JPH0989892A - Method for measuring adhesive antigen - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To measure an antigen adhering to a carrier present in a liquid, by conducting immunoassay with the use of the carrier, an antibody to an antigen to be measured or its antigen-coupled fragment. SOLUTION: For example, an equal amount of human serum albumin (HSA) as a carrier and Hanganvitziu-Deicher(HD) antigen are mixed and left one day, thereby to form a standard substance. Meanwhile, a Fab fragment obtained by decomposing an anti HD antigen monoclonal antibody with papain is turned to a solid phase. Then, the standard substance and many samples of urine collected from healthy people and patients of various cancers are added to a Fab solid phase well, and reacted. After cleaning, a peroxidase marker anti HSA antibody is added to the samples and reacted, to which a color-producing reagent is further added. An absorbance is then measured. An HD antigen-HSA complex is measured by the obtained working curve. In this manner, cancers, particularly, cancers of urinary organs can be detected at a high rate.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、担体物質に付着し
た抗原を測定する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for measuring an antigen attached to a carrier substance.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ハンガナッツゥ−ダイヘル（Hanganutzi
u-Deicher)抗原（以下、「ＨＤ抗原」と言うことがあ
る）は、動物の組織や血液中に存在するが、ヒト及びニ
ワトリの正常組織や正常血液中には存在しない。しかし
ながら、癌患者の組織や血液中に見出される。従って、
ＨＤ抗原に対する抗体（以下、「抗ＨＤ抗体」というこ
とがある）を用いて血清中のＨＤ抗原を測定することに
より癌の診断を行うことが提案されている（特開平７−
５３５９９号公報）。従来、尿中にＨＤ抗原が存在する
ことは知られていなかった。2. Description of the Related Art Hanganutzi
The u-Deicher) antigen (hereinafter sometimes referred to as “HD antigen”) is present in animal tissues and blood, but not in normal human or chicken tissues or normal blood. However, it is found in the tissues and blood of cancer patients. Therefore,
It has been proposed to diagnose cancer by measuring the HD antigen in serum using an antibody against the HD antigen (hereinafter sometimes referred to as “anti-HD antibody”) (Japanese Patent Laid-Open No. 7-
No. 53599). Hitherto, it has not been known that HD antigen is present in urine.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】本願発明者らは、鋭意
研究の結果、尿中にＨＤ抗原は存在するが、これが尿中
のアルブミンに付着して存在することを見出した。この
ように、ＨＤ抗原は尿中ではアルブミンに付着した状態
で存在するので、抗ＨＤ抗体を用いた通常のサンドイッ
チ法を行った場合、下部抗体がＨＤと結合すると、上部
抗体はアルブミンによる立体障害の故にＨＤ抗原と結合
することができない。従って、タンパク質のような担体
物質に付着した抗原を従来のサンドイッチ法により測定
することはできない。また、抗原に２個の抗体が結合す
ることができないので、ラテックス凝集法や免疫比濁法
による免疫測定も行うことができない。DISCLOSURE OF THE INVENTION As a result of earnest research, the present inventors have found that HD antigen exists in urine, but it exists in the presence of albumin in urine. As described above, since the HD antigen exists in the urine in a state of being attached to albumin, when the ordinary sandwich method using anti-HD antibody is performed, when the lower antibody binds to HD, the upper antibody causes steric hindrance by albumin. Therefore, it cannot bind to the HD antigen. Therefore, antigens attached to carrier substances such as proteins cannot be measured by conventional sandwich methods. In addition, since two antibodies cannot bind to the antigen, it is not possible to perform an immunoassay by the latex agglutination method or the immunoturbidimetric method.

【０００４】従って、本発明の目的は、液中に存在する
タンパク質のような担体物質に付着した抗原を測定する
ことができる方法を提供することである。なお、測定す
べき抗原がタンパク質のような担体物質に付着して存在
する場合があるということは本願発明者らが見出した新
知見であるので、上記本発明の目的自身も新規性がある
ものである。It is therefore an object of the present invention to provide a method by which an antigen attached to a carrier substance such as a protein present in a liquid can be measured. The fact that the antigen to be measured may be present in the presence of being attached to a carrier substance such as a protein is a new finding found by the inventors of the present application, and thus the object of the present invention itself is novel. Is.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、担体物質に対する抗体と、前記測定すべき抗
原に対する抗体とを用いた免疫測定により担体物質に付
着した抗原を測定できることを見出し本発明を完成し
た。As a result of earnest research, the inventors of the present invention have found that an antigen attached to a carrier substance can be measured by immunoassay using an antibody against the carrier substance and an antibody against the antigen to be measured. Heading The present invention has been completed.

【０００６】すなわち、本発明は、液中に存在する担体
物質に付着した測定すべき抗原を測定する方法であっ
て、前記担体物質に対する抗体又はその抗原結合性断片
と、前記測定すべき抗原に対する抗体又はその抗原結合
性断片とを用いた免疫測定により前記測定すべき抗原を
測定する、付着性抗原の測定方法を提供する。That is, the present invention is a method for measuring an antigen to be measured attached to a carrier substance existing in a liquid, which comprises an antibody against the carrier substance or an antigen-binding fragment thereof and an antigen to be measured. Provided is a method for measuring an adherent antigen, which comprises measuring the antigen to be measured by immunoassay using an antibody or an antigen-binding fragment thereof.

【０００７】[0007]

【発明の実施の形態】上述のように、本発明の方法で
は、液中に存在する担体物質に付着した抗原を測定す
る。ここで、「液」とは、液体であれば特に限定される
ものではなく、血液や尿のような体液、飲料、食品、医
薬品、化粧品、その他各種用途の液体等を挙げることが
でき、また、液体以外のものを溶媒に溶解、分散又は懸
濁したものであってもよい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION As described above, in the method of the present invention, the antigen attached to the carrier substance existing in the liquid is measured. Here, the “liquid” is not particularly limited as long as it is a liquid, and examples thereof include body fluids such as blood and urine, beverages, foods, pharmaceuticals, cosmetics, and liquids for various other uses. Alternatively, a substance other than a liquid may be dissolved, dispersed or suspended in a solvent.

【０００８】本発明において、「担体物質」とは、測定
すべき抗原が付着する物質であり、抗原性を有するもの
であればいずれの物質でもよい。例として、タンパク
質、糖、糖タンパク質、糖脂質等を挙げることができ
る。例えば、尿中のＨＤ抗原はアルブミンに付着して存
在するが、この場合にはアルブミンが担体物質である。In the present invention, the "carrier substance" is a substance to which an antigen to be measured adheres, and any substance having an antigenicity may be used. Examples include proteins, sugars, glycoproteins, glycolipids and the like. For example, HD antigen in urine exists in the presence of being attached to albumin, in which case albumin is the carrier substance.

【０００９】また、本発明の方法により測定される抗原
も、上記担体物質に付着するものであればいずれの抗原
であってもよく、糖脂質、タンパク質、糖タンパク質、
糖等のいずれでもよい。下記実施例では、糖脂質である
ガングリオシドの一種であるＨＤ抗原を測定している
が、これに限定されるものではない。The antigen measured by the method of the present invention may be any antigen as long as it is attached to the above-mentioned carrier substance, such as glycolipid, protein, glycoprotein,
Any of sugar and the like may be used. In the following examples, the HD antigen, which is a type of ganglioside, which is a glycolipid, is measured, but the present invention is not limited to this.

【００１０】本発明の方法では、前記担体物質に対する
抗体又はその抗原結合性断片（以下、これらを便宜的に
「抗担体抗体」ということがある）と、前記測定すべき
抗原に対する抗体又はその抗原結合性断片（以下、これ
らを便宜的に「抗測定抗原抗体」ということがある）と
を用いる。ここで、「抗原結合性断片」とは、抗原との
結合性を有する抗体の断片であり、Ｆａｂフラグメント
やＦ（ａｂ’）₂ フラグメント等を挙げることができ
る。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクロー
ナル抗体であってもよい。また、抗体の起源も何ら限定
されるものではなく、ヒト抗体、マウス抗体のような各
種哺乳動物抗体及びニワトリ抗体のような鳥類の抗体で
あってもよく、また、これらの混合物であってもよい。In the method of the present invention, an antibody against the carrier substance or an antigen-binding fragment thereof (hereinafter, these may be referred to as “anti-carrier antibody” for convenience), an antibody against the antigen to be measured or an antigen thereof. A binding fragment (hereinafter, these may be referred to as "anti-measurement antigen antibody" for convenience) is used. Here, the “antigen-binding fragment” is a fragment of an antibody having an antigen-binding property, and examples thereof include Fab fragment and F (ab ′) ₂ fragment. The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Further, the origin of the antibody is not particularly limited, and may be human antibody, various mammalian antibodies such as mouse antibody, and avian antibody such as chicken antibody, or a mixture thereof. Good.

【００１１】また、本明細書において、「測定」とは、
定性的な検出及び定量の両者を包含する。In the present specification, "measurement" means
It includes both qualitative detection and quantification.

【００１２】本発明の方法における免疫測定は、例えば
サンドイッチ法により行うことができる。サンドイッチ
法では、上記抗担体抗体及び抗測定抗原抗体のいずれか
を下部抗体として用い、他方を上部抗体として用いる。
どちらを下部抗体として用いてもよい。サンドイッチ法
では、先ず、例えばマイクロタイタープレートのウェル
のような担体に下部抗体を不動化する。洗浄後、非特異
的吸着を防止するために、例えばカゼイン、ウシ血清ア
ルブミン又はスキムミルクのようなタンパク質でブロッ
キングを行う。洗浄後、検体を加え、抗原抗体反応を行
わせる。洗浄後、上部抗体を加え、抗原抗体反応を行わ
せる。上部抗体を標識しておき、洗浄後、該標識を測定
する。あるいは、上部抗体に対する標識抗体をさらに反
応させて該標識を測定する。標識は、酵素標識（ＥＬＩ
ＳＡ）、放射標識（ＲＩＡ）、蛍光標識（ＦＩＡ）、化
学発光標識、ビオチン標識等のいずれであってもよい。
なお、サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周
知の方法であり、下記実施例にもその１例が詳細に記載
されている。The immunoassay in the method of the present invention can be carried out, for example, by the sandwich method. In the sandwich method, one of the above-mentioned anti-carrier antibody and anti-measurement antigen antibody is used as the lower antibody, and the other is used as the upper antibody.
Either may be used as the lower antibody. In the sandwich method, the lower antibody is first immobilized on a carrier such as a well of a microtiter plate. After washing, blocking is performed with proteins such as casein, bovine serum albumin or skim milk to prevent non-specific adsorption. After washing, a sample is added and an antigen-antibody reaction is performed. After washing, an upper antibody is added and an antigen-antibody reaction is performed. The upper antibody is labeled, and after washing, the label is measured. Alternatively, the labeled antibody is further reacted with the upper antibody to measure the label. The label is an enzyme label (ELI
SA), radiolabel (RIA), fluorescent label (FIA), chemiluminescent label, biotin label and the like.
The sandwich method itself is a well-known method in the field of immunoassay, and one example thereof is described in detail in the examples below.

【００１３】なお、上記の方法において、検量線を作成
する場合には、担体物質と測定すべき抗原との付着複合
体を標準物質として調製する。これは、既知濃度の担体
物質を含む液と既知濃度の測定すべき抗原を含む液とを
混合し、例えば２℃〜８℃で一夜若しくは一昼夜、又は
室温若しくは３０℃〜３７℃で１〜１０時間（好ましく
は１〜２時間）放置することにより調製することができ
る。In the above method, when preparing a calibration curve, an attachment complex of a carrier substance and an antigen to be measured is prepared as a standard substance. For this, a liquid containing a known concentration of a carrier substance and a liquid containing a known concentration of an antigen to be measured are mixed and, for example, at 2 ° C to 8 ° C overnight or overnight, or at room temperature or 30 ° C to 37 ° C 1 to 10 ° C. It can be prepared by leaving it for a time (preferably 1 to 2 hours).

【００１４】従来のサンドイッチ法では、上部抗体及び
下部抗体の両者ともが抗測定抗原抗体であったので、担
体物質のために上部抗体が測定抗原と結合できず、測定
すべき抗原を測定することができなかった。一方、本発
明の方法は、抗測定抗原抗体及び抗担体抗体を下部抗体
及び上部抗体として用いるので、担体物質と測定すべき
抗原から成る付着複合体を確実に挟み込むことができ、
従って、確実に測定すべき抗原を測定することができ
る。In the conventional sandwich method, since both the upper antibody and the lower antibody were anti-measurement antigen antibodies, the upper antibody could not bind to the measurement antigen due to the carrier substance, and therefore the antigen to be measured should be measured. I couldn't. On the other hand, since the method of the present invention uses the anti-measurement antigen antibody and the anti-carrier antibody as the lower antibody and the upper antibody, it is possible to reliably sandwich the adhesion complex consisting of the carrier substance and the antigen to be measured,
Therefore, the antigen to be measured can be reliably measured.

【００１５】免疫測定は、上記サンドイッチ法以外にも
ラテックス凝集法や免疫比濁法により行うこともでき
る。ラテックス凝集法では、ラテックス粒子に上記の抗
担体抗体及び抗測定抗原抗体を不動化したものと検体を
反応させ、凝集を測定する。抗担体抗体及び抗測定抗原
抗体は単一の粒子に不動化することもできるし、別々の
粒子に不動化し、これらを混合して用いることもでき
る。凝集は、目視による判定又は濁度計による濁度測定
により測定することができる。同様に、免疫比濁法で
も、上記抗担体抗体と抗測定抗原抗体とを検体と反応さ
せ、濁度を測定することにより測定すべき抗原を測定す
ることができる。ラテックス凝集法及び免疫比濁法自体
は免疫測定の分野において周知である。The immunoassay can be carried out by the latex agglutination method or the immunoturbidimetric method other than the sandwich method. In the latex agglutination method, latex particles are reacted with a sample obtained by immobilizing the above-mentioned anti-carrier antibody and anti-measurement antigen antibody, and aggregation is measured. The anti-carrier antibody and the anti-measurement antigen antibody may be immobilized on a single particle, or may be immobilized on separate particles, and these may be mixed and used. Aggregation can be measured by visual judgment or turbidity measurement with a turbidimeter. Similarly, in the immunoturbidimetric method, the antigen to be measured can be measured by reacting the anti-carrier antibody and the anti-measurement antigen antibody with a sample and measuring the turbidity. The latex agglutination method and the immunoturbidimetric method itself are well known in the field of immunoassay.

【００１６】[0016]

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。EXAMPLES The present invention will be described more specifically below based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

【００１７】実施例１ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とＨＤ抗原とをそれぞれ
終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように等量混合し（溶媒はリ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、４℃にて一夜放置す
ることにより標準物質を作製し、後述のように検量線の
作成に用いた。一方、抗ＨＤ抗原モノクローナル抗体
（特開平７−５３５９９号、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマは工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４３８５として寄託）を常法に
よりパパイン分解して得たＦａｂフラグメントを１０μ
ｇ／ｍｌの濃度（溶媒：ＰＢＳ）で９６穴マイクロタイ
タープレートに固相化（３０℃、２時間）後、洗浄し、
カゼイン溶液（ブロックエース（商品名）、雪印乳業社
製）の４倍希釈物でブロッキングを行った（４℃、一
夜）。次いで、上記標準物質を１ｍｇ／ｍｌＨＳＡ含有
ＰＢＳで既知濃度に低減希釈したものと、尿検体（健常
人１４例、各種癌患者２４例）をＰＢＳで２倍希釈した
ものをそれぞれ１００μｌずつ、上記のＦａｂ固相化ウ
ェルに加えた。３０℃で２時間反応させた後、洗浄し、
ペルオキシダーゼ標識抗ＨＳＡ抗体（カッペル社製）を
１０μｇ／ｍｌに希釈したものを１００μｌずつウェル
に添加した。３０℃で１．５時間反応させた後、洗浄
し、発色剤（ＡＢＴＳ溶液、タウンズ社製）を添加、発
色後、停止液を加え、４１５ｎｍの吸光度を測定した。 Example 1 Human serum albumin (HSA) and HD antigen were mixed in equal amounts so that the final concentration was 1 mg / ml (the solvent was phosphate buffered saline (PBS)), and overnight at 4 ° C. A standard substance was prepared by allowing it to stand and used for preparing a calibration curve as described below. On the other hand, an anti-HD antigen monoclonal antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 7-53599, a hybridoma producing the monoclonal antibody was deposited as FERM BP-4385 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology) was obtained by decomposing papain by a conventional method. Fab fragment 10μ
Immobilize on a 96-well microtiter plate at a concentration of g / ml (solvent: PBS) (30 ° C., 2 hours), then wash,
Blocking was performed with a 4-fold dilution of a casein solution (Block Ace (trade name), manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) (4 ° C., overnight). Then, 100 μl each of the above-mentioned standard substance reduced and diluted to a known concentration with 1 mg / ml HSA-containing PBS and 100 μl each of 2-fold diluted urine specimens (14 healthy subjects and 24 patients with various cancers) with PBS were prepared. Fab-immobilized wells. After reacting at 30 ° C. for 2 hours, washed,
A peroxidase-labeled anti-HSA antibody (manufactured by Kappel) diluted to 10 μg / ml was added to each well in an amount of 100 μl. After reacting at 30 ° C. for 1.5 hours, washing was performed, a color former (ABTS solution, manufactured by Towns) was added, and after color development, a stop solution was added and the absorbance at 415 nm was measured.

【００１８】得られた検量線を図１に、また、尿検体の
測定値を表１及び図２に示す。図１から明らかなよう
に、抗ＨＤ抗原抗体と抗ＨＳＡ抗体によるＨＤ抗原−Ｈ
ＳＡ複合物の測定は、バックグランドも低く、ＨＤ抗原
の増加に伴い良好な直線性を示す検量線が得られた。ま
た、表１及び図２の測定値から、健常人ではほとんどＨ
Ｄ−ＨＳＡ複合体が見られないのに対し、癌、特に泌尿
器系の癌で高率のＨＤ−ＨＳＡ複合体が尿中に出現して
いることが確認された。The calibration curve obtained is shown in FIG. 1, and the measured values of urine specimens are shown in Table 1 and FIG. As is clear from FIG. 1, HD antigen-H by anti-HD antigen antibody and anti-HSA antibody
The measurement of the SA complex had a low background, and a calibration curve showing good linearity was obtained with an increase in HD antigen. In addition, from the measured values in Table 1 and FIG.
While no D-HSA complex was found, it was confirmed that a high rate of HD-HSA complex appeared in urine in cancer, particularly in urinary system cancer.

【００１９】 [0019]

【００２０】[0020]

【発明の効果】本発明により、測定すべき抗原がタンパ
ク質等の担体物質に付着して存在する場合があるという
新知見が得られ、また、従来の免疫測定法では測定が不
可能であったこのような付着性抗原の測定が本発明によ
り初めて可能になった。従って、本発明は、癌診断等の
診断分野やその他の免疫測定分野において大いに貢献す
るものと期待される。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to obtain new knowledge that an antigen to be measured may be present in the presence of a carrier substance such as a protein, and the conventional immunoassay method cannot measure the antigen. The present invention enables the measurement of such an adherent antigen for the first time. Therefore, the present invention is expected to greatly contribute to the diagnostic field such as cancer diagnosis and other immunoassay fields.

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成８年１月１８日[Submission date] January 18, 1996

【手続補正１】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】図面の簡単な説明[Correction target item name] Brief description of drawings

【補正方法】追加[Correction method] Added

【補正内容】[Correction contents]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明の実施例において得られた検量線を示す
図である。FIG. 1 is a diagram showing a calibration curve obtained in an example of the present invention.

【図２】本発明の実施例において得られた、各種癌患者
の尿検体の測定値を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing measured values of urine specimens of various cancer patients, obtained in an example of the present invention.

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 液中に存在する担体物質に付着した測定
すべき抗原を測定する方法であって、前記担体物質に対
する抗体又はその抗原結合性断片と、前記測定すべき抗
原に対する抗体又はその抗原結合性断片とを用いた免疫
測定により前記測定すべき抗原を測定する、付着性抗原
の測定方法。1. A method for measuring an antigen to be measured attached to a carrier substance existing in a liquid, which comprises an antibody against the carrier substance or an antigen-binding fragment thereof, and an antibody against the antigen to be measured or an antigen thereof. A method for measuring an adherent antigen, which comprises measuring the antigen to be measured by an immunoassay using a binding fragment. 【請求項２】 前記免疫測定は、サンドイッチ法、ラテ
ックス凝集法又は免疫比濁法により行われる請求項１記
載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the immunoassay is performed by a sandwich method, a latex agglutination method or an immunoturbidimetric method. 【請求項３】 前記免疫測定は、前記担体物質に対する
抗体又はその抗原結合性断片を下部抗体又は上部抗体と
して用い、前記測定すべき抗原に対する抗体又はその抗
原結合性断片を上部抗体又は下部抗体として用いるサン
ドイッチ法により行われる請求項２記載の方法。3. In the immunoassay, an antibody against the carrier substance or an antigen-binding fragment thereof is used as a lower antibody or an upper antibody, and an antibody against the antigen to be measured or an antigen-binding fragment is used as an upper antibody or a lower antibody. The method according to claim 2, which is carried out by the sandwich method used. 【請求項４】 前記サンドイッチ法は、ＥＬＩＳＡ法に
より行われる請求項３記載の方法。4. The method according to claim 3, wherein the sandwich method is performed by an ELISA method. 【請求項５】 前記液は体液である請求項１ないし４の
いずれか１項記載の方法。5. The method according to claim 1, wherein the liquid is a body fluid. 【請求項６】 前記体液は尿である請求項５記載の方
法。6. The method of claim 5, wherein the body fluid is urine. 【請求項７】 前記担体物質はタンパク質である請求項
１ないし６のいずれか１項記載の方法。7. The method according to claim 1, wherein the carrier substance is a protein. 【請求項８】 前記タンパク質はアルブミンである請求
項７記載の方法。8. The method of claim 7, wherein the protein is albumin. 【請求項９】 前記測定すべき抗原が糖脂質である請求
項１ないし８のいずれか１項記載の方法。9. The method according to claim 1, wherein the antigen to be measured is a glycolipid. 【請求項１０】 前記測定すべき抗原がガングリオシド
である請求項９記載の方法。10. The method according to claim 9, wherein the antigen to be measured is a ganglioside. 【請求項１１】 前記測定すべき抗原がハンガナッツゥ
−ダイヘル抗原である請求項１０記載の方法。11. The method according to claim 10, wherein the antigen to be measured is Hanganut-Daiher antigen.