JPH09502987A - 殺菌性／浸透性が向上した（ｂｐｉ）タンパク質生成物および抗生物質の投与によるグラム陰性細菌感染の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＢＰＩタンパク質生成物を用いた、グラム陰性細菌感染を治療するための方法と組成物を提供する。グラム陰性細菌感染の治療における、抗生物質とＢＰＩタンパク質生成物による同時治療もしくは同時投与は、グラム陰性細菌の抗生物質への感受性の向上ならびに抗生物質に対する細菌の耐性の変換を含めた抗生物質による治療効果を改善する。

Description

【発明の詳細な説明】 殺菌性／浸透性が向上した(BPI)タンパク質生成物および 抗生物質の投与によるグラム陰性細菌感染の治療方法 本願は、1993年９月22日に出願された米国特許出願No．08/125,651の一部継続 出願である、1994年７月11日に出願された米国特許出願 No．08/273,401の一部 継続出願である。 発明の背景 本願発明は、一般に、グラム陰性細菌感染の治療のための方法と組成物に関し 、具体的には、感染治療のための抗生物質と、殺菌性／浸透性が向上した(BPI) タンパク質生成物の併用に関する。BPI タンパク質生成物との併用治療は、グラ ム陰性細菌感染での抗生物質の治療効果を改善し、抗生物質に対するグラム陰性 微生物の感受性を高め、そして、抗生物質に対するグラム陰性微生物の耐性を転 換できる。 BPI とは、侵入してきた微生物を防御する上で必須の血液細胞である哺乳類多 形核白血球（PMNsあるいは好中球）の顆粒から単離されたタンパク質である。ヒ トBPI タンパク質は、酸抽出とイオン交換クロマトグラフィー〔Elsbach，J．Bi ol.Chem.，254: 11000(1979)〕あるいはE．coli アフィニティークロマトグラフ ィー〔Weiss，Blood，69: 652(1987)〕との組み合わせによってPMNsから単離さ れている。かような方法によって取得されたBPI は、本明細書では天然BPI と称 し、多様なグラム陰性細菌に対して強力な殺菌活性を呈する。ヒトBPI の分子量 は、約 55,000 ダルトン(55kD)である。ヒトBPI の全アミノ酸配列ならびにその タンパク質をコードするDNA の核 酸配列は、本明細書にて参照のために取り入れた、Gray et al.，J．Biol．Chem .，264:9505（1989）の図１にて報告されている。Gray et alのアミノ酸配列は 、本明細書の配列番号：69にも示した。 BPI は強力なカチオン性タンパク質である。BPI のＮ末端の半分は高い正荷電 を帯び、その分子のＣ末端の半分は-3の荷電を帯びているとの説明はされている 〔前出の ElsbachとWeiss(1981)〕。約25kDの分子量を有するBPI のタンパク質 分解Ｎ末端断片は、親水性ならびに疎水性領域を含んだ両親媒性であった。ヒト BPI のＮ末端断片は、自然に誘導された55kDのヒトBPI ホロタンパク質の抗細菌 活性を有している。〔Ooi et al.，J．Biol．Chem.，262:14891-14894(1987)〕 。Ｎ末端部分とは対照的に、単離したヒトBPI タンパク質のＣ末端領域は、グラ ム陰性微生物の対してわずかに検出できるだけの抗細菌活性を有していた。〔Oo i et al.，J．ExP．Med.，174:649(1991)〕。「rBPI₂₃」と称する約23kDのＮ末 端BPI 断片が組換法によって生成され、グラム陰性微生物の対する抗細菌活性を 有していた。Gazzano-Santoro et al.，Infect．Immun．60: 4754-4761（1992） 。 BPI の殺菌効果が、グラム陰性種に対して特異的であることは、例えば、Elsb ach とWeiss，Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates，eds ．Gallin et al.，Chapter 30，Ravan Press Ltd．（1992）で報告されている。 BPI は、酵母を含めた他の微生物や高等真核細胞に対して非毒性であると考えら れていた。前出の ElsbachとWeiss（1992）は、10^-8から10^-9Ｍという低濃度のB PI が、多様なグラム陰性細菌に対して抗菌活性を示すが、100 から1000倍の濃 度のBPI が、同時に試験を行ったグラム陽性細菌、酵母および高等真核 細胞に対して非毒性であると報告した。 そして、10^-6Ｍあるいは 160μg/mlの 濃度のBPI を、pH 7.0もしくは 5.5で、グラム陽性細菌Staphylococcus aureus( ４種)、Staphylococcus epidermidis、Streptococcus faecalis、Bacillus subt ilis、Micrococcus lysodeikticus、およびListeria monocytogenesに関して試 験を行った場合、毒性が認められなかった旨を報告している。報告された10^-6Ｍ の濃度のBPI は、pH 7.0もしくは5.5で、真菌のCandida albicansおよびCandida parapsilosiに関して非毒性であり、また、ヒト、ウサギおよびヒツジの赤血球 細胞および数種のヒト腫瘍細胞系などの高等真核細胞に対して非毒性であつた。 Elsbach とWeiss、Advances in Inflammation Research，ed．G．Weissmann，Vo l.2，pp.95-113 Raven Press(1981)も参照のこと。この文献は、標的細胞への特 異性は、グラム陰性微生物の外膜（エピトープ）に独特のリポ多糖(LPS)へのBPI の強力な引きつけによる結果であると考えられていた。 BPI がグラム陰性細菌を殺傷する詳細なメカニズムは未だ完全に解明されてい ないが、BPI がまず最初に、カチオン性BPI タンパク室とLPS の負に帯電部位と の間の静電気力と疎水性相互作用を介して細菌の表面に結合するものと考えられ ている。LPS は、不可逆性の内毒素ショックの結果による宿主炎症細胞による媒 介体の放出を促す刺激、すなわち、炎症反応のために、「内毒素」と称されてき た。 BPI は、LPS にて最も高い毒性と生物学的活性を有すると報告されたリピ ドＡに結合する。 感受性グラム陰性細菌では、BPI 結合はLPS 構造を崩壊せしめ、リン脂質とペ プチドグリカンを分解する細菌性酵素の活性化を招き、細胞の外膜への浸透性に 変化をもたらし、そして、細胞の死に至る過程を歩み始めるものと考えられてい る。〔前 出の ElsbachとWeiss(1981)〕。BPI は、二段階で作用するものと考えられてい る。第一段階は、迅速な成長抑制、外膜の浸透、リン脂質とペプチドグリカンを 加水分解する細菌性酵素の選択的活性化により特徴付けられる仮死段階である。 この段階における細菌は、血清アルブミンを補充した培地で成長させることで救 命することができる〔Mannion et al.，J．Clin．Invest.，85:853-860(1990)〕 。血清アルブミンで復元できない成長阻止によって定義される第二段階に、長時 間にわたって細菌をBPI に曝すことで至り、内部細胞質膜の明らかな損傷を含め た生理学的および構造的変化によって特徴付けられる。 LPS への最初のBPI の結合は、通常はMg²⁺とCa²⁺の結合を介して外膜を安定な らしめている、LPS のKDO 領域中のアニオン基への結合によるものと考えられる 組織の変化をもたらす。グラム陰性細菌の外膜へのBPI の結合は、アクチノマイ シンＤのような疎水化剤の外膜への急速な浸透をもたらす。BPI の結合と、それ に続きグラム陰性細菌の死滅は、少なくとも一部は、LPS 多糖鎖の長さならびに 保有する長いO-鎖、短いO-鎖を有する生物以上にBPI 殺菌効果に対して耐性を有 する「スムース」生物、「ラフ」生物に依る〔Weiss et al.，J．Clin．Invest. ，65: 619-628（1980）〕。グラム陰性エンベロープへの浸透である、BPI 作用 の第一段階は、BPI の解離、二価カチオンの存在を必要とするプロセス、新たな LPS の合成により可逆化できる〔Weiss et al.，J．Immunol．132: 3109-3115(1 984)〕。しかしながら、グラム陰性細菌の生存力の損失は、エンベロープの一体 性を復元するプロセスによって可逆化されず、このことは、殺菌活性が標的生物 にて誘発される他の病変部位によって媒介され、細胞質膜にて刺激を受けること を示唆 している〔Mannion et al.，J．Clin．Invest.，86: 631-641(1990)〕。この可 能性に関する具体的な調査では、モルベースにて、少なくともポリミキシンＢと して細胞質膜水疱機能の阻止を示したが〔In't Veld et al.，Infection and Im munity 56: 1203-1208(1988)〕、正確な作用機構ならびに無傷器官へのかような 水疱の関連は未だ解明されていない。 BPI は、BPI が結合したLPS の内毒性を中和することもできる。グラム陰性生 物の殺菌活性ならびにLPS を中和する能力から、BPI は、菌血症あるいは敗血症 のようなグラム陰性細菌によって引き起こされる疾患を患った哺乳類の治療のた めに利用することができる。 米国特許第5,198,541号は、BPI ホロタンパク質とBPI の断片を含む BPIタン パク質をコードする組換え遺伝子ならびにその発現の方法を開示している。ある 抗生物質、特に、ペニシリン、セファロスポリン、リファムピシンおよびアクチ ノマイシンＤを併用した、BPI タンパク質のＮ末端断片を用いた治療も記載され ている。 グラム陰性細菌としては、以下の属のものを含む。 Acidaminococcus，Acinetobacter，Aeromonas，Alcaligenes，Bacteroides，Bor detella，Branhamella，Brucella，Calymmatobacterium，Campylobacter，Cardi obacterium，Chromobacterium，Citrobacter，Edwardsiella，Enterobacter，Es cherichia，Flavobacterium，Francisella，Fusobacterium，Haemophilus，Kleb siella，Legionella，Moraxella，Morganella，Neisseria，Pasturella，Plesio monus，Proteus，Providencia，Pseudomonas，Salmonella，Serratia，Shigella ，Streptobacillus，Veillonella，VibrioおよびYersiniaを含む。 抗生物質とは、他の微生物の成長を阻害あるいは死滅せしめ る細菌（Bacillus属を含む）、放線菌（Streptomyces属を含む）および真菌のよ うな様々な種の微生物によって産生された比較的低分子量の天然化学物質である 。同様の構造の物質および作用形態は化学的に合成されたり、あるいは半合成の 抗生物質を得るために天然化合物を修飾される。これら生合成および半合成誘導 体も、抗生物質として有効である。抗生物質の主要なクラスとしては、(1) ペニ シリン、セファロスポリンおよびモノバクタムを含むβ−ラクタム；(2) アミノ グリコシド、例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシンおよび アミカシン；(3) テトラサイクリン；(4) スルホンアミドおよびトリメトプリム ；(5) フルオロキノロン、例えば、シプロフロキサシン、ノルフロキサシンおよ びオフロキサシン；(6) バンコマイシン；(7) マクロライド、例えば、エリスロ マイシン、アジスロマイシンおよびクラリスロマイシン、および；(8) 他の抗生 物質、例えば、ポリミキシン、クロラムフェニコールおよびリンコサミドなどが ある。 抗生物質は、以下に分類されるいくつかの作用機構を介してその抗菌効果を発 揮している。すなわち、(1) バシトラシン、セファロスポリン、シクロセリン、 ホスフォマイシン、ペニシリン、リストセチンおよびバンコマイシンのような、 細菌の細胞壁に作用する薬剤、(2) コリスチン、ノボバイオシンおよびポリミキ シンなどの細胞膜に作用したり、あるいは崩壊効果を呈する薬剤、(3) アミノグ リコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、サイ クロヘキシミド、フシディン、リンコマイシン、プロマイシン、リファンピシン 、他のストレプトマイシン、およびエリスロマイシンならびにオレアンドロマイ シンのようなマクロライド抗生物質などの、複製、情報伝達およびタンパク質合 成のリボソームに関する細胞 本来の機能に作用を及ぼす薬剤、(4) フルオロキノロン、アクチノマイシン、エ タムブトール、5-フルオロシトシン、グリセオフルビン、リファマイシンなどの 核酸代謝に影響を及ぼす薬剤、および(5) スルホンアミドおよびトリメトプリム 、結核治療薬イソニアジド、およびパラアミノサリチル酸のような中間代謝に影 響を及ぼす薬剤がある。いくつかの薬剤では、特に高い濃度において、一つ以上 の第一の作用機構を有する。加えて、構造あるいは細菌細胞での代謝における二 番目の変化は、抗微生物薬剤の第一効果が現れた後によく生じる。 ペニシリンは、抗菌活性を呈するβ−ラクタム環とチアゾール環からなる特徴 的な二環構成を有している。ペニシリンは、各ペニシリンに独特の単一の側鎖に よって差別化されている。これら化合物は殺菌活性と、細菌の細胞壁の合成に関 与する酵素である細菌性トランスペプチダーゼの阻害作用を有している。その作 用機序のため、一般に、ペニシリンは成長細胞に対しては活性であるが、休止細 胞に対しては不活性である。ペニシリン、特にペニシリンＧは、大きなグラム陽 性活性を有しており；ペニシリンＧならびに他のいくつかのペニシリンとのグラ ム陰性桿菌との相対的無関連性は、おそらくグラム陰性細菌の外膜への浸透防御 によるものと考えられる。アンピシリン、カルベニシリン、チカルシリン、およ び他のいくつかのペニシリンは、細菌の外膜を通過できるため、グラム陰性細菌 に対して活性である。ペニシリンはほとんど副作用を呈さず、その最大のものと して、超過敏（アレルギー）反応がある。これら化合物は、体内に広く分布して いるが、細胞には侵入せず、また、CSF にも通常は蓄積しない。 ペニシリンに対する細菌の耐性は、β−ラクタム環の加水分解を触媒する酵素 である、β−ラクタマーゼの生成によるもの である。ペニシリンに対する細菌の耐性率は、約80％にまで改善された。メチシ リン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、およびナフシリンを 含むいくつかのペニシリンは、ブドウ球菌のβ−ラクタマーゼによる影響を受け ない。これら抗生物質は、Staphylococcus属の最もβ−ラクタマーゼを産生する 種に対して有効である。しかしながら、少数の種は、これらペニシリンに対して もさえ耐性を有している。ペニシリン、アモキシリン、およびチカルシリンの一 部は、酵素に共有結合し、抗生物質の加水分解を防ぐβ−ラクタマーゼ阻害剤で あるクラブラン酸と併用する恰好で市場に流通している。他の阻害剤、スルバク タムは、アンピシリンと併用する恰好で市場に流通している。 セファロスポリンは、ペニシリンと同様に、β−ラクタム環によって特徴付け られているが、チアゾール環の代わりに、隣接するジヒドロチアジン環を有して いる。便宜のために、これら化合物は、一般にその世代に基づいて分類される。 第一世代は、セファロティン、セファピリン、セファゾリン、セファレキシン、 セファラジン、およびセファドロキシルを含む。一般に、これら薬剤は、腸球菌 とメチシリン耐性ブドウ球菌以外には優れたグラム陽性活性を示すが、グラム陰 性活性は適度のものに過ぎない。第二世代は、セファマンドール、セフォキシチ ン、セフォラニド、セフロキシム、セフロキシムアクセチル、セファクロー、セ フォニシド、およびセフォテタンを含む。一般に、この世代は重量当たりのグラ ム陽性活性を若干失っており、限られた値のグラム陰性活性を新たに獲得してい る。第三世代は、セフォタキシム、モキサラクタム、セフィチゾキシム、セフト リアキソン、セフォペラゾン、およびセフタジミドを含む。一般に、これら化合 物は、重量当たりのグ ラム陽性活性をさらに失っている反面、Enterobacterに対する実質的なグラム陰 性活性を有しており、時には Pseudomonasに対しても活性である。セファロスポ リンは、様々な親和度でもって、ペニシリンが結合しているタンパク質に結合す る。一旦結合してしまうと、タンパク質の合成は阻害される。通常、セファロス ポリンは耐性と、超過敏反応と胃腸効果を含めた副作用を有している。セファロ スポリンは、毒性を高めるために、腎毒性薬剤、特にアミノグリコシドと相互作 用する。β−ラクタマーゼを産生しない株の一部も耐性であるにもかかわらず、 セファロスポリンの耐性は、β−ラクタマーゼの産生を含むいくつかの機序によ って媒介されている。 イミペネムは、鋳型生成物チエナマイシンのＮ−フォルミミドイル誘導体であ る。これは、β−ラクタム環を含み、二番目の環が相違する以外はペニシリンと 同様である。それは、グラム陰性ならびにグラム陽性生物の双方に対して活性を 有しており、Pseudomonas 由来のものでないにもかかわらず、大抵のβ−ラクタ マーゼに対して耐性を有している。腎臓ジヒドロペプチダーゼＩ酵素による腎臓 でのイミペネムの不活性化を阻害する化合物であるシラスチンとの併用の恰好で 、イミペネムは市場に流通している。シラスチンは、血中ではなく、尿中のイミ ペネムの濃度を増大せしめる。 アズスレオナムは、モノバクタムと称する抗生物質の新規集団の最初の物質で ある。これら物質は、β−ラクタム環を含むが、ペニシリンとセファロスポリン に特有の二番目の環は有していない。この物質は、ペニシリン結合タンパク質に 結合し、最終的には溶解する長い、フィラメント様の細菌形状を呈する。アズス レオナムは、好気性グラム陰性細菌に対してのみ活性があり、一部のβ−ラクタ マーゼによる不活性化に対し て感受性があり、ほとんど副作用がない。 アミノグリコシドは、グリコシド結合によって、アミノサイクリトール環に結 合したアミノ糖を有する。これらは、作用および特性において同様の機序を有す るが、作用、毒性、および細菌耐性への感受性のスペクトルにおいて若干の相違 がある。これら化合物は、殺菌活性ならびにグラム陽性およびグラム陰性生物双 方に対する活性を有し、そして、細菌のリボソーム30Ｓのタンパク質に結合し、 そしてタンパク質合成を阻害する。アミノグリコシドは単離したLPS にも結合し 、また、非常に弱い外膜浸透効果を有する。〔Taber et al.，Microbiological Reviews 53: 439-457(1987); Kadurugamuwa et al.，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，37: 715-721(1993); Vaara，Microbiological Reviews 56: 395 -411（1992）〕このクラスの抗生物質としては、アミカシン、ゲンタマイシン、 カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、およびトブラ マイシンがある。アミノグリシドは、耳毒性ならびに腎毒性を含む重大な副作用 のため、通常は、重篤な疾患に対する適用は控える。治療効果が得られる濃度、 例えば、８μg/mlのゲンタマイシンと、毒性効果が得られる濃度、例えば、12μ g/mlのゲンタマイシンとの間には狭小な治療用途の濃度しか存在しない。特に、 ネオマイシンは高毒性であり、決して非経口投与できない。 テトラサイクリンは共通する４つの環構造を有しており、ポリサイクリックナ フタセンカルボキサミドと同属の誘導体と非常に似通っている。これら化合物は 、殺菌活性を有しており、微生物リボソームの30Ｓサブユニットへ結合し、およ びアミノアシルtRNAへの結合に作用することでタンパク質合成を阻害する。これ ら化合物は、グラム陽性およびグラム陰性細菌双方 に対して活性を有するものの、多くの生物種において耐性があるため、その用途 範囲は制限されている。副作用として、胃腸効果、高用量服用による肝細胞毒性 、および一部の患者での腎毒性がある。このクラスの抗生物質としては、テトラ サイクリン、クロロテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン 、メタサイクリン、ミノサイクリン、およびオキシテトラサイクリンがある。 スルホンアミドは、葉酸の細菌合成のための必須前駆体である、パラアミノ安 息香酸(PABA)と同様の構造を有する化合物である、スルファニルアミドの誘導体 である。この化合物は一般に殺菌活性を有しており、チミジン、プリンおよびＤ ＮＡの合成のための補因子であるテトラヒドロ葉酸へのPABAの取り込みを拮抗的 に阻害する。スルホンアミドは、グラム陽性およびグラム陰性細菌双方に対して 広範囲の活性を有するものの、細菌耐性の普及によりその有用性は無くなりつつ ある。抗生物質のスルホンアミドのクラスとしては、スルファサイティン、スル ファジアジン、スルファメチゾール、スルフィソキサゾール、スルファメソキサ ゾール、スルファベンザミド、およびスルファセタミドがある。副作用としては 、超過敏反応、そして時には血液毒性がある。 トリメソプリムは、ＤＮＡ合成の必須因子であり、ジヒドロ葉酸をテトラヒド ロ葉酸に転化する、ジヒドロホレートレダクターゼ酵素の阻害剤である。副作用 としては、胃腸障害、そしてまれに血液毒性がある。トリメソプリムは、スルフ ァメソキサゾールとの併用の形態でも（共トリモキサゾールとしても知られてい る）入手することができる。各構成薬剤は普段は静菌的でしかないものの、この 併用剤は通常では殺菌活性を有している。この併用剤は、Salmonella感染、一部 のShigella 感染、E．coli 旅行者下痢、およびPneumocystis carinii肺炎のための薬剤の一 つである。 フルオロキノロンおよびキノロンは、ナリジキシン酸の誘導体、ナフチリジン 誘導体である。これら化合物は殺菌活性があり、DNA へ結合し、DNA の負のスー パーコイル化を触媒する酵素であるDNA ジャイレースの作用により損傷のあるDN A の複製、転写および修復が進む。ノルフロキサシン、シプロフロキサシンおよ びオフロキサシンを含むフルオロキノロン、ならびにシノキサシンを含むキノロ ンは、グラム陰性ならびにグラム陽性生物に対する広範な抗微生物活性のスペク トルを有する。これら化合物は、血管外組織部位を通じて広く分布し、血清半減 期を有し、また副作用はほとんど無い。DNA に及ぼす効果から、妊婦や骨の成長 が完全でない子供にはこれら化合物は投与できない。 バンコマイシンは、真菌によって生成される約1500の分子量を有するグリコペ プチドである。主に、グラム陽性細菌に対して活性がある。この薬剤は、細菌の 細胞壁の合成の最終工程の一つを阻害するものであり、よって、成長器官に対し てのみ効果がある。細菌耐性や患者のアレルギーのためにペニシリンＧの使用が 有効でない場合に、グラム陽性球菌による重大な感染症の治療のために用いる。 バンコマイシンは、耳毒性と腎毒性の二つの大きな副作用を有している。このよ うな毒性は、アミノグリコシドのような同様の副作用を呈する他の薬剤を同時に 投与することで増大される。 マクロライドは静菌剤であり、70Ｓリボソームの50Ｓサブユニットへ結合し、 タンパク質合成の阻害をもたらす。グラム陰性ならびにグラム陽性細菌に対する 広範な活性スペクトルを有し、感染部位で用いる濃度によって静菌あるいは殺菌 効果を 呈する。これら化合物は、体液中に広く分布する。副作用としては、胃腸障害と 、まれに超過敏反応がある。最も汎用されているマクロライドはエリスロマイシ ンであるが、このクラスには、クラリスロマイシンとアジスロマイシンのような 他の化合物が含まれている。 ポリミキシンは、Bacillus Polymyxa の株によって産生された抗生物質に密接 に関係したグループに属する。カチオン性洗浄剤であるこれら薬剤は、約1000の 分子量を有する単純基本ペプチドである。グラム陰性細菌に対する抗菌活性には 限りがある。また、リン脂質と強く作用し、細胞膜に浸透して分布する。ポリミ キシンＢも、内毒素のリピドＡ部分に結合し、この分子の毒性を中和する。ポリ ミキシンＢは、腎毒性と神経毒性を含めた重篤な副作用を呈するものであり、他 の腎毒性あるいは神経毒性薬剤と同時に投与すべきではない。よって、高い全身 毒性が故に、治療薬剤としての用途にも制限が加えられるが、他の抗生物質には ほとんど応答しない、Pseudomans aeruginosa髄膜炎のような重大な感染症に対 して適用される。 クロラムフェニコールは、50Ｓリボソームサブユニットに結合し、アミノアシ ルtRNAの結合を防ぐことでタンパク質合成を阻害する。抗微生物活性にスペクト ルは非常に大きいが、重篤で致命的な血液学的副作用が故に、髄膜炎、発疹チフ ス、腸チフス、およびロッキー山斑点熱のような重大な感染症のみに適用される 。クロラムフェニコールは、特定の種に対しては殺菌活性を示すが、基本的には 静菌的である。 リコマイシンとクリンダマイシンは、リンコサミド抗微生物剤である。これら は、アミノ糖に結合したアミノ酸から構成されている。双方共に、50Ｓリボソー ムサブユニットに結合することで、タンパク質合成を阻害する。これらは、同じ 結 合部位でエリスロマイシンとクロラムフェニコールと拮抗するが、重複はしない 。相対濃度と感受性によって、これらは静菌的であったり、殺菌的になったりす る。胃腸障害が、最も一般的な副作用である。 他の副作用としては、皮膚過敏 症、一過性の血液学的異常、および肝酵素値のわずかな上昇がある。クリンダマ イシンは、嫌気性細菌による感染症あるいは嫌気性／好気性混合細菌による感染 症のための薬剤の一つであり、感受性好気性グラム陽性球菌に対して使用するこ ともできる。 ある薬剤、例えば、アミノグリコシドの治療用量は、狭小な範囲である。例え ば、細菌の成長阻害のためには、２〜４μg/mlのゲンタマイシンあるいはトブラ マイシンが必要とされるが、血漿中のピーク濃度である６〜10μg/ml以上になる と、耳毒性や腎毒性をもたらすことになる。これら薬剤は、治療濃度に対する毒 性濃度の比率が非常に小さいので、その投与は困難を極める。アミノグリコシド やバンコマイシンのように腎臓に毒性を与え、また腎臓から排出される抗微生物 薬剤は、排出力の低下により血漿濃度が大きくなり、一方で毒性も大きくなるた め、特に注意を要する。腎臓から排出される抗微生物薬剤の用量は、腎臓機能の 障害を持つ患者に対しては減量しなければならない。同様に、肝臓によって代謝 あるいは排出されるエリスロマイシン、クロラムフェニコール、あるいはクリン ダマイシンのような薬剤の用量は、肝機能が低下した患者に対しては減量しなけ ればならない。 細菌の抗菌活性は、様々な問題を包含している。家畜用抗生物質の普及および 医師による抗生物質の過剰処方もあって、異なる作用形態を伴う新規の抗生物質 の研究が追いつかない状態で、抗菌耐性細菌が急速に広まった。〔Science，264 : 360-374(1994)〕一旦、抗菌活性を獲得すると、異なる種の 細菌を含めて、またたく間に他の菌に伝播する。一つの抗生物質の除くすべての 抗生物質に耐性を有する一部の細菌があり、すべての抗生物質に耐性を有する細 菌の出現はもはや時間の問題である。 細菌はいくつかの機構を介して耐性を獲得する。(1)抗生物質を破壊あるいは 不活性化する酵素の産生〔Davies，Science，264: 375-381（1994）〕、(2) 抗 生物質によって認識されない細胞上あるいは細胞内の新規あるいは改変した標的 部位の合成〔Spratt，Science,264: 388-393（1994）〕、(3) 細胞壁タンパク質 をさらに改変することで還元でき、それにより、細菌細胞質組織への抗生物質の 接近を制限することを意味する抗生物質の低浸透性、(4) 薬剤の細胞間輸送能力 の低下、および(5) 膜関連ポンプを介した細胞からの抗生物質除去の促進〔Nika ido，Science，264: 382-387（1994）〕である。 抗生物質に対する細菌の感受性は、一般には、二つの微生物学的方法によって 決定される。迅速ではあるが精度のやや落ちる方法では、所定量の抗生物質が含 浸された市販の濾紙ディスクを用いる。これらディスクは、試験される生物の培 養液が筋状に塗布された寒天プレートの表面に置かれ、成長阻止の大きさに関し てそのプレートは観察される。より正確な方法である、希釈培地感受性試験は、 濃度が異なるように希釈した薬剤を含む液体培地を入れた一連の試験管を用意し 、その試験管内で試験しようとする生物を接種する。インキュベートして一定時 間を経た後に、細菌の成長を阻害した最低濃度を、最小阻害濃度として報告する 。 抗生物質に対する耐性あるいは感受性は、臨床結果、すなわち、感染患者への 抗生物質の投与により投与された生物が順調に治癒するかどうかによって決定さ れる。患者が高濃度の抗 生物質に対して in vitro にて感受的であっても、実際のところ、その患者は生 理学的に適切な濃度の抗生物質に対しても感受的である。生物の成長阻害あるい は殺傷に至るに必要な薬剤濃度が、生物に毒性を付与しない濃度より大きい場合 、その微生物は当該抗生物質に対して耐性があると考えられる。In ｖitro 試験 結果を用いて抗生物質への耐性あるいは感受性を容易に定めるために、臨床実験 基準の国家委員会(NCCLS)は、in vitro での抗生物質の最小阻止濃度の決定値を 臨床結果と相関せしめた、抗生物質への感受性のための基準を設けた。 このように、当該技術分野では、従来の抗生物質による治療の補助を成し、そ して抗生物質による治療効果を改善する機能を果たす薬剤が切望されているので ある。 発明の要約 本発明は、一般に、BPI タンパク質生成物を用いた、グラム陰性感染の予防あ るいは治療のための方法と組成物を提供する。治療のための使用に加え、本発明 の方法と組成物は、グラム陰性細菌感染の可能性の高い患者、例えば、腹部ある いは尿生殖器の外科的処置を受けた患者、あるいは外傷患者での感染予防にも有 用である。具体的には、本発明は、抗生物質でグラム陰性細菌感染において、抗 生物質の治療効果を向上せしめるだけの量のBPI タンパク質生成物を同時に投与 する工程を含めるものである。 本発明は、BPI タンパク質生成物が、従来の抗生物質との組み合わせによる治 療において有用であること、すなわち、BPI タンパク質生成物と抗生物質あるい は複数の抗生物質の同時投与、あるいは同時治療が、それら抗生物質あるいは複 数の抗生物質による治療効果を改善するとの知見に基づくものである。 BPI タンパク質生成物は、抗生物質に対するグラム陰性細菌の耐性の効果的な転 換、BPI タンパク質生成物あるいは抗生物質各々の薬効あるいは添加効果を上回 る相乗あるいは増強効果、あるいは抗生物質により死滅させた細菌から放出した 内毒素の中和により、少量の抗生物質に対するグラム陰性細菌の感受性を高める ことを含めた様々な態様で、抗生物質による治療効果を改善せしめる。BPI タン パク質生成物と抗生物質の同時投与は、いずれかの薬剤のみを投与した場合に比 べ、in vivo にて優れた治療効果を示す。関与するグラム陰性細菌が、BPI タン パク質生成物単独および／または抗生物質単独時の殺菌活性に対しても耐性があ ると考慮される場合でも、本発明の治療方法によるBPI タンパク質生成物の同時 投与の効果は認められる。 本発明は、哺乳動物でのグラム陰性細菌感染の抗生物質を用いた同時治療のた めの薬剤の製造のためのBPI タンパク質生成物の使用を含む。本発明でのこの態 様は、β−ラクタマーゼ阻害剤の有無に関係しないβ−ラクタム、アミノグリコ シド、テトラサイクリン、スルホンアミドならびにトリメトプリム、バンコマイ シン、マクロライド、フルオロキノロンならびにキノロン類、ポリミキシン、お よび他の抗生物質を含めた抗生物質あるいはこれら抗生物質の組み合わせによる 治療を意図するものである。 また、本発明でのこの態様は、グラム陰性細菌感染での抗生物質の治療効果を 改善するための薬剤の製造におけるBPI タンパク質生成物の使用、グラム陰性細 菌感染に関与するグラム陰性細菌の抗生物質への感受性を向上せしめる薬剤の製 造におけるBPI タンパク質生成物の使用、およびグラム陰性細菌感染に関与する グラム陰性細菌の抗生物質への耐性を転化しめる薬剤 の製造におけるBPI タンパク質生成物の使用も意図するものである。 本発明は、天然BPI タンパク質、組換えBPI タンパク質、BPI 断片、BPI 類似 体、BPI 変異体およびBPI ペプチドを含めた当該技術分野で公知のBPI タンパク 質の多様な態様を利用するものである。BPI タンパク質生成物と共に投与される 抗生物質ならびに抗生物質の組み合わせには、β−ラクタマーゼ阻害剤の有無に 関係しないβ−ラクタム、アミノグリコシド、テトラサイクリン、スルホンアミ ドならびにトリメトプリム、バンコマイシン、マクロライド、フルオロキノロン ならびにキノロン類、ポリミキシン、および他の抗生物質を含む抗生物質が包含 されている。 BPI タンパク質あるいは抗生物質のいずれも、グラム陰性細菌感染が確認ある いは疑われた患者に、全身的あるいは局所的に投与できる。BPI タンパク質およ び抗生物質は、異なる経路で、そして、同時あるいは連続的に投与できる。 本発明は、抗生物質の治療効果を改善する量のBPI タンパク質と抗生物質を含 んだグラム陰性細菌感染の治療のための薬剤組成物も提供する。かような組成物 は、任意に、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤あるいは担体を含む。この組成 物は、患者に対して全身的あるいは局所的に投与できるように調剤できる。加え て、BPI タンパク質と抗生物質を含んだ組成物は、体液や表面の除染、外科なら びに他の医療用具、および疑似関節を含めた移植器具を殺菌するための殺菌剤と しての使用など、in vitroでの様々な態様にて使用できる。 本発明の無数の態様や利点は、好適な態様を述べた以下の詳細な説明を考慮す れば、当業者からすれば明白である。 図面の簡単な説明 図１は、E．coli 0111:B4 マウス腹膜炎検定での、rBPI₂₁およびセファマンド ールを個別あるいは組み合わせて治療を施した場合の生存データを示している。 図２〜４は、E．coli 0111:B4 マウス腹膜炎検定にてrBPI₂₁およびセファマン ドールを個別あるいは組み合わせて治療を施した結果に関する。図２には、生存 データ；図３は、腹膜洗浄液からの細菌数；および、図４には血中の細菌数を示 している。 図５Ａと５Ｂは、E．coli O7:K1 マウス腹膜炎検定でのrBPI₂₁およびセファマ ンドールを個別あるいは組み合わせて治療を施した場合の二つの試験結果を示し ている。 図６〜16は、E．coli O7:K1 ウサギ菌血症検定にてrBPI₂₁およびセファマンド ールを個別あるいは組み合わせて治療を施した、心臓血管および代謝上の知見を 含めた結果に関する。図６には生存データ；図７には血中の細菌数を、また図８ には細菌量率；図９は血液の内毒素レベル；図10は平均動脈血圧；図11は心係数 ；図12は全末梢耐性；図13は動脈酸素強度；図14は肺胞−動脈酸素勾配；図15は 呼吸率；および図16は動脈血pHを示す。 図17は、E．coli O7:K1 マウス腹膜炎検定でのrBPI₂₁およびゲンタマイシンを 個別あるいは組み合わせて治療を施した場合の生存データを示している。 図18は、セフトリアキソン耐性 E．coliの成長に関するrBPI₂₁およびセフトリ アキソンを個別あるいは組み合わせて使用した場合の殺菌効果を示している。 図19〜25は、選択したグラム陰性生物の抗生物質殺傷曲線に関するrBPI₂₁の相 乗効果に関する。図19はrBPI₂₁のみの殺菌 活性を示している。図20はトリメスロプリム／スルファメサキサゾールとの組み 合わせにおけるrBPI₂₁の効果；図21はシプロフロキサシンとrBPI₂₁；図22はピペ ラシリンとrBPI₂₁；図23はセフォタキシムとrBPI₂₁；図24はセフロキシムとrBPI₂₁ ；および図25はアミカシンとrBPI₂₁による効果を示している。 詳細な説明 本発明は、BPI タンパク質生成物を用いた、グラム陰性細菌感染の治療のため の方法と組成物を提供する。本発明は、グラム陰性細菌感染を抗生物質で処置す る場合に、BPI タンパク質生成物単独あるいは抗生物質単独の場合には不活性の 用量であっても、抗生物質とBPI タンパク質生成物を同時に投与することで抗生 物質による治療効果が改善されるという予期せぬ発見に基づくものである。BPI タンパク質生成物は、それ自体は一般に、従来の抗生物質よりもやや劣る抗菌活 性しか有していない。しかしながら、その投与により従来の抗生物質による治療 効果を顕著に改善せしめたのである。BPI タンパク質生成物は、グラム陰性細菌 感染の治療のための従来の抗生物質治療の補助する目的において有用である。 本明細書で使用する「グラム陰性細菌感染」とは、グラム陰性細菌感染に関連 する疾患、あるいはその結果によって導かれた状態（例えば、後遺症）をも含む 。これら状態には、グラム陰性敗血症、内毒素関連低血圧症ならびに内毒素関連 性ショック、および発熱、代謝性酸毒症、多発性血管内凝固ならびに関連する凝 血疾患、貧血、血小板減少症、白血球減少症、成人呼吸困難症候群ならびに関連 する肺疾患、腎不全ならびに関連する腎疾患、肝胆汁性疾患、および中枢神経系 疾患を含む一つ以上の疾患に関連する状態を含む。これら状態は、腸からの 細菌の移動ならびに内毒素の放出に伴う状態も含む。 BPI タンパク質生成物は、減少した用量の抗生物質に対するグラム陰性細菌の 感受性の増大、抗生物質に対するグラム陰性細菌の耐性の効果的な転換、BPI タ ンパク質生成物あるいは抗生物質各々の薬効あるいは添加効果を上回る相乗ある いは増強効果、あるいは抗生物質により死滅させた細菌から放出した内毒素の中 和を含む様々な方法により、抗生物質による治療効果を改善せしめる。BPI タン パク質生成物と抗生物質の同時投与は、グラム陰性細菌感染の予期せぬ治療効果 をもたらす。これら二つの薬剤の同時投与は、いずれかの薬剤のみを投与した場 合に比べ、in vivo にて優れた治療効果を示す。同様の効果を得るには、一方あ るいは双方の薬剤の用量を減少することができる。さらに、この同時投与は、い ずれかの薬剤のみを投与した場合に比べ、より迅速あるいは完全に、殺菌／静菌 効果を奏するものと考えられる。 治療効果は臨床結果に基づくものであり、感染に関与する生物を100％死滅せ しめる抗菌剤あるいは薬剤を必要としない。治療効果の成否は、宿主に好都合な 方法で細菌を阻害するに充分なレベルにまで、感染部位の抗菌活性レベルを引き 上げることにかかっている。宿主の防御機構が最も効力がある場合、必要とされ る抗菌活性は最小ですむ。生物の負荷を１の対数だけ（1/10）減じることで、宿 主の防御機構は感染を制御できるようになる。加えて、初期の殺菌／静菌効果を 増大せしめることは、長期の殺菌／静菌効果を得ること以上に重要である。これ ら初期効果は、宿主の防御機構を活性化する時間を確保することができるので、 治療の成功を考える上で重要かつ重大事項でもある。殺菌率を増大することは、 髄膜炎、骨あるいは関節の感染症のような感染症については特に重要である。 〔Stratton，Antibiotics in Laboratory Medicine，3rd ed.，（Lorian，V.，E d.）pp.849-879，Williams and Wilkins，Baltimore Maryland（1991）〕。 In vivo での抗生物質の治療効果を改善するためのBPI タンパク質生成物の効 果は、in vivo での動物モデルによって実証されるであろうし、また、(1) 24時 間にわたるグラム陰性生物の成長を阻害するに必要な抗生物質の最小阻害濃度(M IC)の決定、(2) グラム陰性生物の運動成長曲線に関する抗生物質の効果の決定 、および(3) 抗生物質単独あるいはBPI タンパク質生成物との組み合わせの連続 希釈による最小阻害濃度のチェッカーボード検定、を含む様々なin vitro試験に 基づいて予測できる。例示的なモデルあるいは試験は、Eliopoulos and Moeller ing，Antibiotics in Laboratory Medicine，3rd ed.，(Lorian，V.，Ed.)pp.43 9-492，Williams and Wilkins，Baltimore Maryland（1991）に記載されている 。 24時間での抗生物質のMIC に関するin vitro決定法を用いて、BPI タンパク質 生成物が抗生物質のMIC を減少することを実証できる。この結果によれば、in v ivo でのBPI タンパク質生成物の同時投与が、抗生物質に対するグラム陰性生物 の感受性を向上することが考えられる。BPI タンパク質生成物は、臨床的に生物 が耐性であると考えられる範囲から、臨床的に生物が感受性であると考えられる 範囲に至る間において、抗生物質のMIC を減少せしめるものと思われる。この結 果によれば、in vivo でのBPI タンパク質生成物と抗生物質との同時投与が、耐 性を転換せしめて、抗生物質耐性生物を効果的に抗生物質感受性生物に変換する ことが考えられる。 グラム陰性生物のin vitroでの成長曲線に関する抗生物質の効果を測定するこ とで、BPI タンパク質生成物の存在あるいは 欠如した中で、０〜24時間において、BPI タンパク質生成物が抗生物質の初期の 抗菌効果を高めることが示される。初期の殺菌／成長阻止効果の向上は、治療結 果を決定する上で重要である。 BPI タンパク質生成物および抗生物質は、各薬剤単独による効果あるいは両薬 剤の添加効果以上の相乗あるいは増大効果を示すであろう。チェッカーボード検 定において、抗生物質とBPI タンパク質生成物の組み合わせは、「相乗的」断片 的阻害濃度指数(FIC)において結果を見ることになる。チェッカーボード検定は 、複数の薬剤について見られた結果を、試験した薬剤個々の効果の合計とみなす 足し算に基づいており；このシステムによれば、0.5 未満の FICは相乗的であり 、１が付加的であり、１以上２未満は無作用であると判定される。これに対して 、運動性分析は、ただ一つの代謝経路のみが生物の成長速度を律することができ るとの考えに基づいており、このシステムによれば、（自律性あるいは無関係の ）互いに作用を及ぼさない薬剤の組み合わせ効果は、単に最も活性のある薬剤の 効果のみによることになる。 BPI タンパク質生成物と抗生物質の同時投与に関して、本明細書では、様々な グラム陰性生物に対する様々な抗生物質の低MIC を示した。また、様々なグラム 陰性生物の抗生物質に対する耐性の転換も示した。BPI タンパク質生成物が24時 間での抗生物質のMIC に影響を与えない場合、本明細書では、BPI タンパク質生 成物が、０〜７時間あるいは７〜24時間での成長曲線に関する抗生物質の初期殺 菌効果を高めたものとして示した。BPI タンパク質生成物単独の直接殺菌あるい は成長阻止効果に感受的でないと考えられていたグラム陰性生物に対してもさえ 、BPI タンパク質生成物はこれら効果を付与した。In vivoでのBPI タンパク質生成物と抗生物質の同時投与は、単独投与では同様の臨 床効果を得るに不十分な量とされる量にまで、両薬剤の用量を減少せしめる。 BPI タンパク質生成物と抗生物質のいずれか、あるいは双方は、いずれか一方 のみでは、グラム陰性細菌感染に対して治療効果が得られないという低い用量レ ベルにて投与される。あるいは、好ましい方法に従えば、抗生物質およびBPI タ ンパク質生成物は、それぞれが単独でグラム陰性細菌感染に対して治療効果が得 られるものの、二つの抗生物質の組み合わせることでより強い効果が得られると いう用量で投与できる。BPI タンパク質生成物は、減少した抗生物質用量に対し てグラム陰性細菌の感受性を向上せしめる用量、あるいは抗生物質に対するグラ ム陰性細菌の耐性を転化せしめる用量にて投与される。 BPI タンパク質生成物は、補体、ｐ15ならにびLBP、および免疫系の他の細胞 ならびに要素を含む全血あるいは血清に存在する様々な宿主防御要素と相互作用 すると考えられていた。かような相互作用は、BPI タンパク質生成物の活性化の 強化に繋がると考えられる。これら相互作用が故に、BPI タンパク質生成物は、 in vitroよりもむしろin vivo にて大きな効果を奏するものと期待されている。 よって、in vitro試験結果はin vivo での有用性を予測せしめるものであるが、 in vitroでの活性の欠如が、in vivo での活性の欠如を必ずしも示唆するもので はない。例えば、BPI は、グラム陰性細菌に関する殺菌効果に関して、通常の培 地を用いた検定よりも、全血あるいは血漿検定においてより大きな効果が認めら れている。〔Weiss et al.，J．Clin．Invest．90: 1122-1130（1992）〕このこ とは、従来のin vitro系が、in vivo でのBPI の機能を促進あるいは強化する血 液要素を欠いていること、あるいは、 従来の培地でのBPI タンパク質生成物の抗菌活性の典型的な阻害剤であるマグネ シウムやカルシウムの生理学的濃度が高いことによるものと考えられる。さらに 、宿主において、BPI タンパク質生成物は、in vitro試験結果では認められず、 あるいは当該試験結果から予測できなかった臨床上の利点である、細菌の抗生物 質による死滅の間に放出された内毒素を中和するためにも使用できる。 BPI タンパク質生成物を、BPI タンパク質生成物の殺菌活性を強化する他の生 成物と共に投与することも意図されている。例えば、血清補体は、BPI タンパク 質生成物のグラム陰性殺菌活性を強化し、BPI タンパク質生成物と血清補体の組 み合わせは、相乗的な殺菌／成長阻害効果を示す。例えば、天然の15kDタンパク 質がBPI 抗菌活性を強化することを述べた、Ooi et al．J．Biol．Chem.，265: 15956（1990）およびLevy et al.，J．Biol．Chem.，268: 6038-6083（1990）を 参照のこと。また、1993年７月14日出願の米国特許出願No．08/093,201 の一部 継続出願として1994年７月13日に出願された米国特許出願No．08/274,303に対応 する、共同所有に係る、係属中の1994年７月13日に出願された国際出願No．US94 /07834も参照のこと。本明細書に参考文献として取り入れたこれら出願は、リポ 多糖結合性タンパク質(LBP)およびLBP タンパク生成物を投与することにより、B PI タンパク質生成物のグラム陰性殺菌活性を高めるための方法が記載されてい る。CD14免疫刺激特性を欠いた LBPタンパク質誘導体ならびに誘導ハイブリッド は、本明細書に参考文献として取り入れた、1993年６月17日出願の米国特許出願 No．08/079,510 の一部継続出願として1994年６月17日に出願された共同所有に 係る、係属中の米国特許出願No．08/261,660 に対応する、1994年６月17日に出 願された国際出願 No．US94/06931に記載されている。 本発明の利点は、抗生物質治療の効果を生かしつつ、グラム陰性細菌の治療効 果を高めることができることにある。他の利点は、通常は、一種以上の抗生物質 に対して耐性を有するグラム陰性生物を治療できることにある。さらに他の利点 は、抗生物質によるグラム陰性生物の死滅を促進できることにある。さらに他の 利点は、抗生物質による細菌を死滅する間に放出された内毒素を中和できること にある。さらに他の利点は、ゲンタマイシンやポリミキシンＢのような毒性を有 する抗生物質、あるいはバンコマイシンのような高価な抗生物質を低濃度で使用 できることにある。いくつかの抗生物質では、その全身に及ぶ毒性あるいは極端 に高い費用のためにその使用に制限が課されるため、治療効果を得るに必要な抗 生物質の濃度を低下せしめることは、毒性および／または治療に要する費用を抑 制し、ひいては抗生物質の汎用を許容することになる。本発明は、例えば、治療 期間の短縮、集中治療室あるいは病棟内の滞在期間を短縮し、また、重大な（病 院内）院内感染の危険性をも小さくするなど、生命に係わる特徴も提供する。 さらに本発明は、抗生物質と抗生物質の治療効果を改善するに足る量のBPI タ ンパク質生成物を含む、グラム陰性細菌感染の治療のための薬学的組成物を提供 する。かような組成物は、任意に、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤あるいは 担体を含む。この組成物は、患者に対して全身的あるいは局所的に投与できるよ うに調剤できる。加えて、BPI タンパク質生成物と抗生物質を含んだ殺菌済組成 物は、体液や表面の除染、外科ならびに他の医療用具、および疑似関節を含めた 移植器具を殺菌するための殺菌剤としての使用など、in vitroでの様々な態様に て使用できる。本発明は、抗生物質と組み合わせてBPI タンパク質生成物を投与することを含むin vitroでの体液や表面の除染のための 方法も提供する。 BPI タンパク質生成物あるいは抗生物質のいずれも、全身的あるいは局所的に 投与することができる。全身的投与の経路には、経口投与、静脈注射、筋内注射 あるいは皮下注射、胸郭、胸膜（例えば、胸膜洗浄による）への投与、気化ある いは霧状にした薬剤の肺への投与、あるいは皮膚への適用がある。局所的投与の 経路には、軟膏、点眼、点耳あるいは（例えば、傷の灌流のための）灌注液の形 態での投与を含む。 本明細書で使用する「同時投与」あるいは同時治療とは、薬剤の同時投与ある いは相前後して投与することを含む。BPI タンパク質生成物と抗生物質は、互い に異なる経路から投与される。例えば、BPI タンパク質生成物は静脈投与される のに対し、抗生物質は、筋内投与、静脈投与、皮下投与、経口投与あるいは胸膜 投与される。あるいは、BPI タンパク質生成物は胸膜投与されるのに対し、抗生 物質は胸膜投与あるいは静脈投与され、さもなくば、BPI タンパク質生成物は気 化あるいは霧状にて投与されるのに対し、抗生物質は、例えば、静脈投与される 。BPI タンパク質生成物ならびに抗生物質は、双方が静脈投与されるのが好まし い。BPI タンパク質生成物ならびに抗生物質は、同じ静脈に対して中間洗浄を経 て連続して投与するか、あるいは異なる静脈に対して投与を行う。BPI タンパク 質生成物ならびに抗生物質は、双方の薬剤が感染部位にて効果的濃度に至るよう に時間をかけて、同時あるいは連続して投与される。 本明細書で使用する「BPI タンパク質生成物」とは、天然および組換え生成し たBPI タンパク質；BPI タンパク質の天然、合成、および組換えの生物学的に活 性なポリペプチド断片；ハ イブリッド融合タンパク質および二量体を含む、BPI タンパク質の生物学的に活 性なポリペプチド変異体あるいはその断片；および、システイン置換した類似体 を含む、BPI タンパク質の生物学的に活性なポリペプチド類似体あるいはその断 片あるいはその変異体を包含する。本発明に従って投与したBPI タンパク質生成 物は、当該技術分野いかなる手段によっても生成および／または単離される。本 明細書に参考文献として取り入れた、米国特許第 5,198,541号は、rBPI₅₀と称す る組換えBPI ホロタンパク質とBPI の組換え断片を含むBPI タンパク質の発現の ための方法とそれをコードする組換え遺伝子を開示している。本明細書に参考文 献として取り入れた、1993年５月19日に出願された国際出願 No．93/04752 に対 応し、共同所有に係る、係属中の米国特許出願No．07/885,501 の一部継続出願 である1993年５月19日出願の米国特許出願 No．08/072,063 は、培地中の遺伝子 的に形質転換した哺乳類宿主細胞にて発現し、そこから分泌した組換えBPI タン パク質生成物の新規の精製方法、および安定で、均質な薬剤調製物への導入に好 適な組換えBPI 生成物の大量調製の方法を開示している。 生物学的に活性なBPI の断片(BPI断片)は、断片分子が、ホロタンパク質のア ミノ末端アミノ酸、中間アミノ酸、および／またはカルボキシ末端アミノ酸を欠 いていることを除けば、天然ヒトBPI ホロタンパク質と同じあるいは同様のアミ ノ酸配列を有する生物学的に活性な分子を含む。かような断片の例として、Ooi et al.，J．Exp．Med.，174:649(1991)に記載の約25kDの天然ヒトBPI のＮ末端 断片、およびGazzano-Santoro et al.，Infect．Immun．60: 4754-4761(1992)に 記載の、rBPI₂₃と称する、天然ヒトBPI のＮ末端アミノ酸の１位から約 193ある いは 199位をコードするＤＮＡの組換え発現生成物がある。 その文献にて、発現ベクターを、第 151位のバリンがGTC ではなくGTG でコード され、そして、第 185位が(AAGで特定された)リジンでなく(GAGで特定された)グ ルタミン酸であることを除けば、前出のGray et al.,の図１に記載された成熟し たヒトBPI のＮ末端の31残基のシグナル配列および最初の 199個のアミノ酸を有 する組換え発現生成物(rBPI₂₃)をコードするＤＮＡの源として使用している。組 換えホロタンパク質(rBPI)は、rBPI₂₃に関して述べた例外点ならびに第 417位が (GTTで特定された)バリンでなく(GCTで特定された)アラニンであることを除けば 、前出のGray et al.,の図１に記載された配列(配列番号：145および146)を有す る状態で生成する。他の例としては、本明細書に参考文献として取り入れた、19 95年３月11日に出願された国際出願 No. に対応する、共同所有に係る 、係属中の1994年３月11日に出願された米国特許出願No.08/212,132 に記載され たBPI 断片の二量体がある。好ましい二量体生成物には、単量体がBPI ホロタン パク質の約１〜175 あるいは約１〜199 のＮ末端残基を有するアミノ末端BPI タ ンパク質である二量体のBPI タンパク質生成物がある。特に好ましい二量体生成 物には、rBPI₄₂二量体と称する、１〜 193位のＮ末端残基を有するBPI 断片の二 量体がある。 BPI の生物学的に活性な変異体(BPI変異体)は、組換えハイブリッド融合タン パク質に限定するものではないが、BPI ホロタンパク質あるいはその生物学的に 活性な断片、および少なくとも一つの他のポリペプチドの一部、およびBPI 変異 体の二量体を含む。かようなハイブリッド融合タンパク質および二量体の例は、 本明細書に参考文献として取り入れた、セオファンらによる、共同所有に係る、 係属中の米国特許出願 No．07/ 885,911、その一部継続出願として1993年５月19 日に出願され た米国特許出願No．08/064,693、および対応する1993年５月19日に出願された国 際出願No．US93/04754に記載されており、アミノ末端にBPI タンパク質あるいは その生物学的に活性な断片、そして、カルボキシ末端に少なくとも一つの免疫グ ロブリンＨ鎖とその対立変異体を含むハイブリッド融合タンパク質を含む。 BPI の生物学的に活性な類似体(BPI類似体)は、BPI タンパク質生成物に限定 するものではないが、一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸で置換されたもの を含む。例えば、本明細書に参考文献として取り入れた、共同所有に係る、係属 中の1993年２月２日に出願された米国特許出願 No．08/013,801 および対応する 1994年２月２日に出願された国際出願No．US94/01235 は、システイン残基が異 なるアミノ酸で置換されたBPI とBPI 断片のポリペプチド類似体を開示している 。この出願に記載されている好ましいBPI タンパク質生成物は、BPI ホロタンパ ク質のＮ末端アミノ酸の第１位から約 193あるいは 199位のアミノ酸であり、第 132位のシステイン残基がアラニンで置換され、rBPI₂₁Δcys あるいはrBPI₂₁と 称するアミノ酸をコードするＤＮＡの発現生成物である。他の例として、例えば 、本明細書に参考文献として取り入れた、共同所有に係る、係属中の1994年３月 11日に出願された米国特許出願 No.08/212,132および対応する1995年３月11日に 出願された国際出願 No. に記載されたBPI 類似体の二量体がある。 本発明の方法において有用な他のBPI タンパク質は、組換えあるいは合成手段 で生成したBPI から誘導したペプチド(BPI誘導ペプチド)あるいは当該BPI に基 づくペプチドであり、かようなペプチドとして、本明細書に参考文献として取り 入れた、1994年９月15日に出願された米国特許出願No．08/ 〔代理人整 理 No．93,1133-H〕に対応する、共同所有に係る、 係属中の1994年９月15日に出願された国際出願 No.US94/ 、および1993 年３月12日に出願された米国特許出願No．08/ 030,644の一部継続出願である、 （1994年３月11日に出願された国際出願No．US94/02401に対応する）1993年７月 15日に出願された米国特許出願No．08/093,202の一部継続出願である、1994年１ 月14日に出願された米国特許出願No．08/183,222の一部継続出願である、1994年 ３月11日に出願された米国特許出願No．08/209,762に対応する1994年３月11日に 出願された国際出願No．US94/02465 に記載されたものがある。 目下のところ好ましいBPI タンパク質生成物には、組換え的に生成したBPI の Ｎ末端断片、特に、rBPI₂₃あるいはrBPI₂₁のような約21〜25kDの分子量を有する もの、あるいはこれらＮ末端断片の二量体（例えば、rBPI₄₂二量体）がある。さ らに、好ましいBPI タンパク質生成物としては、rBPI₅₀およびBPI 誘導ペプチド がある。 BPI タンパク質生成物の投与は、好ましくは、BPI タンパク質生成物、および 薬学的に許容される希釈剤、賦形剤あるいは担体を含む薬学的組成物として投与 される。BPI タンパク質生成物は、BPI タンパク質生成物単独、あるいは公知の 界面活性剤、他の化学療法薬、あるいは他の公知の抗微生物薬剤と組み合わせて 投与される。BPI タンパク質生成物（例えば、rBPI₅₀、rBPI₂₃）を含む好ましい 薬学的組成物は、 0.1重量％のポロキサマー188（Pluronic F-68、BASF Wyandot te、パルシパニー、ニュージャージー州）および 0.002重量％のポリソルベート 80（Tween 80、ICI Americas Inc．、ウィルミントン、デラウェア州）を含んだ クエン酸緩衝化した生理食塩水（５あるいは20mMクエン酸、150mM 塩化ナトリウ ム、pH 5.0）中での１mg/ml の濃度のBPI タンパク質生成物を含む。他のBPI タ ンパク質生成物（例えば、rBPI₂₁）を含む好ましい薬学的組成物は、５mMクエン 酸、150mM 塩化ナトリウム、 0.2％ポロキサマー188 および 0.002％ポリソルベ ート80中での２mg/ml の濃度のBPI タンパク質生成物を含む。かような好ましい 組み合わせは、本明細書に参考文献として取り入れた、1993年２月２日に出願さ れた米国特許出願No．08/012,360および1994年２月２日に出願された米国特許出 願No．08/190,869に対応する、共同所有に係る、係属中の1994年２月２日に出願 された国際出願No．US94/01239に記載されている。 好適な抗生物質と、BPI タンパク質生成物と共に投与した時に治療効果を得る ための抗生物質濃度は、in vivo モデル、あるいはin vivo 試験、例えば、in v itro最小阻止濃度(MIC)とin vivo マウス腹膜炎あるいは本明細書で述べるウサ ギ菌血症分析によって決定される。好適な抗生物質とは、細菌の細胞壁、細胞膜 、タンパク質代謝系、あるいは核酸代謝系に作用する抗生物質である。これら抗 生物質としては、β−ラクタマーゼ阻害剤の有無に関係しないβ−ラクタム、ア ミノグリコシド、テトラサイクリン、スルホンアミドならびにトリメトプリム、 バンコマイシン、マクロライド、フルオロキノロンならびにキノロン類、ポリミ キシン、および他の抗生物質を含む抗生物質あるいはこれらの組み合わせがある 。好適な抗生物質の用量と投与法は当該技術分野では公知のことであり、以下に その内容をまとめた。 ペニシリン グラム陰性細菌感染の治療のために、BPI タンパク質生成物をペニシリンと共 に投与する場合、BPI タンパク質生成物は、一般に、日量で１μg/ml〜100mg/kg の範囲の用量、好ましくは、 日量で１mg/kg 〜20mg/kg の範囲の用量で非経口的に投与される。ペニシリンは 、一般に、日量で１μg/ml〜750mg/kgの範囲の用量、好ましくは、成人の場合、 日量で24ｇ（あるいは、小児の場合、600mg/kg）を超えない用量で、好ましくは 以下の態様にて投与される。 ペニシリンＧは、好ましくは、１日当たり 600,000〜1,000,000 単位の範囲の 用量を、非経口的に、成人に対して投与する。従来の投与方法では、大抵のグラ ム陽性生物に対しては効果を示していた。肺炎球菌性髄膜炎の治療のために、ペ ニシリンＧは、２あるいは３時間の間隔を開けて、１日当たり20,000,000〜24,0 00,000単位の用量を投与していた。小児に対する、好ましいペニシリンＧの非経 口投与量は、１日当たり 300,000〜 1,000,000単位である。１単位のペニシリン Ｇは、0.6 μg の純粋なナトリウムペニシリンＧ（すなわち、１mgは1667単位に 相当する）を含む。 アモキシシリンは、好ましくは、３回に等分して、１日当たり 750mg〜1.5gの 範囲の用量を、非経口的に、成人に対して投与する。小児に対するアモキシシリ ンの好ましい非経口投与の量は、３回に等分して、１日当たり20〜40mg/kg の範 囲の用量である。アモキシシリンは、β−ラクタマーゼ阻害剤である、クラブラ ン酸と組み合わせても使用できる。アモキシシリン／クラブラン酸塩の組み合わ せの 250mgの用量は、 250mgのアモキシシリンと、125 あるいは62.5mgのいずれ かのクラブラン酸を含む。この組み合わせは、成人に対しては好ましくは、８時 間間隔で、３回に等分して、１日当たり 750mgの用量で、また、重篤な感染症に ついては、３回に等分して、１日当たり 1.5ｇの用量で経口的に投与する。小児 に対しては、３回に等分して、１日当たり20〜40mg/kg の用量を経口的に投与 する。 アンピシシリンは、好ましくは、３回もしくは４回に等分して、１日当たり６ 〜12ｇの範囲の用量を、非経口的に、成人に対して投与する。小児に対するアモ キシシリンの好ましい非経口投与の量は、３回もしくは４回に等分して、１日当 たり50〜200mg/kgの範囲の用量である。小児での１日当たり400mg/kgに至る用量 、あるいは成人での１日当たり12ｇを、髄膜炎の治療のために非経口的に投与す る。アンピシリンは、β−ラクタマーゼ阻害剤である、スルバクタムと組み合わ せても使用できる。アンピシリン／スルバクタムとの組み合わせの1.5gの用量は 、１ｇのアンピシリンと、0.5gのスルバクタムを含む。この組み合わせは、成人 に対しては好ましくは、６時間間隔で、４回に等分して、１日当たり12ｇの用量 を超えないように、１日当たり６〜12ｇの用量で非経口的に投与する。 アズロシリンは、好ましくは、４回〜６回に等分して、１日当たり８〜18ｇの 範囲の用量を、非経口的に、成人に対して投与する。 カルベニシリンは、好ましくは、４回〜６回に等分して、あるいは連続注入に より、１日当たり30〜40ｇの範囲の用量を、非経口的に、成人に対して投与する 。生命にかかわる感染症を患った小児を治療するために、１日当たり600mg/kgに 至る用量が使用される。 メズロシリンは、好ましくは、４回〜６回に等分して、１日当たり 100〜300m g/kgの用量を、非経口的に、成人に対して投与する。通常の用量は、１日当たり 16〜18ｇ/kg であり、生命にかかわる感染症を患った患者を治療するために、４ 時間間隔で、６回に等分して、１日当たり24ｇの用量を超えないように、１日当 たり350mg/kgに至る用量が投与される。 ナフシリンは、好ましくは、４時間間隔で、６回に等分して、１日当たり３ｇ の用量、重篤な患者にはその倍量を、静脈から成人に対して投与する。従来の投 与方法では、大抵のグラム陽性生物に対して効果を示していた。小児に対する、 好ましい非経口投与量は、12時間間隔で、２回に等分して、１日当たり20〜50mg /kg である。ナフシリンの好ましい経口投与量は、４〜６回に等分して、１日当 たり１〜６ｇの用量の範囲である。 オキサシリンは、好ましくは、４〜６回に等分して、１日当たり２〜12ｇの用 量を、非経口的に成人に対して投与する。従来の投与方法では、大抵のグラム陽 性生物に対して効果を示していた。小児に対して、オキサシリンは、１日当たり 100〜300mg/kgの用量が投与される。 ピペラシリンは、好ましくは、２〜４回に等分して、100mg/kgあるいは１日当 たり６ｇの用量から、４〜６回に等分して、１日当たり24ｇの用量に至る用量を 、非経口的に成人に対して投与する。さらに高用量が副作用を呈すること無く、 使用されている。 ティカルシリンは、好ましくは、４〜６回に等分して、１日当たり４〜18ｇの 用量を、非経口的に成人に対して投与する。通常の用量は、１日当たり 200〜30 0mg/kgである。小児に対するティカルシリンの好ましい非経口投与量は、３、４ もしくは６回に等分して、１日当たり50〜300mg/kgである。ティカルシリン／ク ラブラン酸塩との組み合わせは、４〜６回に等分して、１日当たり 200〜300mg/ kg（ティカルシリン含量に基づく）の用量を、非経口的に成人に対して投与する 。成人に対する通常の用量は、４〜６回時間間隔にて(３ｇのティカルシリンと1 00mg のクラブラン酸を含む)3.1ｇを投与する。３ｇのティカルシリンと200mg のクラブラン酸を含む 3.2ｇの組み 合わせも使用できる。 一般に、ペニシリンあるいはセファロスポリン各々の筋内注射は２ｇまでが限 度であり、より大きい用量は、大きな体積を有する異なる筋肉に複数の注射を行 うことで投与すべきである。 セファロスポリン グラム陰性細菌感染の治療のために、BPI タンパク質生成物をセファロスポリ ンと共に投与する場合、BPI タンパク質生成物は、一般に、日量で１μg/kg〜10 0mg/kgの範囲の用量、好ましくは、日量で１mg/kg 〜20mg/kg の範囲の用量で非 経口的に投与される。セファロスポリンは、一般に、日量で１μg/kg〜500mg/kg の範囲の用量、好ましくは、日量で16ｇを超えない用量で、好ましくは以下の態 様にて投与される。 セファマンドールは、好ましくは、３回に等分して、８時間間隔で、１日当た り 1.5ｇから、生命にかかわる感染症に対しては、６回に等分して、４時間間隔 で、１日当たり12ｇに至る範囲の用量を、非経口的に、成人に対して投与する。 小児に対するセファマンドールの好ましい非経口投与の量は、３〜６回に等分し て、１日当たり12ｇを超えない範囲で、１日当たり50〜150mg/kgの範囲の用量で ある。 セファゾリンは、好ましくは、３回に等分して、８時間間隔で、１日当たり75 0mg の用量を、非経口的に、成人に対して投与する。生命にかかわる感染症を患 った患者に関しては、４回に等分して、６時間間隔で、１日当たり６ｇの用量を 、また、稀な症例の場合には、１日当たり12ｇまでの用量が投与される。小児に 対するセファゾリンの好ましい非経口投与の量は、３もしくは４回に等分して、 １日当たり20〜50mg/kg 、重篤な感染症に対しては１日当たり 100mg/kg である 。 セフォニシドは、好ましくは、１日当たり１回、500mg の用量から、生命にか かわる感染症を患った患者に対する１日当たり１回、２ｇの用量を成人に対して 投与する。筋内投与は、１ｇの注射を二回に分けて２ｇを投与する。 セフォペラゾンは、好ましくは、２回に等分して、12時間間隔で、１日当たり ２ｇから、生命にかかわる感染症に対しては、２、３もしくは４回に等分して、 １日当たり12ｇに至る範囲の用量を、非経口的に、成人に対して投与する。１日 当たり16ｇまでは、合併症を引き起こさずに投与できる。 セフォテタンは、好ましくは、２回に等分して、12時間間隔で、１日当たり１ 〜４ｇの用量を、非経口的に、成人に対して投与する。１日当たり６ｇを超えな い範囲であれば、生命にかかわる感染症に対しては、より高用量のセフォテタン を投与することができる。 セフォタキシムは、好ましくは、１日当たり１〜12ｇの用量を、生命にかかわ る感染症に対しては１日当たり12ｇ（４時間間隔で２ｇ）の用量を超えない範囲 で、非経口的に、成人に対して投与する。小児に対するセフォタキシムの好まし い非経口投与量は、４〜６回に等分して、１日当たり50〜180mg/kgである。 セフォキシチンは、好ましくは、３、４もしくは６回に等分して、１日当たり ３〜12ｇの用量を、非経口的に、成人に対して投与する。小児に対するセフォキ シチンの好ましい非経口投与量は、４〜６回に等分して、１日当たり12ｇの用量 を超えない範囲で、１日当たり80〜160mg/kgである。 セフタジダイムは、好ましくは、２〜３回に等分して（８あるいは12時間間隔 で）、１日当たり500mg の用量から、１日当たり最高６ｇの用量に至る範囲の用 量を、非経口的に、成人に 対して投与する。小児に対するセフタジダイムの好ましい静脈からの投与量は、 １日当たり30〜50mg/kg から１日当たり最高６ｇの用量である。 セフティゾキシムは、好ましくは、２回に等分して、12時間間隔で、１日当た り１ｇの用量から、生命にかかわる感染症に対しては、３回に等分して、８時間 間隔で、１日当たり12ｇの用量に至る範囲の用量を、非経口的に、成人に対して 投与する。通常の成人に対する用量は、８〜12時間間隔で、１〜２ｇである。小 児に対する好ましい非経口投与の量は、日量として200mg/kgの、６あるいは８時 間間隔で50mg/kg である。 セフトリアキソンは、好ましくは、２回に等分して、12時間間隔で、１日当た り１〜２ｇの用量を、非経口的に、成人に対して投与する。１日当たり４ｇを超 えない用量の高用量が投与できる。小児に対するセフトリアキソンの好ましい非 経口投与の量は、１日当たり２ｇを超えない範囲で、１日当たり50〜75mg/kg で ある。髄膜炎に対しては、１日当たり４ｇを超えない範囲で、１日当たり 100mg /kg セフトリアキソンが投与される。 セフロキシムは、好ましくは、３回に等分して、８時間間隔で、１日当たり2. 25〜 4.5ｇの用量を、非経口的に、成人に対して投与する。生命にかかわる感染 症に対しては、４回に等分して、６時間間隔で、１日当たり６ｇの用量を、また 、髄膜炎に対しては、３回に等分して、８時間間隔で、１日当たり９ｇの用量を 投与する。小児に対するセフロキシムの好ましい非経口投与の量は、３〜４回に 等分して、１日当たり50〜 150mg/kg であり、髄膜炎の場合には、１日当たり24 0mg/kgである。 セファレキシンは、経口投与のために製剤化され、好ましくは、２〜４回に等 分して、１日当たり１〜４ｇの用量を、経口 的に、成人に対して投与する。小児に対する好ましい投与の量は、等分して、１ 日当たり20〜50mg/kg であり、重症の感染症の場合には用量を倍量にする。 セファロシンは、通常は、１日当たり８〜12ｇの用量を、非経口的に、成人に 対して投与する。 他のβ−ラクタム グラム陰性細菌感染の治療のために、BPI タンパク質生成物をイミペネム抗生 物質と共に投与する場合、BPI タンパク質生成物は、一般に、日量で１μg/kg〜 100mg/kgの範囲の用量、好ましくは、日量で１mg/kg 〜20mg/kg の範囲の用量で 非経口的に投与される。イミペネムは、一般に、日量で１μg/kg〜100mg/kgの範 囲の用量で、好ましくは以下の態様にて投与される。 イミペネムは、イミペネムを迅速に不活性化する腎臓のジペプチダーゼ酵素の 阻害剤であるシラスティンとの組み合わせの形態にて入手できる。この組み合わ せは、好ましくは、２回に等分して、12時間間隔で、１日当たり１〜 1.5ｇの用 量を、筋内投与にて、成人に対して投与する。１日当たり 1.5ｇを超える量の筋 内投与は避けるべきである。この組み合わせは、好ましくは、４回に等分して、 ６時間間隔で、１日当たり１〜４ｇの用量を、静脈投与にて、成人に対して投与 するが、１日当たり50mg/kg あるいは４ｇを超える用量の投与は避けるべきであ る。 グラム陰性細菌感染の治療のために、BPI タンパク質生成物をモノバクテム抗 生物質と共に投与する場合、BPI タンパク質生成物は、一般に、日量で１μg/kg 〜100mg/kgの範囲の用量、好ましくは、日量で１mg/kg 〜20mg/kg の範囲の用量 で非経口 的に投与される。モノバクテムは、一般に、日量で１μg/kg〜200mg/kgの範囲の 用量で、好ましくは以下の態様にて投与される。 アズトレオナムは、好ましくは、２回に等分して、12時間間隔で、１日当たり １ｇの用量から、生命にかかわる感染症に対しては、３〜４回に等分して、１日 当たり８ｇの推奨された最高用量までの用量を投与する。 アミノグルコシド グラム陰性細菌感染の治療のために、BPI タンパク質生成物をアミノグルコシ ドと共に投与する場合、BPI タンパク質生成物は、一般に、日量で１μg/kg〜10 0mg/kgの範囲の用量、好ましくは、日量で１mg/kg 〜20mg/kg の範囲の用量で非 経口的に投与される。アミノグルコシドは、一般に、日量で15mg/kg を超えず、 日量で１μg/kg〜20mg/kg の範囲の用量で、好ましくは以下の態様にて投与され る。 アミノグルコシドを投与する場合、用量の適合性と安全性を確保するために、 血清ピークと通しの濃度を測定するのが望ましい。毒性ピークと通しの濃度を避 けるために、一般に、用量は調整される。アミカシンは、好ましくは、１日当た り 1.5ｇの用量を超えない範囲にて、２〜３回に等分して、８もしくは12時間間 隔で、１日当たり15mg/kg の用量を、非経口的に、成人および小児に対して投与 する。不完全な感染症に対しては、２回に等分して、１日当たり 500mgのアミカ シンを投与する。35μg/mlを超えるアミカシンの長い血清ピーク濃度および10μ g/mlを超える長い通し濃度を避けるために、用量は調整すべきである。 ゲンタマイシンは、好ましくは、３回に等分して、８時間間 隔で、１日当たり３mg/kg の用量を、非経口的に、成人に対して投与する。生命 にかかわる感染症に対しては、３〜４回に等分して、１日当たり５mg/kg までの ゲンタマイシンを投与し、臨床状態に応じ可能な限り速やかに１日当たり３mg/k g の用量まで濃度を落とす。小児に対するゲンタマイシンの好ましい非経口投与 の量は、１日当たり６〜7.5mg/kgである。12μg/mlを超えるゲンタマイシンの長 い血清ピーク濃度および２μg/mlを超える長い通し濃度を避けるために、用量は 調整すべきである。 ネチルマイシンは、好ましくは、２回に等分して、12時間間隔で、１日当たり ３mg/kg の用量から、重大な全身感染に対しては、２もしくは３回に等分して、 １日当たり 6.5mg/kg の用量までの範囲の用量を、非経口的に、成人に対して投 与する。 小児に対する好ましい非経口投与の量は、２もしくは３回に等分して投与する 、１日当たり 5.5〜８mg/kg である。16μg/mlを超えるネチルマイシンの長い血 清ピーク濃度および４μg/mlを超える長い通し濃度を避けるために、用量は調整 すべきである。 トブラマイシンは、好ましくは、３回に等分して、８時間間隔で、１日当たり ３mg/kg の用量を、非経口的に、成人に対して投与する。生命にかかわる感染症 に対しては、３〜４回に等分して、１日当たり５mg/kg までのトブラマイシンを 投与し、臨床状態に応じ可能な限り速やかに１日当たり３mg/kg の用量まで濃度 を落とす。小児に対するトブラマイシンの好ましい非経口投与の量は、１日当た り６〜7.5mg/kgである。12μg/mlを超えるトブラマイシンの長い血清ピーク濃度 は避けるべきであり、また、毒性に関与する２μg/mlを超える長い通しレベルは 、組織での蓄積として現れる。 BPI タンパク質生成物と、アミカシン、ゲンタマイシン、ネチルマイシンおよ びトブラマイシンを含むアミノグリコシドは、治療効果を得るに必要なこれら毒 性の抗生物質の用量の低下を可能ならしめる。 テトラサイクリン グラム陰性細菌感染の治療のために、BPI タンパク質生成物をテトラサイクリ ンと共に投与する場合、BPI タンパク質生成物は、一般に、日量で１μg/kg〜10 0mg/kgの範囲の用量、好ましくは、日量で１mg/kg 〜20mg/kg の範囲の用量で非 経口的に投与される。テトラサイクリンは、一般に、日量で１μg/kg〜50mg/kg の範囲の用量で、好ましくは以下の態様にて投与される。 テトラサイクリン抗生物質は、一般に、１日当たり１〜２ｇの用量を、成人に 対して投与する。例外はドキシサイクリンであって、これは１日当たり 100〜 2 00mgの用量を成人に対して投与し、また、１日当たり２mg/lb の用量を小児に対 して投与する。テトラサイクリンは、２回に等分して、１日当たり0.5 〜２ｇの 用量を、非経口的に、成人に対して、また、１日当たり10〜20mg/kg の用量を、 非経口的に、小児に対して投与する。 スルホンアミド グラム陰性細菌感染の治療のために、BPI タンパク質生成物をスルホンアミド あるいはトリメトプリムと共に投与する場合、BPI タンパク質生成物は、一般に 、日量で１μg/kg〜100mg/kgの範囲の用量、好ましくは、日量で１mg/kg 〜20mg /kg の範囲の用量で非経口的に投与される。スルホンアミドあるいはト リメトプリムは、好ましくは、日量で960mg のトリメトプリムと4.8gのスルファ メソキサゾールの合計用量を超えない範囲で、一般に、日量で１μg/kg〜150mg/ kgの範囲の用量で、好ましくは以下の態様にて投与される。 トリメトプリム／スルファメソキサゾールの組み合わせは、トリメトプリムと スルファメソキサゾールが１：５の比（例えば、16mgのトリメトプリムと80mgの スルファメソキサゾール）で含有された製剤の形態で入手できる。Pneumocystis carinii による感染に対して、この組み合わせを、３〜４回等分して、１日当 たり（トリメトプリム成分の重量に基づいた）20mg/kg の用量から、１日当たり 960mg のトリメトプリムと4.8gのスルファメソキサゾールからなる推奨された最 高用量に至る用量を投与できる。トリメトプリム単独で、好ましくは、１日当た り200mg の用量を成人に対して経口的に投与する。スルファメソキサゾール単独 では、好ましくは、１日当たり２〜３ｇの用量を成人に対して、また、１日当た り50〜60mg/kg の用量を小児に対して経口的に投与する。 フルオロキノロン グラム陰性細菌感染の治療のために、BPI タンパク質生成物をフルオロキノロ ンあるいはキノロンと共に投与する場合、BPI タンパク質生成物は、一般に、日 量で１μg/kg〜100mg/kgの範囲の用量、好ましくは、日量で１mg/kg 〜20mg/kg の範囲の用量で非経口的に投与される。フルオロキノロンあるいはキノロンは、 好ましくは、日量で１ｇを超えない範囲で、一般に、日量で１μg/kg〜50mg/kg の範囲の用量で、好ましくは以下の態様にて投与される。 ノルフロキサシンは、好ましくは、２回に等分して、12時間 間隔で、日量で 400〜 800mgの用量を、経口的に、成人に対して投与する。シノ キサシンは、好ましくは、２もしくは４回に等分して、１日当たり１ｇの用量を 、経口的に、成人に対して投与する。シプロフロキサシンは、好ましくは、日量 で 400〜 800mgの用量を、成人に対して静脈から、あるいは、２回に等分して、 12時間間隔で、日量で 500〜1500mgの用量を、経口的に投与する。オフロキサシ ンは、好ましくは、日量で 400〜 800mgの用量を、成人に対して静脈から、ある いは、２回に等分して、12時間間隔で、日量で 400〜 800mgの用量を、経口的に 投与する。 バンコマイシン グラム陰性細菌感染の治療のために、BPI タンパク質生成物をバンコマイシン と共に投与する場合、BPI タンパク質生成物は、一般に、日量で１μg/kg〜100m g/kgの範囲の用量、好ましくは、日量で１mg/kg 〜20mg/kg の範囲の用量で非経 口的に投与される。バンコマイシンは、一般には、日量で１mg/kg 〜50mg/kg の 範囲の用量で投与され、好ましくは、２もしくは４回に等分して、６もしくは12 時間間隔で、１日当たり２ｇの用量を非経口的に成人に対して投与する。小児に 対する好ましい投与量は、４回に等分して、６時間間隔で投与する、40mg/kgの 用量である。従来の投与方法において、バンコマイシンは大抵のグラム陽性生物 に対しては効果を示していた。 マクロライド グラム陰性細菌感染の治療のために、BPI タンパク質生成物をマクロライドと 共に投与する場合、BPI タンパク質生成物は、一般に、日量で１μg/kg〜100mg/ kgの範囲の用量、好ましくは、 日量で１mg/kg 〜20mg/kg の範囲の用量で非経口的に投与される。マクロライド は、一般には、日量で１μg/kg〜100mg/kgの用量で、好ましくは、以下の態様に て投与される。 エリスロマイシンは、好ましくは、４回に等分して、６時間間隔で、あるいは 連続注入により、１日当たり15〜20mg/kg の用量を、静脈から成人および小児に 対して投与する。非常に重篤な感染症の症例の場合、１日当たり４ｇに至る用量 が使用される。 クラリスロマイシンは、好ましくは、２回に等分して、12時間間隔で、日量 5 00mg〜１ｇの用量を、経口的に、成人に対して投与する。 アジスロマイシンは、好ましくは、治療初日に500mg の用量を成体に、経口的 に投与し、全投与量が 1.5ｇになるように、その後４日間にわたって、１日１回 、250mg の用量を投与する。 その他 グラム陰性細菌感染の治療のために、BPI タンパク質生成物を他の抗生物質と 共に投与する場合、BPI タンパク質生成物は、一般に、日量で１μg/kg〜100mg/ kgの範囲の用量、好ましくは、日量で１mg/kg 〜20mg/kg の範囲の用量で非経口 的に投与される。 ポリミキシンＢは、一般には、日量で１単位/kg 〜 45,000単位/kg の範囲の 用量で投与され、好ましくは、２回に等分して、12時間間隔で、１日当たり15,0 00〜25,000単位/kg の範囲の用量で、成人および小児に対して、静脈から投与す る。これら抗生物質の注射投与は大きな痛みを伴うものであるが、１日当たり25 ,000〜30,000単位/kg の範囲の用量で、筋内に投与される。１日当たり45,000単 位/kg というポリミキシンＢの 用量が、新生児の Pseudomonas aeruginosa 敗血症の治療のための臨界臨床試験 にて使用されている。ポリミキシンＢは、 Pseudomonas aeruginosa 髄膜炎の治 療手段の一つであり、成人および若年者に対しては、３〜４日間、１日１回、50 ,000単位の用量を、次いで、１日おきに50,000単位の用量を、好ましくは、包膜 内に投与し；また、２歳以下の小児に対しては、３〜４日間、20,000単位の用量 を、次いで、１日おきに25,000単位の用量を、包膜内に投与する。 クロラムフェニコールは、好ましくは、４回に等分して、１日当たり50mg/kg の用量を、静脈から成人に対して投与するものであり、症例によっては、１日当 たり100mg/kgの用量まで投与できる。小児の場合、非常に重篤な感染症の症例に おいては１日当たり100mg/kgの用量まで投与できるが、好ましくは、１日当たり 25mg/kg の用量を、静脈から投与する。 クリンダマイシンは、好ましくは、２、３あるいは４回に等分して、１日当た り600mg 〜 4.8ｇの範囲の用量を、非経口的に成人に対して投与する。各筋内注 射において、600mgの用量を超えない用量とするのが望ましい。小児の場合、ク リンダマイシンは、好ましくは、３あるいは４回に等分して、１日当たり15〜40 mg/kg の範囲の用量を、非経口的に投与する。 代謝機能の低下および／またはかような機能低下状態の患者の薬剤排出機能が 故に、腎障害あるいは肝不全の患者に対するすべての抗微生物薬剤の用量は調整 すべきである。一般に体重の関係から、小児に対する用量は減じるべきである。 最適の効果用量、およびBPI タンパク質生成物と抗生物質の同時投与のための投 与方法を、当業者であれば容易に調整できる。 本発明の他の態様ならびに利点は、以下の実施例を考慮すれば理解されるであ ろう。実施例１は、異なるE．coli の二つの株に投与したゲンタマイシンとBPI の殺菌活性を述べている。実施例２は、他のグラム陰性株に対するゲンタマイシ ンとBPI の殺菌活性を述べている。実施例３は、異なるE．coli の二つの株に投 与したポリミキシンＢとBPI の殺菌活性を述べている。実施例４は、他のグラム 陰性株に対するポリミキシンＢとBPI の殺菌活性を述べている。実施例５は、in vivo マウス腹膜炎 E．coli O111:B4チャレンジモデルでの、BPI タンパク質生 成物とセファロスポリン抗生物質による効果を述べている。実施例６も、in viv o マウス腹膜炎 E．coli O111:B4チャレンジモデルでの、BPI タンパク質生成物 とセファロスポリン抗生物質による効果に関する。実施例７は、in vivo マウス 腹膜炎 E．coli O7:K1チャレンジモデルでの、BPI タンパク質生成物とセファロ スポリン抗生物質による効果に関する。実施例８は、in vivo ウサギ菌血症 E． coli O7:K1チャレンジモデルでの、BPI タンパク質生成物とセファロスポリン抗 生物質による効果を述べている。実施例９は、in vivo マウス腹膜炎 E．coli O 7:K1チャレンジモデルでの、BPI タンパク質生成物とアミノグリコシド抗生物質 による効果を述べている。実施例10は、セフトリアキソン耐性グラム陰性生物の 抗生物質感受性に関する、BPI タンパク質生成物のin vitroでの効果に関する。 実施例11〜19は、様々なグラム陰性生物に関する、BPI タンパク質生成物の抗生 物質感受性向上効果の大規模スクリーニングを述べている。すなわち、Pseudomo nas aeruginosaおよび他のPseudomonas 種（実施例11）、E．coli（実施例12） 、Citrobacter（実施例13）、Klebsiella（実施例14）、Enterobacter（実施例1 5）、Serratia（実施例16）、 Proteus（実施例17）、Providencia（実施例18）、Morganella（実施例19）、Ac inetobacter（実施例20）、およびSalmonellaとShigella（実施例21）である。 実施例23では、代表的な生物、Acinetobacter anitratus、Enterobacter cloaca e、およびE．coli の二つの株に関する様々なBPI タンパク質生成物の効果を検 定している。実施例25は、BPI タンパク質生成物とテトラサイクリンあるいはゲ ンタマイシンの同時投与による E．coli O111:B4に関する効果を述べている。 実施例１ ゲンタマイシンおよびBPI の E．coli 0111:B4グラム 陰性生物への投与による相乗殺菌効果 本実施例では、抗生物質ゲンタマイシンと同時投与したBPI タンパク質生成物 の殺菌効果に対するE．coli 生物の感受性を決定するために、マイクロ希釈プレ ート最小阻止濃度(MIC)分析を行った。この分析は、BPI 感受性生物E．coli J5 （E．coli 0111:B4のRcラフ変異体）およびBPI 耐性生物E．coli 0111:B4 対し て行った。 具体的には、空気の存在下で、37℃で、生物を血液寒天プレートにて一晩成長 させ、次に、単一コロニーを栄養培地No．２(Oxoid CM67)の100ml にてサブ培養 し、そして、対数増殖期に５時間15分にわたって震盪器にて緩やかに攪拌しなが らインキュベーションした。50mlの細菌懸濁液を、Denley BR401ベンチ型遠心分 離機で、4000rpm で、15分間遠心し、得られたペレットを再懸濁し、滅菌済標準 生理食塩水で２度洗浄した。1:10の希釈液が、(約４×10⁹細胞/ml に対応する)3 25nmでの光学密度が0.9(+/-0.01)になるように細菌を再懸濁し、（後述する）「 BPI 培地」にて４×10⁶細胞/ml の最終濃度になるように希釈した。 すべての分析およびBPI タンパク質生成物ならびにゲンタマイシンの希釈は、 水酸化ナトリウムでpH 6.00 に緩衝化した0.1M MOPS(Sigma M-1254)を有する50 ％ペプトン水(Oxoid L37、Lot: 25851279)からなる「BPI 培地」を用いて行った 。これにより、細菌の成長を阻害せず、かつ（至適ではないが）BPI 活性を容易 に測定できるpHに調整された二価カチオン濃度と、低濃度のタンパク質を含む栄 養培地が提供される。 rBPI₂₃とゲンタマイシン(Sigma G-1264、Lot: 91H00325)を、 ウェル当たりの 200μｌの最終体積にて、100 μｌの希釈したBPI 、50μｌの希 釈したゲンタマイシン、および50μｌの細菌懸濁液となるようにBPI 培地で希釈 し、1000nM（25μg/ml）からの連続希釈濃度のBPI と、10⁶細胞/ml の固定濃度 である32μg/mlのゲンタマイシンとした。そして、チェッカーボードを丸底96ウ ェルマイクロ滴定プレート(Greiner No．650180)に作成し、18時間にわたって、 空気の存在下で、37℃で、開放性の蓋を用いてインキュベートした。そして、プ レートを目視で、次いで、約 0.1の光学密度に相当する生育度を 580nmにて自動 プレートリーダー(Titretek Multiscan plus)を用いて測定した（表１のE．coli J5、および表３のE．coli 0111:B4 を参照のこと）。10μｌの培養物を 990μ ｌの栄養培地 No.2 で希釈することにより、二つのE．coli プレート（表２の E ．coli J5 、および表４のE．coli 0111:B4 を参照のこと）に関する生育度を近 接したウェルにて生存菌の計数を行い、そして分散プレートを血液寒天上にて25 μｌの培養物を用いて調製した。BPI タンパク質生成物ならびに抗生物質の阻害 活性は、0.5 未満の部分阻害濃度指数(FIC)は相乗的とし、１の場合は添加的と し、そして１を超え２に満たない場合は無関係と評価する、Eliopoulos and Moe llering In Antibiotics in Laboratory Medicine，3rd ed．（Lorian，V.，Ed. ）pp.432-492，Williamsand Wilkins，Baltimore Maryland（1991）の方法によ って評価した。 BPI 感受性E．coli J5と0.25μg/mlの濃度のゲンタマイシンを用いることで、 正の相乗作用がrBPI₂₃とゲンタマイシンの間で認められ、BPI のMIC も 500nM（ 12.5μg/ml）から62.5nM（1.56μg/ml）へと約 1/8倍に減少し、同様の減少が最 小殺菌濃度(MBC)についても認められた。 実施例２ ゲンタマイシンおよびBPI の他のグラム陰性 生物への投与による相乗殺菌効果 本実施例では、抗生物質ゲンタマイシンと同時投与したBPI タンパク質生成物 の細胞毒性に対する様々なグラム陰性生物の感受性を決定するために、実施例１ に記載の方法に従って、MIC分析を行った。これら分析の結果を、下記表５に示 した。 E．coli J5、E．coli 01:K1、E．coli（S2252）、K．oxytoca、E．tarda、Salmo nella typhimurium(S2136)およびSalmonella arizonaeに対して強い相乗的殺菌 作用が認められた。 E．aloacae(10005)、E．gergoviae(11434)、P．aeruginosa(10332)およびP．aer uginosa（10662）に対して（「添加(+)」と表示した）相乗的殺菌作用が認めら れた。rBPI₂₃とゲンタマイシンの同時投与では、試験したその他のグラム陰性細 菌に対しては、単なる添加効果、無関係、あるいは中間的な効果しか認められな かった。 実施例３ ポリミキシンＢおよびBPI のE．coli J5 およびE．coli 0111:B4 グラム陰性生物 への投与による相乗殺菌効果 本実施例では、抗生物質ポリミキシンＢと同時投与したBPI タンパク質生成物 の細胞毒性に対するE．coli J5およびE．coli 0111:B4 の感受性を決定するため に、実施例１に記載の方法に従って、MIC 分析を行った。ポリミキシンＢ溶液は 、１ml当たり1.595mg のポリミキシンＢ硫酸塩粉末の溶液を調製し、12.54ml 当 たり20μｇの注射用剤となるように、当該溶液を無菌水で希釈した。 rBPI₂₃とE．coli 0111:B4 を用いたポリミキシンＢとの間では強い相乗作用が 認められた（表８および９参照）が、表６および７に示した結果にあるように、 BPI をE．coli J5に適用した場合には、ポリミキシンＢとBPI との間では、相乗 的殺菌効果は認められなかった。 実施例４ ポリミキシンＢおよびBPI の他のグラム 陰性生物への投与による相乗殺菌効果 本実施例では、抗生物質ポリミキシンＢと同時投与したBPI タンパク質生成物 の細胞毒性に対する様々なグラム陰性生物の感受性を決定するために、実施例１ に記載の方法に従って、MIC 分析を行った。これら分析の結果を、以下の表10に 示した。 これら分析結果では、従来の抗生物質の濃度の1/20〜1/10のレベルである、 0 .3μg/mlの濃度のポリミキシンＢの使用において、添加あるいは相乗効果が認め られた。 実施例５ 活性 E．COLI 0111:B4細菌を腹膜内投与したマウス の生存効果に対するIN VIVO でのセファマンドール およびBPI タンパク質生成物の相乗効果 本実施例では、BPI タンパク質生成物の有無による、半合成の広範なスペクト ルを有するセファロスポリン抗生物質であるセファマンドールナファテ抗生物質 (MANDOL(登録商標)、Lilly)を、BPI タンパク質生成物の殺菌／成長阻害効果に 対して感受的でない株である、活性 E．coli 0111:B4細菌のLD_90-100の用量レベ ルを投与したICR マウスを用いて評価した。具体的には、15匹のICR マウスの４ つのグループが静脈より細菌(1.8×10⁹ CFU/マウス)が投与されるよう、セファ マンドールナファテ抗生物質(MANDOL（登録商標）、100mg/kg）あるいは生理食 塩水の静脈注射、次いで、rBPI₂₁(500μg/マウス)あるいはBPI 緩衝液の静脈注 射を行った。そして、７日間にわたってマウスの生存に関して評価し、その結果 を図１に示した。 BPI タンパク質生成物とセファマンドールの同時投与、あるいはセファマンド ールのみの投与では、緩衝液対照と比較して、 E．coli 0111:B4で処置したマウ スでは顕著な保護効果が認められた（それぞれ、ｐ≦0.001 およびｐ≦0.05）。 セファマンドールを伴わずに投与したBPI タンパク質生成物の保護効果は、明ら かでなかった。セファマンドールのみで処置した場合と比較して、BPI タンパク 質生成物とセファマンドールの同時投与では、ｐ≦0.1 にて改善された保護効果 が認められた。これら結果は、BPI タンパク質生成物とセファマンドールの同時 投与が、E．coli 0111:B4に対して相乗的治療効果を有することを示している。 実施例６ 活性 E．COLI 0111:B4細菌を腹膜内投与したマウスの 生存効果ならびに血液および腹膜洗浄液からの細菌除 去効果に対するIN VIVO でのセファマンドールおよび BPI タンパク質生成物の相乗効果 セファロスポリン抗生物質とBPI タンパク質生成物の保護効果を、BPI タンパ ク質生成物の殺菌活性に対する耐性を備えた株である E．coli 0111:B4に静脈投 与して評価した。以下の手順に従って、分析を行った。５〜７週齢の雄のICR マ ウス(Simonzsen Laboratories、Gilroy California)を、調製環境下、暗／明サ イクルの下で飼育し、食料と水を自由に摂取させた。マウスに、LD₉₀（２×10⁹ CFU/マウス）に近い細菌用量 0.5mlを静脈投与した。細菌投与して直ちに、動物 に対して静脈から、(1) 賦形剤のみ、(2) 500 μg/マウスのrBPI₂₁と賦形剤、(3 ) 100mg/kgのセファマンドールナファテ(MANDOL(登録商標)燐酸緩衝化生理食塩 水、Eli Lilly、Indianapolis、Indiana)と賦形剤、あるいは(4)500μg のrBPI_{2 1} と100mg/kgのセファマンドールを投与した。 ４つのグループの生存状態を、７日間モニターした。Chi-スクエア試験によっ て、生存データを統計学的に分析した。 2.5×10⁹ CFU のE．coli 0111:B4 の細菌を用いた別個の実験において、細菌攻 撃に続く異なる時間での培養のために、血液および腹膜洗浄液を回収した。後眼 窩から血液を採取した。３mlの燐酸緩衝化生理食塩水の静脈注射後に、少なくと も１mlの腹膜洗浄液を採取した。血液あるいは腹膜洗浄液試料の10倍希釈液をト リプチカーゼ大豆寒天プレートに播種し、37℃で一晩インキュベートし、そして コロニーを計測することで、細菌数（CFU/mlで表現した）を決定した。このデー タの統計学 的比較を、分散の分析によって実施した。 図２には、セファマンドール(100mg/kg)、rBPI₂₁(500μg)、あるいはこの二つ の薬剤の同時投与による生存効果を示している。BPI タンパク質生成物のみでは 効果は認められなかったが、セファマンドール単独では、顕著ではないにしても 、生存効果の向上が認められた。これに対して、セファマンドールとrBPI₂₁の同 時投与は、いずれか一方の投与によって達成された以上の顕著な生存効果の増大 が認められた（ｐ＜0.05）。図３と図４は、rBPI₂₁の単独投与では、細菌攻撃の 後の血液あるいは腹膜洗浄液での細菌数の減少に至らなかったものの、セファマ ンドール単独の処置では双方の細菌数の減少に至った（ｐ＜0.01対賦形剤）。し かしながら、セファマンドールとrBPI₂₁の同時投与は、２時間ならびに６時間の 時点で、セファマンドール単独による場合の二桁以上もの腹膜洗浄液での細菌数 減少に至っており（ｐ＜0.01：同時投与対セファマンドール単独）、24時間の時 点で完全に消失した。セファマンドールとrBPI₂₁の同時投与を受けたマウスの血 液では、いずれの時点においても、細菌は存在しなかった。 よって、BPI タンパク質生成物、rBPI₂₁と、セファロスポリン抗生物質、セフ ァマンドールの準至適用量の同時投与によって、優れた治療効果が得られた。こ のデータは、BPI タンパク質生成物とセファロスポリン抗生物質は、相乗的治療 効果を奏することを示している。セファマンドール単独処置によって、賦形剤処 置した動物と比較しておおよそ二桁もの細菌数の減少に至っているので、播種時 に10⁷ CFU にまで細菌数が減少した場合に、rBPI₂₁単独により細菌数が減少した か否かを決定するために、他の実験を行った。この実験から得られたデータは、 rBPI₂₁(500μg)が、10⁷ CFU の細菌を攻撃した後の血液 あるいは腹膜洗浄液での細菌数を顕著に減少せしめないことを示している。この ことは、抗生物質が介在した細菌数の指数の減少は、BPI タンパク質生成物と抗 生物質の同時投与に関連した保護作用を、そのこと自体では、説明できないこと を示唆している。 実施例７ 活性 E．COLI 07:K1細菌を腹膜内投与したマウスの 生存効果に対するIN VIVO でのセファマンドール およびBPI タンパク質生成物の相乗効果 セファロスポリン抗生物質とBPI タンパク質生成物の保護効果を、BPI タンパ ク質生成物の殺菌活性に対する感受性を備えた株である E．coli 07:K1（ATCC受 託 No．23503）を静脈投与して評価した。一般的な手順は、実施例５に記載の方 法に従った。20匹のマウスの４集団に対して、２×10⁷ 個の E．coli 07:K1細菌 を静脈より投与し、そして、(1) 賦形剤、(2) 50μg rBPI₂₁のみ、(3) 20mg/kg のセファマンドールのみ、あるいは(4) 50μg のrBPI₂₁と 20mg/kgのセファマン ドール双方で処置した。７日間にわたってマウスの生存状態を観察し、二つの試 験結果を、図5Aと5Bに示した。 一方の試験では、rBPI₂₁のみの試験では賦形剤対照と比較して11％が生存して おり、セファマンドールでは賦形剤対照と比較して47％が生存しており（ｐ＜0. 05対賦形剤）、そして、rBPI₂₁とセファマンドールの同時投与では賦形剤対照と 比較して 100％が生存した（ｐ＜0.001 対賦形剤、ｐ＜0.01対セファマンドール 単独）。他方の試験では、rBPI₂₁のみの試験では賦形剤対照と比較して０％が生 存しており、セファマンドールでは賦形剤対照と比較して12％が生存しており（ ｐ＜0.05対賦 形剤）、そして、rBPI₂₁とセファマンドールの同時投与では59％が生存した（ｐ ＜0.01対賦形剤、ｐ＜0.05対セファマンドール単独）。双方の試験にて、rBPI₂₁ とセファマンドールの同時投与に関連する延命効果は、個々の薬剤の治療による 延命効果の合計を上回るものであった。よって、このモデルにおいては、BPI タ ンパク質生成物とセファマンドールとの間に（添加効果以上の）相乗効果が認め られた。 実施例８ 活性 E．C0LI 07:K1細菌を腹膜内投与したウサギの 細菌除去効果ならびに心臓血管、呼吸および代謝系 に対するIN VIVO でのセファマンドールおよび BPI タンパク質生成物の相乗効果 1.8〜 2.3kgの体重の成体雄ニュージーランド白ウサギ（Charles River Labo ratories、St．Constant、Canada）を、実験前の24時間、絶食せしめた。80/4mg /kg のケタミン／キシラジンの筋内注射によって、各ウサギに麻酔をかけた。左 大腿部動脈にカテーテルを入れて、血圧測定と血液試料の採取を行った。カテー テルを右頸静脈を介して右房に近接して配置し、先端にサーミスターを備えたカ テーテルを右頸動脈を介して大動脈弓に配置した。血流と血液ガスを正常化なら しめるために、カテーテル処置して90〜120 分間ウサギを安静にした。 ウサギを、１グループ当たり４匹となるように４つのグループに分けた。(1) 賦形剤のみ、(2) セファマンドールと賦形剤、(3) rBPI₂₁と賦形剤、および(4) セファマンドールとrBPI₂₁のグループとした。細菌感染時（Ｔ＝０とする）前に 、５分間にわたって、ウサギにセファマンドール(MANDOL(登録商 標)、Eli Lilly、Indianapolis、Indiana)あるいは賦形剤を投与した。Ｔ＝０の 時、 E．coli 07:K1細菌の２×10¹⁰CFU/ウサギを、耳静脈より10分間にわたって 注入した。同時に（Ｔ＝０の時）、10mg/kg のrBPI₂₁あるいは賦形剤を、右頸静 脈カテーテルを介して10分間にわたって注入した。注入して10分後、rBPI₂₁をゆ っくりと２時間をかけて10mg/kg/hrの速度で注入した（最終的に30mg/kg rBPI₂₁ の用量となる）。 細菌数と内毒素レベルを決定するための動脈血試料を、10分間の細菌注入後、 ならびい30分、１、２、３および４時間の時点にて採取した。全血を無菌PBS で 10倍に連続的に希釈し、画分をトリプシン大豆寒天プレートに置き、37℃で一晩 インキュベートし、そして、コロニー形成単位(CFU)について計測した。その結 果は、CFU/血液mlならびに％細菌用量／血液mlとして表した。血液の残余を遠心 分離し、血漿を除去し、そして、細菌を除去するために、0.2 ミクロンの Watma n 濾紙に通した。内毒素レベルは、カブトガニ遊走細胞溶解物検定(Pyrochrome LAL Assay，Associates of Cape Cod，Woods Hole，MA)の変法を用いて決定した 。その結果は、LPS ng/血漿mlとして表した。 心臓血管、呼吸および代謝系の要素を、30分ごとに計測した。平均動脈血圧(M ABP)および心拍数を、実験期間中に連続してモニターし、心臓出力値コンピュー ター(Columbus Instruments Cardiomax II)あるいはチャート記録機に記録を表 示した。心拍数は、動脈圧力波動から導いた。心臓出力値を、熱希釈技術によっ て繰り返して決定した。 900μｌの室温のPBS の注入による血液温度の変化を、 大動脈弓での先端にサーミスターを備えたカテーテルを用いて記録した。そして 、心臓出力値コンピューターは、チャート記録機で読み取れる熱希釈曲線 を描き、温度一時間曲線から心臓出力値が誘導される。心臓指数(CI)は、心臓出 力値／体重kgとして計算される。加えて、全周辺耐性(TPR)は、心臓出力値で血 圧を割ることで決定される。 血液ガス決定のための血液試料は、研究中、30分間隔で、大腿動脈カテーテル から採取した。血液ガスを、Ciba-Corning血液ガスシステム、Model 278(Ciba-C orning Diagnostics Corp.，Medfield，MA)で測定した。この血液ガスシステム は、血液pH、pCO₂の分圧、およびpO₂ の分圧を直接測定する。肺動脈の酸素勾配 、動脈の酸素含量、推定の酸素飽和度、標準重炭酸塩、およびin vivo での塩基 過多を含む他の変数を、Ciba-Corning Diagnostics 社の作成した方程式を用い て計算した。血漿中のグルコースと乳酸塩のレベルを、グルコース／L-乳酸塩分 析器(2300 STAT，YSI，Yellow Springs，OH)を用いて決定した。 生存データを、図６に示した。賦形剤のみで処置した動物の４匹の内、２匹（ 50％）が実験が終了するまでに死亡した。セファマンドールとrBPI₂₁を同時投与 した動物は死亡しなかった。CFU/mlあるいは％細菌用量／mlとして表した、血中 の細菌数を、図７および８にそれぞれ示した。図７において、四角印は賦形剤の みで処置した例、ダイアモンド印はセファマンドールのみで処置した例、丸印は rBPI₂₁のみで処置した例、および三角印はrBPI₂₁とセファマンドールの同時投与 で処置した例を指す。図８において、水平に影を入れた棒はセファマンドールの みで処置した例、白抜きの棒はrBPI₂₁とセファマンドールの同時投与で処置した 例、垂直に影を入れた棒はrBPI₂₁のみで処置した例、および塗りつぶした棒は緩 衝液のみで処置した例を指す。rBPI₂₁とセファマンドールの同時投与で処置し たグループでは、rBPI₂₁のみ、あるいはセファマンドールのみで処置した場合と 比較して、優れた細菌の排除効果が認められた。30および60分の時点で相乗効果 が認められ、特に、30分の時点では、rBPI₂₁とセファマンドールの同時投与によ る細菌の排除効果は、各薬剤個別の処置の場合の排除率の合計よりも高い排除率 である。 内毒素のレベルを、図９に示した。白抜きダイアモンド印は賦形剤のみで処置 した例、塗りつぶしたダイアモンド印はrBPI₂₁のみで処置した例、塗りつぶした 四角印はセファマンドールのみで処置した例、および白抜き四角印はrBPI₂₁とセ ファマンドールの同時投与で処置した例を指す。セファマンドールのみを投与し た動物は、セファマンドールが細菌を死滅せしめ、LPS を放出するため、賦形剤 のみで処置した場合よりも格段に高いLPS レベルを示した。rBPI₂₁とセファマン ドールの同時投与では、セファマンドールのみで治療した場合と比較して、劇的 に減少したLPS レベルを示した。 心肺に関する変数（MABP、CI、TPR 、動脈酸素強度、肺動脈の酸素勾配、心拍 数、および動脈血pH）を、図10〜16にそれぞれ示した。これら図面は、セファマ ンドールのみで処置したグループ（白抜四角で表示）およびrBPI₂₁とセファマン ドールの同時投与で処置したグループ（黒塗四角で表示）についてのみ示してい る。一つ星は、両薬剤の同時投与が、抗生物質のみで処置した場合よりも統計学 的に顕著な改善を示したこと（ｐ＜0.05）、また、二つ星がｐ＜0.01であったこ とを示している。セファマンドールのみ、あるいはrBPI₂₁のみの処置では動物を 保護できず、細菌注入の間に心臓血管ならびに呼吸不全が生じ、そして、その動 物は注入の終了までに循環器系ショックを起こした。セファマンドールのみで処 置したグループ では、60分の時点にて動脈血pHが下がり始め、実験の終了時までには最低レベル に達した。これに対して、rBPI₂₁とセファマンドールの同時投与によれば、心肺 機能が保護され、また敗血症ショックも予防された。このように、BPI タンパク 質生成物と抗生物質の同時投与は、致命的な菌血症から動物を保護し、そして抗 生物質のみでは保護しえなかった心肺機能の保護も果たすのである。 実施例９ 活性 E．COLI 07:K1細菌を腹膜内投与したマウスの 生存効果に対するIN VIVO でのゲンタマイシン およびBPI タンパク質生成物の相乗効果 アミノグリコシド抗生物質とBPI タンパク質生成物の相乗効果を、BPI タンパ ク質生成物の殺菌活性に対する感受性を備えた滑面被包体株である E．coli 07: K1（ATCC受託No．23503）を静脈投与して評価した。一般的な手順は、実施例４ に記載の方法に従った。20匹のマウスの６集団に対して、２×10⁷ 個の E．coli 07:K1細菌を静脈より投与し、そして直後に、(1) 賦形剤、(2) 0.03mg/kg ゲン タマイシン、(3) 0.1mg/kgゲンタマイシン、(4) 50μg のrBPI₂₁、(5) 0.03mg/k g ゲンタマイシンと、次いで、50μg のrBPI₂₁、あるいは(6) 0.1mg/kgゲンタマ イシンと、次いで、50μg のrBPI₂₁で処置した。７日間にわたってマウスの生存 状態を観察した。その結果を、図17に示した。抗生物質単独あるいはrBPI₂₁単独 での処置はいずれも、致死率を僅かに低減する以外は、死亡率の改善には至らな かった。しかしながら、rBPI₂₁と低用量のゲンタマイシンの同時投与によれば、 生存率が顕著に改善された（ｐ＜0.5 対賦形剤）。rBPI₂₁と高用量のゲンタマイ シンの同時投与によ れば、生存率が劇的に改善され（ｐ＜0.001 対賦形剤、およびｐ＜0.05対 0.03m g/kgゲンタマイシンとrBPI₂₁）、細菌攻撃による致命効果を受けた２匹以外のす べての動物を保護した。この結果は、ゲンタマイシンとrBPI₂₁との間の相乗効果 を明確に示している。rBPI₂₁とセファマンドールの同時投与による効果より大き な、ゲンタマイシンとrBPI₂₁との間の相乗効果は、タンパク質合成を阻害するア ミノグリコシドが、BPI タンパク質生成物とは異なる作用機構を有しているとす る事実と符合するものである。 実施例10 セフトリアキソン耐性グラム陰性生物の 抗生物質感受性に関する IN VITRO での BPI タンパク質生成物の効果 セフトリアキソン(Roche Laboratories)に対する様々なグラム陰性生物の耐性 を変換するBPI タンパク質生成物、rBPI₂₁の能力を、in vitroで評価した。 試験に付されるグラム陰性細菌の株を、トリプチカーゼ大豆寒天(TSA)プレー トにて、37℃にて、一晩成長させた。そして、プレートから得られたコロニーを 、栄養培地（あるいは、トリエタノールアミン緩衝化最小塩培地）に接種し、静 止増殖期を一晩かけて成長させ、そして、約６〜10×10⁸ 生物/ml の濃度に至る まで、中期−後期対数増殖期（３〜４時間、37℃で）にて成長させる。生物数の 計測は、連続希釈を調製し、TSA プレート３つに接種し、37℃で、一晩インキュ ベートし、そして目視で確認できるコロニーを数えることで実施した。検量線の 作成に続いて、OD₅₄₀ での計測を行い、プレートを確認することで計数を行った 。6000ｇで、10分間、遠心分離をする ことで、細菌を沈殿せしめ、そして、所望の濃度にまで、無菌生理食塩水で再懸 濁した。 セフトリアキソン溶液は、標準粉末(Roche Laboratories)から調製した。BPI タンパク質生成物の溶液は、rBPI₂₁、Hanks の溶液、ビタミンを含まないカザミ ノ酸、および Tris-塩酸緩衝液、pH 7.0から調製した。双方のMIC 試験は、以下 のようにして行った。マルチチャンネル型ピペット装置を用いて調製し、約 2.5 ×10⁵ CFU/mlに希釈した生物を接種し、そして、37℃で、一晩インキュベートす ることで、100 μl/ウェルの培地、1:1 比率のrBPI₂₁とセフトリアキソンを含む 、Ｕ底で、使い捨て可能なマイクロ滴定用プレート(Dynatech)を作成した。生物 を接種していない対照培地と、生物を接種したが、rBPI₂₁あるいはセフトリアキ ソンを含まない成長対照培地も調製した。細菌の成長を阻害する最低薬剤濃度（ μg/ml）として、MIC を決定した。寒天を用いたMIC の試験は、以下のようにし て行った。生物を、Mueller-Hinton培地(Difco Laboratories)にて、一晩、37℃ で成長させ、対数増殖期に移して成長させ、光学密度を計測し、緩衝液、rBPI₂₁ およびセフトリアキソンで希釈し、そして、30分間、37℃でインキュベートした 。インキュベーションの30分後、試料を無菌生理食塩水で連続的に希釈し、そし て、一晩、37℃でのインキュベーションの後に、細菌数の計数のためにTSA 寒天 培地に移した。 Pseudomonas、Enterobacter、Citrobacter、Klebsiella、およびEscherichia 属を含めた様々な細菌種に対して試験を行った。BPI タンパク質生成物のみの最 小阻止濃度(MIC)、セフトリアキソンのみのMIC 、および両薬剤を併用（rBPI₂₁ とセフトリアキソンの１：１固定比率）のMIC を報告した以下の表11にその結果 の概要を示した。実験は繰り返して行い、表中 の数字は、各グループについての最高あるいは最低のMIC を示している。 選択した株に関するチェッカーボード相乗効果試験を、以下のようにして行っ た。以下の生物を用いて、マイクロプレートを調製した。第１欄は対照生物（成 長対照）、第２〜９欄はセフトリアキソンの連続希釈、第10欄はセフトリアキソ ン単独、第11欄はrBPI₂₁単独、第12欄は対照培地、第１〜８列はrBPI₂₁の連続希 釈とした。よって、第２〜９欄は、セフトリアキソンと BPIの濃度の連続する様 々な比率を含んでいる。対照培地を除くすべてのウェルに懸濁した生物を接種し 、一晩、37℃でインキュベートした。24時間および48時間の時点にて、濁度を記 録した。 セフトリアキソン耐性 E．coliに関するrBPI₂₁とセフトリアキソンの同時投与 に典型的な相乗効果の結果を、以下の表12のチェッカーボードに示した。このチ ェッカーボード検定にて、rBPI₂₁とセフトリアキソンは、それぞれ、 100μg/ml から 0.8μg/mlの範囲の濃度まで連続的に希釈した。これらの結果は、両薬剤の 同時投与は相乗効果を呈することを示している。すべての成長対照ウェル（細菌 を含み、rBPI₂₁と抗生物質を含まない）にて均一な成長が認められたが、対照培 地ウェル（細菌を含まない）では成長は認められなかった。すべての対照セフト リアキソンのウェル（細菌とセフトリアキソンのみ）にて均一な成長が認められ た。BPI 対照ウェル（細菌とrBPI₂₁のみ）では、 6.2μg/ml以下のrBPI₂₁の濃度 ウェルで成長が認められたが、それ以上の BPIタンパク質生成物の濃度では成長 は認められなかった。 生存（あるいは死滅）曲線の試験を、以下のようにして行った。(1) 培地のみ 、(2) 培地とセフトリアキソン、(3) 培地とrBPI₂₁、および(4) 培地とセフトリ アキソンとrBPI₂₁、を含む試験管を準備し、所望の生物を接種し、そして、上記 したよう にしてインキュベートした。０、１、２、４、８および24時間の時点にて、各試 験管からの希釈画分を接種し、インキュベートし、上記したようにしれ計数した 。細菌の成長と生存に関する抗生物質− BPIタンパク質生成物の作用力を実証す るために、24時間にわたる成長曲線（log₁₀ CFU/mlと時間のプロット）が作成さ れた。 セフトリアキソン耐性 E．coliに関するrBPI₂₁とセフトリアキソンの同時投与 に典型的な死滅効果の結果を、以下の図18に示した。黒塗四角印は対照（rBPI₂₁ でもセフトリアキソンでもない）を、白抜四角印はrBPI₂₁単独を、黒塗ダイアモ ンド印はセフトリアキソン単独を、また、白抜ダイアモンド印はセフトリアキソ ンとrBPI₂₁の同時投与の例を示す。rBPI₂₁単独あるいはセフトリアキソン単独で は、４〜８時間にてある程度の初期殺菌効果を有していたが、24時間にて両薬剤 に関する生物の成長は、ほとんど対照の曲線に到達する（対照から約１の対数の 相違）。これに対して、セフトリアキソンとrBPI₂₁の同時投与では、24時間の時 点でも維持された、非常に顕著な殺菌効果が得られた（対照から６以上の対数の 相違）。 実施例11 Pseudomonas種に関するIN VITROでの BPI タンパク質生成物と抗生物質の効果 Pseudomonas aeruginosaの臨床分離株および他のPseudomonas種（Baxter Micr oscan（登録商標）library，Sacramento，CAから入手した）の抗生物質感受性に 関するBPI タンパク質生成物、rBPI₂₁の効果を多数の異なる抗生物質に関する最 小阻止濃度の決定を同時に行うことができる Microscan（登録商標）パネルプレ ート(Baxter Diagnostics，Inc.，Deerfield，IL)を用いて評価した。対照分析 では、rBPI₂₁のための製剤用緩衝液は、様々な生物の抗生物質感受性に関する効 果が認められなかったことが確認された。 Microscan（登録商標）パネルプレートに関して行った抗生物感受性試験は、 培地希釈感受性試験の小規模試験である。抗微生物薬剤は、臨床的用途の濃度に 至るまで（カルシウムならびにマグネシウム、あるいはオキシアシリンのための 塩化ナトリウム、あるいはトリメトプリム、スルファメトキサゾール、およびト リメトプリム／スルファメトキサゾールのためのチミジンホスフォリラーゼを補 充した）Mueller-Hinton培地にて連続的に希釈した。96ウェルの Microscan（登 録商標）プレートのあるウェルを、脱水した培地のみを含む成長対照ウェルとし た。残りのウェルは、試験生物の標準化した懸濁液の接種により所望の濃度にま で再水和した、脱水した培地と抗生物質（あるいは培地と生化学的指示薬）を含 んでいた。発色性の生化学的指示薬を、pH変化と基質の利用の検出に基づいて細 菌の種を同定あるいは特徴付けるために使用する。一晩のインキュベーションの 後、試験生物に対する抗生物質の最小阻止濃度(MIC)を、成長の阻止を示す抗生 物質の最小濃度についてウ ェルを観察することで決定する。Neg Combo Type 16，MIC Plus Type２、あるい はNeg Breakpoint Combo Type ９パネルプレート(Microscan(登録商標)、Baxter Diagnostics．Inc.，Deefield．IL.)を用いて、グラム陰性生物を試験した。こ れらパネルプレートにて試験した抗生物質の濃度は、以下の表13、14および15に それぞれ記載した。各パネルプレートにて試験したグラム陰性生物に適用可能な 抗生物質感受性の基準（Microscan(登録商標)のNCCLS から導いた基準に従った 、耐性、媒介体あるいは感受性としてのMIC の解釈）を、以下の表13A、14A お よび15A に示した。 各実験に関して、以下の手順を踏んだ。生物を、５％羊血液寒天プレート(Rem el、Lenexa、Kansas）に塗布し、18〜24時間、一晩、インキュベートした。プレ ートのウェルで単離したコロニーを、最終濁度が 0.5 McFarland硫酸バリウム標 準に等しくなるように、３mlの無菌 Inoculum Water(カタログ No.B1015-2、Mic roScan(登録商標)system、Baxter Diagnostics，Inc.，Deerfield，IL)で乳状化 した。この細胞懸濁液を２〜３秒間攪拌し、その 100μｌを、Pluronic-D(カタ ログ No.B1015-7、MicroScan(登録商標)system、Baxter Diagnostics，Inc.，De erfield，IL)を含む25mlの Inoculum Water(以下、「Pluronic Inoculum Water 」と称する)、あるいはrBPI₂₁が（製剤用緩衝液にて）0.5〜64μg/rBPI₂₁mlの所 望の濃度に希釈されている25mlのPluronic Inoculum Water を含むガラス製試験 管に移す。 rBPI₂₁を含む25mlの接種物を、よく混合して、そしてトレイに注いだ。この接 種物を、Microscan(登録商標)のパネルプレート用に設計された、マニュアル化 した96ウェル滴定システム(RENOK（登録商標）再水和−接種システム、Baxter H ealth Care Corporation，West Sacramento，CA)に適用し、接種物の 110μｌを Microscan(登録商標)Neg Combo Type 16パネルプレートの各ウェルに入れた。ウ ェルに注ぐ場合、４×10⁵ 〜７×10⁵ CFU/mlの最終細菌濃度になるように接種物 を注ぐ。そして、パネルプレートを、35℃にて、15〜24時間インキュベートし、 細胞の成長を目視で確認した。 ウェルあるいは透明な培地では、わずかな白色による成長の様子は認められな かった。細菌の成長は、ウェル全体に広がる白色の濁り、ウェルの中心部に生じ る白色の粒、あるいはウェル全体に広がる細かい顆粒の成長の形態となって現れ る。 すべてのウェルを、黒の背景から光を当てて間接的に観察した。生化学反応の目 視による結果、細菌同定のためのデータベースと照合する。試験した各抗生物質 のMIC は、成長を阻害が目視で判断できる抗生物質の最低濃度を同定することで 決定される。 Pseudomonas aeruginosaの臨床分離株と、他のPseudomonas 属の株を、Neg Co mbo Type 16 パネルプレートを用いて試験した。以下の表16、17および18は、様 々な濃度のrBPI₂₁と試験に用いた抗生物質の、各株でのMIC を報告した抗生物質 のスクリーニングパネルの結果の要約を示している。試験に用いた各株に関する 結果が報告されているが、感受性が改変したBPI タンパク質生成物に関する抗生 物質についてのみ感受性データを掲載した。試験した生物に適用可能な抗生物質 感受性の基準（Microscan(登録商標)のNCCLS から導いた基準に従った、耐性、 媒介体あるいは感受性としてのMIC の解釈）を、表13A に示した。「試験した抗 生物質」の欄の抗生物質の名称の後に付いた星印は、rBPI₂₁が試験した抗生物質 に対する生物の耐性を変換する（２つ星）、あるいは無関係のMIC を感受性のMI C に変換する（１つ星）ことを示している。これらデータは、BPI タンパク質生 成物が、P．aeruginosa のある株に関するティカルシリン、セファゾリン、セフ ォキシティン、セフロキシン、オフロキサシン、アズトレオナム、ピペラシリン 、およびアミカシンへの耐性を変換し、また、P．aeruginosa のある株に関して ティカルシリン、アズトレオナム、イミペネム、ピペラシリン、オフロキサシン 、セファタジダイム、アミカシン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフロ キシム、トブラマイシン、シプロフロキサシン、トリメトプリム／スルファメト キサゾール、ゲンタマイシン、およびセファゾリンへの感 受性を高めることを示している。BPI タンパク質生成物は、P．cepaciaのある株 に関するセファゾリン、セフォキシティン、セフロキシム、セフトリアキソン、 ティカルシリンへの耐性を変換し、また、P．cepaciaのある株に関してアンピシ リン、ティカルシリン、ピペラシリン、セファゾリン、セフォタキシティン、セ フロキシム、セフトリアキソン、アンピシリン／スルバクタム、セフォタキシム 、ゲンタマイシン、トブラマイシンおよびアミカシンへの感受性を高める。BPI タンパク質生成物は、Xanthamonas maltophilia に関するトリメトプリム／スル ファメトキサゾール、ピペラシリン、およびアミカシンへの耐性を変換し、また 、シプロフロキサシンへの感受性を高める。 表16、17および18も、抗生物質無しに、様々な濃度のrBPI₂₁だけを含む成長対 照ウェルでの細菌の成長の有無を示している。「Ｇ」とは成長が認められたこと を、また「ＮＧ」とは成長が認められなかったことを示している。これら結果は 、32μg/mlの濃度のrBPI₂₁が、試験した Pseudomonas分離株のいくつかについて 、直接的な殺菌／成長阻害効果を有することを示している。 実施例12 E．COLI 株に関するIN VITROでの BPI タンパク質生成物と抗生物質の効果 様々なE．coli 株の抗生物質に関する BPIタンパク質生成物、rBPI₂₁の効果を Neg Combo Type 16パネルプレートを用いた、実施例11に記載のMicroscan(登録 商標)抗生物質感受性スクリーニング検定法にて評価した。これら株に関するrBP I₂₁の直接成長阻害効果も評価した。E．coli 株の臨床分離株(Baxter Microscan (登録商標)library，Sacramento，CA から入手した)に関して検定を行った。 試験した抗生物質のMIC(μg/ml)を表した、抗生物質スクリーニングパネルの 結果を、以下の表19に示した。試験した各株について結果を報告しているが、感 受性が改変したBPI タンパク質生成物に関する抗生物質の結果のみを列挙した。 試験した生物に適用可能な抗生物質基準（Microscan(登録商標)NCCLS から導い た基準に従った耐性、媒介あるいは感受性としてのMIC の解釈）を、表13A に示 した。これら結果は、BPI タンパク質生成物が、ある株に関するセファゾリンへ の耐性を変換し、アンピシリン、セフォロキシム、セファゾリン、アミカシン、 およびセフォキシティンへの感受性を増大したことを示している。 実施例13 CITROBACTER種に関するIN VITROでの BPI タンパク質生成物と抗生物質の効果 様々なCitrobacter 種の抗生物質に関する BPIタンパク質生成物、rBPI₂₁の効 果を Neg Combo Type 16パネルプレートを用いた、実施例11に記載のMicroscan( 登録商標)抗生物質感受性スクリーニング検定法にて評価した。これら株に関す るrBPI₂₁の直接成長阻害効果も評価した。Citrobacter 種の臨床分離株(Baxter Microscan(登録商標)library，Sacramento，CAから入手した)に関して検定を行 った。 試験した抗生物質のMIC(μg/ml)を表した、抗生物質スクリーニングパネルの 結果を、以下の表20に示した。試験した各株について結果を報告しているが、感 受性が改変したBPI タンパク質生成物に関する抗生物質の結果のみを列挙した。 試験した生物に適用可能な抗生物質基準（Microscan(登録商標)NCCLS から導い た基準に従った耐性、媒介あるいは感受性としてのMIC の解釈）を、表13A に示 した。これら結果は、BPI タンパク質生成物が、試験したCitrobacter 株のアズ トレオナム、セフォタキシム、トブラマイシン、アミカシン、セフロキシム、ア ンピシリン、ティカルシン、ピペラシリン、およびセフロキシムへの感受性を増 大したことを示している。 実施例14 KLEBSIELLA 種に関するIN VITROでの BPI タンパク質生成物と抗生物質の効果 様々なKlebsiella種の抗生物質に関する BPIタンパク質生成物、rBPI₂₁の効果 を Neg Combo Type 16パネルプレートを用いた、実施例11に記載のMicroscan(登 録商標)抗生物質感受性スクリーニング検定法にて評価した。これら株に関するr BPI₂₁の直接成長阻害効果も評価した。Klebsiella種の臨床分離株(Baxter Micro scan(登録商標)library，Sacramento，CAから入手した)に関して検定を行った。 試験した抗生物質のMIC(μg/ml)を表した、抗生物質スクリーニングパネルの 結果を、以下の表21に示した。試験した各株について結果を報告しているが、感 受性が改変したBPI タンパク質生成物に関する抗生物質の結果のみを列挙した。 試験した生物に適用可能な抗生物質基準（Microscan(登録商標)NCCLS から導い た基準に従った耐性、媒介あるいは感受性としてのMIC の解釈）を、表13A に示 した。これら結果は、BPI タンパク質生成物が、Klebsiella pneumoniae のトリ メトプリム／スルファメトキサゾールへの耐性を変換し、そして、試験した株の セフォキシティン、アンピシリン／スルバクタム、トリメトプリム／スルファメ トキサゾール、セファゾリン、およびセフロキシムへの感受性を増大したことを 示している。 実施例15 ENTEROBACTER種に関するIN VITROでの BPI タンパク質生成物と抗生物質の効果 様々なEnterobacter種の抗生物質に関する BPIタンパク質生成物、rBPI₂₁の効 果を Neg Combo Type 16パネルプレートを用いた、実施例11に記載のMicroscan( 登録商標)抗生物質感受性スクリーニング検定法にて評価した。これら株に関す るrBPI₂₁の直接成長阻害効果も評価した。Enterobacter種の臨床分離株(Baxter Microscan(登録商標)library，Sacramento，CAから入手した)に関して検定を行 った。 試験した抗生物質のMIC(μg/ml)を表した、抗生物質スクリーニングパネルの 結果を、以下の表22に示した。試験した各株について結果を報告しているが、感 受性が改変したBPI タンパク質生成物に関する抗生物質の結果のみを列挙した。 試験した生物に適用可能な抗生物質基準（Microscan(登録商標)NCCLS から導い た基準に従った耐性、媒介あるいは感受性としてのMIC の解釈）を、表13A に示 した。これら結果は、BPI タンパク質生成物が、E．cloacaeのティカルシリン、 セフロキシム、セフタジダイムおよびセフォタキシムへの耐性を変換したことを 示している。また、BPI タンパク質生成物が、あるEnterobacter株のティカルシ リン、アズトレオナム、ピペラシリン、シプロフロキサシン、セフォタキシム、 トリメトプリム／スルファメトキサゾール、セフロキシム、セフタジダイム、お よびアンピシリン／スルバクタムへの感受性を増大したことを示している。 実施例16 SERRATIA MARCESCENS に関するIN VITROでの BPI タンパク質生成物と抗生物質の効果 Serratia marcescens の抗生物質に関する BPIタンパク質生成物、rBPI₂₁の効 果を Neg Combo Type 16パネルプレートを用いた、実施例11に記載のMicroscan( 登録商標)抗生物質感受性スクリーニング検定法にて評価した。これら株に関す るrBPI₂₁の直接成長阻害効果も評価した。Serratia marcescensの臨床分離株(Ba xter Microscan(登録商標)library，Sacramento，CAから入手した)に関して検定 を行った。 試験した抗生物質のMIC(μg/ml)を表した、抗生物質スクリーニングパネルの 結果を、以下の表23に示した。試験した各株について結果を報告しているが、感 受性が改変したBPI タンパク質生成物に関する抗生物質の結果のみを列挙した。 試験した生物に適用可能な抗生物質基準（Microscan(登録商標)NCCLS から導い た基準に従った耐性、媒介あるいは感受性としてのMIC の解釈）を、表13A に示 した。これら結果は、BPI タンパク質生成物が、ある株のセフタジダイムおよび セフォタキシムへの耐性を変換し、また、他の株のピペラシリン、セフォキシテ ィン、セファタジダイム、セフトリアキソン、トブラマイシン、アンピシリン／ スルバクタム、およびアンピシリンへの感受性を増大したことを示している。 実施例17 PROTEUS MIRABILISに関するIN VITROでの BPI タンパク質生成物と抗生物質の効果 Proteus mirabilis の抗生物質に関する BPIタンパク質生成物、rBPI₂₁の効果 を Neg Combo Type 16パネルプレートを用いた、実施例11に記載のMicroscan(登 録商標)抗生物質感受性スクリーニング検定法にて評価した。これら株に関するr BPI₂₁の直接成長阻害効果も評価した。Proteus mirabilis の臨床分離株(Baxter Microscan(登録商標)library，Sacramento，CAから入手した)に関して検定を行 った。 試験した抗生物質のMIC(μg/ml)を表した、抗生物質スクリーニングパネルの 結果を、以下の表24に示した。試験した各株について結果を報告しているが、感 受性が改変したBPI タンパク質生成物に関する抗生物質の結果のみを列挙した。 試験した生物に適用可能な抗生物質基準（Microscan(登録商標)NCCLS から導い た基準に従った耐性、媒介あるいは感受性としてのMIC の解釈）を、表13A に示 した。これら結果は、BPI タンパク質生成物が、ある株のトリメトプリム／スル ファメトキサゾール、セファゾリン、セフォキシティン、イミペネム、トブラマ イシン、およびアミカシンへの感受性を増大したことを示している。 実施例18 PROVIDENCIA種に関するIN VITROでの BPI タンパク質生成物と抗生物質の効果 Providencia 種の抗生物質に関する BPIタンパク質生成物、rBPI₂₁の効果を N eg Combo Type 16パネルプレートを用いた、実施例11に記載のMicroscan(登録商 標)抗生物質感受性スクリーニング検定法にて評価した。これら株に関するrBPI_{2 1} の直接成長阻害効果も評価した。Providencia 種の臨床分離株(Baxter Microsc an(登録商標)library，Sacramento，CAから入手した）に関して検定を行った。 試験した抗生物質のMIC(μg/ml)を表した、抗生物質スクリーニングパネルの 結果を、以下の表25に示した。試験した各株について結果を報告しているが、感 受性が改変したBPI タンパク質生成物に関する抗生物質の結果のみを列挙した。 試験した生物に適用可能な抗生物質基準（Microscan(登録商標)NCCLS から導い た基準に従った耐性、媒介あるいは感受性としてのMIC の解釈）を、表13A に示 した。これら結果は、BPI タンパク質生成物が、P．stuartii のセファゾリンと セフロキシムの耐性を変換し、また、ピペラシリン、セフタジダイム、アンピシ リン／スルバクタム、イミペネム、およびアミカシンへの感受性を増大したこと を示している。また、BPI タンパク質生成物は、P．rettgeri のセフォキシティ ンおよびセフロキシムの感受性も向上せしめた。 実施例19 MORGANELLA MORGANII に関するIN VITROでの BPI タンパク質生成物と抗生物質の効果 Porganella morganii の抗生物質に関する BPIタンパク質生成物、rBPI₂₁の効 果を Neg Combo Type 16パネルプレートを用いた、実施例11に記載のMicroscan( 登録商標)抗生物質感受性スクリーニング検定法にて評価した。これら株に関す るrBPI₂₁の直接成長阻害効果も評価した。Porganella morganiiの臨床分離株(Ba xter Microscan(登録商標)library，Sacramento，CAから入手した)に関して検定 を行った。 試験した抗生物質のMIC(μg/ml)を表した、抗生物質スクリーニングパネルの 結果を、以下の表26に示した。試験した各株について結果を報告しているが、感 受性が改変したBPI タンパク質生成物に関する抗生物質の結果のみを列挙した。 試験した生物に適用可能な抗生物質基準（Microscan(登録商標)NCCLS から導い た基準に従った耐性、媒介あるいは感受性としてのMIC の解釈）を、表13A に示 した。これら結果は、BPI タンパク質生成物が、試験した株のアンピシリン／ス ルバクタム、アミカシン、およびピペラシリンへの感受性を増大したことを示し ている。 実施例20 ACIETOBACTER種に関するIN VITROでの BPI タンパク質生成物と抗生物質による効果 様々なAcietobacter種の抗生物質の感受性に関するBPI タンパク質生成物、rB PI₂₁の効果を、Neg Combo Type 16 パネルプレートおよびMIC Plus Type ２パネ ルプレートを用いた実施例11のMicroscan(登録商標)抗生物質感受性スクリーニ ング分析にて評価した。これら株に関するrBPI₂₁の直接成長阻害効果も、同検定 方にて評価した。Acietobacter種の臨床分離株（Baxter Microscan（登録商標） library，Sacramento，CA から入手した）に関して検定を行った。界面活性剤で 製剤されたrBPI₂₁あるいは（界面活性剤を用いずに）未製剤のrBPI₂₁の他の生成 物も試験したが、製剤rBPI₂₁と未製剤rBPI₂₁との間には差異はなかった。 試験した抗生物質のMIC(μg/ml)として報告した、抗生物質スクリーニングパ ネルの結果を、以下の表27と28に示した。試験に用いた各株に関する結果が報告 されているが、感受性が改変したBPI タンパク質生成物に関する抗生物質につい てのみ感受性データを掲載した。試験した生物に適用可能な抗生物質感受性の基 準（Microscan(登録商標)のNCCLS から導いた基準に従った、耐性、媒介体ある いは感受性としてのMIC の解釈）を、表13A および14A に示した。参考までに、 EnterobacterあるいはPseudomonas についてのみ抗生物質感受性基準が適用され る場合、Acinetobacter に関する基準はEnterobacterに関する基準と同じである と考えられる。 これらデータは、BPI タンパク質生成物が、A．antiratusに関するアモキシシ リン／Ｋクラブラン酸塩、アンピシリン／スルバクタム、アズトレオナム、カル ベニシリン、セファマンド ール、セファゾリン、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォ テタン、セフォキシティン、セフタジダイム、セフティズキシム、セフトリアキ ソン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ゲンタマイシン、メズロシ リン、ネチルマイシン、ティカルシリン、ティカルシリン／Ｋクラブラン酸塩、 およびトリペトプリム／スルファメトキサゾールへの耐性を変換し、また、ある A．antiratusに関して、アミカシン、アモキシシリン／Ｋクラブラン酸塩、アン ピシリン、アンピシリン／スルバクタム、アズロシリン、アズトレオナム、カル ベニシリン、セファマンドール、セファゾリン、セフォニシド、セフォペラゾン 、セフォタキシム、セフォテタン、セフォキシティン、セフタジダイム、セフテ ィズキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、クロラムフェニコール、シプロ フロキサシン、ゲンタマイシン、イミペネム、メズロシリン、ネチルマイシン、 オフロキサシン、ピペラシリン、ティカルシリン、ティカルシリン／Ｋクラブラ ン酸塩、トブラマイシン、およびトリペトプリム／スルファメトキサゾールへの 感受性を高めることを示している。 BPI タンパク質生成物が、A．lwoffiiに関するアズトレオナム、セファゾリン 、セフロキシム、セフタジダイム、セフォキシティン、トリペトプリム／スルフ ァメトキサゾール、およびピペラシリンへの耐性を変換し、また、A．Lwoffiiに 関して、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、アズトレオナム、セファ ゾリン、セフォタキシム、セフォキシティン、セフタジダイム、セフトリアキソ ン、セフロキシム、ピペラシリン、ティカルシリン、トリペトプリム／スルファ メトキサゾールへの感受性を高めることを示している。 これら結果は、16μg/mlの濃度のrBPI₂₁が、試験した Acinetobacter 分離株のいくつかについて、直接的な殺菌／成長阻害効果を有す ることを示している。 実施例21 SALMONELLAとSHIGELLA種に関するIN VITROでの BPI タンパク質生成物と抗生物質による効果 Salmonella(F270-001から010)の臨床分離株の10株と、Shigella(F321-010 とF 325-002から010)の臨床分離株の10株（すべてBaxter Microscan（登録商標）lib rary，Sacramento， CA から入手した）を、Neg Breakpoint Combo Type ９パネ ルプレートを用いた実施例11のMicroscan(登録商標)抗生物質感受性スクリーニ ング分析にて評価した。０、４および16μg/mlの濃度のrBPI₂₁では、実質的な効 果は認められなかった。 実施例22 E．COLI J5、 E．COLI O7:K1、ENTEROBACTER CLOACAE、 およびKLEBSIELLA PNEUMONIAE の抗生物質による殺菌 曲線に関するBPI タンパク質生成物による効果 選択した生物について選択した抗生物質の殺菌曲線に関するBPI タンパク質生 成物、rBPI₂₁の効果を決定した。実施例11に従い、E．coli J5、E.coli O7:K1、 Enterobacter cloacae(Microscan library ID No．19680)およびKlebiella pneu moniae(Microscan library ID No．16135)のためのMicroscan(登録商標)パネル プレートを調製した。０もしくは16μg/mlのrBPI₂₁を含む25mlのPluronic Inocu lum Water を細胞懸濁液に添加した。接種後、パネルプレートを、35℃で、24時 間インキュベートした。接種して０、４、７および24時間後に、（抗生物質を入 れていない培地を含む）各成長対照ウェルから５μｌの試料と、2/38μg/mlのト リペトプリム／スルファメトキサゾール、２μg/mlのシプロフロキサシン、64μ g/mlのピペラシリン、32μg/mlのセフォタキシム、６μg/mlのセ フロキシム、および16μg/mlのアミカシンを含む各ウェルから５μｌの試料を除 去した。これら５μｌの試料を、無菌水で希釈し、トリプティカーゼ大豆寒天プ レート(Remel、Lenexa、Kansas)に接種した。35℃で、48時間のインキュベーシ ョンの後、プレートの計測を行い、ウェル中の細菌のコロニー形成単位を計算し た。 その結果を、以下の図19〜25に示した。すべての図面において、rBPI₂₁無しに 抗生物質のみ存在している場合、E．coli J5（黒塗四角印）、E．coli O7:K1（ 黒塗ダイアモンド印）、E．cloacae（黒塗三角印）、およびK．pneumoniae（"X" 印）の成長について表示した。また、すべての図面において、抗生物質とrBPI₂₁ が存在している場合、E．coli J5（白抜四角印）、E．coli 07:K1（白抜ダイア モンド印）、E．cloacae（白抜三角印）、およびK．pneumoniae（星印）の成長 について表示した。 図19は、rBPI₂₁（抗生物質無し）の存在、およびrBPI₂₁（抗生物質無し）の欠 如した状況下での生物の速動性成長曲線を示している。図19において、rBPI₂₁を 含まないE．coli J5（黒塗四角印）、 rBPI₂₁ を含むE．coli O7:K1 （白抜ダイ アモンド印）、rBPI₂₁を含まないE．coli O7:K1 （黒塗ダイアモンド印）、rBPI₂₁ を含まないK．pneumoniae（"X"印）の成長曲線は実質的に重複しており、また 、rBPI₂₁を含むE．coli J5（白抜四角印）とrBPI₂₁を含むE．cloacae（白抜三角 印）の成長曲線は０〜７時間は重複していたが、24時間までには分岐した。図19 は、BPI タンパク質生成物のみでは、０〜７時間において、E．coli J5とK．pne umoniae について殺菌効果が、またE．cloacaeについては24時間にわたって殺菌 効果が認められたことを実証した。 図20において、rBPI₂₁を含むE．coli J5（白抜四角印）、rBPI₂₁を含むE．clo acae（白抜三角印）、およびrBPI₂₁を含むK．pneumoniae （星印）の成長曲線は 重複している。図20は、０〜24時間において、E．cloacaeとK．pneumoniae に関 するトリペトプリム／スルファメトキサゾールの殺菌効果を高め、E．coli J5 と E．coli O7:K1の抗生物質の効果をわずかに高めることを実証した。 図21において、rBPI₂₁を含むE．coli J5（白抜四角印）、rBPI₂₁を含まないE ．coli J5（黒塗四角印）、 rBPI₂₁を含むE．coli O7:K1（白抜ダイアモンド印 ）、rBPI₂₁を含まないE．coli O7:K1（黒塗ダイアモンド印）、rBPI₂₁を含むE． cloacae（白抜三角印）、rBPI₂₁を含まないE．cloacae（黒塗三角印）、rBPI₂₁ を含むK．pneumoniae（星印）の成長曲線は重複している。図21は、rBPI₂₁が、 ０〜24時間において、K．pneumoniaeのシプロフロキサシンへの耐性を変換し、 他の生物がシプロフロキサシンに対して非常に感受的であることを実証した。 図22において、rBPI₂₁を含まないE．coli O7:K1（黒塗ダイアモンド印）とrBP I₂₁を含まないE．cloacae（黒塗三角印）の成長曲線が重複しており、また、rBP I₂₁を含むE．coli J5（白抜四角印）、rBPI₂₁を含むE．coli O7:K1（白抜ダイア モンド印）、rBPI₂₁を含むE．cloacae（白抜三角印）、rBPI₂₁を含まないK．pne umoniae（"X"印）、およびrBPI₂₁を含むK．pneumoniae（星印）の成長曲線はし ている。図22は、rBPI₂₁が、E．coli O7:K1 とE．cloacaeのピペラシリンによる 殺菌効果を高め、他の生物がこの薬剤対してすでに感受的であることを実証した 。 図23において、rBPI₂₁を含むE．coli J5（白抜四角印）、rBPI₂₁を含むE．col i O7:K1（白抜ダイアモンド印）、rBPI₂₁ を含まないE.coli O7:K1（黒塗ダイアモンド印）、rBPI₂₁を含まないK．pneumon iae（"X"印）、およびrBPI₂₁を含むK．pneumoniae（星印）の成長曲線が重複し ている 図23は、rBPI₂₁が、E．coli J5とE．cloacaeのセフォタキシムによる殺 菌効果を高め、他の生物がこの薬剤対して感受的であることを実証した。 図24において、すべての成長曲線が重複している。図24は、試験したすべての 種が抗生物質に対して非常に感受的なため、殺菌曲線に関するrBPI₂₁とセフロキ シム；rBPI₂₁の添加による効果は認められなかった。 図25において、すべての成長曲線が重複している。図25は、試験したすべての 種が抗生物質に対して非常に感受的なため、殺菌曲線に関するrBPI₂₁とセフロキ シムの効果は認められなかった。 実施例23 代表的なグラム陰性生物のIN VITROでの抗生物質と 様々なBPI タンパク質生成物による効果 様々な代表的なグラム陰性生物のの抗生物質の感受性に関する様々なBPI タン パク質生成物、rBPI₂₁、rBPI₂₃、rBPI₅₀およびrBPI₄₂二量体の効果を、MIC Plus Type ２パネルプレートを用いた実施例11のMicroscan(登録商標)抗生物質感受 性スクリーニング分析にて評価した。Acietobacter anitratusおよびEnterobact er cloacae（Baxter Microscan（登録商標）library，Sacramento，CA から入手 した）、およびE．coli J5-LとE．coli O7:K1 に関して検定を行った。 表示したBPI タンパク質生成物の様々な濃度での試験した抗生物質のMIC(μg/ ml)として報告した結果を、以下の表29、30、31および32に示した。 実施例24 BPI ペプチドのグラム陰性殺菌活性 BPI ペプチドは、本明細書に参考文献として取り入れた、1994年９月15日に出 願された米国特許出願No．08/ 〔代理人整理 No．93,1133-H〕に対応す る、共同所有に係る、係属中の1994年９月15日に出願された国際出願 No.US94/ 、および1993年３月12日に出願された米国特許出願No．08/ 030,644の 一部継続出願である、（1994年３月11日に出願された国際出願No．US94/02401に 対応する）1993年７月15日に出願された米国特許出願No．08/093,202の一部継続 出願である、1994年１月14日に出願された米国特許出願No．08/183,222の一部継 続出願である、1994年３月11日に出願された米国特許出願No．08/209,762に対応 する1994年３月11日に出願された国際出願No．US94/02465の記載に従って製造さ れる。 このBPI ペプチドを、放射状拡散検定にてE．coli J5と E．coli O111:B4に関 する殺菌効果のためにスクリーニングした。具体的には、細菌を一晩培養したも のを、新しいトリプシン大豆培地にて1:50に希釈し、培養物が対数増殖期に至る まで、37℃で、３時間インキュベートした。そして、細菌を、SorvallRT6000B 遠心分離機（Sorvall Istruments、Newton、TC）にて、５分間、遠心分離してペ レット化した。10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)の５mlを添加し、調製物を 改めてペレット化した。上清を移し、５mlの新しい緩衝液を添加し、細菌を再懸 濁し、そして、その濃度を 590nmでの吸光度（この波長での吸光値 1.00 は、懸 濁液中の約1.25×10⁹ CFU/mlの濃度に相当する）で決定した。細菌を、10mlの（ 約45℃で）溶解した下層の寒天で、４×10⁶ CFU/mlにまで希釈し、そして、混合 目的のために使用される15mlのポリプロピレン製の管にて繰り返し 混合した。 その管の内容物すべてを平底のペトリ皿に注ぎ、皿の側面からゆっくりと揺り 動かすことで均質に分布させた。寒天は、30秒以内に固まりだし、約１mmの均一 厚みを形成する。一連のウェルを、真空装置に接続した無菌の３mmパンチ機を用 いて、固化した寒天に移した。このパンチ器具は、用時に先駆けて細菌培養物の 汚染を避けるために、 100％アルコールで殺菌し、そして風乾した。 各BPI ペプチドの５もしくは10μｌを、各ウェルにピペットで移した。負の対 照として、別個のウェルに希釈緩衝液(pH8.3)を添加し、また、正の対照として 、５μg/mlおよび１μg/mlのrBPI₂₃を添加した。各プレートを、37℃で、３時間 インキュベートし、そして10mlの（約45℃で）溶解した下層の寒天を平底ペトリ 皿に添加し、寒天を固化し、そして37℃で、一晩インキュベートした。翌日、殺 菌活性がウェルでは、細菌接種部位に透明部分が認められた。この部分を視覚的 に容易に捉えるために、希釈した(0.002％クーマシーブリリアントブルー、27％ メタノール、15％ホルムアルデヒド（37％ストック溶液）、および水からなる) クーマシー溶液を寒天上に注ぎ、24時間かけて染色した。細菌部分を、マイクロ メーターで計測する。グラム陰性細菌E．coli J5（ラフ）とE．coli O113 （ス ムース）に関する（BPI.1 からBPI.169 までの）例示的なペプチドの検定結果を 表33にまとめた。殺菌活性は、30mm² の殺菌部位を生成するに必要なペプチドの 量(pmol/ウェルおよびμg/ml)として表現した。他の例示的なBPI ペプチドには 、BPI.221 からBPI.281 までのペプチドがある。抗菌活性を有するBPI ペプチド は、このペプチドを抗生物質を同時投与した場合に、抗生物質の治療効果を改善 することが期待される。 これらペプチドを、本明細書にて述べたモデルや試験を含めた、in vivo モデル あるいはin vitro試験に従って、かような効果に関してスクリーニングすること ができる。 実施例25 E．CoLI 0111:B4 に関するテトラサイクリンあるいはゲンタ マイシンとBPI タンパク質生成物の同時投与による効果 BPI タンパク質生成物と抗生物質テトラサイクリンあるいは抗生物質ゲンタマ イシンとの同時投与の効果に対する、E．coli 0111: B4の感受性を決定するため に、（実施例１に記載のようにして）さらにMIC 分析を行った。 これら試験のために、５mlのMueller-Hinton培地にて、37℃で、一晩、生物を 成長させた。この培養物を、５mlの新しい培地にて1:50に希釈し、そして、対数 増殖期を過ごすために、さらに３時間、37℃で、インキュベートした。細菌を、 1500×ｇで、５分間、遠心分離してペレット化し、そして、２×10⁶細胞／mlの 最終濃度になるように新しい培地で再懸濁した。 rBPI₂₃と抗生物質（テトラサイクリンあるいはゲンタマイシン）を、 100μｌ 細菌懸濁液、50μｌ抗生物質、50μｌ希釈したrBPI₂₃が、10⁶ 細胞／mlの固定濃 度を維持しつつ、10μl/mlテトラサイクリンあるいは 2.5μl/mlゲンタマイシン 、および30μl/ml rBPI₂₃ の濃度からの連続希釈となるように希釈を行った。平 底96ウェルマイクロ滴定用プレートにて、37℃で、18時間のインキュベーション を行い、そして、590nm にて、自動プレート計測機（Titretek Multiscan）を用 いてプレートの計測を行った。 吸光度の４〜６倍の減少が、ある濃度のBPI タンパク質生成物とテトラサイク リンあるいはゲンタマイシンとの組み合わせにおいて認められた。rBPI₂₃を含ま ない10μg/mlのテトラサイクリンのMIC は、rBPI₂₃によって５μg/mlにまで減少 した。rBPI₂₃を含まない 0.6μg/mlのゲンタマイシンのMIC は、rBPI₂₃によって 0.3μg/mlにまで減少した。 前述した実施例にて記載したデータの一部を、抗生物質の分類によって項分し て、以下の表34に示すと共に、様々なグラム陰性生物に関する抗生物質の治療効 果に関するBPI タンパク質生成物の効果も表示した。 上述してきた本発明の好ましい実施態様を当業者が参照することで、本発明の 実施において無数の修正と変更が想到できるものと考えられる。従って、添付し た請求の範囲に記載の限定のみが、本発明の範疇に付加されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/535 9454−4Ｃ Ａ６１Ｋ 31/535 31/65 9454−4Ｃ 31/65 31/71 9051−4Ｃ 31/71 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クン，アダ，エイチ．，シー. アメリカ合衆国 94062 カリフォルニア ウッドサイド ボックス 48 スター ルート（番地なし) (72)発明者 ランバート，ルイス，エイチ．，ジュニア アメリカ合衆国 94539 カリフォルニア フレモント オメガ ドライブ 45928 (72)発明者 リトル，ロジャー，ジー．，ザ セカンド アメリカ合衆国 94510 カリフォルニア ベニシア ローズ ドライブ 620

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類のグラム陰性細菌感染の治療のための薬剤の製造のための、ペニシリ ン、セファロスポリン、リファムピシン、あるいはアクチノマイシンＤ以外の抗 生物質とのＢＰＩタンパク質生成物の使用。 ２．前記薬剤が、１mg/kg 〜100mg/kgの用量のＢＰＩタンパク質生成物投与のた めの薬剤である請求の範囲第１項に記載の使用。 ３．前記薬剤が、アミノグリコシド抗生物質を用いた哺乳類のグラム陰性細菌感 染の治療のための薬剤である請求の範囲第１項に記載の使用。 ４．前記薬剤が、アミノグリコシド抗生物質の哺乳類のグラム陰性細菌感染の治 療効果を改善するための薬剤である請求の範囲第１項に記載の使用。 ５．前記薬剤が、グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のアミノグリコ シド抗生物質に対する感受性を改善するための薬剤である請求の範囲第４項に記 載の使用。 ６．前記薬剤が、グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のアミノグリコ シド抗生物質に対する耐性を変換するための薬剤である請求の範囲第４項に記載 の使用。 ７．前記アミノグリコシド抗生物質が、アミカシン、ゲンタマイシンおよびトブ ラマイシンからなるグループから選択される請求の範囲第３項〜第６項のいすれ かに記載の使用。 ８．前記グラム陰性細菌感染の起炎菌が、Citrobacter、Edwardsiella、Enterob acter、Escherichia、Klebsiella、Morganella、Providencia、Proteus、Pseudo monas、Xanthamonas、SalmonellaおよびSerratia属からなるグループから選択さ れる請求の範囲第３項もしくは第４項に記載の使用。 ９．前記薬剤が、スルフォナミドあるいはトリメトプリム抗生物質を用いた哺乳 類のグラム陰性細菌感染の治療のための薬剤である請求の範囲第１項に記載の使 用。 10．前記薬剤が、スルフォナミドあるいはトリメトプリム抗生物質の哺乳類のグ ラム陰性細菌感染の治療効果を改善するための薬剤である請求の範囲第１項に記 載の使用。 11．前記薬剤が、グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のスルフォナミ ドあるいはトリメトプリム抗生物質に対する感受性を改善するための薬剤である 請求の範囲第10項に記載の使用。 12．前記薬剤が、グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のスルフォナミ ドあるいはトリメトプリム抗生物質に対する耐性を変換するための薬剤である請 求の範囲第10項に記載の使用。 13．前記スルフォナミドあるいはトリメトプリム抗生物質が、スルフォナミド／ トリメトプリム併合抗生物質である請求の範囲第９項〜第12項のいすれかに記載 の使用。 14．前記グラム陰性細菌感染の起炎菌が、Pseudomonas、Xanthamonas、Klebsiel la、Enterobacter、およびProteus属からなるグループから選択される請求の範 囲第９項もしくは第10項に記載の使用。 15．前記薬剤が、フルオロキノロンあるいはキノロン抗生物質を用いた哺乳類の グラム陰性細菌感染の治療のための薬剤である請求の範囲第１項に記載の使用。 16．前記薬剤が、フルオロキノロンあるいはキノロン抗生物質の哺乳類のグラム 陰性細菌感染の治療効果を改善するための薬剤である請求の範囲第１項に記載の 使用。 17．前記薬剤が、グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のフルオロキノ ロンあるいはキノロン抗生物質に対する感受性を改善するための薬剤である請求 の範囲第16項に記載の使用。 18．前記薬剤が、グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のフルオロキノ ロンあるいはキノロン抗生物質に対する耐性を変換するための薬剤である請求の 範囲第16項に記載の使用。 19．前記フルオロキノロンあるいはキノロン抗生物質が、シプロフロキサシン、 ノルフロキサシンおよびオフロキサシンからなるグループから選択される請求の 範囲第15項〜第18項のいすれかに記載の使用。 20．前記グラム陰性細菌感染の起炎菌が、Pseudomonas、Xanthamonas、Klebsiel la、およびEnterobacter属からなるグループから選択される請求の範囲第15項も しくは第16項に記載の使用。 21．前記薬剤が、ペニシリンあるいはセファロスポリン以外のβ−ラクタム抗生 物質を用いた哺乳類のグラム陰性細菌感染の治療のための薬剤である請求の範囲 第１項に記載の使用。 22．前記薬剤が、ペニシリンあるいはセファロスポリン以外のβ−ラクタム抗生 物質の哺乳類のグラム陰性細菌感染の治療効果を改善するための薬剤である請求 の範囲第１項に記載の使用。 23．前記薬剤が、グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のペニシリンあ るいはセファロスポリン以外のβ−ラクタム抗生物質に対する感受性を改善する ための薬剤である請求の範囲第22項に記載の使用。 24．前記薬剤が、グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のペニシリンあ るいはセファロスポリン以外のβ−ラクタム抗生物質に対する耐性を変換するた めの薬剤である請求の範囲第16項に記載の使用。 25．前記ペニシリンあるいはセファロスポリン以外のβ−ラクタム抗生物質が、 アズトレオナムおよびイミペネムからなるグループから選択される請求の範囲第 21項〜第24項のいすれかに記載の使用。 26．前記グラム陰性細菌感染の起炎菌が、Pseudomonas、Citrobacter、Enteroba cter、Proteus、およびProvidencia属からなるグループから選択される請求の範 囲第21項もしくは第22項に記載の使用。 27．前記薬剤が、ポリミキシン抗生物質を用いた哺乳類のグラム陰性細菌感染の 治療のための薬剤である請求の範囲第１項に記載の使用。 28．前記薬剤が、ポリミキシン抗生物質の哺乳類のグラム陰性細菌感染の治療効 果を改善するための薬剤である請求の範囲第１項に記載の使用。 29．前記薬剤が、グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のポリミキシン 抗生物質に対する感受性を改善するための薬剤である請求の範囲第28項に記載の 使用。 30．前記薬剤が、グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のポリミキシン 抗生物質に対する耐性を変換するための薬剤である請求の範囲第28項に記載の使 用。 31．前記ポリミキシン抗生物質が、ポリミキシンＢである請求の範囲第27項〜第 30項のいすれかに記載の使用。 32．前記グラム陰性細菌感染の起炎菌が、Pseudomonas、Escherichia、Enteroba cter、およびProvidencia 属からなるグループから選択される請求の範囲第27項 もしくは第28項に記載の使用。 33．アミノグリコシド抗生物質でグラム陰性細菌感染を治療する方法において、 アミノグリコシド抗生物質の治療効果を改善する効果をもたらす量のＢＰＩタン パク質生成物を同時投与する工程を含むグラム陰性細菌感染の治療方法。 34．前記グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のアミノグリコシド抗生 物質への感受性を高める効果をもたらす量だけ、前記ＢＰＩタンパク質生成物が 投与される請求の範囲第33項に記載の方法。 35．前記グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のアミノグリコシド抗生 物質に対する耐性を変換する効果をもたらす量だけ、前記ＢＰＩタンパク質生成 物が投与される請求の範囲第33項に記載の方法。 36．前記アミノグリコシド抗生物質が、アミカシン、ゲンタマイシンおよびトブ ラマイシンからなるグループから選択される請求の範囲第33項に記載の方法。 37．前記グラム陰性細菌感染の起炎菌が、Citrobacter、Edwardsiella、Enterob acter、Escherichia、Klebsiella、Morganella、Providencia、Proteus、Pseudo monas、Xanthamonas、SalmonellaおよびSerratia属からなるグルー プから選択される請求の範囲第33項に記載の方法。 38．アミノグリコシド抗生物質とアミノグリコシド抗生物質の治療効果を改善す る効果をもたらす量のＢＰＩタンパク質生成物を含むグラム陰性細菌感染の治療 のための薬剤組成物。 39．スルフォナミドあるいはトリメトプリム抗生物質でグラム陰性細菌感染を治 療する方法において、スルフォナミドあるいはトリメトプリム抗生物質の治療効 果を改善する効果をもたらす量のＢＰＩタンパク質生成物を同時投与する工程を 含むグラム陰性細菌感染の治療方法。 40．前記グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のスルフォナミドあるい はトリメトプリム抗生物質への感受性を高める効果をもたらす量だけ、前記ＢＰ Ｉタンパク質生成物が投与される請求の範囲第39項に記載の方法。 41．前記グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のスルフォナミドあるい はトリメトプリム抗生物質に対する耐性を変換する効果をもたらす量だけ、前記 ＢＰＩタンパク質生成物が投与される請求の範囲第39項に記載の方法。 42．前記スルフォナミドあるいはトリメトプリム抗生物質が、スルフォナミド／ トリメトプリム併合抗生物質である請求の範囲第39項に記載の方法。 43．前記グラム陰性細菌感染の起炎菌が、Pseudomonas、Xanthamonas、Klebsiel la、Enterobacter、およびProteus 属からなるグループから選択される請求の範囲第39項に記載の方法。 44．スルフォナミドあるいはトリメトプリム抗生物質とスルフォナミドあるいは トリメトプリム抗生物質の治療効果を改善する効果をもたらす量のＢＰＩタンパ ク質生成物を含むグラム陰性細菌感染の治療のための薬剤組成物。 45．フルオロキノロンあるいはキノロン抗生物質でグラム陰性細菌感染を治療す る方法において、フルオロキノロンあるいはキノロン抗生物質の治療効果を改善 する効果をもたらす量のＢＰＩタンパク質生成物を同時投与する工程を含むグラ ム陰性細菌感染の治療方法。 46．前記グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のフルオロキノロンある いはキノロン抗生物質への感受性を高める効果をもたらす量だけ、前記ＢＰＩタ ンパク質生成物が投与される請求の範囲第45項に記載の方法。 47．前記グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のフルオロキノロンある いはキノロン抗生物質に対する耐性を変換する効果をもたらす量だけ、前記ＢＰ Ｉタンパク質生成物が投与される請求の範囲第45項に記載の方法。 48．前記フルオロキノロンあるいはキノロン抗生物質が、シプロフロキサシン、 ノルフロキサシンおよびオフロキサシンからなるグループから選択される請求の 範囲第45項に記載の方法。 49．前記グラム陰性細菌感染の起炎菌が、Pseudomonas、Xanthamonas、Klebsiel la、およびEnterobacter属からなるグループから選択される請求の範囲第45項に 記載の方法。 50．フルオロキノロンあるいはキノロン抗生物質とフルオロキノロンあるいはキ ノロン抗生物質の治療効果を改善する効果をもたらす量のＢＰＩタンパク質生成 物を含むグラム陰性細菌感染の治療のための薬剤組成物。 51．アズトレオナムあるいはイミペネム抗生物質でグラム陰性細菌感染を治療す る方法において、アズトレオナムあるいはイミペネム抗生物質の治療効果を改善 する効果をもたらす量のＢＰＩタンパク質生成物を同時投与する工程を含むグラ ム陰性細菌感染の治療方法。 52．前記グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のアズトレオナムあるい はイミペネム抗生物質への感受性を高める効果をもたらす量だけ、前記ＢＰＩタ ンパク質生成物が投与される請求の範囲第51項に記載の方法。 53．前記グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のアズトレオナムあるい はイミペネム抗生物質に対する耐性を変換する効果をもたらす量だけ、前記ＢＰ Ｉタンパク質生成物が投与される請求の範囲第45項に記載の方法。 54．前記グラム陰性細菌感染の起炎菌が、Pseudomonas、Citrobacter、Enteroba cter、Proteus およびProvidencia属からなるグループから選択される請求の範 囲第51項に記載 の方法。 55．アズトレオナムあるいはイミペネム抗生物質とアズトレオナムあるいはイミ ペネム抗生物質の治療効果を改善する効果をもたらす量のＢＰＩタンパク質生成 物を含むグラム陰性細菌感染の治療のための薬剤組成物。 56．ポリミキシン抗生物質でグラム陰性細菌感染を治療する方法において、ポリ ミキシン抗生物質の治療効果を改善する効果をもたらす量のＢＰＩタンパク質生 成物を同時投与する工程を含むグラム陰性細菌感染の治療方法。 57．前記グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のポリミキシン抗生物質 への感受性を高める効果をもたらす量だけ、前記ＢＰＩタンパク質生成物が投与 される請求の範囲第56項に記載の方法。 58．前記グラム陰性細菌感染に関与するグラム陰性細菌のポリミキシン抗生物質 に対する耐性を変換する効果をもたらす量だけ、前記ＢＰＩタンパク質生成物が 投与される請求の範囲第56項に記載の方法。 59．前記ポリミキシン抗生物質が、ポリミキシンＢである請求の範囲第56項に記 載の方法。 60．前記グラム陰性細菌感染の起炎菌が、Pseudomonas、Escherichia、Enteroba cter、およびProvidencia 属からなるグループから選択される請求の範囲第56項 に記載の方法。 61．ポリミキシン抗生物質とポリミキシン抗生物質の治療効果を改善する効果を もたらす量のＢＰＩタンパク質生成物を含むグラム陰性細菌感染の治療のための 薬剤組成物。 62．テトラサイクリン抗生物質でグラム陰性細菌感染を治療する方法において、 テトラサイクリン抗生物質の治療効果を改善する効果をもたらす量のＢＰＩタン パク質生成物を同時投与する工程を含むグラム陰性細菌感染の治療方法。 63．テトラサイクリン抗生物質とテトラサイクリン抗生物質の治療効果を改善す る効果をもたらす量のＢＰＩタンパク質生成物を含むグラム陰性細菌感染の治療 のための薬剤組成物。 64．前記薬剤が、テトラサイクリン抗生物質を用いた哺乳類のグラム陰性細菌感 染の治療のための薬剤である請求の範囲第１項に記載の使用。 65．前記ＢＰＩタンパク質生成物が、約21〜25kDの分子量を有するＮ末端断片あ るいはその二量体である請求の範囲第33項、第39項、第45項、第51項、第56項も しくはに第62項記載の方法。 66．前記ＢＰＩタンパク質生成物が、rBPI₂₃、rBPI₂₁あるいはrBPI₅₀である請求 の範囲第33項、第39項、第45項、第51項、第56項もしくはに第62項記載の方法。