロホスファターゼの量を１ｕとす
る。(2) Measurement of activity of pyrophosphatase A reaction solution having the composition shown below is kept at 30 ° C., and an appropriate amount of an enzyme sample solution is added to initiate a reaction shown below. 3N after 10 minutes
The reaction is stopped by adding 0.05 ml of sulfuric acid. The phosphoric acid concentration after the completion of the reaction is quantified using Wako Pure Chemical Industries, Ltd. inorganic phosphoric acid measuring reagent Phospha C-Test Wako. The amount of pyrophosphatase generated by 2 μmol of phosphoric acid per minute, that is, 1 μmol of pyrophosphate is defined as 1 u.

【００２８】 反応液組成（総量０．５ミリリットルとする） トリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８） １００ｍＭ 塩化マグネシウム ５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム ５ｍＭ 試料（ピロホスファターゼ溶液） 適量Reaction solution composition (total volume 0.5 ml) Tris-HCl buffer (pH 8) 100 mM Magnesium chloride 5 mM Sodium pyrophosphate 5 mM Sample (pyrophosphatase solution)

【００２９】[0029]

【化４】 Embedded image

【００３０】（３）ＨＰＬＣによるＡＰＳ及びその誘導
体の定量法 ウォーターズ社製マイクロボンダパックＣ１８カラムを
用いてＡＰＳ及びその誘導体の定量を行った。移動相と
しては、３ｍＭの過塩素酸テトラブチルアンモニウム及
び３０ｍＭのリン酸１カリウムを含む１５容量％のメタ
ノール水溶液を用い、流速０．６ミリリットル／分、検
出はＵＶの吸収（λ＝２５４ｎｍ）を測定することによ
り行った。(3) Quantification of APS and its derivatives by HPLC APS and its derivatives were quantified using a Micro Bonder Pack C18 column manufactured by Waters. As a mobile phase, a 15% by volume aqueous methanol solution containing 3 mM tetrabutylammonium perchlorate and 30 mM monopotassium phosphate was used. The flow rate was 0.6 ml / min, and the detection was by UV absorption (λ = 254 nm). It was performed by measuring.

【００３１】[0031]

【実施例】【Example】

次に、本発明を実施例によって具体的に説明する。 参考例１ グルコース１重量％、酵母エキス１重量％、リン酸０．
１重量％及び若干のミネラル類を含んだ培地を殺菌した
後、ｐＨを６．５に調整し、バチルス・ステアロサーモ
フィラスＮＣＡ１５０３株（ＦＥＲＭ Ｐ−４７７８）
を接種し、培養を行った。６０℃で３時間培養後、培地
中のグルコースが消費されたことを確認し、遠心分離に
て湿菌体を得た。得られた湿菌体を凍結融解法で破砕し
た後、硫安を用いて除核酸を行い、生じた沈殿を遠心分
離により除去して、粗酵素液を得た。Next, the present invention will be specifically described with reference to examples. Reference Example 1 1% by weight of glucose, 1% by weight of yeast extract, and 0.1% of phosphoric acid.
After sterilizing a medium containing 1% by weight and some minerals, the pH was adjusted to 6.5, and Bacillus stearothermophilus NCA1503 strain (FERM P-4778) was used.
Was inoculated and cultured. After culturing at 60 ° C. for 3 hours, it was confirmed that glucose in the medium was consumed, and wet cells were obtained by centrifugation. After the obtained wet cells were crushed by freeze-thaw method, nucleic acid was removed using ammonium sulfate, and the resulting precipitate was removed by centrifugation to obtain a crude enzyme solution.

【００３２】あらかじめ５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース
（ファルマシア社製）カラムに粗酵素液をアプライして
ＡＴＰスルフリラーゼを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄
した後、同緩衝液を用いて０から５００ｍＭの塩化ナト
リウムの直線濃度勾配にて溶出を行った。その活性画分
を回収し、１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを加えた。
この活性画分を１Ｍの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ
のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニ
ルセファロース（ファルマシア社製）カラムにアプライ
した。同緩衝液で十分洗浄した後、５０ｍＭのトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出した。得られた活性画分
を回収し、濃縮・透析後、５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したマトリックスゲルブルーＡ
（アミコン社製）カラムにアプライした。同緩衝液で十
分洗浄した後、１Ｍの塩化カリウムを含む同緩衝液で溶
出した。得られた活性画分を回収し、濃縮後、ポリアク
リルアミド電気泳動を行ったところ、単一なバンドが得
られた。得られたＡＴＰスルフリラーゼの比活性は１
１．１ｕ／ｍｇであった。The crude enzyme solution was applied to a DEAE-Sepharose (Pharmacia) column which had been equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) in advance, and ATP sulfurylase was adsorbed. Using the same buffer, elution was performed with a linear concentration gradient of 0 to 500 mM sodium chloride. The active fraction was collected, and ammonium sulfate was added to 1 M.
This active fraction was treated with 50 mM containing 1 M ammonium sulfate.
Was applied to a phenyl sepharose (Pharmacia) column equilibrated with a Tris-HCl buffer solution (pH 8.0). After sufficiently washing with the same buffer, elution was carried out with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). The obtained active fraction was collected, concentrated and dialyzed, and then matrix gel blue A equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0).
(Amicon) column. After sufficient washing with the same buffer, elution was carried out with the same buffer containing 1 M potassium chloride. The obtained active fraction was collected, concentrated, and subjected to polyacrylamide electrophoresis. As a result, a single band was obtained. The specific activity of the obtained ATP sulfurylase is 1
1.1 u / mg.

【００３３】参考例２ 酵母（サッカロミセス・セルビシエ ATCC 7752)を用
い、ｐＨ７．５、３７℃で６時間培養した以外は参考例
１と同様にしてＡＴＰスルフリラーゼを得た。Reference Example 2 ATP sulfurylase was obtained in the same manner as in Reference Example 1 except that yeast (Saccharomyces cerevisiae ATCC 7752) was used and cultured at pH 7.5 and 37 ° C. for 6 hours.

【００３４】参考例３ サーマス・フラバス（ATCC 33923）を用い、ｐＨ７．
０、６５℃で４時間培養した以外は参考例１と同様にし
てＡＴＰスルフリラーゼを得た。Reference Example 3 The pH was adjusted to 7.0 using Thermus Flavas (ATCC 33923).
ATP sulfurylase was obtained in the same manner as in Reference Example 1 except that the cells were cultured at 0 and 65 ° C. for 4 hours.

【００３５】参考例４ バチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３株
（ＦＥＲＭ Ｐ−４７７８）を用い、参考例１と同様に
して粗酵素液を得た。あらかじめ２５ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース
（ファルマシア社製）カラムに粗酵素液をアプライして
ピロホスファターゼを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄し
た後、同緩衝液を用いて０から５００ｍＭの塩化カリウ
ムの直線濃度勾配にて溶出を行った。その活性画分を回
収し、１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを加えた。この
活性画分を１Ｍの硫酸アンモニウムを含む２５ｍＭのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したフェニルセファ
ロース（ファルマシア社製）カラムにアプライした。同
緩衝液で十分洗浄した後、２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で溶出した。得られた活性画分を回収し、濃
縮後、２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化
したセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラ
ムにアプライした。同緩衝液で溶出し、得られた活性画
分を回収し、濃縮・透析後、ポリアクリルアミド電気泳
動を行ったところ、単一なバンドが得られた。得られた
ピロホスファターゼの比活性は７１．４ｕ／ｍｇであっ
た。Reference Example 4 A crude enzyme solution was obtained in the same manner as in Reference Example 1 using Bacillus stearothermophilus NCA1503 strain (FERM P-4778). The crude enzyme solution was applied to a DEAE-Sepharose (Pharmacia) column previously equilibrated with a 25 mM phosphate buffer (pH 7.5) to adsorb pyrophosphatase, washed sufficiently with the same buffer, and then washed with the same buffer. The solution was eluted with a linear gradient of 0 to 500 mM potassium chloride. The active fraction was collected, and ammonium sulfate was added to 1 M. The active fraction was applied to a phenyl sepharose (Pharmacia) column equilibrated with 25 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 M ammonium sulfate. After washing thoroughly with the same buffer, 25 mM phosphate buffer (p
H7.5). The obtained active fraction was collected, concentrated, and then applied to a Sephadex G-25 (Pharmacia) column equilibrated with 25 mM phosphate buffer (pH 7.5). After elution with the same buffer, the obtained active fraction was collected, concentrated and dialyzed, and subjected to polyacrylamide electrophoresis, whereby a single band was obtained. The specific activity of the obtained pyrophosphatase was 71.4 u / mg.

【００３６】実施例１ 容量１５０リットルの反応恒温槽に、０．５ｍＭのＡＴ
Ｐ、５０ｍＭの硫酸ナトリウム及び５ｍＭの塩化マグネ
シウムを含む１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液１００リッ
トルを調製し、水酸化ナトリウムにてｐＨを８に調整
後、７０℃に保温した。これに参考例１で取得したバチ
ルス・ステアロサーモフィラス由来のＡＴＰスルフリラ
ーゼ４００００ｕと、シグマ社（米国）より購入した酵
母由来のピロホスファターゼ（製品番号 I-1643)２３１
０００ｕを加えて７０℃で反応を行った。２４時間反応
させた後、限外ろ過膜により酵素液を分離し、酵素液は
次の使用のために４℃にて保存した。酵素液を分離した
反応液をＨＰＬＣにより分析したところ、４０mmolのＡ
ＰＳが生成していた。ＡＴＰに対する転化率は８０％で
あった。Example 1 0.5 mM of AT was placed in a 150 liter reaction thermostat.
P, 100 liters of 100 mM Tris-HCl buffer containing 50 mM sodium sulfate and 5 mM magnesium chloride was prepared, adjusted to pH 8 with sodium hydroxide, and kept at 70 ° C. 40000u of ATP sulfurylase derived from Bacillus stearothermophilus obtained in Reference Example 1 and pyrophosphatase derived from yeast (product number I-1643) 231 purchased from Sigma (USA)
000u was added and the reaction was performed at 70 ° C. After reacting for 24 hours, the enzyme solution was separated by an ultrafiltration membrane, and the enzyme solution was stored at 4 ° C. for the next use. The reaction solution from which the enzyme solution was separated was analyzed by HPLC to find that 40 mmol of A
PS had generated. The conversion to ATP was 80%.

【００３７】次に、酵素液を除いた反応液を５０リット
ルのＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社製）カラ
ムにアプライし、０から４００ｍＭの塩化ナトリウムの
直線濃度勾配にて溶出を行ってＡＰＳ水溶液を得た。得
られたＡＰＳ水溶液を逆浸透膜ＮＴＲ−７２５０（日東
電工社製）にて濃縮脱塩し、これを凍結乾燥することに
より１６．０ｇのＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末を得た。ＡＰ
Ｓ・２Ｎａの構造をＮＭＲで確認した後、ＨＰＬＣ分析
を行ったところ、得られたＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末の純
度は９９．５％であった。Next, the reaction solution from which the enzyme solution had been removed was applied to a 50 liter DEAE-Sepharose (Pharmacia) column, and eluted with a linear concentration gradient of 0 to 400 mM sodium chloride to obtain an APS aqueous solution. Was. The obtained APS aqueous solution was concentrated and desalted with a reverse osmosis membrane NTR-7250 (manufactured by Nitto Denko Corporation), and lyophilized to obtain 16.0 g of APS · 2Na white powder. AP
After confirming the structure of S.2Na by NMR, HPLC analysis was performed. As a result, the purity of the obtained APS.2Na white powder was 99.5%.

【００３８】実施例２ 参考例２で取得した酵母由来のＡＴＰスルフリラーゼを
用いた以外は実施例１と同様にしてＡＰＳを製造した。
２４時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣにより分析し
たところ、３６mmolのＡＰＳが生成していた。このとき
のＡＴＰに対する転化率は７２％であった。さらに、実
施例１と同様に単離精製したところ、１３．０ｇのＡＰ
Ｓ・２Ｎａ白色粉末が得られた。この粉末の構造をＮＭ
Ｒで確認した後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、純度は
９９．４％であった。Example 2 An APS was produced in the same manner as in Example 1 except that the yeast-derived ATP sulfurylase obtained in Reference Example 2 was used.
After reacting for 24 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC, and it was found that 36 mmol of APS had been formed. At this time, the conversion rate to ATP was 72%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 13.0 g of AP was obtained.
An S · 2Na white powder was obtained. The structure of this powder is NM
After confirmation by R, HPLC analysis revealed a purity of 99.4%.

【００３９】実施例３ ＡＴＰの代わりにｄＡＴＰを用いた以外は実施例１と同
様にしてデオキシアデノシン−５’−ホスホ硫酸（以下
ｄＡＰＳという。）を製造した。２４時間反応させた
後、反応液をＨＰＬＣにより分析したところ、３４mmol
のｄＡＰＳが生成していた。このときのｄＡＴＰに対す
る転化率は６８％であった。さらに、実施例１と同様に
単離精製したところ、１１．９ｇのｄＡＰＳ・２Ｎａ白
色粉末が得られた。この粉末の構造をＮＭＲで確認した
後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、純度は９９．３％で
あった。Example 3 Deoxyadenosine-5'-phosphosulfate (hereinafter referred to as dAPS) was produced in the same manner as in Example 1 except that dATP was used instead of ATP. After reacting for 24 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC to find that 34 mmol
Of dAPS had been generated. At this time, the conversion with respect to dATP was 68%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 11.9 g of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of the powder by NMR, HPLC analysis revealed that the purity was 99.3%.

【００４０】実施例４ ＡＴＰの代わりｄＡＴＰを用いた以外は実施例２と同様
にしてｄＡＰＳを製造した。２４時間反応させた後、反
応液をＨＰＬＣにより分析したところ、３５mmolのｄＡ
ＰＳが生成していた。このときのｄＡＴＰに対する転化
率は７０％であった。さらに、実施例１と同様に単離精
製したところ、１２．１ｇのｄＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末
が得られた。この粉末の構造をＮＭＲで確認した後、Ｈ
ＰＬＣ分析を行ったところ、純度は９９．５％であっ
た。Example 4 A dAPS was produced in the same manner as in Example 2 except that dATP was used instead of ATP. After reacting for 24 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC to find that 35 mmol of dA
PS had generated. At this time, the conversion with respect to dATP was 70%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 12.1 g of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, H
As a result of PLC analysis, the purity was 99.5%.

【００４１】実施例５ ３つ首のガラス製反応器（容量１５０リットル）の２つ
の首に管をつけて平膜限外ろ過膜器（ミリポア社製）に
つないだ。これに１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）を２５０ミリリットル加え、１リットル／ｈｒの流
速で循環させた。このとき、反応器全体を７０℃に保っ
た。この反応器の別の入口から、参考例３で取得したサ
ーマスフラバス由来のＡＴＰスルフリラーゼを４００ｕ
及び参考例４で取得したバチルス・ステアロサーモフィ
ラス由来のピロホスファターゼ２３１０ｕを加え、そこ
へさらに管をつけ、循環液と同じ緩衝液に溶かした０．
５ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭの硫酸ナトリウム、５ｍＭの
塩化マグネシウム混合液を５０ミリリットル／ｈｒの割
合で加えた。上記の限外ろ過膜を通った溶液の一部を５
０ミリリットル／ｈｒの割合で連続的に回収し、４℃に
て保存した。この反応を７０℃で７２時間行い、３．６
リットルの反応液を得た。この反応液をＨＰＬＣにより
分析したところ、１．３mmolのＡＰＳが生成していた。
このときのＡＴＰに対する転化率は７２％であった。さ
らに、実施例１と同様に単離精製したところ、０．４９
ｇのＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末が得られた。この粉末の構
造をＮＭＲで確認した後、ＨＰＬＣ分析を行ったとこ
ろ、純度は９９．５％であった。Example 5 A three-necked glass reactor (capacity: 150 liters) was connected to a flat membrane ultrafiltration membrane (manufactured by Millipore) by attaching tubes to the two necks. Add 100 mM Tris-HCl buffer (pH
8) was added and circulated at a flow rate of 1 liter / hr. At this time, the entire reactor was kept at 70 ° C. From another inlet of this reactor, 400 u of the ATP sulfurylase derived from the thermus flavus obtained in Reference Example 3 was added.
Further, 2310 u of pyrophosphatase derived from Bacillus stearothermophilus obtained in Reference Example 4 was added thereto, and a tube was further added thereto, and dissolved in the same buffer as the circulating fluid.
A mixed solution of 5 mM ATP, 50 mM sodium sulfate, and 5 mM magnesium chloride was added at a rate of 50 ml / hr. Part of the solution passed through the ultrafiltration membrane
It was continuously collected at a rate of 0 ml / hr and stored at 4 ° C. The reaction is carried out at 70 ° C. for 72 hours, 3.6
One liter of the reaction solution was obtained. When this reaction solution was analyzed by HPLC, 1.3 mmol of APS was generated.
At this time, the conversion rate to ATP was 72%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 0.49
g of APS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, HPLC analysis was performed. As a result, the purity was 99.5%.

【００４２】参考例５ 直径５cmのバイアル瓶にELECTRO-NUCREONICS社製のAmin
opropil Controlled Pore Grass(以下Aminopropil-CPG
という。粒子サイズ；１２０／２００メッシュ、孔径；５０
０Å）を１ｇ採取し、２５重量％のグルタルアルデヒド
を３０ml添加後、アスピレーターで１５分間脱気してグ
ルタルアルデヒドを反応させた。上澄みのグルタルアル
デヒドを除去した後、蒸留水で数回洗浄した。このバイ
アル瓶に参考例１で作製したＡＴＰスルフリラーゼを３
００ｕと、シグマ社製酵母由来のピロポスファターゼ
（製品番号 I-1643 ）を１６００ｕ加え、室温（約２０
℃）で、旋回攪拌機 RCC-100HS（アングル角度４５度、
回転５rpm ）で回転、攪拌して酵素の固定化反応を行っ
た。９０分間反応させた後、上清を採取し、ＡＴＰスル
フリラーゼ及びピロホスファターゼの残存活性を測定し
たところ、ＡＴＰスルフリラーゼは５０ｕ、ピロホスフ
ァターゼは２１０ｕであった。このようにして、ＡＴＰ
スルフリラーゼ２５０ｕとピロホスファターゼ１３９０
ｕとを固定化したガラスビーズ（Aminopropil-CPG ）１
ｇを得た。Reference Example 5 Amin made by ELECTRO-NUCREONICS was placed in a vial having a diameter of 5 cm.
opropil Controlled Pore Grass (Aminopropil-CPG
That. Particle size: 120/200 mesh, pore size: 50
0 g) was collected, 30 ml of 25% by weight glutaraldehyde was added, and the mixture was degassed with an aspirator for 15 minutes to react with glutaraldehyde. After removing glutaraldehyde in the supernatant, the resultant was washed several times with distilled water. The ATP sulfurylase prepared in Reference Example 1 was added to this vial vial 3
00u and 1600 u of pyrosphosphatase (product number I-1643) derived from Sigma yeast, and the mixture was added at room temperature (about 20
° C), with a rotary stirrer RCC-100HS (angle angle 45 degrees,
The mixture was rotated at a speed of 5 rpm and stirred to carry out the enzyme immobilization reaction. After reacting for 90 minutes, the supernatant was collected and the residual activities of ATP sulfurylase and pyrophosphatase were measured. As a result, ATP sulfurylase was 50 u, and pyrophosphatase was 210 u. Thus, ATP
Sulfurylase 250u and pyrophosphatase 1390
glass beads immobilized with u (Aminopropil-CPG) 1
g was obtained.

【００４３】参考例６ 参考例２で作製したＡＴＰスルフリラーゼを用いた以外
は参考例５と同様にして酵素を固定化したガラスビーズ
１ｇを得た。Reference Example 6 1 g of glass beads on which an enzyme was immobilized was obtained in the same manner as in Reference Example 5, except that the ATP sulfurylase prepared in Reference Example 2 was used.

【００４４】参考例７ 直径５cmのバイアル瓶にELECTRO-NUCREONICS社製のAmin
opropil-CPG （粒子サイズ；１２０／２００メッシュ、孔
径；５００Å）を１ｇ採取し、２５重量％のグルタルア
ルデヒドを３０ml添加した後、アスピレーターで１５分
間脱気した。上澄みのグルタルアルデヒドを除去した
後、蒸留水で数回洗浄し、０．５ｇずつ２つのバイアル
瓶に分けた。一方のバイアル瓶に参考例１で作製したＡ
ＴＰスルフリラーゼを３００ｕ加え、もう一方のバイア
ル瓶にシグマ社製酵母由来のピロホスファターゼ（製品
番号 I-1643 ）を１６００ｕ加えて、それぞれ室温（約
２０℃）で、旋回攪拌機 RCC-100HS（アングル角度４５
度、回転５rpm ）で回転、攪拌して酵素の固定化反応を
行った。９０分間反応させた後、それぞれのバイアル瓶
の上清を採取し、ＡＴＰスルフリラーゼ及びピロポスフ
ァターゼの残存活性を測定したところ、ＡＴＰスルフリ
ラーゼは５０ｕ、ピロホスファターゼは２１０ｕであっ
た。このようにしてＡＴＰスルフリラーゼ２５０ユニッ
トを固定したガラスビーズ０．５ｇと、ピロホスファタ
ーゼ１３９０ｕを固定したガラスビーズ０．５ｇをそれ
ぞれ得た。Reference Example 7 Amin manufactured by ELECTRO-NUCREONICS was placed in a vial having a diameter of 5 cm.
1 g of opropil-CPG (particle size; 120/200 mesh, pore size: 500 °) was sampled, and 30 ml of 25% by weight glutaraldehyde was added, followed by degassing with an aspirator for 15 minutes. After removing the glutaraldehyde in the supernatant, it was washed several times with distilled water and divided into two vials of 0.5 g each. A prepared in Reference Example 1 in one vial
300 u of TP sulfurylase was added, and 1600 u of yeast-derived pyrophosphatase (product number I-1643) was added to the other vial, and each was stirred at room temperature (about 20 ° C) with a rotary agitator RCC-100HS (angle angle 45).
The mixture was rotated and stirred at 5 rpm to perform an immobilization reaction of the enzyme. After reacting for 90 minutes, the supernatant of each vial was collected and the residual activity of ATP sulfurylase and pyrophosphatase was measured. As a result, ATP sulfurylase was 50 u, and pyrophosphatase was 210 u. Thus, 0.5 g of glass beads having 250 units of ATP sulfurylase immobilized thereon and 0.5 g of glass beads having 1390 u of pyrophosphatase immobilized thereon were obtained.

【００４５】参考例８ 参考例１で作製したＡＴＰスルフリラーゼに代えて参考
例２で作製したＡＴＰスルフリラーゼを用いた以外は参
考例７と同様にしてＡＴＰスルフリラーゼを固定化した
ガラスビーズを作製した。Reference Example 8 Glass beads having ATP sulfurylase immobilized thereon were produced in the same manner as in Reference Example 7, except that the ATP sulfurylase produced in Reference Example 2 was used instead of the ATP sulfurylase produced in Reference Example 1.

【００４６】実施例６ 直径１０mmのカラムに、参考例５で作製した酵素を固定
化したガラスビーズ１ｇを充填し、７０℃でインキュベ
ートした。このカラムに１００ｍＭのトリス塩酸緩衝
液、０．２ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭの硫酸ナトリウム、
５ｍＭの塩化マグネシウムを含むＡＰＳ合成基質液を、
塩酸にてｐＨを８に調整後、０．３ml/minの流速で１５
００ml通液した。カラム通過液をＨＰＬＣにより分析し
たところ２３０μmol のＡＰＳが生成していた。ＡＴＰ
に対する転化率は７７％であった。酵素液を除いた反応
液を５０mlのＤＥＡＥ−セファロース（ファルマシア社
製）カラムに供与し、０から４００ｍＭの塩化ナトリウ
ム勾配溶液で展開してＡＰＳを分離した。ＡＰＳ水溶液
はさらに逆浸透膜ＮＴＲ−７２５０にて濃縮脱塩し、こ
れを凍結乾燥することにより７５mgのＡＰＳ・２Ｎａ白
色粉末を得た。ＮＭＲで構造を確認した後、ＨＰＬＣ分
析を行ったところ純度は９９．３％であった。Example 6 A column having a diameter of 10 mm was filled with 1 g of glass beads on which the enzyme prepared in Reference Example 5 was immobilized, and incubated at 70 ° C. The column contains 100 mM Tris-HCl buffer, 0.2 mM ATP, 50 mM sodium sulfate,
APS synthesis substrate solution containing 5 mM magnesium chloride,
After adjusting the pH to 8 with hydrochloric acid, the pH was adjusted to 15 at a flow rate of 0.3 ml / min.
The solution was passed through 00 ml. Analysis of the liquid passed through the column by HPLC revealed that 230 μmol of APS had been formed. ATP
The conversion with respect to was 77%. The reaction solution from which the enzyme solution had been removed was applied to a 50 ml DEAE-Sepharose (Pharmacia) column, and developed with a 0 to 400 mM sodium chloride gradient solution to separate APS. The APS aqueous solution was further concentrated and desalted with a reverse osmosis membrane NTR-7250 and freeze-dried to obtain 75 mg of APS · 2Na white powder. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 99.3%.

【００４７】実施例７ 参考例６で作製した酵素を固定化したガラスビーズを用
いた以外は実施例６と同様にしてＡＰＳを製造した。カ
ラム通過液をＨＰＬＣにより分析したところ２１０μmo
l のＡＰＳが生成していた。ＡＴＰに対する転化率は７
０％であった。さらに、実施例６と同様に単離精製する
ことにより６４mgのＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末を得た。Ｎ
ＭＲで構造を確認した後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ
純度は９９．２％であった。Example 7 An APS was produced in the same manner as in Example 6, except that the enzyme-immobilized glass beads prepared in Reference Example 6 were used. When the liquid passed through the column was analyzed by HPLC,
l APS had been generated. Conversion rate to ATP is 7
It was 0%. Further, by isolation and purification in the same manner as in Example 6, 64 mg of APS.2Na white powder was obtained. N
After confirming the structure by MR, HPLC analysis revealed a purity of 99.2%.

【００４８】実施例８ ＡＴＰの代わりにｄＡＴＰを用いた以外は実施例６と同
様にしてｄＡＰＳを製造した。カラム通過液をＨＰＬＣ
により分析したところ２０５μmol のｄＡＰＳが生成し
ていた。ｄＡＴＰに対する転化率は６８％であった。さ
らに、実施例６と同様に単離精製することにより６１mg
のｄＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末を得た。ＮＭＲで構造を確
認した後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ純度は９９．２
％であった。Example 8 A dAPS was produced in the same manner as in Example 6, except that dATP was used instead of ATP. HPLC of the liquid passing through the column
As a result, 205 μmol of dAPS was formed. The conversion to dATP was 68%. Further, by isolating and purifying in the same manner as in Example 6, 61 mg
Of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 99.2.
%Met.

【００４９】実施例９ ＡＴＰの代わりにｄＡＴＰを用いた以外は実施例７と同
様にしてｄＡＰＳを製造した。カラム通過液をＨＰＬＣ
により分析したところ、２００μmol のｄＡＰＳが生成
していた。ｄＡＴＰに対する転化率は６７％であった。
さらに、実施例６と同様に単離精製することにより５９
mgのｄＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末を得た。ＮＭＲで構造を
確認した後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ純度は９９．
０％であった。Example 9 A dAPS was produced in the same manner as in Example 7 except that dATP was used instead of ATP. HPLC of the liquid passing through the column
As a result, 200 μmol of dAPS was produced. The conversion to dATP was 67%.
Further, isolation and purification were performed in the same manner as in Example 6 to obtain 59
mg of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 99.
It was 0%.

【００５０】実施例１０ 参考例７で作製した２種類の酵素を固定化したガラスビ
ーズを０．５ｇずつ混合し、直径１０mmのカラムに充填
して７０℃でインキュベートした。このカラムに１００
ｍＭのトリス塩酸緩衝液、０．２ｍＭのＡＴＰ、５０ｍ
Ｍの硫酸ナトリウム、５ｍＭの塩化マグネシウムを含む
ＡＰＳ合成基質液を、塩酸にてｐＨを８に調整後、０．
３ml/minの流速で１５００ml通液した。カラム通過液を
ＨＰＬＣにより分析したところ２２０μmol のＡＰＳが
生成していた。ＡＴＰに対する転化率は７３％であっ
た。さらに、実施例６と同様に単離精製することにより
７０mgのＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末を得た。ＮＭＲで構造
を確認した後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ純度は９
９．３％であった。Example 10 Glass beads immobilized with two kinds of enzymes prepared in Reference Example 7 were mixed in an amount of 0.5 g each, packed in a column having a diameter of 10 mm, and incubated at 70 ° C. 100 in this column
mM Tris-HCl buffer, 0.2 mM ATP, 50 m
After adjusting the pH of an APS synthetic substrate solution containing sodium sulfate of 5M and 5 mM of magnesium chloride to 8 with hydrochloric acid, the pH of the solution was adjusted to 0.1.
1500 ml of liquid was passed at a flow rate of 3 ml / min. Analysis of the liquid passed through the column by HPLC revealed that 220 μmol of APS had been formed. The conversion to ATP was 73%. Furthermore, 70 mg of APS · 2Na white powder was obtained by isolation and purification in the same manner as in Example 6. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 9
It was 9.3%.

【００５１】実施例１１ 参考例７で作製したＡＴＰスルフリラーゼを固定化した
ガラスビーズに代えて参考例８で作製したＡＴＰスルフ
リラーゼを固定化したガラスビーズを用いた以外は実施
例１０と同様にしてＡＰＳを製造した。カラム通過液を
ＨＰＬＣにより分析したところ、２０８μmol のＡＰＳ
が生成していた。ＡＴＰに対する転化率は６９％であっ
た。さらに、実施例６と同様に単離精製することにより
６７mgのＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末を得た。ＮＭＲで構造
を確認した後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ純度は９
９．０％であった。Example 11 APS was performed in the same manner as in Example 10 except that the ATP sulfurylase-immobilized glass beads prepared in Reference Example 8 were replaced with the ATP sulfurylase-immobilized glass beads prepared in Reference Example 7. Was manufactured. When the liquid passed through the column was analyzed by HPLC, 208 μmol of APS
Had been generated. The conversion to ATP was 69%. Further, isolation and purification were performed in the same manner as in Example 6 to obtain 67 mg of APS.2Na white powder. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 9
It was 9.0%.

【００５２】実施例１２ ＡＴＰの代わりにｄＡＴＰを用いた以外は実施例１０と
同様にしてｄＡＰＳを製造した。カラム通過液をＨＰＬ
Ｃにより分析したところ、２００μmol のｄＡＰＳが生
成していた。ｄＡＴＰに対する転化率は６７％であっ
た。さらに、実施例６と同様に単離精製することにより
６０mgのｄＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末を得た。ＮＭＲで構
造を確認した後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ純度は９
９．１％であった。Example 12 A dAPS was produced in the same manner as in Example 10 except that dATP was used instead of ATP. HPL is applied to the column
Analysis by C revealed that 200 μmol of dAPS had been formed. The conversion to dATP was 67%. Further, by isolating and purifying in the same manner as in Example 6, 60 mg of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 9
9.1%.

【００５３】実施例１３ ＡＴＰの代わりｄＡＴＰを用いた以外は実施例１１と同
様にしてｄＡＰＳを製造した。カラム通過液をＨＰＬＣ
により分析したところ２０５μmol のｄＡＰＳが生成し
ていた。ｄＡＴＰに対する転化率は６８％であった。さ
らに、実施例６と同様に単離精製することにより６２mg
のｄＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末を得た。ＮＭＲで構造を確
認した後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ純度は９９．１
％であった。Example 13 A dAPS was produced in the same manner as in Example 11 except that dATP was used instead of ATP. HPLC of the liquid passing through the column
As a result, 205 μmol of dAPS was formed. The conversion to dATP was 68%. Further, by isolating and purifying in the same manner as in Example 6, 62 mg
Of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed that the purity was 99.1.
%Met.

【００５４】実施例１４ 反応を４０℃で行う以外は実施例１と同様にしてＡＰＳ
を製造した。２４時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣ
により分析したところ、２０mmolのＡＰＳが生成してい
た。このときのＡＴＰに対する転化率は４０％であっ
た。反応を５０℃で行うと７０℃で行った場合に比べて
転化率が下がった。さらに、実施例１と同様に単離精製
したところ、７．５ｇのＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末が得ら
れた。この粉末の構造をＮＭＲで確認した後、ＨＰＬＣ
分析を行ったところ、純度は９９．１％であった。Example 14 APS was carried out in the same manner as in Example 1 except that the reaction was carried out at 40 ° C.
Was manufactured. After reacting for 24 hours, the reaction solution was
As a result, 20 mmol of APS was produced. At this time, the conversion rate to ATP was 40%. When the reaction was performed at 50 ° C., the conversion was lower than when the reaction was performed at 70 ° C. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 7.5 g of APS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, HPLC
Upon analysis, the purity was 99.1%.

【００５５】実施例１５ 参考例２で取得した酵母由来のＡＴＰスルフリラーゼを
用いた以外は実施例１４と同様にしてＡＰＳを製造し
た。２４時間反応させた後、反応液をＨＰＬＣにより分
析したところ、１７mmolのＡＰＳが生成していた。この
ときのＡＴＰに対する転化率は３４％であった。さら
に、実施例１と同様に単離精製したところ、６．４ｇの
ＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末が得られた。この粉末の構造を
ＮＭＲで確認した後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、純
度は９９．０％であった。Example 15 An APS was produced in the same manner as in Example 14 except that the yeast-derived ATP sulfurylase obtained in Reference Example 2 was used. After reacting for 24 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC, and it was found that 17 mmol of APS had been formed. At this time, the conversion rate to ATP was 34%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 6.4 g of APS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, HPLC analysis was performed, and the purity was 99.0%.

【００５６】実施例１６ ＡＴＰの代わりにｄＡＴＰを用いた以外は実施例１４と
同様にしてｄＡＰＳを製造した。２４時間反応させた
後、反応液をＨＰＬＣにより分析したところ、１５mmol
のｄＡＰＳが生成していた。このときのｄＡＴＰに対す
る転化率は３４％であった。さらに、実施例１と同様に
単離精製したところ、５．７ｇのｄＡＰＳ・２Ｎａ白色
粉末が得られた。この粉末の構造をＮＭＲで確認した
後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、純度は９９．１％で
あった。Example 16 dAPS was produced in the same manner as in Example 14 except that dATP was used instead of ATP. After reacting for 24 hours, the reaction mixture was analyzed by HPLC to find that 15 mmol
Of dAPS had been generated. At this time, the conversion with respect to dATP was 34%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 5.7 g of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of the powder by NMR, HPLC analysis revealed that the purity was 99.1%.

【００５７】実施例１７ ＡＴＰの代わりｄＡＴＰを用いた以外は実施例１５と同
様にしてｄＡＰＳを製造した。２４時間反応させた後、
反応液をＨＰＬＣにより分析したところ、１４mmolのｄ
ＡＰＳが生成していた。このときのｄＡＴＰに対する転
化率は３４％であった。さらに、実施例１と同様に単離
精製したところ、５．３ｇのｄＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末
が得られた。この粉末の構造をＮＭＲで確認した後、Ｈ
ＰＬＣ分析を行ったところ、純度は９９．２％であっ
た。Example 17 A dAPS was produced in the same manner as in Example 15 except that dATP was used instead of ATP. After reacting for 24 hours,
When the reaction solution was analyzed by HPLC, 14 mmol d
APS was generated. At this time, the conversion with respect to dATP was 34%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 5.3 g of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, H
As a result of PLC analysis, the purity was 99.2%.

【００５８】実施例１８ 反応を４０℃で行う以外は実施例５と同様にしてＡＰＳ
を製造した。７２時間反応後、３．６リットルの反応液
を得た。この反応液をＨＰＬＣにより分析したところ、
０．８mmolのＡＰＳが生成していた。このときのＡＴＰ
に対する転化率は４５％であった。さらに、実施例１と
同様に単離精製したところ、０．３ｇのＡＰＳ・２Ｎａ
白色粉末が得られた。この粉末の構造をＮＭＲで確認し
た後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、純度は９９．０％
であった。Example 18 APS was carried out in the same manner as in Example 5 except that the reaction was carried out at 40 ° C.
Was manufactured. After reacting for 72 hours, 3.6 liters of a reaction solution was obtained. When this reaction solution was analyzed by HPLC,
0.8 mmol of APS had been formed. ATP at this time
The conversion with respect to was 45%. Furthermore, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 0.3 g of APS.2Na
A white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, HPLC analysis was performed, and the purity was 99.0%.
Met.

【００５９】比較例１ ピロホスファターゼを用いない以外は実施例１４と同様
にしてＡＰＳを製造した。２４時間反応させた後、反応
液をＨＰＬＣにより分析したところ、１mmolのＡＰＳが
生成していた。このときのＡＴＰに対する転化率は２％
であった。さらに、実施例１と同様に単離精製したとこ
ろ、０．４ｇのＡＰＳ・２Ｎａ白色粉末が得られた。こ
の粉末の構造をＮＭＲで確認した後、ＨＰＬＣ分析を行
ったところ、純度は９０．０％であった。Comparative Example 1 An APS was produced in the same manner as in Example 14 except that pyrophosphatase was not used. After reacting for 24 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC, and 1 mmol of APS was generated. At this time, the conversion rate to ATP is 2%.
Met. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 0.4 g of APS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of the powder by NMR, HPLC analysis revealed that the purity was 90.0%.

【００６０】[0060]

【発明の効果】本発明によれば、ＡＰＳ又はその誘導体
を高収率で、かつ高純度で、しかも工業的スケールで製
造することができる。According to the present invention, APS or a derivative thereof can be produced in high yield and high purity on an industrial scale.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 名和 和恵 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 下出 綾子 京都府宇治市宇治蔭山55 (72)発明者 恩田 昌明 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 中島 宏 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 ──────────────────────────────────────────────────の Continuing on the front page (72) Inventor Kazue Nawa 23 Uji Kozakura, Uji City, Kyoto Unitika Unit Research & Development Center (72) Inventor Ayako Shimoide 55 Uji Kageyama, Uji City, Kyoto Prefecture (72) Inventor Onda Masaaki 23 Uji Kozakura, Uji City, Kyoto Unitika Central Research Laboratory (72) Inventor Hiroshi Nakajima 23 Uji Kozakura Uji City, Kyoto Prefecture Unitika Central Research Laboratory

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 アデノシン−５’−三リン酸又はその誘
導体と、スルフェートとを反応基質として用い、アデノ
シン−５’−三リン酸スルフリラーゼとピロホスファタ
ーゼとを共存させて反応を行うことを特徴とするアデノ
シン−５’−ホスホ硫酸又はその誘導体の製造方法。The present invention is characterized in that adenosine-5'-triphosphate or a derivative thereof and a sulfate are used as a reaction substrate, and the reaction is carried out in the presence of adenosine-5'-triphosphate sulfurylase and pyrophosphatase. For producing adenosine-5'-phosphosulfate or a derivative thereof. 【請求項２】 反応を５５℃以上で行う請求項１記載の
アデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその誘導体の製造方
法。2. The method according to claim 1, wherein the reaction is carried out at 55 ° C. or higher. 【請求項３】 アデノシン−５’−三リン酸スルフリラ
ーゼ及びピロホスファターゼを担体に固定化して用いる
請求項１記載のアデノシン−５’−ホスホ硫酸又はその
誘導体の製造方法。3. The method for producing adenosine-5′-phosphosulfate or a derivative thereof according to claim 1, wherein adenosine-5′-triphosphate sulfurylase and pyrophosphatase are immobilized on a carrier.