JPH09510711A

JPH09510711A - 組合せライブラリー中の化合物を同定する方法

Info

Publication number: JPH09510711A
Application number: JP7524723A
Authority: JP
Inventors: ベンコビク，ステファン，ジェイ; ウィノグラド，ニコラス; ブルムメル，クリストファー，エル; リー，イレネ，エヌ．，ダブリュー
Original assignee: Penn State Research Foundation
Current assignee: Penn State Research Foundation
Priority date: 1994-03-23
Filing date: 1995-03-23
Publication date: 1997-10-28
Also published as: ATE197156T1; DK0751950T3; ES2151057T3; DE69519225D1; DE69519225T2; EP0751950A1; WO1995025737A1; EP0751950B1; US5834195A

Abstract

(57)【要約】フェムトモルまたはそれより小量の小さなペプチド、オリゴヌクレオチドまたは異項環化合物をポリスチレンビーズ上に共有結合的に結合させたものをグリツド上に置き、イメージング・タイム・オブ・フライト（飛行時間）２次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）を用いてその分子量を決定する方法が記載されている。この決定方法は、ビーズへのペプチド、オリゴヌクレオチドまたは異項環化合物の結合を選択的に切り、次いでこのビーズをグリッド上に載せてＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析を行なうものである。この方法は種々の異なった小分子を結合により有している１０〜１２０ミクロンの大多数のポリスチレンビーズに適用して、大きな組合せライブラリーの直接的な特徴づけを行なうことができるものである。

Description

【発明の詳細な説明】組合せライブラリー中の化合物を同定する方法関連出願に関する情報この出願は共係属している１９９４年３月２３日出願の米国特許出願第０８／２１７，０４６号の一部継続出願である。発明の分野この発明は組合せライブラリー(ＣＯＭＢＩＮＡＴＯＲＩＡＬＬＩＢＲＡＲＩＥＳ)の中の化合物を同定および分析する方法に関し、ここで同定された化合物は証明された薬剤学的もしくは生理学的活性を有するものである。発明の背景ここ十数年の間、薬剤活性、例えば細胞表面受容体、酵素または抗体のような種々の細胞受容体分子の活性増強剤また拮抗物体質のような活性を有する小さい分子の製造および同定が強く望まれている。このような小さい分子はペプチド、オリゴヌクレオチドまたは異項環のような他の有機化合物である場合もある。これら小さい分子の統合された特性は公知の受容体に特異的に結合することによって操作される。このような結合を経ることによって、残る生物学的工程が調節されて生理的な応答が生じ、これが薬や農学の分野に応用されるのである。薬剤として有用なこのような小さな分子を検索するには（１）このような分子の収集(コレクション)を行ない、（２）生理活性によってこのような分子をスクリーニングし、次いで（３）このスクリーニングで陽性の結果を示す分子の構造を同定する、ことが必要である。最初の２つの工程はこの分野で良く知られた方法を用いて行なうことができ、本明細書中にもそのいくつかを記載している。第三の工程は陽性としてスクリーニングされた小さい分子の構造を決める工程であるが、新しい小分子の薬剤を見出す全工程中で時間を制限している（time-limiting）工程である。この工程は真に陽性でないものや複製物を排除するために必要であり、見込みのある薬剤のために選択された小さな分子を製造するために最も重要なものである。このような小分子の検索に当たっては、発酵生産物、植物または動物組織抽出物のような天然物の収集(ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ)または合成分子のライブラリー (ｌｉｂｒａｒｙ)をスクリーニングすることを含んでいる。化学分析では、特定の受容体分子に結合する種類のものだけを同定するように設計し、また生物学的分析では試験分子がある種の生物学的反応を生じさせる能力を測定した。このような収集物のスクリーニングでは、しばしばまたほとんどの場合、より厳密な技術および関連分子のより広いテストによって更に精製しなければならないものを提供する。これらの技術は、どのような小分子も利用できる濃度やスクリーニングや分析技術の解析能力を有さなければならないので、非常に厳しく制限される。その結果、薬学活性を有する小分子の製造および同定の工程はＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ、プロシージンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスーエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８９、５３８１−５３８３（１９９２）による「不合理なドラッグ・デザイン」ということになり、小さな分子の収集物（レパートリー）の創製および選択法の両者において、継続した改良が必要なのである（前出、５３８１頁）。小分子の収集物は、各分子が少なくともフェムトモル（ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ，１０^-15モル）量が必要であり、多重的合成法または平行的な化学合成プロトコルにより通常は製造される。このような収集物は以下に示される理由のために通常「組合せライブラリー（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」と呼ばれる。ペプチドに関してはこのような合成法はＪｕｎｇおよびＢｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３１，６７−３８３（１９９２））に記載されている。異項環ライブラリー（ＢｕｎｉｎａｎｄＥｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，１０９９７−１０９９８（１９９２）参照）および核酸ライブラリー（ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ，前出）の製造法についても文献に記載されている。ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｌｉｂｒａｒｉｅｓの他の構築法としてはＫｅｒｒ等．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１５，２５２９（１９９３）；Ｌａｍ等．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８２（１９９１）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ等．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８４（１９９１）；およびＦｏｄｏｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，７６７−７７３（１９９１）米国特許第５，１４３，８５４号（１９９２）のようなものが挙げられる。上述の方法においてライブラリー中の化合物は、アミノ酸、核酸、または異なった有機モノマーのような化学的構築ブロックと側鎖基とのカップリングによって構築される。得られたライブラリーは異なった個々の種からなり、その可能性のある数（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｎｕｍｂｅｒ）（ｋ）は用いられた異なった構築ブロック数（ａ）およびライブラリーの各メンバーに結合した異なった構築ブロックの数（ｂ）の関数としてｋ＝ａ^bにしたがって計算することができる。例えば、２０個の異なったアミノ酸（即ちこれが化学的構築ブロックである）を用いて構築されたペンタペプチドのライブラリーは２０⁵、即ち３２０万種もの異なった化合物を含むことになる。前出のＬａｍ等の方法は、組合せライブラリー中の理論的に最大数の異種化合物を見出す方法の１つである。このＬａｍ等の方法は***−合成（ｓｐｌｉｔｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）プロトコルを採用しており、この方法では標準的固相ペプチド合成（例えばＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｐａｒｄ，ソリッド・フェーズ・ペプチド・シンセーシス，ア・プラクティカル・アプローチ（ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ）（オックスフォードユニバーシティ出版、１９８９））が樹脂ビーズ上で行なわれる。用いられる各アミノ酸について各々別個に１個のアミノ酸を樹脂ビーズの一定量標本（ａｌｉｑｕｏｔ）に共有結合的に結合させる。例えば２０個の天然タンパク原性アミノ酸の１つに結合する。通常このような反応に用いられるアミノ酸は当分野で知られている適当なブロッキング基を用いて修飾し１つのビーズに対して唯１個のアミノ酸が結合するようにする。第１段の反応後、異なった１個のアミノ酸が結合している樹脂ビーズの一定量標本を組み合わせ、第１回工程を終了させる。ジペプチドを製造する第２ラウンドは、付加された最後のアミノ酸からブロック基を除去することによって始まり、樹脂ビーズの一定量標本をもう１つの２０個の反応容器へと移しそれによって各樹脂ビーズに第２の単一アミノ酸を結合させる。ジペプチドを含有する樹脂ビーズの結合で第２ラウンドを完了する。これらのラウンドを、ペプチドライブラリーが目的とする数の構築ブロック、ここではアミノ酸を得られるまで繰り返す。Ｌａｍ等の文献にしたがって、上記のように処理された各樹脂ビーズは約５０〜２００ピコモルのペプチドを含有し、各ペプチドは各々５個のアミノ酸からなっていると推定される。このライブラリーは次いでペプチドを含有しているこれらビーズに対してスクリーニングすることができる。これらのペプチドは、直接又は間接に蛍光または酵素等、この分野でよく知られている材料および方法を用いて標識した特定の受容体分子により認識される。このように標識されたビーズはマイクロマニピュレーション技術を用いて物理的に単離することができ、その位置、即ち所在が、ライブラリー中の選択されておらず、標識されていないビーズの中で、更に続く分析のために印づけられる。前出のＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒによって提案されている別法は「付加された遺伝子付箋（ａｐｐｅｎｄｅｄｇｅｎｅｔｉｃｔａｇ）」を含むが、これはライブラリー中の各分子種の構造を与えるように翻訳されることになろう；しかしながら、この方法はこの遺伝子の付箋（ｇｅｎｅｔｉｃｔａｇ）を個々の分子種に化学的に付加することを必要とし、これがこの問題となっている受容体分子と相互作用する分子種の能力に影響を与えることになろう。この遺伝子の付箋がこのような障害を生じないとしても、このように付加された分子種も又、多数の非選択種の中で“読まれ”ないといけない。これらの方法は、本質的に、必要とされる分析数が非常に多いという点から、標識マイクロスコーピックビーズを単離する際に（更に後から議論する）、又は異なった分子種がくっついている同一で標識されていないビーズに囲まれているときに、標識されてビーズにくっついている分子種を同定する際に生じる問題点を完全に克服することはできなかった。問題となっているビーズが物理的に単離されることができると仮定すると、そこに含有されるペプチドは例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＭｏｄｅｌ４７７Ａのような市販のペプチドマイクロシークェンサーを使用してアミノ酸の配列を分析することができる。Ｌａｍ等によれば、「数百万のビーズを含有するライブラリーは午後１０−１５ペトリ皿中で（標識した受容体分子で）スクリーニングできた・・・・３個のペンタペプチドビーズをマイクロシークェンサーを用いて毎日配列分析を行なった。」。明らかに、上記技術文献からも理解されるように、組合せライブラリーから新しい薬を同定する方法における限定的な工程は偽りの陽性のものを廃棄し、問題をなっている種を同定する工程であるが、その難しい点は、標識していないビーズから標識したビーズを単離する工程か、または付着している異なった分子種を有する同じビーズに隣接しているときマイクロスコーピックビーズ上の分子種を分析できる十分に認識し得る技術を使用する工程の中に存在する。例えば問題のペプチドを同定する際に、これらの結合性ペプチドの構造を抽出するという時間的に制約のある工程は、天然のアミノ酸を含有するペプチドだけが同定できるという点でも制限がある。この制限は、マイクロシークェンサーの原理であるエドマン分解技術の特徴により生ずるものである。１日に数個のペプチドの配列しか解析できないということに加えて天然の蛋白質性アミノ酸を含有する配列のペプチドだけがその配列を解析できるという制限がある。したがって、いずれの組合せライブラリーの分析の場合にもＬａｍ等のタイプの方法では分析はライブラリー中の化合物が付着しているビーズはその付着している分子が分析される非常に低い速度でしか行なわれない。存在するライブラリー中のスクリーンされるべき分子の数が正に数百万であることを考えると、たとえ数千まではいかなくても少なくとも数百の分子種付着ビーズが陽性反応（偽の陽性反応を含めて）を示し、これらは更なる分析が必要とされるのである。したがって、１日にほんの数個の分子しか配列解析ができないという制限は、薬剤用化合物のための組合せライブラリーのスクリーニングのための現在行なわれている戦略の非常に大きな欠点といえる。その上、目的とする小分子を有する陽性反応を示すビーズの分析を、そのビーズを他のビーズから分離することなくその存在下で行なうことができれば、目的とする小分子をスクリーニングし、同定する方法は非常に改善されるであろう。発明の要旨直接的な質量分析による分析が、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび異項環分子を含有する幅広い組合せライブラリーを読解するのに用い得ることがこのたび見出された。本発明を用いることにより、どのような組合せライブラリーも適当な基質上に構築してスクリーニングすることができ、そして問題の受容体分子（即ち陽性のスクリーニング結果）と特異的に相互反応する分子を有するものとして同定される個々の基質が、他の選択されていない分子種が付いている同じ基質の存在下で同定することができ、そして総ライブラリーから除くことなく直接質量分析に付し、選択された分子の厳密な分子量を測定することができる。この方法の好ましい態様としては、共有結合的に又はイオン結合によって組合せライブラリーの個々の分子を基質に結合させている新しい結合分子もしくは基質を使用する方法が包含され、この際この結合は分子結合を壊すことなく開裂され、しかもこのライブラリー分子を物理効果に基づく基質への強い結合状態で保持するものである。したがって、本発明は組合せライブラリー由来の薬学的活性剤を同定する能力を大幅に改善するものである。即ち、本発明は、（ａ）固体基質と小さい分子とからなる複合体の複数を形成し、このとき各複合体は１つの基質又はその一部および該ライブラリーの小さい分子の１つを含有し；および（ｂ）２次イオン質量分析法により選択された小さい分子の分子量を測定することを包含する、組合せライブラリーの個々の小分子を同定する方法に関する。本発明では小分子と基質に結合させる、好適な結合分子および好適な反応基が付いている基質も開示されている。本発明の上記および他の態様および利点は、以下の本発明の詳細な説明および添付した図面を参照すれば明らかであるが、これらは全て説明するためだけのもので、本発明を限定するものではない。図面の簡単な説明図１はイメージングタイプ−オブ−フライト２次イオン質量分析（ＴＯＦ− ＳＩＭＳ）装置の概要図である。図２は次のような種々の方法によりポリスチレンビーズに結合したフェニルアラニンの３つの関連した質量分析の概要図である。結合方法は、物理吸着によるもの（図２Ａ）；共有結合によるもの（図２Ｂ）；およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いた共有結合の気相切り出し（クリッピング）後の物理吸着によるもの（図２Ｃ）である。図３は物理吸着によってのみポリスチレンビーズに結合し、次いで銅グリッド上に置かれたトリペプチドの概要図である。図４は２つのＴＯＦ−ＳＩＭＳイメージの組合せであり、いずれも銅グリッド上の同じ場所で行なわれたものである。図４Ａおよび図４Ｂは各々フェニルアラニンおよび銅の（Ｍ＋Ｈ）⁺イオン強度を示している。図５は２つのＴＯＦ−ＳＩＭＳイメージの組合せであり、各々銅グリッド上の同じ場所で行なわれたものである。図５Ａおよび図５Ｂは各々ロイシンおよびフェニルアラニンの（Ｍ＋Ｈ）⁺イオン強度を示している。図６は酸性蒸気に不安定な結合を用いてポリスチレンビーズに共有結合的に結合され、次いで酸性蒸気にさらした後、銅グリッド上に置いたトリペプチドの概要図である。ＴＯＦ−ＳＩＭＳプロフィル中で同定されたトリペプチドＶ−Ｙ− Ｖの断片を表示している構造も図６に含まれている。図７はアンジオテンシンII受容体アンタゴニストを種々のポリスチレンビーズに結合させる結合基を示している。図８はアンジオテンシンII受容体アンタゴニストの２つのエレクトロスプレイマススペクトルの組合せである。このデータはＳ．Ａ．Ｃａｒｒ，Ｍ．Ｅ．Ｈｅｍｌｉｎｇ，Ｇ．Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓによる本発明と、Ｊ．Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，ＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍＰｈａｒｍａｃｅｎｔｉｃａｌｓ，ＫｉｎｇｏｆＰｒｕｓｓｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａとを比較するために提供された。図９はアンジオテンシンII受容体アンタゴニストのマトリックス・アシステッド・レーザー・デソープション（ＭＡＬＤＩ）スペクトルの組合せである。このデータはＳ．Ａ．Ｃａｒｒ，Ｍ．Ｅ．Ｈｅｍｌｉｎｇ，Ｇ．Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓによる本発明と、Ｊ．Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，ＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍＰｈａｒｍａｃｅｎｔｉｃａｌｓ，ＫｉｎｇｏｆＰｒｕｓｓｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａとを比較するために提供された。図９Ａは標準のＭＡＬＤＩスペクトルを示し、図９Ｂは原料崩壊後のスペクトルを示す。図１０はＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂気体による開裂後のＳａｓｒｉｎビーズ上のアンジオテンシンII受容体アンタゴニストのＴＯＦ−ＳＩＭＳ質量分析である。図１１はアンジオテンシンII受容体アンタゴニストの２つの像の組合せである。図１１Ａは（Ｍ＋Ｈ）⁺イオン（ｍ／ｚ４５３．２）の像であり、図１１Ｂは断片のイオン（ｍ／ｚ１３５）の像である。好ましい態様の詳細な説明以下に記載する本発明の実施態様は当業者が本発明を実行することを容易にするためのものであって本発明を限定するものでなく、本発明の趣旨または範囲から離れない限り当業者による種々の改変を包含するものである。本発明は組合せライブラリーから薬剤学的に活性な小分子を同定し、特徴づける能力を非常に改善する方法および該方法で用いられる新規な化合物を提供するものである。このようなライブラリーの一員たる化合物はポリスチレンビーズ表面のような適当な基質に結合させて構成するのが好ましい。小分子と基質との間のこのような結合には適当などのような方法を用いてもよく、例えば物理的吸着、共有結合、イオン結合、疏水性相互反応およびファン・デル・ヴァールス力等が挙げられるが、これらに限定されることはない。このような結合は組合せライブラリーを構築する間に共有結合又はイオン性結合により仲介されてなされ、これらの共有結合性又はイオン性結合は結合された小分子の構造を改変あるいは実質的に改変しないような手段を用いて破壊することができ、また該小分子は物理的吸着または他の効力によって基質に結合され続けているものであるが、２次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）装置における崩壊を許容するものである。このようなライブラリーの構築は前述の発明の背景の項に例えばＬａｍ等（前出）の方法を用いたもので記載されている。このようなライブラリーのスクリーニングについても又、発明の背景の項に記載されている。本発明は上記組合せライブラリーに由来する、陽性としてスクリーニングされた小分子の同定に関するものである。同定の際の好ましい方法としては、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは異項環化合物のような小分子が基質、特にビーズ表面から完全な又は実質的に完全な形で脱着されることができるように構築されることを考慮に入れるべきである。例えば各ビーズは特定の分子種をフェムトモル（ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ，１０^-15 モル）量あるいはそれより少ない量しか吸着していないので、非常に感度の高い分析法が必要とされるのである。例えば、一層のフェニルアラニンで覆った標準的４０ミクロン粒子は、サンプリングに使用する約５０ｆｅｍｔｏｍｏｌｅの表面分子しか持たない。本発明は、これら分子種を基質から除去し、直ちにイオン化することによって、該小分子種の分子量を直接測定するものである。この方法は映像化２次イオン質量分析を用いてポリスチレンビーズ表面に吸着された分子の分子量を測定するものであり、この方法としてはマグネティックセクターＳＩＭＳ、四極子（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ）ＳＩＭＳ、フーリエ転換ＳＩＭＳまたはタイム−オブ−フライト（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）ＳＩＭＳ（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）等が挙げられる。上で挙げたＳＩＭＳ分析に実際に使用される方法は当分野でよく知られているものであり、機器も又その操作も適当に変更し得るものである。本発明ではＴＯＦ−ＳＩＭＳを採用することが好ましい。ＴＯＦ−ＳＩＭＳプロトコルで形成される２次イオンの質量の検出は相当するライブラリーの一員の化合物を独特に同定することを可能とする。というのは、このライブラリーの構築法が、全ての分子種およびそのイオン化断片（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法で生成する）に区別された分子量を与えることができるものであるからである。ＴＯＦ−ＳＩＭＳにおいては、初期イオンのパルスビームを試料表面に当てる。照射された初期イオンが、試料の表面における単層に存在する試料の分子を脱着しイオン化する。これらから生成した２次イオンを次いで電場により加速して均一エネルギーとし、一定の距離を通して検出器へと到達させる。一定の距離を通るこれらの均一エネルギー粒子の飛行時間（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）はイオンの電荷に対する質量比（ｍ／ｚ）に直接比例している。イオンの飛行時間のみをその質量を測定するために計測すればよいので、ＴＯＦ−ＳＩＭＳは試料中に存在する全ての質量を高質量解離度で効率的に質量検出範囲の制限なく、平行して与えることができる。実際、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによって、当分野でよく知られているマグネティックセクターフィールドや四極子のような他の検出子を使用するスキャニング質量分析法に比べて、感度において１０⁴〜１０⁶倍の改善がなされる。このようにＴＯＦ−ＳＩＭＳは、組合せライブラリーに集められた広い範囲の分子種を解読するために一般的に用いることができる。このような分析のためのＴＯＦ−ＳＩＭＳの使用に関する考察が文献中で為されている。例えば、Ｗｉｎｏｇｒａｄ，ＩｏｎＢｅａｍｓａｎｄＬａｓｅｒＰｏｓｔｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｆｏｒＭｏｌｅｃｕｌｅ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＩｍａｇｉｎｇ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６５，６２２Ａ−６２９Ａ（１９９３））で考察されているのは、固体表面上の試料を衝撃するエネルギーを有する１次イオンがその衝撃点の５０オングストロームの範囲内に多大な損傷を与えるということである。投射イオンの量を、単位を形成している試料分子数の約１％より少なく保持することが出来なければ、このイオン照射は表面の化学的性質を変えることになる。この１％という照射イオン量は「静的限界（ｓｔａｔｉｃｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）」と呼ばれている。ＴＯＦ−ＳＩＭＳにおいては、照射イオンビームは非常に短いパルスとして試料に向かって発射されるので、この１次イオンの量は上記静的限界より低く保持される。Ｂｅｎｎｉｎｇｈｏｖｅｎら、ｓｕｒｆａｃｅＭＳ：ＰｒｏｂｉｎｇＲｅａｌ−ＷｏｒｌｄＳａｍｐｌｅｓ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６５，６３０Ａ−６３９Ａ（１９９３））において検討されているように、パルスによる照射ビームの使用は非常に広い範囲の数種のオーダーのマグニチュードが高い反復性での多数回のくり返しを積み重ねることによって得られるので、利点がある。Ｗｉｎｏｇｒａｄら、Ｉｎｓｔ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｎｆ．Ｓｅｒ．，１２８，２５９（１９９２）で検討されているように、特別のカチオン化形式を用いることによって又はスパッターされた中性分子のレーザー後イオン化によって感度を増大させることもできる。ＴＯＦ−ＳＩＭＳ技術はまた、この一次イオンビームを１５０ｎｍより小なるスポットサイズに集約することができ、その際試料上に境界を明確にされたピクセル（ｐｉｘｅｌ）を横切ってイオンビームを照射（ｒａｓｔｅｒ）し、各ピクセルのスペクトルを採ることによって、分子の濃度を小空間領域上に図示することができる。ＴＯＦ−ＳＩＭＳ映像化の他の点については、ＣｈａｉｔおよびＳｔａｕｄｉｎｇのＴｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔマススペクトロメーターフォーメジャーメントオブセカンダリーイオンマススペクトラ（Ｉｎｔ．Ｊ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．ＩｏｎＰｈｙｓ．，４０，１８５−１９３，（１９８１））；およびＳｔｅｆｆｅｎｓら、タイム−オブ−フライトマススペクトロメーターフォースタティックＳＩＭＳアプリケーションズ(Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ａ３（３），１３２２（１９８５））において検討されている。ある条件下では、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより得られる情報は組合せライブラリーの全ての化合物を十分に区別し、同定するものではない。例えば、１つのペプチドには種々の異性体がある可能性があり、各々の異性体は、例えばフェニルアラニン−グリシン−ロイシンおよびグリシン−ロイシン−フェニルアラニンの場合のように同一の質量である。このような状況下、ＴＯＦ−ＳＩＭＳはこのライブラリーが公知の構築ブロックのセットで構築されているとすると、選択されたペプチドの配列を決定するために使用することができる。Ｐｏｐｐｅ−Ｓｃｂｐｉｅｍｅｒら、Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ＦｌｉｇｈｔＳｅｃｏｎｄａｒｙＩｏｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｉｎｔ．Ｊ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．ＩｏｎＰｈｙｓ．，１１１，３０１−３１５，（１９９１））による「既知でない」ペプチドの配列決定において検討されているようにＴＯＦ−ＳＩＭＳに付されている親イオンは必ず各々の断片イオンに分解されていき、それらの重量は存在する質量データに基づき比較分析され、選択されたペプチドの構造を決定する。この方法は、ライブラリーの構築により決められるのと同様に、選択された分子種が組合せライブラリーに存在する可能性のあるペプチドの１つであると決められる程度まで有効である。この方法は又ＴＯＦ−ＳＩＭＳのこのような断片を区別する解読力によって制限される（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ質量の精密性はＷｉｎｏｇｒａｄら、前出による±０．０１ａｍｕの水準である）。又は、他の方法で解析すれば同一の質量である分子種を区別するためにアイソトープインデキシングスキームを用いることができる。例えばフェニルアラニン−グリシン−ロイシンおよびグリシン−ロイシン−フェニルアラニンを区別するために、ＳＩＭＳ分析における断片パターンを試験するか、またはその原子質量がＴＯＦ−ＳＩＭＳにおいて１単位だけ増加することによって容易に識別できるアイソトープである¹⁵Ｎを有するロイシンを用いてペプチドの１つを合成することによって行なうことができる。異性体であるロイシンをイソロイシン残基と区別するときはこのような別法が要求される。同様に、当分野で良く知られている方法を用い、ＬおよびＤアミノ酸を区別して用いることができるであろう。特に本発明は、（ａ）固体基質と小分子とからなる複数の複合体を形成し、各複合体は１つの基質またはその一部およびライブラリーの小分子の１つを含有するものであり；および（ｂ）２次イオン質量分析手段により、選ばれた小分子の質量を測定する工程を包含する組合せライブラリーの小分子を同定する方法に関するものである。本発明において好ましく用いられる２次イオン質量分析は前述のように、また後出の実施例にあるようにＴＯＦ−ＳＩＭＳである。このような組合せライブラリーの小分子はアミノ酸、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび異項環化合物からなる少なくとも１つの群から選択される。本発明の方法は天然に存在するか合成のアミノ酸を含有する小分子に適用できる。好ましい組合せライブラリーはペプチドまたは異項環化合物である小分子を有しており、より好ましい組合せライブラリーはペプチドである小分子を有している。適当なペプチドは一番小さいもので約２個のアミノ酸〜大きいもので約３０個のアミノ酸を有するものであり、好ましいのは約２個から約１５個のアミノ酸を有するものであり、最も好ましいのは約２個から約１０個のアミノ酸を有するものである。本発明を用いてスクリーニングし、同定するペプチド中にはいずれのアミノ酸も包含することができ、その中には天然のタンパク原性アミノ酸と蛋白質には天然に存在しないようなアミノ酸との組合せも含まれ、後者の天然に存在しないアミノ酸の例としては例えば公知のアミノ酸の右旋性形態のものが挙げられるが、これに限定されるものではない。適当なオリゴヌクレオチドは２個から約５０個までのヌクレオチドからなるものであり；好ましくは約５個から約３０個までのヌクレオチドからなるものであり；最も好ましくは約５個から約１５個のヌクレオチドからなる。本発明を用いてスクリーニングし、同定するオリゴヌクレオチド中にはいずれのヌクレオチドも包含することができ、その中には天然のデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド、生物的系中で天然には生ずることのないデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれの組合せも包含される。この天然には生じないものの例としては、Ｈ−ホスホネート誘導体Ｎ−ブロック−５′−Ｏ−ＤＭＴ −デオキシヌクレオシド３′−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、Ｎ−ブロック−５′−Ｏ−ＤＭＴ−デオキシヌクレオシド３′−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、Ｎ −ブロック−５′−Ｏ−ＤＭＴ−デオキシヌクレオシド３′−（メチル−Ｎ，Ｎ −ジイソプロピル）ホスホルアミダイト、Ｎ−ブロック−５′−Ｏ−ＤＭＴ−デオキシヌクレオシド３′−（２−クロロフェニル）ホスフェート、Ｎ−ブロック −５′−Ｏ−ＤＭＴ−デオキシヌクレオシド３′−（２−クロロフェニル２−シアノエチル）ホスフェート等が挙げられる。これらはいずれもオリゴヌクレオチド合成に用いられるヌクレオシド誘導体である。適当な異項環化合物は最小のもので１個の４員環から４員もしくはそれ以上の員数の複素環で、それらの環は１から約２０個の炭素鎖で結合され、これら炭素鎖は飽和でも不飽和でもよい。好ましくは、適当な異項環化合物は１個の４員〜７員環で、Ｎ，ＳまたはＯ原子の数を変化させて有する５，６または７員環の変化する組合せでもよいが、これらに限定されることはない。より好ましくは、適当な異項環化合物はベンゾジアゼピンおよびそれらの誘導体（例えば、Ｂｕｎｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，１０９９８（１９９２））、ペニシリン、セファロスポリンおよび葉酸化合物を包含する。最も好ましい異項環化合物はベンゾジアゼピンおよびその誘導体、およびアンジオテンシンII受容体アンタゴニストである。例えば、心臓欠陥の治療およびおそらくは慢性腎疾患の治療のためにも、レニン−アンジオテンシン系をブロックするために開発された１つのアンジオテンシンII受容体アンタゴニスト（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３４，１５１４（１９９１））；Ｋｅｅｎａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３６，１８８０（１９９３））は本発明を用いて他の異項環化合物との混合物中で同定することができる。上記のアンジオテンシンII受容体アンタゴニストはエチル２−（２′−チオフェニルメチル）−３−〔５′−｛（１′−ｐ−カルボキシフェニルメチル）−２′−ｎ−ブチル｝−イミダゾリル〕 −プロペノエートであるが、このものは図７に示されている種々の結合基を介してポリスチレンビーズに共有結合的に結合している。本発明はベンゾジアゼピンや上記アンジオテンシンII受容体アンタゴニストのような化合物の誘導体の同定に適用することができる。アミノ酸、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび異項環化合物を含有する小分子の混合ライブラリーは次のような、当業者にとって周知の標準法によって調製することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチドの５′ −ヒドロキシルを介してペプチドに結合される。このペプチド末端はカルボキシル基を包含するように改変することができる。このカルボキシル基を上記オリゴヌクレオチドの５′−ヒドロキシル基によりエステル化する方法はペプチド−オリゴヌクレオチド種を含有する混合ライブラリーをつくるのに用いられる。Ｂｒｅｎｎｅｒら、（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,5381-5383(1992)）も又、ヌクレオチドおよびペプチドを有する混合ライブラリーの調製法を記載している。異項環化合物およびペプチドを含有する混合ライブラリーは該異項環上に存在する好適な官能基の反応によっても製造することができる。例えば異項環化合物上のカルボキシル基がアミド結合を提供するペプチド上のアミノ基と反応する。組合せライブラリーの小分子は好ましくは基質に対して常法により共有結合的に結合される。小分子と基質との間の好ましい共有結合は、組合せライブラリーの小分子の構造を実質的に変更することのない水準での外部変化に反応して*** できるという特徴を有している。例えばこのような共有結合は、小分子および基質もしくは適当な反応基がくっついている基質の両方に結合する適当な結合基によってつくられる。重要なことは、適当な共有結合は条件によって分解することである。結合基又は基質に結合している反応基が使用されているとき、小分子と基質の間の共有結合はその１またはそれ以上の内部共有結合においてまたは基質もしくは小分子あるいはその両方と形成している結合において壊れ、それによって小分子と基質の間の共有結合のいずれをも分解するのである。小分子の全量の少なくともかなりの割合のものは、共有結合は全くもつていないが、小分子のいくつかあるいはその大部分でさえ共有結合によって結合していることができる。基質への共有結合が分解している小分子は、しかしながらより弱い分子の相互作用により基質と結合したままでいることができ、この弱い相互作用としては物理的吸着、疏水性相互作用およびファン・デル・ワールスカがあるが、これらに限定されるものではない。この結合の分解または共有結合の***を起こすために用いることのできる適当な条件の変化としては、温度、電磁波の照射、音又は酸性度に効果のある水準を包含し、その水準で該ライブラリーの小分子をそのまま完全な状態に保っており、前述のあるいは他の弱い分子の相互作用の或る組合せを介して基質への結合状態に留まっているのである。適当な結合基としては、アルコール、アミノ、カルボキシル、アセタール、チオアセタール、アミノアルキル、アラルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、ニトロ基のオルト位にベンジルハイドロゲンを有するニトロ芳香族基（例えばＯ −ニトロベンジル誘導体）およびベンジルスルホニル誘導体からなる群から選ばれる反応性官能基を含有するものであり；適当な蒸気または光化学的手段により分解可能である。好ましくは、該結合基はヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、アセタール、チオアセタールＣ₁−Ｃ₁₀アルキルアミノ、Ｃ₁−Ｃ₁₀アラルキアミノ、Ｃ₁−Ｃ₁₀ハロアルキルおよびベンジル性水素を有するオルト−ニトロベンジリック基からなる群から選ばれる少なくとも１つの反応性基を有している。適当な結合基の具体例としてはｐ−アルコキシベンジルアルコール（Ｗａｎｇ樹脂において用いられる）、Ｆ−ｍｏｃ−２，４−ジメトキシ−４′ −（カルボキシメチルオキシ）−ベンズヒドリルアミン、Ｆ−ｍｏｃ−４−メトキシ−４′−（ガンマ−カルボキプロピルオキシ）−ベンズヒドリルアミン、４ −ヒドロキシメチル−フェノキシ−酢酸、アミノメチル（ＰＡＭ樹脂で用いられる）、ベンズヒドリルアミン、Ｃｌ−ＣＨ₂−Ｐｈ−（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂に用いられている）、ベンジルアセタール（Ａｃｅｔａｌ樹脂で用いられている）、ベンジルチオアセタール（Ｔｈｉｏａｃｅｔａｌ樹脂で用いられている）および２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール（Ｓａｓｒｉｎ^R樹脂で用いられている）等が挙げられる。好ましい結合基としてはＦ−ｍｏｃ−２，４−ジメトキシ−４′−（カルボキシメチルオキシ）−ベンズヒドリルアミン、Ｆ−ｍｏｃ−４−メトキシ−４′−（ガンマ−カルボキプロピルオキシ）−ベンズヒドリルアミン、ｐ−アルコキシベンジルアルコール、ベンズヒドリルアミン、Ｃｌ−ＣＨ₂−Ｐｈ−、２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール、６−ニトロベラトリルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニルおよびα，α−ジメチル−ジメトキシベンジルオキシカルボニルを包含し、より好ましい結合基は２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコールを包含する。異なったリンカーの化学的性質で、共有結合的に結合している種々の分子イオンシグナルを強化させることは好ましいことである。基質と小分子との間の共有結合は基質に結合している１つまたは複数の反応性基によっても媒介され得る。例えば上述のようにＳａｓｒｉｎ^R（ＢａｃｈｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）として知られているポリスチレン誘導体のビーズは反応性基（２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール）を有し、この基は全てのペプチドに見出されるカルボン酸基に共有結合的に結合する。これら２つの基のカップリングによって形成される共有結合は酸に弱い。Ｓａｓｒｉｎ^Rビーズに共有結合的に結合している小分子をＴＡＦ気体にさらすと、Ｓａｓｒｉｎ^Rビーズと結合しているいくつかの共有結合、それが結合基であるが、破壊され、それによって分子核が壊れていない状態で放出されるのである。適当な有機溶媒中、ＴＡＦが希釈溶液として好ましく用いられる。ＴＡＦの濃度は約０．５〜約２重量％の範囲に保たれるのが好ましく、より好ましくは約０．７５〜約１．５重量％、最も好ましくは約０．９〜約１．１重量％溶液である。このＴＡＦは、例えば有機溶媒中にＴＡＦを溶解する等のポリスチレンビーズを膨潤させるような方法で適用する。好ましい有機溶媒としては１〜３個の炭素原子を有するハロゲン化低級脂肪族炭化水素が挙げられ、その具体例としてはメチレンクロライド、クロロホルム、ジクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン等が挙げられ、メチレンクロライドがより好ましいものである。組合せライブラリーの小分子がそれとと共に合成されたり、それに結合した形で合成される基質はどのようなものも用いられる樹脂、ポリスチレン、Ｓａｓｒｉｎ^R、Ｗａｎｇ樹脂、Ｐａｍ樹脂およびＭｅｒｒｉｆｉｅｄ樹脂あるいはそれらの組合せが具体例として挙げられるが、これらに限定されることはない。これらの樹脂は例えばＢａｃｈｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．から市販されている。本発明で用いられる基質はどのような形状でも良く、例えば球状物、立方体、長方形プリズム、ピラミッド型、円錐、卵形、シートタイプおよびシリンダーがあるが、これらに限定されることはない。例えばこの基体がシートの形で用いられるとき、例えばグラスマイクロスコープスライドの表面に置かれて用いられるようなとき、前出のＦｏｄｏｒらに記載されているように、該シートの決められた部分（ｄｅｆｉｎｅｄｐｏｒｔｉｏｎｓ）が組合せライブラリーの異なった小分子のために割り当てられる。本発明で用いられる基質として好ましいのは９／１０，０００（ｎｉｎｅｔｅｎｔｈｏｕｓａｎｄｔｈ）ｍｍ³ 以下の小さい粒子で、直径が１２０ミクロンの球状であり、その各々が１個の小分子構造に結合している。本発明に用いられる基質としてより好ましいものは約１０ミクロンから約１２０ミクロンの直径を有するビーズまたは球状物である。最も好ましいのは約２０ミクロンから約８０ミクロンの直径を有するビーズまたは球状物である。本発明はまた該結合基に関するものである。この結合基の特徴および例は、個々の小分子を同定する方法に関して述べた部分のものと同じである。次の実施例は本発明は更に説明するためのものであり、これを限定するものではない。実施例１この実施例はポリスチレンビーズ表面に結合した組合せライブラリー構成分子の分子量の同定のためにＴＯＦ−ＳＩＭＳを使用することについて説明するためのものである。ＴＯＦ−ＳＩＭＳは当業界でよく知られている測定機であり、種々の会社から購入し得るものである。したがって、当業者は特定の機械の操作指示に従えばどのようなＴＯＦ−ＳＩＭＳも使用することができる。以下に示すのはＫｒｏｔｏｓＩｎｃ．（Ｒａｍｓｅｙ，ＮＪ）で製造されたＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いた例であり、本発明ではこの機器を用いている。この装置の概略ダイヤグラムを図１に示す。イオンガン１００を使用して１次イオンのビームをつくり、試料の単層で被覆したビーズ１０１に発射する。このイオンガン１００は液体金属タイプ（ＬＭＩＧ）であり、２５ｋｅＶエネルギーを有するＧａ⁺イオン源を提供する。これらのイオンの量は、試料が５００ｐＡ電流の２００，０００パルスにさらされ、１パルスにつき２０ｎｓ持続という静的限界（ｓｔａｔｉｃｌｉｍｉｔ）内に留まるよう制限されている。この暴露は１０⁷Ｇａ⁺イオンを４０μｍ直径（ビーズの直径）の円形領域に集中させることに相当し、これは８×１０¹¹Ｇａ⁺イオン／ｃｍ²に相当する。２０ｎｓ１次イオンパルスはｍ／ｚ１００において１５００までの質量解析を得る。ビームをパルスさせるには、目的とするパルス持続時間の間装置を通してビームを高速で電気的に偏りを与えることにより行なう。このイオンビームは番号１０２の付けられた焦点レンズを通してビーズ１０１の表面上の約１５０ｎｍのスポットサイズにまで集中させる。複数のビーズが単一の銅グリッド上に付けられているので、イオンガンビームはその表面を通って照射され、各ピクセルにおけるスペクトルが採られ、そこの表面成分を決定することが出来る。イオンビームによるビーズ１０１の衝撃がこの表面から２次イオンを放出させる。この投射イオンパルスによるビーズ１０１の表面から放出される２次イオンは加速されて均一なエネルギーとなり、抽出レンズ１０５によって集中される。このレンズは平らな抽出プレートとエンゼル（ｅｎｚｅｌ）レンズとの組合せである。以下に詳しく説明するように、ビーズが結合されている銅グリッド１０６と抽出レンズ１０５との間に一定の電圧が保たれている。好ましくは、グリッド１０６から抽出レンズ１０５までに距離は約３ｍｍである。抽出レンズ１０５を一旦通った後は、均一のエネルギーイオンが番号１１０の直線路に沿って通過させられる。焦点レンズ、好ましくは反射鏡（ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）１２０の形のものを通路の端に設置する。これらの焦点レンズは、Ｃｏｔｔｅｒ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｖｉｓｏｎ．ＭａｓｓＳｐｅｃ．，１８，５１３−５３２（１９８９）に記載されたようにして、２次イオンの角度分布を修正する。この集中させられた２次イオンは次いで、通路１１０および反射鏡（ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）１２０により定められたＴＯＦアナライザーの端に位置するチャンネルプレート（ｃｈａｎｎｅｌｐｌａｔｅ）検出器１３０によって検出される。このＴＯＦアナライザーの長さは約２ｍであることが好ましい。チャンネルプレート検出器１３０はコンピューター１４０に連結され、このコンピューターによってスペクトル分析に必要な計算を行なう。更に図示されていないいくつかの電子機器を用いてこのシステムを同調させ、２次イオンの生成と該イオンのチャンネルプレート検出器１３０への到達との間の時間を正確に測定する。２次イオンを加速して均一のエネルギーとするために、基質１０６と抽出レンズ１０５との間を一定電圧に保つ。この電圧は好ましくは７２００ボルトであり、銅グリッド１０６は＋２．５ｋＶに保ち、抽出レンズは−４．７ｋＶに保たれる（正に荷電された２次イオンのために）。これらのシグナルの極性およびマグニチュードを変化させて、陰性に荷電された種の検出を行なう。この構造に存在する２つの機構が、選択されたビーズの先端におけるより高いシグナルへと導くことができる。このイオンガン１００によってつくられたイオン電流密度が非常に大きいので、衝撃の間に試料の電荷がいくらか生じる。更に、このビーズは３ｍｍの抽出間隙において物理的長さ（図示したものでは４０ミクロンの直径）を有するので、ビーズの長さにわたって１５０Ｖのオーダーでの電圧勾配が生じる可能性がある。この勾配の大きさはビーズのサイズおよび形、Ｇａ⁺イオンの入射角によって影響を受ける。このビーズの荷電を修正（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅ）するために，試料は低エネルギーの電子で周期的に浸漬（ｆｌｏｏｄ）することができ、例えばＧａ⁺イオンの各パルスの間に５０μｓ間５０ｎＡ／ｃｍ²の３０ｅＶの電子の中に浸して、荷電による人為現象を回避することができる。実施例２この実施例は、約１分子層のフェニルアラニンで被覆した４０ミクロンのポリスチレンビーズのＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを示すものである。標準的な４０ミクロンの直径のポリスチレンビーズ（ＢａｃｈｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をフェニルアラニン溶液で処理し、物理的吸着によりアミノ酸の単位でビーズを被覆した。具体的には、ポリスチレンビーズを１０^-4Ｍのフェニルアラニンのメタノール溶液中に浸漬し、数分後に取り出して空気乾燥し、次いで分析を行なうために銅グリッド上に置いた。この測定を行なうために、２５ｋｅＶＧａ⁺の入射イオンの量を調整して、５００ＰＡの電流を２００，０００パルスで１パルスにつき２０ｎｓ（ナノ秒）の持続の条件で試料が照射を受けるようにした。この照射（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）は４０μｍの直径の円形面積中に１０⁷ Ｇａ⁺イオンを集中させること、即ち８×１０¹¹Ｇａ⁺イオン／ｃｍ²に相当する。２０ｎｓの１次イオンパルスでｍ／ｚ１００において１５００までの質量解像度が得られる。１次イオンの量が少ないと、ＢｅｎｎｉｎｇｈｏｖｅｎおよびＳｉｃｈｔｅｒｍａｎ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，５０，１１８０（１９７８））に記載されているように、試料の分解が標的表面の化学的性質を変化させることはない。図２Ａに示されているように、得られたＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルはｍ／ｚ１２０（Ｍ−ＣＯ₂Ｈ）⁺、１６６（Ｍ＋Ｈ）⁺、１８８（Ｍ＋Ｎａ）⁺および２１０（Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ₂）⁺において大きなピークを示している。ポリスチレン自身に特有の他のピーク［m/z 91(C₇H₇).,103,105,115,117,127, 128,129,141,152,165,178,190および193において"PS"と標識;Leggettら、J.Chem .Soc.Faraday Trans.,88,297(1992を参照されたい)]、ナトリウム(m/z 23)、カリウム(m/z 39)および銅(m/z 63および65)も又認められる。 TOF-SIMS技術の感度は試料の分子の特徴により変化するけれども、ポリスチレンに吸着されるフェニルアラニンについての検出限界は該ビーズ表面で約500att omole（５００×１０^-18モル）であった。40ミクロンの球状物が少なくとも50fe mtomoleで吸着することを考えると、ここに示されているTOFF-SIMS技術は本発明による組合せライブラリーを分析するために必要とされる感度を備えていると言える。このように、この実施例はビーズ上に吸着された少量のアミノ酸を分析するTO F-SIMSの能力を示している。実施例３この実施例はトリペプチド、バリンーチロシン−バリン（Ｖ−Ｙ−Ｖ）の約１つの分子層で被覆された４０ミクロンのポリスチレンビーズのＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを示すものである。実施例２に記載したようにして、標準の４０ミクロンの直径のポリスチレンビーズ（Bachem Bioscience Inc.）をＶ−Ｙ−Ｖの溶液で処理して、物理的吸着により該トリペプチドの単層を該ビーズに被覆し、次いで銅グリッド上に置いた。ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析のために、パルスしたＧａ⁺イオンビームを１００ミクロンの場を横切って照射し、その間のＴＯＦ− ＳＩＭＳスペクトルを１平方ミクロンまでの各ピクセルについて記録した（図３）。ｍ／ｚ３８０、４０２および４２４における各々（Ｍ＋Ｈ）、（Ｍ＋Ｎａ）⁺、（Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ₂）⁺イオンの強度をマッピングすることによって像を形成した。Ｖ−Ｙ−Ｖについては、その強度は一般的にピクセル１つにつき０〜４カウントであった。これらの比較的低い割合のカウントにもかかわらず、この被覆されたビーズの明解な像が各ピクセルにおいて記録された強度レベルの写真として容易に記録され数値を付けられた。本発明方法による結果の多くの重要な点を、Ｖ−Ｙ−Ｖ分析に適用することができる。まず第１に、銅グリッドは電導性であるが、ポリスチレン樹脂そのものは荷電に対して電気的に絶縁体である。通常、静的ＴＯＦ−ＳＩＭＳ実験では、スペクトルを記録するために必要とされる入射イオンの数は小数なので、荷電は重要な問題ではない。しかしながら、今述べている像を造り出す際に、小面積の像形成に当っては、イオン電流密度は非常に高く、したがっていくつかのタイプの荷電補修が必要である。本発明を実行する際に行なわれる実験においては、Ga rdellaおよびHercules（Anal．Chem.，52，226(1980))およびBriggsおよびWooto n(Surf．and Int．Anal.，4，109(1982))の方法に従って、荷電による人為障害を除去するために各Ｇａ⁺イオンパルスの間、５０マイクロ秒の間、５０ｎＡ／ｃｍ²の３０ｅＶ電子中に試料を浸漬した。第２に、該ライブラリーの分子種が結合している粒子の形およびＧａ⁺イオン流の入射角が、実験結果に大きい影響を与える。本発明方法で使用される装置においては、Ｇａ⁺ビームが表面から４５°で入射し、図３に示されたデータを造り出した。例えば、３mmの抽出間隙中に置いた６０ミクロンまでの大きさの直径のポリスチレン粒子は、そこを横切って適用された7200ボルトの場を有する。したがって、ビーズの形態によって生じる問題に加えて、ビーズを横切って150ボルトの場勾配が存在する。これらの両方の効果が、例えば図４に示されている数値化した像に見られるように、ビーズの先端近くにより高いシグナルを造り出す傾向となって現れる。第３に、ここで報告されている各ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析の結果は４分未満で終了した。この分析時間は入射イオンの流量および分解域に到達するまでに必要とされる時間とによって決定される。小さいビーズおよび／又はより高い電流ソースの場合には、この分析時間はおおよそマグニチュードのオーダーで有意に減少されるであろう。図３に示される結果と同様の結果が、他の多くの小ペプチド同様、グリシン− プロリン−グリシン−グリシンを使用して得られた。例えばブラディキニンのような１１個のアミノ酸残基を有するより大きなペプチドのための技術は、該１１ −ｍｅｒがポリスチレンフィルム（Steffensら、前出）上に吸着された時に認識し得るＴＯＦ−ＳＩＭＳスペクトルを与えた。ポリスチレンビーズ上のペプチドの組合せライブラリーは一般に３個から６個のアミノ酸の直鎖から成っているので、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより映像化される範囲はこのようなライブラリーの吸着されたペプチドの親分子のイオンを決定するに充分なものである。したがって、この実施例は、トリペプチドＶ−Ｙ−Ｖを用いた場合のポリスチレンビーズ上に吸着されたペプチドの組合せライブラリーを直接映像化する際の重要なパラメーターについて説明するものである。基質の荷電容量がイオン電流密度を増加させるので、ライブラリーの分子種が吸着されている基質の荷電容量を考慮に入れなければならない。更に、使用される基質の形、Ｇａ⁺イオンの入射角が人工的により高いシグナルを造り出す傾向があり、それ故、当分野でよく知られている方法を使用して修正をする必要がある。最後に、ＴＯＦ−ＳＩＭＳのための時間はわずか４分間で、しかもこれを有意に減らすことができる可能性もあり、これは組合せライブラリーのスクリーニングおよび分析の分野に与えたおどろくべき効果の１つである。実施例４この実施例は実施例２に記載したＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析を用いて、特定の場所にあるペプチドの分子量の決定を示すものであり、そして組合せライブラリーの小分子を可逆的にであるが共有結合的に基質に結合させる新規な方法を示すものである。ポリエステルビーズ上に構築された組合せライブラリーは少なくともこの構築反応の間は必ず共有結合的に結合している。特定の場所に位置する、即ちグリッドの特定の位置におけるこのようなライブラリーの小分子の分子量を決定するために、分解していない完全な分子のままそれを脱着するためにこの共有結合を壊す必要がある。この位置に基く決定のための必要事項をテストする目的のために、フェニルアラニンをＳａｓｒｉｎ^Rポリスチレンビーズ上に吸着させ、このＳａｓｒｉｎ^Rビーズに結合している反応性基により、MerglerらＩ（Tet．Lett．2 9 ，4005(1988)）およびMerglerらII（Tet．Lett．29，4009(1988)）の方法を用いて該ビーズに共有結合的に結合させた。フェニルアラニンおよびＳａｓｒｉｎ^Rビーズの間の共有結合の形成はＳＩＭＳスペクトル法における分子イオンの収率を激減させた。この効果については図２Ｂに示されており、この図中ではｍ／ｚ１２０において強いフラグメントが見られるもののｍ／ｚ１６６における（Ｍ＋Ｈ）⁺の収率はもはや見られないのである。したがって、この親化合物であるフェニルアラニンは同定することはできなかった。より大きな分子を他の同定実験でテストした場合には、親分子イオンは観察されず、そのスペクトルは保護基および例えばアミノ酸のようなモノマーからの強い断片イオンから主に構成されていることが判った。例えば、ペンタペプチド、ロイシン−セリン−アルギニン −イソロイシン−バリンについていえば、モノマー単位各々に典型的な断片イオンは低質量範囲に見られるものの、予測された５８７ｍ／ｚにおける親分子イオンは観察されずまたいずれのカチオン化種も観察されなかった。Mantus ら、Ana l.Chem.，65，1431(1993)を参照されたい。したがって、ポリエステルビーズに共有結合的に結合した小分子のＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析は、この共有結合がＴＯＦ −ＳＩＭＳ分析が行なわれる前に***しない場合には効果がないことが判った。小分子を基質上の位置に残したままでライブラリーの小分子を適当な基質に結合している１個または複数の共有結合を切るプロトコルを、Ｓａｓｒｉｎ^Rポリスチレンビーズに結合しているフェニルアラニンを用いて行なった。共有結合的にアミノ酸が結合しているビーズは次いで銅グリッドに移された。この銅グリッドを支持体として用い、このグリッド上のマーキングを特定のビーズの場所を決めるために（ｌｏｃａｔｅ）用いた。Ｓａｓｒｉｎ^Rポリスチレンビーズは例えばペプチドと酸感受性の共有結合を形成することが見出された。小分子が共有結合的に結合しているビーズを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびＴＦＡの２％メチレンクロリド（ＣＨ₂Ｃｌ₂）溶液からのメチレンクロリド（ＣＨ₂Ｃｌ₂）蒸気で飽和している室に置いた。３分間この蒸気にさらすことによってこのビーズからアミノ酸を切り離すことができた。この反応の進み具合については、ビーズそのものの色がオフホワイトから紫に変るのを観察することでチェックした。一旦この切り出し反応が終了した後、該ビーズと銅グリッドを分析のためのＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置へと直接挿入した。この気相切り出し(vapor phase clipping)を受けたビーズの質量スペクトルは各対応の親イオンに対し強いシグナルを示した。切り出されたフェニルアラニンのＳＩＭＳスペクトルは図２Ｃに示されており、対応するｍ／ｚ１６６の対応像は図４に示されている。図４Ａおよび図４Ｂ（これらは同じ位置に対するＴＯＦ−ＳＩＭＳ像であるが、異なったフィルターを用いている）に由来する重要な観察は、このペプチドが該ビーズにくっついているということである。このことは、そのシグナル（図４Ａに示されている）がその周りにある銅グリッド（図４Ｂに示されている）からは見出されないことから明らかである。したがって、ポリエステルビーズへの共有結合を壊した後も、物理的吸着もしくは他の弱い分子効果の故に、フェニルアラニンがそのビーズへの結合を保ったままでいるのである。更に、図２Ｃのｍ／ｚ−−（Ｍ＋Ｈ）⁺におけるフェニルアラニンに対して観察されるシグナルは、それが単に物理的にビーズに吸着された場合（図２Ａ）のシグナルに比べより強いものである。おそらくそれは、共有結合形成から生じるビーズ上の被覆がより均一であるためである。したがって、単なる物理的吸着だけのような他の方法により行なわれる分析に比べ、ビーズから切り取られた分子種を分析する場合の結果の方がより大きい感受性で得られるのである。フェニルアラニンおよびロイシンの混合物で被覆したビーズを、上記と同じ方法で映像化してこの技術をテストした。このビーズを銅グリッドの上に置き、上述のようにしてＴＦＡで切断した。この映像を図５に示すが、この図は１２０ミクロンのフィールドである。このビーズは互いに非常に近いのであるが、図５Ａおよび図５Ｂを比較したものから明らかなように両者が有意に交差汚染しているということはなかった。この図５Ａおよび図５Ｂでは、ロイシンに対する（Ｍ＋Ｈ）⁺イオン強度が図５Ａに示され、フェニルアラニンに対する（Ｍ＋Ｈ）⁺イオン強度が図５Ｂに示されている。図４に示されるように、図５に描かれている像は同じ位置で、異なったフィルターを用いたものである。この実施例はＴＯＦ−ＳＩＭＳ分子量分析の感度を上げ、異なった分子種を含有するビーズのグリッド上の特定の位置に見出されるライブラリー中に含まれる分子種の決定のための方法をより有意に示すものである。実施例５この実施例は、ビーズに共有結合的に結合したトリペプチドの同定のために適用されたＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析を示すものである。このトリペプチドＶａｌ−Ｔｙｒ−Ｖａｌを、実施例４に記載した方法にしたがって、酸感受性のリンカーを介してビーズに共有結合的に結合させた。このビーズを実施例２に記載したようにして気相法による切り取りに付した。図６（下のパネル）に示したこのマススペクトルはｍ／ｚ３８０（Ｍ＋Ｈ），２８１および２６３におけるイオンを示している。これらのピークの配列についてはこの図に示されており、それらは各々、全トリペプチド、Ｖａｌ−Ｔｙｒジペプチドフラグメント、Ｔｙｒ−Ｖａｌジフラグメントである。低質量範囲（図６、上のパネル）では、ｍ／ｚ７２（Ｖａｌ−ＣＯ₂Ｈ）および１３６（Ｔｙｒ−ＣＯ₂ Ｈ）に強いピークが見られた。Biemann ら、Mass Spectrom．Rev.，６，１(1987 )を用いて、断片配列イオンのＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析によりその組成ばかりでなく、上記フラグメントの型からＶａｌ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ配列も明らかとなった。したがって、この方法は親イオンの質量の決定を行ない、そしてそれによって与えられた分子量を有すライブラリーに属する化合物を直接同定する方法を提供するものである。実施例６この実施例は、本発明と比較するために、Ｓａｓｒｉｎ^Rに共有結合的に結合している異項環式小分子の同定にエレクトロスプレイ・マス・スペクトロメトリーを用いる場合を示している。この実施例および実施例７に示されたデータをS. A.Carr，M.E.Hemling，G.D.Roberts およびJ.Weinstockの、Chemical and Biolo gical Research Division of Smithkline Beecham Pharmaceuticals，King of P russia，Pennsylvaniaによって提供された。アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト（エチル2-(2′-チオフェニルメチル)-3-〔5′-｛(1′-p-カルボキシフェニルメチル)-2′-n-ブチル｝イミダゾリル〕−プロペノエート）が結合しているビーズを単離し、micro-Eppendorf チューブに移した。この分析物を１％のＴＦＡのメチレンクロライド溶液を用いる１５分間の切り出し反応に付した。この試料を乾燥させ、次いでこの化合物を１０ μｌのアセトニトリル中に抽出／溶解した。この溶液の１／１０をフロー・インジェクションにより注入し、Perkin Elmer Sciex API-III triple quadrupole a nalyzer(Thornhill，Ontario)を用いたＥＳＭＳで分析した。（Ｍ＋Ｈ）⁺イオンに相当する強いシグナルが、図８Ａに示されているようにｍ／ｚ４５３．１８（理論値４５３．１８）に容易に検出された。ｍ／ｚ５００〜６００の範囲に、ビーズおよびリンカーからの強いシグナルも観察された。追加の１０％溶液を次いで同じ四極子装置により縦列ＭＳによって分析し、その結果を図８Ｂに示す。この分子イオンクラスターを上記３つの四極子のＱ１により選択し、次いで衝突セルＱ２においてアルゴンで衝突により活性化した。この生成物イオンをＱ３で検出した。多数の断片イオンを観察し、その全てが容易に該アンジオテンシンII受容体アンタゴニストの構造に割当てられた。このように、エレクトロスプレイ質量分析は共有結合的に結合している異項環化合物の分子量を決定するために用いることができた。実施例７この実施例は、Ｓａｓｒｉｎ^Rに共有結合的に結合しているアンジオテンシンI I受容体アンタゴニストをＭＡＬＤＩ法を使用しての同定を示すもので、比較のためのものである。Ｓａｓｒｉｎ^Rビーズをステンレスのスティール試料ターゲット上に置き、約１時間、囲ったチャンバー中でＴＦＡ気体にさらした。ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）のアセトン溶液の０．５μｌを該ビーズ上に置き、空気乾燥させた。２種類のタイプのFisons VG MALDI 質量分析器(Manchester，UK)を用いて分析を行なった。この機器は両方とも３３７ｎｍのパルス窒素レーザーで２３ｋｅＶの加速電圧での光照射を用いる１段階の反射鏡装置である。通常のＭＡＬＤＩスペクトルを造るために、Ｍ／△ｎ１２００（ＦＷＨＭ）の反射モードにおける最大質量解析を有する低実行（low performance）TOFSpec を使用した。通常のＭＡＬＤＩスペクトルを、図９Ａに示したスペクトルを創造するための平均である４１レーザーショットで創造した。この装置はＤＨＢおよびグラミシジンＳの（Ｍ＋Ｈ）＋ピークを用いて外挿的に目盛りをしてあった。ｍ／ｚ４５３．１５（理論値：４５３．１８）において（Ｍ＋Ｈ）＋の有意なシグナルが観察された。断片は観察されなかった。ｍ／ｚ２００より下のピークは主にＤＨＢ基質によるものである。ＤＨＢは低いＭ_r有機化合物のために有効であることが判った。というのは、ＤＨＢがｍ／ｚ２００以上では非常に低い基質バックグラウンドを与えるからである。ＭＡＬＤＩはこの化合物に対して有意の断片スペクトルを造らないという事を克服するために、ポスト・ソース・ディケイ（ＰＳＤ）法〔Della-Negraら、Ana l．Chem.，57，2035(1985)；Tangら，Anal．Chem.，60，1791(1988)；Spengler ら，J.Phys．Chem.，96，9678(1992)；Kaufmann ら、J．Mass Spectrom.，131 ，355 (1994)〕を、VG TofSpec-SE装置を用いるアンジオテンシンII受容体アンタゴニストの分析に適用した。ｍ／ｚ４５３．２における親イオンに集中した約１０Ｄａのウィンドウが、Bradbury-Nielson イオンゲートを用いる生成イオン分析のために選択された。ＰＳＤマススペクトルが、７つの連続した、重複するマススケールセグメントにおいて得られ、その各々が前のセグメントから約３０％の質量変化を有するものであった。このいくつかのＰＳＤセグメントを一緒にし、データシステムによる樹脂基質テトラデカペプチドのＰＳＤスペクトルに対して外挿的に質量計測して得たものが図９Ｂである。このスペクトルを、断片イオンの翻訳のための十分に発展している規則によって容易に翻訳した。このように、実施例７は共有結合的に結合している異項環化合物がＴＦＡによって切り出すことができ、その分子量をＭＡＬＤＩによって決定することができることを示している。実施例８この実施例は、Ｓａｓｒｉｎビーズに結合しているアンジオテンシン II受容体アンタゴニストのＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を使用しての同定を示すものである。ビーズをＴＦＡ気体に囲ったチャンバー中で２時間さらした後、このビーズのＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析を行なった。このビーズはシリコンウェファーの小片上に置いた。ＴＦＡ気体処理後、このウェファーをKratos Prism ＴＯＦ−ＳＩＭＳ装置のＳＩＭＳ分析チャンバー中に直接移した後、該分析を行なった。パルスした２５−ｋｅＶの１次イオンビーム（最小ビーム直径：２００ｎｍ）で試料を照射した。このパルス巾は７ｎｓであった。２．５ｋｅＶの段階電圧を使用してイオンを該分析器中に加速した。この分析器はｍ／△ｍ＝１０，０００より良い質量分析のできる反射鏡装置である。この分析データをマススペクトルかマス解析像として取り出した。図１０は、２．２×１０⁷Ｇａ⁺イオンでの衝撃により得られた約５０μｍの直径の１個のビーズから得られた正のイオンスペクトルを示している。１０¹⁴分子ｃｍ^-2と仮定すると、該表面の０．５％より少ない部分がイオン衝撃を受けている。これはＳＩＭＳのための静的限界の範囲内に十分おさまるものである。ｍ／ｚ４５３における（Ｍ＋Ｈ）＋はｍ／ｚ２８３，１３５および９７における有意の断片ピークと共に非常に明らかである。Ｈ＋およびＣＨ₃イオンを用いる内部計算方法は４５３．１８（理論値：４５３．１８）の（Ｍ＋Ｈ）＋イオンに対するｍ／ｚを得る。計算の精度はＣｓＩ内部水準を導入し、ｍ／ｚ１３３におけるＣｓ＋を使用することによってチェックした。図１０における断片質量は同程度の精度で決定することができ、その決定および標的化合物の同定を行なう際にその分子質量に沿ってそれを使用することの両方を助けるものである。実施例６〜８において検出されたアンジオテンシンII受容体アンタゴニストの断片イオンの計算された質量と観察された質量が次の表１に示されている。質量における誤差は無視できるものであり、上記の３つの質量分析技術が、ピコモル量の単位で存在する可能性のある小分子の結合しているポリマーを同定するのに適している。このＴＯＦ−ＳＩＭＳ法は、実験で得られた質量における誤差のゆれがより少ないことで示されるように、ＭＡＬＤＩよりも大きな感度を有している。図１１は、１次ビームがビーズ表面を横切って照射される時に生ずる２次イオンを集めることによって得られる２つの像を示している。これらの像は、（Ａ）は（Ｍ＋Ｈ）＋イオン、および（Ｂ）はｍ／ｚ１３５イオンに対するイオン回収分布を示している。この標的化合物に起因するイオンが主にビーズから回収され、ほんのわずかなイオンがシリコン支持体からのものであることは明らかである。即ち、これらの像は、ＴＦＡ処理の後でさえもこの標的化合物が実質的にビーズ上に留まっていることを示している。以上のように、実施例８は、基質に共有結合的に結合している異項環化合物はＴＦＡによって切り出すことができ、その分子量はＴＯＦ−ＳＩＭＳによって決定されることができることを示している。実施例９この実施例は、Wang樹脂、アセタール樹脂またはチオアセタール樹脂に共有結合的に結合しているアンジオテンシンII受容体アンタゴニストに関する本発明のＴＯＦ−ＳＩＭＳ法の結果を示すものである。アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト−基質構成物を、基質としてWang樹脂、アセタール樹脂またはチオアセタール樹脂を用いて構築した。このアンタゴニスト−基質の共有結合は、図７に示すように、各々のリンカーと結合することによって形成された。この共有結合をＴＦＡ蒸気にさらすことによって切り出した。ＴＯＦ−ＳＩＭＳを上記の樹脂試料の各々に適用し、次いでこのアンタゴニストの分子量を決定することに成功した。本明細書で挙げられている参考文献は各々参考のために記載されているものである。本発明について記載してきたが、これらは種々の方法で変更することができる。本発明の精神および範囲から離れない限り、当業者にとって明らかであるような変更を加えることは本発明の範囲に包含されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ウィノグラド，ニコラスアメリカ合衆国ペンシルバニア州 16801，ステートカレジ，ニミツアベニュー 415 (72)発明者ブルムメル，クリストファー，エルアメリカ合衆国ペンシルバニア州 16803，ステートカレジ，トフトリースアベニュー 248，アパートメント 308 (72)発明者リー，イレネ，エヌ．，ダブリューアメリカ合衆国ペンシルバニア州 16801，ステートカレジ，サウスゲートドライブ 801，アパートメントＣ10

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の工程を含有する組合せライブラリーの個々の小分子を同定する方法：（ａ）固体基質および小分子の複合体を複数作成する工程であって、各複合体は１つの基質またはその一部、および組合せライブラリーの少なくとも１つの小分子を含有し、この基質および小分子は共有結合またはイオン結合で互いに結合しているものであり；（ｂ）小分子は基質に物理的にそのまま吸着されている程度に共有結合またはイオン結合を壊す工程；および（ｃ）基質に物理的にそのまま吸着されている選択された小分子の分子量を、２次イオンマス・スペクトロメトリーによって決定する工程。２．小分子がアミノ酸、ペプチド、オリゴヌクレオチド、異項環化合物およびそれらの組合せから成る群から選択されるものである、特許請求の範囲第１項記載の方法。３．小分子が共有結合的に基質に結合している、特許請求の範囲第２項記載の方法。４．基質がそこに結合されている結合基を有している高分子樹脂を含む、特許請求の範囲第３項記載の方法。５．高分子樹脂がそこに結合されている結合基を有している、特許請求の範囲第４項記載の方法。６．結合基がヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、アセタール、チオアセタール、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキルアミノ、Ｃ₁−Ｃ₁₀アラルキルアミノおよびＣ₁−Ｃ₁₀ハロアルキル、およびベンジル性水素を有するｏ−ニトロベンジル基から成る群から選ばれる少なくとも１つの反応基を含有するものである、特許請求の範囲第５項記載の方法。７．結合基がＦ−ｍｏｃ−２，４−ジメトキシ−４′− (カルボキシメチルオキシ)-ベンズヒドリルアミン、Ｆ−ｍｏｃ−４−メトキシ−４′−（ガンマ−カルボキプロピルオキシ）−ベンズヒドリルアミン、ｐ−アルコキシベンジルアルコール、ベンジルアセタール、ベンジルチオアセタール、ベンズヒドリルアミン、Ｃｌ−ＣＨ₂−Ｐｈ、２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコールおよびｏ−ニトロベンジルオキシカルボニルから成る群から選ばれたものである、特許請求の範囲第６項記載の方法。８．結合基が２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール、ベンジルアセタールおよびベンジルチオアセタールから成る群から選ばれたものである、特許請求の範囲第７項記載の方法。９．共有結合が小分子を実質的に改変することなく破壊されるものである、特許請求の範囲第８項記載の方法。１０．共有結合がトリフルオロ酢酸を含する蒸気を用いて破壊されるものである、特許請求の範囲第９項記載の方法。１１．共有結合がトリフルオロ酢酸およびメチレンクロライド蒸気の混合物を用いて破壊されるものである、特許請求の範囲第１０項記載の方法。１２．基質がビーズである、特許請求の範囲第１１項記載の方法。１３．ビーズが約１０ミクロンから約１２０ミクロンの直径を有するものである、特許請求の範囲第１２項記載の方法。１４．２次イオン質量分析法が飛行時間２次イオン質量分析法である、特許請求の範囲第１２項記載の方法。１５．ビーズ上の小分子の空間的分布の地図を描く（mapping）工程を更に含有する、特許請求の範囲第１４項記載の方法。１６．小分子がアミノ酸またはペプチドである、特許請求の範囲第１３項記載の方法。１７．ペプチドが２から１０のアミノ酸を含有する、特許請求の範囲第１６項記載の方法。１８．飛行時間２次イオン質量分析法で得られた断片化のパターンから該ペプチドの配列を決定する工程を更に含有する、特許請求の範囲第１７項記載の方法。１９．小分子が、Ｎ，Ｓ，またはＯおよびそれらの組合せを有する４〜７員環を有する異項環化合物である、特許請求の範囲第１４項記載の方法。２０．基質が反応基を有するポリスチレンビーズであり、小分子がアミノ酸、ペプチド、オリゴヌクレオチドもしくは異項環化合物またはそれらの組合せであり、共有結合が酸感受性エステル結合であり、該共有結合はグリッド上に置かれた複合体をトリフルオロ酢酸およびメチレンクロライドの蒸気にさらすことによって破壊され、そして２次イオン質量分析法が飛行時間２次イオン質量分析法である、特許請求の範囲第１項記載の方法。