【発明の詳細な説明】
正の細胞選択及び遊離のためのビオチン類縁体接合抗体
本発明の分野
本発明は、ビオチン類縁体／抗体接合体、及び不均質細胞懸濁液から標的細胞
の特異的捕獲の後、該標的細胞を分離しそして遊離させる方法に関する。この一
般的な分野は正の細胞選択としても知られている。
背景
いくつかの細胞選択技術が、特に標的細胞が末梢血、臍帯血、又は骨髄から分
離されている場合に癌の補助治療の一部として、考えられてきた。細胞選択技術
は２つの広い範疇、即ち負の細胞選択と正の細胞選択とに分けられる。
負の細胞選択は患者の又は供与者の血液又は骨髄からの潜在的に有害な細胞の
選択と除去を含む。例えば、転移癌の治療は、造血細胞の補給のために剥奪療法
の後に患者の骨髄細胞を元に戻す意図をもって、剥奪化学療法又は照射に先立つ
患者の骨髄のサンプルの取り出しを含むだろう。該患者に転移腫瘍細胞を戻すリ
スクを最少化するために、負の細胞選択又は浄化が再注入に先立ち該患者の骨髄
サンプルに適用される。このタイプの負の細胞選択は、磁性ビーズのような固相
に結びつけられた、腫瘍細胞と特異的に結合する抗腫瘍抗体に基づく(Hardwick
，A.,et at., J Hematotherapy 1:379-386,1992)。次いで該固相に結合した該腫
瘍細胞は該骨髄サンプルから除去され、捨てられる。負の細胞選択とは対照的に
、正の細胞選
択の狙いは所望の細胞を結合させ、そして生きた状態でそれらを回収することで
ある。正の細胞選択における最も大きな問題の一つは、該固相分離材料からのそ
れらの遊離を達成させる間の、該所望の細胞の生存性の保持である。細胞機能を
保持するために、有機溶媒が使用されてはならず、pHが約7.0〜7.4で保持されな
ければならず、及び温度が37°Ｃよりもあまり高く上げられることはできない。
従って、pH及び温度のゆきすぎるような従来の方法は正の細胞選択のためには使
用されることができない。あるタイプの細胞はジチオスレイトールのような還元
剤及び／又はEDTAのようなキレート剤の低いレベルに耐えるかもしれないが、一
方他の標的細胞は非常に穏やかな還元又はキレート条件下でさえも生存していら
れないかも知れない。
ビオチンに対するアビジンの強い親和性は負の及び正の細胞選択の両方におい
て用いられてきた。アビジン／ビオチンに基づく技術においては、典型的には、
標的細胞に特異的な抗体が幾つかの標準的方法の１つに従ってビオチン化される
（Avidin-Biotin Chemistry：A Handbook ,Eds.Savage，MD，et al.,Pierce Che
mical Co，1992）。負の選択のためには、標的細胞はビオチン化された抗体によ
って結合され、次にアビジン被覆した通常はカラムの形の固相に結合される。次
いで未結合細胞は回収され、及びアビジンに結合させた負の選択された細胞は捨
てられる。
しかし正の細胞選択のためには、ビオチンに対するアビジンの非常に強い親和
性は、標的細胞が細胞／抗体−ビオチン／アビジン複合体内にしっかりと保持さ
れていることから、不利である。該アビジン／ビオチン相互作用は共有結合では
ないが、該相互作用は非常
に強い(Ka=1015M-1)ため、それはpH、温度の広い極限、有機溶媒、還元剤、及び
ほとんどの形の酵素的蛋白質分解に耐える。該ビオチン／アビジン相互作用を開
裂するのに十分に過酷な条件は該標的細胞を損傷又は殺しをもする。
該アビジン／ビオチン相互作用が非常に強いため、他の結合の開裂が所望の目
標抗原の遊離のために提案された。あるビオチン化された試薬は、それらのスペ
ーサーアーム内に化学的に開裂可能な共有結合を有し、又は目標蛋白質と開裂可
能な共有結合を形成する(Sigler，G.F．US Patent Nos：4,798,795 and 4,709,0
37;Wilchek,M.，et al，German Pat．App．DE 3629194 A; Avidin-Biotin Chemi stry：A Handbook
，上記，p.41）。該結合はジチオスレイトール、メルカプトエ
タノール、又は水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元条件下で開裂されるが、こ
れらの条件は機能を維持していなければならない細胞の選択のために考慮するに
は細胞への損傷が通常大きすぎる。
アビジンとより低い親和性で結合する化学的部分でビオチンをおきかえる試み
もなされてきた（Basch et al.，J．Immunological Meth. 56:269-280(1983)）
。
正の細胞選択のための種々の技術が、選択された細胞の遊離のために抗体／エ
ピトープ相互作用の開裂のための機械的手段に頼る。組織培養フラスコが標的細
胞と結合する一次抗体によって被覆されていてもよい。未結合細胞が洗い流され
た後、標的細胞は該フラスコの横を叩くことで遊離される（Lebkowski，JS,et a
l.，Transplantation 53:1101-1019,1992）。正の細胞選択のための別の一方法
は、複合体を形成するために標的細胞と結合する一次抗体と結合す
るビオチン化された二次抗体に結合させたアビジンを含む「サンドイッチ」法を
用いる。該複合体を不均質細胞懸濁液から分離した後、該標的細胞が、該二次及
び該一次抗体の間の相互作用を開裂させるための攪拌によってアビジンから分離
される(Berenson,R.J.，et al.，US Patent Nos：5,215,927 and 5,225,353)。
機械的遊離は細胞が遊離過程の間、損傷に耐えなければならないという明らかな
理由のために不利であり、機械的遊離後には少数の生存細胞しか回収されないと
報告されてきた(Egeland，T.，et al.，Scand J Immunol 27：439-444，1988)
。
細胞遊離のための別の一方法は、パパイン及びキモパパインのような酵素によ
る蛋白質分解を含む。標的細胞は磁性ビーズに次いで結合される一次の抗体を介
して磁性ビーズに結合できる。該細胞／抗体／ビーズ複合体が該不均質細胞懸濁
液から分離された後、該細胞が該細胞表面抗原又は該抗体又は両方の蛋白質分解
によって該ビーズから遊離される(Hardwick，A.，et al., J Hematotherapy 1:3
79-386，1992；Civin，CE，et al.，In Bone Marrow purging and Processing P rogress in Clinical And Biological Research,
Vol.333，Eds．S．Gross，et
al.，Alan R．Liss，Inc，New York，pp 387-402；Civin，CI，EP 0 395 355 Al
；Hardwick，A.，et al.,In Advances in Bone Marrow Purging and Processing - Progress in Clinical and Biological Research,
Vol．377，Eds．Wor-thing
ton-White，DA，et al.,Wiley-Liss，Inc.，New York，pp583-589)。パパイン又
はキモパパインによる蛋白質分解は、これらの酵素が細胞に対して通常は有毒で
はないため、機械的開裂よりも有利である。
機能する標的細胞の高い収率を与える、そして生理学的な相溶性溶液中の比較
的安価な穏やかな試薬に依存する正の細胞選択方法に対する需要がる。
本発明の要約
本発明は、正の細胞選択及び遊離において使用するための、ビオチン類縁体部
分と共有結合により連結された標的細胞結合性蛋白質、好ましくは抗体の安定し
た接合体を提供する。
本発明は、抗体とビオチン類縁体部分の安定な接合体を形成するための方法で
あって、pHが約８で温度が約２°Ｃ〜８°Ｃにおいて媒質中でビオチン類縁体の
N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルと抗体とを反応接触にもたらすこと
を含む方法をも提供する。
本発明は、不均質細胞縣濁液から標的細胞の正の選択のための方法をも提供す
る。
一つの方法は細胞懸濁液内における、ビオチン類縁体部分と連結した一次抗体
と、該ビオチン類縁体部分と結合させそして細胞選択手段と連結させた二次抗ビ
オチン抗体とによって結合された該標的細胞によって形成された複合体の形成を
含む。該複合体は該不均質細胞懸濁液から分離され、次いで競合性化合物、好ま
しくは本物のビオチン（それに対して該二次抗体はビオチン類縁体に対して持っ
ているよりも高い親和性を持つ）と共にインキュベートされる。該競合性化合物
は該二次抗体の結合部位から該ビオチン類縁体部分を追い出し、それにより該複
合体から該標的細胞を遊離させる。次いで該細胞選択手段は該標的細胞から分離
されてもよい。
別の一方法は、不均質細胞懸濁液内でビオチン類縁体部分に連結
させた一次抗体に結合させた該標的細胞とアビジンの一形態（それはビオチン類
縁体部分と結合される）とによって形成される複合体の生成を含む。該複合体は
該不均質細胞懸濁液から分離され、次いで競合性化合物、好ましくはアビジンが
ビオチン類縁体に対して持っているよりも高い親和性を持つ本物のビオチンと共
にインキュベートされる。該競合性化合物は該アビジンの結合部位から該ビオチ
ン類縁体部分を追い出し、それにより該複合体から該標的細胞を遊離させる。次
いで該アビジンは該標的細胞から分離されてよい。
本発明は、上の方法における中間複合体である物質の混合物をも提供する。一
つの中間複合体は抗ビオチン抗体と結合させた細胞分離手段を含み、該抗体は、
今度は、標的細胞結合性蛋白質に共有結合により結合させたビオチン類縁体部分
に結合させてある。別の一中間複合体は、標的細胞結合性蛋白質に共有結合によ
り結合させたビオチン類縁体部分に結合させたアビジンを含む。
図面の簡単な記述
図１は、標的細胞が、抗体／ビオチン類縁体接合体と結合しており、そして該
接合体が今度は、磁性ビーズに連結させた抗ビオチン抗体によって結合されてい
るものである本発明の好ましい方法を描いている。該標的細胞の遊離は該ビオチ
ン結合部位から該ビオチン類縁体を追い出す本物のビオチンによる溶出によって
達成される。
図２は未接合抗体(2B)と比較した抗体／ビオチン類縁体接合体(2A)の質量スペ
クトル分析を示している。
本発明の詳細な記述
この発明はビオチン類縁体部分に共有結合により連結させた標的
細胞結合性蛋白質の安定な接合体、及び不均質細胞懸濁液からの標的細胞の正の
選択及び回収のために該接合体を用いる方法を提供する。
ここに、「標的細胞結合性蛋白質」という語は、該標的細胞上の細胞表面マー
カーと特異的に結合するあらゆる蛋白質をいう。ここで「細胞表面マーカー」と
いう語は、該標的細胞上の特異的に存在するあらゆる部分と定義され、そのよう
なマーカーは蛋白質、脂質、及び炭水化物を含んでもよい。標的細胞結合性蛋白
質の例はレクチン及び抗体、増殖因子、ホルモン、細胞外マトリックス蛋白質及
びそれらの機能的フラグメントを含む。レクチンは典型的には細胞上の特異な炭
水化物部分と結合するが、特異的蛋白質エピトープ又は脂質又は炭水化物に結合
する抗体を得ることもできる。該標的細胞結合性蛋白質は、蛋白質／ビオチン類
縁体部分の安定な接合体を形成する条件下でビオチン類縁体試薬と反応させられ
、該接合体は該蛋白質の特異的細胞表面結合活性を保持する。
好ましい標的細胞結合性蛋白質は一次抗体である。ここに、「一次抗体」とい
う語は、該標的細胞上の細胞表面抗原と特異的に結合する抗体をいう。ここに、
「二次抗体」という語は該一次抗体と結合する抗体をいい、「三次抗体」という
語は該二次抗体と結合する抗体をいう。
図１は本発明の一つの方法の好ましい具体例を描いている。説明のため、この
方法はＣＤ34細胞表面抗原を担持した造血幹／源細胞の正の選択のためのシステ
ムにおいて最初に述べられる(Civin,CI，et al.，In Bone Marrow Purging and Processing - Progress in Clinical and Biological Research
，Eds．S．Gros
s，et al.，A
lan R．Liss，Inc.，New York，Vol.333，pp 387-402)。接合体がビオチン類縁
体（１°Ab/BA）と共有結合により連結された一次抗ＣＤ34抗体から形成される
。血液細胞の不均質懸濁液は該接合体と共にインキュベートされ、それにより該
接合体に結合させた該目標ＣＤ34＋細胞を含んだ第一の複合体を形成する。第二
の複合体は常磁性ビーズに抗ビオチン抗体を連結させることにより形成される。
該第二の複合体の該抗ビオチン抗体は、該第一の複合体の該ビオチン類縁体部分
と結合して、該標的細胞、該１°抗体／ＢＡ（ビオチン類縁体）接合体、該抗ビ
オチン抗体、及び該常磁性ビーズを含む第三の複合体を形成する。該第三の複合
体は磁石によって該不均質細胞懸濁液から分離される。次いで該第三の複合体は
本物のビオチンと共にインキュベートされ、それが該抗ビオチン抗体の結合位置
に対して競合する。抗ビオチン抗体は該ビオチン類縁体に対するよりも本物のビ
オチンに対する方がより高い親和性を有するので、本物のビオチンは第一の複合
体を追い出し、それにより該ビーズから該標的細胞を遊離させる。
本発明の第二の方法は図１において第二の複合体の代わりにアビジンの使用を
含む。従って、該第一の複合体は図１におけるように形成されるが、それはビオ
チン類縁体部分に対するアビジンの親和性によってアビジンと結合され、それに
よって該標的細胞、該１°Ab/BA及びアビジンを含む第二の複合体を形成する。
該不均質細胞懸濁液から分離の後、該第二の複合体は、本物のビオチンと共にイ
ンキュベートされ、それに対してはアビジンは、ビオチン類縁体に対して有して
いるよりも高い親和性を有する。こうして該標的細胞が該アビジンから遊離され
る。ここに、「アビジン」という語は本
物のアビジン又はストレプトアビジンをいう。好ましくは該アビジンはカラム又
は常磁性ビーズのような固相上に保持することによって不溶化され、従って該ア
ビジンを該標的細胞から分離可能にする。
この発明をうまく実施するには、ビオチン類縁体に共有結合により連結させた
結合性蛋白質の安定な接合体を要求する。ここに、「安定な接合体」という語は
、通常の試験室及び実験的な条件下において該蛋白質と該ビオチン類縁体部分に
連結している共有結合の実質的な加水分解を受けない化合物をいう。ここに通常
の試験室及び実験的な条件は、約２°〜37°Ｃの間の温度、約７〜8.5のｐＨ範
囲、及び約４〜16時間の通常の試験室の光への暴露と定義される。さらに本発明
の該安定な接合体は4°Ｃにおいて貯蔵される間少なくとも16時間、好ましくは2
週間又はより長く機能を維持する。該安定な接合体は−20°Ｃ又はそれより低い
温度で凍結貯蔵された場合も少なくとも2週間及び好ましくはより長く機能を維
持する。
本発明では、該接合体は好ましくはpHが約８で及び温度が約２°〜８°Ｃ、最
も好ましくは4°Ｃにおいて媒質中でビオチン類縁体のN-ヒドロキシスクシンイ
ミド(NHS)エステルと共に結合性蛋白質をインキュベートすることによって形成
される。約4乃至約16時間の反応時間の後、該接合体は機能の実質的な損失を伴
わずに4°Ｃで16時間より長く貯蔵されることができる。該接合体は、試験室及
び臨床での使用のための現実の、及び細胞生存性に資す条件下、即ち前に述べた
ように通常の光、pH、及び温度下で正の細胞選択のために使用されるのに十分安
定である。本発明の方法の実行を室温下で通常の光の下で行うことを可能にする
ことから、本発明の安定な
接合体は臨床的適用のために特に適している。
本物のビオチンと抗体との共有結合による結合のための発表された方法によれ
ば、蛋白質に対するビオチンのモル比は、抗体結合機能の保持のために2〜3のモ
ルビオチン：モル抗体に制限されるべきである（Avidin-Biotin Chemistry：A H andbook
,上記，pp.86-87）。驚くべきことに、本発明の方法を用いて、ビオチ
ン類縁体が抗体の結合機能の損失を伴わずに30:1までのモル比で抗体と共にイン
キュベートされることができることが発見された。この高いモル比は、相互作用
の価数の増加によって、低い親和性の結合に関する問題を克服する。このため該
多くの低い親和性相互作用の総計が、該標的細胞の効率的な分離を許容する。し
かしながら、これらの低い親和性相互作用は該回収された細胞の生存性を減少さ
せる過酷な条件を用いずにやはり開裂されることができる。ここに実験例を与え
られて、該接合体の形成において用いられるモル比が該接合体の用途ならびに使
用される特定のビオチン類縁体に従って変更できることが当業者に明らかであろ
う。例えば、2°抗体に対して比較的高い結合親和性を示すビオチン類縁体は、
より低い親和性のビオチン類縁体と比較して同じ効率を達成するために、より少
ない数の接合された分子を要求するであろう。例えば、標的細胞の最終的な収率
が最適化され、及びビオチン類縁体：抗体のモル比を増加し、同時に、使用され
るビーズの数を減少することによって、よりコスト効果のよいものがつくられる
かもしれない。
ここに、「ビオチン類縁体」という語は、抗ビオチン抗体によって又はアビジ
ンによって結合されるのに十分な物理化学的及び構造的な同族性を本物のビオチ
ンと共有する化合物をいう。ビオチン類
縁体の例はデスチオビオチン及び2'-イミノビオチン（Biochem J 101:774，196
6）、ビオチンスルホン(Methods in Enzymology，Vol XVIII，Vitamins and Co enzymes，Part A,
1970，p．423)、ビスノルビオチン、テトラノルビオチン、及
びオキシビオチンを含む。いくつかのビオチン類縁体のアビジンに対する結合親
和性が知られているが、抗ビオチン抗体のビオチン類縁体に対する結合親和性は
それぞれ個々の抗体について変動すると予想される。一般には、アビジンのビオ
チン類縁体に対する結合親和性は本物のビオチンに対するアビジンの親和性より
も低い。例えば、デスチオビオチンに対するアビジンの結合親和性は5×1013 M- 1
であり、これは本物のビオチンに対するアビジンの該親和性(Ka=1015 M-1)より
も十分に低い。同様に、2'-イミノビオチンに対するアビジンの該親和性は3.5×
1011 M-1であり、これも本物のビオチンに対するアビジンの親和性よりも相当低
い。これは本物のビオチンはアビジン上のそれらの結合位置から本発明の該接合
体上のビオチン類縁体部分を追い出すことに大きな競合上の優位性を有すること
を意味する。
本物のビオチンに抗して産生された抗体によるビオチン類縁体の結合は、ア
ビジンによる結合と同一ではないが類似している。抗ビオチン抗体はポリクロー
ナル又はモノクローナルのいずれかであってもよい。ポリクローナル抗体は通常
、アルブミンのような抗原性アジュバントと接合させたビオチンを当該動物に注
入することによって、ヤギ、ヒツジ、又は家兎のような動物の中で産生される。
（本物のビオチン単独では小さな分子量の分子であることからあまり抗原的では
なく、血液中にビタミンとして天然に存在している。）得られるポリクローナル
血清は、アジュバントと結合したビオチ
ン上のさまざまなエピトープと抗体の独特の組み合わせである。驚くべきことに
、ビオチンに対して産生された異なった源からのさまざまな親和性の精製された
ポリクローナル血清は、本発明において使用するに適した親和性を以てビオチン
類縁体と結合することが発見された。すなわち、該ビオチン類縁体に対する親和
性は該ビーズに該標的細胞を結合させるのに十分強く、しかも本物のビオチンに
よってうまく競合して脱落させられるのに十分弱いものであった。モノクローナ
ル抗体は通常抗原をマウス又はラットに注入し、次いでハイブリドーマを形成す
るために個々の脾細胞を不死の骨髄腫細胞と融合させることによって産生された
。各ハイブリドーマは抗原の個々のエピトープ対して特異的なモノクローナル抗
体を合成する。再度、マウス抗ビオチンモノクローナル抗体が、本発明において
それを有用にするのに適した親和性をビオチン類縁体及び本物のビオチンに対し
て有することを発見したことは驚くべきことであった。該開示を与えられれば、
抗体の産生及び試験を行う当業者は本発明において機能をする他の抗体を得たり
、同定することが可能であろう。
本発明の方法は、競合性の薬剤がアビジン上の又は該抗ビオチン抗体上の結合
位置からビオチン類縁体部分を追い出すことを要求する。該競合性の薬剤は、該
ビオチン類縁体によって占められた該結合位置に対する競合性の結合優位性を有
しなければならない。好ましい競合性の薬剤は本物のビオチンである。なぜなら
アビジンと抗ビオチン抗体の両方へのその結合は試験した薬剤のなかで最も強い
からである。さらに本物のビオチンは、ヒトの治療の使用に適した注入可能グレ
ードで入手できるはずの簡単でよく知られたビタミン
である。他の競合薬剤が本発明の実施において有用かもしれないことも想定され
ている。例えば、該接合体上の該ビオチン類縁体部分がデスチオビオチンに比較
してアビジンや抗ビオチン抗体に対する低い親和性を有するならば、次いでデス
チオビオチンが競合性の薬剤として使用されてもよい。デスチオビオチンも、ビ
オチンシンセターゼによってビオチンに生体内変化されることができることから
、比較的穏やかな試薬と考えられる(Gene 80:39-48，1989; BBRC 88:132，1979)
。最も好ましい組み合わせは、その後の本物のビオチンによる競合的に追い出さ
れる接合体上の部分としてのデスチオビオチンである。
蛋白質とビオチン類縁体試薬の間の共有結合による連結は該蛋白質のアミン基
、スルフヒドリル基、又は炭水化物基を介して形成されることができる。本発明
の接合体の形成において、ビオチン類縁体反応を本物のビオチンとの既知の反応
に従って実施してよい（ Avidin-Biotin Chemistry：A Handbook 上記，pp.25-
87）。ビオチン類縁体試薬はN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、p-ニ
トロフェニル(BNP)エステル、ヒドラジン、ピリジルジチオ−，ヨードアセチル
−，及びマレイミドプロピオニル−ビオチン類縁体よりなる群より選ばれること
ができる。同様に、光活性化可能なビオチン類縁体も使用されてよい。これらの
ビオチン類縁体試薬は購入されてもよく又は確立された方法に従って合成されて
もよい。
一度、蛋白質／ビオチン類縁体接合体が形成されると、それをELISA、ウエス
タンブロット、ドットブロット、及び標的細胞捕獲といった確立された方法によ
って抗原結合能力の保持について試験することができる。該接合体も抗ビオチン
抗体による又はアビジンに
よる結合について同じ方法によって試験されることができる。
この発明は、それらの一次抗体の結合機能を保持する抗体／ビオチン類縁体接
合体を形成するための方法を提供する。しかし、ある環境下では、該一次標的細
胞結合性抗体が接合されていないまま残ることを許容するあるタイプの「サンド
イッチ」法を用いるこの発明の変形の実施が望ましいかもしれない。このタイプ
の変形では、一次抗体に特異的な二次抗体が該ビオチン類縁体と接合される。例
えば、もし該一次抗体がマウスモノクローナル抗ＣＤ34であれば、該二次抗体は
ヤギ抗マウス-Fcであってよかろう。従って、第一の複合体が該標的細胞、該一
次抗体、及び該二次抗体／ビオチン類縁体接合体によって形成される。次いで、
該ビオチン類縁体が図１におけるように第二の複合体に、又はアビジンに結合さ
れ、その後図１におけるように天然のビオチンで溶出される。この変形の利点は
、該一次抗体（これはその意図する適用に従って当該キットの使用者によって選
択されることができよう）を除いた本発明の方法の全ての要素を含んだ汎用性キ
ットの製造を可能とすることである。
この発明の使用は、臨床適用に適した生理学的に適合性のある溶液中の機能的
標的細胞の十分に純粋な集団を提供する。
後の実験例は説明の説明として提されており、本発明の範囲を制限すると意図
したものではない。
実施例 １ビオチン類縁体の抗ＣＤ34抗体への共有結合による連結
「9079」と名付けられたモノクローナル抗ＣＤ34抗体（マウス）がBecton-Dicki
nson(8G12 細胞株)から得られたハイブリドーマから標準的な方法によって製造
された。
N-ヒドロキシ-スクシンイミド-DL-デスチオビオチン(NHS-DL-デスチオビオチン)
(Sigma,Cat．No．H-2134)がカルシウム又はマグネシウムを含まないPBS(pH 8.0)
中に、1.5mg/mlの濃度に溶解された。所望により、該 NHS-DL-デスチオビオチン
は、水溶液に加えられる前に少量のDMSO又はDMF中に最初に溶解された。該溶液
は約4°Ｃまで氷水浴中で冷却された。該モノクローナル抗体は、約4°Ｃにて、
1.0mg/mlの濃度で同じ緩衝剤(ph 8.0)中に溶解された。デスチオビオチンが該抗
体溶液に3.25、7.5、15、及び30:1のモル比（デスチオビオチン：抗体）で加え
られた。該溶液は4°Ｃで4〜16時間保たれ、次いで遊離のNHS及び未結合のデス
チオビオチンのような低分子量化合物を除去するためにゲル濾過カラム(PD-10,P
harmacia，No.17-0851-01)によって分離された。該分離された試料は4°Ｃで保
たれ、そしてウエスタンブロット及びドットブロットによって結合活性について
試験された。
ビオチン類縁体の第二のタイプ、2-イミノビオチンも上と同様な方法を用いて
モノクローナル抗体9079と結合された。
実施例 ２MALDI-TOF 質量スペクトル分析を用いた抗体当たりの接合されたビオチン類縁体 の数の決定
この実施例は標的細胞結合性蛋白質に連結されたビオチン類縁体部分の量を決
定するためにMatrix Assisted Laser DesorptionIonization(MALDI)-Time of Fl
ight(TOF)Mass Spectrometer(MS)の使用を示す。
この分析のために使用された抗体はCD34細胞表面抗原に対して特異的な、前に
述べられた9079であった。該ビオチン類縁体デスチオ
ビオチンの接合が実施例１において述べられたように行われた。具体的にはデス
チオビオチンが、モル比30:1 デスチオビオチン：抗体で抗体に加えられた。接
合の後、該抗体／ビオチン類縁体試料及び未標識の抗体試料が質量スペクトル分
析のために調製された。具体的には該9079抗体及びデスチオビオチンに接合され
た抗体のそれぞれ1mgが燐酸アンモニウム緩衝液の付加こよって2.5mlに調節され
た。次いで緩衝液交換がPD10カラム(Pharmacia)及び燐酸アンモニウム緩衝液に
よる溶出を用いて行われた。それぞれの試料からの溶出液(3.5mls)がCentricon
カラム(Centricon 30；Amicon)を用いて２つの別個の遠心分離によって濃縮され
た。該緩衝液交換の手順が再び燐酸アンモニウム緩衝液によって繰り返された。
該試料はMidwest Center for Mass Spectrometry(University of Nebraska-Linc
oln)に分析のために送られた。
該未標識及びデスチオビオチン標識された抗体両方の分子量がMALDI-TOF質量
スペクトロメトリーによって測定された。該分析結果が図２に示されており、こ
れは25よりも多い独立した決定の平均である。該図中に見ることができるように
、該対照抗体に対する分子量はM+及びM++イオンについてそれぞれ151,181及び15
1,170であった。該デスチオビオチン標識された抗体はM+及びM++イオンについて
それぞれ154,055及び154,030の分子量を示した。
該上の分子量を用い、そして連結手順の間の1つの水分子(MW=18)の除去により
デスチオビオチンの分子量が214.3であるということを与えられて、それぞれの
抗体分子が連結されたデスチオビオチンの分子を平均14.6個含んでいたことが計
算された(SD±1.6)。精度が±0.1％と決定され、おそらく0.016％であろう。逆
に、HABAア
ッセイのみによって得られた結果は、抗体分子当たりのデスチオビオチンの分子
が平均11.3個であることが明らかになった。
これらの結果は、10:1よりも大きいモル比が標的細胞結合性蛋白質と接合させ
たビオチン類縁体部分を用いることで達成されることができることを示す。さら
に該結果は、MALDI-TOF質量スペクトル分析は抗体(MW=150,000)のような大きな
蛋白質と接合された部分の数の決定のために効率的で正確に利用されることがで
きることをも示す。
実施例 ３抗ビオチン抗体の常磁性ビーズへの連結
ポリクローナルヤギ抗ビオチン抗体がVector Labs,San Mateo,CA，Cat．No．S
P3300；CalBiochem,San Diego，CA，Cat．No.203199；Pierce Chemical Co.，Ro
ckford，MD，Cat．No.31852の3つの供給者から得られた。腹水形のモノクローナ
ルマウス抗ビオチン抗体がAmerican Qualex,La Mirada，CA，Cat．No.M2270から
得られ、ProSep Aカラム(Bioprocessing，Durham，UK，Cat．No.8422)によって
精製された。
トシル基活性化常磁性ポリスチレンDynalビーズがBaxter Fenwal Division,Ro
und Lake，ILから得られた。縣濁液中の該トシル基活性化常磁性ビーズは50mMの
ほう酸塩緩衝液pH9.5(カップリング緩衝液)によって素早く洗浄された。抗ビオ
チン抗体がカップリング緩衝液中に1mg/ml（ポリクローナル）又は0.5mg/ml（モ
ノクローナル）に溶解又は復元された。カップリング緩衝液内の抗ビオチン抗体
が該トシル基活性化常磁性ビーズに50μg/mgビーズ（ポリクローナル）又は25μ
g/mgビーズ（モノクローナル）に加えられ、インキ
ュベーションが室温下で終夜行われた。抗ビオチン抗体を連結させた常磁性ビー
ズが洗浄され、そして4°Ｃで貯蔵された。
実施例 ４抗体／デスチオビオチン接合体を用いたKG1a捕獲及び遊離
KG1aはその細胞膜上にCD34抗原を発現するヒト細胞株(ATCC No.CCL 2146.1)で
、CD34+細胞の正の選択のための初期試験又は条件最適化のためのモデル系とし
て使用される。
抗CD34特異的抗体-デスチオビオチン接合体が表１〜４に示された濃度で30分
間室温において（約22°Ｃ）KG1a細胞とインキュベートされた。
他のKG1a細胞が、ビオチン類縁体部分のない抗CD34抗体HPCA-1(Becton-Dickin
son)によってインキュベートされ、その後涸渇のために陽性対照としてヒツジ抗
マウス(SAM)Dynalビーズと結合された。
陰性対照として、KG1a細胞は非特異的なIgG1アイソタイプと共にインキュベー
トされ、その後SAMビーズと混合された。
他のKG1a細胞は、天然のビオチンと溶出／競合による細胞の遊離を比較するた
めの対照実験における使用のために、抗体-ビオチン接合体と共にインキュベー
トされた。該抗体-ビオチン接合体は標準的な化学的方法(Biotinylation Reagen
ts．IN: Avidin-Biotin Chemistry：A Handbook，Eds．Savage，MD，et al,Pier
ce Chemical Company，1992，pp.25-86)によって調製された。
該実験は2%FBSを含む低ビオチンDMEM中で実施された。通常、試験管当たり百
万個の細胞が使用された。細胞は過剰の（未結合）抗体接合体を取り除くため洗
浄された。次いで細胞−抗体−デスチオ
ビオチン複合体が示された濃度に、抗ビオチン抗体で被覆された常磁性ビーズと
混合され、インキュベーションが連続攪拌下で30分間室温において行われた。ビ
ーズ細胞複合物は磁石を用いて未結合細胞から分離された。未結合細胞を含む溶
液は細胞カウントのために確保された（涸渇ステップ）。ビーズ細胞複合物は3
回洗浄された。
細胞抗体ビオチン複合体は上と同様に扱われた。
ビオチン貯蔵溶液が低ビオチンDMEM,2%FBS中でDL-ビオチン(Pierce Chemical
Co.,Rockford,IL,Cat．No.29129)を溶解することによって調製された。次いで該
捕獲された細胞がビーズ細胞複合体を1〜5mMのビオチンと30分間、室温下、連続
攪拌下でインキュベートすることによって該ビーズから遊離された。ビオチンは
抗ビオチン抗体上の結合位置を求めて該デスチオビオチン部分と競合し、従って
該ビーズ／抗ビオチン抗体複合体から該細胞／抗体デスチオビオチン複合体を外
した。
のいづれかによって行われた。
次いで常磁性ビーズが遊離された細胞から磁石を用いて分離された。遊離され
た細胞を含む溶液が細胞カウントのために確保された（遊離段階）。細胞カウン
トは顕微鏡及び血球計算盤を用いて行われた。細胞生存性がトリパンブルー染色
液で該懸濁液を希釈することによって測定された。
続いて計算が行われた。即ち、
％涸渇＝〔１−（未結合画分中の細胞数／IgG1*の未結合画分中の細胞
数）〕×100
（IgG1*は細胞のビーズに対する非特異的な結合を測定するためのアイ
ソタイプ対照である。）
％遊離＝（遊離された画分の細胞数／使用された細胞の初期数、通常106
）×100
％収率及び収量は％遊離と同様に計算された。
結果：表１に示すように、同等の涸渇（即ち、ビーズ上の細胞捕獲）が0.2μg
/106細胞/試験管の抗体濃度でデスチオビオチン接合抗CD34抗体(9079-デスチオ
ビオチン)又は対照(HPCA-1)のいづれを用いても得られた。天然のビオチンによ
るインキュベーションによる、9079-デスチオビオチンと複合化された細胞の遊
離は約78％(収率)もあった。非特異的遊離は、HPCA-1複合体の渦攪拌によって示
されるように、この実験では約18%を示した。これらの結果は、ビオチン競合を
用いた細胞の特異的遊離は約60%又はより良かったことを示す。
表３はビオチンに結合された抗CD34抗体9079(9079B)を用いた対照実験の結果
を示す。予想されたように、該％涸渇（即ち、ビーズ上の細胞の捕獲）は高いが
、しかしビーズからの細胞の％遊離は非常に低く、対照(HPCA-1)よりもたった約
１％多く含むにすぎない。この実験はビオチン接合された抗体はビーズと結合さ
れた細胞が捨てられるべき場合の負の選択に非常に適しているであろうことを示
す。しかしながら、選択された細胞がビーズから遊離されて回収されると意図さ
れている場合の正の選択に対しては、ビオチンに基づく本遊離機構はビオチン接
合抗体に抗して成功しない。
試験管当たり百万個のKG1aが使用された。抗体はKG1a細胞とインキュベートさ
れ、次いでビーズが細胞に加えられた。9079のビオチン化は炭水化物残基を介し
て起こる。
実施例５「サンドイッチ」法、即ち二次抗体／2-イミノビオチン接合体を用いるKG1a捕獲 及び遊離
ヤギ抗マウス(GAM)ポリクローナルIgG(二次抗体)と共有結合により連結された
2'-イミノビオチンの接合体が実施例１の方法に従って調製された。一次抗体（
マウスモノクローナル抗ＣＤ34 9079）がKG1a細胞に結合され、次いで複合体を
形成するために二次抗体GAM／2'-イミノビオチン接合体によって結合された。次
いで三次抗体（ヤギ抗ビオチン）に連結された磁性ビーズが2'-イミノビオチン
に対する三次抗体の親和性を介して該複合体に結合された。次いで細胞は記述さ
れたようにDL-ビオチンと共にインキュベーションすることによって該ビーズか
ら遊離された。
結果：表４に示されたように、該抗体／2-イミノビオチン接合体を用いた％捕
獲（％涸渇）は96%もあり、これは陽性対照(HPCA-1)によって達成されたものと
同等であった。該抗体／2-イミノビオチン接合体を用いた％収率（％遊離）は35
%と同じぐらい高かった。収率パーセントは、最適条件下では80%又はより高くで
きると予想された。
百万個の細胞が5μｇの9079と共にインキュベートされ、未結合抗体が洗浄され
た。次いで該細胞は該表に示された量で接合させたヤギ抗マウス(GAM)2-イミノ
ビオチンと共にインキュベートされる。５百万個のビーズが使用された。
実施例６細胞集団のKG1aスパイク；特異的涸渇及び遊離
KG1a細胞は次のように蛍光色素標識された。即ち、100mgのBisensimide H33342
Fluorochrome(Calbiochem Cat．No.382065)が10億分の1純度の水50mlに溶解され
た(2mg/ml)。 KG1a細胞のそれぞれのフラスコに100μlの蛍光色素染料溶液が加
えられ、該細胞は30分間37°Ｃで染料中でインキュベートされた。次いで、該標
識された細胞はDaudi細胞と1:50の比率で混合された。Daudi細胞は細胞表面にCD
34-抗原を発現しない細胞である。捕獲及び遊離が前のように実行された。該KG1
a細胞は該未結合画分及び該遊離画分内で蛍光顕微鏡下にカウントされた。該遊
離画分中の該Daudi細胞も該遊離画分の純度を測定するためにカウントされた。
パーセント純度が次のように計算された。即ち、
％純度＝(該遊離画分中のKG1a細胞の数×100)／該遊離画分内の全体細
胞（Daudi＋KG1a）の数
結果：表５に示されたように、抗ＣＤ34抗体／デスチオビオチン接合体(9079-
デスチオビオチン)を用いることで、高い涸渇割合と特異的な収率が達成された
。最適結果が0.2μgの抗体接合体/106細胞を用いて得られた。さらに、該遊離細
胞集団の純度が88% KG1a細胞の範囲にあった。
KG1a細胞はDaudi細胞中でスパイクされた(2%)。百万個のKG1a細胞が用いられ
た。ビーズに対するKG1a細胞の比率は1:10である。Nutatorの代わりにVortexが
この実験において使用された。
実施例７ヒトの可動化末梢血及び骨髄からＣＤ34+細胞の捕獲及び遊離
末梢血又は骨髄試料が血小板を除去するために1%ヒト血清アルブミン(Baxter
Hyland Division)を含むDulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM-HSA)中で該
試料を再懸濁し、その後室温において1000RPMで10分間遠心分離することによっ
て３回洗浄された。ビーズに非特異的に結合した細胞を除去するために、洗浄さ
れた血液試料は被覆されていない常磁性ビーズによって30分間37°Ｃで10分毎に
手で回転させながらインキュベートされた。該被覆されていないビーズは磁石を
用いて該血液試料から分離された。該ビーズはDMEM/HSAで一度洗浄され、ビーズ
は分離され、そして該洗浄溶液は該分離された試料と共に再プールされた（予備
涸渇ステップ）。所望により、該予備涸渇ステップは、感作ステップ後、プール
されたヒトIg画分(Gemmagard，Baxter Hyland Division，Duarte，CA)と共に細
胞をインキュベートすることにおきかえられた。次いで該試料は抗CD34抗体デス
チオビオチンと共に30分間4°Ｃで回転しなからインキュベートされた（これは
感作ステップとして知られている）。細胞は未結合抗体接合体を除去するために
洗浄された。次いで該感作された細胞は抗ビオチン抗体が被覆した常磁性ビーズ
によって30分間4°Ｃで回転しなからインキュベートされた。ビーズは磁石を用
いて該試料から分離され、後に該負の画分が残された。ビーズ／細胞複合体はDM
EM/HSAによって３回洗浄され、該３つの洗浄液が該負の画分と共にプールされた
。
次いで該ビーズ／細胞複合体がビオチン(5mM)と共に15分間室温で回転しなか
らインキュベートされた。
陽性対照として、細胞をモノクローナル抗体9069（抗CD34、ビオチン又はビオ
チン類縁体不含）と共にインキュベートされ、その後ヒツジ抗マウス被覆Dynal
常磁性ビーズに結合させた。該末梢血細胞懸濁液から磁性分離の後、該対照ビー
ズ／細胞複合体は15分間37°Ｃで細胞をビーズに結合する抗体を酵素的に消化す
るキモパパインと共にインキュベートされ、こうして該細胞が遊離された。
ビーズは磁石を使用して分離され、そして該溶液は保存された（正の画分）。
ビーズはDMEM/HSAによって一度洗浄され、そして該洗浄液は該正の画分と共にプ
ールされた。
細胞はFACScan分析のために次のように標識された。HPCA-2-FITC(Becton Dick
inson Cat．No.348053)がCD34+細胞の同定のために該9069キモパパイン対照細胞
に加えられた。マウスIgG1-FITC及びIgG2-PEの混合物(Becton Dickinson,Cat．N
o.340041)がアイソタイプ対照として細胞試料に加えられ、細胞に結合する非特
異的な抗体の量を評価するために用いられた。LeukoGATE(Becton Dickinson,Cat
．No.340040)が該全白血球集団を同定するための手段として細胞試料に加えられ
た(LeukoGATEは白血球を標識する抗CD45-FITC及び単球を標識する抗CD14-PEの混
合物である。）ヤギ抗マウスIgG-FITC(Becton Dickinson Cat．No.349031)が、C
D34に結合したマウスモノクローナル抗体9079及び9069を担持した白血球の割合
を決定するために標識として使用された。
それぞれの標識のために、試験又はアイソタイプ対照の抗体調製液の20μl(1
μg)がポリプロピレン試験管に加えられた。試験管当たり有核細胞(106)が初期
試料又は負の画分のために加えられ、そして少なくとも2.5×104細胞が正の画分
のために加えられた。4
°Ｃにおいて30分間のインキュベーションの後、細胞は2mlの2%FBS/0.02%NaN3/P
BS(洗浄緩衝液)を用いて二度洗浄され、次いで固定液300μl中に再懸濁された。
FACScan分析がそれぞれの画分内の％CD34+細胞を決定するために異なった画分
（洗浄試料、予備涸渇画分、負の画分、及び正の画分）に対して行われた。
フローサイトメーターがメーカー推奨に従って較正された。出発材料のHPCA染
色、予備涸渇された試料、及び負の画分について少なくとも20,000の事象が集め
られたことを除き、少なくとも10,000の事象がそれぞれの試料について集められ
た。
該白血球ゲートが、LeucoGATEによって染色された該出発材料(mPBSC)を含んだ
ファイルからFL1(FITC)対FL2データを呼び出すこと、及びFL1内で陽性の全ての
事象の周りにボックス（領域R1）を描くことによって決定された。同じファイル
を用いて、前方散乱(FSC)対側方散乱(SSC)データがR1内に存在する全てのそれら
の事象について呼び出された。ボックスが全ての白血球の周りに描かれた。
CD34+細胞の％が、同時試験対照によって染色された出発材料を含んだファイ
ルからR2（白血球分析ゲート）内に入るそれらFL1対SSCの事象を呼び出して、陽
性染色（即ち、HPCA-2-FITC又はGAM-FITC）によって染色された細胞の同じドッ
トプロットと比較することによって決定された。該陽性染色に陽性且つ低SSC(%C
D34+)である全ての事象を含むボックス（領域R3）が描かれた。
純度パーセントがFACScan分析によって決定された（正の画分中の％CD34+細胞
）。他の値は次のように計算された。
％捕獲＝〔１−（FACScanからの負の画分中の％CD34+細胞×負の細胞の
数／予備涸渇試料中の％CD34+細胞×使用された予備涸渇からの細胞数）〕×100
予備涸渇された細胞からの最終的な収率パーセントは、
（正の画分内の％ＣＤ34+×正の細胞の数）／（予備涸渇された試料内
の％CD34+×予備涸渇から使用された細胞数）
全MNCからの最終パーセントは、
（正の画分中の％CD34+×正の画分内のCoulterカウンティングによる細
胞数）／〔（予備涸渇試料内の％CD34+×予備涸渇から使用された細胞数）／（
予備涸渇からの収率％）〕 （赤血球はカウンティング溶液によって溶解さ
れるので、Coulterカウンティングは単核球のみカウントする。）
結果： 収率は30〜40%であり、該正の画分中のCD34+細胞の純度は40〜80%の
範囲であった。一度条件が最適化されれば、80%よりも大きい収率と80%よりも大
きい純度が得られるであろうと予想される。
実施例８アビジンに結合した抗体デスチオビオチンを介した正の細胞選択
接合体を形成するために実施例１、２、及び／又は７の方法に従って、抗CD34
抗体がデスチオビオチン又は2'-イミノビオチンと共有結合により結合された。K
G1a細胞が該抗体／ビオチン類縁体接合体と共にインキュベートされた。
次いで感作された細胞が次の形でアビジンと共にインキュベートされた。即ち
、アルブミン(HSA)／アビジンビーズ、アビジン／ガラスビーズ、及びストレプ
トアビジン(Dynal)ビーズである。
該抗CD34+抗体上の該ビオチン類縁体部分は、該細胞を該アビジン固相に接合
させるに十分な親和性によってアビジンと結合した。結合パーセント（%涸渇）
は約90%と同じ位高い範囲であった。
次いで該KG1a細胞が、アビジンに対するビオチンのより高い結合親和性のため
、アビジン上の結合位置に対してデスチオビオチンより競合力の優れた本物のビ
オチンとのインキュベーションによって該アビジンから分離された。
この方法はヒトの骨髄又は血液からCD34+幹細胞の正の選択及び回収に対して
うまく適用されるてあろうと予測される。一旦条件が最適化されれば、80%に純
度が近づくと共に％収率は50%又はより高くなると予想される。
実施例９ビオチン類縁体ビオチンスルホン、ビスノルビオチン、テトラノルビオチン、及 びオキシビオチンと接合させた抗体の調製
デスチオビオチン及び２−イミノビオチンに加えてこの発明における使用のた
めに抗体と連結されることができよう多くの他のビオチン類縁体がある。有用な
ビオチン類縁体の例はビオチンスルホン、ビスノルビオチン、テトラノルビオチ
ン、及びオキシビオチンを含む。それらのビオチンとの抗原的類似に加えて、こ
れらの類縁体はビオチンが行うのと同様の様式で反応に加わることが予期される
。従って、これら他のビオチン類縁体のNHSエステルがNHS-デスチオビオチン又
はNHS-2-イミノビオチンが行うように抗体のアミノ基と反応することが予期され
る（上の実施例１を見よ）
さらに、他のタイプのビオチン類縁体試薬が抗体との接合体の形成において有
用であることが明らかになると予想される。ビオチン
類縁体ｐ−ニトロフェニルエステル(BaNP)が抗体を標識するために用いることが
できるであろう別のアミン反応性試薬の一つである。
あるビオチン類縁体ヒドラジドが有用な接合体を形成するために抗体の炭水化
物基及びカルボキシル基と反応すると予測される。
ビオチン類縁体ヘキシル−ピリジルジチオ−プロピオンアミド(HPDP)、ヨード
アセチル−LC−ビオチン類縁体、及び３−（Ｎ−マレイミドプロピオニル）ビオ
チン類縁体は抗体上のスルフヒドリル基と反応することが予期される３つの試薬
である。
光活性化可能な反応基を有するビオチン類縁体もまた蛋白質へのビオチン類縁
体の共有結合による連結のために役立つことが示されよう。
従来のビオチン化学から適応された反応プロトコールが、抗体とさまざまな他
のビオチン類縁体との接合のために用いられるであろう（「Biotinylation Reag
ents」、上記 を見よ）。それぞれの新しい接合体が本発明における使用のその
適性について試験されるであろう。それぞれの接合体はELISA、ウエスタンブロ
ット、及びドットブロットといった従来の方法によって抗原結合活性の保持につ
いて試験されるであろう。次いで、それぞれの接合体は従来の方法を用いて抗ビ
オチン抗体、又はアビジンによる結合について試験されるであろう。次いで抗ビ
オチン抗体又はアビジンの該新しい接合体に対する相対親和性が、該細胞を遊離
するために該接合体の結合を求めて競合するために最終的に使用されるであろう
ビオチン又は他のビオチン類縁体に対して試験されるであろう。いくつかの有用
なビオチン類縁体／抗体接合体を、該接合体が抗ビオチン試薬（抗
体又はアビジン）による認識に関してビオチンと十分な類似性を有するが、しか
し該抗ビオチン剤は天然のビオチンに対するよりも該接合体に対して一層低い親
和性を有し、そのことが競合的溶出及びそれによる所望の細胞の遊離を許容する
、という原理に基づいて作ることができる。Detailed Description of the Invention
Biotin analog conjugated antibody for positive cell selection and release
Field of the invention
The present invention is directed to biotin analog / antibody conjugates and target cells from heterogeneous cell suspensions.
Of specific target cells, and then separating and releasing the target cells. This one
The general field is also known as positive cell selection.
background
Several cell selection techniques have been used to isolate target cells, especially from peripheral blood, cord blood, or bone marrow.
It has been considered as part of adjunctive treatment for cancer when separated. Cell selection technology
Is divided into two broad categories, negative cell selection and positive cell selection.
Negative cell selection is for potentially harmful cells from the patient's or donor's blood or bone marrow.
Including selection and removal. For example, the treatment of metastatic cancer is deprivation therapy to supplement hematopoietic cells.
Prior to deprivation chemotherapy or irradiation with the intent to restore the patient's bone marrow cells after
It will include removal of a sample of the patient's bone marrow. Return metastatic tumor cells to the patient
Negative cell selection or clearance prior to reinfusion in order to minimize risk
Applied to samples. This type of negative cell selection is based on a solid phase such as magnetic beads.
Based on an anti-tumor antibody that binds specifically to tumor cells (Hardwick
， A., et at.,J Hematotherapy 1: 379-386, 1992). The tumor then bound to the solid phase
Ulcer cells are removed from the bone marrow sample and discarded. In contrast to negative cell selection
, Positive cell selection
The aim of choice is to combine the desired cells and recover them alive.
is there. One of the biggest problems in positive cell selection is that of the solid phase separation material.
The retention of viability of the desired cells while achieving their release. Cell function
No organic solvent should be used to hold and the pH should not be held at about 7.0-7.4.
And the temperature cannot be raised above 37 ° C.
Therefore, traditional methods such as pH and temperature extremes are not used for positive cell selection.
Cannot be used. Some types of cells have dithiothreitol-like reduction
Agents and / or may withstand low levels of chelating agents such as EDTA, but
Other target cells may survive even under very mild reducing or chelating conditions.
May not be.
The strong affinity of avidin for biotin is in both negative and positive cell selection.
Has been used. In avidin / biotin based technologies, typically:
Antibodies specific for target cells are biotinylated according to one of several standard methods
(Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, Eds.Savage ， MD ， et al., Pierce Che
mical Co, 1992). For negative selection, target cells were treated with biotinylated antibody.
And then to an avidin-coated solid phase, usually in the form of a column. Next
Unbound cells were recovered and negatively selected cells bound to avidin were discarded.
Be taken.
However, for positive cell selection, avidin's very strong affinity for biotin
The ability of the target cells to be held firmly within the cell / antibody-biotin / avidin complex.
Therefore, it is disadvantageous. The avidin / biotin interaction is not covalent
But the interaction is very
Strong (Ka= 10FifteenM-1Therefore, it has pH, wide temperature limits, organic solvents, reducing agents, and
Withstands most forms of enzymatic proteolysis. Open the biotin / avidin interaction
Conditions that are severe enough to rupture also damage or kill the target cells.
The avidin / biotin interaction is so strong that cleavage of other bonds is desired.
Suggested for the release of standard antigen. Some biotinylated reagents are
Has a chemically cleavable covalent bond in the arm, or is cleavable with the target protein.
Form covalent bonds (Sigler, G.F. US Patent Nos: 4,798,795 and 4,709,0
37; Wilchek, M., et al, German Pat. App. DE 3629194 A;Avidin-Biotin Chemi stry: A Handbook
, Above, p.41). The bond is dithiothreitol, mercaptoe
It is cleaved under reducing conditions with tanol or sodium borohydride.
These conditions should be considered for the selection of cells that must maintain function.
Damage to cells is usually too great.
An attempt to replace biotin with a chemical moiety that binds avidin with lower affinity
Has also been done (Basch et al.,J. Immunological Meth. 56: 269-280 (1983))
.
Various techniques for positive cell selection have been developed for the release of antibody / antibody for the release of selected cells.
Rely on mechanical means for cleavage of pitope interactions. Tissue culture flasks are targeted
It may be coated with a primary antibody that binds to the cell. Unbound cells are washed away
After that, the target cells are released by striking the side of the flask (Lebkowski, JS, et a
l. ，Transplantation 53: 1101-1019,1992). Another method for positive cell selection
Bind to the primary antibody that binds to the target cells to form the complex
A "sandwich" method involving avidin conjugated to a biotinylated secondary antibody
To use. After separating the complex from the heterogeneous cell suspension, the target cells are
And avidin by stirring to cleave the interaction between the primary antibody and the primary antibody.
(Berenson, R.J., et al., US Patent Nos: 5,215,927 and 5,225,353).
Mechanical release reveals that cells must withstand damage during the release process.
Unfavorable for the reason that only a small number of viable cells are recovered after mechanical release
It has been reported (Egeland, T., et al.,Scand J Immunol 27: 439-444, 1988)
.
Another method for cell release is with enzymes such as papain and chymopapain.
Including proteolysis. Target cells are mediated by primary antibodies that are subsequently bound to magnetic beads
And can bind to magnetic beads. The heterogeneous cell suspension in which the cell / antibody / bead complex is
After being separated from the liquid, the cells are proteolytically digested with the cell surface antigen or the antibody or both.
Released from the beads by (Hardwick, A., et al.,J Hematotherapy 1: 3
79-386, 1992; Civin, CE, et al., InBone Marrow purging and Processing P rogress in Clinical And Biological Research,
Vol.333, Eds. S. Gross, et
al., Alan R. Liss, Inc, New York, pp 387-402; Civin, CI, EP 0 395 355 Al
Hardwick, A., et al., InAdvances in Bone Marrow Purging and Processing -Progress in Clinical and Biological Research,
Vol. 377, Eds. Wor-thing
ton-White, DA, et al., Wiley-Liss, Inc., New York, pp583-589). Papain or
Proteolysis by chymopapain indicates that these enzymes are usually toxic to cells.
Is advantageous over mechanical cleavage.
High yield of functional target cells and comparison in physiologically compatible solutions
There is a need for positive cell selection methods that rely on relatively inexpensive and gentle reagents.
Summary of the invention
The present invention provides biotin analog moieties for use in positive cell selection and release.
Of the target cell-binding protein, preferably an antibody, covalently linked to the protein
To provide a joined body.
The present invention provides a method for forming a stable conjugate between an antibody and a biotin analog moiety.
Therefore, at pH of about 8 and temperature of about 2 ° C to 8 ° C, the biotin analogue
Bringing N-hydroxysuccinimide (NHS) ester and antibody into reactive contact
A method including is also provided.
The present invention also provides a method for positive selection of target cells from a heterogeneous cell suspension.
You.
One method is to use a primary antibody in a cell suspension linked to a biotin analog moiety.
With a secondary anti-biotic linked to the biotin analog moiety and linked to a cell selection means.
The formation of the complex formed by the target cells bound by the otin antibody.
Including. The complex is separated from the heterogeneous cell suspension and then competitive compound, preferably
Or real biotin (to which the secondary antibody has biotin analogues)
Has a higher affinity than that of). The competitive compound
Displaces the biotin analog moiety from the binding site of the secondary antibody, thereby
Release the target cells from coalescence. The cell selection means is then separated from the target cells.
May be done.
Another method is to link the biotin analogue moiety in a heterogeneous cell suspension.
A form of avidin and the target cells bound to the primary antibody
And (combined with the limbal portion). The complex is
Separated from the heterogeneous cell suspension, the competitive compound, preferably avidin, is then removed.
Co-react with real biotin, which has a higher affinity than it has for biotin analogues.
Incubated. The competitive compound moves from the binding site of the avidin to the biotin.
The target analog cells, thereby releasing the target cells from the complex. Next
The avidin may then be separated from the target cells.
The present invention also provides a mixture of substances that are intermediate complexes in the above method. one
The one intermediate complex comprises a cell separation means bound to an anti-biotin antibody, which antibody
This time, the biotin analog moiety covalently bound to the target cell-binding protein
It is connected to. Another intermediate complex is covalently linked to the target cell binding protein.
And avidin bound to the biotin analogue portion bound to the protein.
Brief description of the drawing
FIG. 1 shows that target cells have bound antibody / biotin analog conjugates, and
The conjugate is now bound by an anti-biotin antibody linked to magnetic beads.
1 depicts a preferred method of the invention that is The release of the target cells is
The biotin analogue from the binding site by elution with real biotin
Achieved.
Figure 2 shows the mass spec of the antibody / biotin analog conjugate (2A) compared to the unconjugated antibody (2B).
Figure 7 shows the Kuttle analysis.
Detailed description of the invention
This invention describes a target covalently linked to a biotin analog moiety.
Stable conjugates of cell-binding proteins and positive target cells from heterogeneous cell suspensions
Methods of using the conjugate for selection and recovery are provided.
As used herein, the term "target cell binding protein" refers to a cell surface marker on the target cell.
It refers to any protein that specifically binds to a car. Where "cell surface marker"
The term is defined as any part that is specifically present on the target cell, and
Markers may include proteins, lipids, and carbohydrates. Target cell binding protein
Examples of qualities are lectins and antibodies, growth factors, hormones, extracellular matrix proteins and
And functional fragments thereof. Lectins are typically unique charcoal on cells
Binds to hydrate moieties but binds to specific protein epitopes or lipids or carbohydrates
It is also possible to obtain an antibody that The target cell binding protein is a protein / biotin
Reacted with biotin analog reagent under conditions that form a stable conjugate of the analog moiety
, The conjugate retains the specific cell surface binding activity of the protein.
A preferred target cell binding protein is a primary antibody. The term "primary antibody" is used here.
The term refers to an antibody that specifically binds to a cell surface antigen on the target cell. here,
The term "secondary antibody" refers to an antibody that binds to the primary antibody and is referred to as "tertiary antibody".
The term refers to an antibody that binds to the secondary antibody.
FIG. 1 depicts a preferred embodiment of one method of the present invention. For explanation, this
The method is a system for positive selection of hematopoietic stem / source cells carrying the CD34 cell surface antigen.
First described in the following (Civin, CI, et al., InBone Marrow Purging and Processing-Progress in Clinical and Biological Research
, Eds. S. Gros
s, et al., A
lan R. Liss, Inc., New York, Vol.333, pp 387-402). The conjugate is a biotin analogue
Formed from primary anti-CD34 antibody covalently linked to the body (1 ° Ab / BA)
. A heterogeneous suspension of blood cells is incubated with the conjugate, thereby
A first complex containing the target CD34 + cells bound to the zygote is formed. second
The complex of is formed by linking an anti-biotin antibody to paramagnetic beads.
The anti-biotin antibody of the second complex is the biotin analogue portion of the first complex.
Binding to the target cells, the 1 ° antibody / BA (biotin analog) conjugate,
A third complex is formed that includes the otin antibody and the paramagnetic beads. The third compound
The body is separated from the heterogeneous cell suspension by a magnet. Then the third complex
Incubated with real biotin, which binds to the anti-biotin antibody
Compete for. The anti-biotin antibody is more authentic than the biotin analogue.
Genuine biotin is the first complex because it has a higher affinity for Otin.
The body is expelled, thereby releasing the target cells from the beads.
The second method of the present invention is the use of avidin in place of the second complex in FIG.
Including. Thus, the first complex is formed as in Figure 1, which is
It binds to avidin by virtue of its affinity for the tin analog moiety,
Thus, a second complex containing the target cell, the 1 ° Ab / BA and avidin is formed.
After separation from the heterogeneous cell suspension, the second complex is incubated with authentic biotin.
Incubated, for which avidin has for biotin analogues
Has a higher affinity than Thus the target cells are released from the avidin
You. Here, the word "avidin" is a book
The substance avidin or streptavidin. Preferably the avidin is a column or
Is insolubilized by holding it on a solid phase such as paramagnetic beads, thus
Allows vidin to be separated from the target cells.
In order to successfully carry out this invention, the biotin analogue was covalently linked.
Requires a stable conjugate of the binding protein. Here the word "stable zygote"
, Under normal laboratory and experimental conditions, the protein and biotin analogue moieties
A compound that does not undergo substantial hydrolysis of the connecting covalent bond. Usually here
The laboratory and experimental conditions of the temperature range between about 2 ° to 37 ° C and a pH range of about 7 to 8.5.
And exposure to normal laboratory light for about 4 to 16 hours. Further, the present invention
Said stable conjugate of at least 16 hours, preferably 2 hours during storage at 4 ° C.
Maintain function for weeks or longer. The stable conjugate is -20 ° C or lower
Maintains function for at least 2 weeks and preferably longer when stored frozen at temperature
Carry.
In the present invention, the conjugate preferably has a pH of about 8 and a temperature of about 2-8 ° C.
Also preferably N-hydroxysuccinyl of the biotin analogue in medium at 4 ° C.
Formed by incubating binding protein with amide (NHS) ester
Is done. After a reaction time of about 4 to about 16 hours, the conjugate is associated with a substantial loss of function.
It can be stored for more than 16 hours at 4 ° C without any effort. The zygote is
And for conditions that contribute to cell viability for clinical and clinical use, i.e.
Sufficiently safe to be used for positive cell selection under normal light, pH, and temperature.
It is fixed. Allows the practice of the method of the invention to be carried out at room temperature under normal light
Therefore, the stable
The conjugate is particularly suitable for clinical application.
According to published methods for covalent attachment of real biotin to an antibody
For example, the molar ratio of biotin to protein should be between 2 and 3 to maintain antibody binding function.
Rubiotin: should be restricted to molar antibodies (Avidin-Biotin Chemistry: AH andbook
, Above, pp.86-87). Surprisingly, using the method of the present invention, biotin
The antibody analogs can be incorporated with the antibody in a molar ratio of up to 30: 1 without loss of binding function of the antibody.
It has been discovered that it can be cuvated. This high molar ratio is
The increase in valency overcoming the problems associated with low affinity binding. Because of this
The sum of many low affinity interactions allows efficient separation of the target cells. I
However, these low affinity interactions reduce the viability of the recovered cells.
It can also be cleaved without the use of harsh conditions. Give an example here
The molar ratio used in the formation of the conjugate is determined by the application and use of the conjugate.
It will be apparent to those skilled in the art that it can be modified according to the particular biotin analogue used.
U. For example, biotin analogs that exhibit relatively high binding affinity for 2 ° antibodies are:
To achieve the same efficiency compared to the lower affinity biotin analogues, less
It would require an unbounded number of conjugated molecules. For example, the final yield of target cells
Optimized and increased the molar ratio of biotin analogue: antibody at the same time
More cost-effective ones by reducing the number of beads
Maybe.
As used herein, the term "biotin analog" refers to an antibiotin antibody or to avidin.
Physicochemical and structural homology sufficient to be bound by
A compound that is shared with Biotin
Examples of rims are desthiobiotin and 2'-iminobiotin (Biochem J 101: 774, 196
6), biotin sulfone (Methods in Enzymology, Vol XVIII, Vitamins and Co enzymes, Part A,
1970, p. 423), bisnorbiotin, tetranorbiotin, and
And oxybiotin. The binding parent of some biotin analogues to avidin
Although its compatibility is known, the binding affinity of anti-biotin antibody for biotin analogue is
It is expected to vary for each individual antibody. In general, avidin bio
The binding affinity for tin analogs is better than that of avidin for real biotin.
Is also low. For example, the binding affinity of avidin for desthiobiotin is 5 x 1013 M- 1
Which is the affinity of avidin for authentic biotin (Ka = 10Fifteen M-1)Than
Is low enough. Similarly, the affinity of avidin for 2'-iminobiotin is 3.5 x
Ten11 M-1Which is also considerably lower than the affinity of avidin for real biotin.
Yes. This is due to the fact that real biotin can be conjugated to the present invention from their binding position on avidin.
Having a great competitive advantage in expelling biotin analog moieties on the body
Means
Binding of biotin analogs by antibodies produced against real biotin is
Similar but not identical to binding by vidin. Anti-biotin antibody
It may be either null or monoclonal. Polyclonal antibodies are usually
, Injected biotin conjugated to an antigenic adjuvant such as albumin to the animal
Upon entry, it is produced in animals such as goats, sheep, or rabbits.
(Because real biotin alone has a small molecular weight, it is not very antigenic.
None, it is naturally present in the blood as a vitamin. ) Obtained polyclonal
Serum biotin conjugated with adjuvant
It is a unique combination of various epitopes and antibodies. Surprisingly
Produced against biotin, purified from different sources with different affinities
Polyclonal serum is biotinylated with an affinity suitable for use in the present invention.
It was found to bind to analogs. That is, the affinity for the biotin analogue
Is strong enough to bind the target cells to the beads, yet
So it was weak enough to successfully compete and be dropped. Monocrona
Antibodies usually inject the antigen into mice or rats and then form hybridomas
Produced by fusing individual splenocytes with immortal myeloma cells for
. Each hybridoma is a monoclonal antibody specific for an individual epitope of the antigen.
Synthesize the body. Again, mouse anti-biotin monoclonal antibody is used in the present invention.
A suitable affinity for making it useful for biotin analogues and real biotin
It was surprising to discover that they had it. Given the disclosure,
Those skilled in the art of producing and testing antibodies may obtain other antibodies that function in the present invention.
, It would be possible to identify.
The method of the invention involves the binding of a competitive drug on avidin or on the anti-biotin antibody.
Requires the biotin analog moiety to be driven out of position. The competitive drug is
It has a competitive binding advantage for the binding position occupied by the biotin analogue.
Must. The preferred competitive agent is real biotin. Because
Its binding to both avidin and anti-biotin antibody is the strongest of the drugs tested
Because. In addition, real biotin is an injectable grade suitable for human therapeutic use.
Simple and well-known vitamins that should be available on the market
It is. It is also envisioned that other competing agents may be useful in the practice of the present invention.
ing. For example, comparing the biotin analog moiety on the conjugate to desthiobiotin
If it has a low affinity for avidin or anti-biotin antibody then
Thiobiotin may be used as a competitive drug. Desthiobiotin is also
Because it can be biotransformed to biotin by otin synthetase
, Considered to be a relatively mild reagent (Gene 80: 39-48, 1989;BBRC 88: 132, 1979)
. The most preferred combination is then competitively driven out by real biotin.
Desthiobiotin as part of the conjugate that is
The covalent bond between the protein and the biotin analogue reagent is due to the amine group of the protein.
, Sulfhydryl groups, or carbohydrate groups. The present invention
Biotin analog reaction in the formation of a conjugate of the known reaction with real biotin
May be performed according to (Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook Above, pp.25-
87). Biotin analogue reagents are N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, p-ni
Trophenyl (BNP) ester, hydrazine, pyridyldithio-, iodoacetyl
-, And maleimidopropionyl-biotin analogues
Can be. Similarly, photoactivatable biotin analogues may also be used. these
Biotin analog reagents may be purchased or synthesized according to established methods.
Good.
Once the protein / biotin analog conjugate is formed, it is analyzed by ELISA, waste
By well-established methods such as tan blots, dot blots, and target cell capture.
Thus, retention of antigen binding capacity can be tested. The conjugate is also anti-biotin
By antibody or by avidin
Can be tested by the same method for binding.
This invention provides an antibody / biotin analog conjugate that retains the binding function of those primary antibodies.
A method for forming a coalescence is provided. However, under certain circumstances, the primary target
A type of "sand" that allows cell-binding antibodies to remain unconjugated
It may be desirable to implement variations of this invention using the "itch" method. This type
In a variant of, a secondary antibody specific for the primary antibody is conjugated to the biotin analogue. An example
For example, if the primary antibody is mouse monoclonal anti-CD34, then the secondary antibody is
Goat anti-mouse-Fc. Therefore, the first complex is the target cell, the first
Formed by the secondary antibody and the secondary antibody / biotin analog conjugate. Then
The biotin analogue is bound to a second complex as in Figure 1 or to avidin.
And then eluted with native biotin as in FIG. The advantage of this variant is
, The primary antibody, which is selected by the user of the kit according to its intended application.
General purpose key, including all elements of the method of the present invention except
Is to enable the manufacture of
The use of this invention has been shown to be functional in physiologically compatible solutions suitable for clinical application.
Provide a sufficiently pure population of target cells.
The latter experimental examples are provided as illustrations of the description and are intended to limit the scope of the invention.
Not what I did.
Example 1Covalent linking of biotin analogues to anti-CD34 antibody
Becton-Dicki is a monoclonal anti-CD34 antibody (mouse) named "9079"
Produced by standard methods from hybridomas derived from nson (8G12 cell line)
Was done.
N-hydroxy-succinimide-DL-desthiobiotin (NHS-DL-desthiobiotin)
(Sigma, Cat. No. H-2134) is PBS without calcium or magnesium (pH 8.0)
In it was dissolved at a concentration of 1.5 mg / ml. If desired, the NHS-DL-desthiobiotin
Was first dissolved in a small amount of DMSO or DMF before being added to the aqueous solution. The solution
Was cooled to about 4 ° C in an ice water bath. The monoclonal antibody at about 4 ° C
It was dissolved in the same buffer (ph 8.0) at a concentration of 1.0 mg / ml. Desthiobiotin is the anti-
Add to the body solution at a molar ratio of 3.25, 7.5, 15, and 30: 1 (desthiobiotin: antibody).
Was done. The solution was kept at 4 ° C for 4-16 hours, then free NHS and unbound dessert.
Gel filtration columns (PD-10, P-10) to remove low molecular weight compounds such as thiobiotin.
harmacia, No.17-0851-01). The separated sample is kept at 4 ° C.
And binding activity by Western blot and dot blot
Was tested.
A second type of biotin analogue, 2-iminobiotin, was also prepared using the same method as above.
It was bound to the monoclonal antibody 9079.
Example 2Conjugated biotin analogue per antibody using MALDI-TOF mass spectrometry The number of
This example determines the amount of biotin analog moiety linked to a target cell binding protein.
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) -Time of Fl
Demonstrates the use of ight (TOF) Mass Spectrometer (MS).
The antibody used for this analysis was specific for the CD34 cell surface antigen, previously
It was 9079 mentioned. The biotin analogue desthio
Biotin conjugation was performed as described in Example 1. Specifically, death
Thiobiotin was added to the antibody in a molar ratio of 30: 1 desthiobiotin: antibody. Contact
After combination, the antibody / biotin analog sample and unlabeled antibody sample were
Prepared for analysis. Specifically, it is conjugated to the 9079 antibody and desthiobiotin.
1 mg of each antibody was adjusted to 2.5 ml by the addition of ammonium phosphate buffer.
Was. A buffer exchange was then applied to the PD10 column (Pharmacia) and ammonium phosphate buffer.
Was performed using elution. The eluate (3.5 mls) from each sample is Centricon
Concentrated by two separate centrifugations using a column (Centricon 30; Amicon)
Was. The buffer exchange procedure was again repeated with ammonium phosphate buffer.
The sample was Midwest Center for Mass Spectrometry (University of Nebraska-Linc
oln) for analysis.
The molecular weights of both the unlabeled and desthiobiotin-labeled antibodies are MALDI-TOF masses.
Measured by spectroscopy. The analysis result is shown in FIG.
This is the average of more than 25 independent decisions. As you can see in the figure
, The molecular weight for the control antibody is M+And M++151, 181, and 15 for ions, respectively
It was 1,170. The desthiobiotin-labeled antibody is M+And M++About AEON
The molecular weights of 154,055 and 154,030 are shown, respectively.
Using the above molecular weight and by removing one water molecule (MW = 18) during the ligation procedure
Given that the molecular weight of desthiobiotin is 214.3,
On average, 14.6 molecules of desthiobiotin linked with antibody molecules were included.
Calculated (SD ± 1.6). Accuracy was determined to be ± 0.1%, probably 0.016%. Reverse
To HABA
The results obtained by essay only show the molecules of desthiobiotin per antibody molecule.
It was revealed that the average number was 11.3.
These results show that molar ratios greater than 10: 1 conjugated target cell binding proteins.
We show that this can be achieved by using different biotin analogue moieties. Further
The results show that the MALDI-TOF mass spectrum analysis showed a large value like the antibody (MW = 150,000).
It can be used efficiently and accurately for the determination of the number of protein-conjugated moieties.
Also indicates that you can.
Example 3Linking anti-biotin antibody to paramagnetic beads
Polyclonal goat anti-biotin antibody is available from Vector Labs, San Mateo, CA, Cat. No. S
P3300; CalBiochem, San Diego, CA, Cat. No.203199 ； Pierce Chemical Co., Ro
ckford, MD, Cat. Obtained from 3 suppliers, No. 31852. Ascites Monochrome
Lumouse anti-biotin antibody is American Qualex, La Mirada, CA, Cat. From No.M2270
Obtained by ProSep A column (Bioprocessing, Durham, UK, Cat. No. 8422)
Purified.
Tosyl-based activated paramagnetic polystyrene Dynal beads from Baxter Fenwal Division, Ro
Obtained from und Lake, IL. The tosyl group-activated paramagnetic beads in suspension were 50 mM.
It was washed quickly with borate buffer pH 9.5 (coupling buffer). Anti-bio
Chin antibody is 1 mg / ml (polyclonal) or 0.5 mg / ml (molybdenum) in coupling buffer.
Noclonal). Anti-biotin antibody in coupling buffer
Is 50μg / mg beads (polyclonal) or 25μ on the tosyl group-activated paramagnetic beads.
Ink added to g / mg beads (monoclonal)
Incubation took place overnight at room temperature. Paramagnetic beads linked with anti-biotin antibody
The beads were washed and stored at 4 ° C.
Example 4KG1a capture and release using antibody / desthiobiotin conjugate
KG1a is a human cell line (ATCC No. CCL 2146.1) that expresses the CD34 antigen on its cell membrane.
, As a model system for initial testing or condition optimization for positive selection of CD34 + cells
Used.
Anti-CD34 specific antibody-desthiobiotin conjugate at the concentration shown in Tables 1-4 for 30 minutes
And incubated with KG1a cells at room temperature (about 22 ° C).
Another KG1a cell showed that the anti-CD34 antibody HPCA-1 (Becton-Dickin
son) and then sheep anti-depletion as a positive control for depletion.
Bound to mouse (SAM) Dynal beads.
As a negative control, KG1a cells were incubated with a nonspecific IgG1 isotype.
And then mixed with SAM beads.
Other KG1a cells were compared with native biotin for cell release by elution / competition.
Incubation with antibody-biotin conjugate for use in control experiments
Was turned on. The antibody-biotin conjugate was prepared using standard chemical methods (Biotinylation Reagen
ts. IN:Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, Eds. Savage, MD, et al, Pier
ce Chemical Company, 1992, pp.25-86).
The experiment was performed in low biotin DMEM with 2% FBS. Usually one hundred per test tube
Ten thousand cells were used. Cells are washed to remove excess (unbound) antibody conjugate
It was purified. Then cells-antibodies-desthio
Biotin complex at the indicated concentration with paramagnetic beads coated with anti-biotin antibody
Mixed and incubated for 30 minutes at room temperature under continuous agitation. Bi
The cell complex was separated from unbound cells using a magnet. Lysis with unbound cells
The fluid was set aside for cell counting (depletion step). 3 for bead cell complex
Washed twice.
The cell antibody biotin complex was treated as above.
Biotin stock solution is DL-Biotin (Pierce Chemical in low biotin DMEM, 2% FBS)
Co., Rockford, IL, Cat. No. 29129). Then the
The captured cells are continuously mixed with the bead cell complex for 1 to 5 mM biotin for 30 minutes at room temperature.
It was released from the beads by incubating under agitation. Biotin is
Competes with the desthiobiotin moiety for a binding position on the anti-biotin antibody, thus
Remove the cell / antibody desthiobiotin complex from the beads / anti-biotin antibody complex.
did.
It was done by either of them.
The paramagnetic beads were then separated from the released cells using a magnet. Freed
A solution containing live cells was set aside for cell counting (free stage). Cell count
The test was performed using a microscope and a hemocytometer. Cell viability stained with trypan blue
It was measured by diluting the suspension with liquid.
Then the calculation was done. That is,
% Depletion = [1- (cell number in unbound fraction / IgG1*Cells in the unbound fraction of
Number)] x 100
(IgG1*Is an eye for measuring non-specific binding of cells to beads.
It is a sotype control. )
% Release = (cell number of released fraction / initial number of cells used, usually 106
) × 100
The% yield and yield were calculated as for% release.
Results: As shown in Table 1, equivalent depletion (ie cell capture on beads) was 0.2 μg.
/Ten6Desthiobiotin-conjugated anti-CD34 antibody (9079-desthio) at cell / tube antibody concentration
It was also obtained with either biotin) or control (HPCA-1). With natural biotin
Incubation of cells complexed with 9079-desthiobiotin by incubation with
The separation was about 78% (yield). Non-specific release is demonstrated by vortexing the HPCA-1 complex.
As shown, this experiment showed about 18%. These results show that biotin competition
It shows that the specific release of the cells used was about 60% or better.
Table 3 shows the results of a control experiment using anti-CD34 antibody 9079 (9079B) conjugated to biotin.
Is shown. As expected, the% depletion (ie capture of cells on the beads) is high
, But the% release of cells from the beads is very low, only about the same as the control (HPCA-1)
It only contains 1% more. In this experiment, biotin-conjugated antibody was bound to beads.
Shows that isolated cells would be well suited for negative selection when they should be discarded.
You. However, it was not intended that the selected cells would be released from the beads and recovered.
If positive, the biotin-based release mechanism
Does not succeed against synthetic antibodies.
One million KG1a was used per test tube. Antibody incubated with KG1a cells
Beads were then added to the cells. Biotinylation of 9079 is via a carbohydrate residue
Happens.
Example 5"Sandwich" method, ie KG1a capture using secondary antibody / 2-iminobiotin conjugate And liberation
Covalently linked to goat anti-mouse (GAM) polyclonal IgG (secondary antibody)
A 2'-iminobiotin conjugate was prepared according to the method of Example 1. Primary antibody (
Mouse monoclonal anti-CD34 9079) was bound to KG1a cells and then conjugated.
It was bound by the secondary antibody GAM / 2'-iminobiotin conjugate to form. Next
The magnetic beads linked to the secondary antibody (goat anti-biotin) are 2'-iminobiotin.
Was bound to the complex via the affinity of a tertiary antibody for. Then the cells are described
The beads by incubating with DL-biotin as
Was released.
Results: As shown in Table 4,% capture using the antibody / 2-iminobiotin conjugate.
Catch (% depletion) was as high as 96%, which was achieved by the positive control (HPCA-1).
It was equivalent. The% yield (% free) using the antibody / 2-iminobiotin conjugate is 35.
It was as high as%. The percent yield can be 80% or higher under optimal conditions.
It was expected to be possible.
One million cells were incubated with 5 μg 9079 and unbound antibody was washed out.
Was. The cells were then conjugated with goat anti-mouse (GAM) 2-imino in the amounts shown in the table.
Incubated with biotin. 5 million beads were used.
Example 6KG1a spikes in cell populations; specific depletion and release
KG1a cells were labeled with a fluorescent dye as follows. That is, 100 mg Bisensimide H33342
Fluorochrome (Calbiochem Cat. No. 382065) was dissolved in 50 ml of 1 billionth of pure water.
(2 mg / ml). Add 100 μl of fluorochrome dye solution to each flask of KG1a cells.
The cells were then incubated in the dye for 30 minutes at 37 ° C. Then the mark
The recognized cells were mixed with Daudi cells at a ratio of 1:50. Daudi cells are CD on the cell surface
34-Cells that do not express antigen. Capture and release were performed as before. The KG1
a cells were counted under a fluorescence microscope in the unbound and free fractions. The play
The Daudi cells in the fraction were also counted to determine the purity of the free fraction.
Percent purity was calculated as follows. That is,
% Purity = (number of KG1a cells in the free fraction × 100) / total fines in the free fraction
Number of cells (Daudi + KG1a)
Results: As shown in Table 5, anti-CD34 antibody / desthiobiotin conjugate (9079-
Desthiobiotin) achieved high depletion rates and specific yields
. Optimal results 0.2 μg antibody conjugate / 106Obtained using cells. Furthermore, the free
The purity of the cell population was in the range of 88% KG1a cells.
KG1a cells were spiked in Daudi cells (2%). One million KG1a cells were used
Was. The ratio of KG1a cells to beads is 1:10. Vortex instead of Nutator
Used in this experiment.
Example 7Capture and release of CD34 + cells from human mobilized peripheral blood and bone marrow
Peripheral blood or bone marrow samples were treated with 1% human serum albumin (Baxter
Hyland Division) in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM-HSA)
By resuspending the sample and then centrifuging at 1000 RPM for 10 minutes at room temperature.
And washed 3 times. Washed to remove cells that bind nonspecifically to the beads
Blood samples collected by uncoated paramagnetic beads for 30 minutes at 37 ° C every 10 minutes.
Incubated with hand rotation. The uncoated beads are magnets
Was used to separate from the blood sample. The beads are washed once with DMEM / HSA and the beads
Were separated and the wash solution was repooled with the separated sample (preliminary
Depletion step). If desired, the preliminary depletion step may be performed after the sensitization step
With the selected human Ig fraction (Gemmagard, Baxter Hyland Division, Duarte, CA).
It was replaced by incubating the vesicles. The sample was then anti-CD34 antibody death
Incubated with thiobiotin for 30 minutes at 4 ° C without rotation (this is
Known as the sensitization step). Cells to remove unbound antibody conjugate
Washed. The sensitized cells were then paramagnetic beads coated with anti-biotin antibody.
Incubated for 30 minutes at 4 ° C without rotation. Beads use magnet
And separated from the sample, leaving behind the negative fraction. Beads / cell complex is DM
Washed 3 times with EM / HSA, the 3 washes were pooled with the negative fraction
.
Then the beads / cell complex was allowed to rotate with biotin (5 mM) for 15 minutes at room temperature.
Were incubated from above.
As a positive control, cells were treated with monoclonal antibody 9069 (anti-CD34, biotin or biotin).
(Without tin analog), then sheep anti-mouse coated Dynal
It was bound to paramagnetic beads. After magnetic separation from the peripheral blood cell suspension, the control beads
Cells / cell complex enzymatically digests antibodies that bind cells to beads at 37 ° C for 15 minutes.
Incubated with chymopapain, the cells were thus released.
The beads were separated using a magnet and the solution was saved (positive fraction).
The beads were washed once with DMEM / HSA and the wash solution was loaded with the positive fraction.
Was released.
Cells were labeled for FACScan analysis as follows. HPCA-2-FITC (Becton Dick
inson Cat. No.348053) for the identification of CD34 + cells, the 9069 chymopapain control cells
Was added to A mixture of mouse IgG1-FITC and IgG2-PE (Becton Dickinson, Cat. N.
o.340041) was added to the cell sample as an isotype control and the non-specific
It was used to assess the amount of heterologous antibody. LeukoGATE (Becton Dickinson, Cat
. No.340040) was added to the cell sample as a means to identify the total white blood cell population.
(LeukoGATE is a mixture of anti-CD45-FITC that labels leukocytes and anti-CD14-PE that labels monocytes.
It is a compound. ) Goat anti-mouse IgG-FITC (Becton Dickinson Cat. No. 349031)
Percentage of white blood cells carrying mouse monoclonal antibodies 9079 and 9069 bound to D34
Was used as a label to determine
For each label, 20 μl (1 μl of test or isotype control antibody preparation)
μg) was added to polypropylene test tubes. Nucleated cells (106) Is initial
Added for sample or negative fraction, and at least 2.5 x 10FourCell positive fraction
Added for. Four
After incubation for 30 minutes at ° C, the cells contained 2 ml of 2% FBS / 0.02% NaN.Three/ P
It was washed twice with BS (wash buffer) and then resuspended in 300 μl fixative.
Different fractions for FACScan analysis to determine% CD34 + cells within each fraction
(Wash sample, pre-depleted fraction, negative fraction, and positive fraction).
The flow cytometer was calibrated according to manufacturer's recommendations. HPCA dyeing of starting material
At least 20,000 events collected for color, pre-depleted sample, and negative fraction
At least 10,000 events were collected for each sample, except
Was.
The leukocyte gate contained the starting material (mPBSC) stained by LeucoGATE
Calling FL1 (FITC) vs. FL2 data from a file, and all positive in FL1
It was determined by drawing a box (region R1) around the event. Same file
Using forward scatter (FSC) vs side scatter (SSC) data for all those present in R1.
Was called for the event. A box was drawn around all white blood cells.
The percentage of CD34 + cells contained the starting material stained by the concurrent test control.
Call those FL1 vs. SSC events that enter the R2 (white blood cell analysis gate) from the
Same dots of cells stained by sex staining (ie HPCA-2-FITC or GAM-FITC).
It was determined by comparison with Toplot. Positive and low SSC (% C
A box (region R3) containing all events that are D34 +) was drawn.
Percent purity was determined by FACScan analysis (% CD34 + cells in positive fraction)
). Other values were calculated as follows.
% Capture = [1-(% CD34 + cells in negative fraction from FACScan x negative cells
Number /% CD34 + cells in pre-depletion sample x number of cells from pre-depletion used)] x 100
The final percent yield from pre-depleted cells is
(% CD34 + x number of positive cells in positive fraction) / (in pre-depleted sample
% CD34 + x number of cells used from pre-depletion)
The final percentage from all MNCs is
(% CD34 + in positive fraction × Coulter counting in positive fraction
Number of cells) / [(% CD34 + in pre-depleted sample x number of cells used from pre-depletion) / (
Yield% from pre-depletion)] (Red blood cells are lysed by the counting solution.
Therefore, Coulter counting only counts mononuclear cells. )
Results: The yield is 30-40% and the purity of CD34 + cells in the positive fraction is 40-80%.
Range. Once the conditions are optimized, yields greater than 80% and greater than 80%
It is expected that a threshold purity will be obtained.
Example 8Positive cell selection via the antibody desthiobiotin conjugated to avidin
Anti-CD34 according to the methods of Examples 1, 2 and / or 7 to form a conjugate.
The antibody was covalently bound to desthiobiotin or 2'-iminobiotin. K
G1a cells were incubated with the antibody / biotin analog conjugate.
The sensitized cells were then incubated with avidin in the following manner. That is
, Albumin (HSA) / avidin beads, avidin / glass beads, and strep
Toavidin (Dynal) beads.
The biotin analog moiety on the anti-CD34 + antibody conjugates the cells to the avidin solid phase.
Bound to avidin with sufficient affinity to allow Combined Percentage (% Depletion)
Was as high as about 90%.
The KG1a cells were then due to the higher binding affinity of biotin for avidin.
, A real bacterium that is more competitive than desthiobiotin for its binding position on avidin.
Separated from the avidin by incubation with Otin.
This method is for positive selection and recovery of CD34 + stem cells from human bone marrow or blood.
It is expected to be applied successfully. Once the conditions are optimized, it will be 80% pure.
The% yield is expected to be 50% or higher as the degree approaches.
Example 9Biotin analogue biotin sulfone, bisnorbiotin, tetranorbiotin, and Preparation of antibody conjugated with oxybiotin
In addition to desthiobiotin and 2-iminobiotin,
There are many other biotin analogs that could be linked to the antibody for. helpful
Examples of biotin analogues are biotin sulfone, bisnorbiotin, tetranorbioti
And oxybiotin. In addition to their antigenic similarity to biotin,
These analogs are expected to participate in the reaction in a similar manner as biotin does
. Therefore, the NHS ester of these other biotin analogues is
Is expected to react with the amino groups of antibodies as NHS-2-iminobiotin does.
(See Example 1 above)
In addition, other types of biotin analogue reagents are available in the formation of conjugates with antibodies.
It is expected that it will become clear that it is for business. Biotin
The analog p-nitrophenyl ester (BaNP) can be used to label antibodies
It is one of the other amine reactive reagents that could be made.
Carbohydration of antibodies to form useful conjugates of certain biotin analog hydrazides
Expected to react with physical and carboxylic groups.
Biotin analogues Hexyl-pyridyldithio-propionamide (HPDP), iodo
Acetyl-LC-biotin analogue, and 3- (N-Maleimidopropionyl) bio
Three Reagents Expected to React with Sulfhydryl Groups on Antibodies
It is.
Biotin analogues with photoactivatable reactive groups are also biotin analogues to proteins
It will be shown to serve for covalent attachment of the body.
A reaction protocol adapted from conventional biotin chemistry has been developed for antibodies and various other species.
Will be used for conjugation with the biotin analogue (see Biotinylation Reag
ents ”, see above). Each new conjugate is its use in the present invention.
Will be tested for suitability. Each conjugate is ELISA, Western blot
Retention of antigen-binding activity by conventional methods such as
Will be tested. Each conjugate is then anti-vitro using conventional methods.
It will be tested for binding by ottin antibody, or avidin. Then anti-vi
The relative affinity of the otin antibody or avidin for the new conjugate releases the cells
Will eventually be used to compete for binding of the conjugate to
Will be tested against biotin or other biotin analogues. Some useful
The biotin analog / antibody conjugate is treated with an anti-biotin reagent (anti-
Have sufficient similarity to biotin for recognition by the body or avidin)
However, the anti-biotin agent is a lower parent for the conjugate than for native biotin.
Compatible, which allows competitive elution and thereby release of desired cells
It can be made based on the principle.
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
// Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｕ
0276−2Ｊ 33/543 ５０１Ｄ
33/543 ５０１ 0276−2Ｊ ５０１Ｂ
9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｂ
(72)発明者 ジレルモ，ロイ
アメリカ合衆国90745カリフォルニア、カ
ーソン、ウオーターストリート 21810
(72)発明者 スカウテン，ウイリアム，エイチ
アメリカ合衆国84321ユタ、ローガン、325
エヌ150ダブリュー
(72)発明者 スミス，アラン，ケイ
アメリカ合衆国92691カリフォルニア、ミ
ッションビエホ、ブダペスト 25571─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI // G01N 33/53 0276-2J G01N 33/53 U 0276-2J 33/543 501D 33/543 501 0276-2J 501B 9162-4B C12N 15/00 B (72) Inventor Gilermo, Roy United States 90745 California, Carson, Waterstreet 21810 (72) Inventor Scouten, William, H. United States 84321 Utah, Logan, 325 EN 150 W (72) Inventor Smith, Alan, Kay United States 92691 California, Mission Viejo, Budapest 25571