【発明の詳細な説明】
カンプトテシン処方物
発明の分野
本発明は、毒性が低減され、効力が向上したカンプトテシンおよび関連類似体
のリポソーム処方物に関する。
発明の背景
実験的な癌の化学療法だけでなく臨床試験においてリポソーム中の抗癌剤を記
載した報告がいくつかの文献においてみられ、その理論的根拠はリポソーム封入
により封入された抗腫瘍薬の薬物動態学的変数が変わることにある（ダウド、エ
ス・エス（Daoud,S.S.）ら、リポソーム・イン・カンサー・セラピー，アドブ・ドラ
ッグ・デリブ・レヴ（Liposomes in Cancer Therapy．Adv.Drug Deliv.Rev.），３
：４０５−４１８、１９８９）の報文参照）。リポソームにより得られる薬物デ
リバリーの利点は、宿主に対するリポソーム内容物の保護、循環／徐放性の延長
、および標的化の可能性（受動的、区画的、リガンド−媒介および身体的）を包
含する。
今日まで、ほとんどすべての抗癌剤はリポソーム中に封入されている。これら
は、アルキル化剤、ニトロソ尿素、シスプラチン、代謝拮抗物質（シトシンアラ
ビノシド、メトトレキサート、５−フルオロ−ウラシル）およびアントラサイク
リンを包含する。アントラサイクリン抗生物質を含有するリポソームに関する研
究は、薬物を受容しない対照と比較して、心臓毒性および皮膚毒性の減少、およ
び腫瘍を有する動物の生存期間の延長を明示した（セルズ、アール・エイ（Sell
s,R.A.）ら、カンサー・トリートメント・レポーツ（Cancer Treat.Rep.）、１４
：３８３−３８７（１９８７）参照）。広く用いられるアントラサイクリン抗生
物質であるドキソルビシンは、今や第III期臨床実験にある。
抗癌剤カンプトテシンおよび関連類似体のトポテカン（水溶性類似体）は、数
種のヒト腫瘍に対して広範囲に及ぶ活性を示す有望な抗腫瘍薬群に含まれる。こ
の治療薬は、移動性複製フォークの前に導入されたねじれ歪を緩和するためＤＮ
Ａ複製に緊密に関与する酵素であるトポイソメラーゼＩの特異的阻害剤である。
この酵素の阻害は、複製中に致命的なＤＮＡ損傷をもたらす。トポイソメラーゼ
の阻害物質は、その標的酵素の生成物を一掃することによって細胞毒性を生じさ
せるのではなく、トポイソメラーゼ機能に干渉してＤＮＡ損傷を引き起こすこと
により細胞毒性を生じさせる点で独特である（ヘルツベルグ、アール・ピー（Her
tzberg,R.P.）ら、バイオケミストリー（Biochemistry）、２８：４６２９−４
６３８（１９８９））。
親化合物であるカンプトテシンは、水に不溶性でありかつ水中で不安定であり
、迅速なpＨに依存するが可逆的な加水分解を受け、in vivoにて速やかに一掃さ
れる不活性カルボン酸塩イオンになる。ラクトンの開環変換はアルカリ性pＨで
特に好ましく、生理学的pＨ（７.４）で開環形態が優勢である。今や第II期臨床
実験にある、カンプトテシンの水溶性類似体であるトポテカンもまた、可逆的ラ
クトン加水分解およびカルボン酸塩形態への変換により不活化される（アンダー
バーグ、ダブリュウ・ジェイ・エム（Underberg,W.J.M.）ら、ジャーナル・オブ・
ファーマシューティカル・アンド・バイオメディカル・アナリシス（J.Pharmac.Bio
med.Analysis）、８：６８１−６８３（１９９０））。
すべての抗腫瘍薬と同様、カンプトテシンおよびトポテカンの臨床的使用は用
量依存性毒性により制限される。マウスにおいて、カンプトテシンの懸濁液に関
して決定された中毒量は１２ｍｇ／ｋｇであり、トポテカンのセイライン溶液（
pＨ３.０）の場合は１５ｍｇ／ｋｇである。他のリポソーム製剤に関して報告さ
れている研究によれば、カンプトテシン／トポテカンの薬物動態学および薬理学
はリポソーム処方物において変化すると予想される。かくして、リポソーム中に
処方されるカンプトテシンおよび関連類似体の安定性および抗腫瘍活性の改良は
、これらの抗腫瘍薬の商業的価値を確実に増加させるであろう。
発明の要約
本発明はカンプトテシンおよびその構造的に関連した類似体の新規リポソーム
処方物を提供する。これらの新規処方物は本発明の化合物についての薬物動態学
および薬理学を向上させ、これにより抗腫瘍治療における使用に関する用量依存
性毒性が低下する。
より詳細には、カンプトテシンおよびその構造的に関連した類似体の処方物は
、全薬物の少なくとも８０％が高い対脂質薬物比（モル比）（少なくとも１／１
００、好ましくは１／１０）で、リポソームの脂質二重層に組み込まれ、脂質が
天然源である、水性層中に分散された多重ラメラ小胞の形態である。
発明の詳細な記載
生物活性な分子が、人工脂質／水性球状構造であるリポソーム中に封入できる
ことは当業界では周知である。リポソームは水または水性緩衝液部分により分か
れた脂質二重層の１またはそれ以上の同心球体からなる構造と定義される。二重
層の数は、脂質組成および製法に依存する。さらにエネルギーを与えると、多重
ラメラ小胞（ＭＬＶ）は単ラメラ小胞（ＵＬＶ）を形成することができる。リポ
ソームに関して多くの特許および科学論文が発表されており、リポソーム形成お
よび薬物封入の技術的態様は当業界で周知である(カリス、ピー・アール(Cullis
P.R.)ら、ジェネレイティング・アンド・ローディング・オブ・リポソーマル・システ
ム・フォア・ドラッグ・デリバリー・アプリケイションズ，アドブ・ドラッグ・デリブ・
レヴ（Generating and loading of liposomal systems for drugdelivery appl
ications．Adv.Drug Deliv.Rev.）３：２６７−２８２，１９８９）参照)。
本発明は、好ましくは、脂溶性薬物である場合には、脂質二重層中に少なくと
も８０％の薬物が、薬物の脂質に対する比（モル）が少なくとも１／１００、好
ましくは１／５０ないし１／５、より好ましくは１／２０ないし１／１０で封入
された、水性層中に分散された多重ラメラ小胞または単ラメラ小胞の形態の非経
口投与されるカンプトテシンおよびその構造的に関連した類似体の新規リポソー
ム処方物を提供する。好ましくは、全脂質濃度は１０〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好
ましくは１００〜５００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２００〜４００ｍｇ／ｍｌ
、
さらにより好ましくは１００〜２００ｍｇ／ｍｌである。好ましくは、小胞は多
重ラメラである。粒径は当業者であれば変えたり、容易に測定できる。このよう
な投与に関する粒径は一般に０.５〜１０ミクロン、好ましくは０.２〜２.０ミ
クロンである。静脈内投与の場合、粒径は、好ましくは、０.２ミクロン未満で
ある。
本発明の多重ラメラ小胞は標準法により調製でき（カリス、ピー・アールら、
ジェネレイティング・アンド・ローディング・オブ・リポソーマル・システム・フォア・
ドラッグ・デリバリー・アプリケイションズ，アドブ・ドラッグ・デリブ・レブ，３
：２６７−２８２，１９８９）参照）、その開示をすべて出典明示により本発明
の一部とする。親油性薬物に関して適した一の方法は、ａ）脂質および薬物を適
当なリピッドフラスコ中で有機溶媒中に溶解させ、ｂ）真空下で有機溶媒をゆっ
くり除去してリピッドフラスコの内壁上に乾燥した脂質−薬物フィルムを析出さ
せ、ｃ）乾燥脂質−薬物フィルムを水性緩衝液または食塩水で水和させ、続いて
渦動などの機械的攪拌で薬物−脂質懸濁液を分散させてリポソームを得る。これ
らの多重ラメラリポソームを凍結−解凍し、必要ならばポリカーボネート膜を通
して押し出すことにより小さくすることができる（カリス、ピー・アールら、ア
ドブ・ドラッグ・デリブ・レブ，３：２６７−２８２，１９８９）参照、その開示
をすべて出典明示により本発明の一部とする）。別の好ましい方法においては、
親油性薬物をイオン化可能な水和剤を用いて脂質と混合して「プレリポソームゲ
ル」を形成することができる。ゲルを水性溶液で希釈した後、親油２性薬物を封
入したリポソームを形成することができる（ＥＰＯ出願第８６３０６０１４．１
号１９８７年２月２５日公開、米国特許第５２３０８９９号、その開示をすべて
出典明示により本発明の一部とする）。
好ましくは、脂質は天然源から粗抽出物として得られる。粗抽出物は例えば以
下の二つの表に示したような多くの異なる成分を含有する。（パルタフ（Paltau
f）ら、「ホスホリピッズ−ナチュラル、セミシンセティック、シンセティック
」・イン・ホスホリピッズ：バイオケミカル、ファーマシューティカル・アンド・ア
ナリティカル・コンシダレイションズ（“Phospholipids-Natural,
Semisynthetic,Synthetic”in Phospholipids:Biochemical,Pharmaceutical and
Analytical Considerations）ｐｐ１〜１２，プリーナム・パブリッシャーズ（P
lenum Publishers），ＮＹ（１９９０））。
本発明の目的に関して、粗抽出物はしばしば高度に精製して、望ましい場合は
例えばレシチンなどの単一成分にする。酵素ホスホリパーゼＤにより触媒される
トランスホスファチジル化反応により抽出物をホスファチジルグリセロールなど
の特定の脂質に関して純化し、これは高度に精製された抽出物で最もよく行われ
、これはまた粗生成物にも用いられ、市販の卵レシチンなどの卵ホスファチジル
グリセロール（ＥＰＧ）が得られる。
脂質が燐を含む場合、すなわち燐脂質である場合、これは好ましくは周囲温度
、より好ましくは生理学的温度で流体である。
所望により、混合物は少量の合成脂質の混合物を含有してもよい。本発明にお
いて用いる合成脂質は、二飽和燐脂質ジミリストイル、ジパルミトイル、および
ジステアロイルなどの天然源において見られない均質な脂質を意味する。
本発明において用いる脂質は不飽和結合を含んでもよい。この不飽和は、１個
の脂肪アシル鎖上または（可能ならば）両鎖中にあってもよく、鎖は１個以上の
二重結合を含んでもよいか（すなわち二不飽和）または鎖は部分的に水素化され
ていてもよいか、あるいはその混合物を含んでもよい。好ましくは、燐脂質が不
飽和である場合、これは、ジオレイル（Ｃ１８：１）またはジリノレオイル（Ｃ
１８：２）ホスファチジルコリンまたはグリセロールなどの二不飽和生成物であ
る。好ましくは、脂質二重層は少なくとも３０％（モル）不飽和脂肪アシル鎖を
有する脂質を含有する。本明細書において用いる「脂肪アシル鎖」なる語は脂肪
酸のエステルである。あるいは、「脂肪酸鎖」なる語も用いられる。
本明細書において用いる脂質は、負、中性、または正電荷のものであってもよ
い。このような生成物は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールア
ミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジル
グリセロール（カルジオリピン）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシト
ール、スフィンゴリピド、糖脂質、スルファチド、リソリピッドなどの脂質およ
び脂肪酸、コレステロールなどのステロール、重合性脂質、およびその組み合わ
せを包含する。
大豆および卵源の市販品が好ましく、好ましくは、大豆および卵レシチンであ
る。卵レシチンから得られるホスファチジルグリセロールなどの燐脂質も市販さ
れている。適当な水素化レシチンは、ホスホリポンＨおよびＧ（アメリカン・レ
シチン（American Lecithin）コネチカット州、ダンバリー）；ならびにアサヒ
５、２０、４０および６５型卵ホスファチド（旭化成、日本国、東京）の商標の
製品である。本発明で用いられる他のレシチン製品はセントロフェイズ３１およ
びセントロレックスＰ（セントラル・ソヤ（Central Soya）、インディアナ州、
フォート・ウェイン）である。
生理学的条件下で、レシチンおよびホスファチジルグリセロールは二重層形成
脂質であり、ある種の燐脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンおよびカ
ルジオリピン、スフィンゴリピド、スルファチド、リソリピッド、糖脂質および
グリセリド、ならびに脂肪酸は安定な二重層を形成しない。したがって、二重層
形成脂質の非二重層形成脂質に対する比は９：１ないし１：１、好ましくは９：
１ないし７：１である。
本発明において用いるホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロー
ル誘導体は、天然の大豆または卵黄に限定されず；あるいは天然の大豆または卵
黄ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールの水素化により得ら
れる水素化製品が包含される。適当なホスファチジルグリセロール誘導体は卵黄
ホスファチジルグリセロールまたはその塩形態である。
半合成製品、例えばジミリストイル−、ジパルミトイル−、ジステアロイル−
、ジオレオイル、ジリノレオイル、およびその混合物、例えば１−パルミトイル
−２−オレオイルなどを添加してもよい。好ましくは、半合成品を用いる場合、
これは１−パルミトイル−２−オレオイル、ジオレオイル−またはジ−リノレオ
イル；またはその混合物である。好ましくは、脂質の極性先頭基はコリンまたは
グリセロールである。単一成分またはこれらの２種の混合物を用いる場合、その
天然の類似体と同様の量である。好ましい成分は、１−パルミトイル−２−オレ
オイル−ホスファチジルコリンまたはホスファチジルグリセロール、ジオレオイ
ルホスファチジルコリンまたはホスファチジグリセロール（ＤＯＰＣまたはＤＯ
ＰＧ）である。好ましくは、望ましい場合には、他の二置換半合成成分を少量添
加
してもよい。本発明において使用する少量は１０％（モル）未満、好ましくは５
％（モル）未満である。
少量の他の合成二飽和脂質、例えばＣ−１４、Ｃ−１６およびＣ−１８脂肪ア
シル鎖を有するホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロール誘導体
；またはエステル結合した脂肪酸を有する脂質、例えばモノ−、ジ−、およびト
リグリセリド、またはその組み合わせも添加してもよい。
好ましい脂質は、
ａ）一不飽和（Ｃ：１８）または（Ｃ１８：２）脂肪アシル鎖；
ｂ）二不飽和（Ｃ：１８）または（Ｃ１８：２）脂肪アシル鎖；
ｃ）１個の一不飽和ＰＣまたはＰＧが長い（Ｃ１６またはそれ以上）飽和脂肪ア
シル鎖をグリセロール骨格の１位に有し、オレイン酸まはリノール酸が２位でエ
ステル化されているもの
を有するホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルグリセロール（Ｐ
Ｇ）である。このような生成物の一つに１−パルミトイル−２−オレオイルがあ
る。これらの燐脂質における脂肪酸組成は、天然源からの燐脂質において見られ
る脂肪酸分布に類似しているので、この種類が特に好ましい。
好ましい二置換燐脂質はジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰ
Ｇ）およびジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）である。
脂質二重層は、好ましくは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、
ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、
ホスファチジン酸、およびステロール、例えばコレステロールまたはその組み合
わせから選択される脂質を含んでもよい。
適当な中性脂質は、ホスファチジルコリンおよびステロール、例えばコレステ
ロールおよびコレステロール誘導体を包含するが、これに限定されない。
適当な負電荷燐脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン
、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸およびジホスファチジルグリ
セロール（カルジオリピン）およびコレステロール類似体、例えばコレステロー
ルスルフェートおよびヘミスクシネートを包含するが、これに限定されない。
適当な正の脂質は、ステアリルアミン、またはスフィンゴシンを包含するが、
これに限定されない。
脂質は、好ましくは、ステロール誘導体だけでなくコレステロールおよびコレ
ステロール類似体（これに限定されない）などのステロール誘導体を含むが、こ
れに限定されない。脂質処方物はさらに負に帯電したコレステロール塩、例えば
コレステロールスルフェートまたはヘミスクシネートなどを中性ステロールと組
み合わせて含んでもよい。
処方物はまた、別の成分、たとえば酸化防止剤、すなわちビタミンＡ（α−ト
コフェロール）またはトコフェロール−ヘミスクシネートを含んでもよく、また
は他の通常の酸化防止剤を用いてもよい。
「重合性脂質」なる語は当業者には周知であり、適当には、これらの脂質は、
リポソームの膜を形成する個々の脂質分子と共有結合させることにより超音波処
理した小胞が凝集を維持し、融解を最小とするように用いられる。このような重
合に適した基は、ビニル、アクリロイル、メタクリロイル、ブタジエン、ジアセ
チレンおよびＨ2ＮＣＣ(Ｏ)ＯＣＨ3を包含するがこれに限定されない。重合性基
の反応性は二重層の状態により影響を受ける。好ましくは、結合基はジアセチレ
ン基である。ジアセチレン基を含有する燐脂質は例えば片方または両方のアシル
鎖に含有する。ジアセチレン基を含有するホスファチジルコリンは大きな多重ま
たは単ラメラ小胞として分散している場合に重合するが、小さな小胞で分散して
いる場合には重合しない。これらの重合性基は、界面活性剤分子のあらゆる部分
、炭化水素鎖の極性先端部から末端まで存在しうる。小胞の構成分子の架橋は小
胞の安定性を増加させることが判明している。重合性脂質の総論は、リポソーム・
テクノロジー（Liposome Technology）、第１巻、リポソームの調製（Preparat
ion of Liposome）、第９章，グレゴリアディス，グレゴリー（Gregoriadis，Gr
egory）（１９８４）ＣＲＣ・プレス）に記載され、その開示を出典明示により本
発明の一部とする。
リポソームの表面は、ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で
、当業者に周知の方法を用いて修飾してもよい。（ウッドル・エム・シーおよびラ
シッ
ク・ディー・オー（Woodle,M.C.およびLasic,D.O.），バイオシミカ・エ・バイオフ
ィジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）１１１３：１７１−１９３，１９９２
；またはブルーム（Blume）ら、バイオシミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ，１０
２９：９１−９７，１９９０）。脂質マトリックス内に封入されている脂質また
は脂質類似体と他の物質の組み合わせが生理学的に適当な条件下で二重層を形成
するならば、リポソームの修飾は、ほ乳類に有害な影響を及ぼさない一切の入手
可能な脂質を用いて行ってもよい。当業者は、リポソームの組成を修飾して、得
られるリポソームの生物分布および薬物動態学を調節してもよい。
負に帯電したリポソームは、約０％ないし約５０％（モル）の負に帯電した脂
質、より好ましくは、約０％ないし約３０％（モル）の負に帯電した脂質を組成
物中に含んでもよい。中性脂質の負に帯電した脂質に対する比は、９：１ないし
１：１、好ましくは３：１ないし１：１、より好ましくは９：１ないし３：１で
ある。リポソーム中にコレステロールも配合されている場合、そのレベルは０な
いし約５０％、好ましくは約１０％ないし約３０％、より好ましくは約１５ない
し２５％である。中性脂質のコレステロールに対する比は、約８：１ないし約１
：１、より好ましくは４：１ないし１：１である。
中性脂質：負電荷脂質：ステロール含有脂質の好ましいモル比は、それぞれ、
４：２：４、６：１：３、４：３：３、および５：４：１である。好ましくは、
中性脂質はホスファチジルコリンであり、負脂質はホスファチジルグリセロール
であり、ステロールはコレステロールまたはその誘導体である。
本発明の好ましい具体例は、カンプトテシンまたはその構造的に関連した類似
体を含む、薬物の脂質に対する比（モル）が少なくとも１／１００である水性相
中に分散された多重ラメラまたは単ラメラ小胞の形態の医薬組成物であって、脂
質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジ
ルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール（カル
ジオリピン）、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴリ
ピド、糖脂質、スルファチド、リソリピッドおよび脂肪酸、ステロール、重合性
脂質、またはその組みあわせから選択され；脂質二重層は少なくとも５％（モル
）
の量で存在する少なくとも１個の帯電した脂質成分、または少なくとも５％（モ
ル）の量の水溶性類似体の塩の形態；またはその混合物を含む。帯電した成分は
、好ましくは負に帯電している。さらに、負に帯電した成分の存在する量は少な
くとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％
である。好ましい負の成分はホスファチジルグリセロール、コレステロールの帯
電した塩、例えばコレステロールスルフェート、またはヘミスクシネート、また
はホスファチジルセリンであり、より好ましくは、卵ホスファチジルグリセロー
ル（ＥＰＧ）である。この処方物は脂溶性類似体に使用できるが、本発明におい
てはトポテカンなどの水溶性類似体に関しては用いるのが好ましい。最適には、
水溶性類似体は水性相中に多量に存在しないが、脂質二重層中に、好ましくは少
なくとも３０％、より好ましくは５０％、最も好ましくは８０％存在する。
別の具体例において、小胞は非イオン性界面活性剤からなる。この種の小胞は
「ニオソーム」として知られている。ハンジャニ−ビラ（Handjani-Vila）ら、
インターナショナル・ジャーナル・オブ・コスメティック・サイエンス（Int.J.Cos.
Sci.），１：３０３−３１４；バイリエ（Baillie）ら、ジャーナル・オブ・ファ
ーマシー・アンド・ファーマコロジー（J.Pham.Pharmacol.）,３７：８６３−８６
８；ヴァン・ハル（van Hal）ら、ユーロ・ジェイ・ファーム・バイオファーム（Eur
.J.Pharm.Biopharm），３８，４７；およびホフランド（Hofland）ら、ジェイ・
コントル・レル（J.Contr.Rel.）１６：１５５−１６８参照、その開示をすべて
出典明示により本発明の一部とする。ニオソームは数種の非イオン性界面活性剤
、例えばポリグリセロールアキルエーテル、グルコシルジアルキルエーテル、ク
ラウンエーテル、およびポリオキシエチレンアルキルエーテルから調製される。
一の可能な脂質の組み合わせは、コレステロールおよび非イオン性界面活性剤の
使用にある。しばしば、帯電した界面活性剤を二重層中に挿入して、小胞間に静
電斥力を導入し、安定性を増加させる。
本明細書において用いる「カンプトテシンおよびその関連した類似体」なる語
は、カンプトテシンおようび種々の置換基を有する同じ核環系を有する化合物を
意味するが、このような修飾または置換は環ＡおよびＢにあるのが好ましい。
カンプトテシンの基本構造は、
である。
多くの修飾が行われているが、本発明において用いるのに好ましいのは、以下
の類似体である：９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、９−
ヒドロキシ−カンプトテシン、１０−ヒドロキシ−カンプトテシン、１０−アミ
ノカンプトテシン、９−ヒドロキシ−１０−ジメチルアミノメチルカンプトテシ
ン、２０−（ＲＳ）−１０,１１−メチレンジオキシカンプトテシン、９−クロ
ロ−１０,１１−メチレンジオキシ−（２０Ｓ）−カンプトテシン、および７−
エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンおよびその誘導体、例えば７−エチル
−１０−［［［４−（１−ピペリジノ）−１−ピペリジノ］カルボニル］オキシ
カンプトテシン。好ましくは、本発明における使用に関しては、類似体は脂溶性
類似体である。
新規アルカロイドカンプトテシンのカンプトテカ・アクミナタ（Camptotheca
acuminata）は１９６６年に初めて単離され、多くの関連類似体が調製され、当
業界で周知である。かかる化合物に関連するすべての論文および特許を列挙する
のは困難であるが、本発明において有用な別の類似体を示す代表的な文献は以下
のとおりであるが、これに限定されない。１１−ヒドロキシカンプトテシンを開
示するウォール（Wall）ら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（J.M
ed.Chem.），第２９巻，ｐｐ１５３３−１５５５（１９８６）；米国特許第４９
８１９６８号、第４８９４４５６号および第５１２２５２６号（ウォール（Wall
）ら）；カンプトテシンのヒドロキシラクトン環の修飾を開示するヘルツ
ベスグ（Hertzberg）ら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、第３２
巻、ｐｐ７１５−７２０（１９８９）；ワニ（Wani）ら、ジャーナル・オブ・メデ
ィシナル・ケミストリー、第２３巻、ｐ５５４（１９８０）、ワニら、ジャーナ
ル・オブ・メディシナル・ケミストリー、第３０巻、ｐ１７７４およびｐｐ２３１
７−２３１９（１９８０）；ワニら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミスト
リー、第２９巻、ｐ２３５８−２３６３およびｐｐ１５５３−１５５５（１９８
６）；ＪＰ５１−９１２９７、ＣＡ８４：１１５６２９；ダーウェント・アブス
トラクト（Derwent Abstract）８５−０３４３５４／０６（ヤクルト本社株式会
社）日本国特許５９−２２７８８４、ダーウェント・アブストラクト ８７−２８
１０１０／４０（ヤクルト本社株式会社）ＪＰ６２−１９５３８４；ＥＰＯ００
８８５４２；米国特許第４９１４２０５号、第４４７３６９２号、第４５４５８
８０号、第４０６４４６２号、および米国特許第５００４７５８号、その開示を
すべて出典明示により本発明の一部とする。
トポテカンなどのカンプトテシンの水溶性類似体の場合、脂質組成物および／
またはリポソームの電荷の予備修飾、または類似体の脂質誘導は、リポソームの
脂質二重層への封入を向上させるのに必要である。
リポソーム組成物の修飾は、本明細書において、リポソーム中に存在する負に
帯電した脂質の量を増加させたり；脂肪酸鎖の不飽和度を変更したり、二重層中
のコレステロールレベルを変更することを意味する。リポソームの電荷の修飾は
、本明細書においては負電荷脂質のレベルを増加させて全体のリポソーム電荷を
増加させることを意味する。
カンプトテシンの水溶性類似体は、本明細書において、生理学的pＨ範囲で帯
電する類似体または薬物を意味する。
脂質誘導による水溶性類似体の修飾は、本明細書において、脂質が薬物と反対
の電荷を有する場合、薬物を脂質基に共役結合させてイオン対を形成することを
意味する。
トポテカンなどの正の電荷を有する水溶性薬物に関して、コレステロールスル
フェートまたはヘミスクシネートなどの負電荷脂質を用いてもよい。水溶性類似
体とのイオン対の形成は、リポソーム形成中その場で、またはリポソーム中に封
入する前になされる。
本明細書において用いる「非経口」なる語は、静脈内、筋肉内、皮下または腹
膜組織内投与を意味する。当業者には、本発明の処方物の最適用量および個々の
服用間隔を、治療する症状の性質および程度、投与形態、経路および部位、なら
びに治療される患者によって決定され、このような最適条件は通常の技術により
決定できることが理解できよう。また、治療の最適経路、すなわち特定の日数間
一日あたりの投与回数は通常の治療決定試験により決定できることも当業者には
理解できよう。予備処置は、通常、カンプトテシンが治療過程（１カ月）に付き
、２０ｍｇ／Ｍ2ないし８００ｍｇ／Ｍ2の用量にて投与されるようにする。予備
処置は、通常、小肺細胞癌（ＳＣＬＣ）および卵巣癌について、治療過程に付き
、トポテカン（ＩＶ）が一日当たり１.５ｍｇ／Ｍ2の用量で５日間投与されるよ
うにする。
例えば、リポソーム中の薬物濃度は、カンプトテシンに関しては０.１ｍｇ／
ｍｌないし１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約４ｍｇ／ｍｌないし６ｍｇ／ｍｌであ
る。あらゆる場合において、リポソームの容積の合計は、所望の用量要件にあう
ように調節される。例えば、６０ｍｇ／ｋｇのカンプトテシン投与に関して、１
０ｍｌ／ｋｇの容積のリポソームを用いた。
最近、ティー・ジー・バーク（T.G.Burke）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・
ケミカル・ソサイエティ（J.Am.Chem.Soc.）、１１４：８３１８−８３１９、１
９９２およびバイオケミストリー（Biochem.）３２：５３５２−５３６４（１９
９３）は、ＤＭＰＣまたはＤＭＰＧの小さな単ラメラ小胞が、薬物のラクトン環
を脂質二重層中に挿入し、これを溶液（ＰＢＳ、pＨ７.４）から単離することに
より生理学的条件下でカンプトテシンおよび数種の類似体の安定性を向上させる
ことができることを報告している。著者らは、非常に高い対薬物脂質比（２.９
×１０5）でのカンプトテシンの結合および安定化を示しているが、処方物中に
て薬物の高負荷が非常に望ましいので、商業的にあまり注目されない。しかし、
リポソームは、薬物抗腫瘍活性を損なうことなく有効なデリバリーシステムを提
供しうる。
実施例１
カンプトテシン含有ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ多重ラメラリポソームの調製
１.４４０ｇまたは０.５４０ｇのジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭ
ＰＣ）を、０.１６０ｇまたは０.０６０ｇのジミリストイルホスファチジルグリ
セロール（ＤＭＰＧ）ナトリウム塩ならびに０ｇまたは０.０１８ｇのカンプト
テシンとそれぞれ２個の別々の脂質フラスコ中で混合した。６ｍｌの塩化メチレ
ン：メタノール（９／１、ｖ／ｖ）を添加して脂質を可溶化させ、十分量のクロ
ロホルム（５〜１０ｍｌ）を添加して脂質を完全に可溶化し、黄色がかった溶液
を得た。薬物不含の脂質を同様に処理した。その後、有機溶媒を真空下でロータ
リーエバポレータで除去し、薬物−脂質混合物の薄膜を得た。残存する溶媒を真
空下で一夜デシケータ中で除去した。
乾燥した薬物−脂質フィルムならびに薬物不含の脂質サンプルの水和を、脂質
の相転移温度（Ｔｍ）より十分高い温度である３７℃で行った。燐脂質が特徴的
なゲルから液晶転移を受ける温度はＤＭＰＣまたはＤＭＰＧ単独および二成分混
合物に関しては２３℃である。サンプルを生理食塩水（薬物含有および薬物不含
サンプルに関してそれぞれ５および８ｍｌ）で水和し、３７℃で１５〜３０分間
平衡処理した。脂質または薬物−脂質フィルムを、１分間の渦動サイクルを３〜
５回、最大速度で、実験室用ボルテックスミキサー（サイエンティフィック・イ
ンダストリーズ（Scientific Industries）より入手のボルテックス−ジニー（V
ortex-Genie）２を用いて攪拌することにより多重ラメラリポソームを得た。
得られたリポソームの組成は薬物不含リポソームおよび薬物含有リポソームに
ついて、各々、ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ（９０：１０）およびＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ：
カンプトテシン（８４.６：９.４：６.０）である。新しく形成されたリポソー
ムをさらに３７℃で約１時間平衡処理し、周囲温度で貯蔵した。全脂質および薬
物濃度は、各々、２００および６ミリグラム／ミリリットル（以下、ｍｇ／ｍｌ
と表す）であった。所望により、これらの多重ラメラリポソームを、０.４μｍ
および０.２μｍポリカーボネート膜を通して押し出すことにより縮小させるこ
とができる。
実施例２
カンプトテシン含有ＥＰＣ：ＥＰＧ多重ラメラリポソームの調製
すべての操作を周囲温度で行う以外は実施例１と類似の方法を用いて、卵ホス
ファチジルコリン（ＥＰＣ）および卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）ナ
トリウム塩からなる以下の多重ラメラリポソームを調製した：
ａ）ＥＰＣ：ＥＰＧ（９０：１０）；および
ｂ）ＥＰＣ：ＥＰＧ：カンプトテシン（８４.６：９.４：６.０）
（全脂質および薬物濃度は、各々、２００および６ｍｇ／ｍｌ）。
実施例３
カンプトテシン含有ＥＰＣ：ＥＰＧ：ＣＨＯＬ多重ラメラリポソームの調製
１.３３３ｇおよび０.４２５ｇの卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）を０.１
７１ｇまたは０.０６４ｇの卵ホスファチジルグリセロールナトリウム塩（ＥＰ
Ｇ）および０.１６７ｇまたは０.０６３ｇのコレステロール（ＣＨＯＬ）と２個
の別々の脂質フラスコ中で、あるとすれば、０.０１８ｇのカンプトテシンと一
緒に混合した。その後の工程を実施例１および２に記載したように周囲温度で行
った。得られたリポソームは以下のとおりであった：
ａ）ＥＰＣ：ＥＰＧ：ＣＨＯＬ（７０：１０：２０）；および
ｂ）ＥＰＣ：ＥＰＧ：ＣＨＯＬ：カンプトテシン（６５.８：９.４：１８.８：
６.０）
（全脂質および薬物濃度は、各々、２００および６ｍｇ／ｍｌ）。
実施例４
多重ラメラリポソーム中に組み入れたカンプトテシンの測定
リポソーム中に組み入れたカンプトテシンの量をコンスタンティニデス、ピー・
ピー（Constantinides,P.P.）ら、ケミストリー・アンド・フィジックス・リピッド
（Chem.Phys.Lipids）５１：１０５−１１８（１９８９））により記載された方
法に若干修正を加えた方法により測定する。簡単には、実施例１〜３の記載に従
って調製した多重ラメラリポソームを周囲温度（ＥＰＣ：ＥＰＧ、９０：１０お
よびＥＰＣ：ＥＰＧ：ＣＨＯＬ、７０：１０：２０（＋カンプトテシン））また
は３７℃（ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ ９０：１０（＋カンプトテシン））で３時間平
衡処理した。ついで、薬物不含または薬物−脂質混合物を５００００ｒｐｍで２
時間２５℃でＴi８０フィックスト・アングル・ローターを用いて遠心分離に付
した。これらの条件下で、水性媒体から分離された脂質および上清中のカンプト
テシンの濃度を、適当に希釈してベックマンＤＵ７０分光光度計を用いて２５３
ｎｍでの吸光度を測定することにより決定した。
リポソーム中の薬物の量を以下のようにして計算した：
ＤL（合計％）＝（Ｃt−Ｃs／Ｃt）ｘ１００
（式中、ＤLはリポソーム中の薬物であり、Ｃtは遠心分離前のカンプトテシンの
吸光度（全薬物配合）であり、Ｃsは脂質の存在によりカンプトテシンを除いた
上清の吸光度である）。吸光度は上清中に残存する脂質の量（全脂質の１０％未
満）に関して補正する。これらの脂質／分割研究の結果を第Ｉ表に要約する。
第Ｉ表に示すように、３種のすべてのリポソーム組成で、商業的価値のある処
方物として望ましい非常に高い薬物負荷が得られた。
実施例５
カンプトテシンリポソームの粒径測定
実施例１ないし３の記載に従って調製したカンプトテシンリポソームの粒径を
対応する薬物不含のリポソームと一緒に生理食塩水で４００倍に希釈してレーザ
ー光散乱を用いて測定した。種々のリポソーム処方物の粒径をモニターするため
にアルゴンレーザー２０００型を備えたマルバーン・フォトン・コリレーション・
スペクトロメーター（Malvern Photon Correlation Spectrometer）４７００型
（スペクトラ・フィジックス（Spectra Physics）より入手）を用いた。光散乱
を９０°の角度および２５℃の温度でモニターした。粒径標体としてポリスチレ
ン（ラテックス）ビーズを用いた。光散乱データを第II表に要約する。
多重ラメラリポソームに関して予想されるように、これらのリポソームの平均
粒径は約１ミクロン（μｍ）（第II表）であり、寸法分布は０.５ないし５.０μ
ｍ間である。これらのリポソームの寸法の不均質性はまた、ラテックスビーズ標
体に関して得られるものと比較して高多分散性により明らかである。多分散指標
は粒子の均質性の尺度である。これは０ないし１まで変化し、０に近づくほど粒
子は均質（単分散）である。
実施例６低脂質濃度でのトポテカンの多重ラメラリポソーム中への組み入れ
以下の卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、卵ホスファチジルグリセロール（
ＥＰＧ）およびコレステロール（ＣＨＯＬ）のクロロホルム中ストック溶液、硫
酸コレステロール（ＣＨＯＬ−Ｓ）およびトポテカンのメタノール中ストック溶
液ならびに硫酸コレステロールとトポテカンの疎水性塩（ＣＨＯＬ−Ｓ−ＴＯＰ
ＯＴＥＣＡＮ）のクロロホルム：メタノール（１：１）中ストック溶液を用いた
：ＥＰＣ（２４.４ミリモル）；ＥＰＧ（１３.０ミリモル）；ＣＨＯＬ（２５.
８ミリモル）；硫酸コレステロール（１３.７ミリモル）；トポテカン（１０.９
ミリモル）および硫酸コレステロール−トポテカン塩（２.３ミリモル）を用い
た。実施例１〜３の方法に類似する方法、水和溶液としてセイライン（pＨ３.１
）および全脂質濃度２.０ｍｇ／ｍｌ（２.７ミリモル）を用いて、以下の多重ラ
メラリポソームを周囲温度で調製した：
ａ）ＥＰＣ：ＥＰＧ：ＣＨＯＬ：トポテカン（４８：１９：２４：９）；
ｂ）ＥＰＣ：ＥＰＧ：ＣＨＯＬ：トポテカン（３７：３０：２４：９）；
ｃ）ＥＰＣ：ＥＰＧ：ＣＨＯＬ：ＣＨＯＬ−Ｓ：トポテカン
（４８：１９：１５：９：９）；
ｄ）ＥＰＣ：ＣＨＯＬ：ＣＨＯＬ−Ｓ：トポテカン
（６７：２４：４.５：４.５）；
ｅ）ＥＰＣ：ＣＨＯＬ：ＣＨＯＬ−Ｓ−トポテカン（６７：２４：９）。
実施例７高脂質濃度でのトポテカンの多重ラメラリポソーム中への組み入れ
実施例６の脂質および薬物ストック溶液および実施例１〜４と類似の方法を用
いて、トポテカンを配合した多重ラメラリポソーム（実施例６の組成ａ〜ｅ）を
高脂質濃度（２００ｍｇ／ｍｌまたは２７０ミリモル）でも調製した。薬物の脂
質に対する比（１：１１）を高低、両方の合計脂質濃度で維持した。
実施例８実施例６および７の多重ラメラリポソーム中へのトポテカン配合量の測定
実施例４に概要を示した方法を用いて実施例６および７の多重ラメラリポソー
ム中へ配合されたトポテカンのレベルを定量した。この実験の結果を第III表に
要約する。
実施例９
薬物不含のリポソームおよびトポテカン配合リポソームの粒径を実施例８に記
載したようにレーザー光散乱により測定した。第IV表にて光散乱データを要約す
る：
低脂質濃度で、トポテカンは対応するリポソームの粒径を減少させ、一方、高
脂質濃度では、薬物不含のリポソームおよび含有するリポソーム間で粒径に若干
の違いが観察された。また、これらのリポソームの大きさの不均質性もラテック
スビーズ標準に関して得られたものと比較して高い多分散性により明らかである
。トポテカンは、多分散性に対して小さいが可変性の影響を与えると思われる。
実施例１０
リポソームカンプトテシンの毒性評価
リポソームに処方したカンプトテシン（実施例１〜３）をＢ６Ｄ２Ｆ１マウス
において１日および５日に一回ボーラス注射により腹膜組織内投与して毒性を評
価し、カンプトテシン懸濁液処方物と比較した（Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド
：クレモホールＥＬ：水（１０：１０：８０（ｖ／ｖ））。用量および合計脂質
用量をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇおよび２.０ｇ／ｋｇに維持した。薬物不含リポ
ソームを２ｇ／ｋｇ投与した場合、明瞭な毒性は観察されなかった。事実、脂質
投与に反応してマウスの体重がいくらか増加した。リポソーム中カンプトテシン
を、６０、３０、１５、７.５および３.７５ｍｇ／ｋｇの用量で、懸濁液中カン
プトテシンを２４、１２、６、３および１.５ｍｇ／ｋｇで投与した。毒性評価
は臨床的兆候、すなわち、３週間の実験中の生存数および体重の減少を基準とし
た。これらの実験の結果を第Ｖ表に要約する。
実施例１１
リポソームカンプトテシンの有効性評価
フレデリック・カンサー・リサーチ・センター（Frederick Cancer Research
Center of the National Cancer Institute（Frederick MD））から入手したネ
ズミＬ１２１０リンパ性白血病をゲラン（Geran）ら；カンサー・ケモセラ・レプ
（Cancer Chemother.Rep.）３：１−１０３（１９７２））の標準的スクリーニ
ングプロトコルに従って、同系ＤＢＡ／２マウス中に連続して腹膜組織内（ｉ.
ｐ.）移植することにより維持した。
有効性の研究のために、Ｌ１２１０を収穫し、プールし、希釈し、ＺＢＩコー
ルターカウンターを用いて計数した。細胞懸濁液を５×１０6個／ｍｌに調節し
た。０.２ｍｌのＬ１２１０の接種物を側尾静脈から２０〜２２ｇのＢ６Ｄ２Ｆ
１雌マウスに２５−ゲージ針を用いて静脈内（ｉ.ｖ.）投与した。チオグリコレ
ートブロス中に２４時間インキュベートすることにより腫瘍接種物を細菌汚染に
ついて試験した。マウスを無作為に５匹の群に分け、シューボックスケージ中に
入れた。餌および水は自由に与えた。すべての実験では未処置対照として３群の
動物を用いた。薬物誘発の細胞死（ＮＣＫ）が計算できるように、未処置マウス
における腫瘍細胞（１０1〜１０5）の滴定を行った。リポソームおよび懸濁した
カンプトテシンの投与（実施例６参照）を腫瘍移植した２日後に開始した。カン
プトテシンを実施例６に記載したように、すなわち４〜５投与レベルで、それぞ
れ前回の５０％増しでｉ.ｐ.投与した。
有効性試験の結果を図１に示す。２日および６日に単一のボーラス注射として
ｉ.ｐ.投与されたカンプトテシンがｉ.ｖ−移植Ｌ１２１０リンパ性白血病に対
して非常に有効であった。２回の独立した実験を行った。未処置対照マウスは６
日間生存した。ＥＰＣ：ＥＰＧリポソーム（コレステロールと共にまたはなしで
）
に関する最大許容量（ＭＴＤ）は６０ｍｇ／ｋｇより大きかった。６０ｍｇ／ｋ
ｇでＥＰＣ：ＥＰＧリポソーム中カンプトテシンは２回の実験で寿命を２３３お
よび２００％延ばし、これは腫瘍が＞６対数減少したことを示す。ＥＰＣ：ＥＰ
Ｇ：ＣＨＯＬリポソームにおいて、カンプトテシンは寿命を約２００および１８
３％延し、腫瘍の平均の減少は５.８対数であった。ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ処方カ
ンプトテシンのＭＴＤは１５〜３０ｍｇ／ｋｇであった。この処方物は２回の実
験において寿命を１５０〜１１７％増加させ、平均の腫瘍細胞減少は３対数であ
った。水性懸濁液として処方されたカンプトテシンのＭＴＤは１２ｍｇ／ｋｇで
あり、平均腫瘍細胞死２.７対数に関して１３３および１１７％のＩＬＳをもた
らすした。このように、ＥＰＣ：ＥＰＧリポソーム処方物は抗腫瘍活性に影響を
及ぼすことなくカンプトテシンの毒性を減少させた。この結果、該リポソーム処
方物に関してより高い用量レベルで高い有効性が得られた。
実施例１２
リポソームカンプトテシンの薬物動態学的研究
全脂質および薬物濃度が、各々、２００および６ｍｇ／ｋｇであるＥＰＣ：Ｅ
ＰＧ：カンプトテシン（８４.６：９.４：６.０）リポソームを単一ボーラス用
量６０ｍｇ／ｋｇでＢ６Ｄ２Ｆ１マウスにｉ.ｐ.投与した。対照マウスに懸濁液
（ＤＭＡ：クレモホールＥＬ：水＝１０：１０：８０）中カンプトテシンを１０
または６０ｍｇ／ｋｇのいずれかで投与した。血漿サンプルを、５、１５、３０
、６０、９０、１２０、２４０、３６０、４８０、６００、７２０、８４０、９
６０、１０８０、１２６０および１４４０分に、時間ごとに３匹のマウスのグル
ープを用いて集めた（懸濁液中カンプトテシンに関して６０ｍｇ／ｋｇの血漿サ
ンプルを２４０分まで集めた）。
血漿サンプルを全カンプトテシン（ラクトンおよびヒドロキシ酸）およびラク
トン形態に関して、グロチョウ（Grochow）らの方法（ドラッグ・メタボリズム・
ジスポジション（Drug Metabolism Disposition）２０；７０６−７１３，１９
９２）の変法を用いてＨＰＬＣにより分析した。簡単には、１００ｍｌの血漿を
冷メタノールに添加し、サンプルを攪拌し、１４０００ｒｐｍで３０秒間遠心分
離に付した。上清を取り出し、直ちに分析し、−７０℃で保存した。全薬物を定
量するために、１００ｍｌのメタノール性上清を５０ｍｌの０.０５０Ｍリン酸
に添加し、クロマトグラフィー分析の前に、室温で２時間インキュベートした。
ラクトンの定量のために、１００ｍｌのメタノール性上清を０.０１０Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（pＨ６.０）に添加し、直ちにＨＰＬＣ中に注入した。
シリーズ４液体クロマトグラフィー（パーキン−エルマー（Perkin-Elmer））
およびベックマン１５７蛍光検出器からなるイソクラティックＨＰＬＣシステム
を用いて分離を行った。ＯＤＳ４.６ｍｍ×１５ｃｍ ５ｍｍ ベックマン（Bec
kman）カラムを備えたＷＩＳＰ７１０Ｂオートサンプラー（ウォーターズ（Wate
rs））を用いて１００ｍｌ注入した。保持時間およびピーク面積をＨＰ３３９６
シリーズインテグレーター（ヘウレット・パッカード（Hewlett Packard））で記
録した。血漿薬物濃度を３０〜６００ｎＭ間の範囲の濃度に関する校正曲線を用
いて計算した。
薬物動態学的研究の結果を図２に示す。図からわかるように、薬物懸濁液につ
いて得られるものと比較して、リポソーム処方物を投与した後４時間にわたって
高く維持された血漿レベルが観察された。リポソーム対懸濁カンプトテシンから
著しく大きな血漿濃度−時間曲線下にある面積（ＡＵＣ）および長い半減期（ｔ1/2
）が得られた。この高い照射にもかかわらず、リポソーム処方物に関して毒
性が減少した。図２にて、ＣＰＴ（ＥＰＣ：ＥＰＧ）６０ｍｇ／ｋｇ処方物は、
３６９の一期間のｔ1/2（分）を有し、９３９のＡＵＣ（μＭ／分）を有し；Ｃ
ＰＴ（１０ｍｇ／ｋｇの水性懸濁液）は８４０の一期間のｔ1/2（分）および４
２のＡＵＣ（μＭ）を有した。
略号のリスト
ＤＭＰＣ ジミリストイルホスファチジルコリン
ＤＭＰＧ ジミリストイルホスファチジルグリセロール
ＥＰＣ 卵ホスファチジルコリン
ＥＰＧ 卵ホスファチジルグリセロール
ＣＨＯＬ コレステロール
ＣＨＯＬ−Ｓ 硫酸コレステロール
ＤＭＡ Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド
ＭＬＶ 多重ラメラ小胞
ＳＵＶ 小さな単ラメラ小胞
ＭＩＤ 最大許容量
ＩＬＳ 寿命の増加
前記した記載は好ましい具体例を含み本発明を十分開示するものである。本明
細書に開示された具体例の修正および改良は以下の請求の範囲に含まれるもので
ある。当業者であれば、さらに工夫することなく、前記した記載を用いて本発明
を最大限利用できると考えられる。したがって、本明細書の実施例は単に例示的
なものであって、本発明の範囲をなんら制限するものではない。本発明の排他的
性質および優先権を主張するものは以下のとおりである。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to liposomal formulations of camptothecin and related analogs with reduced toxicity and improved efficacy. BACKGROUND OF THE INVENTION There have been reports in several literatures describing anticancer drugs in liposomes in clinical trials as well as in experimental cancer chemotherapy, the rationale for which is the pharmacokinetics of antitumor drugs encapsulated by liposome encapsulation. Changes in the scientific variables (Daoud, SS, et al., Liposomes in Cancer Therapy. Adv. Drug Deliv. Rev.), Liposome in Cancer Therapy, Liposomes in Cancer Therapy. , 3: 405-418, 1989)). Advantages of drug delivery provided by liposomes include protection of liposome contents to the host, prolongation of circulatory / sustained release, and targeting potential (passive, compartmental, ligand-mediated and physical). To date, almost all anti-cancer agents have been encapsulated in liposomes. These include alkylating agents, nitrosoureas, cisplatin, antimetabolites (cytosine arabinoside, methotrexate, 5-fluoro-uracil) and anthracyclines. Studies on liposomes containing anthracycline antibiotics have demonstrated reduced cardiotoxicity and cutaneous toxicity, and extended survival of tumor-bearing animals compared to drug-free controls (Cels, RL ( Sells, RA) et al., Cancer Treat. Rep., 14: 383-387 (1987)). A widely used anthracycline antibiotic, doxorubicin is now in Phase III clinical trials. The anti-cancer agent camptothecin and a related analog, topotecan (a water-soluble analog), are among the promising antineoplastic drug classes with widespread activity against several human tumors. This therapeutic agent is a specific inhibitor of topoisomerase I, an enzyme closely involved in DNA replication to alleviate the torsional strain introduced before the mobile replication fork. Inhibition of this enzyme results in lethal DNA damage during replication. Topoisomerase inhibitors are unique in that they cause cytotoxicity by interfering with topoisomerase function and causing DNA damage, rather than by causing the product of its target enzyme to clear it (Herzberg). Hertzberg, RP et al., Biochemistry, 28: 4629-4638 (1989)). The parent compound, camptothecin, is an insoluble carboxylate ion that is insoluble in water and unstable in water, undergoes rapid pH-dependent but reversible hydrolysis, and is rapidly cleared in vivo. become. Ring-opening conversions of lactones are especially preferred at alkaline pH, with the ring-opened form predominant at physiological pH (7.4). Topotecan, a water-soluble analogue of camptothecin, which is now in Phase II clinical trials, is also inactivated by reversible lactone hydrolysis and conversion to the carboxylate form (Underberg, W. Jay. , WJM) et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (J.Pharmac.Biomed.Analysis, 8: 681-683 (1990)). Like all antineoplastic agents, the clinical use of camptothecin and topotecan is limited by dose-dependent toxicity. In mice, the determined toxic dose for suspensions of camptothecin is 12 mg / kg and for saline of topotecan (pH 3.0) is 15 mg / kg. Studies reported for other liposomal formulations predict that the pharmacokinetics and pharmacology of camptothecin / topotecan will change in liposomal formulations. Thus, the improved stability and antitumor activity of camptothecin and related analogs formulated in liposomes will certainly increase the commercial value of these antitumor agents. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides novel liposomal formulations of camptothecin and its structurally related analogs. These novel formulations improve the pharmacokinetics and pharmacology of the compounds of the invention, which reduces dose-dependent toxicity for use in antitumor therapy. More specifically, formulations of camptothecin and its structurally related analogs have a high drug-to-lipid drug ratio (molar ratio) of at least 80% of the total drug (at least 1/100, preferably 1/10). , In the form of multilamellar vesicles incorporated into the lipid bilayer of liposomes and dispersed in an aqueous layer where lipids are the natural source. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION It is well known in the art that bioactive molecules can be encapsulated in liposomes, which are artificial lipid / aqueous spherical structures. Liposomes are defined as structures consisting of one or more concentric spheres of lipid bilayers separated by water or aqueous buffer moieties. The number of bilayers depends on the lipid composition and the manufacturing process. Upon further application of energy, multilamellar vesicles (MLVs) can form unilamellar vesicles (ULVs). Many patents and scientific articles have been published on liposomes, and the technical aspects of liposome formation and drug encapsulation are well known in the art (Cullis PR et al., Generating and Loading of -Generating and loading of liposomal systems for drug delivery applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 3: 267-282, 1989) reference). The present invention is preferably a lipid-soluble drug, wherein at least 80% of the drug in the lipid bilayer has a drug to lipid ratio (molar) of at least 1/100, preferably 1/50 to 1/1. 5, more preferably 1/20 to 1/10 encapsulated parenterally administered camptothecin and its structurally related analogues in the form of multilamellar vesicles or unilamellar vesicles dispersed in an aqueous layer Provided are novel liposome formulations of the body. Preferably, the total lipid concentration is 10-1000 mg / ml, preferably 100-500 mg / ml, more preferably 200-400 mg / ml, even more preferably 100-200 mg / ml. Preferably, the vesicles are multilamellar. The particle size can be changed and easily measured by those skilled in the art. The particle size for such administration is generally 0.5 to 10 microns, preferably 0.2 to 2.0 microns. For intravenous administration, the particle size is preferably less than 0.2 microns. The multilamellar vesicles of the present invention can be prepared by standard methods (Charis, P. Earl et al., Generating and Loading of Liposomal Systems for Drug Delivery Applications, Adobe Drug Deliver. Rev. 3: 267-282, 1989)), the disclosures of which are incorporated herein by reference. One suitable method for lipophilic drugs is a) dissolving the lipid and drug in an organic solvent in a suitable lipid flask and b) slowly removing the organic solvent under vacuum and drying on the inner wall of the lipid flask. The lipid-drug film is deposited and c) the dried lipid-drug film is hydrated with an aqueous buffer or saline, followed by mechanical stirring such as vortexing to disperse the drug-lipid suspension to obtain liposomes. These multilamellar liposomes can be made smaller by freeze-thawing and, if necessary, extruding through a polycarbonate membrane (Charis, P.R. et al., Adv Drug Deliver Rev, 3: 267-282,1989). , The disclosure of which is incorporated herein by reference. In another preferred method, the lipophilic drug can be mixed with the lipid using an ionizable wettable powder to form a "preliposome gel". Liposomes encapsulating lipophilic di-pharmaceuticals can be formed after dilution of the gel with an aqueous solution (EPO Application No. 86306014.1 published Feb. 25, 1987, US Pat. It is made a part of the present invention by clearly indicating the source). Preferably, the lipid is obtained as a crude extract from natural sources. The crude extract contains many different components, for example as shown in the two tables below. (Paltau f et al., "Phospholipids-Natural, Semisynthetic, Synthetic" in Phospholipids-Natural, Semisynthetic, Synthetic "in Phospholipids: Biochemicals, Pharmaceutical and Analytical Considations Phospholipids: Biochemical, Pharmaceutical and Analytical Considerations) pp 1-12, Plenum Publishers, NY (1990)). For the purposes of the present invention, crude extracts are often highly purified to a single component such as lecithin if desired. The extract was purified for certain lipids such as phosphatidylglycerol by a transphosphatidylation reaction catalyzed by the enzyme phospholipase D, which is best done with highly purified extracts, which is also used for crude products. And commercially available egg phosphatidyl glycerol (EPG) such as egg lecithin is obtained. If the lipid comprises phosphorus, ie is a phospholipid, it is preferably fluid at ambient temperature, more preferably at physiological temperature. If desired, the mixture may contain minor amounts of a mixture of synthetic lipids. Synthetic lipids used in the present invention refer to homogeneous lipids not found in natural sources such as the di-saturated phospholipids dimyristoyl, dipalmitoyl, and distearoyl. The lipid used in the present invention may contain an unsaturated bond. This unsaturation may be on one fatty acyl chain or in both chains (if possible), the chain may contain one or more double bonds (ie diunsaturation) or the chain may be It may be partially hydrogenated or it may comprise a mixture thereof. Preferably, when the phospholipid is unsaturated, it is a diunsaturated product such as dioleyl (C18: 1) or dilinoleoyl (C18: 2) phosphatidylcholine or glycerol. Preferably, the lipid bilayer contains lipids with at least 30% (mole) unsaturated fatty acyl chains. The term "fatty acyl chain" as used herein is an ester of a fatty acid. Alternatively, the term "fatty acid chain" is also used. The lipids used herein may be negative, neutral, or positively charged. Such products include lipids and fatty acids such as phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, diphosphatidylglycerol (cardiolipin), phosphatidic acid, phosphatidylinositol, sphingolipids, glycolipids, sulfatide, risolipid, and fatty acids such as cholesterol. Includes sterols, polymerizable lipids, and combinations thereof. Commercial products of soybean and egg source are preferable, and soybean and egg lecithin are preferable. Phospholipids such as phosphatidylglycerol obtained from egg lecithin are also commercially available. Suitable hydrogenated lecithins are products of Phospholipon H and G (American Lecithin, Danbury, Conn.); And Asahi type 5, 20, 40 and 65 egg phosphatides (Asahi Kasei, Tokyo, Japan). is there. Other lecithin products used in the present invention are CentroPhase 31 and Centrolex P (Central Soya, Fort Wayne, IN). Under physiological conditions, lecithin and phosphatidylglycerol are bilayer-forming lipids, and certain phospholipids such as phosphatidylethanolamine and cardiolipin, sphingolipids, sulfatides, lysolipids, glycolipids and glycerides, and fatty acids are stable bilayers. Does not form. Thus, the ratio of bilayer-forming lipids to non-bilayer-forming lipids is 9: 1 to 1: 1, preferably 9: 1 to 7: 1. The phosphatidylcholine and phosphatidylglycerol derivatives used in the present invention are not limited to natural soybean or egg yolk; or include hydrogenated products obtained by hydrogenation of natural soybean or egg yolk phosphatidylcholine. A suitable phosphatidylglycerol derivative is egg yolk phosphatidylglycerol or a salt form thereof. Semi-synthetic products such as dimyristoyl-, dipalmitoyl-, distearoyl-, dioleoyl, dilinoleoyl, and mixtures thereof such as 1-palmitoyl-2-oleoyl may be added. Preferably, if a semi-synthetic product is used, this is 1-palmitoyl-2-oleoyl, dioleoyl- or di-linoleoyl; or mixtures thereof. Preferably, the polar head group of the lipid is choline or glycerol. If a single component or a mixture of these two is used, it is in similar amounts as its natural analogue. A preferred ingredient is 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholine or phosphatidylglycerol, dioleoylphosphatidylcholine or phosphatidylglycerol (DOPC or DO PG). Preferably, small amounts of other disubstituted semi-synthetic components may be added if desired. The small amount used in the present invention is less than 10% (mol), preferably less than 5% (mol). Small amounts of other synthetic di-saturated lipids, such as phosphatidylcholine and phosphatidylglycerol derivatives with C-14, C-16 and C-18 fatty acyl chains; or lipids with ester linked fatty acids, such as mono-, di-, and triglycerides , Or a combination thereof may be added. Preferred lipids are: a) monounsaturated (C: 18) or (C18: 2) fatty acyl chains; b) diunsaturated (C: 18) or (C18: 2) fatty acyl chains; c) one single Phosphatidylcholine (PC) having an unsaturated PC or PG with a long (C16 or longer) saturated fatty acyl chain at the 1-position of the glycerol backbone and oleic acid or linoleic acid esterified at the 2-position, and Phosphatidyl glycerol (PG). One such product is 1-palmitoyl-2-oleoyl. This class is particularly preferred because the fatty acid composition in these phospholipids is similar to the fatty acid distribution found in phospholipids from natural sources. Preferred disubstituted phospholipids are dimyristoyl phosphatidyl glycerol (DMP G) and dimyristoyl phosphatidyl choline (DMPC). The lipid bilayer may preferably comprise a lipid selected from phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardiolipin, phosphatidic acid, and sterols such as cholesterol or combinations thereof. Suitable neutral lipids include, but are not limited to, phosphatidylcholines and sterols such as cholesterol and cholesterol derivatives. Suitable negatively charged phospholipids include, but are not limited to, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid and diphosphatidylglycerol (cardiolipin) and cholesterol analogs such as cholesterol sulfate and hemisuccinate. Suitable positive lipids include, but are not limited to, stearylamine, or sphingosine. Lipids preferably include, but are not limited to, sterol derivatives as well as sterol derivatives such as, but not limited to, cholesterol and cholesterol analogs. The lipid formulation may further comprise a negatively charged cholesterol salt such as cholesterol sulfate or hemisuccinate in combination with a neutral sterol. The formulation may also include other ingredients, such as antioxidants, vitamin A (α-tocopherol) or tocopherol-hemisuccinate, or other conventional antioxidants may be used. The term "polymerizable lipid" is well known to those of skill in the art and, where appropriate, these lipids are covalently linked to the individual lipid molecules that form the membrane of the liposome so that sonicated vesicles cause aggregation. Used to maintain and minimize melting. Suitable groups for such polymerization include vinyl, acryloyl, methacryloyl, butadiene, diacetylene and H. 2 NCC (O) OCH Three Include, but are not limited to. The reactivity of the polymerizable group is affected by the state of the bilayer. Preferably, the linking group is a diacetylene group. Phospholipids containing diacetylene groups are contained, for example, in one or both acyl chains. Phosphatidylcholines containing diacetylene groups polymerize when dispersed as large multilamellar or unilamellar vesicles, but not when dispersed in small vesicles. These polymerizable groups can be present on any part of the surfactant molecule, from the polar head to the end of the hydrocarbon chain. Cross-linking of vesicle constituent molecules has been shown to increase vesicle stability. For an overview of polymerizable lipids, see Liposome Technology, Volume 1, Preparation of Liposome, Chapter 9, Gregoriadis, Gr egory (1984) CRC Press. And the disclosure of which is incorporated herein by reference. The surface of liposomes may be modified with polymers such as polyethylene glycol (PEG) using methods well known to those skilled in the art. (Woodle, MC and Lasic, DO), Biochim.Biophys.Acta 1113: 171-193,1992; or Blume. Biosimika et Biophysica Actor, 10 29: 91-97, 1990). If the combination of lipids or lipid analogues and other substances encapsulated in the lipid matrix forms bilayers under physiologically relevant conditions, modification of the liposomes will not have any detrimental effects on mammals. It may be carried out using the available lipids of. One of ordinary skill in the art may modify the composition of the liposomes to control the biodistribution and pharmacokinetics of the resulting liposomes. Negatively charged liposomes include from about 0% to about 50% (mole) of negatively charged lipids, more preferably from about 0% to about 30% (mole) of negatively charged lipids in the composition. But it's okay. The ratio of neutral lipids to negatively charged lipids is 9: 1 to 1: 1, preferably 3: 1 to 1: 1 and more preferably 9: 1 to 3: 1. When cholesterol is also incorporated in the liposomes, the level is 0 to about 50%, preferably about 10% to about 30%, more preferably about 15 to 25%. The ratio of neutral lipids to cholesterol is about 8: 1 to about 1: 1 and more preferably 4: 1 to 1: 1. Preferred molar ratios of neutral lipid: negatively charged lipid: sterol-containing lipid are 4: 2: 4, 6: 1: 3, 4: 3: 3, and 5: 4: 1, respectively. Preferably, the neutral lipid is phosphatidyl choline, the negative lipid is phosphatidyl glycerol and the sterol is cholesterol or its derivatives. Preferred embodiments of the invention include multilamellar or unilamellar vesicles containing camptothecin or structurally related analogs thereof dispersed in an aqueous phase having a drug to lipid ratio (molar) of at least 1/100. Wherein the lipids are phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, diphosphatidylglycerol (cardiolipin), phosphatidic acid, phosphatidylinositol, sphingolipids, glycolipids, sulfatides, lysolipids and fatty acids, A sterol, a polymerizable lipid, or a combination thereof; the lipid bilayer is at least one charged lipid component present in an amount of at least 5% (mol), or water soluble in an amount of at least 5% (mol). Kind Analog salt forms; or mixtures thereof. The charged component is preferably negatively charged. Furthermore, the amount of negatively charged component present is at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30%. Preferred negative components are phosphatidyl glycerol, charged salts of cholesterol such as cholesterol sulphate, or hemisuccinate, or phosphatidyl serine, more preferably egg phosphatidyl glycerol (EPG). Although this formulation can be used for fat-soluble analogs, it is preferred in the present invention for water-soluble analogs such as topotecan. Optimally, the water-soluble analog is not present in large amounts in the aqueous phase, but is preferably present in the lipid bilayer at least 30%, more preferably 50%, most preferably 80%. In another embodiment, the vesicle comprises a nonionic detergent. This type of vesicle is known as a "niosome". Handjani-Vila et al., International Journal of Cosmetic Science (Int.J.Cos. Sci.), 1: 303-314; Baillie et al., Journal of Pharmacy &. J.Pham.Pharmacol., 37: 863-688; van Hal et al., Eur.J.Pharm.Biopharm, 38,47; and See Hofland et al., J. Contr. Rel. 16: 155-168, the entire disclosures of which are incorporated herein by reference. Niosomes are prepared from several nonionic surfactants, such as polyglycerol alkyl ethers, glucosyl dialkyl ethers, crown ethers, and polyoxyethylene alkyl ethers. One possible lipid combination is the use of cholesterol and nonionic surfactants. Often, charged surfactants are inserted into the bilayer to introduce electrostatic repulsion between the vesicles and increase stability. As used herein, the term "camptothecin and related analogs" refers to camptothecin and compounds having the same nuclear ring system with various substituents, but such modifications or substitutions include ring A and It is preferably in B. The basic structure of camptothecin is It is. Although many modifications have been made, the following analogs are preferred for use in the present invention: 9-aminocamptothecin, 9-nitrocamptothecin, 9-hydroxy-camptothecin, 10-hydroxy-camptothecin, 10 -Aminocamptothecin, 9-hydroxy-10-dimethylaminomethylcamptothecin, 20- (RS) -10,11-methylenedioxycamptothecin, 9-chloro-10,11-methylenedioxy- (20S) -camptothecin, and 7 -Ethyl-10-hydroxycamptothecin and its derivatives, such as 7-ethyl-10-[[[[4- (1-piperidino) -1-piperidino] carbonyl] oxycamptothecin. Preferably, for use in the present invention, the analogue is a lipophilic analogue. The novel alkaloid camptothecin, Camptotheca acuminata, was first isolated in 1966 and many related analogs have been prepared and are well known in the art. Although it is difficult to list all the articles and patents relating to such compounds, representative references showing other analogs useful in the present invention include, but are not limited to: Wall et al., Disclosing 11-Hydroxycamptothecin, Journal of Medicinal Chemistry, 29, pp1533-1555 (1986); U.S. Pat. Nos. 4,981,1968, 4,894,456; No. 51222526 (Wall et al.); Hertzberg et al., Journal of Medicinal Chemistry, Volume 32, pp 715-720 (1989); Wani, which discloses modifications of the hydroxylactone ring of camptothecin. Et al., Journal of Medicinal Chemistry, Volume 23, p554 (1980), Crocodile et al., Journal of Medicinal Chemistry, Volume 30, p1774 and pp231 7-2319 (1980); Crocodile et al., Journal of・ Medici Le Chemistry, Vol. 29, p2358-2363 and pp1553-1555 (1986); JP51-91297, CA84: 115629; Derwent Abstract 85-034354 / 06 (Yakult Honsha Co., Ltd.) Japanese Patent 59. 227884, Derwent Abstract 87-28 1010/40 (Yakult Honsha Co., Ltd.) JP62-195384; EPO00 88542; U.S. Pat. Nos. 4,914,205, 4,473,692, 4545880, 4064462, and U.S. Pat. , The disclosure of which is incorporated herein by reference. In the case of water-soluble analogues of camptothecin such as topotecan, pre-modification of the lipid composition and / or charge of the liposomes, or lipid derivatization of the analogues is necessary to improve the encapsulation of the liposomes in the lipid bilayer. Modification of the liposome composition herein increases the amount of negatively charged lipids present in the liposome; alters the degree of unsaturation of the fatty acid chains, alters the cholesterol level in the bilayer. Means Modification of the charge of liposomes is meant herein to increase the level of negatively charged lipids to increase the overall liposome charge. A water-soluble analog of camptothecin refers herein to an analog or drug that is charged in the physiological pH range. Lipid-derivatized modification of water-soluble analogs, as used herein, refers to the conjugation of a drug to a lipid group to form an ion pair when the lipid has an opposite charge to the drug. For positively charged water-soluble drugs such as topotecan, negatively charged lipids such as cholesterol sulfate or hemisuccinate may be used. The formation of ion pairs with the water-soluble analog is done in situ during liposome formation or prior to encapsulation in liposomes. The term "parenteral" as used herein refers to intravenous, intramuscular, subcutaneous or intraperitoneal administration. It will be appreciated by those skilled in the art that the optimum dose and individual dosing interval of the formulation of the present invention will be determined by the nature and extent of the condition to be treated, the mode of administration, the route and site, and the patient to be treated, such optimum It will be appreciated that it can be determined by conventional techniques. It will also be appreciated by those skilled in the art that the optimal route of treatment, ie the number of doses per day for a particular number of days, can be determined by routine therapeutic decision tests. Pretreatment was usually 20 mg / M with camptothecin during the course of treatment (1 month). 2 To 800 mg / M 2 Should be administered at a dose of. Pretreatment is usually 1.5 mg / M per day of topotecan (IV) per treatment course for small lung cell carcinoma (SCLC) and ovarian cancer. 2 For 5 days. For example, the drug concentration in liposomes is 0.1 mg / ml to 10 mg / ml for camptothecin, preferably about 4 mg / ml to 6 mg / ml. In all cases, the total liposome volume is adjusted to meet the desired dose requirements. For example, a volume of 10 ml / kg of liposomes was used for administration of 60 mg / kg of camptothecin. Recently, T. Burke et al., Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.) 114: 8318-8319, 1992 and Biochem. 32: 5352. -5364 (1993) is a physiological method in which small unilamellar vesicles of DMPC or DMPG insert the lactone ring of the drug into the lipid bilayer and isolate it from solution (PBS, pH 7.4). It is reported that the stability of camptothecin and several analogues can be improved under the conditions. The authors found that the drug to drug lipid ratio (2.9 x 10) was very high. Five ) Shows the binding and stabilization of camptothecin, but it is of less commercial interest as high drug loading in the formulation is highly desirable. However, liposomes can provide an effective delivery system without compromising drug antitumor activity. Example 1 Preparation of camptothecin-containing DMPC: DMPG multilamellar liposomes 1.440 g or 0.540 g of dimyristoyl phosphatidyl choline (DM PC), 0.160 g or 0.060 g of dimyristoyl phosphatidyl glycerol (DMPG) sodium salt and 0 g or 0.018 g of camptothecin and two separate lipids respectively Mix in flask. 6 ml of methylene chloride: methanol (9/1, v / v) was added to solubilize the lipid, and sufficient amount of chloroform (5-10 ml) was added to completely solubilize the lipid, a yellowish solution Got Drug-free lipids were treated similarly. Then, the organic solvent was removed by a rotary evaporator under vacuum to obtain a drug-lipid mixture thin film. The remaining solvent was removed under vacuum in a dessicator overnight. Hydration of the dried drug-lipid film as well as the drug-free lipid sample was performed at 37 ° C, a temperature well above the phase transition temperature (Tm) of the lipid. The temperature at which phospholipids undergo a characteristic gel-to-liquid crystal transition is 23 ° C. for DMPC or DMPG alone and for binary mixtures. Samples were hydrated with saline (5 and 8 ml for drug-containing and drug-free samples, respectively) and equilibrated at 37 ° C for 15-30 minutes. Lipid or drug-lipid film was vortexed in a laboratory at a maximum speed of 3-5 times at a maximum speed of a laboratory vortex mixer (Vortex-Genie, available from Scientific Industries). Multilamellar liposomes were obtained by stirring using 2. The composition of the obtained liposomes was DMPC: DMPG (90:10) and DMPC: DMPG: camptothecin (84) for drug-free liposomes and drug-containing liposomes, respectively. .6: 9.4: 6.0) The newly formed liposomes were further equilibrated for about 1 hour at 37 ° C. and stored at ambient temperature, total lipid and drug concentrations were 200 and 6 milligrams, respectively. / Ml (hereinafter referred to as mg / ml). Liposomes can be reduced by extrusion through 0.4μm and 0.2μm polycarbonate membrane. Example 2 Preparation of EPC: EPG multilamellar liposomes containing camptothecin The following multilamellar liposomes consisting of egg phosphatidyl choline (EPC) and egg phosphatidyl glycerol (EPG) sodium salt were prepared using a method similar to Example 1 except that all manipulations were performed at ambient temperature: a) EPC: EPG (90:10); and b) EPC: EPG: camptothecin (84.6: 9.4: 6.0) (total lipid and drug concentrations 200 and 6 mg / ml, respectively). Example 3 Preparation of EPC: EPG: CHOL multilamellar liposomes containing camptothecin 1.333 g and 0.425 g of egg phosphatidylcholine (EPC) were added to 0.171 g or 0.064 g of egg phosphatidylglycerol sodium salt (EP G) and 0.167 g or 0.063 g of cholesterol (CHOL) and two separates. In a lipid flask of 0.018 g of camptothecin, if any. Subsequent steps were performed at ambient temperature as described in Examples 1 and 2. The resulting liposomes were as follows: a) EPC: EPG: CHOL (70:10:20); and b) EPC: EPG: CHOL: camptothecin (65.8: 9.4: 18.8: 6.0) (total lipid and drug concentrations are 200 and 6 mg / ml, respectively). Example 4 Determination of camptothecin incorporated in multilamellar liposomes The amount of camptothecin incorporated into the liposomes was described by Constantinides, PP et al., Chem. Phys. Lipids 51: 105-118 (1989). It is measured by the method with some modifications. Briefly, multilamellar liposomes prepared as described in Examples 1-3 were treated at ambient temperature (EPC: EPG, 90:10 and EPC: EPG: CHOL, 70:10:20 (+ camptothecin)) or 37 ° C (DMPC). : DMPG 90:10 (+ camptothecin)) for 3 hours. The drug-free or drug-lipid mixture was then centrifuged at 50,000 rpm for 2 hours at 25 ° C. using a Ti80 fixed angle rotor. Under these conditions, the concentration of camptothecin in the lipids and supernatant separated from the aqueous medium was determined by appropriate dilution and measuring the absorbance at 253 nm using a Beckman DU70 spectrophotometer. The amount of drug in the liposomes was calculated as follows: D L (Total%) = (Ct−Cs / Ct) × 100 (wherein D L Is the drug in the liposome, Ct is the absorbance of camptothecin before centrifugation (total drug combination), and Cs is the absorbance of the supernatant excluding camptothecin due to the presence of lipid). Absorbance is corrected for the amount of lipid remaining in the supernatant (less than 10% of total lipids). The results of these lipid / resolution studies are summarized in Table I. As shown in Table I, all three liposomal compositions yielded very high drug loading, which is desirable as a commercial value formulation. Example 5 Particle size measurement of camptothecin liposomes The particle size of the camptothecin liposomes prepared as described in Examples 1 to 3 was measured with laser light scattering after 400-fold dilution with saline containing the corresponding drug-free liposomes. Uses Malvern Photon Correlation Spectrometer Model 4700 (obtained from Spectra Physics) with Argon Laser Model 2000 to monitor the particle size of various liposome formulations. I was there. Light scattering was monitored at a 90 ° angle and a temperature of 25 ° C. Polystyrene (latex) beads were used as a particle size standard. The light scattering data are summarized in Table II. As expected for multilamellar liposomes, the average particle size of these liposomes is about 1 micron (μm) (Table II) and the size distribution is between 0.5 and 5.0 μm. The dimensional heterogeneity of these liposomes is also evident by the high polydispersity compared to that obtained with the latex bead standard. The polydispersity index is a measure of particle homogeneity. This varies from 0 to 1, the closer to 0 the more homogeneous (monodispersed) the particles are. Example 6 Incorporation of topotecan into multilamellar liposomes at low lipid concentrations The following stock solutions of egg phosphatidyl choline (EPC), egg phosphatidyl glycerol (EPG) and cholesterol (CHOL) in chloroform, cholesterol sulphate (CHOL-S) and topotecan in methanol and hydrophobic salts of cholesterol sulphate and topotecan (CHOL). A stock solution of -S-TOP OTECAN) in chloroform: methanol (1: 1) was used: EPC (24.4 mmol); EPG (13.0 mmol); CHOL (25.8 mmol); cholesterol sulfate (13). Topotecan (10.9 mmol) and cholesterol sulfate-topotecan salt (2.3 mmol) were used. Using a method similar to that of Examples 1-3, using saline (pH 3.1) as the hydration solution and a total lipid concentration of 2.0 mg / ml (2.7 mmol), the following multilamellar liposomes at ambient temperature: Prepared: a) EPC: EPG: CHOL: Topotecan (48: 19: 24: 9); b) EPC: EPG: CHOL: Topotecan (37: 30: 24: 9); c) EPC: EPG: CHOL: CHOL. -S: topotecan (48: 19: 15: 9: 9); d) EPC: CHOL: CHOL-S: topotecan (67: 24: 4.5: 4.5); e) EPC: CHOL: CHOL-S -Topotecan (67: 24: 9). Example 7 Incorporation of topotecan into multilamellar liposomes at high lipid concentrations Using the lipid and drug stock solution of Example 6 and a method similar to Examples 1-4, the multilamellar liposomes loaded with topotecan (compositions ae of Example 6) were added to a high lipid concentration (200 mg / ml or 270). Mmol) was also prepared. The drug to lipid ratio (1:11) was maintained at both high and low total lipid concentrations. Example 8 Measurement of topotecan loading in multilamellar liposomes of Examples 6 and 7. The level of topotecan incorporated into the multilamellar liposomes of Examples 6 and 7 was quantified using the method outlined in Example 4. The results of this experiment are summarized in Table III. Example 9 The particle size of drug-free liposomes and topotecan-loaded liposomes was measured by laser light scattering as described in Example 8. Table IV summarizes the light scattering data: At low lipid concentrations, topotecan reduced the particle size of the corresponding liposomes, while at high lipid concentrations some differences in particle size were observed between drug-free and containing liposomes. The heterogeneity in size of these liposomes is also apparent due to the higher polydispersity compared to that obtained with the latex bead standard. Topotecan appears to have a small but variable effect on polydispersity. Example 10 Toxicity evaluation of liposomal camptothecin Camptothecin (Examples 1 to 3) formulated in liposomes was intraperitoneally administered to B6D2F1 mice once by bolus injection once every 1 and 5 days to evaluate toxicity and compared with camptothecin suspension formulations (N, N-Dimethylacetamide: Cremophor EL: Water (10:10:80 (v / v)) Dose and total lipid dose maintained at 10 mg / kg and 2.0 g / kg respectively 2 g / kg drug-free liposomes. No clear toxicity was observed when administered, in fact there was some weight gain in mice in response to lipid administration: camptothecin in liposomes at 60, 30, 15, 7.5 and 3.75 mg / kg. At doses, camptothecin was administered in suspension at 24, 12, 6, 3, and 1.5 mg / kg.Toxicity assessment is a clinical sign, ie Week survival during the experiment and with reference to the weight loss. Summarizes the results of these experiments are in Table V. Example 11 Evaluation of effectiveness of liposome camptothecin Mouse L1210 lymphocytic leukemia obtained from the Frederick Cancer Research Center of the National Cancer Institute (Frederick MD) Geran et al .; Cancer Chemother. Rep. 3 : 1-103 (1972)), and maintained by continuous intraperitoneal (ip) transplantation into syngeneic DBA / 2 mice. For efficacy studies, L1210 was harvested, pooled, diluted and counted using a ZBI Coulter Counter. 5x10 cell suspension 6 Adjusted to individual / ml. 0.2 ml of L1210 inoculum was administered intravenously (i.v.) from the lateral tail vein to 20-22 g of B6D2F1 female mice using a 25-gauge needle. Tumor inoculum was tested for bacterial contamination by incubating in thioglycollate broth for 24 hours. Mice were randomly divided into groups of 5 and placed in shoebox cages. Food and water were provided ad libitum. All experiments used 3 groups of animals as untreated controls. Tumor cells in naive mice (10) were calculated so that drug-induced cell death (NCK) could be calculated. 1 -10 Five ) Was titrated. Administration of liposomes and suspended camptothecin (see Example 6) started 2 days after tumor implantation. Camptothecin was administered ip as described in Example 6, i.e. at 4-5 dose levels, each with a 50% increase over the previous time. The results of the efficacy test are shown in FIG. Camptothecin given ip as a single bolus injection on days 2 and 6 was highly effective against iv-transplanted L1210 lymphocytic leukemia. Two independent experiments were performed. Untreated control mice survived for 6 days. The maximum tolerated dose (MTD) for EPC: EPG liposomes (with or without cholesterol) was greater than 60 mg / kg. Camptothecin in EPC: EPG liposomes at 60 mg / kg prolonged the lifespan by 233 and 200% in two experiments, indicating that the tumor had a> 6 log reduction. In EPC: EPG: CHOL liposomes, camptothecin extended lifespan by approximately 200 and 183% with an average reduction in tumors of 5.8 logs. The MTD of DMPC: DMPG-formulated camptothecin was 15 to 30 mg / kg. This formulation increased lifespan by 150-117% in two experiments with an average tumor cell loss of 3 logs. The MTD of camptothecin formulated as an aqueous suspension was 12 mg / kg, resulting in an ILS of 133 and 117% with a mean tumor cell death of 2.7 log. Thus, the EPC: EPG liposome formulation reduced the toxicity of camptothecin without affecting its antitumor activity. This resulted in higher efficacy at higher dose levels for the liposome formulation. Example 12 Pharmacokinetic study of liposomal camptothecin EPC: EPG: Camptothecin (84.6: 9.4: 6.0) liposomes with total lipid and drug concentrations of 200 and 6 mg / kg, respectively, were administered i.p. to B6D2F1 mice at a single bolus dose of 60 mg / kg. p. Control mice were dosed with either 10 or 60 mg / kg of camptothecin in suspension (DMA: Cremophor EL: water = 10: 10: 80). Plasma samples were taken at 5, 15, 30, 60, 90, 120, 240, 360, 480, 600, 720, 840, 960, 1080, 1260 and 1440 minutes using groups of 3 mice per hour. (60 mg / kg plasma sample for camptothecin in suspension was collected for up to 240 minutes). Plasma samples were analyzed for total camptothecin (lactone and hydroxy acids) and lactone forms using a modification of the method of Grochow et al. (Drug Metabolism Disposition 20; 706-713, 1992). It was analyzed by HPLC. Briefly, 100 ml of plasma was added to cold methanol, the sample was agitated and centrifuged at 14000 rpm for 30 seconds. The supernatant was removed, immediately analyzed and stored at -70 ° C. To quantify total drug, 100 ml of methanolic supernatant was added to 50 ml of 0.050M phosphoric acid and incubated for 2 hours at room temperature before chromatographic analysis. For lactone quantification, 100 ml of methanolic supernatant was added to 0.010 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) and immediately injected into the HPLC. Separations were performed using an isocratic HPLC system consisting of a Series 4 liquid chromatography (Perkin-Elmer) and Beckman 157 fluorescence detector. 100 ml was injected using a WISP710B autosampler (Waters) equipped with ODS 4.6 mm × 15 cm 5 mm Beckman column. Retention times and peak areas were recorded on an HP3396 series integrator (Hewlett Packard). Plasma drug concentrations were calculated using a calibration curve for concentrations ranging between 30 and 600 nM. The results of the pharmacokinetic study are shown in Figure 2. As can be seen, higher plasma levels were observed over 4 hours after administration of the liposomal formulation, compared to that obtained with the drug suspension. The area under the significantly larger plasma concentration-time curve (AUC) and long half-life (t) from liposomes versus suspended camptothecin. 1/2 )was gotten. Despite this high irradiation, toxicity was reduced for liposomal formulations. In FIG. 2, the CPT (EPC: EPG) 60 mg / kg formulation has a t of 369 for one period. 1/2 (Minutes) with an AUC (μM / min) of 939; CPT (10 mg / kg aqueous suspension) has a t of 840 over a period of time. 1/2 (Min) and AUC (μM) of 42. List of abbreviations DMPC Dimyristoylphosphatidylcholine DMPG Dimyristoylphosphatidylglycerol EPC Egg egg phosphatidylcholine EPG Egg phosphatidylglycerol CHOL Cholesterol CHOL-S Sulfate cholesterol DMA N, N-Dimethylacetamide MLV Multiple lamellar vesicles SUV Small unilamellar vesicles MID Maximum permissible dose ILS The above description fully discloses the invention including preferred embodiments. Modifications and improvements of the embodiments disclosed herein are within the scope of the following claims. Those skilled in the art will be able to make maximum use of the present invention using the above description without further modification. Therefore, the examples herein are merely illustrative and do not limit the scope of the invention in any way. What claims the exclusive nature and priority of the present invention is as follows.