JPH09504949A

JPH09504949A - 関節炎症状の治療のための方法および剤

Info

Publication number: JPH09504949A
Application number: JP7514069A
Authority: JP
Inventors: ドレーパー、ケニス・ジー; パブコ、パメラ; マッスウィッゲン、ジェームズ; ガストフソン、ジョン
Original assignee: リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1993-11-12
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 1997-05-20
Also published as: AU1097395A; WO1995013380A2; EP0728205A1; EP0728205B1; WO1995013380A3; DE69431564D1; AU704687B2; CA2175824A1; ATE226254T1

Abstract

(57)【要約】関節炎症状の発症または持続に関与するmRNAを切断する酵素的RNA分子。

Description

【発明の詳細な説明】関節炎症状の治療のための方法および剤発明の背景本出願は1992年12月7日に出願されたDraperの「関節炎症状の治療のための方法および剤」の継続出願であり、上記前出願の開示全体は、参考のために本明細書に組み込まれる。本発明は、骨関節炎の抑制、特に、マトリックス金属プロテイナーゼによる細胞外マトリックスの分解を減少または排除するような遺伝子発現の抑制のための方法に関する。関節炎には幾つかの種類があるが、骨関節炎および関節リューマチが主なものである。骨関節炎は肋軟骨下骨の増殖および変形を伴う関節軟骨の変性により特徴づけられる緩やかに進行する疾患である。臨床像として疼痛、変形および関節運動の損失を伴う。関節リューマチは慢性の全身性炎症性疾患である。関節リューマチは軽度で再発性のものか、または、重度で進行性のものであり、関節の変形と運動障害をもたらす。関節炎は高齢者集団における機能障害の主要な要因である。運動不能の主要な原因であり、高齢者の入院および医療処置のための出費の大部分に相当する。関節炎は、55歳以上の患者約100万人で全身障害の第１の原因であると推定されており、約100万人以上で重要な要因となっていると考えられている。骨関節炎の発生率を推定することは幾つかの理由のために困難である。第１に、骨関節炎は放射線撮影図に基づいて他覚的に診断されるが、放射線学的な疾患の兆候を有する者の多くは著明な症状を有していない。第２に、全ての患部関節の放射線撮影データが無いため、罹患の推定は臨床的評価に基づくものとなっている。1989年のNHANESI調査では、データは脊柱関節、膝関節、腰関節および末梢関節の異常が認められた期間の完全な骨格評価並びにその他の特定の診断に基づいたものであった。これらの観察結果によれば、米国の25〜74歳の人工の12％が骨関節炎を有している。一般的に、関節リューマチは世界中に分布しており、全ての人種および民族群に発症していると考えられている。米国における厳密な罹患率は不明であるが、 0.5%〜1.5%の範囲であると推定されている。関節リューマチは全ての年齢層で発症し、一般的に年齢と共に罹患率が増大する。女性の罹患率は男性の２〜３倍であり最大発症率は40〜60歳にある。免疫学的要因の他に、環境上、職業上および心理社会的な要因の疾患における潜在的病因論的役割について研究されている。多細胞性物の細胞外マトリックスは、組織の形成と維持に重要な役割を果たしている。細胞外マトリックスのメッシュワークは細胞の堆積場所となり、細胞の付着および移行のための枠組み、並びに、細胞-細胞連絡における透過性障壁として機能する。正常な生育および発達の間、または病的条件下における結合組織のターンオーバーは完全な活性を示すためにはカルシウムを必要とする亜鉛含有酵素である中性金属プロテイナーゼの一群により媒介されていると考えられている。金属プロテイナーゼの発現の調節は、細胞型特異的であり、種内でも変化する。最も良く特性化されたマトリックス金属プロテイナーゼである、間質性コラゲナーゼ(MMP-1)は、コラーゲンのI，IIおよびII型に特異的である。MMP-1は三重らせんの三つのα鎖全てを、間質性コラーゲンの連続的分解が開始される単一の位置で切断する。間質性コラゲナーゼ活性は、炎症性関節炎を有する患者のリューマチ性滑膜細胞並びに滑液に観察されている。ゼラチナーゼ(MMP-2)は、２つの異なる遺伝子産物、即ちほとんどの結合組織細胞により発現される70kDaのゼラチナーゼおよび炎症性食細胞および腫瘍細胞により発現される92kDaのゼラチナーゼよりなる金属プロテイナーゼのサブグループを構成する。大型の酵素はマクロファージ、SV-40形質転換腺維芽細胞および好中球により発現される。小型の酵素はH-ras形質転換気管支上皮細胞および腫瘍細胞並びに正常なヒト皮膚腺維芽細胞により分泌される。これらの酵素はゼラチン（変性コラーゲン）並びに天然型のXI型コラーゲンを分解する。ストロメリシン(MMP-3)は細胞外マトリックスを構成する分子に対し広い作用スペクトルを有する。これはプロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、IVおよびIX型コラーゲンおよびゼラチンを消化し、プロコラーゲンからN末端ブロペプチド領域を除去することができ、これにより、コラゲナーゼを活性化させる。これはヒト軟骨抽出液、リューマチ性滑膜細胞、および、コラーゲン誘発関節炎ラットの関節の滑膜および軟骨細胞中に認められている。骨関節炎および関節リューマチは共に、これらの疾患で認められる細胞外マトリックス破壊に関与するマトリックス金属プロテイナーゼのサイトカインまたは生育因子誘発性の合成を抑制する化合物により主に治療される。現在の臨床的治療はデキサメタゾンおよびレチノイド化合物に依存しており、これらの物質は種々の金属プロテイナーゼの強力な抑制剤である。デキサメタゾンとレチノイドの投与は、投与細胞における遺伝子発現に対して全般的作用があるため、特に長期治療のための代替療法の開発が望まれている。最近、ガンマインターフェロンが培養マクロファージにおけるリポ多糖類誘発性のコラゲナーゼおよびストロメリシンの生産を抑制することが解った。また、組織生育β因子(TGF-β)はインビトロでストロメリシン合成の表皮生育因子(EGF)誘導をブロックすることが解った。遺伝子療法の試みの関与する実験的方法では、金属プロテイナーゼ阻害剤TIMP -1およびTIMP-2の制御発現が行われている。これら最後の３つの試みのうち、ガンマインターフェロン療法のみが現在臨床適用可能である。発明の要旨出願人は、関節の滑膜におけるコラゲナーゼおよびストロメリシンの生産の抑制は、リボザイムおよびアンチセンス分子を用いることにより達成できることを発見した。リボザイム療法は、既存の組織損傷に反応する免疫細胞を主な標的とする現在の治療方法の併用療法となりえる。コラゲナーゼまたはストロメリシンにより誘発される損傷を低減する早期のリボザイム療法およびアンチセンス療法に引き続き、抗炎症剤またはレチノイド類による治療を必要に応じて行なうことができる。この方法により、プロテイナーゼの発現は転写および翻訳の段階で制御することができる。リボザイム療法またはアンチセンス療法は、臨床症状の発現の前に骨関節炎の放射線学的兆候を示した患者に対して行なうことができる。リボザイム療法またはアンチセンス療法は、レチノイド類やデキサメアゾンによる治療に伴う遺伝子発現に対する非特異的作用を誘発することなく、ストロメリシンの発現に影響を与えることができる。ストロメリシンがプロコラゲナーゼを活性化させる能力を有するということは、ストロメリシン発現を低下させるリボザイムまたはアンチセンス分子を更に骨関節炎（主にストロメリシンの関与する疾患である）および関節リューマチ（主にコラゲナーゼ活性亢進に関連する）の両方の治療に用いることができることを示している。多数のサイトカイン類および生育因子が創傷治癒および前骨関節炎症状の組織損傷の過程で金属プロテイナーゼ活性を誘発するが、これらの分子は、治療介入の好ましい標的ではない。治療の前に殆どの患者が放射線学的または臨床的な症状を示すため、細胞外マトリックスの破壊に関与する分子を抑制することが最も重要である。最も好都合な金属プロテイナーゼ（調節されない場合に細胞外マトリックスの殆どの構造の損傷をもたらすことのできる分子）はストロメリシンである。更に、この分子はプロコラゲナーゼを活性化し、これが次に細胞外マトリックスのコラーゲン骨格の損傷を更に誘発するのである。正常な条件下では、プロストロメリシンから活性ストロメリシンへの変換は、TIMP(MMPの組織抑制剤) と称される阻害剤の存在により調節される。滑膜細胞中のTIMPの濃度はプロストロメリシンの濃度より高く、ストロメリシン活性は一般的に非関節炎組織の滑液には存在しないため、非標的細胞においてストロメリシン活性を阻害するという毒性作用は無視できるものとなる。即ち、本発明の特徴は、例えば、滑膜細胞中のプロストロメリシンの合成を阻害するか、または、その他のマトリックス金属プロテイナーゼを阻害することにより、関節炎、特に、骨関節炎を治療または防止するために、リボザイムまたはアンチセンス分子を提供することである。マクロファージ、好中球および滑膜細胞中に発現する標的mRNA(ストロメリシン1,2および3およびコラゲナーゼを含むストロメリシンmRNA)の切断は、ストロメリシンの酵素前駆体型であるプロストロメリシンの合成を抑制する。当業者の知るとおり、上記したその他の潜在的標的もリボザイムによる治療に適し、コラゲナーゼやゼラチナーゼ金属プロテイナーゼ、滑液または軟骨細胞内の金属プロテイナーゼの前酵素型を活性化できるその他のプロテイナーゼ、金属プロテイナーゼの発現を活性化させるサイトカインまたは生育因子、およびマクロファージや好中球を組織傷害領域に誘引する付着分子のような細胞外マトリックスの病的分解の危険性や発生率を低下させる。リボザイムはヌクレオチド塩基配列特異的方法で他の別のRNA分子をくり返し切断することのできる酵素活性を有するRNA分子である。このような酵素RNA分子は実質的に全てのRNA転写物を標的とさせることができるとされており、インビトロで効果的な切断が達成されている(Kim等，84 Proc.Nat.Acad.of Sci．USA 8 788，1987；HaseloffおよびGerlach，334 Nature 585，1988；Cech，260 JAMA 3 030，1988;およびJefferies等，17 Nucleic Acid Research 1372，1989)。リボザイムはまず標的RNAに結合することにより作用する。このような結合は、標的RNAを切断する作用を有するRNAの酵素部分に近接して存在するリボザイムの標的RNA結合部分を介して起こる。即ち、リボザイムはまず相補塩基対を介して標的RNAを認識し、次いでこれと結合し、そして、一旦正しい部位に結合した後は、酵素的に作用して標的RNAを切断するのである。このような標的RNAの戦略的切断により、コードするタンパク質の合成を指揮するその能力は破壊される。リボザイムは、そのRNA標的に結合してこれを分解した後、RNAから遊離することにより更に標的を捜索し、くり返し新しい標的に結合して切断することができるのである。リボザイムの酵素的性質は、治療効果を示すために必要なリボザイムの有効濃度がアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度よりも低いため、アンチセンス法（核酸分子が単に核酸標的に結合してその翻訳をブロックする）のようなその他の方法よりも有利である。この利点はリボザイムが酵素的に作用する能力を反映している。即ち、単一のリボチー、ウ文した標的RNAの多数の分子を切断できる。更に、リボザイムは特異性の高い抑制剤であり、抑制の特異性は、結合の塩基対形成機序のみならず、結合相手のRNAの発現を分子が抑制する機序によっても変化する。即ち、抑制はRNA標的の切断により起り、このため、特異性は、非標的R NAの切断率に対する標的RNAの切断率の比として定義される。この切断機序は塩基対形成に関与する因子に以外の因子にも依存している。即ち、リボザイムの作用の特異性は、同じRNA部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性よりも高い。この種の物質は、意図する標的mRNAの切断に関して高い特異性を示す。その結果、リボザイム剤は特定の遺伝子を発現している細胞のみに作用し、正常な組織には非毒性となるのである。本発明は金属プロテイナーゼ活性化により媒介される骨関節炎またはその他の病理学的症状を治療したり（予防的に）防止したりする際に用いることができる。好ましい投与方法はストロメリシン活性の水準を低下させるためのインビボの投与である。即ち、第１の特徴において、本発明は、関節炎症状の発症または持続に関与するmRNA、例えばストロメリシンをコードするmRNA、特に、ハンマーヘッドとヘアピン標的部位の両方を含む、後に示す表中に開示されるmRNA標的を切断する酵素 RNA分子（即ちリボザイム）を利用する。何れの場合においても、その部位は適切な基質結合アーム部を合成する領域と平行になっており、本明細書に記載し、当該分野でも知られている方法で、酵素活性を得るために適切なハンマーヘッドまたはヘアピンモチーフを付加することができる。例えば、図１を参照し、アーム部IおよびIIIを修飾して特異的な基質結合アーム部を形成し、アーム部IIは本質的に示した状態のままとする。「酵素RNA分子」という表現は、特定のmRNA標的に対する基質結合領域において相補性を有し、そのmRNAを特異的に切断する酵素活性を有するするようなRNA 分子を指す。即ち、酵素RNA分子はmRNAを分子間分解することができ、これにより標的mRNA分子を不活性化する。この相補性機能により、標的RNAへの酵素RNA分子の十分なハイブリダイゼーションが可能となり、切断が可能になる。100%の相補性が好ましいが、50〜75%の相補性でも本発明では有用である。インビボの治療のためには、30〜45塩基の相補性が好ましいが、より少ない数も使用することができる。好ましい実施態様においては、酵素RNA分子はハンマーヘッドモチーフに形成するが、ヘアピン、δ型肝炎ウィルス、I群イントロンまたはRNAseP-様RNA(RNA ガイド配列の場合）のモチーフに形成してもよい。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Rossi等，8 Aids Research and Human Retroviruses 183，1992 に、ヘパリンモチーフの例は、Hampel等の1988年9月20日出願の米国特許出願07/ 247,100号の継続出願である1989年9月20日出願の"RNA Catalyst for Cleaving S pecific RNA Sequences";Hampel およびTritz，28 Biochemistry 4929m 1989;およびHampel等，18 Nucleic Acids Research 299，1990に、そして、δ型肝炎ウィルスモチーフの例は、PerrottaおよびBeen，31 Biochemistry 16，1992に、RN AsePモチーフはGuerrier-Takada等の35 Cell 849，1983、そして、I群イントロンはCech等の米国特許4,987,071号に記載されている。これら全ての文献は参考のために本明細書に組み込まれる。これらの特定のモチーフは本発明を限定するものではなく、当該分野の技術者は、本発明の酵素RNA分子において重要な点は、標的遺伝子RNA領域の１つ以上に対して相補的な特異的基質結合部位を有し、そして、その基質結合部位の内部または周囲に、分子にRNA切断活性を付与するようなヌクレオチド配列を有するという点である。第２の特徴において、本発明は、上記した酵素RNA分子を含む哺乳類細胞を提供する。好ましくは哺乳類細胞はヒト細胞である。第３の特徴において、本発明は、例えば哺乳類細胞内部で上記した酵素RNA分子の発現を可能にするような状態でベクター内に位置する酵素RNA分子をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。第４の特徴において、本発明は、上記した酵素RNA分子を患者に投与することにより、関節炎症状を治療するための方法を提供する。本発明は関節炎症状の起因物質であるmRNAに対する高い特異性を示す一群の化学切断剤を与える。このような酵素RNA分子は感染細胞に対し、内因物質として、または外因物質として供給することができる。好ましいハンマーヘッドモチーフにおいては、小型（40ヌクレオチド未満、好ましくは32〜36ヌクレオチドの長さ）の分子を用いた場合に治療費用を低減できる。今日まで報告されている治療のために供給された１つのリボザイム(Rossi等， 1992、上記)は142ヌクレオチドの長さを有するインビトロ転写物である。長さが100ヌクレオチドより長いリボザイムの合成は、自動的合成方法では極めて困難であり、このような分子の治療費用は極端に高い。発現ベクターを用いたリボザイムの供給はエキソビボの治療を用いた場合のみ基本的に可能である。このためこの方法の用途は限られている。本発明においては、代替法としてより小型のリボザイムモチーフ（例えば図１に一般的に示したハンマーヘッド構造のもの）および外因物質としての供給方法を用いる。これらの分子は単純な構造を有しているため、リボザイムがmRNA構造の標的領域に侵入する能力が増大する。即ち、より長い転写物内にハンマーヘッド構造が含まれるような情況とは異なり、リボザイム構造の正しい屈曲構造やmRNA標的へのリボザイムの相補結合に影響するような非リボザイム平行配列は無い。本発明の酵素RNA分子は、関節炎症状または前関節炎症状を治療するために用いることができる。このような治療はまた、非ヒト霊長類におけるその他の関連遺伝子にも適用できる。対象となる動物を関節炎の危険性が発見された時点で、または予防的に治療することができる。この治療のタイミングが更に関節炎による損傷が生じる機会を低減する。本発明のリボザイムは疾患を有する細胞内の遺伝子の変動や突然変異を調べる診断手段として使用してよい。リボザイム活性と標的RNAの構造との間には緊密な関連性があるため標的RNAの塩基対形成および三次元構造を変化させるような分子の領域における突然変異の検出が可能になる。本発明に記載した複数のリボザイムを用いることにより、RNA構造にとって重要で、インビトロ並びに細胞および組織において機能するような核酸の変化をマッピングすることができる。リボザイムによる標的RNAの切断は、疾患の進行における遺伝子の発現を抑制し、特定の遺伝子産物の（本質的な）役割を定義するために用いてよい。この方法により、その他の遺伝子標的を疾患の重要な媒介物質として定義する。これらの実験は複合療法（例えば種々の遺伝子を標的とした複数のリボザイム、既知の小型分子阻害剤と結合させたリボザイム、またはリボザイムおよび/またはその他の化学的または生物学的分子の組合わせを用いた間欠的治療）の可能性を与えるため、疾患の進行に対してさらに良好な対処が可能になる。本発明のリボザイムおよびアンチセンス分子のその他のインビトロの用途は、当該分野で良く知られており、関節炎症状に関るmRNAの存在の検出を含む。このようなRNAは標準的な方法を用いたリボザイムによる治療の後に切断産物の存在を測定することにより、検出する。本発明のその他の特徴および利点は、以下の好ましい実施態様の記載および請求項から明らかとなる。好ましい実施態様の記載図面について初めに簡単に説明する。図面図１は標的領域との相互作用を示す幹部I，IIIおよびIII(それぞれ、(I)，(II )および(III)と標示)を現したハンマーヘッドモチーフリボザイムのダイアグラム説明図である。リボザイムと標的の両方の5'および3'末端を示す。ダッシュは塩基対ヌクレオチドを示す。標的部位二種類のコンピューター方法を用いて標的部位の同定と活性リボザイムの設計を行なうことができる。まず、DNA/RNA配列分析ソフトウエアを用いてリボザイム切断に必要な配列モチーフを同定し、最も広い使用可能な標的領域を有するリボザイムを設計することができるように、異なる標的生物源間の配列保存を探す。二番目に、リボザイム切断前に組合わせが成功すると考えられるリボザイムと標的部位の組み合わせを探すために、RNA屈曲アルゴリズムを用いてリボザイムおよび標的RNAの両方の二次構造を予測する。RNA屈曲アルゴリズムは短いRNA二重鎖に対する測定から得られた一連の熱力学的パラメーターを利用しており、これらの規則を用いた場合、高度な構造を有するRNAの小さいセットの二次構造の予測は合理的に行なうことができるが、メッセンジャ−RNAの構造の予測のためには、未確認の部分が大きい。現在、５種類のリボザイムが発見されている。これらのリボザイムのうち最も大きいもの(I群イントロンおよびRNAse P RNA)は200〜1000を超えるヌクレオチドの配列(70kD〜350kD以上)を有しており、屈曲構造により、複雑な２次および３次構造を形成する。より小さいリボザイムモチーフ(ハンマーヘッド、ヘアピンおよびHDV)は60ヌクレオチド以下(<21 kD)よりなり、その結果、屈曲により形成される構造の複雑さはより少ない。本開示は小型で構造が明らかにされているという理由からハンマーヘッドリボザイムの標的設定に注目した(図1)。本明細書に記載した一般的方法は、その他のリボザイムによる標的設定にも適用できると考えなければならない。ハンマーヘッドリボザイムモチーフを図１に示す。リボザイムと基質の複合体は中央のコア領域を包囲する３塩基対のらせん構造よりなる。中央コア内のヌクレオチドの大部分は固定されており（ボックス配列）、これらのヌクレオチドの配列が変るとリボザイム切断活性は劇的に低下する(Ruffner等，29 Biochem 106 95，1990)。２塩基対閉鎖幹部IIおよびIIIを除き、３幹部領域内の配列は任意であり、唯一の条件は幹部が形成可能であるという点である。図１はヘアピンループを形成する分子内塩基対形成相互作用により形成された幹部II示す。他の２つの幹部は２つの異なるRNAの間の塩基対形成により形成される。これらの３つの幹部領域の何れも、あるいは全てが、分子内または分子間の塩基対形成相互作用により形成することができる。幹部の２つが相互に連結されている場合は、リボザイム切断反応は分子内（シス切断）反応となる。図１に示す配置は、固定（ボックス）配列の大部分を構造のリボザイム部分に有するトランス切断（分子間）リボザイムを与えるものである。即ち、標的RNAはウリジンヌクレオチド(U)とそれに続くグアノシンを除く何れかの塩基よりなる一次配列を必要とするのみであり、ここで、Hはアデノシン(A)、シチジン(C)またはウリジン(U)を示す。４種類の塩基全てがランダムに分布しているmRNA分子においてはUH配列は平均で５〜６ヌクレオチドおきに存在すると予測される。 UH−次配列の他に、標的部位は適切に設計されたハンマーヘッドリボザイムの結合のプロモーターとなる平行配列を有さなければならない。リボザイムとその認識標的部位との会合が成功するかどうかは主に、(I)標的部位へのリボザイムの結合自由エネルギー、(II)競合自己構造が形成されるように屈曲するリボザイムの傾向、および(III)競合自己構造が形成されるように屈曲する標的RNAの傾向の３つの点に依存している（更にRMA結合タンパク質は細胞内のリボザイムの結合に影響する傾向がある）。標的部位へのリボザイムの結合自由エネルギーは標的結合領域の長さ(図１の幹部IおよびIII)が増加するに従って増大するが、競合自己構造の形成の可能性も増大させる。図１に示すとおり、ハンマーヘッドリボザイムのみが屈曲して標的配列に容易に結合する２つの一重鎖アーム部を有する単一のヘアピンループを形成しなければならない。リボザイムの望ましくない代替屈曲の可能性を低減するか回避するための多くの方法がある。望ましくない代替屈曲を回避するための１つの方法は、単に同じ標的RNA分子上の異なる部位に標的設定したリボザイムに着目すればよい。殆の標的RNAは潜在的なリボザイム切断部位（必要とされるUH配列を含む配列）を多数有している。ある程度までは、正確に屈曲しなかったリボザイムを単に棄てて、標的リボザイムが正確に屈曲したと予測される部位が選択されるようにすればよい。あるリボザイムにおいて、望ましくない構造を少なくしたり排除することは、リボザイムの非保存部分を再設計することにより達成できる。前に記載したとおり、図１の非ボックスヌクレオチドは一般的にリボザイム活性に影響を与えることなく変化させることができる。形態が維持される限り、３つの幹部全てを変えることができる。更に、中央コア内の単一のヌクレオチドを変えることもできる。幹部IIの配列または基質結合アーム部(図１の幹部IおよびIII)の長さを変えることは、リボザイムの予測構造を変えるための２通りの基本的な手段である。基質結合アーム部の長さを変化させることは、リボザイムと標的との間の結合自由エネルギーを変化させることになる。即ち、標的とリボザイムとの間の最も安定な構造の予測も検討しなければならない。二つの未結合のRNA分子を共に屈曲させてその状態で分析することができるような屈曲アルゴリズムは存在しない。そのようなアルゴリズムが存在した場合、構造の分析は２つのRNAの配列の他にそれらの濃度にも依存すると考えられる。この問題の暫定的な解決法は、リボザイムを人工的に相補「標的」配列に結合させ、組合わせられた配列に対して屈曲分析を実施することである。 RNA分子の大きさが増大するに従って、構造の予測は更に困難になる。これには多くの理由がある。第１に、最近傍塩基対形成自由エネルギーの推定は、単純なオリゴヌクレオチド二重鎖において5〜10%の不確実性を有しており、これらの不確実性は、塩基対数の増大に従って倍加する。第２に、重複側鎖ループのようなより複雑な構造の自由エネルギーは実験的に十分定義されておらず、最近傍モデルの付加性の推定に厳密にはあてはまらないと考えられる。第３に、メッセンジャ−RNAの殆の部分は、１つの独特な構造に対して進化論的に選択することはできない。代替構造の全体のセットは相互に平衡状態にある。即ち、現在の自由エネルギー最小化アルゴリズムは、一部のRNA分子(rRNA，tRNA，Ｉ群イントロンなど)の構造を実験的に決定するための適当な出発点となるものの、あるmRNAは同じ自由エネルギーを有する異なる構造の分子の一群として存在すると考えられる。最後に、長鎖のRNAは屈曲して全般的自由エネルギー最小値に到達できないように運動上ブロックされた局所的に安定な構造となる場合がある。そのような場合、全般的自由エネルギー最小値に基づいた構造の予測は、生物学的に妥当な構造を見失う場合がある。接触可能な部位の推定で重要な点は、ある標的mRNAに対する単一の屈曲構造を同定することではない。むしろ、この研究の目的は、２つの部位または領域の間の特定の塩基対形成相互作用を発見することではなく、ある非対（または実質的に非対の）部位がRNA分子内のリボザイム標的である可能性を評価することである。非対の塩基を有するには１つの場合しか存在しないが屈曲構造でその塩基と対を形成するには多数の場合があるため、構造を有さない部位は予測が容易であると考えられる。熱力学的パラメータの不明瞭さ、および、各mRNAが一群の異なる屈曲構造として存在する可能性は、接触可能な部位の評価のための推計学的な方法が適切であることを示唆している。出発点として、mRNAの接触可能性の２つの尺度を調べ、実験的に求められた値と比較する。全般的接触可能性は、全体最小自由エネルギー屈曲に基づいた標的部位の平均接触可能性を計算したものである。RNA分子全体を１回屈曲させ、１セットの100 〜200の最適および非最適構造を最小自由エネルギーの5〜10%内で決定する。同じ構造は集団から除外することにより、代替屈曲構造の間には特定の数の構造上の差異があるようにする（距離パラメータの説明を参照、Zuker，244 Science 4 8，1989）。各構造について、非対塩基の数を、配列内の各潜在的リボザイム(UH )切断部位の周囲の領域について表化する。各部位の周囲の領域の大きさは、その部位に対して設計されたリボザイムにより決定される。これらの最初の研究のためには15ヌクレオチドの部位の大きさを選択した。全般的接触可能性は、所定の（15ヌクレオチドの）標的配列内の非対ヌクレオチドの数を表化し、次に、標的部位の全長に渡る、そして、屈曲構造の群全体に渡る非対ヌクレオチドの平均数を求めることにより計算する。高い評点(最高100%)は対象となる部位内の塩基がある所定の時点において非対である可能性が高いことを示す。計算された平均の接触可能性は代替屈曲構造の間の構造上の差（即ち、距離パラメーターの変化）の程度および分析した非最適構造の数（データ示さず）とは概して無関係である。局所安定性は、考えられる配列の局所捕獲を模式化する局所屈曲構造の能力を計算したものである。重複RNA断片（30〜50ヌクレオチド）をエネルギー最小化により屈曲させ、各断片の最小自由エネルギーを表化する。長さNのRNAに対し、長さnのRNA断片(N-n+1)個が存在する。各断片の相対的局所安定性は、そのエネルギーを他のRNAの屈曲断片全ての平均のエネルギーと比較することにより計算する（即ち、安定性評点=(E_i-E_ab)σ_db，ただし式中E_iは断片iのエネルギーであり、E_abは配列内の全ての断片の平均のエネルギーであり、そしてσ_dbは自由エネルギー分布の標準偏差である）。E_iがE_abより大きい場合、評点は正の数であり、断片iは不安定であり、平均的屈曲断片と比較してより容易に分解すると考えられる。標的RNAが屈曲して極めて安定な構造になると予測される場合、高い安定性評点を有する領域を分解開放するのはなお比較的困難であると考えられる。即ち、断片当たり実際のエネルギーは安定性評点とは別に検討しなければならない。RNA断片の大きさ(30〜50ヌクレオチド)を選択することにより、比較的大きい局所構造（例えば12〜23塩基対の幹部ループ）に適合できると同時に、標的部位の周囲の構造を実際に反映するのに十分小さい断片としておくことができる。関節炎疾患に関るmRNAのリボザイム標的選択領域はRNAの翻訳を好ましく抑制するような方法で標的RNAを切断するように選択する。翻訳の抑制が例えば必要なタンパク質の生産を抑制するなどして細胞の複製を好ましく抑制するか、または例えばストロメリシンのような望ましくないタンパク質の生産を防止するように遺伝子を選択する。mRNAのこれらの厳密な領域内の有効な標的部位の選択には、種々のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションのための標的 RNAの接触可能性の試験が含まれる。これらの研究は、RNAまたはDNAプローブを用いて、RNAseHを用いてハイブリッド分子を切断することにより接触可能性を検定することにより実施できる(後記および、1992年５月14日出願のMcSwiggenの米国特許出願07/884,073号「Assay for Ribozyme Target Site Accessibility」参照，この出願の記載内容は参考のために本明細書に組み込まれる）。あるいは、このような研究では、mRNAの二次構造予測に基づいて設計されたリボザイムプローブを用いることができ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により切断産物を測定することにより、切断された分子および切断されない分子の存在を検出する。以下に記載するものは、適当な標的部位を同定することのできる方法の一例であり、本発明を限定するものではない。一般的に、本方法では、ハンマーヘッドリボザイムの潜在的切断部位を同定し、次にこれらの部位の各々を試験して、二次構造形成が最小限であることを確認することにより、標的としての適性を決定する。 mRNA配列を適切な標的領域において比較する。推定リボザイム切断部位を発見する。これらの部位がこれらの標的mRNA内でのハンマーヘッドリボザイム切断のための好ましい部位となる。表１はハンマーヘッドリボザイムに関するこのような部位の例を示したものである。 mRNA部位の各々に相当する短いRNA基質を設計する。各基質は相当するリボザイム認識領域と塩基対を形成しないヌクレオチド２〜３個を5'および3'末端に有する。非対領域はリボザイム中の相補アーム部を設計する相手となる12〜14個のヌクレオチドの中央領域と平行している。各基質配列の構造はPC屈曲コンピュータープログラムを用いて予測する。正の結合自由エネルギーを与えるような配列が許容される。負の自由エネルギーを与えるような配列は各末端から１〜２個の塩基を除去することにより修飾する。修飾された配列がなお強力な二次結合を有すると予測される場合は、それらを除外する。基質を選択した後、各RNA基質に対してリボザイムを設計する。リボザイムの屈曲もまた、当該分野で良く知られているPC屈曲またはムルフォールド（Mullfo ld）を用いて分析する。ハンマーヘッドモチーフ幹部II(図1参照)領域を形成し、分子内塩基対形成を行わない平行アーム部（幹部IおよびIII）を含むようなリボザイム分子を探す。リボザイム末端から塩基対を除去することにより、または、別の塩基対を幹部II に導入することによりリボザイムを修飾し、所望の屈曲としている場合が多い。正しくない屈曲を有するリボザイムは除外する。基質/リボザイム対が正しい分子内構造を有することが判明した後、分子を共に屈曲させて分子間そうごさようを予測する。代表的なリボザイムとその認識標的配列に対するその配位塩基対形成の模式図を図１に示す。リボヌクレアーゼH検定（後述）においてリボザイム標的として有用であると考えられるような標的を試験することにより核酸プローブへの接触可能性を測定することができる。この検定方法では、リボザイムを合成することなく標的部位の使用についてを迅速に試験することができる。リボザイムの攻撃に最も適する部位を選別するために用いることができる。リボザイムの合成本発明で有用なリボザイムはCechの方法(前述)による遺伝子転写により、または、化学合成により作成できる。RNAの化学合成は、DNAの合成と同様である。しかしながら、RNAには更に2'-OH基が存在し、これは、選択的3'-5'ヌクレオチド間結合形成および塩基の存在下のRNAの易分解性に対応するために、異なる保護基の使用が必要となる。2'ヒドロキシルの保護のためにt-ブチルジメチルシリル基を利用した最近開発されたRNA合成方法はリボザイム合成のためのもっとも信頼できる方法である。この方法は再現性が高いため、正確な3'-5'ヌクレオチド間結合を有するRNAが得られ、平均カップリング収率は99%を超えており、僅か２段階の重合体脱保護を要するのみである。ホスホロアミダイトのH-ホスホネート化学に基づく方法は、ホスホロアミダイト化学に基づく方法よりも比較的低いカップリング効率を示す。これもまたDNA 合成の問題点である。自動オリゴヌクレオチド合成のスケールアップのための確実な方法が、最近H-ホスホネートに関して報告されている。適切なカップリング時間に更に「誤」配列のキャッピングを組合わせることにより、カップリング段階で僅か２当量の単量体を用いて14μモル程度の規模のオリゴヌクレオチド合成を高収率で行なうことができた。その他の代替法では、従来の固体支持体の替わりに、可溶性重合体支持体（例えばポリエチレングリコール）を用いる。この方法では、カップリング段階で約３当量の単量体を用いてバッチ当たり100ミリグラムの量で短いオリゴヌクレオチドを得ることができる。リボザイム構造の種々の修飾を行なうことによりリボザイムの用途を拡張することができる。このような修飾は、棚安定性、インビトロ半減期、安定性を向上させ、そして、例えば細胞膜の透過性を増大させるなどしてリボザイムの標的部位への導入を更に容易にし、標的細胞を認識して結合する能力を与える。リボザイムの外来物質としての供給は、例えば細胞膜を通過して拡散することを容易にするために還元されるリボザイム分子の全体的負電荷による、骨格の化学修飾を利用したものである。オリゴヌクレオチドの電荷を還元するための現在の方法には、メチルホスホネートによるヌクレオチド間の結合の修飾、ホスホロアミダイトの使用、正電荷を有する分子へのオリゴヌクレオチドの連結、およびオリゴヌクレオチド、脂質および標的細胞に対する特定の受容体またはエフェクターよりなる複合パッケージの形成が含まれる。このような修飾の例には、RNA 内のヌクレオチド間結合としてホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートを含むイオウ含有リボザイムが含まれる。このようなイオウ修飾リボの合成は、イオウ伝達試薬、³H-1,2-ベンゼンジチオル-3-オン1,1-ジオキシドの使用により行なうことができる。リボザイムはまた、リボース修飾リボヌクレオチドを含有してもよい。ピリミジン類縁体は原料試薬として３フッ化ジエチルアミノイオウ (DAST)を用いた方法によりウリジンから調製される。リボザイムはまた、電荷の還元を目的として重合体カチオンに、静電気的にまたは共有結合的に連結できる。重合体は末端2',3'-シスジオール系の化ヨウ素酸塩切断により得られるリボヌクレオシドジアルデヒドに3'末端を単に変換することにより、リボザイムに連結できる。デリバリーシステムの特定の条件に応じて、その他の考えられる修飾として、カルボキシル、アミノまたはチオール官能基を有する種々のリンカーアーム部が挙げられる。更に別の例として、メチルホスホネートおよび2'-0-メチルリボースの使用、および5'または3'キャッピングまたはm₇GpppGまたはm₃ ²²⁷Gppp Gによるブロッキングが挙げられる。例えば、キナーゼ化されたリボザイム(T4オリゴヌクレオチドキナーゼを用いた³²P末端標識)をグアノシントリホスフェートおよびグアニルトランスフェラーゼに作用させ、m³Gキャップをリボザイムに付与する。このような合成の後、標準的な方法を用いてリボザイムをゲル精製できる。リボザイムが所望の活性を有することを確認するために、5'キャップの存在下および非存在下、標準的な方法を用いて試験を行ない、酵素活性と安定性の両方について検定してよい。種々の修飾剤を含む合成リボザイムは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて精製できる。逆相カラムおよびシリカおよび重合体上の陰イオン交換剤を用いたその他の液体クロマトグラフィー法も使用してよい。以下に１つのリボザイムの合成例を記載する(1992年５月14日出願のDudyczの米国特許出願07/884,436号参照、開示内容は参考のために本明細書に組み込まれる）。固相ホスホロアミダイト化学を用いる。使用する単量体は、ウリジン、N- ベンゾイルシトシン、N-フェノキシアセチルアデノシンおよびグアノシンの2'-t -ブチルジメチルシリルシアノエチルホスホロアミダイトである(Glen Research ， Sterling，VA)。固相合成はABI394または380B DNA/RNA合成装置により、各器材に付随の標準的方法を用いて行なう。唯一の例外はカップリング段階を10分から 12分間に増加させる。ホスホロアミダイト濃度は0.1Mである。合成は1μモルのR NA反応カラム(Glen Research)を用いて1μモルの規模で行なう。平均カップリング効率は、遊離トリチルカチオンの熱量測定によれば、394型で97%〜98%、380B 型で97〜99%である。ブロックされたリボザイムを固体支持体(例えばCPG)から切断し、塩基およびジホスホエステル部分を、滅菌バイアル中乾燥エタノール性アンモニア(2ml)により、55℃で16時間脱保護する。反応混合物をドライアイス上で冷却する。後に冷却した液体を滅菌スクリューキャップバイアルに移し、凍結乾燥する。 2'-t-ブチルジメチルシリル基をリボザイムから除去するために、残存物を乾燥THF中フッ化テトラn-ブチルアンモニウム(TBAF)の1M溶液中、各シリル基に対して20倍過剰の試薬を用いて、16時間、雰囲気温度（約15〜25℃）で懸濁する。等量の滅菌1M酢酸トリエチルアミン，pH6.5を添加することにより反応をクエンチングする。試料を冷却し、最初の容量の半分までスピードバック(ＳpeedVac) で濃縮する。リボザイムをアセトニトリル勾配を用いたC4 300 A 5mm DeltaPakカラム上のH PLCにより２段階で精製する。第１段階は、「トリチル-オン」段階とも称し、5'-DMT基を欠いた誤配列からの5'-DMT-保護リボザイムの分離である。この段階に用いる溶媒は、A(0.1M酢酸トリエチルアッモニウム，pH6.8)およびB(アセトニトリル)である。溶離方法は、20%Bを10分間、次いで20%Bから50%Bまで50分間に渡る直線勾配、50%B10分間、 50%Bから100%Bまで10分間に渡る直線勾配、そして、100%Bから0%Bまで10分間に渡る直線勾配とする。第２段階は、アセトニトリル勾配中、Ca 300 A 5 mm DeltaPakカラム上の2%トリフルオロ酢酸処理による完全脱ブロックリボザイムの精製である。この第２段階で用いる溶媒は、A(0.1M酢酸トリエチルアンモニウム，pH6.8)およびB(80%アセトニトリル、0.1M酢酸トリエチルアンモニウム)である。溶離方法は、5%Bを５分間、5%Bから15%Bまで60分間に渡る直線勾配、15%Bを10分間、そして、15%B から0%Bまで10分間に渡る直線勾配とする。リボザイムを含有する画分を冷却しSpeedVacで凍結乾燥する。固体残存物をアセトン中エタノールおよび過塩素酸ナトリウムの最小量に溶解する。リボザイムを遠心分離により回収し、アセトンで３回洗浄し、凍結乾燥する。発現ベクター合成リボザイムが本発明では好ましいものの、発現ベクターを用いて作成したものも使用できる(1992年５月14日出願のMcSwiggenの米国特許出願07/884,431号および1992年６月31日出願のDraperの米国特許出願07/923,738号参照)。適当なリボザイム発現ベクターを設計する際には、以下の要因を考慮することが重要である。リボチーム内の望ましくない二次構造を最小限にするためには最終的なリボザイムは可能な限り小さくしなければならない。プロモーター（例えばヒトサイトメガロウイルス直接早期プロモーターまたはヒトβアクチンプロモーター）比較的強力なプロモーターとして選択すべきであり、インビトロおよびインビボの両方で発現可能でなければならない（例えばヒトサイトメガロウイルス直接早期プロモーターまたはヒトβアクチンプロモーター）。このようなプロモーターは標的RNAを破壊するのに十分なリボザイムを生産するのに適した濃度であるが、ただし（細胞死そのものが必要でない限り）その他の細胞活性が生じるのを防止するほどは高くない濃度でリボザイムを発現しなければならない。有用なベクターにはアテノ関連ウイルス(AAV)に基づくものを包含する。必要な転写開始配列(GG またはGGG またはGGGAG)がリボザイムの他の部分に結合して転写過程の調節に影響しないよう徹底するためには、リボザイムの5'末端のヘアピンが有用である。5'ヘアピンは5'-3'エキソヌクレアーゼからリボザイムを保護するためにも有用である。リボザイム遺伝子の3'末端の選択されたヘアピンが有用である理由は、それが転写終止シグナルとして作用し、3'-5' エキソヌクレアーゼ活性からリボザイムを保護するためである。知られた終止シグナルの１つの例は、T7 RNAポリメラーゼ系上に存在するものである。このシグナルは、約30ヌクレオチド長である。より短い長さのその他の3'ヘアピンは良好な終止およびRNA安定性を得るために用いることができる。このようなヘアピンを、ベクター配列内に挿入することにより、標準的なリボゾームを適切な方向に位置させ、このような連結された配列と共に発現させることができる。ポリ(A)テイルもまたリボザイムの3'末端を保護するために有用である。これらは発現ベクターのポリ(A)シグナル部位を含む（ことによりインビボでポリ(A) Sテールを付加するように細胞にシグナルを与える）ことによるか、または発現ベクターにポリ(A)配列を直接導入することにより得ることができる。最初の方法では、シグナルはリボザイムのその他の部分による望ましくない二次構造の形成を防止できるように位置させなければならない。第２の方法では、ポリ(A)伸長部をインビボの発現の期間に渡り短縮化させるため、ベクターを連続的に検査する必要がある。リボザイムが作用するのを防止するポリ(A)結合タンパク質に結合するポリ(A)テールの付加は慎重に行なわなければならない。リボザイム検査所望のリボザイムを選択し、合成し、精製した後、速度論的試験およびその他の試験を行なうことによりその有用性を調べる。このような方法の一例を以下に記載する。リボザイムの調製粗製の合成リボザイム(典型的には一回350μg)を15%変性ポリアクリルアミドゲル（厚み0.75mm，長さ40cm）上で分離することにより精製し、UV照射により可視化する。切断した後、リボザイム全長を含むゲルスライスを４℃で振とうしながら一夜ゲル溶離緩衝液(0.5M NH₄OAc，1mM EDTA)5mlに浸漬する。溶離剤をC-18 マトリックス(Sep-Pakカートリッジ，Millipore，Milford，MA)上で脱塩し、真空乾燥した。乾燥RNAをTE(トリス10mM，EDTA 1mM，pH7.2)50〜100μlに再懸濁する。この溶液のうち少量をTE 1ml中100倍に希釈し、その半量を用いてリボザイム溶液を分光光度計により定量する。この希釈溶液の濃度は典型的には150〜800 nMである。リボザイムの純度は、変性ポリアクリルアミドゲル上に単一のバンドがあることにより確認する。その他の同等な緩衝液を用いて本質的に同様の結果を得ることができる。リボザイムは２つ以上の部分として好都合に合成して良い(1992年５月11日出願のMamoneの米国特許出願07/882,689号参照、この開示内容は参考のために本明細書に組み込まれる）。リボザイムの各部分は一般的には、限られた酵素活性を有するのみであるか、または、まったく酵素活性を有さず、活性は全ての部分を連結した場合に（またはその他の方法でジュクスタポーズされた(Juxtaposed)場合に）かなり（少なくとも５〜10倍）増加する。ハンマーヘッドリボザイム合成の特定の例を以下に記載する。この方法では、２つ（またはそれ以上の）短い「半」リボチームの合成および T4RNAリガーゼを用いたこれらの連結を行なう。例えば、34量体のリボチームを作成するためには、２つの17量体を合成し、１つをホスホリル化し、両方をゲル精製する。次にこれらの精製17量体を２つの17量体に対して相補的ナ DNA スプリント鎖にアニリングする（このようなスプリントは常時必要であるわけではない）。このDNAスプリントは各々の一方の末端が相互に隣接するように２つの17量体を位置付けるように設計された配列を有する。次にジュクスタポーズされた(j uxtaposed)RNA分子をATPの存在下T4 RNAリガーゼで処理する。次に、このようにして形成された34量体のRNAをHPLCで精製する。基質の調製未精製の基質約10〜30ピコモルを[γ-³²P]ATP 25ピコモルを用いてT4ポリヌクレオチドキナーゼで5'末端を放射標識する。全標識混合物を20%変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、オートラジオグラフィーで可視化する。全長バンドを切り出し、TE(10mM トリス塩酸，pH7.6，0.1mM EDTA)100μl中に４℃で一夜浸漬する。速度論的反応より短い基質（８〜16塩基）を用いた反応のために、基質溶液を検定緩衝液(7 5mM トリス塩酸，pH7.6；0.1mm EDTA，10mM MgCl₂,または50mMトリス塩酸，pH7. 5，10mM MgCl₂)中1Xとし、これにより基質濃度が1nM未満となるようにする。リボザイム溶液（典型的には20nM）を緩衝液中1Xとし、1X検定緩衝液を用いて４回希釈する。各リボザイム希釈溶液(即ち20，16，12，８および4nM)15μlを別々の試験管に入れる。これらの試験管および基質試験管を少なくとも５分間37℃で前インキュベートする。反応を開始するために基質15μlをピペットを用いて急速に各リボザイム試験管に添加混合する（最終リボザイム濃度は10，8，6，4，2nM）。５μlづつ15〜3 0秒の間隔で取り出し、反応停止溶液(95%ホルムアミド、20mMEDTAキシレンシアノールおよびブロモフェノールブルー染料）５μlを用いて反応を停止する。最終リボザイム時点の後、残存する基質のうち少量を取り出して、ゼロリボザイム対照群とする。試料は15%または20%の何れかのポリアクリルアミドゲル上で分離する。各ゲルをAmbis ベータスキャナー(Ambis Systems,San Diego,Ca)を用いて可視化し、定量する。最も高い活性を有するリボザイム群に対して、基質過剰で速度論的分析を行ない、K_mおよびK_cat値を求める。長いRNA基質(15塩基より長い)の動的反応のためには、T7 RNAポリメラーゼおよびT7プロモータを含む定義されたテンプレート、および標的RNAの適切なヌクレオチドをコードするDNAを用いた転写により基質を調製する。基質溶液を検定緩衝液(75mM トリス塩酸，pH7.6;0.1mM EDTA;10mM MgCl₂，または50mMトリス塩酸，pH7.5，10mM MgCl₂)中1Xとし、長いRNA分子を58ナノモルの濃度で含有するようにする。反応を開始するためにゲル精製リボザイムを1μMの濃度になるように添加する。20，40，60，80および100分に少量を採取し、停止溶液5μlを添加して反応を停止する。切断産物は変性PAGEを用いて分離する。アンビス（Ambi s）ベータスキャナーまたはモレキュラー・ダイナミクス・ホスファー・イメージ（molecular Dynamics Phosphor Image）用いてバンドを可視化し、定量する。速度論的分析リボザイム媒介切断のための単純な反応機序を以下に示す。式中、Rはリボザイム、Sは基質、そしてPは生成物を示す。箱に入った段階は基質過剰の場合のみ重要である。リボザイム濃度は基質濃度に対して過剰であるため、リホザイム- 基質複合体([R:S])濃度は複合体が初めに形成される極めて短い期間を除いて一定である。即ち：式中tは時間である。そして下記の式が成立する。（Ｒ）（Ｓ）ｋ₁＝（ＲＳ）（ｋ₂＋ｋ₁）反応速度は時間に従って基質が消失する速度である。これらを置き換えると、以下の通りとなる。または、この式を時間に関して積分することにより下記の式が得られる。式中S₀は初期基質量である。従って、基質濃度残分の負の対数vs時間（分）のプロットにより、下記傾きを有する直線が得られる。式中ｋobsは速度定数観察値である。傾き(Kobs)対リボザイム濃度のプロットにより、下記傾きを有する直線が得られる。これらの式を用いることにより、速度論的実験より得られたデータが試験したリボザイムのどれが最も有用であるか、または、活性を有しているかを判断するために必要な情報を与える。このようなリボザイムを選択し、インビボまたはエキソビボの系で試験することができる。リポソームの調製脂質分子を揮発性有機溶媒(CHCl₃，メタノール、ジエチルエーテル、エタノール等）に溶解する。有機溶媒を蒸発させて除去する。脂質を0.1xリン酸塩緩衝食塩水(PBS)中に懸濁させ、次に液体窒素および室温でのインキュベーションにより３回凍結解凍する。懸濁液を順次0.4μm，0.2μmおよび0.1μmのポリカーボネートフィルターを通して最大圧力800psiで押し出す。リボザイムを押し出されたリポソーム懸濁液と混合し、凍結乾燥する。脂質/リボザイム粉末を最初の容量の10分の１となるまで水で再度水和させる。懸濁濁を1x PBSで押し出しに必要な最少容量(1.5ml口径の場合は0.4ml，10ml口径の場合は1.5ml)まで希釈し、0.4μ m，0.2μmおよび0.1μmのポリカーボネートフィルターで再度押し出す。リポソーム捕獲リボザイムを未捕獲リボザイムからゲル濾過クロマトグラフィー(SEPHA ROSE CL-4B，BIOGRL A5M)により分離する。リポソーム抽出液を合わせ、 0.2μmフィルターを通して濾過することにより滅菌する。遊離のリボザイムを合わせエタノール抽出により回収する。リポソーム濃度は放射性脂質を配合することにより測定する。リボザイム濃度は32Pで標識することにより測定する。Rossi 等(1992，前述、本明細書における参考文献)はリポソームの調製に適するその他の方法を記載している。インビボ検定特定のリボザイムの作用効果を、標的mRNAを発現する形質転換細胞または動物を用いて標準的な方法によりインビボで試験した。リボヌクレアーゼ保護検定細胞中の標的mRNAの蓄積またはリボザイムまたはRNAseHによるRNAの切断(インビトロまたはインビボ)をRNAse保護検定を用いて定量した（共に1992年５月14日出願のMcSwiggenの米国特許出願07/883,849号および07/884,073号参照、開示内容は参考のために本明細書に組み込まれる）。この方法においては、アンチセンスリボプローブを、1X転写緩衝液（製造元より入手）、0.2mM ATP，GTPおよびUTP、1U/Aμl膵臓RNAse阻害剤(Boehringer Man nheim Biochemicals)および200 μCi³²P標識CTP(800Ci/mmol，New England Nucl ear)を含有する反応液20μl中１時間37℃でT7 RNAポリメラーゼ(US Biochemical s)を用いてテンプレートDNAから転写する。テンプレートDNAは37℃で15分間1Uの RNAse非含有DNAseI(U.S．Biochemicals，Cleveland，OH)で消化分解し、組み込まれなかったヌクレオチドをG-50SEPHADEXスピンクロマトグラフィーにより除去する。アンチセンスプローブの転写と同様の方法で、適当なDNAテンプレートを用いてインビトロで標的RNAを転写できる。転写産物は標準的な方法で精製し、後に記載する方法に従って37℃でリボザイムを用いて消化分解する。あるいは、損傷を受けた(mRNA発現)細胞をPBS 1ml中に回収し、1.5ml容のエッペンドルフ(EPPENDORF)試験管に移し、ミクロ遠心分離装置中低速で30秒間沈殿させ、ハイブリダイゼーション緩衝液（4M グアニジンイソチオシアネート、0.1 %サルコシル，25mMクエン酸ナトリウム，pH7.5)70μl中で溶解する。細胞溶解物(45μl)または所定の量のインビトロ転写産物（やはりハイブリダイゼーション緩衝液中）を0.5ml容のEppendorf試験管中各アンチセンスリボプローブ5x 1 0⁵cpmを含有するハイブリダイゼーション緩衝液5μlと合わせ、鉱物油25μlを積層し、55℃（または37〜55℃）で一夜加熱することによりハイブリダイゼーションを行なう。ハイブリダイゼーション反応液をRNAse溶液(0.4M NaCl中20U/ml RN Ase A，３U/ml RNAse T1，10U/ml RNAse非含有DNAseI)0.5ml中に希釈し、37℃で 30分間加熱し、20% SDS 10μlおよびプロテイナーゼ K(10mg/ml)1μを添加し、次いで、更に30分間37℃でインキュベートした。ハイブリッドをフェノール/クロロホルムの1:1混合物O.5mlで抽出することにより部分的に精製し、水層を0.5m lイソプロパノールと合わせて、RNAse耐性ハイブリッドをミクロ遠心分離装置により室温（約20℃）で10分間沈殿させる。沈殿を投入緩衝液(95%ホルムアミド、 1X TBE，0.1%ブロモフェノールブルー、0.1%キシレンサイラノール)10μl中に溶解し、５分間95℃で加熱し、氷冷し、変性条件下4%ポリアクリルアミド/7M 尿素ゲル上で分析する。リボザイム安定性選択したリボザイムの安定性を調べることによりその潜在的有用性を判断できる。そのような試験を用いて更にリボザイムの安定性に対する種々の化学修飾（例えばポリ(A)テールの付加）の影響を調べることができ、これにより、より安定なリボザイムを選択することが可能になる。例えば、反応混合物は5'（キナーゼ化）および/または3'標識リボザイム１〜５ピコモル、シトゾル抽出液15μgおよび2.5mM MgCl₂を総容量100μl中に含有する。反応混合物は37℃でインキュベートする。８μlづつ経時的に採取し、停止混合物(20mM EDTA，95%ホルムアミド )８μlと混合する。試料を15%アクリルアミド配列決定ゲル上で分離し、フィルムに露光し、アンビス(Ambis)で操作する。 3'標識リボザイムは、ポリ(A)ポリメラーゼを用いて3'OHに³²P標識コルディセピンを取り込ませることにより形成できる。例えば、ポリ(A)ポリメラーゼ反応液は、40mMトリス、pH8，10mM MgCl₂，250mM NaCl，2.5mM MnCl₂;500Ci/mMの³²P コルディセピン3μlおよびポリ(A)ポリメラーゼ６単位を総容量50μl中に含有する。反応混合物を37℃で30分間インキュベートする。リボザイム活性に対する塩基置換の影響どの一次構造特性が基質のリボザイム切断を変化させるかを調べるために、特定のリボザイムにより認識される基質切断領域内で塩基を僅かに変化させることができる。例えば、基質配列を中央の"C"ヌクレオチドで変化させ、切断部位をG UCからGUAモチーフに変化させることができる(1992年５月14日出願のMcSwiggen の米国特許出願07/884,074号参照、開示内容は参考のために本明細書に組み込まれる)。次に各基質を用いた切断に対するK_cat/K_m値を分析し、そのような変化がリボザイム切断速度を変化させるかどうか判断する。同様の実験を行なうことにより、リボザイム結合アーム部に対して相補的な塩基を変化させることの影響を調べることができる。相補基質への強力な結合を維持できると予測される変化が好ましい。ヌクレオチド含有量の僅かな変化により、結合強度のみからは予測できないような方法でリボザイム/基質相互作用を変化させることができる。リボザイムの触媒コア領域の構造は基質の構造またはリボザイム/基質複合体の三次元構造の何れかの僅かな変化も認識する。リボザイム設計の最適化を開始するために、種々のアーム長を有するが同じ長さの短いRNA基質を標的とするように設定されたリボザイムの切断速度を調べる。最小アーム長が必要であり、効果的な切断はリボザイム/基質の組み合わせにより変化する。選択されたリボザイムの切断活性は標的mRNA基質を用いて評価できる。検定はリボザイム過剰で行ない、得られたK_cat/K_m値を近似させる。短い基質と長い基質で得られた値を比較することによりリボザイムのインビボの有用性が解る。リポソーム供給リボザイムの細胞内安定性選択されたリボザイムのインビボ安定性を調べるためには、以下の試験が有用である。リボザイムを³²p末端標識し、リポソーム中に捕獲し、標的mRNA含有細胞に３時間供給する。細胞を分画し、リボザイムをフェノール/クロロホルム抽出により精製する。あるいは、細胞(1ｘ10⁷，T-175フラスコ)をフラスコ表面から掻き取り、冷PBSで２回洗浄する。細胞をTSE(10mMトリス、pH7.4，0.25M スクロース、5mM EDTA)4ml中で35回振とうすることによりホモゲナイズする。10 0ｘｇで10分間核を沈殿させる。細胞下オルガネラ（膜画分）をSW60ローターを用いて２時間200,000ｘｇで沈殿させる。沈殿をH緩衝液(0.25M スクロース、50 mM HEPES，pH7.4)1ml中に再懸濁させる。上澄みは細胞質画分を(約3.7ml)含有する。核沈殿物をTM(50mM トリス,pH7.4，2.5mM MgCl₂)中65%スクロース1ml中に再懸濁し、SW60ローターで37,000ｘgで１時間スクロース段階勾配(65%スクロースT M中核1ml,1mlの60%スクロースTM，1mlの55%スクロースTM，50%スクロースTM，30 0μlの25％スクロースM)上でバンド化する。核バンドを採取し、10%スクロースとなるようにTM緩衝液で希釈する。核を15分間SW60ローターで37,000ｘgで沈殿させ、沈殿をTM緩衝液1ml中に再懸濁させる。少量を変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分画し、細胞内局在化を測定する。新しく合成したリボザイムの移行速度と比較することにより、未損傷のリボザイムを含有する種々の画分を判別できる。細胞内でリボザイム分子の半減期を長くするような修飾方法を調べるためには、細胞を上記したとおり分画し、各画分の純度を、その画分中に存在することが知られている酵素の活性を検定することにより、測定する。種々の細胞画分を-70℃に凍結し、修飾リボザイム分子の相対的ヌクレアーゼ耐性を測定するために用いる。リボザイム分子は各分子の末端において5ホスホロチオエート(ps)または2'−Oメチル(2'−OMe)修飾を行なうことにより合成して良い。これらの分子およびリボザイムのホスホジエステル型はT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²PおよびATPで末端標識する。等しい濃度を細胞質抽出液に添加し、各々の少量を10分間隔で採取する。試料を変性PAGE出サイズ分画し、Ab isβスキャナーを用いてゲルを走査することによりヌクレアーゼ耐性の相対比を分析する。結果は、リボザイムが細胞質抽出液により消化分解されたかどうか、そして、どの型が相対的により高いヌクレアーゼ耐性を有するかどうかを示す。修飾されたリボザイムは一般的に、短いRNA基質を用いた場合には天然型のリボザイムの触媒活性の80〜90%を温存している。未標識の5'末端標識または3'末端標識リボザイムを検定に用いることができる。これらの実験はまた、観察結果を確認するためにヒト細胞抽出液を用いて行なうこともできる。以下の記載は本発明の非限定的実施例である。実施例１ヒトストロメリシンmRNAにおけるリボザイム標的部位現時点ではハンマーヘッドリボザイム標的部位はUとそれに続くG以外の何れかのヌクレオチド、即ちUC，UAおよびUUを含むRNA配列にのみ制約されている。ヒトストロメリシンmRNA配列中の潜在的ハンマーヘッドリボザイム標的部位の位置を調べるためにRNA配列全体(1801 ヌクレオチド)についてUH配列を調べたところ、326部位が判明した。これらの326箇所の潜在的部位およびその直接平行配列を表２に示す。全てのUH部位の他に表２にはストロメリシンRNA内の潜在的ヘアピンリボザイム標的部位８か所が含まれている。これらの配列認識番号は360〜367 である。位置の番号はヌクレオチドの5'から潜在的リボザイム切断部位までを指す。全てのUH配列に加えて、表３はストロメリシンRNA内の潜在的ヘアピンリボザイム標的部位８か所を示す。更に、ウサギストロメリシンmRNA配列(1795 ヌクレオチド)内の潜在的リボザイム標的部位の位置を調べ、ヒト標的部位と照合させた。ウサギストロメリシン mRNA配列はヒト配列と84%の配列同一性を有しているため、多くのリボザイム標的部位も相同性を有している。即ち、ヒトストロメリシンに標的設定するがウサキストロメリシンmRNA上にも相同またはほぼ相同の切断部位を有するようなリボザイムを試験するための適切な実験動物モデルとしてウサギを使用できる可能性がある。ウサギ配列内の316箇所のUH部位のうち30箇所が、潜在的リボザイム切断部位の周囲の少なくとも14ヌクレチドに関してヒト配列内の相当する部位と同一である。切断部位に直接隣接(5')するようなRNA基質内のヌクレオチドはリボザイム-基質複合体内では非対であり（図１参照）、その結果ヒトとウサギの潜在的リボザイム部位の比較の対象とはならない。試験を継続するためにヒトリボザイム標的部位を選択する際には、ウサギ配列における同一またはほぼ同一な部位の存在を考慮しなければならない。実施例２優位部位潜在的リボザイム標的部位をコンピューター屈曲プログラム(MulfoldまたはMa cintosh-用バージョンのプログラム、LRNA(Zucker(1989)，Science 244:48)を用いて更に分析し、1)標的部位が実質的に一重鎖であり、これによりリボザイムとの相互作用が可能であると予測できるかどうか、2)その部位に対して設計されたリボザイムは幹部IIを形成すると予測されるが、一般的にその他の分子内塩基対形成はないかどうか、そして3)潜在的リボザイムおよび切断部位の両側に平行する配列がともに正確に相互作用を示すと予測されるかどうかを調べた。幹部IIの配列を変化させることにより、幹部をその位置に維持するがリボザイム基質結合アーム部との分子内塩基対形成を最小限にすることができる。これらの最小限の基準に基づき、そしてヒトおよびウサギストロメリシンmRNA配列内で同一の部位全てを含むように、66の潜在的優位リボザイム標的部位の部分集合を（第１ラウンド標的として）選択し、その後の分析対象とした。それらは配列認識番号：である。実施例３接触可能部位これらの潜在的優位部位の一部または全てがその部位に標的設定されたリボザイムに対して接触可能であるかどうかを調べるために、RNAseH検定を実施した（より詳細には共に1992年５月14日に出願されたMcSwiggenの米国特許出願07/883, 849および07884,073/号に記載されており、その内容は参考のために本明細書に組み込まれる）。この検定方法を用いることにより、DNAオリゴヌクレオチドプローブへの潜在的リボザイム標的部位の接触可能性を、その特定の部位に対するリボザイムを合成する必要なく評価することができる。相補DNAオリゴヌクレオチドが潜在的リボザイム標的部位とハイブリダイゼーションできる場合は、DNA/ RNAハイブリッドを切断する能力のあるRNAseHはその特定の部位て標的RNAを切断する能力がある。RNAseHによる標的RNAの特異的切断は、その部位がオリゴヌクレオチド結合に対して「解放的」であるか、または、「接触可能である」ことの指標となり、このため、その部位がリボザイム結合に対しても解放的であると予測する根拠となる。各DNオリゴヌクレオチド/A部位に対して発生した特定のRNAs eH切断産物の相対量を比較することにより、潜在的リボザイム部位を接触可能性に従って順位付け評価することができる。 RNAseH検定を用いて標的部位を分析するために、潜在的標的部位に対して相補的なDNAオリゴヌクレオチド（一般的には13〜15ヌクレオチドの長さ）を合成する。本体標識基質RNA(全長RNAまたは全RNAの約500〜600ヌクレオチドサブフラグメント)を³²P標識ヌクレオチドの存在下インビトロ転写により調製する。取り込まれなかったヌクレオチドを³²p標識基質RNAからG-50セファデックスカラム上のスピンクロマトグラフィーにより分離し、更に精製することなく使用する。この検定を実施するために、³²p標識基質RNAを５分間37℃で20mMトリス塩酸，pH7.9 ，100mM KCl，10mM MgCl₂，0.1mM EDTA，0.1mM DDT中、特異的DNAオリゴヌクレオチド(1μMおよび0.1μMの最終濃度)と共に前インキュベートする。過剰のRNAs eH(0.8単位/10ml反応溶液)を添加し、10分間インキュベーションを継続する。反応を停止するために、等量の95%ホルムアミド、20mM ETA，0.05%ブロモフェノールブルーおよび0.05％キシレンシアノールFFを添加し、その後、試料を２分間95℃に加熱し、急速に冷却し、変性ポリアクリルアミドゲル上に投入する。RNAseH切断RNA産物を未切断RNAから変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、オートラジオグラフィーにより可視化し、切断産物の量を定量する。 66箇所の潜在的リボザイム部位に対するRNAseH分析を行ない、ほとんどのRNAs eH切断に関与したDNAオリゴヌクレオチド/部位を決定した。これらの検定は全長のヒトおよびウサギのストロメリシンRNAを基質として使用しながら実施した。ヒトストロメリシンRNAに対して得られた結果によれば、66箇所のうち23箇所が高い水準のRNAseH切断に関与しており、その他の13箇所は中程度の水準のRNAseH 切断に関与していた。22箇所の部位をこれらの２つの群から選択し、その後の試験の対象とした。この選択において用いた基準のうち２つは、1)特定の部位がヒトスルトメリシンRNAの少なくとも中程度のRNAseH切断に関与していたこと、および、2)その部位がウサギとヒトのストロメリシン配列の間で２個以下のヌクレオチドの相違を有すること、とした。ウサギストロメリシンRNAのRNAseH接触可能性を測定したが、これらの選択のための特定の基準として用いなかった。ウサギ配列に対して完全に相補的ではないDNAオリゴヌクレオチドは、RNAseH切断の相対量の良好な指標とはならないが、その理由は、おそらくは、不適合性のために、DNAオリゴヌクレオチドの不適合RNA基質へのハイブリダイゼーション効率が低くなり、このため、より少ないRNAseH切断が観察されるためと考えられる。実施例４リボザイムの分析次に、RNAseＨ検定で接触可能であると予測された22箇所の部位に対してリボザイムを合成した。これらの22箇所のうち11箇所は相当するウサギ部位と同一である。その22箇所とは、配列認識番号34，35，57，125，126，127，128，129，1 40，162，170，179，188，223，224，236，245，246，256，259，260，281である。どのリボザイム単独およびリボザイム-基質の組み合わせがコンピューター屈曲プログラム(Mulfold)により最も正しく屈曲したと予測されるかに応じて、７ヌクレオチドまたは８ヌクレオチドの何れかの認識アーム部を用いて22個のリボザイムを化学的に合成した。合成後、リボザイムをHPLCで精製するか、またはゲル精製した。これらのリボザイムの配列を以下に示す。次にこれらの22個のリボザイムのヒトおよびウサギの両方の全長ストロメリシンRNAを切断する能力を調べた。全長の本体標識ストロメリシンRNAを³²P[CTP]の存在下インビトロ転写により調製し、スピンクロマトグラフィーによりG50セファデックスカラムに通し、更に精製することなく基質RNAとして使用する。検定を行なうためにリボザイム切断緩衝液(50mM トリス塩酸，pH7.5，37℃、10mM Mg Cl₂)中の2X濃度の精製リボザイムを前加温し、切断反応を開始するために、2Xリボザイム混合物をやはり切断緩衝液中前加温しておいた等量の基質RNA(最大１〜５nM)に添加する。初期スクリーニングとして、検定は最終濃度1μMおよび0.1μ Mのリボザイムを用いて、即ちリボザイム過剰で、37℃で１時間行なう。反応を停止するために等量の95%ホルムアミド、20mMEDTA、0。05％,ブロモフェノールブルーおよび0.05％キシレンシアノールFFを添加し、その後、試料を２分間95℃に加熱し、急速に冷却し、変性ポリアクリルアミドゲル上に投入する。全長基質RN Aおよびリボザイム切断で発生した特異的RNA産物をゲルのオートラジオグラキフ上で可視化する。試験した22個のリボザイムのうち21個が部位特異的にヒトおよびウサギの基質 RNAをインビトロで切断することができた。全ての場合において、適切な長さのR NA切断産物を可視化した。ゲルの隣接列で電気泳動した分子量標準物質と比較することによりRNAの大きさを判断した。リボザイム反応中に切断された基質RNAの画分は、そのリボザイムのinvitroの活性の評価に用いることができる。これらの22個のリボサイムの全長基質RNAに対する活性は、上記したとおり、１μMリボザイムを用いたリボザイム切断検定で切断された基質RNAの約10%〜95%より高値となった。これらのリボザイムの７個の部分集合を選択して試験を継続した。これらの７個のリボザイム（表５に示す）はヒトおよびウサギのストロメリシンRN Aの両方に対して最も高い活性を有するもののうちに属する。これら７部位のうち５部位は、切断部位に平行する両方の方向で最小７個のヌクレオチドについて、ヒトおよびウサギの間でのストロメリシンRNAの配列同一性を有する。これらの部位は883，947，1132，1221および1410であり、リボザイムは配列認識番号て 368，369，370，371，372，373および374である。実施例５アーム長試験インビトロで特定の部位に対するリボザイムの切断活性にアーム長の変動が影響するかどうかを調べるために、これらの７部位に対するリボザイムを結合アーム長が変動するように設計した。各部位について、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、10ヌクレオチドおよび12ヌクレオチドの結合アームを有するリボザイムが含まれるように完全なセットのリボザイム、即ち各部位について５個のリボザイムを合成した。これらのリボザイムを合成後ゲル精製し、上記した通りリボザイム切断検定において試験した。 35個のリボサイム、即ち上記７部位の各々に対して異なるアーム長を有する５個のリボザイムを分析した後、２個のリボザイムがインビトロで最も活性が高いことが解った。これら２個のリボザイムはヌクレオチド617およびヌクレオチド8 20のヒト配列切断部位に対抗する７ヌクレオチドアーム部を有していた。これらを、ヒト(H)配列切断部位(617または820)並びにリボザイム分子の5'および3'側のアーム長を示すように、RZ 617H 7/7およびRZ 820H 7/7と命名した。実施例６培養細胞中のリボザイムの活性の試験次にインビトロで最も活性の高い２個のリボザイム(RZ 617H 7/7およびRZ 820 H 7/7)の細胞内でストロメリシンmRNAを切断する能力を調べた。ヒトまたはウサギの滑膜線維芽細胞の一次培養物をこれらの実験に用いた。これらの有効性試験のために、分子の5'末端の５ヌクレオチド上および分子の3'末端の５ヌクレオチド上で2'0メチル修飾しながら７ヌクレオチドアーム部を有するリボザイムを合成した。比較のために、同じ部位に対するものであるが12ヌクレオチドアーム部を有するリボザイム(RZ 617 12/12およびRZ 820H 12/12)も両方の結合アーム部の末端の５位で2'0メチル修飾しながら合成した。触媒コア領域で２個のヌクレオチド変化を有する不活性リボザイムも対照群として調製した。不活性リボザイムの触媒コア部はCUUAUGAGGCCGAAAGGCCGAUであるのに対し、活性リホザイムでは CUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAである。１時間1μMの濃度で典型的なリボザイム切断検定で全長RNAに対して測定した場合に、不活性リボザイムはインビトロ切断活性を示さない。一般的検定方法は以下のとおりである。ストロメリシンを生産する線維芽細胞を一夜血清欠乏下に置き、リボザイムまたは対照群を翌日細胞に与えた。細胞を血清非含有培地中に培養した。リボザイムは遊離のリボザイムとして、またはカチオン性脂質(例えばトランスフェクタム（Transfectam^TM），リポフェクチン（ Lipofectin^TM）およびリポフェクタミン（Lipofectamine^TM）)、従来のリポソーム、非リン脂質リポソームまたは生体分解性重合体のような種々の供給用媒体と組み合わせて細胞に適用できる。リボザイム添加時点で、または３時間後までの間、インターロイキン-1βを(典型的には20単位/ml)を細胞に添加してストロメリシン発現を大幅に増大させることができる。次にストロメリシンの生産を経時的に、通常は24時間までモニタリングする。リボザイムが細胞内でストロメリシンmRNAを切断する作用を有している場合、ストロメリシンmRNAの量は減少するか、または消失する。細胞ストロメリシンmR NAＭの量の減少、並びに全長ストロメリシンmRNAのリボザイム切断により発生するRNA産物の存在は、ノーザンブロット分析、RNAse保護検定および/またはプライマー伸長検定のような方法で分析できる。ストロメリシンタンパク質の生産に対する細胞ストロメリシンmRNAのリボザイム切断の影響もまた種々の検定により調べることができる。これらには、ELISA(酵素連結免疫吸着試験)および免疫蛍光試験等、後述するものが含まれる。更に、一次基質であるプロテオグリカンの分解を測定することによりストロメリシンの酵素活性をモニタリングする機能的検定方法も発表されている。実施例７ストロメリシンタンパク質の分析インターロイキン-1β誘導ヒト滑膜線維芽細胞の培地内に分泌されたストロメリシンをヒトストロメリシン認識抗体を用いてELISAにより測定した。存在する場合は、トランスフェクタム^TM-リボザイム複合体（リボザイム最終濃度0.15μM ）を３時間2-4ｘ10⁵血清欠乏細胞に与えた後、インターロイキン-1βによる誘導を行なった。トランスフェクタム^TMは1:1(w/w)のジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを添加した以外は製造元(Promega Corp.)の支持に従って調製した。トランスフェクタム^TM-リボザイム複合体を5:1の原料量比率で調製した。インターロイキン-1βの添加後24時間に培地を回収した、対照群(RZ非含有)はTr amsfectam^TMのみを細胞に適用したものとする。７ヌクレオチドアーム部または1 2ヌクレオチドアーム部を有する不活性リボザイムは、上記したとおり触媒コア部に２箇所の不活性化変化を有する。細胞試料を２連で調製し、各試料から得た調整培地の数段階の希釈液を用いて検定を実施した。ELISAの結果は、対照群(RZ 非含有)を100%とした場合の存在するストロメリシンのパーセントとして下記に示す。 RZ標的部位投与物質 617H 820H RZ 7/7 6.83 7.05 RZ 12/12 18.47 33.90 不活性RZ 7/7 100 100 不活性RZ 12/12 100 100 RZ非含有対照群 100 100 上記した結果によれば、明らかに活性リボザイムはRZ617H 7/7およびRZ 820H 7/7のいずれも、細胞により分泌されるストロメリシンの量に対して劇的な作用を有することが解る。未投与の対照群細胞または不活性リボザイムを投与した細胞と比較した場合、ストロメリシンの量は約93%減少した。同じ部位に対するものであるが12ヌクレオチド結合アーム部を有するように合成したリボザイムもまた同様に有効であり、対照群の約66%〜約81%のストロメリシンの減少をもたらした。前のインビトロのリボザイム切断検定において、RZ 617H 7/7およびRZ 820H 7/7は同じ部位に対抗する12ヌクレオチドアーム部を有するリボサイム(617H 12 /12およびRZ 820H 12/12)よりも全長RNA基質に対してより良好な切断活性を示した。実施例８免疫蛍光試験ストロメリシン検出の代替法の１つは、免疫蛍光により細胞内のストロメリシンタンパク質を可視化することである。この試験では細胞にモネンシン(monensi n)を投与して細胞からのタンパク質の分泌を防止する。次にモネンシン添加後に細胞により保持されるストロメリシンを従来型または共焦の顕微鏡の何れかを用いて免疫蛍光により可視化することができる。一般的には、細胞を一夜血清欠乏下に置き、翌日数時間リボザイムで処理した。次にモネンシンを添加し、約５〜６時間後、モネンシン投与細胞を固定し、標準的な方法で透過性とし、ヒトストロメリシンを認識する抗体と共にインキュベートした。蛍光物質にコンジュゲートした二次抗体と共に更にインキュベートした後、細胞を顕微鏡により観察した。不活性リボザイムまたは培地のみ与えた細胞と比較した場合にリボザイム投与細胞で蛍光量が減少したことは、ストロメリシンタンパク質の濃度がリボザイム投与により減少したことを示す。上記した免疫蛍光法により可視化されるとおり、RZ 617H 7/7またはRZ 820H 7 /7（最終濃度1.5μm有利リボザイムまたは0.15μM トランスフェクタム^TM複合リボザイム）のいずれかをヒト滑膜線維芽細胞に投与することにより、対照群と比較して、蛍光がかなり減少し、従ってストロメリシンタンパク質が減少したことが解った。対照群には培地またはトランスフェクタム^TMのみを投与した。触媒コア部に２箇所の不活性下変化を有する相当する不活性リボサイムを細胞に投与した場合、リボザイム投与を行なわない対照群と同様の免疫蛍光が観察された。ウサギ滑膜線維芽細胞にも、RZ 617H 7/7またはRZ 820H 7/7並びにウサギ標的配列に対して完全に相補的となるように適切な１ヌクレオチド変化を各々有するような相当する２つのリボザイム(RZ 617R 7/7またはRZ 820R 7/7)を投与した。リボザイム投与を行なわない対照群と比較して、インターロイキン-1β誘導ウサギ滑膜線維芽細胞における免疫蛍光は上記４種類のリボザイムの投与により、ウサギまたはヒトのmRNA配列の何れかに関わらず、著明に減少した。ウサギ滑膜線維芽細胞における免疫蛍光試験では、ヒトストロメリシンに対する抗体を使用した。実施例９細胞RNAのリボザイム切断本実施例では以下の方法を用いた。プライマー伸長試験プライマー伸長試験を用いて全長RNA並びに各RNAの3'リボザイム切断産物を検出した。この方法では、推定リボザイム切断部の下流(3')に位置するRNA上のある位置にハイブリダイゼーションすることのできるDNAプライマー（一般的に約2 0ヌクレオチドの長さ）を合成する。使用前に、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²P[ATP]でプライマーの5'末端を標識し、ゲル精製した。次に標識プライマーを標準的方法で細胞溶解物から単離した核酸群と共にインキュベートした。反応緩衝液は50mMトリス塩酸，pH8.3，3mM MgCl₂，20mM KClおよび10mM DTTとした。30分間の伸長反応に置いては、RNAにハイブリダイゼーションしている全てのDNAプライマーが、逆転写酵素、即ちテンンプレートとしてRNAを用いてDNプライマーの3'末端にヌクレオチドを付加する酵素の基質として作用した。逆転写酵素はLife Technolgiesから入手し、本質的には製造元の指示に従って使用する。最適な状態では、逆転写酵素はRNA基質の末端に到達するまでcDNAを形成しながらDNAプライマーを伸長する。即ち、リボザイム切断RNA基質を得るためには、cD NA産物は得られた全長のcDNA産物よりも、または、未切断RNA基質よりも短いものとなる。次に、伸長により生産された³²P-標識cDNAの大きさの相違は変性ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により判別でき、オートラジオグラフィーにより可視化できる。しかしながら、RNA基質内の強力な二次構造は逆転写酵素による早期の停止をもたらす場合がある。短いcDNAに関するこの背景は一般的には、これらの早期終止産物の１つが目的のリボザイム切断産物の予測位置に電気泳動されない限り、問題にならない。即ち、3'切断産物はその予測される大きさおよび対象泳動列に存在しないことにより、容易に識別できる。しかしながらRNAの二次構造による強力な停止は、存在する全長および切断RNAの総量を定量する際には問題を生じさせる。この理由により、切断の相対量のみが容易に測定できる。プライマー伸長試験は、トランスフェクタム^TM-複合RZ 617H 7/7，RZ 820h 7/ 7，RZ 617H 12/12およびRZ 820H 12/12を投与されている細胞から単離したRNAに対して実施した。対照群細胞にはトランスフェクタム^TMのみを与えた。これらの４種類のリボザイムの不活性型のトランスフェクタム^TM複合体を投与した細胞から得たRNAに対するプライマー伸長物もまた調製した。20ヌクレオチドプライマー配列は、5’AATGAAAACGAGGTCCTTGC3'であり、リボザイム部位の約285ヌクレオチド下流の領域に対して相補的である。部位617に対するリボザイムを得るためには、3'切断産物に対するcDNA長さは488ヌクレオチドであり、部位820に対しては、285ヌクレオチドである。全長cDNAは1105ヌクレオチドの長さとなる。使用可能な場合は、0.15μMのリボザイム1mlを約２〜３ｘ10⁵血清欠乏ヒト滑膜線維芽細胞に与えた。３時間後、インターロイキン-1β20単位を細胞に添加し、インキュベーションを24時間継続した。 3'産物に対する正しい大きさの³²P標識cDNAは部位617および820に対する活性リボザイムを投与されている細胞から得たRNAを含有している泳動列で明確に目視できた。７ヌクレオチドアーム部を有するリボザイムは、目視できる3'切断産物の相対量を比較することにより12ヌクレオチドアーム部を有するリボザイムよりも高い活性を有すると判断された。このことは、これら同じ試料に由来する調整培地のELISA分析により得られたデータと良好な相関を示した。また、不活性リボザイムを用いた場合はいずれも、細胞に投与した後の3'切断産物に相当する cDNAは全て、目視不可能であった。 RNA基質のリボザイム切断が細胞RNAの調製中またはプリアマー伸長反応そのものの間に起こらなかったことを確認するために、いくつかの対照実験を行なった。１つの対照実験として細胞溶解物に対するインビトロ転写で調製した本体標識ストロメリシンRNAを添加した。次にこの溶解物を非放射性プライマーを用いる他は典型的なRNA調製およびプライマー伸長分析に付した。細胞溶解の時点で細胞内に存在するリボザイムがその後の分析の間の何れの条件下でも活性である場合は、添加した本体標識ストロメリシンRNAは切断されることになる。しかしながら、実際はそのような場合はあり得ない。全長RNAのみがゲル分析で目視でき、リボザイム切断産物は存在しなかった。リボザイム処理細胞由来のRNA中に検出された切断産物は、細胞内のリボザイム切断から得られたものであり、その後の分析の間に得られたものではない。実施例10 RNAse保護検定 RNA保護分析により、細胞内の基質RNAのリボザイム切断により発生した3'および5'産物の両方を同定することができる。RNA保護検定は本質的には、溶解物リボヌクレアーゼ保護キット(United States Biochemical Corp.)とともに供給された使用説明書に記載のとおり実施する。RNAse保護のためのプローブはリボザイム切断部位の周囲の配列に相補的なRNAである。この「アンチセンス」プローブRNAは5'プライマーがT7プロモーター配列含有DNAオリゴヌクレオチドであったポリメラーゼ連鎖反応により調製されたテンプレートからインビトロで転写される。プローブRNAは反応に³²P[CTP]を使用することにより転写の間に本体標識され、G-50セファデックス上のクロマトグラフィーにより、組み込まれなかったヌクレオチドトリホスフェートから分離精製される。プローブRNA(100,000〜250,0 00cpm)を、細胞溶解物由来RNAまたは細胞溶解物から精製したRNAに37℃で一夜ハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション後、RNAseT1およびRNAse Sを添加して、全ての一重鎖RNAを分解し、得られた生成物をゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析する。この分析によれば、全長未切断標的RN Aは全長プローブを保護することになる。リボザイム切断標的RNAについては、プローブが結合する領域で切断がすでに起こっているため、プローブの一部のみが RNAse消化分解から保護されることになる。これにより、２つの保護プローブフラグメント、即ち、その大きさがリボザイム切断が起こる位置を反映するもの、そして、その大きさが全長保護プローブの大きさまで増加するようなものが得られる。 RNAse保護分析は活性または不活性のリボザイムの何れかを投与しておいたウサギ滑膜線維芽細胞から単離した細胞RNAに対して実施した。試験したリボザイムはウサギ配列に対して特異的であるがヒトリボザイム部位617および820に相当する７ヌクレオチドアーム部（即ちRZ 617R 7/7，RZ 820R 7/7）を有していた。同じ部位に対する不活性リボザイムもまた７ヌクレオチドアーム部を有しており、上記した２つの不活性化変化を含んでいた。不活性リボザイムは1μMの濃度におけるインビトロの典型的な１時間のリボザイム切断反応において全長ウサギストロメリシンRNAに対して活性ではなかった。全ての試料について、0.15μMリボザイム1mlをトランスフェクタム^TM複合体として血清欠乏細胞に投与した。インターロイキン-1βを３時間後に添加し、細胞を24時間後に回収した。試験した活性リボザイムを投与した細胞から得た試料については、リボザイム切断産物を示す適切な大きさを有するプローブが目視できた。部位617については、125および29 7ヌクレオチドに相当する２つのフラグメントが存在し、部位820については、２つのフラグメントは328および94ヌクレオチド長であった。RNA切断産物を示す保護プローブフラグメントは何れかのリボザイムを投与されている細胞および不活性リボザイムを投与されている細胞から調製したRNA試料中では目視できなかった。しかしながら全長保護プローブ(422ヌクレオチド長)は目視でき、全長未切断ストロメリシンRNAがこれらの試料中に存在することを示していた。遊離リボザイムおよびトランスフェクタム複合体リボザイムの線維芽細胞への供給リボザイムはカチオン性脂質との複合体として、または遊離の形態で線維芽細胞に供給できる。遊離のリボザイムを供給するためには、リボザイム原液の適切な希釈溶液(最終濃度は通常1.5μM)を血清非含有培地中に調製し、放射性トレーサーを用いる場合は(即ち³²P)リホザイムの比放射能を800〜1200cpm/pmolに調整する。カチオン系脂質トランスフェクタムとの複合体となったリボザイムを供給するためには、脂質をまずジオレオイルホスファチジルコリン(DOPE)1/1(w/w)を含有する原液として調製する。リボザイムを1/5(RZ/TF)の原料比でトランスフェクタム/DOPE混合物と混合し、36量体のリボザイムについては、これはトランスフェクタム45倍モル過剰となる(トランスフェクタムは分子当たり４価の正電荷を有する)。室温で10分間インキュベートした後、混合物を希釈して、通常はリボザイム濃度0.15μMで細胞に適用する。³²P実験については、リボザイムの比放射能は遊離のリボザイム実験の場合と同様とする。 24時間後、与えたトランスフェクタムリボザイムのcpmの約30%が（ヌクレアーゼ耐性状態で）細胞と会合する。このうち、cpmの約10〜15%が未損傷のリボザイムに相当し、これは細胞当たり約20〜25,000,000リボザイムになる。遊離のリボザイムについては、与えた用量の約0.6%が24時間後に細胞と会合する。このうち約10〜15%が未損傷であり、これは細胞当たり約600,000〜800,000リボザイムに相当する。リボザイムの投与選択されたリボザイムを予防的に、または関節炎症状を有する患者に、例えば適切な供給担体、例えばカチオン系脂質、非リン脂質リポソーム、生体分解性重合体、リポソーム、制御放出担体を用いた所望の組織へのリボザイムの外来物質としての供給により、イオン導入法、電子穿孔法(electroporaion)またはイオン対分子を用いることにより、ありは共有結合付加物として、そして、その他の薬理学的に許容される供給方法で、投与することができる。投与経路には、関節内投与、筋肉内投与、エアロゾル、経口投与（錠剤または丸薬形態）、局所投与、全身投与、眼投与、腹腔内投与および/または嚢胞内投与が含まれる。リボザイムによる免疫化および/またはリボザイムの供給のための発現ベクターも適している。このようなリボザイムは癌および血管形成の治療においても有用である。何れかの選択されたリボザイムの特定の供給経路はリボザイムの使用形態により異なる。一般的に、各リボザイムの特定の供給プログラムは、細胞内局在化に関連した未修飾リボザイムの取り込み、次いで、効果の証明を目的としている。あるいは、動物の臓器または組織におけるこれらの同様の細胞への供給を目標とすることができる。取り込み試験には、供給担体または供給方法に関わらず、細胞によるリボザイムの取り込みを評価するための取り込み試験が含まれる。このような検定はまた、取り込み後のリボザイムの細胞内局在化を測定することもでき、最終的には、標的配列を含有する細胞内コンパートメント（核および/または原形質）内の定常状態濃度を維持するための条件を確立することができる。次に有効性と細胞毒性を試験することができる。毒性には細胞の生存性が対象となるだけでなく、細胞の機能も対象となる。使用してよいいくつかの供給方法には以下の方法： a.リポソーム内へのカプセル化、 b.レトロウイルスベクターによる形質導入、 c.コレステロールとのコンジュゲート形成、 d.殆どの核タンパク質上に存在する核標的部位を利用した核コンパートメントへの局在化、 e.ヌクレオチド誘導体を用いたリボザイムの電荷の中和、 f.身体全体にリボザイムを分布させるための血統細胞の使用、および、 g.エキソビボおよびインビボのトランスフェクション、が含まれる。少なくとも３種類の供給方法が本発明では有用であり、それらにはリボザイム修飾、粒子担持薬剤供給担体、およびレトロウイルス発現ベクターが含まれる。未修飾のリボザイムは、殆どの小型分子と同様、ゆっくりではあるが細胞に取り込まれる。細胞による取り込みを促進するために、リボザイムは、その電荷を減少させるが特異的な官能基は温存するような方法で本質的にランダムに修飾してよい。これにより、細胞を通過して拡散することのできる分子が得られ、これにより透過性障壁を排除することができる。電荷を減少させるためのリボザイムの修飾は、これらのより大型の分子の細胞による取り込みを促進するための１つの方法である。しかしながら、リボザイムは構造的および官能基の点で小型の薬剤分子よりも複雑であるため、ランダムな方法は推奨できない。リボザイムの触媒活性を維持するために必要な構造上の基準は当該分野で良く理解されている。これらの基準を考慮しながら細胞内供給を促進させるための修飾方法を考案しなければならない。修飾方法はまた、ヌクレアーゼ分解に対する感受性を低化させるために考案される。これらの特徴の何れもリボザイムの有効性を大きく向上させるはずである。細胞による取り込みは、リボザイム切断活性のために必要なホスホジエステル結合を変化させる必要なく、数桁のオーダーで増大できる。ホスフェート骨格の化学修飾により、負電荷が低減され、膜を通る自由拡散が可能になる。この原理は、アンチセンスDNA法に関して十分明らかにされている。これは、DNAとRNAとの間の化学組成の類似性により、実現可能な方法となっている。身体内では、外部濃度の維持は、組織の細胞への修飾リボザイムの拡散を推進するために必要なこととなる。疾患を有する組織が一次的に高濃度の薬剤に曝露され、薬剤は全身吸収によりゆっくり拡散するような投与経路が望ましい。リボザイムの循環半減期を長くするように設計された薬剤担体を用いた静脈内投与を使用することができる。薬剤担体の大きさと組成により血流からの急速なクリアランスが制限される。感染部位に蓄積するようにされた担体がリボザイムを分解過程から保護することができる。薬剤供給担体は全身投与および局所投与の両方で有効である。遅延放出貯留体として機能するように設計することができ、あるいは、標的細胞に直接内容物を供給するように設計できる。直接供給薬剤担体を用いることの利点は、取り込み当たり複数の分子を供給できることである。このような担体は、その他の方法では血流から急速に消失するような薬剤の循環半減期を延長することが解っている。この種類に属するこのような特殊な薬剤供給担体の例としては、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生体分解性ナノカプセル、および生体付着性微小球である。この種類のデリバリーシステムのうち、リポソームが好ましい。リポソームは細胞内安定性を増大させ、取り込み効率を高め、そして、生物学的活性を向上させる。リポソームは中空の球状の嚢胞であり、細胞膜を構成する脂質と同様の状態で配列した脂質よりなる。水溶性化合物を捕獲するための内部水性空隙を有しており、大きさは直径0.05〜数ミクロンに渡る。いくつかの研究によれば、リポソームはRNAを細胞に供給することができ、RNAは生物学的に活性な状態のまま存続する。例えば研究用材料として本来設計されたリポソーム供給担体であるリポフェクチン(Lipofectin)は未損傷のmRNA分子を細胞に供給し、相当するタンパク質の生産を可能にすることが解っている。リポソームはいくつかの利点を有する。即ち、非毒性であり、組生物として生体分解性であり、長い循環半減期を示し、組織を標的とするために認識分子を容易にその表面に連結することができる。最後に、液体懸濁液または凍結乾燥製品の何れかの形態でリポソーム系薬剤の費用効率的な製造が可能であることは、許容可能な薬剤デリバリーシステムとして本方法が実行可能であることを示している。非粒子およびヒドロゲルのようなその他の制御放出薬剤デリバリーシステムもリボザイムのための潜在的な供給担体である。これらの担体は、化学療法剤およびタンパク質系薬剤のために開発されており、その結果、リボザイムの供給にも適用することができる。リボザイムの局所投与は、全身吸収を最小限にしながら投与部位に局在化した濃度を得ることができるため、有利である。これによりリボザイムの疾患部位への供給方法が単純化され、毒性学的特性の範囲を減少させることができる。更に、適用する材料の量はその他の投与経路で必要とされる量よりもはるかに少ない。有効な供給のためにはリボザイムが感染細胞内に拡散することが必要である。負電荷を中和するためのリボザイムの化学修飾が浸透のために必要な唯一の工程である。しかしながら、電荷の中和が不十分な場合は、修飾リボザイムを透過性増強剤、例えばアゾーン(Azone)またはオレイン酸と共に、リポソーム内に製剤することができる。リポソームは修飾リボザイムおよび透過性増強剤がリポソームから感染細胞に移行するための遅延放出提供担体として存在するか、または、リポソームリン脂質は、修飾リボザイムおよび透過性増強剤と共に細胞内供給の促進に直接参加することができる。場合により、リボザイムおよび透過性増強剤の両方を遅延放出のための坐薬製剤に製剤することができる。リボザイムはまた全身投与してよい。全身吸収とは、血流中への薬剤の蓄積、および、その後の全身に渡る分布を指す。全身吸収をもたらすような投与経路には、静脈内、皮下、腹腔内、鼻内、嚢胞内および眼内投与が含まれる。これらの投与経路の何れも、リボザイムを接触可能な疾患組織に曝露させる。皮下投与は局所リンパ節に導入し、その後リンパ網を介して循環系に至る。循環系への導入速度はモル重量または大きさの関数であることが解っている。リポソームまたはその他の薬剤担体の使用により、リボザイムはリンパ節に局在する。リボザイムを細胞中に拡散するように修飾することもできるが、リポソームを未修飾または修飾されたリボザイムの細胞への供給に直接参加させることもできる。リンパ球およびマクロファージにオリゴヌクレオチドを供給することのできるリポソーム製剤もまた、特定の状況に有用である。このオリゴヌクレオチドデリバリーシステムは感染した一次免疫細胞におけるmRNAの発現を防止する。全血試験によれば、製剤は37℃で８時間後にリンパ球の90%により取り込まれた。生体分布薬物動態予備試験によれば静脈内投与１時間後に脾臓中組織gm当たり注射用量の70%が認められた。静脈内注射されたリポソームは肝臓、肺および脾臓に蓄積する。この蓄積が注射用量の30〜40%となるように組成と大きさを調整することができる。残りの用量は24時間までの期間血流中を循環する。選択された供給方法は、原形質蓄積をもたらすことが必要であり、分子は最適投与のためにはある程度のヌクレアーゼ耐性を有さなければならない。核供給を行なってもよいが、好適度は低い。最も好ましい供給方法にはリポソーム(10〜4 00nm)、ヒドロゲル、制御放出重合体、ミクロ注射または電子穿孔(エキソビボ投与の場合)およびその他の薬学的に適用可能な担体の使用が含まれる。投薬は適応症および投与経路により異なるが、100〜200mg/kg体重/日の範囲である。投与期間は疾患の症状の経過期間を通じて、おおむね継続的に設ける。投与回数は疾患、供給担体および臨床試験の薬効データに応じて設定する。細胞内のリボザイムの治療濃度の確立は取り込みおよび分解の速度に基づく。分解の程度を低減することによりリボザイムの細胞内半減期は延長される。即ち、化学修飾されたリボザイム、例えばホスフェート骨格による修飾またはヌクレオチド類縁体による5'および3'末端のキャッピングを有するものは、異なる投薬方法を必要とする。有用な系の説明は上記した参考文献に記載されており、その内容は参考のために本明細書に組み込まれる。その他の実施態様もまた以下に示す請求の範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マッスウィッゲン、ジェームズアメリカ合衆国80301コロラド、ボウルダー、フランクリン・ドライブ4866番 (72)発明者ガストフソン、ジョンアメリカ合衆国80301コロラド、ボウルダー、グレンウッド・ドライブ・ナンバー 207、2955番

Claims

【特許請求の範囲】１．関節炎症状の発症または持続に関与するmRNAを切断する酵素的RNA分子。２．マトリックス金属タンパク質をコードする遺伝子から産生されるmRNAを切断する、酵素RNA分子。３．配列認識番号１〜367の配列からなる群から選択される配列を有する標的mRN Aを切断する、請求項１または２記載の酵素的RNA分子。４．配列認識番号の配列からなる群から選択される配列を有する標的mRNAを切断する、請求項１記載の酵素的RNA分子。５．配列認識番号34，35，57，125，126，127，128，129，140，162，170，179 ，188，223，224，236，245，246，256，259，260および281の配列からなる群から選択される配列を有する標的mRNAを切断する、請求項１記載の酵素的RNA分子。６．配列認識番号368，369m，371，372および374の配列からなる群から選択される配列を有する標的mRNAを切断する、請求項１記載の酵素的RNA分子。７．該RNA分子がハンマーヘッドモチーフである、請求項1,2または3記載の酵素的RNA分子。８．該RNA分子がヘアピン、デルタ型肝炎ウィルス、１群イントロンまたはRNAse P RNAモチーフである、請求項4記載の酵素的RNA分子。９．リボザイムが該mRNAに対して相補的な5〜23塩基を含有する、請求項４記載の酵素的RNA分子。１０．リボザイムが該mRNAに対して相補的な10〜18塩基を含有する、請求項６記載の酵素的RNA分子。１１．リボザイムが該mRNAに対して相補的な30〜45塩基を含有する、請求項６記載の酵素的RNA分子。１２．請求項1,2または3記載の酵素RNA分子を含有している哺乳類細胞。１３．該細胞がヒト細胞である請求項８記載の細胞。１４．哺乳類細胞内で酵素的RNA分子の発現を可能にするような状態で請求項1,2 または3記載の酵素的RNA分子をコードする核酸を含有する発現ベクター。１５．請求項1,2または3記載の酵素的RNA分子を患者に投与することにより関節炎症状を治療する方法。１６．患者がヒトである請求項11記載の方法。１７．薬学的に許容される緩衝液中に請求項1，2，3，4，5または6の分子の治療有効量を含有する組成物であって、該組成物が関節炎、癌および血管形成よりなる群から選択される疾患の治療に用いるものである医薬組成物。