JPH09507841A - プロカインアミドおよびnapaのマレイミド付加物結合体 - Google Patents
プロカインアミドおよびnapaのマレイミド付加物結合体Info
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Abstract
(57)【要約】
式(a)を有する新規なプロカインアミドおよびN-アセチルプロカインアミド(NAPA)の誘導体が開示される。式中、X=水素またはアセチル;R1=1から3個の炭素原子を有するアルキル基;m=2から10の整数;R2=2から10個の炭素原子を有するアルキル基、シクロアルキル基またはアリール基;Z=ポリ(アミノ酸);およびn=1からp、但し、p=Zの分子量/1000である。これらの誘導体は、タンパク質またはポリ(アミノ酸)、酵素、酵素供与体ポリペプチド、および標識物質のマレイミド結合体を含む。これら結合体の調製に有用な新規な活性化ハプテン中間体、ならびにハプテン中間体および誘導体の合成方法もまた開示される。
Description
【発明の詳細な説明】
プロカインアミドおよびNAPAのマレイミド付加物結合体 発明の背景
本発明は、プロカインアミドおよびN-アセチルプロカインアミド(NAPA)の新
規な誘導体に関する。この誘導体は、抗体生産を刺激するために使用する免疫原
、並びにプロカインアミドおよびNAPAを検出するためのイムノアッセイに有用な
ポリペプチド結合体を含む。上記の免疫原およびポリペプチド結合体の合成にお
けるハプテン中間体もまた提供される。
心抑制剤プロカインアミドおよびN-アセチルプロカインアミドは、心臓性不整
脈を治療または予防するために臨床的に使用されている。N-アセチルプロカイン
アミド(NAPAと省略され、またアセカイニド(acecainide)としても知られている
)は、ヒトにおけるプロカインアミドの主要代謝物である。プロカインアミドの
投与を受けている患者の血漿中におけるこの代謝物の濃度は、しばしば親薬物そ
れ自体の濃度を越える。代謝はin vivoアセチル化によるもので、各患者が薬物
をその代謝物に変換する速度には、遺伝に基づく大幅な変異が観察されている。
この現象は、NAPAに関連する副作用の発症率がより低いため、上記薬物の臨床使
用にとって重要である。これら薬物の治療上の有用性および毒性の両方ともが、
投与量よりも血中レベルとより良く相関している。投与された薬剤の量と血中レ
ベルとの関係は非常に可変的である。それは吸収の完全さ、分布特性ならびに代
謝および***速度によって影響される。
これら考慮すべき問題のゆえに、上記薬物の血中レベルを測定するための多数
の分析方法が開発された。これらの方法には、高速液体クロマトグラフィー(HPL
C)、定量薄層クロマトグラフィー(TLC)、並びに酵素イムノアッセイおよび蛍光
技法を用いたイムノアッセイを含むイムノアッセイが含まれる。競合的結合イム
ノアッセイは特に有利であることが実証された。このアッセイでは、生体サンプ
ル中の分析物が、分析物および分析物類似体に特異的な抗体上の限られた数の受
容体結合部位について、標識化試薬、または分析物類似体、またはトレーサーと
競合する。酵素、蛍光分子、および放射性化合物はトレーサーとして用いられる
一般的な標識物質である。サンプル中における分析物の濃度が抗体に結合する分
析物類似体の量を決定する。抗体に結合する分析物類似体の量は、サンプル中の
分析物濃度に反比例する。なぜなら、分析物および分析物類似体はそれぞれそれ
らの濃度に比例して抗体と結合するからである。次に、遊離の、または結合した
分析物類似体の量を、使用した特定の標識にとって適切な方法で測定することが
できる。
あるタイプの競合的結合イムノアッセイは、サンプル中に存在する分析物の量
を測定するために使用する検出可能なシグナルを生ずる段階として、ポリペプチ
ド断片が再会合し活性な酵素を形成することに基礎を置いている。クローン化酵
素供与体イムノアッセイ(CEDIA)として知られているこのタイプのアッセイは、
参照として内容をここに組み入れる米国特許第4,708,929号に記述されている。
特に、β-ガラクトシダーゼ酵素供与体ポリペプチドはβ-ガラクトシダーゼ酵素
受容体ポリペプチドと結合し、活性なβ-ガラクトシダーゼ酵素を形成する。ハ
プテン、または小さい分析物もしくは分析物類似体を酵素供与体ポリペプチドの
特定部位に結合することは、相補化(complementation)反応によってβ-ガラクト
シダーゼを形成する能力に影響を及ぼさないので、よってβ-ガラクトシダーゼ
の基質が存在する場合にβ-ガラクトシダーゼ活性の速度に影響を及ぼさない。
しかし、酵素供与体-ハプテン結合体が抗分析物抗体によって結合される場合、
相補化速度は抑制され、そしてそれによって反応の初相における酵素に触媒され
る反応速度が低下する。酵素触媒反応速度におけるこの低下をモニターすること
が可能である。そして、反応混合物中に存在する酵素供与体-分析物結合体およ
びサンプル中に存在する分析物が酵素受容体を添加する前に抗分析物抗体につい
て競合する場合、上記の速度低下は複数の分析物を競合阻害の原理で定量するた
めに用いられてきた。β-ガラクトシダーゼ形成の相補化速度、そしてしたがっ
て酵素に触媒される反応の速度は、サンプル中に存在する分析物の量が増えると
増大する。
許容されている臨床プラクティスでは、プロカインアミドとNAPAは別々に分析
される。したがって、NAPAおよびプロカインアミドのイムノアッセイは代謝物ま
たは薬物自体に対して高い特異性を有する抗体を必要とする。代謝物と薬物はア
セチル機能の存在または不在によって異なるだけなので、特異的抗体の作出は特
に興味をそそる問題である。しかし、驚くべきことに、本発明の免疫原はこの目
的に特に有用であることが見いだされた。
プロカインアミドおよびNAPAを測定するイムノアッセイに用いるための、両薬
物に対する抗体の調製は、先行技術において3つの本質的に異なるアプローチに
よって達成されている。1つのアプローチは、ジアゾ化およびそれに続くアルブ
ミンキャリヤーへの縮合によってベンゼン環アミノ基を介してプロカインアミド
を結合することであった[A.S.Russelら,Clin.Exp.Immunol.3:901(1968)
およびMojaverianら,J.Pharm.Sci.69:721 (1980)]。こうして得た抗体は、N
APAとの高い交差反応性を示すが、そのため上記薬物のうち片方に特異的なイム
ノアッセイにおける使用には適さない。
第2のアプローチは、後に抗原性キャリヤーに結合するためにエチル置換基の
1つを修飾することにより、上記の薬物をそれらの構造の反対の端に、つまりN-
ジエチルアミノ基の部分に結合することを含む。その結果、薬物をキャリアーに
結合させるためその薬物の主要官能基が修飾されている抗体が、免疫原に対して
作成される。このアプローチの1例がSinghらに授与された米国特許第4,235,969
号に記述されており、ここではN-アルキル基の1つが非オキソカルボニル-アル
キル置換基に置換されている。非オキソカルボニル機能性、つまりカルボニルま
たはイミノ機能を有する結合基が、抗原および酵素への結合のために用いられる
。同様に、ヨーロッパ特許出願第86103161.5(Heimanら)は、末端ジエチルアミ
ノ基が修飾されたプロカインアミド類似体の抗原性結合体および酵素結合体を開
示している。特異的結合基がポリ(アミノ酸)またはフルオレセイントレーサー
に結合させている。
第3のアプローチにおいては、Bucklerらの米国特許第4,673,763号が、アミド
側鎖のα-位で免疫原性キャリヤー物質または標識と結合しているプロカインア
ミドまたはNAPAの誘導体を記述している。
Singh、HeimanおよびBucklerの刊行物に記述されている結合体はすべて、アミ
ノ-またはカルボキシル-機能化ハプテンを用いたアミド結合縮合化学を使用して
いる。しかし、本発明は先行技術の結合化学とは異なる。本発明の結合体におい
ては、マレイミドで修飾したハプテンがキャリヤータンパク質、酵素または酵素
供与体ポリペプチド上のスルフヒドリル基と反応し、チオエーテル結合ハプテン
結合体を生ずるのである。マレイミド/スルフヒドリル化学[M.Brinkley,Bioc
onjugate Chem.3:5(1992)]はアミド結合縮合より容易に制御されるので、それ
ゆえ規定された、目標設定された度合いの置換を有する免疫原および酵素もしく
は酵素供与体結合体の調製を可能とする。このことは、結合体の機能性効率にと
って非常に重要な特徴である。
最近同定されたプロカインアミドおよびNAPAの他の2つの代謝物に、デスエチ
ルプロカインアミド(PADE)およびデスエチルN-アセチルプロカインアミド(NAPAD
E)[Ruoら,Ther.Drug Monitoring,vol.3:231(1981)およびRuoら,J.Pharm.
Exp.Ther.,vol.216:357(1981)]がある。本発明の免疫原はデスエチル化合物
のハプテン誘導体なので、このような免疫原から誘導される抗体はPADEおよびNA
PADEに対して高い交差反応性を有するであろう、そしてそれゆえプロカインアミ
ドおよびNAPAのアッセイに用いるには不適当であろう、と予想されるであろう。
しかし、全く驚くべきことに、本発明の抗体はPADEおよびNAPADEに対して約10%
未満の低い交差反応性を示す。デスエチル代謝物に対するこのように低い交差反
応性は、正確な臨床分析にとって非常に望ましい。そして、先行技術はこれらの
代謝物に対する交差反応性の問題を今日まで処理するに至っていない。発明の概略
本発明は、下記の式で表される新規な活性化ハプテン誘導体を提供する:
式中:
X=水素またはアセチル;
R1=1〜3個、好ましくは2個の炭素原子を有するアルキル基;
m=2〜10の整数、好ましくは2;および
R2=2〜10個の炭素原子を有するアルキル、シクロアルキルまたはアリ
ール基、好ましくは(CH2)2。
本発明はさらに下記の式で表される新規なハプテン結合体を提供する:
式中:
X=水素またはアセチル;
R1=1〜3個、好ましくは2個の炭素原子を有するアルキル基;
m=2〜10の整数、好ましくは2;
R2=2〜10個の炭素原子を有するアルキル、シクロアルキルまたはアリ
ール基、好ましくは(CH2)2;
Z=ポリ(アミノ酸)または多糖;および
n=1からp、但し、p=ZのMW/1000。
本発明は、ポリ(アミノ酸)上のスルフヒドリル基を介するマレイミド修飾活
性化ハプテン前駆体化合物への結合またはその誘導体化を含む、プロカインアミ
ドおよびNAPAのイムノアッセイに使用する試薬を独自に提供する。本発明の免疫
原(これらはマレイミド部分およびスルフヒドリル架橋を介して免疫原性キャリ
ヤー物質に共有結合したハプテン性薬物を含む)は、それぞれの薬物に対する抗
体の生産を刺激するために用いられる。本発明の新規な免疫原を用いて調製され
た抗体は、プロカインアミドおよびNAPAのデスエチル代謝物に対して驚くほど低
い交差反応性を示すことが判明した。
別な側面において、本発明は、新規な抗体を用いたNAPAおよびプロカインアミ
ド測定のためのイムノアッセイ法および試薬を提供する。本発明はまた、上記ア
ッセイ法の特に好ましい態様のための新規なハプテン-酵素またはハプテン-酵素
供与体結合体を提供する。図面の簡単な説明
本発明は、明細書の一部を形成する図面と組み合わせて以下に述べる発明の詳
細な説明を参照するとより良く理解されるであろう。図面のうち:
図1および図2は、NAPAおよびプロカインアミドのマレイミド誘導体の調製、
および薬物のこのような誘導体化に用いるのに特に有用な前駆体化合物の調製の
ための特定の合成の概要を図解する。
図3は、CEDIAアッセイにおいて本発明の酵素供与体結合体および抗体を使用
した場合の、プロカインアミドの種々のレベルにおける用量反応曲線を示すグラ
フである。
図4は、CEDIAアッセイにおいて本発明の酵素供与体結合体および抗体を使用
した場合の、NAPAの種々のレベルにおける用量反応曲線を示すグラフである。好ましい態様の説明
本発明は、相互に関連した態様の全てにおいて、NAPAおよびプロカインアミド
のマレイミド誘導体の調製に焦点があてられている。調製されたこれらの誘導体
は、従来の抗原性ポリ(アミノ酸)または他のキャリヤー物質に結合することに
より、免疫原を形成するのに用いることができ、そして次に、抗体を得るために
用いることができる。または、上記誘導体は、薬物のイムノアッセイにおける検
出試薬として有用な酵素、酵素供与体、または標識化結合体を形成するのに用い
ることができる。
NAPAおよびプロカインアミドの化学構造は下記の式によって表される:
式中、Xはプロカインアミドについては水素で、NAPAについてはアセチルである
。
本発明の好ましい態様において、上記薬物のマレイミドハプテンおよび免疫原
結合体が図1に示す概要にしたがって合成される。化合物Iは、例えば参照とし
て内容をここに組み入れているRuoら,Ther.Drug Monitoring 3:231(1981)の方
法にしたがって合成される。化合物IIIは、N-カルボベンゾキシブロモアルキル
アミンを用いるアルキル化により化合物Iより製造される。化合物IIIは接触水
素化により、Vに還元される。マレイミド-アルカン酸N-ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルを用いてVをアシル化することにより、反応性中間体IXが得られる
。次に、ポリ(アミノ酸)の遊離スルフヒドリル基を介してこの中間体を結合し
、化合物XIをもたらす。
本発明の別の好ましい態様においては、上記薬物のマレイミド誘導体および免
疫原結合体が図2に示す概要にしたがって合成される。化合物Iの触媒水素化に
よりIIが得られる。無水酢酸を用いた化合物IIの選択的アセチル化により化合物
IVが得られる。次に、N-カルボベンゾキシブロモアルキルアミンを用いて化合物
IVをアルキル化し、VIを製造する。化合物VIを水素化して、カルボベンゾキシ基
(Cbz)を除去し、遊離アミンVIIを製造する。マレイミド-アルカン酸N-ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを用いて化合物VIIをアシル化し、VIIIを得る。最後
に、VIIIをポリ(アミノ酸)の遊離スルフヒドリル基に結合し、生産物Xを得る
。
適切なR2結合基の例は、エチル、プロピル、ブチル、シクロペンチル、シク
ロヘキシル、メチルシクロヘキシル、フェニル、ベンジル、およびそれらの置換
誘導体を含む。
本発明の免疫原の調製においては、免疫原特性を有するチオール含有キャリヤ
ータンパク質または他の物質をマレイミドハプテンに結合する。チオール化スカ
シ貝ヘモシアニン(KLH)は特に好ましい抗原性ポリ(アミノ酸)またはキャリヤ
ータンパク質であるが、アルブミン、血清タンパク質、例えばグロブリン、眼球
水晶体タンパク質、リポタンパク質、等を含む種々のタンパク質キャリヤーが使
用できることが理解されねばならない。例示的なタンパク質キャリヤーは、ウシ
血清アルブミン、卵オボアルブミン、ウシγ-グロブリン、チロキシン結合グロ
ブリン、等を含む。または、十分な数の利用可能なスルフヒドリル基を有する合
成ポリ(アミノ酸)(例えばシステイン等)が、また反応性官能基を有する他の
合成または天然のポリマー物質が使用できる。特に、炭水化物、酵母、または多
糖をハプテンに結合して、免疫原を作成することができる。
酵素供与体結合体は、供与体ポリペプチドをマレイミドハプテンに結合するこ
とによって調製される。マレイミド-ハプテンとの結合に適切な酵素供与体ペプ
チドとは、システイン基を含有するペプチドである。ハプテン対酵素供与体の結
合比は、ハプテンが少なくとも10倍過剰でなければならない。
活性化ハプテンと酵素、蛍光特性を有する物質、または放射性標識、等の標識
群との結合体もまた調製することができ、これらは試薬としてイムノアッセイに
使用できる。免疫原および酵素供与体結合体については、用いれる標識は本発明
における使用に適するためには、利用可能なチオール含有基を有しなければなら
ない。これらチオール基は天然に存在するものでも、またはチオール化剤、例え
ばN-スクシンイミジル-3-(アセチルチオ)プロピオネート(SATP)を用いて人工的
に導入したものでもよい。
抗体を作出するために、凍結乾燥した免疫原を再水和して免疫原の溶液または
懸濁物を形成することにより、宿主動物に注射するのに好都合なように免疫原を
調製する。つぎに、免疫原溶液をフロイントアジュバント等のアジュバントと混
合する。免疫原は何週間にもわたって、1回またはそれ以上の投与で、幾つかの
投与量で、種々の部位に投与することができる。
免疫原を用いたポリクローナル抗体の調製は、当業者に公知の従来の技法のう
ち任意のものにしたがって実施することができる。一般的には、ウサギ、ヤギ、
マウス、モルモット、またはウマ等の宿主動物に免疫原混合物を注射する。血清
の抗体力価を評定して最適力価に到達したと確認されるまで、さらに注射を行う
。次に宿主動物を放血させて適切量の特異的抗血清を得る。所望であれば、抗血
清をアッセイの実施に使用するに適切と見なす前に、非特異的抗体等の望ましく
ない物質を除去するため、精製工程を行ってもよい。
モノクローナル抗体は、Methods in Enzymology,vol.73(Part B),pp.3-46
(1981)に記述されている技法のようなポリエチレングリコール法を用いて、上
記のように免疫感作したマウスリンパ球と骨髄腫細胞をハイブリダイズすること
により得ることができる。
実施例1
p-アミノ-N-[(2-エチルアミノ)エチル]-N'-
[2-(3-マレイミド-プロピオンアミド)エチル]-ベンズアミドの合成
図1を参照して、R1=CH2CH3、R2=(CH2)2およびR3=(CH2)2である、p-アミノ-N-
[(2-エチルアミノ)エチル]-N'-[2-(3-マレイミド-プロピオンアミド)エチル]-ベ
ンズアミド(IX)を下記の概要にしたがって合成した:
まず、Ruoらの方法(前出)を用いて、N-エチル-エチレンジアミンおよびp-ニ
トロベンゾイルクロリドより、p-ニトロ-N-[2-(エチルアミノ)エチル]ベンズア
ミド(I)を合成した。この中間体のうち233 mgを2.5 mlのN,N-ジメチルホルム
アミド(DMF)に溶解し、282 mgの無水炭酸カリウムの存在下で266 mgのN-カルボ
ベンゾキシ-2-ブロモエチルアミン[E.KatchalskiおよびD.B.Ishai,J.Org.C
hem.15:1067(1950)]で処理した。室温で20時間攪拌後、懸濁液を1mlになるまで
ロータリーエバポレータで濃縮し、さらに20時間反応させた。次に、反応混合物
を濾過し、油状になるまでロータリーエバポレータで濃縮した。この粗生成物を
25 mlのクロロホルムに溶解し、分液漏斗に入れ、水、1M 重炭酸ナトリウム、お
よび飽和塩化ナトリウム溶液各々10 mlで、順番に洗浄した。クロロホルム溶液
を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過して油状になるまでエバポレータで処理した
。生成物を、溶離液としてクロロホルム/メタノール(95:5 v/v)を用いたシリカ
ゲルクロマトグラフィーによって未反応出発物質より精製し、167 mgのp-ニトロ
-N-[(2-エチルアミノ)エチル]-N'-[2-カルボベンゾキシ-アミノエチル]-ベンズ
アミド(III)を得た。後者の中間体を、10 mlのエタノールおよび0.8 mlの1N 塩
酸からなる混合物に溶解した。この混合物をParr反応器中、121 mgの10%パラジ
ウム/炭触媒の存在下で、圧力50 psi水素で、水素化した。室温で2時間振とう
後、水素化を停止し、懸濁液をセライト(Celite)床で濾過して触媒を除去した。
エタノール濾液を膜になるまでロータリーエバポレートで濃縮した。生成物をエ
タノール/ジエチルエーテルより沈殿させ、75 mgのp-アミノ-N-[(2-エチルアミ
ノ)エチル]-N'-[2-アミノエチル]-ベンズアミドジヒドロクロリド(V)を得た。こ
のアミン中間体39mgを1.4 mlのDMFに溶解した。トリエチルアミン0.034 mlを添
加し、次に32 mgの3-マレイミドプロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルを添加した。得られた混合物を室温で18時間攪拌した。マレイミド
付加化合物のDMF溶液を、0.1%トリフルオロ酢酸水溶液(TFA)で平衡化した分取HP
LCカラム(Vydac,2.2 x 25 cm C18)にロードした。260 nmおよび280 nmでモニタ
ーしながら、このカラムを4 ml/分の速度で、0.1% TFAを含有する0〜15%アセト
ニトリル(20分直線勾配)を用いて溶出した。主要ピークを集め、凍結乾燥して
、最大279 nmにおけるUV吸収に基づいて29.7 mgのマレイミド付加物を得た。生
成物の1H-核磁気共鳴より、標的構造IXが確認された〔すなわち、6.8 ppmにおけ
るマレイミドの共鳴(一重線)、7.2および7.8 ppmにおけるp-アミノベンズアミ
ドの共鳴(二重線)、1.4 ppm(CH3三重線)、2.5 ppmにおける(CH2-CO 三重線
)および3.3〜4.0 ppm(CH2-N 重なりあう多重線)におけるアルキル共鳴〕。
実施例2
p-アセトアミド-N-[(2-エチルアミノ)エチル]-N'-
[2-(マレイミド-プロピオンアミド)エチル]-ベンズアミドの合成
図2を参照して、X=CH3CO、R1=CH2CH3、R2=(CH2)2およびR3=(CH2)2である、p-
アセトアミド-N-[(2-エチルアミノ)エチル]-N'-[2-(マレイミド-プロピオンア
ミド)エチル]-ベンズアミド(VIII)を下記の概要にしたがって合成した:
まず、Ruoらの方法(前出)を用いてp-ニトロ-N[(エチルアミノ)エチル]ベン
ズアミド(I)を還元してデスエチルプロカインアミドとし、ついでアセチル化し
て、p-アセトアミド-N-[(2-エチルアミノ)エチル]-ベンズアミドまたはデスエチ
ル-NAPA(IV)を合成した。デスエチルNAPA 152 mgを2 mlのDMFに溶解し、160 mg
のN-カルボベンゾキシ-2-ブロモエチルアミンおよび166 mgの無水炭酸カリウム
で室温で53時間攪拌して処理した。次に、2 mlのDMFに溶解した169 mgのN-カル
ボベンゾキシ-2-ブロモエチルアミンをさらに添加し、混合物を21時間攪拌した
。最後に、N-カルボベンゾキシ-2-ブロモエチルアミンの第3の部分を2 mlのDMF
中に加え、反応をさらに3日間継続した。この時、TLCによりほぼ反応が完了
したことを示した。次に、反応混合物を濾過し、油状になるまでロータリーエバ
ポレータで濃縮した。油状物を20 mlのクロロホルムに再溶解し、1M 重炭酸ナ
トリウムおよび飽和塩化ナトリウム溶液を各々10 ml用いて順番に分液漏斗中で
洗浄した。クロロホルム溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、油状になるまでロー
タリーエバポレータで濃縮した。クロロホルム/メタノール溶離液(95:5および9
0:10 v/v)を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製を行い、100 mg
のp-アセトアミド-N-[(2-エチルアミノ)エチル]-N'-[2-カルボベンゾキシ-アミ
ノエチル]-ベンズアミド(VI)を油状物として得た。後者の中間体を、20 mlのメ
タノールに溶解し、Parr反応器中、1.5 時間、100 mgの10%パラジウム/炭触媒
の存在下で圧力38 psiの水素で、水素化した。濾過により触媒を除去し、濾液を
0.8 mlの1N 塩酸で希釈した。ロータリーエバポレータで処理して、これをエタ
ノールに再溶解し、ジエチルエーテルで沈殿させ、54 mgの固体のp-アセトアミ
ド-N-[(2-エチルアミノ)エチル]-N'-(2-アミノエチル)-ベンズアミドジヒドロク
ロリド(VII)を得た。このアミン中間体44 mgを1.4 mlのDMFに溶解した。トリエ
チルアミン0.034 mlを添加し、次に34 mgのマレイミドプロピオン酸N-ヒドロキ
シスクシンイミドエステルを添加した。反応混合物を室温で6時間攪拌した。上
記実施例1と同様に、分取HPLCにより精製をおこなった。ただし、15分以上かけ
て5〜20%とする勾配を用いた。HPLC由来の主要ピークを凍結乾燥して、最大268
nmにおけるUV吸収に基づいて29 mgを得た。生成物の1H-核磁気共鳴より、標的
構造(VIII)が確認された〔すなわち、6.8 ppmにおけるマレイミドの共鳴(一重
線)、7.55および7.7 ppmにおけるp-アセトアミドベンズアミドの共鳴(二重線
)、2.2 ppmにおけるアセチルメチルの共鳴、および1.35 ppm(三重線)、2.4 p
pm(三重線)および3.3-4.0 ppm(重なりあう多重線)におけるアルキルの共鳴
〕。
実施例3
免疫原の調製
プロカインアミドおよびNAPA免疫原は、活性化マレイミドハプテン(化合物VI
IIおよびIX)をそれぞれチオール化したキーホールリンペットヘモシアニン(KLH
)と結合させることにより調製した。KLHに結合させるべきマレイミド修飾ハプテ
ンのためには、KLH上に十分なスルフヒドリル基が存在しなければならない。こ
れは、チオール化剤であるN-スクシンイミジル-3-(アセチルチオ)プロピオネー
ト(SATP)を用いることにより行った。KLHのチオール化
100 mgのKLHを20 mlのリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、次にこれを穏やかに超
音波処理し、室温で攪拌することによりKLHを可溶化した。300モル過剰のSATPを
用いて、化合物VIIIおよびIXに結合させるためにKLHをチオール化した。1 mlの
ジメチルホルムアミド(DMF)に73.5 mgのSATPを溶解した。室温で攪拌しながら、
KLHをSATPにゆっくり加えた。反応混合物を1時間室温でインキュベートし、つ
ぎに1/10容の1M リシンを添加し(最終濃度100 mM)、さらに15分間インキュベー
ションを継続した。KLH-SATPを、50 mMリン酸pH 7.4に対して、50,000の分子量
カットオフSpectroporeTM(Spectrum Medical)透析チューブを用いて一晩透析し
た(4L x 4回交換)。チオールの取り込みを、5,5'-ジチオ-ビス-2-ニトロ安息香
酸(DTNB)との反応により、分光光度計を用いて測定し、その結果KLH 1モルあた
り33モルであることが判明した。化合物VIIIおよび化合物IXのKLHへの結合
KLH-SATPの1/4を化合物VIIIとの結合に、そして1/4を化合物IXとの結合に用い
た。残りは後で使用するために取っておいた。透析したKLH-SATPの1/2に1/10容
の1M ヒドロキシルアミン(最終濃度100 mM)を添加してスルフヒドリルを脱保護
し、反応液を室温で1時間インキュベートした。脱保護化された物質を半分に分
け、2本の試験管に入れた。20mgの化合物VIIIおよび20 mgの化合物IXをそれぞ
れ1.67 mlのDMFに溶解し、それぞれを試験管に入れた2つの脱保護KLH-SATPサン
プルにそれぞれ加えた(すなわち、片方の試験管は化合物VIIIおよびKLH-SATPを
含み、他方の試験管は化合物IXおよびKLH-SATPを含んでいた)。反応混合物をゆ
っくり攪拌しながら室温で4時間インキュベートした。反応混合物を50,000分子
量カットオフ Spectropore透析チューブに移し、蒸留水に対して透析した(4L x
3回)。UV分析は、KLH上のチオールがハプテンで飽和されていることを示した。
サンプルをバイアルに分注し(1 mg/バイアル)、-70℃で冷凍し、凍結乾燥した。
後に免疫原として使用するため、凍結乾燥サンプルを-20℃で保存した。
実施例4
化合物VIII(または化合物IX)の
β-ガラクトシダーゼのペプチド断片への結合
本実施例で使用されたβ-ガラクトシダーゼのペプチド断片(ED28)は、Manning
らのヨーロッパ特許出願第90308937.3号に記述されているように、β-ガラクト
シダーゼアミノ酸1〜46からなり、第1位および46位にシステインを有する。
この化合物の保存緩衝液中で使用されている還元試薬を除去するため、NAP5TM(P
harmacia)脱塩カラムを用いて、3.3 mgのED28を1 mlの50 mM リン酸ナトリウムp
H 7.0中で脱塩した。この物質の1 mgまたは1 μmolを結合反応に使用した。1μm
olの化合物VIIIを100μlのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。ゆっくり攪
拌しながら、1 μmolの化合物VIIIに1 mgの脱塩ED28を一滴ずつ加えた。これを
室温で1時間インキュベートした。HPLC精製用のサンプルを調製するため、水、
0.1% TFAで平衡化したNAP5カラムを用いて結合体混合物を脱塩し、過剰なハプテ
ンを除去した。C4セミ分取(semi-preparative)HPLC カラム(Vydac)を用いて、4
ml/分の速度で/0.1% TFA(溶媒A)とアセトニトリル/0.1% TFA(溶媒B)を用
いて15分以上かけて25〜40% の勾配となる溶離液で結合体を精製した。そして主
要ピークを集め、-20℃で保存した。この方法においては、2モルの化合物VIII
がペプチド上の2個のチオールを介してED28の各1モルに結合された。化合物IX
-ED28の結合にも、同じ方法が使用された。
実施例5
抗体の調製 宿主の免疫感作
免疫原の調製および宿主の免疫感作は、当業者に公知の技法を用いて実施され
る。免疫原は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で凍結乾燥された免疫原を再水和
することにより、宿主動物への注射に適するように調製することができる。次に
、抗原溶液を等容量のフロイントアジュバントと混合し、エマルジョンを形成す
る。第1回免疫感作はフロイントの完全アジュバントを用いて行うことができる
。そして、その後の感作は全てフロイントの不完全アジュバントを用いて行うこ
とができる。免疫原は種々の部位に、何種類かの用量で、1回またはそれ以上の
回数で、何週間にもわたって投与することができる。抗体の選択
本実施例では、CEDIAホモジニアスアッセイを用いて、96-ウエルの培養プレー
トから上清を選択した。先に記述したように、CEDIAアッセイは2つの遺伝子工
学的に操作された、酵素的に不活性なβ-ガラクトシダーゼの断片を用いるもの
である。相補化と呼ばれる過程において、酵素供与体と称する小さいほうのポリ
ペプチドは、大きい方の断片(すなわち酵素受容体)と自然に再結合し、活性な
β-ガラクトシダーセを形成することができる。リガンドに対する特異的抗体が
酵素供与体結合体に結合すると、相補化は阻害される。この系に遊離のリガンド
を加えることは、相補化の阻害を調節(modulate)する。このアッセイ原理を96-
ウエル様式において融合産物のスクリーニングに用いた。
融合産物の一次スクリーニングを実施し、まず実施例4で調製した酵素供与体
結合体と結合し、相補化を阻害する抗体の能力を評価した。次に、遊離の薬物が
抗体のために酵素供与体結合体を調節するか、またはこれと競合するかを決定す
るための二次スクリーニングアッセイを実施して、多数の阻害陽性クローンをさ
らにしぼった。この調節アッセイはまた、交差反応性分析物に対してスクリーニ
ングした場合の特異的クローンを同定した。次に、選択した特定分析物で調節さ
れるクローンをさらなる試験のために増殖させた。モノクローナル抗体を含有す
る培養上清を集め、下記の実施例6に記述するようにHITACHI 717 自動分析機(B
oehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,IN)を用いて評価した。
実施例6
プロカインアミドおよびNAPAに関するアッセイ
実施例4で調製した酵素供与体結合体および実施例5にしたがって作成した抗
体を用いて、プロカインアミドおよびNAPAに関するCEDIAアッセイを行った。下
記の試薬を調製した。供与体試薬
:
受容体試薬:
HITACHI 717自動分析機を用いてアッセイを実施した。この装置は、1つのキ
ュベットにNAPAまたはプロカインアミドを含有する3 μlのサンプルを分注し、
そこに200 μlの供与体試薬を加えた。混合物を37℃で5分間インキュベートし
、その後、150 μlの受容体試薬を加えた。受容体試薬の添加後、243.4秒から30
2.75秒にわたって吸光速度を測定した。用いた一次波長は570 nmで、二次波長は
660 nmであった。570 nmにおける吸光速度をプロカインアミドまたはNAPAの濃度
に対してプロットし、用量反応曲線を作成した。得られた曲線を図3および図4
に示す。
実施例7
NAPAおよびプロカインアミドの抗体との交差反応性
各クローンの交差反応性を、実施例6に記述するようにHITACHI 717自動分析
機を用いてアッセイした。下記の分析物および濃度を用いて、各クローンの交差
反応性を試験した:NAPA、50μg/ml;プロカインアミド、50μg/ml;PADE、50μ
g/ml;NAPADE、50μg/ml;p-アミノ安息香酸(PABA)、50μg/ml;およびアセトア
ミノフェン、500μg/ml。上記分析物のそれぞれによってもたらされた速度から
交差反応性パーセントを計算した。そして、見かけ用量を、図3および図4を標
準曲線として用いて決定した。分析物の見かけ用量を実際の用量で割り、100を
乗じたものが交差反応性パーセントである。
実施例6の方法および図3の標準曲線を用いて、クローン13<PA>6の上記物質
との交差反応性を調べた。得られた結果は以下の通りである:
別の例で、クローン24<NAPA>11.1についても、実施例6の方法および図4の標
準曲線を用いて、これらの物質との交差反応性を調べた。以下の結果が得られた
:
明細書および実施例は本発明を説明するものであり、限定するものではないこ
とが理解されるであろう。また、本発明の精神および範囲内にある他の態様が当
業者にはおのずと明らかであることが理解されるであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
A61K 39/395 9284−4C A61K 39/395 D
(72)発明者 ウォルター,チャールズ エフ.
アメリカ合衆国 46032 インディアナ州
カーメル,ウォルター ドライヴ 210
番地
(72)発明者 デュラント,チャールズ イー.
アメリカ合衆国 46268 インディアナ州
インディアナポリス,ウィザリントン
ロード 8047番地
(72)発明者 グランシー,トッド
アメリカ合衆国 46928 インディアナ州
フェアマウント,4240 イー. 1050
エス.
(72)発明者 クライン,フランク イー.
アメリカ合衆国 21921 メリーランド州
エルクトン,メドー クリーク レーン
201番地 アパートメント ビー.
(72)発明者 ドーン,アラン アール.
アメリカ合衆国 46033 インディアナ州
カーメル,ハリソン ドライヴ 13126
番地
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.下記の式で表される化合物: 式中: X=水素またはアセチル; R1=1から3個の炭素原子を有するアルキル基; m=2から10の整数;および R2=2から10個の炭素原子を有するアルキル基、シクロアルキル基また はアリール基。 2.下記の式で表される化合物: 式中: X=水素またはアセチル; R1=1から3個の炭素原子を有するアルキル基; m=2から10の整数; R2=2から10個の炭素原子を有するアルキル基、シクロアルキル基また はアリール基; Z=ポリ(アミノ酸)、多糖または標識物質;および n=1からp、但し、p=ZのMW/1000。 3.Zが免疫原性ポリ(0ミノ酸)または多糖である、請求項2に記載の化合物 。 4.Zが酵素、または酵素供与体ポリペプチドである、請求項2に記載の化合物 。 5.Zがスカシ貝ヘモシアニンである、請求項2に記載の化合物。 6.Zがβ-ガラクトシダーゼの酵素供与体ポリペプチドである、請求項2に記 載の化合物。 7.R1が2個の炭素原子を有するアルキル基である、請求項2に記載の化合物 。 8.mが2である、請求項2に記載の化合物。 9.R2が(CH2)2である、請求項2に記載の化合物。 10.Zが免疫原性ポリ(アミノ酸)または多糖である、請求項2に記載の化合 物への免疫応答により調製される抗体。 11.Xが水素で、かつZが免疫原性ポリ(アミノ酸)または多糖である、請求 項2に記載の化合物への免疫応答により調製される、プロカインアミドに対する 抗体。 12.Xがアセチルで、かつZが免疫原性ポリ(アミノ酸)または多糖である、 請求項2に記載の化合物への免疫応答により調製される、NAPAに対する抗体。 13.PADEに対して約10%未満の交差反応性を有する、プロカインアミドに対 する抗体。 14.NAPADEに対して約10%未満の交差反応性を有する、NAPAに対する抗体。 15.下記の式で表される前駆体化合物を免疫原性ポリ(アミノ酸)または多糖 に結合する工程を含む免疫原の作成方法: 式中: X=水素またはアセチル; R1=1から3個の炭素原子を有するアルキル基; m=2から10の整数;および R2=2から10個の炭素原子を有するアルキル基、シクロアルキル基また はアリール基。 16.免疫原性ポリ(アミノ酸)がスカシ貝ヘモシアニンである、請求項15に 記載の方法。 17.下記の式で表される前駆体化合物を酵素供与体ポリペプチドに結合する工 程を含むハプテン-酵素供与体結合体の作成方法: 式中: X=水素またはアセチル; R1=1から3個の炭素原子を有するアルキル基; m=2から10の整数;および R2=2から10個の炭素原子を有するアルキル基、シクロアルキル基また はアリール基。 18.酵素供与体ポリペプチドがβ-ガラクトシダーゼの酵素供与体ポリペプチ ドである、請求項17に記載の方法。 19.下記の工程を含んでなる、サンプル中のプロカインアミドの測定方法: (a)サンプルを (i)Xが水素で、かつZがβ-ガラクトシダーゼの酵素供与体ポリペ プチドである、請求項2に記載の化合物に基づく酵素供与体ポリペプチド結合体 ; (ii)プロカインアミドに対する抗体の不在下で、該酵素供与体ポリペ プチド結合体とともにβ-ガラクトシダーゼ活性を有する活性な酵素複合体を形 成することを特徴とする酵素受容体ポリペプチド; (iii)該酵素供与体結合体が競合的に結合可能であり、それによって 活性な酵素複合体の形成を抑制する、プロカインアミドに特異的な抗体;および (iv)該活性な酵素複合体による基質の変換率がモニター可能な様式で 該活性な酵素複合体と反応可能な基質、 と接触させ、そして (b)該活性な酵素複合体による該基質の変換率を測定する。 20.プロカインアミドに対する抗体が下記の式で表される化合物への免疫応答 により調製される、請求項19に記載の方法: 式中: X=水素; R1=1から3個の炭素原子を有するアルキル基; m=2から10の整数; R2=2から10個の炭素原子を有するアルキル基、シクロアルキル基また はアリール基; Z=抗原性ポリ(アミノ酸)または多糖;および n=1からp、但し、p=ZのMW/1000。 21.下記の工程を含んでなる、サンプル中のNAPAの測定方法: (a)サンプルを (i)Xがアセチルで、かつZがβ-ガラクトシダーゼの酵素供与体ポ リペプチドである、請求項2に記載の化合物に基づく酵素供与体 ポリペプチド結合体; (ii)NAPAに対する抗体の不在下で、該酵素供与体ポリペプチド結合体 とともにβ-ガラクトシダーゼ活性を有する活性な酵素複合体を形成することを 特徴とする酵素受容体ポリペプチド; (iii)該酵素供与体結合体が競合的に結合可能であり、それによって 活性な酵素複合体の形成を抑制する、NAPAに特異的な抗体;および (iv)該活性な酵素複合体による基質の変換率がモニター可能な様式で 該活性な酵素複合体と反応可能な基質、 と接触させ、そして (b)該活性な酵素複合体による該基質の変換率を測定する。 22.NAPAに対する抗体が下記の式で表される化合物への免疫応答により調製さ れる、請求項21に記載の方法: 式中: X=アセチル; R1=1から3個の炭素原子を有するアルキル基; m=2から10の整数; R2=2から10個の炭素原子を有するアルキル基、シクロアルキル基また はアリール基; 原性ポリ(アミノ酸)または多糖;および n=1からp、但し、p=ZのMW/1000。
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1994
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