JPH099976A - ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、それをコードするdna、そのdnaを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法 - Google Patents
ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、それをコードするdna、そのdnaを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法Info
- Publication number
- JPH099976A JPH099976A JP8057409A JP5740996A JPH099976A JP H099976 A JPH099976 A JP H099976A JP 8057409 A JP8057409 A JP 8057409A JP 5740996 A JP5740996 A JP 5740996A JP H099976 A JPH099976 A JP H099976A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ala
- ser
- thr
- lys
- glu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【課題】 クラミジア・ニューモニエの抗体検査、診断
等に好適な融合タンパク質の製造に有用なDNA、及び
同融合タンパク質の製造に有用な形質転換体及び抗クラ
ミジア・ニューモニエ抗体の製造法を提供する。 【解決手段】 配列番号1で示されるペプチドに、直接
に又は介在アミノ酸配列を介して、配列番号2で示され
るペプチドの中の連続した少なくとも5個のアミノ酸か
らなる配列を含むポリペプチドAが結合した、ジヒドロ
葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タン
パク質、この融合タンパク質をコードするDNA若しく
はそれに相補的なDNA、このDNAを含む組換えベク
ター、この組換えベクターを含む形質転換体及び前記融
合タンパク質を抗原として用いることを特徴とする、抗
クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法。
等に好適な融合タンパク質の製造に有用なDNA、及び
同融合タンパク質の製造に有用な形質転換体及び抗クラ
ミジア・ニューモニエ抗体の製造法を提供する。 【解決手段】 配列番号1で示されるペプチドに、直接
に又は介在アミノ酸配列を介して、配列番号2で示され
るペプチドの中の連続した少なくとも5個のアミノ酸か
らなる配列を含むポリペプチドAが結合した、ジヒドロ
葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タン
パク質、この融合タンパク質をコードするDNA若しく
はそれに相補的なDNA、このDNAを含む組換えベク
ター、この組換えベクターを含む形質転換体及び前記融
合タンパク質を抗原として用いることを特徴とする、抗
クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、ジヒドロ葉酸還元
酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、
それをコードするDNA、そのDNAを含む組換えベク
ター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗ク
ラミジア・ニューモニエ抗体の製造法に関する。本発明
は医薬品工業、特にクラミジア・ニューモニエ感染症の
診断薬の製造において有効に利用される。
酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、
それをコードするDNA、そのDNAを含む組換えベク
ター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗ク
ラミジア・ニューモニエ抗体の製造法に関する。本発明
は医薬品工業、特にクラミジア・ニューモニエ感染症の
診断薬の製造において有効に利用される。
【0002】
【従来の技術】クラミジア属の細菌は、クラミジア・ト
ラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニュ
ーモニエ等の種(Species)が知られている。クラミジ
ア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽
腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を
引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オ
ウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニ
エは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。
ラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニュ
ーモニエ等の種(Species)が知られている。クラミジ
ア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽
腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を
引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オ
ウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニ
エは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。
【0003】クラミジア・ニューモニエの引き起こす呼
吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエや
インフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と
類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのた
め、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発
が望まれていた。
吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエや
インフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と
類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのた
め、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発
が望まれていた。
【0004】感染症の診断は、通常、感染部位等におけ
る原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中におけ
る(原因菌に対する)抗体の存在の検出により確定的に
なされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、
いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニュー
モニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエ
の基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られ
ている。
る原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中におけ
る(原因菌に対する)抗体の存在の検出により確定的に
なされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、
いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニュー
モニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエ
の基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られ
ている。
【0005】一方、大腸菌においてタンパク質を大量に
発現させることのできるプラスミドとして、pBBK1
0MMが知られている(特開平4−117284号公
報)。このプラスミドは、ジヒドロ葉酸還元酵素(以
下、DHFRと略す。)と抗アレルギー性ペプチドとの
融合タンパク質を発現させることができる。ここで得ら
れる融合タンパク質にはDHFRの酵素活性も保持され
ているので、融合タンパク質の精製はDHFRの特性と
活性を利用して容易に行うことができる。しかし、クラ
ミジア・ニューモニエの基本小体は、クラミジア・ニュ
ーモニエ以外のクラミジア属細菌、すなわち、クラミジ
ア・トラコマチス又はクラミジア・シッタシにも共通に
存在する抗原を含むため、この基本小体を用いる方法で
はクラミジア・ニューモニエに対する抗体だけでなく、
他の種のクラミジアに対する抗体とも反応し、特異性に
欠ける難点があった。
発現させることのできるプラスミドとして、pBBK1
0MMが知られている(特開平4−117284号公
報)。このプラスミドは、ジヒドロ葉酸還元酵素(以
下、DHFRと略す。)と抗アレルギー性ペプチドとの
融合タンパク質を発現させることができる。ここで得ら
れる融合タンパク質にはDHFRの酵素活性も保持され
ているので、融合タンパク質の精製はDHFRの特性と
活性を利用して容易に行うことができる。しかし、クラ
ミジア・ニューモニエの基本小体は、クラミジア・ニュ
ーモニエ以外のクラミジア属細菌、すなわち、クラミジ
ア・トラコマチス又はクラミジア・シッタシにも共通に
存在する抗原を含むため、この基本小体を用いる方法で
はクラミジア・ニューモニエに対する抗体だけでなく、
他の種のクラミジアに対する抗体とも反応し、特異性に
欠ける難点があった。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】請求項1記載の発明
は、クラミジア・ニューモニエの抗体検査等に好適な融
合タンパク質を提供するものである。請求項2記載の発
明は、請求項1記載の発明の効果に加え、感度の高い診
断薬の製造に好適な融合タンパク質を提供するものであ
る。請求項3記載の発明は、請求項1記載の発明の効果
に加え、抗原としての安定性に優れる融合タンパク質を
提供するものである。請求項4記載の発明は、請求項1
記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエの
特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質を提供するも
のである。請求項5記載の発明は、請求項1記載の発明
の効果に加え、クラミジア・ニューモニエの特異的抗体
検査等に好適な融合タンパク質を提供するものである。
は、クラミジア・ニューモニエの抗体検査等に好適な融
合タンパク質を提供するものである。請求項2記載の発
明は、請求項1記載の発明の効果に加え、感度の高い診
断薬の製造に好適な融合タンパク質を提供するものであ
る。請求項3記載の発明は、請求項1記載の発明の効果
に加え、抗原としての安定性に優れる融合タンパク質を
提供するものである。請求項4記載の発明は、請求項1
記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエの
特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質を提供するも
のである。請求項5記載の発明は、請求項1記載の発明
の効果に加え、クラミジア・ニューモニエの特異的抗体
検査等に好適な融合タンパク質を提供するものである。
【0007】請求項6記載の発明は、クラミジア・ニュ
ーモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの診断
に好適な融合タンパク質の製造に有用なDNAを提供す
るものである。請求項7記載の発明は、請求項6記載の
発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエの特異的
抗体検査等に適切な融合タンパク質の製造に有用なDN
Aを提供するものである。請求項8記載の発明は、請求
項6記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニ
エの特異的抗体検査等に適切な融合タンパク質の製造に
有用なDNAを提供するものである。
ーモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの診断
に好適な融合タンパク質の製造に有用なDNAを提供す
るものである。請求項7記載の発明は、請求項6記載の
発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニエの特異的
抗体検査等に適切な融合タンパク質の製造に有用なDN
Aを提供するものである。請求項8記載の発明は、請求
項6記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニ
エの特異的抗体検査等に適切な融合タンパク質の製造に
有用なDNAを提供するものである。
【0008】請求項9記載の発明は、クラミジア・ニュ
ーモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの診断
に好適な融合タンパク質の製造に有用な組換えベクター
を提供するものである。請求項10記載の発明は、請求
項9記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニ
エの特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質の製造に
有用な組換えベクターを提供するものである。請求項1
1記載の発明は、クラミジア・ニューモニエの抗体検査
やクラミジア・ニューモニエの診断に好適な融合タンパ
ク質の製造に有用な形質転換体を提供するものである。
請求項12記載の発明は、クラミジア・ニューモニエ感
染の診断薬製造に好適な抗クラミジア・ニューモニエ抗
体の製造法を提供するものである。
ーモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの診断
に好適な融合タンパク質の製造に有用な組換えベクター
を提供するものである。請求項10記載の発明は、請求
項9記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモニ
エの特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質の製造に
有用な組換えベクターを提供するものである。請求項1
1記載の発明は、クラミジア・ニューモニエの抗体検査
やクラミジア・ニューモニエの診断に好適な融合タンパ
ク質の製造に有用な形質転換体を提供するものである。
請求項12記載の発明は、クラミジア・ニューモニエ感
染の診断薬製造に好適な抗クラミジア・ニューモニエ抗
体の製造法を提供するものである。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、まず、ク
ラミジア・ニューモニエからゲノムDNAを抽出し、制
限酵素で部分分解してこれをファージベクターλgt11D
NAに挿入してゲノムDNAライブラリーを作成し、こ
れを大腸菌Y1090r−株に感染させ、クラミジア・
ニューモニエ特異的モノクローナル抗体を用いてクラミ
ジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドを発現する感染
大腸菌のコロニーをスクリーニングし、陽性の感染大腸
菌からλファージを抽出し、この操作を繰り返してλフ
ァージを精製し、そのDNAを取得した。そして、遺伝
子組換え技術を利用してこのλファージのDNAと上述
のプラスミドpBBK10MMから組換えプラスミドベ
クターpCPN533Tを構築し、本発明を完成した。
ラミジア・ニューモニエからゲノムDNAを抽出し、制
限酵素で部分分解してこれをファージベクターλgt11D
NAに挿入してゲノムDNAライブラリーを作成し、こ
れを大腸菌Y1090r−株に感染させ、クラミジア・
ニューモニエ特異的モノクローナル抗体を用いてクラミ
ジア・ニューモニエの抗原ポリペプチドを発現する感染
大腸菌のコロニーをスクリーニングし、陽性の感染大腸
菌からλファージを抽出し、この操作を繰り返してλフ
ァージを精製し、そのDNAを取得した。そして、遺伝
子組換え技術を利用してこのλファージのDNAと上述
のプラスミドpBBK10MMから組換えプラスミドベ
クターpCPN533Tを構築し、本発明を完成した。
【0010】即ち、本発明は、下記(1)〜(12)に
関するものである。 (1)配列番号1で示されるペプチドに、直接に又は介
在アミノ酸配列を介して、配列番号2で示されるペプチ
ドの中の連続した少なくとも5個のアミノ酸からなる配
列を含むポリペプチドAが結合した、ジヒドロ葉酸還元
酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質。 (2)ポリペプチドAが、配列番号2で示されるペプチ
ドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドである、前
記(1)記載の融合タンパク質。 (3)ポリペプチドAが、配列番号2で示されるペプチ
ドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか又
は配列番号2で示されるペプチドの中にアミノ酸が挿入
されているポリペプチドである、前記(1)記載の融合
タンパク質。 (4)配列番号3で示されるペプチドである、前記
(1)記載の融合タンパク質。 (5)配列番号4で示されるペプチドである、前記
(1)記載の融合タンパク質。
関するものである。 (1)配列番号1で示されるペプチドに、直接に又は介
在アミノ酸配列を介して、配列番号2で示されるペプチ
ドの中の連続した少なくとも5個のアミノ酸からなる配
列を含むポリペプチドAが結合した、ジヒドロ葉酸還元
酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質。 (2)ポリペプチドAが、配列番号2で示されるペプチ
ドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドである、前
記(1)記載の融合タンパク質。 (3)ポリペプチドAが、配列番号2で示されるペプチ
ドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているか又
は配列番号2で示されるペプチドの中にアミノ酸が挿入
されているポリペプチドである、前記(1)記載の融合
タンパク質。 (4)配列番号3で示されるペプチドである、前記
(1)記載の融合タンパク質。 (5)配列番号4で示されるペプチドである、前記
(1)記載の融合タンパク質。
【0011】(6)前記(1)〜(5)のいずれかに記
載の融合タンパク質をコードするDNA若しくはそれに
相補的なDNA。 (7)配列番号5で示される塩基配列を有する、前記
(6)記載のDNA。 (8)配列番号6で示される塩基配列を有する、前記
(6)記載のDNA。 (9)前記(6)〜(8)のいずれかに記載のDNAを
含む組換えベクター。 (10)pCPN533Tプラスミドである前記(9)
記載の組換えベクター。 (11)前記(6)又は(10)に記載の組換えベクタ
ーを含む形質転換体。 (12)前記(1)〜(5)のいずれかに記載の融合タ
ンパク質を抗原として用いることを特徴とする、抗クラ
ミジア・ニューモニエ抗体の製造法。 なお、本明細書において、塩基の数が1のデオキシヌク
レオチドはモノデオキシヌクレオチドといい、塩基の数
が2以上のデオキシヌクレオチドは、特に断らない限
り、DNAと総称した。
載の融合タンパク質をコードするDNA若しくはそれに
相補的なDNA。 (7)配列番号5で示される塩基配列を有する、前記
(6)記載のDNA。 (8)配列番号6で示される塩基配列を有する、前記
(6)記載のDNA。 (9)前記(6)〜(8)のいずれかに記載のDNAを
含む組換えベクター。 (10)pCPN533Tプラスミドである前記(9)
記載の組換えベクター。 (11)前記(6)又は(10)に記載の組換えベクタ
ーを含む形質転換体。 (12)前記(1)〜(5)のいずれかに記載の融合タ
ンパク質を抗原として用いることを特徴とする、抗クラ
ミジア・ニューモニエ抗体の製造法。 なお、本明細書において、塩基の数が1のデオキシヌク
レオチドはモノデオキシヌクレオチドといい、塩基の数
が2以上のデオキシヌクレオチドは、特に断らない限
り、DNAと総称した。
【0012】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 クラミジア・ニューモニエ抗原 本発明において、クラミジア・ニューモニエ抗原は、ペ
プチドが抗原性を有する最小の大きさの観点から、配列
番号2で示されるペプチドの中の連続した少なくとも5
個のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド(以下
「ポリペプチドA」という)からなるものである。ポリ
ペプチドAのペプチド鎖中に含有されるクラミジア・ニ
ューモニエ抗原ポリペプチド由来のアミノ酸配列が長い
ほうが高感度の抗原抗体反応を期待できることから、ポ
リペプチドAとしては、配列番号2で示されるペプチド
の中の連続した20個以上のアミノ酸からなる配列を含
むポリペプチドであることが好ましく、100個以上の
アミノ酸からなる配列を含むポリペプチドであることが
より好ましく、250個以上のアミノ酸からなる配列を
含むポリペプチドであることがさらに好ましい。
プチドが抗原性を有する最小の大きさの観点から、配列
番号2で示されるペプチドの中の連続した少なくとも5
個のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド(以下
「ポリペプチドA」という)からなるものである。ポリ
ペプチドAのペプチド鎖中に含有されるクラミジア・ニ
ューモニエ抗原ポリペプチド由来のアミノ酸配列が長い
ほうが高感度の抗原抗体反応を期待できることから、ポ
リペプチドAとしては、配列番号2で示されるペプチド
の中の連続した20個以上のアミノ酸からなる配列を含
むポリペプチドであることが好ましく、100個以上の
アミノ酸からなる配列を含むポリペプチドであることが
より好ましく、250個以上のアミノ酸からなる配列を
含むポリペプチドであることがさらに好ましい。
【0013】また、クラミジア・ニューモニエ抗原とし
ての抗原性を保有する限り、ポリペプチドAは、配列番
号2で示されるペプチドからアミノ酸(例えば1〜25
0個)が欠落しているものであってもよい。欠落するア
ミノ酸の個数が多すぎると、ポリペプチドAのクラミジ
ア・ニューモニエ抗原としての抗原性が損なわれる傾向
がある。欠落するアミノ酸の個数が多い場合(例えば5
個以上)、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原
性が低下しやすいので、この低下をできるだけ小さくす
るためには、配列番号2で示されるペプチドから欠落す
るアミノ酸は連続(例えば5個以上)しているものであ
ることが好ましい。
ての抗原性を保有する限り、ポリペプチドAは、配列番
号2で示されるペプチドからアミノ酸(例えば1〜25
0個)が欠落しているものであってもよい。欠落するア
ミノ酸の個数が多すぎると、ポリペプチドAのクラミジ
ア・ニューモニエ抗原としての抗原性が損なわれる傾向
がある。欠落するアミノ酸の個数が多い場合(例えば5
個以上)、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原
性が低下しやすいので、この低下をできるだけ小さくす
るためには、配列番号2で示されるペプチドから欠落す
るアミノ酸は連続(例えば5個以上)しているものであ
ることが好ましい。
【0014】また、クラミジア・ニューモニエ抗原とし
ての抗原性を保有する限り、ポリペプチドAとしては、
クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド由来のアミ
ノ酸配列に加えてそれ以外のアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドを利用することもできるが、このポリペプチ
ドは、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性に
対して、クラミジア・ニューモニエ抗原以外の物質とし
ての抗原性がないか又は低いことが必要とされる。この
ようなポリペプチドの例としては、配列番号2で示され
るペプチドの中のアミノ酸(例えば1〜100個)が他
のアミノ酸で置換されているポリペプチド、配列番号2
で示されるペプチドの中にアミノ酸(例えば1〜100
個)が挿入されているポリペプチド等が挙げられる。
ての抗原性を保有する限り、ポリペプチドAとしては、
クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド由来のアミ
ノ酸配列に加えてそれ以外のアミノ酸配列を含有するポ
リペプチドを利用することもできるが、このポリペプチ
ドは、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原性に
対して、クラミジア・ニューモニエ抗原以外の物質とし
ての抗原性がないか又は低いことが必要とされる。この
ようなポリペプチドの例としては、配列番号2で示され
るペプチドの中のアミノ酸(例えば1〜100個)が他
のアミノ酸で置換されているポリペプチド、配列番号2
で示されるペプチドの中にアミノ酸(例えば1〜100
個)が挿入されているポリペプチド等が挙げられる。
【0015】置換又は挿入されるアミノ酸の個数が多い
場合(例えば5個以上)、クラミジア・ニューモニエ抗
原としての抗原性が低下しやすいので、この低下をでき
るだけ小さくするためには、配列番号2で示されるペプ
チドの中において置換又は挿入されるアミノ酸は連続
(例えば5個以上)しているものであることが好まし
い。置換されるアミノ酸は類似の性質を有するものであ
ることが好ましく、例えば、グリシンとアラニンの置換
が挙げられる。ポリペプチドAの具体例としては、例え
ば、配列番号2で示されるペプチド、配列番号2で示さ
れるペプチドの488番目のアミノ酸であるアラニンが
グリシンに置換されたペプチド、配列番号4で示される
ペプチドの162〜432番目のアミノ酸配列からなる
ペプチド、が挙げられる。
場合(例えば5個以上)、クラミジア・ニューモニエ抗
原としての抗原性が低下しやすいので、この低下をでき
るだけ小さくするためには、配列番号2で示されるペプ
チドの中において置換又は挿入されるアミノ酸は連続
(例えば5個以上)しているものであることが好まし
い。置換されるアミノ酸は類似の性質を有するものであ
ることが好ましく、例えば、グリシンとアラニンの置換
が挙げられる。ポリペプチドAの具体例としては、例え
ば、配列番号2で示されるペプチド、配列番号2で示さ
れるペプチドの488番目のアミノ酸であるアラニンが
グリシンに置換されたペプチド、配列番号4で示される
ペプチドの162〜432番目のアミノ酸配列からなる
ペプチド、が挙げられる。
【0016】ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニュ
ーモニエ抗原融合タンパク質 本発明のジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモ
ニエ抗原融合タンパク質は、配列番号1で示されるペプ
チドに、直接に又は介在アミノ酸配列を介して、配列番
号2で示されるペプチドの中の連続した少なくとも5個
のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチドAが結合し
たものである。配列番号1で示されるペプチドは、融合
タンパク質のうち、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)
部分である。配列番号2で示されるペプチドの中の連続
した少なくとも5個のアミノ酸からなる配列を含むポリ
ペプチドAは、前記したクラミジア・ニューモニエ抗原
部分である。介在アミノ酸配列は特に限定されないが、
例えば、ロイシン、ロイシン−メチオニンのアミノ酸配
列等が挙げられる。
ーモニエ抗原融合タンパク質 本発明のジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモ
ニエ抗原融合タンパク質は、配列番号1で示されるペプ
チドに、直接に又は介在アミノ酸配列を介して、配列番
号2で示されるペプチドの中の連続した少なくとも5個
のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチドAが結合し
たものである。配列番号1で示されるペプチドは、融合
タンパク質のうち、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)
部分である。配列番号2で示されるペプチドの中の連続
した少なくとも5個のアミノ酸からなる配列を含むポリ
ペプチドAは、前記したクラミジア・ニューモニエ抗原
部分である。介在アミノ酸配列は特に限定されないが、
例えば、ロイシン、ロイシン−メチオニンのアミノ酸配
列等が挙げられる。
【0017】本発明のDHFR−クラミジア・ニューモ
ニエ抗原融合タンパク質の具体例としては、例えば、配
列番号3及び配列番号4で示されるペプチドが挙げられ
る。配列番号3で示されるペプチドは、DHFRにクラ
ミジア・ニューモニエの53KDaの抗原ポリペプチド
全体が結合した融合タンパク質であり、クラミジア・ニ
ューモニエ抗原としての抗原性を保有する。配列番号4
で示されるペプチドは、DHFRにクラミジア・ニュー
モニエの53KDaの抗原ポリペプチドの一部と他のペ
プチドが結合した融合タンパク質であり、クラミジア・
ニューモニエ抗原としての抗原性を保有する。上記融合
タンパク質の中では、クラミジア・ニューモニエの53
KDaの抗原ポリペプチド全体を含むものである配列番
号3で示されるペプチドが好ましい。
ニエ抗原融合タンパク質の具体例としては、例えば、配
列番号3及び配列番号4で示されるペプチドが挙げられ
る。配列番号3で示されるペプチドは、DHFRにクラ
ミジア・ニューモニエの53KDaの抗原ポリペプチド
全体が結合した融合タンパク質であり、クラミジア・ニ
ューモニエ抗原としての抗原性を保有する。配列番号4
で示されるペプチドは、DHFRにクラミジア・ニュー
モニエの53KDaの抗原ポリペプチドの一部と他のペ
プチドが結合した融合タンパク質であり、クラミジア・
ニューモニエ抗原としての抗原性を保有する。上記融合
タンパク質の中では、クラミジア・ニューモニエの53
KDaの抗原ポリペプチド全体を含むものである配列番
号3で示されるペプチドが好ましい。
【0018】DHFR−クラミジア・ニューモニエ抗原
融合タンパク質の製造法 本発明のDHFR−クラミジア・ニューモニエ抗原融合
タンパク質を製造する方法としては、例えば、遺伝子組
換え法が挙げられる。遺伝子組換え法としては、例え
ば、前記融合タンパク質をコードするDNAをベクター
に挿入して組換えベクターを構築し、それを宿主に挿入
して形質転換体を作製し、その形質転換体から目的の融
合タンパク質を精製する方法が挙げられる。前記融合タ
ンパク質をコードするDNAについては後述する。ベク
ターとしては、例えば、プラスミドやファージ等が挙げ
られる。宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母
等が挙げられる。以下、形質転換体の作製法と、その形
質転換体を用いた目的の融合タンパク質の精製法につい
て詳しく説明する。
融合タンパク質の製造法 本発明のDHFR−クラミジア・ニューモニエ抗原融合
タンパク質を製造する方法としては、例えば、遺伝子組
換え法が挙げられる。遺伝子組換え法としては、例え
ば、前記融合タンパク質をコードするDNAをベクター
に挿入して組換えベクターを構築し、それを宿主に挿入
して形質転換体を作製し、その形質転換体から目的の融
合タンパク質を精製する方法が挙げられる。前記融合タ
ンパク質をコードするDNAについては後述する。ベク
ターとしては、例えば、プラスミドやファージ等が挙げ
られる。宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母
等が挙げられる。以下、形質転換体の作製法と、その形
質転換体を用いた目的の融合タンパク質の精製法につい
て詳しく説明する。
【0019】融合タンパク質をコードするDNAを含む
組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の作
製 まず、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコ
ードするDNA(後述)と、DHFRをコードするDN
A(後述)とを市販のキット等を利用して連結する。市
販のキットとしては、例えば、DNAライゲーションキ
ット(宝酒造(株)商品名)を用いることができる。連結
によって得られたDNAが複製起点を持たず、プラスミ
ドやファージ等として機能しない場合は、このDNAを
新たなプラスミドベクターやファージベクターに挿入
し、組換えベクターを構築する。新たなプラスミドベク
ターとしては、例えば、pBR322、pUC18、p
UC19等を使用することができる。いずれにしても、
融合タンパク質をコードするDNAの挿入箇所はプロモ
ーター領域の下流であることが必要とされる。
組換えベクターの作製、及びそれを含む形質転換体の作
製 まず、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコ
ードするDNA(後述)と、DHFRをコードするDN
A(後述)とを市販のキット等を利用して連結する。市
販のキットとしては、例えば、DNAライゲーションキ
ット(宝酒造(株)商品名)を用いることができる。連結
によって得られたDNAが複製起点を持たず、プラスミ
ドやファージ等として機能しない場合は、このDNAを
新たなプラスミドベクターやファージベクターに挿入
し、組換えベクターを構築する。新たなプラスミドベク
ターとしては、例えば、pBR322、pUC18、p
UC19等を使用することができる。いずれにしても、
融合タンパク質をコードするDNAの挿入箇所はプロモ
ーター領域の下流であることが必要とされる。
【0020】上記連結の反応物又は得られた組換えベク
ターを宿主に入れ、形質転換体を作製する。大腸菌由来
のプラスミドやλファージを使用する場合は宿主として
は大腸菌を使用することができ、例えば、大腸菌HB1
01株を使用することができる。この宿主をコンピテン
トセルとなるように処理をする。大腸菌HB101株を
処理して得たコンピテントセルは宝酒造(株)等から販売
されている。上記連結の反応物を宿主に入れ、形質転換
体を作製する方法の一般的手法は、「サムブロック他編
集、モレキュラー・クローニング 第2版(コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー)(1989年)」(J.
Samblook et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold S
pring Harbor Laboratory Press (1989)、以下、本文
献を文献″モレキュラー・クローニング″という)に記
載されている。
ターを宿主に入れ、形質転換体を作製する。大腸菌由来
のプラスミドやλファージを使用する場合は宿主として
は大腸菌を使用することができ、例えば、大腸菌HB1
01株を使用することができる。この宿主をコンピテン
トセルとなるように処理をする。大腸菌HB101株を
処理して得たコンピテントセルは宝酒造(株)等から販売
されている。上記連結の反応物を宿主に入れ、形質転換
体を作製する方法の一般的手法は、「サムブロック他編
集、モレキュラー・クローニング 第2版(コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー)(1989年)」(J.
Samblook et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold S
pring Harbor Laboratory Press (1989)、以下、本文
献を文献″モレキュラー・クローニング″という)に記
載されている。
【0021】得られた形質転換体を培養してコロニーを
形成させ、各コロニーからプラスミドDNAを取得し、
適切な制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分
析し、所望の組換えプラスミドをもつ形質転換体を選択
する。このようにして作製されたプラスミドベクターと
しては、例えば、pCPN533Tプラスミドが挙げら
れる。このようにして作製された形質転換体としては、
例えば、前述の組換えベクターpCPN533Tが入っ
た大腸菌HB101株が挙げられ、この株は受託番号F
ERM BP−5222として工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されている。
形成させ、各コロニーからプラスミドDNAを取得し、
適切な制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分
析し、所望の組換えプラスミドをもつ形質転換体を選択
する。このようにして作製されたプラスミドベクターと
しては、例えば、pCPN533Tプラスミドが挙げら
れる。このようにして作製された形質転換体としては、
例えば、前述の組換えベクターpCPN533Tが入っ
た大腸菌HB101株が挙げられ、この株は受託番号F
ERM BP−5222として工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されている。
【0022】形質転換体を培養する方法としては、例え
ば、その形質転換体が成長しうる培地でこの目的の融合
タンパク質が形質転換体内に十分蓄積されるまで適温で
培養器を振とうする方法を使用することができる。形質
転換体として前述の組換えベクターpCPN533Tが
入った大腸菌HB101株を使用する場合は、アンピシ
リンを含むLB培地で37℃で一晩振とう培養し、その
後、この培養液をアンピシリン及びトリメトプリムを含
むTB培地等に接種してさらに37℃で一晩振とう培養
する方法を利用することができる。TB培地の調製方法
は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されて
いる。
ば、その形質転換体が成長しうる培地でこの目的の融合
タンパク質が形質転換体内に十分蓄積されるまで適温で
培養器を振とうする方法を使用することができる。形質
転換体として前述の組換えベクターpCPN533Tが
入った大腸菌HB101株を使用する場合は、アンピシ
リンを含むLB培地で37℃で一晩振とう培養し、その
後、この培養液をアンピシリン及びトリメトプリムを含
むTB培地等に接種してさらに37℃で一晩振とう培養
する方法を利用することができる。TB培地の調製方法
は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されて
いる。
【0023】培養した形質転換体を破砕する方法として
は、例えば、遠心分離で形質転換体を集め、これを緩衝
液に懸濁して懸濁液を作製し、この懸濁液に物理的な衝
撃を与える方法を採用することができる。緩衝液として
は、例えば、TE緩衝液を使用することができる。上記
懸濁液に物理的な衝撃を与える方法としては、例えば、
上記懸濁液に超音波を照射する方法を使用することがで
きる。形質転換体が大腸菌の場合は、上記懸濁液に物理
的な衝撃を与える代わりに、例えば、上記懸濁液にリゾ
チームを加え、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含
むTE緩衝液を加えて撹拌することよって形質転換体を
溶解させる方法を採用することもできる。形質転換体を
破砕又は溶解した後、遠心分離して細胞残渣を除去し、
上清を取得する。
は、例えば、遠心分離で形質転換体を集め、これを緩衝
液に懸濁して懸濁液を作製し、この懸濁液に物理的な衝
撃を与える方法を採用することができる。緩衝液として
は、例えば、TE緩衝液を使用することができる。上記
懸濁液に物理的な衝撃を与える方法としては、例えば、
上記懸濁液に超音波を照射する方法を使用することがで
きる。形質転換体が大腸菌の場合は、上記懸濁液に物理
的な衝撃を与える代わりに、例えば、上記懸濁液にリゾ
チームを加え、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含
むTE緩衝液を加えて撹拌することよって形質転換体を
溶解させる方法を採用することもできる。形質転換体を
破砕又は溶解した後、遠心分離して細胞残渣を除去し、
上清を取得する。
【0024】融合タンパク質の精製法としては、例え
ば、ストレプトマイシン硫酸塩を添加する核酸の除去及
び硫酸アンモニウムを添加する蛋白質の取得の各工程を
使用することができる。ストレプトマイシン硫酸塩を添
加して核酸を除去する工程としては、例えば、上記のい
ずれかの上清にストレプトマイシン硫酸塩を添加し、し
ばらく撹拌し、遠心分離することによって、核酸を沈殿
物として除去し、上清を取得する操作を使用することが
できる。硫酸アンモニウムを添加して蛋白質を取得する
工程としては、例えば、核酸を沈殿物として除去した後
の上清に硫酸アンモニウムを添加し、撹拌し、遠心分離
する操作を使用することができる。通常、沈殿を取得す
るが、目的の融合タンパク質が上清に含まれていること
もあり、サンプリングして、目的の融合タンパク質の有
無を確認しておくことが好ましい。
ば、ストレプトマイシン硫酸塩を添加する核酸の除去及
び硫酸アンモニウムを添加する蛋白質の取得の各工程を
使用することができる。ストレプトマイシン硫酸塩を添
加して核酸を除去する工程としては、例えば、上記のい
ずれかの上清にストレプトマイシン硫酸塩を添加し、し
ばらく撹拌し、遠心分離することによって、核酸を沈殿
物として除去し、上清を取得する操作を使用することが
できる。硫酸アンモニウムを添加して蛋白質を取得する
工程としては、例えば、核酸を沈殿物として除去した後
の上清に硫酸アンモニウムを添加し、撹拌し、遠心分離
する操作を使用することができる。通常、沈殿を取得す
るが、目的の融合タンパク質が上清に含まれていること
もあり、サンプリングして、目的の融合タンパク質の有
無を確認しておくことが好ましい。
【0025】続いて、目的とする融合タンパク質を含む
画分を取得する工程を行う。この工程としては、例え
ば、上記沈殿を少量の緩衝液に溶解したものか又は上記
上清を液体クロマトグラフィーによって分画し、目的と
する融合タンパク質が含有されている画分を同定してそ
の画分を取得する方法を使用することができる。目的と
する融合タンパク質が含有されている画分を同定する方
法としては、例えば、クラミジア・ニューモニエ特異的
モノクローナル抗体(後述)を用いるウェスタン・ブロ
ット法が挙げられる。細胞残渣の除去、ストレプトマイ
シン硫酸塩を添加するDNAの除去、硫酸アンモニウム
を添加する蛋白質の取得及びウェスタン・ブロット法の
具体的方法は、文献″モレキュラー・クローニング″に
記載されている。
画分を取得する工程を行う。この工程としては、例え
ば、上記沈殿を少量の緩衝液に溶解したものか又は上記
上清を液体クロマトグラフィーによって分画し、目的と
する融合タンパク質が含有されている画分を同定してそ
の画分を取得する方法を使用することができる。目的と
する融合タンパク質が含有されている画分を同定する方
法としては、例えば、クラミジア・ニューモニエ特異的
モノクローナル抗体(後述)を用いるウェスタン・ブロ
ット法が挙げられる。細胞残渣の除去、ストレプトマイ
シン硫酸塩を添加するDNAの除去、硫酸アンモニウム
を添加する蛋白質の取得及びウェスタン・ブロット法の
具体的方法は、文献″モレキュラー・クローニング″に
記載されている。
【0026】一方、DHFRの親和性を利用して目的と
する融合タンパク質を含む画分を取得する方法も利用す
ることができる。この方法は、例えば、前記上清等をメ
ソトレキセート−アガロースカラムに流し、融合タンパ
ク質をカラムに吸着させ、その後、葉酸を含む溶出液を
利用して融合タンパク質を溶出する工程を使用すること
ができる。
する融合タンパク質を含む画分を取得する方法も利用す
ることができる。この方法は、例えば、前記上清等をメ
ソトレキセート−アガロースカラムに流し、融合タンパ
ク質をカラムに吸着させ、その後、葉酸を含む溶出液を
利用して融合タンパク質を溶出する工程を使用すること
ができる。
【0027】融合タンパク質をコードするDNA 本発明において、融合タンパク質をコードするDNAと
は、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列を、トリプ
レット暗号表(それぞれのアミノ酸に対して、1〜6通
りのヌクレオチド配列が割り当てられている)に従って
アミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのDNA
群から選ばれるDNAのことである。融合タンパク質の
うち、DHFR部分の塩基配列の具体例としては、例え
ば、配列番号5で示される塩基配列の1〜480番目の
塩基配列が挙げられる。一方、クラミジア・ニューモニ
エ抗原部分の塩基配列の具体例としては、例えば、配列
番号5で示される塩基配列の484〜1947番目の塩
基配列が挙げられる。配列番号5で示される塩基配列の
481〜483番目の塩基配列は介在アミノ酸配列部分
の塩基配列である。
は、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列を、トリプ
レット暗号表(それぞれのアミノ酸に対して、1〜6通
りのヌクレオチド配列が割り当てられている)に従って
アミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときのDNA
群から選ばれるDNAのことである。融合タンパク質の
うち、DHFR部分の塩基配列の具体例としては、例え
ば、配列番号5で示される塩基配列の1〜480番目の
塩基配列が挙げられる。一方、クラミジア・ニューモニ
エ抗原部分の塩基配列の具体例としては、例えば、配列
番号5で示される塩基配列の484〜1947番目の塩
基配列が挙げられる。配列番号5で示される塩基配列の
481〜483番目の塩基配列は介在アミノ酸配列部分
の塩基配列である。
【0028】融合タンパク質をコードするDNAの具体
例としては、例えば、配列番号5で示される塩基配列及
び配列番号6で示される塩基配列が挙げられる。配列番
号5で示される塩基配列は、DHFRとクラミジア・ニ
ューモニエ53KDa抗原ポリペプチド全体の融合タン
パク質をコードするDNAとなっており、配列番号6で
示される塩基配列は、DHFRとクラミジア・ニューモ
ニエ53KDa抗原ポリペプチド(一部)の融合タンパ
ク質をコードするDNAとなっている。
例としては、例えば、配列番号5で示される塩基配列及
び配列番号6で示される塩基配列が挙げられる。配列番
号5で示される塩基配列は、DHFRとクラミジア・ニ
ューモニエ53KDa抗原ポリペプチド全体の融合タン
パク質をコードするDNAとなっており、配列番号6で
示される塩基配列は、DHFRとクラミジア・ニューモ
ニエ53KDa抗原ポリペプチド(一部)の融合タンパ
ク質をコードするDNAとなっている。
【0029】融合タンパク質をコードするDNAは、遺
伝子組換え法で作製することができる。遺伝子組換え法
としては、例えば、前述したように、クラミジア・ニュ
ーモニエ抗原ポリペプチドをコードするDNAと、DH
FRをコードするDNAを別々に取得し、遺伝子組換え
法によって両者を連結する方法が挙げられる。DHFR
をコードするDNAは、そのDNAを含むプラスミドベ
クターから制限酵素を用いてそのDNAを切り出すか、
あるいはそのDNAを有するプラスミドDNAやゲノム
DNAを鋳型とし、適切なプライマーを用いてPCR法
を行ってそのDNAを増幅することによって取得するこ
とができる。
伝子組換え法で作製することができる。遺伝子組換え法
としては、例えば、前述したように、クラミジア・ニュ
ーモニエ抗原ポリペプチドをコードするDNAと、DH
FRをコードするDNAを別々に取得し、遺伝子組換え
法によって両者を連結する方法が挙げられる。DHFR
をコードするDNAは、そのDNAを含むプラスミドベ
クターから制限酵素を用いてそのDNAを切り出すか、
あるいはそのDNAを有するプラスミドDNAやゲノム
DNAを鋳型とし、適切なプライマーを用いてPCR法
を行ってそのDNAを増幅することによって取得するこ
とができる。
【0030】前者の方法では、DHFRをコードするD
NAを含むプラスミドベクターとして、例えばプラスミ
ドベクターpBBK10MMや本発明の組換えベクター
でもあるpCPN533Tを利用することができる。p
CPN533Tを含む大腸菌は受託番号FERM (B
P−5222)として工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。この大腸菌(プラスミド保持菌)か
らプラスミドを取得するには、通常のプラスミドDNA
取得方法に従えば良く、この方法は文献″モレキュラー
・クローニング″に記載されている。プラスミドpBB
K10MMを用いる場合は制限酵素としてBamHI及びとX
hoIを使用し、約4.6KbpのDNA断片を切り出せばよ
い。
NAを含むプラスミドベクターとして、例えばプラスミ
ドベクターpBBK10MMや本発明の組換えベクター
でもあるpCPN533Tを利用することができる。p
CPN533Tを含む大腸菌は受託番号FERM (B
P−5222)として工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。この大腸菌(プラスミド保持菌)か
らプラスミドを取得するには、通常のプラスミドDNA
取得方法に従えば良く、この方法は文献″モレキュラー
・クローニング″に記載されている。プラスミドpBB
K10MMを用いる場合は制限酵素としてBamHI及びとX
hoIを使用し、約4.6KbpのDNA断片を切り出せばよ
い。
【0031】後者の方法では、プラスミドDNAとして
例えば前述のpBBK10MMやpCPN533Tをそ
のまま利用することができ、ゲノムDNAとしては例え
ば枯草菌のゲノムDNAを使用することができる。ゲノ
ムDNAを取得するには通常のゲノムDNA取得方法に
従えば良く、この方法は文献″モレキュラー・クローニ
ング″に記載されている。後者の方法に使用するプライ
マーは、DHFRをコードするDNAの5′末端と3′
末端にある塩基配列を考慮して設計・合成することがで
きる。例えば配列番号5の塩基配列の1番目から20番
目の配列を有するオリゴヌクレオチドと461番目から
480番目の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができる。これらのオリゴヌクレ
オチドは市販のDNA合成機を用いて化学合成すること
ができる。
例えば前述のpBBK10MMやpCPN533Tをそ
のまま利用することができ、ゲノムDNAとしては例え
ば枯草菌のゲノムDNAを使用することができる。ゲノ
ムDNAを取得するには通常のゲノムDNA取得方法に
従えば良く、この方法は文献″モレキュラー・クローニ
ング″に記載されている。後者の方法に使用するプライ
マーは、DHFRをコードするDNAの5′末端と3′
末端にある塩基配列を考慮して設計・合成することがで
きる。例えば配列番号5の塩基配列の1番目から20番
目の配列を有するオリゴヌクレオチドと461番目から
480番目の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレ
オチドを使用することができる。これらのオリゴヌクレ
オチドは市販のDNA合成機を用いて化学合成すること
ができる。
【0032】次に、クラミジア・ニューモニエから、ク
ラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードする
DNAをクローニングする方法について詳しく説明す
る。 クラミジア・ニューモニエの培養 培養したHL細胞等に予めクラミジア・ニューモニエを
感染させておき、この細胞をSPG液(ショ糖75.0
g、リン酸1カリウム0.52g、リン酸2カリウム
1.22g及びグルタミン酸0.72gを水1リットル
に溶解した水溶液、pH7.4〜7.6)に懸濁し、この
動物細胞を破砕又は溶解し、遠心分離して上清(クラミ
ジア・ニューモニエの浮遊液)を取得する。クラミジア
・ニューモニエとしては、例えば、クラミジア・ニュー
モニエYK41株(金本ら:ミクロバイオロジカル・イ
ムノロジー、37巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et
al.,Microbiol. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))
が使用できる。
ラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードする
DNAをクローニングする方法について詳しく説明す
る。 クラミジア・ニューモニエの培養 培養したHL細胞等に予めクラミジア・ニューモニエを
感染させておき、この細胞をSPG液(ショ糖75.0
g、リン酸1カリウム0.52g、リン酸2カリウム
1.22g及びグルタミン酸0.72gを水1リットル
に溶解した水溶液、pH7.4〜7.6)に懸濁し、この
動物細胞を破砕又は溶解し、遠心分離して上清(クラミ
ジア・ニューモニエの浮遊液)を取得する。クラミジア
・ニューモニエとしては、例えば、クラミジア・ニュー
モニエYK41株(金本ら:ミクロバイオロジカル・イ
ムノロジー、37巻、495-498頁、1993年(Y.Kanamoto et
al.,Microbiol. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993))
が使用できる。
【0033】培養したHL細胞等から細胞浮遊液を調製
し、培養上清を除去した後に前記クラミジア・ニューモ
ニエ浮遊液を添加して培養し、遠心分離し、細胞内でク
ラミジア・ニューモニエが増殖したクラミジア・ニュー
モニエ感染HL細胞を取得する。
し、培養上清を除去した後に前記クラミジア・ニューモ
ニエ浮遊液を添加して培養し、遠心分離し、細胞内でク
ラミジア・ニューモニエが増殖したクラミジア・ニュー
モニエ感染HL細胞を取得する。
【0034】クラミジア・ニューモニエの基本小体の精
製 クラミジア・ニューモニエ感染HL細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン(シェーリン
グ社製)を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離する。予備実験で黄色味がかった白いバンドの
中にクラミジア・ニューモニエの基本小体が含有されて
いることを電子顕微鏡で確認しているので、このバンド
を回収する。
製 クラミジア・ニューモニエ感染HL細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン(シェーリン
グ社製)を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離する。予備実験で黄色味がかった白いバンドの
中にクラミジア・ニューモニエの基本小体が含有されて
いることを電子顕微鏡で確認しているので、このバンド
を回収する。
【0035】クラミジア・ニューモニエのゲノムDNA
の調製 クラミジア・ニューモニエの基本小体を、1mM エチ
レンジアミン四酢酸(EDTA)を含む10mMトリス
−塩酸緩衝液(pH8.0)(以下、TE緩衝液とい
う。)に懸濁し、1%ドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)水溶液及び1mg/mlプロテイナーゼK水溶液を加え
て保温し、基本小体を溶解させる。0.1Mトリス−塩
酸緩衝液(pH8.0)飽和フェノールを加えて撹拌し、
遠心分離し、水層を回収する。さらにRNA分解酵素
(RNase)処理をし、フェノール/クロロホルム/
イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、
クラミジア・ニューモニエのゲノムDNAを取得する。
の調製 クラミジア・ニューモニエの基本小体を、1mM エチ
レンジアミン四酢酸(EDTA)を含む10mMトリス
−塩酸緩衝液(pH8.0)(以下、TE緩衝液とい
う。)に懸濁し、1%ドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)水溶液及び1mg/mlプロテイナーゼK水溶液を加え
て保温し、基本小体を溶解させる。0.1Mトリス−塩
酸緩衝液(pH8.0)飽和フェノールを加えて撹拌し、
遠心分離し、水層を回収する。さらにRNA分解酵素
(RNase)処理をし、フェノール/クロロホルム/
イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理をし、
クラミジア・ニューモニエのゲノムDNAを取得する。
【0036】ゲノムDNA発現ライブラリーの作製 ゲノムDNAを制限酵素AccI、HaeIII及びAl
uIで消化し、フェノール/クロロホルム/イソアミル
アルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化D
NAを取得する。この部分消化DNAにリンカー、アデ
ノシン−5′−三リン酸(adenosine 5′-triphosphat
e、以下、ATPと略す。)及びT4リガーゼを添加し
て、部分消化DNAにリンカーを付加させる。これを、
0.1M NaCl及び1mM EDTA含有10mM
トリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン60
00(Chroma spin 6000)カラムにかけ、溶出液を分取
し、1kbpから7kbpのDNA断片を含む分画を回
収する。得られた分画にATP及びT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加えて反応させ、DNA断片の5′端をリ
ン酸化する。反応液をフェノール/クロロホルム/イソ
アミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、5′
端がリン酸化されたDNA断片を取得する。
uIで消化し、フェノール/クロロホルム/イソアミル
アルコール処理とエタノール沈殿処理をし、部分消化D
NAを取得する。この部分消化DNAにリンカー、アデ
ノシン−5′−三リン酸(adenosine 5′-triphosphat
e、以下、ATPと略す。)及びT4リガーゼを添加し
て、部分消化DNAにリンカーを付加させる。これを、
0.1M NaCl及び1mM EDTA含有10mM
トリス−塩酸緩衝液を移動相とするクロマ・スピン60
00(Chroma spin 6000)カラムにかけ、溶出液を分取
し、1kbpから7kbpのDNA断片を含む分画を回
収する。得られた分画にATP及びT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼを加えて反応させ、DNA断片の5′端をリ
ン酸化する。反応液をフェノール/クロロホルム/イソ
アミルアルコール処理及びエタノール沈殿処理し、5′
端がリン酸化されたDNA断片を取得する。
【0037】このDNA断片に、予め制限酵素EcoR
Iで切断しておいたλgt11DNA、ATP及びT4リガ
ーゼを加えて反応させ、市販のパッケージングキットを
用い、得られた組換えλgt11DNAをパッケージング
し、ゲノムDNA発現ライブラリーを作製する。
Iで切断しておいたλgt11DNA、ATP及びT4リガ
ーゼを加えて反応させ、市販のパッケージングキットを
用い、得られた組換えλgt11DNAをパッケージング
し、ゲノムDNA発現ライブラリーを作製する。
【0038】クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドをコードするDNAのクローニング大腸菌Y1090
r−株の培養液に上記ゲノムDNA発現ライブラリーを
感染させ、寒天培地上で培養し、イソプロピルチオ−β
−D−ガラクトシド(IPTG)水溶液に浸漬したニト
ロセルロースフィルターを利用して、挿入DNAの発現
により菌体内に産生されたタンパク質をニトロセルロー
スフィルターに付着させる。このフィルターを牛血清ア
ルブミンを用いてブロッキング反応させ、洗浄し、次い
でフィルターをクラミジア・ニューモニエ特異的モノク
ローナル抗体と反応させる。クラミジア・ニューモニエ
特異的モノクローナル抗体としては、例えば、AY6E
2E8やSCP53を使用することができる。AY6E
2E8を産生するハイブリドーマは工業技術院生命工学
工業技術研究所に受託番号FERM BP−5154と
して寄託されている。また、SCP53を産生するハイ
ブリドーマについてはジャーナル・オブ・クリニカル・
ミクロバイオロジー、132巻、583-588頁(1994)(J. Cli
n. Microbiol.,Vol.132, p.583-588, 1994)に記載され
ている。反応後、フィルターを洗浄し、パーオキシダー
ゼ等の酵素で標識された抗マウスIgG抗体を反応させ
る。反応後、フィルターを洗浄し、発色基質液を添加し
て反応させる。発色基質液としては、例えば、過酸化水
素水溶液及び4−クロロ−1−ナフトールのメタノール
溶液を含む液を利用することができる。反応後、フィル
ターを洗浄し、風乾させる。
ドをコードするDNAのクローニング大腸菌Y1090
r−株の培養液に上記ゲノムDNA発現ライブラリーを
感染させ、寒天培地上で培養し、イソプロピルチオ−β
−D−ガラクトシド(IPTG)水溶液に浸漬したニト
ロセルロースフィルターを利用して、挿入DNAの発現
により菌体内に産生されたタンパク質をニトロセルロー
スフィルターに付着させる。このフィルターを牛血清ア
ルブミンを用いてブロッキング反応させ、洗浄し、次い
でフィルターをクラミジア・ニューモニエ特異的モノク
ローナル抗体と反応させる。クラミジア・ニューモニエ
特異的モノクローナル抗体としては、例えば、AY6E
2E8やSCP53を使用することができる。AY6E
2E8を産生するハイブリドーマは工業技術院生命工学
工業技術研究所に受託番号FERM BP−5154と
して寄託されている。また、SCP53を産生するハイ
ブリドーマについてはジャーナル・オブ・クリニカル・
ミクロバイオロジー、132巻、583-588頁(1994)(J. Cli
n. Microbiol.,Vol.132, p.583-588, 1994)に記載され
ている。反応後、フィルターを洗浄し、パーオキシダー
ゼ等の酵素で標識された抗マウスIgG抗体を反応させ
る。反応後、フィルターを洗浄し、発色基質液を添加し
て反応させる。発色基質液としては、例えば、過酸化水
素水溶液及び4−クロロ−1−ナフトールのメタノール
溶液を含む液を利用することができる。反応後、フィル
ターを洗浄し、風乾させる。
【0039】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファ
ージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗
体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原
又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードす
るDNAをクローン化し、クラミジア・ニューモニエ特
異的モノクローナル抗体反応性の前記ポリペプチドを発
現するλファージを取得する。
培地上のプラークを同定し、プラークに含まれるλファ
ージを取得する。プラークが全て上記モノクローナル抗
体と反応するようになるまで前記操作を繰り返し、抗原
又は有効成分として用いられるポリペプチドをコードす
るDNAをクローン化し、クラミジア・ニューモニエ特
異的モノクローナル抗体反応性の前記ポリペプチドを発
現するλファージを取得する。
【0040】クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドをコードするDNAの取得 取得したλファージを大腸菌Y1090r−株に感染さ
せ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキッ
トを用いてλファージからDNAを取得・精製する。こ
のDNAにプライマー、タックポリメラーゼ(Taq Poly
merase)及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、
冷却、保温の工程を繰り返し、λgt11に挿入されたDN
Aを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt11
・フォワード・プライマー(λgt11 forward primer)
及びλgt11・リバース・プライマー(λgt11 reverse p
rimer)(いずれも宝酒造株式会社製、商品名)が挙げ
られ、タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリ
タック・DNA・ポリメラーゼ(AmpliTaq DNA Polymer
ase)(宝酒造株式会社製、商品名)がある。このDN
A増幅方法の一般的手法はPCR法として知られてお
り、詳細は文献″モレキュラー・クローニング″に記載
されている。
ドをコードするDNAの取得 取得したλファージを大腸菌Y1090r−株に感染さ
せ、培養し、λファージを大量に生産する。市販のキッ
トを用いてλファージからDNAを取得・精製する。こ
のDNAにプライマー、タックポリメラーゼ(Taq Poly
merase)及びデオキシヌクレオチド類を添加し、加熱、
冷却、保温の工程を繰り返し、λgt11に挿入されたDN
Aを増幅させる。プライマーとしては、例えば、λgt11
・フォワード・プライマー(λgt11 forward primer)
及びλgt11・リバース・プライマー(λgt11 reverse p
rimer)(いずれも宝酒造株式会社製、商品名)が挙げ
られ、タックポリメラーゼとしては、例えば、アンプリ
タック・DNA・ポリメラーゼ(AmpliTaq DNA Polymer
ase)(宝酒造株式会社製、商品名)がある。このDN
A増幅方法の一般的手法はPCR法として知られてお
り、詳細は文献″モレキュラー・クローニング″に記載
されている。
【0041】増幅されたDNAを取得し、塩基配列を決
定・解析する。DNAの取得には市販のキットを使用す
ることができ、例えばウイザード・PCR・プレップキ
ット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製、
商品名)を使用することができる。また、塩基配列を決
定はタックポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータ
サイクルシークエンス法で行うことができ、この方法を
用いるには、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売
されているキットを使用することができる。また、分析
にあたっては市販の機械、例えば、373A型DNAシ
ークエンサ(アプライドバイオシステムズ社)を利用す
ることができる。
定・解析する。DNAの取得には市販のキットを使用す
ることができ、例えばウイザード・PCR・プレップキ
ット(Wizard PCR Prep kit)(プロメガ(Promega)社製、
商品名)を使用することができる。また、塩基配列を決
定はタックポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミネータ
サイクルシークエンス法で行うことができ、この方法を
用いるには、パーキン・エルマー・ジャパン社から販売
されているキットを使用することができる。また、分析
にあたっては市販の機械、例えば、373A型DNAシ
ークエンサ(アプライドバイオシステムズ社)を利用す
ることができる。
【0042】塩基配列の決定後、得られたDNA塩基配
列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミ
ノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトと
しては、「DNASIS」(日立ソフトウェアエンジニ
アリング社)を用いることができる。解析の結果、完全
長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されて
いるDNAの前後のDNAをゲノムウォーキングによっ
て取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造
(株)から販売されているキットを使用することができ
る。一旦、抗原又は有効成分として用いられるポリペプ
チドをコードするDNAが取得されると、遺伝子組換え
法や前述したPCR法を利用することによって、そのD
NAを複製させることができるので、クラミジア・ニュ
ーモニエの基本小体からクラミジア・ニューモニエ抗原
ポリペプチドをコードするDNAを再度取得する操作は
不要である。
列を遺伝子配列分析ソフトで解析し、編集、連結、アミ
ノ酸翻訳領域の推定を行なう。遺伝子配列分析ソフトと
しては、「DNASIS」(日立ソフトウェアエンジニ
アリング社)を用いることができる。解析の結果、完全
長の遺伝子が取得できていない場合は、既に取得されて
いるDNAの前後のDNAをゲノムウォーキングによっ
て取得する。ゲノムウォーキングを行うには、宝酒造
(株)から販売されているキットを使用することができ
る。一旦、抗原又は有効成分として用いられるポリペプ
チドをコードするDNAが取得されると、遺伝子組換え
法や前述したPCR法を利用することによって、そのD
NAを複製させることができるので、クラミジア・ニュ
ーモニエの基本小体からクラミジア・ニューモニエ抗原
ポリペプチドをコードするDNAを再度取得する操作は
不要である。
【0043】遺伝子組換え法を用いる方法は、例えば、
次のようにして行うことができる。まず、取得された前
記DNAを上述したように既存のプラスミドベクターや
ファージベクター等に挿入して組換えベクターを作製
し、その組換えベクターを宿主に入れて形質転換体を作
製し、その形質転換体を培養する。この培養により形質
転換体内で組換えベクターが増幅されるので、その形質
転換体から増幅された組換えベクターを取得し、制限酵
素を用いて前記DNAを切り出す。形質転換体から増幅
された組換えベクターを取得する操作は、例えば、次の
ようにして行うことができる。組換えベクターがプラス
ミドである場合、その形質転換体を破砕し、フェノール
/クロロホルム処理とエタノール沈殿処理を行い、DN
Aを取得する。臭化エチジウム含有塩化セシウムを用
い、取得したDNAを超遠心分離し、組換えベクターを
プラスミドDNAとして取得する。一方、組換えベクタ
ーがファージである場合、その形質転換体を破砕し、フ
ァージ粒子を取得し、ファージ粒子を溶解し、組換えベ
クターをファージDNAとして取得する。
次のようにして行うことができる。まず、取得された前
記DNAを上述したように既存のプラスミドベクターや
ファージベクター等に挿入して組換えベクターを作製
し、その組換えベクターを宿主に入れて形質転換体を作
製し、その形質転換体を培養する。この培養により形質
転換体内で組換えベクターが増幅されるので、その形質
転換体から増幅された組換えベクターを取得し、制限酵
素を用いて前記DNAを切り出す。形質転換体から増幅
された組換えベクターを取得する操作は、例えば、次の
ようにして行うことができる。組換えベクターがプラス
ミドである場合、その形質転換体を破砕し、フェノール
/クロロホルム処理とエタノール沈殿処理を行い、DN
Aを取得する。臭化エチジウム含有塩化セシウムを用
い、取得したDNAを超遠心分離し、組換えベクターを
プラスミドDNAとして取得する。一方、組換えベクタ
ーがファージである場合、その形質転換体を破砕し、フ
ァージ粒子を取得し、ファージ粒子を溶解し、組換えベ
クターをファージDNAとして取得する。
【0044】PCR法を利用する方法としては、例え
ば、増幅させようとするDNAの両末端の塩基配列を基
にして化学合成法によりプライマーDNAを作製し、ク
ラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードする
DNAを鋳型DNAとしてPCRを行う方法を利用する
ことができる。遺伝子組換え法やPCR法を用いてDN
Aを複製させる方法の一般的手法は文献″モレキュラー
・クローニング″に記載されている。
ば、増幅させようとするDNAの両末端の塩基配列を基
にして化学合成法によりプライマーDNAを作製し、ク
ラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードする
DNAを鋳型DNAとしてPCRを行う方法を利用する
ことができる。遺伝子組換え法やPCR法を用いてDN
Aを複製させる方法の一般的手法は文献″モレキュラー
・クローニング″に記載されている。
【0045】融合タンパク質を抗原として用いる抗クラ
ミジア・ニューモニエ抗体の製造法抗クラミジア・ニュ
ーモニエ抗体を製造する方法としては、例えば、本発明
の融合タンパク質を抗原としてマウスを免疫し、そのひ
臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを作
製し、その中からクラミジア・ニューモニエの53KD
aの抗原ポリペプチドを認識するハイブリドーマを選択
し、これを培養し、その培養上清から抗クラミジア・ニ
ューモニエ抗体を取得する方法を利用することができ
る。骨髄腫細胞株としては、例えばP3X63Ag8.
653(ATCC CRL−1580)やP3/NSI
/1−Ag4−1(ATCC TIB−18)を使用す
ることができる。抗原として本発明の融合タンパク質を
使用すること以外は、マウスを免疫して抗体を得る公知
の一般的手法に従い、抗クラミジア・ニューモニエ抗体
を製造する。
ミジア・ニューモニエ抗体の製造法抗クラミジア・ニュ
ーモニエ抗体を製造する方法としては、例えば、本発明
の融合タンパク質を抗原としてマウスを免疫し、そのひ
臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを作
製し、その中からクラミジア・ニューモニエの53KD
aの抗原ポリペプチドを認識するハイブリドーマを選択
し、これを培養し、その培養上清から抗クラミジア・ニ
ューモニエ抗体を取得する方法を利用することができ
る。骨髄腫細胞株としては、例えばP3X63Ag8.
653(ATCC CRL−1580)やP3/NSI
/1−Ag4−1(ATCC TIB−18)を使用す
ることができる。抗原として本発明の融合タンパク質を
使用すること以外は、マウスを免疫して抗体を得る公知
の一般的手法に従い、抗クラミジア・ニューモニエ抗体
を製造する。
【0046】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
以下の実施例において、使用したモノクローナル抗体
は、SCP53及びAY6E2E8である。SCP53
は、本発明者の一人の松本等がクラミジア・ニューモニ
エKKpn−1株を抗原として、マウスを免疫し、その
脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて得られたハイブ
リドーマSCP53が分泌する抗体であり、また、AY
6E2E8は、本発明者の一人の井筒等が、クラミジア
・ニューモニエYK−41株の基本小体を抗原として、
マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマと細胞融合
させて得られたハイブリドーマAY6E2E8が分泌す
る抗体AY6E2E8である。表1に示されるように、
モノクローナル抗体のSCP53及びAY6E2E8は C.ニュ
ーモニエに特異的である。
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
以下の実施例において、使用したモノクローナル抗体
は、SCP53及びAY6E2E8である。SCP53
は、本発明者の一人の松本等がクラミジア・ニューモニ
エKKpn−1株を抗原として、マウスを免疫し、その
脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて得られたハイブ
リドーマSCP53が分泌する抗体であり、また、AY
6E2E8は、本発明者の一人の井筒等が、クラミジア
・ニューモニエYK−41株の基本小体を抗原として、
マウスを免疫し、その脾臓細胞をミエローマと細胞融合
させて得られたハイブリドーマAY6E2E8が分泌す
る抗体AY6E2E8である。表1に示されるように、
モノクローナル抗体のSCP53及びAY6E2E8は C.ニュ
ーモニエに特異的である。
【0047】
【表1】
【0048】モノクローナル抗体の作製方法については
後述する。以下、クラミジア・ニューモニエの宿主細胞
の培養から、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプ
チドの遺伝子DNA配列とアミノ酸配列の決定まで、順
を追って説明する。
後述する。以下、クラミジア・ニューモニエの宿主細胞
の培養から、クラミジア・ニューモニエの抗原ポリペプ
チドの遺伝子DNA配列とアミノ酸配列の決定まで、順
を追って説明する。
【0049】実施例1 クラミジア・ニューモニエ特異
的53K抗原ポリペプチドをコードするDNAの作製 (A)宿主細胞(HL細胞)の培養 予め、プラスチック製培養フラスコ(75cm2)の底面
いっぱいに増殖させたHL細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液(以下、PBSという。)マグネシウム不含(−)液
5mlで洗浄し、0.1%(w/v)トリプシンを含むP
BSを5ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を
捨てた後、37℃で10分間保温し、10%(v/v)
牛胎児血清を含むダルベッコMEM培地5mlを加え、ピ
ペッテイングによりHL細胞を剥離して、細胞浮遊液を
調製した。この細胞浮遊液8mlと10%牛胎児血清含有
ダルベッコMEM培地292mlとの混合液4mlずつを6
ウェルプラスチック製培養容器の各ウェルに加え、5%
(v/v)炭酸ガス雰囲気下で培養した。
的53K抗原ポリペプチドをコードするDNAの作製 (A)宿主細胞(HL細胞)の培養 予め、プラスチック製培養フラスコ(75cm2)の底面
いっぱいに増殖させたHL細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液(以下、PBSという。)マグネシウム不含(−)液
5mlで洗浄し、0.1%(w/v)トリプシンを含むP
BSを5ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を
捨てた後、37℃で10分間保温し、10%(v/v)
牛胎児血清を含むダルベッコMEM培地5mlを加え、ピ
ペッテイングによりHL細胞を剥離して、細胞浮遊液を
調製した。この細胞浮遊液8mlと10%牛胎児血清含有
ダルベッコMEM培地292mlとの混合液4mlずつを6
ウェルプラスチック製培養容器の各ウェルに加え、5%
(v/v)炭酸ガス雰囲気下で培養した。
【0050】(B)クラミジア・ニューモニエYK−4
1の培養 クラミジアとして、クラミジア・ニューモニエYK−4
1株(金本ら:Microbiol.Immunol.,Vol.37,P.495-498,
1993)を用いた。取得したHL細胞に予めクラミジア・
ニューモニエYK−41株を感染させておき、この細胞
をSPG液に懸濁し、ポリプロピレン製遠心チューブに
入れ、これに1秒間隔で30回超音波を照射し、遠心チ
ューブを1,500×gで3分間遠心分離し、上清を取
得し、クラミジア・ニューモニエ浮遊液とした。6ウェ
ルプラスチック製培養容器(底面上)に増殖したHL細
胞の培養上清をピペットで取り除き、これにクラミジア
・ニューモニエ浮遊液を1ウェルあたり2ml加えて、
2,000rpmで1時間遠心吸着を行った。遠心吸着
後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、1μg/ml
シクロヘキシミド及び10%(v/v)牛胎児血清を含
むダルベッコMEM培地をウェルあたり4ml加え、5%
(v/v)炭酸ガス雰囲気下、36℃で3日間培養し
た。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞
を回収した。これを8,000rpmで30分間遠心分離
して、沈殿をSPGに再懸濁し、−70℃で保存した。
1の培養 クラミジアとして、クラミジア・ニューモニエYK−4
1株(金本ら:Microbiol.Immunol.,Vol.37,P.495-498,
1993)を用いた。取得したHL細胞に予めクラミジア・
ニューモニエYK−41株を感染させておき、この細胞
をSPG液に懸濁し、ポリプロピレン製遠心チューブに
入れ、これに1秒間隔で30回超音波を照射し、遠心チ
ューブを1,500×gで3分間遠心分離し、上清を取
得し、クラミジア・ニューモニエ浮遊液とした。6ウェ
ルプラスチック製培養容器(底面上)に増殖したHL細
胞の培養上清をピペットで取り除き、これにクラミジア
・ニューモニエ浮遊液を1ウェルあたり2ml加えて、
2,000rpmで1時間遠心吸着を行った。遠心吸着
後、クラミジア・ニューモニエ浮遊液を除き、1μg/ml
シクロヘキシミド及び10%(v/v)牛胎児血清を含
むダルベッコMEM培地をウェルあたり4ml加え、5%
(v/v)炭酸ガス雰囲気下、36℃で3日間培養し
た。培養後、滅菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞
を回収した。これを8,000rpmで30分間遠心分離
して、沈殿をSPGに再懸濁し、−70℃で保存した。
【0051】(C)クラミジア・ニューモニエYK−4
1の基本小体の精製 −70℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエY
K−41感染凍結HL細胞浮遊液を融解し、テフロンホ
モジナイザーでホモジナイズした。2,500rpmで1
0分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びSPG
に懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の
操作を更に2回行い、得られた上清は集めて合わせた。
1の基本小体の精製 −70℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエY
K−41感染凍結HL細胞浮遊液を融解し、テフロンホ
モジナイザーでホモジナイズした。2,500rpmで1
0分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びSPG
に懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の
操作を更に2回行い、得られた上清は集めて合わせた。
【0052】別途、遠心管に50%(w/v)庶糖を含
む0.03Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)、次い
で、ウログラフィン76%(シェーリング社製)3容量
と0.03Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)7容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、8,000rpmで1時間遠心分離した。50
%(w/v)庶糖を含む0.03Mトリス−塩酸緩衝液
(pH7.4)層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のSPG液を加え、10,000rpmで30分間遠心分
離した。上清を捨て、沈殿をSPG液に懸濁した。遠心
分離管に、ウログラフィン76%(シェーリング社製)
と0.03Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)の35%
から50%(総量に対する前者の容量比)までの連続密
度勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、8000
rpmで1時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ
YK41の基本小体に相当する黄色味を帯びた白濁した
バンドを回収し、これをSPG液で2倍に希釈し、10
000rpmで30分間遠心分離した。得られた沈殿をS
PG液に懸濁し、タンパク質濃度を測定(バイオラッド
社のタンパク測定キットを用い、牛血清アルブミンを標
準とした)後、−70℃で保存した。
む0.03Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)、次い
で、ウログラフィン76%(シェーリング社製)3容量
と0.03Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)7容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、8,000rpmで1時間遠心分離した。50
%(w/v)庶糖を含む0.03Mトリス−塩酸緩衝液
(pH7.4)層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のSPG液を加え、10,000rpmで30分間遠心分
離した。上清を捨て、沈殿をSPG液に懸濁した。遠心
分離管に、ウログラフィン76%(シェーリング社製)
と0.03Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4)の35%
から50%(総量に対する前者の容量比)までの連続密
度勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、8000
rpmで1時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ
YK41の基本小体に相当する黄色味を帯びた白濁した
バンドを回収し、これをSPG液で2倍に希釈し、10
000rpmで30分間遠心分離した。得られた沈殿をS
PG液に懸濁し、タンパク質濃度を測定(バイオラッド
社のタンパク測定キットを用い、牛血清アルブミンを標
準とした)後、−70℃で保存した。
【0053】(D)クラミジア・ニューモニエYK−4
1株のゲノムDNAの調製 上記精製クラミジア・ニューモニエYK−41株の基本
小体の懸濁液300μl(タンパク質濃度:1.37mg
/ml)を4℃、12,000rpmで5分間遠心分離した。
沈殿に1mM EDTAを含む10mMトリス−塩酸緩
衝液pH8.0(以下、TE緩衝液という)500μlを
加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を3
00μlのTE緩衝液に懸濁した。1%SDS水溶液3
0μl及び1mg/mlプロテイナーゼK水溶液30μlを
加え、56℃で30分間インキュベートし、基本小体を
溶解させた。0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)
飽和フェノール350μlを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合後、4℃、12,000rpmで5分間遠心
分離し、水層を回収した(DNAの抽出)。この抽出操
作はもう一度繰り返した。10mg/mlのRNase溶液
を2μl加え、37℃で2時間インキュベートし、RN
Aを分解した。0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.
0)飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアル
コールの25:24:1(容量比)の混合液(以下、P
CIという。)300μlを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合し、4℃、12,000rpmで5分間遠心
分離し、水層を回収した。この操作を合計5回繰り返し
た。
1株のゲノムDNAの調製 上記精製クラミジア・ニューモニエYK−41株の基本
小体の懸濁液300μl(タンパク質濃度:1.37mg
/ml)を4℃、12,000rpmで5分間遠心分離した。
沈殿に1mM EDTAを含む10mMトリス−塩酸緩
衝液pH8.0(以下、TE緩衝液という)500μlを
加えて懸濁した。同様の遠心分離を再度行い、沈殿を3
00μlのTE緩衝液に懸濁した。1%SDS水溶液3
0μl及び1mg/mlプロテイナーゼK水溶液30μlを
加え、56℃で30分間インキュベートし、基本小体を
溶解させた。0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)
飽和フェノール350μlを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合後、4℃、12,000rpmで5分間遠心
分離し、水層を回収した(DNAの抽出)。この抽出操
作はもう一度繰り返した。10mg/mlのRNase溶液
を2μl加え、37℃で2時間インキュベートし、RN
Aを分解した。0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.
0)飽和フェノール、クロロホルム及びイソアミルアル
コールの25:24:1(容量比)の混合液(以下、P
CIという。)300μlを加え、ボルテックスミキサ
ーでよく混合し、4℃、12,000rpmで5分間遠心
分離し、水層を回収した。この操作を合計5回繰り返し
た。
【0054】得られた液にその1/10容の10M酢酸
アンモニウム水溶液及び2容のエタノールを加え、5分
間放置し、DNAを析出させた後、4℃、12,000
rpmで5分間遠心分離した。沈殿は70%エタノール水
溶液600μlを加え、混合し、4℃、12,000rp
mで5分間遠心分離する洗浄を2回繰り返した。遠沈管
のふたを開けたまま15分間放置して沈殿を乾燥させ、
これにTE200μlを加えて溶かし、−20℃に保存
した。
アンモニウム水溶液及び2容のエタノールを加え、5分
間放置し、DNAを析出させた後、4℃、12,000
rpmで5分間遠心分離した。沈殿は70%エタノール水
溶液600μlを加え、混合し、4℃、12,000rp
mで5分間遠心分離する洗浄を2回繰り返した。遠沈管
のふたを開けたまま15分間放置して沈殿を乾燥させ、
これにTE200μlを加えて溶かし、−20℃に保存
した。
【0055】(E)ゲノムDNA発現ライブラリーの作
製 ゲノムDNA溶液100μlに、制限酵素用M-buffer1
0μl、制限酵素混合液(AccI、HaeIII及び1
/50希釈のAluI各0.4μlとTE20μlを混
合)10μlを加え、37℃で20分間反応させた。な
お、上記20分の反応時間は、DNAが1kbp〜7k
bpの大きさの部分消化DNAに分解される時間で、予
め少量のゲノムDNAを用いて試験した。上記反応液に
PCIを100μl加え、ボルテックスミキサーでよく
混ぜ、4℃、12,000rpmで5分間遠心分離し、水
層を回収した。これに3M酢酸ナトリウム水溶液10μ
l及びエタノール220μlを加え、−80℃に15分
間静置し、部分消化DNAを析出させた。4℃、12,
000rpmで5分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、
沈殿に70%エタノール水溶液500μlを加えて混
ぜ、再び、12,000rpmで5分間遠心分離した。上
清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。
製 ゲノムDNA溶液100μlに、制限酵素用M-buffer1
0μl、制限酵素混合液(AccI、HaeIII及び1
/50希釈のAluI各0.4μlとTE20μlを混
合)10μlを加え、37℃で20分間反応させた。な
お、上記20分の反応時間は、DNAが1kbp〜7k
bpの大きさの部分消化DNAに分解される時間で、予
め少量のゲノムDNAを用いて試験した。上記反応液に
PCIを100μl加え、ボルテックスミキサーでよく
混ぜ、4℃、12,000rpmで5分間遠心分離し、水
層を回収した。これに3M酢酸ナトリウム水溶液10μ
l及びエタノール220μlを加え、−80℃に15分
間静置し、部分消化DNAを析出させた。4℃、12,
000rpmで5分間遠心分離し、上清液を捨てたのち、
沈殿に70%エタノール水溶液500μlを加えて混
ぜ、再び、12,000rpmで5分間遠心分離した。上
清液を捨て、沈殿を減圧下に乾燥した。
【0056】得られた部分消化DNAを精製水20μl
に溶かし、その19μlをとり、これに下記化1で示す
リンカー(20pmole/μl)14μl、10mM AT
P4.5μl、50mM MgCl2、50mMジチオ
スレイトール及び500μg/ml牛血清アルブミン含有
0.2Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.6、以下、10倍
濃度ライゲーション用緩衝液という)4.5μl、精製
水2μl及びT4リガーゼ1μlを加え、16℃で4時
間反応させ、リンカーを付加させた。
に溶かし、その19μlをとり、これに下記化1で示す
リンカー(20pmole/μl)14μl、10mM AT
P4.5μl、50mM MgCl2、50mMジチオ
スレイトール及び500μg/ml牛血清アルブミン含有
0.2Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.6、以下、10倍
濃度ライゲーション用緩衝液という)4.5μl、精製
水2μl及びT4リガーゼ1μlを加え、16℃で4時
間反応させ、リンカーを付加させた。
【化1】
【0057】リンカーを付加させた部分消化DNAを、
0.1M NaCl及び1mM EDTA含有10mMト
リス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラ
ムにかけた。溶出液2滴ずつを分取し、各分画の一部を
0.8%アガロースゲル電気泳動で分析して、1kbp
から7kbpのDNA断片を含む分画を回収した。得ら
れた分画144μlに、精製水13μl、10mM A
TP 20μl、0.1M MgCl2、50mMジチオ
スレイトール、1mMスペルミジン塩酸塩及び1mM
EDTA含有0.5Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.6、
以下、10倍濃度リン酸化反応用緩衝液という。)20
μl、及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ3μlを加
え、37℃で30分間反応させ、DNA断片の5′端を
リン酸化した。PCI 200μlを加えてよく振り混
ぜた後、4℃、12,000rpmで5分間遠心分離し、
水層を回収した。20mg/mlグリコーゲン水溶液1μ
l、3M酢酸ナトリウム水溶液20μl及びエタノール
400μlを加えてヌクレオチドを析出させた。4℃、
12,000rpmで10分間遠心分離し、上清を捨て、
沈殿に70%エタノール200μlを加え混ぜ、再び遠
心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水1μlを
加え溶かした。
0.1M NaCl及び1mM EDTA含有10mMト
リス−塩酸緩衝液を移動相とするChroma spin 6000カラ
ムにかけた。溶出液2滴ずつを分取し、各分画の一部を
0.8%アガロースゲル電気泳動で分析して、1kbp
から7kbpのDNA断片を含む分画を回収した。得ら
れた分画144μlに、精製水13μl、10mM A
TP 20μl、0.1M MgCl2、50mMジチオ
スレイトール、1mMスペルミジン塩酸塩及び1mM
EDTA含有0.5Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.6、
以下、10倍濃度リン酸化反応用緩衝液という。)20
μl、及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ3μlを加
え、37℃で30分間反応させ、DNA断片の5′端を
リン酸化した。PCI 200μlを加えてよく振り混
ぜた後、4℃、12,000rpmで5分間遠心分離し、
水層を回収した。20mg/mlグリコーゲン水溶液1μ
l、3M酢酸ナトリウム水溶液20μl及びエタノール
400μlを加えてヌクレオチドを析出させた。4℃、
12,000rpmで10分間遠心分離し、上清を捨て、
沈殿に70%エタノール200μlを加え混ぜ、再び遠
心分離し、上清を捨て、沈殿を風乾し、精製水1μlを
加え溶かした。
【0058】この液0.6μlに、予め制限酵素Eco
RIで切断したλgt11 DNA(1μg/μl、ストラタジ
ーン(Stratagene)社)1μl、10倍濃度ライゲーシ
ョン用緩衝液0.5μl、10mM ATP0.5μl、
T4リガーゼ0.4μl及び精製水2μlを加え、4℃
で一晩反応させた。次いで、ギガパック(Gigapack)II
Goldパッケージングキット(ストラタジーン社)を用
い、得られた組換えλgt11DNAをパッケージングし
た。
RIで切断したλgt11 DNA(1μg/μl、ストラタジ
ーン(Stratagene)社)1μl、10倍濃度ライゲーシ
ョン用緩衝液0.5μl、10mM ATP0.5μl、
T4リガーゼ0.4μl及び精製水2μlを加え、4℃
で一晩反応させた。次いで、ギガパック(Gigapack)II
Goldパッケージングキット(ストラタジーン社)を用
い、得られた組換えλgt11DNAをパッケージングし
た。
【0059】(F)クラミジア・ニューモニエ特異的モ
ノクローナル抗体の作製 骨髄腫細胞株の培養及び継代 モノクローナル抗体の作製に用いた骨髄腫細胞株は、P
3/NSI/1−Ag4−1(ATCC TIB−1
8)である。10%(v/v)牛胎児血清を含むRPM
I1640培地で培養し、継代した。細胞融合に供する
2週間前に、0.13mMの8−アザグアニン、0.5
μg/mlのMC−210(マイコプラズマ除去剤、大日本
製薬(株)製)及び10%(v/v)牛胎児血清を含むR
PMI1640培地で1週間培養し、その後の1週間は
通常の培地で培養した。
ノクローナル抗体の作製 骨髄腫細胞株の培養及び継代 モノクローナル抗体の作製に用いた骨髄腫細胞株は、P
3/NSI/1−Ag4−1(ATCC TIB−1
8)である。10%(v/v)牛胎児血清を含むRPM
I1640培地で培養し、継代した。細胞融合に供する
2週間前に、0.13mMの8−アザグアニン、0.5
μg/mlのMC−210(マイコプラズマ除去剤、大日本
製薬(株)製)及び10%(v/v)牛胎児血清を含むR
PMI1640培地で1週間培養し、その後の1週間は
通常の培地で培養した。
【0060】マウスの免疫 タンパク質の濃度が270μg/mlの上記基本小体の懸濁
液200μlを、12000rpmで10分間遠心分離
し、沈殿に200μlのPBSを加え、再懸濁した。こ
れに200μlのフロイントコンプリートアジュバント
を加え、エマルジョンとし、その150μlをマウスの
背中の皮下に注射した(この日を0日目とする)。14
日目、34日目及び49日目に、タンパク質の濃度が2
70μg/mlの精製基本小体の懸濁液100μlをマウス
の腹腔内に注射した。更に、69日目にタンパク質の濃
度が800μg/mlの精製基本小体の懸濁液50μl、9
2日目に同懸濁液100μlをマウスの腹腔内に注射
し、95日目に脾臓を取りだし、細胞融合に供した。
液200μlを、12000rpmで10分間遠心分離
し、沈殿に200μlのPBSを加え、再懸濁した。こ
れに200μlのフロイントコンプリートアジュバント
を加え、エマルジョンとし、その150μlをマウスの
背中の皮下に注射した(この日を0日目とする)。14
日目、34日目及び49日目に、タンパク質の濃度が2
70μg/mlの精製基本小体の懸濁液100μlをマウス
の腹腔内に注射した。更に、69日目にタンパク質の濃
度が800μg/mlの精製基本小体の懸濁液50μl、9
2日目に同懸濁液100μlをマウスの腹腔内に注射
し、95日目に脾臓を取りだし、細胞融合に供した。
【0061】細胞融合 免疫したマウスの脾臓から得られた脾細胞108個に対
して骨髄腫細胞107個を丸底ガラスチューブにとり、
よく混合し、1400rpmで5分間遠心分離し、上清を
除去した後、細胞を更によく混合した。予め37℃に保
温しておいた30%(w/v)ポリエチレングリコール
を含むRPMI1640培地0.4mlを加え、30秒間
放置した。700rpmで6分間遠心分離した後、RPM
I1640培地10mlを加え、ポリエチレングリコール
がよく混ざるようにガラスチューブをゆっくり回転さ
せ、1400rpmで5分間遠心分離し、上清を完全に
除去し、沈殿に5mlのHAT培地を加え、5分間放置し
た。更に10〜20mlのHAT培地を加え、30分間放
置した後、骨髄腫細胞濃度が3.3×105/mlとなるよ
うにHAT培地を加えて細胞を懸濁させ、パスツールピ
ペットを用い96ウェルプラスチック製培養容器のウェ
ルに2滴ずつ分注した。5%(v/v)炭酸ガス雰囲気
下、36℃で培養し、1日後、7日後及び14日後にウ
ェルにHAT培地を1〜2滴加えた。
して骨髄腫細胞107個を丸底ガラスチューブにとり、
よく混合し、1400rpmで5分間遠心分離し、上清を
除去した後、細胞を更によく混合した。予め37℃に保
温しておいた30%(w/v)ポリエチレングリコール
を含むRPMI1640培地0.4mlを加え、30秒間
放置した。700rpmで6分間遠心分離した後、RPM
I1640培地10mlを加え、ポリエチレングリコール
がよく混ざるようにガラスチューブをゆっくり回転さ
せ、1400rpmで5分間遠心分離し、上清を完全に
除去し、沈殿に5mlのHAT培地を加え、5分間放置し
た。更に10〜20mlのHAT培地を加え、30分間放
置した後、骨髄腫細胞濃度が3.3×105/mlとなるよ
うにHAT培地を加えて細胞を懸濁させ、パスツールピ
ペットを用い96ウェルプラスチック製培養容器のウェ
ルに2滴ずつ分注した。5%(v/v)炭酸ガス雰囲気
下、36℃で培養し、1日後、7日後及び14日後にウ
ェルにHAT培地を1〜2滴加えた。
【0062】抗体生産細胞のスクリーニング 精製したクラミジアニューモニエYK41の基本小体を
1%(w/v)SDSで可溶化し、0.02%アジ化ソ
ーダ含有0.05M重炭酸ソーダ緩衝液(pH9.6)に
対して透析したのち、タンパク質濃度が1μg/mlとなる
ように希釈した液を、塩化ビニル製96ウェルEIA用
プレートのウェルに50μlとり、4℃で一晩放置し、
抗原を吸着させた。上澄みを除去し、ウェルに0.02
%(w/v)ツィーン20を含むPBS150μlを加
え、3分間放置し、その後除去・洗浄した。洗浄操作を
更に1回行なった後、ウェルに1%(v/v)牛血清ア
ルブミンを含むPBS100μlを加え、4℃で一晩放
置し、ブロッキングを行なった。牛血清アルブミンを含
むPBSを除いた後、0.02%(w/v)ツィーン2
0を含むPBSで同様に2回洗浄後、ウェルに融合細胞
の培養上清を50μl加え、室温で2時間放置した。
0.02%(w/v)ツィーン20を含むPBSで同様
に3回洗浄後、ウェルに25ng/mlのペルオキシダーゼ
標識化ヤギ抗マウスIgG抗体を50μl加え、室温で
2時間放置した。0.02%(w/v)ツィーン20を
含むPBSで同様に3回洗浄後、ウェルにABTS溶液
(KPL社製)を50μl加え、室温で15分〜1時間
放置して発色反応させた後、96ウエルEIAプレート
用光度計で405nmの吸光度を測定した。
1%(w/v)SDSで可溶化し、0.02%アジ化ソ
ーダ含有0.05M重炭酸ソーダ緩衝液(pH9.6)に
対して透析したのち、タンパク質濃度が1μg/mlとなる
ように希釈した液を、塩化ビニル製96ウェルEIA用
プレートのウェルに50μlとり、4℃で一晩放置し、
抗原を吸着させた。上澄みを除去し、ウェルに0.02
%(w/v)ツィーン20を含むPBS150μlを加
え、3分間放置し、その後除去・洗浄した。洗浄操作を
更に1回行なった後、ウェルに1%(v/v)牛血清ア
ルブミンを含むPBS100μlを加え、4℃で一晩放
置し、ブロッキングを行なった。牛血清アルブミンを含
むPBSを除いた後、0.02%(w/v)ツィーン2
0を含むPBSで同様に2回洗浄後、ウェルに融合細胞
の培養上清を50μl加え、室温で2時間放置した。
0.02%(w/v)ツィーン20を含むPBSで同様
に3回洗浄後、ウェルに25ng/mlのペルオキシダーゼ
標識化ヤギ抗マウスIgG抗体を50μl加え、室温で
2時間放置した。0.02%(w/v)ツィーン20を
含むPBSで同様に3回洗浄後、ウェルにABTS溶液
(KPL社製)を50μl加え、室温で15分〜1時間
放置して発色反応させた後、96ウエルEIAプレート
用光度計で405nmの吸光度を測定した。
【0063】この結果、陽性のウエルが見出され、その
培養上清中には基本小体と反応する抗体が含まれている
ことが分かった。このウェル中の細胞をそれぞれパスツ
ールピペットで回収し、24ウェルプラスチック製培養
容器に移し、HAT培地1〜2mlを加え、同様に培養
した。
培養上清中には基本小体と反応する抗体が含まれている
ことが分かった。このウェル中の細胞をそれぞれパスツ
ールピペットで回収し、24ウェルプラスチック製培養
容器に移し、HAT培地1〜2mlを加え、同様に培養
した。
【0064】限界希釈法によるクローニング 24ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた融合細
胞の細胞濃度を測定し、細胞数が20個/mlとなるよう
それぞれをHT培地で希釈した。別にHT培地に懸濁し
た4〜6週齢のマウス胸腺細胞を96ウェルプラスチッ
ク製培養容器に2×105個/ウェルとり、これに上記
の融合細胞(細胞濃度が20個/ml)を50μl/ウェ
ルずつ加え、5%(v/v)炭酸ガス雰囲気下、36℃
で培養し、その1日後、7日後及び14日後にHT培地
を1〜2滴/ウェル加えた。細胞の増殖が見られたウェ
ルの培養上清を50μl回収し、上記と同様の方法で抗
体の生産を確認した。ウェル中に単一の細胞コロニーし
か存在せず、基本小体と反応する抗体を生産するもの
で、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き続き
24ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた。更
に、同様のクローニング操作を繰り返し、最終的にハイ
ブリドーマAY6E2E8を得た。
胞の細胞濃度を測定し、細胞数が20個/mlとなるよう
それぞれをHT培地で希釈した。別にHT培地に懸濁し
た4〜6週齢のマウス胸腺細胞を96ウェルプラスチッ
ク製培養容器に2×105個/ウェルとり、これに上記
の融合細胞(細胞濃度が20個/ml)を50μl/ウェ
ルずつ加え、5%(v/v)炭酸ガス雰囲気下、36℃
で培養し、その1日後、7日後及び14日後にHT培地
を1〜2滴/ウェル加えた。細胞の増殖が見られたウェ
ルの培養上清を50μl回収し、上記と同様の方法で抗
体の生産を確認した。ウェル中に単一の細胞コロニーし
か存在せず、基本小体と反応する抗体を生産するもの
で、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き続き
24ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた。更
に、同様のクローニング操作を繰り返し、最終的にハイ
ブリドーマAY6E2E8を得た。
【0065】モノクローナル抗体の生産 ハイブリドーマAY6E2E8を、10%(v/v)牛
胎児血清含有RPMI1640培地20mlを入れた75
cm2プラスチック製細胞培養用フラスコで増殖させ、3
〜4日ごとにその培養液から16〜18mlを抜き取り、
代わりに新鮮な10%(v/v)牛胎児血清含有RPM
I1640培地を総量で20mlとなるように補い、継代
培養を続けた。抜き取って回収した細胞培養液は、12
00rpmで5分間遠心分離し、上清(モノクローナル抗
体含有培養上清)を回収した。また、予め2週間前にプ
リスタン0.5mlを腹腔内に注射しておいたBalb/
cマウスのその腹腔内に、1×106個/mlとなるよう
PBSで懸濁したハイブリドーマ株を1ml注射した。3
週間後、balb/cマウスの腹水を回収し、1200
rpmで5分間遠心分離し、上清(モノクローナル抗体含
有腹水)を回収した。
胎児血清含有RPMI1640培地20mlを入れた75
cm2プラスチック製細胞培養用フラスコで増殖させ、3
〜4日ごとにその培養液から16〜18mlを抜き取り、
代わりに新鮮な10%(v/v)牛胎児血清含有RPM
I1640培地を総量で20mlとなるように補い、継代
培養を続けた。抜き取って回収した細胞培養液は、12
00rpmで5分間遠心分離し、上清(モノクローナル抗
体含有培養上清)を回収した。また、予め2週間前にプ
リスタン0.5mlを腹腔内に注射しておいたBalb/
cマウスのその腹腔内に、1×106個/mlとなるよう
PBSで懸濁したハイブリドーマ株を1ml注射した。3
週間後、balb/cマウスの腹水を回収し、1200
rpmで5分間遠心分離し、上清(モノクローナル抗体含
有腹水)を回収した。
【0066】モノクローナル抗体の精製 ハイブリドーマAY6E2E8が生産するモノクローナ
ル抗体は以下のようにして精製した。ハイブリドーマA
Y6E2E8をマウス腹腔内に注射して得られたモノク
ローナル抗体含有腹水1容に3容のPBSを加えて混合
し、3000rpmで10分間遠心分離し、その上清をポ
アサイズ0.22μmのフィルタで濾過後、これをクロ
マトップスーパープロテインAカラム(径4.6mm×1
00mm、日本ガイシ(株)製)を用いるHPLCで精製し
た。カラムは予め、PBSで平衡化しておいた。0.2
2μmフィルタで濾過後のサンプル1mlをカラムに注
入後、PBSを1ml/minで3分間流し、次いで、5ml/m
inで4分間流してカラムを洗浄した後、精製水1LにN
aCl 8.77g、クエン酸(一水和物)16.7g
及びNa2HPO4・12H2O 14.72gを溶かした
液を2ml/minで5分間流してモノクローナル抗体を溶出
した。モノクローナル抗体の溶出画分を集め、TTBS
溶液で希釈した。
ル抗体は以下のようにして精製した。ハイブリドーマA
Y6E2E8をマウス腹腔内に注射して得られたモノク
ローナル抗体含有腹水1容に3容のPBSを加えて混合
し、3000rpmで10分間遠心分離し、その上清をポ
アサイズ0.22μmのフィルタで濾過後、これをクロ
マトップスーパープロテインAカラム(径4.6mm×1
00mm、日本ガイシ(株)製)を用いるHPLCで精製し
た。カラムは予め、PBSで平衡化しておいた。0.2
2μmフィルタで濾過後のサンプル1mlをカラムに注
入後、PBSを1ml/minで3分間流し、次いで、5ml/m
inで4分間流してカラムを洗浄した後、精製水1LにN
aCl 8.77g、クエン酸(一水和物)16.7g
及びNa2HPO4・12H2O 14.72gを溶かした
液を2ml/minで5分間流してモノクローナル抗体を溶出
した。モノクローナル抗体の溶出画分を集め、TTBS
溶液で希釈した。
【0067】クラミジア・ニューモニエの基本小体を溶
解し、基本小体に含有されているペプチドを取得した。
このペプチドと上記モノクローナル抗体を用いてウェス
タンブロットを行い、取得したモノクローナル抗体の特
異性を確認した。その結果、取得したモノクローナル抗
体はクラミジア・ニューモニエ53KDa抗原ポリペプ
チドを認識することがわかった。ハイブリドーマ AY
6E2E8と同様にして、ハイブリドーマSCP53を
取得した。上記の方法と同様にしてハイブリドーマSC
P53が産生するモノクローナル抗体の特異性を調べた
結果、このモノクローナル抗体は、クラミジア・ニュー
モニエの53KDa抗原ポリペプチドを認識することが
わかった。また、ハイブリドーマ AY6E2E8及び
ハイブリドーマSCP53が産生するモノクローナル抗
体のサブクラスを調べた結果、これらの抗体のサブクラ
スは、それぞれ、IgG2b及びIgG1であった。
解し、基本小体に含有されているペプチドを取得した。
このペプチドと上記モノクローナル抗体を用いてウェス
タンブロットを行い、取得したモノクローナル抗体の特
異性を確認した。その結果、取得したモノクローナル抗
体はクラミジア・ニューモニエ53KDa抗原ポリペプ
チドを認識することがわかった。ハイブリドーマ AY
6E2E8と同様にして、ハイブリドーマSCP53を
取得した。上記の方法と同様にしてハイブリドーマSC
P53が産生するモノクローナル抗体の特異性を調べた
結果、このモノクローナル抗体は、クラミジア・ニュー
モニエの53KDa抗原ポリペプチドを認識することが
わかった。また、ハイブリドーマ AY6E2E8及び
ハイブリドーマSCP53が産生するモノクローナル抗
体のサブクラスを調べた結果、これらの抗体のサブクラ
スは、それぞれ、IgG2b及びIgG1であった。
【0068】(G)抗原ポリペプチドをコードするDN
Aのクローニング 大腸菌Y1090r−株の一白金耳を10mM MgS
O43ml、0.2%マルトース及び50μg/mlアンピシ
リン含有のLB(水1L中にNaCl 5g、ポリペプ
トン10g及び酵母エキス5gを含む)培地に接種し、
37℃で一晩振とう培養した後、これを2,000rpm
で10分間遠心分離した。沈殿(大腸菌)に10mM
MgSO4水溶液9mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液
の0.35mlを採り、これにλgt11(DNAライブラリ
ー)懸濁液を0.1μl加え、37℃で20分間インキ
ューベートし、大腸菌にλgt11を感染させた。予め47
℃に保温した液状LB寒天培地2.5mlに、上記λgt11
感染大腸菌を加え、これを直ちにLB寒天培地上に撒い
た。上層寒天培地が固化した後、42℃で3〜4時間培
養し、プラークが観察された時点で10mM IPTG
水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルター(φ82
mm)を上層寒天培地に乗せ、37℃で12時間培養し
た。黒インクをつけた注射針で非対称に3ヵ所突き刺し
てフィルターに目印をつけた後、フィルターを寒天培地
からとり出し、150mM NaCl及び0.1%ツィ
ーン20含有20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)
(以下、TTBS緩衝液という)で3回洗浄した。寒天
培地は冷蔵庫中に保存した。
Aのクローニング 大腸菌Y1090r−株の一白金耳を10mM MgS
O43ml、0.2%マルトース及び50μg/mlアンピシ
リン含有のLB(水1L中にNaCl 5g、ポリペプ
トン10g及び酵母エキス5gを含む)培地に接種し、
37℃で一晩振とう培養した後、これを2,000rpm
で10分間遠心分離した。沈殿(大腸菌)に10mM
MgSO4水溶液9mlを加えて混ぜ、この大腸菌懸濁液
の0.35mlを採り、これにλgt11(DNAライブラリ
ー)懸濁液を0.1μl加え、37℃で20分間インキ
ューベートし、大腸菌にλgt11を感染させた。予め47
℃に保温した液状LB寒天培地2.5mlに、上記λgt11
感染大腸菌を加え、これを直ちにLB寒天培地上に撒い
た。上層寒天培地が固化した後、42℃で3〜4時間培
養し、プラークが観察された時点で10mM IPTG
水溶液に浸漬したニトロセルロースフィルター(φ82
mm)を上層寒天培地に乗せ、37℃で12時間培養し
た。黒インクをつけた注射針で非対称に3ヵ所突き刺し
てフィルターに目印をつけた後、フィルターを寒天培地
からとり出し、150mM NaCl及び0.1%ツィ
ーン20含有20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)
(以下、TTBS緩衝液という)で3回洗浄した。寒天
培地は冷蔵庫中に保存した。
【0069】フィルターを150mM NaCl含有2
0mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)(以下、TBS
緩衝液という)の0.1%牛血清アルブミン含有液に浸
し、37℃で1時間振とうし、ブロッキング反応を行っ
た。次いで、フィルターをTTBS緩衝液で2回洗浄し
たのち、5μg/mlのクラミジア・ニューモニエ特異的モ
ノクローナル抗体(AY6E2E8又はSCP53)の
TTBS溶液に浸し、37℃、1時間振とうした。フィ
ルターをTTBS緩衝液で3回洗浄した後、パーオキシ
ダーゼ標識の(50ng/ml)抗マウスIgG抗体溶液
(TTBS緩衝液)中、37℃で1時間振とうした。フ
ィルターをTTBS緩衝液で3回、及びTBS緩衝液で
3回洗浄した後、発色基質液(TBS緩衝液100mlに
30%過酸化水素水溶液60μlと0.3% 4−クロ
ロ−1−ナフトールのメタノール溶液20mlを加えて調
製)に浸漬し、室温で約30分間放置した。十分発色し
た時点でフィルターをとり出し、精製水で洗浄し、風乾
した。
0mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)(以下、TBS
緩衝液という)の0.1%牛血清アルブミン含有液に浸
し、37℃で1時間振とうし、ブロッキング反応を行っ
た。次いで、フィルターをTTBS緩衝液で2回洗浄し
たのち、5μg/mlのクラミジア・ニューモニエ特異的モ
ノクローナル抗体(AY6E2E8又はSCP53)の
TTBS溶液に浸し、37℃、1時間振とうした。フィ
ルターをTTBS緩衝液で3回洗浄した後、パーオキシ
ダーゼ標識の(50ng/ml)抗マウスIgG抗体溶液
(TTBS緩衝液)中、37℃で1時間振とうした。フ
ィルターをTTBS緩衝液で3回、及びTBS緩衝液で
3回洗浄した後、発色基質液(TBS緩衝液100mlに
30%過酸化水素水溶液60μlと0.3% 4−クロ
ロ−1−ナフトールのメタノール溶液20mlを加えて調
製)に浸漬し、室温で約30分間放置した。十分発色し
た時点でフィルターをとり出し、精製水で洗浄し、風乾
した。
【0070】フィルターの発色スポットに対応する寒天
培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパ
スツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回
収したプラークはクロロホルム1滴を加えた0.1M
NaCl、8mM硫酸マグネシウム及び0.01%ゼラ
チン含有50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)(以
下、SM緩衝液という)中に採り、4℃で一晩放置しプ
ラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記
モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操
作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするDNAを
クローン化した。このようにして、クラミジア・ニュー
モニエ特異的モノクローナル抗体反応性のクラミジア・
ニューモニエ特異的抗原ポリペプチドを発現するλファ
ージが得られ、これを53−3Sλファージと命名し
た。
培地上のプラークを捜して同定し、この部分の寒天をパ
スツールピペットでつき刺し、プラークを回収した。回
収したプラークはクロロホルム1滴を加えた0.1M
NaCl、8mM硫酸マグネシウム及び0.01%ゼラ
チン含有50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)(以
下、SM緩衝液という)中に採り、4℃で一晩放置しプ
ラーク中のλファージを抽出した。プラークが全て上記
モノクローナル抗体と反応するようになるまで、前記操
作を繰り返し、抗原ポリペプチドをコードするDNAを
クローン化した。このようにして、クラミジア・ニュー
モニエ特異的モノクローナル抗体反応性のクラミジア・
ニューモニエ特異的抗原ポリペプチドを発現するλファ
ージが得られ、これを53−3Sλファージと命名し
た。
【0071】(H)53−3Sλファージの培養とDN
A精製 前記(F)で述べた方法と同様にしてプラークを形成さ
せ、一つのプラークを回収し、100μlのSM緩衝液
に入れ、4℃で一晩放置しλファージを抽出した。LB
培養液で一晩培養した大腸菌Y1090r−株250μ
lに、λファージ液5μlを加え、37℃で20分間放
置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め37℃に
温めておいた10mM硫酸マグネシウムを含むLB培地
50mlに接種し、λファージによる大腸菌の溶菌が起こ
るまで37℃で5時間振とう培養した。250μlのク
ロロホルムを加え、3,000rpmで10分間遠心分離
し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁液を得た。λ
ファージDNAは、Wizardλ preps キット(プロメガ
社、商品名)を用いて精製した。
A精製 前記(F)で述べた方法と同様にしてプラークを形成さ
せ、一つのプラークを回収し、100μlのSM緩衝液
に入れ、4℃で一晩放置しλファージを抽出した。LB
培養液で一晩培養した大腸菌Y1090r−株250μ
lに、λファージ液5μlを加え、37℃で20分間放
置し、大腸菌にλファージを感染させた。予め37℃に
温めておいた10mM硫酸マグネシウムを含むLB培地
50mlに接種し、λファージによる大腸菌の溶菌が起こ
るまで37℃で5時間振とう培養した。250μlのク
ロロホルムを加え、3,000rpmで10分間遠心分離
し大腸菌細胞残渣を除き、λファージ懸濁液を得た。λ
ファージDNAは、Wizardλ preps キット(プロメガ
社、商品名)を用いて精製した。
【0072】(I)クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドをコードするDNAの増幅 600μl用のマイクロチューブに、精製水61.5μ
l、10倍濃度 反応用緩衝液(500mM KCl、
15mM MgCl2、0.01%ゼラチンを含むトリ
ス−塩酸緩衝液pH8.3)10μl、20mM dNT
P 1μl、53−3SλファージDNA溶液0.1μ
l、20nM λgt11 forward primer(宝酒造(株)
製、商品名)1μl、20nM λgt11 reverse prime
r(宝酒造(株)製、商品名)1μl、AmpliTaq DNA Poly
merase(宝酒造(株)製、商品名)0.5μlを入れ、ミ
ネラルオイルを2滴重層した。94℃ 30秒、55℃
30秒、73℃ 2分のサイクルのインキュベーショ
ンを30回繰返し、DNAを増幅した。反応後、1.2
%低温融解アガロースゲル電気泳動を行い、増幅された
DNAを切り出して Wizard PCR Prep キット(プロメ
ガ社製、商品名)で精製した。
ペプチドをコードするDNAの増幅 600μl用のマイクロチューブに、精製水61.5μ
l、10倍濃度 反応用緩衝液(500mM KCl、
15mM MgCl2、0.01%ゼラチンを含むトリ
ス−塩酸緩衝液pH8.3)10μl、20mM dNT
P 1μl、53−3SλファージDNA溶液0.1μ
l、20nM λgt11 forward primer(宝酒造(株)
製、商品名)1μl、20nM λgt11 reverse prime
r(宝酒造(株)製、商品名)1μl、AmpliTaq DNA Poly
merase(宝酒造(株)製、商品名)0.5μlを入れ、ミ
ネラルオイルを2滴重層した。94℃ 30秒、55℃
30秒、73℃ 2分のサイクルのインキュベーショ
ンを30回繰返し、DNAを増幅した。反応後、1.2
%低温融解アガロースゲル電気泳動を行い、増幅された
DNAを切り出して Wizard PCR Prep キット(プロメ
ガ社製、商品名)で精製した。
【0073】(J)DNA塩基配列分析 DNA塩基配列分析は、PCRで増幅したDNAを鋳型
として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミ
ネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行
い、373A型DNAシークエンサ(アプライドバイオ
システムズ社製、商品名)で分析を行った。得られたD
NA塩基配列を遺伝子配列分析ソフト「DNASIS」
(日立ソフトウェアエンジニアリング(株)製、商品名)
を用いて、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行な
い、配列番号7の配列を得た。配列番号7の配列の解析
結果から、53KDa抗原ポリペプチドについて、その
N末端からC末端に向けて約60%のアミノ酸配列が解
明されたことが分かった。
として、Taq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標識ターミ
ネータサイクルシークエンス法でシークエンス反応を行
い、373A型DNAシークエンサ(アプライドバイオ
システムズ社製、商品名)で分析を行った。得られたD
NA塩基配列を遺伝子配列分析ソフト「DNASIS」
(日立ソフトウェアエンジニアリング(株)製、商品名)
を用いて、編集、連結、アミノ酸翻訳領域の推定を行な
い、配列番号7の配列を得た。配列番号7の配列の解析
結果から、53KDa抗原ポリペプチドについて、その
N末端からC末端に向けて約60%のアミノ酸配列が解
明されたことが分かった。
【0074】上記クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペ
プチドをコードするDNAは、クラミジア・ニューモニ
エに特異的で、かつ、53KDa抗原ポリペプチドを認
識するモノクローナル抗体を利用してクローニングされ
たので、このDNAは、明らかに53KDa抗原ポリペ
プチドをコードしている。配列番号7の塩基配列及びア
ミノ酸配列の相同性検索をGenBankデータベース
で行なった結果、高い相同性を示す既知の配列は無かっ
た。
プチドをコードするDNAは、クラミジア・ニューモニ
エに特異的で、かつ、53KDa抗原ポリペプチドを認
識するモノクローナル抗体を利用してクローニングされ
たので、このDNAは、明らかに53KDa抗原ポリペ
プチドをコードしている。配列番号7の塩基配列及びア
ミノ酸配列の相同性検索をGenBankデータベース
で行なった結果、高い相同性を示す既知の配列は無かっ
た。
【0075】実施例2 DHFRとクラミジア・ニュー
モニエの53KDa抗原ポリペプチドの一部を含む融合
タンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターの
作製及びそれを含む形質転換体の作製 プラスミドpBBK10MMを制限酵素BamHIとXhoIで
切断し、1.2%低温融解アガロースゲル電気泳動を行
い、約4.6KbpのDNA断片を切り出して精製した。
一方、53−3SλファージDNAを制限酵素EcoRIで
切断し、同様に約1.0KbpのDNA断片を精製した
後、さらに制限酵素AvaIIで切断し、同様に約0.8Kbp
のDNA断片を精製した。上記の約4.6KbpのDNA
断片100ngに上記の約0.8KbpのDNA断片100n
g、配列番号8〜11の合成DNA各1ngを添加し、D
NAライゲーションキット(宝酒造)を用いてこれらの
DNAを連結した。この反応物を大腸菌HB101株コ
ンピテントセル(宝酒造)に入れ、形質転換体を作製し
た。
モニエの53KDa抗原ポリペプチドの一部を含む融合
タンパク質をコードするDNAを含む組換えベクターの
作製及びそれを含む形質転換体の作製 プラスミドpBBK10MMを制限酵素BamHIとXhoIで
切断し、1.2%低温融解アガロースゲル電気泳動を行
い、約4.6KbpのDNA断片を切り出して精製した。
一方、53−3SλファージDNAを制限酵素EcoRIで
切断し、同様に約1.0KbpのDNA断片を精製した
後、さらに制限酵素AvaIIで切断し、同様に約0.8Kbp
のDNA断片を精製した。上記の約4.6KbpのDNA
断片100ngに上記の約0.8KbpのDNA断片100n
g、配列番号8〜11の合成DNA各1ngを添加し、D
NAライゲーションキット(宝酒造)を用いてこれらの
DNAを連結した。この反応物を大腸菌HB101株コ
ンピテントセル(宝酒造)に入れ、形質転換体を作製し
た。
【0076】この形質転換体を、50mg/Lのアンピシリ
ンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で24時間培養
した。得られた大腸菌のコロニーを50mg/Lのアンピシ
リンを含むLB培地3mlに接種し、37℃で一晩振とう
培養した。アルカリ溶解法でプラスミドベクターを分離
し、制限酵素NruIで切断し、0.8%アガロースゲル電
気泳動で分析し、616bpと4822bpのDNA断片が
生じている組換えプラスミドベクターをもつ大腸菌を選
択した。得られた組換えプラスミドベクターをpCPN
533Tと名付けた。このプラスミドベクターは、配列
番号12の塩基配列を有する約5.4kbpのDNAで
あり、DHFRのC末端にクラミジア・ニューモニエの
53KDa抗原ポリペプチドの一部を含むポリペプチド
を連結した融合タンパク質を発現させるものである。こ
の融合タンパク質をコードするDNAの塩基配列は配列
番号6のようになっており、この塩基配列から推定され
るアミノ酸配列はを配列番号4のようになっていた。
ンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で24時間培養
した。得られた大腸菌のコロニーを50mg/Lのアンピシ
リンを含むLB培地3mlに接種し、37℃で一晩振とう
培養した。アルカリ溶解法でプラスミドベクターを分離
し、制限酵素NruIで切断し、0.8%アガロースゲル電
気泳動で分析し、616bpと4822bpのDNA断片が
生じている組換えプラスミドベクターをもつ大腸菌を選
択した。得られた組換えプラスミドベクターをpCPN
533Tと名付けた。このプラスミドベクターは、配列
番号12の塩基配列を有する約5.4kbpのDNAで
あり、DHFRのC末端にクラミジア・ニューモニエの
53KDa抗原ポリペプチドの一部を含むポリペプチド
を連結した融合タンパク質を発現させるものである。こ
の融合タンパク質をコードするDNAの塩基配列は配列
番号6のようになっており、この塩基配列から推定され
るアミノ酸配列はを配列番号4のようになっていた。
【0077】実施例3 DHFRとクラミジア・ニュー
モニエの53KDa抗原ポリペプチドの一部を含むポリ
ペプチドの融合タンパク質の確認 プラスミドpCPN533Tを保持する大腸菌HB10
1株1白金耳を50mg/lのアンピシリンを含むLB培地
3mlに接種し、37℃で一晩振とう培養した。この大腸
菌を含む培地10μlに10μlのローディング緩衝液
(0.01%ブロモフェノールブルー、10%メルカプ
トエタノール、20%グリセロール、5%SDSを含む
0.156Mトリス塩酸緩衝液、pH6.8)を加え、8
0℃で5分間加熱した後、反応液を5−20%ポリアク
リルアミドグラジエントゲル電気泳動にかけた。セミド
ライブロッティング装置の陽極板上に、10%メタノー
ル、0.05%ドデシル硫酸ナトリウムを含む0.3M
トリス水溶液で湿らせたろ紙1枚、10%メタノール、
0.05%ドデシル硫酸ナトリウムを含む25mMトリ
ス水溶液で湿らせたろ紙1枚、10%メタノール、0.
05%ドデシル硫酸ナトリウム、40mMアミノカプロ
ン酸を含む25mMトリス水溶液で湿らせたニトロセル
ロース膜1枚、上記電気泳動の終了したポリアクリルア
ミドゲル、40mMアミノカプロン酸を含む25mMト
リス水溶液で湿らせたろ紙2枚をこの順序で重ね、陰極
板をセットして2.5mA/cm2の電流密度で1時間電流を
流し、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をニトロ
セルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を
0.1%牛血清アルブミンを含むTBS緩衝液に入れ、
室温で1時間以上放置し、ブロッキングした。ニトロセ
ルロース膜をTTBS緩衝液で2回洗浄した後、ハイブ
リドーマAY6E2E8が生産するモノクローナル抗体
溶液(10μg/ml TTBS緩衝液中)中で37℃、1
時間振とうした。ニトロセルロース膜をTTBS緩衝液
で3回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識した抗マウス
IgG抗体溶液(50ng/ml TTBS緩衝液中)中で
37℃1時間振とうした。ニトロセルロース膜をTTB
S緩衝液で3回洗浄した後、発色基質液(100mlのTBS
緩衝液に60μlの30%過酸化水素水溶液と20mlの
4−クロロ−1−ナフトール メタノール溶液を混合す
る)に入れ、室温で30分間反応させた。ニトロセルロ
ース膜を取り出し、精製水で洗浄した後風乾した。この
結果、融合タンパク質の大きさに相当する位置に発色し
たバンドが観察され、プラスミドpCPN533Tをも
つ大腸菌が、クラミジア・ニューモニエ特異的に反応す
るモノクローナル抗体と反応することのできる53KD
a抗原を発現していることが示された。
モニエの53KDa抗原ポリペプチドの一部を含むポリ
ペプチドの融合タンパク質の確認 プラスミドpCPN533Tを保持する大腸菌HB10
1株1白金耳を50mg/lのアンピシリンを含むLB培地
3mlに接種し、37℃で一晩振とう培養した。この大腸
菌を含む培地10μlに10μlのローディング緩衝液
(0.01%ブロモフェノールブルー、10%メルカプ
トエタノール、20%グリセロール、5%SDSを含む
0.156Mトリス塩酸緩衝液、pH6.8)を加え、8
0℃で5分間加熱した後、反応液を5−20%ポリアク
リルアミドグラジエントゲル電気泳動にかけた。セミド
ライブロッティング装置の陽極板上に、10%メタノー
ル、0.05%ドデシル硫酸ナトリウムを含む0.3M
トリス水溶液で湿らせたろ紙1枚、10%メタノール、
0.05%ドデシル硫酸ナトリウムを含む25mMトリ
ス水溶液で湿らせたろ紙1枚、10%メタノール、0.
05%ドデシル硫酸ナトリウム、40mMアミノカプロ
ン酸を含む25mMトリス水溶液で湿らせたニトロセル
ロース膜1枚、上記電気泳動の終了したポリアクリルア
ミドゲル、40mMアミノカプロン酸を含む25mMト
リス水溶液で湿らせたろ紙2枚をこの順序で重ね、陰極
板をセットして2.5mA/cm2の電流密度で1時間電流を
流し、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をニトロ
セルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を
0.1%牛血清アルブミンを含むTBS緩衝液に入れ、
室温で1時間以上放置し、ブロッキングした。ニトロセ
ルロース膜をTTBS緩衝液で2回洗浄した後、ハイブ
リドーマAY6E2E8が生産するモノクローナル抗体
溶液(10μg/ml TTBS緩衝液中)中で37℃、1
時間振とうした。ニトロセルロース膜をTTBS緩衝液
で3回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識した抗マウス
IgG抗体溶液(50ng/ml TTBS緩衝液中)中で
37℃1時間振とうした。ニトロセルロース膜をTTB
S緩衝液で3回洗浄した後、発色基質液(100mlのTBS
緩衝液に60μlの30%過酸化水素水溶液と20mlの
4−クロロ−1−ナフトール メタノール溶液を混合す
る)に入れ、室温で30分間反応させた。ニトロセルロ
ース膜を取り出し、精製水で洗浄した後風乾した。この
結果、融合タンパク質の大きさに相当する位置に発色し
たバンドが観察され、プラスミドpCPN533Tをも
つ大腸菌が、クラミジア・ニューモニエ特異的に反応す
るモノクローナル抗体と反応することのできる53KD
a抗原を発現していることが示された。
【0078】実施例4 クラミジア・ニューモニエの5
3KDa抗原ポリペプチド全体をコードするDNAの取
得 配列番号7の塩基配列を元に、配列番号13及び14の
塩基配列を有するDNAを、DNA合成機を用いて合成
した。実施例1で得たクラミジア・ニューモニエYK4
1株のゲノムDNAの水溶液10μl(DNA含有量:
約1μg)に、10倍濃縮Kバッファ5μl、精製水3
5μl及び制限酵素HindIII(19U/μl)5μ
lを添加し、37℃で3時間保温した。得られた反応液
をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、遠心分離
して沈殿を取得した。この沈殿に、PCR in vitro Cl
oning Kit(宝酒造(株)製、商品名)中のHindIIIカセ
ットDNA(20ng/μl)5μl、ライゲーション溶液
15μlを添加し、16℃で30分間保温した。取得し
た反応液をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、
遠心分離して沈殿を取得し、これを10μlの精製水に
溶解した。
3KDa抗原ポリペプチド全体をコードするDNAの取
得 配列番号7の塩基配列を元に、配列番号13及び14の
塩基配列を有するDNAを、DNA合成機を用いて合成
した。実施例1で得たクラミジア・ニューモニエYK4
1株のゲノムDNAの水溶液10μl(DNA含有量:
約1μg)に、10倍濃縮Kバッファ5μl、精製水3
5μl及び制限酵素HindIII(19U/μl)5μ
lを添加し、37℃で3時間保温した。得られた反応液
をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、遠心分離
して沈殿を取得した。この沈殿に、PCR in vitro Cl
oning Kit(宝酒造(株)製、商品名)中のHindIIIカセ
ットDNA(20ng/μl)5μl、ライゲーション溶液
15μlを添加し、16℃で30分間保温した。取得し
た反応液をフェノールで抽出し、エタノールを添加し、
遠心分離して沈殿を取得し、これを10μlの精製水に
溶解した。
【0079】得られた溶液1μlに、精製水78.5μ
l、10倍濃縮PCR用バッファ10μl、2.5mM
dNTP8μl及びTaqポリメラーゼ0.5μl(5
U/μl)を添加し、さらに、プライマーDNAとし
て、配列番号13の塩基配列を有するDNA(20pmol
/μl)1μl及び配列番号15の塩基配列を有するDN
A(20pmol/μl)(上記キットにおいて、プライマー
C1として同封されていたもの)1μlを添加して、こ
れらを0.6mlのマイクロチューブに入れ、ミネラル
オイル2滴を重層し、94℃30秒、55℃2分、72
℃3分の温度サイクルを30回繰り返した。以上の工程
をPCR工程という。
l、10倍濃縮PCR用バッファ10μl、2.5mM
dNTP8μl及びTaqポリメラーゼ0.5μl(5
U/μl)を添加し、さらに、プライマーDNAとし
て、配列番号13の塩基配列を有するDNA(20pmol
/μl)1μl及び配列番号15の塩基配列を有するDN
A(20pmol/μl)(上記キットにおいて、プライマー
C1として同封されていたもの)1μlを添加して、こ
れらを0.6mlのマイクロチューブに入れ、ミネラル
オイル2滴を重層し、94℃30秒、55℃2分、72
℃3分の温度サイクルを30回繰り返した。以上の工程
をPCR工程という。
【0080】PCR工程後の反応液1μlに、プライマ
ーDNAとして、配列番号14の塩基配列を有するDN
A(20pmol/μl)1μl及び配列番号16の塩基配列
を有するDNA(20pmol/μl)(上記キットにおい
て、プライマーC2として同封されていたもの)1μl
を用い、再度PCR工程を行った。2番目のPCR工程
後の反応液を1.2%低融点アガロースゲル電気泳動さ
せ、約1.4kbpの大きさのDNAが含有されている
アガロースゲルを切り出した。DNAの精製には Wizar
d PCR Prep キット(プロメガ社製、商品名)を用い
た。即ち、切り出したアガロースゲルにキットに同封さ
れている緩衝液を添加し、加熱してアガロースゲルを溶
解し、キットに同封されている精製用樹脂を添加してD
NAを樹脂に吸着させ、遠心分離して精製用樹脂を沈殿
として取得した。沈殿をプロパノールで洗浄し、再度遠
心分離して沈殿を取得した。沈殿に精製水を添加し、精
製用樹脂からDNAを溶出して、遠心分離し、上清(D
NA水溶液)を得た。以上の工程をDNA精製工程とい
う。
ーDNAとして、配列番号14の塩基配列を有するDN
A(20pmol/μl)1μl及び配列番号16の塩基配列
を有するDNA(20pmol/μl)(上記キットにおい
て、プライマーC2として同封されていたもの)1μl
を用い、再度PCR工程を行った。2番目のPCR工程
後の反応液を1.2%低融点アガロースゲル電気泳動さ
せ、約1.4kbpの大きさのDNAが含有されている
アガロースゲルを切り出した。DNAの精製には Wizar
d PCR Prep キット(プロメガ社製、商品名)を用い
た。即ち、切り出したアガロースゲルにキットに同封さ
れている緩衝液を添加し、加熱してアガロースゲルを溶
解し、キットに同封されている精製用樹脂を添加してD
NAを樹脂に吸着させ、遠心分離して精製用樹脂を沈殿
として取得した。沈殿をプロパノールで洗浄し、再度遠
心分離して沈殿を取得した。沈殿に精製水を添加し、精
製用樹脂からDNAを溶出して、遠心分離し、上清(D
NA水溶液)を得た。以上の工程をDNA精製工程とい
う。
【0081】取得したDNA水溶液を用い、含まれるD
NAを鋳型とするTaq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標
識ターミネータサイクルシークエンス法でシークエンス
反応を行い、373A型DNAシークエンサ(アプライ
ドバイオシステムズ社製、商品名)でそのDNAの塩基
配列を分析した。得られたDNA塩基配列を遺伝子配列
分析ソフト「DNASIS」(日立ソフトウェアエンジ
ニアリング(株)製、商品名)を用いて、編集、連結、ア
ミノ酸翻訳領域の推定を行なった。以上の工程を塩基配
列解析工程という。
NAを鋳型とするTaq DNA ポリメラーゼを用いた蛍光標
識ターミネータサイクルシークエンス法でシークエンス
反応を行い、373A型DNAシークエンサ(アプライ
ドバイオシステムズ社製、商品名)でそのDNAの塩基
配列を分析した。得られたDNA塩基配列を遺伝子配列
分析ソフト「DNASIS」(日立ソフトウェアエンジ
ニアリング(株)製、商品名)を用いて、編集、連結、ア
ミノ酸翻訳領域の推定を行なった。以上の工程を塩基配
列解析工程という。
【0082】取得したDNAの塩基配列を解析した結
果、このDNAは実施例1で取得したクラミジア・ニュ
ーモニエの抗原ポリペプチドをコードするDNAの中の
3′末端側の約50bpの塩基配列を有していた。さら
に、その塩基配列の下流には、終始コドンを含有する約
0.7kbのコード領域が存在していることがわかっ
た。配列番号7の塩基配列を元に、クラミジア・ニュー
モニエの抗原ポリペプチドのをコードするDNAの上流
部分に相当するプライマーとして、配列番号17の塩基
配列を有するDNAを、また、上記の約0.7kbのコ
ード領域を含む塩基配列を元に、クラミジア・ニューモ
ニエの抗原ポリペプチドのをコードするDNAの下流部
分に相当するプライマーとして、配列番号18の塩基配
列を有するDNAを、それぞれ、DNA合成機を用いて
合成した。
果、このDNAは実施例1で取得したクラミジア・ニュ
ーモニエの抗原ポリペプチドをコードするDNAの中の
3′末端側の約50bpの塩基配列を有していた。さら
に、その塩基配列の下流には、終始コドンを含有する約
0.7kbのコード領域が存在していることがわかっ
た。配列番号7の塩基配列を元に、クラミジア・ニュー
モニエの抗原ポリペプチドのをコードするDNAの上流
部分に相当するプライマーとして、配列番号17の塩基
配列を有するDNAを、また、上記の約0.7kbのコ
ード領域を含む塩基配列を元に、クラミジア・ニューモ
ニエの抗原ポリペプチドのをコードするDNAの下流部
分に相当するプライマーとして、配列番号18の塩基配
列を有するDNAを、それぞれ、DNA合成機を用いて
合成した。
【0083】実施例1で得たクラミジア・ニューモニエ
YK41株のゲノムDNAの水溶液1μlを用い、プラ
イマーDNAとして配列番号17の塩基配列を有するD
NA(20pmol/μl)1μl及び配列番号18の塩基配
列を有するDNA(20pmol/μl)1μlを用いてPC
R工程を行った。3番目のPCR工程後の反応液を用
い、上記DNA精製工程を行い、約1.5kbpのDN
Aを取得した。取得したDNA水溶液を用い、上記塩基
配列解析工程を行った。取得したDNAの塩基配列を解
析した結果、このDNAは配列番号5の484〜194
7番目の塩基配列を有しており、配列番号3の162〜
649番目のアミノ酸配列をコードしていることがわか
った。またプラスミドpCPN533Tと前述のλgt11
のDNAライブラリーを用いてゲノムウォーキングを行
い、クラミジア・ニューモニエの53KDa抗原ポリペ
プチド全体をコードするDNAを取得した。
YK41株のゲノムDNAの水溶液1μlを用い、プラ
イマーDNAとして配列番号17の塩基配列を有するD
NA(20pmol/μl)1μl及び配列番号18の塩基配
列を有するDNA(20pmol/μl)1μlを用いてPC
R工程を行った。3番目のPCR工程後の反応液を用
い、上記DNA精製工程を行い、約1.5kbpのDN
Aを取得した。取得したDNA水溶液を用い、上記塩基
配列解析工程を行った。取得したDNAの塩基配列を解
析した結果、このDNAは配列番号5の484〜194
7番目の塩基配列を有しており、配列番号3の162〜
649番目のアミノ酸配列をコードしていることがわか
った。またプラスミドpCPN533Tと前述のλgt11
のDNAライブラリーを用いてゲノムウォーキングを行
い、クラミジア・ニューモニエの53KDa抗原ポリペ
プチド全体をコードするDNAを取得した。
【0084】実施例5 DHFRとクラミジア・ニュー
モニエの53KDa抗原ポリペプチド全体の融合タンパ
ク質をコードするDNAを含む組換えベクターの作製及
びそれを含む形質転換体の作製 プラスミドpBBK10MMと前記クラミジア・ニュー
モニエの53KDa抗原ポリペプチド全体をコードする
DNAを用い、実施例2と同様にしてDHFRとクラミ
ジア・ニューモニエの53KDa抗原ポリペプチド全体
の融合タンパク質をコードするDNAを含む組換えベク
ターとそれを含む形質転換体を作製する。この融合タン
パク質をコードするDNAの塩基配列は配列番号5のよ
うになっており、この塩基配列から推定されるアミノ酸
配列はを配列番号3のようになっている。
モニエの53KDa抗原ポリペプチド全体の融合タンパ
ク質をコードするDNAを含む組換えベクターの作製及
びそれを含む形質転換体の作製 プラスミドpBBK10MMと前記クラミジア・ニュー
モニエの53KDa抗原ポリペプチド全体をコードする
DNAを用い、実施例2と同様にしてDHFRとクラミ
ジア・ニューモニエの53KDa抗原ポリペプチド全体
の融合タンパク質をコードするDNAを含む組換えベク
ターとそれを含む形質転換体を作製する。この融合タン
パク質をコードするDNAの塩基配列は配列番号5のよ
うになっており、この塩基配列から推定されるアミノ酸
配列はを配列番号3のようになっている。
【0085】実施例6 融合タンパク質を抗原として用
いる、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造 本発明の融合タンパク質を抗原として用いる抗クラミジ
ア・ニューモニエ抗体のは、例えば、次のようにして製
造することができる。 (A)骨髄腫細胞株の培養及び継代 骨髄腫細胞株はP3X63Ag8.653(ATCC
CRL−1580)を10%(v/v)牛胎児血清を含
むRPMI1640培地で培養し、継代する。細胞融合
に供する2週間前に、0.13mMの8−アザグアニ
ン、0.5μg/mlのMC−210(マイコプラズマ
除去剤、大日本製薬(株)製)及び10%(v/v)牛
胎児血清を含むRPMI1640培地で1週間培養し、
その後の1週間は通常の培地で培養する。
いる、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造 本発明の融合タンパク質を抗原として用いる抗クラミジ
ア・ニューモニエ抗体のは、例えば、次のようにして製
造することができる。 (A)骨髄腫細胞株の培養及び継代 骨髄腫細胞株はP3X63Ag8.653(ATCC
CRL−1580)を10%(v/v)牛胎児血清を含
むRPMI1640培地で培養し、継代する。細胞融合
に供する2週間前に、0.13mMの8−アザグアニ
ン、0.5μg/mlのMC−210(マイコプラズマ
除去剤、大日本製薬(株)製)及び10%(v/v)牛
胎児血清を含むRPMI1640培地で1週間培養し、
その後の1週間は通常の培地で培養する。
【0086】(B)マウスの免疫 タンパク質の濃度が270μg/mlの上記融合タンパク質
の懸濁液200μlを、12000rpmで10分間遠心
分離し、沈殿に200μlのPBSを加え、再懸濁す
る。これに200μlのフロイントコンプリートアジュ
バントを加え、エマルジョンとし、その150μlをマ
ウスの背中の皮下に注射する(この日を0日目とす
る)。14日目、34日目及び49日目に、タンパク質
の濃度が270μg/mlの上記融合タンパク質の懸濁液1
00μlをマウスの腹腔内に注射し、更に、69日目に
タンパク質の濃度が800μg/mlの上記融合タンパク質
の懸濁液50μl、92日目に同懸濁液100μlをマ
ウスの腹腔内に注射し、95日目に脾臓を取り出し、細
胞融合に供する。
の懸濁液200μlを、12000rpmで10分間遠心
分離し、沈殿に200μlのPBSを加え、再懸濁す
る。これに200μlのフロイントコンプリートアジュ
バントを加え、エマルジョンとし、その150μlをマ
ウスの背中の皮下に注射する(この日を0日目とす
る)。14日目、34日目及び49日目に、タンパク質
の濃度が270μg/mlの上記融合タンパク質の懸濁液1
00μlをマウスの腹腔内に注射し、更に、69日目に
タンパク質の濃度が800μg/mlの上記融合タンパク質
の懸濁液50μl、92日目に同懸濁液100μlをマ
ウスの腹腔内に注射し、95日目に脾臓を取り出し、細
胞融合に供する。
【0087】(C)細胞融合 上記脾臓から得られる脾細胞108個に対して骨髄腫細
胞107個を丸底ガラスチューブにとり、よく混合し、
1400rpmで5分間遠心分離し、上清を除去し、細胞
を更によく混合する。予め37℃に保温してある30%
(w/v)ポリエチレングリコールを含むRPMI16
40培地0.4mlを加え、30秒間放置する。700rp
mで6分間遠心分離した後、RPMI1640培地10m
lを加え、ポリエチレングリコールがよく混ざるように
ガラスチューブをゆっくり回転させ、1400rpmで5
分間遠心分離し、上清を完全に除去し、沈殿に5mlのH
AT培地を加え、5分間放置する。更に10〜20mlの
HAT培地を加え、30分間放置し、骨髄腫細胞濃度が
3.3×105/mlとなるようにHAT培地を加えて細胞
を懸濁させ、パスツールピペットを用い96ウェルプラ
スチック製培養容器のウェルに2滴ずつ分注する。5%
(v/v)炭酸ガス雰囲気下、36℃で培養し、1日
後、7日後及び14日後にウェルにHAT培地を1〜2
滴加える。
胞107個を丸底ガラスチューブにとり、よく混合し、
1400rpmで5分間遠心分離し、上清を除去し、細胞
を更によく混合する。予め37℃に保温してある30%
(w/v)ポリエチレングリコールを含むRPMI16
40培地0.4mlを加え、30秒間放置する。700rp
mで6分間遠心分離した後、RPMI1640培地10m
lを加え、ポリエチレングリコールがよく混ざるように
ガラスチューブをゆっくり回転させ、1400rpmで5
分間遠心分離し、上清を完全に除去し、沈殿に5mlのH
AT培地を加え、5分間放置する。更に10〜20mlの
HAT培地を加え、30分間放置し、骨髄腫細胞濃度が
3.3×105/mlとなるようにHAT培地を加えて細胞
を懸濁させ、パスツールピペットを用い96ウェルプラ
スチック製培養容器のウェルに2滴ずつ分注する。5%
(v/v)炭酸ガス雰囲気下、36℃で培養し、1日
後、7日後及び14日後にウェルにHAT培地を1〜2
滴加える。
【0088】(D)抗体生産細胞のスクリーニング 上記融合タンパク質をタンパク質濃度が1〜10μg/ml
となるように0.02%(w/v)アジ化ソーダ含有
0.05M重炭酸ソーダ緩衝液(pH9.6)に懸濁し、
0.02%アジ化ソーダ含有0.05M重炭酸ソーダ緩
衝液(pH9.6)に対して透析し、その後、タンパク質
濃度が1〜10μg/mlとなるように希釈した液を、塩化
ビニル製96ウェルEIA用プレートのウェルに50μ
lとり、4℃で一晩放置し、抗原を吸着させる。上澄み
を除去し、ウェルに0.02%(w/v)ツィーン20
を含むPBS150μlを加え、3分間放置し、その後
除去・洗浄する。洗浄操作を更に1回行なった後、ウェ
ルに1%(v/v)牛血清アルブミンを含むPBS10
0μlを加え、4℃で一晩以上放置し、ブロッキングを
行なう。牛血清アルブミンを含むPBSを除いた後、
0.02%(w/v)ツィーン20を含むPBSで同様
に2回洗浄後、ウェルに融合細胞の培養上清を50μl
加え、室温で2時間放置する。0.02%(w/v)ツ
ィーン20を含むPBSで同様に3回洗浄後、ウェルに
25ng/mlのペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスIg
G抗体を50μl加え、室温で2時間放置する。0.0
2%(w/v)ツィーン20を含むPBSで同様に3回
洗浄後、ウェルにABTS溶液(KPL社製)を50μ
l加え、室温で15分〜1時間放置して発色反応させ、
96ウエルEIAプレート用光度計で405nmの吸光度
を測定する。そして陽性のウエル中の細胞をそれぞれパ
スツールピペットで回収し、24ウェルプラスチック製
培養容器に移し、HAT培地1〜2mlを加え、同様に培
養する。
となるように0.02%(w/v)アジ化ソーダ含有
0.05M重炭酸ソーダ緩衝液(pH9.6)に懸濁し、
0.02%アジ化ソーダ含有0.05M重炭酸ソーダ緩
衝液(pH9.6)に対して透析し、その後、タンパク質
濃度が1〜10μg/mlとなるように希釈した液を、塩化
ビニル製96ウェルEIA用プレートのウェルに50μ
lとり、4℃で一晩放置し、抗原を吸着させる。上澄み
を除去し、ウェルに0.02%(w/v)ツィーン20
を含むPBS150μlを加え、3分間放置し、その後
除去・洗浄する。洗浄操作を更に1回行なった後、ウェ
ルに1%(v/v)牛血清アルブミンを含むPBS10
0μlを加え、4℃で一晩以上放置し、ブロッキングを
行なう。牛血清アルブミンを含むPBSを除いた後、
0.02%(w/v)ツィーン20を含むPBSで同様
に2回洗浄後、ウェルに融合細胞の培養上清を50μl
加え、室温で2時間放置する。0.02%(w/v)ツ
ィーン20を含むPBSで同様に3回洗浄後、ウェルに
25ng/mlのペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスIg
G抗体を50μl加え、室温で2時間放置する。0.0
2%(w/v)ツィーン20を含むPBSで同様に3回
洗浄後、ウェルにABTS溶液(KPL社製)を50μ
l加え、室温で15分〜1時間放置して発色反応させ、
96ウエルEIAプレート用光度計で405nmの吸光度
を測定する。そして陽性のウエル中の細胞をそれぞれパ
スツールピペットで回収し、24ウェルプラスチック製
培養容器に移し、HAT培地1〜2mlを加え、同様に培
養する。
【0089】(E)限界希釈法によるクローニング 24ウェルプラスチック製培養容器で増殖させた2株の
融合細胞の細胞濃度を測定し、細胞数が20個/mlとな
るようそれぞれをHT培地で希釈する。別にHT培地に
懸濁した4〜6週齢のマウス胸腺細胞を96ウェルプラ
スチック製培養容器に1〜2×105個/ウェルとり、
これに上記の融合細胞(細胞濃度が20個/ml)を5
0μl/ウェルずつ加え、5%(v/v)炭酸ガス雰囲
気下、36℃で培養し、その1日後、7日後及び14日
後にHT培地を1〜2滴/ウェル加える。細胞の増殖が
見られたウェルの培養上清を50μl回収し、上記
(D)の「抗体生産細胞のスクリーニング」と同様の方
法で抗体の生産を確認する。ウェル中に単一の細胞コロ
ニーしか存在せず、基本小体と反応する抗体を生産する
もので、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き
続き24ウェルプラスチック製培養容器で増殖させる。
更に、同様のクローニング操作を繰り返し、抗クラミジ
ア・ニューモニエ抗体を産生するハイブリドーマを取得
する。これを培養し、その培養上清から抗クラミジア・
ニューモニエ抗体を製造する。
融合細胞の細胞濃度を測定し、細胞数が20個/mlとな
るようそれぞれをHT培地で希釈する。別にHT培地に
懸濁した4〜6週齢のマウス胸腺細胞を96ウェルプラ
スチック製培養容器に1〜2×105個/ウェルとり、
これに上記の融合細胞(細胞濃度が20個/ml)を5
0μl/ウェルずつ加え、5%(v/v)炭酸ガス雰囲
気下、36℃で培養し、その1日後、7日後及び14日
後にHT培地を1〜2滴/ウェル加える。細胞の増殖が
見られたウェルの培養上清を50μl回収し、上記
(D)の「抗体生産細胞のスクリーニング」と同様の方
法で抗体の生産を確認する。ウェル中に単一の細胞コロ
ニーしか存在せず、基本小体と反応する抗体を生産する
もので、かつ増殖が早い細胞をウェルから回収し、引き
続き24ウェルプラスチック製培養容器で増殖させる。
更に、同様のクローニング操作を繰り返し、抗クラミジ
ア・ニューモニエ抗体を産生するハイブリドーマを取得
する。これを培養し、その培養上清から抗クラミジア・
ニューモニエ抗体を製造する。
【0090】
【発明の効果】請求項1記載の融合タンパク質は、クラ
ミジア・ニューモニエの抗体検査等に好適である。請求
項2記載の融合タンパク質は、請求項1記載の融合タン
パク質の効果を奏し、さらにアミノ酸配列が短いため、
担体等に固定化できる抗原ペプチドの数を多くすること
ができ、それにより感度の高い診断薬の製造に利用でき
る。請求項3記載の融合タンパク質は、請求項1記載の
融合タンパク質の効果を奏し、さらにタンパク質分解酵
素による分解を受けにくい構造を造ることができるの
で、抗原としての安定性に優れる。請求項4記載の融合
タンパク質は、請求項1記載の融合タンパク質の効果を
奏し、さらにクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原
ポリペプチドの全体を有するので、クラミジア・ニュー
モニエの特異的抗体検査等に極めて適切である。請求項
5記載の融合タンパク質は、請求項1記載の融合タンパ
ク質の効果を奏し、さらにクラミジア・ニューモニエに
特異的な抗原部分を有するので、クラミジア・ニューモ
ニエの特異的抗体検査等に好適である。
ミジア・ニューモニエの抗体検査等に好適である。請求
項2記載の融合タンパク質は、請求項1記載の融合タン
パク質の効果を奏し、さらにアミノ酸配列が短いため、
担体等に固定化できる抗原ペプチドの数を多くすること
ができ、それにより感度の高い診断薬の製造に利用でき
る。請求項3記載の融合タンパク質は、請求項1記載の
融合タンパク質の効果を奏し、さらにタンパク質分解酵
素による分解を受けにくい構造を造ることができるの
で、抗原としての安定性に優れる。請求項4記載の融合
タンパク質は、請求項1記載の融合タンパク質の効果を
奏し、さらにクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原
ポリペプチドの全体を有するので、クラミジア・ニュー
モニエの特異的抗体検査等に極めて適切である。請求項
5記載の融合タンパク質は、請求項1記載の融合タンパ
ク質の効果を奏し、さらにクラミジア・ニューモニエに
特異的な抗原部分を有するので、クラミジア・ニューモ
ニエの特異的抗体検査等に好適である。
【0091】請求項6記載のDNAは、クラミジア・ニ
ューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの診
断に好適な融合タンパク質の製造に利用できる。請求項
7記載のDNAは、請求項6記載のDNAの効果を奏
し、さらにこのDNAにコードされている融合タンパク
質は、クラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペ
プチドの全体を有するので、クラミジア・ニューモニエ
の特異的抗体検査等に極めて適切な融合タンパク質の製
造に利用できる。請求項8記載のDNAは、請求項6記
載のDNAの効果を奏し、さらにこのDNAにコードさ
れている融合タンパク質は、クラミジア・ニューモニエ
に特異的な抗原部分を有するので、クラミジア・ニュー
モニエの特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質の製
造に利用できる。
ューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモニエの診
断に好適な融合タンパク質の製造に利用できる。請求項
7記載のDNAは、請求項6記載のDNAの効果を奏
し、さらにこのDNAにコードされている融合タンパク
質は、クラミジア・ニューモニエに特異的な抗原ポリペ
プチドの全体を有するので、クラミジア・ニューモニエ
の特異的抗体検査等に極めて適切な融合タンパク質の製
造に利用できる。請求項8記載のDNAは、請求項6記
載のDNAの効果を奏し、さらにこのDNAにコードさ
れている融合タンパク質は、クラミジア・ニューモニエ
に特異的な抗原部分を有するので、クラミジア・ニュー
モニエの特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質の製
造に利用できる。
【0092】請求項9記載の組換えベクターは、クラミ
ジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモ
ニエの診断に好適な融合タンパク質の製造に利用でき
る。請求項10記載の組換えベクターは、請求項9記載
の組換えベクターの効果を奏し、さらにクラミジア・ニ
ューモニエに特異的な抗原部分を有する融合タンパク質
を発現させることができるので、クラミジア・ニューモ
ニエの特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質の製造
に利用できる。請求項11記載の形質転換体は、クラミ
ジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモ
ニエの診断に好適な融合タンパク質の製造に利用でき
る。請求項12記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体
の製造法は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断薬製
造に好適である。
ジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモ
ニエの診断に好適な融合タンパク質の製造に利用でき
る。請求項10記載の組換えベクターは、請求項9記載
の組換えベクターの効果を奏し、さらにクラミジア・ニ
ューモニエに特異的な抗原部分を有する融合タンパク質
を発現させることができるので、クラミジア・ニューモ
ニエの特異的抗体検査等に好適な融合タンパク質の製造
に利用できる。請求項11記載の形質転換体は、クラミ
ジア・ニューモニエの抗体検査やクラミジア・ニューモ
ニエの診断に好適な融合タンパク質の製造に利用でき
る。請求項12記載の抗クラミジア・ニューモニエ抗体
の製造法は、クラミジア・ニューモニエ感染の診断薬製
造に好適である。
【0093】
配列番号:1 配列の長さ:160 配列の型:アミノ酸 配列の種類:ペプチド 配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160
【0094】配列番号:2 配列の長さ:488 配列の型:アミノ酸 配列の種類:ペプチド 配列 Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met 1 5 10 15 Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys 20 25 30 Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys 35 40 45 Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys 50 55 60 Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly 65 70 75 80 Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp 85 90 95 Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr 100 105 110 Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu 115 120 125 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu 130 135 140 Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser 145 150 155 160 Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg 165 170 175 Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr 180 185 190 Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln 195 200 205 Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile 210 215 220 Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240 Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val 245 250 255 Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala Ala 260 265 270 Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala 275 280 285 Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr 290 295 300 Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val Lys 305 310 315 320 Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile Lys 325 330 335 Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val Lys 340 345 350 Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala Lys 355 360 365 Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val Ile 370 375 380 Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val 385 390 395 400 Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser Glu 405 410 415 Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu Gln 420 425 430 Ala Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln Ala 435 440 445 Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gln 450 455 460 Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ile 465 470 475 480 Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 485 488
【0095】配列番号:3 配列の長さ:649 配列の型:アミノ酸 配列の種類:ペプチド 配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 Leu Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile 165 170 175 Met Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp 180 185 190 Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly 195 200 205 Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly 210 215 220 Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln 225 230 235 240 Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala 245 250 255 Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala 260 265 270 Thr Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met 275 280 285 Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys 290 295 300 Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320 Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro 325 330 335 Arg Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln 340 345 350 Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr 355 360 365 Gln Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala 370 375 380 Ile Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala 385 390 395 400 Glu Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr 405 410 415 Val Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala 420 425 430 Ala Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala 435 440 445 Ala Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala 450 455 460 Thr Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val 465 470 475 480 Lys Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile 485 490 495 Lys Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val 500 505 510 Lys Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala 515 520 525 Lys Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val 530 535 540 Ile Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val 545 550 555 560 Val Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser 565 570 575 Glu Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu 580 585 590 Gln Ala Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln 595 600 605 Ala Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr 610 615 620 Gln Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala 625 630 635 640 Ile Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 645 649
【0096】配列番号:4 配列の長さ:432 配列の型:アミノ酸 配列の種類:ペプチド 配列 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 Leu Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile 165 170 175 Met Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp 180 185 190 Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly 195 200 205 Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly 210 215 220 Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln 225 230 235 240 Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala 245 250 255 Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala 260 265 270 Thr Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met 275 280 285 Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys 290 295 300 Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320 Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro 325 330 335 Arg Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln 340 345 350 Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr 355 360 365 Gln Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala 370 375 380 Ile Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala 385 390 395 400 Glu Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr 405 410 415 Val Met Ile Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro Leu Ile Asn 420 425 430 432
【0097】配列番号:5 配列の長さ:1947 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 ATG ATC AGT CTG ATT GCG GCG TTA GCG GTA GAT CGC GTT ATC GGC ATG 48 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 GAA AAC GCC ATG CCG TGG AAC CTG CCT GCC GAT CTC GCC TGG TTT AAA 96 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 CGC AAC ACC TTA AAT AAA CCC GTG ATT ATG GGC CGC CAT ACC TGG GAA 144 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 TCA ATC GGT CGT CCG TTG CCA GGA CGC AAA AAT ATT ATC CTC AGC AGT 192 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 CAA CCG GGT ACG GAC GAT CGC GTA ACG TGG GTG AAG TCG GTG GAT GAA 240 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 GCC ATC GCG GCG TGT GGT GAC GTA CCA GAA ATC ATG GTG ATT GGC GGC 288 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 GGT CGC GTT TAT GAA CAG TTC TTG CCA AAA GCG CAA AAA CTG TAT CTG 336 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 ACG CAT ATC GAC GCA GAA GTG GAA GGC GAC ACC CAT TTC CCG GAT TAC 384 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 GAG CCG GAT GAC TGG GAA TCG GTA TTC AGC GAA TTC CAC GAT GCT GAT 432 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 GCG CAG AAC TCT CAC AGC TAT GAG TTC GAA ATT CTG GAG CGG CGG ATC 480 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 CTG ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC 528 Leu Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile 165 170 175 ATG TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT 576 Met Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp 180 185 190 AAG CTG TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT 624 Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly 195 200 205 AAA AAC ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA 672 Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly 210 215 220 AAA GAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG 720 Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln 225 230 235 240 GGA GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT 768 Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala 245 250 255 GAT ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA 816 Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala 260 265 270 ACA AAA ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG 864 Thr Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met 275 280 285 GAG TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA 912 Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys 290 295 300 GAA GTC GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT 960 Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320 TCC GCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA 1008 Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro 325 330 335 AGA TCA GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG 1056 Arg Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln 340 345 350 ACA TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA 1104 Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr 355 360 365 CAA GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG 1152 Gln Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala 370 375 380 ATA AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC 1200 Ile Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala 385 390 395 400 GAA CAG AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT 1248 Glu Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr 405 410 415 GTG ATG ATC GCG GTT TCT GTT GCC ATT ACA GTT ATT TCT ATT GTT GCT 1296 Val Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala 420 425 430 GCT ATT TTT ACA TGC GGA GCT GGA CTC GCT GGA CTC GCT GCG GGA GCT 1344 Ala Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala 435 440 445 GCT GTA GGT GCA GCG GCA GCT GGA GGT GCA GCA GGA GCT GCT GCC GCA 1392 Ala Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala 450 455 460 ACC ACG GTA GCA ACA CAA ATT ACA GTT CAA GCT GTT GTC CAA GCG GTG 1440 Thr Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val 465 470 475 480 AAA CAA GCT GTT ATC ACA GCT GTC AGA CAA GCG ATC ACC GCG GCT ATA 1488 Lys Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile 485 490 495 AAA GCG GCT GTC AAA TCT GGA ATA AAA GCA TTT ATC AAA ACT TTA GTC 1536 Lys Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val 500 505 510 AAA GCG ATT GCC AAA GCC ATT TCT AAA GGA ATC TCT AAG GTT TTC GCT 1584 Lys Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala 515 520 525 AAG GGA ACT CAA ATG ATT GCG AAG AAC TTC CCC AAG CTC TCG AAA GTC 1632 Lys Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val 530 535 540 ATC TCG TCT CTT ACC AGT AAA TGG GTC ACG GTT GGG GTT GGG GTT GTA 1680 Ile Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val 545 550 555 560 GTT GCG GCG CCT GCT CTC GGT AAA GGG ATT ATG CAA ATG CAG CTC TCG 1728 Val Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser 565 570 575 GAG ATG CAA CAA AAC GTC GCT CAA TTT CAG AAA GAA GTC GGA AAA CTG 1776 Glu Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu 580 585 590 CAG GCT GCG GCT GAT ATG ATT TCT ATG TTC ACT CAA TTT TGG CAA CAG 1824 Gln Ala Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln 595 600 605 GCA AGT AAA ATT GCC TCA AAA CAA ACA GGC GAG TCT AAT GAA ATG ACT 1872 Ala Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr 610 615 620 CAA AAA GCT ACC AAG CTG GGC GCT CAA ATC CTT AAA GCG TAT GCC GCA 1920 Gln Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala 625 630 635 640 ATC AGC GGA GCC ATC GCT GGC GCA GCA 1947 Ile Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 645 649
【0098】配列番号:6 配列の長さ:1296 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 ATG ATC AGT CTG ATT GCG GCG TTA GCG GTA GAT CGC GTT ATC GGC ATG 48 Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Arg Val Ile Gly Met 1 5 10 15 GAA AAC GCC ATG CCG TGG AAC CTG CCT GCC GAT CTC GCC TGG TTT AAA 96 Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys 20 25 30 CGC AAC ACC TTA AAT AAA CCC GTG ATT ATG GGC CGC CAT ACC TGG GAA 144 Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu 35 40 45 TCA ATC GGT CGT CCG TTG CCA GGA CGC AAA AAT ATT ATC CTC AGC AGT 192 Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser 50 55 60 CAA CCG GGT ACG GAC GAT CGC GTA ACG TGG GTG AAG TCG GTG GAT GAA 240 Gln Pro Gly Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu 65 70 75 80 GCC ATC GCG GCG TGT GGT GAC GTA CCA GAA ATC ATG GTG ATT GGC GGC 288 Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly 85 90 95 GGT CGC GTT TAT GAA CAG TTC TTG CCA AAA GCG CAA AAA CTG TAT CTG 336 Gly Arg Val Tyr Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu 100 105 110 ACG CAT ATC GAC GCA GAA GTG GAA GGC GAC ACC CAT TTC CCG GAT TAC 384 Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr 115 120 125 GAG CCG GAT GAC TGG GAA TCG GTA TTC AGC GAA TTC CAC GAT GCT GAT 432 Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp 130 135 140 GCG CAG AAC TCT CAC AGC TAT GAG TTC GAA ATT CTG GAG CGG CGG ATC 480 Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Glu Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg Ile 145 150 155 160 CTG ATG TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC 528 Leu Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile 165 170 175 ATG TCT CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT 576 Met Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp 180 185 190 AAG CTG TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT 624 Lys Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly 195 200 205 AAA AAC ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC
ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA 672 Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly 210 215 220 AAA GAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG 720 Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln 225 230 235 240 GGA GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT 768 Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala 245 250 255 GAT ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA 816 Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala 260 265 270 ACA AAA ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG 864 Thr Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met 275 280 285 GAG TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA 912 Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys 290 295 300 GAA GTC GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT 960 Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320 TCC GCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA 1008 Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro 325 330 335 AGA TCA GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG 1056 Arg Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln 340 345 350 ACA TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA 1104 Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr 355 360 365 CAA GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG 1152 Gln Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala 370 375 380 ATA AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC 1200 Ile Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala 385 390 395 400 GAA CAG AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT 1248 Glu Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr 405 410 415 GTG ATG ATC GCG AAG GGG TTC GAA TTG CCA TGG GGG CCC TTA ATT AAT 1296 Val Met Ile Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro Leu Ile Asn 420 425 430 432
ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA 672 Lys Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly 210 215 220 AAA GAC AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG 720 Lys Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln 225 230 235 240 GGA GTT GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT 768 Gly Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala 245 250 255 GAT ACT GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA 816 Asp Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala 260 265 270 ACA AAA ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG 864 Thr Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met 275 280 285 GAG TCT ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA 912 Glu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys 290 295 300 GAA GTC GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT 960 Glu Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly 305 310 315 320 TCC GCA AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA 1008 Ser Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro 325 330 335 AGA TCA GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG 1056 Arg Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln 340 345 350 ACA TTG GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA 1104 Thr Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr 355 360 365 CAA GCA CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG 1152 Gln Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala 370 375 380 ATA AAA ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC 1200 Ile Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala 385 390 395 400 GAA CAG AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT 1248 Glu Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr 405 410 415 GTG ATG ATC GCG AAG GGG TTC GAA TTG CCA TGG GGG CCC TTA ATT AAT 1296 Val Met Ile Ala Lys Gly Phe Glu Leu Pro Trp Gly Pro Leu Ile Asn 420 425 430 432
【0099】配列番号:7 配列の長さ:1048 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:C. ニューモニエ 株名:YK-41 直接の起源 クローン:53-3S 配列の特徴 特徴を表す記号:CDS 存在位置:236..1012 特徴を決定した方法:P 配列 TCAGTATCGG CGGAATTCGA ACCCCTTCGC GGC
TCTTTCT GGAACTCTAG AATCTTTACA 60 TCTCGAAGAG TTAACTCAAG GATTATTCCC TTC
TGCCCAA GAAGATGCCA ACTTCGCAAA 120 GGAGTTATCT TCAGTAGTAC ACGGATTAAA AAACCTAACC ACTGTAGTTA ATAAACAAAT 180 GGTTAAAGGC GCTGAGTAAA GCCCTTTGCA GAATCAAACC CCTTAGGATA CAAAC ATG 238 Met 1 TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG TCT 286 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met Ser 5 10 15 CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG CTG 334 Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys Leu 20 25 30 TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA AAC 382 Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys Asn 35 40 45 ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA GAC 430 Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys Asp 50 55 60 65 AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA GTT 478 Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly Val 70 75 80 GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT ACT 526 Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp Thr 85 90 95 GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA AAA 574 Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr Lys 100 105 110 ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG TCT 622 Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu Ser 115 120 125 ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA GTC 670 Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu Val 130 135 140 145 GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC GCA 718 Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser Ala 150 155 160 AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA TCA 766 Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg Ser 165 170 175 GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA TTG 814 Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr Leu 180 185 190 GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA GCA 862 Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln Ala 195 200 205 CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA AAA 910 Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile Lys 210 215 220 225 ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA CAG 958 Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu Gln 230 235 240 AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG ATG 1006 Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val Met 245 250 255 ATC GCG AAGGGGTTCG AATTCCAGCT GAGCGCCGGT CGCTAC 1048 Ile Ala 259
TCTTTCT GGAACTCTAG AATCTTTACA 60 TCTCGAAGAG TTAACTCAAG GATTATTCCC TTC
TGCCCAA GAAGATGCCA ACTTCGCAAA 120 GGAGTTATCT TCAGTAGTAC ACGGATTAAA AAACCTAACC ACTGTAGTTA ATAAACAAAT 180 GGTTAAAGGC GCTGAGTAAA GCCCTTTGCA GAATCAAACC CCTTAGGATA CAAAC ATG 238 Met 1 TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG TCT 286 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met Ser 5 10 15 CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG CTG 334 Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys Leu 20 25 30 TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA AAC 382 Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys Asn 35 40 45 ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA GAC 430 Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys Asp 50 55 60 65 AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA GTT 478 Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly Val 70 75 80 GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT ACT 526 Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp Thr 85 90 95 GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA AAA 574 Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr Lys 100 105 110 ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG TCT 622 Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu Ser 115 120 125 ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA GTC 670 Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu Val 130 135 140 145 GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC GCA 718 Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser Ala 150 155 160 AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA TCA 766 Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg Ser 165 170 175 GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA TTG 814 Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr Leu 180 185 190 GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA GCA 862 Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln Ala 195 200 205 CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA AAA 910 Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile Lys 210 215 220 225 ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA CAG 958 Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu Gln 230 235 240 AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG ATG 1006 Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val Met 245 250 255 ATC GCG AAGGGGTTCG AATTCCAGCT GAGCGCCGGT CGCTAC 1048 Ile Ala 259
【0100】配列番号:8 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GATCCTGATG TCTATTTCAT CTTCTTCAG 29
【0101】配列番号:9 配列の長さ:28 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GTCCTGAAGA AGATGAAATA GACATCAG 28
【0102】配列番号:10 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 AATTGCCATG GGGGCCCTTA ATTAATTAAC 30
【0103】配列番号:11 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 TCGAGTTAAT TAATTAAGGG CCCCCATGGC 30
【0104】配列番号:12 配列の長さ:5438 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 配列の種類:他の核酸 プラスミド 配列 ATCGATGTTA ACAGATCTAA GCTTAACTAA CTAACTCCGG AAAAGGAGGA ACTTCCATGA 60 TCAGTCTGAT TGCGGCGTTA GCGGTAGATC GCGTTATCGG CATGGAAAAC GCCATGCCGT 120 GGAACCTGCC TGCCGATCTC GCCTGGTTTA AACGCAACAC CTTAAATAAA CCCGTGATTA 180 TGGGCCGCCA TACCTGGGAA TCAATCGGTC GTCCGTTGCC AGGACGCAAA AATATTATCC 240 TCAGCAGTCA ACCGGGTACG GACGATCGCG TAACGTGGGT GAAGTCGGTG GATGAAGCCA 300 TCGCGGCGTG TGGTGACGTA CCAGAAATCA TGGTGATTGG CGGCGGTCGC GTTTATGAAC 360 AGTTCTTGCC AAAAGCGCAA AAACTGTATC TGACGCATAT CGACGCAGAA GTGGAAGGCG 420 ACACCCATTT CCCGGATTAC GAGCCGGATG ACTGGGAATC GGTATTCAGC GAATTCCACG 480 ATGCTGATGC GCAGAACTCT CACAGCTATG AGTTCGAAAT TCTGGAGCGG CGGATCCTGA 540 TGTCTATTTC ATCTTCTTCA GGACCTGACA ATCAAAAAAA TATCATGTCT CAAGTTCTGA 600 CATCGACACC CCAGGGCGTG CCCCAACAAG ATAAGCTGTC TGGCAACGAA ACGAAGCAAA 660 TACAGCAAAC ACGTCAGGGT AAAAACACTG AGATGGAAAG CGATGCCACT ATTGCTGGTG 720 CTTCTGGAAA AGACAAAACT TCCTCGACTA CAAAAACAGA AACAGCTCCA CAACAGGGAG 780 TTGCTGCTGG GAAAGAATCC TCAGAAAGTC AAAAGGCAGG TGCTGATACT GGAGTATCAG 840 GAGCGGCTGC TACTACAGCA TCAAATACTG CAACAAAAAT TGCTATGCAG ACCTCTATTG 900 AAGAGGCGAG CAAAAGTATG GAGTCTACCT TAGAGTCACT TCAAAGCCTC AGTGCCGCGC 960 AAATGAAAGA AGTCGAAGCG GTTGTTGTTG CTGCCCTCTC AGGGAAAAGT TCGGGTTCCG 1020 CAAAATTGGA AACACCTGAG CTCCCCAAGC CCGGGGTGAC ACCAAGATCA GAGGTTATCG 1080 AAATCGGACT CGCGCTTGCT AAAGCAATTC AGACATTGGG AGAAGCCACA AAATCTGCCT 1140 TATCTAACTA TGCAAGTACA CAAGCACAAG CAGACCAAAC AAATAAACTA GGTCTAGAAA 1200 AGCAAGCGAT AAAAATCGAT AAAGAACGAG AAGAATACCA AGAGATGAAG GCTGCCGAAC 1260 AGAAGTCTAA AGATCTCGAA GGAACAATGG ATACTGTCAA TACTGTGATG ATCGCGAAGG 1320 GGTTCGAATT GCCATGGGGG CCCTTAATTA ATTAACTCGA GAGATCCAGA TCTAATCGAT 1380 GATCCTCTAC GCCGGACGCA TCGTGGCCGG CATCACCGGC GCCACAGGTG CGGTTGCTGG 1440 CGCCTATATC GCCGACATCA CCGATGGGGA AGATCGGGCT CGCCACTTCG GGCTCATGAG 1500 CGCTTGTTTC GGCGTGGGTA TGGTGGCAGG CCCGTGGCCG GGGGACTGTT GGGCGCCATC 1560 TCCTTGCATG CACCATTCCT TGCGGCGGCG GTGCTCAACG GCCTCAACCT ACTACTGGGC 1620 TGCTTCCTAA TGCAGGAGTC GCATAAGGGA GAGCGTCGAC CGATGCCCTT GAGAGCCTTC 1680 AACCCAGTCA GCTCCTTCCG GTGGGCGCGG GGCATGACTA TCGTCGCCGC ACTTATGACT 1740 GTCTTCTTTA TCATGCAACT CGTAGGACAG GTGCCGGCAG CGCTCTGGGT CATTTTCGGC 1800 GAGGACCGCT TTCGCTGGAG CGCGACGATG ATCGGCCTGT CGCTTGCGGT ATTCGGAATC 1860 TTGCACGCCC TCGCTCAAGC CTTCGTCACT GGTCCCGCCA CCAAACGTTT CGGCGAGAAG 1920 CAGGCCATTA TCGCCGGCAT GGCGGCCGAC GCGCTGGGCT ACGTCTTGCT GGCGTTCGCG 1980 ACGCGAGGCT GGATGGCCTT CCCCATTATG ATTCTTCTCG CTTCCGGCGG CATCGGGATG 2040 CCCGCGTTGC AGGCCATGCT GTCCAGGCAG GTAGATGACG ACCATCAGGG ACAGCTTCAA 2100 GGATCGCTCG CGGCTCTTAC CAGCCTAACT TCGATCACTG GACCGCTGAT CGTCACGGCG 2160 ATTTATGCCG CCTCGGCGAG CACATGGAAC GGGTTGGCAT GGATTGTAGG CGCCGCCCTA 2220 TACCTTGTCT GCCTCCCCGC GTTGCGTCGC GGTGCATGGA GCCGGGCCAC CTCGACCTGA 2280 ATGGAAGCCG GCGGCACCTC GCTAACGGAT TCACCACTCC AAGAATTGGA GCCAATCAAT 2340 TCTTGCGGAG AACTGTGAAT GCGCAAACCA ACCCTTGGCA GAACATATCC ATCGCGTCCG 2400 CCATCTCCAG CAGCCGCACG CGGCGCATCT CGGGCAGCGT TGGGTCCTGG CCACGGGTGC 2460 GCATGATCGT GCTCCTGTCG TTGAGGACCC GGCTAGGCTG GCGGGGTTGC CTTACTGGTT 2520 AGCAGAATGA ATCACCGATA CGCGAGCGAA CGTGAAGCGA CTGCTGCTGC AAAACGTCTG 2580 CGACCTGAGC AACAACATGA ATGGTCTTCG GTTTCCGTGT TTCGTAAAGT CTGGAAACGC 2640 GGAAGTCAGC GCCCTGCACC ATTATGTTCC GGATCTGCAT CGCAGGATGC TGCTGGCTAC 2700 CCTGTGGAAC ACCTACATCT GTATTAACGA AGCGCTGGCA TTGACCCTGA GTGATTTTTC 2760 TCTGGTCCCG CCGCATCCAT ACCGCCAGTT GTTTACCCTC ACAACGTTCC AGTAACCGGG 2820 CATGTTCATC ATCAGTAACC CGTATCGTGA GCATCCTCTC TCGTTTCATC GGTATCATTA 2880 CCCCCATGAA CAGAAATTCC CCCTTACACG GAGGCATCAA GTGACCAAAC AGGAAAAAAC 2940 CGCCCTTAAC ATGGCCCGCT TTATCAGAAG CCAGACATTA ACGCTTCTGG AGAAACTCAA 3000 CGAGCTGGAC GCGGATGAAC AGGCAGACAT CTGTGAATCG CTTCACGACC ACGCTGATGA 3060 GCTTTACCGC AGCTGCCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT GAAAACCTCT GACACATGCA 3120 GCTCCCGGAG ACGGTCACAG CTTGTCTGTA AGCGGATGCC GGGAGCAGAC AAGCCCGTCA 3180 GGGCGCGTCA GCGGGTGTTG GCGGGTGTCG GGGCGCAGCC ATGACCCAGT CACGTAGCGA 3240 TAGCGGAGTG TATACTGGCT TAACTATGCG GCATCAGAGC AGATTGTACT GAGAGTGCAC 3300 CATATGCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC GTAAGGAGAA AATACCGCAT CAGGCGCTCT 3360 TCCGCTTCCT CGCTCACTGA CTCGCTGCGC TCGGTCGTTC GGCTGCGGCG AGCGGTATCA 3420 GCTCACTCAA AGGCGGTAAT ACGGTTATCC ACAGAATCAG GGGATAACGC AGGAAAGAAC 3480 ATGTGAGCAA AAGGCCAGCA AAAGGCCAGG AACCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGGCGTTT 3540 TTCCATAGGC TCCGCCCCCC TGACGAGCAT CACAAAAATC GACGCTCAAG TCAGAGGTGG 3600 CGAAACCCGA CAGGACTATA AAGATACCAG GCGTTTCCCC CTGGAAGCTC CCTCGTGCGC 3660 TCTCCTGTTC CGACCCTGCC GCTTACCGGA TACCTGTCCG CCTTTCTCCC TTCGGGAAGC 3720 GTGGCGCTTT CTCAATGCTC ACGCTGTAGG TATCTCAGTT CGGTGTAGGT CGTTCGCTCC 3780 AAGCTGGGCT GTGTGCACGA ACCCCCCGTT CAGCCCGACC GCTGCGCCTT ATCCGGTAAC 3840 TATCGTCTTG AGTCCAACCC GGTAAGACAC GACTTATCGC CACTGGCAGC AGCCACTGGT 3900 AACAGGATTA GCAGAGCGAG GTATGTAGGC GGTGCTACAG AGTTCTTGAA GTGGTGGCCT 3960 AACTACGGCT ACACTAGAAG GACAGTATTT GGTATCTGCG CTCTGCTGAA GCCAGTTACC 4020 TTCGGAAAAA GAGTTGGTAG CTCTTGATCC GGCAAACAAA CCACCGCTGG TAGCGGTGGT 4080 TTTTTTGTTT GCAAGCAGCA GATTACGCGC AGAAAAAAAG GATCTCAAGA AGATCCTTTG 4140 ATCTTTTCTA CGGGGTCTGA CGCTCAGTGG AACGAAAACT CACGTTAAGG GATTTTGGTC 4200 ATGAGATTAT CAAAAAGGAT CTTCACCTAG ATCCTTTTAA ATTAAAAATG AAGTTTTAAA 4260 TCAATCTAAA GTATATATGA GTAAACTTGG TCTGACAGTT ACCAATGCTT AATCAGTGAG 4320 GCACCTATCT CAGCGATCTG TCTATTTCGT TCATCCATAG TTGCCTGACT CCCCGTCGTG 4380 TAGATAACTA CGATACGGGA GGGCTTACCA TCTGGCCCCA GTGCTGCAAT GATACCGCGA 4440 GACCCACGCT CACCGGCTCC AGATTTATCA GCAATAAACC AGCCAGCCGG AAGGGCCGAG 4500 CGCAGAAGTG GTCCTGCAAC TTTATCCGCC TCCATCCAGT CTATTAATTG TTGCCGGGAA 4560 GCTAGAGTAA GTAGTTCGCC AGTTAATAGT TTGCGCAACG TTGTTGCCAT TGCTGCAGGC 4620 ATCGTGGTGT CACGCTCGTC GTTTGGTATG GCTTCATTCA GCTCCGGTTC CCAACGATCA 4680 AGGCGAGTTA CATGATCCCC CATGTTGTGC AAAAAAGCGG TTAGCTCCTT CGGTCCTCCG 4740 ATCGTTGTCA GAAGTAAGTT GGCCGCAGTG TTATCACTCA TGGTTATGGC AGCACTGCAT 4800 AATTCTCTTA CTGTCATGCC ATCCGTAAGA TGCTTTTCTG TGACTGGTGA GTACTCAACC 4860 AAGTCATTCT GAGAATAGTG TATGCGGCGA CCGAGTTGCT CTTGCCCGGC GTCAACACGG 4920 GATAATACCG CGCCACATAG CAGAACTTTA AAAGTGCTCA TCATTGGAAA ACGTTCTTCG 4980 GGGCGAAAAC TCTCAAGGAT CTTACCGCTG TTGAGATCCA GTTCGATGTA ACCCACTCGT 5040 GCACCCAACT GATCTTCAGC ATCTTTTACT TTCACCAGCG TTTCTGGGTG AGCAAAAACA 5100 GGAAGGCAAA ATGCCGCAAA AAAGGGAATA AGGGCGACAC GGAAATGTTG AATACTCATA 5160 CTCTTCCTTT TTCAATATTA TTGAAGCATT TATCAGGGTT ATTGTCTCAT GAGCGGATAC 5220 ATATTTGAAT GTATTTAGAA AAATAAACAA ATAGGGGTTC CGCGCACATT TCCCCGAAAA 5280 GTGCCACCTG ACGTCTAAGA AACCATTATT ATCATGACAT TAACCTATAA AAATAGGCGT 5340 ATCACGAGGC CCTTTCGTCT TCAAGAATTA ATTGTTATCC GCTCACAATT AATTCTTGAC 5400 AATTAGTTAA CTATTTGTTA TAATGTATTC ATAAGCTT 5438
【0105】配列番号:13 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCTGCCGAAC AGAAGTCTAA 20
【0106】配列番号:14 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 CTCGAAGGAA CAATGGATAC 20
【0107】配列番号:15 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GTACATATTG TCGTTAGAAC GCG 23
【0108】配列番号:16 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 TAATACGACT CACTATAGGG AGA 23
【0109】配列番号:17 配列の長さ:28 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GCGGATCCTG ATGTCTATTT CATCTTCT 28
【0110】配列番号:18 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 ATCTCGAGTT TTATGCTGCT GCGCCAGCGA 3
0
0
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 1/21 7804−4B C12N 1/21 C12P 21/02 C12P 21/02 C G01N 33/569 G01N 33/569 F 33/571 33/571 // A61K 39/395 A61K 39/395 D 49/00 49/00 A C12P 21/08 C12P 21/08 (C12N 15/09 ZNA C12R 1:01) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91) (54)【発明の名称】 ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、それをコードするDN A、そのDNAを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジ ア・ニューモニエ抗体の製造法
Claims (12)
- 【請求項1】 配列番号1で示されるペプチドに、直接
に又は介在アミノ酸配列を介して、配列番号2で示され
るペプチドの中の連続した少なくとも5個のアミノ酸か
らなる配列を含むポリペプチドAが結合した、ジヒドロ
葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タン
パク質。 - 【請求項2】 ポリペプチドAが、配列番号2で示され
るペプチドからアミノ酸が欠落しているポリペプチドで
ある、請求項1記載の融合タンパク質。 - 【請求項3】 ポリペプチドAが、配列番号2で示され
るペプチドの中のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されて
いるか又は配列番号2で示されるペプチドの中にアミノ
酸が挿入されているポリペプチドである、請求項1記載
の融合タンパク質。 - 【請求項4】 配列番号3で示されるペプチドである、
請求項1記載の融合タンパク質。 - 【請求項5】 配列番号4で示されるペプチドである、
請求項1記載の融合タンパク質。 - 【請求項6】 請求項1〜5のいずれかに記載の融合タ
ンパク質をコードするDNA若しくはそれに相補的なD
NA。 - 【請求項7】 配列番号5で示される塩基配列を有す
る、請求項6記載のDNA。 - 【請求項8】 配列番号6で示される塩基配列を有す
る、請求項6記載のDNA。 - 【請求項9】 請求項6〜8のいずれかに記載のDNA
を含む組換えベクター。 - 【請求項10】 pCPN533Tプラスミドである請
求項9記載の組換えベクター。 - 【請求項11】 請求項9又は10に記載の組換えベク
ターを含む形質転換体。 - 【請求項12】 請求項1〜5のいずれかに記載の融合
タンパク質を抗原として用いることを特徴とする、抗ク
ラミジア・ニューモニエ抗体の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8057409A JPH099976A (ja) | 1995-04-28 | 1996-03-14 | ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、それをコードするdna、そのdnaを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7-106006 | 1995-04-28 | ||
JP10600695 | 1995-04-28 | ||
JP8057409A JPH099976A (ja) | 1995-04-28 | 1996-03-14 | ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、それをコードするdna、そのdnaを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH099976A true JPH099976A (ja) | 1997-01-14 |
Family
ID=26398446
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8057409A Pending JPH099976A (ja) | 1995-04-28 | 1996-03-14 | ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、それをコードするdna、そのdnaを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH099976A (ja) |
-
1996
- 1996-03-14 JP JP8057409A patent/JPH099976A/ja active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6489122B1 (en) | Method of detecting anti-Chlamydia pneumoniae antibody using Chlamydia pneumoniae-specific antigens | |
CN109021111B (zh) | 一种基因碱基编辑器 | |
CN107686848A (zh) | 转座子协同CRISPR/Cas9***的稳定敲除单质粒载体及其应用 | |
US20240117335A1 (en) | Fusion proteins for base editing | |
CN109735480B (zh) | 一种合成乳酰-n-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 | |
TW201010718A (en) | Combined measles-human papilloma vaccine | |
CN111378785A (zh) | 用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品及其应用 | |
IL171903A (en) | Purification of 2 – her variants | |
CN115044614B (zh) | 一种用于基因靶向与表达的aav-8型血清型的改造型载体及其构建方法及应用 | |
CN110257403B (zh) | 一种表达传染性喉气管炎病毒gB基因、其重组鸡痘病毒及构建方法和应用 | |
CN100591771C (zh) | 缺氧反应元件基因治疗质粒及其构建方法 | |
US6365344B1 (en) | Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules | |
JP3692599B2 (ja) | 抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定法及びその試薬並びにクラミジア・ニューモニエ感染の診断薬 | |
CN113880957A (zh) | 一种链球菌溶血素o融合蛋白 | |
KR101488110B1 (ko) | 나노아케움 이퀴탄스 유래의 Neq HS DNA 중합효소의 돌연변이체 제조 및 이를 이용한 hot-start PCR 응용 | |
JPH099976A (ja) | ジヒドロ葉酸還元酵素−クラミジア・ニューモニエ抗原融合タンパク質、それをコードするdna、そのdnaを含む組換えベクター、その組換えベクターを含む形質転換体、及び抗クラミジア・ニューモニエ抗体の製造法 | |
KR102009268B1 (ko) | 구제역 C3 Resende 주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스 | |
CN114196702A (zh) | 一种利用单碱基编辑器构建长qt疾病干细胞的方法 | |
CN114885899B (zh) | 一种基于重组腺病毒的猫冠状病毒感染动物模型的构建方法及应用 | |
CN110079530A (zh) | 一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用 | |
CN114835822B (zh) | 猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法 | |
KR102623115B1 (ko) | 신규한 구제역 Asia1형 재조합 바이러스 및 상기 바이러스를 포함하는 구제역 백신 조성물 | |
CN112480249B (zh) | Akt新底物hip-55的磷酸化抗体产品制备方法与应用 | |
CN114773441B (zh) | Hot1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用 | |
RU2670543C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pAL2-T-ExP, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ДНК-КАЛИБРАТОРОВ ПРИ ОЦЕНКЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМ МИЕЛОИДНЫМ ЛЕЙКОЗОМ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050826 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051025 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20051025 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060314 |