JPH09502167A - Novel stem cell marker - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規な幹細胞マーカーによる、専任された細胞からの幹細胞の分離により、ヒト造血幹細胞を得る方法が提供される。得られる細胞が提供される。単離された細胞は、増殖潜在能の増加を示している。 (57) [Summary] A method for obtaining human hematopoietic stem cells by separating stem cells from dedicated cells by a novel stem cell marker is provided. The resulting cells are provided. Isolated cells show increased proliferative potential.

Description

【発明の詳細な説明】 新規な幹細胞マーカー序 技術分野 本発明の分野は、造血細胞集団の単離である。背景 哺乳類造血細胞は、多様な範囲の生理活性を提供する。これらの細胞はリンパ 系統、骨髄球様系統、および赤血球系統に分かれている。リンパ系統（Ｂ細胞お よびＴ細胞を含む）は、抗体の産生、細胞性免疫系の調節、血液中の外来因子の 検出、宿主に対する外来の細胞の検出などを提供する。骨髄系統（単球、顆粒球 、巨核球、および他の細胞を含む）は、異物の存在についてモニターし、新生物 細胞に対する防御を提供し、外来物質を捕捉し、血小板を生成するなどを行う。 赤血球系統は、赤血球を提供し、これは酸素の担体として作用する。 本明細書中で引用した全ての公開物は、それにより本明細書中にその全体が参 考として援用されている。 造血細胞の性質、形態、特性、および機能の多様性に関わらず、現在、これら の細胞は、単一の前駆細胞集団（「幹細胞」と称される）に由来すると考えられ ている。幹細胞は、自己再生し得、特異的系統への分化および拡張に専任(dedic ate)される系統が方向付けられた前駆細胞（lineage committed progenitors） になり得る。 幹細胞の高度に精製された集団が、種々のインビトロ実験およびインビボ指標 に必要である。例えば、幹細胞の精製集団は、その自己再生に関連した成長因子 の同定を可能にする。さらに、これらは、未だ発見されていないが、以下に関連 する成長因子であり得る：（１）幹細胞の特定の系統への専任の初期段階；（２ ）このような専任の防止；および（３）幹細胞増殖のネガティブ制御。 幹細胞は、以下における使用が分かっている：（１）幹細胞が欠乏している宿 主の造血系の再生；（２）疾患にかかっており、そして骨髄の除去、幹細胞の単 離、および薬物での個体の処置、または幹細胞の移植前の放射線照射により処置 され得る宿主；（３）種々の造血細胞の生産；（４）幹細胞自己再生に関連した 成長因子の検出および評価；および（５）造血細胞系統の発達および造血発達に 関連した因子についてのアッセイ。幹細胞はまた、血液細胞に有用な特性を賦与 する遺伝子療法の標的でもある。 高度に精製された幹細胞は、造血移植に必須であり、これは、癌患者の造血移 植および造血移植に関連した他の臓器移植を包含するが、これらに限定されない 。幹細胞は、遺伝子療法の重要な標的であり、ここで挿入された遺伝子は、幹細 胞が移植された個体の健康を促進する。さらに、幹細胞の単離が可能になること により、リンパ腫および白血病、ならびに他の新生物症状の処置に役立ち得る。 このため、世界的に、実質的に純粋または純粋な形態のヒト造血幹細胞の単離に 対する試みがなされてきた。 幹細胞は、造血細胞の総数の小パーセントを構成するのみである。造血細胞は 、種々の細胞表面タンパク質「マーカー」の存在により同一とみなされる。この ようなマーカーは、特定の系統または前駆細胞に対して特異的であり得るか、ま たは１つより多くの細胞型に存在し得る。近年では、分化細胞に関連したどれだ けのマーカーがまた幹細胞に存在するのかは知られていない。幹細胞に単独で存 在するとして既に示された１つのマーカーであるCD34はまた、かなりの数の系統 が方向付けられた前駆細胞上で見出されている。米国特許第4,714,680号には、 ヒト幹細胞を含有する組成物が記載されている。 これらのマーカーは、多数の系統が方向付けられた造血細胞上で見出されてい る。特に、CD34⁺集団の80〜90％は、他の系統特異的マーカーおよび非特異的マ ーカーによりマークされている。従って、骨髄または末梢血液中の全細胞数の小 さい割合が造血細胞であること、幹細胞に関連したマーカーがより分化した細胞 とは異なることが不確実であること、そしてヒト幹細胞について生物学的にアッ セイすることが通常できないことを考慮すると、幹細胞の同定および精製は困難 であった。ヒト造血幹細胞の特徴付けおよび単離は、以下において報告されてい る：Baumら (1992) Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:2804-2808；およびTsukam otoら 米国特許第5,061,620号。 造血細胞のローダミン123（rho123）染色の減少は、最初の色素の蓄積ではな く、P-糖タンパク質（P-gp）阻害剤に感受性の流出プロセスによって決定される 。ヒト骨髄細胞におけるいくつかのP-gp輸送蛍光色素（rho123を含む）の保持は 、P-gpの発現に逆相関した。多能性幹細胞の物理的特性および抗原特性を発現す る骨髄細胞は、高レベルのP-gp発現および蛍光色素流出を示した。rho123流入の 増加またはP-gp発現のいずれか基づいて単離されたヒト骨髄細胞の画分は、実際 に、ヒト骨髄の始原前駆細胞（LTC-開始細胞を含む）を全て含んだ。Chaudhary およびRoninson（1991）Cell 66:85-94。 幹細胞のrho123標識は標識条件に非常に依存することが示されている。例えば 、より長期間および／またはより高い温度で染色した細胞は、より多くのrho123 を取り込む。従って、rho123染色に対する細胞の特徴付けは、染色条件を考慮す べきである。 近年、マウス幹細胞が、少なくとも非常に濃縮された形態（精製形態ではない が）で得られた。ここで、骨髄から得られた約30個未満の細胞が、致死的に放射 線照射されたマウスの造血系の系統の全てを再構成することができた。各アッセ イ細胞は全ての造血系統に対して多能性であるが、これらの細胞間で自己更新は 変動性である。Spangrudeら（1988）Science 241:58-62；Smithら（1991）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 88:2788-2792；Uchida（1992）Ph.D．Thesis Stanford U．；およびまた欧州特許出願第89 304651.6号およびそこに引用されているマ ウス幹細胞の単離が記載されている参考文献を参照のこと。発明の要旨 ヒト造血幹細胞の実質的に均質な組成物の単離を得る方法が提供される。この 細胞は、ヒト造血細胞抗原（hu-HCA）と称されるマーカーを発現するために、hu -HCA⁺と称される。この方法は、F84.1と呼ばれるモノクローナル抗体により認識 されるエピトープを有する分子を認識する抗体を用いる分離レジメを使用する。 このような抗体は、αhu-HCAと称される。この方法に由来する細胞もまた提供さ れ、hu-HCA⁺と称される。図面の簡単な説明 図１は、種々の供給源の幹細胞の蛍光標示式細胞分取器（FACS）分析を図示す る。Ａは、IgG１イソ型コントロール抗体および抗CD34抗体（αCD34）で染色し たFBMのFACS分析を図示する。Ｂは、F84.1およびαCD34で染色したFBMのFACS分 析を図示する。Ｃは、IgG１イソ型コントロール抗体およびαCD34で染色した成 体骨髄（ABM）のFACS分析を図示する。Ｄは、F84.1およびαCD34で染色したABM のFACS分析を図示する。Ｅは、IgG１イソ型コントロールおよびαCD34で染色し た動員末梢血液（MPB）のFACS分析を図示する。Ｆは、F84.1およびαCD34で染色 したMPBのFACS分析を図示する。 図２は、いくつかの異なる抗体に対してrho123で染色したFBM細胞のFACS分析 を図示する。Ａは、αCD34およびrho123での染色のFACS分析を図示し、ゲートは CD34⁺について設定される；図２Ｂ〜Ｄは、CD34⁺集団についてゲートされている 。Ｂは、IgG１イソ型コントロールおよびrho123での染色のFACS分析を図示する 。Ｃは、抗Thy-1抗体（αThy-1）およびrho123での染色のFACS分析を図示する。 Ｄは、F84.1およびrho123での染色のFACS分析を図示する。 図３は、rho123および種々の抗体で染色したABM細胞のFACS分析を図示する。 Ａは、αCD34およびrho123での染色のFACS分析を図示し、ゲートはCD34⁺細胞に ついて設定される；図３Ｂ〜Ｄは、Ａに示すように、CD34⁺集団についてゲート されている。Ｂは、IgG１イソ型コントロールおよびrho123での染色のFACS分析 を図示する。Ｃは、αThy-1およびrho123での染色のFACS分析を図示する。Ｄは 、F84.1およびrho123での染色のFACS分析を図示する。 図４は、種々の抗体に対してrho123で染色したMPB細胞の初期の採取でのFACS 分析を図示する。Ａは、αCD34およびrho123での染色のFACS分析を図示し、ゲー トはCD34⁺細胞について設定される。F84.1およびrho123での染色の分析；図４Ｂ 〜Ｄは、CD34⁺集団についてゲートされている。Ｂは、IgG１イソ型コントロール およびrho123での染色のFACS分析を図示する。Ｃは、αThy-1およびrho123での 染色のFACS分析を図示する。Ｄは、F84.1およびrho123での染色のFACS分析を図 示する。 図５は、種々の抗体に対してrho123で染色したMPB細胞の後期の採取を図示す る。Ａは、αCD34およびrho123での染色のFACS分析を図示し、ゲートはCD34⁺細 胞について設定される；図５Ｂ〜Ｃは、CD34⁺集団についてゲートされている。 Ｂは、IgG１イソ型コントロールおよびrho123での染色のFACS分析を図示する。 Ｃは、F84.1およびrho123での染色のFACS分析を図示する。 図６は、ヒト造血細胞の種々の集団のhu-HCA（F84.1）染色に対するrho123染 色のFACS分析を図示する。細胞はCD34⁺についてゲートされていなかった。Ａは 、FBMのFACS分析を図示する。Ｂは、ABMのFACS分析を図示する。Ｃは、動員末梢 血液のFACS分析を図示する。 図７は、LIFおよびIL-6で処理したAC6細胞におけるhu-HCA⁺rho⁺CD34⁺細胞集団 の増殖能を図示するグラフである。黒四角は、hu-HCA⁺rho^hiである細胞を表す。 白四角は、hu-HCA⁺rho^hiである細胞を表す。黒菱形は、hu-HCA⁺rho^midである細 胞を表す。白菱形は、hu-HCA⁺rho^lo細胞を表す。特定の実施態様の説明 １つの実施態様では、本発明は、造血細胞抗原「hu-HCA」と称されるヒトマー カーを有するために、hu-HCA⁺と称される富化されたヒト細胞組成物を提供する 。hu-HCAは、mAB F84.1、およびF84.1により認識されるエピトープを有する分子 を認識する抗体により認識される。このような抗体はαhu-HCAと称される。実質 的に均質な組成物は、hu-HCA⁺である細胞の選択的単離により得られ得る。 本発明の別の実施態様では、hu-HCA⁺幹細胞を含む組成物が提供される。この ような組成物は、ヒト造血系の再構成および上記のような造血細胞の種々のパラ メーターの研究において有用性を有する。 本発明は、ヒト造血細胞について富化される細胞を提供する。hu-HCA⁺およびL in^-である細胞は、ヒト造血幹細胞について富化される。Lin-細胞は、一般に、 Ｔ細胞（例えばCD2、CD3、および８）、Ｂ細胞（例えば、CD10、19、および20） 、骨髄球様細胞（例えばCD14、15、16、および33）、およびRBC（グリコホリン⁺ ）に関連したマーカーを欠く細胞を意味する。細胞は、他の幹細胞特異的マーカ ーの選択についてさらに富化され得る。このようなマーカーは、Thy-1⁺、CD34⁺ 、およびrho^loを包含するが、これらに限定されない。特定の因子を用いて適 切に選択すること、および幹細胞の自己再生およびそれらのマーカーに関する幹 細胞のスクリーニングを可能にするバイオアッセイの開発により、富化された生 存ヒト造血幹細胞組成物が、種々の目的のために生産され得る。 幹細胞は、造血移植において用いられ得、ここでこの細胞は新生物細胞を除か れている。さらに、精製幹細胞の使用により、対宿主性移植片病を防止し得る。 さらに、細胞は、遺伝子欠陥を訂正するため、あるいは個体または幹細胞一般の いずれかに関して幹細胞において天然に欠損している遺伝的能力を提供するため に、相同または非相同で、適切な遺伝子導入組換えにより改変され得る。さらに 、組成物は実質的に他の細胞を含まないため、幹細胞組成物は、再生および分化 に関連した因子を単離および定義づけるために用いられ得る。 本発明はさらに、ヒト造血幹細胞において実質的に均質である細胞を提供する 。従って、特定の因子を用いて適切に選択すること、および幹細胞の自己再生お よびそれらのマーカーに関する幹細胞のスクリーニングを可能にするバイオアッ セイの開発により、実質的に均質な生存ヒト造血幹細胞組成物が、種々の目的の ために生産され得る。幹細胞は、造血移植において用いられ得、ここでこの細胞 は新生物細胞を除かれている。さらに、精製幹細胞の使用により、対宿主性移植 片病を防止し得る。さらに、細胞は、遺伝子欠陥を訂正するため、あるいは個体 または幹細胞一般のいずれかに関して幹細胞において天然に欠損している遺伝的 能力を提供するために、相同または非相同で、適切な遺伝子導入組換えにより改 変され得る。さらに、組成物は実質的に他の細胞を含まないため、幹細胞組成物 は、再生および分化に関連した因子を単離および定義づけるために用いられ得る 。 F84.1は、マウスをラット細胞株XKM（神経細胞株）で免疫することにより得ら れた。Princeら（1992）Devel．Br．Res. 68:193-201。F84.1により認識される ラット神経タンパク質（「F84.1糖タンパク質」）は、クローン化細胞株B49から 精製され、そして部分的なアミノ末端のアミノ酸配列決定に供された。Princeら （1992）。F84.1糖タンパク質は、神経系に分布している90〜105kDの細胞表面糖 タンパク質であり、嚢、上皮、神経についてBENと称されるマウスmABにより認識 されるニワトリ抗原の糖タンパク質と類似している。F84.1糖タンパク質とBENと の部分配列の比較は、それらが接着性タンパク質のファミリーに属することを示 す。Princeら（1992）。BENはまた、嚢上皮細胞、ニワトリ神経細胞、およびニ ワトリ造血細胞上で形成される95〜100kDの糖タンパク質を認識する。BENは特定 のニワトリ造血細胞を認識する。この細胞は、例えば、分化しているＴ細胞（CD 4⁺CD8⁺Ｔ細胞）ならびに骨髄球様前駆細胞および赤血球様前駆細胞であるが、Ｂ 細胞ではない。Pourquieら（1990）Devel. 109:743-752；およびCorbelら（1992 ）Exp．Cell Res. 203:91-99。 本明細書中に示される結果は、F84.1が、ヒト造血細胞（特にヒト造血幹細胞 を含む）上で見出される細胞表面抗原を高い特異性で認識し、結合することを示 す。この特異性は、hu-HCA⁺幹細胞を単離および精製するために用いられ得る。 本明細書で用いられるhu-HCAは、F84.1により認識されるエピトープを有する ヒトタンパク質を意味する。本明細書で用いられるhu-HCA⁺細胞は、F84.1、また はF84.1により認識されるエピトープを有する分子に結合するいかなる抗体によ っても認識されるマーカーを発現する細胞を意味する。本明細書で用いられるα hu-HCAは、モノクローナル抗体F84.1、およびF84.1により認識されるエピトープ を有する分子に結合するいかなるモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体 をも意味する。これはまた、F84.1と同一の抗原特異性を有するいかなる抗体を も包含する。 hu-HCA⁺幹細胞は、hu-HCAの存在、および系統が方向付けられた細胞（Ｔ細胞 （例えばCD2、CD3、またはCD8）；Ｂ細胞（例えば、CD10、19、または20）；骨 髄単球細胞（例えばCD14、15、16）；ナチュラルキラー（「NK」）細胞（例えば CD2）；および赤血球（「RBC」）（例えばグリコホリン⁺）、巨核球、肥満細胞 、好酸球、および好塩基球を包含するが、これらに限定されない）に関連したマ ーカーの不在または低発現によって特徴づけられる。このような系統特異的マー カーの不在または低発現は、細胞特異的マーカーに特異的な抗体結合の欠如によ り特徴づけられ、いわゆる「ネガティブ選択」に有用である。造血前駆細胞につ いての分析はWhitlockおよびWitte（1982）Proc．Nat1．Acad．Sci．USA 79:360 8-3612；およびWhitlockら（1987）Cell 48:1009-1021。 表１は、胎児、成体、および動員末梢血液における幹細胞の考えられる表現型 をまとめている。表１において、骨髄単球は、骨髄単球関連マーカーを表し、NK はナチュラルキラー細胞を表し、そしてAMPBは、成体動員末梢血を表す。本明細 書、下記、前出、および表１で用いられる負の印または上付きの負の印（^-）は 、表記のマーカーのレベルがFACS分析によるIgイソ型コントロールよりも検出不 能であり、そして表記のマーカーの非常に低い発現を有する細胞を包含する。 幹細胞の選択は、幹細胞に特異的なマーカーを用いて行う必要はない。ネガテ ィブ選択（系統が方向付けられた細胞の除去）およびポジティブ選択（細胞の単 離）の組合せを用いることにより、富化された幹細胞組成物が得られ得る。 所望であれば、大きな割合の分化細胞が、初めに「比較的粗い」分離を用いる ことにより除去され得る。細胞の供給源は、骨髄、胎児、新生児、または成体あ るいは他の造血細胞源（例えば、胎児の肝臓または末梢血液）であり得る。例え ば、磁性ビーズ分離は、大多数の系統が方向付けられた細胞を除去するために最 初に用いられ得る。望ましくは全造血細胞の少なくとも約80％、通常少なくとも 約70％が除去される。 開始段階では、全ての専任された細胞クラス、特に主要でない集団メンバーを 除去することは必須ではない。通常、血小板および赤血球が選別の前に除去され る。プロトコルにおいてポジティブ選択があるので、ポジティブ選択マーカーを 欠く専任細胞が後に残される。しかし、全ての専任細胞系統についてネガティブ 選択が行われることが好ましく、そのため最終のポジティブ選択において存在す る専任細胞数が最小化される。 hu-HCA⁺であることに加えて、幹細胞は、以下の表現型により、または表１に 示されるように特徴づけられ得る。胎児細胞の場合CD34⁺、CD3^-、CD7^-、CD8^-、C D10^-、CD14^-、CD15^-、CD19^-、CD20^-、およびThy-1⁺を包含するがこれらに限定さ れない；成熟細胞の場合、CD34⁺、CD3^-、CD7^-、CD8^-、CD10^-、CD14^-、CD15^-、CD 19^-、CD20^-、およびThy-1^lo/+を包含するがこれらに限定されない。また、ヒトC D34⁺については、rho123は細胞を高サブセットおよび低サブセット（「rhｏ^lo」 および「rho^hi」）に分類し得る。マウス幹細胞についてのrho123の使用の記載 については、Spangrude（1989）Immunology Today 10:344-350を参照のこと。好 ましくは、細胞はrho^loである。 hu-HCA⁺幹細胞を得るために、骨髄または他の造血源において希少な多能性ヒ ト幹細胞を他の細胞から単離することが必要である。まず、骨髄細胞は、骨髄の 供給源から得られ得る。この供給源は、腸骨（例えば、寛骨から腸骨稜を経由す る）、脛骨、大腿骨、脊椎、または他の骨窩を包含するが、これらに限定されな い。ヒト造血幹細胞の他の供給源は、胚卵黄嚢、胎児肝臓、胎児および成体脾臓 、血液、および臍帯血液を包含するが、これらに限定されない。 胎児骨または他の骨供給源由来の骨髄の単離のために、適切な溶液が骨を洗い 流す（flush）ために用いられ得る。この溶液は、低濃度（通常、約５〜25mM） の受容可能な緩衝液と合わせた、ウシ胎児血清（FCS）または他の天然に存在す る因子を好都合に補足した塩溶液が包含するが、これに限定されない。便利な緩 衝液としては、Hepes、リン酸緩衝液、および乳酸緩衝液が挙げられるが、これ らに限定されない。他の場合では、骨髄は、便利な方法に従って、骨から吸引さ れ得る。 初めに専任された系統の細胞を除去することにより細胞を分離するために、種 々の技法が用いられ得る。モノクローナル抗体は、特定の細胞系統および／また は分化段階に関連したマーカーを同定するために、特に有用である。抗体は、粗 い分離を可能にするために、固体支持体に結合され得る。用いられる分離技法は 、回収される画分の生存能力の保持を最大にすべきである。異なる効力の種々の 技法が、「比較的粗い」分離を得るために用いられ得る。このような分離は、マ ーカーを有しない存在する全細胞の10％まで、通常約５％程度、好ましくは約１ ％程度が、保持される細胞集団と共に残存し得る。用いられる特定の技法は、分 離の効率、方法の細胞傷害性、遂行の容易さおよび速さ、ならびに精巧な装置お よび／または技術の必要性に依存する。 分離手法は、磁性分離を包含するが、これに限定されない。この分離は、抗体 被覆磁性ビーズ、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に接 続させたまたはモノクローナル抗体と合わせて用いられる細胞傷害性因子（補体 およびサイトトキシンを包含するがこれらに限定されない）、および固体マトリ ックスに結合させた抗体との「パンニング」（例えば、プレート、水簸、または 任意の便利な技法）を用いる。 分離技法の使用は、物理的特性の差異に基づく技法（密度勾配遠心分離および 対流遠心水簸）、細胞表面特性の差異に基づく技法（レクチンおよび抗体アフィ ニティー）、および生体染色特性の差異に基づく技法（ミトコンドリア結合色素 rho123およびDNA結合色素Hoechst 33342）を包含するが、これらに限定されない 。 正確な分離を提供する技法は、FACSを包含するが、これに限定されない。これ は、様々な精巧度（例えば、複数の色度チャンネル、低射角および鈍角光散乱検 出チャンネル、インピーダンスチャンネルなど）を有し得る。 用いられ得る１つの手法は、最初に細胞を低温（通常、約４℃）で短時間、特 定の方向付けられた細胞型（Ｔ細胞決定基に対するCD3および8を包含するが、こ れらに限定されない）に特異的な飽和レベルの抗体とインキュベートし、次いで FCSクッション（cushion）で細胞を洗浄することである。細胞は、次いで、上記 のような緩衝培養液中に懸濁され得、そして特定の決定基に対する抗体に基づい て、抗体または抗体−抗原複合体に特異的な種々のタンパク質を用いて分離され 得る。 好都合には、抗体は、マーカーと複合体化され得、特定の細胞型の分離を容易 にする。このマーカーは、磁性ビーズ（直接分離を可能にする）、ビオチン（支 持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンで除去され得る）、蛍光色素 （FACSなどと共に用いられ得る）を包含するが、これらに限定されない。残存細 胞の生存能力に過度に有害でない任意の技法が用いられ得る。 好都合には、成熟細胞マーカーを欠く細胞をかなり富化した後、一般には少な くとも約50％、好ましくは少なくとも約70％まで、細胞は、次いでFACSまたは高 特異性を有する他の方法によって分離され得る。多色分析が、種々の方法によっ て用いられ得る。この方法は、FACSを包含するがこれに限定されない。細胞は、 特定の抗原の染色レベルに基づいて分離され得る。 最初の分離において、典型的には約１×10^8-9、好ましくは約５×10^8-9細胞で 開始するが、CD34またはhu-HCAに対する抗体は１つの蛍光色素で標識され得るが 、種々の専任系統に対する抗体は別の異なる蛍光色素に複合体化され得る。多色 分析での使用が分かっている蛍光色素は、フィコビリンタンパク質(phycobilipr otein)（例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン）；フルオレセイ ンおよびテキサスレッドを包含するが、これらに限定されない。 各系統は別個の工程において分離され得るが、望ましくは、系統は、hu-HCAお よび／またはThyおよび／またはc/kitおよび／またはCD34についてポジティブ選 択を行うと同時に分離される。一般に、二重選択後に得られる細胞数は、元の細 胞の約１％未満であり、通常約0.5％未満であり、そして約0.2％以下であり得る 。 細胞は、次いでThy⁺またはrho^loについてポジティブ選択することによりさら に分離され得る。ミトコンドリア結合色素rho123は、骨髄前駆細胞集団の分離に 有用である。造血細胞の低レベルのrho123染色は、P-gpの発現によるその輸出と 相関する。 分離した細胞は、一般には、元の細胞の0.5%未満、一般に0.01〜0.05％の範囲 であり得る。細胞は、死細胞に関連した色素（ヨード化プロピジウム（PI）を包 含するが、これに限定されない）を用いることにより、死細胞に対して選択され 得る。好ましくは、細胞は、２％FCSを含む培養液中に回収される。 ポジティブ選択のための他の技法は、正確な分離を行う、例えばアフィニティ ーカラムなどのような方法が用いられ得る。この方法は、非幹細胞集団の約20％ 未満、好ましくは約５％未満の残余量で除去を行う。 hu-HCA⁺Lin^-；およびhu-HCA⁺Thy⁺Lin^-；CD34⁺Lin^-；およびCD34⁺Lin^-Thy-1⁺精 製細胞は、FACS分析により低い側方散乱プロフィルおよび低〜中度の前方散乱プ ロフィルを有する。細胞遠心調製物（cytospin preparation）は、成熟リンパ球 様細胞と成熟顆粒球との間の大きさを有する富化幹細胞を示す。細胞は、光散乱 特性および種々の細胞表面抗原の発現に基づいて選択され得る。 特定の分離順序は本発明に対して決定的ではないと考えられるが、指示される 順序が好ましい。好ましくは、細胞は、まず粗分離により分離され、その後密分 離により分離され、幹細胞に関連したマーカーのポジティブ選択および系統が方 向付けられた細胞に関連したマーカーについてのネガティブ選択が行われる。こ の分離の後、多系統分化能および増強自己再生能を有する細胞組成物についての 選択を行う。 90％より多い、通常約95％より多くのhu-HCA⁺幹細胞を有する組成物が、この 方法によって得られ得る。所望の幹細胞はhu-HCA⁺Lin^-Thy-1⁺；および／またはC D34⁺、およびLin^-；そして好ましくはrho^lo、または表２に挙げられるようなこ れらのマーカーの組合せであること、そして種々の造血系統の全てのメンバーの 細胞再生および発達を提供し得ることにより同定される。最終的に、単細胞がこ のような幹細胞組成物から得られ得、長期間にわたってヒトの再構成に用いられ 得た。表２の空欄は、細胞が表記のマーカーに対してネガティブであることを意 味しないことに留意されたい；それらは単にマーカーが用いられないことを意味 する。 hu-HCA⁺幹細胞を含む組成物が、適切な培養物において骨髄球様細胞およびリ ンパ球様細胞の産生を提供することが見いだされ、これらの培養物は、骨髄球様 細胞の産生についてはヒドロコルチゾンを提供し（Dexterタイプ培養物と関連づ けられる）、そしてヒドロコルチゾンを欠いた培養物において（Whitlock-Witte タイプ培養物と関連づけられる）Ｂリンパ球を産生する。各培養物中で、マウス あるいはヒトのストローマ細胞が供給される。このストローマ細胞はAC3あるい はAC6、ヒト幹細胞を維持する能力に関する選択によりマウスあるいはヒトFBMか ら得られるストローマ細胞などを含むが、それらには限定されない種々の株に由 来し得る。 細胞の培養に用いられる培地は、好都合には、IMDM（Iscove改変ダルベッコ培 地）およびIMDMとRPMIとの50:50混合物を包含するが、それらに限定されない、 規定された富化培地（enriched medium）である。この培地は、一般的に、塩、 アミノ酸、ビタミン類、５×10^-5M β-メルカプトエタノール（β-ME）、ストレ プトマイシン／ペニシリンおよび10％FCSからなり、時折、一般的には少なくと も１週間あたり約１度から２度取り替えられ得る。特に、細胞をヒドロコルチゾ ンを含むある培養物から、ヒドロコルチゾンを欠いた別の培養物に移し、異なる 培養物中で異なる系統のメンバーの産生を示すことによって、幹細胞の存在およ びその維持が支持される。このようにして、骨髄球様細胞とＢ細胞の両方の産生 を同定し得る。 骨髄球様細胞の能力およびＢ細胞の能力を同定する際に、好都合には、試験さ れる集団はまず、ヒドロコルチゾンを含む培養物に導入され、このような培養物 中で６週間生育させられる。用いられた培地は、10％FCS、10％ウマ血清、スト レプトマイシン／ペニシリン、グルタミンおよび５×10^-7M〜１×10^-6Mのヒドロ コルチゾンを含むRPMI 1640とIMDMとの50:50混合物を含む。６週間の間に、前駆 細胞の非存在下では成熟細胞はすべて死滅することが予測される。６週間の経過 時に、骨髄球様細胞がまだ観察されれば、骨髄球様細胞への連続的な分化を提供 する前駆細胞が存在すると結論付け得る。この時点で、Ｂ細胞の生育を促すため に、培地がヒドロコルチゾンを欠くように培地を変えてもよい。４〜８週間待ち 、そしてFACS分析によりＢ細胞の存在を示すことにより、以前骨髄球様細胞を産 生し得た前駆細胞はまた、Ｂ細胞も産生し得ると結論づけられる。ヒドロコルチ ゾンの存在下で生育されたヒト造血細胞は、少なくとも１カ月間、ときには４カ 月を超えて維持され得る。同様に、ヒドロコルチゾンの非存在下で生育されたヒ ト造血細胞は、少なくとも４カ月間、Ｂリンパ球(CD19⁺)および骨髄単球細胞を 含む。これらの培養物からhu-HCA⁺Lin^-を選別し得る。hu-HCA⁺Lin^-は、前駆造血 幹細胞において実質的に濃縮された組成物を提供するはずである。 hu-HCA⁺Lin^-細胞をヒト造血源から分離することにより、長期の培養活性は、h u-HCA^-に比べhu-HCA⁺画分において富化（enrich）される。さらに、hu-HCA⁺細胞 は、長期の培養物中でＢ細胞および骨髄球様細胞の両方を生成する。Thy1に対す る抗体および／または表２に特定されている組み合わせのいずれかおよび／また はｃキットを用いるhu-HCA⁺細胞のさらなる富化（enrichment）により、Ｂ細胞 および骨髄球様細胞の両方を生成する頻度はさらに増加し得る。 hu-HCA⁺Lin^-細胞から生成される細胞およびこれらの培養物から得られる細胞 は、以下に記載するインビボアッセイにおいてＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄単球細 胞を生成し得る。 Ｔ細胞への分化を示すために、胎児胸腺を単離し、そして約25℃で４〜７日間 培養して、リンパ球様集団を実質的に除去する。次いで、Ｔ細胞の活性について 試験される細胞を胸腺組織にマイクロ注入する。胸線で、注入された集団のHLA を、胸腺細胞のHLAと不適合にさせる。次いで、米国特許第5,147,784号に記載さ れているように、胸腺組織をscid／scidマウスに移植、特に腎被膜下に移植し得 る。 具体的には、選別されたhu-HCA⁺Lin^-の集団をHLA不適合胸腺フラグメントにマ イクロ注入し得る。６〜10週間後、hu-HCA⁺Lin^-細胞を注入された胸腺フラグメ ントのアッセイを行い、ドナーから得られたＴ細胞について評価し得る。hu-HCA⁺ Lin^-画分を注入された胸腺フラグメントが、CD3⁺、4⁺および8⁺Ｔ細胞をそれら の前駆細胞と共に生成し、維持することを見いだすと期待される。これは、hu-H CA^-Lin^-画分が注入されたフラグメントで観察されるものとは異なる。Thy⁺およ び／またはCD34⁺および／またはｃキットおよび／またはrho123に基づくhu-HCA⁺ Lin^-画分の亜画分化（subfractionation）は、活性の富化を示すはずである。 様々な細胞集団の維持された能力は、SCID-hu骨モデルにおける連続した骨髄 球様細胞およびＢ−リンパ球様細胞の産生の検出によってさらに示され得る。Ky oizumiら、（1992）Blood 79:1704。このことを分析するために、ヒト胎児骨を 単離し、この骨の縦方向にスライスした一部分をSCID動物の皮下に移入し得る： インビボにおける約８週間のインキュベーションにより、内因性細胞を骨腔から 除去する。試験ドナー集団の注入前に、宿主マウスを放射線照射する。注入され た集団のHLAを、骨細胞のHLAと不適合にさせる。 hu-HCA⁺Lin^-細胞をヒト造血源から、あるいは長期インビトロ培養物から分離 することによって、hu-HCA⁺Lin^-画分は、Ｂリンパ球生成および骨髄造血を維持 することができ得る。さらに、この一次レシピエントから細胞を採取することお よび細胞を二次宿主に移入することによって、様々な細胞集団の活性を見いだし 得る。 RBCについては、BFU-Eユニットを同定するために、従来の技術、例えば、細胞 が赤血球系統を発生させ得ることを示すメチルセルロース培養を用い得る。Metc alf(1977) In：Recent Results in Cancer Research 61。Springer-Verlag、Ber lin、pp.1-227。 多能性ヒト幹細胞は、以下のように定義され得る：（１）すべてが規定されて いる血液リンパ球様系統中で子孫を生じる；および（２）限られた数の細胞は、 細胞再生による多能性造血幹細胞を含む、すべての血液細胞タイプおよびそれら の前駆細胞において、重度の免疫無防備状態のヒト宿主を完全に再構成し得る。 幹細胞が単離されると、それらは骨髄、胎児胸線、あるいは胎児肝臓から得ら れ得るストローマ細胞などのストローマ細胞からのならし培地中で生育すること によって増殖し得、また、そのようなストローマ細胞との共培養、あるいは幹細 胞の増殖を支持する保持因子を含む培地において、幹細胞保持と関連づけられた 成長因子の分泌を提供することが知られている。この場合、ストローマ細胞は、 同種異系あっても異種であってもよい。共培養において用いる前に、望ましくな い細胞を除去するのに、適切なモノクローナル抗体、例えば、抗体−毒素複合体 、抗体および補体などを用いて、混合したストローマ細胞調製物から造血細胞を 除去する。あるいは、ストローマ株が同種異系あるいは異種である場合は、クロ ーニングされたストローマ細胞株を用い得る。 目的の細胞組成物は、様々な方法において用いられ得る。細胞は無傷（naive ）なので、放射線照射された宿主および／または化学療法を受けた宿主を完全に 再構成するために用い得る；あるいは、エリトロポイエチン、コロニー刺激因子 （例えば、GM-CSF、G-CSFまたはM-CSF）、インターロイキン（例えばIL-1、IL-2 、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8など）などを含むがそれらに限定されな い様々な因子、あるいは幹細胞が特定の系統に方向づけられることまたはそれら の増殖、成熟および分化に関連するストローマ細胞系を用いて、一つまたはそれ 以上の選択される系統にそれらの増殖、成熟および分化を提供することによっ て、特定の系統の細胞源として用い得る。 造血細胞の分化および成熟と関連づけられる因子の単離および評価においても 、hu-HCA⁺幹細胞を用い得る。従って、ならし培地のような培地の活性の測定、 細胞成長活性についての流体の評価、特定系統の専任との関係などのためのアッ セイにおいて、hu-HCA⁺幹細胞を用い得る。 hu-HCA⁺幹細胞を、遺伝病の治療に用い得る。造血細胞と関連づけられる遺伝 病は、自己由来幹細胞あるいは同種異系幹細胞を遺伝子的に改変し、遺伝子欠損 を修正することによって治療され得る。例えば、βサラセミア、鎌状赤血球貧血 、アデノシンデアミラーゼ欠乏症、リコンビナーゼ欠乏症、リコンビナーゼ調節 遺伝子欠乏症などを含むがこれらに限定されない疾病は、相同組換えまたはラン ダムな組換えのいずれかによる、野生型遺伝子のhu-HCA⁺幹細胞への導入によっ て修正され得る。その他に、遺伝子治療の他の適応は、薬剤耐性遺伝子の導入に より正常幹細胞に利点を有させること、および化学治療の間に選択的圧力（sele ctive pressure）を課すことを可能にすることである。適切な薬剤耐性遺伝子は 、多薬剤耐性（MDR）タンパク質をコードする遺伝子を含むが、これに限定され ない。 疾病がホルモン、酵素、インターフェロン、成長因子などを含むがこれらに限 定されない特定の分泌生成物の欠乏に関連した場合、造血細胞と関連づけられる 疾病以外の疾病も治療され得る。適切な調節開始領域を用いることによって、欠 乏タンパク質の誘導可能な生成が達成され得、それにより、タンパク質の生成は 自然生産と平行するが、そのようなタンパク質を通常生成する細胞タイプとは異 なる細胞タイプにおいて生成が行われる。特定の遺伝子産物あるいは疾病、特に 向血液リンパ性疾病（hematolymphotropic diseases）に対する罹病性を阻害す るために、リボザイム、アンチセンスあるいは他のメッセージを挿入することも 可能である。 あるいは、Ｔ細胞レセプターの特定の可変領域をＴ細胞レパートリーから除去 することも望み得る。相同組換え、あるいは発現を防止するアンチセンス配列ま たはリボザイム配列を用いることによって、特定のＴ細胞レセプターの発現が阻 害され得る。HIV、HTLV-IおよびHTLV-IIなどのようなの血液栄養性病原について 、 幹細胞は遺伝子的に改変され、幹細胞あるいは幹細胞から分化した細胞内におい て病原の増殖を防止するアンチセンス配列あるいはリボザイムが導入され得る。 哺乳動物細胞における組換え方法は、Molecular Cloning、A Laboratory Manu al（1989）Sambrook、Fritsch および Maniatis、Cold Spring Harbor、NYに見 い出され得る。 実質的に相同なhu-HCA⁺細胞を含む組成物も提供される。上記のように得られ る細胞を即座に用いても、あるいは液体窒素温度で凍結して長期間保存し、解凍 し再利用してもよい。細胞は、10％DMSO、50％FCS、40％RPMI 1640培地中で通常 保存される。解凍されると、幹細胞の増殖および分化と関連づけられる成長因子 あるいはストローマ細胞を利用して、細胞を拡張し得る。 別の実施態様において、タンパク質あるいはそのフラグメントに特異的に結合 可能なポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体が提供される。抗 体という用語は、均質な分子実体（entity）あるいは複数の異なる分子実体から 作られる血清生成物のような混合物のいずれをも指すために用いられる。タンパ ク質と特異的に反応するモノクローナルあるいはポリクローナル抗体は、当該分 野において公知の方法によって作成され得る。例えば、HarlowおよびLane、(198 8) Antibodies：A Laboratory Manual、CSH Laboratories；Goding（1986）Mono clonal Antibodies：Principles and Practice 、第２版、Academic Press、New York；およびAusubelら(1987)を参照のこと。また、組換え免疫グロブリンは、 米国特許第4,816,567号に記載の方法を含むが、それには限定されない当該分野 において公知の方法によって作成され得る。10⁸M^-1、好ましくは10⁹〜10¹⁰M^-1ま たはそれ以上の親和性を有するモノクローナル抗体が好ましい。 タンパク質に特異的な抗体は、幹細胞の精製において有用であり得る。このよ うな抗体は、（モノクローナル抗体であろうとポリクローナル抗体であろうと） 、F84.1によって認識される精製ヒトタンパク質を免疫原として利用して、当該 分野において公知の方法によって作成され得る。精製hu-HCAは、天然の供給源(n ative sources)から得られ得る。あるいは、抗体は、当該分野において記載され て 2)。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能な信号を提供する物質と、 共有結合あるいは非共有結合することによって標識される。適切な標識は、放射 線核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光物質、化学発光物質、磁性粒子など を含むが、それらに限定されない。このような標識の使用を記載している米国特 許は、米国特許第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号 ；第4,277,437号；第4,275,149号および第4,366,241号を含むが、それらに限定 されない。 以下の実施例は、限定としてではなく例として記載される。 実施例１ 材料および方法 抗体． 様々なマーカーに対する抗体を以下のように得た：CD3、CD8、CD10、 CD14、CD15、CD19、CD20およびCD33（Becton-Dickinson）。DalchauおよびFabre （1979）J．Exp．Med. 149:576に記載の抗体と同様のThy-1抗体を用いた。S．Zi リンあるいはテキサスレッド(Texas red)（Caltag）と複合化した適切な抗Igを 用いて、抗体を検出した。Thy-1抗体は、フルオレセイン、フィコエリトリンあ るいはビオチン複合体であり、この場合、ビオチン複合体はテキサスレッド−ア ビジン（Caltag）を用いて検出した。CD34抗体を、テキサスレッド（Southern B iotech）と複合化した抗マウスIgG3を用いて検出した。Thy-1およびF84.1抗体を 、フィコエリトリン（Caltag）と複合化した抗マウスIgG1を用いて検出した。 実施例２ FACS分析および選別 Becton-Dickinson FACSter Plusを用いた。デュアルレーザ装置によって、４ つの蛍光パラメータおよび２つの光散乱パラメータを、分析される各細胞につい て、記録し得る。４色分析における、光散乱ゲーティング(light scattering ga ting)およびPI染色によって、あるいは光散乱のみを行うことによって、残る赤 血球、死細胞および残渣を分析から排除した。フルオレセインとフィコエリトリ ンとの、およびフルオレセインとPIとの空間的オーバーラップに対する補償を、 ParksおよびHerzenberg（1984）Met．Enzymol．108:197に記載されているように 、電気的に調整した。蛍光色素の様々な空間的オーバーラップとは無関係に結果 を確実に一貫させるために、同一試薬を異なる蛍光色素と複合化したいくつかの 組み合わせを用いて、４色の染色を行った。さらに、４色分析の結果を、２色分 析および３色分析からのデータと比較して較正した。 細胞の選別については、選別手順全体を通じて、染色したサンプルを４℃に維 持した。２％FCS（Hyclone，Inc.）および10mM Hepes pH7.4を含有するRPMI 16 40あるいはHBSS中に選別滴(sorted drop)を回収した。２色選別あるいは３色選 別では、単一のFACSチャンネル中においては両方の信号を検出および排除すると 、CD34標識にはテキサスレッドを、Thy-1あるいはF84.1の標識にはフィコエリト リンを、フルオレセインチャンネルにおいてはrho123を、死細胞の標識にはPIを 用いた。次いでFACSによる細胞集団の単離後、血球計数のためにサンプルをペレ ットし、HBSS中に再懸濁した。 Bertoncelloら（1988）、Exp．Hematol. 16:245-249およびSpangrudeおよびJo hnson（1990）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：7433-7437に記載されている ように、rho123染色を行った。簡単にいうと、rho123（Molecular Probes、Euge ne、OR）の1mg/mlストック溶液を調製した。ヒト細胞を、２％FCSを含む緩衝溶 液（HEPESあるいはPBSを含むHBSS、RPMI）中に１〜５×10⁶/mlでまたはそれ未満 で再懸濁し、0.1μg/mlのrho123で37℃で30分間インキュベートした。細胞を洗 浄し、rho123色素を含まない緩衝液と共に、37℃で30〜120分間、典型的には、4 0分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、抗体を用いて染色した。 rho123の蛍光強度を、FITCチャンネルにおいて分析した。rho^hi対rho^loについ てのゲートを、細胞全体あるいはCD34⁺細胞のいずれかの主集団の染色のすぐ下 に設定した。上記のように、インキュベーション時間および温度が、rho^lo細胞 対rho^hi細胞の相対的なパーセントを臨界的に規定することに留意されたい。 CD34⁺細胞のThy-1あるいはF84.1抗体による染色の例を、図１〜図５に示す。 図１に示すFACS分析は、αCD34およびF84.1による細胞の同時染色を図示してい る。さらに、図１に提示された結果は、F84.1が、CD34^-であり、従って、おそら くは系統が方向付けられている造血細胞のサブセットを染色することを示してい る。図２に示すFACS分析は、FBMについて、F84.1が、CD34⁺細胞を２つの別個の 集団、すなわちF84.1⁺およびF84.1^-にさらに分割することを示している。さらに 、rho123低染色細胞の大部分あるいはすべてがF84.1⁺である。図３に示すFACS分 析は、ABMについて、F84.1がCD34⁺細胞を２つの別個集団、すなわちF84.1⁺およ びF84.1^-にさらに分割することを示している。さらに、rho123低染色細胞のすべ てがF84.1⁺である。図４に示すFACS分析は、ABMについて、F84.1がCD34⁺細胞を ２つの別個集団、すなわちF84.1⁺およびF84.1^-にさらに分割することを示してい る。さらに、rho123低染色細胞のすべてがF84.1⁺である。図５に示すFACS分析は 、MPBについて、F84.1がCD34⁺細胞を２つの別個集団、すなわちF84.1⁺およびF84 .1^-にさらに分割することを示している。さらに、rho123低染色細胞のすべてがF 84.1⁺である。 FBM、ABMまたはMPBのFACS分析を行い、画分をCD34⁺lin^-細胞に分割し、さらに この画分をThy⁺、F84.1⁺および／またはrho123染色について分析した。この分析 に基づいて、CD34⁺画分、あるいは骨髄全体またはMPBをさらに分割し、それらを 連続的に培養物中で８週間生育させ、骨髄球様細胞およびＢ細胞の存在について スクリーニングすることが可能である。 FBM、ABMおよびMPBをFACSによって、hu-HCA⁺rho^loThy⁺あるいはhu-HCA、rho12 3、Thy、CD34およびlin^-の他の組み合わせに分離し、細胞を共培養物中で生育さ せ得る（表２を参照）。限定希釈分析を用いることによって、どの集団が、共培 養物中で６週間を超える期間維持し得、成熟骨髄球様細胞およびＢ細胞に分化し 得るかを決定することができる。 選別された細胞集団および未選別細胞を、分離時（ｔ＝０）および21日後（ｔ ＝21）に分析する。 実施例３ hu-HCA⁺細胞の特徴付け 造血系を再集合化(repopulate)させるhu-HCA⁺細胞の能力を測定するために、 以下の実験を行った。まず、HCAおよびrho123の発現を、種々のヒト造血細胞上 でモニターした。第２に、ABM細胞の長期増殖の潜在能力を、細胞培養アッセイ において測定した。 両方の実験について、細胞を当該分野で公知の方法によって得た。製造者の指 示書に従って、CellProカラムを用いてこれらの粗細胞調製物からCD34⁺細胞を得 た。rho123、αCD34およびF84.1を用いる染色および分離は、実施例２に記載さ れたものと同様であった。図６は、種々の細胞タイプのFACS分析の結果を示して いる。成体および胎児骨髄の両方において、rho^lo細胞も低い割合でhu-HCA⁺であ るが、移動性の末梢血中では、rho^lo細胞も高い割合でhu-HCA⁺である。各場合に おけるrho^hi集団は、hu-HCA⁺のおおよそ半分である。 種々の選別された集団の長期増殖の潜在能力を測定するために、以下のように 培養アッセイを行った。 Whitlockら（1987）Cell 48:1009-1021に記載されているネズミストローマ細 胞AC6株が、支持環境として働く。組織培養培地を５〜７日毎に変えることによ って、密集ストローマ細胞層を継代なしで７〜８週間まで維持した。継代のため に、ストローマ細胞層を無血清で３回洗浄し、次いで、無血清培地中で2.5ml（T -25フラスコ）の0.5mg/mlコラゲナーゼ−ディスパーゼ(collagenaze-dispase)（ Boehringer-Mannheim、Indianapolis、IN）でおおった。培養物を37℃で15〜30 分インキュベートした；次いで、酵素含有培地中の細胞を回収し、血清を含むRP MI-1640培地を添加した。ストローマ細胞をパスツールピペットでピペッティン グすることによって懸濁し、次いで、元の細胞濃度の１／５〜１／50で直接培養 した。一般に、1:10で継代培養した密集ストローマ層は、５〜７日後に再び密集 に達した。培養物を１ウェルあたり30細胞から0.3細胞に限定希釈することによ って、サブクローンを得た。 成体骨髄細胞を上記のようにCD34発現に関して選別し、hu-HCA^-rho^hi、hu-HCA⁺ rho^hi、hu-HCA⁺rho^midおよびhu-HCA⁺rho^loに分割した。次いで、１ウエルあた り１、３、５、または15細胞で予め定着させた（pre-established）マウススト ローマ細胞層を含む96ウエルのマイクロタイタープレート上への直接自動化沈着 （automated deposition）により細胞を接種した(少なくとも96個のウエルが各 濃度接種された)。 IL-6（10ng/ml）および白血病阻害因子（LIF）（50ng/ml）（Sandoz Pharma） を含む培地中のストローマ単層上で細胞を培養した。サイトカイン含有培地の半 分を毎週置き換えた。培養物を３週目からよみとり、表現型分析についてポジテ ィブな細胞を６〜８週目に採取した。CD19、CD33およびCD34に対する抗体を用い る表現型分析は、前駆細胞、Ｂ細胞および骨髄球様細胞が存在することを示した 。２つの実験から得られた結果は平均され、直線回帰分析によって長期培養開始 細胞（long term culture initiating cell）（LTC-IC）頻度に達した。得られ た結果を図７に示す。これらの結果は、CD34⁺hu-HCA⁺rho^loサブセットがLTC-IC について高度に富化されていることを示している。 明確な理解のために上記の発明を図および実施例により一部詳細に記載したが 、ある程度の変更および改変を実施し得ることは当業者に明らかである。従って 、記載および実施例は、添付の請求の範囲によって記載される本発明の範囲を制 限するように解釈されるべきではない。Detailed Description of the Invention                           Novel stem cell markerForeword Technical field   The field of the invention is the isolation of hematopoietic cell populations.background   Mammalian hematopoietic cells provide a diverse range of biological activities. These cells are lymph It is divided into a lineage, a myeloid lineage, and an erythroid lineage. Lymphatic system (B cell And T cells) induce the production of antibodies, regulation of the cell-mediated immune system, It provides detection, detection of foreign cells to the host, etc. Bone marrow lineage (monocytes, granulocytes , Megakaryocytes, and other cells) to monitor for the presence of foreign bodies and It provides protection against cells, traps foreign substances, produces platelets, and so on. The red blood cell lineage provides red blood cells, which act as carriers of oxygen.   All publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entireties. It is used as a consideration.   Despite the diversity of hematopoietic cell properties, morphologies, characteristics, and functions, these Cells are thought to be derived from a single progenitor cell population (called "stem cells") ing. Stem cells are capable of self-renewal and are committed to differentiation and expansion into specific lineages. lineage committed progenitors Can be.   A highly purified population of stem cells can be used in a variety of in vitro experiments and in vivo indicators. Is necessary for For example, a purified population of stem cells may have growth factors associated with their self-renewal. Enables identification of In addition, these have not yet been discovered, but are related to Growth factor: (1) early stage of stem cell dedication to a specific lineage; (2) ) Prevention of such dedication; and (3) Negative control of stem cell proliferation.   Stem cells are known to be used in the following: (1) Lodgings deficient in stem cells Regeneration of the main hematopoietic system; (2) suffering from disease and removal of bone marrow, stem cell isolation Treatment by dissociation and treatment of the individual with a drug or irradiation prior to transplantation of stem cells Possible host; (3) production of various hematopoietic cells; (4) related to stem cell self-renewal Detection and evaluation of growth factors; and (5) development of hematopoietic cell lineage and development of hematopoiesis Assay for relevant factors. Stem cells also endow blood cells with useful properties It is also a target for gene therapy.   Highly purified stem cells are essential for hematopoietic transplantation, which is an important factor in hematopoietic transfer in cancer patients. Includes, but is not limited to, transplantation and other organ transplants related to hematopoietic transplants . Stem cells are an important target for gene therapy, where the inserted genes are Promotes the health of the individual in which the vesicles are transplanted. Furthermore, the ability to isolate stem cells Can help treat lymphomas and leukemias, as well as other neoplastic conditions. This makes it possible to isolate human hematopoietic stem cells in substantially pure or pure form worldwide. Attempts have been made to counter this.   Stem cells only make up a small percentage of the total number of hematopoietic cells. Hematopoietic cells , Are considered identical by the presence of various cell surface protein “markers”. this Such markers may be specific for a particular lineage or progenitor cell, or Alternatively, it may be present in more than one cell type. In recent years, which is related to differentiated cells It is not known if the injury marker is also present on stem cells. Exist alone in stem cells One marker previously shown to be present, CD34, also has a significant number of lineages. Have been found on directed progenitor cells. U.S. Pat.No. 4,714,680 includes Compositions containing human stem cells have been described.   These markers have been found on hematopoietic cells with many lineage orientations. You. Especially CD34⁺Eighty to ninety percent of the population comprises other strain-specific markers and non-specific markers. Marked by the car. Therefore, the total number of cells in the bone marrow or peripheral blood is small. Cells with a high percentage of hematopoietic cells, with more differentiated markers related to stem cells Uncertainty that is different from Stem cells are difficult to identify and purify given their inability to perform Met. Characterization and isolation of human hematopoietic stem cells has been reported below. Ru: Baum et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2804-2808; and Tsukam oto et al. U.S. Patent No. 5,061,620.   Decreased rhodamine 123 (rho123) staining of hematopoietic cells is not the first pigment accumulation. First, determined by efflux processes that are sensitive to P-glycoprotein (P-gp) inhibitors . Retention of some P-gp transport fluorescent dyes (including rho123) in human bone marrow cells , Were inversely correlated with P-gp expression. Express the physical and antigenic properties of pluripotent stem cells Bone marrow cells showed high levels of P-gp expression and fluorochrome efflux. rho123 inflow The fraction of human bone marrow cells isolated on the basis of either increased or P-gp expression is actually All human progenitor cells of bone marrow (including LTC-initiating cells) were included. Chaudhary And Roninson (1991)Cell 66: 85-94.   Rho123 labeling of stem cells has been shown to be highly dependent on labeling conditions. For example Cells stained for longer periods and / or at higher temperatures show more rho123 Take in. Therefore, characterization of cells for rho123 staining considers staining conditions. Should be.   In recent years, mouse stem cells have been at least highly enriched (not in purified form) Was obtained in). Here, less than about 30 cells from the bone marrow are lethal to radiation. It was possible to reconstitute all hematopoietic lineages of the irradiated mice. Each assembly I cells are pluripotent for all hematopoietic lineages, but self-renewal between these cells It is volatile. Spangrude et al. (1988)Science 241: 58-62; Smith et al. (1991)Proc . Natl. Acad. Sci. USA  88: 2788-2792; Uchida (1992)Ph.D. Thesis Stanford  U. And also European Patent Application No. 89 304651.6 and the references cited therein; See the references that describe the isolation of U.S. stem cells.Summary of the Invention   Methods are provided for obtaining the isolation of a substantially homogeneous composition of human hematopoietic stem cells. this The cells express hu in order to express a marker called human hematopoietic cell antigen (hu-HCA). -HCA⁺It is called. This method is recognized by a monoclonal antibody called F84.1. Separation regimes are used that use antibodies that recognize molecules with the epitopes that are described. Such an antibody is called αhu-HCA. Cells derived from this method are also provided. Hu-HCA⁺It is called.Brief description of the drawings   FIG.Illustrates fluorescence activated cell sorter (FACS) analysis of stem cells from various sources You. A was stained with IgG1 isotype control antibody and anti-CD34 antibody (αCD34) 9 illustrates a FACS analysis of FBM. B is the FACS fraction of FBM stained with F84.1 and αCD34. Figure 9 illustrates the analysis. C is an IgG1 isotype control antibody and αCD34 stained. 6 illustrates FACS analysis of body bone marrow (ABM). D is ABM stained with F84.1 and αCD34 9 illustrates a FACS analysis of. E stained with IgG1 isotype control and αCD34 9 illustrates a FACS analysis of mobilized peripheral blood (MPB). F stained with F84.1 and αCD34 9 illustrates a FACS analysis of the MPBs performed.   FIG.FACS analysis of FBM cells stained with rho123 against several different antibodies Is illustrated. A illustrates FACS analysis of staining with αCD34 and rhol23, gated CD34⁺2B-D shows CD34⁺Gated for the collective . B depicts FACS analysis of staining with IgG1 isotype control and rho123. . C depicts FACS analysis of staining with anti-Thy-1 antibody (αThy-1) and rhol23. D illustrates FACS analysis of staining with F84.1 and rhol23.   FIG.Illustrates FACS analysis of ABM cells stained with rhol23 and various antibodies. A illustrates FACS analysis of staining with αCD34 and rhol23, gated to CD34⁺On cells 3B-D, as shown in FIG.⁺Gate about the group Have been. B, FACS analysis of IgG1 isotype control and staining with rho123 Is illustrated. C depicts FACS analysis of staining with αThy-1 and rhol23. D is Figure 9 illustrates FACS analysis of staining with F84.1 and rhol23.   FIG.FACS on early harvests of MPB cells stained with rho123 for various antibodies The analysis is illustrated. A illustrates FACS analysis of staining with αCD34 and rhol23, CD34⁺Set for cells. Analysis of staining with F84.1 and rhol23; Figure 4B. ~ D is CD34⁺Gated for the collective. B is IgG1 isotype control And FACS analysis of staining with rhol23. C is at αThy-1 and rho123 9 illustrates FACS analysis of staining. D depicts FACS analysis of staining with F84.1 and rho123. To show.   FIG.Illustrates late harvest of MPB cells stained with rho123 for various antibodies You. A illustrates FACS analysis of staining with αCD34 and rhol23, gated to CD34⁺Fine Cell set; Figures 5B-C show CD34⁺Gated for the collective. B depicts FACS analysis of staining with IgG1 isotype control and rhol23. C depicts FACS analysis of staining with F84.1 and rhol23.   Figure 6Shows rho123 staining against hu-HCA (F84.1) staining of different populations of human hematopoietic cells 9 illustrates FACS analysis of color. The cell is CD34⁺Was not gated about. A is , FACS analysis of FBM is illustrated. B illustrates FACS analysis of ABM. C is a mobilized peripheral 6 illustrates FACS analysis of blood.   FIG.Hu-HCA in AC6 cells treated with LIF and IL-6⁺rho⁺CD34⁺Cell population 2 is a graph illustrating the proliferation ability of the. Black squares are hu-HCA⁺rho^hiRepresents a cell that is White squares are hu-HCA⁺rho^hiRepresents a cell that is Black diamonds are hu-HCA⁺rho^midIs thin Represents a cell. White diamonds are hu-HCA⁺rho^loRepresents a cell.Description of a specific embodiment   In one embodiment, the present invention provides a human antibody designated hematopoietic cell antigen "hu-HCA". Hu-HCA to have a car⁺Providing an enriched human cell composition referred to as . hu-HCA is a molecule with mAB F84.1 and an epitope recognized by F84.1. Is recognized by an antibody that recognizes. Such an antibody is called αhu-HCA. Substance Homogeneous composition is hu-HCA⁺Can be obtained by selective isolation of cells that are   In another embodiment of the invention, hu-HCA⁺Compositions are provided that include stem cells. this Such a composition may be used to reconstitute the human hematopoietic system and various parameters of hematopoietic cells as described above. Has utility in meter research.   The present invention provides cells that are enriched for human hematopoietic cells. hu-HCA⁺And L in^-Cells are enriched for human hematopoietic stem cells. Lin-cells are generally T cells (eg CD2, CD3, and 8), B cells (eg CD10, 19, and 20) , Myeloid cells (eg CD14, 15, 16, and 33), and RBC (glycophorin).⁺ ) Means a cell lacking a marker associated with. Cells are other stem cell-specific markers Can be further enriched in choice of Such markers are Thy-1⁺, CD34⁺ , And rho^loBut not limited to these. Suitable with specific factors Wise selection, and stem for stem cell self-renewal and their markers The development of bioassays that enable screening of cells has led to the enrichment of live cells. Live human hematopoietic stem cell compositions can be produced for a variety of purposes.   Stem cells can be used in hematopoietic transplants, where the cells exclude neoplastic cells. Have been. Furthermore, the use of purified stem cells may prevent graft-versus-host disease. In addition, cells may be used to correct genetic defects, or in individuals or stem cells in general. To provide a genetic capacity that is naturally deficient in stem cells for either In particular, it may be homologous or heterologous and may be modified by suitable gene recombination. further , Stem cell compositions regenerate and differentiate because they are substantially free of other cells. Can be used to isolate and define factors associated with.   The invention further provides cells that are substantially homogeneous in human hematopoietic stem cells. . Therefore, proper selection using specific factors, and stem cell self-renewal and Bioassays that enable the screening of stem cells for and their markers. With the development of Seyi, a substantially homogeneous viable human hematopoietic stem cell composition was developed for various purposes. Can be produced for. Stem cells can be used in hematopoietic transplants, where the cells Is excluding neoplastic cells. In addition, by using purified stem cells Can prevent unilateral illness. In addition, cells can be used to correct genetic defects or to Or a genetic defect that is naturally defective in stem cells with respect to either stem cells in general To provide competence, homologous or heterologous, modified by appropriate transgenic recombination. Can be changed. Further, the stem cell composition is substantially free of other cells. Can be used to isolate and define factors associated with regeneration and differentiation .   F84.1 was obtained by immunizing mice with the rat cell line XKM (neuronal cell line). Was. Prince et al. (1992)Devel. Br. Res. 68: 193-201. Recognized by F84.1. Rat neuroprotein (“F84.1 glycoprotein”) from cloned cell line B49 Purified and subjected to partial amino-terminal amino acid sequencing. Prince et al (1992). The F84.1 glycoprotein is a 90-105 kD cell surface glucose that is distributed in the nervous system. A protein that is recognized by mouse mAB called BEN for sac, epithelium, and nerve It is similar to the glycoprotein of chicken antigens. F84.1 glycoprotein and BEN Comparison of the subsequences of the two shows that they belong to a family of adhesive proteins. You. Prince et al. (1992). BEN also affects sac epithelial cells, chicken neurons, and chickens. Recognizes a 95-100 kD glycoprotein formed on chicken hematopoietic cells. BEN is specific Recognize chicken hematopoietic cells. This cell is, for example, a differentiated T cell (CD Four⁺CD8⁺T cells) and myeloid and erythroid progenitor cells, but B Not a cell. Pourquie et al. (1990)Devel. 109: 743-752; and Corbel et al. (1992 )Exp. Cell Res. 203: 91-99.   The results presented herein indicate that F84.1 indicates that human hematopoietic cells (especially human hematopoietic stem cells Recognizing and binding with high specificity the cell surface antigens found above. You. This specificity is due to hu-HCA⁺It can be used to isolate and purify stem cells.   As used herein, hu-HCA has an epitope recognized by F84.1. Means human protein. Hu-HCA as used herein⁺The cells are F84.1, Is any antibody that binds to a molecule with the epitope recognized by F84.1. It also means a cell that expresses a recognized marker. Α as used herein hu-HCA is an epitope recognized by monoclonal antibodies F84.1 and F84.1 Monoclonal and polyclonal antibodies that bind to molecules having Also means It also binds any antibody with the same antigen specificity as F84.1. Is also included.   hu-HCA⁺Stem cells are the presence of hu-HCA and lineage-directed cells (T cells (Eg, CD2, CD3, or CD8); B cells (eg, CD10, 19, or 20); bone Medullary monocyte cells (eg CD14, 15, 16); Natural Killer (“NK”) cells (eg CD2); and red blood cells (“RBC”) (eg glycophorin)⁺), Megakaryocytes, mast cells , But not limited to, eosinophils, and basophils). Characterized by the absence or low expression of markers. Such strain-specific markers The absence or low expression of Kerr is due to the lack of antibody binding specific for cell-specific markers. And is useful for so-called “negative selection”. About hematopoietic progenitor cells The analysis is based on Whitlock and Witte (1982)Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 79: 360 8-3612; and Whitlock et al. (1987).Cell 48: 1009-1021.   Table 1 shows possible phenotypes of stem cells in fetal, adult, and mobilized peripheral blood. Are summarized. In Table 1, myelomonocytic cells represent myelomonocytic-related markers, and NK Represents natural killer cells and AMPB represents adult mobilized peripheral blood. This specification Negative mark or superscript negative mark used in the book, below, above, and in Table 1 (^-) Is , The level of the indicated marker is less detectable than the Ig isotype control by FACS analysis. Cells, which are capable of and have very low expression of the indicated markers.   The selection of stem cells does not have to be performed using a stem cell specific marker. Negate Active selection (elimination of lineage-directed cells) and positive selection (single selection of cells). Enriched stem cell compositions can be obtained by using the combination of   If desired, a large proportion of differentiated cells initially use a "relatively coarse" separation Can be removed by Sources of cells can be bone marrow, fetus, newborn, or adult. Alternatively, it may be another source of hematopoietic cells, such as fetal liver or peripheral blood. example For example, magnetic bead separation is the best method for removing cells for which the majority of lineages are directed. Can be used for the first time. Desirably at least about 80% of all hematopoietic cells, usually at least About 70% is removed.   At the beginning, all dedicated cell classes, especially non-primary population members, It is not mandatory to remove it. Platelets and red blood cells are usually removed prior to sorting You. There is a positive selection in the protocol, so a positive selection marker The lacking dedicated cells are left behind. But negative for all dedicated cell lines It is preferred that selection be done so that it is present in the final positive selection. The number of dedicated cells used is minimized.   hu-HCA⁺In addition to, the stem cells have the following phenotypes or It can be characterized as shown. CD34 for fetal cells⁺, CD3^-, CD7^-, CD8^-, C D10^-, CD14^-, CD15^-, CD19^-, CD20^-, And Thy-1⁺Include but are not limited to Not; CD34 for mature cells⁺, CD3^-, CD7^-, CD8^-, CD10^-, CD14^-, CD15^-, CD 19^-, CD20^-, And Thy-1^{lo / +}But is not limited to. Also, human C D34⁺For rho123, cells with high and low subsets (“rho^lo" And "rho^hi)). Description of the use of rho123 on mouse stem cells About Spangrude (1989)Immunology Today TenSee: 344-350. Good More preferably, the cells are rho^loIt is.   hu-HCA⁺Rare pluripotent humans in bone marrow or other hematopoietic sources to obtain stem cells It is necessary to isolate the stem cells from other cells. First, bone marrow cells It can be obtained from a source. This source can be from the iliac (eg, the hipbone through the iliac crest ), Tibia, femur, spine, or other fovea. Yes. Other sources of human hematopoietic stem cells are embryonic yolk sac, fetal liver, fetal and adult spleen , Blood, and umbilical cord blood.   For isolation of bone marrow from fetal bone or other bone sources, a suitable solution will wash the bone. It can be used to flush. This solution has a low concentration (usually about 5-25 mM) Fetal calf serum (FCS) or other naturally occurring, combined with an acceptable buffer of Include, but are not limited to, a salt solution conveniently supplemented with a factor. Convenient loose Buffers include Hepes, phosphate buffers, and lactate buffers. It is not limited to them. In other cases, the bone marrow is aspirated from the bone according to a convenient method. Can be   To isolate the cells by first removing the cells of the lineage dedicated to Various techniques may be used. Monoclonal antibodies are specific cell lines and / or Are particularly useful for identifying markers associated with the stage of differentiation. Antibody is crude It may be attached to a solid support to allow easy separation. The separation technique used is , The viability retention of the collected fractions should be maximized. Variety of different potency Techniques can be used to obtain a "relatively coarse" separation. Such separation is Up to 10% of the total cells without a marker, usually about 5%, preferably about 1 As much as% may remain with the retained cell population. The specific technique used is Separation efficiency, method cytotoxicity, ease and speed of performance, and sophisticated equipment And / or technology needs.   Separation techniques include, but are not limited to, magnetic separation. This separation is the antibody Contact with coated magnetic beads, affinity chromatography, monoclonal antibodies Cytotoxic factor (complement And solid matri), including but not limited to cytotoxins). "Panning" with the antibody bound to the cell (eg, plate, elutrix, or Any convenient technique).   The use of separation techniques is based on differences in physical properties (density gradient centrifugation and Convective centrifugal elutriation), a technique based on differences in cell surface characteristics (lectin and antibody affinity) , And techniques based on differences in vital staining properties (mitochondrial binding dyes rho123 and the DNA-binding dye Hoechst 33342), but is not limited to .   Techniques that provide accurate separation include, but are not limited to, FACS. this Vary in sophistication (eg, multiple chromaticity channels, low-angle and obtuse-angle light scatter detection). Output channel, impedance channel, etc.).   One technique that can be used is to first treat the cells at a low temperature (usually about 4 ° C) for a short period of time. Certain oriented cell types (including CD3 and 8 for T cell determinants, Incubated with saturating levels of antibody specific for (but not limited to) Washing the cells with an FCS cushion. The cells are then Based on antibodies to specific determinants. Are separated using various proteins specific for the antibody or antibody-antigen complex. obtain.   Conveniently, the antibody may be complexed with a marker to facilitate separation of specific cell types. To This marker includes magnetic beads (which allow direct separation), biotin (support Can be removed with avidin or streptavidin bound to the carrier), a fluorescent dye (Which may be used with FACS and the like), but is not limited to. Remaining Any technique that is not overly detrimental to the viability of the cell may be used.   Advantageously, cells that lack the mature cell marker are significantly enriched and then generally To at least about 50%, preferably at least about 70%, the cells are then FACS or high. It can be separated by other methods with specificity. Multicolor analysis can be performed by various methods. Can be used. This method includes, but is not limited to, FACS. Cells They can be separated based on the staining level of a particular antigen.   Typically about 1 x 10 in the first separation^8-9, Preferably about 5 × 10^8-9In cells To begin, although antibodies to CD34 or hu-HCA can be labeled with one fluorochrome , Antibodies to various proprietary strains can be conjugated to different fluorescent dyes. Multicolor The fluorescent dyes known to be used in the assay are phycobilipin proteins (phycobilipr proteins). otein) (eg phycoerythrin and allophycocyanin); And Texas Red, but is not limited to these.   Although each strain can be separated in a separate step, desirably the strains are hu-HCA or And / or Thy and / or c / kit and / or CD34 positive selection They are separated at the same time they make a choice. In general, the number of cells obtained after double selection is Less than about 1% of the cells, usually less than about 0.5%, and can be less than about 0.2% .   The cells are then Thy⁺Or rho^loMore by choosing positive about Can be separated into The mitochondrial-binding dye rho123 is used to separate myeloid progenitor cell populations Useful. Low level rho123 staining of hematopoietic cells was associated with its export due to P-gp expression. Correlate.   Isolated cells are generally less than 0.5% of the original cells, generally in the range 0.01-0.05%. Can be. The cells contain a dye (propidium iodide (PI)) associated with dead cells. (Including but not limited to) selected against dead cells. obtain. Preferably, the cells are harvested in culture medium containing 2% FCS.   Other techniques for positive selection provide accurate separations, such as affinity -Methods such as column and the like can be used. This method is used for about 20% of the non-stem cell population. Less than, preferably less than about 5% residual removal.   hu-HCA⁺Lin^-; And hu-HCA⁺Thy⁺Lin^-; CD34⁺Lin^-; And CD34⁺Lin^-Thy-1⁺Spirit The cells were made by FACS analysis with low side scatter profile and low to moderate forward scatter profile. Have lofill. Cytospin preparation is a mature lymphocyte 2 shows enriched stem cells with a size between like cells and mature granulocytes. Cells scattered light Selection can be based on characteristics and expression of various cell surface antigens.   The particular separation order is not considered critical to the present invention, but is indicated. Order is preferred. Preferably, the cells are first separated by crude separation and then densely packed. Positive selection and lineage of markers associated with stem cells that are separated by dissociation Negative selection for markers associated with the targeted cells is performed. This For the cell composition having multilineage differentiation ability and enhanced self-renewal ability after isolation of Make a choice.   More than 90%, usually about 95% more hu-HCA⁺The composition having stem cells is Can be obtained by the method. The desired stem cell is hu-HCA⁺Lin^-Thy-1⁺And / or C D34⁺, And Lin^-; And preferably rho^loOr as listed in Table 2 The combination of these markers, and of all members of different hematopoietic lineages Identified by being able to provide cell regeneration and development. Finally, the single cell Can be obtained from stem cell compositions such as Obtained. The blanks in Table 2 mean that the cells are negative for the indicated markers. Note that it does not taste; they simply mean no markers are used I do.   hu-HCA⁺The composition containing the stem cells can be used to prepare myeloid cells and cells in appropriate cultures. It has been found that they provide for the production of lymphoid cells, and these cultures were For the production of cells provided hydrocortisone (related to Dexter type cultures , And in cultures lacking hydrocortisone (Whitlock-Witte Produce B lymphocytes (associated with type cultures). Mouse in each culture Alternatively, human stromal cells are supplied. This stromal cell is AC3 or AC6, mouse or human FBM, depending on choice for ability to maintain human stem cells Obtained from various strains including but not limited to stromal cells. Can come.   The medium used to culture the cells is conveniently IMDM (Iscove modified Dulbecco's culture). And a 50:50 mixture of IMDM and RPMI, including but not limited to: It is a defined enriched medium. This medium is generally Amino acids, vitamins, 5 × 10^-FiveM β-mercaptoethanol (β-ME), strain It consists of putomycin / penicillin and 10% FCS, and occasionally at least generally Can also be replaced about once to twice a week. In particular, cells From one culture containing hydrocortisone to another culture lacking hydrocortisone By demonstrating the production of different lineage members in culture, the presence of stem cells and And its maintenance is supported. In this way, the production of both myeloid and B cells Can be identified.   In identifying the capacity of myeloid-like cells and the capacity of B cells, it was expediently tested. Population is first introduced into cultures containing hydrocortisone, and such cultures It is allowed to grow for 6 weeks. The medium used was 10% FCS, 10% horse serum, strage. Leptomycin / penicillin, glutamine and 5x10^-7M ~ 1 x 10^-6M's hydro Includes a 50:50 mixture of RPMI 1640 with cortisone and IMDM. Procurement within 6 weeks All mature cells are expected to die in the absence of cells. 6 weeks Sometimes provides continuous differentiation into myeloid-like cells if myeloid-like cells are still observed It can be concluded that there are progenitor cells that do. At this point, to promote the growth of B cells Alternatively, the medium may be changed so that the medium lacks hydrocortisone. Wait 4-8 weeks , And previously produced myeloid cells by showing the presence of B cells by FACS analysis. It is concluded that the viable progenitor cells can also produce B cells. Hydrocorti Human hematopoietic cells grown in the presence of D. elegans for at least 1 month and sometimes 4 Can be maintained for more than a month. Similarly, humans grown in the absence of hydrocortisone Hematopoietic cells are B lymphocytes (CD19⁺) And myelomonocytic cells Including. Hu-HCA from these cultures⁺Lin^-Can be selected. hu-HCA⁺Lin^-Progenitor hematopoiesis It should provide a composition substantially enriched in stem cells.   hu-HCA⁺Lin^-By separating cells from human hematopoietic sources, long-term culture activity can be u-HCA^-Compared to hu-HCA⁺Enriched in fractions. Furthermore, hu-HCA⁺cell Produces both B cells and myeloid-like cells in long-term culture. For Thy1 Antibodies and / or any of the combinations specified in Table 2 and / or Hu-HCA using c kit⁺B cells due to further enrichment of cells The frequency of producing both and myeloid cells can be further increased.   hu-HCA⁺Lin^-Cells produced from cells and cells obtained from these cultures Are used to analyze B cells, T cells and myelomonocytic cells in the in vivo assay described below. Can produce vesicles.   The fetal thymus was isolated and shown at about 25 ° C for 4-7 days to show T cell differentiation. Culture to substantially remove the lymphoid population. Then, about the activity of T cells The cells to be tested are microinjected into the thymus tissue. HLA of the infused population at the chest line Are incompatible with HLA of thymocytes. Then described in U.S. Pat.No. 5,147,784. As described above, thymus tissue can be transplanted into scid / scid mice, especially under the renal capsule. You.   Specifically, sorted hu-HCA⁺Lin^-To a HLA-incompatible thymus fragment. Black salmon can be injected. 6-10 weeks later, hu-HCA⁺Lin^-Thymus fragrance injected with cells An assay can be performed to evaluate T cells obtained from the donor. hu-HCA⁺ Lin^-The thymus fragment injected with the fraction is CD3⁺,Four⁺And 8⁺Those T cells It is expected to be found to be generated and maintained with the progenitor cells of. This is hu-H CA^-Lin^-The fractions are different from those observed with the injected fragments. Thy⁺And And / or CD34⁺And / or c-kit and / or hu-HCA based on rho123⁺ Lin^-Subfractionation of the fraction should indicate enrichment of activity.   The sustained capacity of various cell populations was determined by the continuous bone marrow in the SCID-hu bone model. It can be further demonstrated by detection of production of sphere-like cells and B-lymphoid cells. Ky oizumi et al. (1992)Blood 79: 1704. To analyze this, we analyzed human fetal bone An isolated and longitudinally sliced portion of this bone can be implanted subcutaneously in SCID animals: Endogenous cells were removed from the bone cavity by in vivo incubation for about 8 weeks Remove. Host mice are irradiated prior to injection of the test donor population. Injected A population of HLA is made incompatible with the bone cell HLA.   hu-HCA⁺Lin^-Isolate cells from human hematopoietic sources or from long-term in vitro cultures By doing hu-HCA⁺Lin^-Fractions maintain B lymphopoiesis and myelopoiesis You can do it. In addition, it is important to collect cells from this primary recipient. And the transfer of cells to a secondary host find activity in various cell populations. obtain.   For RBC, conventional techniques for identifying BFU-E units, such as cell Methylcellulose cultures can be used which show that the can develop a red blood cell lineage. Metc alf (1977) In: Recent Results in Cancer Research 61. Springer-Verlag, Ber lin, pp.1-227.   Pluripotent human stem cells can be defined as: (1) all defined To give rise to progeny in a living blood lymphoid lineage; and (2) a limited number of cells All blood cell types and those including pluripotent hematopoietic stem cells by cell regeneration In the progenitor cells of, severely immunocompromised human hosts can be completely reconstituted.   Once stem cells are isolated, they can be obtained from bone marrow, fetal thymus, or fetal liver. Growing in conditioned medium from stromal cells, such as possible stromal cells Can be grown by co-culture with such stromal cells, or stem cells. Associated with stem cell retention in media containing retention factors that support cell growth It is known to provide secretion of growth factors. In this case, the stromal cells are They may be of the same kind or different kinds or different kinds. Prior to use in co-culture, Suitable monoclonal antibodies, eg, antibody-toxin conjugates, to remove cells , Hematopoietic cells from the mixed stromal cell preparation using antibodies, complement, etc. Remove. Alternatively, if the stromal strain is allogeneic or heterologous, A trained stromal cell line can be used.   The cell composition of interest can be used in a variety of ways. Cells are intact (naive ), So that the irradiated and / or chemo Can be used to reconstitute; or erythropoietin, colony stimulating factor (Eg GM-CSF, G-CSF or M-CSF), interleukins (eg IL-1, IL-2 , IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, etc.) and the like. Various factors, or that stem cells are orientated to a particular lineage Using a stromal cell line associated with the proliferation, maturation and differentiation of By providing these selected lineages with their proliferation, maturation and differentiation And can be used as a cell source for a particular lineage.   In the isolation and evaluation of factors associated with hematopoietic cell differentiation and maturation , Hu-HCA⁺Stem cells can be used. Therefore, measuring the activity of a medium, such as a conditioned medium, For evaluation of fluids for cell growth activity, relationships with specific lineages, etc. In Sei, hu-HCA⁺Stem cells can be used.   hu-HCA⁺Stem cells can be used in the treatment of genetic diseases. Inheritance associated with hematopoietic cells Disease is caused by genetic modification of autologous stem cells or allogeneic stem cells Can be treated by modifying. For example, β-thalassemia, sickle cell anemia , Adenosine deamylase deficiency, recombinase deficiency, recombinase regulation Diseases including, but not limited to, genetic deficiencies include homologous recombination or Hu-HCA of wild-type gene due to either dumb recombination⁺By introducing into stem cells Can be modified. Other indications for gene therapy include the introduction of drug resistance genes. To make more normal stem cells more beneficial, and selective pressure (sele ctive pressure). The appropriate drug resistance gene is , Including, but not limited to, genes encoding multidrug resistance (MDR) proteins Absent.   Diseases include but are not limited to hormones, enzymes, interferons, growth factors, etc. Associated with hematopoietic cells if associated with deficiency of unspecified secretory products Diseases other than the diseases can be treated. By using the appropriate regulatory initiation region, Inducible production of a poor protein may be achieved, which results in protein production Parallel to natural production, but distinct from the cell type that normally produces such proteins. Production occurs in different cell types. Specific gene products or diseases, especially Inhibits susceptibility to hematolymphotropic diseases To insert ribozymes, antisense or other messages to It is possible.   Alternatively, removal of specific variable regions of the T cell receptor from the T cell repertoire You may also want to do it. Antisense sequences that prevent homologous recombination or expression. Or ribozyme sequences prevent the expression of specific T cell receptors. Can be harmed. About hematotrophic pathogens such as HIV, HTLV-I and HTLV-II , Stem cells are genetically modified and are located within stem cells or cells differentiated from stem cells. Antisense sequences or ribozymes that prevent the growth of pathogens can be introduced.   Recombinant methods in mammalian cells are described in Molecular Cloning, A Laboratory Manu. al (1989) See Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, NY. Can be taken out.   Substantially homologous hu-HCA⁺Compositions comprising cells are also provided. Obtained as above Cells can be used immediately or frozen at liquid nitrogen temperature for long-term storage and thawing. You may reuse it. Cells are usually in 10% DMSO, 50% FCS, 40% RPMI 1640 medium Saved. Growth factors that, when thawed, are associated with stem cell proliferation and differentiation Alternatively, stromal cells can be utilized to expand the cells.   In another embodiment, it specifically binds to a protein or fragment thereof. Possible polyclonal and / or monoclonal antibodies are provided. Anti The term body refers to either a homogeneous molecular entity or multiple different molecular entities. Used to refer to any mixture such as serum product made. Tampa Monoclonal or polyclonal antibodies that specifically react with It can be prepared by a method known in the field. For example, Harlow and Lane, (198 8)Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Laboratories; Goding (1986)Mono clonal Antibodies: Principles and Practice , 2nd Edition, Academic Press, New See York; and Ausubel et al. (1987). In addition, recombinant immunoglobulin The art including, but not limited to, the methods described in U.S. Patent No. 4,816,567. Can be prepared by a method known in the art. Ten⁸M^-1, Preferably 10⁹~Ten^TenM^-1Ma Or, a monoclonal antibody having an affinity higher than that is preferable.   Antibodies specific for the protein may be useful in purifying stem cells. This Such antibodies (whether monoclonal or polyclonal) , Using purified human protein recognized by F84.1 as an immunogen It can be prepared by a method known in the art. Purified hu-HCA is a natural source (n native sources). Alternatively, antibodies are described in the art hand 2). Often, the polypeptides and antibodies are substances that provide a detectable signal, Labeled by covalent or non-covalent binding. Suitable label is radiation Radionuclides, enzymes, substrates, cofactors, inhibitors, fluorescent substances, chemiluminescent substances, magnetic particles, etc. Including, but not limited to. US patents describing the use of such labels. U.S. Pat. Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345 Including, but not limited to, 4,277,437; 4,275,149 and 4,366,241; Not done.   The following examples are described by way of example and not limitation.                                 Example 1                              Materials and methods   antibody.  Antibodies to various markers were obtained as follows: CD3, CD8, CD10, CD14, CD15, CD19, CD20 and CD33 (Becton-Dickinson). Dalchau and Fabre (1979)J. Exp. Med. 149The Thy-1 antibody similar to the antibody described in: 576 was used. S. Zi Appropriate anti-Ig complexed with phosphorus or Texas red (Caltag) The antibody was used to detect. Thy-1 antibodies are fluorescein and phycoerythrin Or biotin complex, in which case the biotin complex is Texas Red-A Detection was performed using vidin (Caltag). CD34 antibody was added to Texas Red (Southern B iotech) and anti-mouse IgG3 conjugated to it. Thy-1 and F84.1 antibodies , Anti-mouse IgG1 complexed with phycoerythrin (Caltag) was used for detection.                                 Example 2                            FACS analysis and sorting   Becton-Dickinson FACSter Plus was used. 4 by dual laser device One fluorescence parameter and two light scattering parameters for each cell analyzed. Can be recorded. Light scattering gamut in four color analysis ting) and PI staining, or only by light scattering Blood cells, dead cells and debris were excluded from the analysis. Fluorescein and phycoerythri Compensation for spatial overlap of the fluorescein and PI with Parks and Herzenberg (1984)Met. Enzymol. 108: 197 , Electrically adjusted. Results independent of various spatial overlaps of fluorochromes In order to ensure consistent The combination was used to stain four colors. In addition, the results of the 4-color analysis are calculated for Calibrated by comparison with data from analysis and three color analysis.   For cell sorting, the stained samples were kept at 4 ° C throughout the sorting procedure. I had RPMI 16 containing 2% FCS (Hyclone, Inc.) and 10 mM Hepes pH 7.4 Sorted drops were collected in 40 or HBSS. 2-color selection or 3-color selection Alternatively, if you detect and eliminate both signals in a single FACS channel, , Texas Red for CD34 and Phycoeryth for Thy-1 or F84.1 Phosphorus, rho123 for fluorescein channels, PI for dead cell labeling Using. The sample was then pelleted for hemocytometry after isolation of the cell population by FACS. And resuspended in HBSS.   Bertoncello et al. (1988),Exp. Hematol. 16: 245-249 and Spangrude and Jo hnson (1990),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: Described in 7433-7437 Rho123 staining was performed as follows. Simply put, rho123 (Molecular Probes, Euge ne, OR) 1 mg / ml stock solution was prepared. Buffered human cells containing 2% FCS 1 to 5 × 10 in liquid (HBES containing PBS or PBS, RPMI)⁶/ ml or less The cells were resuspended in 0.1 μg / ml rho123 and incubated at 37 ° C for 30 minutes. Wash cells Clean, buffer with rho123 dye-free for 30-120 minutes at 37 ° C, typically 4 Incubated for 0 minutes. Cells were washed again and stained with antibody.   The fluorescence intensity of rho123 was analyzed in the FITC channel. rho^hiVs rho^loAbout The whole cell or CD34⁺Just below the staining of any main population of cells Set to. As mentioned above, the incubation time and temperature depend on the rho^locell Vs rho^hiNote that the relative percentage of cells is critically defined.   CD34⁺Examples of staining of cells with Thy-1 or F84.1 antibody are shown in FIGS. The FACS analysis shown in Figure 1 illustrates co-staining of cells with αCD34 and F84.1. You. Furthermore, the results presented in Figure 1 show that F84.1^-And, therefore, sora Or shows that the lineage stains a subset of hematopoietic cells that are directed. You. The FACS analysis shown in Fig. 2 shows that F84.1 shows CD34 for FBM.⁺Cells in two separate Collective, F84.1⁺And F84.1^-It is shown to be further divided into. further Most or all of the rho123 low-staining cells are F84.1⁺It is. FACS shown in Figure 3 For ABM, F84.1 is CD34⁺Cells into two distinct populations, namely F84.1⁺And And F84.1^-It is shown to be further divided into. In addition, all rho123 low-staining cells F84.1⁺It is. The FACS analysis shown in Figure 4 shows that for ABM, F84.1 was CD34.⁺Cells Two separate populations, namely F84.1⁺And F84.1^-Shows that it is further divided into You. In addition, all rho123 low-staining cells were F84.1⁺It is. The FACS analysis shown in Figure 5 About MPB, F84.1 is CD34⁺Cells into two distinct populations, namely F84.1⁺And F84 .1^-It is shown to be further divided into. Furthermore, all rho123 low-staining cells were F 84.1⁺It is.   Perform FACS analysis of FBM, ABM or MPB, and fractionate to CD34⁺lin^-Split into cells, then This fraction is Thy⁺, F84.1⁺And / or analyzed for rhol23 staining. This analysis Based on CD34⁺Subdivide the fractions, or whole bone marrow or MPB, and For the presence of myeloid-like cells and B cells, continuously grown in culture for 8 weeks It is possible to screen.   FBM, ABM and MPB by hu-HCA by FACS⁺rho^loThy⁺Or hu-HCA, rho12 3, Thy, CD34 and lin^-The cells were grown in co-culture, separated into other combinations of (See Table 2). By using limited dilution analysis, which population is co-cultivated Can be maintained in culture for more than 6 weeks and differentiates into mature myeloid and B cells You can decide what to get.   Sorted cell populations and unsorted cells were separated (t = 0) and 21 days later (t = 21).                                 Example 3                           Characterization of hu-HCA ⁺ cells   Hu-HCA that repopulates the hematopoietic system⁺To measure the capacity of cells, The following experiment was conducted. First, the expression of HCA and rho123 was expressed on various human hematopoietic cells. I monitored it at. Second, the long-term growth potential of ABM cells was assessed in cell culture assays. Was measured.   For both experiments, cells were obtained by methods known in the art. Manufacturer's finger CD34 from these crude cell preparations using CellPro columns according to the manufacturer's instructions.⁺Get cells Was. Staining and separation with rho123, αCD34 and F84. 1 is described in Example 2. It was similar to what was done. Figure 6 shows the results of FACS analysis of various cell types. I have. Rho in both adult and fetal bone marrow^loCells also have a low percentage of hu-HCA⁺In However, in mobile peripheral blood, rho^loHigh percentage of cells also hu-HCA⁺It is. In each case Rho^hiThe population is hu-HCA⁺Is about half.   To measure the long-term growth potential of various selected populations, do the following: Culture assay was performed.   Whitlock et al. (1987)Cell 48: 1009-1021 described in the mouse rod Cell AC6 strain acts as a support environment. By changing the tissue culture medium every 5-7 days Thus, the dense stromal cell layer was maintained for 7-8 weeks without passage. For passaging The stromal cell layer was washed three times with serum-free medium, and then 2.5 ml (T -25 flasks) 0.5 mg / ml collagenase-dispase ( Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN). Culture at 37 ° C for 15-30 Incubated for minutes; then harvested cells in enzyme-containing medium, serum-containing RP MI-1640 medium was added. Pipette stroma cells with a Pasteur pipette By culturing, then culturing directly at 1/5 to 1/50 of the original cell concentration did. In general, a dense stromal layer subcultured at 1:10 should be reconfluent after 5 to 7 days. Reached. By diluting the culture from 30 cells per well to 0.3 cells Then, a subclone was obtained.   Adult bone marrow cells were selected for CD34 expression as described above and hu-HCA^-rho^hi, Hu-HCA⁺ rho^hi, Hu-HCA⁺rho^midAnd hu-HCA⁺rho^loDivided into. Then 1 well Mouse strain pre-established with 1, 3, 5, or 15 cells Direct automated deposition on 96-well microtiter plates containing Roman cell layers Cells were seeded by (automated deposition) (at least 96 wells each Concentration inoculated).   IL-6 (10ng / ml) and leukemia inhibitory factor (LIF) (50ng / ml) (Sandoz Pharma) Cells were cultured on stroma monolayers in medium containing Half of cytokine-containing medium Minutes replaced weekly. Read the cultures from the 3rd week and perform positive phenotypic analysis. Live cells were harvested at 6-8 weeks. Using antibodies against CD19, CD33 and CD34 Phenotypic analysis showed the presence of progenitor cells, B cells and myeloid cells . The results obtained from the two experiments were averaged and the long-term culture was started by linear regression analysis. The cell (long term culture initiating cell) (LTC-IC) frequency was reached. Obtained The results are shown in FIG. These results are CD34⁺hu-HCA⁺rho^loLTC-IC is a subset Shows that it is highly enriched.   Although the above invention has been described in some detail with reference to the drawings and examples for clear understanding, It will be apparent to those skilled in the art that certain changes and modifications can be made. Therefore The description and examples limit the scope of the invention as described by the appended claims. It should not be construed as limiting.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ヒト造血幹細胞を含む実質的に均質な組成物を得る方法であって、ヒト造血 細胞の混合物を、モノクローナル抗体F84.1により認識されるエピトープを有す る分子を認識する抗体によって認識される細胞を含む富化された画分に分離する 工程を包含する、方法。 ２．前記hu-HCA⁺細胞が、他の幹細胞特異的マーカーを有することによりさらに 特徴づけられる、請求項１に記載の方法。 ３．前記hu-HCA⁺細胞がCD34⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求項１ に記載の方法。 ４．前記hu-HCA⁺細胞がThy-1⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求項 １に記載の方法。 ５．前記hu-HCA⁺細胞がrho^loであることによりさらに特徴づけられる、請求項１ に記載の方法。 ６．前記hu-HCA⁺細胞が、系統特異的マーカーを発現する細胞からさらに分離さ れている、請求項１に記載の方法。 ７．前記hu-HCA⁺細胞が、他の幹細胞特異的マーカーを有することによりさらに 特徴づけられる、請求項１に記載の方法。 ８．前記hu-HCA⁺細胞がCD34⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求項１ に記載の方法。 ９．前記hu-HCA⁺細胞がlin^-であることによりさらに特徴づけられる、請求項８ に記載の方法。 １０．前記hu-HCA⁺細胞がThy-1⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求 項８に記載の方法。 １１．前記hu-HCA⁺細胞がrho^loであることによりさらに特徴づけられる、請求項 ８に記載の方法。 １２．前記分離が、以下の工程： 前記混合物を、蛍光標識と複合化したhu-HCAに対する抗体および系統特異的マ ーカーに対する抗体と組み合わせる工程であって、該αhu-HCA抗体が他の抗体と は異なる蛍光標識を有する、工程；および hu-HCA⁺lin^-であることより特徴づけられる細胞画分を、該蛍光標識により分 離する工程 を包含する、請求項８に記載の方法。 １３．請求項１に記載の方法により得られる造血細胞の実質的に純粋な集団を含 む組成物。 １４．前記hu-HCA⁺細胞が、他の幹細胞特異的マーカーを有することによりさら に特徴づけられる、請求項１３に記載の組成物。 １５．前記hu-HCA⁺細胞がCD34⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求項 １３に記載の組成物。 １６．前記hu-HCA⁺細胞がThy-1⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求 項１３に記載の組成物。 １７．前記hu-HCA⁺細胞がrho^loであることによりさらに特徴づけられる、請求項 １３に記載の組成物。 １８．請求項８に記載の方法により得られる造血幹細胞の実質的に純粋な集団を 含む組成物。 １９．前記hu-HCA⁺細胞が、他の幹細胞特異的マーカーを有することによりさら に特徴づけられる、請求項１８に記載の組成物。 ２０．前記hu-HCA⁺細胞がCD34⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求項 １８に記載の組成物。 ２１．前記hu-HCA⁺細胞がLin^-であることによりさらに特徴づけられる、請求項 １８に記載の組成物。 ２２．前記hu-HCA⁺細胞がThy-1⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求 項１８に記載の組成物。 ２３．前記hu-HCA⁺細胞がrho^loであることによりさらに特徴づけられる、請求項 １８に記載の組成物。 ２４．hu-HCAを認識する抗体により認識されるヒト造血細胞を含む組成物。 ２５．前記hu-HCA⁺細胞が、他の幹細胞特異的マーカーを有することによりさら に特徴づけられる、請求項２４に記載の組成物。 ２６．前記hu-HCA⁺細胞がCD34⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求項 ２４に記載の組成物。 ２７．前記hu-HCA⁺細胞がThy-1⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求 項２４に記載の組成物。 ２８．前記hu-HCA⁺細胞がrho^loであることによりさらに特徴づけられる、請求項 ２４に記載の組成物。 ２９．hu-HCAを認識する抗体により認識されるヒト造血幹細胞を含む組成物。 ３０．前記hu-HCA⁺細胞が、他の幹細胞特異的マーカーを有することによりさら に特徴づけられる、請求項２９に記載の組成物。 ３１．前記hu-HCA⁺細胞がCD34⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求項 ２９に記載の組成物。 ３２．前記hu-HCA⁺細胞がLin^-であることによりさらに特徴づけられる、請求項 ２９に記載の組成物。 ３３．前記hu-HCA⁺細胞がThy-1⁺であることによりさらに特徴づけられる、請求 項２９に記載の組成物。 ３４．前記hu-HCA⁺細胞がrho^loであることによりさらに特徴づけられる、請求項 ２９に記載の組成物。[Claims] 1. A method for obtaining a substantially homogeneous composition comprising human hematopoietic stem cells, the mixture of human hematopoietic cells comprising cells recognized by an antibody recognizing a molecule having an epitope recognized by monoclonal antibody F84.1. A method comprising separating into enriched fractions. 2. The method of claim 1, wherein the hu-HCA ⁺ cells are further characterized by having other stem cell specific markers. 3. The method of claim 1, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being CD34 ⁺ . 4. The method of claim 1, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being Thy-1 ⁺ . 5. The method of claim 1, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being rho ^lo . 6. The method of claim 1, wherein the hu-HCA ⁺ cells are further separated from cells expressing lineage-specific markers. 7. The method of claim 1, wherein the hu-HCA ⁺ cells are further characterized by having other stem cell specific markers. 8. The method of claim 1, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being CD34 ⁺ . 9. The method of claim 9, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being lin ⁻ . 10. 9. The method of claim 8, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being Thy-1 ⁺ . 11. 9. The method of claim 8, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being rho ^lo . 12. The separation comprises the following steps: a step of combining the mixture with an antibody against hu-HCA complexed with a fluorescent label and an antibody against a strain-specific marker, wherein the αhu-HCA antibody has a fluorescence different from other antibodies. 9. The method of claim 8, comprising the step of: having a label; and separating the cell fraction characterized by hu-HCA ⁺ lin ^- with said fluorescent label. 13. A composition comprising a substantially pure population of hematopoietic cells obtained by the method of claim 1. 14． 14. The composition of claim 13, wherein the hu-HCA ⁺ cells are further characterized by having other stem cell specific markers. 15. 14. The composition of claim 13, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being CD34 ⁺ . 16. 14. The composition of claim 13, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being Thy-1 ⁺ . 17． 14. The composition of claim 13, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being rho ^lo . 18. A composition comprising a substantially pure population of hematopoietic stem cells obtained by the method of claim 8. 19. 19. The composition of claim 18, wherein the hu-HCA ⁺ cells are further characterized by having other stem cell specific markers. 20. 19. The composition of claim 18, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being CD34 ⁺ . 21. 19. The composition of claim 18, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being Lin ⁻ . 22. 19. The composition of claim 18, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being Thy-1 ⁺ . 23. 19. The composition of claim 18, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being rho ^lo . 24. A composition comprising human hematopoietic cells recognized by an antibody that recognizes hu-HCA. 25. 25. The composition of claim 24, wherein the hu-HCA ⁺ cells are further characterized by having other stem cell specific markers. 26. 25. The composition of claim 24, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being CD34 ⁺ . 27. 25. The composition of claim 24, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being Thy-1 ⁺ . 28. 25. The composition of claim 24, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being rho ^lo . 29. A composition comprising human hematopoietic stem cells recognized by an antibody that recognizes hu-HCA. 30. 30. The composition of claim 29, wherein the hu-HCA ⁺ cells are further characterized by having other stem cell specific markers. 31. 30. The composition of claim 29, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being CD34 ⁺ . 32. 30. The composition of claim 29, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being Lin ⁻ . 33. 30. The composition of claim 29, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being Thy-1 ⁺ . 34. 30. The composition of claim 29, further characterized by said hu-HCA ⁺ cells being rho ^lo .