JPH09504176A - 抗真菌剤の選抜法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 真菌細胞の翻訳において活性な抗真菌剤を同定するための選抜法、該方法によって同定される抗真菌剤および該抗真菌剤の使用。

Description

【発明の詳細な説明】 抗真菌剤の選抜法 この発明は、真菌症、真菌の感染症または体内侵入の治療に有用な作因（agen t）の選抜法、該選抜法によって同定される新規な作因、およびこれらの作因の 抗真菌剤（antifungal agent；antimycotic agent）としての使用に関する。 発明の背景 カビやその他の真菌の病原体［これらの一部は次の文献に記載されている：「 ヒトの真菌症」、ベネケ（Ｅ.Ｓ.Ｂeneke）、アップジョン社：Ｋalamazoo、Ｍ Ｉ、1979年；「ヒトおよび他の動物の日和見真菌症」、スミス（Ｊ.Ｍ.Ｂ.Ｓmit h）、ＣＡＢインターナショナル：Ｗallingford、ＵＫ、1989年；「スクリップ の抗真菌剤レポート」、ＰＪＢパブリケーションズ・リミテッド、1992年］は特 に限定的ではないが、以下に例示するような疾患を含むヒト、他の動物および植 物の多様な疾患の原因となっている：皮膚、毛髪または粘膜の真菌症［例えば、 アスペルギルス症、黒色砂毛症、カンジダ症、クロモセス症、クリプトコックス 症、爪真菌症、外耳炎、好糸菌症、ムコール菌症、癜風、白癬、白癬性毛瘡、頭 部白癬、躯幹白癬、股部白癬、黄癬、渦状癬、手白癬、黒色癬、足部白癬、爪白 癬、トルロプシス症、黄菌毛症、白色砂毛症、およびこれらのシノニム（synony m）］および重い全身的または日和見感染症［例えば、放線菌症、アスペルギル ス症、カンジダ症、クロモセス症、コクシジオイデス症、クリプトコックス症、 エントモフトラ症、ゲオトリクム症、ヒストプラスマ症、ムコール症、菌腫、ノ カルジア症、北アメリカプラストミセス症、パラコクシジオイドミコーシス、好 糸菌症、ムコール菌症、ニューモシスティス性肺炎、ピチオシス（Ｐythiosis） 、スポロトリクム症、トルロプシス症、およびこれらのシノニム］。これらの疾 患の一部のものは致命的になる場合がある。 既知のカビやその他の真菌の病原体としては、特に限定的ではないが、次のも のが例示される：アプシディア種、アクチノマズラ・マズレエ、アクチノミセス 属、アレシェリア・ボイディ、アルテルナリア種、アントプシス・デルトイデア 、アポフィソミセス・エレガンス、アルニウム・レオポリヌム、アスペルギルス 種、アウジオバシジウム・プルランス、バシジオボルス・ラナルム、ビポラリス 種、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ種、セファロスポリウム種、ケ トコニジウム種、ケトミウム種、クラドスポリウム種、コクシジオイデス・イミ チス、コニジオボルス種、コリネバクテリウム・テヌイス、クリプトコックス種 、クニングハメラ・バルトレチエ、クルブラリア種、ダクチラリア種、エピデル モフィトン種、エピデルモフィトン・フロッコスム、エクセロフィルム種、エキ ソフィアラ種、フォンセカエア種、フサリウム種、ゲオトリクム種、ヘルミント スポリウム種、ヒストプラズマ種、レシトフォラ種、マズレラ種、マラセジア・ フルフル（癜風菌）、ミクロスポルム種、ムコール種、マイコセントロスポラ・ アセリナ、ノカルジア種、ブラジル・パラコクシジオイデス、ペニシリウム種、 フェオスクレラ・デマチオイデス、フェオアネロミセス種、フィアレモニウム・ オボバツム、フィアロフォラ種、フォマ種、ピオドライア・ホルタイ、カリニ・ ニューモシスティス、ピチウム・インシジオスム、リノクラジェラ・アグアスペ ルサ、リゾムコル・プシルス、リゾプス種、サクセナエア・バシホルミス、サル シノミセス・フェオムリホルミス、スポロスリックス・シェンキイ、シンセファ ラストルム・ラセモスム、テニオレラ・ボッピイ、トルロプソシス種、トリコフ ィトン種、トリコスポロン種、ウロクラジウム・カルタルム、ワンギェラ・デル マチチジス、キシロヒファ種、およびこれらのシノニム。「明らかに病原性ポテ ンシャル」を有する他の真菌（スミスの前記文献参照）としては、特に限定的で はないが、テルモムコール・インジカエ−スダチカエ、ラジオミセス種および既 知の病原性属の他の種が例示される。ヒトの病原体としてのサッカロミセスに関 連する報文もある［例えば、サッカロミセス科による真菌血症］、ニールソン（ Ｈ.Ｎielson）、ステンデラップ（Ｊ.Ｓtenderup)およびブルーン(Ｂ.Ｂruun） 、Scand.Ｊ．Ｉnfect.Ｄis.、第２２巻、第５８１頁〜第５８４頁（1990年）参 照］。最近、 重大な真菌症の数が著しく増大しているが、これは免疫抑制および免疫妥協され た患者、例えば、被移植者、化学療法を受けた患者およびＨＩＶ感染患者等の増 加による。 真菌感染症は獣医学の分野においても重大な問題となっており、この種の感染 症としは、特に限定的ではないが次のものが例示される：カンジダ症、クリプト コックス症、アスペルギルス症、ムコール症、ピチオシス、エントモフトラ症、 オーミコシス（oomycosis）、クロモセス症、トルロプシス症およびペニシリウ ム種、トリコスポロン種、ペシロミセス種またはミクロスポルム種による感染症 並びに多種多様な比較的珍しい日和見真菌症［「ヒトおよびその他の動物におけ る日和見真菌症」、スミス、ＣＡＢインターナショナル、ワリングフォード、英 国、1989年参照］。真菌感染症は犬や猫の鼻の疾患の一般的な原因である［「犬 や猫の鼻腔の真菌感染症」、ウォルフ（Ａ.Ｍ.Ｗolf）、Ｖet.Ｃlin.of Ｎorth Ａmer.：Small Ａnim.Ｐrac.、第２２巻、第1119頁〜第1132頁(1992年)参照］。 種々の真菌（例えば、特に限定的ではないが、アスペルギルス種、カンジダ種、 ペシロミセス種、ペニシリウム種、アルテルナリア種、ゲオトリクム種およびク ラドスポリウム種等）が動物の目から単離されており、これらの真菌はいくつか の動物種（例えば、特に限定的ではないが、馬、犬および猫等）において真菌角 膜炎をもたらす［「イヌ科およびネコ科の動物の目の微生物学」、ゲルディング （Ｐ.Ａ.Ｇerding）およびカコマ（Ｉ.Ｋakoma）、Ｖet.Ｃlin.of Ｎorth Ａmer .：Ｓmall Ａnim.Ｐrac.、第２０巻、第６１５頁〜第６２５頁(1990年)参照］。 真菌（例えば、特に限定的ではないが、ミクロスポルム・カニス、トリコフィト ン・メンタグロフィテス、トリクロフィトン・ベルコスム、ミクロスポルム・エ グイヌム、ミクロスポルム・ガリナエおよびミクロスポルム・ナヌム等）による 皮膚感染症が多くの野生動物や家畜において発生しており、一部の感染症は宿主 種に特異的である［「動物との接触に関係する真菌による皮膚感染症」、ラデン ツ(Ｗ.Ｈ.Ｒadentz)、ＡＦＰ、第４３巻、第1253頁〜第1256頁(1991年)参照］。 動物に感染する真菌の一部は動物からヒトに伝染する。真菌による人畜共通感 染症は最も一般的にはペット動物と関連するが、動物と接触する機会の多い獣医 の分野に従事する人にはより高い頻度でみられる［上記文献およびラピン（Ｍ. Ｒ.Ｌappin）、Ｖet.Ｃlin.of Ｎorth Ａmer.：Ｓmall Ａnim.Ｐrac.、第２３巻 、第５７頁〜第７８頁(1993年)参照］。ヒトおよびその他のの動物のこのような 感染症の治療には局所用または全身用抗真菌剤が使用されている。 真菌の感染または侵入は農業の分野でも非常に重大な問題となっており、野菜 、果物およびナッツ等を真菌から保護するために殺真菌剤が使用されている［マ ッキーウェン（Ｆ.Ｌ.ＭcＥwen）およびスティーブンソン（Ｇ.Ｒ.Ｓtephenson ）、「病虫害防除剤の自然環境での使用と意義」（ウィリー社(ニューヨーク)19 79年発行）参照］。殺真菌剤は土壌、種子、増殖物、生育期の植物に使用され、 病原体を撲滅させている。種子や土壌に含まれる病原体としては、特に限定的で はないが、次のものが例示される：アファノミセス種、アルミラリア種、セファ ロスポリウム種、シリンドロクラジウム種、フサリウム種、ヘルミントスポリウ ム種、マクロフォミナ種、マグナポルテ種、オフィオボルス種、フィマトトリク ム種、フィトフトラ種、フィチウム種、リゾクトニア種、スセロチウム種、スク レロチニア種、チェラビオプシス種、ウスチラゴ種、ベルチシリウム種およびウ ェトキセリニア種［ロドリゲズ−カバナ（Ｒ.Ｒodriguez−Ｋabana）、バックマ ン（Ｐ.Ａ.Ｂackman）およびカール（Ｅ.Ａ.Ｃurl）、「種子や土壌に起因する 植物病の抑制」、殺菌剤、（シーゲル(Ｍ.Ｓiegel)およびシスラー(Ｈ.Ｓisler) 編、マーセル・デッカー社(ニューヨーク)、1977年発行）参照］。新鮮な果物や 野菜の収穫後の病気は、特に限定的ではないが、次の真菌によってもたらされる ：アルテルナリア種、ボトリチス種、セントロスポラ種、セラトシスチス種、コ レトトリクム種、クリプトポリオプシス種、ジプロジア種、フサリウム種、ヘル ミントスポリウム種、モニリニア種、ネクトリア種、オースポラ種、ペニシリウ ム種、フリクタエナ種、フォマ種、フォモプシス種、リゾプス種、スクレロチニ ア種、およびベルチシリウム種。 作物の成育中の病気の抑制、農産物の貯蔵の改良または個々の作物の生産量の 増大のために、世界の作物の２分の１の生産過程において殺真菌剤が使用されて いる［オルディシュ（Ｇ.Ｏrdish）およびミッチェル（Ｊ.Ｆ.Ｍitchell）、「 世界の殺真菌剤の使用量」、殺真菌剤、アドバンスド・トリーティズ、第１巻、 第３９頁〜第６２頁、トルゲソン編、アカデミック・プレス（ニューヨーク）19 67年発行］。米国の作物用非牧草地の約２０％が殺真菌剤で処理されている［パ ルム(Ｅ.Ｗ.Ｐalm)、「殺真菌剤と線虫駆除剤の不使用および非化学的抑制によ らない場合の予想収穫損失」、農業における害虫処理のためのＣＲＣハンドブッ ク、第１巻、第１３９頁以降参照］。経済的には、殺真菌剤の使用停止により、 農作物、野菜、果物およびナッツ類の損失は２０億ドル以上にのぼる（上記文献 参照）。一部の作物は特に大きな打撃をうける。たとえば、ピーナツの損失は全 体の７０％以上、ペカンの損失は全体の６５％以上、トマトの損失は全体の６０ ％以上、ジャガイモの損失は全体の４０％以上、果物例えば、リンゴ、サクラン ボ、モモおよびナシの損失はいずれも全体の５０％以上にのぼる（上記文献参照 ）。 真菌による木材の損害も重要な経済的問題であり、米国においては、既知の防 腐剤を広範囲に使用しているにもかかわらず、１年間に１０億ドルにのぼる（但 し、生木の損害は含まない）［レビ（Ｍ.Ｐ.Ｌevi）、「木材防腐用殺真菌剤」 、殺真菌性化合物、ジーゲルおよびシスラー編、マーセル・デッカー社(ニュー ヨーク)1977年発行］。何百種もの真菌が木材から単離されている。木材表面の カビは、特に限定的ではないが、例えば次の菌の感染によるものである：トリコ デルマ種、グリオクラジウム種、ペニシリウム種、アスペルギルス種およびアル テルナリア種。樹液の汚損菌としては、特に限定的ではないが、セラトシスチス 種、ジプロジア種、グラフィウム種、アウレオバシジウム種およびシトスポラ種 が例示される。多大な経済的損失をもたらす腐敗菌としては、特に限定的ではな いが、コニオフォラ種、レンチヌス種、レンジテス種、ポリポルス種、ポリア種 およびメルリウス種が例示される。腐敗病菌としては、特に限定的ではないが、 アスコミセテス種、カエトミウム種およびフンギ・インペルフェクチが例示され る。 真菌の蔓延をうけやすいその他の製品としては、織物、プラスチック、紙、ゴ ム、接着剤、エマルションポリマー、革、化粧品、家庭用消毒剤、防臭剤および 塗料等が例示される［イーガー(Ｃ.Ｃ.Ｙeager)、「産業用殺真菌剤」、殺真菌 性化合物、ジーゲルおよびシスラー編、マーセル・デッカー社(ニューヨーク)19 77年発行］。塗料については、他のサブストレートについてより多くの研究がな されている塗装面に蔓延する真菌は、塗り替えを必要とする程度まで塗膜の形態 を損なう。再塗装は問題の一時的な解決策にすぎず、真菌は新しい塗膜を突き破 って蔓延する。塗料に蔓延する菌としては、特に限定的ではないが、プルラリア 種、クラドスポリウム種、アスペルギルス種およびペニシリウム種が例示される 。塗料系における真菌の増殖を抑制する唯一の成功法は、適当な静菌剤または抗 真菌剤を塗料に添加する方法ある。 多くの分野において、抗真菌性薬剤による治療法の開発は、抗菌性薬剤による 治療法の開発のようには急速にはおこなわれていないが、これは、ヒトまたはそ の他の動物の宿主と真菌病原体がいずれも真核生物であって多くの共通の薬剤標 的をもっているからである。今日まで、真菌細胞の表面または膜の成分に対して 活性を示す多くの抗真菌剤やリード化合物が知られている［グレイビル(Ｊ.Ｒ. Ｇraybill)、「新規な抗真菌剤」、Ｅur.Ｊ.Ｃlin.Ｍicrobiol.Dis.、第８巻、 第４０２頁〜第４１２頁(1989年)；コルチン(Ｙ.Ｋoltin)、「抗真菌剤発見のた めの標的」、Ａnnual Ｒeports in Ｍedical Chemistry、第２５巻、第１４１頁 〜第１４８頁(1989年)；シルバー（Ｌ.Ｓilver）およびボスチアン（Ｋ.Ｂostia n）、「抗菌剤用天然物の選抜」、Ｅur.Ｊ.Ｃlin.Ｍicrobiol.Dis.、第９巻、第 ４５５頁〜第４６１頁(1990年)；フェルナンデス（Ｐ.Ｂ.Ｆernandes）編、「抗 真菌剤の新しいアプローチ」、バークハウザー社（ボストン）1992年発行；「ス クリップの抗真菌剤レポート」、ＰＪＢパブリケーションズ社1992年発行］。例 えば、ポリエンマクロライドは細胞表面上の真菌に特異的なエルゴステロールに 結合し、また、アゾール系薬剤はエルゴステロール生合成酵素を阻害する。細胞 内標的（例えば、チューブリン等）およびヌクレオチド代謝に向けられた研究も 一部ではなされているが、これによって得られる化合物（例えば、ベノミルおよ びフルオロサイトシン等）は毒性と耐性の点で問題がある。シクロヘキシミド（ アクチジオン）は、真菌に対して特に特異的に作用するものではないが、一部の 作物に対しては殺真菌剤とし使用されている。ブラスチシジンＳも一部の作物に 対して抗真菌剤として使用されている。 真菌に対して特異的な治療剤を同定することは困難なだけでなく、真菌症の治 療剤として現在入手し得る多くの薬剤は重大な副作用をもたらすか、または一部 の重要な病原体に対する有効性を欠く。例えばアンホテリシンＢ（抗真菌性ポリ エンマクロリド抗生物質）は短期および長期にわたって不都合な効果（例えば悪 心、嘔吐および腎臓障害等）をもたらす。アゾール系薬剤、例えば、クロトリマ ゾールおよびミクロナゾール等はこのような不都合な副作用をもたらすので、こ れらの用途は一般に局所的または表面的な感染症の治療に制限されている。比較 的最近開発されたトリアゾール系薬剤（例えば、フルコナゾール）は比較的軽度 の副作用しかもたらさないが、全ての病原体に対して十分に有効なものではない 。また、これらの薬剤に対して耐性が発生するという証拠もある。従って、副作 用が少なくて、既存の薬剤によって治療効果の得られない病原体に対して有効な 新規抗真菌剤に開発が依然として要請されている。 さらに、真菌病原体は多くの治療剤の侵入に対する透過障壁を細胞に形成させ ることによる自然の耐性を有するか、または耐性を発生させる場合が多い。殺真 菌剤に対する耐性の発生は、本来的には殺真菌剤の影響を受ける真菌の細胞また は個体群が殺真菌剤と一定期間接触した後で遺伝的変化を起こして該殺真菌剤の 影響を受けにくくなったときにもたらされる。大抵の場合、耐性は殺真菌剤の取 り込みの変化または作用部位の変化に関連しており、解毒はまれにしか起こらな い［デッカー（Ｊ.Ｄekker）、「殺虫剤と殺真菌剤の耐性の予防と管理」、ヒト の場合の戦略と戦術］。特定の適用分野（例えば、農業）においては、殺真菌剤 の変更使用または殺真菌剤の混合物の使用によってこのような耐性の問題に対処 することが可能である。耐性抗原体集団の堆積を防止または遅延させるためには 、個々の病気に対して有効な種々の薬剤が必要となる。利用し得る薬剤の数を増 加 させる一つの方法は、新規な部位特異的インヒビターを探索することである（上 記論文参照）。従って、解決されるべき課題は、ヒトまたは他の動物または植物 の宿主に有害な影響を及ぼすことなく、病原体の内部に侵入してこれを特異的に 死滅させるか、またはその増殖の進行を止める化合物を同定する方法を開発する ことである。 抗真菌性化合物を同定するための古典的なアプローチにおいては、大抵の場合 は真菌の増殖を抑制することに最終目標がおかれている。天然物、半合成薬剤ま たは合成薬剤のライブラリーについて、標的病原体または関連する非病原性モデ ル生物体を死滅させる特性またはこれらの増殖を抑制する特性に関する選抜がお こなわれている。このような方法は面倒なだけでなく、化合物の作用機構につい ての情報は全く提供しない。このような選抜によって有望視されるリード化合物 はヒト、その他の動物または植物の宿主に対する毒性の有無を調べる試験に付さ れなければならず、さらに、作用機構を詳細に検討することによって、作用を受 けた分子標的を同定し、該化合物と該標的との正確な相互作用を調べなければな らない。 真菌症は、特に免疫抑制患者または免疫妥協患者の増加との関係で臨床的に非 常に重要な問題となっているので、抗真菌性薬剤を発見するのにより有効な方法 を開発することが急務となっている。このような課題に対する一つのアプローチ は、真菌に対して特有の特異的経路または真菌経路（fungal pathway）が所望の 薬剤と特異的に作用することが期待されるヒト、その他の動物または植物の同等 物（counterpart）とは十分に異なる特異的経路を標的化する異なる生体外アッ セイを利用するものである。真菌に特有の経路としてはキチンの合成と分解が例 示される。これらの経路の重要な過程に関係する個々の酵素は精製した後、潜在 的インヒビターを同定するための生体外での研究に供される。ヒト、その他の動 物または植物の同等物に比べて薬剤と特異的に作用する真菌標的としては、mＲ ＮＡスプライシングに必要な成分およびトポイソメラーゼが例示される。特異的 分子標的を精製した後、潜在的インヒビターを同定するための生体外での研究に 供することができる。採用されている生体外での研究は次の２つに大別される： （1）精製された標的高分子を生体外アッセイに使用して多数の化合物ライブ ラリーを抑制性薬剤のために選抜する研究、および （2）高分子標的の構造または、好ましくは、普通の基質もしくは配位子と関 連する高分子標的の構造を第一に決定することが必要な合理的な薬剤設計プログ ラムを作成するために精製標的分子を使用する研究。 このような研究によって得られる情報は抑制性化合物の設計に利用されるが、 該化合物は別途合成して試験に供されなければならない。試験結果を利用し、リ ード化合物が得られるまで分子モデルと薬剤の設計プロセスの精選を繰り返して おこなう。 被験化合物の存否による真菌の増殖を評価する伝統的な選抜法に比べて、上記 の方法によればある程度改良された結果が得られるが、該方法にはなお制約があ る。該方法の優れた点は、比較的効率のよい薬剤の探索ができることであり、こ れによって同定されるリード化合物は既知の標的との作用機構を有する。しかし ながら、このような方法は、精製高分子標的を用いて生体外でおこなわれるので 、得られるリード化合物は種々の原因により、真菌病原体の死滅またはその増殖 の抑制をもたらさないようになる。潜在的リード化合物は、輸送または透過に対 する障壁のために真菌細胞内へ侵入できず、該細胞内に侵入しても、金属イオン 封鎖、修飾または分解によって不活性化される。該細胞は過剰な生化学経路、ま たは薬剤の作用を受けない標的を有するものと考えられる。また、生体外での薬 剤開発プログラム用標記として単一の高分子を選択するための理論的基礎は、該 標的が保証されていないという仮定に基づくものである。 一部の研究者によれば、真菌の翻訳延長因子ＥＦ−３が抗真菌性化合物の良好 な標的になることが認められている。しかしながら、これらの研究者の以下の引 用文から明らかなように、これらの研究者のいずれもＥＦ−３を新規な抗真菌剤 の同定に利用する特異的方法は提案していない。 チューイト（Ｍ.Ｆ.Ｔuite）は、新規な抗真菌性標的の同定と利用に関する報 文を発表している［Ｔrends in Ｂiotechnol.、第１０巻、第２３５頁〜第２３ ９頁(1992年)参照］。彼は次の様に述べている： 「ＥＦ−３はサッカロミセス・セレビシエのリボソーム上でのタンパク質合成に は必須要素であるが、哺乳類のリボソーム上でのタンパク質合成には必須ではな い。その後の研究により、可溶性のＥＦ−３が真菌中のみに存在することが確認 された。………翻訳におけるその正確な役割は依然として明らかにされていない が、生化学的研究によれば、ＥＦ−３は本質的なヌクレオチダーゼ活性を示すこ とが提案されている。………従って、真菌のリボソームに対するＥＦ−３の結合 の阻止は新規な抗真菌手段を提供する。今日までの研究はサッカロミセス・セレ ビシエからのＥＦ−３に注目したものであるが、アルビカンス（Ｃ.albicans） のＥＦ−３をコードする遺伝子がそのサッカロミセス・セレビシエの同等物と機 能的に代替し得るということを明らかにした最近の分離と立証技術は、アルビカ ンスについての分子遺伝学的研究を行う際の困難を回避する手段を提供するであ ろう。しかしながら、潜在的抗真菌性標的の同定は、増加の一途をたどっている 生命を脅かす真菌性疾患を治療するのに有効な抗真菌性化合物を製造するという 最終的な目標に達するまでの第一段階に過ぎない。 （1）該標的に特異的に作用する潜在的インヒビターを同定するためには高性 能のスループット選抜が開発されなければならず、また、（2）有効な抗真菌剤 の合理的な設計を促進する標的分子を得るためには詳細な構造的情報が必要とな る。このような要求を満たす研究は簡単なものでなく、いずれも新規な抗真菌性 標的の同定に左右される。」 コルサースト（Ｃolthurst）らは次の様に述べている［Ｍol.Ｍicrobiol.、第 ６巻、第1025頁(1992年)参照］： 「従って、ＥＦ−３は真菌種に見掛け上は特有の必須ポリペプチドのほとんど唯 一の例であり、哺乳類にはこれと見掛け上の同等物はない（もっとも、ＥＦ−３ が真菌のリボソームにもたらす本質的活性は実際上は哺乳類のリボソームタンパ ク質の固有の特性かもしれない）。サッカロミセス・セレビシエにおけるこの本 質的特性の立証により、合理的に設計された抗真菌剤用標的としてのＥＦ−３の 潜在性が明確になる。ＥＦ−３に関連するリボソーム依存性ヌクレオチダーゼ活 性の抑制は有効な標的に対応するものではないが、リボソームとの結合の阻止能 はより現実的な目標となるかもしれない。重要なヒトの病原性酵母菌、即ち、ア ルビカンスから得られるＥＦ−３が、遺伝子的に操作可能な宿主（例えば、サッ カロミセス・セレビシエ）中で機能的に発現できることの立証は、タンパク質合 成におけるこの翻訳因子の機能的役割の分子遺伝学的分析に大いに役立つので、 ＥＦ−３を標的とする抗真菌剤を合理的に設計する研究を促進するであろう。」 さらに、コルサーストらは次の様に述べている。［ＦＥＭＳ Ｍicrobiology Ｌetters、第８０巻、第４５頁(1991年)参照］： 「ＥＦ−３は、増加の一途をたどっている抑制免疫系を有するカンジダ症感染者 に特に投与される抗真菌剤の重要な潜在的標的になるかもしれない。」 発明の概要 この発明は、新規な抗真菌剤の同定法、および真菌性疾患を治療して他の真菌 の侵入［例えば、特に限定的ではないが、「ヒトの真菌症（ベネケ(Ｅ.Ｓ.Ｂene ke)著、アップジョン社（カラマズー、ミシガン）1979年発行）に記載されてい るもの］を防止するための該抗真菌剤の使用法に関する。これらの方法により、 真菌細胞系がタンパク質を合成する真菌翻訳を阻害する抗真菌剤が同定される。 生体外での生化学的方法の簡便さと標的特異性および全細胞アッセイの全ての特 徴を結びつけるこれら方法によれば、天然化合物、半合成化合物または合成化合 物の多数のコレクションのなかから抗真菌剤を選抜することが可能となる。 翻訳の分野が多数の標的性抗真菌剤を産出する領域になるかもしれないという ことは認識されているが［コルチン（Ｙ.Ｋoltin）、「抗真菌剤探索用標的」、 Ａnnual Ｒeports in Ｍedicinal Ｃhemistry、第２５巻、第１４１頁〜第１４ ８頁(1989年)；シルバー（Ｌ.Ｓilver）およびボスチアン（Ｋ.Ｂostian）、「 抗菌剤用天然物の選抜］、Ｅur.Ｊ.Ｃlin．Ｍicrobiol.Ｄis.、第９巻、第４５ ５頁〜第４６１頁(1990年)；チューイト（Ｍ.Ｆ.Ｔuite）、「抗真菌剤の開発： 新 規標的の同定」、Ｔrends in Ｂiotechnol、第１０巻、第２３５頁〜第２３９頁 (1992年)］、本件出願人の知見によれば、これらの研究者は、翻訳特異的な（tr anslation-specific）抗真菌剤を同定する特異的な方法は提案していない。 翻訳のインヒビターが細菌感染症の治療に有用であることは証明されている。 真菌翻訳の特異的インヒビターは真菌侵入の治療には望ましいものであるが、こ の種の治療法は利用されていない。これは従来法によってはこれらの化合物を同 定できないからである。 本発明方法は従来法に比べて著しく改良されており、効率的で的確な薬剤の探 索を可能とする。第一の重要な改良点は、化合物の特異的高分子標的を知らなく ても、アプリオリにタンパク質の翻訳を阻害する化合物を同定する方法と該高分 子標的をその後に同定する方法を組合わせた点にする。第二の重要な改良点は、 被験微生物内部の分子標的へのリード化合物の到達をより容易にすることによっ て薬剤の探索効率を高めた点にある。 「真菌細胞系（mycotic cell system）」は一般的には真菌細胞の細胞翻訳系 を意味する。このような系は好ましくは、翻訳の開始に必要な全ての酵素と補因 子を含む。好ましい態様においては、該系は全真菌細胞、最も好ましくは生きた 増殖性細胞を意味する。 この発明においては、真菌細胞という用語としては「fungal cell」と「mycot ic cell」という用語を互換的に使用するが、該用語には、当業者には認識され ているように、分類学的には真菌群に属するカリニ・ニューモシステスを含む全 ての微生物および広義の真菌症として知られている疾患をもたらすことが知られ ているか、または該疾患をもたらすと考えられている全ての微生物（これにには 非真菌性病原体、例えば、当業者に認識されているアクチノミセスやミコバクテ リウム等の真菌様の（fungal-like）細菌が含まれる）［ベネケ、「ヒトの真菌 症」、アップジョン社（カラマズー、ミシガン）1979年発行］。 標的真菌病原体には、真菌病原体、真菌ペスト、および非真菌病原体（例えば 、真菌様細菌）が含まれる。本発明方法によって同定される化合物の一部は他の 所 謂非細菌性の「下等真核生物」（例えば、特に限定的ではないが、原生動物、ジ アルディア、渦鞭毛虫類および蠕虫等が例示される）、動植物の真菌病原体およ び無生物（例えば、特に限定的ではないが、穀物やその他の食糧、木材、紙、そ の他の天然物、塗料、ゴム、接着剤、エマルションポリマーおよびその他の合成 品等が例示される）への真菌の侵入に対しても有効である。 本発明は、真菌の翻訳能を有意に低下させる作因の同定法によって特徴づけら れる。そのような作因を選抜処理に付すことにより、真菌の翻訳系に対する特異 性および治療や予防の観点から宿主の細胞翻訳系に対してほとんどもしくは全く 影響を及ぼさないという特性を高めることができる。宿主の細胞系に対して多少 の影響を及ぼすような作因であっても、疾患の治療、特に生命を脅かすような疾 患、例えば、カンジダ症等の治療にはなお有用である。 この種の作因は、例えば、真菌のＲＮＡとのハイブリッド形成によって真菌Ｒ ＮＡと直接的に相互作用させてもよく、あるいは真菌の翻訳系の他の成分と相互 作用させてもよい。アンチセンス核酸、抗体およびその他のタンパク質は本発明 によって同定された抗真菌剤の例であるが、本件出願人は、有用は抗真菌剤とし て容易に処方し得る低分子量（１０,０００ダルトン以下、好ましくは、５,００ ０ダルトン以下、最も好ましくは１,０００ダルトン以下）の作因に特に興味が ある。好ましい態様においては、このような低分子量の作因によって本発明は特 徴づけられる。 単離された真菌特異的作因は薬学的に許容される製剤に配合した後、真菌性疾 患または他の真菌症の特異的処置に使用することができるが、この場合、宿主生 物体の細胞はほとんどまたは全く影響をうけない。 以下に説明する方法のうち多くのものは、真菌インヒビターが一部の組成物の 場合には真菌細胞の増殖を実際上高めるが、薬剤組成物の場合には真菌細胞を死 滅させるか、または該細胞の増殖能を低下させるのに有用な系を利用する。この ことが可能な理由は、以下に記載の系は一般に、変異真菌細胞を用いる特定の環 境下で増殖するように設計されているからである。しかしながら、このような変 異体と特異的環境の不存在下において用量を比較的高くする場合には、該インヒ ビターは真菌翻訳のインヒビターとして作用するので、有効な抗真菌剤となる。 これらの方法においては、従来から別の目的のために利用されていた系である が、抗真菌剤の検出のために有用なものとしては認識されていなかった多くの系 を利用する。この種の系は、最適な状態で利用できるように当該分野で既知の方 法によって修飾してもよい。例えば、次の文献には本発明において使用できる系 が記載されている：メーレ（Ｍoehle）およびヒンネブッシュ（Ｈinnebusch）、 Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、第１１巻、第2723頁(1991年)；フィルーザン（Ｆiroozan） ら、Ｙeast、第７巻、第１７３頁(1991年)；レイ（Ｒay）およびビュトウ（Ｂut ow）、Ｍol.Ｇen.Ｇenet.、第１７３巻、第２２７頁および第２３９頁(1979年) ；ヴァルナー（Ｗarner）およびゴーレンシュタイン（Ｇorenstein）、Ｎature 、第２７５巻、第３３９頁(1978年)；エゼキール（Ｅzekiel）およびエルキンス （Ｅlkins）、Ｂiochem.Ｂiophys.ＡＣＴＡ、第１６６巻、第４６６頁(1968年) ；グロス（Ｇross）およびポゴ（Ｐogo）、Ｂiochemistry、第１５巻、第2082頁 (1976年)；オリヴァー（Ｏliver）およびマクローリン（ＭcＬaughlin）、Ｍol. Ｇen.Ｇenet.、第１５４巻、第１４５頁(1977年)；クラーレ（Ｃlare）およびオ リヴァー、Ｍol.Ｇen.Ｇenet.、第１８８巻、第９６頁(1982年)；ヴァルトシェ ヴァ（Ｗaltschewa）ら、Ｃell、第３３巻、第２２１頁(1983年)；スタテヴァ（ Ｓtateva）およびヴェンコフ（Ｖenkov）、Ｍol.Ｇen.Ｇenet.、第１９５巻、第 ２３４頁(1984年)。これらの文献の記載内容も本明細書の一部を成すものである 。これらの文献のうちの一部のものには、真菌細胞の既知の翻訳インヒビターが 使用されているが、本発明においては、未知のインヒビターの選抜も使用される 。 本発明の第一の観点によれば、翻訳−応答性（translation-responsive）遺伝 子生産物に依存する抗真菌剤の同定法が提供れさる。この方法には、レポーター 分子の生産量（全翻訳量の百分率）が真菌細胞の全翻訳量が低減する条件下で増 加するような真菌細胞を構築する過程が含まれる。具体的に言えば、全翻訳量が 低減したときにレポーター遺伝子の生産量を相対的に増加させるように構築配列 された配列に翻訳的または転写的に結合した核酸によって該レポーター分子をコ ードする。好ましくは、全翻訳量は、全翻訳量の百分率として測定した発現量が 全翻訳量が低減したときに一定になるような第２のインジケーター遺伝子の発現 によって測定する。このような第２のインジケーター遺伝子の発現によって測定 する。この方法にはさらに、真菌細胞を被験化合物と接触させ、次いで、真菌細 胞内での第１のレポーター分子の生産量を該被験化合物が増加させるかどうかを 測定する過程が含まれる。 「翻訳的に結合した（translationally linked）」とは、結合遺伝子の固有の 翻訳を所望の時点で開始させるために、翻訳調節に含まれるリーダー配列（lead er sequence）が適当に結合することを意味する。 「転写的に結合した（transcriptionally linked）」とは、結合遺伝子の転写 を所望の時点で適当に開始させるために、プロモーターを構築配列することを意 味する。 「翻訳−応答性遺伝子生産物」とは、その合成が翻訳の総括速度に左右される 遺伝子生産物を意味する。一般的には２群の翻訳−応答性遺伝子生産物が使用さ れる。 第一群の遺伝子生産物は、その合成が特定の翻訳度において翻訳の総括速度に 左右されるように調整される遺伝子生産物から成る。このような翻訳−応答性遺 伝子としてはＧＣＮ４−型遺伝子が例示される。 「ＧＣＮ４−型遺伝子」は、細胞の全翻訳量が低減したときに翻訳的に結合し た遺伝子の発現量を増加させる調節配列を有する遺伝子を意味する。サッカロミ セス・セレビシエのＧＣＮ４の場合、調節配列はmＲＮＡ５'においてはＧＣＮ４ ポリペプチドをコードする開放読み枠（ＯＲＦ）までである。しかしながら、調 節配列は、ＧＣＮ４−型遺伝子のmＲＮＡ内のいずれかの配列であってもよい。 当業者であれば、他の真菌細胞内の同等物を認識できる。 ＧＣＮ４−型遺伝子生産物をレポーター分子として直接的または間接的に使用 するときには、ＧＣＮ−型遺伝子を細胞系内において突然変異させてもよい。何 故ならば、翻訳を阻害しないが一般アミノ酸調節経路を活性化する化合物もＧＣ Ｎ４−型遺伝子生産物の翻訳量を増加させるからである。すなわち、翻訳阻害性 化合物が非有用性化合物を検出することなく検出できるように細胞系が設計され る。好ましい態様においては、突然変異させたＧＣＮ−型遺伝子はサッカロミセ ス・セレビシエのＧＣＮ２遺伝子である。 「ＧＣＮ−型」遺伝子は、交差経路調節としても知られている一般アミノ酸調 節経路によるアミノ酸生合成の調節に必要な遺伝子を意味する。ＧＣＮ−型遺伝 子に欠損のある突然変異体はアミノ酸制限に応答して複数のアミノ酸生合成経路 を調節する機能にも欠損がある。このように定義されるＧＣＮ−型遺伝子には、 特に限定的ではないが、サッカロミセス・セレビシエの遺伝子（ＧＣＮまたはＧ ＣＤ）、および他の生物体のこれらと同等の遺伝子が含まれる。 「一般アミノ酸調節（Ｇeneral Ａmino Ａcid Ｃontrol）」という用語は当該 分野において認識されている意味で使用する。 第二群の遺伝子生産物は、その合成が特定の翻訳度において翻訳の総括速度に 左右されるように調節される遺伝子生産物から成る。翻訳−応答性遺伝子として はＲＰＬ１６Ａ−型遺伝子が例示される。ＲＰＬ１６Ａ−型遺伝子は、全細胞翻 訳量が低減したときに、転写的に結合した遺伝子の翻訳量を増加させるプロモー ターを有する遺伝子である。サッカロミセス・セレビシエのＲＰＬ１６Ａ遺伝子 の場合、細胞を第一に特殊な条件下（すなわち、アミノ酸制限培地内）に置き、 ＲＰＬ１６Ａ遺伝子が上記のように応答するようにする。当業者であれば、他の 真菌細胞中の同等物を認識できる。ＲＰＬ１６Ａ−型遺伝子生産物をレポーター 分子として用いる場合、ＧＣＮ−型遺伝子は突然変異させるのが好ましい。この 理由は、翻訳を阻害せずにＧＣＮ−型遺伝子を活性化させる化合物は特殊なアミ ノ酸制限条件を逆転させるからである。このような逆転は本明細書に記載のアッ セイにおける翻訳阻害の区別を困難にする。上記の突然変異を利用することによ り、細胞系は翻訳インヒビターを特異的に検出する。 好ましい態様においては、レポーター分子はそれ自体が翻訳−応答性遺伝子生 産物であり、その生産物は全翻訳量が低減すると増加する。別の好ましい態様に おいては、レポーターは異なった分子であり、その生産物は翻訳−応答性遺伝子 生産物の生産物と結合させる。レポーターと翻訳−応答性遺伝子生産物の間のこ のような結合はいくつかの方法によって達成することができる。レポーターをコ ードする遺伝子配列は、例えば、翻訳−応答性遺伝子生産物をコードする遺伝子 の一部もしくは全体および／または該遺伝子生産物の生産を調節する遺伝要素の 一部もしくは全体と融合させてもよい。あるいは、翻訳−応答性遺伝子生産物に よって、レポーターをコードする遺伝子の転写および／または翻訳を直接的また は間接的に促進させてもよい。 別の好ましい態様においては、レポーター分子の生産量は、レポーター遺伝子 生産物、例えば、β−ガラクトシダーゼ等の酵素活性によって測定する。 他の好ましい態様においては、細胞系は真菌の全細胞であり、特定条件下での 該全細胞の増殖量を測定する過程が含まれる。このような特定条件は、翻訳イン ヒビターの存在下では増殖がおこなわれるが、該インヒビターの不存在下では増 殖がほとんどまたは全くおこなわれないように選択される。このような条件はい くつかの方法によって達成される。一つの方法は、レポーター遺伝子生成物の競 合インヒビターを用いて真菌細胞系を増殖させる方法である。別の好ましい態様 においては、真菌細胞系を、レポーター遺伝子生産物であるイミダゾールグリセ ロールデヒドロゲナーゼ（サッカロミセス・セレビシエＨＩＳ３遺伝子生産物） のインヒビター［３−アミノ−１,２,４−トリアゾール（３ＡＴ）］を用いて増 殖させる。ＨＩＳ３遺伝子の発現の増大によって３ＡＴに対する耐性が高められ る。あるいは、レポーター遺伝子の部分的欠損性または栄養緩徐性の対立遺伝子 を用いてもよい。他の好ましい態様においては、サッカロミセス・セレビシエの hisl−２９遺伝子を用いる。栄養緩徐性対立遺伝子の発現増大によってその固有 欠損は補償され、一部の細胞系はＨis^-表現型からＨis⁺表現型に変換される。 さらに別の好ましい態様においては、レポーター分子の生産を、毒性剤、例え ば、５−フルオロトリプトファン（５−ＦＴ）または３ＡＴ等の有害な効果を軽 減させる特性によって測定する。 また、他の好ましい態様においては、特定条件下で増殖させた真菌細胞の抽出 物を細胞系として使用し、生体外での転写と翻訳を測定する過程を含む。このよ うな特定条件は、翻訳インヒビターを細胞抽出物に添加することによってレポー ターの転写量または翻訳量が増加するように選定される。 本発明の第二の観点によれば、１種または数種の翻訳成分に対する妨害を受け やすい真菌細胞系を利用することによって抗真菌剤を同定する方法が提供される 。 この方法には、突然変異させた真菌細胞であって、対応する野生型細胞の場合 に比べて形態または量の点で相違する１種または複数種の翻訳成分が存在する変 異真菌細胞を構築する過程が含まれる。このような野生型細胞は変異細胞と同質 遺伝子型であり、このことは次のことを意味する。すなわち、変質翻訳成分をコ ードする遺伝子以外の他の全ての遺伝子の対立遺伝子の形態は野生型細胞の場合 と変異細胞の場合とでは同一である。 この方法には、変異細胞と野生型細胞の増殖に対する影響を評価することによ って、被験化合物の翻訳妨害能を調べる過程が含まれる。翻訳に関与する特定の 成分に作用して翻訳を妨害する化合物は、該成分とは形態と量の点で相違する変 異真菌細胞を、対応する野生型細胞とは異なった様式で増殖させるが、野生型細 胞の増殖の場合とは異なり、翻訳に関与する他の成分を変化させる他の変異細胞 の増殖に影響を及ぼさない。従って、この方法によれば、被験化合物が翻訳を妨 害するかどうかを同意する手段だけでなく、該化合物がその効果を発揮する部位 を特定する手段が得られる。被験化合物によって増殖が影響を受ける細胞内に存 在する形態と含有量が相違する翻訳成分は被験化合物の作用部位になり得る。 本発明の第三の観点によれば、翻訳を適確におこなう段階、例えば、翻訳中に 固有の読み枠を保持する段階および終止コドンにおいて翻訳を終止させる段階等 を妨害する抗真菌剤を同定する方法が提供される。 この方法には、翻訳を終止コドンにおいて終止させるか、または１つの読み枠 内に維持する正常なプロセスが中断されたときに検出可能なレポーターポリペプ チドのみが生産されるような変異真菌細胞を構築する過程が含まれる。この方法 には、変異真菌細胞を被験化合物と接触させることによって該化合物がレポータ ーポリペプチドの生産を増大させるかどうかを調べる過程も含まれる。 好ましい態様においては、変異真菌細胞は遺伝子融合物を含んでおり、該融合 物の転写物は、機能性生産物の翻訳を著しく低下させる読み枠シフトまたは翻訳 終止コドンを有するレポーターポリペプチドのためのコード化配列（coding seq uence）を有する。正常な翻訳プロセスが中断されたときにのみ、該コード化配 列は翻訳される。 本発明の第四の観点によれば、真菌細胞翻訳を阻害するＧＣＮ２−型キナーゼ 、例えば、サッカロミセス・セレビシエeＩＦ−２αキナーゼ（ＧＣＮ２キナー ゼとしても知られている）の機能を活性化するかまたは阻害する抗真菌剤の同定 法が提供される。 一つの方法には、代謝物の正常形態の有効態（availability）がＧＣＮ２−型 キナーゼの活性によって増加しない限り真菌細胞に対して毒性を示す代謝物類似 体および被験化合物の存在下で真菌細胞を増殖させる過程が含まれる。この方法 には、低濃度でキナーゼ（例えば、フォスファターゼ）をある程度活性化させる かまたはキナーゼを拮抗する機能を不活性化させることによって毒性類似体の存 在下での細胞増殖に増殖上の利点をもたらす化合物を選択する過程が含まれる。 比較的高い濃度の場合、この種の化合物は増殖が有害な影響を受ける程度までキ ナーゼを活性化させる。この理由は、キナーゼの異常に高い活性によって全翻訳 量が著しく低減するからである。この種の化合物は有効な抗真菌剤である。 このような毒性類似体は当該分野においては周知であり、例えば、使用に供さ れる細胞によって正常なアミノ酸またはプリンとして十分に認識される置換アミ ノ酸誘導体または置換プリン誘導体であって、有害な生産物を生産するかまたは 臨界酵素活性を阻害する化合物が挙げられる。 これに関連する方法には、ＧＣＮ２−型キナーゼの構成的に活性化された対立 遺伝子を発生させる突然変異真菌細胞を被験化合物と接触させる過程が含まれる 。 低濃度でキナーゼをある程度不活性化させるか、またはキナーゼの活性を別の方 法で拮抗する化合物は、キナーゼの構成的に活性化された対立遺伝子によっても たらされる有害な効果を改善する。このような化合物は、比較的高い濃度では、 真菌の増殖が有害な影響を受ける程度までキナーゼを不活性化させる。この種の 化合物も有効な抗真菌剤である。 「ＧＣＮ２−型キナーゼ」は、翻訳成分をリン酸化することによって全翻訳を 阻害する。好ましい態様においては、ＧＣＮ２−型キナーゼは、サッカロミセス ・セレビシエの翻訳成分（eＩＦ−２α）の５１番目の位置におけるセリン残基 を特異的にリン酸化することのできるタンパク質キナーゼである。 「機能(function)」は、ＧＣＮ２−型キナーゼと反対の効果をもたらす活性を 意味する。このような機能を有するものとしては、特に限定的ではないが、フォ スファターゼ、普通はＧＣＮ２−型キナーゼによって阻害される翻訳成分、例え ばeＩＦ−２およびeＩＦ−２Ｂが挙げられる。 「構成的に活性化された対立遺伝子（constitutively activated allele）」 は、全試験条件下において表現型活性を示すタンパク質をコードする遺伝子の対 立遺伝子を意味する。 「ＧＣＮ２−型キナーゼの構成的に活性化された対立遺伝子」とは、野生型Ｇ ＣＮ２でコードされたタンパク質を不活性な状態に維持する条件（例えば、アミ ノ酸調節培地）（抑制条件）のもとで表現型活性を示すＧＣＮ２−型キナーゼを コードする遺伝子の対立遺伝子を意味する。 翻訳を開始させるためには、翻訳機構に関与する成分を可逆的に物理的に相互 接触させなければならない。このような接触が比較的永続的におこなわれるかま たは妨害されると、翻訳は中断される。 本発明の第五の観点によれば、翻訳機構に関与する成分間の特異的相互作用を 妨害する抗真菌剤の生成法および／または同定法が提供される。 この一つの方法には、外部シグナルに応答して翻訳成分の突然変異体を合成す るつ真菌細胞を構築する過程が含まれる。翻訳成分の一部の突然変異体、例えば 該成分の優性の負の対立遺伝子は、それらの翻訳成分パートナーとの接触を、野 性型の同等物との接触よりもより永続的なものとする。この方法には、真菌の増 殖に有害な効果をもたらす変異翻訳成分を同定する過程が含まれる。このような 変異翻訳成分は有効な抗真菌剤である。 好ましい態様においては、このようなより永続的な接触を仲介する最小の可能 なドメインを、変異体のサイズを順次低減させることによって同定し、次いで、 最小の機能性ドメインおよびその誘導体と類似体が抗真菌活性を有するかどうか を調べる。 別の方法には、一つの翻訳成分が第１の非相同ドメイン(例えば、ＤＮＡ−結 合ペプチド)と融合し、他の翻訳成分が第２の非相同ドメイン(例えば、転写−活 性ドメイン)との融合した真菌細胞を構築する過程が含まれる。これらの非相同 ドメインとしては、２つの翻訳成分が相互に物理的に相互作用したときに測定可 能なシグナルを発生するものを選択する。例えば、転写−活性ドメインは、２つ の翻訳成分が相互に物理的に相互作用したときに、検出可能なレポーターの転写 とその後の翻訳を活性化する。相互作用した翻訳成分ドメインは活性機能を保有 する最小サイズのペプチドまで縮小される。ペプチドおよび該ペプチドの誘導体 と類似体が実際に相互作用する競合インヒビターとしての効力を有するかどうか を、まず第一にレポーターポリペプチドの生産量を低減させるかどうかを測定し 、次いで、翻訳過程における関連する段階を妨害するかどうかを測定することに よって調べる。真菌翻訳成分の有効な競合インヒビターは有効な抗真菌剤である 。 「誘導体」または「類似体」は、ペプチドの所望の生物学的特性を有する化合物で あって、１または複数のアミノ酸の位置に変化のある化合物を意味する。このよ うな変化は、ペプチド内の３つまでの位置においてアミノ酸を別のアミノ酸で置 換させたものであってもよく(好ましくは、荷電アミノ酸と別の荷電アミノ酸で 置換させる)、あるいはペプチド内の３つまでの位置において、化学基を別の化 学基で置換させたものであってもよい。 別の方法においては、ペプチド配列との関連性が知られていない被験化合物が 特異的相互作用を阻害する特性を有するかどうかを上述のようにして調べる。 本発明の、第六の観点によれば、ミトコンドリア中での翻訳を特異的に阻害す る抗真菌剤を、非ミトコンドリア翻訳が終止した真菌細胞内でのタンパク質合成 を被験化合物の存在下で測定することによって同定する方法が提供される。 「非ミトコンドリア翻訳が終止した」とは、非ミトコンドリア細胞コンパートメ ント内(特に細胞質内)での翻訳過程が、ミトコンドリア中での翻訳過程がほとん どまたは全く影響を受けることなく妨害されることを意味する。 好ましい態様においては、非ミトコンドリア翻訳はシクロヘキシミドによって 終止させる。別の好ましい態様においては、非ミトコンドリア翻訳は他の低分子 インヒビターによって終止させる。また、他の好ましい態様においては、非ミト コンドリア翻訳は、１種または複数種の細胞質翻訳成分の温度感受性対立遺伝子 を有する真菌細胞を非許容温度までシフトさせることによって終止させる。 本発明の第七の観点によれば、細胞または生物体に透過障壁を付与する１種ま たは複数種のタンパク質をコードする１または複数の遺伝子の変異または欠失に よって該細胞または生物体に対する被験化合物のアクセス(access)を高める方法 が提供させる。 「透過障壁」とは、細胞または生物体に損傷を与える化合物の取り込み、出入れ 、封鎖または解毒に該細胞または生物体が関与しないようにするいずれかの機構 (mechanism)を意味する。真菌細胞の場合、このような機構には、多面的薬剤抵 抗性(ＰＤＲ)遺伝子の生産物によってコードされる機構または該生産物によって 生産が調節される機構が含まれる。 好ましい態様においては、１または複数のＰＤＲ遺伝子を不活性化するか、ま たは真菌細胞から除去することによって、生化学経路における被験化合物の妨害 能の検出が可能となる(該妨害能は他の方法によって検出できないが、これは、 活性なＰＤＲ遺伝子生産物によって仲介された真菌細胞から被験化合物が急速に 排出されるからである)。 以上のように、本発明によれば、サッカロミセス・セレビシエの延長因子ＥＦ −３に関して活性でないインヒビターを含む特異的な真菌翻訳インヒビターの多 数の選抜法が提供される。当業者には明らかなように、上述の抗真菌剤の選抜法 には重要な利点がある。上記の方法においては、多くのレポーター遺伝子が使用 できる。当業者であれば使用するのに望ましいこの種の遺伝子は容易に認識する ことができ、このうちの多くの遺伝子は、容易に検出可能なシグナル(例えば蛍 光性シグナル)または細胞増殖をもたらす他の系においても一般的に使用できる 。本発明によって得られる抗真菌剤は生体外アッセイだけでなく、生体内処置に おいても有用である。このようなアッセイには、実験室での研究者によっておこ なわれる常套の科学的実験等が含まれる。 本発明には、請求の範囲に記載の方法によって得られる新規な抗真菌剤および これらの抗真菌剤の使用、例えば、特に限定的ではないが、真菌性感染症の処置 または予防的処置等が含まれる。 本発明のその他の特徴や利点は以下に示す好ましい態様の詳細な説明と請求の 範囲から明らかになる。 好ましい態様の説明 図面 まず最初に図面について説明する。 図１aは翻訳状態のモニターとしての一般的調節を示す。ＧＣＮ４ mＲＮＡの 翻訳は図示する経路によって調節される。アミノ酸制限によってキナーゼＧＣＮ ２が活性化され(＋)、該キナーゼはトリマー翻訳開始因子 eＩＦ−２のアルファ サブユニット上のセリン−５１残基を特異的にリン酸化する。eＩＦ−２αのセ リン−５１−リン酸化物は翻訳開始因子 eＩＦ−２Ｂ(ＧＥＦとしても知られて いる)のインヒビター(−)である。因子 eＩＦ−２Ｂは、因子 eＩＦ−２を不活 性なＧＤＰ−結合状態から活性なＧＴＰ−結合状態へ循環させる。アミノ酸が十 分な条件下での効率的な循環により、三重複合体(eＩＦ−２−ＧＴＰ−tＲＮＡ −met．)の効率的な生成と効率的な翻訳開始がもたらされる。効率的な翻訳開始 により、mＲＮＡリーダー内の短い上流ＯＲＦの存在に起因してＧＣＮ４ ＯＲ Ｆの翻訳は非常に少なくなる。これに対して、アミノ酸が制限される条件下では 、ＧＣＮ２キナーゼが活性化される。このリン酸化生成物は eＩＦ−２の循環を 阻害するので、三重複合体の生成量が減少して翻訳開始が阻害される。翻訳開始 の阻害によりＧＣＮ４(アミノ酸生合成遺伝子の転写活性化因子)の翻訳量が著し く増加する。ＧＣＮ４の翻訳はアミノ酸生合成の生体内アッセイによって測定さ れる増殖に対するその効果または生体内もしくは生体外での酵素アッセイによっ て測定されるレセプター遺伝子の発現に対するその効果によってモニターされる 。 図１bは一般アミノ酸調節アッセイの模式図である。翻訳のインヒビターを選 抜するためには一般アミノ酸調節経路に関する知識が利用される。ＧＣＮ２は、 eＩＦ−２αセリン−５１をリン酸化する酵母中で知られている唯一のキナーゼ である。ＧＣＮ２を欠く別の野性型菌株の場合、ＧＣＮ４翻訳は常に少なく、ア ミノ酸制限条件下でもそうである。eＩＦ−２およびeＩＦ−２Ｂをコードする遺 伝子における遺伝子欠損は、アミノ酸が十分に存在する条件下でさえも高レベル のＧＣＮ４翻訳をもたらす。翻訳開始を阻害する低分子は、セリン−５１−リン 酸化 eＩＦ−２αまたは翻訳因子遺伝子における遺伝子欠損の効果と類似の効果 を示し、高レベルのＧＣＮ４翻訳をもたらす。 図１aおよび図１bにおいて、矢印の上部の事項の「＋」は矢印の下部の事項もし くは条件の発生を促進することを示し、また、矢印の上部の事項の「−」は矢印の 下部の事項または条件の発生を阻害することを示す。 図２はヒスチジンの生合成経路を示す。ヒスチジンの合成は前駆体であるホス ホリボシルピロリン酸(pＲpp)およびＨＩＳ１遺伝子によってコードされた酵素 によって開始する。ＨＩＳ３遺伝子によってコードされた酵素は３−アミノトリ アゾール(３ＡＴ)によって競合的に阻害される。この経路における酵素をコード する大部分もしくは全ての遺伝子の転写はＧＣＮ４によって促進される。 図３は一般調節増殖アッセイ(general control growth assay)を示す。本発明 によるいくつかの方法においては、推定される翻訳遮断剤は「逆説増殖アッセイ」 によって選抜される。このアッセイは、翻訳遮断剤を低用量で用いた場合には被 験生物体の増殖を促進するが、高用量で用いた場合には被験生物体の増殖を阻害 するか、または該生物体を死滅させるように設計される。このような条件を満た すためには、被験生物体をほとんどまたは全く増殖させない増殖培地、並びに増 殖制限を解除する生産物および不完全な翻訳阻害をレポーターの発現増加と関連 づける転写もしくは翻訳調節配列の両方をコードするレポーター遺伝子が必要で ある。各アッセイにおいては、平行培養物を平行条件下において被験化合物と共 にインキュベートする(但し、増殖制限条件は、例えば、レポーターがヒスチジ ン生合成酵素をコードしたときにヒスチジンを添加することによって達成される )。この図に示すように、培養は軽く接種した菌叢(lawn)として固体状培地上で 増殖させ、被験化合物は該菌叢の上部面上に載置した多孔性ディスクに塗布する 。これらのアッセイにおいては、多くの化合物が増殖に対して効果がなく、一部 の化合物は増殖を単に阻害する。一方、の化合物は増殖を高濃度の場合は阻害す るが低濃度の場合は促進する。この最後の化合物群は翻訳遮断剤と推定される。 化合物のディスク上への塗布量に応じて、増殖阻害域は明らかに小さくなるか、 または存在しなくなる。これらのアッセイは、翻訳に対して亜致死的な(sub−le thal)効果を与えるリード化合物の同定を可能にする高精度の方法である。 図４は翻訳状態のモニターとしての緊縮調節を示す。リボソームタンパク質Ｌ １６をコードする遺伝子対の一つであるＲＰＬ１６Ａで類型化される多くのリボ ソームタンパク質遺伝子の転写は図示する経路によって調節される。アミノ酸制 限によって、荷電(アミノアシル化)tＲＮＡに対する未荷電tＲＮＡの比を高める ことができる。この比が高くなると、翻訳リボソームは、同種の荷電tＲＮＡを 得ることができないコドンに引き止められるようになる。このようなコドンは「 ハングリー(hungry)」コドンと呼ばれる。酵母タンパク質はハングリーコドンを 認 識して飢餓シグナルを発生し、該シグナルが、緊縮調節経路に応答するリボソー ムタンパク質遺伝子および他の遺伝子の転写を特異的に低減させるものと考えら れている。亜致死的濃度の翻訳−延長遮断剤をアミノ酸が制限された細胞培養物 に添加すると、翻訳延長および荷電 tＲＮＡの消費が低下し、また、アミノ酸制 限自体が緩和されなくても、飢餓シグナルは減衰する。その結果、緊縮調節に応 答する遺伝子の転写は翻訳延長遮断剤の添加によって増加する。この現象は「緊 縮応答の表現型緩和」として知られている。図中、矢印の上部の事項の「＋」は矢 印の下部の事項または条件の形成を促進することを示し、矢印の上部の事項の「 −」は矢印の下部の事項または条件の形成を阻害することを示す。 図５は終止抑制アッセイを示す。このアッセイは翻訳終止のインヒビターを同 定するように設計される。翻訳終止コドン(ナンセンスコドン)はＯＲＦ中に導入 され、これによって翻訳されるべき標準長のＯＲＦは非常に少なくなる。翻訳終 止を妨害してナンセンスコドンを測定可能な頻度でセンスコドンとして誤読させ る被験化合物は標準長のＯＲＦの翻訳を増加させる。 この態様の場合、ＰＨＯ５によってコードされる抑制性酸性フォスファターゼ を使用するが、その使用を必要とするこの特定のレポーターについて特有のもの はない。このレポーターを選択する理由は、酵素活性の背景レベルが十分に低く 、酵素アッセイが比較的簡単であり、酵素が細胞の外部表面上に局在下されてい るからである。これらの因子は完全細胞を用いる高率のスループットアッセイに 好適なものである。未変性のＰＨＯ５ mＲＮＡは、翻訳終止コドン(またはフレ ームシフト)によって妨害されない大きなＯＲＦを有する。このアッセイのため には、単一の終止コドンを開放読み枠内へ導入し、いくつかの対立遺伝子を矢印 で示すようにして形成させる。終止コドンはシグナル配列の切断部位の近くに導 入するのが好ましい。その理由は、この部位においては間違って挿入されたアミ ノ酸が酵素の活性または局在化を妨げる可能性が低いからである。 図６aは、被験化合物として既知の翻訳遮断剤を用いた表現型緩和アッセイの 結果を示す。既知の翻訳遮断剤は図３に示すような「逆説的増殖アッセイ」によっ て試験した。この場合、実施例２に記載の培地および適切な遺伝子型菌株ＲＰＬ １６Ａ−ＨＩＳ３ his３ gcn４を使用した。被験化合物は水、エタノールまた はジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)に溶解させた。これらの溶媒はいずれも単独 ではアッセイに影響を及ぼさなかった。１０種類の被験化合物がアッセイにおい て正の結果を示した（３ＡＴ上での増殖が促進された）。５種類の被験化合物が 真菌毒性を示した。即ち、これらの化合物は比較的高濃度で酵母細胞を死滅させ るか、または該細胞の増殖を阻害した。１４種類の被験化合物はアッセイにおい て視覚で認識できるような効果を示さなかった(大部分のこれらの化合物は原核 リボソームに対して特異的であることが知られている)。このアッセイはエメチ ン、グーゲロチンおよびピューロマイシンを陽性体として同定するのに十分な感 度を示す。これらの３種の化合物は生体外での酵素の翻訳を阻害するが、完全な 酵母細胞に対しては効果がないことが報告されている。 図６bは非翻訳遮断剤を用いた表現型緩和アッセイの結果を示す。アッセイは 図６aの場合のようにしておこなった。但し、この場合には、翻訳遮断剤として 知られていない化合物や薬剤を使用し、正の結果(３ＡＴ上での増殖促進)がどの ような頻度で得られるかを調べた。翻訳に影響を及ぼすことなく３ＡＴ上での増 殖を促進する化合物は偽似陽性体と呼ばれる。これらの偽似陽性体の多くは強酸 または強塩基であり、いずれの場合も、pＨの中和によって３ＡＴ培地上での増 殖促進能を失った(これらの化合物を用いる予想外の方法によって翻訳に影響を 及ぼすようにすることは可能である)。ニスタチンは比較的高濃度では３ＡＴ培 地失での増殖を促進するが、比較的低濃度では該増殖を促進しない。 図７は、総括翻訳アッセイ法の一般的アッセイスキームのグラフ表示である。 このようなアッセイは特異的レポーター遺伝子に依存するものであり、細胞の全 翻訳量または全転写量に対する該レポーター遺伝子の翻訳量または転写量は、翻 訳遮断剤の添加によって増加する。このようなアッセイにおいては、細胞または 特異的レポーター遺伝子の全翻訳量または全転写量は低減する。しかしながら、 特異的レポーター遺伝子の翻訳量または転写量は、翻訳遮断剤の添加後は、細胞 の全翻訳量または全転写量に対して増加しなければならない。図中の矢印は翻訳 遮断剤の添加を示す。 図８は翻訳成分特異的アッセイの模式的表示である。好ましい態様においては 、翻訳成分遺伝子のみのが相違する一組の同質遺伝子菌株(isogenic strain)を 用いる。この菌株は種々の被験化合物を含有する増殖許容培地中で平行してイン キュベートした。翻訳特異剤(translation−specificagent)の不存在下、または 、一定の限界濃度の該翻訳特異剤の存在下においては、全ての菌株が増殖した( 但し、Ａ１２に示す負の増殖コントロールは除く)。非特異的インヒビターの存 在下、または過度に高い濃度の翻訳特異剤の存在下においては、いずれの菌株も 増殖しなかった(但し、Ｂ１２に示す正の増殖コントロールを除く)。翻訳特異剤 が適当な濃度範囲で存在する場合、菌株のサブセットは増殖しない。被験化合物 によって阻害される変異体菌株のパターンは該化合物の期待できる標的を示す。 図９はサッカロミセス・セレビシエＹＥＦ３遺伝子を発生させる同質遺伝子酵 母を用いて得られたアッセイの模式的表示である。酵母菌株と培養条件は実施例 ４に記載の通りであるが、以下の様に若干相違する。十分に希釈した培養物０． ３mlと試験溶液４μlをウェル「Ａ」に添加し、十分に希釈した培養物０.１５mlを ウェル「Ｂ」〜「Ｇ」に添加し、さらに細胞を含まない培地０.１５mlをウェル「Ｈ」 に添加した。ウェル「Ａ」中の培養物と試験溶液を混合させた後、該混合物０.１ ５mlを、既に培養物０.１５mlを含む隣接するウェル「Ｂ」の中へ添加した。混合 後、該混合物０.１５mlを隣接するウェル「Ｃ」の中へ添加し、混合する。以下、 同様にしてウェル「Ｇ」内で混合をおこない、ウェル「Ｇ」から混合物０.１５mlを 取り出した。試験溶液は図中の格子の上部に示す：シクロヘキシミド(０.１３μ g／ml)、パロモマイシン(左から右にそれぞれ、２.７mg／ml、１.３mg／mlおよ び０.６７mg／ml)、ヒグロマイシンＢ(０.６７mg／ml)、コントロール(脱イオン 水)。 以下、本発明の特異的アッセイにおいて必要な種々の成分と方法について詳細 に説明する。これらの説明によって本発明は限定されるものではなく、当業者に とって明らかなように、いずれの真菌細胞系も該真菌細胞の翻訳系において活性 な抗真菌性化合物を選抜するための本発明による方法に適用できる。従って、以 下に説明する多くの実施例は試験系としてのサッカロミセス・セレビシェの使用 に関するものであるが、当業者には明らかなように、他の真菌細胞系もサッカロ ミセス・セレビシエの場合と同様にして処理することによって同等の真菌細胞系 を誘導することができる。さらに、多くの実施例が全細胞系を用いる増殖アッセ イに関するものであるが、当業者には明らかなように、このような全細胞の抽出 物も、翻訳アッセイ系を得るのに必要な全ての翻訳成分を含んでいる限り使用で きる。 １．試験生物体の選択 好ましい態様においては、アッセイでは試験真菌細胞系としてサッカロミセス ・セレビシエ（ベーカー酵母）を使用する。この生物体は増殖が容易で、アッセ イの進行を促進する強力な分子遺伝学的機能を有しており、また、病原性真菌と 共通の特徴を有している(例えば、アルビガンスの翻訳延長因子ＥＦ−３は機能 的にはサッカロミセス・セレビシエの対応物と代替することができる)。サッカ ロミセス・セレビシエはげっ歯動物またはヒトにおいては特定の条件下では病原 菌になり得ることが報告されている[ステンダーラップ(Ｊ．Ｓtenderup)および ブルーン(Ｂ．Ｂruun)、「サッカロミセス科の酵母菌による真菌病」、Ｓcand． Ｊ．Ｉnfect．Ｄis．第２２巻、第５８１頁〜第５８４頁(１９９０年)]。サッカ ロミセス・セレビシエの使用が好ましいということは、本発明方法における他の 真菌細胞系(例えば、特に限定的ではないが、本明細書の背景技術の部分に記載 したもの)の使用を除外することを意味するものではない。 ２．細胞の翻訳状態の指標として機能する遺伝子 以下に説明する２種のアッセイ、即ち、一般的調節アッセイおよび表現型緩和 アッセイはそれぞれ遺伝子ＧＣＮ４およひＲＰＬ１６Ａの発現のモニターに基礎 をおくものであり、これらの遺伝子は細胞の翻訳状態を特に敏感に反映する。本 発明にとって好適な特性を有する他の遺伝子は系統的なサーチによって同定する ことができる。これらの遺伝子の本発明にとって好適な特性は、(１)翻訳が妨害 された条件下において、全細胞 mＲＮＡまたはタンパク質に対する発現度(％)と して測定した発現量を増加または低減させる特性および(２)この調節をもたらす 配列要素を同定して操作する特性である。 このような系統的なサーチの一つは、正常な翻訳条件下と妨害された翻訳条件 下での放射性アミノ酸もしくはアミノ酸前駆体を用いる瞬間標識細胞培養を平行 しておこなう操作を伴うものである。標識後、タンパク質の一部または全部を当 業者に既知の方法、例えば、二次元ゲル電気泳動法によって分離する。２通りの 条件下における全タンパク質合成に関して発現度の異なる個々のタンパク質を同 定して単離し、該当する遺伝子を当業者には既知の方法によってクローン化する 。 別の系統的サーチは、２通りの条件下における全 mＲＮＡに対して異なって発 現された mＲＮＡを探索することを伴うものである。mＲＮＡは当業者に既知の 方法によって同定できる[サムブルック(Ｊ．Ｓambrook)、フリッチュ(Ｅ．Ｆ． Ｆritsch)およびマニアチス(Ｔ．Ｍaniatis)編、「分子クローン化、実験室マニ ュアル」(第２版)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(ニ ューヨーク)１９８９年発行]。このような遺伝子の特性を図７に示す。この場合 、所望のレポーター遺伝子は全翻訳度に比べて高い発現度を示す。 ３．一般的調節アッセイ 本発明の一つの特徴は、細胞の翻訳能の影響を受けやすい翻訳調節を示す特定 の酵母遺伝子を同定して被験化合物の活性の指標として使用する抗真菌剤の選抜 法にある。生体内もしくは生体外アッセイにより遺伝子生産物を直接測定するか 、またはそれらの調節要素を適当なレポーター遺伝子と融合させて生体内もしく は生体外でのハイブリッド遺伝子生産物の生産量を測定することによって被験化 合物の活性を直接伝達するのにこれらの遺伝子の発現を利用してもよい。あるい は、被験化合物の活性のレポーターとして順繰りに機能する他の遺伝子の発現を 誘導するのに翻訳指標の発現を利用してもよい。この方法においては、翻訳抑制 条件 において特異的な１または複数のＲＮＡの好ましい翻訳を可能にする真菌の翻訳 応答性翻訳調節核酸配列を利用する。好ましい態様においては、この配列はレポ ーターポリペプチドをコードするＲＮＡと翻訳的に結合する。 この方法には、細胞または細胞抽出物、例えば、該配列を含む酵母の細胞また は細胞抽出物等を、潜在的抗真菌剤の不存在下ではレポーターポリペプチドがほ とんどまたは全く合成されないような条件下において該抗真菌剤と接触させる過 程が含まれる。 この方法にはさらに、該潜在的抗真菌剤がレポーターポリペプチドの翻訳度を 高めるかどうかを決定する過程が含まれる。逆説的には、この翻訳度を高めるい ずれの作因も、比較的高い用量を必要とするが、抗真菌剤として潜在的に有用な ものである。 「一般アミノ酸調節アッセイ」に関連する別の好ましい態様においては(図１a参 照)、酵母生合成遺伝子の翻訳活性化因子であるＧＣＮ４の活性を[ヒンネブッシ ュ(Ａ．Ｇ．Ｈinnebusch)およびリープマン(Ｓ．Ｗ．Ｌiebman)、「タンパク質合 成と翻訳調節」、サッカロミセス属酵母菌の分子生物学：ブローチ(J．Ｒ．Ｂroa ch)、プリングル(Ｊ．Ｒ．Ｐringle)およびジョーンズ(Ｅ．Ｗ．Ｊones)編、Ｃ ＨＳラボラトリープレス(ニューヨーク)１９９１年発行、第６２６頁〜第７３６ 頁参照]、翻訳遮断剤の敏感な指標として使用する。この理由は、翻訳を阻害す る条件は、通常は非常に低いレベルまで抑制されるＧＣＮ４の発現を促進するか らである。ＧＣＮ４の合成または活性に対する被験化合物の効果は、ＧＣＮ４の 調節下においてレポーター遺伝子生産物を合成する菌株を用いて検出する。この ようなレポーター遺伝子には、特に限定的ではないが、次のものが含まれる：( １)ＧＣＮ４発現が抑制される細胞の増殖を妨げる選択的条件下で細胞を増殖さ せるためにはその生産物が高濃度で要求される遺伝子、および(２)その生産物が 免疫学的手段、分光測定法的手段、発光測定法的手段または放射性同位体を用い て容易に検出される遺伝子。レポーター遺伝子は、その発現がＧＣＮ４遺伝子生 産物自体によって調節されるようにＧＣＮ４から物理的に分離してもよく、ある いは、 遺伝子ハイブリッドを形成するのに必要な調節要素を有するＧＣＮ４遺伝子の一 部に融合させてもよい。遺伝生産物は、レポーター遺伝子生産物活性が保持され ると共に関連するＧＣＮ４調節要素が制御される条件下で合成される。 「真菌翻訳−応答性翻訳調節核酸配列」とは、翻訳阻害性条件下において翻訳的 に関連したＲＮＡの優先的翻訳を可能にする核酸を意味する。このような核酸と しては、翻訳阻害条件下で関連するリボ核酸の翻訳を可能にするＧＣＮ４ mＲＮ Ａリーダーが例示される。 「優先的翻訳」とは、mＲＮＡの全翻訳に対する翻訳阻害条件下での翻訳速度ま たはタンパク質の収率が、翻訳の非阻害条件下の場合に比べて高くなるように m ＲＮＡの翻訳がおこなわれることを意味する。さらに、全細胞の mＲＮＡの平均 的な翻訳は、非翻訳阻害条件下の場合に比べて低い翻訳速度または低いタンパク 質収率でおこなわれてもよい。このような優先的翻訳は以下に説明するように容 易に検知できる。 「翻訳阻害条件」は、タンパク質合成の総括速度が低下するような条件を意味す る。 「レポーターポリペプチド」は、以下に説明するように、特定の環境条件下で比 色シグナルを供与するか、または当業者に周知のその他のシグナルを供与するこ とによって容易に検出できるペプチドを意味する。 実施例１：ＧＣＮ４発現のモニター 一般アミノ酸調節経路は酵母細胞の翻訳状態に非常に敏感である[ヒンネブッ シュおよびリープマン、「タンパク質の合成と翻訳調節」、サッカロミセス属酵母 菌の分子生物学、ブローク、プリングルおよびジョーンズ編、ＣＨＳラボラトリ ープレス(ニューヨーク)１９９１年発行、第６２６頁〜第７３６頁]。アミノ酸 の制限に関する図１aにおいて、未荷電の tＲＮＡは増量し、ＧＣＮ２キナーゼ はセリン５１残基上でリン酸化 eＩＦ−２αに活性化される。このリン酸化種は 、ｅＩＦ−２ＢまたはＧＥＦとして知られている ｅＩＦ−２に対するＧＤＰ− ＧＴＰ交換因子を阻害して、ＧＴＰに結合した活性な ｅＩＦ−２を減量させる 。この 欠失に応答して、ＧＣＮ４ ＯＲＦの翻訳は抑制される。ＧＣＮ４は、アミノ酸 生合成酵素をコードする多くの遺伝子のプロモーター中に見出される共通部位に 結合し、アミノ酸の生合成の正味の増量をもたらす。ＧＣＮ結合部位は一部のt ＲＮＡ合成酵素遺伝子、例えば、リシンtＲＮＡ合成酵素をコードするＧＣＤ５ ／ＫＲＳ１等のプロモーター中にも存在する。実際、gcd５−１変異体は、発現 を増殖のために十分なレベルまで増加させる完全な一般調節経路によって完全に 左右される[ランカー(Ｓ．Ｌanker)、ブッシュマン(Ｊ．Ｌ．Ｂushman)、ヒンネ ブッシュ(Ａ．Ｇ．Ｈimnebush)、トラクセル(Ｈ．Ｔrachsel)およびミュラー(Ｐ ．Ｐ．Ｍueller)、Ｃell、第７０巻、第６４７頁〜第６５７頁(１９９２年)]。 ＧＣＮ２キナーゼの不存在下では、一般調節経路およびＧＣＮ４遺伝子の発現 はアミノ酸飢餓によって活性化されない。一方、ｅＩＦ−２またはeＩＦ−２Ｂ のサブユニットを不完全に不活性化する突然変異体を含む菌株は、ＧＣＮ４翻訳 に対して構成的に抑制される。さらに、翻訳の開始または延長を阻害する低分子 はセリン−５１−リン酸化 eＩＦ−２αまたは eＩＦ−２もしくはeＩＦ−２Ｂ 中の突然変異体の効果と類似の効果をもたらし、ＧＣＮ翻訳を抑制する。従って 、ＧＣＮ２を欠くと共に一組の野性型翻訳成分 eＩＦ−２および eＩＦ−２Ｂを 有する菌株は、細胞内でのＧＣＮ４の発現レベルをモニターすることによって翻 訳の開始および延長のインヒビターを同定するのに利用できる。さらに、ＧＣＮ ４に応答性のtＲＮＡ合成酵素のインヒビターは、ＧＣＮ２キナーゼを欠く細胞 内においてはより高い毒性を示す。 Ａ．レポーター系 本発明のこの態様においては２つのタイプのレポーターを使用する。即ち、一 方のタイプのレポーターは酵素アッセイ、例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子 融合によって容易にモニターされるものであり、別のタイプのレポーターは細胞 培養の増殖特性、例えば、ヒスチジンの不存在下での増殖によってモニターされ るものである。いずれの場合も、レポーターの合成は、翻訳インヒビターに対し て出来るだけ敏感に応答するように設計すべきである。 β−ガラクトシダーゼのような酵素のアッセイ法の利点は周知である。このレ ポーターを用いて容易に得られるＧＣＮ４−lacＺ融合物は、アミノ酸制限また は翻訳開始因子遺伝子ＧＣＤ１の突然変異に応答して１０〜５０倍高い調節能を 示す。被験化合物に対してより高感度のアッセイ法においては、ＣＹＣ１ ＵＡ Ｓ１−ＵＡＳ２配列の位置におけるＧＣＮ４結合部位の２つのコピーとのＣＹＣ １ −lacＺ融合物は同じ条件下において２０〜２００倍高い調節能を示し、また 、ＧＣＮ４結合部位の２よりも多いコピーとの融合物はさらに高い調節能を示す [ヒンネブッシュ、ルッキニ(Ｇ．Ｌucchini)およびフィンク(Ｇ．Ｆink)、ＰＮ ＡＳ、第８２巻、第４９８頁〜第５０２頁(１９８５年)]。後者の融合物はプラ スミドpＣＭ８３[メーレ(Ｃ．Ｍ．Ｍoehle)およびヒンネブッシュ、「サッカロミ セス・セレビシエにおけるリボソームタンパク質遺伝子転写の緊縮調節によるＲ ＡＰ１結合部位の結合」、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、第１１巻、第２７２３頁〜第 ２７３５頁(１９９１年)]および次のオリゴヌクレオチドの相補対を用いて構築 される： ５'−ＴＣＧ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＧＴ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＡ Ｃ ＴＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＧＴＴ ＴＴＴ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＴＧ ＴＣＴ Ｇ ＴＣ Ａ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ.：１）および ５'−ＧＡＴ ＣＴＧ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＣＴ ＣＧＡ ＧＣＡ ＡＡＡ Ａ ＣＧ ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＧＴ ＣＧＡ ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＧＡＧ Ｔ ＣＡ Ｇ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ.：２)。 これらの相補対のアニール化物は２つのＧＣＮ４結合部位を有する。このオリゴ ヌクレオチド対はpＣＭ８３のＸhoＩ−ＢglＩＩ部位にクローン化され、これに よって不全ＸhoＩ部位、第１のＧＣＮ４部位、ＳalＩ制限部位、第２のＧＣＮ４ 部位、新たなＸhoＩ部位、およびlacＺ ＯＲＦに対して５'末端から３'末端に わたって再構築されたＢglＩＩ部位がもたらされる。同じオリゴヌクレオチド対 を新たなプラスミドのＳalＩ−ＢglＩＩ部位にクローン化させてさらに１つのＧ ＣＮ４部位(正味)を加えるか、またはＸhoＩ−ＢglＩＩ部位にクローン化させて さらに２つのＧＣＮ４部位を加える。最適な立体配置(２つ、４つまたは６つの ＧＣＮ４結合部位を有する構造)の選択は、gcn２欠失菌株中(抑制条件)、gcn２ gcd１菌株中(脱抑制)および既知の翻訳インヒビターが存在するgcn２欠失菌株 中における各々の構造に対するβ−ガラクトシダーゼ活性を調べることによって 決定される。 第２のタイプのレポーターアッセイ法においては、細胞培養物の増殖特性をモ ニターする。一つの態様においては、内因性ＨＩＳ３遺伝子をレポーターとして 使用する。ＨＩＳ３の発現および３ＡＴに対する増殖耐性はＧＣＮ４遺伝子の発 現の増大に伴って増大する。より好ましい態様においては、hisl−２９遺伝子を レポーターとして使用する。 ＧＣＮ２キナーゼを欠くと共に野性型ＨＩＳ１遺伝子の代わりにhisl−２９遺 伝子を有する菌株は増殖に十分なヒスチジンを合成できない。遺伝子変異体、例 えばgcd１またはgcd２による翻訳の阻害または翻訳インヒビター、例えばアニソ マイシンまたはＴ−２毒素の添加による翻訳の阻害によりＧＣＮ４タンパク質の 翻訳が増大し、これによってhisl−２９(および他のヒスチジン生合成遺伝子)の 翻訳増大がもたらされ、細胞は増殖に十分なヒスチジンを生産する。一部の菌株 のバックグラウンドにおいては、経験的に見出される低濃度(最終的には約１０ μＭ)のヒスチジンの培地に添加することによってこの後者のアッセイ法をより 効率的におこなうことができる。 このアッセイには別のレポーター、例えば特に限定的ではないが、修飾ＨＩＳ ３ 遺伝子、インヒビターを得るための酵素をコードする遺伝子またはインヒビタ ーを不活性化する酵素をコードする遺伝子等を用いることもできる。 Ｂ．試験菌株 この選抜法の目的は、翻訳を阻害してＧＣＮ４の発現を抑制する化合物を見出 すことである。野性型ＧＣＮ２遺伝子を有する菌株を用いるならば、翻訳を阻害 しないがＧＣＮ２(eＩＦ−２αキナーゼ)を活性化する化合物も選抜によって検 出可能であるが、これは活性化されたＧＣＮ２がＧＣＮ４を抑制するからである 。機能性ＧＣＮ２遺伝子を欠く変異菌株を用いることによって、このような面倒 な 事態は回避される。好ましい態様においては、増殖アッセイに用いる試験菌株に は、部分的に欠損のあるＨＩＳ１タンパク質をコードするhisl−２９対立遺伝子 も含有されているべきである。hisl−２９変異体は、Ｇcn＋バックグラウンドに おけるヒスチジン不含培地中で増殖できるが、Ｇcn^-バックグラウンドの場合に は増殖できない。関連する表現型his１−２９ gcn２::ＬＥＵ２ ＧＣＮ４を有 する単数体菌株ＹＲＧ１３０を次のセクションの選抜において用いる。 酵素発現アッセイに用いる菌株はレポーター遺伝子融合物、例えばＨＩＳ４− lacＺ 、ＧＣＮ４−lacＺまたはＣＹＣ１−lacＺ(ＣＹＣ１ ＵＡＳ１およびＵＡ Ｓ２配列の位置にＧＣＮ４結合サイトを有する)を有するのが好ましい。 Ｃ．抗真菌剤の選抜 図３に基づき、潜在的な治療剤を化合物のライブラリーから同定するために、 菌株ＹＲＧ１３０(his１−２９ gcn２ ＧＣＮ４)の培養物を調製し、以下に説 明する逆説培地１上に接種し、次いで被験化合物を添加してその効果を評価する 。この方法の第１段階は、該菌株をＹＥＰＤ(１％酵母抽出物、２％ペプトン、 ２％デキストロース)ブイヨン２ml中において、撹拌下、３０℃で一夜増殖させ る。このスターター培養物を遠心分離によってペレット化し、これを殺菌脱イオ ン水４ml中で洗浄した後、殺菌脱イオン水３４ml中に再懸濁させる。洗浄して再 懸濁させた培養物１６mlを、逆説培地１ ２５０mlを保有する１０インチ正方形 プレート上に接種する。接種後、直ちに吸引によって出来るだけ多くの過剰液を 除去し、残存する過剰液は、該プレートを蓋を取ったバイオセイフティーキャビ ネット内において送風機を作動させながら４０〜９０分間インキュベートするこ とによって乾燥除去する。乾燥後、直径２.５mmのピンを培地内に挿入してウェ ルを形成させ、該ウェル内に被験化合物２〜４μlをピペットを用いて注入する 。当業者には明らかなように、被験化合物をこのようにして使用することによっ て濃度勾配が形成され、最も高い濃度がウェルに近接して存在する。従って、こ のアッセイ法によって、個々の被験化合物の一定の濃度範囲における効果を調べ ることがてきる。プレートは３０℃で１〜４日間(一般的には２日間)インキュベ ー トし、この間に菌叢の増殖をモニターする。被験化合物の不存在下においては、 培養物の増殖はほんのわずかおこなわれるか、あるいは全くおこなわれない。翻 訳インヒビター、例えばモデル化合物であってペプチジルトランスフェラーゼ活 性を阻害するアニソマイシン[ジーゲル(Ｍ．Ｒ．Ｓiegel)、「タンパク質合成に 対する抗真菌剤の効果」、抗真菌性化合物(第２巻)、ジーゲルおよびシスラー編 、マーセルデッカー社(ニューヨーク)１９７７年発行、第３９９頁〜第４２８頁 ]または１以上の翻訳段階を阻害するシクロヘキシミド(該文献参照)の存在下に おいては、翻訳が完全に阻害されるので、円盤状領域を包囲するリング状の非増 殖領域が形成される。リング状の非増殖領域を包囲する領域は増殖促進領域であ り、該領域には翻訳が不完全に阻害される平衡領域が存在する。この平衡領域内 では、翻訳の十分な低減によってＧＣＮ４の発現の抑制とヒスチジン合成の増加 がもたらされるが、細胞の増殖と***を続行させるのに十分な翻訳がおこなわれ る。非翻訳標的によって酵母菌を死滅させる化合物、例えばカナバニンまたは１ ０％ＳＤＳ(ナトリウムドデシルスルフェート)の存在下においては、該円盤状領 域はリング状の非増殖域によって包囲されるが、増殖が促進される他の同心リン グ状領域によっては包囲されない。 この方法によって同定される重要な化合物は、他の同質遺伝子のgcn２ his １−２９ gcn４菌株、即ち、当業者に周知の標準的な方法によって構築される ＹＲＧ１２９を用いる類似のアッセイ法によって二次的に選抜される。ＧＣＮ４ タンパク質の不存在下では、推定される翻訳インヒビターは第１領域内における 増殖を制限するが、第２領域内における増殖は促進しない。tＲＮＡ合成酵素(例 えば、ボレリジン)またはアミノ酸生合成酵素(例えば、３ＡＴ)(これらはいずれ も生体内での翻訳用基質を提供する)を阻害する化合物は、Ｇcn＋菌株よりもＧc n−菌株に対してより効果的なものとして同定される。菌株ＹＲＧ１２９を用い る二次的なアッセイ法は、ＹＲＧ１３０を用いる一次的アッセイ法の場合と同じ 手順によっておこなう。但し、逆説的培地１の代わりに逆説的培地２を用いる。 ＹＲＧ１２９菌株にはＧＣＮ４タンパク質が存在しないので、該菌株を用いる場 合にはＹＲＧ１３０の場合よりも、増殖のためにはより多くのヒスチジンを必要 とする。 逆説的培地１および２の配合処方を以下に示す。 逆説的培地１ 成 分 配合量 バクト寒天(Ｂacto Ａgar) ５.０ｇ アミノ酸を含まないジフコ(Ｄifco)酵母菌用窒素源 １.６８ｇ ２００mＭ イソシトール ０.２５ml １００mＭ アルギニン １.２５ml １０mＭ ウラシル ５.０ml １００mＭ ヒスチジン ７.５μl 蒸留水 ２３０ml 上記組成物をオートクレーブを用いて３０〜４０分間処理した後、４０％デキ ストロース１２.５mlを添加し、該混合物を５５℃まで冷却した後、滅菌培養皿( ２５cm×２５cm)[例えば、ストラタジーン(Ｓtratagene)＃４０００４０]に注ぐ 。 逆説的培地２ 成 分 配合量 バクト寒天 ５.０ｇ アミノ酸を含まないジフコ酵母菌用窒素源 １.６８ｇ イノシトール原液 ０.２５ml アルギニン原液 １.２５ml ウラシル原液 ５.０ml ヒスチジン原液 ７５μl 蒸留水 ２３０ml 上記組成物をオートクレーブを用いて３０〜４０分間処理した後、４０％デキ ストロース１２.５mlを添加し、該混合物を５５℃まで冷却した後、滅菌培養皿( ２５cm×２５cm)(例えば、ストラタジーン＃４０００４０)に注ぐ。 Ｄ．酵素アッセイ 化合物のライブラリーから潜在的な治療剤を同定するために、適当な菌株(こ の態様の場合にはＧＣＮ４−lacＺ レポーター遺伝子を有するgcn２菌株)のス ターター培養物を栄養要求性を満たすように補充したＳＤ培地中で一夜増殖させ [「酵素遺伝子と分子生物学へのガイド」、グソリー(Ｃ．Ｇuthrie)およびフィン ク(Ｇ．Ｆink)編、酵素学における方法、第１９４巻、１９９１年]、次いで同じ 培地を用いて１:５０の希釈比で希釈する。細胞の増殖を２〜４時間再開させた 後、被験化合物を、増殖を完全に停止させる濃度ではないが、増殖を制限する濃 度で添加する。最も好ましくは、被験化合物は細胞倍加時間において３倍の増加 をもたらす。細胞倍加時間は全細胞タンパク質の蓄積のアッセイによって測定す るのが好ましく、液状培養物の光散乱特性に基づいて測定するのは好ましくはな い。被験化合物が、倍加時間において２倍よりも低い増加率しかもたらさないな らば、濃度が十分に高くないので偽陰性であり、さらに高い濃度でのアッセイが 必要となる。被験化合物が倍加時間において５倍よりも高い増加率をもたらすな らば、全翻訳が過度に効果的に停止されて翻訳調節の変化が観察されないので偽 陰性であり、より低い濃度でのアッセイが必要となる。さらに５〜６時間経過後 、培養物を収集し、レポーター遺伝子の活性を当業者に周知の方法によってアッ セイする[メーレおよびヒンネブッシュ、「サッカロミセス・セレビシエにおける リボソームタンパク質遺伝子の緊縮調節とＲＡＰ１結合サイトとの関連性」、Ｍo l.Ｃell．Ｂiol．、第１１巻、第２７２３頁〜第２７３５頁(１９９１年)および 該報文に引用されている文献参照]。レポーターの活性は、被験化合物を用いて 処理しないで平行して培養する培養物の場合と比較する。 翻訳を阻害する化合物はＧＣＮ４−lacＺ発現を促進して十分に高いβ−ガラ クトシダーゼ活性をもたらす。この方法によって同定される重要な化合物は、m ＲＮＡリーダー内に第４の上流開放読み枠(ＯＲＦ)のみを有するＧＣＮ４−lac Ｚ およびＧＣＮ４対立遺伝子を生成する別の同質遺伝子菌株を用いる類似のアッ セイ法によって二次的に選抜される。この対立遺伝子は翻訳調節機構に応答でき ないので、翻訳インヒビターに応答しない[ヒンネブッシュおよびリープマン、「 タンパク質合成と翻訳調節」、サッカロミセス属酵母菌の分子生物学、ブローク 、プリングルおよびジョーンズ編、ＧＨＳラボラトリープレス(ニューヨーク)１ ９９１年発行、第６２６頁〜第７３６頁参照]。 ４．表現型緩和アッセイ 本発明の一つの特徴は、細胞の翻訳能に感受性の翻訳調節能を有する特定の酵 母遺伝子を同定し、該遺伝子を被験化合物の活性の指標として使用することを含 む抗真菌剤の選抜法にある。これらの遺伝子の発現を利用することによって被験 化合物の活性を直接的に測定してもよい。この測定は、生体内もしくは生体外で のアッセイにより該遺伝子の遺伝子生産物を直接的に測定するか、または該遺伝 子の調節要素を適当なレポーター遺伝子と融合させてハイブリッド遺伝子生産物 の生体内または生体外での生産量を測定することによっておこなう。あるいは、 翻訳指標の発現を利用し、被験化合物の活性のレポーターとして機能する他の遺 伝子の発現を誘発させてもよい。 この方法においては、翻訳阻害条件下における１または複数の特異的ＲＮＡの 転写とその後の翻訳を増大させる真菌翻訳応答性の翻訳調節核酸配列を利用する 。好ましい態様においては、この配列は、レポーターポリペプチドをコードする 遺伝子と転写的に結合させる。この方法には、この配列を有する細胞または細胞 抽出物を潜在的抗真菌剤と、該抗真菌剤の不存在下でのレポーターポリペプチド の合成をほとんどまたは全く可能にさせないような条件下で接触させる過程が含 まれる。さらにこの方法には、該抗真菌剤がレポーターポリペプチドの合成度を 増大させるかどうかを測定する過程が含まれる。逆説的には、この合成度を増加 させる作因は、比較的高い用量を必要とするが、抗真菌剤として潜在的に有用な ものである。 あるいは、その方法では、翻訳阻害条件下での１または複数のＲＮＡの転写と その後の翻訳を増大させる細菌翻訳応答性の転写調節核酸配列を利用する。好ま しい態様においては、この配列は、レポーターポリペプチドをコードする遺伝子 と転写的に結合させる。この方法には、該配列を有する細菌細胞または細菌細胞 抽出物を潜在的抗真菌剤と、該抗真菌剤の不存在下でのレポーターポリペプチド の合成をほとんどまたは全く可能にさせないような条件下で接触させる過程が含 まれる。さらにこの方法には、該抗真菌剤がレポーターポリペプチドの合成度を 増大させるかどうかを測定する過程が含まれる。逆説的には、該合成度を増加さ せる作因は、比較的高い用量を必要とするが、抗真菌剤として潜在的に有用なも のである。 より好ましい態様である「表現型緩和アッセイ」においては、表現型緩和[エゼ キール(Ｄ．Ｈ．Ｅzekiel)およびエルキンス(Ｂ．Ｎ．Ｅlkins)、Ｂiochim．Ｂi ophgs．ＡＣＴＡ、第１６６巻、第４６６頁〜第４７４頁(１９６８年)参照]を利 用して翻訳遮断剤を同定する(図４参照)。部分的には酵素を用いて独立に立証さ れるものであるが、細菌の場合のように[カシェル(Ｍ．Ｃashel)およびルッド( Ｋ．Ｅ．Ｒudd)、「緊縮応答」、大腸菌とネズミチフス菌の細胞分子生物学、ナイ トハルト(Ｆ．Ｃ．Ｎeidhardt)編、アメリカン・ソサイアティー・フォー・マイ クロバイオロジー(ワシントン、ＤＣ)１９８７年発行および該報文に引用されて いる文献参照]、酵母におけるアミノ酸の飢餓によって通常は非荷電 tＲＮＡレ ベル対荷電 tＲＮＡレベルの比の増加がもたらされるが、これは翻訳リボソーム によって認識される。該翻訳リボソームは、リボソームＲＮＡとタンパク質の合 成速度を低下させる飢餓シグナルを発生すると考えられる(「緊急応答」)。翻訳を 阻害する被験化合物はアミノアシル tＲＮＡのプールの需要量を低減させるので 、飢餓シグナルの発生を遮断によってアミノ酸飢餓の効果は相殺され、リボソー ムタンパク質の合成は部分的に回復する。 従って、リボソームタンパク質、例えば、遺伝子ＲＰＬ１６Ａの合成度は被験 化合物の活性をモニターするのに使用できる。リボソームタンパク質自体をレポ ーターとして用いてもよいが、好ましい態様においては、ＲＰＬ１６Ａの調節要 素を適当なレポーター遺伝子またはその一部の５'末端に融合させ、この遺伝子 ハイブリッドの発現をアミノ酸の部分的飢餓条件下でのタンパク質合成インヒビ ターの検出に利用する。より具体的には、この翻訳遮断剤アッセイにおいては、 (a)サッカロミセス・セレビシエのＨＩＳ３遺伝子によってコードされるイミダ ゾール−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼの周知のインヒビターであ って、ヒスチジンを制限して緊急応答の誘発およびヒスチジンを欠く最少培地ま たは補充培地上での酵母菌増殖の阻害をもたらす３−アミノ−１,２,４−トリア ゾールおよび(b)レポーター遺伝子としてＲＰＬ１６Ａ調節要素と融合したＨＩ Ｓ３ 遺伝子を使用する。逆説的には、翻訳を阻害する低用量の被験化合物は３Ａ Ｔで処理した細胞に、ＲＰＬ１６Ａに結合したＨＩＳ３タンパク質をより多く生 産させる。これにより細胞は３ＡＴによる増殖阻害効果を排除し、別の状況では 増殖速度が非常に遅いか、または全く増殖しないような条件下において増殖する 。あるいは、ＨＩＳ３−レポーターは、当業者に周知の方法によって容易にアッ セイできる別の遺伝子、例えば、大腸菌のlacＺ遺伝子で代替させてもよい。 ＲＰＬ１６Ａ ＨＩＳ３およびＲＰＬ１６Ａ lacＺの使用は単なる例示に過 ぎないものであり、本発明はこれらの遺伝子とこれらの生産物の使用に限定され ない。当業者であれば、有用なレポーター遺伝子として別のリボソーム遺伝子を 認識できる。 「真菌翻訳応答性の転写調節核酸配列」とは、翻訳阻害条件下における１または 複数の特異的ＲＮＡの転写増大をもたらす核酸を意味する。このような核酸とし ては、アミノ酸制限条件において、翻訳インヒビターの導入により、転写的に結 合した遺伝子配列の転写を増大させるＲＰＬ１６Ａ遺伝子の調節要素が例示され る。 「転写的に結合した」とは、(１)転写開始のタイミング、頻度および位置並びに 転写終結の位置を決定する調節要素および(２)転写配列(即ち、ＲＮＡに転写さ れるＤＮＡ配列)から成る転写ユニットの一部のメンバーになることを意味する 。転写ユニットの配列は該ユニットの一部ではない別のＤＮＡ配列で分離させて もよい。さらに、多くの場合、該ユニットのメンバーの間隔は固有の機能にとっ て重要である。 「転写増大」とは、翻訳阻害条件下での全mＲＮＡ合成もしくは収率に対するmＲ ＮＡの転写速度また収率が非翻訳阻害条件下の場合に比べて高速または高収率に なることを意味する。さらに、全細胞の平均のmＲＮＡは非翻訳阻害条件下の場 合に比べて低速または低収率で転写されてもよい。このような転写の変化は以下 に記載のようにして容易に検知することができる。 「緊縮応答」とは、アミノ酸制限条件下での微生物細胞の調節応答を意味する。 細胞代謝の多くの点がこの影響を受けるが、本発明における最も顕著な効果は、 翻訳成分をコードする多くの酵母菌遺伝子の転写が特異的に低減することである 。 「緊縮応答の緩和」とは、緊縮応答による効果の完全または不完全な逆転、即ち 、翻訳成分遺伝子の転写が、アミノ酸制限下において影響を受けないか、または わずかな影響を受けることを意味する。 「緊縮応答の表現型緩和」とは、環境条件、例えば翻訳インヒビターを添加した 条件に起因する緊縮応答の緩和を意味するものであり、この緩和は、遺伝子変異 に起因する緊縮応答の緩和とは対照的である。 実施例２:ＲＰＬ１６Ａ発現のモニター 微生物は、細胞内のアミノ酸の濃度をモニターしてこれに応答するために緊縮 調節経路を利用する。アミノ酸が制限される結果、細胞内では非荷電tＲＮＡの 濃度が増大し、これに応答して細胞は飢餓シグナルを発生させ、該シグナルはリ ボソームの構成成分の合成を低減させる。細菌の場合には、リボソームに結合し た因子Ｒe１ＡがリボソームのＡ部位をモニターすることが知られている。同種 のアミノアシル化tＲＮＡを得ることができないためにリボソームがコドンで引 き止められると、Ｒe１Ａは第２のメッセンppＧppを合成する。細胞内でのppＧp pの濃度はリボソームの構成成分の合成速度に反比例する。延長のインヒビター 、例えば、クロラムフェニコールをアミノ酸が枯渇状態の細胞内へ亜致死濃度で 添加すると、荷電tＲＮＡは速やかに消費されなくなる。従って、リボソームは 頻繁には引き止められず、Ｒe１ＡはppＧppを多量に合成せず、またリボソーム の構成成分の合成は大幅には低減しない。この後者の現象は緊縮応答の表現型緩 和として知られている[エゼキールおよびエルキンス、Ｂiochim．Ｂiophys．Ａ ＣＴＡ、第１６６巻、第４６６頁〜第４７４頁(１９６８年)参照]。酵母菌との その同種菌においてはＲe１ＡとppＧppが同定されていないことに関する知見は 少ないが、サッカロミセス属の酵母菌は細菌のような緊縮応答(表現型緩和現象 を含む)を示すことが知られている[メーレおよびヒンネブッシュ、「サッカロミ セス・セレビシエにおけるリボソームタンパク質遺伝子転写の緊縮調節とＲＡＰ １結合部位との関連性」、Ｍoll．Ｃell．Ｂiol．、第１１巻、第２７２３頁〜第 ２７３５頁(１９９１年)および該報文に引用されている文献参照]。酵母菌内で の翻訳を阻害する治療剤は、表現型緩和を観察することによって同定できる。し かしながら、リボソームの構成成分の合成を直接的にモニターすることは、大規 模な処理の場合は非常に面倒である。この発明には、緊縮応答の表現型緩和を遺 伝子融合体を用いてモニターすることにより、翻訳の延長および開始を阻害する 抗真菌剤を同定する方法が含まれる。 Ａ．レポーター系 本発明のこの態様においては、２種のタイプのレポーターを用いた。即ち、一 方のタイプのレポーターは酵素アッセイによって容易にモニターできるもの、例 えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合物等であり、他方のタイプのレポーター は細胞培養の増殖特性例えば、ヒスチジンの不存在下での増殖等によってモニタ ーできるものである。いずれの場合も、レポーターの合成は、翻訳インヒビター に対して出来るだけ高い感受性を示すように設計すべきである。 酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ等のアッセイする方法の利点は周知である 。容易に入手し得るＲＰＬ１６Ａ−lacＺ融合物を用いることによって、アミノ 酸 制限に応答して４〜６倍の調節効果が得られる。被験化合物に対してより高い感 受性が要求される場合には、ＲＰＬ１６Ａ−lacＺ融合物の誘導体を使用するこ とができる。この場合、推定されている非調節的または基本的な転写Ｔ−リッチ 要素(Ｔ−rich element)の一部または全部を緊縮調節応答性のＲＡＰ１−結合 部位の２〜４個のエクストラコピー(extra copy)で置換する。 後者の融合物は、BglII−適合性末端とＸhoＩ−適合性末端によって包囲され るＲＰＬ１６Ａから誘導される２つのＲＡＰ１−結合部位を有する２個の二本鎖 Ｌ１６オリゴヌクレオチド[メーレおよびヒンネブッシュ、「サッカロミセス・セ レビシエにおけるリボソームタンパク質遺伝子転写の緊縮調節とＲＡＰ１結合部 位との関連性」、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、第１１巻、第２７２３頁〜第２７３５ 頁(１９９１年)参照]を結合させた後、生成するダイマーをpＲＳ３０６のＳalＩ 部位にクローン化させることによって構築される[シコルスキおよびヒーター、「 サッカロミセス・セレビシエにおけるＤＮＡの効率的な操作のために設計された 酵母宿主菌株とシャトルベクターの系」、Ｇenetics、第１２２巻、第１９頁〜第 ２７頁(１９８９年)参照]。ＸhoＩおよびＳalＩ制限フラグメントを結合させる ことによってハイブリッド部位を形成させることができるが、該部位は酵素によ って認識されない。このクローン化によって、ＢglII末端において結合した一対 のＬ１６オリゴヌクレオチドを有するプラスミドが調製される。このダイマーは 、元のＳalＩ部位を包囲するＸhoＩ部位とＢamＨＩ部位において該プラスミドを 切断することによって切除し、次いでpＣＭ５４のＸhoＩ−BglII部位に結合させ ることができる[メーレおよびヒンネブッシュ、「サッカロミセス・セレビシエに おけるリボソームタンパク質遺伝子転写の緊縮調節とＲＡＰ１結合部位との関連 性」、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、第１１巻、第２７２３頁〜第２７３５頁(１９９１ 年)参照]。ＳalＩとＸhoＩとの間の関連性はＢamＨＩとＢglIIとの間にもある。 第２のタイプのレポーター、即ち、細胞培養の増殖特性によってモニターでき るレポーターは、外部から供給される試薬によって阻害される生産物をコードす る遺伝子を利用する。以下に記載のように、イミダゾールグリセロールホスフェ ートデヒドロゲナーゼをコードするＨＩＳ３遺伝子をレポーターとして使用し、 また、３−アミノ−１,２,４−トリアゾール(３ＡＴ)をインヒビターとして使用 する。ＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３融合物を以下に記載の方法によって構築し、適当 な酵母菌株(his３ gcn４)に導入した。以下に記載のようにして、未変性ＨＩＳ ３ 遺伝子を除去してバックグラウンド活性を除き、また、ＧＣＮ４遺伝子を除去 してヒスチジン経路内の他の遺伝子の発現を一定のレベルで固定させた。これは 、３ＡＴに応答して揺動するＧＣＮ４レベルに対して大部分または全ての遺伝子 が感受性を示すからである(図２参照)。３ＡＴの最小阻害濃度(ＭＩＣ)において は、ＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３融合物の発現はアミノ酸制限に対する緊縮応答に起 因して低下し、培養物は増殖しない。 図６aおよび図６bに示す場合において、翻訳延長のインヒビター、例えば、シ クロヘキシミドをＭＩＣの３ＡＴで処理した培養物中に添加すると、ＲＰＬ１６ Ａプロモーターを抑制する飢餓シグナルは減衰し、細胞はより多くのＲＰＬ１６ Ａ−ＨＩＳ３ を合成して増殖する。このアッセイにはその他のプロモーター、例 えば、特に限定的ではないが、ＲＰＬ１６Ａ遺伝子に対する修飾プロモーターお よびアミノ酸制限に応答する遺伝子（ＲＰＬ１６Ａ）に対する未変性もしくは組 換えプロモーター等も使用できる。 「ＭＩＣ」は最小阻害濃度を意味する。 Ｂ．ＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３およびＣＹＣ１−ＨＩＳ３の融合遺伝子 完全なＨＩＳ３ＯＲＦを有するＤＮＡフラグメントを、プラスミドＹＩp１中 の比較的大きなＨＩＳ３フラグメントからのＰＣＲ法により、次の配列を有する ２つのオリゴヌクレオチドを用いて増大させた:５'−ＣＧ−ＡＡＧ−gga−tcc− ＡＴＧ−ＡＣＡ−ＧＡＧ−ＣＡＧ−ＡＡＡ−ＧＣＣ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．３)お よび５'−ＡＣＣ−ＡＣＴ−gtc−gac−ＣＴＡ−ＴＣＡ−ＣＣＡ−ＣＡＡ−ＣＴ Ａ−ＡＣＴ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．４)(この場合、下流の配列は導入されたＢam ＨＩ制限部位およびＳalＩ制限部位をそれぞれ示す)。ＢamＨＩ制限部位をＡＴ Ｇ開始コドンの隣接する５'であり、ＳalＩ制限部位はＨＩＳ３ＯＲＦの終止コ ドンの１５４bp３'である。このフラグメントをＢamＨＩおよびＳalＩを用いて 切断し、pＲＳ３０６のＢamＨＩおよびＳalＩ制限部位とクローン化させた[シコ ルスキーおよびヒーター、「サッカロミセス・セレビシエにおけるＤＮＡの効率 的な操作のために設計された酵母宿主株とシャトルベクターの系」、Ｇenetics、 第１２２巻、第１９頁〜第２７頁(１９８９年)参照]。プロモーター、転写開始 部位および前記のＲＰＬ１６Ａ−lacＺ融合物からのＲＰＬ１６ＡのＯＲＦの最 初の４９コドンを有する１.１kbのＢamＨＩフラグメントをＢamＨＩ部位に固有 の配向でクローン化させることによってＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３融合遺伝子を形 成させた。ＨＩＳ３フラグメントの２つの末端のＤＮＡ配列は当業者に周知の方 法によって確認した。次いで、このプラスミドに含まれるＵＲＡ３遺伝子を制限 酵素ＮcoＩおよびＡatIIによる該プラスミドの消化によって無能化させた後、大 腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントとdＮＴＰと共にインキュ ベートし、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートした。 得られたプラスミドは、相同組換えによるＵＲＡ３座への組込みのために使用 できるＵＲＡ３遺伝子のフラグメントを有する。ＣＹＣ１−ＨＩＳ３融合物は、 ＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３を含有するプラスミドのＢamＨＩ−ＳtuＩフラグメント をpＣＭ６１からの類似フラグメントで代替させることによって調節した[メーレ およびヒンネブッシュ、「サッカロミセス・セレビシエにおけるリボソームタン パク質遺伝子転写の緊縮調節とＲＡＰ１結合部位との関連性」、Ｍol．Ｃell．Ｂ iol．、第１１巻、第２７２３頁〜第２７３５頁(１９９１年)参照]。 Ｃ．試験菌株 このアッセイにより、アミノ酸制限下でのＲＰＬ１６Ａ発現の抑制を遮断する 化合物を選抜することによって翻訳インヒビターを見出すことが可能である。こ の選抜は、酵母菌株が翻訳インヒビターが存在する場合以外は増殖しないように 設計される。好ましい態様においては、この選抜には、遺伝子型のhis３−６０ ９ ＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３ gcm２ ＲＰＬ１６Ａ−lacＺを有する菌株が必要 である。ＨＩＳ３遺伝子を欠失することによって、ＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３を選 択可能なレポーター遺伝子の使用を容易にする。his３−６０９対立遺伝子はほ ぼ完全なＯＲＦ(６０９bp)を欠いているので好ましく、また、この欠失はＯＲＦ を越えておこなわれない。類似の対立遺伝子は、隣接するＰＥＴ５６遺伝子とＤ ＥＤ１ 遺伝子にとって重要な調節領域内に欠失が及ばない限り利用することがで きる。his３−６０９対立遺伝子は、エピソームのＵＲＡ３を含有するプラスミ ドＹＥp２４と共にその補体にアニールさせた次の８４個の残基を有する合成オ リゴヌクレオチドを用いてＨＩＳ３ ura３酵母菌株を形質転換させることによ って形成させた:５'−Ｇ−ＣＡＧ−ＧＣＡ−ＡＧＡ−ＴＡＡ−ＡＣＧ−ＡＡＧ− ＧＣＡ−ＡＡＧ−atg−ＡＣＡ−ＧＡＧ−ＣＡＧ−ＡＡＡ−Ｇ ＣＣ−Ｃ／ＡＴ −ＧＴＴ−ＣＣＣ−ＴＣＣ−ＡＣＣ−ＡＡＡ−ＧＧＴ−ＧＴＴ−ＣＴＴ−ＡＴＧ −tag−ＴＧＡ−ＣＡＣ−ＣＧ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：５)(この場合、開始コド ンと終止コドンは下流にあり、欠失の位置はスラッシュで示す)。 次いで、Ｕra 形質転換細胞をＨis変異体用に選抜した。染色体欠失は当業者 に周知のＤＮＡブロッティング／ハイブリッド形成によって確認した。完全な一 般調節経路を有する菌株は３ＡＴによってもたらされるアミノ酸制限下でのヒス チジン生合成のいくつかの過程を脱抑制するので、ＧＣＮ２遺伝子を欠失させてＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３ を選択可能なレポーター遺伝子の使用を容易にする。該 経路を経るこの可変性代謝フラックスは、ＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３−コード化過 程の増殖に対する影響を低下させる。異なるgcn変異体、例えばgcn４をこの選抜 に用いてもよいが、gcn２の方が２つの利点を有する。第一に、ＧＣＮ２タンパ ク質は一般調節経路のトップまたはその近くにおいて作用するので、ＧＣＮ４発 現を活性化する化合物は、先に概説したように、３ＡＴ培地上での増殖を誘発す るので、これによって該化合物は同定される。第二に、gcn２変異体のＧＣＮ４ 発現は構成的に低レベルであるが、gcn４変異体はＧＣＮ４発現を示さない。こ の態様においては、構成的に低レベルのＧＣＮ４発現によってＲＰＬ１６Ａ−Ｈ ＩＳ３−コード化過程はヒスチジン合成の律速段階となり、選抜感度はさらに高 くなる。 Ｄ．増殖アッセイ 多数の化合物がライブラリーから潜在的治療剤を同定するために、適当な菌株 (ＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３ his３ gcn４;ＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３を欠く同質遺 伝子のＣＹＣ１−ＨＩＳ３ gcn２菌株をコントロールとして平行して使用する) を、該菌株の培養物約２mlを以下に説明する適当な酵母を保有するペトリ皿(直 径:１００mm)に移して２分間かきまぜてから過剰液を除去することによって軽く 接種する。このペトリ皿を平坦な表面上で１〜数時間乾燥させた後、高用量の被 験化合物を含浸させたフィルターディスクを培地の表面上に載置する。被験化合 物の濃厚原液１０μlを、該原液を前もって塗布する場合以外は、該ディスクを 細胞培養物上に載置した直後に各々の該ディスク上に添加する。当業者には明ら かなように、被験化合物のこのような使用態様によって濃度勾配が形成され、最 大濃度域は該ディスクに近接する。従って、このアッセイ法によれば、一回の試 験によって被験化合物を一定の濃度範囲においてアッセイすることができる。次 いで、ペトリ皿を３０℃で１〜４日間(一般的には２日間)インキュベートしなが ら、菌叢の増殖をモニターする。被験化合物の不存在下では、菌叢はほんのわず か増殖するか、あるいは全く増殖しない。 翻訳のインヒビター、例えばアニソマイシン、シクロヘキシミド、Ｇ４１８、 ヒグロマイシンＢまたはＴ−２毒素を存在させる図６aおよび図６bの場合におい ては翻訳が完全に阻害されるので、ディスクを包囲するリング状の非増殖域が形 成される。リング状の非増殖域を包囲する部分は増殖が促進された領域であり、 該領域は翻訳の阻害が不完全な平衡領域である。即ち、この領域では、ＲＰＬ１ ６Ａ 発現の抑制を遮断してヒスチジン合成を増大させるのに十分な程度まで翻訳 が低下するが、細胞の増殖と分割を続行させるのに十分な翻訳が依然としておこ なわれる。他の翻訳インヒビター、例えばゲンタミシン、グーゲロチンまたはピ ューロマイシン等の存在下においても類似の結果が得られた(但し、増殖阻害領 域はみられなかった)。 酵母菌を死滅させるが翻訳を標的としない化合物の場合(例えば、カナバニン 、 ０.５Ｍ ＥＤＴＡおよび１０％ＳＤＳ)、ディスクはリング状の非増殖域によっ て包囲されるが、第２の同心リング状の増殖促進域によっては包囲されない。偽 陽性を除くためには、この方法によって同定される重要な化合物を、ＣＹＣ１− ＨＩＳ３ 融合物を発生させるがＲＰＬ１６Ａ−ＨＩＳ３融合物を欠く別の同質遺 伝子菌株(この種の菌株は当業者に周知の標準的な方法によって構築される)を用 いる類似のアッセイによって再び選抜する。後者の菌株においては、翻訳インヒ ビターは第１の領域においては増殖を制限するが、第２の領域においては増殖を 促進しない。 Ｅ．アッセイ用培地 以下の混合物を別々のフラスコ内で調製した: フラスコ１ 成 分 配合量 ジフコ酵母菌用窒素源(アミノ酸と硫酸 アンモニウムを含まない) １.７g 硫酸アンモニウム ５.０g バクト寒天 ２０.０g 蒸留水または脱イオン水 ４２０ml フラスコ２ 成 分 配合量 各アミノ酸(ヒスチジンとトリプトファンを含まない) ０.１g ロイシン ０.３g ウラシル ０.１g イノシトール ０.１g アデニン ０.０５g p−アミノ安息香酸 ０.０１g １Ｍ ３ＡＴ原液(水溶液を滅菌濾過処理に付し た後、−２０℃で貯蔵した溶液) １.０ml 蒸留水または脱イオン水 ５００ml フラスコ１およびフラスコ２の内容物をオートクレーブ内で別々に処理した後 、混合し、得られた混合物に４０％デキストロース原液５０mlおよび４０mＭト リプトファン原液(滅菌濾過処理に付した後、４℃の暗所で貯蔵した溶液)１０ml を添加する。得られた培地を５５℃まで冷却した後、無菌皿に注ぐ。 Ｆ．酵素アッセイ 化合物のライブラリーから潜在的な治療剤を同定するために、適当な菌株(例 えば、この態様において用いるＲＰＬ１６Ａ−lacＺレポーター遺伝子を有するg cn２ 菌株)のスターター培養物を、栄養素要求性[シャーマン(Ｆ．Ｓherman)、フ ィンク(Ｇ．Ｒ．Ｆink)およびヒックス(Ｊ．Ｂ．Ｈicks)、「酵母菌遺伝子におけ る方法のための実験コースマニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラ ボラトリー(ニューヨーク)１９８６年発行]を満たすように補充した合成最少培 地(デキストロース２％、硫酸アンモニウム０.５％、ジフコ酵母菌用窒素源(ア ミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない)１.７g／リットル)中で一夜増殖させ た後、同一培地を用いて１:５０の割合で希釈する。細胞を再び２〜４時間増殖 させた後、被験化合物を、増殖を制限するが完全には停止させないような濃度で 添加する。好ましくは、細胞倍加時間が被験化合物によって３倍増大するように 添加量を調整する(この時間は全細胞タンパク質の蓄積をアッセイすることによ って測定するのが好ましく、液状培養物の光散乱特性の観察によって測定するの は好ましくはない)。被験化合物による細胞倍加時間の増大が２倍よりも小さい 場合には、濃度が十分に高くないので偽陰性であり、より高濃度でのアッセイが さらに必要である。被験化合物による細胞倍加時間の増大が５倍よりも大きい場 合には、翻訳調節の変化を観察するには過度に高い効率で全翻訳が停止されるの で偽陰性であり、より低濃度でのアッセイがさらに必要である。 増殖をさらに５〜６時間続行した後、培養物を収集し、レポーター遺伝子の活 性を当業者に周知の方法によってアッセイする[メーレおよびヒンネブッシュ、「 サッカロミセス・セレビシエにおけるリボソームタンパク質遺伝子転写の緊縮調 節 とＲＡＰ１結合部位との関連性」、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、第１１巻、第２７２ ３頁〜第２７３５頁(１９９１年)および該報文に引用されている文献参照]。レ ポーター遺伝子の活性は、被験化合物で処理しないで平行しておこなう培養物の 場合と比較する。 翻訳を阻害する化合物はＲＰＬ１６Ａ−lacＺ発現を促進して著しく高い活性 を示す。この方法によって同定される重要な化合物が翻訳に対して特異的に作用 することを立証するためには、該化合物を、ＣＹＣ１−lacＺ融合物を発生する 別の同質遺伝子菌株を用いる類似のアッセイ法によって二次的選抜する。この融 合物は緊縮調節機構に応答できないので[メーレおよびヒンネブッシュ、「サッ カロミセス・セレビシエ」におけるリボソームタンパク質遺伝子転写の緊縮調節 とＲＡＰ１結合部位との関連性」、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、第１１巻、第２７２ ３頁〜第２７３５頁(１９９１年)参照]、翻訳インヒビターに応答しない。 ５．翻訳成分特異的アッセイ 翻訳のいくつかの過程が、特定の変異酵母菌細胞の表現型に基づいて相違する 成分の化学量論によって影響されることが知られている。例えば、(１)ＥＦ−３ をコードするＹＥＦ３の遺伝子量が増加すると、翻訳精度を妨げる薬剤に対する 感受性が高くなり［サイドベーケン(Ｍ．Ｇ．Ｓandbaken)、ルピセラ（Ｊ．Ａ． Ｌupisella)、ジドメニコ(Ｂ．ＤiＤomenico)およびカクラバーティー(Ｋ．Ｃha kraburtty)、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem,、第２６５巻、第１５８３８頁〜第１５８４４ 頁(１９９０年)参照]、(２)eＩＦ−２βおよびeＩＦ−２γをそれぞれコードす るＳＵＩ３およびＧＣＤ１１の遺伝子量が増加するとＧＣＮ４の翻訳が増大する が(これは翻訳の開始効率の低下を意味する)、eＩＦ−２αをコードするＳＵＩ ２ の遺伝子量が増加しても測定し得る効果はもたらされず、また、(３)eＩＦ− ２Ｂの非必須サブユニットであるＧＣＮ３−コード化タンパク質の不完全または 完全な減少によって、リン酸化eＩＦ−２αによる阻害に対するeＩＦ−２Ｂの感 受性は低下する[ヒンネブッシュおよびリープマン、「タンパク質合成と翻訳調節」 、サッカロミセス属酵母菌の分子生物学、ブローク、プリングルおよびジョー ンズ編、 ＣＳＨラボラトリープレス(ニューヨーク)１９９１年発行]。 このような観測結果およびその他の関連する実験結果は、翻訳成分もしくはサ ブユニットの高発現または低発現によって、翻訳の関連過程のインヒビターに対 する感受性を変化させることが可能であることを提案している。第一の場合、治 療剤は翻訳の１または複数の所定の過程のインヒビターになり得る。このような インヒビターは、該過程を触媒する高分子の欠乏によって制限される細胞もしく は細胞抽出物に対してより強く作用し、および／または野性型の細胞もしくは細 胞抽出物に比べて該高分子を過剰に含有する細胞もしくは細胞抽出物に対しては 弱く作用する。第二の場合、治療剤は、翻訳経路における１または複数の過程を 通常は触媒する高分子によって良性から毒性に形質転換されるプロドラッグ(pro −drug)となり得る。このような化合物は、該過程を触媒する高分子の欠乏によ って制限される細胞もしくは細胞抽出物に対しては弱く作用し、および／または 野性型の細胞もしくは細胞抽出物に比べて該高分子を過剰に含有する細胞もしく は細胞抽出物に対しては強く作用する。第三の場合、治療剤は、通常は翻訳過程 に含まれる高分子を刺激し、該治療剤の不存在下での触媒化よりも過度に触媒化 されたときの有害反応を触媒する。このような化合物は、該過程を触媒する高分 子の欠乏によって制限される細胞もしくは細胞抽出物に対しては弱く作用し、お よび／または野性型の細胞もしくは細胞抽出物に比べて該高分子を過剰に含有す る細胞もしくは細胞抽出物に対してはより強く作用する。 従って、本発明の一つの特徴は、１または複数の翻訳成分の摂動(perturbatio n)に対して感受性のある真菌細胞系を利用する抗真菌剤の選抜法にある。 好ましい態様においては(図８参照)、この方法には、同質遺伝子のバックグラ ウンドから誘導される酵母菌の変異菌株のバッテリー(battery)を準備する過程 が含まれる。各々の菌株は、翻訳成分をコードする遺伝子の変異の点で他の菌株 および野性型菌株と相違する。これらの成分または翻訳に特に必要な高分子のた めの遺伝子はいくつかの方法によって得ることができる。このような方法として は、特に限定的ではないが、遺伝プラスミドライブラリーを用いる関連変異の相 補によるクローン化法、該高分子を認識する抗体を用いる発現ライブラリーの選 抜法、酵母菌またはその他の生物体中の高分子をコードすることが知られている 標識化ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列を用いるハイブリッド形成による遺伝プラスミ ドまたはファージライブラリーの選抜法が例示される[ガスリーら編、「酵母菌の 遺伝学と分子生物学」、Ｍethod in Ｅnzymology、第１９４巻(１９９１年)参 照]。 この薬剤探索法は、翻訳機構のいずれかの成分と作因との結合を測定する簡単 なアッセイを含んでいてもよい。しかしながら、被験化合物に対する増殖感受性 によって菌株のバッテリーを選抜するのが好ましい。特定の翻訳成分の量を変化 させるかまたはその活性を変化させる点で野性型菌株と相違する変異菌株は、該 成分を標的にする薬剤に対して異なる感受性を示す。これに対して、同じ変異体 または野性型コントロールは、この標的と相互作用しない被験化合物によって攻 撃されたときに野性型の感受性を示す。この同じ組の菌株を用いることにより、 生体外翻訳用の一組の細胞抽出物が調製される。この場合、各々の抽出物は、翻 訳に関与する単一のタンパク質もしくはＲＮＡの量または活性の点でのみ相違す る。一般に、特定の過程を標的にする翻訳インヒビターの効能はその標的の有効 濃度に反比例する。しかしながら、翻訳に基づく治療法が逆の効果をもたらす場 合もあり、その効能は、その分子標的が該成分の治療的効果の発生に関与する限 り、その標的の有効濃度に比例する。 このアッセイの好ましい態様ではないが、保存菌株の必ずしも全てが全一遺伝 子のバックグラウンドからのものでなくてもよい。この方法を用いることにより 、タンパク質合成に必要ないずれかの高分子を標的にするように調整できる簡易 化細胞抽出物アッセイおよび全細胞アッセイの開発が可能となる。このアッセイ は、潜在的な翻訳成分−特異的薬剤の発見に利用できるだけでなく、正確な分子 標的が予め知られていない翻訳インヒビターの特異的標的の同定にも利用できる 。 「選抜」は、多数の潜在的に有用な作因を処理する過程を意味するのが好ましい 。これは、単一の作因を詳細に調べてその作用様式を決定する単一の実験とは異 な る過程である。この場合、「多数」とは、２０以上、好ましくは１００以上の潜在 的に有用な作因を意味する。 「抗真菌剤」は、特に限定的ではないがヒトに対して病原性の真菌を含む真菌と して一般的には言及される生物体を死滅させるか、またはその増殖速度を著しく 低下させる効果を有する化合物を意味する。 「酵母菌」は、好ましくはサッカロミセス・セレビシエを意味するが、その他の 酵母菌または真菌生物体であってもよい。 「野性型酵母菌」は、ある程度は任意的であるが、所定の実験に対する標準また はコントロールとして定義される酵母菌株を意味する。野性型菌株は、当該実験 に無関係の遺伝子中に１または複数の変異を有していてもよい。例えば、ロイシ ンに要求されるleul変異を有する菌株は翻訳を調べる目的にとっては野性型であ るが、ロイシンの生合成を調べる目的にとっては野性型とみなすことはできない 。 「変異酵母菌」は、１または複数の既知または未知の遺伝子または遺伝子座に関 して定義される野性型のものと相違する酵母菌株を意味する。遺伝子の相違は、 特に限定的ではないが、次のいくつかの異なったタイプのものであってもよい： 単一塩基対が３つの他の可能な塩基対に変化する点変異、１または複数の塩基対 の挿入、遺伝子座の全長にわたる１または複数の塩基対の欠失、１つの遺伝子と 別の遺伝子との融合、存在する遺伝子の付加的コピーの導入、従前には存在しな い新しい遺伝子の１または複数のコピーの導入、またはこれらの任意の組合せ。 「同一遺伝子のバックグラウンド」は、遺伝学的均一性(genetically uniform) を意味する[キング(Ｒ．Ｃ．Ｋing)、「遺伝学辞典」、第２版(改訂版)、オックス フォード・ユニバーシティ・プレス(ニューヨーク)１９７６年発行]。換言すれ ば、同一遺伝子のバックグラウンドは、特に言及しない限り、一組の菌株または 生物体の間に既知の遺伝学的相違がないことを意味する。この定義においては、 このようなバックグラウンドはＤＮＡの形質転換をおこなういくつかの実験法に よってのみ達成でき、このような方法のいくつかは当業者には周知である。遺伝 子の相違は、特に限定的ではないが、次のいずれかのタイプのものであってもよ い:単一塩基対が３つの他の可能な塩基対に変化する点変異、１または複数の塩 基対の挿入、遺伝子座の全長にわたる１または複数の塩基対の欠失、１つの遺伝 子の別の遺伝子との融合、存在する遺伝子の付加的コピーの導入、従前には存在 しない新しい遺伝子の１または複数のコピーの導入、またはこれらの任意の組合 せ。 「翻訳成分」は、翻訳の過程は含まれていることが知られているか、またはその ように考えられている遺伝子生産物(タンパク質または核酸)であり、特に限定的 ではないが、次のものが例示される:アミノアシル−tＲＮＡ合成酵素、翻訳開始 因子、例えば、特に限定的ではないが、メルリック(Ｗ．Ｃ．Ｍerrick)の報文に 記載されている因子[「真核タンパク質合成の機構と調節」、Ｍicrobiological Ｂ eviews、第５６巻、第２９１頁〜第３１５頁(１９９２年)参照]またはハーシェ イ(Ｊ．Ｈershey)の報文に記載されている因子[Ａnn．Ｒev．of Ｂioshem．、 第６０巻、第７１７頁〜第７５５頁(１９９１年)参照]、翻訳延長因子、例えば 、特に限定的ではないが、上記報文に記載の因子、翻訳終了因子(翻訳終結因子) 、例えば、特に限定的ではないが、上記報文に記載の因子、全能サプレッサーと して作用し得るタンパク質、例えば、特に限定的ではないが、遺伝子ＳＵＰ３５ とＳＵＰ４５およびこれらのシノニムによってコードされるタンパク質[ヒンネ ブッシュおよびリープマン、「タンパク質合成と翻訳調節」、サッカロミセス属酵 母菌の分子生物学(ブローク、プリングルおよびジョーンズ編)、第６２６頁〜第 ７３６頁、ＣＳＨラボラトリープレス(ニューヨーク)１９９１年発行]、翻訳の 忠実度に影響を及ぼす以外はその正確な機能が知られていない遺伝子(ＳＵＰ、 ＳＵＦまたはＳＡＬ)から生産されるタンパク質、例えば、特に限定的ではない が上記文献に記載のタンパク質、生体内での効率的な翻訳に必要であってタンパ ク質−タンパク質相互作用に影響を及ぼす以外は正確な機能が知られていないタ ンパク質、例えば、特に限定的ではないが、酵母菌ＳＩＳＩタンパク質[ゾング( Ｔ．Ｚhong)およびアルント(Ｋ．Ｔ．Ａrndt)、Ｃell、第７３巻、第１１７５頁 〜第１１８６頁(１９９３年)参照]および７０kd熱ショックタンパク質[ネルソン (Ｒ. Ｊ．Ｎelson)、チーゲルホッファー(Ｔ．Ｚiegelhoffer)、ニコレット（Ｃ．Ｎi colet)、フェルナー−バッシュブルネ(Ｍ．Ｗerner−Ｗashburne)およびクレイ ク(Ｅ．Ａ．Ｃraig)、Ｃell、第７１巻、第９７頁〜第１０５頁(１９９２年)参 照]、物理的にはリボソームと結合しているが塩洗浄(salt wash)によって除去 される十分には定義されていないタンパク質、大小のリボソームサブユニット、 即ち、リボソームＲＮＡ、tＲＮＡ、シグナル認識粒子(ＳＲＰ)を含む完全リボ ソームタンパク質、特異的mＲＮＡの翻訳に必要ないずれかのタンパク質または ＲＮＡ、例えば、特に限定的ではないが、ＣＯＸＩＩＩ翻訳に必要なＰＥＴ４９ ４、ＰＥＴ１２２およびＰＥＴ５４[ポン(Ｌ．Ｐon)およびシャッツ(Ｇ．Ｓchat z)、「ミトコンドリア属酵母菌の生物発生」、サッカロミセス属酵母菌の分子生物 学、第３３３頁〜第４０６頁、ブローク、プリングルおよびジョーンズ編、ＣＳ Ｈラボラトリープレス(ニューヨーク)１９９１年発行;リンダールおよびヒンネ ブッシュ、「原核生物と下等真核生物における翻訳の調節機構の多様性」、Ｃurr ．Ｏpin.in Ｇen．and Ｄev．、第２巻、第７２０頁〜第７２６頁(１９９２年 )]、特異的mＲＮＡの翻訳抑制に必要ないずれかのタンパク質またはＲＮＡ、例 えば、特に限定的ではないが、ＳＫＩ２タンパク質[ウィドナー(Ｗ．Ｒ．Ｗidne r)およびウィックナー(Ｒ．Ｂ．Ｗickner)、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、第１３巻、 第４３３１頁〜第４３４１頁(１９９３年)参照]、上記のいずれかのものをその 活性が測定できるように修飾するいずれかのタンパク質またはＲＮＡ、例えば、 特に限定的ではないが、リボヌクレアーゼ、タンパク質キナーゼおよびホスファ ターゼ、ＲＮＡ塩基を修飾する酵素、ポリヌクレオチドから塩基を除去する酵素 、ＡＤＰリボシル化酵素、ヒプシンを発生する酵素、ジフタミドを発生する酵素 、セレノシステインまたはセレノシステイン含有ポリペプチドを発生する酵素、 タンパク質またはリボ核酸をメチル化または脱メチル化する酵素、mＲＮＡの半 減期を増加または減少させる化合物[ヒギンス(Ｃ．Ｆ．Ｈiggins)、ペルツ(Ｓ． Ｗ．Ｐeltz)およびヤコブソン(Ａ．Ｊacobson)、Ｃurr．Ｏpin．in Ｇen．and Ｄev．、第２巻、第７３９頁〜第７４７頁(１９９２年)参照]、例えば、特に 限定的では ないが、サッカロミセス・セレビシエ中のmＲＮＡの代謝回転を促進するＵＰＦ １タンパク質[リーズ(Ｐ．Ｌeeds)、ウッド(Ｊ．Ｍ．Ｗood)、レー(Ｂ．Ｓ．Ｌe e)およびカルバートソン(Ｍ．Ｒ．Ｃulbertson)、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、第１ ２巻、第２１６５頁〜第２１７７頁(１９９２年)参照]およびミトコンドリア属 酵素菌の３'末端の１２量体配列に結合する「１２量体配列−結合性タンパク質[ ミン(Ｊ．Ｍin)およびザッセンハウス(Ｈ．Ｐ．Ｚassenhaus)、Ｍol．Ｃell．Ｂ iol．、第１３巻、第４１６７頁〜第４１７３頁(１９９３年)参照]、およびタン パク質またはリボ核酸をアセチル化または脱アセチル化する酵素。 「翻訳成分」はまた、生体外反応系に添加したときに翻訳または翻訳のいずれか の部分反応を好ましくは１０倍以上(２〜１０倍程度ではあまり好ましくはない) 促進するいずれかの遺伝子生産物(タンパク質または核酸)を意味する。 「翻訳成分」はまた、生体内での翻訳に好ましくは１０倍以上(２〜１０倍程度 ではあまり好ましくない)の変化をもたらすいずれかの遺伝子生産物(タンパク質 または核酸)を意味する。この変化は、翻訳的に調節されたレポータータンパク 質の合成に対する効果またはいずれかの既知の翻訳成分の量または状態に対する 効果を決定することによって測定できる。 「増進感受性の変化」は、同一遺伝子のバックグラウンド(類似遺伝子のバック グラウンドはあまり好ましくない)からの野性型細胞培養物に比べて、変異細胞 培養物の増殖速度の増加または減少を意味する。この変化は、当業者には既知の 方法、例えば、予め決められた時間(一般的には、１２時間〜３日間)経過後、細 胞数、生存細胞数、コロニー形成性ユニット、全細胞マス、全細胞タンパク質ま たは濁度を決定することによりタンパク質または細胞の収量を測定することによ って調べることができる。変異体の増殖感受性の変化により、変異菌株の増殖速 度または収量が野性型菌株の場合に比べて好ましくは１０倍以上(２〜１０倍程 度ではあまり好ましくない)変化する。 「塩洗浄」は当業者に既知の処理方法を意味する。この処理方法においては、リ ボソームの含有量が非常に多い細胞下(subcellular)フラクションを適度な高濃 度の塩(一般的には５００mＭ ＫＣl)を用いて処理し、リボソームに結合した高 分子を除去する(リボソームの全構成成分は塩洗浄によって除去されない)。次い で、リボソームに結合していた成分は分画遠心分離によってリボソームの全構成 成分から分離する。 「活性の変化」は、ＲＭＡ鋳型の解読(翻訳)によるタンパク質の合成に必要な生 化学段階として定義されるいずれかの翻訳段階における速度または特異性の増減 を意味する。この場合、翻訳活性の変化は、前述のように、ヒトまたは機械的手 段によるモニターによって区別できるような細胞培養物の増殖特性を変化させる か、または、野性型細胞抽出物に比べて変異体細胞から得られる不完全もしくは 完全な生体外翻訳抽出物の生化学的特性を変化させるのに十分に大きなものであ る。このような変化の測定はいくつかの好ましい態様において詳細に説明する。 Ａ．翻訳に含まれる分子 先に説明した「成分−特異的アッセイ」には、単一の翻訳成分またはそのサブユ ニットに対して各々を変化させるように構築した一組の菌株が必要である。試験 に供してもよい成分としては、特に限定的ではないが、翻訳成分またはそのサブ ユニットとして知られているか、またはそのように考えられているいずれかの遺 伝子生産物(タンパク質または核酸)、例えば前節で例示したもの、あるいは同定 されていないその他のいずれかの遺伝子生産物等が挙げられる。タンパク質また はポリヌクレオチドは、その存在によって翻訳または翻訳のいずれかの部分的反 応が２倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上促進されるなら ば、翻訳成分とみなすことができる。さらに、タンパク質またはポリヌクレオチ ドは。翻訳または翻訳のいずれかの部分的反応を２倍以上、好ましくは５倍以上 、より好ましくは１０倍以上促進させる生産物をもたらすならば、翻訳成分とみ なすことができる。この後者の基準から特に免除されるものは、ＡＴＰ、ＧＴＰ 、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨおよびこれらの代謝物であり、これらはいずれも翻訳に 影響を及ぼすだけでなく、１５以上の他の代謝経路にも影響を及ぼす。 翻訳に含まれる成分の分析に使用できる方法としては、特に限定的ではないが 、 次の方法が挙げられる:酵素活性の機能的アッセイ、生体外転写−翻訳反応と組 合せた生体外翻訳、リン酸化状態の決定を可能にする[ガンマー³²Ｐ]ＡＴＰとの インキュベーション、免疫沈澱、一次元または二次元ゲル電気泳動ウェスタンブ ロット法、分画遠心分離、クロマトグラフィー精製、ＵＶ−架橋、ゲル遅延アッ セイ、ＤＮＡ結合アッセイおよびＲＮＡ結合アッセイ等。 翻訳に含まれる成分は特性決定および本発明による方法での使用のために精製 してもよい。使用できる分画法としては、特に限定的ではないが、次の方法が例 示される:遠心分離、硫酸アンモニウム沈澱、他の分画沈澱、ゲル濾過、イオン 交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグ ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、分画抽出、等電点電気泳動、電 気泳動および等速泳動等。 翻訳はmＲＮＡ鋳型の効用によって左右されるので、分析の範囲をmＲＮＡの合 成、プロセシング、輸送および分解まで広げることが重要である。mＲＮＡの合 成(転写)は、タンパク質合成の場合のように、標識化前駆体をmＲＮＡに組み込 み、mＲＮＡ合成の総括速度を決定して寒天またはポリアクリルアミドゲル上で のゲル電気泳動によって調べることのできる標識化物を発生させることにより調 べることができる。mＲＮＡのプロセシングと輸送も、標識化前駆体を用いて細 胞の核と細胞質の抽出物中の種々の標識化ＲＮＡ種の大きさと量を分析すること によって調べることができる。あるいは、このようなＲＮＡ種の大きさと量はノ ーザンブロットハイブリッド形成法によって調べることができる。この場合、電 気泳動によって分離されてハイブリット形成膜へ輸送されたＲＮＡは、問題とな るＲＮＡに対して特異的な標識化核酸プローブによって検出される。 mＲＮＡの分解は、放射能標識化mＲＮＡまたはノーザンブロットハイブリッド 形成によってmＲＮＡの寿命を追跡することによって調べることができる。mＲＮ Ａの合成、プロセシングおよび分解のいずれの段階の場合も、含まれる酵素や他 のタンパク質、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、スプライシング酵素、スプライス 部位結合タンパク質およびmＲＮＡの分解の原因となるリボヌクレアーゼ等の活 性や濃度を測定するのが有用である。転写活性の変化は、生体外転写反応用細胞 抽出物を用いることによって検知して分析してもよい。 Ｂ．低発現性変異体 クローン化遺伝子の発現度は、遺伝子の非コード化配列を変化させ、次いで、 当業者には既知の方法による生体内での形質転換と相同組換えによって変化構築 物で未変性遺伝子を代替させることによって操作される[サムブルック、フリッ チュおよびマニアチス編、「分子クローン化の実験マニュアル(第２版)」、コール ド・スプリング、ハーバー・ラボラトリー・プレス(ニューヨーク)１９８９年発 行;ガスリーおよびフィンク編、「酵母菌の遺伝学と分子生物学への入門」、酵素 学における方法、第１９４巻(１９９１年)]。この変化は、存在する制限酵素部 位およびリガーゼ、ポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼを利用して形成させ た転写ユニットの上流領域での欠失の形でおこなうことができる。あるいは、転 写活性用の既知の共通配列、例えば、ＲＡＰ１結合部位またはポリピリミジン領 域がプロモーター領域内に認識されるときには、該共通配列を部位特異的変異誘 発法によって変化させることができる。 例えば、ＥＦ−３をコードするＹＥＦ３遺伝子の上流領域はＣＣＡＣcＣＡＴ ＧＣＡ ＴＡＡ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．:６)配列を含んでおり、該配列は転写活性 化因子タンパク質ＲＡＰ１を結合させるための共通配列であり、低有効性の共通 配列に変化させることができ[ニューヴィント(Ｎieuwint)ら、１９８９年;ヴィ ネイス(Ｖignais)ら、１９９０年]、これによって細胞増殖に不可欠の翻訳因子 ＥＦ−３の正味の合成量が低減する。 特に、ＹＥＦ３遺伝子を発生するプラスミドは、上記の下線部の配列ＡＴＧＣ ＡＴを認識する制限酵素ＮsiＩを用いて線形化される。相同組換えを首尾よくお こなう野性型の酵母菌細胞または細菌細胞は該線形プラスミドおよび約４０bpの 二本鎖オリゴヌクレオチド(該オリゴヌクレオチドはＹＥＦ３とほぼ同一であり 、ＮsiＩ制限部位を開く)を用いて形質転換される。該線形プラスミドを用いる 形質転換とプラスミドからの指標に対する選択処理(例えば、アンピシリン耐性 またはウラシルプロトトロフィー)に付した後の細胞の生存度はプラスミドと二 本鎖オリゴヌクレオチドの組換えに依存する。何故ならば、該細胞は線形プラス ミドの保持能または結合能を有さないからである。被験プラスミドはＮsiＩを用 いる消化によって選抜した後、ＤＮＡ配列決定によって確認する。ＹＥＦ３との 非同一性は、ＮsiＩ部位を破壊する単一の塩基の変化およびＲＡＰ１仲介転写活 性の低下をもたらす変化、例えば上記配列中の小文字「c」の「Ａ」への変化にある( ニューヴィントら、１９８９年;ヴィグネイスら、１９９０年)。この特別な変化 は単なる例示であり、ＹＥＦ３発現度を増殖を維持するには過度に低い程度まで 低減させることも可能である。この場合、別の変化をもたらし、適当な生存可能 な変異体の発生を調べることができる。 ＮsiＩ部位の破壊により、所望の変異体の対立遺伝子のその後の選抜が促進さ れるが、これは、該部位を失ったほとんど全てのプラスミドが別の変異を含んで いるからである。該部位を保有するプラスミドは、形質転換に用いられた汚染性 未切断プラスミドから誘導されるものと考えられる。このような変化による効果 は、ＹＥＦ３のＯＲＦの約１０番目のコドンのＸbaＩ部位における枠内のレポー ター遺伝子、例えば、大腸菌遺伝子lacＺまたはuidＡ等をサブクローン化し、次 いでレポーター遺伝子の活性を野性型と変異体のプロモーター配列を用いて測定 することによってモニターすることができる。遺伝子発現の低下に用いる改変に は、特に限定的ではないが、次のものが例示される:メッセージ安定度または収 率を低下させる配列変更と欠失、開始コンテクストを不都合にする変更およびＯ ＲＦを不都合なコドンバイアスに変える変更。 ２段階遺伝子変換法により、構築された変異体対立遺伝子を用いて野性型対立 遺伝子を交換する[ヴィンストン、チャムリーおよびフィンク、Ｍethods Ｅnzy mol．、第１０１巻、第２１１頁〜第２２８頁(１９８３年)参照]。 第一に、適当な酵母菌宿主(leu２ ura３)を、ＵＲＡ３以外の選択可能な指標 を有する複製性プラスミド上において野性型ＹＥＦ３遺伝子を用いて形質転換さ せる。次いで、変異体yef３プロモーター(ＵＲＡ３遺伝子)の１.６kbＥcoＲＩ−Ｘba Ｉフラグメントを発生するプラスミドであって、酵母菌ＡＲＳまたは動原体 配列を有するプラスミドをＸhoＩ部位におけるyef３遺伝子内で線形化した後、 標準的方法によるウラシルプロトトロフィーに対する選択によって宿主に形質転 換させた。この手順は、エピソーム上の野性型ＹＥＦ３、端を切り取ったＯＲＦ と融合した野性型ＹＥＦ３プロモーターおよび野性型ＯＲＦに融合した変異体プ ロモーターを有する菌株を生産されるように設計される(後の２つのプロモータ ーは記載の順序で縦列に存在する)。これらの形質転換体を、非選択性培地上で の増殖後のＬＥＵ２指標の欠損に関する選抜処理に付すと次の４つの結果が可能 である:１)Ｌeu^-コロニーはＵra^-であり、このことは線状プラスミドが染色体で はなくてエピソームに組込まれたことを意味する。２)Ｌeu^-コロニーは得られず 、このことは変異体プロモーターからのＹＥＦ３の発現が増殖を維持するには低 過ぎることを示す。３)Ｌeu^-コロニーはＵraであり、増殖欠損はみられず、この ことは発現に対する変異の効果が無視し得る程度であることを示す。４)Ｌeu^-コ ロニーはＵra^-であり、ある程度の増殖欠損がみられ、これは望ましい結果であ る。 第二段階においては、Ｌeu Ｕra形質転換体を５−フルオロオロト酸(５−ＦＯ Ａ)を含有する合成培地上でのレプリカ培養処理に付す。５−ＦＯＡはＵＲＡ３ 遺伝子が欠損した組換え体を選択する。この選択は、サッカロミセス・セレビシ エ酵母菌におけるオロチジン−５'−ホスフェートデカルボキシラーゼ活性を欠 く変異体に対して正の選択である(５−ＦＯＡ耐性)[ベーケ、ラクルートおよび フィンク、Ｍｏl．Ｇen．Ｇenet．、第１９７巻、第３４５頁〜第３４６頁(１ ９８４年)参照]。Ｕra^-細胞は、プラスミド配列およびyef３の２つの染色体コピ ーの一方の除去を伴う相同組換えの結果物である。組換え体の一方の部分は野性 型ＹＥＦ３遺伝子であり、他方の部分は、野性型ＯＲＦに融合した変異プロモー ターを有する変性yef３遺伝子である。これらの２種の生産物はＰＣＲ選択とそ の後のＮsiＩ酵素を用いる消化によって区別できる。 あるいは、変異体対立遺伝子は、該遺伝子の未変性の野性型コピーを欠く菌株 のゲノム中の別の座に組込むことができる。この組込みは、例えば、次の方法に よっておこなうことができる。二倍体菌株中の野性型遺伝子の一つのコピーを欠 失または***させ、変異体コピーを別座(例えば、ＵＲＡ３)に組込み、二倍体を 胞子形成させ、次いで、野性型対立遺伝子を欠くが変異体対立遺伝子を有する単 相体を選抜処理に付す。当業者に既知の別の類似法を用いてもよい。 酵母菌中の翻訳成分をコードするいくつかの遺伝子を複製する。２つのコピー は異なって発現される場合が多く、一方の欠失は増殖に対して効果がなく、他方 の欠失は増殖の遅い表現型をもたらす。これらの成分に対しては、遺伝子コピー の一方を当業者に周知の方法を用いて欠失させることによって低発現変異体を発 生させる。 Ｃ．欠損異型変異体 翻訳成分をコードする遺伝子が変異した酵母菌変異体は科学文献に多数報告さ れており、適当な研究機関または中央寄託機関、例えば、アメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクションおよびバークリー・イースト・ジェネティックス・ス トック・センター等から入手可能である。一般に、変異体は、これらの比較を複 雑にしている多様な遺伝子バックグラウンド中にあるので、被験化合物の選択に 直接使用すべきである。好ましい態様においては、望ましい変異体をクローン化 した後、同一遺伝子バックグラウンド中に再導入する。変異体の対立遺伝子はＰ ＣＲ、ギャップのあるプラスミド修復体中のクローン化した野生型遺伝子を用い る方法、または当業者に既知の方法による指標救援(marker rescue)実験によっ て回収される[例えば、オルーヴィーバー(Ｔ.Ｌ.Ｏur−Ｗeaver)、スゾスターク (Ｊ.Ｗ.Ｓzostak)およびロースシュタイン(Ｒ.Ｊ.Ｒothstein)、Ｍethods Ｅnzy mol.、第１０１巻、第２２８頁〜第２４５頁(１９８３年)参照]。 Ｄ．多発現変異体 適当なプラスミドライブラリーからクローン化した遺伝子は、該プラスミドの コピー数が１よりも大きい場合には、そのまま使用できる。別源から得た遺伝子 は、酵母菌中に高コピー数で存在することが知られているプラスミドベクターに クローン化させることができる。クローン化の方法としては、標準的な実験法[「 分子クローン化の実験マニュアル(第２版)」、サムブルック、フリッチュおよび マニアチス編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(ニュ ーヨーク)１９８９年発行;「酵母菌の遺伝学と分子生物学への入門」、ガスリーお よびフィンク編、Ｍethods in Ｅnzymology、第１９４巻(１９９１年)]および原 ベクターと適当なベクター間の相同組換えの選択による方法[エリックソンおよ びジョンストン、Ｇenetics、第１３４巻、第１５１頁〜第１５７頁(１９９３年 )が例示される。このスキームの別の変形態様においては、翻訳成分の１よりも 多くのサブユニットをコードする遺伝子を同じ方法によってプラスミド中に組み 入れることができる。これらの高複製ベクターのうちの最も一般的なものは動原 体配列を伴わないＡＲＳ(自己複製配列)または酵母菌の２ミクロンのプラスミド の一部もしくは全部を含む。より高いコピー数は、遺伝子の多重コピーを染色体 ＤＮＡに組み込むことによって得られる。これらの高複製スキームの代替法また は該スキームと併用する方法は、問題となる遺伝子をその正味の発現が増大する ように変性させる方法である。このような変性法としては、コドンバイアスまた は翻訳開始のコンテクストの改良、転写を増大させるようなプロモーターの変性 および生体内での安定性を増大させるようなmＲＮＡ配列の変更等が例示される 。問題となる１または複数の遺伝子は別々に同一の酵母菌株に形質転換させ、こ れによって、同一遺伝子の別の構造を有する形質転換菌株のコレクションが形成 される。 実施例３:翻訳成分変異細胞を用いる選抜 化合物の多数のライブラリーから潜在的な治療剤を同定するために、変異体の コレクションを、被験化合物を含有するか、または含有しない液状酵母培地中に おいて平行して増殖させた。十分な化合物が得られたならば、一組の別培地中に おいて試験を繰り返しておこなう。別培地としては、炭素源としてデキストロー ス(ＹＥＰＤ)もしくはグリセロール(ＹＥＰＧ)を含有するリッチ培地または窒素 源として硫酸アンモニウムもしくはプロリンを含有する合成培地(ＳＤ)が例示さ れるが、これらの培地は酵母菌の代謝に顕著な効果をもたらすことが知られてい る[「酵母菌の遺伝学と分子生物学への入門」、ガスリーおよびフィンク編、Ｍeth ods in Ｅnzymology、第１９４巻(１９９１年);[サッカロミセス属酵母菌の分子 生物学」、ストラセルン、ジョーンズおよびブローク編、ＣＳＨラボラトリー・ プレス(ニューヨーク)１９８１年発行;「サッカロミセス属酵母菌の分子生物学」 、ブローク、プリングルおよびジョーンズ編、ＣＳＨラボラトリー・プレス(ニ ューヨーク)１９９１年発行]。 図８に関連して、チューブローラー上の試験管(１８×１５０mm)内に入れたＳ Ｄ最少培地(デキストロース２％、アミノ酸を含まないジフコ酵母窒素源０.６７ ％および試験菌株の増殖に必要な補充成分)３ml中において培養物を３０℃で一 夜(１２〜２４時間)予備増殖させる。一夜増殖させた培養物を新鮮なＳＤ最少培 地を用いて希釈する。即ち、培養物の吸光度＋光散乱度を６００nmで測定し(即 ち、試料の光透過度の減少を測定した値:Ａ₆₀₀)、得られた測定値に基づいて、 培養物をＡ₆₀₀が３×１０^-5になるように希釈する。この希釈法は、１個のウェ ルあたり４〜１５個の細胞を配分するために経験的に導かれたものである。希釈 培養物は９６個のウェルを備えたマイクロタイター皿に分配する(０.２ml／ウェ ル)。被験化合物をマイクロタイター皿のウェル内の細胞懸濁液と混合した後(２ μl／ウェル)、静置状態で３０℃で２日間インキュベートする。増殖抑制のない ウェルの底部には数個の小コロニーの増殖がみられる。光散乱と細胞密度との関 連性は分光光度計による測定毎に完全な再現性を示さないので、同一の効果が確 実に得られるように希釈を調整することが必要である。しかしながら、細胞の密 度は上記の方法の成否に対する臨界的な要件とはならない。 変異体コレクションのサブユニットの増殖抑制は、被験化合物が翻訳の特定段 階を標的にすることを意味する。全菌株の増殖抑制は、被験化合物の用量が翻訳 に対して多過ぎるか、または該化合物が非翻訳標的を介して増殖を抑制すること を意味するが、いずれの場合も、該化合物の用量を低減させる試験が必要である 。被験化合物の１または複数の標的は、種々の変異細胞培養物の応答から推断で きる。例えば、ＥＦ−２に部分的欠損のある変異体は、野生型菌株またはこのイ ンヒビターに対する標的ではないeＩＦ−４Ａに部分的欠損のある変異体よりも 、ヒグロマイシンに対してより高い感受性を示す[チューイト(Ｍ.Ｆ.Ｔuite)、「 タンパク質合成」、酵母菌、第３巻(第２版)、ＩＳＢＮ＃０−１２−５９６４１ ３−７、１９８９年]。 実施例４:野生型および変異体細胞を用いる選抜 実施例３に記載の一般的手順に従い、選抜系を以下のようにして調製すること によって、その活性が真菌特異性翻訳因子ＥＦ−３によって仲介されるか、また は該因子によって強化される潜在的な抗真菌剤を同定した。この系は、ＥＦ−３ に影響を及ぼす作因が多数の化合物ライブラリーからＹＥＦ３遺伝子の用量およ びＥＦ−３の細胞内濃度の点で相違する同質遺伝子の酵母菌株に対する異なる効 果によって同定されるという原理に基づく。ＹＥＦ３遺伝子のクローン化および 配列決定に関する既知の知見を利用することにより[Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、第２６５ 巻、第１９０３頁〜第１９１２頁(１９９０年)およびＢiochim．Ｂiophys．Ａct a、第１０５０巻、第２３０頁〜第２３４頁(１９９０年)参照]、「ジェンバンク( ＧenＢank)」(商標)／ＥＭＢＬデータバンクのアクセスファイル番号Ｊ０６１９ ７に記載されている塩基対３９３９〜４５７４に相当するＤＮＡフラグメントの ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されるようにプライマーを設計した。ハイブ リッド形成プローブとしてこの増幅フラグメントを使用することによって、サッ カロミセス・セレビシエのゲノムライブラリー中のＹＥＦ３含有クローンを同定 した。２つの類似のプラスミドを同一の酵母菌株に平行して導入することによっ て同一 遺伝子菌株を調製した。第一のプラスミドpＲＳ４２６[Ｇene、第１１０巻、第 １１９頁〜１２２頁(１９９２年)参照]は、サッカロミセス・セレビシエにおい て高いコピー数(一般的には１０〜５０コピー／細胞)を維持すると共にura３変 異体においてウラシル プロトトロフィーをもたらすＤＮＡ配列を有する。第二 のプラスミドは第一のプラスミドから誘導されるものであって、クローン化したＹＥＦ３ 遺伝子を含む。細胞培養物は実施例３に記載のようにして調製した。こ の系は、翻訳延長に対して強い影響を与えることが知られている化合物(シクロ ヘキシミド、パロモマイシンおよびヒグロマイシンＢ)を用いる試験に供した。 高複製ＹＥＦ３プラスミドを発生する酵母菌株の増殖は、コントロールプラスミ ドpＲＳ４２６を発生する菌株の増殖抑制に必要な濃度よりも４倍低い濃度のパ ロモマイシンまたはヒグロマイシンＢによって抑制される。これに対して、シク ロヘキシミドの抑制濃度は両方の菌株に対して同程度であった。従って、この選 抜系を用いることにより、２種の菌株に対する延長に影響を及ぼす化合物の異な る効果を同定することができ、また、その効果がＹＥＦ３によって仲介されるか または増強される化合物(例えば、パロモマイシンおよびヒグロマイシンＢ)とそ うでない化合物(例えば、シクロヘキサミド)とを区別することができる。 実施例５:変異体細胞抽出物を用いる選抜 細胞抽出物は前述の翻訳成分変異体から調製し、生体外での翻訳インヒビター の選抜に使用できる。前記の各々の翻訳成分変異体は、１種の翻訳成分を除き、 野生型菌株と同一である。細胞抽出物は野生型菌株および変異体菌株から調製し 、当業者に既知の方法による生体外翻訳に使用できる[例えば、チューイトおよ びプレセット(Ｊ.Ｐlesset)、「mＲＮＡ依存性酵母細胞不含翻訳系:理論と実際」 、Ｙeast、第２巻、第３５頁〜第５２頁(１９８６年);チューイト、「タンパク質 合成」、酵母菌、第３巻(第２版)、ＩＳＢＮ＃０−１２−５９６４１３−７、１ ９８９年]。 野生型菌株から得られた抽出物および１もしくは複数の変異体菌株から得られ た１または複数の抽出物に所定の化合物を平行して添加する。翻訳に対する該化 合物の効果は当業者に既知の方法、例えば、次の方法によって測定できる:放射 能標識化アミノ酸のポリペプチドへの組み込み法(これは、ＴＣＡで沈殿可能な 物質の液体シンチレーション計数器による計数によって測定できる)、翻訳生産 物に対する電気フェログラムの蛍光光度法、タンパク質に対する電気フェログラ ムの直接的染色法、翻訳ミックスに含まれるmＲＮＡによってコードされたタン パク質に対する免疫的または酵素的試験法、および当業者に既知のその他の方法 。所定の化合物の１または複数の標的は、種々の変異体細胞抽出物の応答から推 断される。 ６．終止アッセイの抑制 図５に関連する本発明の特徴は、特定の酵母菌遺伝子を、その完全な遺伝子生 産物の生産が翻訳終止の干渉に依存するように構築するかまたは同定し、該遺伝 子生産物を被験化合物の活性の指標として使用することを含む抗真菌剤の選抜法 にある。この遺伝子生産物は、被験化合物の活性を、例えば生体内または生体外 でのアッセイによりその濃度または活性を測定することによって決定するのに直 接使用してもよい。あるいは、遺伝子生産物の発現を利用して、被験化合物の活 性のレポーターとして機能する他の遺伝子の発現を推進させてもよい。 この方法には、その完全な翻訳が翻訳終止過程の干渉に依存する遺伝子生産物 をコードするmＲＮＡを含有する酵母菌の細胞または細胞抽出物を潜在的な抗真 菌剤と、該抗真菌剤の不存在下では該遺伝子生産物の合成がほとんどまたは全く おこなわれない条件下で接触させることが含まれる。この方法にはさらに、その 合成が遺伝子生産物に依存するレポーター分子または遺伝子生産物の翻訳のレベ ルを該抗真菌剤が増加させるかどうかを決定することが含まれる。逆説的には、 このレベルを増加させる作因はいずれも比較的高い用量で用いる抗真菌剤として 潜在的に有用である。 終止アッセイの抑制のより好ましい態様においては、適当なレポーター、例え ば、サッカロミセス・セレビシエのＰＨＯ５遺伝子によってコードされた酸性ホ スファターゼであってそのタンパク質生産物が酵素アッセイ、免疫決定法または 当業者に既知の他のいずれかの方法によって容易に定量できる酵素をＯＲＦ中( 好ましくはＯＲＦの開始点の近く)の翻訳終止コドンの導入によって変性させ、 これによって、レポータータンパク質を非常に低いレベルで発現させ、弱いシグ ナルを選定したアッセイによって得る。リボソームの翻訳終止能に干渉する化合 物は、この導入された終止コドンのセンスコドンとしての誤読をもたらし、これ によってレポータータンパク質の発現が増加する。 このアッセイが導入された終止コドンと天然の終止コドンとの識別には依存し ないということに注意すべきである。これは、抗転写終結が比較的まれであり、 アッセイにおいては十分にチェックされるからである。このアッセイは細胞不含 翻訳抽出物または完全細胞(後者が好ましい)を用いて生体外でおこなうことがで きる。 この抗真菌剤の選抜法の機構は、サッカロミセス属の菌における翻訳終止の遺 伝サプレッサーと終止コドンとの相互作用の強度を測定するためのアッセイに多 少類似する点があるが[フィローザン(Ｍ.Ｆiroozan)、グラント(Ｃ.Ｍ.Ｇrant) 、ジュアート(Ｊ.Ａ.Ｂ．Ｄuarte)およびチューイト、「新規な遺伝子融合アッセ イによる酵母菌中の終止コドンの読み通しの定量」、Ｙeast、第７巻、第１７３ 頁〜第１８３頁(１９９１年)参照]、本発明は従来の報告とは以下の重要な点で 相違する。１)本発明は翻訳終止過程に干渉して抗真菌剤として作用する外因性 化合物の同定に関するものであるのに対して、従来の報告は酵母菌細胞の内因性 成分間の相互作用の強度の測定に関する。従来の報告はそのようなアッセイが翻 訳インヒビターまたは抗真菌剤の同定のために使用できるか、または該同定用に 修正できることを教示しておらず、また、このような用途は従来の報告からは明 らかでない。２)従来の論文に記載されているアッセイは遺伝変異体または治療 剤の大規模な選抜法としては利用しにくく有用性が低いという技術的制約がある 。本発明による方法は大規模な選抜法としては利用しやすく、十分に適したもの である。好ましい態様においては、レポーター遺伝子は酵母菌の染色体に組み込 まれ、これによってレポーター遺伝子のコピー数の安定性は著しく増大する。ま た、 好ましい態様においてはＰＨＯ５を用いるが、これは該遺伝子がコードする酵素 が細胞表面に分泌されてそこに保持されるからである。これによって酵素的およ び免疫的アッセイは容易になるが、これは、細胞の切開が不要となり、選抜過程 が簡素化されるからである。 「翻訳終止」は、翻訳リボソームが３つの共通終止コドンのうちの１つのコドン と出会い、これを、発生期のポリペプチドへのアミノ酸の付加を停止させるシグ ナルとして首尾よく読み取る現象を意味する。 「終止コドン」または「ナンセンスコドン」は、３つのコドンのうちの１つのコド ン、即ち、普通はＯＲＦの末端へシグナルを伝えるＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ を意味する。 「センスコドン」は、６１個のコドンのうちのいずれか１つのコドンであって、 普通はアミノ酸をコードしてＯＲＦの開始部または継続部にシグナルを伝えるコ ドンを意味する。 「リボソーム放出」は、mＲＮＡ分子からのリボソームの分離を意味する。 Ａ．レポーターおよび菌株 この態様においては、分泌された酸性ホスファターゼをコードする酵母菌のＰ ＨＯ５ 遺伝子の修飾体を利用するが、この場合、ＰＨＯ５を使用して実施すべき 特別な要求または制約はない。部位特異的変異誘発を利用して終止コドンをＰＨ Ｏ５ に導入するが、導入する位置はＯＲＦの開始点の近くが好ましい。これらの 対立遺伝子をいくつか調製する。未変性プロモーターを使用してもよいが、置換 体を使用してホスフェートレギュロンの制約を回避するのが好ましい。未変性プ ロモーターの良好な置換体は、上流の４つの短いＯＲＦを欠く５'mＲＮＡリーダ ーおよびＧＣＮ４プロモーターの置換体である。この置換体は、既知の顕著ない ずれの転写調節の影響も受けない強力なプロモーターである。この好ましい態様 においては、ＰＨＯ４遺伝子を当業者に周知の方法によって欠失させる。ＰＨＯ ４タンパク質はＰＨＯ３、ＰＨＯ５、ＰＨＯ１０およびＰＨＯ１１によってコー ドされる酸性ホスファターゼの転写活性化因子である。変性ＰＨＯ５遺伝子は当 業者に周知の方法により酵母菌の染色体に組み込まれる。 実施例６:「終止アッセイの抑制」による選抜 酸性ホスファターゼ酵素は既知の方法によって容易にアッセイすることができ る[フワン(Ｙ.−Ｉ.Ｈwang)、ハラシマ(Ｓ.Ｈarashima)やよびオシマ(Ｙ.Ｏshim a)、「サッカロミセス・セレビシエ菌中の抑制性酸性ホスファターゼをコードす るＰＨＯ５遺伝子を用いるプロモーター・プローブベクターの構築」、Ａppl.Ｍi crobiol.Biotechnol．、第２８巻、第１５５頁〜第１５９頁(１９８８年)参照] 。好ましい態様においては、細胞を約１×１０⁷〜５×１０⁷細胞／mlまで増殖さ せ、培養物０.１mlを９６個のウェルを有するマイクロタイター板上のウェルに 分配する(ウェル内には被験化合物またはコントロールを存在させる)。このマイ クロタイター板を３０℃で５時間インキュベートした後、遠心分離と吸引によっ て細胞を培地から分離させる。得られた細胞を０.５Ｍ酢酸ナトリウム溶液(pＨ ４.０)０.１mlを用いて１回洗浄した後、p−ニトロフェニルホスフェートを０. ０２５mｇ添加した同じ緩衝液０.２ml中に再懸濁させ、次いで４１０nmでの分光 光度法により６０分間モニターする。１分間あたりの吸光度の変化を、ウェル中 の酸性ホスファターゼの全活性の尺度とする。この値の増加は被験化合物が翻訳 終止に干渉することを示す。 翻訳終止を抑制する化合物は細胞に対して毒性であってもよく、また、ホスフ ァターゼ発現の増加は、翻訳能のある生存細胞の数を低減させることによって相 殺させることができる。この場合のコントロールを得るためには、使用する各々 の被験化合物とコントロール化合物の各濃度に関してマイクロタイター板を平行 して調製してインキュベートするが、該マイクロタイター板のアッセイは、ＦＲ Ｅ１ 遺伝子によってコードもしくは調節された外部レダクターゼに関しておこな う[ダンシス、ロマン、アンダーソン、ヒンネブッシュおよびクラウスナー、「サ ッカロミセス・セレビシエの第二鉄レダクターゼ:分子の特性評価、鉄取り込み における役割および鉄による転写調節」、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.、第８９巻、 第３８６９頁〜第３８７３頁(１９９２年)参照]。ホスファターゼ:レダクターゼ の 比が３倍以上増加または減少することは、被験化合物が翻訳終止に干渉すること を示す。さらに、レダクターゼの発現レベルの低減は、被験化合物が真菌細胞に 対して毒性があることを示す。 ７．フレームシフトアッセイ 本発明の一つの特徴は、選定されたレポータータンパク質の合成を翻訳のフレ ームシフトに依存させることを含む抗真菌剤の選抜法にある。このタンパク質の 発現を利用して被験化合物の活性を、生体内もしくは生体外アッセイにより遺伝 子生産物を直接的に測定することによって決定してもよい。あるいは、翻訳指標 の発現を利用して、被験化合物の活性の指標として機能する他の遺伝子の発現を 推進させてもよい。この方法においては、フレームシフト条件下においてレポー タータンパク質をコードするＲＮＡの翻訳を可能にする真菌の翻訳−フレームシ フト核酸配列を利用する。フレームシフトの頻度を増加または減少させる化合物 は細胞に対して毒性であってもよい。 好ましい態様においては、真菌の翻訳−フレームシフト核酸配列を、レポータ ータンパク質をコードする同じＲＮＡ内に位置させる。この方法には、翻訳−フ レームシフト核酸配列を有する酵母菌の細胞または細胞抽出物を潜在的な抗真菌 剤と、該抗真菌剤の不存在下では該レポータータンパク質の合成がほとんどまた は全くおこなわれない条件下で接触させることが含まれる。この方法にはさらに 、該抗真菌剤がレポータータンパク質の翻訳レベルを増加させるかどうかを決定 することが含まれる。逆説的には、このレベルを増加させるいずれの作因も比較 的高い用量で用いる抗真菌剤として潜在的に有用である。 このフレームシフトアッセイのより好ましい態様においては、いずれかの適当 なレポーター、例えば、サッカロミセス・セレビシエのＰＨＯ５遺伝子によって コードされた酸性ホスファターゼであって、そのタンパク質生産物が酵素アッセ イ、免疫決定法または当業者には既知の他のいずれかの方法によって容易に定量 できる酵素を、ＯＲＦ内(好ましくはＯＲＦの開始点の近く)に翻訳フレームシフ トを導入することによって変性させ、これによってレポータータンパク質を非常 に低レベルで発現させ、弱いシグナルを選定されたアッセイによって測定する。 翻訳の忠実度(fidelity)に干渉する化合物は導入されたフレームシフトの誤読を もたらすと共に検出可能な頻度でＯＲＦへのリターンを引起こすので、レポータ ータンパク質の発現は増加する。このアッセイは細胞不含翻訳抽出物(好ましく は完全細胞)を用いて生体外でおこなうことができる。 「導入されたフレームシフト」とは、レポータータンパク質のＯＲＦに導入され る変更であって、変更の３'側のＯＲＦが、変更の５'側のＯＲＦに対して１個の ヌクレオチドの増減を伴うフレームからのシフトを意味する。この変更は当業者 には既知の多くの方法によっておこなうことができる。このような方法としては 、特に限定的ではないが、次の方法が例示される:３で割り切れない数のＯＲＦ 内の塩基対の付加または欠失、および天然のフレームシフト配列であることが証 明されているより長い配列、例えば、特に限定的ではないが、酵母菌のレトロト ランスポゾンＴＹ１およびＴＹ２の「スリップ」配列等の付加[ベルコート(Ｍ.Ｆ. Ｂelcourt)およびファラボー(Ｐ.Ｆarabough)、「酵母菌のレトロトランスポゾン ＴＹにおけるリボソームフレームシフト:７ヌクレオチド最小部位でのtＲＮＡ誘 導滑り」、Ｃell、第６２巻、第３３９頁〜第３５２頁(１９９０年)参照]。 「スリップ」配列は、cisにおいて酵母菌の翻訳中に＋１のフレームシフトを促 進するＤＮＡ配列ＣＴＴＡＧＧＣ(上記文献参照;ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．:１５)を 意味する。しかしながら、この配列は単なる例示であって、「スリップ」配列はこ の特定の配列に限定されない。さらにこの方法においては、−１のフレームシフ トを促進する配列も使用できる。 Ａ．レポーターと菌株の設計 この態様においては、分泌された酸性ホスファターゼをコードする酵母菌のＰ ＨＯ５ 遺伝子の修飾体を利用するが、この場合、ＰＨＯ５を使用して実施すべき 特別な要求または制約はない。部位特異的変異誘発を利用して終止コドンをＰＨ Ｏ５ に導入するが、導入する位置はＯＲＦの開始点の近くが好ましい。これらの 対立遺伝子をいくつか調製する。未変性プロモーターを使用してもよいが、置換 体を使用してホスフェートレギュロンの制約を回避するのが好ましい。未変性プ ロモーターの良好な置換体は、上流の４つの短いＯＲＦを欠く５'mＲＮＡリーダ ーおよびＧＣＮ４プロモーターの置換体である。この置換体は、既知の顕著ない ずれの転写調節の影響も受けない強力なプロモーターである。この好ましい態様 においては、ＰＨＯ４遺伝子は当業者には周知の方法によって欠失させる。ＰＨ Ｏ４ タンパク質はＰＨＯ３、ＰＨＯ５、ＰＨＯ１０およびＰＨＯ１１によってコ ードされる酸性ホスファターゼの転写活性化因子である。変性ＰＨＯ５遺伝子は 当業者には周知の方法により酵母菌の染色体に組み込まれる。 実施例７:レフレームシフトアッセイを用いる選抜 酸性ホスファターゼ酵素は既知の方法によって容易にアッセイすることができ る[フワン、ハラシマおよびオシマ、「サッカロミセス・セレビシエ菌中の抑制性 酸性ホスファターゼをコードするＰＨＯ５遺伝子を用いるプロモーター・プロー ブベクターの構築」、Ａppl．Ｍicrobiol．Ｂiotechnol．、第２８巻、第１５５ 頁〜第１５９頁(１９８８年)参照]。好ましい態様においては、細胞を約１×１ ０⁷〜５×１０⁷細胞／mlまで増殖させ、培養物０.１mlを９６個のウェルを有す るマイクロタイター板上のウェルに分配する(ウェル内には被験化合物またはコ ントロールを存在させる)。このマイクロタイター板を３０℃で５時間インキュ ベートした後、遠心分離と吸引によって細胞を培地から分離させる。得られた細 胞を０.５Ｍ酢酸ナトリウム溶液(pＨ４.０)０.１mlを用いて１回洗浄した後、ｐ −ニトロフェニルホスフェートを０.０２５mg添加した同じ緩衝液０.２ml中に再 懸濁させ、次いで４１０nmでの分光光度法により６０分間モニターする。１分間 あたりの吸光度の変化を、ウェル中の酸性ホスファターゼの全活性の尺度とする 。この値の増加は被験化合物の増加または翻訳のフレームシフトを意味するのに 対し、この値の減少は被験化合物の減少または翻訳のフレームシフトを意味する 。 フレームシフトの頻度を変化させる化合物は細胞に対して毒性であってもよく 、また、ホスファターゼ発現の増加は、翻訳能のある生存細胞の数を低減させる ことによって相殺させることができる。この場合のコントロールを得るためには 、 使用する各々の被験化合物とコントロール化合物の各濃度に関してマイクロタイ ター板を平行して調製してインキュベートするが、該マイクロタイター板のアッ セイは、ＦＲＥ１遺伝子によってコードもしくは調節された外部レダクターゼに 関しておこなう。ホスファターゼ:レダクターゼの比が３倍以上増加または減少 することは、被験化合物がフレームシフトに干渉することを示す。さらに、レダ クターゼ発現のレベルの低下は被験化合物が真菌細胞に対して毒性であることを 示す。 ８．ｅＩＦ−２アルファキナーゼ活性化アッセイ 本発明の一つの特徴は、翻訳開始因子eＩＦ−２(この因子はサッカロミセス属 の菌においてはＧＣＮ２遺伝子によってコードされ、ｅＩＦ−２アルファキナー ゼまたはＧＣＮ２キナーゼとして知られている)のアルファサブユニット上の残 基セリン５１をリン酸化するキナーゼの活性化因子を同定することを含む抗真菌 剤の選抜法にある。eＩＦ−２アルファキナーゼ上のこの部位のリン酸化は、酵 母菌からヒトに至るまでの生物体における翻訳と増殖の調節のキーステップ(key step)である。翻訳開始はキナーゼ活性の増加によって低下し、キナーゼ活性 が十分に高くなると翻訳は完全に阻止される。しかしながら、キナーゼを活性化 するシグナルはこれらの２種の生物体においては非常に異なる。 酵母菌の場合には、キナーゼはアミノ酸の制限によって活性化されるが、これ は、「一般アミノ酸調節」経路の見地からすると、その結果としてもたらされる未 変性tＲＮＡの増加に起因すると考えられる[ヒンネブッシュおよびリープマン、「 タンパク質合成と翻訳調節」、ブローク、プリングルおよびジョーンズ編、サッ カロミセス属酵母菌の分子生物学、第６２６頁〜第７３６頁、ＣＳＨラボラトリ ー・プスレ(ニューヨーク)１９９１年発行]。 ヒトの場合には、１つ型のeＩＦ−２アルファキナーゼはヘム飢餓によって活 性化されるが、別の型のものは二本鎖ＲＮＡによって活性化され、いずれもアミ ノ酸飢餓によっては活性化されない。 この知見は、哺乳類のキナーゼに影響を与えない酵母菌キナーゼの活性化因子 の探索に利用できる。このような活性化因子は真菌の増殖を抑制し、宿主に真菌 感染を排除するより良い機会を与える。 好ましい態様(「ＧＣＮ２キナーゼ活性化アッセイ」として知られている)におい ては、酵母菌細胞は致死濃度のアミノ酸類似体を含有する培地上で増殖させる。 このようなアミノ酸類似体としては、特に限定的ではないが、５−フルオロトリ プトファンが例示される。この化合物はタンパク質の翻訳中にポリペプチド中に 取り込まれると毒性効果をもたらすが、アミノアシル−tＲＮＡ合成に影響を与 えることによってはこのような効果をもたらさない。ＧＣＮ２キナーゼを適度に 活性化させる化合物は翻訳の開始を適度に抑制し、これによってＧＣＮ４タンパ ク質の翻訳が増大するためにアミノ酸の生合成が増大し、これによって毒性類似 体の効力の弱化がもたらされる。用量がさらに高くなると、該化合物はＧＣＮ２ キナーゼを過度に活性化させ、これによって翻訳開始が過度に抑制されるので増 殖が抑制される。別の態様においては、このアッセイを生体内においてeＩＦ− ２アルファ基質に対するキナーゼ活性を測定することによっておこなう[デバー( Ｔ.Ｄ.Ｄever)、フェング(Ｌ.Ｆeng)、ウェク(Ｒ.Ｃ.Ｗek)、シガン(Ａ.Ｍ.Ｃig an)、ドナフー(Ｔ.Ｆ.Ｄonahue)およびヒンネブッシュ、「タンパク質キナーゼＧ ＣＮ２による開始因子２アルファのリン酸化は酵母菌中のＧＣＮ４の遺伝子特異 的翻訳調節を仲介する」、Ｃell、第６８巻、第５８５頁〜第５９６頁(１９９２ 年)]。 「一般アミノ酸調節」は「交差経路調節」としても知られており、細胞がアミノ酸 の制限または不均衡を克服するのに用いる調節ネットワークを意味する(これは サッカロミセス属の菌において最も良く特徴付けられている)。この代謝調節経 路に関する見解はアスペルギルス・ニドゥランスとニューロスポラ・クラサにお いて立証されており、大部分もしくは全ての真菌において適用できるものと考え られる。この現象についての包括的な説明は次の報文およびその引用文献にみら れる:ヒンネブッシュおよびリープマン、「タンパク質合成および翻訳調節」、ブ ローク、プリングルおよびジョーンズ編、サッカロミセス属酵母菌の分子生物学 、 第６２６頁〜第７３６頁、ＣＨＳラボラトリー・プレス(ニューヨーク)１９９１ 年発行]。 実施例８:ＧＣＮ２キナーゼの高活性化の選抜 一部の毒性アミノ酸類似体、例えば、５−フルオロトリプトファン(５−ＦＴ) はタンパク質翻訳レベルでは本物のアミノ酸と代替し得る作用を示すが、タンパ ク質機能レベルでは本物のアミノ酸と代替し得る作用を示さない。このタイプの 毒性は、本物のアミノ酸を培地により多く添加するかまたは細胞内でのその合成 を増加させることにより、その濃度を増大させることによって改善できる。ＧＣ Ｎ２キナーゼの活性化により、アミノ酸の生合成および５−ＦＴのような毒性ア ミノ酸類似体に対する耐性の増大がもたらされる。ＧＣＮ２キナーゼは遺伝変異 、未荷電tＲＮＡの細胞内濃度の増加または外因性化合物の添加によって活性化 させることができる。このアッセイは、ＧＣＮ２キナーゼを活性化する化合物を 同定するように設計される。このアッセイにおいては、一般アミノ酸調節に対し て野生型の酵母菌株を５−ＦＴのようなアミノ酸類似体のＭＩＣの存在下で増殖 させる。被験化合物を培養物中に添加して増殖を測定する。ＧＣＮ２キナーゼを 刺激する化合物は５−ＦＴの存在下での増殖の増大をもたらす。好ましい態様に おいては、このアッセイにおける培養条件は表現型緩和アッセイの場合と同一に する(但し、５−ＦＴを添加し、トリプトファンと３−アミノトリアゾールは培 地に添加しない)。 ９．eＩＦ−２アルファキナーゼ抑制アッセイ この発明の一つの特徴は、サッカロミセス属の菌においてＧＣＮ２遺伝子によ ってコードされる翻訳開始因子eＩＦ−２のアルファサブユニット上の残基セリ ン５１をリン酸化するキナーゼのインヒビターを同定することを含む抗真菌剤の 選抜法にある(該因子はeＩＦ−２アルファキナーゼまたはＧＣＮ２キナーゼとし て知られている)。eＩＦ−２アルファのこの部位のリン酸化は、一般アミノ酸調 節によるアミノ酸制限中のアミノ酸生合成の抑制に必要である[ヒンネブッシュ およびリープマン、「タンパク質合成と翻訳調節」、ブローク、プリングルおよび ジョ ーンズ編、サッカロミセス属酵母菌の分子生物学、第６２６頁〜第７３６頁、コ ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(ニューヨーク)１９９１ 年発行]。ＧＣＮ２キナーゼは平衡アミノ酸培地上での増殖には不必要であるが 、アミノ酸制限培地上での増殖には必要である。 このようなアミノ酸制限条件は自然界では頻繁にみられ、哺乳類の組織「培地 」は真菌に対してこのような条件を提供する。一般アミノ酸調節経路は少なくと も他の２種類の真菌、即ち、ニューロスポラ・クラサおよびアスペルギルス・ニ ドゥランス中に存在することが知られており、また、その他の真菌中にも存在す ると考えられる。 このアッセイの一つの態様においては、増殖が適度に遅い表現型をもたらす構 成的に活性化されたＧＣＮ２の対立遺伝子を発生する酵母菌株を構築する。この 種の菌株は次の文献にいくつか記載されている:ラミレツ(Ｍ.Ｒamirez)、ウェク (Ｒ.Ｃ.Ｗek)、バズケズ・デ・アルデナ(Ｃ.Ｒ.Ｖazquez de Ａldena)、ジャク ソン(Ｂ.Ｍ.Ｊackson)、フリーマン(Ｂ.Ｆreeman)およびヒンネブッシュ、「酵母 菌のeＩＦ−２アルファキナーゼＧＣＮ２を活性化する変異:ヒスチジル−tＲＮ Ａシンセターゼに関するドメインを変える対立遺伝子の単離」、Ｍol.Ｃell.Ｂio l.、第１２巻、第５８０１頁〜第５８１５頁(１９９２年)]。キナーゼを抑制す る化合物または他の方法(例えば、特に限定的ではないが、対抗するホスファタ ーゼの活性化)によってキナーゼの活性を拮抗する化合物は増殖の遅い表現型を 改善し、培養物の増殖を促進する[ウェク、キャノン(Ｊ.Ｆ.Ｃannon)、デバー( Ｔ.Ｅ.Ｄever)およびヒンネブッシュ、「eＩＦ−２アルファキナーゼＧＣＮ２に 欠損のある酵母菌変異体におけるＧＣＮ４発現の翻訳活性を回復させる截形タン パク質ホスファターゼＧＬＣ７」、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.、第１２巻、第５７００頁 〜第５７１０頁(１９９２年)]。より高い濃度においては、この種の化合物はキ ナーゼの機能を完全に阻害し、アミノ酸制限条件下でのアミノ酸の生合成を抑制 しない。 このアッセイの他の態様においては、ＧＣＮ２によって正に調節されるレポー ター遺伝子であって、２−デオキシガラクトースの存在下において毒性または条 件付毒性の生産物、例えばガラクトキナーゼを生産する遺伝子を使用する。別の 態様においては、このアッセイは生体外において、精製されたeＩＦ−２アルフ ァ基質上でのキナーゼ活性を測定することによっておこなう。 さらにこのアッセイの別の態様においては、構成的に活性化されたキナーゼは 別の生物体から誘導される。このようなキナーゼとしては、例えば、特に限定的 ではないが、「ｐ６８」、「ＤＡＩ」または「ＰＫＲ」等色々な名前で呼ばれている哺 乳類の細胞から誘導されるＧＣＮ２−型キナーゼが挙げられる。このキナーゼは サッカロミセス属の菌の細胞内に導入されると、構成的に活性化されたＧＣＮ２ キナーゼのように機能する。 「平衡アミノ酸培地」は２０種の共通のアミノ酸の各々を増殖を促進するのに十 分に高い濃度で含有する限定的または非限定的なリッチ培地(rich medium)を意 味し、該濃度は原栄養体に対してはゼロに近くなるほど低くすることも可能であ るが、２０種のアミノ酸の１種または２種以上のアミノ酸または他の必須栄養素 または代謝物の利用または取り込みに干渉するほど高くすべきでない。。 「アミノ酸制限培地」は限定的または非限定的なリッチ培地であって、(１)２０ 種の共通アミノ酸の１種または２種以上のアミノ酸を増殖を促進するのに十分高 くない濃度で含有する培地、(２)増殖に必要なアミノ酸を欠く培地、(３)１種ま たは２種以上のアミノ酸を、１種または２種以上の他の２０種のアミノ酸または 他の必須栄養素または代謝物の利用または取り込みに干渉するほど高い濃度で含 有する培地、または(４)アミノ酸生合成のインヒビターを含有する培地を意味す る。 前節における「構成的に活性化された対立遺伝子(constitutively activated a llele)」は、野生型タンパク質を不活性に維持する条件下(抑制条件下)、即ち、 アミノ酸平衡培地上で表現型活性のあるＧＣＮ２タンパク質をコードする遺伝子 の変異体対立遺伝子(異形)を意味する。野生型ＧＣＮ２キナーゼは生体外のこの ような条件下では非常にわずかな活性しか示さないが、構成的に活性化された対 立遺伝子はより高い活性を示す。非常に低い活性から高い活性まで種々の活性を 有する多くの対立遺伝子が知られている。一般的には、対立遺伝子がより高い活 性をもつほど、該対立遺伝子を有する菌株の増殖速度はより遅くなる[ラミレツ 、ウェク、バズケズ・デ・アルデナ、ジャクソン、フリーマンおよびヒンネブッ シュ、「酵母菌のeＩＦ−２アルファキナーゼＧＣＮ２を活性化する変異:ヒスチ ジル−tＲＮＡシンセダーゼに関するドメインを変える対立遺伝子の単離」、Ｍol .Ｃell.Ｂiol.、第１２巻、第５８０１頁〜第５８１５頁(１９９２年)]。構成的 に活性化された対立遺伝子は、調節能を有さないという意味で構成要素である必 要はなく、その代りにタンパク質が鈍い調節能を有していてもよい。 「増殖が適度に遅い表現型」とは、増殖速度が少なくとも２倍増大し、１０倍以 上は増大しないことを意味する。 実施例９:ＧＣＮ２キナーゼの不活性化に対する選抜 ＧＣＮ２の特定の変異体対立遺伝子は「活性化されたい状態」にあるか、または「 構成的」であると考えられているが、これは、コード化されたキナーゼが正常な 刺激シグナルの不存在下で活性であるからである。これらの対立遺伝子のいくつ かのものの活性は、該対立遺伝子を有する菌株の増殖を遅延させるのに十分に高 いものである。ＧＣＮ２キナーゼを抑制するいずれかの化合物は菌株の増殖促進 能を回復させる。好ましい態様においては、培養条件は表現型緩和アッセイの場 合と同一にする(但し、３ＡＴは培地に添加しない)。 １０．タンパク質−タンパク質相互作用アッセイ:の優性対立 遺伝子 本発明の一つの特徴は、翻訳成分間の正常な相互作用に干渉する真菌または細 菌の翻訳成分の負の優性対立遺伝子を同定することによる抗真菌剤の選抜法にあ る。従来からこの種の相互作用は対立遺伝子の特徴とされている。例えば、大腸 菌ＥＦ−ＴuのＫ１３６Ｅ対立遺伝子は、ＥＦ−Ｔsの隔離によってその効果を発 揮する負の優性変異による[フワン、カーターおよびミラー、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem． 、第２６７巻、第２２１９８頁〜第２２２０５頁(１９９２年):フワン、サンケ ズ およびミラー、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．、第２６４巻、第８３０４頁〜第８３０９頁（ １９８９年)]。しかしながら、これらの報文の著者は治療剤の発見との関連性に ついては何も提案していない。負の優性対立遺伝子の遺伝子生産物は単離される と、その大きさが漸進的に低減し、フラグメントは可能な限り小さくなる。負の 優性変異を有する小さなペプチドは治療剤または全身用化学薬剤を設計するため のリード化合物として用いられる。 「優性対立遺伝子」は、同じ遺伝子の劣性対立遺伝子の存在下においてその効果 または表現型をもたらす野生型または変異体の対立遺伝子を意味する。優性対立 遺伝子および劣性対立遺伝子という用語は相互に相対的に定義されるものであり 、絶対的なものではない。 「負の優性対立遺伝子」は、劣性対立遺伝子の機能を損わせるか、またはこれに 干渉する優性遺伝子を意味する。 「正常な相互作用」は、問題となる代謝経路に影響を及ぼす既知の変異をもたら さない菌株中で発生する共通の相互作用を意味する。 「正常な相互作用に対する干渉」とは、正常な相互作用の摂動、例えば、特に限 定的ではないが、該相互作用をより強くするか、より弱くするか、より特異的に するか、またはより非特異的にする摂動を意味する。 「可能な限り小さなフラグメント」とは問題となる活性を保持する最小のフラグ メント、好ましくは１０個以下のアミノ酸、より好ましくは５個以下のアミノ酸 を有するフラグメントを意味する。このような短ペプチドは他の特許出願に係る 明細書に開示されている。例えば、テトラペプチドＧＬＹ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−Ｐ ＲＯはフィブリンの重合を阻止し、また、ロイペプチン、即ち、Ｎ−末端および Ｃ−末端が遮断されたトリペプチドは基質と類似の作用をするのでセリンプロテ アーゼ活性を競合的に抑制する。このようなタイプの多数の短ペプチドは関連す る科学的文献と共に、シグマ・ケミカル・カンパニー(セントルイス、ミズリー) から発行されている１９９３年版のカタログ、第１０３５頁〜第１１０２頁に記 載されている。 Ａ．負の優性対立遺伝子の選抜 本発明において有用なプロトコルの概要は次の通りである:１)クローン化され た翻訳成分遺伝子を用いて操作を開始し、２)該遺伝子に当業者に周知の方法に よって突然変異を起こさせ、３)該変異体遺伝子をプラスミド中において誘発性 プロモーターの制御下におき、４)該プラスミドを酵母菌または細菌に形質転換 させ、５)誘発性条件下で増殖を抑制するプラスミドを選抜し、６)開放読み枠( ＯＲＦ)をサブクローン化させて酵母菌の増殖を抑制する最小ペプチドを探索し 、７)該ペプチドを化学的に修飾してより強力な類似体を見出す。 １１．タンパク質−タンパク質相互作用アッセイ:２ハイブリッド法 本発明の一つの特徴は、２ハイブリッド法(two hybrid approach)に部分的に 基づく方法による抗真菌剤の選抜法にある。２ハイブリッド法においては、物理 的に相互作用する２種の被験タンパク質またはタンパク質ドメインを２つの非相 同ドメインに別々に融合させる。該非相同ドメインとしては、サッカロミセス属 の菌から得られるＧＡＬ４タンパク質等のタンパク質のＤＮＡ−結合性ドメイン および転写活性ドメインが例示されるが、これらのドメインは、２種の被験タン パク質またはタンパク質ドメインが実験条件下での相互作用によって接近すると 検出可能なシグナル、例えば、レポーターポリペプチドの合成シグナルを発生す る。本発明においては、相互作用する翻訳成分ドメインの一方もしくは両方の大 きさを、相互作用に必要な最小フラグメントが得られるまで欠失によって低減さ せる。好ましい態様においては、この小さなペプチドを当業者には既知の方法に よって増幅させた後、生体外での翻訳と生体内での抗真菌活性に対する該ペプチ ドの抑制能を調べる。より好ましい態様においては、小さな抑制性ペプチドを薬 剤の設計研究のモデル化合物として用いる。 この方法の第二の態様においては、２つの相互作用するドメインの一方をＤＮ Ａ−結合性ドメインまたは転写−活性ドメインから分離させ、これを当業者に既 知の方法によって突然変異させ、次いで調節可能なプロモーターの制御下におい て別々に導入する。突然変異コピーを選抜処理に付すことによって、野生型ドメ インの相互作用に対して最も強力な阻害能を発揮する誘導体を見出すことができ る。このような誘導体は当業者に既知の方法で増幅させた後、生体外での翻訳抑 制と生体内での抗真菌活性に関する試験に供する。 この方法の第三の態様においては、被験化合物のライブラリーを、生体外(よ り好ましくは生体内)での２種のドメインの相互作用の阻害能に関する選抜処理 に付す。 「２ハイブリッド法」は次の報文に記載の方法であって、問題となるタンパク質 (このタンパク質に対する遺伝子はクローン化される)と相互作用する未知のタン パク質(このタンパク質に対する遺伝子はプラスミドライブラリー内にある)を同 定するための方法である:[チェン、バーテル、ステルングランツおよびフィール ズ、「２ハイブリッド系:問題となるタンパク質と相互作用するタンパク質に対す る遺伝子を同定してクローン化する方法」、Ｎatl．Ａcad、Ｓci．、第８８巻、 第９５７８頁〜第９５８２頁(１９９１年)]。この種の未知のタンパク質を同定 する方法は当業者には周知である。この方法を薬剤の発見のために利用すること は、この報文の著者によって意図されている用途とは著しく相違するものであり 、また、この報文にはこのような利用法は全く教示されていない。 Ａ．２ハイブリッド系を用いる選抜 本発明に有用なプロトコルの概要は次の通りである:１)物理的に相互作用する ２種の真菌もしくは細菌の翻訳成分に対するクローン化遺伝子を用いて操作を開 始し、２)誘発性プロモーターの制御下において一方の成分をＧＡＬ４ ＤＮＡ− 結合性ドメインに付着させ、他方の成分を誘発性プロモーターの制御下でＧＡＬ ４転写活性ドメインに付着させ、３)転写活性に対する選抜によってこれらの成 分が相互作用するかどうかを調べ、４)翻訳成分の大きさを最小の機能性フラグ メントが得られるまで低減させ、５)最小フラグメントを化学的に修飾すること によってその効力を増大させ、次いで６)上記３)の転写活性を妨げる化合物を選 抜する。 １２．ミトコンドリアのタンパク質合成の抑制 ミトコンドリア翻訳と細胞質翻訳は、後者の強力なインヒビターであるシクロ ヘキシドを用いることによって区別できる。細胞培養物を約１×１０⁷〜５×１ ０⁷細胞／mlまで増殖させた後、シクロヘキシミドを５mg／lの濃度で添加する。 ３０分後、培養物をアリコートに分割し、これらのアリコートを被験化合物と混 合する。さらに３０分経過後、放射性アミノ酸を添加し、培養物をさらに１時間 インキュベートする。冷却したトリクロロ酢酸を最終濃度が１０％になるまで添 加し、試料を４℃で２０分間インキュベートした後、遠心分離処理に付す。ペレ ットを約０.２mlのアセトンを用いて３回洗浄した後、残存放射能濃度を液体シ ンチレーション計数器を用いて測定する。このプロトコルによれば、組み込まれ ない放射性アミノ酸を除去すると共に、ミトコンドリアのタンパク質合成作用に よってポリペプチド内に取り込まれた放射性アミノ酸を保持することができる。 ミトコンドリアのタンパク質合成に対するインヒビターによって、このプロトコ ルの最終段階に存在する放射能の量を低減させることができる。 １３．被験生物体の有用性を向上させる方法 この発明は、標的となる細胞もしくは生物体を被験化合物の浸透を受けやすく することによって有用な作因の選択効率を増大させる新規な方法が提供される。 好ましい態様においては、この方法には、外因性の添加化合物に対して自然の正 味の透過障壁を付与する遺伝子生産物を同定することおよびこれらの生産物をコ ードする遺伝子を除去することが含まれ、これによってより多くの化合物と少量 の多くの化合物に対して感受性のある細胞系が生産される。 一つの態様においては、翻訳インヒビターを同定するための標的細胞としてサ ッカロミセス・セレビシエ酵母菌を使用するが、その他のタイプの細胞や生物体 もこのような目的のために使用できる。例えば、特に限定的ではないが、次に例 示するものを用いて翻訳抑制性化合物だけでなく、細胞内標的に作用する他の治 療剤を同定することができる:その他の真菌、細菌、アメーバ、焔色植物、変形 体、変形体細胞系、線虫、線虫細胞系、昆虫、昆虫細胞系、緑色植物、緑色細胞 系、動物、動物細胞系、腫瘍、腫瘍細胞系。 遺伝学的に透過性の増大した標的生物体に有効な有用なリード化合物を同定し たならば、該化合物が元の標的生物体に対して有効であるかどうかを試験する。 元の標的生物体がリード化合物に対して低透過性または非透過性を示すときであ っても、該化合物は当業者には周知の方法によって合理的に修飾することにより 、その有用な治療特性を損うことなくその透過能を改良することができる。 この態様においては、サッカロミセス属の菌の細胞が遺伝子生産物のネットワ ークによって提供される正味の透過障壁を利用して全細胞抽出物中で必須の生化 学反応を抑制し得る多数の化合物に対して不完全または完全な耐性を示すという 知見を利用する。さらに、酵母菌細胞を増殖抑制性化合物の存在下で増殖させる 場合には、該細胞は、構造または標的の点で関連性のない多数の化合物に対して 予想外の交差抵抗性を示す耐性細胞に頻繁に突然変異する。 この現象は文献においては「多面的薬剤抵抗性」(ＰＤＲ)と呼ばれており、該現 象には、哺乳類の細胞、変形体およびその他の生物体において観察されている「 多剤耐性」(ＭＤＲ)現象の場合と多くの類似性がみられる。ＰＤＲ遺伝子、例え ばＰＤＲ１またはＰＤＲ５が欠失された細胞はこれらの化合物に対して過敏にな る[バルジ(Ｅ.Ｂalzi)およびゴフォー(Ａ.Ｇoffeau)、Ｂiochim．Ｂiophys．Ａc ta、第１０７３巻、第２４１頁〜第２５２頁(１９９１年)およびそこに引用され ている文献参照]。薬剤の発見という見地からは、この基本的なＰＤＲ現象は非 能率的であるが、これは多くの潜在的に有用な化合物が細胞内に蓄積されないた めに選抜過程で見落とされるからである。これらのＰＤＲ(またはＭＤＲ)遺伝子 をゲノムから系統的に欠失させることによってより効果的な薬剤発見アッセイが 得られ、このようなアッセイは本発明による翻訳遮断剤アッセイ、他の生化学的 標的を使用する酵母菌による他のアッセイまたはいずれかの細胞内標的を使用す る酵母菌による別のアッセイである。これらの過透過性生物体を用いてリード化 合物が同定されたならば、野生型生物体に対するその有効性(透過能)は化学的修 飾によって改良することができる。 多面的遺伝子抵抗性を付与する遺伝子は酵母菌においては少なくとも１２種知 られており、この種の遺伝子としては、特に限定的ではないが、次のものが例示 される:ＰＤＲ１、ＰＤＲ２、ＰＤＲ３、２種の異なる遺伝子ＰＤＲ４(このうち の一方はＹＡＰ１として知られている)、ＰＤＲ５、ＰＤＲ６、ＰＭＡ１、ＣＰ Ｒ１ 、ＳＴＥ６[バルジおよびゴフォー、Ｂiochim．Ｂiophys．Ａcta、第１０７ ３巻、第２４１頁〜第２５２頁(１９９１年)およびそこに引用されている文献参 照]、および標的と構造の点で関連のない１種以上の化合物に対する耐性または 感受性を増大させるように変性できるその他のいずれかの遺伝子。薬剤発見アッ セイの効率を増大させる前記利点を得るためには、これらの遺伝子のいずれかも しくは全ての遺伝子および文献に記載されていない遺伝子や現時点では未知の遺 伝子は当業者には周知の方法によってゲノムから欠失させることができる。 「ＰＤＲ」遺伝子または「ＭＤＲ」遺伝子は、構造的には明らかに関連のない２種 またはそれ以上の低分子に対する細胞の正味の透過障壁を生体内で増大させる作 用をするポリヌクレオチドもしくはポリペプチドをコードするいずれかの遺伝子 を意味する。構造的には明らかに関連のない２種またはそれ以上の低分子に対す る細胞の正味の透過障壁を生体内で低減させる作用するポリヌクレオチドもしく はポリペプチドをコードする遺伝子も、遺伝子生産物の多発現によって該化合物 に対する該細胞の感受性がより高くなるならば、「ＰＤＲ」遺伝子または「ＭＤＲ」 遺伝子と考えることができる。 本願で概説した実施例においては、「ＰＤＲ４」は、ジェンバンクの登録番号Ｘ ５３８３０内に記載されている遺伝子を指定するために用いる。 「正味の透過障壁」は、活性形態の外因性添加化合物の細胞境界内部への蓄積に 対する障壁を意味する。この蓄積に対する障壁は該化合物に対する実際の障壁ま たは該化合物の遮断に起因させることができ(該化合物は細胞境界を横断しない) 、または速度論的障壁に起因させることができる(該化合物は細胞境界を横断す る)。しかしながら、該障壁は細胞から速やかに排除するか、または細胞内にお いて速やかに封鎖するかもしくは不活性化させることによって、該化合物がその 細胞内標的と相互作用する機会をなくすか、または該化合物とこれらの障壁との 結合を 防止する。この定義には酵素、例えば、特に限定的ではないが、グルタチオン− Ｓ−トランスフェラーゼ、シトクロムＰ−４５０sおよびモノオキシゲナーゼ等 も含まれる。この種の酵素は比較的非特異的に種々の化合物を化学的に不活性化 させる[例えば次の文献参照:ワックスマン(Ｄ.Ｊ.Ｗaxman)、サンドセス(Ｓ.Ｓ. Ｓundseth)、スリバスタバ(Ｐ.Ｋ.Ｓrivastava)およびラペンソン(Ｄ.Ｐ.Ｌapen son)、「アルファ、ミュー、パイおよびミクロソーム ラット グルタチオン−Ｓ −トランスフェラーゼ:肝酵素インデューサーおよび白金抗癌剤による肝トラン スフェラーゼ発現と調節の分析」、Ｃancer Ｒes.、第５２巻、第５７９７頁〜 第５８０２頁(１９９２年);エバーハルト(Ｄ.Ｃ.Ｅberhart)、ゲムジク(Ｂ.Ｇem zik)、ハルボルソン(Ｍ.Ｒ.Ｈalvorson)およびパーキンソン(Ａ.Ｐerkinson)、「 毒性およびジギトキシンのシトクロムＰ４５０IIIＡ−依存性代謝における種差」 、Ｍol.Pharmacol．、第４０巻、第８５９頁〜第８６７頁(１９９１年);ヒュト ソン(Ｄ.Ｈ.Ｈutson)およびロガン(Ｃ.Ｊ.Ｌogan)、「ラット、ラビットおよびヒ トの肝酵素による有機リン殺虫剤クロルフェンビンホスの解毒」、Ｘenobiotjca 、第１６巻、第８７頁〜第９３頁(１９８６年);ミランダ(Ｃ.Ｌ.Ｍiranda)、チ ャン(Ｗ.Ｃhung)、リード(Ｒ.Ｅ.Ｒeed)、ツァオ(Ｘ.Ｚhao)、ヘンダーソン、フ ァン、ウィリアムズおよびビューラー、「フラビン含有モノオキシゲナーゼ:テン ジクネズミの組織中のピロリジジンアルカロイドセネシオニンに対する主要な解 毒酵素」、Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.、第１７８巻、第５４６頁〜第５２ ２頁(１９９１年)。 実施例１０:薬剤選抜用の改良酵母菌株 サッカロミセス・セレビシエの菌から遺伝子ＰＤＲ１およびＰＤＲ４を欠失さ せた。ＰＤＲ１およびＰＤＲ４に対するＤＮＡ配列はジェンバンクのデータベー スにＪ０３４８７およびＸ５３８３０としてそれぞれ登録されている。これらの 遺伝子のいずれも以下の平行処理によって欠失される。各々の遺伝子に対しては ４種のオリゴヌクレオチド(オリゴ)を合成した。即ち、ＰＤＲ１に対しては、オ リゴＰＤＲ１−１[ggg cat gcＡ ＣＧＣ ＣＡＡ ＡＣＧ ＡＴＣ ＧＣＧ(Ｓ ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．:７)、ヌクレオチド３４〜４９]、オリゴＰＤＲ１−２[ggg gat cc Ａ ＧＣＣ ＴＣＧ ＣＡＴ ＣＴＣ ＣＡＧ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．： ８)、ヌクレオチド４６６〜４５１に対する補体]、オリゴＰＤＲ１−３[gga ga t cＴ Ａ ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＣＧ ＡＣＧ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．： ９)、ヌクレオチド３６１５〜３６３１]およびオリゴＰＤＲ１−４[ggg aat tc Ａ ＴＧＧ ＴＧＧ ＣＧＡ ＧＡＣ ＧＧＧ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．:１０)、 ヌクレオチド４１３６〜４１２１に対する補体]を合成し、またＰＤＲ４に対し ては、オリゴＰＤＲ４−１[ggg cat gcＡ ＡＧＴ ＡＣＧ ＧＧＡ ＡＣＧ ＡＧＧ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．:１１)、ヌクレオチド１１６８〜１１９３]、オリ ゴＰＤＲ４−２[ggg gat ccＡ ＧＣＧ ＡＣＣ ＴＣＴ ＴＧＧ ＣＧＧ(Ｓ ＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．:１２)、ヌクレオチド１６５９〜１６４４に対する補体]、 オリゴＰＤＲ４−３[gga gat ctＧ ＴＴＣ ＣＡＴ ＣＴＡ ＡＧＧ ＡＡ Ｇ Ｇ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．:１３)、ヌクレオチド３３９２〜３４０８]および オリゴＰＤＲ４−４[ＧＧＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＴＡＣ ＡＴＡ ＧＴＣ ＴＡ Ａ ＡＴＡ ＴＡＴ ＴＴＡ(ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．:１４)、ヌクレオチド３７ ６１〜３７３４に対する補体]を合成した(制限酵素の部位は下線で示し、未変性 のＤＮＡ配列は大文字で示し、ナンバリングはジェンバンクのファイルに従った )。 各々のオリゴヌクレオチド対(ＰＤＲ１−１／１−２、ＰＤＲ１−３／１−４ 、ＰＤＲ４−１／１−２およびＰＤＲ４−３／４−４)を使用し、酵母菌のゲノ ムＤＮＡからの各々のＰＤＲ遺伝子のフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応によ って増幅させた後、ＰＣＲフラグメントのクローン化用に調製したベクター[イ ンビトロゲン社(Ｉnvitrogen Ｉnc．)製のＴＡクローン化キット]に直接結合さ せた。これらのフラグメントは次の様にしてベクターpＮＫ２９４[アラニ(Ｅ.Ａ lani)、カオ(Ｌ.Ｃao)およびクレックナー(Ｎ.Ｋleckner)、Ｇenetics)第１１６ 巻、第５４１頁〜第５４５頁(１９８７年)]とサブクローン化した。オリゴＰＤ Ｒ１−１／１−２を用いて調製したＰＣＲフラグメントを制限酵素SphＩおよびＢam ＨＩで消化させた後、プラスミドpＮＫ２９４の同じ部位にサブクローン化 した。これと平行して、オリゴＰＤＲ４−１／４−２を用いて調製したＰＣＲフ ラグメントについて同じ処理をおこなった。サブクローンを確認した後、オリゴ ＰＤＲ１−３／１−４を用いて調製したＰＣＲフラグメントを同じ酵素を用いて 消化させた後、ＥcoＲＩおよびＢglII抑制部位にサブクローン化した。これと平 行して、オリゴＰＤＲ４−３／４−４を用いて調製したＰＣＲフラグメントにっ いて同じ処理をおこなった。この時点において、両方のプラスミドはＰＤＲ遺伝 子の遮断コピー(interrupted copy)を有するＤＮＡフラグメントを保有し、該 遺伝子の中央部は、大腸菌のhisＧ遺伝子からの１１５０bpフラグメントの２つ のリピートが隣接した酵母菌のＵＲＡ３遺伝子を有するカセットによって置換さ れた。 pdrl欠失／***対立遺伝子は制限酵素SphＩおよびＥcoＲＩを用いてそのプラ スミドから切除し、そのフラグメントを用いてプロトトロフィーに対する選択に より、ＵＲＡ３機能遺伝子を有さない酵母菌株を形質転換させた。得られたＵra 形質転換体をサザンブロット法またはＰＣＲアッセイによってチェックし、内 因性ＰＤＲ１遺伝子が相同組換えによって欠失／***対立遺伝子によって置換さ れたことを確認した。Ｕra 形質転換体をウラシルと５−フルオロ−オロト酸( ５−ＦＯＡ)を含有する培地上で増殖させた後、ＵＲＡ３遺伝子によってコード された酵素を用いて毒性代謝物に転化させ、該遺伝子の欠損を選択する。ＵＲＡ ３ 遺伝子の欠損は、相同組換え用基質を提供するhisＧＤＮＡリピートの存在に よって促進され、ＰＤＲ１遺伝子の中央部には該リピートの１つのコピー残存す る。このプロセスは、得られたpdr１ ura３二重変異体を類似のpdr４欠失／*** 対立遺伝子を用いて形質転換させることによって繰り返した。このようにして、 多面的薬剤抵抗性を付与する遺伝子の一部または全部を同じ細胞系から除去する ことができる。 １４．推定上の抗真菌剤の効能試験 推定上の抗真菌性化合物の効能試験法について説明する。最初に、当業者に既 知の方法により、サッカロミセス属の菌抽出物中での生体外翻訳に対する被験化 合物の効果を調べる。特定のリッチ培地、動物モデルおよび規制臨床研究におけ る医療的または商業的により関連性の強い真菌の増殖に対する被験化合物の抑制 効果を当業者に既知の方法であって、食品医薬品局によって許可されている方法 、例えば、特に限定的ではないが、Ｔhe Ｆedral Ｒegister、第４７巻(第５ ６号)、第１２５５８頁〜第１２５６４頁(１９８２年３月２３日)に公表されて いる方法によって調べる。 １５．推定上の抗真菌剤の試験 上記のいずれかの方法において活性を示す化合物がヒトの細胞系の翻訳機構に 対してほとんどまたは全く影響を及ぼさずかつヒトの細胞に対して毒性がないか どうかを調べると共に、該化合物が生体内条件下で活性を示すかどうかを調べる 方法を説明する(上記文献参照)。該化合物は、標準的な生体外試験に有用な薬学 的に許容される１または複数の緩衝液に配合する。 「薬学的に許容される緩衝液」とは、薬学的に許容されるキャリヤーもしくは希 釈剤に薬学的に有効量の本明細書に記載の作因を含有する貯蔵後に投与される薬 剤組成物の成分として使用できるいずれかの緩衝液を意味する。治療用に許容さ れるキャリヤーもしくは希釈剤は薬学の分野においては周知であり、例えば、「 レミングトンの薬物科学」[ジェンナロ(Ａ.Ｒ.Ｇenllaro)編、マック・パブリッ シング社(Ｍack Ｐublishing Ｃo.)１９８５年発行]に記載されている。薬剤 組成物には防腐剤、安定剤、色素および香料を配合してもよい。例えば、安息香 酸ナトリウム、ソルビン酸およびp−ヒドロキシ安息香酸を防腐剤として添加し てもよく、また、酸化防止剤や沈殿防止剤を配合してもよい(該文献参照)。 Ａ．毒性に対する補足的選抜:方法１ 抗真菌活性を有するものとして同定された化合物のヒト培養細胞に対する毒性 について評価する。この評価は、生存細胞がＸＴＴと呼ばれる次の化合物の還元 能を有することに基づく:２,３−ビス[２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホ ニルフェニル]−５−[(フェニルアミノ)カルボニル]−２Ｈ−テトラゾリウムヒ ドロキシド][ポウルら、Ｊ.Ｈeterocyl．Ｃhem．、第２５巻、第７６３頁〜第７ ６７頁(１９８７年);ワイスロウら、Ｊ.Ｎatl．Ｃanc．Ｉnst．第８１巻、第５ ７７頁(１９８９年)]。哺乳類の生存細胞はＸＴＴのテトラゾール環中のＮ−Ｎ 結合を還元的に切断してＸＴＴホルマゾンを生成する。死細胞またはエネルギー 代謝を損なった細胞はこのような開裂反応をもたらさない。この開裂度は被験生 存細胞の数に比例する。ヒトの細胞系からの細胞、例えば、ＨeLa細胞を、９６ 個のウェルを有するマイクロタイター板の各ウェルに０.１ml入れた細胞培養培 地(ウシ胎児血清を１０％補充したドゥルベッコの変性最少必須培地)に接種する (１０³細胞／ウェル)。このマイクロタイター板を空気９５％とＣＯ₂５％から成 る雰囲気中、３７℃での培養処理に付すことによって細胞を該板に付着させる。 培養を一夜おこなった後、被験化合物の溶液をウェル中に２倍添加する(濃度は ５対数希釈度８に相当する)。平行して、被験化合物を溶解させるのに用いる溶 剤を別のウェルに２倍添加する。細胞培養を所定時間(一般的には２４時間)続行 した後、ＸＴＴ溶液とカプラー(メチルフェナゾニウムスルフェート)を各ウェル に添加し、４時間インキュベートした後、各ウェルの内容物の光学濃度を自動化 プレートリーダー(plate reader)内において４５０nmで測定する。哺乳類の細 胞の死滅、該細胞の死滅、該細胞のエネルギー代謝の欠損または該細胞の増殖抑 制をもたらす化合物は、被験化合物を添加しないウェルの場合に比べて４５０nm における光学濃度が低下することによって検出される。 Ｂ．毒性の補足的選抜:方法２ ヒトの培養細胞系に対する抗真菌性化合物の細胞毒性効果を、細胞生存度の指 標としてのタンパク質への³⁵Ｓメチオニンの取り込みを利用して調べる。ＨeＬa 細胞を、ウシ胎児血清１０％およびペニシリンとストレプトマイシン５０μg／m l補充したドゥルベッコ最少必須培地を０.１ml入れた９６個のウェル中で増殖さ せる。細胞はウェルあたり１０³個接種する。細胞を抗真菌剤の不存在下で４８ 時間増殖させた後、培地を除去し、完全培地を用いて調製した抗真菌剤の種々の 希釈液を各ウェルに添加する(但し、対照ウェルには該希釈液は添加しない)。細 胞をさらに４８〜７２時間インキュベートする。培地は２４時間毎に、同濃度の 抗真菌剤を含有する新鮮な培地と交換する。次いで培地を抗真菌剤を含有しない 完全培地と交換する。抗真菌剤の不存在下で細胞を２４時間インキュベートした 後、³⁵Ｓをタンパク質へ取り込むことによって細胞の生存度を測定する。培地を メチオニン不含完全培地と交換し、３０分間インキュベートする。培地を、³⁵Ｓ メチオニンを０.１μＣi／ml含有する完全培地と交換し、３時間インキュベート する。ウェルをＰＢＳ中で３回洗浄した後、１００％メタノールを添加し、細胞 を透過処理に１０分間付す。氷冷した１０％クロロ酢酸(ＴＣＡ)をウェルを満た すまで添加し、氷上で５分間インキュベートした後、ＴＣＡを用いて２回以上洗 浄する。ウェルをメタノールで洗浄した後風乾させる。シンチレーション反応混 液５０μlを各ウェルに添加した後、遠心分離による乾燥処理をおこなう。処理 板に対してＸ線フィルムを露出させる。抗真菌剤不含ウェルを含むオートラジオ グラムのデンシトメーター走査によって、細胞の５０％が生存できない用量(Ｉ Ｄ₅₀)を決定する[イーアン・フレッシュネイ(Ｒ.Ｉan Ｆreshney)、「動物細胞の 培養。基礎技術マニュアル]、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(ニューヨー ク)１９８７年発行]。 １６．抗真菌剤の投与 本発明の一つの特徴は、真菌の増殖に必要な１または複数の真菌ＲＮＡの翻訳 を選択的に阻害し得る抗真菌剤を被験体に有効治療量投与することによって、真 菌に感染した被験体を処置する方法にある。投与は当業者に既知のいずれかの方 法、例えば局所的塗布または全身投与等によっておこなうことができる。さらに 、本発明による抗真菌剤は真菌に感染した商品、例えば、木材、金属およびプラ スチック等の処理にも使用できる。処理法としては、特に限定的ではないが、抗 真菌剤を感染商品に噴霧、散布および含浸させる方法等が例示される。前述のよ うに、本発明による抗真菌剤は、当業者に周知の一般的な科学的アッセイにも有 用である。 「有効治療量」とは、患者の病気または疾患の１または複数の症状をある程度軽 減させる量を意味する。さらに、「有効治療量」とは、真菌による病気または疾患 と関連があるか、またはこれらの原因となる生理学的また生化学的パラメーター を部分的または完全に正常な状態に復帰させる量を意味する。一般的には、その ＥＣ₅₀並びに患者の年令、体重および病状に応じて約１ナノモル〜１マイクロモ ルの間で変化する。 １７．本発明方法によって同定される抗真菌剤 本発明の１つの特徴は、前記の方法によって発見される新規な抗真菌剤にある 。また本発明には、前記のようにして発見される抗真菌剤を薬学的に許容される 製剤中に配合することによって調製される新規な薬剤組成物が含まれる。 １８．パッケージ化キット 本発明の一つの特徴は、レポーターをコードする配列に転写的または翻訳的に 結合された真菌核酸を含有する核酸構築物(mucleic acid construct)を抗真菌 剤の発見に使用する方法および該構築物を抗真菌剤の選抜法で使用するためのキ ットにある。 その他の態様は以下の請求の範囲内にある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の過程（ｉ）〜（iii）を含む真菌細胞翻訳インヒビターの選抜法： （ｉ）真菌細胞系の全翻訳量が低減したときに、全細胞翻訳量の百分率として表 示されるレポーター遺伝子の発現度を増大させるように構築配列された配列に翻 訳的に結合したレポーター遺伝子を含む真菌細胞系を準備し、 （ii）真菌の翻訳に対して潜在的なインヒビターと該真菌細胞系を接触させ、次 いで （iii）該レポーター遺伝子の発現度を測定する（この場合、該潜在的インヒビ ターの存在下での全細胞翻訳量の百分率としての発現度が、該潜在的インヒビタ ーの不存在下での発現に比べて増大することは、該インヒビターが真菌翻訳の有 効なインヒビターであることを示す）。 ２．配列が、サッカロミセス・セレビシエ ＧＣＮ４−型遺伝子が結合した配 列である請求項１記載の方法。 ３．細胞系が真菌全細胞である請求項１記載の方法。 ４．細胞系が真菌細胞抽出物である請求項１記載の方法。 ５．特定条件下での真菌細胞の増殖能の測定を含む請求項３記載の方法。 ６．レポーター遺伝子の発現が真菌細胞の検出可能な増殖に要求される請求項 ３記載の方法。 ７．レポーター遺伝子がアミノ酸合成に必要な酵素をコードする請求項５また は６記載の方法。 ８．レポーター遺伝子が真菌細胞増殖培地内の作因に対する耐性をコードする 請求項３記載の方法。 ９．レポーター遺伝子が、真菌細胞系の増殖に条件付で必要な遺伝子の栄養緩 徐な対立遺伝子をコードする請求項１記載の方法。 １０．栄養緩徐な対立遺伝子がhisl−２９である請求項９記載の方法。 １１．レポーター遺伝子の遺伝子生産物の酵素活性を測定することを含む請求 項３または４記載の方法。 １２．レポーター遺伝子の遺伝子生産物の発現を放射線写真法、蛍光写真法、 免疫学的方法またはこれらと類似の方法によって測定する請求項３または４記載 の方法。 １３．真菌細胞系が、サッカロミセス・セレビシエ ＧＣＮ２−型遺伝子また は該遺伝子の遺伝子生産物を不活性化する該遺伝子内での変異体をさらに含有す る請求項１記載の方法。 １４．真菌細胞系が、該細胞系の全翻訳量が低減したときに、全翻訳量と共に 第２のレポーター遺伝子の発現度が低減するように構築配列された第２の配列に 翻訳的に結合した第２のレポーター遺伝子をさらに含み、また、第２のレポータ ー遺伝子の発現度を測定して第１のレポーター遺伝子と第２のレポーター遺伝子 の発現度を潜在的インヒビターの有効性の尺度として比較することを含む請求項 １記載の方法。 １５．第１のレポーター遺伝子と第２のレポーター遺伝子がそれぞれ異なった 酵素をコードする請求項１４記載の方法。 １６．真菌細胞系を、真菌翻訳のインヒビターの存在下で毒性が低減する毒性 剤と接触させることをさらに含む請求項１記載の方法。 １７．毒性剤がアミノ酸類似体である請求項１６記載の方法。 １８．アミノ酸類似体が３−アミノトリアゾールである請求項１７記載の方法 。 １９．アミノ酸類似体が５−フルオロトリプトファンである請求項１７記載の 方法。 ２０．毒性剤がプリン類似体である請求項１６記載の方法。 ２１．レポーター遺伝子が、該レポーター遺伝子の発現度の測定を可能にする 第２遺伝子の発現を促進する請求項１記載の方法。 ２２．第２遺伝子が、ＧＣＮ４−結合配列の１または２以上のコピーと融合し た遺伝子を含む請求項２１記載の方法。 ２３．第２遺伝子が、ＧＣＮ４−結合配列の１または２以上のコピーと融合し たＣＹＣ１−１acＺ融合遺伝子を含有する請求項１８記載の方法。 ２４．下記の過程(ｉ)〜(iii)を含む真菌細胞翻訳のインヒビターの選抜法： (ｉ)真菌細胞系の全翻訳量が低減したときに、全転写量に対するレポーター遺伝 子の転写度を増大させるように構築配列された配列に転写的に結合したレポータ ー遺伝子を含む真菌細胞系を準備し、 (ii)該真菌細胞系を真菌細胞翻訳の潜在的インヒビターと接触させ、 (iii)レポーター遺伝子の遺伝子生産物の合成度を測定する（この場合、潜在的 インヒビターの存在下での合成度が、該潜在的インヒビターの不存在下での合成 度に比べて増大することは、該インヒビターが真菌翻訳の有効なインヒビターで あることを示す）。 ２５．配列が、リボソームタンパク質・コード化遺伝子のプロモーターまたは リボソームＲＮＡ・コード化遺伝子を含む請求項２４記載の方法。 ２６．配列がＲＰＬ１６Ａ−型遺伝子からのプロモーターを含む請求項２４記 載の方法。 ２７．真菌細胞系を作因と接触させるか、または真菌細胞をアミノ酸を制限す る条件下におくことによって、該真菌細胞系内で緊縮応答を惹起させることをさ らに含む請求項２４記載の方法。 ２８．該作因が３−アミノ−１,２,４−トリアゾールである請求項２７記載の 方法。 ２９．真菌細胞系が、欠損ＧＣＮ−型遺伝子を有する全真菌細胞である請求項 ２４記載の方法。 ３０．レポーター遺伝子が、真菌細胞の増殖に必要な酵素をコードする請求項 ２４記載の方法。 ３１．欠損ＧＣＮ−型遺伝子がgcn２である請求項３０記載の方法。 ３２．欠損ＧＣＮ−型遺伝子がgcn４である請求項３０記載の方法。 ３３．レポーター遺伝子が、アミノ酸合成に必要な酵素をコードする請求項３ ０記載の方法。 ３４．レポーター遺伝子がＨＩＳ３である請求項３０から３３いずれかに記載 の方法。 ３５．第２レポーター遺伝子が、真菌細胞系の翻訳のインヒビターの存在下で の第２レポーター遺伝子の遺伝子生産物の合成度を増大させない第２配列に転写 的に結合しており、また、第２レポーター遺伝子の遺伝子生産物の合成度を測定 し、潜在的インヒビターの有効性の尺度としての第１レポーター遺伝子と第２レ ポーター遺伝子の遺伝子生産物の合成度を比較することをさらに含む請求項２４ 記載の方法。 ３６．第１レポーター遺伝子が、酵素アッセイによって検出可能な酵素をコー ドする第２レポーター遺伝子に作用する請求項２４記載の方法。 ３７．第２レポーター遺伝子によってコードされる酵素がβ−ガラクトシダー ゼである請求項３５記載の方法。 ３８．下記の過程（ｉ）および（ii）を含む真菌細胞翻訳のインヒビターの選 抜法： (ｉ)単一の翻訳成分を多発現もしくは少発現し得るか、または該翻訳成分の欠損 変異体を発現し得る１または２以上の同質遺伝子型真菌細胞系を準備し、 (ii)真菌細胞翻訳のインヒビターの存在下での１または２以上の各々の該真菌細 胞系の増殖または活性を測定する（この場合、１または２以上の該真菌細胞系の 増殖または活性の差異は、潜在的インヒビターが真菌翻訳の有効なインヒビター であることを示す）。 ３９．細胞系が全真菌細胞である請求項３８記載の方法。 ４０．細胞系が真菌細胞の抽出物である請求項３８記載の方法。 ４１．下記の過程(ｉ)〜(iii)を含む真菌細胞翻訳を妨げる化合物の選抜法： (ｉ)第２終止コドンの第１終止コドン５′を有するmＲＮＡをコードする遺伝子 を含む真菌細胞系を準備し（この場合、第１終止コドンでの終結によって第１終 止コドンタンパク質が生成し、該タンパク質は、第２終止コドンでの終結によっ て生成される第２終止コドンタンパク質と容易に区別できる）、 (ii)該細胞系を、真菌細胞翻訳を潜在的に妨げ得る化合物と接触させ、 (iii)該第２終止コドンタンパク質の発現度を測定する（この場合、該化合物の 存在下での発現度が、該化合物の不存在下での発現度に比べて増大することは、 該化合物が真菌細胞翻訳を妨げるのに有効であることを示す）。 ４２．第２終止コドンタンパク質が酵素であるか、または細胞増殖物に生存機 能を付与する請求項４１記載の方法。 ４３．酵素が分泌酵素である請求項４２記載の方法。 ４４．分泌酵素がＰＨＯ５の生産物である請求項４３記載の方法。 ４５．真菌細胞系が真菌細胞である請求項４１記載の方法。 ４６．真菌細胞がサッカロミセス・セレビシエ細胞である請求項４５記載の方 法。 ４７．下記の過程(ｉ)〜(iii)を含む真菌細胞翻訳を妨げ得る化合物の選抜法 ： (ｉ)タンパク質をコードする遺伝子を含む真菌細胞系を準備し(この場合、該遺 伝子は終止コドンの翻訳フレームシフトシグナル５′を有するmＲＮＡをコード し、該フレームシフトシグナルによる翻訳によって、フレームシフトによらずに 生産される第２タンパク質と異なる第１タンパク質が生産される)、 (ii)該真菌細胞系を、真菌細胞翻訳を潜在的に妨げ得る化合物と接触させ、 (iii)該第１タンパク質の発現度を測定する（この場合、該化合物の存在下での 発現度が、該化合物の不存在下での発現度に比べて増大または減少することは、 該化合物が真菌細胞翻訳を妨げるのに有効であることを示す）。 ４８．第１タンパク質と第２タンパク質の発現度を測定する請求項４７記載の 方法。 ４９．第２タンパク質が酵素であるか、または細胞増殖物に生存機能を付与す る請求項４７または４８記載の方法。 ５０．酵素が分泌酵素である請求項４９記載の方法。 ５１．分泌酵素がＰＨＯ５の生産物である請求項５０記載の方法。 ５２．下記の過程(ｉ)および(ii)を含む真菌細胞翻訳を阻害し得るキナーゼを 活性化する化合物の選抜法： (ｉ)該キナーゼを潜在的に活性化し得る化合物および毒性アミノ酸もしくはプリ ン類似体を含有する培地中で真菌細胞系を増殖させ、 (ii)該細胞系の増殖量を測定する（この場合、増殖量の増大は該化合物が真菌細 胞翻訳の有効なインヒビターであることを示す）。 ５３．キナーゼがＧＣＮ２−型キナーゼである請求項５２記載の方法。 ５４．毒性アミノ酸類似体が５−フルオロトリプトファンである請求項５２記 載の方法。 ５５．該化合物が、該キナーゼと拮抗する機能体を阻害する作用をする請求項 ５２から５４いずれかに記載の方法。 ５６．機能体がホスファターゼである請求項５５記載の方法。 ５７．機能体が、普通はキナーゼによって阻害される翻訳成分である請求項５ ５記載の方法。 ５８．翻訳成分がeＩＦ−２またはeＩＦ−２Ｂである請求項５７記載の方法。 ５９．該細胞系が哺乳類のＧＣＮ−型キナーゼＤＡＩの対立遺伝子を生産する 請求項５６から５８いずれかに記載の方法。 ６０．下記の過程(ｉ)および(ii)を含む、真菌細胞の増殖に必要なキナーゼの 活性化因子であって真菌細胞翻訳を阻害し得る活性化因子の生体外選抜法： (ｉ)該キナーゼをその潜在的活性化因子と接触させ、 (ii)該キナーゼの活性を測定する（この場合、活性の増大は、該潜在的インヒビ ターが真菌細胞翻訳の有効なインヒビターであることを示す）。 ６１．キナーゼがＧＣＮ２型キナーゼである請求項６０記載の方法。 ６２．下記の過程(ｉ)および(ii)を含むキナーゼを阻害する化合物の選抜法（ この場合、真菌細胞の増殖には低濃度のキナーゼが必要であるが、真菌細胞の増 殖の阻害には高濃度のキナーゼが必要である）： (ｉ)該キナーゼの構成的に活性化された対立遺伝子を有する真菌細胞系を、該キ ナーゼの潜在的インヒビターを含有する培地中で増殖させ（該対立遺伝子は、正 常な対立遺伝子に比べて真菌細胞系に対する増殖効果は劣る）、 (ii)該細胞系の増殖量または活性を測定する（この場合、該潜在的インヒビター の存在下での増殖量または活性の増大は、該潜在的インヒビターが真菌細胞増殖 のインヒビターとして有用であることを示す）。 ６３．該細胞系が、ＧＣＮ２−型遺伝子の構成的に活性化された対立遺伝子を 生産する請求項６２記載の方法。 ６４．該細胞系が、ＧＣＮ２−型遺伝子によって正に調節されると共に毒性ま たは条件付で毒性の生産物を生産するレポーター遺伝子を含む請求項６２記載の 方法。 ６５．レポーター遺伝子がガラクトキナーゼをコードする請求項６４記載の方 法。 ６６．該化合物が該キナーゼを拮抗する機能体を活性化する作用をする請求項 ６２から６５いずれかに記載の方法。 ６７．該機能体がホスファターゼである請求項６４記載の方法。 ６８．該機能体が、キナーゼによって通常は阻害される翻訳成分である請求項 ６６記載の方法。 ６９．翻訳成分がeＩＦ−２またはeＩＦ−２Ｂである請求項６８記載の方法。 ７０．該細胞系が哺乳類のＧＣＮ２−型キナーゼＤＡＩの対立遺伝子を生産す る請求項６６から６９いずれかに記載の方法。 ７１．下記の過程(ｉ)および(ii)を含む、真菌細胞増殖に必要なキナーゼのイ ンヒビターであって真菌細胞翻訳を阻害するインヒビターの生体外選抜法： (ｉ)該キナーゼをその潜在的インヒビターと接触させ、 (ii)該キナーゼの活性を測定する(この場合、該キナーゼの活性低下は、該潜在 的インヒビターが真菌細胞翻訳の有効なインヒビターであることを示す)。 ７２．該キナーゼがＧＣＮ２−型キナーゼである請求項７１記載の方法。 ７３．下記の過程(ｉ)〜(iv)を含む真菌細胞翻訳のインヒビターの選抜法： (ｉ)相互作用する真菌細胞翻訳系の２種の成分を同定し、 (ii)該成分の一方の一部と類似するポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似 体を準備し、 (iii)該ポリペプチドまたはその誘導体もしくは類似体を含有する培地内で真菌 細胞系を増殖させ、 (iv)該細胞系の増殖量を測定する（この場合、増殖量の低減は、該ペプチドまた はその誘導体もしくは類似体が真菌細胞翻訳の有効なインヒビターであることを 示す）。 ７４．ポリペプチドが、翻訳成分の負の優性対立遺伝子の遺伝子生産物である 請求項７３記載の方法。 ７５．ポリペプチドが、翻訳成分の負の優性対立遺伝子の遺伝子生産物の一部 である請求項７３記載の方法。 ７６．ポリペプチドが化学的に修飾されたものである請求項７４または７５記 載の方法。 ７７．下記の過程(ｉ)〜(iv)を含む翻訳成分の負の優性対立遺伝子の選抜法： (ｉ)翻訳成分をコードする遺伝子に突然変異を起こさせ、 (ii)突然変異遺伝子を誘発性プロモーターの調節下でベクター内に入れ、 (iii)該ベクター真菌細胞系内へ導入し、 (iv)該プロモーターの発現を誘発する条件下において、該真菌細胞系の増殖の阻 害度を測定する（この場合、増殖の低減は、該突然変異遺伝子の遺伝子生産物が 真菌細胞翻訳の有効なインヒビターであることを示す）。 ７８．翻訳成分をコードする遺伝子が、翻訳成分をコードする遺伝子の一部で ある請求項７７記載の方法。 ７９．下記の過程(ｉ)〜(iv)を含む真菌細胞翻訳のインヒビターの選抜法： (ｉ)第１の非相同ドメインに融合した１種の翻訳成分を準備し、 (ii)第２の非相同ドメインに融合した他の翻訳成分を準備し、 (iii)該両成分を相互作用させることによって第１および第２の非相同ドメイン の相互作用によりシグナルを発生させ、 (iv)真菌細胞翻訳の潜在的インヒビターの存在下での該シグナルの発生量を測定 する（この場合、シグナルの低減は、該翻訳成分が無菌細胞翻訳の有用なインヒ ビターであることを示す）。 ８０．翻訳成分が２種のタンパク質である請求項７９記載の方法。 ８１．翻訳成分がタンパク質の２つのドメインである請求項７９記載の方法。 ８２．翻訳成分が２種の翻訳タンパク質の一部分である請求項７９記載の方法 。 ８３．翻訳成分が翻訳タンパク質の２つのドメインの一部分である請求項７９ 記載の方法。 ８４．翻訳成分が化学的に修飾されたものである請求項７９から８３いずれか に記載の方法。 ８５．第１の非相同ドメインがＧＡＩ４ ＤＮＡ−結合ドメインであり、第２ の非相同ドメインがＧＡＩ４転写活性ドメインであり、また、転写活性の指標と しての該シグナルを、該翻訳成分間の相互作用の強さの指標として測定すること を含む請求項７９記載の方法。 ８６．翻訳成分が真菌翻訳成分である請求項７９から８５いずれかに記載の方 法。 ８７．下記の過程(ｉ)および(ii)を含む真菌のミトコンドリア翻訳のインヒビ ターの選抜法： (ｉ)真菌の細胞質翻訳のインヒビターおよび真菌のミトコンドリア翻訳の潜在的 インヒビターを含有する培地内で真菌細胞系を増殖させ、 (ii)タンパク質の合成量を測定する（この場合、タンパク質合成量の低減は、該 潜在的インヒビターが真菌のミトコンドリア翻訳の有効なインヒビターであるこ とを示す）。 ８８．真菌の細胞質翻訳のインヒビターがシクロヘキシミドである請求項８７ 記載の方法。 ８９．標的細胞または標的生物体への被験化合物の侵入をより受けやすくする ことによる細胞増殖のインヒビターの選抜法であって、 (ｉ)該細胞または生物体に対する透過障壁をもたらすタンパク質をコードする１ 種または２種以上の遺伝子を突然変異させることによって突然変異した細胞また は生物体を形成させ、 (ii)該突然変異細胞または生物体を該インヒビターの選抜アッセイにおいて使用 する ことを含む細胞増殖のインヒビターの選抜法。 ９０．標的細胞または標的生物体が次の群から選択されるものである請求項８ ９記載の方法：真菌、細菌、アメーバ、焔色植物、変形体、変形体細胞系、ネマ トーダ、ネマトーダ細胞系、昆虫、昆虫細胞系、緑色植物、植物細胞系、動物、 動物細胞系、腫瘍および腫瘍細胞系。 ９１．標的生物体がサッカロミセス・セラビシエである請求項８９記載の方法 。 ９２．標的細胞が、サッカロミセス・セラビシエから遺伝子ＰＤＲＩ、ＰＤＲ ４ およびＰＤＲ５を欠失させたものである請求項９１記載の方法。