JPH09506255A - 核酸の保護方法および分析方法 - Google Patents
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- JPH09506255A JPH09506255A JP7515942A JP51594295A JPH09506255A JP H09506255 A JPH09506255 A JP H09506255A JP 7515942 A JP7515942 A JP 7515942A JP 51594295 A JP51594295 A JP 51594295A JP H09506255 A JPH09506255 A JP H09506255A
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.核酸の特定領域を試薬による攻撃から保護する方法であって、この核酸に配 列特異的にハイブリダイズする核酸類似体とこの核酸との間に複合体を形成させ 、ついで該核酸を核酸攻撃試薬と接触させることを含んでなる方法であり、該複 合体が該出発核酸よりも該試薬による攻撃に対しより安定である方法。 2.該試薬がヌクレアーゼである、請求項1記載の方法。 3.この核酸類似体が、連結バックボーン部分より構成されるバックボーンに結 合したリガンドの配列を含むポリマー鎖を含み、かつ相補的配列の核酸とハイブ リダイズすることができるものである、請求項1又は請求項2記載の方法。 4.該核酸類似体バックボーンがポリアミド、ポリチオアミド、ポリスルフィン アミド又はポリスルホンアミドのバックボーンである、請求項3記載の方法。 5.該連結バックボーン部分がペプチド結合したアミノ酸部分である、請求項4 記載の方法。 6.核酸類似体が相補的配列の核酸とハイブリダイズして、配列上該類似体に対 応する通常のデオキシリボヌクレオチド と該核酸との間のハイブリッドよりも熱変性に対してより安定なハイブリッドを 形成することができるものである、請求項1〜請求項5いずれか1項に記載の方 法。 7.該核酸類似体がそのバックボーンがポリアミドバックボーンであるペプチド 核酸であり、該リガンドが該バックボーン中のアザ窒素原子に直接的又は間接的 に結合しているものであり、そして該リガンドを保持する窒素原子が主として4 〜8個の介入原子により該バックボーン中で相互に隔てられているものである、 請求項1〜請求項6いずれか1項に記載の方法。 8.核酸類似体が一方の鎖が該類似体に相補的な配列を持つ二本鎖核酸にハイブ リダイズして該一方の鎖から他方の鎖を置換することができるものである、請求 項1〜請求項7いずれか1項に記載の方法。 9.核酸類似体が下記一般式1を持つものである、請求項1〜請求項8いずれか 1項に記載の方法、 式中、 nは少なくとも2であり、 L1〜Lnはそれぞれ独立に、水素、水酸基、(C1〜C4)アルカノイル基、天然 に生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基類、芳香族部分、DNAインター カーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分、及びレポーターリガンド類から なる群より選択されるものであり、 C1〜Cnはそれぞれ(CR6R7)yであり、ここでR6は水素であり、R7は天然 に生ずるαアミノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はR6と R7は独立に水素、(C2〜C6)アルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテ ロアリール基、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ基、(C1〜C6)アルキルチオ 基、NR3R4及びSR5からなる群より選択されるものであり、ここでR3とR4 は以下に定義され、R5は水素、(C1〜C6)アルキル基、水酸基、アルコキシ 基、又はアルキルチオ−置換(C1〜C6)アルキル基であり、又はR6とR7は一 緒になって脂環系又は複素環系を作り、 D1〜Dnはそれぞれ、(CR6R7)zであり、ここでR6とR7は上記のように定 義され、 y及びzはそれぞれゼロ又は1〜10の整数であり、y+zの和は2〜10であ り、 G1〜Gn-1はそれぞれ−NR3CO−、−NR3CS−、−NR3SO−、又は− NR3SO2−であり、いずれの方向でもよく、ここでR3は以下に定義され、 A1〜An及びB1〜Bnはそれぞれ以下のものから選択される、 (a)Aは式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)の群であり、かつBはN又はR3N+ であり、又は (b)Aは式(IId)の群であり、かつBはCHであり、 式中、 XはO、S、Se、NR3、CH2又はC(CH3)2であり、 Yは単結合、O、S又はNR4であり、 pとqはそれぞれゼロ又は1〜5の整数であり、p+qの和 は10以下であり、 rとsはそれぞれゼロ又は1〜5の整数であり、r+sの和は10以下であり、 R1とR2はそれぞれ独立に、水素、ヒドロキシ−,アルコキシ−,又はアルキル チオ−で置換されていてもよい(C1〜C4)アルキル基、水酸基、アルコキシ基 、アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり 、そして R3及びR4はそれぞれ独立に、水素、(C1〜C4)アルキル基、ヒドロキシ−, アルコキシ−,アルキルチオ−置換(C1〜C4)アルキル基、水酸基、アルコキ シ基、アルキルチオ基及びアミノ基からなる群から選択されるものであり、 Qは−CO2H、−CONR’R”、−SO3H又は−SO2NR’R”、又は− CO2H又は−SO3Hの活性誘導体、及び Iは−NR’R''であり、ここでR’及びR''は独立に水素、アルキル基、アミ ノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド 、タンパク質、炭水化物、リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、 ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オリゴリボヌクレオチドとオリ ゴデオキシリボヌクレオチドの両者を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオ シド、及び可溶性及び不溶性ポリマーからなる群より選択されるものである。 10.該核酸類似体が一般式III、IV又はVの化合物を含むものである、請求項 9記載の方法、 式中、 Lはそれぞれ独立に水素、フェニル基、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基、及 び天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、 R7はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選 択されるものであり、 nは1より大きな整数であり、 k、1及びmはそれぞれ独立にゼロ又は1〜5の整数であり、 pはそれぞれゼロ又は1であり、 RhはOH、NH2又は−NHLysNH2であり、そして Riは水素又はCOCH3である。 11.核酸試料中に存在するある配列を検出する方法であって、ハイブリダイゼ ーション条件下に、該核酸試料中に存在するときは該配列と配列選択的にハイブ リダイズすることができる核酸類似体に核酸試料を接触させて、該核酸類似体と 該配列を含む該核酸の領域との間に複合体を形成させ、つい で該核酸を、該核酸複合体の該配列が試薬の攻撃から保護されるが該核酸の残り の部分は分解されるような条件の下に、該核酸を分解することができる試薬と接 触させ、そして該複合体の存在を検出することを含む方法。 12.該複合体の存在が、電気泳動における該複合体の泳動と同様の条件下での 該核酸類似体の泳動とを比較することにより検出されるものである、請求項11 記載の方法。 13.核酸類似体が一つ以上の検出可能な標識を保持するものである、請求項1 1又は請求項12記載の方法。 14.該標識が蛍光標識又は放射標識である、請求項11〜請求項13いずれか 1項に記載の方法。 15.核酸の増幅を実施する方法であって、核酸にそれに配列特異的にハイブリ ダイズする核酸類似体をハイブリダイズさせることにより核酸試料中の核酸の特 定領域を保護し、該特定領域を除き試料中の核酸を分解する核酸攻撃試薬に該試 料を接触させ、そして該特定領域を増幅することを含んでなる方法。 16.核酸増幅法による反応産物を作成する方法であって、核酸とそれに配列選 択的にハイブリダイズする核酸類似体との間の複合体の形成により核酸増幅産物 の特定領域を保護し 、ついで該核酸を核酸攻撃試薬に接触させることを含む方法であって、該複合体 が該試薬による攻撃に対しもとの該核酸よりもより安定である方法。 17.保護対象となる該特定領域が該増幅手順の繰り返しに必要な少なくとも1 個のプライマー結合部位をも含まないものである、請求項16記載の方法。 18.核酸類似体が、相補的配列の核酸にハイブリダイズして、配列上該類似体 に対応する通常のデオキシリボヌクレオチドと該核酸との間のハイブリッドより も熱変性に対してより安定なハイブリッドを形成することができるものである、 請求項11〜請求項17いずれか1項に記載の方法。 19.核酸類似体がそのバックボーンがポリアミドバックボーンであるペプチド 核酸であり、該リガンドがそれぞれ直接的に又は間接的に該バックボーン中のア ザ窒素原子に結合しており、そして該リガンドを保持する窒素原子が主として該 バックボーン中で4〜8個の介入原子により相互に隔てられているものである、 請求項11〜請求項18いずれか1項に記載の方法。 20.核酸類似体が一方の鎖が該類似体に相補的な配列を有する二本鎖核酸にハ イブリダイズして、該一方の鎖から他方の鎖を置換することができるものである 、請求項11〜請求 項19いずれか1項に記載の方法。 21.核酸類似体が一般式1を有するものである、請求項11〜請求項20いず れか1項に記載の方法、 式中、 nは少なくとも2であり、 L1〜Lnはそれぞれ独立に、水素、水酸基、(C1〜C4)アルカノイル基、天然 に生ずる核酸塩基類、天然に生じない核酸塩基類、芳香族部分、DNAインター カーレーター類、核酸塩基結合基、複素環部分、及びレポーター類からなる群よ り選択されるものであり、 C1〜Cnはそれぞれ(CR6R7)yであり、ここでR6は水素であり、R7は天然 に生ずるαアミノ酸類の側鎖からなる群より選択されるものであり、又はR6と R7は独立に水素、(C2〜C6)アルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテ ロアリール基、水酸基、(C1〜C6)アルコキシ 基、(C1〜C6)アルキルチオ基、NR3R4及びSR5からなる群より選択され るものであり、ここでR3とR4は以下に定義され、R5は水素、(C1〜C6)ア ルキル基、水酸基、アルコキシ基、又はアルキルチオ−置換(C1〜C6)アルキ ル基であり、又はR6とR7は一緒になって脂環系又は複素環系を作り、 D1〜Dnはそれぞれ、(CR6R7)zであり、ここでR6とR7は上記のように定 義され、 y及びzはそれぞれゼロ又は1〜10の整数であり、y+zの和は2〜10であ り、 G1〜Gn-1はそれぞれ−NR3CO−、−NR3CS−、−NR3SO−、又は− NR3SO2−でありいずれの方向でもよく、ここでR3は以下に定義され、 A1〜An及びB1〜Bnはそれぞれ以下のものから選択される、 (a)Aは式(IIa)、(IIb)、(IIc)又は(IId)の群であり、かつBはN又はR3N+ であり、又は (b)Aは式(IId)の群であり、かつBはCHであり、 式中、 XはO、S、Se、NR3、CH2又はC(CH3)2であり、 Yは単結合、O、S又はNR4であり、 pとqはそれぞれゼロ又は1〜5の整数であり、p+qの和は10以下であり、 rとsはそれぞれゼロ又は1〜5の整数であり、r+sの和は10以下であり、 R1とR2はそれぞれ独立に水素、ヒドロキシ−,アルコキシ−,又はアルキルチ オ−で置換されていてもよい(C1〜C4)アルキル基、水酸基、アルコキシ基、 アルキルチオ基、アミノ基及びハロゲンからなる群より選択されるものであり、 そして R3及びR4はそれぞれ独立に水素、(C1〜C4)アルキル基、ヒドロキシ−,ア ルコキシ−,アルキルチオ−置換(C1〜C4)アルキル基、水酸基、アルコキシ 基、アルキルチオ基及びアミノ基からなる群から選択されるものであり、 Qは−CO2H、−CONR’R”、−SO3H又は−SO2NR’R”、又は− CO2H又は−SO3Hの活性誘導体であり、及び Iは−NR’R''であり、ここでR’及びR''は独立に水素、アルキル基、アミ ノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレーター、ペプチド 、タンパク質、炭水化物、リピド、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、 ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オリゴリボヌクレオチドとオリ ゴデオキシリボヌクレオチドの両者を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオ シド、及び可溶性及び不溶性ポリマーからなる群より選択されるものである。 22.該核酸類似体が一般式III、IV又はVの化合物を含んでなるものである、 請求項21記載の方法、 式中、 Lはそれぞれ独立に水素、フェニル、複素環部分、天然に生ずる核酸塩基、及び 天然に生じない核酸塩基からなる群より選択されるものであり、 R7はそれぞれ独立に水素及び天然に生ずるαアミノ酸の側鎖からなる群より選 択されるものであり、 nは1より大きな整数であり、 k、1及びmはそれぞれ独立にゼロ又は1〜5の整数であり、 pはそれぞれゼロ又は1であり、 RhはOH、NH2又は−NHLysNH2であり、そして Riは水素又はCOCH3である。 23.実施例3で実質的に既に記述したようにして核酸配列を検出する方法。 24.実施例3又は実施例4又は実施例5で実質的に既に記述したようにして、 攻撃試薬による消化から核酸を保護する方法。 25.実施例5で既に実質的に記述したようにして配列変異を検出する方法。
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