【発明の詳細な説明】
被検体の検出
本発明は、唾液サンプル中の被検体、特に抗体または抗原等の特異的な結合分
子の検出方法に関するものである。本発明は、特に、予め貯蔵または凍結されて
いない新鮮な唾液サンプル中の被検体の検出に関するものである。
唾液中の抗体の検出は、様々な病気や症状、特に胃の感染の簡便な診断方法で
ある。哺乳動物、特にヒトの、胃の感染は、共通の粘膜の免疫システムの活性化
を介して、唾液等の粘膜分泌物における免疫応答を刺激する。この応答は、Ｉｇ
Ａ抗体の存在によって通常特徴付けられるが、初期は、血清中の抗体反応に近似
していることが多い。しかしながら、唾液等の分泌物中の免疫応答は、抗原（例
えば、細菌またはウィルス）を身体から排除した後、迅速に消失する。したがっ
て、唾液中の抗体の存在は、現行の感染(current infection)、即ち、同時期の
感染(contemporary infection)を反映する。例えば、細菌による感染の場合には
、唾液中の抗体（以下、「分泌性抗体」と称する）は、胃における等の、細菌の
コロニー形成の現行の状態を反映するため、同時期の感染(contemporary infect
ion)の有用なモニターである。これに対して、血清中の抗体は細菌が身体から排
除された後も一定期間残る。したがって、陽性の血清抗体試験結果は、過去及び
現在の両方で抗原にさらされたことを意味するため、臨床医にとってはあまり有
用ではない。陽性の分泌性抗体試験は細菌による現在または同時期の感染を示す
ものである。
唾液サンプルが使用できることは、他の体液、特に血清サンプルを使用するこ
とに比べて患者にとって非常に好ましい。さらに、唾液サンプ
ルの場合には、血清サンプルの場合のように針を使用する必要性がないので、患
者または臨床医が感染する危険性が非常に低い。
唾液サンプルからの診断方法は既知であり、特に、ＡＵ−Ａ−９０６７６７６
号は唾液等の粘膜分泌物におけるヘリコバクター ピロリ（Helicobacter pylor
i）抗原に特異的なＩｇＧの検出に関するものであり、これにより、哺乳動物に
おける上記微生物による現行の、即ち、同時期の感染を検査する手段が提供され
る。相当する文献としては、ウィット(Witt)ら、フロンティアズ イン ムコサ
ル イムノロジー(Frontiers in Mucosal Immunology)、１巻、頁６９３〜６９
６（１９９１年）がある。
ＷＯ−Ａ−９３２２６８２号は、ヘリコバクター ピロリ（H．pylori）に対
するＩｇＧ抗体を検出するヘリコバクター ピロリ（H．pylori）に関する唾液
を基礎とする試験に関するものである。
市販の唾液を基礎とした試験による欠点の一つとしては、状況によっては、信
頼性がなくなってしまうということである；特に、試験で得られる偽陽性の数が
許容できないくらい高くなり得る。ヘリコバクターピロリ（H．pylori）に対す
る唾液の抗体に関する免疫検定法を開発しようとして行われた実験では、７８人
の被検者が清潔な滅菌容器に唾液の留出液を溜めるよう依頼された。これらのサ
ンプルをヘリコバクターピロリ（H．pylori）に対する抗体の存在に関して試験
したところ、偽陽性の結果の数がかなり多いため、結果が血清試験の結果と良好
に相関しないことが分かった。
唾液を基礎とした試験がほとんどの他のタイプの診断試験と共通して有する他
の欠点としては、結果を得るためには、サンプルを実験室に送付して分析しても
らう必要があるということである。これには数日を要し、細菌による現在の感染
結果を得るという長所の一部を損じる。さら
に、患者は、特にサンプルを渡す時と試験結果を受けとる時との間に症状が消失
してしまうと、試験結果を集めることを忘れてしまう。
したがって、数分で信頼性のある結果が出る唾液サンプルにおける被検体の検
出用試験キットは、試験を一般的な医療従事者との対診中に行えるので、非常に
有用である。このようなキットは、患者が確実に結果を集められ、必要であれば
処置を受けられるというさらなる長所がある。しかしながら、唾液を基礎とした
試験に存在する偽陽性の結果の問題は、唾液サンプルを収集してから数分以内に
分析すると、新鮮な唾液サンプルについて行った検定からの結果が従来ほとんど
完全に無意味になってしまうくらい非常に増大する。
特に新鮮な唾液サンプルでは、サンプル中に試験試薬に非特異的に結合しこれ
により偽陽性結果を生じる物質が存在するため、このように信頼性がなくなると
考えられる。非特異的な結合を抑制する物質をサンプルに添加することは当然可
能であるが、これはまた、このような物質の多くは真に陽性の結果が偽陽性の結
果と共に排除されてしまうくらい特異的な結合をも抑制してしまうので、問題で
ある。本発明は、上記問題を解決し、真の陽性結果は残したまま偽陽性結果を排
除することを可能にするものである。
本発明の第一の概念においては、唾液サンプルを被検体と特異的な結合複合体
(specific binding complex)を形成できる特異的な結合物質と接触させて、特異
的な結合複合体の存在を検出することからなる、唾液サンプル中の被検体の存在
を検出する方法において、この唾液サンプルを初めにパルミチン酸および／また
はステアリン酸のポリオキシエチレンソルビタン誘導体からなる溶液と接触させ
ることを特徴とする方法を提供するものである。
試験結果が非侵襲的な方法によって迅速にかつ確かに得られ、加えて、
新鮮な唾液を用いる際に生じる問題を解決し、「その場の(on the spot)」試験
から信頼性のある結果を得ることができることが本発明の方法の特長である。本
発明の明細書中、「新鮮な唾液」という表現は、約３０分間以内、好ましくは１
０分以内で、多くの場合上記した時間より短い時間貯蔵された唾液を意味するも
のである。
界面活性剤を非常に慎重に選択することは必須であり、本発明の驚くべき態様
の一つとしては、広範な市販の界面活性剤のうち、信頼性のある結果が確実に得
られるものは上記で定義したもののみであるという点である。適当な界面活性剤
は、トゥイーン４０(TWEEN 40)、トゥイーン６０(TWEEN 60)、トゥイーン６１(T
WEEN 61)、トゥイーン６５（TWEEN 65)及びトゥイーン８０(TWEEN 80)の商標で
市販されている。
界面活性剤が４０〜６５％のステアリン酸誘導体を含むことが特に好ましく、
約５５％のステリン酸誘導体を含み残りはパルミチン酸誘導体であるトゥイーン
６０(TWEEN 60)が特に好ましく、ほとんどの他の界面活性剤よりもかなり信頼性
の高い結果が得られる。
界面活性剤の存在量は、固体の基材を下記のようにして用いる際には、基材中
を通るサンプルの流れを最大限するような量が選択されることが好ましい。流れ
は、界面活性剤が０．１〜１容量％、特に約０．５容量％存在する際に、一般的
に最大になる。このような量の界面活性剤により、特異的な結合、即ち、本発明
の方法を用いて得られる検出の閾値には大きな影響を与えずに非特異的な結合を
排除して最良の結果が得られる。
溶液を約６．８〜７．８のｐＨにまで緩衝化する(buffer)際に最良の結果が得
られるが、ｐＨ７．４にまで緩衝化される(buffer)溶液が最適であることが分か
った。溶液のｐＨを好ましい範囲内に維持させられるものであれば、いずれの緩
衝液を使用してもよい。リン酸緩衝液が本発
明において特に好ましい緩衝液であるが、溶液のｐＨを好ましい範囲内にするよ
うに使用できる他の緩衝液の例も当業者には既知である。
ナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩等の水溶性の塩を緩衝溶液の調製
に使用してもよいが、ナトリウム塩がしばしば最良の結果を出す。効果的な緩衝
作用(buffering)は０．００１〜０．５Ｍ、好ましくは約０．０２Ｍのリン酸ナ
トリウム溶液を用いて得られることが分かった。
他の物質が、試験試薬への試験サンプル中のムチンや他の粒状材料の非特異的
な結合を最小限にするために溶液中存在していてもよい。このような物質として
は、塩化ナトリウム等の無機塩及びウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパ
ク質が挙げられる。
塩化ナトリウムは約０．１〜０．２Ｍの濃度で存在する。特異的な結合を損な
いやすいので、０．２Ｍの濃度の上限は超えないことが非常に好ましい。特に好
ましくは、溶液中に存在する塩化ナトリウムの濃度は約０．１２５Ｍである。
存在する際のＢＳＡは約０．０５重量％〜０．５重量％、好ましくは０．１重
量％の量で含まれる。
被検体は、特異的な結合物質と反応して特異的な結合複合体を形成できる特異
的な結合分子であってもよい。特異的な結合複合体の例としては、抗体−抗原複
合体が挙げられ、すなわち、被検体は抗体または抗原のいずれかであってもよい
。
被検体が抗体である場合には、いずれのイソタイプであってもよく、病原体に
対する抗体であってもよい。唾液サンプルの分析は、ヘリコバクター ピロリ（
Helicobacter pylori）（以前はカンピロバクター ピロリ（Campylobacter pyl
ori）として既知である）等の病原体によって引き起こされる胃の感染の診断に
特に有用である。上述したように、ヘ
リコバクター ピロリ（H．pylori）の感染は唾液中のＩｇＧの存在によって示
されるため、試験の目的がヘリコバクター ピロリ（H．pylori）の感染を検出
することであれば、被検体はヘリコバクター ピロリ（H.pylori）抗原に特異的
なＩｇＧであってもよい。
「抗原」という表現は最も広範な意味で使用され、全病原体細胞または病原体
からの均質な、均質に近い若しくは異質の抽出物を含むものであり、この際すべ
てが唾液中の特異的な抗体に結合できる。
特異的な結合物質が抗原である際には、この物質はタンパク質、多糖若しくは
脂質またはこれらの組み合わせである。抗原である際の好ましい特異的な結合物
質としては、例えば、超音波処理、圧力砕解(pressure disintegration)、デタ
ージェント抽出(detergent extraction)若しくは分画によって調製された病原体
のタンパク質、リポ多糖または細胞抽出物が挙げられる。
本発明の方法を用いてヘリコバクター ピロリ（H．pylori）による感染を検
出する際には、特異的な結合物質はヘリコバクター ピロリ（H.pylori）由来の
抗原であってもよい。本発明の方法において特異的な結合物質として好ましく使
用されるヘリコバクター ピロリ（H．pylori）由来の抗原はＷ−Ａ−９３２２
６８２号に開示されている。しかしながら、いずれのヘリコバクター ピロリ（
H．pylori）由来の抗原を特異的な結合物質として使用してもよい。
特異的な結合物質は、簡便にかつ好ましく固体支持体に結合する。適当な固体
支持体としては、ニトロセルロース膜、ガラスまたはポリマーの固体支持体が挙
げられる。上記を目的として最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、
ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロ
ピレンであるが、本発明はこれらに限定されない。固体支持体は、ストリップ、
チューブ、ビーズ、ディス
ク若しくはマイクロプレート、または免疫検定を行うのに適した他の表面の形態
を有している。
特に有用な固体支持体は、サンプルを固体支持体上に添加すると、被検体はニ
トロセルロース膜の上面に特異的な結合物質によって固定化されるがサンプルの
残りは膜を通過して吸収パッドに吸収されるように、吸収パッドによって裏打ち
されたニトロセルロース膜からなるものである。これにより、不必要な材料は特
異的な結合複合体が検出される領域から除去される。
ニトロセルロース膜は、約０．５〜８μｍ、好ましくは約１〜２μｍの孔径(p
ore size)を有する。
パッドは、いずれの吸収材料から形成されてもよいが、吸収紙が、通常、コス
トを考慮すると、好ましい材料であることが多い。
本発明において使用できる特異的な結合分子は固体支持体に共有結合してもま
たは非共有（「受動的に」）結合してもよい。適当な結合プロセスは当該分野に
おいて既知であり、通常、固体支持体に抗原を架橋、共有結合、または物理的に
吸着することから構成される。
被検体の存在は、被検体と特異的な結合物質との複合体の形成を検出すること
によって本発明の手段によって診断される。したがって、検出手段の形態によっ
ては、特異的な結合複合体の存在（または、必要であれば、量）を同定すること
が必要である場合がある。
検出手段は、リポーター分子(reporter molecule)と複合し、特異的な結合複
合体に特異的に結合可能な、抗体であってもよい。
抗体を検出しようとする場合には、検出手段は、被検体抗体のイソタイプのす
べての抗体に特異的な標識された第二の抗体からなる。ヒトのヘリコバクター
ピロリ（H．pylori）に関する試験では、被検体抗体はしばしばＩｇＧのイソタ
イプを有し、この場合には第二の抗体は抗ヒト
ＩｇＧである。
「リポーター分子」は、化学的な性質によって、分析により同定可能な特性を
有するまたは抗原が結合した抗体の検出ができる分析により同定可能なシグナル
を提供する分子または一群である。検出は定性的であってもまたは定量的であっ
てもよい。このようなタイプの検定において使用されるリポーター分子は、酵素
、発蛍光団または放射性核種を含有した分子（例えば、放射性同位元素）のいず
れかであってもよい。エンザイムイヌノアッセイの場合には、酵素を、通常グル
タルアルデヒドまたは過ヨウ素酸によって、第二の抗体に複合させる(conjugate
)。しかしながら、容易に認識されるように、当業者に容易に利用できる、広範
な様々な複合技術が存在する。一般的に使用される酵素としては、これらのうち
、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ及びアルカリホスファターゼが挙げられる。特異的な酵素と共に使用される
発色団は、通常、対応する酵素による加水分解の際に、検出可能な色の変化を生
成するようなものが選択される。発色団は、目的とする用途によって、可溶性で
あっても不溶性であってもよい。例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム(5-bromo-4-chloro-3-indolyl
phosphate/nitroblue tetrazolium)がアルカリホスファターゼ複合体(conjugate
)と共に使用するために好ましい；ペルオキシダーゼ複合体では、１，２−フェ
ニレンジアミン−５−アミノサリチル酸(1,2-phenylenediamine-5-aminosalicyl
ic acid)、３，３，５，５−テトラメチルベンジジン(3,3,5,5-tetramethylbenz
idine)、トリジン(tolidine)またはジアニシジン(dianisidine)が一般的に使用
される。また、上記した発色団ではなく、蛍光産物を産生する、発蛍光団を用い
ることも可能である。発蛍光団の例としては、フルオレセイン及びローダミンが
ある。特定波長の
光による照射によって活性化する際には、蛍光色素で標識された抗体が光エネル
ギーを吸収して、分子の励起状態を誘導した後、一般的に光学顕微鏡で肉眼で検
出可能な特徴的な色の光を放射する。
しかしながら、本発明は、その結果が数分で利用でき対診の間に一般的な従事
者によって行える「インスタント診断(instant diagnosis)」として使用するた
めに特に良好に適用される。このような理由にから、検出方法は可能な限り簡単
であり特殊な設備を必要としないことは非常に好ましい。したがって、本発明に
おいて好ましいリポーター分子は、コロイド金または炭素等の着色試薬、ポリス
チレン若しくはラッテクス粒子である。
このようなタイプのリポーター物質を用いる際には、付着した(attached)色素
物質と結合した(bound)第二の抗体が明瞭に目視できるように、結合しなかった
第二の抗体を除去することが重要である。このようなことは、上記したように吸
収パッドで裏打ちされたニトロセルロース膜上に特異的な結合物質を予め固定す
ることによって達成できる。余分な第二の抗体は膜を通過し、パッド中に吸収さ
れてニトロセルロース膜表面には結合した第二の抗体及び会合した色素物質のみ
が残る。
唾液を基礎とした検定から信頼性のある結果を得る問題をさらに調査すること
によって、偽陽性の結果を生じる可能性のある原因の一つとして、試験試薬に非
特異的に結合して偽陽性の結果を生じるムチンや粒状材料が唾液サンプル中に存
在することが示唆された。したがって、本発明の方法に、特異的な結合複合体の
存在を検出しようとする前にサンプルを濾過する段階を含むことが好ましい。
具体的には、フィルターは、約１〜１５μｍ、好ましくは３〜８μｍの有効孔
径を有する。これは、どのようなタイプのフィルターを用いても達成されるが、
好ましいタイプは、プラスチック材料から作製され約
５〜１０μｍの典型的な実際の孔径を有するフリット(frit)である。このような
タイプのフリット(frit)では、フリットは比較的深く細孔が整列していない(out
of alignment)ので、有効孔径は実際の孔径より小さい。
唾液サンプルからの粒状材料の除去は、特異的な結合物質が結合した基材がコ
ンタミされないようにすることを補助する。このようなことは、基材が膜である
際には、粒状物質が膜の細孔を塞いで結合していないサンプルが膜を通過して試
験表面から除去されることを妨げる、即ち、サンプルに関する流れ時間(flow th
rough time)が増加してしまうため、特に重要である。
濾過段階前に含まれるさらなる段階としては、サンプルを綿または綿毛のパッ
ド等の粗いフィルターに通す一次分離段階がある。これにより、恐らく高分子量
のムコ多糖が除去されることにより、唾液サンプルの粘度が減少する。粘度が減
少したサンプルは、粘性のある唾液サンプルを膜の細孔を通過させることは困難
であり、これによりこのような段階がないと試験にはかなりより長いがかかって
しまうので、特異的な結合分子が膜基材上に固定化される際に有用である。さら
に、このような段階を含まないと、残渣はしばしば試験表面上に残り、これが特
異的な結合反応をまたは検出段階を妨害する。
これらの予備濾過段階は、唾液からムチンや粒状材料を除去するのには完全に
は効果的でないと考えられ、流れ時間(flow through time)が遅く、サンプルを
予め濾過しても多くの偽陽性の結果が得られることが多い。
しかしながら、サンプルを基材表面上に吸着させた後に単に基材表面を拭きと
ることによって本発明の試験で得られる偽陽性の結果の数は減少できることが示
された。最も予期できないことであったが、すべての
混入物が従来試みられていた濾過段階によって除去されると考えられていたが今
回はそうではないと考えられる。
したがって、特異的な結合物質を基材上に吸着させる場合には、本発明の方法
がサンプルを予め基材に添加した後であって特異的な結合複合体を検出しようと
する前に拭きとり(wiping)段階を入れることが好ましい。この拭きとり(wiping)
段階は、サンプルの流れ時間(flow through time)を劇的に減少すると同時に偽
陽性の結果の発生率を抑制する。
拭きとりは手動で行っても、あるいはプロセスを自動化してもよい。通常、吸
収材料を用いて基材を拭きとり、適当な材料の例としては、綿毛及び吸収紙が挙
げられる。
拭きとり段階は、特異的な結合分子に結合しない材料を基材表面から除去する
のに十分激しく行われなければならない。すべての不必要な材料が除去されたこ
とを明瞭にするために、着色剤を基材上のサンプルに添加してもよい。簡便には
、着色剤を界面活性剤溶液中に含ませてもよいが、必ずしもそうでなくともよい
。界面活性剤溶液は約０．００５〜０．０５％（ｗ／ｗ）、好ましくは約０．０
１〜０．０２％（ｗ／ｗ）の粒状着色剤を含んでいてもよいが、他のタイプの着
色剤をより多い量で存在させてもよい。
着色剤は、基材上に残り唾液の検定で生じる偽陽性の多くの問題の原因である
ムチン及び他の混入物に特異的な物質である。しかしながら、ラテックス、アガ
ロース、ポリスチレンまたは他のポリマー等の着色粒状材料を着色剤として使用
することが多くの場合より簡単である。粒子は当然基材の孔径よりは大きいが使
用されるプレフィルターの孔径よりは小さくなければならない。上記したように
、初期の精製段階で使用されるフィルターは３μｍよりも大きい孔径を有するよ
うに選択されるので、約３μｍの直径を有する粒子を用いることが多くの場合好
ましいこ
とが分かった。着色した粒子は、より小さな粒子が基材を通過する際に偽陽性の
問題を生じると考えられるムチン及び粒状不純物と共に基材表面上に残る。
このようにして、着色剤を用いる際に、従事者にとって着色剤を基材表面から
拭きとり、これによりすべての表面崩壊物を基材から予め除去できるようにする
ことは簡単なことである。
偽陽性の結果の排除を補助するさらなる精製法としては、検出試薬と反応でき
るコントロール試薬を基材上に提供することがある。コントロール試薬は特異的
な結合分子とは異なる位置に存在し、検出物質と特異的に結合することが可能で
ある。したがって、例えば、検出試薬が抗ヒトＩｇＧである際には、コントロー
ル試薬がヒトＩｇＧである。コントロール試薬の存在は、その存在が検出されな
い際には明らかにその検出方法が正確に働いていないので、本発明の方法の実行
可能性をモニターする手段である。
したがって、本発明は、唾液サンプルが新鮮でない時でも唾液サンプルを検定
する簡単でかつ効果的な方法を提供するものである。
界面活性剤溶液は、方法に関して上述した界面活性剤のみが検定において偽陽
性の結果を防止するのに有効であることが分かったので、本発明の重要な部分で
ある。
したがって、本発明の第二の概念においては、０．１〜１容量％のパルミチン
酸および／またはステアリン酸のポリオキシエチレンソルビタン誘導体；６．８
〜７．８の値に溶液のｐＨを維持できる緩衝液；および必要であれば、水溶性塩
、ＢＳＡ等のタンパク質及び粒状着色剤からなる、本発明の方法に使用される界
面活性剤溶液を提供するものである。
好ましい緩衝液及び塩、ＢＳＡや着色剤の濃度は、本発明の第一の概念に関連
して上述したのと同様である。
上記方法は、本発明のさらなる概念を形成するキットを用いて行われる。
本発明の上記概念においては、以下よりなるキットを提供するものである：
ｉ． パルミチン酸及びステアリン酸のポリオキシエチレンソルビタン誘導
体からなる溶液；
ｉｉ． 基材上に固定され被検体と特異的な結合複合体を形成することが可能
な特異的な結合物質；および
ｉｉｉ．特異的な結合複合体の存在を検出するための検出試薬。
本発明は、ヘリコバクター ピロリ（H．pylori）に感染した患者の唾液中に
存在するヘリコバクター ピロリ（H．pylori）に対する抗体を検出するのに、
特に有用である。上述したように、ヘリコバクター ピロリ（H．pylori）は、
感染によってＩｇＧのイソタイプの抗体が唾液中に存在するようになる点で一般
的ではない。
したがって、本発明の第四の概念においては、以下よりなる、ヘリコバクター
ピロリ（H．pylori）に特異的なＩｇＧの検出用キットを提供するものである
：
ｉ． パルミチン酸及びステアリン酸のポリオキシエチレンソルビタン誘導
体からなる溶液；
ｉｉ． 基材上に固定されたヘリコバクター ピロリ（H．pylori）由来の抗
原；および
ｉｉｉ．ヒトのＩｇＧに特異的に結合できる標識抗体溶液。
溶液の好ましい成分、および好ましい基材及び検出試薬は、本発明の第一の概
念の方法で記載したのと同様である。
キットは、唾液収集器を有するものであってもよい。サンプルの予備濾過用の
綿または綿毛パッド等の粗いフィルターが含まれていてもよく、
必要であれば、唾液収集器の一部を形成していてもよい。さらに、キットは、サ
ンプルからの粒状材料を除去するためのフィルターを有するものであってもよい
。第一の概念の方法に関して説明したように、フィルターは、約１〜１５μｍ、
好ましくは３〜８μｍの有効孔径を有する。これは、どのようなタイプのフィル
ターを用いても達成されるが、好ましいタイプはプラスチック材料から作製され
約５〜１０μｍの典型的な実際の孔径を有するフリットである。このようなタイ
プのフリットでは、フリットは比較的深く細孔が整列していない(out of alignm
ent)ので、有効孔径は実際の孔径より小さい。
基材表面上に残存可能な着色剤がまた、本発明の方法が上述した拭くとり段階
を有する際には、含まれていてもよい。この着色剤は、ムチン及び粒状不純物を
染色することができる物質であるが、好ましくは、粒子が行われる予備濾過段階
では除去されないが基材の細孔を通過するには大きすぎるように、粒径が選択さ
れたラテックス、アガロース、ポリスチレンまたは他のポリマーの着色粒子から
構成される。
本発明を、下記実施例を参照しながら詳細に説明する。実施例１
界面活性剤溶液の調製
界面活性剤溶液は、室温で混合することによって下記成分から調製された：
０．０２Ｍ リン酸ナトリウム溶液 １００ｍｌ
塩化ナトリウム ０．７３ｇ
ウシの血清アルブミン ０．１ｇ
トゥイーン６０（商標）（TWEEN 60TM） ０．５ｇ
紺青色のラテックス粒子 ０．１ｇ
（直径；０．３μｍ）
紺青色のラテックス粒子はポリマー ラボラトリーズ（Polymer Laboratorles
）（英国）から市販されている。実施例２
ヘリコバクター ピロリ（H．pylori）由来抗原の調製
ヘリコバクター ピロリ（H．pylori）由来の抗原を、ＷＯ−Ａ−９３２２６
８２号の実施例１に記載された方法に従って調製した。要約すると、ヘリコバク
ター ピロリ（H．pylori）の未精製超音波処理物を調製し、分画した。４４０
ｋＤａのタンパク質を除去して、２６５及び３４０ｋＤａのタンパク質を含む混
合物が残した。実施例３
試験装置の調製
１〜５μｌの０．０５％（ｗ／ｗ）の実施例２の抗原溶液を基材上にスポット
して試験領域を形成した。基材は、吸上材料として作用するシュレイシャー ア
ンド シュエル クロマトグラフィー紙 Ｎｏ．３４６９(Schleicher & Schuel
l chromatography paper No．3469)（アンダーマン アンド コーポレイション
(Anderman & Co.)、キンストン アポン テムズ(Kinston upon Thames)、英国
より市販）の基材層(backing layer)上に支持された１．２μｍのサルトリウス
（商標）（SARTORIUSTM）のニトロセルロース膜であった。
１〜５μｌの０．００５％（ｗ／ｗ）の精製された正常ヒトＩｇＧ（シグマ
ケミカル カンパニー リミテッド(Sigma Chemical Company Ltd.)製、プール
、ドーセット(Poole，Dorset)、英国）溶液を試験領域から離れたコントロール
領域の基材上にスポットした。実施例４
検出剤の調製
検出剤(disclosing agent)は、５２０ｎｍ、路長１ｃｍでの吸光度が
０．５吸光単位になるように、トゥイーン２０(TWEEN 20)の商標で市販されてい
る界面活性剤 ０．０５容量％及びＢＳＡ ０．１重量％を含むリン酸緩衝液（
ＰＢＳ）でヤギ抗ヒトＩｇＧ（重及び軽鎖）（バイオセル リサーチ ラボラト
リーズ(Biocell Research Laboratories)製、カーディフ(Cardiff)、英国）と複
合する(conjugate)コロイド金を希釈することによって調製された。実施例５
唾液サンプルの検定
唾液（１ｍｌ）を、オムニサル(OMNISAL)の商標（サリヴァ ダイアグノステ
ィック システムズ(Saliva Diagnostic Systems)製、ヴァンクーヴァー、ワシ
ントン(Vancouver，Washington)、アメリカ）で市販されている収集器を用いて
収集し、サンプルを粗いフィルターとしても作用するパッド中に集めた。次に、
サンプルを含む収集器を実施例１の溶液１．０ｍｌを含むチューブに移した。集
められた唾液を、約５μｍの排除を有するポーレックス ウルトラファイン血清
分離器(Porex Ultrafine serum separator)を用いて瀘過した後、実施例３で調
製された試験装置に添加した。
希釈唾液サンプルをニトロセルロース膜を通してクロマトグラフィー紙の基材
層(backing layer)中に予め流した後、青色ラテックス粒子が基材表面上に単層
を形成した。この層を、青色がなくなるまで、綿毛でしっかりとだがやさしく拭
きとることによって除去した。
さらに、実施例４の検出剤(disclosing agent)０．５ｍｌを試験装置に加えた
。この検出剤をニトロセルロース膜を通して排出させた後、試験を読んだ。
コントロール領域における単一のピンク色のスポットは目視できるが陰性の試
験結果を示すので、試験領域でスポットをおよびコントロール
領域でもスポットを生じる試験は陽性結果を示す。
この試験は、０．８単位（０〜１０までの範囲で）という低いレベルの抗ヘリ
コバクター ピロリ（H．pylori）ＩｇＧを検出することが可能であり、偽陽性
の結果は生じなかった。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Object detection The present invention relates to a method for detecting an analyte in a saliva sample, particularly a specific binding molecule such as an antibody or an antigen. The invention particularly relates to the detection of analytes in fresh saliva samples that have not been previously stored or frozen. Detection of antibodies in saliva is a simple method for diagnosing various diseases and conditions, especially gastric infections. Stomach infections in mammals, especially humans, stimulate immune responses in mucosal secretions such as saliva through activation of the common mucosal immune system. This response is usually characterized by the presence of IgA antibodies, but often early on closely approximates the antibody response in serum. However, the immune response in secretions such as saliva disappears rapidly after elimination of the antigen (eg, bacteria or virus) from the body. Therefore, the presence of antibodies in saliva reflects the current infection, ie, a contemporary infection. For example, in the case of infection with bacteria, the antibody in saliva (hereinafter referred to as "secretory antibody") reflects the current state of bacterial colonization, such as in the stomach, so that infection at the same time ( It is a useful monitor for contemporary infect ion). In contrast, serum antibodies remain for a period of time after the bacteria are cleared from the body. Therefore, a positive serum antibody test result is less useful to the clinician as it implies exposure to the antigen both past and present. A positive secretory antibody test indicates current or contemporaneous infection with bacteria. The availability of saliva samples is highly preferred for patients compared to using other body fluids, especially serum samples. Furthermore, in the case of saliva samples, the risk of infection of the patient or clinician is very low, as there is no need to use needles as in the case of serum samples. Diagnostic methods from saliva samples are known, and in particular, AU-A-9607676 relates to the detection of IgG specific to the Helicobacter pylori antigen in mucosal secretions such as saliva. Means are provided for testing current, i.e., contemporaneous infections by the above microorganisms in mammals. Corresponding literature is Witt et al., Frontiers in Mucosal Immunology, Vol. 1, pages 693-696 (1991). WO-A-9322682 relates to a saliva-based test for Helicobacter pylori (H. pylori) that detects IgG antibodies against Helicobacter pylori (H. pylori). One of the drawbacks of commercial saliva-based tests is that they can be unreliable in some circumstances; in particular, the number of false positives obtained in a test can be unacceptably high. In an experiment conducted in an attempt to develop an immunoassay for saliva antibodies against H. pylori, 78 subjects were asked to collect saliva distillates in clean sterile containers. These samples were tested for the presence of antibodies to H. pylori and found that the results did not correlate well with the serum test results due to the large number of false positive results. Another drawback that saliva-based tests have in common with most other types of diagnostic tests is that samples must be sent to the laboratory for analysis in order to obtain results. Is. This can take days and diminishes some of the advantages of getting current bacterial infection results. Furthermore, patients forget to collect test results, especially if the symptoms disappear between the time the sample is given and the test results are received. Therefore, a test kit for detecting an analyte in a saliva sample that gives reliable results in a few minutes is very useful because the test can be performed during consultation with general medical personnel. Such a kit has the further advantage of ensuring that the patient will be able to collect results and receive treatment if necessary. However, the problem with false-positive results present in saliva-based tests is that when saliva samples are collected and analyzed within minutes, the results from assays performed on fresh saliva samples have traditionally yielded almost no results. It grows so much that it makes sense. Particularly in fresh saliva samples, this may be unreliable due to the presence of substances in the sample that bind non-specifically to the test reagent and thereby give rise to false positive results. It is, of course, possible to add substances to the sample that suppress non-specific binding, but this also means that many of these substances are so specific that truly positive results are excluded along with false positive results. This is a problem because it also suppresses the dynamic coupling. The present invention solves the above problems and enables elimination of false positive results while leaving true positive results. In the first concept of the present invention, a saliva sample is contacted with a specific binding substance capable of forming a specific binding complex with an analyte to detect the presence of the specific binding complex. A method for detecting the presence of an analyte in a saliva sample, which comprises first contacting the saliva sample with a solution of a polyoxyethylene sorbitan derivative of palmitic acid and / or stearic acid. Is provided. Test results are obtained quickly and reliably by non-invasive methods, in addition to solving the problems encountered with fresh saliva and providing reliable results from "on the spot" tests. It is an advantage of the method of the present invention. In the context of the present invention, the expression "fresh saliva" means saliva stored within about 30 minutes, preferably within 10 minutes, often shorter than the times mentioned above. Very careful choice of surfactant is essential, and one of the surprising aspects of the present invention is that among the wide range of commercially available surfactants, one that ensures reliable results. It is only the one defined above. Suitable surfactants are commercially available under the trademarks TWEEN 40, TWEEN 60, TWEEN 61, TWEEN 65 and TWEEN 80. It is particularly preferred that the surfactant comprises 40-65% stearic acid derivative, with about 55% steric acid derivative and the balance palmitic acid derivative, TWEEN 60 being particularly preferred and most other interfaces. It gives considerably more reliable results than the active agent. The amount of surfactant present is preferably selected to maximize the flow of sample through the substrate when a solid substrate is used as described below. The flow is generally maximum when the surfactant is present at 0.1-1% by volume, especially about 0.5% by volume. Such an amount of detergent eliminates non-specific binding without significantly affecting the specific binding, ie, the threshold of detection obtained using the method of the invention, for best results. can get. Best results are obtained when the solution is buffered to a pH of about 6.8 to 7.8, but a solution buffered to a pH of 7.4 has been found to be optimal. It was Any buffer may be used as long as it can maintain the pH of the solution within the preferred range. Phosphate buffer is a particularly preferred buffer in the present invention, but examples of other buffers that can be used to bring the pH of the solution into the preferred range are also known to those skilled in the art. Water soluble salts such as sodium, potassium or ammonium salts may be used in preparing the buffer solution, although sodium salts often give the best results. It has been found that effective buffering is obtained using 0.001 to 0.5M, preferably about 0.02M sodium phosphate solution. Other substances may be present in solution to minimize non-specific binding of mucin or other particulate material in the test sample to the test reagent. Such substances include inorganic salts such as sodium chloride and proteins such as bovine serum albumin (BSA). Sodium chloride is present at a concentration of about 0.1-0.2M. It is highly preferred that the upper limit of the concentration of 0.2 M is not exceeded, as it is likely to impair specific binding. Particularly preferably, the concentration of sodium chloride present in the solution is about 0.125M. BSA, when present, is included in an amount of about 0.05% to 0.5% by weight, preferably 0.1% by weight. The analyte may be a specific binding molecule capable of reacting with a specific binding substance to form a specific binding complex. Examples of specific binding complexes include antibody-antigen complexes, i.e. the analyte may be either an antibody or an antigen. When the subject is an antibody, it may be any isotype and may be an antibody against a pathogen. Analysis of saliva samples is particularly useful in diagnosing gastric infections caused by pathogens such as Helicobacter pylori (formerly known as Campylobacter pylori). As mentioned above, infection of Helicobacter pylori (H. pylori) is indicated by the presence of IgG in saliva, so if the purpose of the test is to detect infection of Helicobacter pylori (H. pylori), It may be IgG specific to the Helicobacter pylori (H. pylori) antigen. The expression "antigen" is used in its broadest sense and includes homogeneous, near-homogeneous or heterogeneous extracts from whole pathogen cells or pathogens, all of which are specific antibodies in saliva. Can be combined. When the specific binding substance is an antigen, this substance is a protein, a polysaccharide or a lipid or a combination thereof. The preferred specific binding substance when it is an antigen, for example, sonication, pressure disintegration, pathogen proteins prepared by detergent extraction or fractionation, lipopolysaccharides or cells An extract is mentioned. When detecting infection by Helicobacter pylori (H. pylori) using the method of the present invention, the specific binding substance may be an antigen derived from Helicobacter pylori (H. pylori). An antigen derived from Helicobacter pylori which is preferably used as a specific binding substance in the method of the present invention is disclosed in W-A-9322682. However, any Helicobacter pylori-derived antigen may be used as the specific binding substance. The specific binding substance is conveniently and preferably bound to the solid support. Suitable solid supports include nitrocellulose membranes, glass or polymeric solid supports. The most commonly used polymers for the above purposes are cellulose, polyacrylamide, nylon, polystyrene, polyvinyl chloride or polypropylene, but the invention is not limited thereto. Solid supports have the form of strips, tubes, beads, discs or microplates, or other surfaces suitable for performing immunoassays. A particularly useful solid support is that when the sample is loaded onto the solid support, the analyte is immobilized on the upper surface of the nitrocellulose membrane by a specific binding substance, while the rest of the sample passes through the membrane to the absorption pad. It consists of a nitrocellulose membrane lined with an absorbent pad for absorption. This removes unwanted material from the areas where specific binding complexes are detected. The nitrocellulose membrane has a pore size of about 0.5-8 μm, preferably about 1-2 μm. The pad may be formed of any absorbent material, although absorbent paper is often the preferred material, usually for cost considerations. Specific binding molecules that can be used in the present invention may be covalently or non-covalently (“passively”) bound to a solid support. Suitable attachment processes are known in the art and usually consist of cross-linking, covalently attaching or physically adsorbing the antigen to a solid support. The presence of the analyte is diagnosed by the means of the invention by detecting the formation of a complex between the analyte and the specific binding substance. Therefore, depending on the form of the detection means, it may be necessary to identify the presence (or amount, if necessary) of the specific binding complex. The detection means may be an antibody which is capable of complexing with a reporter molecule and specifically binding to a specific binding complex. If an antibody is to be detected, the detection means consists of a labeled second antibody specific for all antibodies of the analyte antibody isotype. In tests with human H. pylori, the analyte antibody often has an IgG isotype, in which case the second antibody is anti-human IgG. A "reporter molecule" is a molecule or group of molecules that, by their chemical nature, provide an analytically identifiable signal that has analytically identifiable properties or that allows the detection of antigen-bound antibodies. Detection may be qualitative or quantitative. Reporter molecules used in these types of assays may be either enzymes, fluorophores or radionuclide containing molecules (eg radioisotopes). In the case of the Enzyme Inuno Assay, the enzyme is conjugated to the second antibody, usually with glutaraldehyde or periodate. However, as will be readily appreciated, there are a wide variety of composite technologies readily available to one of ordinary skill in the art. Among the commonly used enzymes, among these are horseradish peroxidase, glucose oxidase, β-galactosidase and alkaline phosphatase. Chromophores used with specific enzymes are usually selected such that they produce a detectable color change upon hydrolysis by the corresponding enzyme. The chromophore may be soluble or insoluble depending on the intended use. For example, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate / nitroblue tetrazolium is preferred for use with the alkaline phosphatase complex. In the peroxidase complex, 1,2-phenylenediamine-5-aminosalicylic acid, 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (3,3,5,5) -Tetramethylbenzidine, tolidine or dianisidine are commonly used. It is also possible to use a fluorophore that produces a fluorescent product instead of the chromophore described above. Examples of fluorophores are fluorescein and rhodamine. When activated by irradiation with light of a specific wavelength, a fluorescent dye-labeled antibody absorbs light energy and induces the excited state of the molecule, which is generally a feature that can be visually detected with an optical microscope. Emits light of a specific color. However, the present invention is particularly well adapted for use as an "instant diagnosis", the results of which are available in minutes and which can be done by a general practitioner during the consultation. For this reason, it is highly preferred that the detection method is as simple as possible and requires no special equipment. Therefore, preferred reporter molecules in the present invention are coloring reagents such as colloidal gold or carbon, polystyrene or latex particles. When using such a type of reporter substance, remove the unbound second antibody so that the bound second antibody bound to the attached dye substance is clearly visible. is important. This can be accomplished by pre-immobilizing a specific binding substance on the nitrocellulose membrane lined with an absorbent pad as described above. Excess second antibody passes through the membrane and is absorbed into the pad leaving only the bound second antibody and associated dye material on the surface of the nitrocellulose membrane. Further investigation of the problem of obtaining reliable results from saliva-based assays has shown that one of the possible causes of false positive results is non-specific binding to test reagents and false positive results. It was suggested that mucins and particulate materials that give rise to the above results were present in saliva samples. Therefore, it is preferred that the method of the invention comprises the step of filtering the sample before attempting to detect the presence of the specific binding complex. Specifically, the filter has an effective pore size of about 1-15 μm, preferably 3-8 μm. This is accomplished with any type of filter, but the preferred type is a frit made of plastic material and having a typical actual pore size of about 5-10 μm. With this type of frit, the frit is relatively deep and out of alignment, so the effective pore size is smaller than the actual pore size. Removal of particulate material from the saliva sample helps to prevent contamination of the substrate with specific binding substances. This prevents the particulate matter from blocking the pores of the membrane and leaving unbound sample removed from the test surface through the membrane when the substrate is a membrane, i.e. This is especially important because it increases the flow th rough time. An additional step included prior to the filtration step is a primary separation step in which the sample is passed through a coarse filter such as a cotton or fluff pad. This will reduce the viscosity of the saliva sample, possibly by removing high molecular weight mucopolysaccharides. Samples of reduced viscosity make it more difficult to pass a viscous saliva sample through the pores of the membrane, which would make the test much longer without such steps, and It is useful when the binding molecule is immobilized on the membrane substrate. Furthermore, without such steps, residues often remain on the test surface, which interferes with the specific binding reaction or the detection step. These pre-filtration steps are not considered to be completely effective in removing mucin and particulate material from saliva, have a slow flow through time, and pre-filtering the sample often results in many false positives. Is often obtained. However, it was shown that the number of false positive results obtained in the test of the invention can be reduced by simply wiping the substrate surface after adsorbing the sample onto the substrate surface. Most unexpectedly, all contaminants were thought to have been removed by previously attempted filtration steps, but this time they are not. Therefore, when adsorbing a specific binding substance on a substrate, the method of the present invention wipes after the sample has been previously added to the substrate and before attempting to detect the specific binding complex. It is preferable to include a (wiping) step. This wiping step dramatically reduces the sample flow through time while at the same time suppressing the incidence of false positive results. Wiping may be done manually or the process may be automated. Absorbent materials are typically used to wipe the substrate and examples of suitable materials include fluff and absorbent paper. The wiping step must be performed vigorously enough to remove material from the substrate surface that does not bind to the specific binding molecule. A colorant may be added to the sample on the substrate to clarify that all unwanted material has been removed. For convenience, the colorant may be included in the surfactant solution, but this is not always necessary. The surfactant solution may contain about 0.005 to 0.05% (w / w), preferably about 0.01 to 0.02% (w / w) of a particulate colorant, but otherwise. Higher amounts of these types of colorants may be present. Colorants are substances specific to mucins and other contaminants that are responsible for many of the problems of false positives that occur in saliva assays that remain on the substrate. However, it is often easier to use colored particulate materials such as latex, agarose, polystyrene or other polymers as colorants. The particles must of course be larger than the pore size of the substrate but smaller than the pore size of the prefilter used. As mentioned above, it has been found that it is often preferable to use particles having a diameter of about 3 μm, since the filters used in the initial purification step are chosen to have a pore size of greater than 3 μm. The colored particles remain on the substrate surface with mucins and particulate impurities that are believed to cause false positive problems as smaller particles pass through the substrate. In this way, when using the colorant, it is easy for the practitioner to wipe the colorant off the surface of the substrate, thereby allowing any surface disintegration to be pre-removed from the substrate. A further purification method that helps eliminate false positive results is to provide a control reagent on the substrate that can react with the detection reagent. The control reagent is present at a position different from that of the specific binding molecule and can specifically bind to the detection substance. Thus, for example, when the detection reagent is anti-human IgG, the control reagent is human IgG. The presence of the control reagent is a means of monitoring the feasibility of the method of the invention, since obviously the detection method is not working correctly when its presence is not detected. Accordingly, the present invention provides a simple and effective method of assaying a saliva sample even when the saliva sample is not fresh. Surfactant solutions are an important part of the present invention as only the detergents described above with respect to the method have been found to be effective in preventing false positive results in the assay. Therefore, according to the second concept of the present invention, the pH of the solution can be maintained at a value of 6.8 to 7.8, from 0.1 to 1% by volume of a polyoxyethylene sorbitan derivative of palmitic acid and / or stearic acid. A buffer solution and, if necessary, a water-soluble salt, a protein such as BSA, and a granular colorant are used to provide a surfactant solution for use in the method of the present invention. Preferred buffer and salt, BSA and colorant concentrations are similar to those described above in connection with the first concept of the invention. The above method is performed using a kit that forms a further concept of the invention. Within the above concept of the invention there is provided a kit comprising: i. A solution consisting of a polyoxyethylene sorbitan derivative of palmitic acid and stearic acid; ii. A specific binding substance that is immobilized on a substrate and is capable of forming a specific binding complex with an analyte; and iii. A detection reagent for detecting the presence of a specific binding complex. The present invention is particularly useful for detecting an antibody against Helicobacter pylori (H. pylori) present in saliva of a patient infected with Helicobacter pylori (H. pylori). As mentioned above, H. pylori is uncommon in that infection causes antibodies of IgG isotype to be present in saliva. Therefore, in the fourth concept of the present invention, there is provided a kit for detecting IgG specific to H. pylori, which comprises: i. A solution consisting of a polyoxyethylene sorbitan derivative of palmitic acid and stearic acid; ii. An antigen from Helicobacter pylori immobilized on a substrate; and iii. A labeled antibody solution capable of specifically binding to human IgG. The preferred components of the solution, and the preferred substrates and detection reagents are the same as described in the method of the first concept of the invention. The kit may include a saliva collector. Coarse filters such as cotton or fluff pads for pre-filtration of the sample may be included and may, if desired, form part of the saliva collector. In addition, the kit may have a filter for removing particulate material from the sample. As described with respect to the method of the first concept, the filter has an effective pore size of about 1-15 μm, preferably 3-8 μm. This can be achieved with any type of filter, but the preferred type is a frit made of a plastic material and having a typical actual pore size of about 5-10 μm. In these types of frits, the effective pore size is smaller than the actual pore size because the frit is relatively deep out of align. A colorant that can remain on the surface of the substrate may also be included when the method of the invention has the wiping step described above. This colorant is a substance capable of dyeing mucins and particulate impurities, but preferably the particles are such that they are not removed in the pre-filtration step in which they are carried out but are too large to pass through the pores of the substrate. Composed of colored particles of latex, agarose, polystyrene or other polymers of selected diameter. The present invention will be described in detail with reference to the following examples. Example 1 Preparation of Surfactant Solution A surfactant solution was prepared from the following ingredients by mixing at room temperature: 0.02M sodium phosphate solution 100 ml sodium chloride 0.73 g bovine serum albumin 0.1 g Tween 60 ™. (TWEEN 60 TM ) 0.5 g navy blue latex particles 0.1 g (diameter; 0.3 μm) Navy blue latex particles are commercially available from Polymer Laboratorles (UK). Example 2 Preparation of Helicobacter pylori (H. pylori) Derived Antigen Helicobacter pylori (H. pylori) derived antigen was prepared according to the method described in Example 1 of WO-A-9322682. Briefly, a crude sonicate of H. pylori was prepared and fractionated. The 440 kDa protein was removed, leaving a mixture containing the 265 and 340 kDa proteins. Example 3 Preparation of test device 1-5 μl of 0.05% (w / w) of the antigen solution of Example 2 was spotted on the substrate to form a test area. The substrate is Schleischer and Schuell Chromatography Paper No. 3469 (Schleicher & Schuel l chromatography paper No. 3469) (commercially available from Anderman & Co., Kinston upon Thames, UK) supported on a backing layer 1.2 μm Sartorius ™ (SARTORIUS TM ) Nitrocellulose membrane. 1-5 μl of 0.005% (w / w) purified normal human IgG (Sigma Chemical Company Ltd., pool, Dorset, UK) solution from the test area The spots were spotted on the substrate in a remote control area. Example 4 Preparation of Detection Agent The disclosing agent is a surfactant commercially available under the trademark of TWEEN 20 so that the absorbance at 520 nm and the path length of 1 cm is 0.5 absorption unit. Complex with goat anti-human IgG (heavy and light chains) (Biocell Research Laboratories, Cardiff, UK) in phosphate buffer (PBS) containing vol.% And BSA 0.1% by weight. (conjugate) Prepared by diluting colloidal gold. Example 5 Assay of Saliva Samples Saliva (1 ml) was collected on a collector sold by OMNISAL under the trademark (Saliva Diagnostic Systems, Vancouver, Washington, USA). Collected and the sample collected in a pad that also acts as a coarse filter. The collector containing the sample was then transferred to a tube containing 1.0 ml of the solution of Example 1. The collected saliva was filtered using a Porex Ultrafine serum separator with an exclusion of about 5 μm and then added to the test device prepared in Example 3. After pre-flowing the diluted saliva sample through the nitrocellulose membrane into the backing layer of the chromatography paper, blue latex particles formed a monolayer on the substrate surface. This layer was removed by wiping it firmly but gently with a fluff until the blue color disappeared. In addition, 0.5 ml of the disclosing agent of Example 4 was added to the test device. The test was read after draining the detector through a nitrocellulose membrane. A test that produces spots in the test area and also spots in the control area gives a positive result, since a single pink spot in the control area shows a visible but negative test result. This test was able to detect anti-H. Pylori IgG at levels as low as 0.8 units (ranging from 0 to 10) with no false positive results.
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９６年３月８日
【補正内容】
請求の範囲
１．唾液サンプルを被検体と特異的な結合複合体を形成できる特異的な結合物質
と接触させて、特異的な結合複合体の存在を検出することからなる、唾液サンプ
ル中の被検体の存在を検出する方法において、該唾液サンプルを初めにパルミチ
ン酸および／またはステアリン酸のポリオキシエチレンソルビタン誘導体からな
る界面活性剤溶液と接触させることを特徴とする方法。
２．該唾液サンプルは新鮮な唾液からなる、請求の範囲第１項に記載の方法。
３．該界面活性剤はトゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン６１、トゥイ
ーン６５及びトゥイーン８０の商標で市販される、請求の範囲第１項または第２
項に記載の方法。
４．該界面活性剤が０．１容量％〜１容量％の量で存在する、請求の範囲第１〜
３項のいずれかに記載の方法。
５．該界面活性剤溶液が約６．８〜７．８のｐＨにまで緩衝化される、請求の範
囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
６．該被検体が抗体である、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の方法。
７．該被検体がヘリコバクター ピロリ抗原に特異的な抗体である、請求の範囲
第６項に記載の方法。
８．該抗体がＩｇＧイソタイプを有するものである、請求の範囲第７項に記載の
方法。
９．該特異的な結合分子が抗原である、請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載
の方法。
１０．該抗原がヘリコバクター ピロリ由来である、請求の範囲第９項
に記載の方法。
１１．該特異的な結合分子がニトロセルロース膜またはガラス若しくはポリマー
の固体支持体等の固体支持体上に固定されるものである、請求の範囲第１〜１０
項のいずれかに記載の方法。
１２．該固体支持体が吸収パッドによって裏打ちされたニトロセルロース膜から
なる、請求の範囲第１１項に記載の方法。
１３．該特異的な結合複合体が、リポーター分子と複合された抗体を用いて検出
され、該抗体は該特異的な結合複合体に特異的に結合できるものである、請求の
範囲第１〜１２項のいずれかに記載の方法。
１４．該被検体がＩｇＧイソタイプを有するヘリコバクター ピロリに特異的な
抗体であり、該特異的な結合複合体はヒトＩｇＧに特異的に結合できる抗体を用
いて検出される、請求の範囲第１３項に記載の方法。
１５．該リポーター分子が西洋ワサビのペルオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ若しくはアルカリホスファターゼ等の酵素、フルオ
レセイン若しくはローダミン等の発蛍光団、放射性核種含有分子またはコロイド
金等の着色試薬またはポリスチレン粒子である、請求の範囲第１３項または第１
４項に記載の方法。
ヒトＩｇＧである、請求の範囲第２２項に記載の方法。
２４．以下よりなる、ヘリコバクター ピロリに特異的なＩｇＧの検出用キット
：
ｉ． パルミチン酸及びステアリン酸のポリオキシエチレンソルビタン誘導
体からなる溶液；
ｉｉ． 基材上に固定されたヘリコバクター ピロリ由来の抗原；および
ｉｉｉ．ヒトのＩｇＧに特異的に結合できる標識抗体溶液。
２５．該界面活性剤溶液が０．１〜１容量％のパルミチン酸および／またはステ
アリン酸のポリオキシエチレンソルビタン誘導体；６．８〜７．８の値に溶液の
ｐＨを維持できる緩衝液；および必要であれば、水溶性の塩、ＢＳＡ等のタンパ
ク質及び粒状着色剤からなる、請求の範囲第２４項に記載のキット。
２６．該界面活性剤溶液が基材表面上に残ることができる、着色粒子等の、着色
剤からさらになる、請求の範囲第２４項または第２５項に記載のキット。
２７．下記の一つまたはそれ以上をさらに含む、請求の範囲第２４〜２６項のい
ずれかに記載のキット：
唾液収集器；
唾液収集器の一部を形成する綿または綿毛パッド等の粗いフィルター；お
よび
サンプルから粒状材料を除去するためのフィルター。[Procedure of Amendment] Article 184-8 of the Patent Act
[Submission date] March 8, 1996
[Correction contents]
The scope of the claims
1. Specific binding substance capable of forming a specific binding complex of saliva sample with analyte
Saliva sample consisting of contacting with and detecting the presence of a specific binding complex.
In the method for detecting the presence of an analyte in a sample, the saliva sample is first analyzed in palmit
From polyoxyethylene sorbitan derivatives of acid and / or stearic acid
And a method of contacting with a surfactant solution.
2. The method of claim 1, wherein the saliva sample comprises fresh saliva.
3. The surfactants are Tween 40, Tween 60, Tween 61 and Tween.
Claims 1 or 2 as marketed under the trademarks Tawn 65 and Tween 80.
The method described in the section.
4. Claims 1 to 3, in which the surfactant is present in an amount of 0.1% to 1% by volume.
The method according to any one of item 3.
5. Claims wherein the surfactant solution is buffered to a pH of about 6.8-7.8.
The method according to any one of items 1 to 4.
6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the analyte is an antibody.
7. The subject is an antibody specific to the Helicobacter pylori antigen.
The method according to item 6.
8. The method of claim 7, wherein the antibody has an IgG isotype.
Method.
9. 9. The specific binding molecule according to claim 1, wherein the specific binding molecule is an antigen.
the method of.
10. 10. The antigen according to claim 9, which is derived from Helicobacter pylori.
The method described in.
11. The specific binding molecule is a nitrocellulose membrane or glass or polymer
It is fixed on a solid support such as the solid support according to any one of claims 1 to 10.
The method according to any of paragraphs.
12. From a nitrocellulose membrane whose solid support is lined by an absorbent pad
The method according to claim 11, wherein the method comprises:
13. Detection of the specific binding complex using an antibody complexed with a reporter molecule
And the antibody is capable of specifically binding to the specific binding complex.
13. The method according to any of claims 1-12.
14． The analyte is specific to Helicobacter pylori having an IgG isotype
The antibody is an antibody, and the specific binding complex is an antibody that can specifically bind to human IgG.
14. The method of claim 13, wherein the method is detected.
15. The reporter molecule is glucose oxidase, a horseradish peroxidase.
Enzymes such as galactose, β-galactosidase or alkaline phosphatase
Fluorophores such as rescein or rhodamine, radionuclide-containing molecules or colloids
14. A coloring reagent such as gold or polystyrene particles, claim 13 or 1.
The method according to item 4.
The method according to claim 22, which is human IgG.
24. A kit for detecting IgG specific to Helicobacter pylori, comprising:
:
i. Polyoxyethylene sorbitan induction of palmitic acid and stearic acid.
Solution consisting of the body;
ii. An antigen from Helicobacter pylori immobilized on a substrate; and
iii. A labeled antibody solution capable of specifically binding to human IgG.
25. The surfactant solution contains 0.1 to 1% by volume of palmitic acid and / or starch.
Polyoxyethylene sorbitan derivative of formic acid; solution of 6.8-7.8 values
Buffer that can maintain pH; and, if necessary, water-soluble salt, tamper such as BSA
The kit according to claim 24, which comprises a texture and a granular colorant.
26. Coloring, such as colored particles, by which the surfactant solution can remain on the substrate surface.
The kit according to claim 24 or 25, further comprising an agent.
27. 27. A method according to claims 24 to 26, further comprising one or more of the following:
Kit described in the gap:
Saliva collector;
Coarse filters such as cotton or fluff pads that form part of the saliva collector;
And
A filter for removing particulate material from the sample.
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，
ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ
，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ
Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ
，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，
ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 スミス，クリストファー，ジョン
イギリス国，クルウィド エルエル17 ０
ティイー，ルアルト，トレマイルチオン
レーン，イスフリン （番地なし)────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M
C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG
, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN,
TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG),
AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, C
H, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB
, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR,
KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, M
N, MW, MX, NL, NO, NZ, PL, PT, RO
, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM,
TT, UA, UG, US, UZ, VN
(72) Inventors Smith, Christopher, John
Cluwid El El 170, United Kingdom
Thiey, Rualto, Tremay Thion
Lane, Isflin (No street number)