JPH10117793A - Production of adenosine-5'-phosphosulfate or its derivative - Google Patents
Production of adenosine-5'-phosphosulfate or its derivativeInfo
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- JPH10117793A JPH10117793A JP5003797A JP5003797A JPH10117793A JP H10117793 A JPH10117793 A JP H10117793A JP 5003797 A JP5003797 A JP 5003797A JP 5003797 A JP5003797 A JP 5003797A JP H10117793 A JPH10117793 A JP H10117793A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品又はその原
料として有用なアデノシン−5’−ホスホ硫酸又はその
誘導体の製造方法に関するものである。The present invention relates to a method for producing adenosine-5'-phosphosulfate or a derivative thereof useful as a drug or a raw material thereof.
【0002】[0002]
【従来の技術】3’−ホスホアデノシン−5’−ホスホ
硫酸(以下PAPSという。)は、糖やプロテオグルカ
ン、タンパク質の硫酸化の硫酸基供与体としての役割、
生体内に侵入した異物を硫酸抱合により***する際の硫
酸基供与体としての役割等が知られている。このPAP
Sの前駆体であるアデノシン−5’−ホスホ硫酸(以下
APSという。)及びその誘導体は、医薬品又はその原
料としての利用が期待されている。このAPSを得る方
法としては、アデノシン−5’−一リン酸(以下AMP
という。)と三酸化硫黄ピリジン錯塩から合成する方法
〔ジャーナル オブ ケミカル ソサイエティー (J.Ch
em.Soc.),1067(1957) 〕やPAPSを3’−ヌクレオチ
ダーゼとインキュベートする方法〔アナリティカル バ
イオケミストリー(Analytical Biochemistry),74,623-6
26(1976)〕等が知られている。BACKGROUND OF THE INVENTION 3'-Phosphoadenosine-5'-phosphosulfate (hereinafter referred to as PAPS) plays a role as a sulfate group donor for sulfation of sugars, proteoglycans and proteins,
It is known that it functions as a sulfate group donor when excreting foreign substances that have entered the living body by sulfate conjugation. This PAP
Adenosine-5'-phosphosulfate (hereinafter referred to as APS), which is a precursor of S, and its derivatives are expected to be used as pharmaceuticals or raw materials thereof. As a method for obtaining this APS, adenosine-5'-monophosphate (hereinafter referred to as AMP) is used.
That. ) And sulfur trioxide pyridine complex [Journal of Chemical Society (J.Ch
em. Soc.), 1067 (1957)] and a method of incubating PAPS with 3'-nucleotidase (Analytical Biochemistry, 74, 623-6).
26 (1976)].
【0003】[0003]
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の方法の
うちのAMPと三酸化硫黄ピリジン錯塩とを用いる方法
では、副生成物が生じることから反応及び精製の収率が
悪く、さらに、高純度のAPSを得ることが困難であっ
た。また、PAPSから合成する方法では、原料のPA
PSが高価で不安定なため工業的なAPSの製造法とは
ならなかった。本発明は、APS又はその誘導体を高収
率で、かつ高純度で、しかも工業的スケールで製造する
ことのできるAPS又はその誘導体の製造方法を提供す
ることを目的とするものである。However, in the above-mentioned method using AMP and sulfur trioxide pyridine complex salt, the yield of the reaction and purification is low due to the formation of by-products. It was difficult to obtain APS. In the method of synthesizing from PAPS, PA
Since PS was expensive and unstable, it did not become an industrial method for producing APS. An object of the present invention is to provide a method for producing APS or a derivative thereof, which can produce APS or a derivative thereof with high yield and high purity on an industrial scale.
【0004】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な課題を解決するために鋭意検討の結果、アデノシン−
5’−三リン酸(以下ATPという。)又はその誘導体
と、スルフェートとを反応基質として用い、ATPスル
フリラーゼとピロホスファターゼとを共存させて反応を
行うことによりAPS又はその誘導体を収率よく製造す
ることができ、さらに精製が容易となるため、工業的ス
ケールで高純度でAPS及びその誘導体を得ることがで
きるということを見出し、本発明に到達した。すなわ
ち、第1の発明は、ATP又はその誘導体と、スルフェ
ートとを反応基質として用い、ATPスルフリラーゼと
ピロホスファターゼとを共存させて反応を行うことを特
徴とするAPS又はその誘導体の製造方法を要旨とする
ものである。また、第2の発明は、反応を55℃以上で
行う上記のAPS又はその誘導体の製造方法を要旨とす
るものである。さらに、第3の発明は、ATPスルフリ
ラーゼとピロホスファターゼを担体に固定化して用いる
上記のAPS又はその誘導体の製造方法を要旨とするも
のである。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in order to solve such problems, and as a result, have found that adenosine-
Using ATP sulfurylase and pyrophosphatase in the coexistence of 5′-triphosphate (hereinafter referred to as ATP) or a derivative thereof and sulfate as a reaction substrate, APS or a derivative thereof is produced in good yield. The present inventors have found that APS and its derivatives can be obtained with high purity on an industrial scale because the purification can be easily performed, and the present invention has been achieved. That is, the first invention provides a method for producing APS or a derivative thereof, which comprises using ATP or a derivative thereof and sulfate as a reaction substrate, and performing the reaction in the presence of ATP sulfurylase and pyrophosphatase. Is what you do. In addition, a second invention is directed to a method for producing APS or a derivative thereof in which the reaction is performed at 55 ° C. or higher. Further, the third invention provides a method for producing APS or a derivative thereof using ATP sulfurylase and pyrophosphatase immobilized on a carrier.
【0005】[0005]
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるATPの誘導体としては、下記一般
式で示されるような誘導体(但し、R1,R2,R4,R5 が
Hで、R3 がOHのときはATPである。)が挙げら
れ、具体的には、デオキシアデノシン−5’−三リン酸
(以下dATPという。)、N6 −メチルアデノン−
5’−三リン酸、N6,N6 −ジメチルアデノシン−5’
−三リン酸、N6 −カルボキシメチルアデノシン−5’
−三リン酸、N6 −ベンゾイルアデノシン−5’−三リ
ン酸、8−ブロモアデノシン−5’−三リン酸、2−ク
ロロアデノシン−5’−三リン酸、N6 −メチルデオキ
シアデノシン−5’−三リン酸、N6 −カルボキシメチ
ルデオキシアデノシン−5’−三リン酸、N6 −ベンゾ
イルデオキシアデノシン−5’−三リン酸、8−ブロモ
デオキシアデノシン−5’−三リン酸、2−クロロデオ
キシアデノシン−5’−三リン酸等が挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The derivative of ATP used in the present invention is a derivative represented by the following general formula (however, when R 1 , R 2 , R 4 and R 5 are H and R 3 is OH, it is ATP). Specifically, deoxyadenosine-5'-triphosphate (hereinafter referred to as dATP), N 6 -methyladenone-
5'-triphosphate, N 6, N 6 - dimethyl adenosine 5 '
- triphosphate, N 6 - carboxymethyl adenosine 5 '
- triphosphate, N 6 - benzoyl-5'-triphosphate, 8-bromo-5'-triphosphate, 2-chloro-adenosine-5'-triphosphate, N 6 - methyl deoxyadenosine -5 '- triphosphate, N 6 - carboxymethyl-deoxyadenosine-5'-triphosphate, N 6 - benzoyl-deoxyadenosine-5'-triphosphate, 8-bromo-deoxyadenosine-5'-triphosphate, 2 Chlorodeoxyadenosine-5'-triphosphate and the like.
【0006】[0006]
【化1】 Embedded image
【0007】(R1,R2 :H又はアルキル基、カルボキ
シアルキル基、ベンゾイル基、カルボキシベンゾイル
基、 R3 :H又はOH、 R4,R5 :H又はOH、ハロゲンを表す。R1 −N−R
2 はH又はOH、ハロゲンであってもよい。)[0007] (R 1, R 2: H or an alkyl group, carboxyalkyl group, a benzoyl group, carboxy benzoyl group, R 3: H or OH, R 4, R 5: H or OH, halogen .R 1 - NR
2 may be H, OH, or halogen. )
【0008】また、本発明に用いられるスルフェートと
しては、硫酸イオンを遊離する化合物であれば特に限定
されるものではなく、例えば硫酸マグネシウム、硫酸ア
ンモニウム、硫酸ナトリウム等が挙げられる。[0008] The sulfate used in the present invention is not particularly limited as long as it is a compound capable of releasing sulfate ions, and examples thereof include magnesium sulfate, ammonium sulfate and sodium sulfate.
【0009】本発明に用いられるATPスルフリラーゼ
(硫酸アデニルトランスフェラーゼEC2.7.7.4 )とし
ては、スルフェートの存在下でATP又はその誘導体の
5’−リン酸を硫酸化し得るものであればどのようなA
TPスルフリラーゼでもよく、酵素の特異性や由来等に
よらず適用できる。このようなATPスルフリラーゼと
しては、例えば、バチルス・ステアロサーモフィラス
(B.stearothermophillus)や酵母菌(Yeast)等から、抽
出、精製して得ることができる。As the ATP sulfurylase (adenyl sulfate transferase EC 2.7.7.4) used in the present invention, any ATP sulfurylase capable of sulfating 5′-phosphate of ATP or its derivative in the presence of sulfate can be used.
TP sulfurylase may be used and can be applied regardless of the specificity or origin of the enzyme. Such ATP sulfurylase can be obtained by, for example, extracting and purifying from Bacillus stearothermophillus, yeast, and the like.
【0010】また、本発明に用いられるピロホスファタ
ーゼ(ピロリン酸ホスホハイドロラーゼ EC 3.6.1.1 )
としては、ピロリン酸をリン酸に加水分解し得るもので
あればどのようなピロホスファターゼでもよく、酵素の
特異性や由来等によらず適用できる。このようなピロホ
スファターゼとしては、例えば、バチルス・ステアロサ
ーモフィラス(B.stearothermophillus)、酵母菌(Yeas
t)等より、抽出、精製して得ることができる。The pyrophosphatase (pyrophosphate phosphohydrolase EC 3.6.1.1) used in the present invention
Any pyrophosphatase may be used as long as it can hydrolyze pyrophosphate into phosphoric acid, and can be applied regardless of the specificity or origin of the enzyme. Examples of such a pyrophosphatase include Bacillus stearothermophillus and yeast (Yeas).
It can be obtained by extraction and purification according to t) and the like.
【0011】本発明のAPS又はその誘導体の製造方法
は、ATPスルフリラーゼの触媒作用によりATP又は
その誘導体の5’−リン酸を硫酸化させる反応(式1)
と、生成したピロリン酸をピロホスファターゼの触媒作
用によりリン酸に加水分解させる反応(式2)からな
る。本発明においては、生成したピロリン酸を加水分解
することにより、反応の平衡がAPS又はその誘導体の
生成に傾くため、APS又はその誘導体を高収率で製造
することができる。The process for producing APS or a derivative thereof according to the present invention comprises a reaction for sulfated 5′-phosphate of ATP or a derivative thereof by the catalytic action of ATP sulfurylase (formula 1).
And a reaction (formula 2) for hydrolyzing the generated pyrophosphate to phosphoric acid by the catalytic action of pyrophosphatase. In the present invention, by hydrolyzing the generated pyrophosphoric acid, the reaction equilibrium tends to produce APS or a derivative thereof, so that APS or a derivative thereof can be produced in high yield.
【0012】[0012]
【化2】 Embedded image
【0013】本発明のAPS又はその誘導体の製造方法
としては、同一の反応器の中にATP又はその誘導体
と、スルフェートと、ATPスルフリラーゼ及びピロホ
スファターゼとを共存させて反応させればよい。In the method for producing APS or a derivative thereof according to the present invention, ATP or a derivative thereof, sulfate, ATP sulfurylase and pyrophosphatase are allowed to react in the same reactor.
【0014】ATPスルフリラーゼ及びピロホスファタ
ーゼの量としては、合成を終了するまでの時間と関連し
て変動するが、特に限定されるものではなく、最大50
0u/ミリリットル程度の範囲で使用できる。通常は
0.1mu/ミリリットル〜100u/ミリリットル、
さらに実用的には5mu/ミリリットル〜10u/ミリ
リットルの範囲で使用することが好ましい。また、AT
Pスルフリラーゼ及びピロホスファターゼの比率として
は、ピロホスファターゼ/ATPスルフリラーゼの活性
比が、0.1以上が好ましく、特に1〜50が好まし
い。The amounts of ATP sulfurylase and pyrophosphatase vary depending on the time until completion of the synthesis, but are not particularly limited.
It can be used in a range of about 0 u / milliliter. Usually 0.1 mu / ml to 100 u / ml,
More practically, it is preferable to use in the range of 5 mu / milliliter to 10 u / milliliter. Also, AT
As the ratio of P sulfurylase and pyrophosphatase, the activity ratio of pyrophosphatase / ATP sulfurylase is preferably 0.1 or more, particularly preferably 1 to 50.
【0015】ATP又はその誘導体の濃度としては、特
に限定されるものではないが、1μM以上、実用的には
100μM以上が適当である。スルフェートの濃度とし
ては、1μM以上、実用的には100μM以上が適当で
あり、ATP及びその誘導体の濃度の当量以上が好まし
い。The concentration of ATP or a derivative thereof is not particularly limited, but is suitably 1 μM or more, and practically 100 μM or more. The concentration of sulfate is suitably 1 μM or more, and practically 100 μM or more, and is preferably equal to or more than the concentration of ATP and its derivatives.
【0016】また、反応時には、ATPと相互作用し、
反応を効率的に進めるために、マグネシウムイオンを添
加することが好ましく、その量としては、ATP又はそ
の誘導体の当量以上が好ましく、特に1〜3当量が好ま
しい。At the time of the reaction, it interacts with ATP,
To promote the reaction efficiently, it is preferable to add magnesium ion, and the amount is preferably equal to or more than the equivalent of ATP or a derivative thereof, and particularly preferably 1 to 3 equivalents.
【0017】反応時のpHとしては、酵素によって異な
るが、中性付近、すなわち、pH5〜11が好ましく、
特にpH6〜9が好ましい。通常はこれらのpHの緩衝
液を用いてpHを調整すればよい。緩衝液としては、こ
れらpHに適した通常のものを使用することができ、具
体的には、トリス塩酸、リン酸、イミダゾール、グリシ
ン等が挙げられる。The pH at the time of the reaction varies depending on the enzyme, but is preferably around neutral, that is, pH 5 to 11,
Particularly, pH 6 to 9 is preferable. Usually, the pH may be adjusted by using a buffer having such a pH. As the buffer, a normal buffer suitable for these pHs can be used, and specific examples include Tris-HCl, phosphoric acid, imidazole, glycine and the like.
【0018】また、反応時の温度としては、酵素の失活
が起こらず、反応がスムーズに進行する範囲であれば特
に限定されるものではなく、通常20〜80℃で行えば
よいが、本発明においては、55℃以上で行うとAPS
の生成量が著しく多くなる。特に55〜80℃で行うこ
とが好ましく、さらには60〜75℃で行うことが好ま
しい。The temperature during the reaction is not particularly limited as long as the enzyme does not deactivate and the reaction proceeds smoothly. Usually, the temperature may be 20 to 80 ° C. In the present invention, APS is performed at 55 ° C. or more.
Is significantly increased. In particular, it is preferably performed at 55 to 80 ° C, and more preferably at 60 to 75 ° C.
【0019】本発明においてはATPスルフリラーゼ及
びピロホスファターゼを適当な担体、例えばセルロー
ス、デキストラン、アガロース等のような多糖類の誘導
体、ポリスチレン、エチレン−マレイン酸共重合体、架
橋ポリアクリルアミド等のようなビニルポリマーの誘導
体、L−アラニン、L−グルタミン酸共重合体、ポリア
スパラギン酸等のようなポリアミノ酸又はアミドの誘導
体、ガラス、アルミナ、ヒドロキシアパタイト等のよう
な無機物の誘導体等に結合、包含あるいは吸着させて、
いわゆる固定化酵素として用いると、効率的かつ連続的
にAPS及びその誘導体を製造することができるので好
ましい。特にガラスビーズにグルタルアルデヒドを用い
て固定化すると酵素の失活が少なく、効率的に固定化す
ることができるので好ましい。このとき、アデノシン−
5’−三リン酸スルフリラーゼとピロホスファターゼと
を混合して同じ担体に固定化して用いてもよく、アデノ
シン−5’−三リン酸スルフリラーゼとピロホスファタ
ーゼとを別々の担体に固定化し、混合して用いてもよ
い。In the present invention, ATP sulfurylase and pyrophosphatase are converted to a suitable carrier, for example, a polysaccharide derivative such as cellulose, dextran or agarose, or a vinyl such as polystyrene, ethylene-maleic acid copolymer or cross-linked polyacrylamide. Binding, inclusion or adsorption to derivatives of polymers, derivatives of polyamino acids or amides such as L-alanine, L-glutamic acid copolymer, polyaspartic acid, etc., and inorganic derivatives such as glass, alumina, hydroxyapatite, etc. hand,
It is preferable to use it as a so-called immobilized enzyme because APS and its derivatives can be produced efficiently and continuously. In particular, it is preferable to immobilize glass beads using glutaraldehyde because the enzyme is less inactivated and the immobilization can be performed efficiently. At this time, adenosine-
5′-Triphosphate sulphurylase and pyrophosphatase may be mixed and immobilized on the same carrier for use, or adenosine-5′-triphosphate sulphurylase and pyrophosphatase may be immobilized on separate carriers and mixed. May be used.
【0020】固定化の方法としては、例えば担体として
ガラスビーズを用いる場合には、ガラスビーズとグルタ
ルアルデヒドとを反応させた後、酵素を添加することに
より固定化することができる。このときのガラスビーズ
としては、グルタルアルデヒドと反応する官能基を有し
ていれば特に限定されるものではなく、このような官能
基としては、アミノ基が挙げられ、具体的には、アミノ
プロピル基、アミノエチル基、ジエチルアミノエチル
基、アミノシラン誘導体等が挙げられる。また、ガラス
ビーズとしては、多孔性のものが好ましい。グルタルア
ルデヒドとしては、特に限定されるものではなく市販の
25重量%水溶液を用いればよい。As a method of immobilization, for example, when glass beads are used as a carrier, the glass beads can be reacted with glutaraldehyde and then immobilized by adding an enzyme. The glass beads at this time are not particularly limited as long as they have a functional group that reacts with glutaraldehyde. Examples of such a functional group include an amino group, and specifically, aminopropyl. Group, aminoethyl group, diethylaminoethyl group, aminosilane derivative and the like. Further, the glass beads are preferably porous. Glutaraldehyde is not particularly limited, and a commercially available 25% by weight aqueous solution may be used.
【0021】グルタルアルデヒドの量としては、ガラス
ビーズのグルタルアルデヒドと反応する官能基の等モル
以上であることが好ましく、特に、2〜50倍が好まし
い。また、反応の温度としては、0〜80℃で行うこと
が好ましく、室温で行えばよい。また、反応時には反応
液を攪拌することが好ましい。担体に固定化する酵素量
としては、アデノシン−5’−三リン酸スルフリラーゼ
とピロホスファターゼとを同時に固定化する場合は、担
体1gに対して、アデノシン−5’−三リン酸スルフリ
ラーゼを50〜5000u、好ましくは100〜100
0uと、ピロホスファターゼをアデノシン−5’−三リ
ン酸スルフリラーゼのユニット数の1/2〜100量、
好ましくは1〜20量を加えて攪拌し固定化すればよ
い。また、別々に固定化する場合は、担体0.5gに対
して、アデノシン−5’−三リン酸スルフリラーゼを5
0〜5000u、好ましくは100〜1000uと、別
に、担体0.5gに対して、ピロホスファターゼをアデ
ノシン−5’−三リン酸スルフリラーゼのユニット数の
1/2〜100量、好ましくは1〜20量を加えて攪拌
し固定化すればよい。The amount of glutaraldehyde is preferably at least equimolar to the functional group which reacts with glutaraldehyde of the glass beads, and particularly preferably 2 to 50 times. The reaction is preferably performed at a temperature of 0 to 80 ° C., and may be performed at room temperature. It is preferable to stir the reaction solution during the reaction. When adenosine-5'-triphosphate sulfurylase and pyrophosphatase are simultaneously immobilized on the carrier, the amount of enzyme to be immobilized on the carrier is 50 to 5000 u / a of adenosine-5'-triphosphate sulfurylase per 1 g of the carrier. , Preferably 100 to 100
0u, the pyrophosphatase is 1 / to 100 times the number of units of adenosine-5′-triphosphate sulfurylase,
Preferably, 1 to 20 volumes may be added, and the mixture may be stirred and fixed. When immobilized separately, 5 g of adenosine-5'-triphosphate sulfurylase is added to 0.5 g of the carrier.
0 to 5000 u, preferably 100 to 1000 u, and separately, 0.5 g of the carrier, the amount of pyrophosphatase is 1/2 to 100, preferably 1 to 20 of the number of units of adenosine-5'-triphosphate sulfurylase. May be added, stirred and fixed.
【0022】反応に用いられる反応器としては、反応を
スムーズに進行させるものであればいかなるものでもよ
く、各々の酵素量、基質液の濃度、pH及び供給速度、
反応温度等によって反応器の大きさ及び形状を選定すれ
ばよい。その反応器の形状としては、例えば、膜型の反
応器、カラム型の反応器を使用することができる。カラ
ム型の反応器を用いる場合の反応基質液の通液速度とし
ては、カラム型反応器の形状及び固定化単体の体積当た
りの酵素量などに依存し、転化率を調整することができ
るが、線速度で0.01〜100cm/分、好ましくは
0・1〜10cm/分であり、体積速度では、0.00
1〜100ミリリットル/分、好ましくは0.05〜1
0ミリリットル/分である。The reactor used for the reaction may be any reactor as long as the reaction proceeds smoothly. The amount of each enzyme, the concentration of the substrate solution, the pH and the supply rate,
The size and shape of the reactor may be selected according to the reaction temperature and the like. As the shape of the reactor, for example, a membrane reactor or a column reactor can be used. The flow rate of the reaction substrate solution when using a column-type reactor depends on the shape of the column-type reactor and the amount of enzyme per volume of the immobilized substance, and the conversion can be adjusted. The linear velocity is 0.01 to 100 cm / min, preferably 0.1 to 10 cm / min, and the volume velocity is 0.00
1 to 100 ml / min, preferably 0.05 to 1
0 ml / min.
【0023】上述の反応器は、連続的に操作することを
前提として説明したものであるが、このような思想に基
づいて他の反応器を用いることもできるし、場合によっ
ては、バッチ式の反応器を使用してバッチ式に操作して
反応させることもできる。The above-described reactor has been described on the assumption that it is operated continuously. However, other reactors can be used based on such a concept, and in some cases, a batch-type reactor is used. The reaction can also be carried out in a batch manner using a reactor.
【0024】以下に本発明において用いられる測定法及
び使用酵素の活性測定法を解説する。 (1)ATPスルフリラーゼの活性測定 以下に示す組成の反応液を30℃に保ち、適量の酵素試
料液を加えて以下に示す反応を開始する。10分後に3
Nの硫酸を0.05ミリリットル加え反応を停止する。
反応終了後のリン酸濃度を、和光純薬工業株式会社製無
機リン酸測定試薬ホスファC−テストワコーにより定量
する。1分間に2μmol のリン酸、すなわち1μmol の
ピロリン酸が生成するATPスルフリラーゼの量を1u
とする。The measuring method used in the present invention and the method for measuring the activity of the enzyme used are described below. (1) Measurement of ATP sulfurylase activity A reaction solution having the composition shown below is kept at 30 ° C., and an appropriate amount of an enzyme sample solution is added to initiate a reaction shown below. 3 after 10 minutes
The reaction is stopped by adding 0.05 ml of N sulfuric acid.
The phosphoric acid concentration after the completion of the reaction is quantified using Wako Pure Chemical Industries, Ltd., inorganic phosphoric acid measuring reagent Phospha C-Test Wako. The amount of ATP sulfurylase that produces 2 μmol of phosphoric acid per minute, ie 1 μmol of pyrophosphate, is reduced to 1 u
And
【0025】 反応液組成(総量0.5ミリリットルとする) トリス塩酸緩衝液(pH 8) 100mM 塩化マグネシウム 10mM モリブデン酸ナトリウム 10mM ATP 10mM ピロホスファターゼ(シグマ社製) 0.4u/ミリリットル 試料(ATPスルフリラーゼ溶液) 適量Reaction solution composition (total volume 0.5 ml) Tris-HCl buffer (pH 8) 100 mM magnesium chloride 10 mM sodium molybdate 10 mM ATP 10 mM pyrophosphatase (Sigma) 0.4 u / milliliter Sample (ATP sulfurylase solution) ) Appropriate amount
【0026】[0026]
【化3】 Embedded image
【0027】(2)ピロホスファターゼの活性測定 以下に示す組成の反応液を30℃に保ち適量の酵素試料
液を加えて以下に示す反応を開始する。10分後に3N
の硫酸を0.05ミリリットル加え反応を停止する。反
応終了後のリン酸濃度を、和光純薬工業株式会社製無機
リン酸測定試薬ホスファCーテストワコーにより定量す
る。1分間に2μmol のリン酸、すなわち1μmol のピ
ロリン酸が生成するピロホスファターゼの量を1uとす
る。(2) Measurement of activity of pyrophosphatase A reaction solution having the composition shown below is kept at 30 ° C., and an appropriate amount of an enzyme sample solution is added to initiate a reaction shown below. 3N after 10 minutes
The reaction is stopped by adding 0.05 ml of sulfuric acid. The phosphoric acid concentration after the completion of the reaction is quantified using Wako Pure Chemical Industries, Ltd. inorganic phosphoric acid measuring reagent Phospha C-Test Wako. The amount of pyrophosphatase generated by 2 μmol of phosphoric acid per minute, that is, 1 μmol of pyrophosphate is defined as 1 u.
【0028】 反応液組成(総量0.5ミリリットルとする) トリス塩酸緩衝液(pH 8) 100mM 塩化マグネシウム 5mM ピロリン酸ナトリウム 5mM 試料(ピロホスファターゼ溶液) 適量Reaction solution composition (total volume 0.5 ml) Tris-HCl buffer (pH 8) 100 mM Magnesium chloride 5 mM Sodium pyrophosphate 5 mM Sample (pyrophosphatase solution)
【0029】[0029]
【化4】 Embedded image
【0030】(3)HPLCによるAPS及びその誘導
体の定量法 ウォーターズ社製マイクロボンダパックC18カラムを
用いてAPS及びその誘導体の定量を行った。移動相と
しては、3mMの過塩素酸テトラブチルアンモニウム及
び30mMのリン酸1カリウムを含む15容量%のメタ
ノール水溶液を用い、流速0.6ミリリットル/分、検
出はUVの吸収(λ=254nm)を測定することによ
り行った。(3) Quantification of APS and its derivatives by HPLC APS and its derivatives were quantified using a Micro Bonder Pack C18 column manufactured by Waters. As a mobile phase, a 15% by volume aqueous methanol solution containing 3 mM tetrabutylammonium perchlorate and 30 mM monopotassium phosphate was used. The flow rate was 0.6 ml / min, and the detection was by UV absorption (λ = 254 nm). It was performed by measuring.
【0031】[0031]
次に、本発明を実施例によって具体的に説明する。 参考例1 グルコース1重量%、酵母エキス1重量%、リン酸0.
1重量%及び若干のミネラル類を含んだ培地を殺菌した
後、pHを6.5に調整し、バチルス・ステアロサーモ
フィラスNCA1503株(FERM P−4778)
を接種し、培養を行った。60℃で3時間培養後、培地
中のグルコースが消費されたことを確認し、遠心分離に
て湿菌体を得た。得られた湿菌体を凍結融解法で破砕し
た後、硫安を用いて除核酸を行い、生じた沈殿を遠心分
離により除去して、粗酵素液を得た。Next, the present invention will be specifically described with reference to examples. Reference Example 1 1% by weight of glucose, 1% by weight of yeast extract, and 0.1% of phosphoric acid.
After sterilizing a medium containing 1% by weight and some minerals, the pH was adjusted to 6.5, and Bacillus stearothermophilus NCA1503 strain (FERM P-4778) was used.
Was inoculated and cultured. After culturing at 60 ° C. for 3 hours, it was confirmed that glucose in the medium was consumed, and wet cells were obtained by centrifugation. After the obtained wet cells were crushed by freeze-thaw method, nucleic acid was removed using ammonium sulfate, and the resulting precipitate was removed by centrifugation to obtain a crude enzyme solution.
【0032】あらかじめ50mMのトリス塩酸緩衝液
(pH8.0)で平衡化したDEAE−セファロース
(ファルマシア社製)カラムに粗酵素液をアプライして
ATPスルフリラーゼを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄
した後、同緩衝液を用いて0から500mMの塩化ナト
リウムの直線濃度勾配にて溶出を行った。その活性画分
を回収し、1Mとなるよう硫酸アンモニウムを加えた。
この活性画分を1Mの硫酸アンモニウムを含む50mM
のトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化したフェニ
ルセファロース(ファルマシア社製)カラムにアプライ
した。同緩衝液で十分洗浄した後、50mMのトリス塩
酸緩衝液(pH8.0)で溶出した。得られた活性画分
を回収し、濃縮・透析後、50mMのトリス塩酸緩衝液
(pH8.0)で平衡化したマトリックスゲルブルーA
(アミコン社製)カラムにアプライした。同緩衝液で十
分洗浄した後、1Mの塩化カリウムを含む同緩衝液で溶
出した。得られた活性画分を回収し、濃縮後、ポリアク
リルアミド電気泳動を行ったところ、単一なバンドが得
られた。得られたATPスルフリラーゼの比活性は1
1.1u/mgであった。The crude enzyme solution was applied to a DEAE-Sepharose (Pharmacia) column which had been equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) in advance, and ATP sulfurylase was adsorbed. Using the same buffer, elution was performed with a linear concentration gradient of 0 to 500 mM sodium chloride. The active fraction was collected, and ammonium sulfate was added to 1 M.
This active fraction was treated with 50 mM containing 1 M ammonium sulfate.
Was applied to a phenyl sepharose (Pharmacia) column equilibrated with a Tris-HCl buffer solution (pH 8.0). After sufficiently washing with the same buffer, elution was carried out with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). The obtained active fraction was collected, concentrated and dialyzed, and then matrix gel blue A equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0).
(Amicon) column. After sufficient washing with the same buffer, elution was carried out with the same buffer containing 1 M potassium chloride. The obtained active fraction was collected, concentrated, and subjected to polyacrylamide electrophoresis. As a result, a single band was obtained. The specific activity of the obtained ATP sulfurylase is 1
1.1 u / mg.
【0033】参考例2 酵母(サッカロミセス・セルビシエ ATCC 7752)を用
い、pH7.5、37℃で6時間培養した以外は参考例
1と同様にしてATPスルフリラーゼを得た。Reference Example 2 ATP sulfurylase was obtained in the same manner as in Reference Example 1 except that yeast (Saccharomyces cerevisiae ATCC 7752) was used and cultured at pH 7.5 and 37 ° C. for 6 hours.
【0034】参考例3 サーマス・フラバス(ATCC 33923)を用い、pH7.
0、65℃で4時間培養した以外は参考例1と同様にし
てATPスルフリラーゼを得た。Reference Example 3 The pH was adjusted to 7.0 using Thermus Flavas (ATCC 33923).
ATP sulfurylase was obtained in the same manner as in Reference Example 1 except that the cells were cultured at 0 and 65 ° C. for 4 hours.
【0035】参考例4 バチルス・ステアロサーモフィラスNCA1503株
(FERM P−4778)を用い、参考例1と同様に
して粗酵素液を得た。あらかじめ25mMのリン酸緩衝
液(pH7.5)で平衡化したDEAE−セファロース
(ファルマシア社製)カラムに粗酵素液をアプライして
ピロホスファターゼを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄し
た後、同緩衝液を用いて0から500mMの塩化カリウ
ムの直線濃度勾配にて溶出を行った。その活性画分を回
収し、1Mとなるよう硫酸アンモニウムを加えた。この
活性画分を1Mの硫酸アンモニウムを含む25mMのリ
ン酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したフェニルセファ
ロース(ファルマシア社製)カラムにアプライした。同
緩衝液で十分洗浄した後、25mMのリン酸緩衝液(p
H7.5)で溶出した。得られた活性画分を回収し、濃
縮後、25mMのリン酸緩衝液(pH7.5)で平衡化
したセファデックスG−25(ファルマシア社製)カラ
ムにアプライした。同緩衝液で溶出し、得られた活性画
分を回収し、濃縮・透析後、ポリアクリルアミド電気泳
動を行ったところ、単一なバンドが得られた。得られた
ピロホスファターゼの比活性は71.4u/mgであっ
た。Reference Example 4 A crude enzyme solution was obtained in the same manner as in Reference Example 1 using Bacillus stearothermophilus NCA1503 strain (FERM P-4778). The crude enzyme solution was applied to a DEAE-Sepharose (Pharmacia) column previously equilibrated with a 25 mM phosphate buffer (pH 7.5) to adsorb pyrophosphatase, washed sufficiently with the same buffer, and then washed with the same buffer. The solution was eluted with a linear gradient of 0 to 500 mM potassium chloride. The active fraction was collected, and ammonium sulfate was added to 1 M. The active fraction was applied to a phenyl sepharose (Pharmacia) column equilibrated with 25 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 M ammonium sulfate. After washing thoroughly with the same buffer, 25 mM phosphate buffer (p
H7.5). The obtained active fraction was collected, concentrated, and then applied to a Sephadex G-25 (Pharmacia) column equilibrated with 25 mM phosphate buffer (pH 7.5). After elution with the same buffer, the obtained active fraction was collected, concentrated and dialyzed, and subjected to polyacrylamide electrophoresis, whereby a single band was obtained. The specific activity of the obtained pyrophosphatase was 71.4 u / mg.
【0036】実施例1 容量150リットルの反応恒温槽に、0.5mMのAT
P、50mMの硫酸ナトリウム及び5mMの塩化マグネ
シウムを含む100mMのトリス塩酸緩衝液100リッ
トルを調製し、水酸化ナトリウムにてpHを8に調整
後、70℃に保温した。これに参考例1で取得したバチ
ルス・ステアロサーモフィラス由来のATPスルフリラ
ーゼ40000uと、シグマ社(米国)より購入した酵
母由来のピロホスファターゼ(製品番号 I-1643)231
000uを加えて70℃で反応を行った。24時間反応
させた後、限外ろ過膜により酵素液を分離し、酵素液は
次の使用のために4℃にて保存した。酵素液を分離した
反応液をHPLCにより分析したところ、40mmolのA
PSが生成していた。ATPに対する転化率は80%で
あった。Example 1 0.5 mM of AT was placed in a 150 liter reaction thermostat.
P, 100 liters of 100 mM Tris-HCl buffer containing 50 mM sodium sulfate and 5 mM magnesium chloride was prepared, adjusted to pH 8 with sodium hydroxide, and kept at 70 ° C. 40000u of ATP sulfurylase derived from Bacillus stearothermophilus obtained in Reference Example 1 and pyrophosphatase derived from yeast (product number I-1643) 231 purchased from Sigma (USA)
000u was added and the reaction was performed at 70 ° C. After reacting for 24 hours, the enzyme solution was separated by an ultrafiltration membrane, and the enzyme solution was stored at 4 ° C. for the next use. The reaction solution from which the enzyme solution was separated was analyzed by HPLC to find that 40 mmol of A
PS had generated. The conversion to ATP was 80%.
【0037】次に、酵素液を除いた反応液を50リット
ルのDEAE−セファロース(ファルマシア社製)カラ
ムにアプライし、0から400mMの塩化ナトリウムの
直線濃度勾配にて溶出を行ってAPS水溶液を得た。得
られたAPS水溶液を逆浸透膜NTR−7250(日東
電工社製)にて濃縮脱塩し、これを凍結乾燥することに
より16.0gのAPS・2Na白色粉末を得た。AP
S・2Naの構造をNMRで確認した後、HPLC分析
を行ったところ、得られたAPS・2Na白色粉末の純
度は99.5%であった。Next, the reaction solution from which the enzyme solution had been removed was applied to a 50 liter DEAE-Sepharose (Pharmacia) column, and eluted with a linear concentration gradient of 0 to 400 mM sodium chloride to obtain an APS aqueous solution. Was. The obtained APS aqueous solution was concentrated and desalted with a reverse osmosis membrane NTR-7250 (manufactured by Nitto Denko Corporation), and lyophilized to obtain 16.0 g of APS · 2Na white powder. AP
After confirming the structure of S.2Na by NMR, HPLC analysis was performed. As a result, the purity of the obtained APS.2Na white powder was 99.5%.
【0038】実施例2 参考例2で取得した酵母由来のATPスルフリラーゼを
用いた以外は実施例1と同様にしてAPSを製造した。
24時間反応させた後、反応液をHPLCにより分析し
たところ、36mmolのAPSが生成していた。このとき
のATPに対する転化率は72%であった。さらに、実
施例1と同様に単離精製したところ、13.0gのAP
S・2Na白色粉末が得られた。この粉末の構造をNM
Rで確認した後、HPLC分析を行ったところ、純度は
99.4%であった。Example 2 An APS was produced in the same manner as in Example 1 except that the yeast-derived ATP sulfurylase obtained in Reference Example 2 was used.
After reacting for 24 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC, and it was found that 36 mmol of APS had been formed. At this time, the conversion rate to ATP was 72%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 13.0 g of AP was obtained.
An S · 2Na white powder was obtained. The structure of this powder is NM
After confirmation by R, HPLC analysis revealed a purity of 99.4%.
【0039】実施例3 ATPの代わりにdATPを用いた以外は実施例1と同
様にしてデオキシアデノシン−5’−ホスホ硫酸(以下
dAPSという。)を製造した。24時間反応させた
後、反応液をHPLCにより分析したところ、34mmol
のdAPSが生成していた。このときのdATPに対す
る転化率は68%であった。さらに、実施例1と同様に
単離精製したところ、11.9gのdAPS・2Na白
色粉末が得られた。この粉末の構造をNMRで確認した
後、HPLC分析を行ったところ、純度は99.3%で
あった。Example 3 Deoxyadenosine-5'-phosphosulfate (hereinafter referred to as dAPS) was produced in the same manner as in Example 1 except that dATP was used instead of ATP. After reacting for 24 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC to find that 34 mmol
Of dAPS had been generated. At this time, the conversion with respect to dATP was 68%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 11.9 g of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of the powder by NMR, HPLC analysis revealed that the purity was 99.3%.
【0040】実施例4 ATPの代わりdATPを用いた以外は実施例2と同様
にしてdAPSを製造した。24時間反応させた後、反
応液をHPLCにより分析したところ、35mmolのdA
PSが生成していた。このときのdATPに対する転化
率は70%であった。さらに、実施例1と同様に単離精
製したところ、12.1gのdAPS・2Na白色粉末
が得られた。この粉末の構造をNMRで確認した後、H
PLC分析を行ったところ、純度は99.5%であっ
た。Example 4 A dAPS was produced in the same manner as in Example 2 except that dATP was used instead of ATP. After reacting for 24 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC to find that 35 mmol of dA
PS had generated. At this time, the conversion with respect to dATP was 70%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 12.1 g of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, H
As a result of PLC analysis, the purity was 99.5%.
【0041】実施例5 3つ首のガラス製反応器(容量150リットル)の2つ
の首に管をつけて平膜限外ろ過膜器(ミリポア社製)に
つないだ。これに100mMのトリス塩酸緩衝液(pH
8)を250ミリリットル加え、1リットル/hrの流
速で循環させた。このとき、反応器全体を70℃に保っ
た。この反応器の別の入口から、参考例3で取得したサ
ーマスフラバス由来のATPスルフリラーゼを400u
及び参考例4で取得したバチルス・ステアロサーモフィ
ラス由来のピロホスファターゼ2310uを加え、そこ
へさらに管をつけ、循環液と同じ緩衝液に溶かした0.
5mMのATP、50mMの硫酸ナトリウム、5mMの
塩化マグネシウム混合液を50ミリリットル/hrの割
合で加えた。上記の限外ろ過膜を通った溶液の一部を5
0ミリリットル/hrの割合で連続的に回収し、4℃に
て保存した。この反応を70℃で72時間行い、3.6
リットルの反応液を得た。この反応液をHPLCにより
分析したところ、1.3mmolのAPSが生成していた。
このときのATPに対する転化率は72%であった。さ
らに、実施例1と同様に単離精製したところ、0.49
gのAPS・2Na白色粉末が得られた。この粉末の構
造をNMRで確認した後、HPLC分析を行ったとこ
ろ、純度は99.5%であった。Example 5 A three-necked glass reactor (capacity: 150 liters) was connected to a flat membrane ultrafiltration membrane (manufactured by Millipore) by attaching tubes to the two necks. Add 100 mM Tris-HCl buffer (pH
8) was added and circulated at a flow rate of 1 liter / hr. At this time, the entire reactor was kept at 70 ° C. From another inlet of this reactor, 400 u of the ATP sulfurylase derived from the thermus flavus obtained in Reference Example 3 was added.
Further, 2310 u of pyrophosphatase derived from Bacillus stearothermophilus obtained in Reference Example 4 was added thereto, and a tube was further added thereto, and dissolved in the same buffer as the circulating fluid.
A mixed solution of 5 mM ATP, 50 mM sodium sulfate, and 5 mM magnesium chloride was added at a rate of 50 ml / hr. Part of the solution passed through the ultrafiltration membrane
It was continuously collected at a rate of 0 ml / hr and stored at 4 ° C. The reaction is carried out at 70 ° C. for 72 hours, 3.6
One liter of the reaction solution was obtained. When this reaction solution was analyzed by HPLC, 1.3 mmol of APS was generated.
At this time, the conversion rate to ATP was 72%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 0.49
g of APS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, HPLC analysis was performed. As a result, the purity was 99.5%.
【0042】参考例5 直径5cmのバイアル瓶にELECTRO-NUCREONICS社製のAmin
opropil Controlled Pore Grass(以下Aminopropil-CPG
という。粒子サイズ;120/200メッシュ、孔径;50
0Å)を1g採取し、25重量%のグルタルアルデヒド
を30ml添加後、アスピレーターで15分間脱気してグ
ルタルアルデヒドを反応させた。上澄みのグルタルアル
デヒドを除去した後、蒸留水で数回洗浄した。このバイ
アル瓶に参考例1で作製したATPスルフリラーゼを3
00uと、シグマ社製酵母由来のピロポスファターゼ
(製品番号 I-1643 )を1600u加え、室温(約20
℃)で、旋回攪拌機 RCC-100HS(アングル角度45度、
回転5rpm )で回転、攪拌して酵素の固定化反応を行っ
た。90分間反応させた後、上清を採取し、ATPスル
フリラーゼ及びピロホスファターゼの残存活性を測定し
たところ、ATPスルフリラーゼは50u、ピロホスフ
ァターゼは210uであった。このようにして、ATP
スルフリラーゼ250uとピロホスファターゼ1390
uとを固定化したガラスビーズ(Aminopropil-CPG )1
gを得た。Reference Example 5 Amin made by ELECTRO-NUCREONICS was placed in a vial having a diameter of 5 cm.
opropil Controlled Pore Grass (Aminopropil-CPG
That. Particle size: 120/200 mesh, pore size: 50
0 g) was collected, 30 ml of 25% by weight glutaraldehyde was added, and the mixture was degassed with an aspirator for 15 minutes to react with glutaraldehyde. After removing glutaraldehyde in the supernatant, the resultant was washed several times with distilled water. The ATP sulfurylase prepared in Reference Example 1 was added to this vial vial 3
00u and 1600 u of pyrosphosphatase (product number I-1643) derived from Sigma yeast, and the mixture was added at room temperature (about 20
° C), with a rotary stirrer RCC-100HS (angle angle 45 degrees,
The mixture was rotated at a speed of 5 rpm and stirred to carry out the enzyme immobilization reaction. After reacting for 90 minutes, the supernatant was collected and the residual activities of ATP sulfurylase and pyrophosphatase were measured. As a result, ATP sulfurylase was 50 u, and pyrophosphatase was 210 u. Thus, ATP
Sulfurylase 250u and pyrophosphatase 1390
glass beads immobilized with u (Aminopropil-CPG) 1
g was obtained.
【0043】参考例6 参考例2で作製したATPスルフリラーゼを用いた以外
は参考例5と同様にして酵素を固定化したガラスビーズ
1gを得た。Reference Example 6 1 g of glass beads on which an enzyme was immobilized was obtained in the same manner as in Reference Example 5, except that the ATP sulfurylase prepared in Reference Example 2 was used.
【0044】参考例7 直径5cmのバイアル瓶にELECTRO-NUCREONICS社製のAmin
opropil-CPG (粒子サイズ;120/200メッシュ、孔
径;500Å)を1g採取し、25重量%のグルタルア
ルデヒドを30ml添加した後、アスピレーターで15分
間脱気した。上澄みのグルタルアルデヒドを除去した
後、蒸留水で数回洗浄し、0.5gずつ2つのバイアル
瓶に分けた。一方のバイアル瓶に参考例1で作製したA
TPスルフリラーゼを300u加え、もう一方のバイア
ル瓶にシグマ社製酵母由来のピロホスファターゼ(製品
番号 I-1643 )を1600u加えて、それぞれ室温(約
20℃)で、旋回攪拌機 RCC-100HS(アングル角度45
度、回転5rpm )で回転、攪拌して酵素の固定化反応を
行った。90分間反応させた後、それぞれのバイアル瓶
の上清を採取し、ATPスルフリラーゼ及びピロポスフ
ァターゼの残存活性を測定したところ、ATPスルフリ
ラーゼは50u、ピロホスファターゼは210uであっ
た。このようにしてATPスルフリラーゼ250ユニッ
トを固定したガラスビーズ0.5gと、ピロホスファタ
ーゼ1390uを固定したガラスビーズ0.5gをそれ
ぞれ得た。Reference Example 7 Amin manufactured by ELECTRO-NUCREONICS was placed in a vial having a diameter of 5 cm.
1 g of opropil-CPG (particle size; 120/200 mesh, pore size: 500 °) was sampled, and 30 ml of 25% by weight glutaraldehyde was added, followed by degassing with an aspirator for 15 minutes. After removing the glutaraldehyde in the supernatant, it was washed several times with distilled water and divided into two vials of 0.5 g each. A prepared in Reference Example 1 in one vial
300 u of TP sulfurylase was added, and 1600 u of yeast-derived pyrophosphatase (product number I-1643) was added to the other vial, and each was stirred at room temperature (about 20 ° C) with a rotary agitator RCC-100HS (angle angle 45).
The mixture was rotated and stirred at 5 rpm to perform an immobilization reaction of the enzyme. After reacting for 90 minutes, the supernatant of each vial was collected and the residual activity of ATP sulfurylase and pyrophosphatase was measured. As a result, ATP sulfurylase was 50 u, and pyrophosphatase was 210 u. Thus, 0.5 g of glass beads having 250 units of ATP sulfurylase immobilized thereon and 0.5 g of glass beads having 1390 u of pyrophosphatase immobilized thereon were obtained.
【0045】参考例8 参考例1で作製したATPスルフリラーゼに代えて参考
例2で作製したATPスルフリラーゼを用いた以外は参
考例7と同様にしてATPスルフリラーゼを固定化した
ガラスビーズを作製した。Reference Example 8 Glass beads having ATP sulfurylase immobilized thereon were produced in the same manner as in Reference Example 7, except that the ATP sulfurylase produced in Reference Example 2 was used instead of the ATP sulfurylase produced in Reference Example 1.
【0046】実施例6 直径10mmのカラムに、参考例5で作製した酵素を固定
化したガラスビーズ1gを充填し、70℃でインキュベ
ートした。このカラムに100mMのトリス塩酸緩衝
液、0.2mMのATP、50mMの硫酸ナトリウム、
5mMの塩化マグネシウムを含むAPS合成基質液を、
塩酸にてpHを8に調整後、0.3ml/minの流速で15
00ml通液した。カラム通過液をHPLCにより分析し
たところ230μmol のAPSが生成していた。ATP
に対する転化率は77%であった。酵素液を除いた反応
液を50mlのDEAE−セファロース(ファルマシア社
製)カラムに供与し、0から400mMの塩化ナトリウ
ム勾配溶液で展開してAPSを分離した。APS水溶液
はさらに逆浸透膜NTR−7250にて濃縮脱塩し、こ
れを凍結乾燥することにより75mgのAPS・2Na白
色粉末を得た。NMRで構造を確認した後、HPLC分
析を行ったところ純度は99.3%であった。Example 6 A column having a diameter of 10 mm was filled with 1 g of glass beads on which the enzyme prepared in Reference Example 5 was immobilized, and incubated at 70 ° C. The column contains 100 mM Tris-HCl buffer, 0.2 mM ATP, 50 mM sodium sulfate,
APS synthesis substrate solution containing 5 mM magnesium chloride,
After adjusting the pH to 8 with hydrochloric acid, the pH was adjusted to 15 at a flow rate of 0.3 ml / min.
The solution was passed through 00 ml. Analysis of the liquid passed through the column by HPLC revealed that 230 μmol of APS had been formed. ATP
The conversion with respect to was 77%. The reaction solution from which the enzyme solution had been removed was applied to a 50 ml DEAE-Sepharose (Pharmacia) column, and developed with a 0 to 400 mM sodium chloride gradient solution to separate APS. The APS aqueous solution was further concentrated and desalted with a reverse osmosis membrane NTR-7250 and freeze-dried to obtain 75 mg of APS · 2Na white powder. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 99.3%.
【0047】実施例7 参考例6で作製した酵素を固定化したガラスビーズを用
いた以外は実施例6と同様にしてAPSを製造した。カ
ラム通過液をHPLCにより分析したところ210μmo
l のAPSが生成していた。ATPに対する転化率は7
0%であった。さらに、実施例6と同様に単離精製する
ことにより64mgのAPS・2Na白色粉末を得た。N
MRで構造を確認した後、HPLC分析を行ったところ
純度は99.2%であった。Example 7 An APS was produced in the same manner as in Example 6, except that the enzyme-immobilized glass beads prepared in Reference Example 6 were used. When the liquid passed through the column was analyzed by HPLC,
l APS had been generated. Conversion rate to ATP is 7
It was 0%. Further, by isolation and purification in the same manner as in Example 6, 64 mg of APS.2Na white powder was obtained. N
After confirming the structure by MR, HPLC analysis revealed a purity of 99.2%.
【0048】実施例8 ATPの代わりにdATPを用いた以外は実施例6と同
様にしてdAPSを製造した。カラム通過液をHPLC
により分析したところ205μmol のdAPSが生成し
ていた。dATPに対する転化率は68%であった。さ
らに、実施例6と同様に単離精製することにより61mg
のdAPS・2Na白色粉末を得た。NMRで構造を確
認した後、HPLC分析を行ったところ純度は99.2
%であった。Example 8 A dAPS was produced in the same manner as in Example 6, except that dATP was used instead of ATP. HPLC of the liquid passing through the column
As a result, 205 μmol of dAPS was formed. The conversion to dATP was 68%. Further, by isolating and purifying in the same manner as in Example 6, 61 mg
Of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 99.2.
%Met.
【0049】実施例9 ATPの代わりにdATPを用いた以外は実施例7と同
様にしてdAPSを製造した。カラム通過液をHPLC
により分析したところ、200μmol のdAPSが生成
していた。dATPに対する転化率は67%であった。
さらに、実施例6と同様に単離精製することにより59
mgのdAPS・2Na白色粉末を得た。NMRで構造を
確認した後、HPLC分析を行ったところ純度は99.
0%であった。Example 9 A dAPS was produced in the same manner as in Example 7 except that dATP was used instead of ATP. HPLC of the liquid passing through the column
As a result, 200 μmol of dAPS was produced. The conversion to dATP was 67%.
Further, isolation and purification were performed in the same manner as in Example 6 to obtain 59
mg of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 99.
It was 0%.
【0050】実施例10 参考例7で作製した2種類の酵素を固定化したガラスビ
ーズを0.5gずつ混合し、直径10mmのカラムに充填
して70℃でインキュベートした。このカラムに100
mMのトリス塩酸緩衝液、0.2mMのATP、50m
Mの硫酸ナトリウム、5mMの塩化マグネシウムを含む
APS合成基質液を、塩酸にてpHを8に調整後、0.
3ml/minの流速で1500ml通液した。カラム通過液を
HPLCにより分析したところ220μmol のAPSが
生成していた。ATPに対する転化率は73%であっ
た。さらに、実施例6と同様に単離精製することにより
70mgのAPS・2Na白色粉末を得た。NMRで構造
を確認した後、HPLC分析を行ったところ純度は9
9.3%であった。Example 10 Glass beads immobilized with two kinds of enzymes prepared in Reference Example 7 were mixed in an amount of 0.5 g each, packed in a column having a diameter of 10 mm, and incubated at 70 ° C. 100 in this column
mM Tris-HCl buffer, 0.2 mM ATP, 50 m
After adjusting the pH of an APS synthetic substrate solution containing sodium sulfate of 5M and 5 mM of magnesium chloride to 8 with hydrochloric acid, the pH of the solution was adjusted to 0.1.
1500 ml of liquid was passed at a flow rate of 3 ml / min. Analysis of the liquid passed through the column by HPLC revealed that 220 μmol of APS had been formed. The conversion to ATP was 73%. Furthermore, 70 mg of APS · 2Na white powder was obtained by isolation and purification in the same manner as in Example 6. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 9
It was 9.3%.
【0051】実施例11 参考例7で作製したATPスルフリラーゼを固定化した
ガラスビーズに代えて参考例8で作製したATPスルフ
リラーゼを固定化したガラスビーズを用いた以外は実施
例10と同様にしてAPSを製造した。カラム通過液を
HPLCにより分析したところ、208μmol のAPS
が生成していた。ATPに対する転化率は69%であっ
た。さらに、実施例6と同様に単離精製することにより
67mgのAPS・2Na白色粉末を得た。NMRで構造
を確認した後、HPLC分析を行ったところ純度は9
9.0%であった。Example 11 APS was performed in the same manner as in Example 10 except that the ATP sulfurylase-immobilized glass beads prepared in Reference Example 8 were replaced with the ATP sulfurylase-immobilized glass beads prepared in Reference Example 7. Was manufactured. When the liquid passed through the column was analyzed by HPLC, 208 μmol of APS
Had been generated. The conversion to ATP was 69%. Further, isolation and purification were performed in the same manner as in Example 6 to obtain 67 mg of APS.2Na white powder. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 9
It was 9.0%.
【0052】実施例12 ATPの代わりにdATPを用いた以外は実施例10と
同様にしてdAPSを製造した。カラム通過液をHPL
Cにより分析したところ、200μmol のdAPSが生
成していた。dATPに対する転化率は67%であっ
た。さらに、実施例6と同様に単離精製することにより
60mgのdAPS・2Na白色粉末を得た。NMRで構
造を確認した後、HPLC分析を行ったところ純度は9
9.1%であった。Example 12 A dAPS was produced in the same manner as in Example 10 except that dATP was used instead of ATP. HPL is applied to the column
Analysis by C revealed that 200 μmol of dAPS had been formed. The conversion to dATP was 67%. Further, by isolating and purifying in the same manner as in Example 6, 60 mg of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed a purity of 9
9.1%.
【0053】実施例13 ATPの代わりdATPを用いた以外は実施例11と同
様にしてdAPSを製造した。カラム通過液をHPLC
により分析したところ205μmol のdAPSが生成し
ていた。dATPに対する転化率は68%であった。さ
らに、実施例6と同様に単離精製することにより62mg
のdAPS・2Na白色粉末を得た。NMRで構造を確
認した後、HPLC分析を行ったところ純度は99.1
%であった。Example 13 A dAPS was produced in the same manner as in Example 11 except that dATP was used instead of ATP. HPLC of the liquid passing through the column
As a result, 205 μmol of dAPS was formed. The conversion to dATP was 68%. Further, by isolating and purifying in the same manner as in Example 6, 62 mg
Of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure by NMR, HPLC analysis revealed that the purity was 99.1.
%Met.
【0054】実施例14 反応を40℃で行う以外は実施例1と同様にしてAPS
を製造した。24時間反応させた後、反応液をHPLC
により分析したところ、20mmolのAPSが生成してい
た。このときのATPに対する転化率は40%であっ
た。反応を50℃で行うと70℃で行った場合に比べて
転化率が下がった。さらに、実施例1と同様に単離精製
したところ、7.5gのAPS・2Na白色粉末が得ら
れた。この粉末の構造をNMRで確認した後、HPLC
分析を行ったところ、純度は99.1%であった。Example 14 APS was carried out in the same manner as in Example 1 except that the reaction was carried out at 40 ° C.
Was manufactured. After reacting for 24 hours, the reaction solution was
As a result, 20 mmol of APS was produced. At this time, the conversion rate to ATP was 40%. When the reaction was performed at 50 ° C., the conversion was lower than when the reaction was performed at 70 ° C. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 7.5 g of APS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, HPLC
Upon analysis, the purity was 99.1%.
【0055】実施例15 参考例2で取得した酵母由来のATPスルフリラーゼを
用いた以外は実施例14と同様にしてAPSを製造し
た。24時間反応させた後、反応液をHPLCにより分
析したところ、17mmolのAPSが生成していた。この
ときのATPに対する転化率は34%であった。さら
に、実施例1と同様に単離精製したところ、6.4gの
APS・2Na白色粉末が得られた。この粉末の構造を
NMRで確認した後、HPLC分析を行ったところ、純
度は99.0%であった。Example 15 An APS was produced in the same manner as in Example 14 except that the yeast-derived ATP sulfurylase obtained in Reference Example 2 was used. After reacting for 24 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC, and it was found that 17 mmol of APS had been formed. At this time, the conversion rate to ATP was 34%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 6.4 g of APS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, HPLC analysis was performed, and the purity was 99.0%.
【0056】実施例16 ATPの代わりにdATPを用いた以外は実施例14と
同様にしてdAPSを製造した。24時間反応させた
後、反応液をHPLCにより分析したところ、15mmol
のdAPSが生成していた。このときのdATPに対す
る転化率は34%であった。さらに、実施例1と同様に
単離精製したところ、5.7gのdAPS・2Na白色
粉末が得られた。この粉末の構造をNMRで確認した
後、HPLC分析を行ったところ、純度は99.1%で
あった。Example 16 dAPS was produced in the same manner as in Example 14 except that dATP was used instead of ATP. After reacting for 24 hours, the reaction mixture was analyzed by HPLC to find that 15 mmol
Of dAPS had been generated. At this time, the conversion with respect to dATP was 34%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 5.7 g of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of the powder by NMR, HPLC analysis revealed that the purity was 99.1%.
【0057】実施例17 ATPの代わりdATPを用いた以外は実施例15と同
様にしてdAPSを製造した。24時間反応させた後、
反応液をHPLCにより分析したところ、14mmolのd
APSが生成していた。このときのdATPに対する転
化率は34%であった。さらに、実施例1と同様に単離
精製したところ、5.3gのdAPS・2Na白色粉末
が得られた。この粉末の構造をNMRで確認した後、H
PLC分析を行ったところ、純度は99.2%であっ
た。Example 17 A dAPS was produced in the same manner as in Example 15 except that dATP was used instead of ATP. After reacting for 24 hours,
When the reaction solution was analyzed by HPLC, 14 mmol d
APS was generated. At this time, the conversion with respect to dATP was 34%. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 5.3 g of dAPS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, H
As a result of PLC analysis, the purity was 99.2%.
【0058】実施例18 反応を40℃で行う以外は実施例5と同様にしてAPS
を製造した。72時間反応後、3.6リットルの反応液
を得た。この反応液をHPLCにより分析したところ、
0.8mmolのAPSが生成していた。このときのATP
に対する転化率は45%であった。さらに、実施例1と
同様に単離精製したところ、0.3gのAPS・2Na
白色粉末が得られた。この粉末の構造をNMRで確認し
た後、HPLC分析を行ったところ、純度は99.0%
であった。Example 18 APS was carried out in the same manner as in Example 5 except that the reaction was carried out at 40 ° C.
Was manufactured. After reacting for 72 hours, 3.6 liters of a reaction solution was obtained. When this reaction solution was analyzed by HPLC,
0.8 mmol of APS had been formed. ATP at this time
The conversion with respect to was 45%. Furthermore, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 0.3 g of APS.2Na
A white powder was obtained. After confirming the structure of this powder by NMR, HPLC analysis was performed, and the purity was 99.0%.
Met.
【0059】比較例1 ピロホスファターゼを用いない以外は実施例14と同様
にしてAPSを製造した。24時間反応させた後、反応
液をHPLCにより分析したところ、1mmolのAPSが
生成していた。このときのATPに対する転化率は2%
であった。さらに、実施例1と同様に単離精製したとこ
ろ、0.4gのAPS・2Na白色粉末が得られた。こ
の粉末の構造をNMRで確認した後、HPLC分析を行
ったところ、純度は90.0%であった。Comparative Example 1 An APS was produced in the same manner as in Example 14 except that pyrophosphatase was not used. After reacting for 24 hours, the reaction solution was analyzed by HPLC, and 1 mmol of APS was generated. At this time, the conversion rate to ATP is 2%.
Met. Further, when isolated and purified in the same manner as in Example 1, 0.4 g of APS.2Na white powder was obtained. After confirming the structure of the powder by NMR, HPLC analysis revealed that the purity was 90.0%.
【0060】[0060]
【発明の効果】本発明によれば、APS又はその誘導体
を高収率で、かつ高純度で、しかも工業的スケールで製
造することができる。According to the present invention, APS or a derivative thereof can be produced in high yield and high purity on an industrial scale.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 名和 和恵 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 下出 綾子 京都府宇治市宇治蔭山55 (72)発明者 恩田 昌明 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 (72)発明者 中島 宏 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内 ──────────────────────────────────────────────────の Continuing on the front page (72) Inventor Kazue Nawa 23 Uji Kozakura, Uji City, Kyoto Unitika Unit Research & Development Center (72) Inventor Ayako Shimoide 55 Uji Kageyama, Uji City, Kyoto Prefecture (72) Inventor Onda Masaaki 23 Uji Kozakura, Uji City, Kyoto Unitika Central Research Laboratory (72) Inventor Hiroshi Nakajima 23 Uji Kozakura Uji City, Kyoto Prefecture Unitika Central Research Laboratory
Claims (3)
導体と、スルフェートとを反応基質として用い、アデノ
シン−5’−三リン酸スルフリラーゼとピロホスファタ
ーゼとを共存させて反応を行うことを特徴とするアデノ
シン−5’−ホスホ硫酸又はその誘導体の製造方法。The present invention is characterized in that adenosine-5'-triphosphate or a derivative thereof and a sulfate are used as a reaction substrate, and the reaction is carried out in the presence of adenosine-5'-triphosphate sulfurylase and pyrophosphatase. For producing adenosine-5'-phosphosulfate or a derivative thereof.
アデノシン−5’−ホスホ硫酸又はその誘導体の製造方
法。2. The method according to claim 1, wherein the reaction is carried out at 55 ° C. or higher.
ーゼ及びピロホスファターゼを担体に固定化して用いる
請求項1記載のアデノシン−5’−ホスホ硫酸又はその
誘導体の製造方法。3. The method for producing adenosine-5′-phosphosulfate or a derivative thereof according to claim 1, wherein adenosine-5′-triphosphate sulfurylase and pyrophosphatase are immobilized on a carrier.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5003797A JPH10117793A (en) | 1996-08-27 | 1997-03-05 | Production of adenosine-5'-phosphosulfate or its derivative |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP22482896 | 1996-08-27 | ||
JP8-224828 | 1996-08-27 | ||
JP5003797A JPH10117793A (en) | 1996-08-27 | 1997-03-05 | Production of adenosine-5'-phosphosulfate or its derivative |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10117793A true JPH10117793A (en) | 1998-05-12 |
Family
ID=26390482
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5003797A Pending JPH10117793A (en) | 1996-08-27 | 1997-03-05 | Production of adenosine-5'-phosphosulfate or its derivative |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH10117793A (en) |
-
1997
- 1997-03-05 JP JP5003797A patent/JPH10117793A/en active Pending
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