JPH09500788A - B7-2: CTLA4 / CD28 counter receptor - Google Patents

B7-2: CTLA4 / CD28 counter receptor

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JPH09500788A
JPH09500788A JP7505397A JP50539795A JPH09500788A JP H09500788 A JPH09500788 A JP H09500788A JP 7505397 A JP7505397 A JP 7505397A JP 50539795 A JP50539795 A JP 50539795A JP H09500788 A JPH09500788 A JP H09500788A
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cell
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フリーマン，ゴードン・ジェイ
ナドラー，リー・エム
グレイ，ゲーリー・エス
グリーンフィールド，エドワード
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Repligen Corp
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Abstract

(57)【要約】 Ｔ細胞を活性化を共剌激する新規なＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドをコードする核酸を開示する。一態様において該核酸はＢリンパ球抗原Ｂ７−２をコードする配列を有する。好ましくは該核酸は、図８、配列番号１または図１４、配列番号２３に示すヌクレオチド配列の少なくとも１部分を含むＤＮＡ分子である。本発明の核酸配列を様々な発現ベクターにインテグレイトし、様々な宿主、特に哺乳動物および昆虫細胞培養等の真核生物細胞で、対応するタンパク質またはペプチドを合成することができる。本発明の核酸配列によりコードされるタンパク質またはペプチドを産生するようトランスホームされた宿主細胞、および新規なＢリンパ球抗原の少なくとも一部分を含む単離されたタンパク質およびペプチドも開示する。本明細書に記載したタンパク質およびペプチドはＴ細胞媒介免疫応答を高め、または抑制するため患者に投与できる。 (57) Summary Disclosed are nucleic acids that encode novel CTLA4 / CD28 ligands that stimulate T cell activation. In one aspect, the nucleic acid has a sequence encoding the B lymphocyte antigen B7-2. Preferably, the nucleic acid is a DNA molecule comprising at least a portion of the nucleotide sequence shown in Figure 8, SEQ ID NO: 1 or Figure 14, SEQ ID NO: 23. The nucleic acid sequences of the present invention can be integrated into various expression vectors to synthesize the corresponding proteins or peptides in various hosts, especially eukaryotic cells such as mammalian and insect cell cultures. Also disclosed are host cells transformed to produce the proteins or peptides encoded by the nucleic acid sequences of the invention, and isolated proteins and peptides comprising at least a portion of the novel B lymphocyte antigens. The proteins and peptides described herein can be administered to a patient to enhance or suppress a T cell mediated immune response.

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ７−２：ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８カウンターレセプター 政府資金 本明細書に記載した研究はナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルスに より与えられたＣＡ−４０２１６−０８の下に支持された。それ故、米国政府は 本発明に一定の権利を有し得る。 発明の背景 抗原特異的なＴ細胞の活性化およびクローンエクスパンションを誘導するため には、抗原提示細胞(ＡＰＣ)により提供される２つのシグナルが静止Ｔリンパ球 の表面に伝達されねばならない(Ｊenkins，Ｍ．およびＳchwartz，Ｒ．(１９８ ７)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１６５、３０２〜３１９；Ｍueller，Ｄ.Ｌ．等(１９ ９０)Ｊ．Ｉmmunol．、１４４、３７０１〜３７０９；Ｗilliams，Ｉ.Ｒ．およ びＵnanue，Ｅ.Ｒ．（１９９０）Ｊ．Ｉmmunol．、１４５、８５〜９３)。免疫 応答に特異性を与える第１のシグナルは、主要組織適合性遺伝子複合体(ＭＨＣ) に示された外来の抗原性ペプチドの認識後に、Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)により 媒介される。共刺激と呼ばれる第２のシグナルはＴ細胞が増殖し、機能性となる よう誘導する(Ｓchwartz，Ｒ.Ｈ.、（１９９０）Ｓcience、２４８、１３４９〜 １３５６)。共刺激は抗原特異的でもＭＨＣ限定性でもなく、ＡＰＣにより発現 される１以上の別の細胞表面分子により提供される(Ｊenkins，Ｍ.Ｋ．等(１９ ８８)、Ｊ．Immunol．、１４０、３３２４〜３３３０；Ｌinsley，Ｐ.Ｓ.等(１ ９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７２１〜７３０；Ｇimmi，Ｃ.Ｄ．等(１ ９９１)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８８、６５７５〜６５７９；Ｙ oung，Ｊ.Ｗ．等(１９９２)、Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest．、９０、２２９〜２３７； Ｋoulova，Ｌ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７５９〜７６２；Ｒ eiser，Ｈ．等(１９９２)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８９、２７１ 〜 ２７５；van−Ｓeventer，Ｇ.Ａ．等(１９９０)、Ｊ．Ｉmmunol．、１４４、４ ５７９〜４５８６；ＬaＳalle，Ｊ.Ｍ.等(１９９１)、Ｊ．Ｉmmunol．、１４７ 、７７４〜８０；Ｄustin，Ｍ.Ｉ.等(１９８９)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１６９、 ５０３；Ａrmitage，Ｒ.Ｊ.等(１９９２)、Ｎature、３５７、８０〜８２；Ｌiu ，Ｙ．等(１９９２)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７５、４３７〜４４５)。 ＡＰＣ上に発現されるＢ７タンパク質が一つのそのような重要な共剌激性分子 であることをかなりな証拠が示唆する(Ｌinsley，Ｐ.Ｓ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅ xp．Ｍed． 、１７３、７２１〜７３０；Ｇimmi，Ｃ.Ｄ．等(１９９１)、Ｐroc． Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、８８、６５７５〜６５７９；Ｋoulova，Ｌ．等( １９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７５９〜７６２；Ｒeiser，Ｈ．等(１ ９９２)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８９、２７１〜２７５；Ｌinsl ey，Ｐ.Ｓ．等(１９９０)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８７、５０３ １〜５０３５；Freeman，Ｇ.Ｊ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７４、６ ２５〜６３１)。Ｂ７はＴリンパ球上で発現される２つのリガンドについてのカ ウンターレセプターである。ＣＤ２８と名付けられる第１のリガンドは静止Ｔ細 胞上で構成的に発現され活性化後増加する。Ｔ細胞レセプターを介して信号を送 った後、ＣＤ２８のライゲーションはＴ細胞が増殖し、ＩＬ−２を分泌するよう 誘導する(Ｌinsley，Ｐ.Ｓ．等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７３、７２１ 〜７３０；Ｇimmi，Ｃ.Ｄ．等(１９９１)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、８８、６５７５〜６５７９；Ｔhompson，Ｃ.Ｂ．等(１９８９)、Ｐroc．Ｎatl ．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、８６、１３３３〜１３３７；Ｊune，Ｃ.Ｈ．等(１９９ ０)、Ｉmmunol．Ｔoday、１１、２１１〜６；Ｈarding，Ｆ.Ａ．等(１９９２)、Ｎature 、３５６、６０７〜６０９)。ＣＴＬＡ４と名付けられる第２のリガンド はＣＤ２８と相同性であるが、静止Ｔ細胞上では発現せず、Ｔ細胞活性化の後に 生じる(Ｂrunet，Ｊ．Ｆ等(１９８７)、Ｎature、３２８、２６７〜２７０)。ヒ トおよびマウスＣＴＬＡ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、Ｄariavich等 (１９８８)、Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．、１８(１２)、１９０１〜１９０５；Ｂrune t，Ｊ.Ｆ．等(１９８７)、上書；Ｂrunet，Ｊ.Ｆ．等(１９８８)、Ｉmmunol．Ｒ ev． 、１０３、２１〜３６；およびＦreeman，Ｇ.Ｊ．等(１９９２)、Ｊ．Immun ol． 、１４９、３７９５〜３８０１に記載されている。Ｂ７はＣＤ２８に対して より、ＣＴＬＡ４に対してより大きい親和性を有するが(Ｌinsley，Ｐ.Ｓ．等( １９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７４、５６１〜５６９)、ＣＴＬＡ４の機能は 未だ未知である。 Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４共刺激経路の重要性はインビトロおよびいくつか のインビボモデル系で示された。この共剌激経路を封鎖するとマウスおよびヒト の系において抗原特異的寛容の発生をもたらす(Ｈarding，Ｆ.Ａ．等(１９９２) 、Ｎature、３５６、６０７〜６０９；Ｌenschow，Ｄ.Ｊ．等(１９９２)、Ｓcie nce 、２５７、７８９〜７９２；Ｔurka，Ｌ.Ａ．等(１９９２)、Ｐroc．Ｎatl． Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、８９、１１１０２〜１１１０５；Ｇimmi，Ｃ.Ｄ．等(１ ９９３)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０、６５８６〜６５９０；Ｂ oussiotis，Ｖ．等(１９９３)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７８、１７５３〜１７６ ３)。逆に言えば、Ｂ７陰性のマウス腫瘍細胞によるＢ７の発現は、腫瘍拒絶に 伴うＴ細胞媒介特異的免疫および腫瘍挑戦に対する長い永続的な保護を誘導する (Chen，Ｌ．等(１９９２)、Ｃell、７１、１０９３〜１１０２；Ｔownsend，Ｓ. Ｅ．およびＡllison，Ｊ.Ｐ．(１９９３)、Ｓcienco、２５９、３６８〜３７０ ；Ｂaskar，Ｓ．等(１９９３)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、９０、５ ６８７〜５６９０)。従って、Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を操作するとヒ トにおける免疫応答を刺激し、または抑制する大きい可能性を提供する。 発明の概要 本発明はＴ細胞活性化を共刺激する新規な分子をコードする単離された核酸に 関する。好ましい共刺激分子にはＢリンパ球、専門的な抗原提示細胞(例えば単 球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞)、および免疫細胞に抗原を提示し、ＣＴＬ Ａ４、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の両方、または他の既知のもしくは 未だ定義されていない免疫細胞上の受容体に結合する他の細胞(例えばケラチノ サイト、内皮細胞、神経膠星細胞、線維芽細胞、乏突起膠細胞)の表面上の抗原 を含む。そのような共剌激分子は、本明細書ではＣＴＬＡ４／ＣＤ２８結合性カ ウンターレセプターまたはＢリンパ球抗原と呼び、活性化されたＴ細胞に共刺激 を与え、それによってＴ細胞の増殖および／またはサイトカイン分泌を誘導する ことができる。好ましいＢリンパ球抗原には、Ｂ７−２およびＢ７−３、並びに ＣＴＬＡ４および/またはＣＤ２８を結合し、免疫細胞の共剌激を阻害し、また は誘導する能力を有するそれらの可溶性フラグメントまたは誘導体を含む。一態 様では、ヒトＢ７−２Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする単離 された核酸を提供する。好ましくはその核酸は、図８(配列番号１)に示す。ヒト Ｂ７−２をコードするヌクレオチド配列を有するcＤＮＡ分子である。他の態様 ではその核酸は、図１４(配列番号２２)に示す、ミュリン(murine)Ｂ７−２をコ ードするヌクレオチド配列を有するcＤＮＡ分子である。 本発明は、Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列、また は図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％、より好まし くは少なくとも約６０％、最も好ましくは少なくとも７０％の相同性であるペプ チドをコードする核酸に関する。Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２)に示す アミノ酸配列、または図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列と少なくとも約 ８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５ ％、最も好ましくは少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の相同性であ るペプチドをコードする核酸も本発明の範囲内にある。他の態様では、Ｂ７−２ 活性を有するペプチドは、図８(配列番号２)のアミノ酸配列を有するペプチド、 または図１４(配列番号２３)のアミノ酸を有するペプチドをコードする核酸に、 高または低ストリンジェンシィ条件下にハイブリダイズする核酸によりコードさ れる。 本発明はさらに、Ｂ７−２活性を有し、少なくとも２０のアミノ酸残基長を有 するペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸に関する。Ｂ７−２活 性を有し、長さで少なくとも４０のアミノ酸残基、少なくとも６０のアミノ酸残 基、少なくとも８０のアミノ酸残基、少なくとも１００のアミノ酸残基、または 少なくとも２００以上のアミノ酸残基よりなるペプチドも本発明の範囲内である 。 特に好ましい核酸は、Ｂ７−２活性を有し、少なくとも２０のアミノ酸残基また は以上の長さ、および図８(配列番号２)に示す配列と少なくとも５０％または以 上の相同性(好ましくは少なくとも７０％)を有するペプチドをコードする。 １つの好ましい態様では、本発明はＢ７−２活性を有し、および式： Ｘn−Ｙ−Ｚm によって表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたＤＮ Ａに関する。 式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５より本質 的になる。ＸnおよびＺmは、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列においてＹに 隣接するアミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基である。Ｘnは、図８(配列番 号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸から選択される、 すなわち、アミノ酸残基２３〜１から選択されるアミノ酸残基である。Ｚmは図 ８(配列番号２)に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸から 選択される、すなわち、アミノ酸残基２４６〜３２９から選択されるアミノ酸残 基である。式においてnは０〜２３の数であり(n＝０〜２３)、mは０〜８４の数 である(m＝０〜８４)。特に好ましいＤＮＡは、Ｙが図８(配列番号２)に示す配 列のアミノ酸残基２４〜２４５であり、n＝０、m＝０である、式Ｘn−Ｙ−Ｚmに より表わされるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。 本発明は、Ｂ７−２活性を有する第１のペプチドをコードするヌクレオチド配 列、および第１のペプチドの溶解性、結合親和性、安定性、価数を変化させる部 分に対応する第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、Ｂ７−２融 合タンパク質をコードする単離されたＤＮＡにも関する。好ましくは、Ｂ７−２ 活性を有する第１ペプチドは、Ｂ７−２タンパク質の細胞外ドメイン部分(例え ば図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基約２４〜２４５)を含み、第２ペ プチドは、免疫グロブリンの定常領域、例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領 域を含むヒトのＣγ１またはＣγ４ドメインであり、Ｂ７−２免疫グロブリン融 合タンパク質(Ｂ７−２Ｉg)を形成する(Ｃapon等(１９８９)、Ｎature、３３７ 、５２５〜５３１、およびＣapon，米国特許第５,１１６,９６４号参照)。 本発明により得られる核酸を様々な発現ベクターに挿入し、様々な宿主、特に 哺乳類および昆虫細胞培養などの真核生物細胞、およびＥ．Ｃoli等の原核生物 細胞中で対応するタンパク質またはペプチドを合成させる。本発明の範囲にある 発現ベクターは、本明細書に記載した新規なＢリンパ球抗原の活性を有する少な くとも１つのペプチドをコードする核酸、およびその核酸配列に作動可能に結合 したプロモータを含む。一態様において、発現ベクターは、Ｂ７−２抗原の活性 を有するペプチドをコードするＤＮＡ、および以前にキャラクタライズされたＢ ７活性化抗原(本明細書でＢ７−１と呼ぶ)等の他のＢリンパ球抗原の活性を有す るペプチドをコードするＤＮＡを含む。そのような発現ベクターは、宿主細胞を トランスフェクションし、それによって、本明細書に記載した核酸によりコード される、融合タンパク質を含むタンパク質またはペプチドを製造するのに使用で きる。 Ｂリンパ球抗原Ｂ７−２およびＢ７−３を発現するＢ細胞の存在についての生 物学的試料を分析するのに有用な核酸プローブも本発明の範囲にある。 本発明はさらに、Ｂ７−２およびＢ７−３タンパク質抗原を含む、新規なＢリ ンパ球抗原の活性を有する単離したペプチドに関する。Ｂ７−２活性を有する好 ましいペプチドは組換え発現によって作られ、図８(配列番号２)に示すアミノ酸 配列を含む。Ｂ７−２活性を有する他の好ましいペプチドは図１４(配列番号２ ３)に示すアミノ酸配列を含む。Ｂ７−２抗原の活性を有する特に好ましいペプ チドは、患者のＴ細胞媒介免疫応答を高め、または抑制するのに使用できる、細 胞外ドメイン部分(例えば配列番号２のアミノ酸残基約２４〜２４５)等の成熟形 のタンパク質の少なくとも一部分を含む。Ｂ７−２活性を有する他の好ましいペ プチドは次式により表わされるアミノ酸配列を有するペプチドを含む。 Ｘn−Ｙ−Ｚm 式中、Ｙは、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基５５〜６８、図８(配 列番号２)に示す配列のアミノ酸残基８１〜８９、図８(配列番号２)に示す配列 のアミノ酸残基１２８〜１４２、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１ ６０〜１６９、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１８８〜２００、図 ８(配列番号２)に示すアミノ酸残基２６９〜２８２よりなる群から選択されるア ミノ酸残基である。式中、ＸnおよびＺmは、アミド結合によりＹに結合した付加 的なアミノ酸残基であり、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列においてＹに隣 接するアミノ酸残基から選択される。Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列におい てＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸から選択されるアミノ酸残基である。Ｚm は図８(配列番号２)に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸 から選択されるアミノ酸残基である。式中、nは０〜３０の数であり(n＝０〜３ ０)、mは０〜３０の数である(m＝０〜３０)。 新規なＢリンパ球抗原(例えばＢ７−２、Ｂ７−３)の活性を有するペプチドを 含む融合タンパク質またはハイブリッド融合タンパク質にも関する。例えば、第 １ペプチドの溶解性、結合親和性、安定性および／または価数を変化させる、免 疫グロブリン定常領域等の第２ペプチドに融合した、新規なＢリンパ球抗原の細 胞外ドメイン部分を含む第１ペプチドを含む融合タンパク質を提供する。一態様 において、Ｃγ１またはＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に対応する配 列のアミノ酸残基を含む第２ペプチドに結合した、Ｂ７−２タンパク質の細胞外 ドメイン部分のアミノ酸残基を含む第１ペプチドを含んでなる融合タンパク質を 作り、Ｂ７−２Ｉｇ融合タンパク質を形成する。他の態様においては、Ｂ７−１ 抗原の細胞外ドメイン部分およびＢ７−２抗原の細胞外ドメイン部分を含む第１ ペプチド、およびＣγ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３に対応するアミノ酸残基 を含む第２ペプチドを含むハイブリッド融合タンパク質を作る(例えばＬinsley 等(１９９１)、Ｊ．Ｅxp．Ｍed．、１７８３、７２１〜７３０；Ｃapon等(１９ ８９)、Ｎature、３３７、５２５〜５３１；およびＣapon米国特許第５,１１６, ９６４号参照)。 本発明の単離されたペプチドおよび融合タンパク質は、１以上のＢリンパ球抗 原の発現を上方調節(upregulate)または阻害し、または１以上のＢリンパ球抗原 のＴ細胞等の免疫細胞上でのそれらの天然のリガンドへのライゲーションをブロ ックし、それによってインビボでの細胞媒介免疫応答を高め、または抑制するた めに、患者に投与できる。 本発明の他の態様は、新規Ｂリンパ球抗原のペプチドまたは本明細書に記載す る融合タンパク質に特異的に反応する抗体、好ましくはモノクロナール抗体を提 供する。好ましい抗体は、ハイブリドーマ細胞ＨＦ２.３Ｄ１、ＨＡ５.２Ｂ７お よびＨＡ３.１Ｆ９により製造される抗ヒトＢ７−２モノクロナール抗体である 。これらのハイブリドーマ細胞はＡＴＣＣ寄託番号 (ＨＦ２.３Ｄ１ )、ＡＴＣＣ寄託番号 (ＨＡ５.２Ｂ７)、およびＡＴＣＣ寄託番号 (ＨＡ３.１Ｆ９)でアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション に寄託されている。 本発明のさらなる要旨は、本発明の核酸、特にcＤＮＡを用いて、哺乳動物細 胞の免疫原性を高めることを含む。好ましい態様において哺乳類細胞は、肉腫、 リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、カルチノーマ等の腫瘍細胞、または マクロファージ等の抗原提示細胞であり、これらの細胞をトランスフェクション し、本発明の新規なＢリンパ球抗原活性を有するペプチドを、細胞表面上で発現 させる。Ｂ７−２抗原等のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドを発現するマ クロファージは、適当な病原体関連抗原または腫瘍抗原でパルス(pulse)された 場合、Ｔ細胞活性化および免疫剌激を高める、抗原提示細胞として用いることが できる。 哺乳動物細胞を、Ｂ７−２抗原等の新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプ チドをコードする核酸を含む適当な発現ベクターで半ビボ(ex vivo)でトランス フェクションし、次に宿主の哺乳動物に導入でき、あるいは細胞を遺伝子治療技 術によりその遺伝子でインビボでトランスフェクションできる。例えばＢ７−２ 活性を有するペプチドをコードする核酸を単独で、または他の共刺激性分子をコ ードする核酸と組み合わせてトランスフェクションできる。クラスＩまたはクラ スII ＭＨＣ分子を発現しない腫瘍の免疫原性を高める場合において、本明細書 に記載するＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする核酸でトランス フェクトされるべき哺乳動物細胞中に、適当なクラスＩまたはII遺伝子を付加的 にトランスフェクトすることは有益であるかもしれない。 本発明は、例えば本発明の新規なＢリンパ球抗原、例えばＢ７−２およびＢ７ −３のＴ細胞上でのそれらの天然のリガンドとの機能的な相互作用をブロックし 、それによってレセプターリガンド対を介して共剌激をブロックすることにより 、患者における一般的な免疫抑制および抗原特異的な寛容を誘導する方法をも提 供する。一態様においては、天然のヒトＢ７−２抗原の、その天然のリガンド( 例えばＣＴＬＡ４およびＣＤ２８)に対する相互作用をブロックするのに用いる ことのできる阻害性分子は、Ｂ７−２結合活性を有するが、免疫細胞を共剌激す る能力を有しない可溶性ペプチド、Ｂ７−２のそのリガンドへの結合をブロック し共刺激シグナルを伝達できない抗体(ブロッキング抗Ｂ７−２抗体等のいわゆ る「ブロッキング抗体」)、本発明の教示に従って製造できるＢ７−２−Ｉg融合タ ンパク質、並びにＣＴＬＡ４ＩgまたはＣＤ２８Ｉg等の可溶性形のＢ７−２レセ プターを含む。そのようなブロッキング剤は単独で、または他の共剌激性分子の それらの天然リガンドをブロックする薬剤(例えば抗Ｂ７抗体)と組み合わせて用 いることができる。本明細書に記載する方法によるＴ細胞応答の阻害およびＴ細 胞寛容の誘導は、移植拒絶(固体の器官、皮膚および骨髄)および移植片対宿主病 の予防、特に同種間骨髄移植において、予防的に有用であり得る。本発明の方法 は、自己免疫病、アレルギーおよびアレルギー反応、移植拒絶、および移植片対 宿主病の治療において、治療的にも有用であり得る。 本発明の他の要旨は、Ｂ７−２活性を有するペプチドおよびＢ７−２融合タン パク質等の可溶性の、多価形のＢ７−２タンパク質を含む、刺激性の形のＢ７− ２抗原を用いることによる共刺激性シグナルのＴ細胞への伝達により免疫応答を 上方調節する方法に関する。抗原と共に刺激性形のＢ７−２の運搬は、様々な病 原体に対する予防接種の効果を高めるのに予防的に有用であり、感染中の個別的 な病原体に対する、または腫瘍を有する宿主における腫瘍に対する免疫応答を上 方調節するのに治療的にも有用であり得る。 本発明は、Ｂリンパ球抗原、例えばＢ７−２、Ｂ７−３のそれらのレセプター との相互作用を阻害するか、またはそれらのレセプターを介しての細胞内信号伝 達を妨げることのできる分子を同定する方法にも関する。細胞上でのＢリンパ球 抗原の発現を調節できる分子を同定する方法をも提供する。更に新規なＢリンパ 球抗原によるＴ細胞の共刺激に応じて産生されるサイトカインを同定する方法も 本発明の範囲である。 図面の簡単な説明 図１Ａ〜Ｂは、媒地、抗ＣＤ３単独、または以下のモノクローナル抗体若しく は組換えタンパク質、αＢ７(１３３、抗Ｂ７−１);ＣＴＬＡ４Ｉg;ＦabαＣＤ ２８;コントロールＩg融合タンパク質(ＣＴＬＡ４Ｉgについてのアイソタイプコ ントロール);またはαＢ５(抗Ｂ５、抗Ｂ７−１についてのアイソタイプコント ロール)の存在下での抗ＣＤ−３中で培養された、Ｂ７(Ｂ７−１)でトランスフ ェクトされたＣＨＯ細胞(パネルａ)、または同系の(syngeneic)活性化Ｂリンパ 球(パネルｂ)により提供される共剌激に対する、3Ｈチミジン導入またはＩＬ− ２分泌により評価した、ＣＤ２８+Ｔ細胞の応答のグラフ表示である。 図２Ａ〜Ｃは表面免疫グロブリン(sＩg)架橋で活性化された脾Ｂ細胞上でのＢ ７−１の細胞表面発現のlog蛍光強度のグラフである。全(パネルａ)、Ｂ７−１ 陽性(Ｂ７−１+、パネルｂ)およびＢ７−１陰性(Ｂ７−１−、パネルｃ)活性化 Ｂ細胞を、抗Ｂ７−１モノクローナル抗体(１３３)およびフルオロセインイソチ オシアネート(ＦＩＴＣ)ラベルのヤギ抗マウス免疫グロブリンで染色し、フロー サイトメトリーで分析した。 図３Ａ〜Ｂは、媒地、抗ＣＤ３単独、または以下のモノクローナル抗体若しく は組換えタンパク質、αＢＢ−１(１３３、抗Ｂ７−１および抗Ｂ７−３);αＢ ７(抗Ｂ７−１);ＣＴＬＡ４Ｉg;ＦabαＣＤ２８;コントロールＩg融合タンパク 質またはαＢ５(抗Ｂ５)の存在下での抗ＣＤ３中で培養した、Ｂ７−１+(パネル a)またはＢ７−１-(パネルｂ)活性化同系のＢリンパ球により提供される共剌激 に対する、3Ｈ−チミジン導入およびＩＬ−２分泌により評価される、ＣＤ２８+ Ｔ細胞の応答のグラフ表示である。 図４は、分別したＢ７−１+およびＢ７−１-活性化Ｂリンパ球上でのＢ７−１ 、Ｂ７−３および全ＣＴＬＡ４カウンターレセプターの細胞表面発現のグラフ表 示である。 図５は、sＩg架橋により活性化された脾Ｂ細胞上でのＢ７−１(ＣＴＬＡ４Ｉg およびmＡbsＢＢ−１および１３３)、Ｂ７−３(ＣＴＬＡ４ＩgおよびmＡbＢＢ１ )およびＢ７−２(ＣＴＬＡ４Ｉg)カウンターレセプターの時間的な表面発現のグ ラフ表示である。 図６は、ＭＨＣクラスII架橋により活性化された脾Ｂ細胞上でのＢ７−１(Ｃ ＴＬＡ４ＩgおよびmＡbsＢＢ−１および１３３)、Ｂ７−３(ＣＴＬＡ４Ｉgおよ びmＡbＢＢ１)、およびＢ７２(ＣＴＬＡ４Ｉg)カウンターレセプターの時間的な 表面発現のグラフ表示である。 図７Ａ〜Ｂは、媒地、抗ＣＤ３単独、または次のモノクローナル抗体若しくは 組換えタンパク質、αＢ７(１３３、抗Ｂ７−１);αＢＢ１(抗Ｂ７−１、抗Ｂ７ −３);ＣＴＬＡ４Ｉg;ＦabαＣＤ２８;およびαＢ５(抗Ｂ５)の存在下での抗Ｃ Ｄ３中で培養された、２４時間(パネルａ)または４８時間(パネルｂ)、sＩg架橋 により活性化された同系のＢリンパ球により提供される剌激に対する、3Ｈ−チ ミジン導入およびＩＬ−２分泌により評価される、ＣＤ２８+Ｔ細胞の応答のグ ラフ表示である。 図８はヒトＢリンパ球抗原Ｂ７−２のヌクレオチド配列および推定されたアミ ノ酸配列である(hＢ７−２−クローン２９)。 図９は、コントロールmＡb(ＩgＭ)、抗Ｂ７−１(mＡbs１３３およびＢＢ−１) 、組換えタンパク質ＣＴＬＡ４Ｉg、またはアイソタイプのマッチしたコントロ ールＩgタンパク質に続く適当な第２のＦＩＴＣラベルの免疫グロブリンで染色 し、フローサイトメトリーで分析した、コントロールプラスミド(pＣＤＮＡＩ、 Ｂ７−１を発現するプラスミド(Ｂ７−１)、またはＢ７−２を発現するプラスミ ド(Ｂ７−２)でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞のグラフ表示である。 図１０Ａ〜Ｂは、刺激されない、および抗Ｉg活性化ヒト脾Ｂ細胞および細胞 系(パネルa)およびヒトミエローマ(パネルＢ)中のＢ７−２発現のＲＮＡブロッ ト分析を示す。 図１１は、ベクター単独またはＢ７−１またはＢ７−２の発現を指向するベク ターでトランスフェクトされたフォルボールミリスチン酸(ＰＭＡ)およびＣＯＳ 細胞でのサブミトジェニック(submitogenic)剌激に対する、3Ｈ−チミジン導入 またはＩＬ−２分泌により評価した、ＣＤ２８+Ｔ細胞の増殖のグラフ表示であ る。 図１２は、ベクター単独(ベクター)、またはＢ７−１(Ｂ７−１)若しくはＢ７ −２(Ｂ７−２)を発現するベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞、およ びＰＭＡによる刺激に対する、3Ｈ−チミジン導入およびＩＬ−２分泌により評 価した、ＣＤ２８+Ｔ細胞の増殖の組換えタンパク質およびmＡbsによる阻害のグ ラフ表示である。阻害の研究は、ＰＭＡ刺激ＣＯＳ細胞混合ＣＤ２８+Ｔ細胞へ の、抗体添加なし(no mＡＢ)、抗Ｂ７mＡb１３３(１３３)、抗Ｂ７mＡbＢＢ− １(ＢＢ１)、抗Ｂ５mＡb(Ｂ５)、抗ＣＤ２８のＦabフラグメント(ＣＤ２８Ｆab) 、ＣＴＬＡ４Ｉg(ＣＴＬＡ４Ｉg)、またはＩgコントロールタンパク質(コントロ ールＩg)の添加で行った。 図１３は、ヒトＢ７−２タンパク質(hＢ７−２)推定アミノ酸配列(配列番号２ )並びにヒトＢ７−１タンパク質(hＢ７−１)(配列番号２８および２９)およびミ ュリンＢ７−１タンパク質(mＢ７)(配列番号３０および３１)の両方のアミノ酸 配列間の配列相同性を示す。 図１４は、マウスＢ７−２抗原(mＢ７−２)のヌクレオチド配列および推定さ れるアミノ酸配列(配列番号２２および２３)である。 図１５は、Ｂ７ファミリー−Ｉg融合タンパク質による、固定化Ｂ７−２Ｉgに 対するビオチニル化ＣＴＬＡ４Ｉgの結合の競合的阻害のグラフ表示である。競 合物として調べたＩg融合タンパク質は、全長Ｂ７−２(hＢ７.２)、全長Ｂ７− １(hＢ７.１)、Ｂ７−２の可変領域様ドメイン(hＢ７.２Ｖ)、またはＢ７−２の 定常領域様ドメイン(hＢ７.２Ｃ)である。 図１６Ａ〜Ｂは、ラベルしないＢ７−１−Ｉg(パネルＡ)またはＢ７−２−Ｉg (パネルＢ)の濃度を増加させることによる、固定化ＣＴＬＡ４−Ｉgに対するビ オチニル化Ｂ７−１−Ｉg(パネルＡ)またはＢ７−２−Ｉg(パネルＢ)の結合の競 合的阻害のグラフ表示である。実験的に決定したＩＣ50値を、パネルの上右隅に 示す。 図１７は、抗hＢ７−２モノクローナル抗体、ＨＡ３.１Ｆ９で染色した細胞の フローサイトメトリープロファイルを示す。抗体で染色した細胞(３Ｔ３−ｈＢ ７.２)は、ヒトＢ７−２を発現するようトランスフェクトされたＣＨＯ細胞(Ｃ ＨＯ−hＢ７.２)、ヒトＢ７−２を発現するようトランスフェクトされたＮＩＨ ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−ｈＢ７.２)、およびコントロールのトランスフェクトされ たＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−ネオ)である。抗hＢ７.２抗体Ｂ７０を陽性コント ロールとして用いた。 図１８は、抗hＢ７−２モノクローナル抗体、ＨＡ５.２Ｂ７で染色した細胞の フローサイトメトリープロファイルを示す。その抗体で染色した細胞は、ヒトＢ ７−２を発現するようトランスフェクトしたＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−hＢ７.２)、ヒ トＢ７−２を発現するようトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−hＢ ７.２)、およびコントロールのトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３ ーネオ)である。抗hＢ７.２抗体Ｂ７０を陽性コントロールとして用いた。 図１９は、抗hＢ７−２モノクローナル抗体、ＨＦ２.３Ｄ１で染色した細胞の フローサイトメトリープロファイルを示す。該抗体で染色した細胞は、ヒトＢ７ −２を発現するようトランスフェクトしたＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−hＢ７.２)、ヒト Ｂ７−２を発現するようトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３−hＢ７ .２)、およびコントロールのトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(３Ｔ３− ネオ)である。抗hＢ７.２抗体Ｂ７０を陽性コントロールとして用いた。 図２０は、Ｂ７−１(Ｊ５５８−Ｂ７.１)またはＢ７−２(Ｊ５５８−Ｂ７.２) を発現するようトランスフェクトしたＪ５５８形質細胞腫細胞、またはＪ５５８ 形質細胞腫細胞の移植後のマウス中の腫瘍細胞の成長(腫瘍の大きさで測定)のグ ラフ表示である。 発明の詳細な記載 以前にキャラクタライズされたＢリンパ球活性化抗原Ｂ７(本明細書ではＢ７ −１と呼ぶ)の外に、ヒトＢリンパ球はＴ細胞活性化を共刺激する他の新規な分 子を発現する。これらの共刺激性分子は、Ｂリンパ球、専門的な抗原提示細胞( 例 えば単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞)、および免疫細胞に抗原を提示し、 ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８の両方、または他の既知のも しくは未だ定義されていない免疫細胞上の受容体に結合する他の細胞(例えば角 化細胞、内皮細胞、神経膠星細胞、線維芽細胞、乏突起膠細胞)の表面上の抗原 を含む。本発明の範囲内の共剌激性分子を本明細書では、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８ リガンド(カウンターレセプター)またはＢリンパ球抗原と呼ぶ。活性化されたＴ 細胞に共刺激を与えて、それにより、Ｔ細胞の増殖および／またはサイトカイン 分泌を誘導する新規なＢリンパ球抗原は、本明細書に記載し、キャラクタライズ するＢ７−２(ヒトおよびミュリン)およびＢ７−３抗原を含む。 Ｂリンパ球抗原Ｂ７−２は、抗免疫グロブリンまたは抗ＭＨＣクラスIIモノク ロナール抗体のいずれかによる剌激の後、約２４時間にヒトＢ細胞により発現さ れる。Ｂ７−２抗原は検出可能なＩＬ−２分泌およびＴ細胞増殖を誘導する。活 性化後約４８〜７２時間において、ヒトＢ細胞はＢ７−１、およびＢ７−１をも 結合する、モノクロナール抗体ＢＢ−１により同定された、第３のＣＴＬＡ４カ ウンターレセプター、Ｂ７−３の両方を発現する(Ｙokochi，Ｔ．等(１９８２) 、Ｊ．Ｉmmunol．、１２８、８２３〜８２７)。Ｂ７−３抗原は、Ｂ７−１陰性 の活性化されたＢ細胞上でも発現され、検出可能なＩＬ−２の産生なしにＴ細胞 増殖を共刺激し、このことはＢ７−１およびＢ７−３分子は別のものであること を示す。Ｂ７−３は活性化されたＢ細胞、活性化された単球、樹状細胞、ランゲ ルハンス細胞、および角化細胞を含む様々な細胞上で発現される。Ｂ細胞活性化 後７２時間において、Ｂ７−１およびＢ７−３の発現は衰え始める。活性化Ｂリ ンパ球表面上のこれらの共剌激性分子の存在は、Ｔ細胞共刺激がＢ細胞活性後こ れらの分子の一時的発現により部分的に制御されていることを示す。 従って、本発明の要旨の一つは、Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２、そのような核酸 のフラグメント、またはそれらの均等物等の新規な共刺激性分子をコードするヌ クレオチド配列を含む単離された核酸に関する。本明細書で用いる「核酸」という 語は、そのようなフラグメントまたは均等物を含むことを意図する。「均等物」と いう語は、新規なＢリンパ球抗原の活性(すなわち、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４およ び／またはＣＤ２８等の免疫細胞上のＢリンパ球抗原の天然のリガンドに結合し 、免疫細胞共刺激を阻害（例えばブロック）し、または刺激（例えば高める）す る能力)を有する、機能的に均等なＢリンパ球抗原、または機能的に均等なペプ チドをコードするヌクレオチド配列を含むことを意図する。そのような核酸は図 ８に示したヒトＢ７−２ヌクレオチド配列(配列番号１)および図１４に示したミ ュリンのＢ７−２ヌクレオチド配列(配列番号２２)の均等物と考えられ、本発明 の範囲内にある。 一態様において、核酸はＢ７−２ Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドを コードするcＤＮＡである。好ましくは核酸は、図８に示すヒトＢ７−２をコー ドするヌクレオチド配列(配列番号１)の少なくとも一部分、または図１４(配列 番号２)に示すミュリンＢ７−２をコードするヌクレオチド配列(配列番号２２) の少なくとも一部分よりなるcＤＮＡ分子である。図８(配列番号１)または図１ ４(配列番号)のcＤＮＡ分子の好ましい部分は分子のコーディング領域を含む。 他の態様においては本発明の核酸は、Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２) または図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。 好ましい核酸は、Ｂ７−２活性を有し、図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列と 少なくとも約５０％の相同性、より好ましくは少なくとも約６０％の相同性、お よび最も好ましくは少なくとも約７０％の相同性を有するペプチドをコードする 。Ｂ７−２活性を有し、図８に示す配列(配列番号２)と少なくとも約９０％、よ り好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％の 相同性を有するペプチドをコードする核酸も本発明の範囲内である。相同性とは Ｂ７−２等の新規なＢリンパ球抗原の活性を有する２つのペプチド間、または２ つの核酸分子間の配列類似性を言う。相同性は、比較の目的に一列に並べた各配 列中の位置を比較することにより決定できる。比較される配列中のある位置が同 じヌクレオチド塩基またはアミノ酸によって占められている場合には、それらの 分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度(パーセント)は配列によっ て共有された、マッチングした、または相同な位置の数の関数である。 本発明の他の態様は、図８に示すアミノ酸配列(配列番号２)のすべて、または 一部を有するペプチド、または図１４に示すアミノ酸配列(配列番号２３)のすべ てまたは一部を有するペプチドをコードする核酸に高または低ストリンジェンシ ィ条件下にハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーション を促進する適当なストリンジェンシィ条件、例えば約４５℃での６.０×塩化ナ トリウム／クエン酸ナトリウム(ＳＳＣ)、その後の５０℃での２.０×ＳＳＳ洗 浄)は当業者に知られており、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｍolecnlar Ｂiolog y、Ｊohn Ｗiley ＆ Ｓons、ニューヨーク(１９８９)、６.３.１〜６.３.６ に見出すことができる。例えば洗浄工程における塩濃度は、約２.０×ＳＳＣ(５ ０℃)という低ストリンジェンシィから約０.２×ＳＳＣ(５０℃)という高ストリ ンジェンシィまで選択できる。更に洗浄工程における温度は室温、約２２℃の低 ストリンジェンシィ条件から、約６５℃の高ストリンジェンシィ条件まで選択す ることができる。 新規なＢリンパ球抗原を有するペプチドをコードし、遺伝コードにおける縮重 のため、図８(配列番号１)または図１４(配列番号２２)に示すヌクレオチド配列 と異なる配列を有する単離された核酸も本発明の範囲内にある。そのような核酸 は機能的に均等なペプチド(例えばＢ７−２活性を有するペプチド)をコードする が、遺伝コードにおける縮重のため、図８または図１４の配列とは配列が相異す る。例えば多くのアミノ酸は１以上のトリプレットにより指定される。同じアミ ノ酸を示すコドン、すなわち同義語(例えばＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに ついての同義語である)は、遺伝コードにおける縮重のため生じる。一例として 、Ｂ７−２のヌクレオチド配列内部のＤＮＡ配列多形性（特にコドンの３番目の コドン内部の）はコードされたアミノ酸に影響しないＤＮＡ配列における「サイ レント」な変異を生じるかも知れない。しかしながら、Ｂ７−２抗原のアミノ酸 配列の変化を生じるＤＮＡ配列多形性が集団内部に存在するであろうことが予期 される。新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする核酸の１以 上のヌクレオチドにおけるこれらの変異（ヌクレオチドの約３〜４％までの）が 、天然のアレル変異のため集団内部の個々のものの間に存在し得ることは当業者 に 認識されるであろう。どのような、そしてすべてのそのようなヌクレオチド変異 体およびその結果生じるアミノ酸多形体も本発明の範囲である。さらに、本明細 書に記載する新規なＢリンパ球抗原の１以上のアイソ型、または関連する交差反 応性(cross−reacting)ファミリーのメンバーも存在し得る。そのようなアイソ 型またはファミリーメンバーは、Ｂリンパ球抗原(例えばＢ７−２抗原)に機能お よびアミノ酸配列において関連するが、異なる場所の遺伝子によるコードされた タンパク質と定義する。 新規なＢリンパ球抗原をコードする核酸の「フラグメント」は、Ｂリンパ球抗原 の全アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列より少ないヌクレオチドを有し 、Ｂリンパ球抗原の活性(すなわち、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４および／またはＣＤ ２８等の、免疫細胞上のＢリンパ球抗原の天然リガンドへ結合し、免疫細胞共剌 激を刺激するか阻害する能力)を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列 と定義する。従って、Ｂ７−２活性を有するペプチドは、ＣＴＬＡ４および／ま たはＣＤ２８を結合し、例えば一次活性化シグナルを受け取ったＴ細胞によるサ イトカイン分泌産生および／またはＴ細胞増殖により実証されるような、Ｔ細胞 媒介免疫応答を刺激し、または阻害する。一態様においては、該核酸フラグメン トは、ＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８に結合する抗原の能力を保持し、共剌 激性シグナルをＴリンパ球に運ぶＢ７−２抗原のペプチドをコードする。他の態 様では、該核酸フラグメントはヒトＢ７−２抗原の細胞外部分(例えば図８(配列 番号２)に示される配列のアミノ酸残基約２４〜２４５)を含み、ＣＴＬＡ４およ び／またはＣＤ２８を結合し、一価形では共刺激を阻害し、または多価形では共 刺激を誘導し、もしくは高めるのに用いることができるペプチドをコードする。 好ましい核酸フラグメントは、長さで少なくとも２０のアミノ酸残基、好まし くは少なくとも４０のアミノ酸残基、そしてより好ましくは少なくとも６０のア ミノ酸残基よりなるペプチドをコードする。長さで少なくとも８０のアミノ酸残 基、少なくとも１００のアミノ酸残基、および少なくとも２００またはそれ以上 のアミノ酸残基よりなるペプチドをコードする核酸フラグメントも本発明の範囲 内である。特に好ましい核酸フラグメントは、式： Ｘn−Ｙ−Ｚm によって表わされるアミノ酸配列と、ヒトＢ７−２活性を有するペプチドをコー ドする。式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５を 含んでなり、ＸnおよびＺmはアミド結合によりＹに結合した更なるアミノ酸残基 である。ＸnおよびＺmは図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列中のＹに隣接する アミノ酸残基から選択される。式中、Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列におい てＹのアミノ末端に隣接するアミノ酸、すなわちアミノ酸残基２３〜１から選択 されるアミノ酸残基である。Ｚmは図８(配列番号２)に示す配列のＹのカルボキ シ末端に隣接するアミノ酸、すなわちアミノ酸残基２４６〜３２９から選択され るアミノ酸残基である。更に、式中、nは０〜２３の数であり(n＝０〜２３)、m は０〜８４の数である(m＝０〜８４)。特に好ましいペプチドは、n＝０、m＝０ である上記の式Ｘn−Ｙ−Ｚmにより表わされるアミノ酸配列を有する。 本発明の範囲内の核酸フラグメントは、本明細書に記載したＢリンパ球と交差 反応性(cross−reacting)の新規タンパク質を検出するためスクリーニングプロ トコールにおいて使用するための、他の動物種からの核酸とハイブリダイズする ことができるものを含む。これら、および他のフラグメントは以下に詳細に記載 する。一般にＢリンパ球抗原のフラグメントをコードする核酸は、成熟タンパク 質をコードする塩基から選択するが、いくつかの場合には、ヌクレオチド配列の リーダー配列または非コード部分からのフラグメントのすべて、または部分を選 択するのが好ましい。本発明の範囲内の核酸は、リンカー配列、修飾された制限 エンドヌクレアーゼ部位、および分子クローニング、組換えタンパク質の発現ま たは構成に有用な他の配列、またはそれらのフラグメントをも含み得る。核酸配 列のこれら、および他の修飾は以下に詳細に記載する。 Ｂ７−２抗原のような新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコード する核酸は、活性化されたＢリンパ球に存在するmＲＮＡから得ることができる 。Ｂリンパ球抗原をコードする核酸配列をＢ細胞ゲノムＤＮＡから得ることも可 能であろう。例えば、Ｂ７−２抗原をコードする遺伝子を、本明細書に記載する プロトコールに従ってcＤＮＡまたはゲノムライブラリーからクローンできる。 Ｂ ７−２抗原をコードするcＤＮＡは適当な細胞系からの全mＲＮＡを単離すること により得ることができる。次に、２本鎖cＤＮＡを全mＲＮＡから調製できる。次 に、多くの公知の技術のいずれか一つを用いてそのcＤＮＡを適当なプラスミド またはウイルス(例えばバクテリオファージ)ベクターに挿入できる。新規なＢリ ンパ球抗原をコードする遺伝子は、本発明により提供されるヌクレオチド配列情 報に従い、確立されたポリメラーゼチエインリアクション技術を用いてクローン することもできる。本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。好ましい核 酸は、図８(配列番号１)に示す配列を有するヒトＢ７−２抗原をコードするcＤ ＮＡである。他の好ましい核酸は図１４(配列番号２２)に示す配列を有するミュ リンＢ７−２抗原をコードするcＤＮＡである。 本発明は更に、少なくとも１つの制御配列に作動可能に結合した、本明細書に 記載の新規Ｂリンパ球抗原の活性を有する少なくとも１つのペプチドをコードす る核酸を含む発現ベクターに関する。「作動可能に結合した」とは、該核酸配列が 、その発現を可能にするような方法で制御配列に結合されている(例えばシスま たはトランスで)ことを意味することを意図する。制御配列は当業界で知られて おり、適当な宿主細胞中での所望のタンパク質の発現を指示するよう選択する。 従って、制御配列という語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節 因子を含む。そのような制御配列は当業者に知られており、Goeddel、Gene Exp ression Technology、Ｍethods in Ｅnzymology、Ａcademic Ｐress、サン ディエゴ、カリフォルニア(１９９０)に記載されている。発現ベクターのデサイ ンは、トランスフェクトされる宿主の選択、および／または発現されるよう望ま れるタンパク質のタイプに依存することが理解されるべきである。一態様におい ては発現ベクターは、細胞外ドメイン部分等のＢ７−２タンパク質の少なくとも 一部をコードする核酸を含む。他の態様では、発現ベクターは、Ｂ７−２抗原の 活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、およびＢ７−１等の他のＢリンパ球 抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを含む。ヒトＢ７−１およびマ ウスＢ７−１抗原をコードするcＤＮＡは配列番号２８および配列番号３０にそ れぞれ示される。これらの抗原の推論されたアミノ酸配列は、配列番号２９およ び配列番号３１にそれぞれ示される。そのような発現を用いて、細胞をトランス フェクトし、それによって、本明細書に記載した核酸配列によりコードされる融 合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチドを製造すること ができる。これ等および他の態様は本明細書に更に詳細に記載する。 本発明は、新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドを製造する方法にも 関する。例えばＢ７−２タンパク質の活性を有するペプチドをコードするヌクレ オチド配列の発現を指向する核酸ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を 適当な条件下に培地中で培養し、ペプチドを発現させることができる。更に、Ｂ ７−２の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ、および第２のＢリンパ球抗 原(例えばＢ７−１、Ｂ７−３)の活性を有するペプチド等の他のペプチドをコー ドするＤＮＡを含む１以上の発現ベクターを用いて宿主細胞をトランスフェクト し、これらのペプチドを共発現させるか、または融合タンパク質またはペプチド を製造できる。一態様では、Ｂ７−２融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む 組換え発現ベクターを製造できる。Ｂ７−２融合タンパク質は、Ｂ７−２活性を 有する第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第１のペプチドの 溶解性、親和性、安定性または価数を変化させる部分に対応する第２のペプチド 、例えば免疫グロブリン定常領域、をコードするヌクレオチド配列の組換え発現 により製造できる。好ましくは第１のペプチドは、ヒトＢ７−２抗原の細胞外ド メインの部分(例えば図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基約２４〜２４ ５)よりなる。第２のペプチドは、免疫グロブリン定常領域、例えばヒトＣγ１ ドメインまたはＣγ４ドメイン(例えばヒトＩgＣγ１またはヒトＩgＣγ４のヒ ンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、Ｃapon等の米国特許第５,１１６,９６４号参照 、同特許は本明細書の一部を構成する)を含む。生じるＢ７−２Ｉg融合タンパク 質は、変化したＢ７−２の溶解性、結合親和性、安定性、および／または価数( すなわち分子あたり利用できる結合部位の数)を有し得、タンパク質精製の効率 を増加させ得る。組換え技術により製造された融合タンパク質およびペプチドは 分泌され、細胞および該タンパク質またはペプチドを含む培地の混合物から単離 し得る。あるいは、タンパク質またはペプチドは細胞質に保持され、細胞を収穫 し、溶菌 し、タンパク質を単離し得る。細胞培養は典型的には、宿主細胞、培地、および 他の副生物を含む。細胞培養用の適当な培地は当該技術分野で周知である。タン パク質およびペプチドは、当該技術分野で知られたタンパク質およびペプチド精 製技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞、または両者から単離できる。宿主細 胞をトランスフェクトし、タンパク質およびペプチドを精製する技術は本明細書 に更に詳細に記載する。 特に好ましいヒトＢ７−２Ｉg融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域に 結合したヒトＢ７−２の細胞外ドメイン部分または可変領域様ドメインを含む。 免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリン構造に固有なエフェクター活性を減 少させ、または失くす遺伝的修飾を含んでもよい。例えば、ヒトＢ７−２(hＢ７ −２)の細胞外部分をコードするＤＮＡも、ヒトＢ７−２の可変領域様ドメイン( hＢ７.２Ｖ)またはヒトＢ７−２の定単領域様ドメインをコードするＤＮＡも、 部位指定突然変異誘発により修飾されたヒトＩgＣγ１および／またはＩgＣγ４ のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードするＤＮＡに結合され得る。これら の融合タンパク質の製造およびキャクタリゼーションは実施例７に詳細に記載す る。 細胞の表面に１以上のＢリンパ球抗原(例えばＢ７−２、Ｂ７−３)の活性を有 するペプチドを発現するトランスフェクトされた細胞も、本発明の範囲内である 。一態様においては、ＣＯＳ細胞等の宿主細胞が、細胞の表面でのＢ７−２活性 を有するペプチドの発現を指向する発現ベクターでトランスフェクトされる。そ のようなトランスフェクトされた宿主細胞は、Ｂ７−２をＴ細胞上でそのカウン ターレセプターに結合することを阻害し、あるいはＢ７−２相互作用に応答する Ｔ細胞への共剌激の分子内信号伝達を妨げる分子を同定する方法に使用できる。 他の態様では、肉腫、黒色腫、白血病、リンパ腫、カルチノーマまたは神経芽細 胞腫等の腫瘍細胞を、腫瘍細胞表面上での新規なＢリンパ球抗原の活性を有する 少なくとも１つのペプチドの発現を指向する発現ベクターでトランスフェクトす る。ある場合には、腫瘍細胞をトランスフェクトし、主要組織適合遺伝子複合体 (ＭＨＣ)タンパク質、例えばＭＨＣクラスIIαおよびβ鎖タンパク質またはＭＨ ＣクラスＩα鎖タンパク質、および必要ならβ２ミクログロブリンタンパク質を 共 発現させることも有益である。そのようなトランスフェクトされた腫瘍細胞を用 いて患者における腫瘍免疫性を誘導することができる。これらのおよび他の態様 は本明細書に更に詳細に記載する。 本発明の核酸配列は標準的な技術を用いて化学的に合成することもできる。ポ リデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法は、ペプチド合成と同様 に、商業的に利用できるＤＮＡ合成機において完全に自動化された固相合成を含 め、知られている(Ｉtakura等、米国特許第４,５９８,０４９号;Ｃaruthers等、 同第４,４５８,０６６号;およびＩtakura等同４,４０１,７９６号および第４,３ ７３,０７１号参照、これらの特許は本明細書の一部を構成する。)。 本発明の他の要旨は、新規なＢリンパ球抗原(例えばＢ７−２、Ｂ７−３)の活 性を有する単離されたペプチドに関する。Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチ ドは、図８(配列番号２)に示すヒトＢ７−２配列、または図１４(配列番号２２) に示すミュリンＢ７−２配列等のＢリンパ球抗原とはアミノ酸配列は異なっても よいが、そのような相異はＢリンパ球抗原と同じ、または類似の方法で機能し、 またはＢリンパ球抗原と同じまたは類似の特徴を有するペプチドを生じる。例え ばＢ７−２タンパク質の活性を有するペプチドは、Ｔ細胞上のＣＬＴＡ４および ／またはＣＤ２８等の、免疫細胞上のＢ７−２タンパク質の天然のリガンドに結 合し、免疫細胞共剌激を剌激し、または阻害する能力を有するペプチドと本明細 書において定義する。従ってＢ７−２活性を有するペプチドはＣＴＬＡ４および ／またはＣＤ２８に結合し、Ｔ細胞媒介免疫応答を剌激し、または阻害する(例 えば１次活性化シグナルを受けたＴ細胞によるサイトカイン産生および／または 増殖により証拠づけられる)。１態様はＢ７−２結合活性を有するが、共刺激シ グナルをＴ細胞に伝達する能力を欠いたペプチドを提供する。そのようなペプチ ドは患者におけるＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分泌を阻害しまたはブ ロックするのに用いることができる。或いは、Ｂ７−２結合活性およびＴ細胞に 共刺激シグナルを伝達する能力の両方を有するペプチドは患者におけるＴ細胞増 殖および／またはサイトカイン分泌を剌激し、または高めるのに用いる。これら の、および他の機能的に均等なペプチドを産生するＢ７−２タンパク質の様々な 修飾は本明細書に詳細に記載する。本明細書で用いる「ペプチド」の語は、ペプチ ド、タンパク質、およびポリペプチドを言う。 Ｂ７−２の機能(すなわちＣＴＬＡ４および／またはＣＤ２８に結合し、およ び／またはＴ細胞共刺激を剌激し、または阻害するＢ７−２の能力)に直接関与 しないアミノ酸残基の置換、付加、または削除などの、図８(配列番号２)に示す ヒトＢ７−２タンパク質、または図１４(配列番号２３)に示すミュリンＢ７−２ タンパク質のアミノ酸配列の修飾によりペプチドを製造できる。本発明のペプチ ドは、典型的には長さで少なくとも２０のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも ４０のアミノ酸残基、最も好ましくは６０のアミノ酸残基である。Ｂ７−２の活 性を有し、長さで少なくとも８０のアミノ酸残基、少なくとも１００のアミノ酸 残基、または少なくとも２００またはそれ以上のアミノ酸残基を有するペプチド も本発明の範囲にある。好ましいペプチドは、ヒトＢ７−２抗原の細胞外ドメイ ン部分(例えば図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基約２４〜２４５)を含 む。他の好ましい配列は、式： Ｘn−Ｙ−Ｚm (式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基５５〜６８、図(配列番 号２)を示す配列のアミノ酸残基８１〜８９、図８(配列番号２)に示す配列のア ミノ酸残基１２８〜１４２、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１６０ 〜１６９、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１８８〜２００、および 図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２６９〜２８２よりなる群から選択 されるアミノ酸残基である。) によって示されるアミノ酸配列を有する。該式中、ＸnおよびＺmはアミド結合に よりＹに結合した付加的なアミノ酸残基である。ＸnおよびＺmは、図８(配列番 号２)に示すアミノ酸配列においてＹに隣接するアミノ酸より選択されるアミノ 酸残基である。Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣 接するアミノ酸から選択されるアミノ酸残基である。Ｚmは、図８(配列番号２) に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸から選択されるアミ ノ酸残基である。式中、nは０〜３０の数であり(n＝０〜３０)、mは０〜３０の 数である(m＝０〜３０)。特に好ましいペプチドは、n＝０、およびm＝０である 、式Ｘn−Ｙ−Ｚmによって表されるアミノ酸配列を有する。 本発明の他の態様は、Ｂ７−２またはＢ７−３等の新規なＢリンパ球抗原の活 性を有するペプチドの実質的に純粋な製造物を提供する。そのような製造物は、 該ペプチドが細胞中に天然に共にあり、または細胞により分泌された場合天然に 共にあるタンパク質およびペプチドを実質的に含まない。 本明細書を通じて用いる「単離された」の語は、組換えＤＮＡ技術により製造 される場合には細胞物質または培養培地、化学的に合成させた場合には化学的な 前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、Ｂ７−２等の新規なＢリンパ球 抗原の活性を有する核酸、タンパク質、またはペプチドを言う。単離された核酸 は、該核酸が由来する生物において天然に該核酸の側面にある配列(すなわち該 核酸の５'および３'末端に位置する配列)をも含まない。 本発明のこれらの、および他の要旨は以下に詳細に記載する。Ｉ．細胞株からの核酸の単離 新規なＢリンパ球の活性を有するペプチドをコードする核酸を単離するのに用 いる適当な細胞は、Ｂリンパ球抗原(例えばＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３)をコ ードするmＲＮＡを産生し、そのmＲＮＡを対応するタンパク質にほぼ翻訳するこ とのできる細胞を含む。mＲＮＡの１つの源は、静止、または抗免疫グロブリン 抗体若しくは抗ＭＨＣクラスII抗体により活性化された、或いは腫瘍性のＢ細胞 のサブセットからの通常のヒト脾Ｂ細胞である。ヒトＢ７−２抗原の発現は、静 止Ｂ細胞において、および活性化Ｂ細胞において検出可能であり、mＲＮＡレベ ルは刺激後、静止レベルから４倍増加する。全細胞のＲＮＡは、標準的な技術を 用いて、静止またはこれ等の間隔の間に活性化されたＢ細胞から得ることができ 、cＤＮＡライブラリーの構築に用いることができる。 更に、腫瘍性Ｂ細胞の様々なサブセットはＢ７−２およびＢ７−３を発現し、 cＤＮＡライブラリー構築のためのmＲＮＡ源として代わりに役立つ。例えば非ホ ジキンスリンパ腫を有する患者から単離された腫瘍細胞はＢ７−１mＲＮＡを発 現する。結節性(nodular)の、あまり分化していないリンパ腫(ＮＰＤＬ)からの Ｂ細胞は、大きい細胞リンパ腫(ＬＣＬ)を拡散させ、バーキットリンパ腫細胞系 もヒトＢ７−１mＲＮＡ、および恐らくＢ７−２およびＢ７−３mＲＮＡの適当な 供給源であろう。ミエローマはＢ７−２を一般に発現するが、Ｂ７−１mＲＮＡ を発現しないので、Ｂ７−２mＲＮＡの供給源を提供する。バーキットリンパ腫 細胞系ＲajiはＢリンパ球抗原mＲＮＡの一つの供給源である。好ましくはＢ７− ２mＲＮＡは静止および活性化した正常なヒトＢ細胞の両者の集団から得る。活 性化Ｂ細胞は、例えば抗免疫グロブリン抗体、または抗ＭＣＨクラスII抗体を用 い広い範囲の時間(例えば分から日)にわたる刺激により得られる。II．mＲＮＡの単離およびcＤＮＡライブラリーの構築 全細胞mＲＮＡは、様々な技術により、例えばChirgwin等、Ｂiochemistry、１ ８ 、５２９４〜５２９９(１９７９)のグアニジニウム−チオシアネート抽出方法 を用いることにより、単離できる。この方法によれば、Ｐoly(Ａ＋)mＲＮＡを、 オリゴ(dＴ)セルロース選択を用いて、cＤＮＡライブラリー構築における使用の ため調製し、精製する。cＤＮＡをオリゴ(dＴ)プライミングおよび逆転写酵素を 用いて、poly(Ａ＋)ＲＮＡから次に合成する。Ｍoloney ＭＬＶ逆転写酵素(Ｇi bco／ＢＲＬ、ベセスダ、メリーランドから入手できる)、またはＡＭＶ逆転写酵 素(Ｓeikagaku Ａmerica,Ｉnc．，セントピーターズバーグ、フロリダから入手 できる)を好ましくは用いる。 逆転写の後、mＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子を通常の技術を用いて２本鎖 ＤＮＡに変換し、適当なベクター中に導入する。ここでの実験は２本鎖cＤＮＡ への変換にはＥ．coli ＤＮＡポリメラーゼＩおよびリボヌクレアーゼＨを用い る。 cＤＮＡのクローニングは、２本鎖ＤＮＡを適当なベクターと結合するための 従来の技術のいずれかを用いて行うことができる。合成アタプターを用いること が特に好ましい。何故ならそれはクローニング前の制限酵素によるcＤＮＡの解 裂の可能性を緩和するからである。この方法を用い非自己相補体の、カイネース (kinased)したアダプターを、ベクタとのライゲーション前にＤＮＡに付加する 。実際上どのようなアダプタも使用し得る。以下の実施例により詳細に示すよう に、 非自己相補性のＢstＸＩアダプターを、ＢstＸＩ消化によりクローニングのため 調製したpＣＤＭ８ベクタ中へのライゲーションのために、クローニング用のcＤ ＮＡに好ましくは付加する。 真核生物cＤＮＡは、適当な真核細胞プロモーター、複製起点、およびエンハ ンサー、スプライスアクセプターおよび／またはドナー配列、並びにポリアデニ ル化シグナルを含む他の要素を提供するベクター中にセンスオリエンテーション で配置した場合に発現され得る。本発明のcＤＮＡを、原核生物プロモーター、 Ｅ．coli中で機能する複製起点、ＣＯＳ細胞中で増殖を可能にするＳＶ４０複製 起点、およびcＤＮＡ挿入部位を有する適当なベクター中に位置させる。適当な ベクターは、πＨ３(ＳeedおよびＡruffo、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．、８４ 、３３６５〜３３６９(１９８７)),πＨ３m(ＡruffoおよびＳeed、Ｐroc．Ｎatl ．Ａcad．Ｓci ．、８４、８５７３〜８５７７(１９８７))、pＣＤＭ７およびpＣ ＤＭ８(Ｓeed、Ｎature、３２９、８４０〜８４１(１９８７))を含み、pＣＤＭ ８ベクターが特に好ましい(Ｉnvitrogen、サンディエゴ、カリフォルニアより入 手できる)。III．宿主細胞のトランスフェクションおよび新規なＢリンパ球活性化抗原のス クリーニング かく調製したcＤＮＡライブラリーを用いて、発現クローニング技術により問 題の遺伝子をクローンする。基本的な発現クローニング技術は、ＳeedおよびＡr uffo、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８４、３３６５〜３３６９(１９８ ７)、およびＡruffoおよびSeed、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ、８４、 ８５７３〜８５７７(１９８７)に記載されているが、この技術の改変は必要であ り得る。 １態様によれば、プラスミドＤＮＡを公知のトランスフェクション技術(例え ばＤＥＡＥ−デキストラン)を用いて、サルのＣＯＳ細胞株(Ｇluzman、Cell)、２３ 、１７５(１９８１))に導入し、cＤＮＡ挿入物を複製し、発現させる。Ｂ７ −１抗原を発現するトランスフェクタントを、抗Ｂ７−１モノクローナル抗体( 例えば１３３およびＢ１．１)および抗ミュリンＩgＧおよびＩgＭでコートした イ ムノマグネチックビーズでディプリート(deplete)させる。ヒトＢ７−２抗原を 発現するトランスフェクタントを、そのトランスフェクタントを融合タンパク質 ＣＴＬＡ４ＩgおよびＣＤ２８Ｉgと反応させ、次いで抗ヒトIg抗体でコートした プレートでパニングすることにより、陽性選択できる。ヒトＣＴＬＡ４Ｉgおよ びＣＤ２８Ｉg融合タンパク質を用いたが、Ｂ７−１および例えばマウスＢ７− １間でクロススピシーズ(cross speciles)反応性があるとすれば、他の交叉反 応性種と反応性の他の融合タンパク質も使用できるであろうことが期待できる。 パニング(panning)後、エピソームＤＮＡをパン化された(panned)細胞から回収 し、コンピテントな細菌宿主、好ましくはＥ．coli．にトランスフォームする。 プラスミドＤＮＡを次にＣＯＳ細胞に再導入し、発現およびパニングのサイクル を少なくとも２回繰返す。最終サイクルの後、プラスミドＤＮＡを個々のコロニ ーから調製し、ＣＯＳ細胞にトラスフェクトし、例えばＣＴＬＡ４ＩgおよびＣ Ｄ２８Ｉgを用いる間接免疫蛍光法により新規なＢリンパ球抗原の発現について 分析する。IV．新規なＢリンパ球抗原の配列決定 ＣＤＬＡ４ＩgおよびＣＤ２８Ｉgと強い反応性のこれらのコロニーからプラス ミドを調製する。これらのプラスミドを次に配列決定する。約１.０kb以上のＤ ＮＡのトラクトを配列決定するのに適した従来の配列決定技術のいずれも使用で きる。 実施例４に記載したように、９８７ヌクレオチドよりなるシングルの長いオー プンリーディングフレームおよび３'非コード配列の約２７ヌクレオチドを有す る１,１２０塩基対挿入物を有するヒトＢ７−２クローン(クローン２９)が得ら れた(図８、配列番号１)。タンパク質のオープンリーディングフレームによりコ ードされる予想されるアミノ酸配列を図８のヌクレオチド配列の下に示す。コー ドされたＢ７−２タンパク質は長さで３２９のアミノ酸残基であると予想される (配列番号２)。このタンパク質配列は、他のタイプＩ Ｉgスーパーファミリー 膜タンパク質に共通の多くの特徴を示す。タンパク質翻訳は、コンセンサス真核 生物翻訳開始部位を有する領域におけるＤＮＡ相同性に基づいてメチオニンコド ン(ＡＴＧ、ヌクレオチド１０７〜１０９)で始まると予言される(Ｋozak,Ｍ.(19 87)、Ｎucl．Ａcids Ｒes、１５、８１２５〜８１４８参照)。Ｂ７−２タンパ ク質のアミノ末端(アミノ酸１〜２３)は、位置２３および２４におけるアラニン 間の予想される解裂による分泌シグナルペプチドの特徴を有する(von Ｈeijne( ９８７)、Ｎucl．Ａcids Ｒes．、１４、４６８３)。この部位でのプロセシン グは、約３４kＤaの非修飾分子量を有する３０６アミノ酸のＢ７−２膜結合タン パク質を生じる。このタンパク質は、アミノ酸残基約２４〜２４５よりなるほぼ 細胞外ＩgスーパーファミリーＶおよびＣ様ドメイン、アミノ酸残基約２４６〜 ２６８よりなる疎水性の膜貫通ドメイン、およびアミノ酸残基約２６９〜３２９ よりなる長い細胞質ドメインよりなる。Ｉgスーパーファミリーに対する相同性 は位置４０〜１１０および１５７〜２１８におけるシステインにより結合された 細胞外領域における２つの隣接するＩg様ドメインによる。細胞外ドメインは８ つの可能性のあるＮ−結合グリコシル化部位をも有し、Ｂ７−１と同様に多分グ リコシル化される。ヒトＢ７−２タンパク質のグリコシル化は約５０〜７０kＤa へ分子量を増加させ得る。ヒトＢ７−２の細胞質ドメインは、Ｂ７−１より幾分 長いが、抗原提示細胞(ＡＰＣ)内部で信号伝達または制御ドメインとして多分作 用する多数のシステイン、それに続く正に荷電したアミノ酸よりなる一般的な領 域を含む。ヒトＢ７−２のヌクレオチドおよびアミノ配列の両方の、ＧenＢank およびＥＭＢＬデータベースとの比較は、ヒトＢ７−１とのかなりな相同性(約 ２６％のアミノ配列の同一性)を示した。ヒトＢ７−１、ヒトＢ７−２およびミ ュリンＢ７−１はすべてヒトＣＴＬＡ４およびＣＤ２８に結合するので、相同性 のアミノ酸はＣＴＬＡ４またはＣＤ２８結合配列を含むのに必要なアミノ酸を多 分示す。ヒトＢ７−２をコードするcＤＮＡ挿入物を有するベクターでトランス フェクトされたＥ．coli(クローン２９)は、１９９３年７月２６日に、受託番号 第６９３５７号としてアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(ＡＴＣ Ｃ)に寄託された。Ｖ．他の哺乳動物種からの新規なＢリンパ球抗原のクローニング 本発明はヒト核酸分子に限定されず、Ｂリンパ球抗原を発現する他の哺乳動物 種からの新規なＢリンパ球抗原ホモローグが、以下に記載する技術を用いてクロ ーンされ配列決定されることを意図する。クロススピーシーズ反応性を示す、１ つの種(例えばヒト)について単離されたＢリンパ球抗原を用いて、他の種(例え ばマウス)におけるＴ細胞媒介免疫応答を修飾し得る。他の種からのcＤＮＡクロ ーンの単離はハイブリダイゼーションプローブとして、ヒトＢ７−２cＤＮＡ等 のヒトcＤＮＡ挿入物を用いて行うこともできる。 実施例６に示すように、９２７のヌクレオチドよりなるシングルの長いオープ ンリーディングフレーム、および３'非コード配列の約１２６ヌクレオチドを有 する１,１６３の塩基対よりなる挿入物を含むミュリンＢ７−２クローン(mＢ７ −２、クローン４)を得た(図１４、配列番号２２)。タンパク質のオープンリー ディングフレームによりコードされる予想されるアミノ酸配列を、図１４のヌク レオチド配列の下に示す。コードされるミュリンＢ７−２タンパク質は、長さで ３０９アミノ酸残基であると予想される(配列番号２３)。このタンパク質は他の タイプＩ Ｉgスーパーファミリー膜タンパク質に共通な多くの特徴を有する。 タンパク質翻訳は、コンセンサス真核生物翻訳開始部位を有する領域におけるＤ ＮＡ相同性に基づいて、メチオニンコドン(ＡＴＧ、ヌクレオチド１１１〜１１ ３)で開始すると予想される(Ｋozak,Ｍ(１９８７)、Ｎucl．Ａcids Ｒes、１５ 、８１２５〜８１４８を参照)。ミュリンＢ７−２タンパク質のアミノ末端(アミ ノ酸１〜２３)は、位置２３のアラニンおよび位置２４のバリン間の予想される 解裂を有する分泌シグナルペプチドの特徴を有する(von Ｈeijne(１９８７)、Ｎucl．Ａcids．Ｒes ．、１４、４６８３)。この部位でのプロセシングは、約３ ２kＤaの非修飾分子量を有する、２８６のアミノ酸よりなるミュリンＢ７−２膜 結合タンパク質を生じるであろう。このタンパク質は、アミノ酸残基約２４〜２ ４６のほぼ細胞外ＩgスーパーファミリーＶおよびＣ様領域、アミノ酸残基約２ ４７〜２６５の疎水性膜貫通ドメイン、およびアミノ酸残基約２６６〜３０９の 長い細胞質ドメインよりなるであろう。Ｉgスーパーファミリーに対する相同性 は、位置４０〜１１０および１５７〜２１６におけるシステインにより結合され た細胞外領域における２つの隣接するＩg様領域による。細胞外ドメインは９つ の可 能性のあるＮ−結合グリコシル化領域をも含み、ミュリンＢ７−１と同様、恐ら くグリコシル化されている。ミュリンＢ７−２タンパク質のグリコシル化は約５ ０〜７０kＤまで分子量を増加させ得る。ミュリンＢ７−２の細胞質ドメインは 、ＡＰＣ内部の信号伝達または制御ドメインとして多分機能するシステインに続 く正に荷電したアミノ酸を有する一般的な領域を含む。ミュリンＢ７−２のヌク レオチドおよびアミノ酸配列の両方を、ＧenＢankおよびＥＭＢＬデータベース と比較すると、ヒトおよびミュリンＢ７−１とかなりの相同性(約２６％のアミ ノ酸配列の同一)を示す。ミュリンＢ７−２は、そのヒトホモローグ、hＢ７−２ と約５０％の同一性および６７％の類似性を示す。ミュリンＢ７−２をコードす るcＤＮＡ挿入を含むベクター(プラスミドpmＢx４)でトランスフェクトされたＥ ．coli(ＤＨ１０６／Ｐ３)(クローン６)は、受託番号第６９３８８号として１９ ９３年８月１８日にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(ＡＴＣＣ) に寄託された。 ミュリンＢ７−２等の、他の種から新規なＢリンパ球抗原をコードする核酸は 、トランスジェニック動物、または「ノックアウト」動物を創出するのに用い得、 その動物は治療的に有用な薬剤の開発およびスクリーニングに有用である。トラ ンスジェニック動物(例えばマウス)は、トランスジーンを有する細胞を有する動 物であり、そのトランスジーンを、動物または出生前の、例えば胚段階の動物の 前身に導入する。トランスジーンはそれからトランスジェニック動物が発生する 細胞のゲノムに結合されるＤＮＡである。一態様においてミュリンのＢ７−２c ＤＮＡまたはその適当な配列を用いて、確立された技術によりゲノムＢ７−２を クローンし、そのゲノム配列を用いてＢ７−２タンパク質を発現する細胞を有す るトランスジェニック動物を作り出すことができる。トランスジェニック動物、 特にマウスのような動物、を創出する方法は当該技術分野でありふれたものとな っており、例えば米国特許第４,７３６,８６６号および同４,８７０,００９号に 記載されている。典型的には特別の細胞を組織特異的なエンハンサーを用いてＢ ７−２トランスジーン導入のための目標に定め、Ｔ細胞共刺激および高められた Ｔ細胞増殖および自己免疫性をもたらし得るであろう。胚段階にある動物の生殖 系 列に導入されたＢ７−２トランスジーンのコピーを含むトランスジェニック動物 を用いて増加したＢ７発現の影響を調べることができる。そのような動物は、例 えば自己免疫病からの保護を与えると考えられる薬剤に対するテスター動物とし て用いることができる。本発明のこの要旨に従い、ある動物を薬剤で処理し、ト ランスジーンを有する非処理動物と比べた病気の出現率の減少はその病気に対す る治療的関与の可能性を示すであろう。 或いは、内因性のＢ７−２遺伝子および動物の胚細胞に導入された変化させた Ｂ７−２ゲノムＤＮＡの間の相同的な組換えの結果としてＢ７−２遺伝子の欠陥 または変化を有するＢ７−２「ノックアウト」動物を作るために、Ｂ７−２の非ヒ トホモローグを用いることができる。例えばミュリンＢ７−２cＤＮＡを用いて 、確立された技術に従ってゲノムＢ７−２をクローンすることができる。ゲノム Ｂ７−２ＤＮＡの一部分(例えば細胞外ドメインをコードするエクソン等の)を削 除し、またはインテグレーションをモニターするのに用いる得る選択可能なマー カーをコードする遺伝子のような他の遺伝子で置換し得る。典型的には、変化さ せないフランキングＤＮＡ(５'および３'末端両方での)数キロの塩基をベクター 中に含ませる(例えば、Ｔhomas,Ｋ．ＲおよびＣapecchi,Ｍ．Ｒ．(１９８７)、Ｃell 、５１、５０３の相同的な組換えベクターの記述を参照)。そのベクターを 胚性の幹細胞系に導入し(例えばエレクトロポレーションにより)、導入されたＤ ＮＡが内因性のＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する(例えばＬi,Ｅ等( １９９２)、Ｃell、６９、９１５を参照)。選択した細胞を動物(例えばマウス) の胚盤胞に次に注入し、アグリゲーションキメラを形生する(例えばＢraley、Ｔ eratocarcinomas and Ｅmbryonic Ｓtem Ｃell :Ａ Ｐractical Ａpproach 、Ｅ,Ｊ．Ｒobertson編(ＩＲＬ、Ｏxtord,１９８７)１１３〜１５２頁参照)。キ メラ胚を適当な偽妊娠のメスのフォスター動物に移植し、その胚を折りあわせ、「 ノックアウト動物」を創出する。それらの胚細胞において相同的に組換えたＤＮ Ａを有する後代は標準的な技術により同定でき、動物のすべての細胞が相同的に 組換えられたＤＮＡを有する動物を育てるのに用いることができる。ノックアウ ト動物は、移植片を受容し、腫瘍を拒絶し、および感染性の病気に対し防御する そ れらの能力につきキャラクタライズでき、基本的な免疫生物学の研究に用いるこ とができる。VI．Ｂリンパ球抗原の発現 新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドを発現するようトランスフェク トされた宿主細胞も本発明の範囲内である。宿主細胞は原核生物細胞、または真 核生物細胞であり得る。例えばＢ７−２活性を有するペプチドを、Ｅ．coli等の 細菌細胞、昆虫細胞(バクロウイルス)、酵母、チャイニーズオバリーセル(ＣＨ Ｏ)およびＮＳＯ細胞等の哺乳動物中で発現し得る。他の適当な宿主細胞はＧoed del(１９９０)、上書に見出され、当業者に知られている。 例えば哺乳動物、酵母、または昆虫細胞などの真核生物細胞中での発現は、組 換えタンパク質の部分的または完全なグリコシル化および／または関連する鎖間 または鎖内ジサルファイド結合の形成をもたらし得る。酵母Ｓ．cerivisaeにお ける発現用のベクターの例は、pＹepＳecl(Ｂaldari等(１９８７)、Ｅmbo Ｊ． 、６、２２９〜２３４)、pＭＦa(ＫurjanおよびＨerskowitz(１９８２)、Ｃell 、３０、９３３〜９４３)、pＪＲＹ８８(Ｓchultz等(１９８７)、Ｇene、５４、 １１３〜１２３)およびpＹＥＳ２(Ｉnvitrogen Ｃorporation、サンディエゴ、 カリフォルニア)を含む。培養した昆虫細胞(ＳＦ９細胞)中でタンパク質の発現 に利用できるバクロウィルスベクターは、pＡcシリーズ(Ｓmith等(１９８３)、Ｍol．Ｃell Ｂiol． 、３、２１５６〜２１６５)およびpＶＬシリーズ(Ｌucklo w,Ｖ．Ａ．およびＳummers,Ｍ．Ｄ(１９８９)、Ｖirology、１７０、３１〜３９ )を含む。一般にＣＯＳ細胞(Ｇluzman,Ｙ．(１９８１)、Ｃell、２３、１７５〜 １８２)を、哺乳動物における一時的な増幅／発現のためpＣＤＭ８等のベクター (Ｓeed,Ｂ．(１９８７)、Ｎature、３２９、８４０)と組合せて用い、ＣＨＯ(dh fr-チャイニーズハムスターオベリー)細胞は、哺乳動物細胞中の安定な増幅／発 現のためにpＭＴ２ＰＣ等のベクター(Ｋaufman等(１９８７)、ＥＭＢＯ Ｊ．、６ 、１８７〜１９５)と共に用いる。組換えタンパク質の製造用の好ましい細胞 株は、ＥＣＡＣＣ(カタログ＃８５１１０５０３)から入手でき、Ｇalfre,Ｇ．お よびＭilstein,Ｃ(１９８１)、Ｍethods in Ｅnzymology、７３(１３)、３〜 ４６およびＰreparation of Ｍonoclonal Ａntibodies:Ｓtrategies and Ｐrocedure 、Ａcademic Ｐress、ニューヨークに記載されているＮＳＯミエロ ーマ細胞株である。ベクターＤＮＡは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム 共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチンま たはエレクトロポレーション等の通常の技術により哺乳動物細胞に導入できる。 宿主細胞をトランスホームするのに適した方法は、Ｓambrook等、Ｍolecular Ｃloning:Ａ Ｌaboratory Ｍannual 、第２編、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌa boratory press(１９８９)および他の実験室テキストブックに見出すことがで きる。哺乳動物細胞中で用いる場合、発現ベクターの制御機能はウイルス材料に よりしばしば提供される。例えば一般に用いるプロモーターは、ポリオーマ、ア デノウイルスス、サイトメガロウイル、および最もしばしばシミアンウイルス４ ０に由来する。 細胞の少部分(約１／１０5)が典型的にはＤＮＡをそれらのゲノムに組込む。 これらの組込体を同定するために、選択可能なマーカー(すなわち抗生物質に対 する抵抗性)を含む遺伝子を、問題の遺伝子と共に宿主細胞に一般に導入する。 好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキ セート等の薬剤に対する抵抗性を与えるものを含む。選択可能なマーカーは問題 の遺伝子と同じプラスミドに導入してもよく、別のプラスミドに導入してもよい 。問題の遺伝子を有する細胞は薬剤選択により同定できる。すなわち選択可能な マーカー遺伝子を導入した細胞は生き残り、他の細胞は死ぬ。生き残った細胞を 、Ｂ細胞抗原に対するリガンド(例えばＣＴＬＡ４ＩgおよびＣＤ２８Ｉg)を用い る細胞表面染色により、新規Ｂリンパ球抗原の製造に関して次にスクリーニング し得る。或いは、該タンパク質をラベルしたアミノ酸で代謝的にラベルし、抗Ｂ リンパ球抗原モノクローナル抗体、またはＣＴＬＡ４ＩgまたはＣＤ２８Ｉg等の 融合タンパク質で細胞上清液から免疫沈澱させ得る。 原核生物における発現は、融合または非融合タンパク質の発現を指向する構成 性または誘導性プロモーターを含むベクターを有すＥ．coli中で最もしばしば行 われる。融合ベクターは、発現される標的遺伝子の通常アミノ末端に多くのアミ ノ酸を加える。そのような融合ベクターは、１)組換えタンパク質の発現を増加 させる； ２)標的組換えタンパク質の溶解性を増加させる、および３)アフィニ ティ精製におけるリガンドとして作用することにより標的組換えタンパク質の精 製を助けるという３つの目的に典型的には役立つ。融合発現ベクターにおいては しばしば、タンパク質分解解裂部位を、融合部分と標的組換えタンパク質の結合 部分に導入し、融合タンパク質の精製後に、融合部分から標的組換えタンパク質 を分離するのを可能にする。そのような酵素、およびそれらの同種認識配列は、 因子Ｘa、トロンビン、およびエンテロキーゼを含む。典型的な融合発現ベクタ ーは、標的組換えタンパク質に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルト ースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを融合するpＧＥＸ(Ａmrad Ｃorp. 、メルボルン、オーストラリア)、pＭＡＬ(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs,ビバリー 、マサチューセッツ)、およびpＲＩＴ５(Ｐharmacia、ピスカタウェイ、ニュー ジャジィ)を含む。 Ｅ．coli．発現系は、誘導性の発現ベクターpＴrc(Ａmann等(１９８８)、Ｇen e 、６９、３０１〜３１５)およびpＥＴ１１(Ｓtudier等、Ｇene Ｅxpression Ｔechnology:Ｍethods in Ｅnzymology 、１８５、Ａcademic Ｐress、サンジ ェゴ、カリホルニア(１９９０)、６０〜８９； Ｎovagen から商業的に入手で きる)を含む。pＴrcベクター系においては挿入された遺伝子を、ハイブリッドtr p−lac融合プロモータからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写によるpelＢシグナル 配列と共に発現させる。誘導の後、組換えタンパク質をペリプラズム部画分から 精製できる。pＥＴ１１ベクター系においては、標的遺伝子を、共発現のウイル スＲＮＡポリメラーゼにより媒介されるＴ７gn１０−lac ０融合プロモーター( Ｔ７gnl)からの転写による非融合タンパク質として発現させる。このウイルスポ リメラーゼは、lacＵＶ５プロモーターの転写調節の下Ｔ７gnlを有するレジデン トλプロファージから宿主Ｅ．coli株 ＢＬ２１(ＤＥ３)およびＨＭＳ１７４( Ｄ Ｅ３)により供給される。この系においては組換えタンパク質を変性した形の封 入小体から精製でき、望ましいならステップブラジエント透析により復元して変 性物を除去する。 Ｅ．coli中の組換えＢ７−２発現を最大にする１方策は、組換えタンパク質を タンパク質分解酵素によりより解裂する能力の損なわれた宿主細菌中でタンパク 質を発現することである(Ｇottesman,Ｓ.、Ｇene Ｅxpression Ｔechnology; Ｍethods in Ｅnzymology 、１８５、Ａcademic Ｐress、サンディエゴ、カリ フォルニア(１９９０)、１１９〜１２８)。他の方策は発現ベクターに挿入され るべきＢ７−２遺伝子または他のＤＮＡの核酸配列を、各アミノ酸の個々のコド ンが高度に発現されたＥ．coliタンパク質で優先的に用いられるものであるよう 変化させることであろう(Ｗada等(１９９２)、Ｎuc．Ａcids Ｒes．、２０、２ １１１〜２１１８)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的なＤＮＡ合成 技術により行い得る。 哺乳動物細胞中または他の方法で発現した新規なＢリンパ球抗原およびその部 分は、硫酸アンモニウム沈澱、分別カラムクロマトグラフィー(例えばイオン交 換、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティクロマトグラフィ等)、および究極的に は結晶化を含む。当該技術分野の標準的な方法に従い精製できる(一般的には、 “Ｅnzyme Ｐurification and Ｒelated Ｔechniques”、Ｍethods in Ｅ nzymology 、２２、２３３〜５７７(１９７１)を参照)。部分的にまたは均一にな るまで精製されると、組換え的に製造されたＢリンパ球抗原またはその部分は、 以下に詳細に記載する薬学的投与に適した組成物に使用できる。VII．本発明の核酸およびアミノ酸配列の修飾およびＢ７リンパ球抗原活性の分 析 新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードする他の核酸を上記方 法により単離できることは当業者に認識されるであろう。異なった細胞株が異な った塩基配列を有するＤＮＡ分子を生ずことは予期され得る。更に、変異体が遺 伝物質の遺伝的多型性および細胞媒介修飾により存在し得る。更に、Ｂリンパ球 抗原のＤＮＡ配列を遺伝技術を用いて修飾し、変化したアミノ酸配列を有するタ ンパク質またはペプチドを製造し得る。そのような配列は本発明の範囲内である と 考えられ、発現されたペプチドは活性化Ｔ細胞媒介免疫応答および免疫機能を誘 導し、または阻害できる。 多くの方法が単離されたＤＮＡ配列の均等物またはフラグメントを作るのに用 いることができる。Ｂ７−２タンパク質をコードする核酸の小さいサブ領域また はフラグメント、例えば長さで１〜３０の塩基、を標準的な合成有機化学手段に より調製できる。その技術はＢ７−２ＤＮＡのより大きい合成フラグメントの作 製に用いる、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびプライマーの調製にも有用 である。 Ｂリンパ球抗原をコードする遺伝子のより大きいサブ領域またはフラグメント は、ポリメラーゼチェインリアクション(ＰＣＲ)(Ｓambrook、ＦritshおよびＭa niatis、Ｍolecular Ｃloning;Ａ Ｌabaratory Ｍanual、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク(１９８９))を用いて関連するＤＮＡ片を合成し、このよ うにして得られたＤＮＡを適当な発現ベクターにライゲートすることにより、ペ プチドとして発現できる。ＰＣＲを用いて、クローン化された２本鎖ＤＮＡの特 殊な配列が作り出され、発現ベクターにクローン化され、次にＣＴＬＡ４／ＣＤ ２８結合活性につき分析する。例えば分泌(可溶)形のヒトＢ７−２タンパク質を 発現させるために、ＰＣＲを用いて、該タンパク質の膜貫通および細胞質領域を コードしないＤＮＡを合成できる。このＤＮＡ分子を適当な発現ベクターにライ ゲートし、ＣＨＯ等の宿主細胞に導入でき、そこでＢ７−２タンパク質フラグメ ントが合成され、分泌される。そのＢ７−２タンパク質フラグメントは培養培地 から容易に得ることができる。 他の態様では、単純な削除物若しくは挿入物、塩基クラスターの系統的な削除 物、挿入物若しくは置換物、または単一・塩基の置換物を作る方法を含め、多く の方法のいずれかでＤＮＡ中に突然変異を導入し、Ｂリンパ球抗原ＤＮＡの変異 体または修飾された均等物を作ることができる。例えば図８(配列番号１)に示す ヒトＢ７−２cＤＮＡ配列、および図１４(配列番号２)に示すミュリンＢ７−２c ＤＮＡ配列における、アミノ酸置換または削除などの変化は、部位指定突然変異 誘発により好ましくは得られる。部位指定突然変異誘発は当業界でよく知られて いる。プロトコールおよび試薬は、Ａmersham Ｉnternational ＰＬＣ、アマ ーシャム、英国より商業的に得られる。 新規なＢリンパ球抗原の活性、すなわち、例えば１次活性化シグナルを受取っ たＴ細胞によるサイトカイン産生および／またはＴ細胞増殖により証拠づけられ る、Ｔ細胞上でＢリンパ球抗原の天然のリガンドを結合し、活性化Ｔ細胞媒介免 疫応答を剌激(増幅)し、または阻害(プロック)する能力を有するペプチドは本発 明の範囲内にあると考えられる。より具体的には、Ｔリンパ球、例えばＣＤ２８+ に結合するペプチドは、共刺激性シグナルをＴリンパ球に運ぶことができ、該 シグナルは、抗原およびクラスIIＭＨＣ、または１次シグナルをＴ細胞に伝える ことのできる他の物質の存在下に伝達された場合、Ｔ細胞内部でのサイトカイン 遺伝子の活性化を結果として生ずる。或いは、そのようなペプチドをクラスＩＭ ＨＣと共に用い、それによりＣＤ８+細胞溶解性Ｔ細胞を活性化できる。更に可 溶性、モノマー性形のＢ７−２タンパク質は、ＣＤ２８+Ｔ細胞上でそれらの天 然のリガンドに結合する能力を保持するが、多分リガンドとの不十分な架橋のた め、サイトカイン産生および細胞***を高めるのに必須な２次的シグナルを伝達 できない。細胞中でアネルギーまたは寛容状態を誘導する手段を提供するそのよ うなペプチドも本発明の範囲内にあると考えられる。 本明細書に記載する特徴的なＢリンパ球抗原活性を保持するものについてのペ プチドのスクリーニングは、１以上の、いくつかの異なった分析を用いて行うこ とができる。例えばそのペプチドを、細胞表面Ｂ７−２、またはＣＴＬＡ４Ｉg またはＣＤ２８Ｉg等の融合タンパク質と反応性の抗７−２モノクローナル抗体 との特異的な反応性についてスクリーニングできる。具体的にはＣＯＳ細胞のよ うな適当な細胞を、ペプチドをコードするＢ７−２ＤＮＡでトランスフェクトし 、次に間接免疫蛍光およびフローサイトメトリーにより細胞表面の表現型につい て分析し、そのペプチドがＢ７−２活性を有するか否か決定する。トランスフェ クトされた細胞の細胞表面発現は、細胞表面Ｂ７−２またはＣＴＬＡ４Ｉgまた はＣＤ２８Ｉgタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて評価 する。分泌形のＢ７−２の産生は免疫沈降用の抗Ｂ７−２モノクローナル抗体ま た はＣＴＬＡ４ＩgまたはＣＤ２８融合タンパク質を用いて評価する。 他の、より好ましい分析は、Ｂ７−２抗原の機能的な特徴を利用する。先に説 明したように、サイトカインを合成するＴ細胞の能力は、抗原に対するＴ細胞レ セプターの占有または架橋によるばかりでなく(「活性化Ｔ細胞」を作るための、 例えば抗ＣＤ３またはフォルボールエステルにより提供される「１次活性化シグ ナル)、この場合にはＢ７−２、Ｂ７−１またはＢ７−３等のＢリンパ球抗原と の相互作用による共刺激性の誘導にもよる。例えばＣＤ２８+Ｔ細胞上でのＢ７ −２のその天然のリガンドへの結合は、サイトカイン、特にインターロイキン− ２の増加したレベルの産生を誘導し、次にＴリンパ球の増殖を刺激する、Ｔ細胞 へのシグナルの伝達という効果を有する。Ｂ７−２機能の他の分析は、インター ロイキン−２、インターロイキン−４、または他の公知の、若しくは知られてい ない新しいサイカイン等のサイカイン類の合成の分析、および／または１次活性 化シグナルを受取ったＣＤ２８+Ｔ細胞によるＴ細胞増殖についての分析を含む 。 インビボで、Ｔ細胞は、抗Ｔ３モノクローナル抗体(例えば抗ＣＤ３)若しくは フォルボールエステル、より好ましくはクラスIIＭＨＣと結合した抗原により、 第１の、または１次的な活性化シグナルを与えられる。１次活性化シグナルを受 取ったＴ細胞を本明細書では活性化Ｔ細胞と言う。Ｂ７−２機能は、Ｔ細胞培養 に、Ｂ７−２源(例えばＢ７−２活性を有するペプチドを発現する細胞、または 分泌形のＢ７−２)およびクラスIIＭＨＣに結合した抗原等の１次活性化シグナ ルを加え、培養上清液を、インタロイキン−２、γ−インターフェロンまたは他 の公知または知られていないサイトカインにつき分析することにより分析される 。例えばインターロイキン−２のいくつかの従来の分析法、例えばＰroc．Ｎatl ．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、８６、１３３３(１９８９)に記載された分析法(その関 連部分は本明細書の一部を構成する)、のいずれも用いることができる。インタ ーフェロン産生分析用キットも、Ｇenzyme Ｃorporation(ケンブリッジ、マサ チューセッツ)より入手できる。Ｔ細胞増殖も以下の実施例に記載したように測 定できる。本明細書に記載したＢ７−２抗原の特徴を保持するペプチドは、Ｔ細 胞によるＩＬ−２等のサイトカインの細胞あたりの生産の増加をもたらし、共刺 激シ グナルを欠いている陰性対照と比較して高められたＴ細胞増殖をもたらす。 Ｂ７−２活性を有するが、共刺激シグナルを運ぶ能力を欠いたペプチドをスク リーニングするため同じ基本的な機能的分析も使用できるが、そのようなペプチ ドの場合、Ｂ７−２タンパク質の添加は増殖またはＴ細胞によるサイトカイン分 泌の顕著の増加をもたらさないであろう。正常なＢ７−２共剌激シグナルを阻害 しまたは完全にブロックし、アネルギーの状態を誘導するそれらのタンパク質の 能力は、細胞表面Ｂ７−２を発現し、抗原を提示する抗原提示細胞でＴ細胞を剌 激するその後の試みを用いて測定できる。ＩＬ−２合成およびＴ細胞増殖により 測定される、その後の活性化の試みにＴ細胞が非応答性であるなら、アネルギー の状態が誘導されている。本発明による分析の基礎として用いる分析システムに ついては、Ｇimmi,Ｃ．Ｄ．等(１９９３)、Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 、９０、６５８６〜６５９０を参照。 溶解性の増加、治療または予防効果の増大、または安定性(例えば半ビボ(ex vivo)貯蔵期間、およびインビボのタンパク分解酵素による分解に対する抵抗性) の増大などの目的のための新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドの構造 の修飾も可能である。そのような修飾されたペプチドは本明細書に定義したＢリ ンパ球抗原の機能的な均等物であると考えられる。例えばＢ７−２活性を有する ペプチドを、それがＴ細胞増殖を剌激および／またはサイトカインを産生する能 力を維持するよう修飾できる。Ｔ細胞上でＣＴＬＡ４／ＣＤ２８レセプターと相 互作用するのに必須であると示されたこれら残基を、その必須アミノ酸を、その 存在がレセプター相互作用を高め、減少させるかが、失くしはせず、または影響 しない、他の好ましくは類似のアミノ酸残基で置換することにより(保存的置換) 修飾できる。更に、レセプター相互作用に必須でないこれらのアミノ酸残基を、 その導入が反応性を高め、減少させ、または影響しない他のアミノ酸により置換 することにより修飾してもよい。 新規なＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドの修飾の他の例は、システイン 残基を、好ましくはアラニン、セリン、スレオニン、ロイシン、またはグルタミ ン酸残基で置換して、ジサルファイド結合による二量化を最小限にすることであ る。更に、Ｂ７−２活性を有するペプチドのアミノ酸側鎖を化学的に修飾できる 。他の修飾はペプチドの環化である。 安定性および／または反応性を高めるために、Ｂ７−２活性を有するペプチド を、いずれかの天然のアレル変異から生じる抗原のアミノ酸配列の１以上多型性 を導入するよう修飾し得る。更にＤ−アミノ酸、非天然アミノ酸、非アミノ酸ア ナローグで置換し、付加して本発明の範囲内の修飾タンパク質を製造し得る。更 に、ペプチドをＡ．Ｓehonおよび協力者の方法(Ｗie等、上書)によるポリエチレ ングリコール(ＰＥＧ)を用いて修飾し、ＰＥＧと結合したペプチドを作ることが できる。更に、ＰＥＧはペプチドの化学合成の間に付加することができる。ペプ チドの他の修飾は、還元／アルキル化(Ｔarr、Ｍethods of Ｐrotein Ｍicro characterzation 、Ｊ．Ｅ．Ｓilver編、Ｈuman Ｐress、クリフトン、ニュージ ャージー、１５５〜１９９４(１９８６))、アシル化(Ｔarr、上書)、適当な担体 への化学的結合(ＭishellおよびＳhiigi編、Ｓelected Ｍethods in Ｃellul ar lmmunology 、ＷＨ Ｆreeman、サンフランシスコ、カリフォルニア(１９８ ０)、米国特許第４,９３９,２３９号)、または弱いホルマリン処理(Ｍarsh(１９ ７１)、Ｉnt．Ａrch．of Ａllergy and Ａppl．Ｉmmunol．、４１、１９９〜 ２１５)を含む。 ペプチドの精製を容易にし、溶解性をもしかすると増加させるために、タンパ ク質骨核にアミノ酸融合部分を付加することは可能である。例えばヘキサ−ヒス チジンを、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによる精製のため ペプチドに付加することができる(Ｈochuli,Ｅ等(１９８８)、Ｂio／Ｔechnolog y 、６、１３２１〜１３２５)。更に無関係の配列を含まないＢリンパ球抗原の単 離を容易にするために、特異的なエンドプロテアーゼ解裂部位を融合部分および ペプチドの配列の間に導入できる。ペプチドに機能性の基を付加することにより 、またはペプチドの疎水性領域を省くことにより、ペプチドの溶解性を増加させ ることは必要であり得る。 VII．Ｂリンパ球抗原およびＢ７−２活性を有するペプチドをコードしている 核酸配列の用途。 Ａ．分子プローブ。 本発明に係る核酸は、生物学的試料中のＢリンパ球の活性化状態を測定するこ とにより疾病の進行を追跡し、またはＢリンパ球抗原の発現に及ぼす分子の効果 を検定する（例えば細胞のｍＲＮＡレベルを検出する）のに、診断上有用である 。これらの診断的検定に従い、この核酸配列を、検出可能なマーカー、例えば放 射性、蛍光、またはビオチニル化されたマーカーを用いて標識し、常套的なドッ トブロットまたはノーザンハイブリダイゼーション法を用いて生物学的試料由来 の総またはポリ（Ａ＋）ＲＮＡのｍＲＮＡ分子をプロービングする。 Ｂ．抗体の産生。 本発明に係る核酸分子から生成されるペプチドおよび融合蛋白はさらに、Ｂリ ンパ球抗原と特異的に反応する抗体の産生に使用することもできる。例えば、全 長のＢ７−２蛋白、または、Ｂ７−２の予想アミノ酸配列に基づくアミノ酸配列 を有するそのペプチドフラグメントを使用することにより、抗蛋白／抗ペプチド ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を、標準法を用いて作製するこ とができる。哺乳動物（例えばマウス、ハムスター、またはウサギ）を、その哺 乳動物において抗体反応を顕現させる免疫原性型の蛋白またはペプチドで免疫す ることができる。この免疫原は、例えば組み替えＢ７−２蛋白、またはそのフラ グメント、合成ペプチドフラグメントまたはその表面にＢリンパ球抗原を発現す る細胞であってよい。この細胞は、例えば脾臓Ｂ細胞、またはＢリンパ球抗原が その細胞表面に発現されるような本発明に係るＢリンパ球抗原をコードしている 核酸（例えばＢ７−２ ｃＤＮＡ）によりトランスフェクトされた細胞であって よい。免疫原はその免疫原性を増すために修飾することができる。例えば、ペプ チドに免疫原性を付与するための技術には、担体へのコンジュゲーションまたは その他の当分野でよく知られる技術が包含される。例えば、ペプチドをアジュバ ントの存在下で投与することができる。免疫感作の進行は血漿または血清中の抗 体力価の検出により監視することができる。標準的ＥＬＩＳＡまたはその他のイ ムノアッセイを、抗体のレベルを評価するための抗原としての免疫原と共に使用 することができる。 免疫感作の後、抗血清を取得し、所望ならばこの血清からポリクローナル抗体 を単離することができる。モノクローナル抗体を生成させるため、抗体産生細胞 （リンパ球）を免疫された動物から採取し、標準的体細胞融合法により骨髄腫細 胞と融合させてこれらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を生成させること ができる。このような技術は当分野においてよく知られている。例えば、ケーラ ーおよびミルシュタイン（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）、２５６巻４９５−４９７ 頁）により最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならびにヒトＢ細胞ハイブリ ドーマ技術（コズバー等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ（１９８３）、４巻７２ 頁）、ヒトモノクローナル抗体を生成させるためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術 （コール等、モノクローナル・アンティボディーズ・イン・キャンサー・セラピ ー（１９８５）（アレン・Ｒ．ブリス、Ｉｎｃ．、７７−９６頁）、および組み 合わせ抗体ライブラリーのスクリーニング（ヒューズ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９ ８９）、２４６巻１２７５頁）である。ハイブリドーマ細胞をこのペプチドと特 異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングし、モノクロー ナル抗体を分離することができる。 本明細書中使用される抗体という語は、本明細書に記載される新規なＢリンパ 球抗原の活性を有するペプチドまたは融合蛋白と特異的に反応するそれらのフラ グメントを包含する事を意図している。抗体は常套技術を用いてフラグメント化 され、そのフラグメントを、抗体全体について上に記載したものと同じ方法で、 用途についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ(ａｂ')2フラグメン トは、抗体をペプシンで処理することにより生成させることができる。得られた Ｆ(ａｂ')2フラグメントを処理してジスルフィド橋を還元し、Ｆａｂ’フラグメ ントを生成させることができる。本発明に係る抗体はさらに、抗Ｂリンパ球抗原 （即ちＢ７−２、Ｂ７−３）部分を有する二重特異性およびキメラ分子を包含す ることを意図している。 特に好ましい抗体は、ハイブリドーマＨＡ３.１Ｆ９、ＨＡ５.２Ｂ７およびＨ Ｆ２.３Ｄ１により産生される抗ヒトＢ７−２モノクローナル抗体である。これ らの抗体の製造および特性決定は実施例８に詳細に記載されている。モノクロー ナル抗体ＨＡ３.１Ｆ９はＩｇＧイソタイプのものであると確定され；モノクロ ーナル抗体ＨＡ５.２Ｂ７はＩｇＧ２ｂイソタイプのものであると確定され；モ ノクローナル抗体ＨＦ２.３Ｄ１はＩｇＧ２ａイソタイプのものであると確定さ れた。ハイブリドーマ細胞は、ＡＴＣＣ受理番号 （ハイブリドーマＨ Ａ３.１Ｆ９）、ＡＴＣＣ受理番号 （ＨＡ５.２Ｂ７）およびＡＴＣ Ｃ受理番号 （ＨＦ２.３Ｄ１）として、ブダペスト条約の要件にか なうアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９４年７月１９日に 寄託された。 ヒト以外の対象において産生された抗体が治療的に人間に使用される場合、そ れらは程度の差こそあれ外来性であると認識され、患者に免疫反応が起こり得る 。この問題を最小にまたは排除する、全身的免疫抑制より好ましい一つのアプロ ーチは、キメラ抗体誘導体、即ちヒト以外の動物の可変領域とヒト不変領域とを 結合させた抗体分子を産生させることである。キメラ抗体分子には、例えば、ヒ ト不変領域を伴う、マウス、ラット、またはその他の種の抗体由来の抗原結合ド メインが包含され得る。キメラ抗体を作製するための様々なアプローチが記載さ れており、そして本発明に係る新規なＢリンパ球抗原の遺伝子産物を認識する免 疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体の作製に使用することができる。例えば 、モリソン等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１巻 ６８５１頁（１９８５）；タケダ等、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻４５２頁（１９８ ５）、キャビリー等、米国特許第４８１６５６７号；ボス等、米国特許第４８１ ６３９７号；タナグチ等、欧州特許公開ＥＰ１７１４９６；欧州特許公開０１７ ３４９４、英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂを参照されたい。このようなキメラ抗 体は、対応する非キメラ抗体よりもヒト対象における免疫原性が小さいと予想さ れる。 人間の治療目的のために、本明細書に記載のＢリンパ球抗原の活性を有するペ プチドと特異的に反応するモノクローナルまたはキメラ抗体を、ヒト可変領域キ メラを生成させることにより、さらにヒト化することができるが、この場合、可 変領域の一部、とりわけ抗原結合ドメインの保存フレームワーク領域がヒト起源 であり、超可変領域のみが非ヒト起源である。「ヒト化された」キメラ抗体の総 説は、Ｓ．Ｌ．モリソン（１９８５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻１２０２−１ ２０７頁およびオイ等（１９８６）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４巻２１４ 頁に提供されている。このような変化させた免疫グロブリン分子は当分野で知ら れる幾つかの技術のうち任意のもの（例えばテング等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０巻７３０８−７３１２頁（１９８３）；コ ズボー等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４巻７２７９頁（１９８３）； オルソン等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２巻３−１６頁（１９８２））に よって作成することができ、好ましくはＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３または ＥＰ０２３９４００の教示に従って作成する。ヒト化抗体は、例えばスコットジ ェン・リミッティド、２ホーリー・ロード、トゥイッケンハム、ミドルセクス、 英国により商業生産することができる。好適な「ヒト化」抗体は、別法としてＣ ＤＲまたはＣＥＡ置換により生成させることができる（ウィンターに対する米国 特許５２２５５３９；ジョーンズ等（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻５５ ２−５２５頁；ヴェルホーヤン等（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻１５ ３４頁；およびバイドラー等（１９８８）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１巻４０ ５３−４０６０頁を参照されたい）。免疫原性を低下させたヒト化抗体が、ヒト 対象における免疫療法のために好ましい。ヒト化抗体を用いる免疫療法は、付随 する免疫抑制の必然性を減少させると思われ、また慢性疾患の状況または抗体処 置を反復する必要のある状況の処置に対する長期有効性を増大させる結果を生む ことができる。 マウスまたは他の種由来のモノクローナル抗体をヒト化する代わりに、ヒト蛋 白に対するヒトモノクローナル抗体を生成させることもできる。ヒトＢリンパ球 抗原、例えばＢ７−２で免疫され得る、ヒトの抗体レパートリーを有するトラン スジェニックマウスが作り出された。次に、これらの免疫されたトランスジェニ ックマウスの脾臓細胞を用いて、ヒトＢリンパ球抗原と特異的に反応するヒトモ ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作り出すことができる（例えば、 ウッド等、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／００９０６、クチャーラパティ等、ＰＣＴ公開 ＷＯ９１／１０７４１；ロンバーグ等、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８；ケイ 等、 ＰＣＴ公開９２／０３９１７；Ｎ．ロンバーグ等（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ、 ３６８巻８５６−８５９頁；Ｌ．Ｌ．グリーン等（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、７巻１３−２１頁；Ｓ．Ｌ．モリソン等（１９９４）、Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻６８５１−６８５５頁；ブラッ ジマン等（１９９３）、Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻３３−４０頁；テュ アイロン等（１９９３）、ＰＮＡＳ、９０巻３７２０−３７２４頁；およびブラ ッジマン等（１９９１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１巻１３２３−１ ３２６頁を参照されたい）。 本発明に係るモノクローナル抗体組成物は、組み替えＤＮＡ技術の分野におい て通常の知識を有する者によく知られるその他の方法によっても生成させること ができる。「組み合わせ抗体ディスプレー」法と呼ばれる別法は、特定の抗原特 異性を有する抗体フラグメントを同定し単離するために開発され、これを、本発 明に係るＢリンパ球抗原を結合するモノクローナル抗体の生成に利用することが できる（組み合わせ抗体ディスプレーの説明については、例えばサストリー等（ １９８９）、ＰＮＡＳ、８６巻５７２８頁；ヒューズ等（１９８９）、Ｓｃｉｅ ｎｃｅ、２４６巻１２７５頁；およびオーランディ等（１９８９）、ＰＮＡＳ、 ８６巻３８３３頁を参照されたい）。動物をＢリンパ球抗原で免疫した後、得ら れたＢ細胞プールの抗体レパートリーをクローニングする。オリゴマープライマ ーの混合物およびＰＣＲを使用することによる、免疫グロブリン分子の多様な集 団の可変領域のＤＮＡ配列を直接取得するための方法は一般に知られている。例 えば、５'リーダー（シグナルペプチド）配列および／またはフレームワーク１ （ＦＲ１）配列に対応する混合オリゴヌクレオチドプライマー、ならびに保存さ れた３'不変領域プライマーに対するプライマーを、幾つかのマウス抗体由来の 重鎖および軽鎖可変領域のＰＣＲ増幅のために使用することができる（ラーリッ ク等（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１巻１５２−１５６頁）。 同様の戦法を、ヒト抗体由来のヒト重鎖および軽鎖可変領域の増幅にも使用する ことができる（ラーリック等（１９９１）、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐａｎｉｏ ｎ ｔｏＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍoｌｏｇｙ、２巻１０６−１１０頁 ）。 例示的態様においては、例えば末梢血球、骨髄、または脾臓試料の活性化Ｂ細 胞から、標準的プロトコルを用いてＲＮＡが分離される（例えば、米国特許第４ ６８３２０２号；オーランディ等、ＰＮＡＳ（１９８９）、８６巻３８３３−３ ８３７頁；サストリー等、ＰＮＡＳ（１９８９）、８６巻５７２８−５７３２頁 ；およびヒューズ等（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻１２７５−１２８ １頁）。第一のｃＤＮＡ鎖は、重鎖の不変領域ならびにκおよびλ軽鎖の各々に 対し特異的なプライマー、ならびにシグナル配列に対するプライマーを用いて合 成する。可変領域ＰＣＲプライマーを用いて、重鎖および軽鎖の両者の可変領域 を単独でまたは組み合わせて増幅し、ディスプレーパッケージの作成におけるさ らなる操作のために適切なベクター中にライゲーションする。増幅プロトコルに 役立つオリゴヌクレオチドプライマーは、特異なものであるか、縮重しているか 、または縮重位置にイノシンを組み入れ得る。増幅されたフラグメントをベクタ ー中の予め定められた発現のための読み取り枠にクローニングできるようにする ため、制限エンドヌクレアーゼ認識配列もまたこのプライマー中に組み入れるこ とができる。 免疫感作で誘導された抗体レパートリーからクローニングされたＶ遺伝子ライ ブラリーは、好ましくは、抗体ディスプレーライブラリーを形成させるための繊 維状ファージから誘導されるディスプレーパッケージの集団によって発現させる ことができる。理想的には、このディスプレーパッケージは、極めて大きな多様 な抗体ディスプレーライブラリーのサンプリング、各親和分離工程後の迅速な分 類、そして精製されたディスプレーパッケージからの抗体遺伝子の容易な単離が 可能な系を含む。ファージディスプレーライブラリーの作成のための入手し得る 市販のキット（例えば、ファルマシアの組み替えファージ抗体系、カタログ番号 ２７−９４００−０１；およびストラタジーンのＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファー ジディスプレーキット、カタログ番号２４０６１２）に加えて、多様な抗体ディ スプレーライブラリーの生成の際の使用に特に従う方法および試薬の例は、例え ば、ラドナー等、米国特許第５２２３４０９号；カング等、国際公開第ＷＯ９２ ／１８６１９号；ドウアー等、国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号；ウィンター 等、国際公開ＷＯ９２／２０７９１；マークランド等、国際公開第ＷＯ９２／１ ５６７９号；ブライトリング等、国際公開ＷＯ９３／０１２８８；マッカファー ティ等、国際公開第ＷＯ９２／０１０４７号；ガラード等、国際公開第ＷＯ９２ ／０９６９０号；ラドナー等、国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号；ファッハ等 （１９９１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻１３７０−１３７２頁；ヘ イ等（１９９２）、Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、３巻８１ −８５頁；ヒューズ等（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻１２７５−１２ ８１頁；グリフツ等（１９９３、ＥＭＢＯ Ｊ １２巻７２５−７３４頁；ホー キンズ等（１９９２）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２２６巻８８９−８９６頁；ク ラックソン等（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻６２４−６２８頁；グラム 等（１９９２）、ＰＮＡＳ、８９巻３５７６−３５８０頁；ガラド等（１９９１ ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻１３７３−１３７７頁；ホーゲンブー ム等（１９９１）、Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９巻４１３３−４１３７頁； およびバーバス等（１９９１）、ＰＮＡＳ、８８巻７９７８−７９８２頁に見い だすことができる。 或る態様において、重鎖および軽鎖のＶ領域ドメインを同じポリペプチド上で 発現させ、可変リンカーによって連結して一本鎖Ｆｖフラグメントを形成し、そ して続いてこのｓｃＦＶ遺伝子を所望の発現ベクターまたはファージゲノム中に クローニングすることができる。マッカファーティ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０ ）、３４８巻５５２−５５４頁に一般的に記載されるように、可変性の（Ｇｌｙ4 −Ｓｅｒ）3リンカーにより連結された抗体の完全なＶHおよびＶLドメインを使 用して、ディスプレーパッケージを抗原親和性に基づき分離可能とすることので きる一本鎖抗体を生成させることができる。続いて、Ｂリンパ球抗原の活性を有 するペプチドと免疫反応する単離されたｓｃＦＶ抗体を、本発明方法での使用の ための薬用調製物に調合することができる。 ディスプレーパッケージ（例えば繊維状ファージ）の表面上に表示されたなら ば、この抗体ライブラリーを、Ｂリンバ球抗原蛋白またはそのペプチドフラグメ ントでスクリーニングしてＢリンパ球抗原に対する特異性を有する抗体を発現す るパッケージを同定および単離する。選択された抗体をコードしている核酸をデ ィスプレーパッケージから（例えばファージゲノムから）回収し、標準的組み替 えＤＮＡ技術により他の発現ベクター中にサブクローニングすることができる。 本発明に係る抗体は、Ｔ細胞の共同刺激に必要なレセプター：リガンド相互作 用を遮断することにより、Ｔ細胞活性化の阻害に治療的に使用することができる 。これらのいわゆる「遮断抗体」は、本明細書に記載されるインビトロ共同刺激 検定に添加される時、Ｔ細胞増殖および／またはサイトカイン産生を阻害するそ れらの能力によって同定することができる。Ｔ細胞の機能を阻害する遮断抗体の 能力は、これらの抗体がインビボで投与される時、免疫抑制および／または寛容 をもたらし得る。 Ｃ．蛋白の精製。 本発明に係るポリクローナルまたはモノクローナル抗体、例えばＢ７−２活性 またはＢ７−３活性を有する組み替えまたは合成ペプチドと特異的に反応する抗 体は、さらに、天然のＢリンパ球抗原を細胞から単離するために使用することが できる。例えば、このペプチドと反応する抗体を使用して、天然に存在するまた は天然型のＢ７−２を活性化されたＢリンパ球から免疫親和クロマトグラフィー によって単離することができる。加えて、天然型のＢ７−３は、モノクローナル 抗体ＢＢ−１を用いる免疫親和クロマトグラフィーによってＢ細胞から単離する ことができる。 Ｄ．その他の治療用試薬。 本明細書に記載される核酸配列および新規なＢリンパ球抗原は、Ｔ細胞仲介免 疫反応の上方調節（例えば増幅）または下方調節（例えば抑制または寛容を成立 させる）のいずれかを行う能力を有する治療用試薬の開発に使用することができ る。例えば、可溶性、単量体型のＢ７−２抗原またはＢ７−２融合蛋白、例えば Ｂ７−２Ｉｇを包含するＢ７−２活性を有するペプチド、および、最初の活性化 シグナルを受け取ったＴ細胞に共同刺激シグナルを送ることのできない抗Ｂ７− ２抗体を使用して、Ｔ細胞上のＢ７−２リガンドを遮断し、それにより対象に免 疫抑制を惹起そして／または寛容を誘発させる特異的手段を提供することができ る。このような遮断または阻害型のＢリンパ球抗原および融合蛋白および遮断抗 体は、本明細書前記のようなインビトロ共同刺激検定に添加された場合のＴ細胞 増殖および／またはサイトカイン産生を阻害する能力によって同定することがで きる。単量体型とは対称的に、刺激型のＢ７−２、例えば無傷の細胞表面Ｂ７− ２は、共同刺激シグナルをＴ細胞に伝達する能力を保持しており、その結果、二 次シグナルを受け取っていない活性化Ｔ細胞と比較してサイトカインの分泌が増 加する。 加えて、別のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−１）の活性を有する第二のペプチ ドと融合したＢ７−２の活性を有する第一のペプチドからなる融合蛋白を使用し て、Ｔ細胞仲介免疫反応を修飾することができる。別法として、Ｂリンパ球抗原 、例えばＢ７−２およびＢ７−１の活性を有する二つの別個のペプチド、または 、遮断抗体の組み合わせ（例えば抗Ｂ７−２および抗Ｂ７−１モノクローナル抗 体）を単一の組成物として合してまたは別々に（同時にまたは連続して）投与し て、対象におけるＴ細胞仲介免疫反応を上方調節または下方調節することができ る。さらに、Ｂ７−２活性および／またはＢ７−１活性を有する１またはそれ以 上のペプチドの治療的有効量を他の免疫調節試薬と共に使用して、免疫反応に影 響を及ぼすことができる。他の免疫調節試薬の例には、遮断抗体、例えばＣＤ２ ８またはＣＴＬＡ４に対するもの、他のＴ細胞マーカーに対するもの、またはサ イトカインに対するもの、融合蛋白、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ、または免疫抑制薬 、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６が包含される。 本発明に係る核酸分子から生成されるペプチドはさらに、Ｔ細胞の破壊により Ｔ細胞の機能を遮断する治療薬の組み立てにおいて有用となり得る。例えば、記 載されたように、分泌された形のＢリンパ球抗原は、標準的遺伝子工学技術によ って組み立てることができる。可溶性型のＢ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−３を リシンのような毒素に連結することにより、Ｔ細胞活性化を防止できる物質を作 成することができる。患者の体内への１つのまたは組み合わせた免疫毒素、例え ばＢ７−２−リシン、Ｂ７−１−リシンの注入は、Ｔ細胞、特により大量のＣＤ ２８およびＣＴＬＡ４を発現する活性化されたＴ細胞の死をもたらし得る。一価 の 形のＢ７−２の可溶性型単独でも、上記のようにＢ７−２機能の遮断に有用であ り、この場合は担体分子をも使用してよい。 Ｂリンパ球抗原の機能を妨げるもう一つの方法は、アンチセンスまたはトリプ レックスオリゴヌクレオチドの使用によるものである。例えば、Ｂ７−１、Ｂ７ −２またはＢ７−３翻訳開始部位付近の領域に対し相補的なオリゴヌクレオチド （例えば、Ｂ７−１についてはＴＧＧＣＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡ（配列番号 ２０）ヌクレオチド３２６−３０９、そしてＢ７−２についてはＧＣＣＡＡＡＡ ＴＧＧＡＴＣＣＣＣＡ（配列番号２１）を合成することができる。１またはそれ 以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、典型的には２００μｇ／ｍｌで、細 胞培地に添加し、または患者に投与して、Ｂ７−１、Ｂ７−２および／またはＢ ７−３の合成を妨げることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞に より取り込まれ、適当なＢリンパ球抗原ｍＲＮＡとハイブリダイズして翻訳を妨 げる。別法として、二本鎖ＤＮＡに結合しトリプレックス組み立て物を形成して ＤＮＡの巻き戻しと転写を妨げるオリゴヌクレオチドを使用することもできる。 いずれの結果においても、１またはそれ以上のＢリンパ球抗原の合成が遮断され る。 Ｅ．免疫反応の下方調節による治療用途。 本明細書に開示される新規なＢリンパ球抗原の構造および機能が提供されるな らば、幾つかの方法でＢリンパ球抗原の機能を下方調節し、それにより免疫反応 を下方調節することが可能である。下方調節は、既に進行中の免疫反応を阻害ま たは遮断する形であってよく、または免疫反応の誘導の防止を含んでいてもよい 。活性化Ｔ細胞の機能は、Ｔ細胞反応を抑制することにより、またはＴ細胞にお いて特異的寛容を誘導することにより、またはその両者によって阻害することが できる。Ｔ細胞反応の免疫抑制は、一般に、Ｔ細胞が抑制薬物に絶えずさらされ ていることを必要とする、活発な非抗原特異的過程である。寛容は、Ｔ細胞に不 応性またはアネルギーを誘発することを含むが、これは、一般に抗原特異的であ り、且つ寛容化物質への暴露が終わった後も持続することで免疫抑制とは区別で きる。操作上は、寛容は、寛容化物質の不在下で特異抗原に再暴露させた時のＴ 細胞反 応の欠如によって立証することができる。 １またはそれ以上のＢリンパ球抗原機能を下方調節または妨げること、例えば 活性化Ｔ細胞による高レベルリンホカイン合成の防止は、組織、皮膚および臓器 移植の状況ならびに移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の際に有用であろう。例えば、 Ｔ細胞機能の遮断は組織移植の際の組織破壊の低下をもたらすに相違ない。典型 的には、組織移植においては、移植片の拒絶はそれが外来性であるとのＴ細胞に よる認識で始まり、続いてその移植片を破壊する免疫反応へと続く。Ｂ７リンパ 球抗原が免疫細胞上でその天然リガンドと相互作用することを阻害または遮断す る分子（例えば、Ｂ７−２活性を有する可溶性単量体型のペプチドを単独で、ま たは別のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−１、Ｂ７−３）の活性を有する単量体型 のペプチドまたは遮断抗体と組み合わせて）を移植前に投与することで、対応す る共同刺激シグナルの伝達なしに免疫細胞上の天然リガンドに当該分子を結合さ せることができる。この方法でのＢリンバ球抗原機能の遮断は、免疫細胞、例え ばＴ細胞によるサイトカイン合成を防止し、したがって免疫抑制手段として作用 する。その上、共同剌激の欠如はＴ細胞のアネルギー化に十分であり、それによ り対象に寛容を誘導することができる。Ｂリンパ球抗原遮断試薬による長期寛容 の誘導は、これらの遮断試薬の反復投与の必要性を回避し得る。対象に十分な免 疫抑制または寛容を達成するためには、組み合わせたＢリンパ球抗原の機能を遮 断することも必要であるかも知れない。例えば、それらの抗原の各々の活性を有 するペプチドの可溶性型の組み合わせまたは遮断抗体を移植前に投与（別々にま たは単一組成物で一諸に）することによって、Ｂ７−２およびＢ７−１、Ｂ７− ２およびＢ７−３、Ｂ７−１およびＢ７−３またはＢ７−２、Ｂ７−１およびＢ ７−３の機能を遮断することが望ましいかも知れない。別法として、阻害型のＢ リンパ球抗原を、他の抑制剤、例えば他のＴ細胞マーカーに対するもしくはサイ トカインに対する遮断抗体、他の融合蛋白、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇ、または免疫 抑制薬と共に使用することもできる。 特定の遮断試薬が臓器移植拒絶またはＧＶＨＤを防止する有効性は、人間にお ける有効性が予想される動物モデルを用いて評価することができる。Ｂ７−１の 機能上重要な側面は種間で構造的に保存されており、故に、他のＢリンパ球抗原 も種にまたがって機能できると思われ、よってヒトの蛋白で構成される試薬を動 物系で使用することができる。使用できる適当な系の例には、ラットにおける同 種間の心臓移植およびマウスにおける異種間の膵島細胞移植が包含され、そのい ずれもが、レンショウ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７巻７８９−７９２頁（１９９ ２）およびトゥルカ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９ 巻１１１０２−１１１０５頁（１９９２）に記載のようにＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋 白の免疫抑制効果をインビボで調査するために使用された。さらに、ＧＶＨＤの マウスモデル（パウル編、ファンダメンタル・イムノロジー、レイヴン・プレス 、ニューヨーク、１９８９、８４６−８４７頁を参照されたい）を用いて、この 疾患の進行に及ぼすインビボのＢリンパ球抗原機能遮断の効果を測定することが できる。 例えばＢ７−２活性を有するペプチドを、単独、またはＢ７−１活性を有する ペプチドおよび／またはＢ７−３活性を有するペプチドと組み合わせて使用する ことにより、Ｂリンパ球抗原機能を遮断することは、自己免疫疾患の処置にも治 療上有用であり得る。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対し反応性であるＴ細 胞の不適当な活性化の結果であり、これがこの疾患の病理に含まれるサイトカイ ンおよび自己抗体の産生を促進する。自己反応性Ｔ細胞の活性化の防止は疾病の 症候を軽減または排除し得る。Ｂリンパ球抗原のレセプター：リガンド相互作用 を破壊することによりＴ細胞の共同剌激を遮断する試薬の投与を用いてＴ細胞の 活性化を阻害し、疾病の過程に含まれ得る自己抗体またはＴ細胞により誘導され るサイトカインの産生を防止することができる。さらに、遮断試薬は自己反応性 Ｔ細胞の抗原特異的寛容を誘導し、これは当該疾患からの長期間の治癒につなが る。自己免疫疾患を防止または軽減する遮断試薬の有効性は、幾つかの十分に性 格決定されたヒト自己免疫疾患の動物モデルを用いて測定することができる。例 には、マウス実験的自己免疫性脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺ Ｂハイブリッドマウスの全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫コラーゲン関 節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットの真性糖尿病、ならびにマウスの実験的重 症筋無力症が包含される（パウル編、ファンダメンタル・イムノロジー、レイヴ ン・プレス、ニューヨーク、１９８９、８４０−８５６頁を参照されたい）。 アトピー性アレルギーにおけるＩｇＥ抗体の反応は高度にＴ細胞依存性であり 、したがって、Ｂリンパ球抗原の誘発するＴ細胞活性化の阻害は、アレルギーお よびアレルギー性反応の処置に治療上有用であり得る。阻害型のＢ７−２蛋白、 例えばＢ７−２活性を有するペプチドを単独でまたは別のＢリンパ球抗原、例え ばＢ７−１の活性を有するペプチドと組み合わせてアレルギー患者に投与して、 その患者のＴ細胞仲介アレルギー反応を阻害することができる。Ｔ細胞のＢリン パ球抗原共同剌激の阻害は、適当なＭＨＣ分子と結合したアレルゲンへの暴露を 随伴し得る。アレルギー反応の性質は、アレルゲンの侵入経路および肥満細胞ま たは好塩基性細胞上のＩｇＥ沈着のパターンに応じて、全身性または局所性であ り得る。そこで、阻害型のＢ７−２蛋白の適切な投与により、Ｔ細胞仲介アレル ギー反応を局所的または全身的に阻害する必要があり得る。 Ｂリンパ球抗原機能の遮断によるＴ細胞活性化の阻害は、Ｔ細胞のウイルス感 染の際にも、治療上重要であり得る。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ ）において、ウイルスの複製はＴ細胞の活性化によって剌激される。Ｂ７−２機 能の遮断は、より低いレベルのウイルス複製へと導き、それによりＡＩＤＳの経 過を改善する。さらに、組み合わされたＢリンパ球抗原、即ちＢ７−１、Ｂ７− ２およびＢ７−３の機能の遮断もまた必要であるかもしれない。驚くべき事に、 ＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴ細胞はＢ７−１およびＢ７−２を発現する。この発現 はＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴ細胞の成長において重要であり、また、Ｂ７−２お よび／またはＢ７−３の機能と共にＢ７−１機能の遮断はＨＴＬＶ−Ｉ誘発白血 病の進行を遅くするかも知れない。別法として、単離および使用に十分な量のレ トロウイルスを生成させる目的のために、刺激型のＢ７−２蛋白との接触によっ てＴ細胞活性化によるウイルス複製の剌激を誘発してもよい。 Ｆ．免疫反応の上方調節による治療上の用途。 免疫反応を上方調節する手段としてのＢリンパ球抗原機能の上方調節もまた治 療に有用となり得る。免疫反応の上方調節は、存在している免疫反応の促進また は最初の免疫反応の顕現という形であり得る。例えば、Ｂリンパ球抗原機能を剌 激することによる免疫反応の増強は、ウイルス感染の場合に有用であり得る。ウ イルス感染は主として細胞溶解性Ｔ細胞により排除される。本発明に従えば、Ｔ 細胞上の天然リガンドを伴うＢ７−２、そして故にＢ７−１およびＢ７−３は、 少なくとも幾らかのＴ細胞の細胞溶解活性の増加をもたらし得る。さらに、Ｂ７ −２、Ｂ７−１およびＢ７−３がＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞の初期活性化および生 成に関与していることも信ぜられる。単独で、または別のＢリンパ球抗原の活性 を有するペプチドと組み合わせて、多価型で、Ｂ７−２活性を有する可溶性ペプ チドを添加して共同刺激経路を介してＴ細胞活性を剌激することは、このように 、ウイルスのより迅速なまたは完全な排除が有利である状況において治療上有用 となるであろう。これらは、ヘルペスまたは帯状疱疹のようなウイルス性皮膚疾 患を包含し、これらの場合、Ｂ７−２活性を有する多価可溶性ペプチド、または 係るペプチドおよび／またはＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７ −３活性を有するペプチドの組み合わせを局所的に皮膚に適用する。加えて、イ ンフルエンザ、風邪、および脳炎のような全身性ウイルス疾患が、刺激型のＢリ ンパ球抗原の全身投与によって軽快し得る。 別法として、患者からＴ細胞を除去し、Ｂ７−２活性を有するペプチドを発現 （単独でまたはＢ７−１活性を有するペプチドおよび／またはＢ７−３活性を有 するペプチドと組み合わせて）する、ウイルス抗原でパルスしたＡＰＣにより、 またはＢ７−２活性を有する可溶性ペプチドの刺激型（単独でまたはＢ７−１活 性を有するペプチドおよび／またはＢ７−３活性を有するペプチドと組み合わせ て）と共に、ウイルス抗原でパルスしたＡＰＣにより、インビトロでＴ細胞を共 同刺激し、そしてこのインビトロで活性化したＴ細胞を再び患者に導入すること によって、感染した患者における抗ウイルス免疫反応を増進させることもできる 。抗ウイルス免疫反応を増進させる別の方法は、感染した細胞を患者から分離し 、それらを、本明細書に記載のＢリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコード し ている核酸を用いてトランスフェクトしてその細胞がその表面にＢリンパ球抗原 、例えばＢ７−２またはＢ７−３の全てまたは一部を発現するようにさせ、そし てこのトランスフェクトされた細胞を再び患者の体内に導入することである。そ うすれば、感染した細胞は、インビボでＴ細胞に共同刺激シグナルを伝達でき、 そして故にＴ細胞を活性化することができるであろう。 剌激型のＢリンパ球抗原は、予防的に、種々の病原体に対するワクチンに使用 することもできる。病原体、例えばウイルスに対する免疫は、適当なアジュバン トに入れた、Ｂ７−２活性を有するペプチドまたはＢリンパ球抗原の活性を有す る別のペプチドの刺激型を伴うウイルス蛋白によってワクチン接種することによ り誘導し得る。別法として、病原性抗原およびＢリンパ球抗原の活性を有するペ プチド両者のための遺伝子をコードしている発現ベクター、例えば、ウイルス蛋 白をコードしている核酸と、本明細書に記載のようなＢ７−２活性を有するペプ チドをコードしている核酸とを発現するよう組み立てられたワクシニアウイルス 発現ベクターを、ワクチン接種に使用することもできる。例えばＢ７−２活性を 有するペプチドおよびＭＨＣクラスＩα鎖蛋白およびβ2ミクログロブリンを同 時発現するようトランスフェクトさせた細胞による、クラスＩ ＭＨＣ蛋白を伴 うＢ７−２の提示もまた、細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらし、ウイ ルス感染からの免疫感作を提供する。ワクチンが有用となり得る病原体には、Ｂ 型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス、Ｈ ＩＶ−１、ＨＩＶ−２、結核、マラリアおよび住血吸虫症が包含される。 別の態様において、Ｂリンパ球抗原の活性を有する１またはそれ以上の可溶性 ペプチドの剌激型を、腫瘍を持つ患者に投与して、抗腫瘍性免疫を誘導するため のＴ細胞に対する共同剌激シグナルを提供することができる。 Ｇ．共同剌激分子を発現させるための腫瘍細胞の修飾。 腫瘍細胞がＴ細胞における共同刺激シグナルを誘発できないのは、共同刺激分 子の発現の欠如、たとえ腫瘍細胞が係る分子を発現できる能力があったとしても 共同刺激分子の発現に失敗したこと、腫瘍細胞表面の共同剌激分子の発現が不十 分であること、または適切な共同刺激分子の発現が無いこと（例えばＢ７−２お よび／またはＢ７−３ではなくＢ７の発現）に起因し得る。したがって、本発明 の一つの態様によれば、腫瘍細胞を、腫瘍細胞表面でのＢ７−２および／または Ｂ７−３の発現に好適な形のＢ７−２および／またはＢ７−３をコードしている 核酸でトランスフェクトすることにより、この腫瘍細胞をＢ７−２および／また はＢ７−３を発現するよう修飾する。別法として、腫瘍細胞を、腫瘍細胞表面で のＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を誘導または増強する物質と接触させ ることにより、修飾する。さらに別の態様においては、Ｂ７−２および／または Ｂ７−３を腫瘍細胞の表面に結合させて修飾された腫瘍細胞を生成させる。これ らのおよびその他の態様を、以下の亜項においてさらに詳細に説明する。 （１）共同刺激分子をコードしている核酸による腫瘍細胞のトランスフェクシ ョン。 分離された腫瘍細胞を、その腫瘍細胞の表面に当該分子を発現するのに好適な 形でＢ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１をコードしている核酸でト ランスフェクトすることにより、Ｂ７−２またはＢ７−３を単独でまたはＢ７− １と組み合わせて発現するよう、この腫瘍細胞をエクスビボで修飾することがで きる。「トランスフェクション」または「でトランスフェクト」という語は、外 因性核酸を哺乳動物細胞中に導入することを意味し、電気穿孔、燐酸カルシウム 沈殿化、ＤＥＡＥデキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクシ ョンおよびウイルスベクターによる感染を包含する、哺乳動物細胞中に核酸を導 入するのに有用な様々な技術を包含している。哺乳動物細胞をトランスフェクト するための好適な方法は、サムブルック等（モレキュラー・クローニング：ア・ ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ トリー・プレス（１９８９））およびその他の研究室用教科書に見いだすことが できる。導入すべき核酸は、例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコード している遺伝子を包含するＤＮＡ、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコードし ているセンス鎖ＲＮＡ、またはＢ７−２および／またはＢ７−３をコードしてい るｃＤＮＡを含む組み替え発現ベクターであってよい。ヒトＢ７−２をコードし ているｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列表に示す。 腫瘍細胞中にＢ７−２および／またはＢ７−３をコードしている核酸を導入す るための好ましいアプローチは、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコードして いる核酸、例えばｃＤＮＡを含むウイルスベクターの使用によるものである。使 用できるウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター（Ｍ．Ａ．エグリテ ィス等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻１３９５−１３９８頁（１９８５）；Ｏ．ダ ノスおよびＲ．ミュリガン、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８５巻６４６０−６４６４頁（１９８８）；Ｄ．マルコヴィッツ等、Ｊ．Ｖｉｒ ｏｌ．、６２巻１１２０−１１２４頁（１９８８））、アデノウイルスベクター （Ｍ．Ａ．ローゼンフェルト等、Ｃｅｌｌ、６８巻１４３−１５５頁（１９９２ ））およびアデノ伴生ウイルスベクター（Ｊ．Ｄ．トラッチン等、Ｍｏｌ．Ｃｅ ｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻３２５１−３２６０頁（１９８５））を包含する。ウイ ルスベクターによる腫瘍細胞の感染は、細胞の大部分が核酸を受け入れ、それに より、核酸を受け入れた細胞の選択の必要性が回避され、また、例えばウイルス ベクター中に含まれるｃＤＮＡによりウイルスベクター内にコードされている分 子は、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞中で効率よく発現されるという 利点を有する。 別法として、Ｂ７−２および／またはＢ７−３は、Ｂ７−２および／またはＢ ７−３をコードしている核酸、例えばｃＤＮＡを含むプラスミド発現ベクターを 用いて腫瘍細胞上に発現され得る。好適なプラスミド発現ベクターは、ＣＤＭ８ （Ｂ．シード、Ｎａｔｕｒｅ、３２９巻８４０頁（１９８７））およびｐＭＴ２ ＰＣ（カウフマン等、ＥＭＢＯ Ｊ．、６巻１８７−１９５頁（１９８７））を 包含する。宿主細胞、例えば腫瘍細胞中で核酸を発現するための好適なベクター および方法は、本明細書にさらに詳細に記載される。 腫瘍細胞のトランスフェクションが、その腫瘍細胞の大部分の修飾および腫瘍 細胞の表面でのＢ７−２および／またはＢ７−３の効率的な発現につながる場合 、例えばウイルス発現ベクターを使用する場合、腫瘍細胞は、さらなる分離また はサブクローニングなしで使用することができる。別法として、トランスフェク トされた腫瘍細胞の均質な集団は、１個のトランスフェクトされた腫瘍細胞を限 界 希釈クローニングし、その後この１個の腫瘍細胞を標準技術により細胞のクロー ン集団へと拡大することによって調製することができる。 （２）腫瘍細胞表面での共同刺激分子の誘導または発現増強。 Ｂ７−２および／またはＢ７−３を発現する能力はあるがそれができない、ま たはＴ細胞を活性化するには不十分な量でＢ７−２および／またはＢ７−３を発 現する腫瘍細胞上でＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を誘導または発現レ ベルを増強することにより、Ｔ細胞において共同剌激シグナルを誘発するよう、 腫瘍細胞を修飾することができる。腫瘍細胞上でＢ７−２および／またはＢ７− ３の発現を誘導または増強するため、Ｂ７−２および／またはＢ７−３の発現を 剌激する物質を使用することができる。例えば、腫瘍細胞を、培養基中インビト ロでこの物質と接触させることができる。Ｂ７−２および／またはＢ７−３の発 現を剌激する物質は、例えばＢ７−２および／またはＢ７−３遺伝子の転写を増 強することにより、Ｂ７−２および／またはＢ７−３ｍＲＮＡの翻訳を増強する ことにより、または、細胞表面に対するＢ７−２および／またはＢ７−３の安定 性もしくは輸送を増強することにより、作用し得る。例えば、Ｂ７の発現は、ｃ ＡＭＰを含む第二のメッセンジャー経路により細胞内で上方調節され得ることが 知られている。Ｎ．ナバヴィ等、Ｎａｔｕｒｅ、３６０巻２６６−２６８頁（１ ９９２）。Ｂ７−２およびＢ７−３も同様にｃＡＭＰによって誘導可能である。 即ち、腫瘍細胞を、細胞内ｃＡＭＰレベルを増大させる、またはｃＡＭＰ類似体 のようなｃＡＭＰに近似した物質、例えばジブチリルｃＡＭＰと接触させて、こ の腫瘍細胞表面のＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を刺激することができ る。Ｂ細胞上の細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子をＭＨＣクラスＩＩ分子に対する 抗体で架橋することにより、正常な静止Ｂ細胞上にＢ７の発現が誘導されること もまた知られている。Ｌ．クオロヴァ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻７５ ９−７６２（１９９１）。同様に、Ｂ細胞上の細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子を 架橋することによってＢ７−２およびＢ７−３が静止Ｂ細胞上に誘導され得る。 したがって、その表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する腫瘍細胞を抗ＭＨＣク ラスＩＩ抗体で処理して、その腫瘍細胞表面のＢ７−２および／またはＢ７−３ 発現を誘導または増強することができる。加えて、Ｂ細胞上のＢ７−２の発現を 誘導することが判明しているインターロイキン４（ＩＬ−４）を用いて、腫瘍細 胞上のＢ７−２の発現を上方調節することができる（Ｒ．Ｍ．スタック等、Ｊ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈeｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１（１８）巻４３４頁（１９９４） 。 腫瘍細胞表面のＢ７−２および／またはＢ７−３の発現を誘導または増強する のに使用できるもう一つの物質は、共同剌激分子をコードしている遺伝子の転写 を上方調節する転写因子をコードしている核酸である。共同剌激分子の遺伝子の 転写を増強させるためにこの核酸を腫瘍細胞中にトランスフェクトし、その結果 共同剌激分子の細胞表面レベルの増大をもたらすことができる。 （３）腫瘍細胞の表面への共同刺激分子の結合。 別の態様においては、Ｂ７−２および／またはＢ７−３を腫瘍細胞の表面に結 合させることにより、この腫瘍細胞を、Ｔ細胞における共同剌激シグナルが誘発 可能となるよう修飾する。例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−３分子は、共 同剌激分子の生成および単離を可能にする標準的組み替えＤＮＡ技術および発現 系を用いて取得することができる。別法として、標準的蛋白精製技術を用いてＢ ７−２および／またはＢ７−３を、共同剌激分子を発現する細胞から単離するこ ともできる。例えば、Ｂ７−３蛋白は、ＢＢ１モノクローナル抗体のような抗Ｂ ７−３抗体を用いる免疫沈降によって、活性化Ｂ細胞から単離することができる 。次いで、単離された共同剌激分子を腫瘍細胞に結合させる。「結合した」また は「結合している」という語は、それによってＢ７−２および／またはＢ７−３ が腫瘍細胞に連結し、その結果共同刺激分子が腫瘍細胞表面に存在してＴ細胞に おける共同刺激シグナルを誘発できるような化学的、酵素的またはその他の手段 （例えば抗体）を意味する。例えば、Ｂ７−２および／またはＢ７−３は、市販 品が入手可能な架橋試薬（ピアス、ロックフォード、ＩＬ）を用いて腫瘍細胞表 面に化学的に架橋することができる。Ｂ７−２および／またはＢ７−３を腫瘍細 胞に結合させる別のアプローチは、共同刺激分子と腫瘍細胞上の細胞表面分子の 両者に結合する二重特異性抗体を使用することである。腫瘍細胞の表面に結合さ せた時にＴ細胞において共同刺激シグナルを誘発する能力を保持している、Ｂ７ −２ および／またはＢ７−３のフラグメント、突然変異体または変異体もまた使用す ることができる。 （４）複数の共同剌激分子を発現させるような腫瘍細胞の修飾 本発明のもう一つの態様は、複数の共同刺激分子を発現するように修飾された 腫瘍細胞である。活性化されたＢ細胞上の共同剌激分子の一時的発現は、Ｂ７、 Ｂ７−２およびＢ７−３に対して異なっている。例えば、Ｂ７−２はＢ細胞活性 化後、早期に発現され、一方Ｂ７−３は後に発現される。即ち、異なった共同剌 激分子は、免疫反応の過程中、別個の機能を果たすことができる。有効なＴ細胞 の反応には、Ｔ細胞が複数の共同剌激分子から共同刺激シグナルを受け取ること が必要であるかも知れない。したがって、本発明は、１以上の共同刺激分子を発 現するよう修飾された腫瘍細胞を包含する。例えば、腫瘍細胞は、Ｂ７−２およ びＢ７−３の両者を発現するよう修飾することができる。別法として、Ｂ７−２ を発現するよう修飾された腫瘍細胞を、Ｂ７−１を発現するようさらに修飾する こともできる。同様に、Ｂ７−３を発現するよう修飾された腫瘍細胞を、Ｂ７− １を発現するようさらに修飾することもできる。Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＢ７ −３を発現するよう、腫瘍細胞を修飾することもできる。本明細書に記載される 任意の技術によって、複数の共同刺激分子（例えばＢ７−１およびＢ７−２）を 発現するよう、腫瘍細胞を修飾することができる。 修飾の前には、腫瘍細胞は、いずれの共同刺激分子も発現しないかも知れない し、または或る共同剌激分子は発現するが別のものは発現しないかも知れない。 本明細書に記載のように、腫瘍細胞は、共同剌激分子をコードしている核酸でそ の腫瘍細胞をトランスフェクトすることにより、共同刺激分子の発現を誘導する ことにより、または、その腫瘍細胞に共同刺激分子を結合させることにより、修 飾することができる。例えば、Ｂ７−２をコードしている核酸でトランスフェク トされた腫瘍細胞は、Ｂ７−１をコードしている核酸でさらにトランスフェクト することができる。ヒトＢ７−１のｃＤＮＡおよび導き出されたアミノ酸配列を 配列表に示す。別法として、１以上の型の修飾を施すこともできる。例えば、Ｂ ７−２をコードしている核酸でトランスフェクトされた腫瘍細胞を、Ｂ７−１の 発現を誘導する物質で剌激することができる。 （５）ＭＨＣ分子を発現させるためのさらなる腫瘍細胞の修飾。 本発明のまた別の態様は、共同刺激分子を発現し、且つ１またはそれ以上のＭ ＨＣ分子をそれらの表面に発現して、Ｔ細胞に、共同剌激シグナルおよび第一の 抗原特異的シグナルの両者を誘発するように修飾した腫瘍細胞を特徴とする。修 飾の前には、腫瘍細胞は、ＭＨＣ分子を発現できないかも知れず、ＭＨＣ分子を 発現する能力はあっても係る分子の発現ができないかも知れず、または、Ｔ細胞 活性化を惹起するに十分な量のＭＨＣ分子を腫瘍細胞上に発現しないかも知れな い。腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれか、また は両者を発現するよう修飾することができる。ＭＨＣ分子を発現するよう腫瘍細 胞を修飾する一つのアプローチは、１またはそれ以上のＭＨＣ分子をコードして いる１またはそれ以上の核酸で腫瘍細胞をトランスフェクトすることである。別 法として、腫瘍細胞上での１またはそれ以上のＭＨＣ分子の発現を誘導または増 強する物質を用いて腫瘍細胞を修飾することもできる。腫瘍ペプチドをＣＤ４+ Ｔ細胞に直接提示するＭＨＣクラスＩＩ+腫瘍細胞の能力は、プロフェッショナ ルなＭＨＣクラスＩＩ+ＰＣの必要性を回避できることから、腫瘍細胞上のＭＨ ＣクラスＩＩ分子の発現の誘導または増強は、腫瘍に対するＣＤ４+Ｔ細胞の活 性化にとって特に有益となり得る。可溶性の腫瘍抗原（腫瘍細胞の破片または分 泌された蛋白の形）はプロフェッショナルなＭＨＣクラスＩＩ+ＡＰＣによる取 り込みに利用され得ないため、このことは腫瘍の免疫原性を改善し得る。 本発明の一つの態様は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３ならびに１またはそ れ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を細胞表面に発現する、修飾された腫瘍細胞であ る。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、構造的には抗原性ペプチドがその中に結合する裂 け目を含み、そして、結合したペプチドを抗原特異性ＴｃＲに提示する機能を有 する、細胞表面α／βヘテロ二量体である。複数の異なったＭＨＣクラスＩＩ蛋 白が、プロフェッショナルＡＰＣ上に発現され、異なったＭＨＣクラスＩＩ蛋白 は異なった抗原性ペプチドに結合する。故に、複数のＭＨＣクラスＩＩ分子の発 現は、ＡＰＣによりまたは修飾された腫瘍細胞により提示され得る抗原性ペプチ ドのスペクトルを増大する。ＭＨＣクラスＩＩ分子のαおよびβ鎖は異なった遺 伝子によりコードされている。例えば、ヒトＭＨＣクラスＩＩ蛋白ＨＬＡ−ＤＲ は、ＨＬＡ−ＤＲαおよびＨＬＡ−ＤＲβ遺伝子によりコードされている。さら に、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の多くの多形性対立遺伝子が、ヒトおよびその他の 種に存在する。特定の個体のＴ細胞は、自己のＭＨＣ分子と結合した抗原性ペプ チドによる刺激に応答し、これはＭＨＣ制限と呼ばれる現象である。加えて、或 るＴ細胞は、他の個体の細胞上に見いだされるＭＨＣ分子の多形性対立遺伝子に よる剌激にも応答することができ、これは同種性と呼ばれる現象である。ＭＨＣ クラスＩＩの構造および機能の総説については、ジャーメインおよびマーギュリ ーズ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻４０３−４５０頁１９９３、 を参照されたい。 本発明の別の態様は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３ならびに１またはそれ 以上のＭＨＣクラスＩ分子を細胞表面に発現する、修飾された腫瘍細胞である。 ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子と同様に、複数のＭＨＣクラスＩ遺伝子があり、これら 遺伝子の多くの多形性対立遺伝子が、ヒトおよびその他の種で発見されている。 ＭＨＣクラスＩＩ蛋白と同様に、クラスＩ蛋白は、Ｔ細胞に対する提示のために 抗原のペプチドフラグメントに結合する。機能的細胞表面クラスＩ分子は、β２ ミクログロブリン蛋白と結合したＭＨＣクラスＩα鎖蛋白により構成される。 （６）ＭＨＣ分子をコードしている核酸による腫瘍細胞のトランスフェクショ ン。 １またはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩα鎖および１またはそれ以上のＭＨＣク ラスＩＩβ鎖を、腫瘍細胞の表面でのＭＨＣクラスＩＩ分子の発現に好適な形で コードしている１またはそれ以上の核酸によって、単離された腫瘍細胞をトラン スフェクトすることにより、１またはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現す るよう、腫瘍細胞をエクスビボで修飾することができる。表面のヘテロ二量体を 形成させるためにαおよびβ鎖蛋白の両方が腫瘍細胞に存在せねばならず、いず れの鎖も単独では細胞表面に発現されないであろう。多くのマウスおよびヒトク ラスＩＩ遺伝子の核酸配列が知られている。例えば、Ｌ．フード等、Ａｎｎ．Ｒ ｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻５２９−５６８頁（１９８３）およびＣ．オーフ レイおよびＪ．Ｌ．ストロミンガー、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻１９７−２４７頁（１９８７）を参照されたい。好まし くは、導入されるＭＨＣクラスＩＩ分子は自己ＭＨＣクラスＩＩ分子である。別 法として、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、外来の同種ＭＨＣクラスＩＩ分子であって もよい。腫瘍細胞中に導入されるべき特定の外来ＭＨＣクラスＩＩ分子は、腫瘍 を持っている対象由来のＴ細胞に、その外来ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細 胞により刺激された場合にサイトカインを増加および／または分泌させるよう誘 導する能力によって（即ち、同種反応を誘導する能力によって）選択することが できる。トランスフェクトすべき腫瘍細胞は、トランスフェクション前にはその 表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しないかも知れないし、またはＴ細胞の応答 を刺激するには不十分な量を発現するかも知れない。別法として、トランスフェ クション前にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する腫瘍細胞を、さらなる異なったＭ ＨＣクラスＩＩ遺伝子によって、またはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の他の多形性対 立遺伝子によってさらにトランスフェクトし、その腫瘍細胞がＴ細胞に対して提 示できる抗原性フラグメントのスペクトルを増大させることもできる。 Ｔ細胞による増殖および／またはリンホカイン産生によって立証されるような 、ペプチド抗原を結合させＴ細胞反応を活性化する能力を保持しているＭＨＣク ラスＩＩ分子のフラグメント、突然変異体または変異体は、本発明の範囲内にあ ると考えられる。好ましい変異体は、αおよびβ鎖の一方または両方の細胞質ド メインが末端切除されているＭＨＣクラスＩＩ分子である。細胞質ドメインの末 端切除は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチドの結合およびＭＨＣクラスＩＩ 分子の細胞表面での発現を可能にするが、細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子の架橋 の際ＭＨＣクラスＩＩ蛋白鎖の細胞質ドメインによって生成される細胞内シグナ ルによって誘発される内因性Ｂ７発現の誘導を妨げることが知られている。Ｌ． クオロヴァ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻７５９−７６２頁（１９９１） ；Ｎ．ナバヴィ等、Ｎａｔｕｒｅ、３６０巻２６６−２６８頁（１９９２）。Ｂ ７−２およびＢ７−３の発現もまた架橋している表面ＭＨＣクラスＩＩ分子によ っ て誘導され、したがってＭＨＣクラスＩＩ分子の末端切除はＢ７−２および／ま たはＢ７−３の誘導をも妨げ得る。Ｂ７−２および／またはＢ７−３の構成的発 現を行うようトランスフェクトさせた腫瘍細胞においては、内因性共同刺激分子 の発現を阻害する、例えば、起こり得る下方調節フィードバック機作を抑制する ことが望ましいかも知れない。細胞質ドメイン末端切除型のＭＨＣクラスＩＩα およびβ鎖蛋白をコードしている核酸による腫瘍細胞のトランスフェクションは 、内因性Ｂ７−１の発現および恐らくは内因性Ｂ７−２およびＢ７−３の発現を も阻害するであろう。このような変異体は、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ鎖遺伝子 中の膜貫通領域をコードしているヌクレオチドの後に停止コドンを導入すること によって生成させることができる。α鎖またはβ鎖蛋白いずれかの細胞質ドメイ ンを末端切除、または、より完全なＢ７（そして恐らくはＢ７−２および／また はＢ７−３）誘導の阻害のために、αおよびβ鎖の両者を末端切除することがで きる。例えばグリフィス等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ８５巻４８４７−４８５２頁（１９８８）、ナバヴィ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 、１４２巻１４４４−１４４７頁（１９８９）を参照されたい。 腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩα鎖蛋白をコードしている核酸でトランスフェク トすることにより、ＭＨＣクラスＩ分子を発現するよう修飾することができる。 核酸の例については、Ｌ．フード等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻 ５２９−５６８頁（１９８３）およびＣ．オーフレイおよびＪ．Ｌ．ストロミン ガー、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻１９７ −２４７頁（１９８７）を参照されたい。所望により、その腫瘍細胞がβ２ミク ログロブリンを発現しないならば、これを、β２ミクログロブリン蛋白をコード している核酸でトランスフェクトすることもできる。核酸の例については、Ｄ． グソウ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３９巻３１３２−３１３８頁（１９８７） およびＪ．Ｒ．パーンズ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ７８巻２２５３−２２５７頁（１９８１）を参照されたい。ＭＨＣクラスＩＩ分 子と同様に、腫瘍細胞で発現されるＭＨＣクラスＩ遺伝子またはＭＨＣクラスＩ 遺伝子の多形性対立遺伝子の数を増加させることにより、その腫瘍細胞がＴ細胞 に提示することのできる抗原性フラグメントのスベクトルを増大させることがで きる。 １以上の分子、例えばＢ７−２および／またはＢ７−３分子、ＭＨＣクラスＩ Ｉα鎖蛋白およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖蛋白をコードしている核酸で腫瘍細胞を トランスフェクトする時、このトランスフェクションは同時にまたは順次実施す ることができる。もしトランスフェクションを同時に実施するならば、コードさ れる配列が使用する特定のベクターの負担能力を超えない限り、当該分子は同じ 核酸上に導入できる。別法として、当該分子を別々の核酸によりコードすること もできる。トランスフェクションを連続的に実施し、且つ腫瘍細胞が選択マーカ ーを用いて選択される場合、一つの選択マーカーを最初に導入された核酸に関連 して使用し、一方、異なる選択マーカーを次に導入される核酸に関連して使用す ることができる。 腫瘍細胞の細胞表面でのＭＨＣ分子（クラスＩまたはクラスＩＩ）の発現は、 例えば、異なるＭＨＣ分子に対する蛍光標識されたモノクローナル抗体を用いて 腫瘍細胞の免疫蛍光によって測定することができる。特定のＭＨＣ分子の非多形 性領域（非対立遺伝子特異性）または特定のＭＨＣ分子の多形性領域（対立遺伝 子特異性）のいずれかを認識するモノクローナル抗体を使用することができ、そ してこれらは当業者に知られている。 （７）腫瘍細胞上でのＭＨＣ分子の誘導または発現の増強。 腫瘍細胞の表面でＭＨＣ分子を発現するよう腫瘍細胞をエクスビボで修飾する 別のアプローチは、その腫瘍細胞表面でＭＨＣ分子の発現を誘導または増強する ために、ＭＨＣ分子の発現を剌激する物質を使用することである。例えば、腫瘍 細胞を培養基中、インビトロで当該物質と接触させることができる。ＭＨＣ分子 の発現を刺激する物質は、例えば、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ遺 伝子の転写を増強することによって、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ ｍＲＮＡの翻訳を増強することによって、または、ＭＨＣクラスＩおよび／また はクラスＩＩ蛋白の細胞表面に対する安定性または細胞表面への輸送を増強する ことによって、働き得る。幾つかの物質がＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現 のレベルを増強することが示されている。例えば、Ｓ．Ｍ．コックフィールド等 、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４巻２９６７−２９７４頁（１９９０）；Ｒ．Ｊ ．ノエル等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻１７１８−１７２３頁（１９８６ ）；Ｊ．Ｊ．モンド等、Ｊ．ｍｍｕｎｏｌ．、１２７巻８８１−８８８頁（１９ ８１）；Ｃ．Ｌ．ウィリアム等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７０巻１５５９−１ ５６７頁（１９８９）；Ａ．セラダおよびＲ．マキ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１ ４６巻１１４−１２０頁（１９９１）およびＬ．Ｈ．グリムチャーおよびＣ．Ｊ ．カラ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻１３−４９頁（１９９２） およびそれらの参照文献を参照されたい。これらの物質には、サイトカイン、他 の細胞表面分子に対する抗体、およびホルボールエステル類が包含される。広範 囲の細胞型においてＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子を上方調節する一つの 物質はサイトカインインターフェロンγである。即ち、例えば、Ｂ７−２および ／またはＢ７−３およびＢ７−１を発現するよう修飾された腫瘍細胞は、インタ ーフェロンγとの接触により、ＭＨＣ分子の発現を増強するようさらに修飾する ことができる。 腫瘍細胞表面でのＭＨＣ分子の発現を誘導または増強するために使用できるも う一つの物質は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ遺伝子の転写を上方調節する 転写因子をコードしている核酸である。このような核酸は、腫瘍細胞中にトラン スフェクトされてＭＨＣ遺伝子の転写の増強を惹起することができ、その結果Ｍ ＨＣ蛋白の細胞表面レベルを増大させる。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝 子は異なった転写因子によって調節されている。しかしながら、複数のＭＨＣク ラスＩＩ遺伝子がそうであるように、複数のＭＨＣクラスＩ遺伝子が協同的に調 節されている。故に、ＭＨＣ遺伝子の発現を調節する転写因子をコードしている 核酸による腫瘍細胞のトランスフェクションは、腫瘍細胞表面の幾つかの異なっ たＭＨＣ分子の発現を増強することができる。ＭＨＣ遺伝子の発現を調節する幾 つかの転写因子が同定され、クローニングされ、そして性格決定されている。例 えば、Ｗ．ライス等、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、４巻１５２８−１５４０頁（１９ ９０）；Ｈ．Ｃ．リュー等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７巻１５８１−１５８４頁（ １ ９８８）；Ｄ．Ｋ．ディディアー等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻７３２２−７３２６頁（１９８８）。 （８）腫瘍細胞における非変異鎖の発現の阻害。 本発明のもう一つの態様は、Ｔ細胞共同刺激分子（例えばＢ７−２および／ま たはＢ７−３およびＢ７−１）を発現するよう修飾された腫瘍細胞であって、Ｍ ＨＣクラスＩＩに結合した蛋白、非変異鎖、の発現が阻害される腫瘍細胞を提供 するものである。非変異鎖の発現が阻害されて、内因性ＴＡＡペプチドとＭＨＣ クラスＩＩ分子との結合が促進し、抗原−ＭＨＣ複合体が作り出される。この複 合体は、共同剌激シグナルと関連してＴ細胞の活性化を誘導するためのＴ細胞に おける抗原特異的シグナルを誘発することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子は内 因性ペプチドを提示する能力のあることが示されている。Ｊ．Ｇ．ナクターン等 、Ｎａｔｕｒｅ、３４３巻７４−７６頁（１９９０）；Ｓ．ワイスおよびＢ．ボ ーゲン、Ｃｅｌｌ、７６７−７７６頁（１９９１）。しかしながら、ＭＨＣクラ スＩＩ分子を天然に発現する細胞においては、αおよびβ鎖蛋白は、小胞体から のこの蛋白の細胞内輸送の間、非変異鎖（以下Ｉｉ）と結合している。Ｉｉは、 部分的には、内因性ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を妨げることによ り機能すると信ぜられる。Ｗ．エリオット等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３８巻 ２９４９−２９５２頁（１９８７）；Ｂ．ストッキンガー等、Ｃｅｌｌ、５６巻 ６８３−６８９頁（１９８９）；Ｌ．グアグリアーディ等、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏ ｎｄｏｎ）、３４３巻１３３−１３９頁（１９９０）；Ｏ．バッケ等、Ｃｅｌｌ 、６３巻７０７−７１６頁（１９９０）；Ｖ．ロットルー等、Ｎａｔｕｒｅ、３ ４８巻６００−６０５頁（１９９０）；Ｊ．ピーターズ等、Ｎａｔｕｒｅ、３４ ９巻６６９−６７６頁（１９９１）；Ｐ．ロッチェ等、Ｎａｔｕｒｅ、３４５巻 ６１５−６１８頁（１９９０）；Ｌ．テイトン等、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻３９ −４４頁（１９９０）。ＴＡＡは腫瘍細胞において内因性合成されるのであるか ら、これらから誘導されるペプチドは細胞内で利用できると思われる。したがっ て、Ｉｉを発現する腫瘍細胞でのＩｉの発現の阻害は、ＴＡＡペプチドがＭＨＣ クラスＩＩ分子と結合する見込みを増大させ得る。この機作と合致して、Ｉｉ遺 伝子 によるＭＨＣクラスＩＩ+、Ｉｉ-腫瘍細胞の超トランスフェクションが、この腫 瘍細胞による腫瘍特異的免疫の刺激を妨げることが示された。Ｖ．Ｋ．クレメン ツ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻２３９１−２３９６頁（１９９２）。 修飾に先立ち、腫瘍細胞におけるＩｉの発現を、ノーザンブロッティングによ るＩｉ ｍＲＮＡの存在もしくは不在の検出により、または免疫沈降によるＩｉ 蛋白の存在または不在の検出により、評価することができる。Ｉｉの発現を阻害 するための好ましいアプローチは、Ｉｉ遺伝子のコーディングまたは調節領域に 対してアンチセンスの核酸を腫瘍細胞中に導入することによるものであって、こ れはかつて記載されている。Ｎ．コッホ等、ＥＭＢＯ Ｊ．、６巻１６７７−１ ６８３頁（１９８７）。例えば、Ｉｉ ｍＲＮＡの翻訳開始部位付近のヌクレオ チドに対し相補的なオリゴヌクレオチドを合成することができる。１またはそれ 以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、腫瘍細胞を含む培地に、典型的には ２００μｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチド濃度で添加することができる。このアン チセンスオリゴヌクレオチドは腫瘍細胞により取り込まれてＩｉ ｍＲＮＡとハ イブリダイズし、翻訳を妨げる。別の態様においては、組み替え発現ベクターを 使用し、ここで核酸は、Ｉｉ遺伝子のコーディングまたは調節領域に対しアンチ センスであるｍＲＮＡが産生されるような向きにＩｉ遺伝子の配列をコードして いる。したがってこの組み替え発現ベクターによりトランスフェクトされた腫瘍 細胞は、Ｉｉ蛋白の産生を妨げるためのＩｉアンチセンス核酸の継続的な供給源 を含む。別法として、腫瘍細胞におけるＩｉ発現は、この腫瘍細胞を、Ｉｉ発現 を妨害する物質で処理することによって阻害することもできる。例えば、Ｉｉ遺 伝子の発現、ＩｉｍＲＮＡの翻訳またはＩｉ蛋白の安定性もしくは細胞内輸送を 阻害する薬物を使用することができる。 （９）修飾される腫瘍細胞の型。 本明細書に記載されるような修飾を受ける腫瘍細胞は、Ｂ７−２および／また はＢ７−３を単独またはＢ７−１と組み合わせて発現するための、本発明により 包含される１またはそれ以上のアプローチによりトランスフェクトまたは処理す ることができる腫瘍細胞を包含する。必要ならば、この腫瘍細胞をさらに修飾し てＭＨＣ分子またはＩｉ発現の阻害剤を発現するようにすることができる。腫瘍 細胞を取得する腫瘍は、例えば人間の患者において、自然発生したものであって よく、または、例えば動物対象において実験的に誘導もしくは誘発したものであ ってよい。腫瘍細胞は、例えば、臓器の充実性腫瘍、例えば肺、肝臓、***、結 腸、骨などの腫瘍から取得することができる。充実性臓器の悪性腫瘍には、癌腫 、肉腫、黒色腫および神経芽細胞腫が包含される。腫瘍細胞は、リンパ腫、骨髄 腫または白血病のような血液に由来する（即ち、分散された）悪性腫瘍から取得 することもできる。 修飾されるべき腫瘍細胞は、トランスフェクション前にその細胞表面にＭＨＣ 分子を発現するもの、および皆無または低いレベルのＭＨＣクラスＩおよび／ま たはクラスＩＩ分子を発現するものを包含する。正常な細胞型のうち少数がＭＨ ＣクラスＩＩ分子を発現する。故に、多くの腫瘍細胞は天然にはＭＨＣクラスＩ Ｉ分子を発現しないであろうと予想される。これらの腫瘍は、Ｂ７−２および／ またはＢ７−３およびＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するよう修飾することができ る。幾つかの型の腫瘍、例えば黒色腫（ヴァン・ドゥイネン等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８巻１０１９−１０２５頁、１９８８）、び慢性大細胞リンパ腫（ オキーン等、Ｃａｎｃｅｒ、６６巻１１４７−１１５３頁、１９９０）、頭頸部 の扁平上皮癌（マティジュセン等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）６巻９５−１０ ０頁、１９９１）および大腸直腸癌（モラー等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６ 巻１５５−１６２頁、１９９１）は、表面ＭＨＣクラスＩＩ分子を天然に発現す ることが判明している。天然にクラスＩＩ分子を発現する腫瘍細胞は、Ｂ７−２ および／またはＢ７−３、そしてさらに、他のクラスＩＩ分子を発現するよう修 飾して、その腫瘍細胞により提示され得るＴＡＡペプチドのスペクトルを増大さ せ ることができる。殆どの非悪性腫瘍細胞の型はＭＨＣクラスＩ分子を発現する。 しかしながら、悪性腫瘍への形質転換はしばしば腫瘍細胞の表面でのＭＨＣクラ スＩ分子の発現の下方調節を伴う。Ａ．シバ等、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、 ５０巻６９９−７０９頁（１９８４）。重要なことに、腫瘍細胞によるＭＨＣク ラスＩ抗原の発現の喪失は、腫瘍細胞のより大きな攻撃性および／または転移可 能性を伴う。Ｐ．Ｉ．シュリアー等、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻７７１−７７５頁 （１９８３）；Ｃ．Ａ．ホールデン等、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ ．、９巻８６７−８７１頁（１９８３）；Ｍ．バニヤッシュ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．、１２９巻１３１８−１３２３頁（１９８２）。ＭＨＣクラスＩ発現が阻 害されることが示されている腫瘍の型には、黒色腫、大腸直腸癌および扁平上皮 癌が包含される。ヴァン・ドゥイネン等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４８巻１０ １９−１０２５頁（１９８８）；モラー等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６巻１ ５５−１６２頁（１９９１）；Ａ．シバ等、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５０ 巻６９９−７０９頁（１９８４）；Ｃ．Ａ．ホールデン等、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、９巻８６７−８７１頁（１９８３）。クラスＩ分子の発 現ができない、または低レベルのＭＨＣクラスＩ分子のみを発現する腫瘍細胞は 、本明細書に記載される１またはそれ以上の技術により修飾して、腫瘍細胞表面 でのＭＨＣクラスＩ分子の発現を誘導または増強させ、腫瘍細胞の免疫原性を亢 進させることができる。 （１０）インビボでの腫瘍細胞の修飾。 本発明のもう一つの態様は、Ｂ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１ を発現させてＴ細胞における共同刺激シグナルを誘発させるよう、腫瘍細胞をイ ンビボで修飾することにより、この腫瘍細胞の免疫原性を増大させるための方法 を提供する。加えて、腫瘍細胞をインビボでさらに修飾してＭＨＣ分子を発現さ せ、Ｔ細胞における第一の、抗原特異的シグナルを誘発させるようにすることが できる。Ｂ７−２および／またはＢ７−３およびＢ７−１をコードしている核酸 を、腫瘍細胞の表面での共同剌激分子の発現に好適な形でその腫瘍細胞中に導入 することにより、この腫瘍細胞をインビボで修飾することができる。同様に、Ｍ ＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子またはＩｉ遺伝子のアンチセンス配列をコー ドしている核酸を腫瘍細胞中にインビボで導入することができる。一つの態様に おいて、遺伝子治療の一形式として、組み替え発現ベクターを用いて、Ｂ７−２ および／またはＢ７−３およびＢ７−１をコードしている核酸を腫瘍細胞にイン ビボで送り込むことができる。インビボ遺伝子治療に有用なベクターはかつて記 載されており、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ 関連ウイルスベクターを包含する。例えば、Ｍ．Ａ．ローゼンフェルト、Ｃｅｌ ｌ、６８巻１４３−１５５頁（１９９２）；Ｗ．Ｆ．アンダーソン、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ、２２６巻４０１−４０９頁（１９８４）；Ｔ．フリードマン、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ、２４４巻１２７５−１２８１頁（１９８９）を参照されたい。別法として 、腫瘍細胞中への裸の核酸の直接注射により、核酸を腫瘍細胞にインビボで送り 込むこともできる。例えば、Ｇ．アサディ等、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻８１５− ８１８頁（１９９１）を参照されたい。送り込むための装置は市販品が入手可能 である（バイオラド）。所望により、注射に好適となるように、この核酸をリポ ソームのような担体と複合体形成させることができる。リポソームと複合体形成 したＭＨＣクラスＩ分子をコードしている核酸は、黒色腫の患者の腫瘍中に直接 注射された。Ｍ．ホフマン、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻３０５−３０９頁（１９ ９２）。 腫瘍細胞は、本明細書に記載のように、Ｂ７−２および／またはＢ７−３およ びＢ７−１（そして必要ならばＭＨＣ分子）の発現を誘導または増強する物質の 使用により、インビボで修飾することもできる。この物質は、全身的に、例えば 静脈内注射、または好ましくは腫瘍細胞に局所的に投与できる。 （１１）抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応のエフェクター相。 本発明に係る修飾された腫瘍細胞は、腫瘍特異的Ｔ細胞における抗原特異的シ グナルおよび共同刺激シグナルを誘発することにより抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応 の剌激に有用である。この、免疫反応の誘導的または求心的相に続いて、Ｔ細胞 のエフェクター集団が生成される。これらのエフェクターＴ細胞集団は、ＣＤ４ ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両者を含み得る。このエフェクター集団は、例 えば腫瘍細胞の細胞溶解による、腫瘍細胞の排除を担う。いったんＴ細胞が活性 化されると、共同剌激分子の発現は、エフェクターＴ細胞による標的細胞の認識 またはＴ細胞のエフェクター機能にとって標的細胞上で必要ない。Ｆ．Ａ．ハー ディングおよびＪ．Ｐ．アリソン、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻１７９１− １７９６頁（１９９３）。故に、本発明に係る修飾された腫瘍細胞により誘導さ れる抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応は、修飾された腫瘍細胞および共同剌激分子を発 現しない非修飾腫瘍細胞の両者に対して有効である。 さらに、Ｔ細胞仲介免疫反応の求心的および遠心的相に要する細胞表面のＭＨ Ｃ分子の密度および／または型は相違し得る。Ｔ細胞の最初の活性化に要するよ り少ないＭＨＣ分子または或る型のＭＨＣ分子のみ（例えばＭＨＣクラスＩＩで はなくＭＨＣクラスＩ）が、エフェクターＴ細胞による認識のために腫瘍細胞上 で必要であるかも知れない。故に、天然で少量のＭＨＣ分子を発現するが、より 大量のＭＨＣ分子を発現するよう修飾された腫瘍細胞は、非修飾腫瘍細胞に対し て有効なＴ細胞仲介免疫反応を誘導することができる。別法として、天然でＭＨ ＣクラスＩ分子を発現するがＭＨＣクラスＩＩ分子は発現せず、そこでＭＨＣク ラスＩＩ分子を発現するよう修飾された腫瘍細胞は、親のＭＨＣクラスＩ＋、ク ラスＩＩ−腫瘍細胞を排除し得るエフェクターＴ細胞集団を含むＴ細胞仲介免疫 反応を誘導することができる。 （１２）腫瘍細胞の治療用組成物。 本発明のもう一つの態様は、対象へのインビボでの薬学的投与に好適な生物学 的に適合し得る型の、修飾された腫瘍細胞の組成物である。この組成物は、或る 量の修飾された腫瘍細胞および生理学上許容し得る担体を含む。修飾された腫瘍 細胞の量は、治療上有効であるように選択する。「インビボでの薬学的投与に好 適な生物学的に適合し得る型」という語は、その腫瘍細胞の毒性効果よりその腫 瘍細胞の治療効果が優っていることを意味する。「生理学上許容し得る担体」と は、対象と生物学的に適合し得る担体である。許容し得る担体の例には、食塩水 および緩衝剤水溶液が包含される。全ての場合において、組成物は無菌でなけれ ばならず、また容易な被注射性が成立する程度まで流体でなければならない。「 対 象」という語は、腫瘍が発生または実験的に誘導され得る生体を包含することを 意図している。対象の例には、人間、犬、猫、マウス、ラット、およびそれらの トランスジェニック種が包含される。 本発明に係る治療用組成物の投与は、所望の結果を達成するために有効な期間 および用量で、既知の方法を用いて実施することができる。例えば、修飾された 腫瘍細胞の治療的有効量は、年齢、性別および個体の体重、腫瘍細胞の型および 腫瘍負荷の程度、ならびに対象の免疫学的応答能のような因子に応じて変わり得 る。投与計画は最良の治療応答を提供するよう調節することができる。例えば、 修飾された腫瘍細胞の単一の用量を投与することができ、または幾つかの用量を 回を追って投与することができる。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内および皮下 注射を含む注射によるものであってよい。 （１３）腫瘍特異的Ｔリンパ球のインビトロ活性化。 Ｔ細胞における共同刺激シグナルの誘発により抗腫瘍Ｔ細胞仲介免疫反応を誘 導または冗進するもう一つのアプローチは、腫瘍を持っている対象からＴリンパ 球を取得し、腫瘍細胞および単独またはＢ７−１と組み合わせたＢ７−２および ／またはＢ７−３の刺激型でこれを刺激することによってこれをインビトロで活 性化することである。Ｔ細胞は対象から、例えば末梢血から取得できる。末梢血 はさらに分画して赤血球を除き、そしてＴリンパ球またはＴリンパ球亜集団に富 ませまたはこれを単離することができる。Ｔ細胞は、剌激型のＢ７−２および／ またはＢ７−３と合した、対象から（例えば、生検から、または血液由来の悪性 腫瘍の場合は末梢血から）取得した腫瘍細胞と共に培養することにより、または 別法として、本明細書に記載されるような修飾された腫瘍細胞に暴露することに より、インビトロで活性化することができる。「刺激型」という語は、その共同 刺激分子がＴ細胞上のそのレセプターと架橋してＴ細胞において共同剌激シグナ ルを誘発できることを意味する。共同刺激分子の刺激型は、例えば、共同刺激分 子の可溶性多価分子、または例えば固体支持体に結合させた共同剌激分子の固定 型であってよい。Ｔ細胞において共同剌激シグナルを誘発する能力を保持するＢ ７−２および／またはＢ７−３のフラグメント、突然変異体または変異体（例え ば融合蛋白）もまた使用することができる。好ましい態様においては、Ｂ７−２ および／またはＢ７−３の可溶性細胞外部分を使用してＴ細胞に共同剌激を提供 する。腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化するため、Ｔ細胞を腫瘍細胞およびＢ７−２お よび／またはＢ７−３と共に、または修飾された腫瘍細胞と共にインビトロで培 養した後、このＴ細胞を、例えば静脈内注射により対象に投与することができる 。 （１４）修飾された腫瘍細胞の治療用途。 本発明に係る修飾された腫瘍細胞は、腫瘍の免疫原性を増大させるのに使用す ることができ、故に腫瘍を持つ対象または腫瘍が発生するおそれのある対象にお いてＴリンパ球仲介抗腫瘍免疫を誘導または亢進するために治療的に使用するこ とができる。腫瘍を持つ対象を処置するための方法は、その対象から腫瘍細胞を 取得し、その腫瘍細胞を、例えば、適当な核酸でそれらをトランスフェクトする ことにより、Ｔ細胞共同刺激分子を発現するようエクスビボで修飾し、そしてこ の修飾された腫瘍細胞の治療的有効用量を対象に投与することを含む。腫瘍細胞 中に導入すべき適当な核酸は、本明細書に記載の、単独の、またはＢ７−１、Ｍ ＨＣ分子（クラスＩまたはクラスＩＩ）またはＩｉアンチセンス配列をコードし ている核酸と合した、Ｂ７−２および／またはＢ７−３をコードしている核酸を 包含する。別法として、対象から腫瘍細胞を取得した後、Ｂ７−２および／また はＢ７−３の発現を誘導または増強する物質を用いて（そしてことによるとＢ７ −１またはＭＨＣ分子を誘導または増強する物質をも使用して）これらをエクス ビボで修飾することができる。 腫瘍細胞は、例えば、腫瘍細胞の外科的除去、例えば腫瘍の生検によって対象 から、または、血液由来の悪性腫瘍の場合には対象の血液試料から取得できる。 実験的に誘導された腫瘍の場合、その腫瘍の誘導に使用される細胞、例えば腫瘍 セルラインの細胞を使用することができる。充実性腫瘍の試料は、最大のトラン スフェクション効率のために、修飾に先立ち、腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を生成 するよう処理することができる。可能性ある処理には、細胞の手動分散または結 合組織の繊維の、例えばコラゲナーゼによる酵素的消化が包含される。 腫瘍細胞は、対象から取得した直後にトランスフェクトすることができ、また はその腫瘍細胞のさらなる性格決定（例えば、細胞表面分子の発現の測定）を可 能とするためトランスフェクション前にインビトロ培養することができる。トラ ンスフェクション用に選択される核酸は、その腫瘍細胞により発現される蛋白の 性格決定後に決定することができる。例えば、その腫瘍細胞の細胞表面でのＭＨ Ｃ蛋白の発現、および／またはその腫瘍細胞におけるＩｉ蛋白の発現を評価する ことができる。皆無のまたは限られた量または型のＭＨＣ分子（クラスＩまたは クラスＩＩ）を発現する腫瘍は、ＭＨＣ蛋白をコードしている核酸でトランスフ ェクトすることができ、Ｉｉ蛋白を発現する腫瘍はＩｉアンチセンス配列でトラ ンスフェクトすることができる。必要ならば、トランスフェクションの後に、目 的とする核酸と共に腫瘍細胞中に導入された選択マーカー（例えば薬物耐性）を 用いることにより、当該核酸の導入について腫瘍細胞をスクリーニングすること ができる。 対象への投与に先立ち、修飾された腫瘍細胞が対象内でそれ以上増殖できない ようにする処理をし、それによりその修飾された腫瘍細胞の考え得る生長を防ぐ ことができる。可能な処理は照射またはマイトマイシンＣ処理であり、これらは 、腫瘍細胞の増殖能を破棄する一方で、Ｔ細胞における抗原特異的および共同刺 激シグナルを誘発し、そのようにして免疫反応を剌激する当該腫瘍細胞の能力を 維持する。 修飾された腫瘍細胞は、その腫瘍細胞を対象に注射することによって対象に投 与することができる。注射の経路は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮 下とすることができる。元の腫瘍の部位への修飾された腫瘍細胞の投与は、元の 腫瘍に対する局所Ｔ細胞仲介免疫反応の誘導にとって有益となり得る。播種的方 法、例えば静脈内注射）での修飾された腫瘍細胞の投与は、全身的な抗腫瘍免疫 を提供し、さらに、元の部位からの腫瘍細胞の転移性拡散から保護し得る。修飾 された腫瘍細胞は、他の治療形態の前にまたはそれと一緒に投与することができ 、または、化学療法もしくは外科的侵襲のような他の処置の後に投与することが できる。 さらに、１以上の型の修飾された腫瘍細胞が対象に投与され得る。例えば、有 効なＴ細胞反応は、１以上の型の共同剌激分子への暴露を必要とするかも知れな い。さらに、異なる共同刺激分子に対するＴ細胞の時間を追って連続した暴露が 、有効な反応の生成にとって重要であるかも知れない。例えば、活性化の際Ｂ細 胞は、その反応の初期にＢ７−２を発現することが知られている（刺激の約２４ 時間後）。続いてＢ７−１およびＢ７−３がＢ細胞により発現される（刺激の約 ４８−７２時間後）。即ち、Ｔ細胞は、免疫反応中のＢ７−１および／またはＢ ７−３への暴露による免疫反応の誘導の初期にＢ７−２への暴露が必要であるの かも知れない。したがって、腫瘍細胞に対する有効な免疫反応を対象に生成させ るために、異なる型の修飾された腫瘍細胞を異なった時期に投与することができ る。例えば、Ｂ７−２を発現するよう修飾された腫瘍細胞を対象に投与すること ができる。この投与の後、同じ腫瘍由来であるがＢ７−３を発現（単独でまたは Ｂ７−１と共に）するよう修飾された腫瘍細胞を、その対象に投与することがで きる。 腫瘍によって対象を処置するもう一つの方法は、単独でまたはＢ７−１、ＭＨ Ｃ分子および／またはＩｉ発現の阻害剤と共にＢ７−２および／またはＢ７−３ を発現するよう、腫瘍細胞をインビボで修飾することである。この方法は、本明 細書の前項に記載のようなインビボ遺伝子治療のために有効なベクターおよび運 搬法を用いて、発現されるべき蛋白をコードしている核酸を提供することにより 、腫瘍細胞をインビボで修飾することを含み得る。別法として、Ｂ７−２および ／またはＢ７−３、そしてことによるとＢ７−１またはＭＨＣ分子の発現を誘導 または増強する１またはそれ以上の物質を、腫瘍を持つ対象に投与することがで きる。 本発明に係る修飾された腫瘍細胞は、腫瘍の転移性分散を防止または処置する ための、または腫瘍の再発を防止または処置するための方法に使用することもで きる。以下の実施例の一つに詳細に立証されるように、Ｂ７−１発現腫瘍細胞に より誘導される抗腫瘍免疫は、再暴露の腫瘍細胞がＢ７−１を発現するか否かに 拘わらず、腫瘍細胞による後のチャレンジに対して有効である。即ち、本明細書 に記載されるような修飾された腫瘍細胞の投与または腫瘍細胞のインビボ修飾は 、元の、非修飾腫瘍の細胞ならびに元の腫瘍の転移または可能な元の腫瘍の再成 長 に対する腫瘍の免疫を提供することができる。 さらに本発明は、ＣＤ４+Ｔ細胞における抗腫瘍反応を特異的に誘導するため の組成物および方法を提供する。ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結 びついた抗原によって活性化される。ＴＡＡのペプチドフラグメントとＭＨＣク ラスＩＩ分子との結合は、ＣＤ４+Ｔ細胞によるこれらの抗原性ペプチドの認識 を産む。Ｂ７−２および／またはＢ７−３と共にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現す るよう修飾された、または、Ｂ７−２および／またはＢ７−３と共にＭＨＣクラ スＩＩ分子を発現するようインビボ修飾された腫瘍細胞を対象に提供することは 、腫瘍抗原の提示をＭＨＣクラスＩＩ経路に向かわせるのに有用であり、それに より、腫瘍細胞に対し特異的なＣＤ４+Ｔ細胞による抗原認識およびその活性化 がもたらされる。抗ＣＤ４または抗ＣＤ８抗体によるＣＤ４+またはＣＤ８+Ｔ細 胞いずれかのインビボでの涸渇を用いて、特異的抗腫瘍免疫が特定の（例えばＣ Ｄ４+）Ｔ細胞亜集団により仲介されることを立証することができる。 修飾された腫瘍細胞に最初に暴露された対象は、その後の非修飾腫瘍細胞への 暴露に対して有効な抗腫瘍特異的Ｔ細胞反応を示す。即ち、その対象は抗腫瘍特 異的免疫を示す。別の人間の対象における抗腫瘍免疫を誘導する免疫原としての 一人の人間の対象からの本発明に係る修飾された腫瘍細胞の一般的使用は、血縁 のない人間間の組織適合性の相違によって阻まれる。しかしながら、将来の腫瘍 出現の可能性から防御するために、或る個体からの修飾された腫瘍細胞を使用し て別の個体における抗腫瘍免疫を誘導することは、家族性悪性腫瘍の場合に有用 であるかも知れない。この状況においては、修飾されるべき腫瘍細胞の、腫瘍を 持つドナーは、修飾された腫瘍細胞の（腫瘍を持たない）受容者と濃い血縁関係 にあり、故にドナーおよび受容者はＭＨＣ抗原を共有する。或る型の悪性腫瘍、 例えば或る乳癌および直腸癌には強い遺伝性要素が確認されている。特定の悪性 腫瘍への易罹患性がわかっており、一人が現在腫瘍を持っている家族において、 その一人からの腫瘍細胞を、Ｂ７−２および／またはＢ７−３を単独でまたはＢ ７−１と組み合わせて発現するよう修飾し、易罹患性の組織適合性の家族成員に 投与して、その家族が罹患し易い型の腫瘍に対する受容者の抗腫瘍免疫反応を誘 導することができる。この抗腫瘍反応は、免疫感作された受容者におけるその後 の腫瘍出現に対する防御免疫を提供し得る。 （１５）腫瘍特異的Ｔ細胞寛容。 実験的に誘導された腫瘍の場合、対象（例えばマウス）を、非修飾腫瘍細胞に よりチャレンジする前に本発明に係る修飾された腫瘍細胞に暴露することができ る。即ち、最初に対象は、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞を活性化するＢ７−２および／ま たはＢ７−３、およびＢ７−１と共に腫瘍細胞上のＴＡＡペプチドに暴露される 。すると活性化されたＴ細胞は、非修飾腫瘍細胞によるその後のチャレンジに対 して有効となる。自然発生腫瘍の場合は、人間の患者の場合がそうであるが、対 象の免疫系は、本発明に係る修飾された腫瘍細胞への暴露の前に、非修飾腫瘍細 胞に暴露される。即ちこの対象は、共同剌激シグナルの不在下で腫瘍細胞上のＴ ＡＡペプチドに最初に暴露される。この状況は、非修飾腫瘍細胞に暴露されてお り且つ接触しているＴ細胞においてＴＡＡ特異的Ｔ細胞の寛容を誘導すると思わ れる。共同刺激シグナルを誘発できる修飾された腫瘍細胞への対象の二次的な暴 露は、この腫瘍への一次暴露によりアネルギー化されたＴＡＡ特異的Ｔ細胞の寛 容に打ち勝つには十分でないかも知れない。故に、既に非修飾腫瘍細胞に暴露さ れた対象における抗腫瘍免疫を誘導するための修飾された腫瘍細胞の使用は、小 さな腫瘍負荷、例えば転移していない小さな限局性腫瘍を有する早期に診断され た患者において最も効果的となり得る。この状況においては、腫瘍細胞は身体の 限られた領域に限定されており、したがってＴ細胞レパートリーの一部分が腫瘍 抗原に暴露されアネルギー化しているに過ぎない。例えば限局された腫瘍の外科 的除去および分離された腫瘍細胞の修飾の後の全身的方法による修飾された腫瘍 細胞の投与は、非アネルギー化Ｔ細胞を、単独、またはＢ７−１と組み合わせた Ｂ７−２および／またはＢ７−３と共に腫瘍抗原に暴露させ、それにより非アネ ルギー化Ｔ細胞における抗腫瘍反応を誘導することができる。この抗腫瘍反応は 、可能性ある腫瘍の再成長に対して、または、検出されていないかも知れない元 の腫瘍の微小転移に対して有効であり得る。対象において腫瘍細胞に対する広汎 に広がった末梢Ｔ細胞寛容に打ち勝つためには、サイトカインのようなさらなる シ グナルを、修飾された腫瘍細胞と共に対象に提供する必要があるかも知れない。 Ｔ細胞成長因子として機能するサイトカイン、例えばＩＬ−２は、修飾された腫 瘍細胞と共に対象に提供することができる。インビトロ系においてＩＬ−２は、 二次アロ抗原剌激の時点で外因性ＩＬ−２を添加する時、前にアネルギー化され たＴ細胞のアロ抗原特異的反応を回復できることが示されている。Ｐ．タン等、 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻１６５−１７３頁（１９９３）。 腫瘍に対する対象のＴ細胞の寛容にも拘わらず対象における抗腫瘍Ｔ細胞反応 を生成させる別のアプローチは、腫瘍に暴露されていない別の対象（ナイーヴド ナーと称する）由来のＴ細胞において抗腫瘍反応を刺激し、このナイーヴドナー からの剌激されたＴ細胞を、腫瘍を持つ対象に移し、その結果、移されたＴ細胞 が当該腫瘍細胞に対する免疫反応を装備できるようにする事である。このＴ細胞 を本発明に係る修飾された腫瘍細胞を用いてインビトロで剌激することにより、 ナイーヴドナー由来のＴ細胞で抗腫瘍反応が誘導される。このような養子免疫伝 達のアプローチは一般に、移入されるＴ細胞と腫瘍を持つ受容者との間の組織適 合性の相違のため、異系交配された集団では妨げられる。しかしながら、同種骨 髄移植における進歩をこの状況に適用して、受容者による養子免疫伝達された細 胞の受容および移植片対宿主病の防止を可能にすることができる。まず、腫瘍を 持つ対象（宿主と称する）を既知の方法によってナイーヴドナーからの同種骨髄 移植のために準備し、移植を施す。宿主の準備は、全身の照射を含み、これは、 腫瘍に対し寛容が成立しているＴ細胞および腫瘍細胞自身を含む、宿主の免疫系 を破壊する。骨髄移植は、骨髄移植片からの成熟Ｔ細胞の涸渇といったような移 植片対宿主病を防止するための処置、免疫抑制剤による宿主の処置、または宿主 組織に対するドナーＴ細胞の寛容を誘導するためのＣＴＬＡ４Ｉｇのような物質 による宿主の処置を伴う。次に、宿主に残った腫瘍細胞または宿主の元の腫瘍の 再成長もしくは転移に対して応答し得る抗腫瘍特異的Ｔ細胞を宿主に提供するた め、ナイーヴドナーからのＴ細胞を本明細書に記載のようにＢ７−２および／ま たはＢ７−３を発現するよう修飾した、この宿主由来の腫瘍細胞によってインビ トロで刺激する。即ち、ドナーＴ細胞は最初に共同刺激シグナルと共に腫瘍細胞 に暴露され、故にこの腫瘍細胞に応答するよう活性化される。次いでこれらの活 性化された抗腫瘍特異的Ｔ細胞を、非修飾腫瘍細胞に対し反応性である宿主に移 入する。宿主はドナーの免疫系により再構成されているため、この宿主は移入さ れたＴ細胞を拒絶せず、さらに、移植片対宿主病を防止するための宿主の処置が 、移入されたＴ細胞と正常な宿主組織との反応性を妨げるであろう。Ｈ．Ｂリンパ球抗原医薬製剤の投与 本発明のペプチドはＴ細胞を介する免疫反応を強化または抑制するための生体 内医薬投与に適する生物学的に適応性ある剤型として対象体に投与される。「生 体内投与に適する生物学的に適応性ある剤型」とは治療効果が毒性効果を凌いで いる投与される蛋白質の製剤を意味する。対象体という用語は免疫反応を起こす 生物体、たとえば哺乳類、を含むものを意図する。対象体の例には、ヒト、犬、 猫、マウス、ラットならびにこれらのトランスジェニック種を含む。ここに記載 する新規Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチドの投与はペプチド単独あるいは他 種Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチドとの組合せでの治療的活性量および医薬 的に許容される担体を含むいかなる医薬的剤型をとることもできる。本発明の治 療用組成物の治療的有効量の投与とは所期結果を得るために必要な用量と時間に おいて有効な量であると定義される。例えば、Ｂ７−２活性を持つペプチドの治 療的有効量は病状、年齢、性および個体の体重および個体中で所期反応を起こす ペプチドの能力のような因子によっても変化しうる。用量範囲は最適な治療反応 を得るように調整してもよい。例えば、毎日数回に分割した用量を投与してもよ いし、用量を治療状況の実情が示すものに比例して減量してもよい。 活性化合物（たとえば、ペプチド）は注射（皮下、静脈内など）、経口投与、 吸入、経皮投与または直腸投与のような好都合な方法でも投与されうる。投与経 路に依存して、活性化合物は化合物を不活化するかもしれない酵素や酸の作用お よび他の天然の条件から化合物を保護する物質で被覆することもありうる。 非経口投与以外によりＢ７−２活性を持つペプチドを投与するためには、その ペプチドの不活化を阻止する物質で被覆するか、またはそれと同時に投与するこ とが必要になることもありうる。例えば、Ｂ７−２活性を持つペプチドを個体に 適当な担体、希釈剤またはアジュバント内で投与するか、酵素阻害剤と同時に投 与するか、またはリポソームのような適当な担体中で投与する。医薬的に許容さ れる希釈剤は食塩水および緩衝水溶液を含む。アジュバントは最広義に解され、 インターフェロンのようないかなる免疫促進化合物をも含む。ここにアジュバン トにはレゾルシノール類、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキ サデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤をも含むことが意 図されている。酵素阻害剤には膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロ ホスフェート（ＤＥＰ）およびトラシロールをも含む。リポソームには水中油中 水型乳剤ならびに通常のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎなど（１９８４年）、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻：２７頁）を含む。 活性化合物は非経口的または腹腔内にも投与されうる。分散剤はグリセリン、 液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中および油中で製造すること もできる。通常の貯蔵および使用条件の下では、これらの製剤には微生物の生育 を予防するための保存剤をも含ませうる。 注射のために適当な医薬的組成物には無菌水溶液（水溶性の場合）または水分 散剤および無菌注射用溶液または分散剤の要時調製用無菌粉末剤を含む。すべて の場合、組成物は無菌でなければならず、また容易に注射できる程度に流動性で なければならない。それは製造保存条件下に安定でなければならず、細菌および カビのような微生物の汚染から予防されていなければならない。担体は、例えば 水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコールおよび 液体ポリエチレングリコールなど）およびその混合物を含む溶媒または分散媒体 であることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンのような被覆剤の使用 、分散剤の場合には必要な粒子径の維持および界面活性剤の使用などにより維持 することができる。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノー ル、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌剤および抗カ ビ剤 により達成することができる。多くの場合、組成物内に、例えば、糖、マンニト ール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムなどの等張剤を含 むことが好ましいと思われる。注射剤組成物の長時間の吸収は組成物内に、例え ばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤 を含有させることによって行うことができる。 無菌注射剤溶液は活性化合物（たとえばＢ７−２活性を持つペプチド）の適量 を、要すれば前記成分１種または組合せを含む適当な溶媒中に添加し、続いて無 菌濾過することにより製造することができる。一般に、分散剤は活性化合物を基 礎的分散媒体および前記からの必要な他種成分を含む無菌賦形剤中に添加するこ とにより製造される。無菌注射溶液を製造するための無菌粉末の場合、好適な製 法は真空乾燥および凍結乾燥であって、予め無菌濾過した溶液からの活性成分（ たとえば、ペプチド）プラス所期追加的成分の粉末を与える。 活性化合物が前記のように適当に保護されている時、蛋白質は、例えば不活性 希釈剤または同化しうる食用担体とともに経口投与もされうる。ここに使用する 「医薬的に許容される担体」にはすべてのいかなる溶媒、分散媒体、被覆、抗菌 剤および抗カビ剤、等張剤および吸収遅延剤などをも含む。医薬的活性物質のた めのそれら媒体および薬剤の使用は当該技術分野でよく知られている。この活性 化合物にその通常の媒体または薬剤が配合禁忌である場合を除き、この治療的組 成物中での使用は意図されているものである。この組成物中には補助的活性化合 物を添加することもできる。 投与容易化と用量均一化のために非経口投与組成物を単位用量剤型に製剤化す ることは殊に有利である。ここに使用する単位用量剤型は、処置さるべき哺乳類 対象体への均一な投与に適し、各単位が所期治療効果を得られるように予め計算 された活性化合物の所定量および必要な医薬的担体とともに含む、物理的に区別 された単位を示す。本発明の単位用量剤型の処方は（イ）活性化合物に独特な特 性および達成さるべき特定の治療効果と（ロ）各個体の感受性に対する処置のた めに活性化合物を混合する技術に必然的な制限とにより決定され、直接的に依存 する。Ｉ．共剌激により誘発されるサイトカインの認識 ここに記載する新規Ｂリンパ球抗原活性を持つペプチドをコードする核酸配列 を使用して、たとえばＢ７−２のようなＢリンパ球抗原の一型による刺激に反応 してＴ細胞によって生産されるサイトカインを認識することができる。Ｔ細胞は 試験管内ではホルボールエステル、抗−ＣＤ３抗体または好ましくは抗原とＭＨ ＣクラスＩＩ分子とのような一次活性化シグナルにより準最適（ｓｕｂｏｐｔｉ ｍａｌ）の剌激を受け、例えばＢ７−２活性を持つペプチドをコードする核酸で トランスフェクトされて表面にペプチドを発現する細胞によるか、またはそのペ プチドの可溶性剌激型によるようなＢ７−２抗原の刺激型から共刺激的（ｃｏｓ ｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）シグナルを受ける。培地に放出される既知サイトカイン はＥＬＩＳＡにより、また、Ｔ細胞増殖を阻害するサイトカインを遮断する抗体 の能力やサイトカインにより誘発される他種細胞型の増殖を阻害する抗体の能力 により認識することができる。ＩＬ−４ＥＬＩＳＡキットやＩＬ−７遮断抗体は Ｇｅｎｚｙｍe社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手できる。ＩＬ−９およ びＩＬ−１２に対する遮断抗体はＧｅｎｅｔｉｃｓ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａ ｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手できる。 前記試験管内Ｔ細胞共剌激検定法は共刺激によっても誘導されうる新規サイト カインを認識する方法においても使用することができる。もし、共剌激により誘 導される特定の活性、たとえばＴ細胞増殖、が既知サイトカインに対する遮断抗 体の添加によって阻止できなければ、その活性は未知サイトカインの作用に起因 するかもしれない。共刺激後、このサイトカインを常法により培地から精製して Ｔ細胞増殖を誘発する能力によりその活性を測定することができる筈である。 寛容性の誘導を予防するサイトカインを認識するために前記の試験管内Ｔ細胞 共剌激検定法を用いることができる。この場合、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを 与え、続いて共剌激シグナルを与えずに、選択したサイトカインと接触させる。 Ｔ細胞を洗浄し、休止させた後に、細胞に一次活性化シグナルおよび共刺激シグ ナルの両方を与える。もしＴ細胞が応答（たとえば、増殖するかまたはＩＬ−２ を生産する）しなければ、細胞は耐性を獲得しており、そのサイトカインは寛容 性誘導を予防しなかったものである。しかしながら、もしＴ細胞が応答すれば、 そのサイトカインにより寛容性誘導が予防されたものである。寛容性誘導を予防 できるサイトカインは移植受容者または自己免疫疾患患者の寛容性を誘発するた めにより効果的な手段としてのＢリンパ球抗原を遮断する薬剤に関連する生体内 遮断のための目標とすることができる。例えば、Ｂ７−２遮断剤をサイトカイン 遮断抗体とともに対象体に投与することができよう。Ｊ．共剌激を阻止する分子の認識 本発明の新規Ｂリンパ球抗原の活性を持つペプチド（たとえば、Ｂ７−２およ びＢ７−３）の別の応用はこれらペプチドの１種またはそれ以上を共刺激リガン ド結合の阻止剤および／または共剌激後のＴ細胞の細胞内シグナル伝達の阻止剤 である未発見分子を発見するスクリーニング検定法で使用することである。例え ば、Ｂ７−２のようなＢリンパ球抗原の活性を持つペプチドを使用する固相結合 検定法はその抗原と適当なＴ細胞リガンド（たとえば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８） との結合を阻止する分子を認識するために使用することができるであろう。加え るに、前記の試験管内T細胞共刺激検定法は、その分子のＴ細胞増殖および／ま たはサイトカイン生産の阻止能（しかし、Ｂリンパ球抗原のその受容体への結合 は予防しない）で判定される、共刺激後にＴ細胞を経る細胞内シグナル伝達を阻 害する分子を発見するために使用することができるであろう。例えば、サイクロ スポリンＡ化合物はＴ細胞活性化をＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路ではなく、Ｔ細胞 受容体経路を経由する剌激によって阻止する。それ故、共剌激には異なる細胞内 シグナル伝達経路が含まれている。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を経る細胞内シグ ナル伝達を阻害する分子は生体内で免疫抑制剤（サイクロスポリンＡの効果に類 似の）として有効であろう。Ｋ．Ｂリンパ球抗原発現を調節する分子の認識 本発明の蛋白質とペプチドとを用いて生産されるモノクローナル抗体は細胞上 のＢリンパ球抗原発現を調節する分子のスクリーニング検定法で使用できる。例 えば、Ｂリンパ球抗原誘導に導く細胞内シグナル伝達をもたらす分子、たとえば Ｂ７−２またはＢ７−３は細胞表面におけるＢリンパ球抗原１種またはそれ以上 の発現を検定することによって認識することができる。ある分子の存在下での抗 −Ｂ７−２抗体による免疫螢光染色の低減はその分子が細胞内シグナルを阻止す ることを指摘すると思われる。Ｂリンパ球抗原発現を増強する分子は免疫螢光染 色の強化をもたらす。他に、Ｂ７−２のようなＢリンパ球抗原の発現へのある分 子の効果はプローブとしてＢ７−２ｃＤＮＡを使用して細胞Ｂ７−２ｍＲＮＡ水 準を検出することにより判定できる。例えば、Ｂ７−２活性を持つペプチドを発 現する細胞は被検分子と接触させ、その細胞内でのＢ７−２ｍＲＮＡ濃度の増減 をノーザンハイブリッド化分析または検出しうるマーカーで標識したＢ７−２ｃ ＤＮＡプローブを使用するｍＲＮＡまたは全ポリ（Ａ+）ＲＮＡの通常のドット ブロット検定のような標準的技術により検出できる。Ｂリンパ球抗原発現を調節 する分子は単独でまたは可溶性遮断剤または刺激剤とともに免疫反応を増強また は減衰するために治療上有用であろう。例えば、Ｂ７−２の発現を阻止する分子 はＢ７−２遮断剤とともに免疫抑制の目的で投与できるであろう。前記の検定法 で検査できる分子にはＩＬ−４、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−Ｃ ＳＦおよびプロスタグランジンのようなサイトカインを含む。 本発明を以下の実施例により例示するが、これらには限定的意図はない。本明 細書中に引用した全ての参考文献および公表された特許出願の内容は参考のため に提示するものである。 実施例１、２及び３では以下の方法論を使用した。方法および材料 Ａ．細胞 単核球はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法により正常ヒト脾 臓の遊離細胞懸濁液から単離し、羊赤血球によるロゼット形成によりＥ−および Ｅ＋画分に分離した（Ｂｏｙｄ，Ａ．Ｗ．など（１９８５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．、１３４巻：１５１６頁）。Ｂ細胞はＥ−画分から単球のプラスチックへ の付着および抗−ＣＤ４、−ＣＤ８、−ＣＤ１１ｂ、−ＣＤ１４および−ＣＤ１ ６モノクローナル抗体を用いる抗−ＭｓＩｇＧおよび抗−ＭｓＩｇＭ被覆磁性ビ ーズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ・Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ） での処理２回による残留Ｔ、天然キラー細胞（ＮＫ）および残留単球の除去によ り精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は同じ脾臓のＥ＋画分からプラスチックへの付着と ＮＫ、Ｂ細胞および残留単球の磁性ビーズおよび抗−ＣＤ２０、−ＣＤ１１ｂ、 −ＣＤ８およびＣＤ１６モノクローナル抗体での除去後に分離した。ＣＤ２８＋ Ｔ細胞は同様にこのＥ＋画分から抗−ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、−ＣＤ１４および −ＣＤ１６モノクローナル抗体を用いて分離した。精製効果は間接的免疫螢光法 およびＥＰＩＣＳフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を使用するフロー サイトメトリーで分析した。Ｂ細胞製品は＞９５％ＣＤ２０＋、＜２％ＣＤ３＋ 、＜１％ＣＤ１４＋であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞製品は＞９８％ＣＤ３＋、＞９８ ％ＣＤ４＋、＜１％ＣＤ８＋、＜１％ＣＤ２０＋、＜１％ＣＤ１４＋であった。 ＣＤ２８＋Ｔ細胞製品は＞９８％ＣＤ３＋、＞９８％ＣＤ２８＋、＜１％ＣＤ２ ０＋、＜１％ＣＤ１４＋であった。Ｂ．モノクローナル抗体および融合蛋白質 別段の記述がない限り、モノクローナル抗体は精製Ｉｇとして使用した：抗− Ｂ７：１３３、ＩｇＭは遮断抗体であって、以前に報告があり（Ｆｒｅｅｄｍａ ｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：３２６０〜３ ２６７頁）；抗−Ｂ７：Ｂ１．１、ＩｇＧ１（ＲｅｐｌｉＧｅｎ社、Ｃａｍｂｒ ｉｄｇｅ、ＭＡ）（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂなど（１９９３年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐ ａｔｈｏｌ．、１４２巻：１０２９〜１０４０頁）は非遮断モノクローナル抗体 であり；ＢＢ−１：ＩｇＭは遮断抗体（Ｄｒ．Ｅ．Ｃｌａｒｋ、ワシントン大学 、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）（Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔなど（１９８２年）、Ｊ．Ｉｍ ｍｕｎｏｌ．、１２８巻：８２３〜８２７頁）であり；抗−ＣＤ２０：Ｂ１、Ｉ ｇＧ２ａ（Ｓｔａｓｈｅｎｋｏ，Ｐなど（１９８０年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 、１２５巻：１６７８〜１６８５頁）；抗−Ｂ５、ＩｇＭ（Ｆｒｅｅｄｍａｎ， Ａ．など（１９８５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４巻：２２２８〜２２３ ５頁）；抗−ＣＤ８：７ＰＴ３Ｆ９，ＩｇＧ２ａ；抗−ＣＤ４：１９Ｔｈｙ５Ｄ ７，ＩｇＧ２ａ；抗−ＣＤ１１ｂ：Ｍｏ１，ＩｇＭおよび抗−ＣＤ１４：Ｍｏ２ ，ＩｇＭ（Ｔｏｄｄ，Ｒなど（１９８１年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２６巻 ：１４ ３５〜１４４２頁）；抗−ＭＨＣクラスＩＩ：９−４９，ＩｇＧ２ａ（Ｄｒ．Ｒ ．Ｔｏｄｄ、ミシガン大学、Ａｎｎ・Ａｒｂｏｒ）、（Ｔｏｄｄ，Ｒ．Ｉ．など （１９８４年）、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０巻：２３〜４０頁）；抗−Ｃ Ｄ２８：９．３，ＩｇＧ２ａ（Ｄｒ．Ｃ．Ｊｕｎｅ、Ｎａｖａｌ・Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、（Ｈａｎｓｅｎ，Ｊ．Ａ．な ど（１９８０年）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０巻：２４７〜２６０頁 ）；抗−ＣＤ１６：３Ｇ８，ＩｇＧ１（腹水症として使用）、（Ｄｒ．Ｊ．Ｒｉ ｔｚ、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ・Ｃａｎｃｅｒ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔ ｏｎ）；抗−ＣＤ３：ＯＫＴ３，ＩｇＧ２ａハイブリドマはアメリカンタイプカ ルチャーコレクションから入手し精製モノクローナル抗体をプラスチック板に１ μｇ／ｍＬの濃度で付着させた。抗−ＣＤ２８Ｆａｂ断片は製造元（Ｐｉｅｒｃ ｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の指示書に従って９．３モノクローナル抗体か らパパイン消化により発生させ、蛋白質Ａカラム上で精製した。ヒトＣＴＬＡ４ 融合蛋白質（ＣＴＬＡ４Ｉｇ）および対照融合蛋白質（対照−Ｉｇ）は以前の報 告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５８６〜６５９０頁）通りに製造した。Ｂｏｕｓ ｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（印刷用に受理済）。Ｃ．ＣＨＯ細胞のトランスフェクション Ｂ７−１トランスフェクト体（ＣＨＯ−Ｂ７）はＢ７−１陰性のチャイニーズ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系から製造し、パラホルムアルデヒドで固定し、 以前の報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：６５７５〜６５７９頁）通りに使用した。Ｄ．試験管内でのＢ細胞活性化およびＢ７＋およびＢ７−細胞の選択 脾臓Ｂ細胞を組織培養フラスコ中の完全培養培地｛１０％熱不活化ウシ胎児血 清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ−グルタミン、１ｍＭ−ピルビン酸 ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、硫酸ストレプトマイシン（１０ ０μｇ／ｍＬ）および硫酸ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）｝中で、２×１０6 細胞／ｍＬに培養し、ｓＩｇをＡｆｆｉ−Ｇｅｌ７０２ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ 社、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）（Ｂｏｙｄ，Ａ．Ｗ．など（１９８５年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４巻：１５１６頁）に結合したアフィニティー精製ウサ ギ抗−ヒトＩｇＭとの交差結合によって、またはＡｆｆｉ−Ｇｅｌ７０２ビーズ に結合したＭＨＣクラスＩＩの９−４９抗体との交差結合によって活性化した。 Ｂ細胞は７２時間活性化し、活性化全Ｂ細胞集団として使用するか、または抗− Ｂ７（Ｂ１．１）モノクローナル抗体およびイソチオシアン酸フルオレッセイン （ＦＩＴＣ）で標識したヤギ抗−マウス免疫グロブリン（Ｆｉｓｈｅｒ社、Ｐｉ ｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）で間接的に染色し、フローサイトメトリー細胞分別法（ ＥＰＩＣＳ・Ｅｌｉｔｅ・ｆｌｏｗ・ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｃｏｕｌｔｅｒ社） によりＢ７−１＋およびＢ７−１−集団に分画して使用した。Ｅ．免疫螢光法およびフローサイトメトリー 表面フェノタイプ分析のため、６、１２、２４、４８、７２および９４時間交 差結合したＭＨＣクラスＩＩまたはｓＩｇにより活性化したＢ細胞集団を抗−Ｂ ７（１３３）、ＢＢ−１モノクローナル抗体、対照ＩｇＭ抗体、ＣＴＬＡ４Ｉｇ または対照−Ｉｇにより染色した。細胞懸濁液を１０μｇ／ｍＬの一次モノクロ ーナル抗体に続いて適当な２次試薬による２段階間接膜染色法で染色した。具体 的には、抗−Ｂ７（１３３）およびＢＢ−１モノクローナル抗体との免疫反応性 をヤギ抗−マウスＩｇまたは免疫グロブリンＦＩＴＣ（Ｆｉｓｈｅｒ）を２次試 薬として使用する間接染色法により検討し、融合蛋白質との免疫反応性はビオチ ン化ＣＴＬＡ４Ｉｇまたはビオチン化対照−Ｉｇおよびストレプトアビジン−フ ィコエリスリンとを２次試薬に使用して検討した。希釈および洗浄剤には１０％ ＡＢ血清添加ＰＢＳを使用した。細胞を０．１％パラホルムアルデヒドで固定し て、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ・Ｅｌｉｔｅ・Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析 した。Ｆ．増殖検定法 Ｔ細胞は９６穴平底マイクロタイター板穴当り１×１０5細胞の濃度で３７℃ で３日間５％ＣＯ2中で培養した。同遺伝子型活性化Ｂ細胞（全Ｂ細胞集団また はＢ７＋およびB７−画分）を照射（２５００ラド）し、穴当り１×１０5細胞濃 度で培地に添加した。検討因子を穴当り最終全容積２００μＬになるのに必要 な濃度で添加した。指定した時にはＴ細胞を抗−ＣＤ２８Ｆａｂ（最終濃度１０ μｇ／ｍＬ）と３０分間４℃でインキュベーションし、続いて実験用板に添加し た。同様に、ＣＨＯ−Ｂ７またはＢ細胞はＣＴＬＡ４Ｉｇまたは対照Ｉｇ（１０ μｇ／ｍＬ）と３０分間４℃でインキュベーションした。***促進活性の指標と してのチミジン取込みは培養の最終１５時間に｛メチル−3Ｈ｝チミジン（Ｄｕ ・Ｐｏｎｔ社、ボストン、ＭＡ）１μＣｉ（３７ｋＢｑ）とインキュベーション した後に評価した。濾過して細胞を収穫し、乾燥濾板上の放射能をＰｈａｒｍａ ｃｉａ社ベータプレート液体シンチレーションカウンター中で測定した。Ｇ．ＩＬ−２およびＩＬ−４検定 ＩＬ−２とＩＬ−４との濃度はＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄ・Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｍ ｉｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮおよびＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、 ＣＡ）により培養開始２４時間後に集めた上清液中で検定した。実施例１ Ｔ細胞増殖を誘発する新規ＣＴＬＡ４リガンドの活性化Ｂ細胞上での 発現 交差結合表面Ｉｇはヒト休止Ｂ細胞がＢ７−１を７２時間目に最大（５０〜８ ０％）に発現するように誘導するので、活性化したヒトＢリンパ球が準***促進 的に（ｓｕｂｍｉｔｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）活性化したＴ細胞を増殖させ、ＩＬ −２を分泌させる能力を測定した。図１には抗−ＣＤ３モノクローナル抗体で準 ***促進的に活性化したヒト脾臓ＣＤ２８＋Ｔ細胞のＢ７（Ｂ７−１）をトラン スフェクトしたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｂ７）または抗−Ｉｇで７２時間活性化し た同遺伝子型脾Ｂ細胞での共剌激反応を示す。3Ｈ−チミジン取込みは７２時間 培養の最終１５時間に検定した。ＩＬ−２はＥＬＩＳＡにより培養２４時間後の 上清液で検定（検出限界：３１〜２０００ｐｇ／ｍＬ）した。図１は１７回の実 験結果を表す。 準***促進的に活性化したＣＤ２８＋Ｔ細胞はＣＨＯ−Ｂ７（図１、ａ）で与 えられるＢ７−１共刺激に反応して増殖し、高濃度のＩＬ−２を分泌した。増殖 もＩＬ−２分泌もＣＨＯ細胞上のＢ７−１分子を抗−Ｂ７−１モノクローナル抗 体でまたは高アフィニティー受容体であるＣＴＬＡ４の融合蛋白質によって遮断 することで完全に阻止された。同様に、増殖とＩＬ−２分泌はＦａｂ抗−ＣＤ２ ８モノクローナル抗体のＣＤ２８を経るＢ７−１シグナル伝達の遮断によって取 除かれた。対照モノクローナル抗体または対照融合蛋白質は無効であった。増殖 とＩＬ−２分泌の殆ど同じ共剌激は抗−Ｉｇで７２時間活性化した脾臓Ｂ細胞に よって示された（図１、ｂ）。抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体はＣＨＯ−Ｂ７ により起きる増殖とＩＬ−２分泌を完全に取除くことができたが、抗−Ｂ７−１ モノクローナル抗体は活性化Ｂ細胞により誘導される増殖を５０％しか確実に阻 止しなかったが、一方ＩＬ−２分泌は完全に阻止された。抗−Ｂ７−１モノクロ ーナル抗体に誘導される増殖の部分遮断とは対照的に、ＣＴＬＡ４ＩｇもＦａｂ 抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体も増殖とＩＬ−２分泌を完全に遮断した。これ らの結果は活性化ヒトＢ細胞はＴ細胞増殖とＩＬ−２分泌とを誘導できる追加的 なＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンド１個またはそれ以上を発現するという仮説に適 合する。実施例２ 活性化ヒト脾臓Ｂ細胞はＢ７−１とは異なるＣＴＬＡ４リガンドを発 現する 前記観察から見て、別のＣＴＬＡ４結合性カウンターレセプターが活性化Ｂ細 胞上に発現するかどうか確認することにした。このため、ヒト脾臓Ｂ細胞を抗− Ｉｇで７２時間活性化し、次にＢ７−１を介する共剌激を阻止しない抗−Ｂ７− １モノクローナル抗体（Ｂ１．１）で染色した。イソチオシアン酸フルオレッセ イン（ＦＩＴＣ）とｍＡｂＢ１．１を用い、フローサイトメトリーで細胞選択を 行ってＢ７−１+画分とＢ７−１-画分とを分離した。得られた分離後陽性集団は ９９％Ｂ７−１+であり、分離後陰性集団は９８％Ｂ７−１-（図２）であった。 各集団の共刺激能を検討するため、ヒト脾臓ＣＤ２８＋Ｔ細胞を照射Ｂ７−１ ＋またはＢ７−１−抗−Ｉｇ活性化（７２時間）脾臓Ｂ細胞の存在下に抗−ＣＤ ３モノクローナル抗体で準***促進的に刺激した。3Ｈ−チミジン取込みは７２ 時間培養の最後の１５時間に検討した。ＩＬ−２はＥＬＩＳＡにより培養２４時 間後の上清液について評価（検定の検出限界：３１〜２０００ｐｇ／ｍＬ）した 。図３は１０回の実験結果を示す。Ｂ７−１＋Ｂ細胞は抗−ＣＤ３活性化Ｔ細胞 に 増殖とＩＬ−２の分泌を誘導した（図３ａ）が、ＩＬ−４は誘導しなかった。未 分画活性化Ｂ細胞集団で観察されたように、抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体（ １３３）は増殖を５０％しか阻止しなかったが、ＩＬ−２分泌は十分に消滅した 。前記の通り、Ｆａｂ抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体によるＣＴＬＡ４Ｉｇ結 合またはＣＤ２８の遮断は増殖もＩＬ−２分泌も完全に阻止した。対照モノクロ ーナル抗体と対照−Ｉｇは阻止的ではなかった。Ｂ７＋Ｂ細胞により起こされる 残余非Ｂ７仲介増殖の原因となっているかもしれない他種潜在的ＣＴＬＡ４／Ｃ Ｄ２８結合性共刺激リガンドを発見する試みでは、増殖とＩＬ−２分泌に対する ＢＢ−１モノクローナル抗体の効果を試験した。前記のように、ＢＢ−１モノク ローナル抗体は増殖およびＩＬ−２分泌を完全に阻止した（図３ａ）。図３ｂは Ｂ７−１−活性化ヒト脾臓Ｂ細胞の共刺激能を提示する。照射Ｂ７−１−活性化 （７２時間）Ｂ細胞は準***促進的活性化ＣＤ４＋リンパ球に明瞭な共剌激シグ ナルを伝達するであろう。この共刺激は検出可能なＩＬ−２（図３ｂ）またはＩ Ｌ−４の蓄積も伴なわず、抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体は増殖を阻止しなか った。しかしながら、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｆａｂ抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体 およびＢＢ−１モノクローナル抗体はすべて増殖を完全に阻止した。 Ｂ７−１+およびＢ７−１-活性化脾臓Ｂ細胞のフェノタイプ分析は前記機能的 結果を確認した。図４は分画されたＢ７−１+およびＢ７−１-で活性化されたＢ 細胞上でのＢ７−１、Ｂ７−２およびＢ７−３の細胞表面発現を示す。図４に示 すように、Ｂ７−１＋活性化脾臓Ｂ細胞は抗−Ｂ７−１（１３３）モノクローナ ル抗体、ＢＢ−１モノクローナル抗体および結合ＣＴＬＡ４Ｉｇで染色した。対 照的に、Ｂ７−活性化脾臓Ｂ細胞は抗−Ｂ７−１（１３３）モノクローナル抗体 で染色しなかったが、ＢＢ−１モノクローナル抗体およびＣＴＬＡ４Ｉｇでは染 色した。これらフェノタイプおよび機能的結果はＢ７−１＋およびＢ７−１−活 性化（７２時間）ヒトＢリンパ球が１）準***促進的に活性化されたＴ細胞に検 出可能なＩＬ−２分泌を伴わずに増殖を誘導し、また、２）ＢＢ−１モノクロー ナル抗体には認識されるが、抗−Ｂ７−１モノクローナル抗体には認識されない ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプターを発現することを証明する。そこで、これ らＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドはＢ細胞活性化後の一時的発現およびそれらと ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗−Ｂ７モノクローナル抗体との反応性を基にして区別す ることができる。図４は５回の実験結果を表す。実施例３ ヒトＢ細胞活性化後、３種の異なるＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドが 発現する 活性化後ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプターの逐次的発現を判定するため、 ヒト脾臓Ｂ細胞を表面ＩｇまたはＭＨＣクラスＩＩの交差結合により活性化し、 Ｂ７−１、Ｂ７−３およびＢ７−２結合蛋白質の発現をフローサイトメトリー分 析により検討した。ＩｇまたはＭＨＣクラスＩＩの交差結合は同様なパターンの ＣＴＬＡ４Ｉｇ結合を誘導した（図５および６）。図５は抗−Ｂ７−１およびＢ Ｂ−１結合の実験２５回の結果およびＣＴＬＡ４Ｉｇ結合の実験５回の結果を表 す。図６は抗−Ｂ７−１結合の実験２５回の結果およびＣＴＬＡ４Ｉｇ結合の実 験５回の結果である。これらの実験結果は２４時間より前にはこれらの分子はど れも発現されていないことを示す。活性化後２４時間には多数の細胞がＣＴＬＡ ４Ｉｇに結合する蛋白質を発現するが（Ｂ７−２）、しかしながら２０％以下が Ｂ７−１またはＢ７−３を発現する。ＭＨＣクラスＩＩの交差結合は４８時間目 にＢ７−１およびＢ７−３を最大に誘導し、Ｉｇの交差結合は７２時間目に最大 発現を誘導し、その後は発現が減少する。これらの結果は新種のＣＴＬＡ４結合 カウンターレセプターは２４時間に発現され、種類の異なるＢ７−１とＢ７−３ 蛋白質の一時的発現と時間的に一致しているように見えることを示唆する。 一連の実験を行って、このＣＴＬＡ４結合カウンターレセプターの一時的発現 とＴ細胞の増殖および／またはＩＬ−２分泌を共剌激する能力との相関が異なる かどうかを判定した。抗−ＣＤ３で準***促進的に刺激したヒト脾臓ＣＤ２８＋ Ｔ細胞をあらかじめ試験管内で２４、４８または７２時間ｓＩｇと交差結合して 活性化しておいた照射ヒト脾臓Ｂ細胞の存在下に７２時間培養した。ＩＬ−２分 泌は２４時間後上清液中でＥＬＩＳＡにより評価し、Ｔ細胞増殖は培養７２時間 の最終１５時間の間の3Ｈ−チミジン取込みにより評価した。図７は実験５回の 結果を表す。図７ａに見られるように、２４時間活性化Ｂ細胞は中庸な水準のＩ Ｌ−２生産を伴う共刺激的シグナルを与えたが、その増殖の程度は４８時間およ び７２時間活性化ヒトＢ細胞で観察されるよりも顕著に少なかった（3Ｈ−チミ ジン取込みのスケールに注目）。抗−Ｂ７−１（１３３）またはＢＢ−１はいず れも増殖もＩＬ−２蓄積も阻止しなかった。対照的にＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗− ＣＤ２８Ｆａｂモノクローナル抗体は増殖とＩＬ−２蓄積を完全に消滅させた。 ４８時間活性化したＢ細胞は共剌激を起こし、その結果殆ど最大の増殖とＩＬ− ２分泌に到った（図７ｂ）。ここに、抗−Ｂ７−１（１３３）モノクローナル抗 体は増殖を約５０％阻止したが、ＩＬ−２蓄積は完全に遮断した。ＢＢ−１モノ クローナル抗体は増殖およびＩＬ−２分泌を完全に阻止した。前記のように、Ｃ ＴＬＡ４ＩｇおよびＦａｂ抗−ＣＤ２８も増殖およびＩＬ−２生産を完全に遮断 した。最後に、７２時間活性化Ｂ細胞は４８時間活性化Ｂ細胞により誘導される ものと同じＴ細胞の反応を誘導した。もし、準***促進的シグナルがホルボール ミリステートアセテート（ＰＭＡ）から伝達されれば、また、ヒト脾臓Ｂ細胞が Ｉｇ交差結合でなくて、ＭＨＣクラスＩＩにより活性化されていれば同様な結果 が観察される。これらの結果はＣＴＬＡ４結合分子には３種あり、一時的に活性 化Ｂ細胞に発現され、各々がＴ細胞に準***促進的な増殖を剌激誘導できること を示す。これらの分子の中で２種、早期ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプター（ Ｂ７−２）およびＢ７−１（１３３）はＩＬ−２生産を誘導するが、一方、Ｂ７ −３は検出可能なＩＬ−２生産なしに増殖を誘導する。 以前の報告には抗−Ｂ７モノクローナル抗体、１３３およびモノクローナル抗 体ＢＢ−１が同じ分子を認識するか否かについて矛盾する証拠を提出されていた （Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７ 巻：３２６０〜３２６７頁；Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．など（１９８２年）、Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．、１２８巻：８２３〜８２７頁；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など （１９８９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：２７１４〜２７２２頁）。 両モノクローナル抗体はヒトＢ細胞活性化４８時間後に発現する分子を認識する が、いくつかの報告はＢ７（Ｂ７−１）とモノクローナル抗体ＢＢ−１が認識す る分子とは細胞系により、またＢ細胞新生物上で、異なって発現されるので相違 することを示唆していた（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：３２６０〜３２６７頁；Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．など （１９８２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２８巻：８２３〜８２７頁；Ｆｒｅ ｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：２ ７１４〜２７２２頁；Ｃｌａｒｋ，Ｅ．とＹｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．（１９８４年） 、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−Ｔｙｐｉｎｇ，１ｓｔ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ・ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、３３９〜３４６頁；Ｃｌａｒｋ，Ｅ ．など（１９８４年）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−Ｔｙｐｉｎｇ，１ｓｔ−Ｉｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、７４０頁）。 加えて、これらＩｇＭモノクローナル抗体の免疫沈降とウエスターンブロッティ ングはそれらが異なる分子を認識することを示唆した（Ｃｌａｒｋ，Ｅ．とＹｏ ｋｏｃｈｉ，Ｔ．（１９８４年）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ・Ｔｙｐｉｎｇ，１ｓｔ ・Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、３ ３９〜３４６頁；Ｃｌａｒｋ，Ｅ．（１９８４年）、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−Ｔｙ ｐｉｎｇ，１ｓｔ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・Ｗｏ ｒｋｓｈｏｐ、７４０頁）。本来の抗−Ｂ７モノクローナル抗体１３３は抗−免 疫グロブリン活性化ヒトＢリンパ球での免疫により生成したが、一方、ＢＢ−１ モノクローナル抗体はヒヒの細胞系での免疫によって生成した。それ故に、ＢＢ −１モノクローナル抗体はヒヒとヒトとの間で保存されているヒト細胞のエピト ープを認識する筈である。 ヒトＢ７遺伝子（Ｂ７−１）の分子クローニングと発現の後、Ｂ７トランスフ ェクトＣＯＳ細胞が抗−Ｂ７（１３３）とＢＢ−１モノクローナル抗体で同様に 染色されることが見出され、それら両方が同一の広い分子バンド（４４〜５４ｋ Ｄ）を沈降してそれらが同じ分子を認識することを強く示唆した（Ｆｒｅｅｍａ ｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：２７１４ 〜２７２２頁）。この発見はＢＢ−１モノクローナル抗体により認識される分子 をコードする遺伝子が以前に染色体１２に割付けられ（Ｋａｔｚ，Ｆ．Ｅ．など （１９８５年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１０３〜６頁）、一方、２つ のグ ループがＢ７遺伝子を染色体３に置いた（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９ ９２年）、Ｂｌｏｏｄ、７９巻：４８９〜４９４頁；Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒ，Ａ ．など（１９９２年）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、３６巻：１７５〜１８ １頁）ので、予想外であった。その後、Ｂ７（Ｂ７−１）とＢＢ−１モノクロー ナル抗体が認識する分子の間のフェノタイプ発現に別の相違が注目された。ＢＢ −１モノクローナル抗体は胸腺上皮細胞（Ｔｕｒｋａ，Ｌ．Ａ．など（１９９１ 年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６巻：１４２８〜３６頁；Ｍｕｎｒｏ，Ｊ． Ｍ．など、Ｂｌｏｏｄ、投稿済）およびケラチノサイト（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ， Ｂ．など（１９９３年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４２巻：１０２９〜１ ０４０頁；Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｍ．など（１９９３年）、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄ ｅｒｍａｔｏｌ．、１００巻：２７５〜２８１頁）を染色するが、一方、抗−Ｂ ７はこれを染色しなかった。最近、Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆなど（１９９３年）、Ａ ｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４２巻：１０２９〜１０４０頁はＢＢ−１および抗 −Ｂ７（Ｂ１．１および１３３）モノクローナル抗体を用いてケラチノサイトで ＢＢ−１モノクローナル抗体およびＢ７が認識する分子の不協和な発現を報告し た。ＮｉｃｋｏｌｏｆｆなどはこれらＢＢ−１陽性細胞はＢ７ｍＲＮＡを発現し ないがＣＤ２８トランスフェクトＣＯＳ細胞に結合して、モノクローナル抗体Ｂ Ｂ−１と結合する異なる蛋白質の存在に対する別の証拠があることも証明した。 今回の発見はＢＢ−１モノクローナル抗体Ｂ７−３が認識する別のＣＴＬＡ４ カウンターレセプターが存在することおよびこの蛋白質が機能的にはＢ７−１（ １３３）とは相違することを確認するものである。Ｂ細胞活性化後のＢ７−１お よびＢ７−３の発現はＢ７陽性Ｂ細胞では時間的に一致すると思われるが、これ らの研究からＢ７−３分子はＢ７陰性活性化Ｂ細胞でも発現されることを立証す る。さらに重要なことには、Ｂ７−３分子は検出可能なＩＬ−２またはＩＬ−４ 生産なしにＴ細胞増殖を誘導できると思われることである。この結果はＩＣＡＭ −１は検出可能なＩＬ−２またはＩＬ−４の生産なしにＴ細胞増殖を共刺激でき る（Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．印刷中）という以 前の観察に類似している。これらのデータはＢＢ−１モノクローナル抗体はＢ７ −１蛋 白質上のエピトープを認識することおよびこのエピトープは共刺激的機能を持っ ているが異なる蛋白質Ｂ７−３にも存在することを示す。フェノタイプおよび遮 断の研究からＢＢ−１モノクローナル抗体はこれら蛋白質の１種（Ｂ７陰性細胞 上）または両方（Ｂ７陽性細胞上）を認識できることが証明された。対照的に、 抗−Ｂ７モノクローナル抗体１３３およびＢ１．１はＢ７−１蛋白質のみを認識 する。総合すると、これらの結果は表面免疫グロブリンまたはＭＨＣクラスＩＩ の交差結合によるＢ細胞の活性化４８時間後、Ｂ細胞は一方は抗−Ｂ７およびＢ Ｂ−１モノクローナル抗体の両方により認識されるものおよび他方はＢＢ−１モ ノクローナル抗体のみにより認識されるものの少なくとも２種の異なるＣＴＬＡ ４結合カウンターレセプターを発現することを示唆する。 Ｂ７−２抗原は活性化Ｂ細胞上では１２時間後には検出されないが、２４時間 には強く発現し、機能を示す。増殖とＩＬ−２生産がＦａｂ抗−ＣＤ２８モノク ローナルにより完全に阻害されるので、この分子はＣＤ２８を経てシグナル伝達 しているように思われる。抗−Ｂ７モノクローナル抗体がＩＬ−２生産を完全に 遮断するので、活性化４８時間後になるとＩＬ−２分泌はＢ７−１共刺激に起因 していると思われる。 以前の研究およびここに記載した結果からＢ細胞活性化後４８時間まではＢ７ （Ｂ７−１）は発現されず（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）、 Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：３２６０〜３２６７頁；Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ． Ｓ．など（１９９１年）、Ｃｅｌｌ・Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻：４２９〜４ ３７頁）Ｔ細胞増殖またはＩＬ−２分泌を共刺激することもできないことが立証 される。以前の研究から共刺激不在下でのＴＣＲを経るＴ細胞の活性化（Ｇｉｍ ｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６５８６〜６５９０頁；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．など（１ ９８９年）、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉ ｏｌ．、５４巻：６０５〜１０頁；Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｂ．など（１９９２年）、 Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４巻：６６１〜６７１頁）およびＩＬ−２の不在（ Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．など、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、投稿済；Ｂｅｖｅｒ ｌ ｙ，Ｂ．など（１９９２年）、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４巻：６６１〜６７ １頁；Ｗｏｏｄ，Ｍ．など（１９９３年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻： ５９７〜６０３頁）はアネルギーを起こすことが証明されている。Ｂ７−１がＩ Ｌ−２分泌の誘導が可能な唯一の共剌激分子であったとすれば、ＩＬ−２生産を 共剌激するＢ７−１が存在しないので、Ｔ細胞は活性化後最初の２４時間にはア ネルギー化されるものと思われる。それ故、他に最初の２４時間にＩＬ−２分泌 を共刺激できる早期誘導可能な共刺激分子の存在はアネルギーではなく、効果的 免疫反応を誘導するために必要と思われる。Ｂ細胞活性化１２時間と２４時間と の間の早期ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプター、Ｂ７−２、の出現はこの機能 を果たす。 追加されたこれらＣＴＬＡ４結合カウンターレセプター２種の生物学的および 潜在的臨床的意義について２個の新知見が光明をもたらした。第一に、Ｂ７（Ｂ ７−１）欠失マウスが開発されたが、その抗原提示細胞もＣＴＬＡ４Ｉｇに結合 することが見出された（ＦｒｅｅｍａｎとＳｈａｒｐｅ、投稿準備中）。このマ ウスは健常であり、分離された単核球は試験管内でＴ細胞と培養する時には検出 可能な水準のＩＬ−２を誘導する。それ故、別のＣＤ２８共剌激的カウンター受 容体または別のＩＬ−２生産経路が機能している筈である。第二にはネズミとヒ トの系で抗原特異的アネルギーを誘導する最有力な試薬はＣＴＬＡ４Ｉｇおよび Ｆａｂ抗−ＣＤ２８であるが、一方、抗−Ｂ７モノクローナル抗体ははるかに弱 い（Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．Ａ．など（１９９２年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻： ６０７〜６０９頁；Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．など（１９９２年）、Ｓｃｉｅ ｎｃｅ、２５７巻：７８９〜７９２頁；Ｃｈｅｎ，Ｌ．など（１９９２年）、Ｃ ｅｌｌ、７１巻：１０９３〜１１０２頁；Ｔａｎ，Ｐ．など（１９９３年）、Ｊ ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７巻：１６５〜１７３頁）。これらの観察もＩＬ−２ を誘導することのできる別種ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８リガンドが存在するとの仮説 に一致し、ここに提出する結果を勘案すれば、ＣＴＬＡ４結合カウンターレセプ ター３種全てがＴ細胞免疫の誘導に必須であろうことを示唆する。さらにＴ細胞 アネルギーの誘導のためにはそれらの遮断が必要であると思われる。同一の結果 が ヒトのＢ７−１およびＢ７−２分子に対応するＣＴＬＡ４結合リガンド２種の認 識によりネズミの系でも観察された。Ｂ７欠失マウスのＡＰＣはＣＴＬＡ４と結 合し、ＩＬ−２分泌を誘導できる。総合すると、これらの観察はネズミの系では 多重ＣＴＬＡ４結合のカウンターレセプターが存在し、逐次にＴ細胞活性化を共 刺激していることを示す。実施例４ Ｂ７−２抗原のクローニング、配列決定および発現 Ａ．ｃＤＮＡライブラリーの構築 文献記載（Ａｒｕｆｆｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））のヒト抗−ＩｇＭ活性化Ｂ細胞からポ リ（Ａ）+ＲＮＡを用いてｐＣＤＭ８ベクター（Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２ ９巻：８４０頁（１９８７年））中にｃＤＮＡライブラリーを構築した。脾臓Ｂ 細胞を組織培養フラスコ中、完全培養培地｛１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣ Ｓ）添加ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ−グルタミン、１ｍＭ−ピルビン酸ナトリウ ム、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ ｍＬ）および硫酸ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）｝中２×１０6細胞／ｍＬに 培養し、ｓＩｇとＡｆｆｉ−Ｇｅｌ・７０２ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈ ｍｏｎｄ、ＣＡ）（Ｂｏｙｄ，Ａ．Ｗ．など（１９８５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．、１３４巻：１５１６頁）結合アフィニティー精製ウサギ抗−ヒトＩｇＭと の交差結合により活性化した。活性化Ｂ細胞を１／６、１／２、４、８、１２、 ２４、４８、７２および９６時間後に収穫した。 活性化Ｂ細胞を４Ｍ−チオシアン酸グアニジン、０．５％ザルコシール、２５ ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、０．１３％Ｓｉｇｍａ社アンチフォームＡおよび ０．７％メルカプトエタノールの溶液中でホモゲナイズしてＲＮＡを調製した。 ＲＮＡはこのホモジェネートを５．７Ｍ−ＣｓＣｌ、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、２５ ｍＭ−酢酸ナトリウム、ｐＨ７から毎分３２０００回転で２４時間遠心分離して 精製した。ＲＮＡのペレットを５％ザルコシル、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１０ｍＭ− トリス、ｐＨ７．５に溶解し、５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イ ソアミルアルコール混液２容で抽出した。ＲＮＡはエタノールから２回沈降させ た。ｃＤＮＡライブラリー構築に用いたポリ（Ａ）+ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）− セルロース選択２サイクルにより精製した。 抗−ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞ポリ（Ａ）+ＲＮＡ５．５μｇから５０ｍＭ−ト リス、ｐＨ８．３、７５ｍＭ−ＫＣｌ、３ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ−ジチオ スレイトール、５００μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、オリゴ （ｄＴ）12〜18５０μｇ／ｍＬ、ＲＮａｓｉｎ１８０単位／ｍＬおよびＭｏｌｏ ｎｅｙ−ＭＬＶ逆転写酵素１００００単位／ｍＬを全容５５μＬ中に含む反応液 中で３７℃１時間で相補ＤＮＡを合成した。逆転写後、溶液を２５ｍＭ−トリス 、ｐＨ８．３、１００ｍＭ−ＫＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ2、各２５０μＭ−ｄＡ ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５ｍＭ−ジチオスレイトール、ＤＮＡポ リメラーゼ１２５０単位／ｍＬ、リボヌクレアーゼＨ８．５単位／ｍＬに調整し 、１６℃で２時間インキュベーションして、ｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換した 。ＥＤＴＡを添加して１８ｍＭとし、溶液を５０％フェノール、４９％クロロホ ルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出した。ＤＮＡは２．５Ｍ−酢酸 アンモニウムと担体としての直線状ポリアクリルアミド４μｇとの存在下にエタ ノール２容で沈殿させた。別に抗−ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞ポリ（Ａ）+ＲＮＡ ４μｇから５０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．８、オリゴ（ｄＴ）12〜18５０μｇ／ｍ Ｌ、ＲＮａｓｉｎ３２７単位／ｍＬおよびＡＭＶ逆転写酵素９５２単位／ｍＬを 全容１００μＬ中に含む反応液中０．６７時間４２℃でｃＤＮＡを合成した。逆 転写後、７０℃に１０分間加熱して逆転写酵素を不活化した。水３２０μＬと０ ．１Ｍ−トリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭ−ＭｇＣｌ2、０．５Ｍ−ＫＣｌ、ウシ 血清アルブミン２５０μｇ／ｍＬおよび５０ｍＭ−ジチオスレイトールの溶液８ ０μＬとを加え、溶液を各２００μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴ Ｐ、ＤＮＡポリメラーゼ１５０単位／ｍＬ、リボヌクレアーゼＨ８単位／ｍＬに 調整し、１６℃で２時間インキュベートしてｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換した 。ＥＤＴＡを添加して１８ｍＭとし、溶液を５０％フェノール、４９％クロロホ ルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出した。ＤＮＡを２．５Ｍ−酢酸 アンモニウムおよび担体としての直線状ポリアクリルアミド４μｇの存在下に エタノール２容で沈降させた。 ＡＭＶ逆転写４μｇおよびＭｏｌｏｎｅｙＭＬＶ逆転写２μｇからのＤＮＡを 混合した。非自己相補ＢｓｔＸＩアダプターを以下のようにＤＮＡに添加した。 ポリ（Ａ）+ＲＮＡ６μｇからの二重鎖ｃＤＮＡをキナーゼ処理した配列ＣＴＴ ＴＡＧＡＧＣＡＣＡ（配列番号１５）のオリゴヌクレオチド３．６μｇおよびキ ナーゼ処理した配列ＣＴＣＴＡＡＡＧ（配列番号１６）のオリゴヌクレオチド２ ．４μｇとを６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５、６ｍＭ−ＭｇＣｌ2、５ｍＭ−Ｎａ Ｃｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍＬ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、 ０．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレイトール、１ｍＭ−スペルミジンおよ びＴ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を含む溶液全容０．４５ｍＬ中、１５℃で１６ 時間インキュベーションした。ＥＤＴＡを添加して３４ｍＭとし、溶液を５０％ フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出し た。ＤＮＡは２．５Ｍ−酢酸アンモニウムの存在下にエタノール２容から沈降さ せた。 ６００ｂｐより大きいＤＮＡは以下の通りに選択した：アダプターＤＮＡを１ ０ｍＭ−トリス、ｐＨ８、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、６００ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１％ ザルコシル中に再溶解し、セファロースＣＬ−４Ｂカラム上、同一緩衝液でクロ マトグラフィーした。カラム空隙容積中のＤＮＡ（６００ｂｐ以上のＤＮＡを含 む）を集め、エタノール沈降した。 ｐＣＤＭ８ベクターをＢｓｔＸＩ消化とアガロースゲル精製とにより調製し、 ｃＤＮＡクローニングに用いた。ポリ（Ａ）+ＲＮＡ６μｇからのアダプターＤ ＮＡを２．２５μｇのＢｓｔＸＩ切断ｐＣＤＭ８に６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５ 、６ｍＭ−ＭｇＣｌ2、５ｍＭ−ＮａＣｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍ Ｌ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレ イトール、１ｍＭ−スペルミジンおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を全容１ ．５ｍＬ中に含む溶液中で１５℃で２４時間リゲートした。リゲート反応混合物 を感応大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３に形質転換して独立のｃＤＮＡクローン合計４ ２９００００個を得た。 プラスミドＤＮＡはｃＤＮＡライブラリー形質転換体の培養液５００ｍＬから 製造した。プラスミドＤＮＡをアルカリ分解法により精製し、続いてＣｓＣｌ平 衡勾配２回でバンド化分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒ ｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８７年））。Ｂ．クローニング操作法 スクリーニングの第一段階で、５０％密集生長ＣＯＳ細胞の１００ｍｍシャー レ３０個を抗−ＩｇＭ活性化ヒトＢ細胞ライブラリーＤＮＡ０．０５μｇ／ｍＬ でＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｅｅｄなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））を用いてトランスフェク トした。細胞をトリプシン処理し、２４時間後に再播種した。４７時間後、細胞 をＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４／０．０２％アジ化ナトリウム中 で３０分間３７℃でインキュベーションして剥離した。脱離細胞をＣＴＬＡ４Ｉ ｇおよびＣＤ２８Ｉｇ１０μｇ／ｍＬで４５分間４℃で処理した。細胞を洗い、 アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体で被覆した培養皿に散布し、室温で 付着させた。３時間後、プレートをＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４ ／０．０２％アジ化ナトリウム、５％ＦＣＳで２回と０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、０ ．０１Ｍ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、５％ＦＣＳで１回穏やかに洗浄した。エピ ソームＤＮＡを培養（ｐａｎ）細胞から集め、大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に形質転 換 した。プラスミドＤＮＡを文献記載のスフェロプラスト融合（Ｓｅｅｄなど、Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７ 年））によりＣＯＳ細胞に再導入し、発現と培養を２回反復した。 選択の第二および第三段階では、４７時間後、脱離したＣＯＳ細胞を初めにα −Ｂ７−１ｍＡｂｓ（１３３およびＢ１．１、１０μｇ／ｍＬ）とインキュベー ションし、Ｂ７−１を発現するＣＯＳ細胞をα−マウスＩｇＧおよびＩｇＭ被覆 磁気ビーズで除去した。ＣＯＳ細胞を次にヒトＣＴＬＡ４Ｉｇ（ｈＣＴＬＡ４Ｉ ｇ）およびヒトＣＤ２８Ｉｇ（ｈＣＤ２８Ｉｇ）１０μｇ／ｍＬで処理し、ヒト Ｂ７−２発現ＣＯＳ細胞をヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体プレートのディッシュ上で培 養して選択した。第三段階後、各コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＥ ＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェ クトしたＣＯＳ細胞上のＢ７−２発現はＣＴＬＡ４Ｉｇとの間接免疫螢光法によ り分析した。 選択の最終段階後、各コロニーからプラスミドＤＮＡを製造した。候補クロー ン４８個の中から全部で４個が約１．２ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片を含んでいた。 これら４個のクローンをＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。クローン４個全て はＣＴＬＡ４Ｉｇを用いる間接免疫螢光法およびフローサイトメトリー分析によ ればＢ７−２発現が強陽性であった。Ｃ．配列決定 クローン２９のＢ７−２ｃＤＮＡ挿入断片を以下の方策を用いてｐＣＤＭ８発 現ベクター中で配列決定した。最初の配列決定はプライマーＴ７、クローン化し たＢ７−２ｃＤＮＡに隣接するＣＤＭ８ベクター配列に相同のＣＤＭ８Ｒ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った（表Ｉ参照）。配列決定は色素終結反応お よびＡＢＩ自動ＤＮＡ配列決定器（ＡＢＩ社、Ｆｏｓｔｅｒ・Ｃｉｔｙ、ＣＡ） を使用して行った。これらのプライマーを使用して得られたＤＮＡ配列を用いて 次の配列決定プライマーを設計した（表Ｉ参照）。この配列決定および次のプラ イマー選択のサイクルを両鎖についてＢ７−２ｃＤＮＡが完全に配列決定される まで継続した。 ヒトＢ７−２クローン２９は１１２０塩基対の挿入断片と９８７ヌクレオチド の単一の長い読み枠および約２７ヌクレオチドの３’非コード配列を含んでいた （図８、配列番号１）。この蛋白質のオープン読み枠がコードすると予測される アミノ酸配列を図８のヌクレオチド配列の下に示す。コードされた蛋白質である ヒトＢ７−２は長さ３２９アミノ酸であると予測される（配列番号２）。この蛋 白質配列は他の１型Ｉｇスーパーファミリー膜蛋白質に共通の特徴を多数示す。 蛋白質翻訳はコンセンサス真核細胞翻訳開始部位（Ｋｏｚａｋ，Ｍ（１９８７年 ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１５巻：８１２５〜８１４８頁）とのこ の領域でのＤＮＡ相同性を基にして、ＡＴＧコドン（ヌクレオチド１０７〜１０ ９）から始まると予測される。ヒトＢ７−２蛋白質のアミノ端末（アミノ酸１か ら２３）は２３位と２４位のアラニンの間に予測切断部位（ｖｏｎ・Ｈｅｉｊｎ ｅ（１９８６年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１４巻：４６８３頁）の ある分泌シグナルペプチドの特性を持つ。この部位でのプロセッシングは未修飾 分子量約３４ｋＤａを持つ３０６アミノ酸のヒトＢ７−２膜結合蛋白質をもたら すと思 われる。この蛋白質は大体アミノ酸残基２４〜２４５の細胞外Ｉｇスーパーファ ミリーＶおよびＣ様ドメイン、大体アミノ酸残基２４６〜２６８の親水性膜貫通 ドメインおよび大体アミノ酸残基２６９〜３２９の長い原形質ドメインからなる と思われる。Ｉｇスーパーファミリーとの相同性は４０から１１０位および１５ ７から２１８位にあるシステインで結合する細胞外領域中の近接するＩｇ様ドメ イン２個に起因する。細胞外ドメインはＮ−結合グリコシル化の可能性ある部位 ８個も含む。ヒトＢ７−２蛋白質をコードするクローン２９のｃＤＮＡ挿入断片 を含むベクターでトランスフェクトした大腸菌は、１９９３年７月２６日にアメ リカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号６９３５７で寄託 された。 ヒトＢ７−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の双方のＧｅｎＢａｎｋおよ びＥＭＢＬデータベースとの比較で、ヒトおよびネズミＢ７−１蛋白質だけが関 連していることが判った。Ｂ７蛋白質配列３種を並べると（図１３）ヒトＢ７− ２はヒトＢ７−１と約２６％のアミノ酸同一性を持つことが判る。図１３はヒト Ｂ７−２（ｈＢ７−２）（配列番号２）、ヒトＢ７−１（ｈＢ７−１）（配列番 号２８および２９）およびネズミＢ７（ｍＢ７）（配列番号３０および３１）の アミノ酸配列の比較を示す。ヒトＢ７−１およびネズミＢ７（以下ネズミＢ７− １と記載する）のアミノ酸配列は各々Ｇｅｎｂａｎｋに寄託番号＃Ｍ２７５３３ およびＸ６０９５８として見出すことができる。図１３の垂直線はｈＢ７−２お よびｈＢ７−１またはｍＢ７との間の同一のアミノ酸を示す。ｈＢ７−１とｍＢ ７との間の同一アミノ酸は示していない。ｈＢ７−２蛋白質はＩｇスーパーファ ミリーが持つ共通のシステイン（ＩｇＶドメインの４０位と１１０位、ＩｇＣド メインの１５７位と２１７位）および他の多数の共通アミノ酸により定義付けら れるｈＢ７−１と同じ一般構造を示す。ｈＢ７−１とｍＢ７は両方ともヒトＣＴ ＬＡ４およびヒトＣＤ２８に結合することが知られているので、これらの関連蛋 白質２種の間に共通なアミノ酸はＣＴＬＡ４またはＣＤ２８結合配列を含むのに 必要であると思われる。この配列の例はＫＹＭＧＲＴＳＦＤ（８１〜８９位、ｈ Ｂ７−２）（配列番号１７）またはＫＳＱＤＮＶＴＥＬＹＤＶＳ（１８８〜２０ ０位、ｈＢ７−２）（配列番号１８）である。別の関連配列は配列比較から明ら かであり、他はアスパラギン酸とグルタミン酸、アラニンとグリシンおよび他の 認められた機能関連アミノ酸のような相同的に関連したアミノ酸を考慮すること によって推論できる。Ｂ７配列はおそらく細胞内シグナル伝達に関与しているで あろう原形質部分ＷＫＷＫＫＫＫＲＰＲＮＳＹＫＣ（２６９〜２８２位、ｈＢ７ −２）（配列番号１９）に高度にプラス荷電したドメインを持つ。実施例５ 組換えＢ７−２抗原の特性 Ａ．Ｂ７−２はＣＴＬＡ４Ｉｇと結合するが抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３モ ノクローナル抗体とは結合しない ＣＯＳ細胞をベクターＤＮＡ（ｐＣＤＮＡＩ）またはＢ７−１（Ｂ７−１）ま たはＢ７−２（Ｂ７−２）を含む発現プラスミドのいずれかでトランスフェクト した。７２時間後、トランスフェクトしたＣＯＳ細胞を０．５ｍＭ−ＥＤＴＡお よび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で３０分間３７℃でインキュベ ーションして脱離した。この細胞を細胞表面発現について間接免疫螢光法とイソ チオシアン酸フルオレッセイン結合（ＦＩＴＣ）ヤギ抗−マウスＩｇまたはヤギ 抗−ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いるフローサイトメトリー分析法で分析した（図 ９）。Ｂ７−１の細胞表面発現はｍＡｂｓ１３３（抗−Ｂ７−１）およびＢＢ− １（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３）で、およびＣＴＬＡ４Ｉｇで検出し、一 方Ｂ７−２はＣＴＬＡ４Ｉｇのみと反応させた。Ｂ７トランスフェション体はい ずれもイソタイプ対照（ＩｇＭまたは対照Ｉｇ）では染色されなかった。ベクタ ーでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞はどの検出試薬でも染色されなかった。さ らに、どの細胞もＦＩＴＣ標識検出試薬でも染色されなかった。これはＢ７−２ がＣＴＬＡ４カウンターレセプターである蛋白質をコードしてはいるが、Ｂ７− １ともＢ７−３とも異なることを証明する。Ｂ．非刺激および活性化ヒトＢ細胞、細胞系および骨髄腫におけるＢ７−２発現 のＲＮＡブロット分析 ヒト脾臓Ｂ細胞をＴ細胞と単核球を除去することにより文献記載（Ｆｒｅｅｄ ｍａｎ，Ａ．Ｓ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｃ．， Ｄａｌｅｙ，Ｊ．，Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７ 年）、１３７巻：３２６０〜３２６７頁）通りに分離した。脾臓Ｂ細胞を抗−Ｉ ｇビーズを用いて活性化し、細胞を記載の時点で収穫した（Ｆｒｅｅｄｍａｎな ど（１９８７年）、前出）。骨髄標本のＥロゼット化と付着を用いて報告（Ｆｒ ｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９年）、１４３巻： ２７１４〜２７２２頁）通りにＴ細胞および単核球を除去してヒト骨髄腫を精製 した。ＲＮＡをチオシアン酸グアニジンによるホモゲナイズ化および塩化セシウ ム遠心分離によって調製した。等量のＲＮＡ（２０μｇ）をアガロースゲル上で 電気泳動し、染色し、32Ｐ−標識Ｂ７−２ｃＤＮＡにハイブリド化した。図１０ のａには非剌激および抗−Ｉｇ活性化ヒト脾臓Ｂ細胞およびＲａｊｉ（Ｂ細胞バ ーキットリンパ腫）、Ｄａｕｄｉ（Ｂ細胞バーキットリンパ腫）、ＲＰＭＩ８２ ２６（骨髄腫）、Ｋ５６２（赤白血病）およびＲＥＸ（Ｔ細胞急性リンパ芽球白 血病）を含む細胞系のＲＮＡブロット分析を示す。図１０のｂにはヒト骨髄腫の ＲＮＡブロット分析を示す。 Ｂ７−２ｃＤＮＡへのハイブリッド化により１．３５、１．６５および３．０ ｋｂのｍＲＮＡトランスクリプト３個を検出した（図１０のｂ）。ＲＮＡのブロ ット分析はＢ７−２ｍＲＮＡは非刺激ヒト脾臓Ｂ細胞中に発現され、活性化後４ 倍に増加することを証明した。Ｂ７−２ｍＲＮＡはＢ細胞新生物系（Ｒａｊｉ、 Ｄａｕｄｉ）と骨髄腫（ＲＰＭＩ８２２６）とで発現されたが、赤白血病Ｋ５６ ２およびＴ細胞系ＲＥＸでは発現されなかった。対照的に、我々は以前にＢ７− １ｍＲＮＡは休止Ｂ細胞では発現されず、活性化後は一時的に発現されることを 報告した（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、前出）。ヒト骨髄腫 から分離したｍＲＮＡの研究からＢ７−２ｍＲＮＡは患者６人中で６人に発現さ れていることを証明したが、Ｂ７−１はこの６人中で１人にのみ発見された（Ｆ ｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、前出）。そこで、Ｂ７−１とＢ７ −２との発現は独立に制御されていることが明らかである。Ｃ．共刺激 ヒトＣＤ２８+Ｔ細胞を以前の文献報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９ ３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５８６〜 ６５９０頁）通りに免疫磁気ビーズ除去法によりＢ細胞、天然キラー細胞および マクロファージに対するモノクローナル抗体を用いて分離した。Ｂ７−１、Ｂ７ −２およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトランスフェクト後７ ２時間に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１時間インキュベーション し、次に十分に洗浄した。１０5ＣＤ２８+およびＴ細胞をホルボールミリステー トアセテート（ＰＭＡ）１ｎｇ／ｍＬおよび指摘した数のＣＯＳトランスフェク ト体とインキュベーションした（図１１）。図１１のａに示すように、Ｔ細胞の 増殖は７２時間のインキュベーションの最後の１２時間に取込まれた３Ｈ−チミ ジン（１μＣｉ）により測定した。図１１のｂは培養開始２４時間後に収穫した 上清液を用いるＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＡ）により測定されたＴ細 胞によるＩＬ−２生産を示す。Ｄ．Ｂ７−２共剌激は抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ｍＡｂｓでは遮断されな いが、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗−ＣＤ２８Ｆａｂによって遮断される ヒトＣＤ２８+Ｔ細胞をＢ細胞、天然キラー細胞およびマクロファージに対す るｍＡｂｓを用いて以前の報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ． Ｊ．、Ｇｒｉｂｂｅｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｇｒａｙ，Ｇ．、Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．（ １９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５ ８６〜６５９０頁）通りに免疫ビーズ除去法により分離した。Ｂ７−１、Ｂ７− ２およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトランスフェクション後 ７２時間目に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１時間インキュベーシ ョンし、次に十分に洗浄した。ＣＤ２８+Ｔ細胞１０5個をホルボールミリステー トアセテート（ＰＭＡ）１ｎｇ／ｍＬとＣＯＳトランスフェクト体２×１０4個 とともにインキュベーションした。遮断剤（１０μｇ／ｍＬ）は図１２の左端に 示したが、１）モノクローナル抗体不含（遮断剤なし）、２）ｍＡｂ１３３（抗 −Ｂ７−１ｍＡｂ）、３）ｍＡｂＢＢ−１（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ｍ Ａｂ）、４）ｍＡｂＢ５（対照ＩｇＭｍＡｂ）、５）抗−ＣＤ２８Ｆａｂ（ｍＡ ｂ９．３）、６）ＣＴＬＡ−Ｉｇおよび７）対照Ｉｇを含む。図１２のａは７２ 時 間インキュベーションの最後の１２時間の3Ｈ−チミジン（１μＣｉ）取込みに より測定された増殖を示す。図１２のｂは培養開始２４時間後に収穫した上清液 を用いてＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＡ）で測定したＩＬ−２生産を示 す。 Ｂ７−１およびＢ７−２をトランスフェクトしたＣＯＳ細胞は広範な剌激体／ 応答体細胞比率で検査した時に相応水準のＴ細胞増殖を共剌激した（図１１）。 Ｂ７−１と同様にＢ７−２をトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の共剌激は広範な 刺激体／応答体細胞比率でＩＬ−２生産を示した（図１１）。対照的に、ベクタ ーでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞はＴ細胞増殖もＩＬ−２生産も共刺激しな かった。Ｅ．Ｂ７−２共刺激は抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ｍＡｂｓでは遮断されな いが、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび抗−ＣＤ２８Ｆａｂによって遮断される ヒトＣＤ２８+Ｔ細胞をＢ細胞、天然キラー細胞およびマクロファージに対す るｍＡｂを用いて以前の報告（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ ．、Ｇｒｉｂｂｅｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｇｒａｙ，Ｇ．、Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．（１ ９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：６５８ ６〜６５９０頁）通りに免疫ビーズ除去法により分離した。Ｂ７−１、Ｂ７−２ およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトランスフェクション後７ ２時間目に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１時間インキュベーショ ンし、次に十分に洗浄した。ＣＤ２８+Ｔ細胞１０5個をホルボールミリステート アセテート（ＰＭＡ）Ｉｎｇ／ｍＬおよびＣＯＳトランスフェクト体２×１０4 個とともにインキュベーションした。遮断剤（１０μｇ／ｍＬ）は図１２の左端 に示したが、１）モノクローナル抗体不含（遮断剤なし）、２）ｍＡｂ１３３（ 抗−Ｂ７−１ｍＡｂ）、３）ｍＡｂＢＢ−１（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３ ｍＡｂ）、４）ｍＡｂＢ５（対照ＩｇＭｍＡｂ）、５）抗−ＣＤ２８Ｆａｂ（ｍ Ａｂ９．３）、６）ＣＴＬＡ−Ｉｇおよび７）対照Ｉｇを含む。図１２のａは７ ２時間インキュベーションの最後の１２時間に取込まれた3Ｈ−チミジン（１μ Ｃｉ）により測定された増殖を示す。図１２のｂは培養開始２４時間後に集めた 上 清液を用いてＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、ＣＡ）で測定したＩＬ−２生産 を示す。 Ｂ７−２をＢ７−１およびＢ７−３から区別するために、Ｂ７−１およびＢ７ −３に対するｍＡｂを用いて準***促進的に活性化したヒトＣＤ２８+Ｔ細胞の 増殖およびＩＬ−２生産を阻止した。Ｂ７−１およびＢ７−２ＣＯＳトランスフ ェクト体はＴ細胞の増殖およびＩＬ−２生産を共刺激した（図１２）。ｍＡｂ１ ３３（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１９８７年）前出）（抗−Ｂ７−１） およびＢＢＩ（Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．Ａ．など（総説中）、Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；Ｙｏｋｏｃｈｉ，Ｔ．、Ｈｏｌｌｙ，Ｒ． Ｄ．、Ｃｌａｒｋ，Ｅ．Ａ．（１９８２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２８巻 ：８２３〜８２７頁）（抗−Ｂ７−１および抗−Ｂ７−３）はＢ７−１により誘 導された増殖およびＩＬ−２生産を完全に阻止したが、Ｂ７−２をトランスフェ クトしたＣＯＳ細胞による共剌激には効果がなかった。イソタイプに適合した対 照Ｂ５ｍＡｂは無効であった。Ｂ７−２シグナルがＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路を 辿るかどうか決定するために抗−ＣＤ２８ＦａｂおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合蛋 白質を検査してこれらがＢ７−２共刺激を阻止するかどうか判定した。抗−ＣＤ ２８ＦａｂおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇの双方ともＢ７−１またはＢ７−２ＣＯＳト ランスフェクト体により誘導された増殖およびＩＬ−２生産を阻止したが、一方 、対照Ｉｇ融合蛋白質は無効であった（図１２）。ＣＴＬＡ４−Ｉｇは増殖のＢ ７−２共刺激を９０％だけ阻止したが、別の実験では阻止はさらに大きかった（ ９８〜１００％）。遮断剤はどれもＰＭＡとフィトヘマグルチニンとの組合せに より誘導されたＴ細胞の増殖もＩＬ−２生産も阻害しなかった。 Ｂ７−１と同様に、Ｂ７−２はＣＤ２８およびＣＴＬＡ４・Ｔ細胞表面分子に 対するカウンターレセプターである。両蛋白質は次の点で類似している：１）Ａ ＰＣ表面に発現する、２）構造的にＩｇスーパーファミリーに関連し、ＩｇＶお よびＩｇＣドメインを持ち、アミノ酸同一性２６％を持つ；３）Ｔ細胞を共剌激 してＩＬ−２を生産し、増殖させる。しかしながら、Ｂ７−１とＢ７−２とはい くつかの点で基本的に相違する。第一に、Ｂ７−２ｍＲＮＡは非刺激Ｂ細胞に構 造的に発現されるが、一方、Ｂ７−１ｍＲＮＡは４時間目まで現出せず、細胞表 面蛋白質は２４時間目まで検出されない（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．など（１ ９８７年）、前出；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．など（１９８９年）、前出）。非 刺激ヒトＢ細胞は細胞表面上にＣＴＬＡ４カウンターレセプターを発現せず、Ｔ 細胞増殖を共刺激しない（Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．Ａ．など、前出）。それ 故、非刺激Ｂ細胞におけるＢ７−２ｍＲＮＡの発現は活性化後にその細胞表面上 におそらく貯蔵ｍＲＮＡまたは蛋白質からであろうＢ７−２蛋白質を急速に発現 させるものと思われる。Ｂ７−２トランスフェクト体による共剌激は部分的には パラホルムアルデヒド固定化に敏感であるが、一方、Ｂ７−２共刺激は抵抗性で ある（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．など（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：６５７５〜６５７９頁）。第二に、細胞系とヒト Ｂ細胞新生物とでのＢ７−１とＢ７−２との発現は実質的に異なっている。第三 に、Ｂ７−２蛋白質はＢ７−１より長い原形質ドメインを持ち、これがＢ細胞の 分化に役割を演じるであろう。これらのフェノタイプおよび機能的な相違はこれ らの相同性分子は生物学的に明確に異なる機能を持つであろうことを示唆する。実施例６ ネズミＢ７−２抗原のクローニングと配列決定 Ａ．ｃＤＮＡライブラリーの構築 文献記載（Ａｒｕｆｆｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））の通りにジブチリル環状ＡＭＰ（ｃＡ ＭＰ）活性化Ｍ１２細胞（ネズミＢ細胞腫瘍系）からポリ（Ａ）+ＲＮＡを用い てｐＣＤＭ８ベクター（Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２９巻：８４０頁（１９８ ７年））でｃＤＮＡを構築した。 Ｍ１２細胞を１×１０6細胞／ｍＬまで組織培養フラスコの中で完全培養培地 ｛１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＲＰＭＩ１６４０、２ｍＭ−グル タミン、１ｍＭ−ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、硫 酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および硫酸ゲンタマイシン（５μｇ ／ｍＬ）｝で培養し、ジブチリルｃＡＭＰ３００μｇ／ｍＬで活性化した（Ｎａ ｂａｖｉ，Ｎ．など（１９９２年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６０巻：２６６〜２６８ 頁）。０、６、１２、１８、２４および３０時間後に活性化Ｍ１２細胞を収穫し た。 ＲＮＡは活性化Ｍ１２細胞を４Ｍ−チオシアン酸グアニジン、０．５％ザルコ シル、２５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、０．１３％Ｓｉｇｍａ社アンチフォー ムＡおよび０．７％メルカプトエタノール混液中でホモゲナイズして調製した。 ホモゲネートを５．７Ｍ−ＣｓＣｌ、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、２５ｍＭ−酢酸ナト リウム、ｐＨ７混液中２４時間毎分３２０００回転で遠心分離してＲＮＡを精製 した。ＲＮＡのペレットを５％ザルコシル、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、１０ｍＭ−トリ ス、ｐＨ７．５中に溶解し、５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソ アミルアルコール２容で抽出した。ＲＮＡをエタノールから２回沈降させた。ｃ ＤＮＡライブラリー構築に使用したポリ（Ａ）+ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルロ ース選択２サイクルで精製したものである。 相補ＤＮＡを５０ｍＭ−トリス、ｐＨ８．３、７５ｍＭ−ＫＣｌ、３ｍＭ−Ｍ ｇＣｌ2、１０ｍＭ−ジチオスレイトール、５００μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、オリゴ（ｄＴ）12〜18５０μｇ／ｍＬ、ＲＮａｓｉｎ１８ ０単位／ｍＬおよびモロニー−ＭＬＶ逆転写酵素１００００単位／ｍＬの反応液 全容積５５μＬ中、ジブチリルｃＡＭＰで活性化したネズミＭ１２細胞のポリ（ Ａ）+ＲＮＡ５．５μｇから１時間３７℃で合成した。逆転写後、溶液を２５ｍ Ｍ−トリス、ｐＨ８．３、１００ｍＭ−ＫＣｌ、５ｍＭ−ＭｇＣｌ2、各２５０ μＭ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５ｍＭ−ジチオスレイトール 、ＤＮＡポリメラーゼ１２５０単位／ｍＬ、リボヌクレアーゼＨ８．５単位／ｍ Ｌに調製し、２時間１６℃でインキュベーションしてｃＤＮＡを２重鎖ＤＮＡに 変換した。ＥＤＴＡを１８ｍＭまで添加し、溶液を５０％フェノール、４９％ク ロロホルム、１％イソアミルアルコール混液等容で抽出した。ＤＮＡを２．５Ｍ −酢酸アンモニウムの存在下エタノール２容および担体としての線状ポリアクリ ルアミド４μｇで沈降させた。逆転写後、逆転写酵素は７０℃に１０分間加熱し て不活化した。水３２０μＬおよび０．１Ｍ−トリス、ｐＨ７．５、２５ｍＭ− ＭｇＣｌ2、０．５Ｍ−ＫＣｌ、ウシ血清アルブミン２５０μｇ／ｍＬおよび５ ０ ｍＭ−ジチオスレイトールの混液８０μＬを添加し、溶液を各２００μＭ−ｄＡ ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ１５０単位／ｍＬ、 リボヌクレアーゼＨ８単位／ｍＬに調製し、２時間１６℃でインキュベーション してｃＤＮＡを２重鎖ＤＮＡに変換した。ＥＤＴＡを１８ｍＭまで添加し、溶液 を５０％フェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液等容 で抽出した。ＤＮＡを２．５Ｍ−酢酸アンモニウムの存在下エタノール２容およ び担体としての線状ポリアクリルアミド４μｇで沈降させた。 このＤＮＡに非自己相補ＢｓｔＸＩアダプター２μｇを次のようにして添加し た：ポリ（Ａ）+ＲＮＡ５．５μｇからの２重鎖ｃＤＮＡを配列ＣＴＴＴＡＧＡ ＧＣＡＣＡ（配列番号１５）のキナーゼ処理オリゴヌクレオチド３．６μｇおよ び配列ＣＴＣＴＡＡＡＧ（配列番号１６）のキナーゼ処理オリゴヌクレオチド２ ．４μｇと６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５、６ｍＭ−ＭｇＣｌ2、５ｍＭ−ＮａＣ ｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍＬ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、０ ．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレイトール、１ｍＭ−スペルミジンおよび Ｔ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を含む全容０．４５ｍＬの溶液中、１５℃で１６ 時間インキュベーションした。ＥＤＴＡを３４ｍＭまで添加し、溶液を５０％フ ェノール、４９％クロロホルム、１％イソアミルアルコール混液の等容で抽出し た。ＤＮＡを２.５Ｍ−酢酸アンモニウムの存在下にエタノール２容から沈降さ せた。 ６００ｂｐ以上のＤＮＡは次の通りに選択した：アダプターＤＮＡを１０ｍＭ −トリス、ｐＨ８、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、６００ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１％ザルコ シル中に再溶解し、セファロースＣＬ−４Ｂカラム上、同じ緩衝液でクロマトグ ラフィーした。カラム空隙容積中のＤＮＡ（６００ｂｐ以上のＤＮＡを含む）を 集めてエタノールで沈降させた。 ｃＤＮＡクローニング用のｐＣＤＭ８ベクターをＢｓｔＸＩによる消化とアガ ロースゲル精製によって調製した。ポリ（Ａ）+ＲＮＡ５．５μｇからのアダプ ターＤＮＡを６ｍＭ−トリス、ｐＨ７．５、６ｍＭ−ＭｇＣｌ2、５ｍＭ−Ｎａ Ｃｌ、ウシ血清アルブミン３５０μｇ／ｍＬ、７ｍＭ−メルカプトエタノール、 ０．１ｍＭ−ＡＴＰ、２ｍＭ−ジチオスレイトール、１ｍＭ−スペルミジンおよ びＴ４ＤＮＡリガーゼ６００単位を含む溶液全容積１．５ｍＬ中、１５℃で２４ 時間に２．２５μｇのＢｓｔＸＩ切断ｐＣＤＭ８にリゲートした。結合反応混合 物を有能大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３に形質転換し、独立のｃＤＮＡクローン全部 で２００×１０6を得た。 プラスミドＤＮＡは原ｃＤＮＡライブラリー形質転換体培養液５００ｍＬから 製造した。プラスミドＤＮＡをアルカリ分解操作により精製し、続いてＣｓＣｌ 平衡勾配中で２回バンド化分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ・Ｓ ｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８７年））。Ｂ．クローニング操作法 スクリーニングの第一段階では５０％密集生長ＣＯＳ細胞の１００ｍｍシャー レ３０個を活性化Ｍ１２ネズミＢ細胞ライブラリーＤＮＡ０．０５μｇ／ｍＬで ＤＥＡＥ−デキストリン法（Ｓｅｅｄなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（１９８７年））を用いてトランスフェクト した。細胞をトリプシン処理し、２４時間後に再播種した。４７時間後、細胞を ＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４／０．０２％アジ化ナトリウム中、 ３７℃で３０分間インキュベーションして脱離した。脱離細胞をヒトＣＴＬＡ４ ＩｇとネズミＣＤ２８Ｉｇ１０μｇ／ｍＬで４５分間４℃で処理した。細胞を洗 い、アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体で被覆した培養皿に散布し、室 温で付着させた。３時間後、プレートをＰＢＳ／０．５ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ７ ．４／０．０２％アジ化ナトリウム、５％ＦＣＳで２回および０．１５Ｍ−Ｎａ Ｃｌ、０．０１Ｍ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、５％ＦＣＳとで１回穏やかに洗浄 した。エピソームＤＮＡを培養した細胞から収穫し、大腸菌ＤＨ１０Ｂ／Ｐ３に 形質転換した。プラスミドＤＮＡを文献記載のスフェロプラスト融合（Ｓｅｅｄ など、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻：３３６５頁（ １９８７年））によりＣＯＳ細胞に再導入し、発現と培養のサイクルを２回反復 した。選択の第二および第三段階では、４７時間後、脱離したＣＯＳ細胞をまず α−ネズミＢ７−１ｍＡｂ（１６−１０Ａ１、１０μｇ／ｍＬ）とインキュベー ショ ンし、Ｂ７−１を発現するＣＯＳ細胞をα−マウスＩｇＧおよびＩｇＭでコート した磁気ビーズで除去した。ＣＯＳ細胞を次にヒトＣＴＬＡ４Ｉｇおよびネズミ ＣＤ２８Ｉｇの１０μｇ／ｍＬで処理し、ネズミＢ７−２発現ＣＯＳ細胞をヤギ 抗−ヒトＩｇＧ抗体被覆ディッシュ上で培養して選択した。第三段階の後、各コ ロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ 細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＯＳ細胞上のＢ７−２の 発現はＣＴＬＡ４Ｉｇとの間接免疫螢光法により分析した。 選択の最終段階後、各コロニーからプラスミドＤＮＡを製造した。候補クロー ン８個の中、全部で６個が約１．２ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片を含んでいた。クロ ーン８個のプラスミドＤＮＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。１．２Ｋｂ のｃＤＮＡ挿入断片を持つクローン６個は全てＣＴＬＡ４Ｉｇを用いる間接免疫 螢光法とフローサイトメトリー分析によればB７−２発現が強陽性であった。Ｃ．配列決定 クローン４のＢ７−２ｃＤＮＡ挿入断片を次の方策を用いてｐＣＤＭ８発現ベ クター中で配列決定した。最初の配列決定は配列決定プライマーＴ７、クローン したＢ７−２ｃＤＮＡに隣接するＣＤＭ８ベクター配列に相同のＣＤＭ８Ｒ（Ｉ ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った（表ＩＩ参照）。配列決定は色素ターミ ネーター反応とＡＢＩ自動ＤＮＡ配列決定器（ＡＢＩ社、Ｆｏｓｔｅｒ・Ｃｉｔ ｙ、ＣＡ）を用いて行った。これらのプライマーを用いて得られたＤＮＡ配列を 使って次の配列決定プライマーを設計した（表ＩＩ参照）。この配列決定および 次段プライマー選択のサイクルをネズミＢ７−２ｃＤＮＡが両鎖について完全に 配列決定されるまで続行した。 得られたネズミＢ７−２クローン（ｍＢ７−２、クローン４）の一つは１１６ ３塩基対の挿入断片と９２７ヌクレオチドの単一の長いオープン読み枠および約 １２６ヌクレオチドの３’非コード配列（図１４、配列番号２２）が含まれてい た。この蛋白質のオープン読み枠がコードすると予測されたアミノ酸配列を図１ ４のヌクレオチド配列の下に示す。コードされたネズミＢ７−２蛋白質は長さが ３０９アミノ酸残基であると予測される（配列番号２３）。この蛋白質配列は他 のＩ型Ｉｇスーパーファミリー膜蛋白質に共通の特徴多数を示す。蛋白質翻訳は コンセンサス真核細胞翻訳開始部位（Ｋｏｚａｋ，Ｍ（１９８７年）、Ｎｕｃｌ ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１５巻：８１２５〜８１４８頁参照）とのこの領域で のＤＮＡ相同性を基にすればメチオニンコドン（ＡＴＧ、ヌクレオチド１１１〜 １１３）から始まると予測される。ネズミＢ７−２蛋白質のアミノ端末（アミノ 酸１から２３）は２３位のアラニンと２４位のバリンとの間に予測切断部位（ｖ ｏｎ・Ｈｅｉｊｎｅ（１９８７年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１４巻 ：４６８３頁）のある分泌シグナルペプチドの特性を持つ。この部位でのプロセ ッシングは未修飾分子量約３２ｋＤａを持つ２８６アミノ酸のネズミＢ７−２膜 結合蛋白質をもたらすと思われる。この蛋白質はほぼアミノ酸残基２４〜２４６ の細胞外ＩｇスーパーファミリーＶおよびＣ様ドメイン、ほぼアミノ酸残基２４ ７〜２６５の親水性膜貫通ドメインおよびほぼアミノ酸残基２６６〜３０９の長 い原形質ドメインから構成されると思われる。Ｉｇスーパーファミリーとの相同 性は４０から１１０位および1５７から２１６位にあるシステインが結合する細 胞外領域中の近接するＩｇ様ドメイン２個に起因する。細胞外ドメインはＮ−結 合グリコシル化の可能性ある部位９個も含み、ネズミＢ７−１と同様、おそらく グリコシル化されている。ネズミＢ７−２蛋白質のグリコシル化は分子量を約５ ０〜７０ｋＤａに増加する。ネズミＢ７−２の原形質ドメインはシステンとそれ に続いておそらくＡＰＣ内でシグナル伝達または制御ドメインとして機能するプ ラスに荷電したアミノ酸を持つ共通領域を含む。ネズミＢ７−２のヌクレオチド お よびアミノ酸配列の双方のＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースとの比較 で、ヒトおよびネズミＢ７−１が有意な相同性（アミノ酸配列同一性約２６％） を示した。ネズミＢ７−２はヒトの同族体ｈＢ７−２と同一性５０％と類似性６ ７％を示した。ネズミＢ７−２（クローン４）をコードするｃＤＮＡ挿入断片を 含むベクター（プラスミドｐｍＢｘ４）でトランスフェクトした大腸菌（ＤＨ１ ０６／ｐ３）は１９９３年８月１８日にアメリカンタイプカルチャーコレクショ ン（ＡＴＣＣ）に受託番号６９３８８で寄託された。Ｄ．共刺激 ＣＤ４+マウスＴ細胞を第一にトリス−ＮＨ4Ｃｌで処理して赤血球を除去して 精製した。Ｔ細胞をナイロンウールカラムを通して濃縮した。ＣＤ４+Ｔ細胞を 抗−ＭＨＣクラスＩＩおよび抗−ＣＤ２８のｍＡｂ混合物とウサギ補体で２回処 理して精製した。ネズミＢ７−１（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ癌研究所、ボストン 、ＭＡのＧｏｒｄｏｎ・Ｆｒｅｅｍａｎ博士から恵与；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ ．など（１９９１年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７４巻：６２５〜６３１頁参 照）、ネズミＢ７−２およびベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞をトラ ンスフェクションの７２時間後に収穫し、マイトマイシンＣ２５μｇ／ｍＬと１ 時間インキュベーションし、十分に洗浄した。ネズミＣＤ４+Ｔ細胞１０5個をホ ルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）１ｎｇ／ｍＬおよびＣＯＳトランス フェクト体２×１０4個とインキュベーションした（表ＩＩＩ）。Ｔ細胞増殖は ７２時間のインキュベーションの最終１２時間に取込まれた3Ｈ−チミジン（１ μＣｉ）により測定した。 実施例７ ヒトＢ７−２免疫グロブリン融合蛋白質の構築と特性 Ａ．ヒトＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質の製造 ヒトＢ７−２の細胞外部分を免疫グロブリン定常領域に結合した融合蛋白質と して製造した。免疫グロブリン定常領域は免疫グロブリン構造に必須のエフェク ター活性を減弱または除去する修飾を含む遺伝子的修飾を含んでいてもよい。総 括的にはｈＢ７−２の細胞外部分をコードするＤＮＡを指向性突然変異によって 修飾したヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領 域をコードするＤＮＡに結合した。これは以下のサブセクションに記載のように して行った。Ｂ．遺伝子融合体の調製 目的とするＤＮＡ配列に対応するＤＮＡ断片は下記プライマー対を用いてポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製した。一般的に、ＰＣＲ反応物はプライ マー（各１μＭ）、ｄＮＴＰ（各２００μＭ）、テンプレートＤＮＡ１ｎｇ、お よびＴａｑポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉなど（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２ ３９巻：４８７〜４９１頁）を含むＴａｑポリメラーゼ緩衝液（Ｇｅｎｅ・Ａｍ ｐ・ＰＣＲキット、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ、 ＣＴ）最終容積１００μＬ中で調製した。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅はサーモサイ クラー（Ｅｒｉｃｏｍｐ）Ｓａｎ・Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて各々が変性段階 （９４℃で１分間）、再生段階（５４℃で３０秒間）および鎖伸長段階（７２℃ で１分間）から構成される２５から３０サイクルを行った。各ｈＢ７−２−Ｉｇ 遺伝子融合体の構造はＢ７−２の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＣγ１またはＩ ｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに結合する分泌促進シグナルの 配列から構成される。ＩｇＣγ１およびＩｇＣγ４の配列はヒンジ領域内にある ジスルフィド結合形成能のあるシステイン残基をセリン残基で置換したヌクレオ チド変換を含み、さらにＣＨ２ドメインにＦｃ受容体へのＩｇＣ結合および補体 活性化に必要と思われるアミノ酸を置換するヌクレオチド変換を含んでいよう。 配列分析でｍγ４およびｍγ１クローンの構造を確認し、各々の構築を用いて ２９３細胞をトランスフェクトして過渡的発現を検査した。ｈＩｇＧ・ＥＬＩＳ Ａによって両構築について１００ｎｇ蛋白質／ｍＬ細胞上清液にほぼ等しい過渡 的発現水準が観測され／確認された。ＮＳＯ細胞系をトランスフェクトして融合 蛋白質の永続的発現を行った。Ｃ．ｈＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質遺伝子の構築 （１）シグナル配列の調製 ＰＣＲ増幅を用いて哺乳類細胞からのＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質の分泌に適する 免疫グロブリンシグナル配列を製造した。このＩｇシグナル配列はネズミＩｇＧ 重鎖遺伝子を含むプラスミド（Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．など（１９８９年）、Ｐｒ ｏｃ．Ａｃａｄ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻：３８３３３８３７頁）か らオリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＡＣＴＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＧＡ ＴＣＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＴＡＣ−３’（＃０１）（配列番号：）を正方向プ ライマー（ｆｏｒｗａｒｄ・ｐｒｉｍｅｒ）とし、オリゴヌクレオチド５’−Ｇ ＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧ −３’（＃０２）（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ・ ＰＣＲ・ｐｒｉｍｅｒ）として用いて調製した。正方向ＰＣＲプライマー（配列 番号：）は制限酵素ＢｓａＩの認識配列を含み、Ｉｇシグナル配列の５’開始メ チオニンへの配列に相同である。逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はｈＢ ７−２の細胞外ドメイン５’端末およびＩｇシグナル配列３’端末から誘導され た配列から構成される。これらのプライマーを用いるネズミＩｇシグナルテンプ レートＤＮＡのＰＣＲ増幅は２２４ｂｐ生成物を与えるが、これはＢｓａＩ制限 部位とそれに続いてｈＢ７−２の細胞外ドメインをコードする最初の２０ヌクレ オチドの配列に融合するＩｇシグナル領域の配列から構成されている。シグナル 配列とｈＢ７−２との間の結合点はシグナル配列で開始する蛋白質翻訳が正しい 読み枠中のｈＢ７−２を通って継続するものである。 （２）ｈＢ７．２遺伝子セグメントの調製 ｈＢ７−２遺伝子の細胞外ドメインは発現ベクターｐＣＤＮＡＩ（Ｆｒｅｅｍ ａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２巻：９０９〜１１頁（１９９４年））に挿入 したｈＢ７−２ｃＤＮＡを含むプラスミドのＰＣＲ増幅により調製した： ｈＢ７−２の細胞外ドメインはオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＴＣＣＴＣＴＧ ＡＡＧＡＴＴＣＡＡＧＣ−３’（＃０３）（配列番号：）を正方向プライマーと し、オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣ ＴＧＡＧＧＴＣＣ−３’（＃０４）（配列番号：）を逆方向プライマーとして使 用するＰＣＲ増幅により調製した。正方向ＰＣＲプライマーはＢ７−２細胞外ド メインの最初の２０ヌクレオチドに相当する配列を含み、逆方向ＰＣＲプライマ ーはＢ７−２細胞外ドメインの最後のヌクレオチド２２個とそれに続いてＢｃｌ Ｉ制限部位および非コードヌクレオチド７個に対応する配列を含む。プライマー ＃０３および＃０４でのＰＣＲ増幅はｈＢ７−２の細胞外ＩｇＶおよびＩｇＣ様 ドメインとそれに続く独特なＢｃｌＩ制限部位に対応する６７３ｂｐ生成物を与 える。 シグナル配列は次の通りＰＣＲによってｈＢ７−２の細胞外部分に結合した。 前記で得られたシグナル配列およびｈＢ７−２細胞外ドメインに対応するＤＮＡ のＰＣＲ生産物を等モル量混合し、１００℃に加熱して変性し、５４℃に３０℃ 間維持して相補端末をアニーリングさせ、両鎖をｄＮＴＰとＴｏｑポリメラーゼ を用いて充足した。ＰＣＲプライマー＃０１および＃０４を添加し、ＰＣＲ増幅 して完全断片を製造してＢｓａＩ制限部位とそれに続いてｈＢ７−２の細胞外ド メインに融合したシグナル配列とそれとに続くＢｃｌＩ制限部位から構成される 〜８８０断片を得た。 （３）免疫グロブリン融合ドメインのクローニングおよび修飾 プラスミドｐＳＰ７２１ｇＧ１はヒトＩｇＧ１重鎖ゲノムＤＮＡの２０００ｂ ｐセグメント（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．など（１９８２年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃ ｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１０巻：４０７１〜４０７９頁）をクローニングベクターｐ ＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の多重クローニング部位に クローニングして調製した。プラスミドｐＳＰ７２１ｇＧ１はヒト重鎖ＩｇＣγ １遺伝子のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコードするゲノムの ＤＮＡを含んでいた。重鎖のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を中間のＤＮＡと共に 増幅するように設計されたＰＣＲプライマーは次の通りに調製した。正方向ＰＣ Ｒプライマー５’−ＧＣＡＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡ ＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＡＣＣ ＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣ−３’（配列番号：）はＨｉｎｄＩＩＩおよび ＢｃｌＩ制限部位を含み、システイン残基３個をセリンに変更させるヌクレオチ ド置換５個を除きヒンジドメイン配列について相同であった。逆方向ＰＣＲプラ イマー５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：）は 購入可能なＴ７プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と同一で あった。これらのプライマーによる増幅で、５’−端末でＨｉｎｄＩＩＩおよび ＢｃｌＩ制限部位に結合し、３’−端末でＢａｍＨ１、Ｓｍａ１、Ｋｐｎ１、Ｓ ａｃ１、ＥｃｏＲ１、Ｃｌａ１、ＥｃｏＲ５およびＢｇ１１１制限部位に結合す る１０５０ｂｐ断片が得られた。この断片はＩｇＣヒンジドメインを含んでいた が、そこではシステインコドン３個がセリンコドンに置換され、続いてイントロ ン、ＣＨ２ドメイン、イントロン、ＣＨ３ドメインおよび後続の３’配列が付い ていた。ＰＣＲ増幅後、ＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲ１で消化し、同 じ制限酵素で消化した発現ベクターｐＮＲＤＳＨにクローニングした。これでプ ラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１が得られた。 同様なＰＣＲによる方策を用いて、ヒトＩｇＣγ４定常領域のヒンジ−ＣＨ２ −ＣＨ３ドメインをクローニングした。完全なＩｇＣγ４重鎖ゲノム配列を含む （Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．、Ｂｕｘｂａｕｍ，Ｊ．およびＨｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．（１ ９８１年）、ＤＮＡ）１巻：１１〜１８頁）プラスミドｐ４２８Ｄ（Ｍｅｄｉｃ ａｌ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｃｏｕｎｃｉｌ、ロンドン、英国）を、オリゴヌクレ オチド５’ＧＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧ ＧＴＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣ− ３’（配列番号：）を正方向ＰＣＲプライマーとし、オリゴヌクレオチド５’Ｇ ＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＴ ＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番 号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとして用いるＰＣＲ増幅の鋳型に用いた。正方 向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はＢｃｌＩ制限部位に続いてＩｇＣγ４のヒ ンジドメインをコードする配列を含む。ヒンジ領域のシステイン残基をセリン残 基に入れ換えるためにヌクレオチド置換を行った。逆方向ＰＣＲプライマー（配 列番号：）はＰｓｐＡＩ制限部位（５’ＣＣＣＧＧＧ−３’）を含む。これらプ ライマーでのＰＣＲ増幅で１１７９ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ生産物をＢ ｃｌＩとＰｓｐＡＩで消化し、同じ制限酵素で消化したｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１ にリゲートしてプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４を得た。この反応物ではＩｇ Ｃγ４ドメインがｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１中に存在したＩｇＣγ１ドメインの代 わりになっていた。 ＩｇＣ内のＣＨ２ドメインでＦｃ受容体に結合に関与すると思われるアミノ酸 を入れ換える修飾は次の通りに行った。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１をＩ ｇＣγ１ＣＨ２ドメインの修飾用鋳型に用い、プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ ４をＩｇＣγ４ＣＨ２ドメインの修飾用鋳型に利用した。プラスミドｐＮＲＤＳ Ｈ／ＩｇＧ１は正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）およびオリゴヌクレオチ ド５’−ＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＣＧＧＴＧ ＣＣＣＣＣＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号： ）を逆方向ＰＣＲプライマーに用いてＰＣＲ増幅した。正方向ＰＣＲプライマー （配 列番号：）は前に記載があり、逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はアミノ 酸２３４、２３５および２３７（Ｃａｎｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｍ．およびＭｏｒｒｉ ｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９９１年）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３巻：１４８３ 〜１４９１頁）を各々ＬｅｕからＡｌａ、ＬｅｕからＧｌｕおよびＧｌｙからＡ ｌａに変換するように設計されたヌクレオチド置換５個を除いてＩｇＧ１のＣＨ ２ドメインのアミノ末端部分と相同である。これらＰＣＲプライマーの増幅で修 飾ヒンジドメイン、イントロンおよび修飾ＣＨ２ドメイン部分から構成される２ ３９ｂｐのＤＮＡ断片が得られる。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１について はオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＧ ＣＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣ−３’ （配列番号：）を正方向プライマーとし、オリゴヌクレオチド（配列番号：）を 逆方向ＰＣＲプライマーとするＰＣＲ増幅も行った。正方向ＰＣＲプライマー（ 配列番号：）はプライマー（配列番号：）に対して相補的で、ＣＨ２のアミノ酸 置換に必要な相補ヌクレオチド変化５個を含む。逆方向ＰＣＲプライマー（配列 番号：）は前に記載がある。これらのプライマーでの増幅は修飾されたＣＨ２ド メイン部分、イントロン、ＣＨ３ドメインおよび３’付加的配列から構成される ８７５ｂｐの断片を与えた。修飾ヒンジドメイン、修飾ＣＨ２ドメインおよびＣ Ｈ３ドメインから構成される完全ＩｇＣγ１セグメントは更に１回のＰＣＲ反応 によって調製した。前記２回のＰＣＲ反応の生成物を精製し、混合し、変性（９ ５℃、１分間）し、次に再生（５４℃、３０秒）して断片２個の相補的末端をア ニーリングさせた。両鎖をｄＮＴＰとＴａｑポリメラーゼを用いて充足（ｆｉｌ ｌ・ｉｎ）し、全断片を正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）および逆方向Ｐ ＣＲプライマー（配列番号：）を用いて増幅した。得られた１０５０ｂｐの断片 を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、予め同じ制限酵素で消化した ｐＮＲＤＳＨにリゲートしてプラスミドｐＮＲＤＳＨＩｇＧ１ｍを得た。 免疫グロブリンの２３５位と２３７位にあるアミノ酸２個を各々ＬｅｕからＧ ｌｕおよびＧｌｙからＡｌａに変更してＩｇＣγ４ＣＨ２ドメインにあるＦｃ受 容体結合部を除去した。プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４を正方向プライマー （配列番号：）およびオリゴヌクレオチド５’−ＣＧＣＡＣＧＴＧＡＣＣＴＣＡ ＧＧＧＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＴＣＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴ ＧＧＧＧＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＡＡＣ ＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧ−３’（配列番号：）を逆方向プライマーに用いて のＰＣＲ増幅も行った。正方向プライマーは前に記載があり、逆方向ＰＣＲプラ イマーは前記アミノ酸置換のために設計されたヌクレオチド置換３個を除いてＣ Ｈ２ドメインのアミノ末端部分と相同である。このプライマーは後続するクロー ニングのためにＰｍＩＩ制限部位も含む。これらプライマーでの増幅で修飾ヒン ジ領域、イントロンおよびＣＨ２ドメインの修飾５’部分から構成される２５６ ｂｐの断片を得た。 オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＧ ＧＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧ ＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴ ＧＣＧ−３’（配列番号：）を正方向プライマーとし、オリゴヌクレオチド（配 列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとしてもプラスミドｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ ４をＰＣＲ増幅した。正方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）はプライマー（配 列番号：）に対して相補的で、ＣＨ２アミノ酸入換えのために必要な相補ヌクレ オチド変化３個を含む。逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）は前に記載があ る。これらのプライマーでの増幅で修飾ＣＨ２ドメイン部分、イントロン、ＣＨ ３ドメインおよび３’付加配列から構成される１０１２ｂｐの断片を得た。修飾 ヒンジドメイン、修飾ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインから構成される完全 ＩｇＣγ４セグメントは更に一回のＰＣＲ反応で調製した。前記２回のＰＣＲ反 応の生成物を精製し、混合し、変性（９５℃、１分間）し、次に再生（５４℃、 ３０秒）して断片２個の相補的末端をアニーリングさせた。両鎖をｄＮＴＰとＴ ａｑポリメラーゼを用いて充足し、全断片を正方向ＰＣＲプライマー（配列番号 ：）および逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：）を用いて増幅した。得られた １１７９ｂｐの断片を精製し、ＢｃＩＩとＰｓｐＡＩで消化し、予め同じ制限酵 素で消化しておいたｐＮＲＤＳＨにリゲートしてプラスミドｐＮＲＤＳＨ／Ｉｇ Ｇ４ｍを得た。 （４）最終ｈＢ７−２Ｉｇ遺伝子の組立 前記で調製したＩｇシグナル−ｈＢ７−２遺伝子融合体に対応するＰＣＲ断片 をＢｓａＩおよびＢｃｌＩ制限酵素で消化し、予めＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｃｌ Ｉで消化しておいたｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１、ｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１ｍ、ｐＮ ＲＤＳＨ／ＩｇＧ４およびｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ４ｍにリゲートした。結合プラ スミドをＣａＣｌ2能力細胞大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、形質転換体をアン ピシリン（５０μｇ／ｍＬ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｆｉ ｔｓｃｈ，Ｅ．Ｅ．およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．編、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を含むＬ−寒天上で選択した。形質転 換大腸菌から分離されたプラスミドを制限酵素消化により分析した。予測された 制限プラスミドを配列決定してシグナルｈＢ７−２−ＩｇＧ遺伝子融合セグメン トの全部分を確認した。Ｄ．ｈＢ７−２Ｖ−ＩｇＧ１およびｈＢ７−２Ｃ−ＩｇＧ１の発現クローニング ヒトＢ７−２の可変および定常ドメインを別々にｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ１中に クローニングした。これらのクローニングはＰＣＲを用いて行った。可変および 定常領域に対応するｈＢ７−２の部分はイントロン／エキソン地図および公表さ れた遺伝子構造分析から決定した。 （１）ｈＢ７−２ＶＩｇの組立 ｈＢ７−２ＶドメインＩｇ配列は前記と同様なＰＣＲ方策を用いて組立てた。 シグナル配列はｏｎｃｏＭ遺伝子を含むプラスミドのＰＣＲ増幅によりｏｎｃｏ Ｍ遺伝子からオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＡＡＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡ ＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧ−３’（＃０５ ）（配列番号：）を正方向ＰＣＲプライマーとし、５’−ＡＧＴＣＴＣＡＴＴＧ ＡＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣ ＡＴＧＣＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧ−３’（＃０６）（配列番号：）を逆方向 プライマーとして用いて誘導した。正方向ＰＣＲプライマー（＃０５）はＨｉｎ ｄＩＩＩ制限部位およびｏｎｃｏＭシグナル配列のアミノ端末部分を含む。逆方 向ＰＣＲ（＃０６）はｈＢ７−２ＩｇＶ様ドメインの５’端末に融合したｏｎｃ ｏＭシグナル配列の３’部分に対応する配列を含む。 ｈＢ７−２ＩｇＶ様ドメインはオリゴヌクレオチド５’−ＣＴＣＣＴＧＴＴＴ ＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＣＡＧ ＧＣＴＴＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＧＡＣ−３’（＃０７）（配列番号：）を正方向 、オリゴヌクレオチド５’−ＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＣＴＧ ＡＴＣＡＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣ−３’（＃０８） （配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとして用いるｈＢ７−２ｃＤＮＡのＰ ＣＲ増幅によって得られた。これらのプライマーでのＰＣＲ増幅でｏｎｃｏＭシ グナル配列の３’末端部分を５’端末に、ＢｃｌＩ制限部位を３’端末に持つｈ Ｂ７−２ＩｇＶドメインを得た。シグナルおよびＩｇＶドメインをＰＣＲ反応で 結合した。そこではｏｎｃｏＭシグナルおよびＩｇＶドメインＤＮＡ断片等モル 量を混合し、変性し、アニーリングし、鎖を充足した。正方向プライマー＃０５ および逆方向プライマー＃０８を用いる後続ＰＣＲ増幅でＨｉｎｄＩＩＩ制限部 位、続いてＢ７−２ＩｇＶドメインに融合したｏｎｃｏＭシグナル、続いてＢｃ ｌＩ制限部位を含むＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよび ＢｃｌＩで消化し、同じ制限酵素で消化した発現ベクターｐＮＲＤＳＨ／ＩｇＧ １にクローニングしてｐＮＲＤＳＨ／Ｂ７−２ＣＩｇを得た。 （２）ｈＢ７−２ＣＩｇの組立 ｈＢ７−２ＩｇＣドメインのための発現プラスミドはＩｇＣドメインに特異的 なＰＣＲプライマーを使用した点を除いてＩｇＶのために前記したようにして製 造した。シグナル配列ｏｎｃｏＭはオリゴヌクレオチド＃０５を正方向ＰＣＲプ ライマーとし、オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＡＡＡＴＴＧＧＴＡＣＴＡＴＴＴ ＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＴＴＧ ＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧ−３’（＃０９）（配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマ ーとして用いて製造した。ｈＢ７−２ＩｇＣドメインはオリゴヌクレオチド５’ −ＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＡＣＴＴ ＣＡＧＴＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＴＡＧＴＡＣＣＡＡＴＴＴＣ−３’（＃１１）（ 配列番号：）を逆方向ＰＣＲプライマーとして用いて製造した。両ＰＣＲ生成物 を混合し、プライマー＃０５および＃１１で増幅してシグナル配列ｏｎｃｏＭと ｈＢ７−２ＩｇＣドメインを組立てた。このＰＣＲ生成物を次にＨｉｎｄＩＩＩ およびＢｃｌＩで消化し、同様な制限酵素で消化した発現ベクターｐＮＲＤＳＨ ／ＩｇＧ１にリゲートして最終発現プラスミドｐＮＲＤＳＨ／ｈＢ７−２ＣＩｇ Ｇ１を得た。Ｅ．ヒトＢ７−２Ｉｇ融合蛋白質による競合的結合の検定 種々のＢ７族−Ｉｇ融合蛋白質がビオチン化ＣＴＬＡ４Ｉｇの固定化Ｂ７−２ −Ｉｇへの結合を競合的に阻害する性能を測定した。競合結合検定は次の通りに 行い、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．（１９８５年）、Ｊ ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４巻：２１３〜２２８頁）に従って 分析した。溶解性ｈＣＴＬＡ４Ｉｇを125Ｉで約２×１０6ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比 活性に標識した。ｈＢ７−２−Ｉｇ融合蛋白質１０μｇ／ｍＬｐＨ８．０の１０ ｍＭ−トリス溶液で５０μＬ／ウェルで一夜マイクロタイター板を被覆した。ウ ェルを結合緩衝液（１０％熱不活化ＦＢＳ、０．１％ＢＳＡおよび５０ｍＭ−Ｂ ＥＳを含むＤＭＥＭ、ｐＨ６．８）により２時間室温でブロックした。各ウェル に完全長Ｂ７−２（ｈＢ７−２Ｉｇ）、完全長Ｂ７−１（ｈＢ７−１Ｉｇ）、Ｂ ７−２（ｈＢ７−２ＶＩｇ）可変領域様ドメインおよびＢ７−２（ｈＢ７−２Ｃ Ｉｇ）定常領域様ドメインを含む非標識競合Ｉｇ融合蛋白質の存在または不在下 に標識ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（４ｎＭ）を添加し、室温で２．５時間結合させた。ウ ェルを氷冷結合緩衝液で１回洗浄し、次に氷冷ＰＢＳで４回洗浄した。ウェルを ０． ５Ｎ−ＮａＯＨで５分間処理して結合放射能を回収し、溶解物質を取り、ガンマ 線計測器でカウントした。 これらの検定結果を図１５に示すが、ここではｈＢ７−２Ｉｇ（１０〜２０ｎ Ｍ）およびｈＢ７−２ＶＩｇ（３０〜４０ｎＭ）の双方が固定化Ｂ７−２蛋白質 へのＣＴＬＡ４Ｉｇの結合を阻害している。ｈＢ７−２ＣＩｇは可溶性ＣＴＬＡ ４と競合せず、Ｂ７−２結合領域は可変領域様ドメインにあることが判明した。Ｆ．Ｂ７−１およびＢ７−２融合蛋白質のための競合的結合の検定 種々の型の組換えＣＴＬＡ４がｈＢ７−１またはｈＢ７−２に結合する性能を 次の通りに競合的結合ＥＬＩＳＡ検定により評価した。精製組換えｈＢ７−Ｉｇ （２０μｇ／ｍＬＰＢＳ）５０μＬ中、室温で一夜コスターＥＩＡ／ＲＩＡ９６ ウェルマイクロタイター皿（Ｃｏｓｔａｒ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳ Ａ）に結合させた。各ウェルをＰＢＳ２００μＬで３回洗浄し、１％ＢＳＡ・Ｐ ＢＳを添加（２００／穴）して非結合部分を室温で１時間ブロックした。各ウェ ルは前記のように洗浄した。ビオチン化ｈＣＴＬＡ４ＩｇＧ１（ｒｅｆ、ＭＦＧ Ｒ、１μｇ／ｍＬ、順次２倍希釈、１５．６ｎｇ／ｍＬまで、５０μＬ）を各ウ ェルに添加し、室温で２．５時間インキュベーションした。各ウェルは前記の通 り洗浄した。結合したビオチン化ＣＴＬＡ４Ｉｇはストレプトアビジン−ＨＲＰ （Ｐｉｅｒｃｅ・Ｃｈｅｍiｃａｌ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）１：２０００ 希釈液５０１／１を室温で３０分間加えて検出した。ウェルを前記の通りに洗浄 し、ＡＢＴＳ（Ｚｙｍｅｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）５０μＬを添加し、３０分 後に４０５ｎｍで青色の呈色を観測した。典型的な結合検定結果のグラフを図１ ６に示す。種々の量の競合蛋白質と非飽和性が証明されたビオチン化ＣＴＬＡ４ ＩｇＧ１一定量（すなわち、７０ｎｇ／ｍＬ、１．５ｎＭ）とを混合し、前記の 通り結合検定を行い、種々の型のＣＴＬＡ４がビオチン化ＣＴＬＡ４ＩｇＧ１と 競合する性能を評価した（図１５）。ビオチン化ＣＴＬＡ４ＩｇＧ１に予期され るシグナル（４０５ｎｍ吸光）の低下はｈＢ７−１への結合での競合を示す。 ＣＴＬＡ４がＢ７−１に親和性の高い受容体であるとの前記証拠を考慮して、 ＣＴＬＡ４とＣＤ２８とのＢ７−１およびＢ７−２への結合力を比較した。Ｂ７ −１−ＩｇまたはＢ７−２−Ｉｇをビオチンで標識し、種々の濃度の非標識Ｂ７ −１−ＩｇまたはＢ７−２−Ｉｇの存在または不在下に固定化ＣＴＬＡ４−Ｉｇ に結合させた。実験は125Ｉ−標識Ｂ７−１−ＩｇまたはＢ７−２−Ｉｇでも反 復した。この固相結合検定法を使用して、Ｂ７−２のＣＴＬＡ４に対する結合力 （２．７ｎＭ）はＢ７−１で観測されたもの（４．６ｎＭ）より約２倍大きいと 測定された。実験的に決定したＩＣ50値は図の上右隅に示した。ＣＤ２８に対す るＢ７−１およびＢ７−２の双方の親和性は低くて信頼性よく結論を出すことは 困難であった。実施例８ ヒトＢ７−２に対するモノクローナル抗体の製造と特性 Ａ．免疫および細胞融合 Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ研究所、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｎ Ｙから入手）を１匹当り完全フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に乳濁化したヒトＢ７．２−Ｉｇ５０μ ｇまたはＣＨＯ−ヒトＢ７．２細胞１０6個を腹腔内投与して免疫した。マウス を不完全フロインドアジュバント（Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ＳｔＬｏ ｕｉｓ、ＭＯ）中に乳濁化したヒトＢ７．２−Ｉｇ１０〜２５μｇで２回または ＣＨＯ−ヒトＢ７．２細胞で初めの免疫に続いて次の２ケ月間１４日の間隔で追 加免疫した。マウスの眼窩後部から採血し、血清をヒトＢ７．２−Ｉｇに対する ＥＬＩＳＡによりこの免疫原に反応する抗体の存否について検定した。ｈＣＴＬ Ａ４−Ｉｇに対するＥＬＩＳＡも行ってＩｇテイル指向性抗体反応に対する対照 とした。強い血清反応を示したマウスに尾部静脈からヒトｈＢ７．２−Ｉｇ２５ μｇを燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ・Ｉｓ ｌａｎｄ、ＮＹ）に希釈して静脈内追加免疫を行った。この追加免疫後３日から ４日後にマウス脾臓に免疫グロブリンの重鎖も軽鎖も分泌できない（Ｋｅａｒｎ ｅｙなど（１９７９年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２３巻：１５４８頁）ＳＰ ２／０骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ・Ｔｙｐｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ・Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、Ｎｏ．ＣＲＬ８００６）を５：１で注 入した。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎが開発した方法（Ｎａｔｕｒｅ（ １ ９７５年）、２５６巻：４９５頁）に基づく標準法を用いた。Ｂ．抗体スクリーニング １０日〜２１日後、注入液からのハイブリドマコロニーを含むウェルの上清液 をヒトＢ７．２に対して反応性のある抗体の存在を次の通りにスクリーニングし た：平底９６穴板（Ｃｏｓｔａｒ社、カタログ番号３５９０）の各ウェルをヒト Ｂ７．２−Ｉｇ１μｇ／ｍＬ溶液５０μＬでコートするか、リジン被覆板に４℃ で燐酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２中、３Ｔ３−ｈＢ７．２細胞５×１０4個でコー トした。ヒトＢ７．２−Ｉｇ溶液を吸引し去るか、細胞をグルタルアルデヒドで 板に結合し、各ウェルをＰＢＳで３回洗い、次に１％ＢＳＡ（ＰＢＳ）溶液（１ ００μＬ／穴）で１時間室温でブロックした。このブロッキング用インキュベー ション後、ウェルをＰＢＳで３回洗い、ハイブリドーマ上清液を穴当り５０μＬ 加え、室温で１．５時間インキュベーションした。このインキュベーション後、 ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、次に室温でホースラディッシュペルオキシダーゼ −結合、親和性精製、ヤギ抗−マウスＩｇＧまたはＩｇＭ重鎖および軽鎖−特異 性抗体（ＨＲＰ、Ｚｙｍｅｄ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ・Ｆｒａｎｃ ｉｓｃｏ、ＣＡ）の１：４０００希釈液ウェル当り５０ｐＬと共に１．５時間イ ンキュベーションした。穴を次にＰＢＳで３回洗浄し、続いて結合した抗体を検 出するＨＲＰへの基質として３０％過酸化水素１：１０００希釈を加えた１ｍＭ −２，２−アジノビス−３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴ Ｓ）の０．１Ｍ−クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．２溶液ウェル当り５０μＬ中で ３０分間インキュベーションした。続いて自動読取分光光度計（Ｄｙｎａｔｅｃ ｈ、ＶＡ）によりＯＤ410で吸光度を測定した。 ハイブリドマ３種、ＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１が ヒトＢ７．２−Ｉｇに対する抗体を生産することを確認した。ＨＡ３．１Ｆ９は ＩｇＧ１イソタイプ、ＨＡ５．２Ｂ７はＩｇＧ２ｂイソタイプおよびＨＦ２．３ Ｄ１はＩｇＧ２ａイソタイプであると判定した。これらハイブリドマはさらに２ 回サブクローニングしてモノクローナルであることを確認した。各ハイブリドマ 細胞はブタペスト条約の規定に適合するアメリカンタイプカルチャーコレクショ ンにＡＴＣＣ受託番号−−−（ハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９）、ＡＴＣＣ受理番 号−−−（ハイブリドマＨＡ５．２Ｂ７）およびＡＴＣＣ受託番号−−−（ハイ ブリドマＨＦ２．３Ｄ１）として１９９４年７月１９日に寄託した。Ｃ．競合的ＥＬＩＳＡ ハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１からの上 清液をさらに競合的ＥＬＩＳＡで解析し、固定化ｈＢ７−２免疫グロブリン融合 蛋白質へのビオチン化ｈＣＴＬＡ４Ｉｇの結合を阻止するモノクローナル抗体の 性能を検討した。ｈＣＴＬＡ４Ｉｇのビオチン化はＰｉｅｒｃｅ社のＩｍｍｕｎ ｏｐｕｒｅ・ＮＨＳ−ＬＣ・Ｂｉｏｔｉｎ（カタログ番号２１３３５）を用いて 行った。使用したＢ７−２免疫グロブリン融合蛋白質はｈＢ７．２−Ｉｇ（完全 長ｈＢ７−２）、ｈＢ７．２−ＶＩｇ（可変ドメインのみのｈＢ７−２）および ｈＢ７．２−ＣＩｇ（定常ドメインのみのｈＢ７−２）であった。ｈＢ７．１− Ｉｇ融合蛋白質を対照として用いた。ＥＬＩＳＡ用には、９６ウェル板をＩｇ融 合蛋白質（２０μｇ／ｍＬ溶液を５０μＬ／穴）で一夜室温でコートした。ウェ ルをＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％ウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液で１時間室温でブロックし、さらにＰＢＳで３ 回洗浄した。各穴にＢｉｏ−ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇ（７０ｎｇ／ｍＬ）５０μＬと 競合モノクローナル抗体上清液５０μＬとを添加した。対照抗体は抗−Ｂ７．１ ｍＡｂ（ＥＷ３．５Ｄ１２）および抗−ｈＢ７−２ｍＡｂＢ７０（ＩｇＧ２ｂκ 、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）であった。各ウェルを再び洗い、ストレプト アビジン−結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ社から、カ タログ番号２１１２６、１：２０００希釈、５０μＬ／穴）を添加し、室温で３ ０分間インキュベーションした。再びウェルを洗浄し、続いてＨＲＰの基質とし て抗体を検出するために３０％過酸化水素を１：１０００希釈で添加したＡＢＴ Ｓの０．１Ｍ−クエン酸ナトリウム、ｐＨ４．２溶液ウェル当り５０μＬ中で３ ０分間インキュベーションした。続いて、自動読取分光光度計（Ｄｙｎａｔｅｃ ｈ、ＶＡ）によりＯＤ410で吸光度を測定した。下記表ＩＶに示す結果はハイブ リドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１から生産される各 ｍＡｂはｈＣＬＴＡ４Ｉｇの完全長ｈＢ７．２−ＩｇまたはｈＢ７．２−ＶＩｇ への結合を競合的に阻止できることを証明する（ｈＣＬＴＡ４ＩｇはｈＢ７．２ −ＣＩｇには結合しない）。 Ｄ．フローサイトメトリー ハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２．３Ｄ１からの上 清液をフローサイトメトリーによっても解析した。クローンから集めた上清液を ｈＢ７．２を発現するようにトランスフェクトしたＣＨＯおよび３Ｔ３細胞（Ｃ ＨＯ−ｈＢ７．２および３Ｔ３−ｈＢ７．２）上または対照をトランスフェクト ３Ｔ３細胞（３Ｔ３−Ｎｅｏ）上でフローサイトメトリーによりスクリーニング した。フローサイトメトリーは次の通りに行った：細胞１×１０6個を１％ＢＳ ＡのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、次に細胞を１×１０6細胞当りハイブリドマ上清 液または培養液５０μＬ中で４℃で３０分間インキュベーションした。インキュ ベーション後、細胞を１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、次にフルオレッセ イン結合ヤギ抗−マウスＩｇＧまたはＩｇＭ抗体（Ｚｙｍｅｄ・Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ・Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）１：５０希釈液を１×１０6 細胞当り５０μＬを用いて４℃で３０分間インキュベーションした。次に細胞を １％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド溶液で固定化 した。細胞標本を次にＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ・Ｄ ｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ・Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。図１７、１８および １９に示す結果はハイブリドマＨＡ３．１Ｆ９、ＨＡ５．２Ｂ７およびＨＦ２． ３Ｄ１により生産されるモノクローナル抗体は各々細胞表面上のｈＢ７−２に結 合することを証明している。Ｅ．抗−ｈＢ７−２ｍＡｂによるヒトＴ細胞増殖の阻止 抗−ヒトＢ７−２ｍＡｂを含むハイブリドマ上清液がヒトＴ細胞のｈＢ７−２ 共刺激を阻止する性能について検討した。この検定では、精製ＣＤ２８+ヒトＴ 細胞を準***促進量のＰＭＡ（１ｎｇ／ｍＬ）で処理して一次シグナルを得、表 面にｈＢ７−２を発現するＣＨＯ細胞で共剌激シグナルを得た。Ｔ細胞の増殖は 培養液中３日後に3Ｈ−チミジンを添加して残りの１８時間の間に測定した。表 Ｖに示すように3Ｈ−チミジン（５１０ｐｍ）取込法による測定では休止Ｔ細胞 は増殖を示さなかった。ＰＭＡによるシグナル１の放出ではいくらかの増殖（３ ８００ｐｍ）が見られ、一次（ＰＭＡ）および共刺激（ＣＯＳ／ｈＢ７−２）シ グナルの両方を受けたＴ細胞では最高に増殖（９０２０ｃｐｍ）した。検査した 抗−ｈＢ７−２ｍＡｂ３個全ては共刺激シグナルが誘導した増殖をＰＭＡ単独処 理細胞で見られる増殖にまで低減し、これらｍＡｂがＢ７／ＣＤ２８共剌激経路 を遮断することによってＴ細胞増殖を阻止することを示した。 実施例９ Ｂ７−２を発現するようにトランスフェクトした移植腫瘍細胞の退縮 この実施例ではトランスフェクトしていないか、Ｂ７−２をトランスフェクト したＪ５５８形質細胞腫細胞を腫瘍退縮研究に用いて動物に移植した時、この腫 瘍細胞表面に発現するＢ７−２の腫瘍細胞成長に対する効果を検討した。 Ｊ５５８形質細胞腫細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃ ｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手、＃ＴＩＢ６）にマウスＢ７−２（ｐＡＷＮＥ０３ ）またはＢ７−１（ｐＮＲＤＳＨまたはｐＡＷＮＥ０３）およびネオマイシン耐 性遺伝子をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトした。ネ オマイシン耐性を基準にして安定なトランスフェクト体を選択し、腫瘍細胞上の Ｂ７−２またはＢ７−１の細胞表面発現を抗−Ｂ７−２または抗−Ｂ７−１抗体 を用いるＦＡＣＳ分析により確認した。 同遺伝子型Ｂａｌｂ／ｃマウスを１群５〜１０匹として腫瘍細胞上のＢ７−２ 細胞表面発現が移植腫瘍細胞の退縮をもたらすかどうかを判定できるように設計 した実験に用いた。未トランスフェクトおよびトランスフェクトＪ５５８細胞を 試験管内で培養し、採取し、Ｈａｎｋの緩衝塩溶液（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ・ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ・Ｙｏｒｋ）で洗浄後、１０8細胞／ｍＬの濃度で再懸濁 した。各マウスの右側腹部の皮膚の一部を脱毛薬で脱毛し、２４時間後にマウス １匹当り腫瘍細胞５×１０6個を皮内または皮下に移植した。２日または３日毎 にカリパスと定規を用いて腫瘍容積を（３垂直方向の直線的測定で）計測した。 典型的実験を１８〜２１日継続したが、終了時には、未トランスフェクト対照Ｊ ５５８細胞を移植したマウスでは腫瘍サイズはマウス体容積の１０％を超えてい た。図２０に示す通り、マウスは表面にＢ７−２を発現するようにトランスフェ クトしたＪ５５８細胞を排除した。３週間後にさえ、腫瘍生育は観察されなかっ た。同様な結果は表面にＢ７−１を発現するようにトランスフェクトしたＪ５５ ８細胞でも観察された。対照的に、未トランスフェクト（野生型）Ｊ５５８細胞 では１２日目には動物に治療不能な大きな腫瘍を造った。この実施例は腫瘍細胞 へのＢ７−２ｃＤＮＡのトランスフェクションによるような腫瘍細胞のＢ７−２ 細胞表面発現が感受性動物に腫瘍細胞拒絶を起こすに十分な抗腫瘍反応を誘導す ることを証明するものである。均等 当業者は通例的実験以上を用いずとも、ここに記載した本発明の特定的態様に 多数の均等体を認識するか、または確信できるものである。このような均等範囲 は本請求項に包含されるべきであると意図されている。 Detailed Description of the Invention             B7-2: CTLA4 / CD28 counter receptor                                  Government funding   The research described herein is based on the National Institute of Health. Supported under CA-40216-08, which is more provided. Therefore, the US government You may have certain rights in the invention.                                 Background of the Invention   To induce antigen-specific T cell activation and clonal expansion Have two signals provided by antigen presenting cells (APCs) in resting T lymphocytes. Must be transmitted to the surface of (Jenkins, M. and Schwartz, R. (198 7),J. Exp. Med.,165, 302-319; Mueller, DL. Etc. (19 90)J. Immunol.,1443701-3709; Williams, IR. And And Unanue, ER. (1990)J. Immunol.,145, 85-93). Immunity The first signal that gives specificity to the response is the major histocompatibility complex (MHC) After recognition of the foreign antigenic peptide shown in 1., T cell receptor (TCR) Mediated. The second signal, called costimulation, causes T cells to proliferate and become functional (Schwartz, RH, (1990)Science,248, 1349- 1356). Co-stimulation is neither antigen-specific nor MHC-restricted, expressed by APC Provided by one or more additional cell surface molecules (Jenkins, M. K. et al. (19) 88),J. Immunol.,1403324-3330; Linsley, PS et al. (1) 991),J. Exp. Med.,173, 721-730; Gimmi, CD. Etc. (1 991),Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88, 6575-6579; Y oung, J.W. Etc. (1992),J. Clin. Invest.,90229-237; Koulova, L .; Etc. (1991),J. Exp. Med.,173, 759-762; R eiser, H.M. Etc. (1992),Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89, 271 ~ 275; van-Seventer, GA. Etc. (1990),J. Immunol.,144Four 579-4586; LaSalle, JM et al. (1991),J. Immunol.,147 , 774-80; Dustin, MI, et al. (1989),J. Exp. Med.,169, 503; Armitage, R.J. et al. (1992),Nature,357, 80-82; Liu , Y. Etc. (1992),J. Exp. Med.,175437-445).   The B7 protein expressed on APC is one such important co-stimulatory molecule. Considerable evidence suggests that (Linsley, PS et al. (1991),J. E xp. Med. ,173, 721-730; Gimmi, CD. Etc. (1991),Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,886575-6579; Koulova, L .; etc( 1991),J. Exp. Med.,173759-762; Reiser, H .; Etc. (1 992),Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 271-275; Linsl ey, PS Etc. (1990),Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 503 1-5035; Freeman, GJ. Etc. (1991),J. Exp. Med.,174, 6 25-631). B7 is a ligand for two ligands expressed on T lymphocytes. Unter receptor. The first ligand, named CD28, is a quiescent T cell. It is constitutively expressed on cells and increases after activation. Sends signals via T cell receptors Ligation of CD28 caused the T cells to proliferate and secrete IL-2. Induce (Linsley, PS et al. (1991),J. Exp. Med.,173, 721 ~ 730; Gimmi, CD. Etc. (1991),Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,886575-6579; Thompson, CB. Etc. (1989),Proc. Natl . Acad. Sci. USA ,86, 1333-1337; June, CH. Etc. (199 0),Immunol. Today,11, 211-6; Harding, FA. Etc. (1992),Nature ,356, 607-609). A second ligand named CTLA4 Is homologous to CD28, but is not expressed on resting T cells, and after T cell activation Occurs (Brunet, JF et al. (1987) Nature 328, 267-270). Hi And DNA sequences encoding the mouse and CTLA4 proteins are described by Dariavich et al. (1988),Eur. J. Immunol.,18(12), 1901-1905; Brune t, J.F. Et al. (1987), supra; Brunet, JF. Etc. (1988),Immunol. R ev. ,10321-36; and Freeman, GJ. Etc. (1992),J. Immun ol. ,1493795-3801. B7 is for CD28 Have a greater affinity for CTLA4 (Linsley, PS et al. 1991),J. Exp. Med.,174, 561-569), the function of CTLA4 It is still unknown.   B7: CD28 / CTLA4 costimulatory pathway is important in vitro and in several Of the in vivo model system. Blocking this co-stimulatory pathway would result in mouse and human Results in the development of antigen-specific tolerance (Harding, FA et al. (1992) ,Nature,356607-609; Lenschow, D.J. Etc. (1992),Scie nce ,257, 789-792; Turka, LA. Etc. (1992),Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,8911102-11105; Gimmi, CD. Etc. (1 993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 6586-6590; B oussiotis, V. Etc. (1993),J. Exp. Med.,178, 1753-176 3). Conversely, expression of B7 by B7-negative mouse tumor cells leads to tumor rejection. Induces long lasting protection against associated T cell-mediated specific immunity and tumor challenge (Chen, L. et al. (1992),Cell,71, 1093 to 1102; Townsend, S .; E. FIG. And Allison, JP. (1993),Scienco,259368-370 Baskar, S .; Etc. (1993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90, 5 687-5690). Therefore, if the B7: CD28 / CTLA4 route is manipulated, It offers great potential to stimulate or suppress the immune response in mice.                                 Summary of the invention   The present invention provides isolated nucleic acids encoding novel molecules that co-stimulate T cell activation. Related. Preferred co-stimulatory molecules include B lymphocytes, specialized antigen presenting cells (eg Spheres, dendritic cells, Langerhans cells), and immune cells to present the antigen, A4, CD28, both CTLA4 and CD28, or other known or Other cells that bind to receptors on undefined immune cells, such as keratin Surface, endothelial cells, astrocytes, fibroblasts, oligodendrocytes) including. Such co-stimulatory molecules are referred to herein as CTLA4 / CD28 binding proteins. Unter receptor or B lymphocyte antigen, co-stimulates activated T cells To induce T cell proliferation and / or cytokine secretion be able to. Preferred B lymphocyte antigens include B7-2 and B7-3, and Binds CTLA4 and / or CD28, inhibits co-stimulation of immune cells, and Include soluble fragments or derivatives thereof that have the ability to induce. State In a similar manner, an isolation encoding a peptide having the activity of the human B7-2B lymphocyte antigen Provided nucleic acid. Preferably the nucleic acid is shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 1). Human A cDNA molecule having a nucleotide sequence encoding B7-2. Other aspects Then, the nucleic acid corresponds to the murine B7-2 shown in FIG. 14 (SEQ ID NO: 22). A cDNA molecule having a nucleotide sequence to be encoded.   The present invention has B7-2 activity and has the amino acid sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2), With at least about 50% of the amino acid sequence shown in Figure 14 (SEQ ID NO: 23), more preferably Or at least about 60%, and most preferably at least 70% homology. It relates to a nucleic acid coding for tide. It has B7-2 activity and is shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2). At least about the amino acid sequence or the amino acid sequence shown in FIG. 14 (SEQ ID NO: 23). 80%, more preferably at least about 90%, more preferably at least about 95 %, Most preferably at least about 98% or at least about 99% homology. Nucleic acids encoding the peptides are also within the scope of the invention. In another aspect, B7-2 The active peptide is a peptide having the amino acid sequence of FIG. 8 (SEQ ID NO: 2), Alternatively, in the nucleic acid encoding the peptide having the amino acid of FIG. 14 (SEQ ID NO: 23), Encoded by nucleic acids that hybridize under high or low stringency conditions It is.   The invention further has B7-2 activity and a length of at least 20 amino acid residues. To an isolated nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding the peptide. B7-2 live Having a length of at least 40 amino acid residues and at least 60 amino acid residues A group, at least 80 amino acid residues, at least 100 amino acid residues, or Peptides consisting of at least 200 amino acid residues are also within the scope of the present invention. . Particularly preferred nucleic acids have B7-2 activity and have at least 20 amino acid residues or Is at least 50% of the above length and the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2) or Encode peptides with the above homology (preferably at least 70%).   In one preferred embodiment, the invention has B7-2 activity and has the formula:           Xn-Y-Zm Isolated DN encoding a peptide having an amino acid sequence represented by Regarding A.   In the formula, Y is essentially composed of amino acid residues 24-245 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). Be correct. Xn and Zm are represented by Y in the amino acid sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). It is an amino acid residue selected from adjacent amino acid residues. Xn is shown in Fig. 8 (sequence number No. 2) selected from the amino acids adjacent to the amino terminus of Y, That is, it is an amino acid residue selected from amino acid residues 23-1. Zm is a figure From the amino acid adjacent to the carboxy terminus of Y in the sequence shown in 8 (SEQ ID NO: 2) Amino acid residues selected, ie selected from amino acid residues 246-329 Group. In the formula, n is a number from 0 to 23 (n = 0 to 23) and m is a number from 0 to 84. (M = 0 to 84). A particularly preferred DNA has the sequence Y shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). In the formula Xn-Y-Zm, where the amino acid residues 24-245 of the string are n = 0, m = 0. Encodes a peptide having the amino acid sequence represented by   The present invention provides a nucleotide sequence encoding a first peptide having B7-2 activity. Rows and parts that alter the solubility, binding affinity, stability, valency of the first peptide A B7-2 fusion containing a nucleotide sequence encoding a second peptide corresponding to It also relates to an isolated DNA encoding a combined protein. Preferably B7-2 The first active peptide is the extracellular domain portion of the B7-2 protein (eg, 8 (SEQ ID NO: 2), which includes amino acid residues of about 24-245). Ptides are immunoglobulin constant regions, such as hinge, CH2 and CH3 regions. Is a human Cγ1 or Cγ4 domain containing the B7-2 immunoglobulin fusion domain. Form a combined protein (B7-2Ig) (Capon et al. (1989),Nature,337 , 525-531, and Capon, US Pat. No. 5,116,964).   The nucleic acid obtained by the present invention can be inserted into various expression vectors to Eukaryotic cells such as mammalian and insect cell cultures, and E. Prokaryotes such as Coli Synthesizes the corresponding protein or peptide in the cell. Within the scope of the present invention The expression vector contains a small amount of the activity of the novel B lymphocyte antigens described herein. Nucleic acid encoding at least one peptide, and operably linked to the nucleic acid sequence Included promoter. In one aspect, the expression vector comprises the activity of the B7-2 antigen. Encoding a peptide having a, and a previously characterized B 7 has the activity of other B lymphocyte antigens such as the 7 activation antigen (referred to herein as B7-1) DNA which encodes a peptide. Such expression vectors may be used in host cells. Transfects, thereby encoded by the nucleic acids described herein Can be used to produce proteins or peptides, including fusion proteins Wear.   Lives for the presence of B cells expressing the B lymphocyte antigens B7-2 and B7-3 Nucleic acid probes useful for analyzing physical samples are also within the scope of the present invention.   The invention further provides novel B-receptors, including B7-2 and B7-3 protein antigens. It relates to an isolated peptide having the activity of a human antigen. Good with B7-2 activity The preferred peptide is produced by recombinant expression and has the amino acid sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2). Contains an array. Another preferred peptide having B7-2 activity is shown in FIG. It includes the amino acid sequence shown in 3). Particularly preferred pep having activity of B7-2 antigen Tide is a microbe that can be used to enhance or suppress a T cell-mediated immune response in a patient. A mature form of the extracellular domain portion (eg, amino acid residues of about 24-245 of SEQ ID NO: 2) At least a portion of the protein of Other preferred peptides having B7-2 activity Peptides include peptides having an amino acid sequence represented by the formula:               Xn-Y-Zm In the formula, Y represents amino acid residues 55 to 68 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2), and FIG. Amino acid residues 81 to 89 of the sequence shown in column No. 2), the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID No. 2) Amino acid residues 128 to 142 of amino acid 1 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2) 60-169, amino acid residues 188-200 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2), FIG. 8 (SEQ ID NO: 2) selected from the group consisting of amino acid residues 269 to 282. It is a mino acid residue. In the formula, Xn and Zm are additions linked to Y by an amide bond. 8 is a common amino acid residue and is adjacent to Y in the amino acid sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). Selected from contiguous amino acid residues. Xn has the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). Is an amino acid residue selected from the amino acids adjacent to the amino terminus of Y. Zm Is the amino acid adjacent to the carboxy terminus of Y in the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). Is an amino acid residue selected from. In the formula, n is a number from 0 to 30 (n = 0 to 3) 0) and m are numbers from 0 to 30 (m = 0 to 30).   Peptides having the activity of novel B lymphocyte antigens (eg B7-2, B7-3) It also relates to fusion proteins or hybrid fusion proteins that comprise. For example, Immunity to change the solubility, binding affinity, stability and / or valency of one peptide A novel B lymphocyte antigen domain fused to a second peptide such as an epiglobulin constant region. A fusion protein is provided that includes a first peptide that includes an extracellular domain portion. One aspect In the Cγ1 or Cγ4 hinge, CH2 and CH3 regions. Extracellular of B7-2 protein bound to a second peptide containing a string of amino acid residues A fusion protein comprising a first peptide containing an amino acid residue of a domain part Made to form the B7-2Ig fusion protein. In another aspect, B7-1 A first comprising the extracellular domain portion of the antigen and the extracellular domain portion of the B7-2 antigen Peptides and amino acid residues corresponding to Cγ1 hinge, CH2 and CH3 Making a hybrid fusion protein containing a second peptide containing (eg Linsley Etc. (1991),J. Exp. Med.,1783, 721-730; Capon et al. (19 89),Nature,337, 525-531; and Capon US Pat. No. 5,116, 964).   The isolated peptides and fusion proteins of the invention contain one or more B lymphocyte anti-antibodies. Upregulate or inhibit the expression of the original, or one or more B lymphocyte antigens Ligation to their natural ligands on immune cells such as To enhance or suppress a cell-mediated immune response in vivo. Therefore, it can be administered to patients.   Another aspect of the invention is a peptide of the novel B lymphocyte antigen or described herein. Antibody that specifically reacts with the fusion protein, preferably a monoclonal antibody. Offer. Preferred antibodies are hybridoma cells HF2.3D1, HA5.2B7. And anti-human B7-2 monoclonal antibody produced by HA3.1F9. . These hybridoma cells have the ATCC deposit number (HF 2.3D1 ), ATCC deposit number (HA5.2B7), and ATCC deposit number (HA3.1F9) American Type Culture Collection Has been deposited with.   A further subject matter of the invention is the use of the nucleic acids according to the invention, in particular cDNA, in mammalian cells. Including increasing the immunogenicity of the vesicle. In a preferred embodiment the mammalian cell is a sarcoma, Tumor cells such as lymphoma, melanoma, neuroblastoma, leukemia, carcinoma, or Antigen-presenting cells such as macrophages and transfection of these cells And express the peptide having the novel B lymphocyte antigen activity of the present invention on the cell surface. Let it. Ma expressing a peptide having B lymphocyte antigen activity such as B7-2 antigen Clophages were pulsed with the appropriate pathogen-associated or tumor antigen In some cases, it can be used as an antigen-presenting cell that enhances T cell activation and immune stimulation. it can.   Mammalian cells are treated with a peptide having the activity of a novel B lymphocyte antigen such as B7-2 antigen. Transfection in vivo with an appropriate expression vector containing the nucleic acid encoding the tide. Can be introduced into the host mammal, or cells can be transfected with gene therapy techniques. The gene can be transfected in vivo by surgery. For example, B7-2 Nucleic acids encoding active peptides alone or with other costimulatory molecules It can be transfected in combination with the nucleic acid to be encoded. Class I or class In the case of enhancing the immunogenicity of a tumor that does not express a SII MHC molecule, the present specification A nucleic acid encoding a peptide having the B lymphocyte antigen activity described in 1. Appropriate class I or II gene is added to mammalian cells to be It may be beneficial to transfect.   The present invention provides, for example, novel B lymphocyte antigens of the present invention, such as B7-2 and B7. -3 block functional interactions with their natural ligands on T cells , Thereby blocking co-stimulation via the receptor-ligand pair Also offers methods to induce general immunosuppression and antigen-specific tolerance in patients Offer. In one aspect, the natural human B7-2 antigen, its natural ligand ( Used to block interactions with eg CTLA4 and CD28) Capable inhibitory molecules have B7-2 binding activity but stimulate immune cells Block the binding of B7-2 to its ligand, a soluble peptide that does not have the ability to Antibodies that cannot transmit costimulatory signals (blocking anti-B7-2 antibodies, etc. "Blocking antibody"), a B7-2-Ig fusion protein prepared according to the teachings of the present invention. Protein and soluble forms of B7-2 such as CTLA4Ig or CD28Ig Including Putter. Such blocking agents may be used alone or with other co-stimulatory molecules. For use in combination with agents that block their natural ligands (eg anti-B7 antibodies) Can be. Inhibition of T cell responses and T cells by the methods described herein Induction of cell tolerance is associated with transplant rejection (solid organs, skin and bone marrow) and graft-versus-host disease. Can be prophylactically useful in the prevention of, especially in allogeneic bone marrow transplants. The method of the invention Are autoimmune diseases, allergies and allergic reactions, transplant rejection, and graft pairing It may also be therapeutically useful in treating host diseases.   Another aspect of the invention is a peptide having B7-2 activity and a B7-2 fusion protein. Stimulatory forms of B7-, including soluble, polyvalent forms of B7-2 protein, such as proteins Immune response is transmitted by the transmission of costimulatory signals to T cells by using two antigens. A method of adjusting upwards. Delivery of stimulatory forms of B7-2 along with antigen is associated with various diseases. Useful prophylactically to increase the effectiveness of vaccination against the drug substance and Immune responses against various pathogens or in tumor-bearing hosts It may also be therapeutically useful in regulating blood pressure.   The present invention relates to B lymphocyte antigens, such as their receptors for B7-2, B7-3. Intracellular signal transduction through their receptors or by their interaction with It also relates to a method of identifying molecules that can interfere with access. B lymphocytes on cells Also provided are methods of identifying molecules that can regulate the expression of the antigen. More novel B lymph A method for identifying a cytokine produced in response to co-stimulation of T cells by a sphere antigen is also provided. It is the scope of the present invention.                             Brief description of the drawings   1A-B show media, anti-CD3 alone, or the following monoclonal antibody or Is a recombinant protein, αB7 (133, anti-B7-1); CTLA4Ig; FabαCD 28; Control Ig fusion protein (isotype codon for CTLA4Ig Control); or αB5 (anti-B5, anti-B7-1 isotype control Of B7 (B7-1) cultured in anti-CD-3 in the presence of CHO cells (panel a), or syngeneic activated B-lymph Against the co-stimulation provided by the sphere (panel b),ThreeH-thymidine introduction or IL- CD28, assessed by 2 secretion+3 is a graphical representation of T cell response.   2A-C B on splenic B cells activated with surface immunoglobulin (sIg) cross-links. It is a graph of the log fluorescence intensity of the cell surface expression of 7-1. All (panel a), B7-1 Positive (B7-1+, Panel b) and B7-1 negative (B7-1-, panel c) activation. B cells were treated with anti-B7-1 monoclonal antibody (133) and fluorescein isothiocyanate. Stain with goat anti-mouse immunoglobulin labeled with ocyanate (FITC) and flow It was analyzed by cytometry.   3A-B show media, anti-CD3 alone, or the following monoclonal antibody or Is a recombinant protein, αBB-1 (133, anti-B7-1 and anti-B7-3); αB 7 (anti-B7-1); CTLA4Ig; FabαCD28; control Ig fusion protein Quality or cultured in anti-CD3 in the presence of αB5 (anti-B5), B7-1+(panel a) or B7-1-(Panel b) Co-stimulation provided by activated syngeneic B lymphocytes ForThreeCD28 as assessed by H-thymidine transduction and IL-2 secretion+ 3 is a graphical representation of T cell response.   FIG. 4 shows sorted B7-1.+And B7-1-B7-1 on activated B lymphocytes Graph of cell surface expression of B7-3, B7-3 and total CTLA4 counter-receptors It is shown.   Figure 5 shows B7-1 (CTLA4Ig on splenic B cells activated by sIg cross-linking. And mAbsBB-1 and 133), B7-3 (CTLA4Ig and mAbBB1) ) And B7-2 (CTLA4Ig) counter-receptor temporal surface expression. This is a rough display.   FIG. 6 shows B7-1 (C) on splenic B cells activated by MHC class II cross-linking. TLA4Ig and mAbs BB-1 and 133), B7-3 (CTLA4Ig and And mAbBB1), and B72 (CTLA4Ig) counterreceptors temporally It is a graphic representation of surface expression.   7A-B show media, anti-CD3 alone, or the following monoclonal antibody or Recombinant protein, αB7 (133, anti-B7-1); αBB1 (anti-B7-1, anti-B7 -3); CTLA4Ig; Fab αCD28; and anti-C in the presence of αB5 (anti-B5) 24 h (panel a) or 48 h (panel b) sIg cross-linking, cultured in D3 Against the stimulation provided by syngeneic B lymphocytes activated byThreeH-H CD28 as assessed by mitin incorporation and IL-2 secretion+Response of T cells This is a rough display.   Figure 8 shows the nucleotide sequence of human B lymphocyte antigen B7-2 and the predicted amino acid sequence. Noh acid sequence (hB7-2-clone 29).   Figure 9 shows control mAb (IgM), anti-B7-1 (mAbs 133 and BB-1). , Recombinant protein CTLA4Ig, or isotype-matched controls Staining with a suitable second FITC-labeled immunoglobulin following the Ig protein. And analyzed by flow cytometry, a control plasmid (pCDNAI, A plasmid expressing B7-1 (B7-1), or a plasmid expressing B7-2 (B7-2) is a graphic representation of COS cells transfected.   10A-B show unstimulated and anti-Ig activated human splenic B cells and cells. RNA blocks of B7-2 expression in the system (panel a) and human myeloma (panel B). G analysis is shown.   FIG. 11 is a vector directing expression of B7-1 or B7-2 alone or vector. Phorbol myristic acid (PMA) and COS Against submitogenic stimulation in cells,ThreeH-thymidine introduction Or CD28 assessed by IL-2 secretion+A graphical representation of T cell proliferation You.   FIG. 12 shows the vector alone (vector), or B7-1 (B7-1) or B7. -2 (B7-2) expressing COS cells transfected with a vector, and And PMA stimulation,ThreeEvaluated by H-thymidine introduction and IL-2 secretion It's worth, CD28+Inhibition of T cell proliferation by recombinant proteins and mAbs This is a rough display. Inhibition studies refer to PMA-stimulated COS cell mixed CD28+To T cells No antibody (no mAB), anti-B7 mAb 133 (133), anti-B7 mAb BB- 1 (BB1), anti-B5 mAb (B5), anti-CD28 Fab fragment (CD28 Fab) , CTLA4Ig (CTLA4Ig), or Ig control protein (control This is done by the addition of a sol. Ig).   FIG. 13 shows the deduced amino acid sequence of human B7-2 protein (hB7-2) (SEQ ID NO: 2). ) And human B7-1 protein (hB7-1) (SEQ ID NOs: 28 and 29) and Both amino acids of the urin B7-1 protein (mB7) (SEQ ID NOs: 30 and 31) Shows sequence homology between sequences.   Figure 14 shows the nucleotide sequence and deduced sequence of mouse B7-2 antigen (mB7-2). 2 is an amino acid sequence (SEQ ID NOS: 22 and 23).   FIG. 15 shows immobilized B7-2Ig by B7 family-Ig fusion protein. Figure 4 is a graphical representation of competitive inhibition of binding of biotinylated CTLA4Ig to. Competition The Ig fusion proteins examined as a compound were full-length B7-2 (hB7.2), full-length B7- 1 (hB7.1), variable region-like domain of B7-2 (hB7.2V), or B7-2 It is a constant region-like domain (hB7.2C).   16A-B show unlabeled B7-1-Ig (panel A) or B7-2-Ig. By increasing the concentration of (Panel B), the concentration of immobilized CTLA4-Ig against immobilized CTLA4-Ig was increased. Competition for binding of octynylated B7-1-Ig (panel A) or B7-2-Ig (panel B) 9 is a graphical representation of synthetic inhibition. IC determined experimentally50The value in the upper right corner of the panel Show.   Figure 17 shows cells stained with anti-hB7-2 monoclonal antibody, HA3.1F9. The flow cytometry profile is shown. Cells stained with antibody (3T3-hB 7.2) are CHO cells (C cells transfected to express human B7-2). HO-hB7.2), NIH transfected to express human B7-2 3T3 cells (3T3-hB7.2), and control transfected NIH3T3 cells (3T3-neo). Positive control for anti-hB7.2 antibody B70 Used as a roll.   Figure 18 shows cells stained with anti-hB7-2 monoclonal antibody, HA5.2B7. The flow cytometry profile is shown. The cells stained with the antibody are human B CHO cells transfected with 7-2 (CHO-hB7.2), NIH3T3 cells (3T3-hB transfected to express B7-2) 7.2), and control transfected NIH3T3 cells (3T3 -Neo). Anti-hB7.2 antibody B70 was used as a positive control.   Figure 19 shows cells stained with anti-hB7-2 monoclonal antibody, HF2.3D1. The flow cytometry profile is shown. Cells stained with the antibody are human B7 CHO cells (CHO-hB7.2) transfected to express C-2, human NIH3T3 cells transfected to express B7-2 (3T3-hB7 .2), and control transfected NIH3T3 cells (3T3- Neo). Anti-hB7.2 antibody B70 was used as a positive control.   FIG. 20 shows B7-1 (J558-B7.1) or B7-2 (J558-B7.2). Or J558 plasmacytoma cells transfected to express Growth of tumor cells (measured by tumor size) in mice after implantation of plasmacytoma cells This is a rough display.                             Detailed description of the invention   A previously characterized B lymphocyte activation antigen B7 (herein B7 -1), human B lymphocytes co-stimulate T cell activation. Express offspring. These costimulatory molecules are found in B lymphocytes, specialized antigen presenting cells ( An example Presenting antigens to monocytes, dendritic cells, Langerhans cells), and immune cells, CTLA4, CD28, both CTLA4 and CD28, or other known Other cells (e.g., horns) that bind to receptors on immune cells that are not yet defined. Cells, endothelial cells, astrocytes, fibroblasts, oligodendrocytes) including. Co-stimulatory molecules within the scope of the present invention are herein referred to as CTLA4 / CD28. It is called a ligand (counter receptor) or B lymphocyte antigen. Activated T Co-stimulate cells, whereby T cell proliferation and / or cytokines A novel B lymphocyte antigen that induces secretion is described and characterized herein. B7-2 (human and murine) and B7-3 antigens.   B lymphocyte antigen B7-2 is an anti-immunoglobulin or anti-MHC class II monoc Expressed by human B cells approximately 24 hours after stimulation with either lonal antibody. It is. The B7-2 antigen induces detectable IL-2 secretion and T cell proliferation. Live Approximately 48 to 72 hours after sexualization, human B cells also contained B7-1 and B7-1. A third CTLA4 clone identified by the monoclonal antibody BB-1 that binds. Expresses both the unter receptor and B7-3 (Yokochi, T. et al. (1982) ,J. Immunol.,128, 823-827). B7-3 antigen is B7-1 negative Cells also expressed on activated B cells of T cells without detectable IL-2 production Co-stimulate proliferation, which means that the B7-1 and B7-3 molecules are distinct Is shown. B7-3 is activated B cells, activated monocytes, dendritic cells, Lange It is expressed on a variety of cells including Luhans cells and keratinocytes. B cell activation After 72 hours, B7-1 and B7-3 expression begins to decline. Activation B The presence of these co-stimulatory molecules on the surface of the tissue implicates T cell costimulation after B cell activation. We show that they are partially regulated by the transient expression of these molecules.   Therefore, one of the gist of the present invention is B lymphocyte antigen, B7-2, such nucleic acid. Nucleotide encoding novel costimulatory molecules such as fragments of It relates to an isolated nucleic acid comprising a cleotide sequence. As used herein, "nucleic acid" The term is intended to include such fragments or equivalents. "Equivalent" The term refers to the activity of a novel B lymphocyte antigen (ie CTLA4 and TLA on T cells). And / or binds to the natural ligand of the B lymphocyte antigen on immune cells such as CD28 , Inhibits (eg blocks) or stimulates (eg enhances) immune cell costimulation Functionally equivalent B lymphocyte antigen or functionally equivalent pep It is intended to include the nucleotide sequence encoding Tide. Such nucleic acid is 8 and the human B7-2 nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) shown in FIG. Considered to be the equivalent of the B7-2 nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 (SEQ ID NO: 22). Within the range.   In one aspect, the nucleic acid comprises a peptide having B7-2 B lymphocyte antigen activity. It is the encoding cDNA. Preferably, the nucleic acid encodes human B7-2 shown in FIG. At least a part of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) Nucleotide sequence encoding murin B7-2 shown in No. 2) (SEQ ID NO: 22) Is a cDNA molecule consisting of at least a part of Figure 8 (SEQ ID NO: 1) or Figure 1 A preferred portion of the 4 (SEQ ID NO :) cDNA molecule comprises the coding region of the molecule.   In another embodiment, the nucleic acid of the invention has B7-2 activity and is shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2). Alternatively, it encodes a peptide containing the amino acid sequence shown in FIG. 14 (SEQ ID NO: 23). A preferred nucleic acid has B7-2 activity and has the amino acid sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2). At least about 50% homology, more preferably at least about 60% homology, And most preferably encodes a peptide having at least about 70% homology . It has B7-2 activity and is at least about 90% of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). More preferably at least about 95%, most preferably at least about 98-99%. Nucleic acids encoding peptides with homology are also within the scope of the invention. What is homology? Between two peptides having the activity of a novel B lymphocyte antigen such as B7-2, or 2 Sequence similarity between two nucleic acid molecules. Homology refers to the arrangement of each sequence in a row for comparison purposes. It can be determined by comparing the positions in the row. A position in the compared sequences is the same Same nucleotide bases or amino acids, if The molecules are homologous at that position. The degree of homology between sequences varies depending on the sequence. Is a function of the number of shared, matched, or homologous positions.   Another embodiment of the present invention is the amino acid sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2), or A peptide having a part or all of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 23) shown in FIG. High or low stringency for nucleic acids encoding peptides having A nucleic acid that hybridizes under the following conditions is provided. DNA hybridization Suitable stringency conditions to promote the reaction, eg 6.0 × sodium chloride at about 45 ° C. Thorium / sodium citrate (SSC) followed by 2.0 x SSS wash at 50 ° C Is known to those skilled in the art and may be found in Current Protocols in Molecnlar Biolog. y, John Wiley & Sons, New York (1989), 6.3.1-6.3.6 Can be found in. For example, the salt concentration in the washing process is about 2.0 × SSC (5 Low stringency (0 ° C) to high stringency of approximately 0.2 x SSC (50 ° C) You can select even the length. Furthermore, the temperature in the cleaning process is room temperature, which is as low as about 22 ℃. Select from stringency conditions to high stringency conditions of approximately 65 ° C. Can be   Encodes a peptide with a novel B lymphocyte antigen and degenerates in the genetic code Therefore, the nucleotide sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 1) or FIG. 14 (SEQ ID NO: 22) Isolated nucleic acids having sequences different from are also within the scope of the invention. Such nucleic acid Encodes a functionally equivalent peptide (eg, a peptide having B7-2 activity) However, due to the degeneracy of the genetic code, the sequence differs from that of FIG. 8 or 14. You. For example, many amino acids are designated by one or more triplets. Same net Codon for noic acid, or synonyms (eg CAU and CAC for histidine Synonyms for) occur because of degeneracy in the genetic code. As an example , A DNA sequence polymorphism within the nucleotide sequence of B7-2 (especially the third codon (Within codons) is a "sythesis" in the DNA sequence that does not affect the encoded amino acid. May cause "rent" mutations. However, the amino acids of the B7-2 antigen Expect DNA sequence polymorphisms that result in sequence changes to be present within the population Is done. One or more of nucleic acids encoding peptides having novel B lymphocyte antigen activity These mutations in the upper nucleotide (up to about 3-4% of the nucleotides) Those skilled in the art may exist between individuals within the population due to natural allelic variations. To Will be recognized. What, and all such nucleotide mutations The body and the resulting amino acid polymorphs are also within the scope of the invention. Further, this specification Of one or more of the novel B lymphocyte antigens described in Members of the cross-reacting family may also be present. Such an iso A type or family member functions on a B lymphocyte antigen (eg, B7-2 antigen). And related in amino acid sequence but encoded by genes in different locations Defined as protein.   A “fragment” of a nucleic acid encoding a novel B lymphocyte antigen is a B lymphocyte antigen. Has fewer nucleotides than the nucleotide sequence encoding the entire amino acid sequence of , B lymphocyte antigen activity (ie CTLA4 and / or CD on T cells) 28, etc., to bind to the natural ligands of B lymphocyte antigens on immune cells, such as Nucleotide sequence encoding a peptide with the ability to stimulate or inhibit Is defined. Therefore, peptides with B7-2 activity are expected to have CTLA4 and / or Or T cells that bind CD28 and receive, for example, a primary activation signal. T cells, as demonstrated by itocaine secretory production and / or T cell proliferation Stimulates or inhibits the mediated immune response. In one aspect, the nucleic acid fragment Retain the ability of the antigen to bind to CTLA4 and / or CD28 and interact with it. It encodes a peptide of the B7-2 antigen that carries an expulsive signal to T lymphocytes. Other states In a similar manner, the nucleic acid fragment is an extracellular portion of the human B7-2 antigen (eg, Figure 8 (sequence No. 2), which contains amino acid residues of about 24-245), and contains CTLA4 and CTLA4. And / or CD28, inhibits costimulation in the monovalent form, or co-stimulates in the polyvalent form. Encodes a peptide that can be used to induce or enhance stimulation.   Preferred nucleic acid fragments are at least 20 amino acid residues in length, preferably Or at least 40 amino acid residues, and more preferably at least 60 amino acid residues. It encodes a peptide consisting of mino acid residues. At least 80 amino acid residues in length Groups, at least 100 amino acid residues, and at least 200 or more A nucleic acid fragment encoding a peptide consisting of amino acid residues of It is within. A particularly preferred nucleic acid fragment has the formula:                 Xn-Y-Zm The peptide having human B7-2 activity is encoded by the amino acid sequence represented by To In the formula, Y represents amino acid residues 24-245 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). Xn and Zm are additional amino acid residues linked to Y by an amide bond It is. Xn and Zm are adjacent to Y in the amino acid sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). Selected from amino acid residues. In the formula, Xn is in the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). Selected from the amino acids adjacent to the amino terminus of Y, that is, amino acid residues 23 to 1 Is an amino acid residue. Zm is a carboxyl group of Y in the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). Selected from the amino acids adjacent to the amino terminus, ie, amino acid residues 246-329. Amino acid residue. Further, in the formula, n is a number from 0 to 23 (n = 0 to 23), and m Is a number from 0 to 84 (m = 0 to 84). Particularly preferred peptides are n = 0, m = 0 Having the amino acid sequence represented by the formula Xn-Y-Zm above.   Nucleic acid fragments within the scope of the present invention cross-link with the B lymphocytes described herein. Screening tools to detect novel cross-reacting proteins Hybridizes to nucleic acids from other animal species for use in protocols Including those that can. These and other fragments are described in detail below. I do. Generally, the nucleic acid encoding the B lymphocyte antigen fragment is the mature protein. Selected from bases that encode quality, but in some cases, nucleotide sequences Select all or part of the fragment from the leader sequence or non-coding part. Preferably selected. Nucleic acids within the scope of the present invention include linker sequences, modified restrictions. Endonuclease sites, and molecular cloning, recombinant protein expression Or other sequences useful in construction, or fragments thereof. Nucleic acid distribution These and other modifications of the columns are described in detail below.   Encodes a peptide having the activity of a novel B lymphocyte antigen such as B7-2 antigen Nucleic acid can be obtained from mRNA present in activated B lymphocytes . It is also possible to obtain the nucleic acid sequence encoding the B lymphocyte antigen from the B cell genomic DNA. It will be Noh. For example, the gene encoding the B7-2 antigen is described herein. It can be cloned from a cDNA or genomic library according to the protocol. B CDNA encoding the 7-2 antigen should be isolated from total mRNA from a suitable cell line. Can be obtained by Double-stranded cDNA can then be prepared from total mRNA. Next The cDNA is then cloned into a suitable plasmid using any one of a number of well-known techniques. Alternatively, it can be inserted into a viral (eg bacteriophage) vector. New B The gene encoding the antigen of the antigen is a nucleotide sequence information provided by the present invention. Clone using established polymerase chain reaction technology according to the report You can also. The nucleic acid of the present invention can be DNA or RNA. Preferred nucleus The acid is cD encoding human B7-2 antigen having the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 1). It is NA. Another preferred nucleic acid is a murine having the sequence shown in Figure 14 (SEQ ID NO: 22). This is a cDNA encoding the phosphorus B7-2 antigen.   The invention further provides herein a operably linked at least one control sequence. Encoding at least one peptide having the activity of the novel B lymphocyte antigen described And an expression vector containing the nucleic acid. "Operably linked" means that the nucleic acid sequence , Linked to regulatory sequences in a manner that allows its expression (e.g., cis or Or in a trance). Control sequences are known in the art Selected to direct expression of the desired protein in a suitable host cell. Thus, the term regulatory sequence refers to promoters, enhancers and other expression control elements. Including factors. Such control sequences are known to those of skill in the art and can be found in Goeddel, Gene Exp ression Technology,Methods in Enzymology, Academic Press, Sun Diego, California (1990). Expression vector desiccation The desired host to be transfected and / or expressed. It should be understood that it depends on the type of protein involved. One aspect smell In some cases, the expression vector contains at least the B7-2 protein such as extracellular domain portion. Includes a nucleic acid that partially encodes. In another aspect, the expression vector is for the B7-2 antigen. DNA encoding a peptide having activity, and other B lymphocytes such as B7-1 It includes a DNA encoding a peptide having the activity of an antigen. Human B7-1 and ma The cDNA encoding Usus B7-1 antigen is shown in SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 30. Shown respectively. The deduced amino acid sequences of these antigens are SEQ ID NO: 29 and And SEQ ID NO: 31 respectively. Such expression is used to transfect cells. The fusion sequence encoded by the nucleic acid sequences described herein. Producing a protein or peptide, including a combined protein or peptide Can be. These and other aspects are described in further detail herein.   The present invention also relates to a method for producing a peptide having a novel B lymphocyte antigen activity. Related. For example, a nucleotide encoding a peptide having the activity of B7-2 protein Host cells transfected with a nucleic acid vector that directs expression of the The peptide can be expressed by culturing in a medium under appropriate conditions. Furthermore, B DNA encoding a peptide having 7-2 activity, and a second B lymphocyte anti- Other peptides such as peptides having the activity of the original (for example, B7-1, B7-3) Transfecting host cells with one or more expression vectors containing DNA And co-express these peptides or fusion proteins or peptides Can be manufactured. In one aspect, comprising DNA encoding a B7-2 fusion protein A recombinant expression vector can be produced. The B7-2 fusion protein exhibits B7-2 activity. A nucleotide sequence encoding a first peptide having, and A second peptide corresponding to a moiety that changes solubility, affinity, stability or valency Recombinant expression of a nucleotide sequence encoding, for example, an immunoglobulin constant region Can be manufactured. Preferably the first peptide is the extracellular domain of human B7-2 antigen. Main part (for example, about 24 to 24 amino acid residues of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2)) It consists of 5). The second peptide is an immunoglobulin constant region, eg human Cγ1. Domain or Cγ4 domain (eg, human IgCγ1 or human IgCγ4 , CH2 and CH3 regions, see Capon et al., US Pat. No. 5,116,964. , Which constitutes a part of this specification). The resulting B7-2Ig fusion protein Quality may be due to altered B7-2 solubility, binding affinity, stability, and / or valency ( I.e. the number of binding sites available per molecule) and the efficiency of protein purification Can be increased. Fusion proteins and peptides produced by recombinant technology Secreted and isolated from a mixture of cells and medium containing the protein or peptide I can do it. Alternatively, the protein or peptide is retained in the cytoplasm and the cells are harvested And lysis And the protein can be isolated. Cell cultures typically include host cells, medium, and Including other by-products. Suitable media for cell culture are well known in the art. Tan Proteins and peptides are well known in the art for protein and peptide purification. It can be isolated from cell culture medium, host cells, or both using manufacturing techniques. Host details Techniques for transfecting cells and purifying proteins and peptides are described herein. Will be described in more detail in.   A particularly preferred human B7-2Ig fusion protein is an immunoglobulin constant region It comprises a bound extracellular domain portion or variable region-like domain of human B7-2. The immunoglobulin constant region diminishes effector activity inherent in immunoglobulin structure. It may also include genetic modifications that reduce or eliminate it. For example, human B7-2 (hB7 -2) also encodes the extracellular portion of human B7-2 variable region-like domain ( hB7.2V) or the DNA encoding the constant region-like domain of human B7-2, Human IgCγ1 and / or IgCγ4 modified by site-directed mutagenesis Can be bound to the DNA encoding the hinge, CH2 and CH3 regions. these The production and characterization of the fusion protein of E. coli is described in detail in Example 7. You.   The activity of one or more B lymphocyte antigens (eg, B7-2, B7-3) on the cell surface Transfected cells expressing the peptide are also within the scope of the invention. . In one aspect, the host cell, such as a COS cell, has B7-2 activity at the surface of the cell. Transfected with an expression vector that directs the expression of the peptide having So Transfected host cells such as B7-2 on T cells Inhibits binding to target receptor or responds to B7-2 interaction It can be used in a method to identify molecules that interfere with co-stimulatory intramolecular signaling to T cells. In other embodiments, sarcoma, melanoma, leukemia, lymphoma, carcinoma or neuroblastoma. Tumor cells such as blastoma have novel B lymphocyte antigen activity on the surface of tumor cells Transfecting with an expression vector directing the expression of at least one peptide You. In some cases, tumor cells were transfected with major histocompatibility complex (MHC) proteins such as MHC class II α and β chain proteins or MH C class I α chain protein and, if necessary, β2 microglobulin protein Both It is also beneficial to express. Using such transfected tumor cells Tumor immunity in patients. These and other aspects Are described in more detail herein.   The nucleic acid sequences of the invention can also be chemically synthesized using standard techniques. Po Various methods for chemically synthesizing lideoxynucleotides are similar to peptide synthesis. Include fully automated solid-phase synthesis on commercially available DNA synthesizers. (Itakura et al., U.S. Pat. No. 4,598,049; Caruthers et al. No. 4,458,066; and Itakura et al., No. 4,401,796 and No. 4,3. 73,071, these patents form part of the present specification. ).   Another aspect of the present invention is the activity of novel B lymphocyte antigens (eg B7-2, B7-3). Isolated peptide having sex. Pepti having B lymphocyte antigen activity Is the human B7-2 sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2), or FIG. 14 (SEQ ID NO: 22) Although the amino acid sequence is different from the B lymphocyte antigen such as the murine B7-2 sequence shown in Better yet, such a difference works in the same or a similar way as the B lymphocyte antigen, Or it produces peptides with the same or similar characteristics as the B lymphocyte antigen. example For example, the peptide having the activity of B7-2 protein is CLTA4 on T cells and And / or binding to a natural ligand of the B7-2 protein on immune cells, such as CD28. And a peptide having the ability to stimulate or inhibit immune cell co-stimulation Defined in the book. Therefore, peptides with B7-2 activity are CTLA4 and Bind to CD28 and / or stimulate or inhibit a T cell-mediated immune response (eg, For example, cytokine production and / or by T cells that have received a primary activation signal Evidenced by proliferation). One embodiment has B7-2 binding activity, but is co-stimulatory. Peptides lacking the ability to transmit gnal to T cells are provided. Such a pepti Inhibits T cell proliferation and / or cytokine secretion in patients or Can be used to lock. Alternatively, for B7-2 binding activity and T cells Peptides that have both the ability to transduce costimulatory signals will increase T cell expansion in patients. Used to stimulate or enhance proliferation and / or cytokine secretion. these And other functionally equivalent peptides that produce a variety of B7-2 proteins Modifications are described in detail herein. The term "peptide" as used herein refers to pepti Refers to proteins, proteins, and polypeptides.   The function of B7-2 (ie binding to CTLA4 and / or CD28, and And / or the ability of B7-2 to stimulate or inhibit T cell costimulation) Shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2), such as substitutions, additions, or deletions of amino acid residues that are not Human B7-2 protein or murin B7-2 shown in Figure 14 (SEQ ID NO: 23) A peptide can be produced by modifying the amino acid sequence of a protein. The pepti of the present invention Is typically at least 20 amino acid residues in length, preferably at least 40 amino acid residues, most preferably 60 amino acid residues. Activity of B7-2 Having at least 80 amino acid residues in length and at least 100 amino acids Peptides having residues, or at least 200 or more amino acid residues Are also within the scope of the present invention. A preferred peptide is the extracellular domain of human B7-2 antigen. Region (for example, about amino acid residues 24-245 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2)). No. Other preferred sequences have the formula:               Xn-Y-Zm (In the formula, Y is amino acid residues 55 to 68 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2), FIG. No. 2), the amino acid residues 81 to 89 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). Minoic acid residues 128-142, amino acid residue 160 of the sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2) ~ 169, amino acid residues 188-200 of the sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2), and Selected from the group consisting of amino acid residues 269 to 282 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2) Is an amino acid residue. ) Having an amino acid sequence represented by In the formula, Xn and Zm are amide bonds. Additional amino acid residues linked to more Y. Xn and Zm are shown in FIG. Amino acid selected from the amino acids adjacent to Y in the amino acid sequence shown in No. 2) It is an acid residue. Xn is adjacent to the amino terminus of Y in the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). It is an amino acid residue selected from contiguous amino acids. Zm is shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). An amino acid selected from the amino acids adjacent to the carboxy terminus of Y in the sequence shown in No acid residue. In the formula, n is a number from 0 to 30 (n = 0 to 30), and m is from 0 to 30. It is a number (m = 0 to 30). Particularly preferred peptides are n = 0 and m = 0 , Having an amino acid sequence represented by the formula Xn-Y-Zm.   Another aspect of the invention is the activity of novel B lymphocyte antigens such as B7-2 or B7-3. A substantially pure product of the active peptide is provided. Such products are The peptide is naturally present in the cell or naturally if secreted by the cell. Substantially free of co-existing proteins and peptides.   The term "isolated" as used throughout this specification is produced by recombinant DNA technology. Cell material or culture medium, if used, chemical if chemically synthesized Novel B lymphocytes, such as B7-2, substantially free of precursors or other chemicals A nucleic acid, protein, or peptide having the activity of an antigen. Isolated nucleic acid Is a sequence that naturally flanks the nucleic acid in the organism from which it is derived (i.e. It also does not include sequences located at the 5'and 3'ends of nucleic acids.   These and other aspects of the invention are described in detail below.I. Isolation of nucleic acids from cell lines   Used to isolate a nucleic acid encoding a peptide having a novel B lymphocyte activity Appropriate cells containing B lymphocyte antigen (eg, B7-1, B7-2, B7-3) To produce an mRNA that encodes the Including cells that can One source of mRNA is quiescent, or anti-immunoglobulin B cells activated by antibody or anti-MHC class II antibody, or tumorous Normal human splenic B cells from a subset of Expression of human B7-2 antigen is MRNA levels detectable in static B cells and in activated B cells Le increases 4 times from rest level after stimulation. For whole cell RNA, use standard techniques Can be obtained from B cells activated during quiescence or during these intervals , Can be used for the construction of a cDNA library.   Furthermore, various subsets of neoplastic B cells express B7-2 and B7-3, It serves as an alternative source of mRNA for the construction of cDNA libraries. For example, Tumor cells isolated from a patient with Dickin's lymphoma express B7-1 mRNA. Manifest. From nodular, poorly differentiated lymphoma (NPDL) B cells spread large cell lymphoma (LCL), a Burkitt lymphoma cell line Of human B7-1 mRNA, and possibly B7-2 and B7-3 mRNA It will be a supply source. Myeloma generally expresses B7-2, but B7-1 mRNA Does not express, thus providing a source of B7-2 mRNA. Burkitt lymphoma The cell line Raji is one source of B lymphocyte antigen mRNA. Preferably B7- 2 mRNA is obtained from both populations of quiescent and activated normal human B cells. Live For the activated B cells, for example, anti-immunoglobulin antibody or anti-MCH class II antibody is used. It is obtained by stimulation over a wide range of times (eg minutes to days).II. Isolation of mRNA and construction of cDNA library   Whole cell mRNA can be prepared by various techniques, for example Chirgwin et al.Biochemistry,1 8 5,294-5299 (1979) Guanidinium-Thiocyanate Extraction Method Can be isolated by using. According to this method, Poly (A +) mRNA is Using oligo (dT) cellulose selection for its use in cDNA library construction Prepare and purify. cDNA was oligo (dT) primed and reverse transcriptase It is then used to synthesize from poly (A +) RNA. Moloney MLV reverse transcriptase (Gi bco / BRL, available from Bethesda, MD), or AMV reverse transcription Raw (obtained from Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, Florida) Is possible) is preferably used.   After reverse transcription, the mRNA / DNA hybrid molecule is double-stranded using standard techniques. It is converted to DNA and introduced into an appropriate vector. The experiment here is a double-stranded cDNA For conversion to E. coli DNA polymerase I and ribonuclease H You.   The cloning of the cDNA is to connect the double-stranded DNA with an appropriate vector. This can be done using any of the conventional techniques. Using synthetic adapters Is particularly preferred. Because it is the solution of cDNA by restriction enzyme before cloning. This is because it reduces the possibility of cracking. Kinase of non-self complement using this method Add (kinased) adapter to DNA before ligation with vector . Virtually any adapter can be used. As shown in more detail in the examples below To For cloning non-self-complementary BstXI adapters by BstXI digestion CD for cloning for ligation into the prepared pCDM8 vector Preferably added to NA.   Eukaryotic cDNAs contain suitable eukaryotic promoters, origins of replication, and enhancers. Sensor, splice acceptor and / or donor sequences, and polyadenylation Sense orientation in a vector that provides other elements, including Can be expressed when placed in. The cDNA of the present invention is a prokaryotic promoter, E. FIG. Origin of replication that functions in E. coli, SV40 replication that allows growth in COS cells Position the origin and in a suitable vector with the cDNA insertion site. Appropriate The vector is πH3 (Seed and Aruffo,Proc. Natl. Acad. Sci. ,84 3365-3369 (1987)), πH3m (Aruffo and Seed,Proc. Natl . Acad. Sci . ,84, 8573-8577 (1987)), pCDM7 and pC. DM8 (Seed,Nature,329, 840-841 (1987)), pCDM 8 vectors are especially preferred (commercially available from Invitrogen, San Diego, CA). I can get it).III. Transfection of host cells and screening of a novel B lymphocyte activation antigen cleaning   The cDNA library thus prepared was used to query by expression cloning technology. Clone the subject gene. The basic expression cloning techniques are Seed and Ar uffo,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,843365-3369 (198 7), and Aruffo and Seed,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 8573-8577 (1987), but requires modification of this technique. Can be   According to one aspect, plasmid DNA may be transfected with known transfection techniques (eg, For example, DEAE-dextran) was used to develop monkey COS cell lines (Gluzman,Cell),23 175 (1981)) to replicate and express the cDNA insert. B7 -1 anti-B7-1 monoclonal antibody ( Eg 133 and B1.1) and anti-murin IgG and IgM I Deplete with munomagnetic beads. Human B7-2 antigen Expressing transfectants and fusion proteins of the transfectants Reacted with CTLA4Ig and CD28Ig, then coated with anti-human Ig antibody Positive selection can be performed by panning with a plate. Human CTLA4Ig and And the CD28Ig fusion protein were used, but B7-1 and, for example, mouse B7- If there is cross speciles reactivity between one, then there is no cross anti-reactivity. It is expected that other fusion proteins reactive with the reactive species could also be used. Recovery of episomal DNA from panned cells after panning And a competent bacterial host, preferably E. coli. coli. Transform to The plasmid DNA is then reintroduced into COS cells and the cycle of expression and panning Repeat at least twice. After the final cycle, plasmid DNA was added to individual colonies. Prepared from E. coli and transfected into COS cells, eg CTLA4Ig and C Expression of a novel B lymphocyte antigen by indirect immunofluorescence using D28Ig analyse.IV. Sequencing of a novel B lymphocyte antigen   Plus from those colonies that are strongly reactive with CDLA4Ig and CD28Ig Prepare the mid. These plasmids are then sequenced. D of about 1.0 kb or more Any conventional sequencing technique suitable for sequencing NA tracts can be used. Wear.   As described in Example 4, a single long oh consisting of 987 nucleotides. It has a bun reading frame and approximately 27 nucleotides of the 3'non-coding sequence. A human B7-2 clone (clone 29) with a 1,120 base pair insert was obtained. (FIG. 8, SEQ ID NO: 1). The open reading frame of the protein The predicted amino acid sequence encoded is shown below the nucleotide sequence in FIG. Co Predicted B7-2 protein is predicted to be 329 amino acid residues in length (SEQ ID NO: 2). This protein sequence is found in the other Type I Ig superfamily It exhibits many features common to membrane proteins. Protein translation is a consensus eukaryote Based on DNA homology in the region containing the biotranslation initiation site, methionine cod (ATG, nucleotides 107-109) (Kozak, M. (19 87),Nucl. Acids Res,15, 8125-8148). B7-2 Tampa The amino terminus of the protein (amino acids 1 to 23) is alanine at positions 23 and 24. With the characteristic of a secretory signal peptide with the expected cleavage between (von Heijne ( 987),Nucl. Acids Res. ,14, 4683). Procesin at this site Is a 306 amino acid B7-2 membrane bound protein with an unmodified molecular weight of approximately 34 kDa. It produces puffiness. This protein is almost composed of amino acid residues of about 24-245. Extracellular Ig superfamily V and C-like domains, amino acid residues 246- A hydrophobic transmembrane domain consisting of 268 and about amino acid residues 269-329. It consists of a long cytoplasmic domain. Homology to Ig superfamily Bound by cysteines at positions 40-110 and 157-218 By two adjacent Ig-like domains in the extracellular region. Extracellular domain is 8 It also has one potential N-linked glycosylation site, probably similar to B7-1. Be lycosylated. Glycosylation of human B7-2 protein is approximately 50-70 kDa The molecular weight can be increased. The cytoplasmic domain of human B7-2 is somewhat more than that of B7-1. Long, but probably act as a signaling or regulatory domain inside antigen presenting cells (APCs) A common domain consisting of a number of cysteines followed by a positively charged amino acid Including the area. GenBank for both the nucleotide and amino acid sequences of human B7-2. And a comparison with the EMBL database showed considerable homology with human B7-1 (approximately 26% amino sequence identity). Human B7-1, human B7-2 and mi Urin B7-1 all bind to human CTLA4 and CD28 and therefore have homology Contains many amino acids necessary to contain the CTLA4 or CD28 binding sequence. Show minutes. The vector containing the cDNA insert encoding human B7-2 was transduced. Fected E. coli (clone 29), accession number, July 26, 1993 American Type Culture Collection (ATC No. 69357) Deposited at C).V. Cloning of novel B lymphocyte antigens from other mammalian species   The present invention is not limited to human nucleic acid molecules, but other mammals expressing B lymphocyte antigens. A novel B lymphocyte antigen homologue from a species was cloned using the technique described below. Intended to be sequenced and sequenced. 1 showing cross species reactivity Using B lymphocyte antigens isolated for one species (eg, human), another species (eg, T cells-mediated immune response in mice, for example). CDNA clones from other species For the isolation of the clone, human B7-2 cDNA etc. can be used as a hybridization probe. It can also be carried out using the human cDNA insert of   As shown in Example 6, a single long open consisting of 927 nucleotides. With an open reading frame and approximately 126 nucleotides of 3'non-coding sequence. A murine B7-2 clone (mB7 containing an insert consisting of 1,163 base pairs) -2, clone 4) was obtained (Fig. 14, SEQ ID NO: 22). Protein openly The predicted amino acid sequence encoded by the Ding frame is shown in FIG. Shown below the leotide sequence. The encoded murin B7-2 protein is It is predicted to be 309 amino acid residues (SEQ ID NO: 23). This protein is It has many features in common with the type II Ig superfamily membrane proteins. Protein translation involves D in the region containing the consensus eukaryotic translation initiation site. Based on NA homology, methionine codon (ATG, nucleotides 111-11 3) is expected to start (Kozak, M (1987),Nucl. Acids Res,15 , 8125-8148). The amino terminus of the murine B7-2 protein (ami No acids 1-23) are predicted between alanine at position 23 and valine at position 24 Characterized by a secretory signal peptide with cleavage (von Heijne (1987),Nucl. Acids. Res . ,14, 4683). Processing at this site is about 3 Murin B7-2 membrane consisting of 286 amino acids with an unmodified molecular weight of 2 kDa Will produce a binding protein. This protein contains about 24 to 2 amino acid residues 46 extracellular Ig superfamily V and C-like regions, approximately 2 amino acid residues A hydrophobic transmembrane domain of 47-265 and about amino acid residues 266-309 It will consist of a long cytoplasmic domain. Homology to Ig superfamily Are bound by cysteines at positions 40-110 and 157-216 Due to two adjacent Ig-like regions in the extracellular region. 9 extracellular domains Possible It also contains a potential N-linked glycosylation region and, like murin B7-1, probably Glycosylated. Glycosylation of the murine B7-2 protein is about 5 The molecular weight can be increased from 0 to 70 kD. The cytoplasmic domain of murin B7-2 is Follows cysteine, which probably functions as a signaling or regulatory domain within APC. Includes common regions with highly positively charged amino acids. Murin B7-2 Nuku GenoBank and EMBL databases for both leotide and amino acid sequences In comparison with human and murine B7-1, there is considerable homology (about 26% of the amino acids). No acid sequence is the same). Murin B7-2 is its human homologue, hB7-2. With about 50% identity and 67% similarity with. Code the Mullin B7-2 E-transfected with a vector containing the cDNA insert (plasmid pmbx4) . coli (DH106 / P3) (clone 6) has been identified under Accession No. 69388 as 19 American Type Culture Collection (ATCC) August 18, 1993 Deposited with.   Nucleic acids encoding novel B lymphocyte antigens from other species, such as murin B7-2, are , Transgenic animals, or can be used to create “knockout” animals, The animal is useful in the development and screening of therapeutically useful agents. Tiger Transgenic animals (e.g., mice) have an animal with cells bearing the transgene. A transgene of an animal or a prenatal animal such as an embryonic animal. Introduce to the predecessor. Transgene then develops transgenic animals It is DNA that is bound to the cell's genome. In one embodiment, murine B7-2c Genome B7-2 was constructed by established techniques using DNA or its appropriate sequence. Clone and have cells expressing the B7-2 protein using its genomic sequence Transgenic animals can be produced. Transgenic animals, Methods for creating animals, especially mice, are commonplace in the art. See, for example, US Pat. Nos. 4,736,866 and 4,870,009. Have been described. Typically, specific cells are labeled with B using tissue-specific enhancers. Targeted, T cell costimulatory and enhanced for 7-2 transgene transduction It could lead to T cell proliferation and autoimmunity. Reproduction of animals at the embryonic stage system Transgenic animal containing a copy of the B7-2 transgene introduced in a row Can be used to investigate the effect of increased B7 expression. Such animals are examples For example, as a tester animal against drugs that are thought to confer protection from autoimmune diseases Can be used. In accordance with this aspect of the invention, an animal is treated with a drug Decreased prevalence of disease compared to untreated animals with lancegene is associated with that disease May indicate potential therapeutic involvement.   Alternatively, the endogenous B7-2 gene and altered introduced into the embryonic cell of the animal Deficiency of the B7-2 gene as a result of homologous recombination between B7-2 genomic DNA Or to create B7-2 "knockout" animals with alterations, non-human B7-2 Tohomologues can be used. For example, using murin B7-2 cDNA Genome B7-2 can be cloned according to established techniques. genome A part of B7-2 DNA (eg, exon encoding extracellular domain) is deleted. Or selectable markers that can be used to monitor integration. It may be replaced with another gene, such as the gene encoding the Kerr. Typically changed Non-flanking DNA vector of several kilobases (at both 5'and 3'ends) (For example, Thomas, KR and Capecchi, MR (1987),Cell ,51, 503 for a description of homologous recombination vectors). The vector Introduced into an embryonic stem cell line (eg by electroporation) and introduced D Select cells in which NA is homologously recombined with endogenous DNA (eg Li, E, etc. ( 1992),Cell,69, 915). Animals selected (e.g. mouse) Then injected into blastocysts of S. aureus to form aggregation chimeras (eg Braley,T eratocarcinomas and Embryonic Stem Cell : A Practical Approach E.J. Edited by Robertson (IRL, Oxtord, 1987), pages 113-152). Ki The mella embryo was transplanted to an appropriate pseudopregnant female foster animal, the embryo was folded, and " Create a “knockout animal”. DNs homologously recombined in their germ cells Progeny with A can be identified by standard techniques, and all cells of the animal are homologous It can be used to raise animals with recombinant DNA. Knockout Animals receive grafts, reject tumors, and protect against infectious diseases So Their abilities can be characterized and used in basic immunobiology research. Can be.VI. Expression of B lymphocyte antigen   Transfecting to express a peptide having the activity of a novel B lymphocyte antigen Included host cells are also within the scope of the invention. The host cell is a prokaryotic cell, or a true It can be a nuclear cell. For example, a peptide having B7-2 activity can be labeled with E. coli etc. Bacterial cells, insect cells (baculovirus), yeast, Chinese ovary cells (CH O) and NSO cells. Other suitable host cells are Goed del (1990), supra and known to those skilled in the art.   Expression in eukaryotic cells, such as mammalian, yeast, or insect cells, is Partial or complete glycosylation of the recombinant protein and / or related interchain Or it may result in the formation of an intrachain disulfide bond. Yeast S. to cerivisae Examples of vectors for expression in pYepSecl (Baldari et al. (1987),Embo J.M. ,6229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982),Cell ,30, 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987),Gene,54, 113-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, California) is included. Protein expression in cultured insect cells (SF9 cells) The baculovirus vector that can be used for pAC series (Smith et al. (1983),Mol. Cell Biol. ,3, 2156-2165) and pVL series (Lucklo w, V. A. And Summers, M .; D (1989),Virology,17031-39 )including. Generally, COS cells (Gluzman, Y. (1981),Cell,23, 175- 182) is a vector such as pCDM8 for transient amplification / expression in mammals. (Seed, B. (1987),Nature,329, 840) in combination with CHO (dh fr-Chinese hamster ovary) cells are stable amplification / generation in mammalian cells. For the present, vectors such as pMT2PC (Kaufman et al. (1987),EMBO J.C.,6 , 187-195). Preferred cells for the production of recombinant proteins Strains are available from ECACC (catalog # 85110503) and are available from Galfre, G .; Oh And Milstein, C (1981),Methods in Enzymology,73(13) 3- 46 andPreparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedure NSO MIERO, New York, Academic Press, New York Cell line. Vector DNA is calcium phosphate or calcium chloride Coprecipitation, DEAE-dextran mediated transfection, lipofectin or Alternatively, it can be introduced into mammalian cells by conventional techniques such as electroporation. Suitable methods for transforming host cells are described by Sambrook et al.Molecular Cloning: A Laboratory Mannual , Part 2, Cold Spring Harbor La It can be found in boratory press (1989) and other laboratory textbooks. Wear. When used in mammalian cells, expression vector control functions in viral More often provided. For example, commonly used promoters are polyoma, Denovirus, cytomegaloyl, and most often simian virus 4 Derived from 0.   A small part of the cell (about 1/10Five) Typically integrates DNA into their genome. To identify these integrants, selectable markers (i.e. Resistance) to the host cell along with the gene of interest. Preferred selectable markers are G418, hygromycin and methotrex Including those that impart resistance to drugs such as cerate. Selectable markers matter It may be introduced into the same plasmid as the gene of or may be introduced into another plasmid. . Cells carrying the gene of interest can be identified by drug selection. Ie selectable Cells that have introduced the marker gene survive and other cells die. Surviving cells , Using ligands for B cell antigens (eg CTLA4Ig and CD28Ig) Then screen for the production of novel B lymphocyte antigens by cell surface staining I can do it. Alternatively, the protein may be metabolically labeled with a labeled amino acid to provide anti-B Lymphocyte antigen monoclonal antibody, or CTLA4Ig or CD28Ig, etc. The fusion protein may be immunoprecipitated from cell supernatant.   Expression in prokaryotes is a construct that directs expression of fusion or non-fusion proteins. E. most often in coli Will be The fusion vector will contain many amino acids usually at the amino terminus of the expressed target gene. Add noic acid. Such fusion vectors 1) increase expression of recombinant proteins 2) increase the solubility of the target recombinant protein, and 3) Affini Purification of the target recombinant protein by acting as a ligand in purification It typically serves three purposes: to aid in manufacturing. In the fusion expression vector Often, a proteolytic cleavage site is created between the fusion moiety and the target recombinant protein. Targeting recombinant protein from the fusion moiety after introduction into the moiety and purification of the fusion protein Allows to separate. Such enzymes, and their cognate recognition sequences, Includes factor Xa, thrombin, and enterokise. Typical fusion expression vector Is the target recombinant protein, glutathione S-transferase, malt PGEX (Amrad Corp.) that fuses protein E-binding protein or protein A. , Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolabs, Beverly , Massachusetts) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, New Jazzi) is included.   E. FIG. coli. The expression system is an inducible expression vector pTrc (Amann et al. (1988),Gen e ,69, 301-315) and pET11 (Studier et al.,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology ,185, Academic Press, Sanji Yego, California (1990), 60-89; commercially available from Novagen. Can be included. In the pTrc vector system, the inserted gene is hybridized with pelB signal by host RNA polymerase transcription from p-lac fusion promoter Express with sequence. After induction, recombinant protein from periplasmic fraction Can be purified. In the pET11 vector system, the target gene was RNA polymerase-mediated T7gn10-lac0 fusion promoter ( It is expressed as a non-fusion protein by transcription from T7gnl). This virus Limerase is a T7gnl-resident resident under the transcriptional regulation of the lacUV5 promoter. Lambda prophage to host E. coli strains BL21 (DE3) and HMS174 ( D E3). In this system, the recombinant protein is denatured and sealed. It can be purified from impregnated bodies and reconstituted and modified by step gradient dialysis if desired. Remove properties.   E. FIG. One strategy for maximizing recombinant B7-2 expression in E. coli involves recombinant protein Proteins in host bacteria with impaired ability to be more cleaved by proteolytic enzymes Quality is expressed (Gottesman, S.,Gene Expression Technology; Methods in Enzymology ,185, Academic Press, San Diego, Cali Fornia (1990), 119-128). Other strategies are inserted into the expression vector The nucleic acid sequence of the B7-2 gene or other DNA to be In which E. coli was highly expressed. Seems to be used preferentially in coli proteins Would change (Wada et al. (1992),Nuc. Acids Res.,20Two 111-2118). Such alterations of the nucleic acid sequences of the present invention are standard DNA synthesis. It can be done by technology.   Novel B lymphocyte antigens and parts thereof expressed in mammalian cells or otherwise Ammonium sulfate precipitation, fractionation column chromatography (for example, ion exchange Replacement, gel filtration, electrophoresis, affinity chromatography, etc.) and ultimately Includes crystallization. It can be purified according to standard methods in the art (generally, "Enzyme Purification and Relatated Techniques",Methods in E nzymology ,22233-577 (1971)). Partially or evenly Recombinantly produced B lymphocyte antigen or portion thereof, It can be used in compositions suitable for pharmaceutical administration as described in detail below.VII. Modification of the nucleic acid and amino acid sequences of the present invention and the component of B7 lymphocyte antigen activity Analysis   Another nucleic acid encoding a peptide having the activity of a novel B lymphocyte antigen is described above. It will be appreciated by those skilled in the art that it can be isolated by the method. Different cell lines are different It can be expected to give rise to a DNA molecule having a different base sequence. Furthermore, the mutant remains It may be present due to genetic polymorphisms in the transmitter and cell-mediated modifications. Furthermore, B lymphocytes The DNA sequence of the antigen has been modified using genetic techniques, resulting in an altered amino acid sequence. Proteins or peptides can be produced. Such sequences are within the scope of the invention When Possible and expressed peptides elicit an activated T cell-mediated immune response and immune function. Can lead or inhibit.   Many methods have been used to produce equivalents or fragments of isolated DNA sequences. Can be. A small subregion of the nucleic acid encoding the B7-2 protein or Is a fragment, eg, 1 to 30 bases in length, that is standard for synthetic organic chemistry. It can be prepared more. The technique was used to create larger synthetic fragments of B7-2 DNA. Also useful for preparing antisense oligonucleotides and primers used in manufacturing It is.   Larger subregions or fragments of the gene encoding the B lymphocyte antigen Is a polymerase chain reaction (PCR) (Sambrook, Fritsh and Ma niatis,Molecular Cloning; A Labaratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)) was used to synthesize relevant pieces of DNA and By ligating the DNA thus obtained into an appropriate expression vector, It can be expressed as a peptide. PCR was used to characterize the cloned double-stranded DNA. The specific sequence was created and cloned into an expression vector, then CTLA4 / CD 28 binding activity is analyzed. For example, the secreted (soluble) form of human B7-2 protein For expression, the transmembrane and cytoplasmic regions of the protein were expressed using PCR. Can synthesize non-coding DNA. Copy this DNA molecule into an appropriate expression vector. It can be gated and introduced into host cells such as CHO where the B7-2 protein fragment Are synthesized and secreted. The B7-2 protein fragment is a culture medium Can be easily obtained from.   In other embodiments, simple deletions or inserts, systematic deletions of base clusters Many, including methods for making singles, inserts or substitutions, or single / base substitutions. Mutation of B lymphocyte antigen DNA by introducing a mutation into the DNA by any of You can make a body or a modified equivalent. For example, as shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 1) Human B7-2c DNA sequence and murin B7-2c shown in Figure 14 (SEQ ID NO: 2). Changes in the DNA sequence, such as amino acid substitutions or deletions, refer to site-directed mutations. It is preferably obtained by induction. Site-directed mutagenesis is well known in the art I have. Protocols and reagents are Amersham Alternative PLC, Amall -Siam, commercially obtained from the United Kingdom.   The activity of the novel B lymphocyte antigen, ie, for example, when receiving a primary activation signal Evidenced by cytokine production by T cells and / or T cell proliferation Bind to the natural ligand of B lymphocyte antigen on T cells and activate T cell-mediated immunity. Peptides that have the ability to stimulate (amplify) or block (block) epidemiological responses It is believed to be in the light range. More specifically, T lymphocytes such as CD28+ A peptide that binds to can carry a costimulatory signal to T lymphocytes, Signals convey antigen and class II MHC, or primary signals to T cells Inside T cells when delivered in the presence of other substances that can The resulting activation of the gene. Alternatively, such peptides can be labeled as class IM Used with HC, thus CD8+Cytolytic T cells can be activated. Further acceptable The soluble, monomeric form of the B7-2 protein is CD28+Those heavens on T cells Retains the ability to bind to the natural ligand, but possibly lacks sufficient cross-linking with the ligand. Transduce essential secondary signals to enhance cytokine production and cell division Can not. It provides a means of inducing anergy or tolerance in cells Such peptides are also considered to be within the scope of this invention.   For those that retain the characteristic B lymphocyte antigen activity described herein, Screening for peptides should be done using one or more different assays. Can be. For example, the peptide is added to the cell surface B7-2, or CTLA4Ig. Or an anti-7-2 monoclonal antibody reactive with a fusion protein such as CD28Ig Can be screened for specific reactivity with. Specifically, for COS cells Suitable cells were transfected with the peptide-encoding B7-2 DNA. , Followed by indirect immunofluorescence and flow cytometry to determine the cell surface phenotype. Assayed to determine if the peptide has B7-2 activity. Transfer The cell surface expression of the cloned cells was determined by cell surface B7-2 or CTLA4Ig or Is evaluated using a monoclonal antibody that specifically reacts with the CD28Ig protein I do. Secreted forms of B7-2 are produced by anti-B7-2 monoclonal antibodies for immunoprecipitation. Was Is assessed using CTLA4Ig or CD28 fusion proteins.   Another, more preferred assay utilizes the functional characteristics of the B7-2 antigen. The theory first As demonstrated, the ability of T cells to synthesize cytokines depends on the T cell level against the antigen. Not only by occupying or cross-linking the scepter (to create "activated T cells", For example, "primary activation sig provided by anti-CD3 or phorbol ester. Null), in this case B lymphocyte antigens such as B7-2, B7-1 or B7-3 It also depends on the induction of co-stimulation by the interaction of. For example CD28+B7 on T cells -2 binding to its natural ligand is dependent on cytokines, especially interleukin- T cells that induce increased levels of production of 2 and then stimulate proliferation of T lymphocytes It has the effect of transmitting a signal to. Another analysis of B7-2 function is Leukin-2, Interleukin-4, or other known or known Analysis of synthesis of cyclines, such as new cyclines, and / or primary activity CD28 that received the activation signal+Includes analysis of T cell proliferation by T cells .   In vivo, T cells may be treated with anti-T3 monoclonal antibody (eg, anti-CD3) or Phorbol ester, more preferably an antigen associated with class II MHC, It is given a primary or primary activation signal. Receives primary activation signal The taken T cells are referred to herein as activated T cells. B7-2 function is T cell culture Including a B7-2 source (eg, a cell expressing a peptide having B7-2 activity, or B7-2) in secreted form and primary activation of antigens bound to class II MHC And add the culture supernatant to the interleukin-2, γ-interferon or other By analyzing for known or unknown cytokines in . For example, some conventional assays for interleukin-2, such asProc. Natl . Acad. Sci. USA ,86, 1333 (1989). The continuous portion forms a part of the present specification). Inter -Feron production analysis kit is also available from Genzyme Corporation (Cambridge, Mass. It is available from T cell proliferation was also measured as described in the Examples below. Can be set. Peptides that retain the features of the B7-2 antigen described herein are T cells. Cells increase the production of cytokines such as IL-2 per cell by Super It results in enhanced T cell proliferation compared to a negative control lacking gnal.   A peptide that has B7-2 activity but lacks the ability to carry costimulatory signals is screened for. The same basic functional analysis can be used for leaning, but such peptides In the case of Cd, the addition of B7-2 protein is due to proliferation or cytokine content by T cells. It will not result in a significant increase in lactation. Inhibits normal B7-2 co-stimulatory signal Of those proteins that block or completely block and induce anergic states The ability is to express T7 cells on antigen presenting cells that express cell surface B7-2 and present antigen. It can be measured using intense subsequent attempts. By IL-2 synthesis and T cell proliferation If the T cells are unresponsive to the subsequent activation attempt measured, anergy Is being induced. In the analysis system used as the basis of the analysis according to the present invention Regarding Gimmi, C.I. D. Etc. (1993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,90, 6586-6590.   Increased solubility, increased therapeutic or prophylactic effect, or stability (e.g., ex vivo (ex (vivo) shelf-life and resistance to degradation by proteolytic enzymes in vivo) Of peptides having activity of novel B lymphocyte antigens for purposes such as expansion Can also be modified. Such a modified peptide is a B-ligand as defined herein. It is considered to be a functional equivalent of the immunity antigen. For example, has B7-2 activity The ability of a peptide to stimulate T cell proliferation and / or produce a cytokine Can be modified to maintain power. Interact with CTLA4 / CD28 receptor on T cells Those residues that are shown to be essential for interaction are labeled with their essential amino acids Presence enhances, diminishes, does not lose, or affects receptor interactions Not, by substituting another, preferably similar amino acid residue (conservative substitution) Can be modified. In addition, these amino acid residues that are not essential for receptor interaction are Substitution with other amino acids whose introduction enhances, decreases, or does not affect reactivity You may modify by doing.   Another example of modification of a peptide having the activity of a novel B lymphocyte antigen is cysteine. The residue is preferably alanine, serine, threonine, leucine, or glutamine. Substitution with an acid residue to minimize dimerization due to disulfide bonds. You. Furthermore, the amino acid side chains of peptides having B7-2 activity can be chemically modified. . Another modification is cyclization of the peptide.   Peptides having B7-2 activity to enhance stability and / or reactivity With one or more polymorphisms in the amino acid sequence of the antigen resulting from any natural allelic variation Can be modified to introduce. Furthermore, D-amino acids, unnatural amino acids, and non-amino acid amino acids Narrows can be substituted and added to produce modified proteins within the scope of the invention. Change The peptide was Polyethylene by the method of Sehon and collaborators (Wie et al., Overwritten) It can be modified with PEG to make PEG-bonded peptides. it can. In addition, PEG can be added during the chemical synthesis of peptides. Pep Other modifications of tide include reduction / alkylation (Tarr,Methods of Protein Micro characterzation J. E. FIG. Silver Edition, Human Press, Clifton, Newge , 155-1994 (1986)), acylation (Tarr, Id.), Suitable carrier. Chemical coupling to (Mishell and Shiigi,Selected Methods in Cellul ar lmmunology , WH Freeman, San Francisco, California (198 0), U.S. Pat. No. 4,939,239), or weak formalin treatment (Marsh (19 71),Int. Arch. of Allergy and Appl. Immunol.,41199 ~ 215) is included.   In order to facilitate peptide purification and possibly increase solubility, tampering It is possible to add an amino acid fusion moiety to the mineral bone nucleus. Hexa-His Tidine for purification by immobilized metal ion affinity chromatography Can be added to peptides (Hochuli, E et al. (1988),Bio / Technolog y ,6, 1321-1325). In addition, the B lymphocyte antigen alone does not contain unrelated sequences. A specific endoprotease cleavage site was added to the fusion moiety and It can be introduced between sequences of peptides. By adding a functional group to the peptide , Or increasing the solubility of the peptide by omitting the hydrophobic region of the peptide It may be necessary.   VII. Encodes a B lymphocyte antigen and a peptide having B7-2 activity Uses of nucleic acid sequences.   A. Molecular probe.   The nucleic acid according to the present invention can measure the activation state of B lymphocytes in a biological sample. The effect of molecules on the progression of disease by or on the expression of B lymphocyte antigens Diagnostically useful for assaying (eg, detecting cellular mRNA levels) . According to these diagnostic assays, this nucleic acid sequence is labeled with a detectable marker, such as e.g. Label with radioactive, fluorescent, or biotinylated markers, and Derived from biological sample using blot or Northern hybridization Probing total or poly (A +) RNA mRNA molecules.   B. Production of antibodies.   Peptides and fusion proteins produced from the nucleic acid molecules of the present invention further include B It can also be used for the production of antibodies that specifically react with the immunity antigen. For example, all Long B7-2 protein or amino acid sequence based on the predicted amino acid sequence of B7-2 Anti-protein / anti-peptide by using its peptide fragment having Polyclonal antisera or monoclonal antibodies can be prepared using standard methods. Can be. A mammal (eg, mouse, hamster, or rabbit) is Immunize with an immunogenic protein or peptide that elicits an antibody response in mammals Can be This immunogen may be, for example, recombinant B7-2 protein, or its fragment. Fragment, synthetic peptide fragment or B lymphocyte antigen expressed on its surface Cells. The cells are, for example, splenic B cells or B lymphocyte antigens Encodes the B lymphocyte antigen of the invention as expressed on its cell surface A cell transfected with a nucleic acid (eg B7-2 cDNA) Good. The immunogen can be modified to increase its immunogenicity. For example, Pep Techniques for conferring immunogenicity to tide include conjugation to a carrier or Other techniques well known in the art are included. For example, the peptide Can be administered in the presence of The progress of immunization depends on the plasma or serum It can be monitored by detecting the physical strength. Standard ELISA or other Using the Munoassay with immunogens as antigens to assess antibody levels can do.   After immunization, obtain antisera and, if desired, polyclonal antibodies from this serum. Can be isolated. Antibody-producing cells to produce monoclonal antibodies (Lymphocytes) were collected from the immunized animal and myeloma cells were prepared by standard somatic cell fusion. Immortalize these cells by fusion with cells and generate hybridoma cells Can be. Such techniques are well known in the art. For example, Kera And Milstein (Nature (1975), Vol. 256, 495-497. Hybridoma technology originally developed by Dorma Technology (Kosber et al., Immunol. Today (1983), Vol. 72 EBV-hybridoma technology for producing human monoclonal antibodies. (Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy such as Cole -(1985) (Allen R. Bliss, Inc., pp. 77-96), and Kumi Screening of combined antibody libraries (Hughes et al., Science (19 89), 246, 1275). Hybridoma cells were characterized by this peptide. Monochrome screened immunochemically for production of differentially reactive antibodies The null antibody can be isolated.   The term antibody, as used herein, refers to the novel B lymphoids described herein. Peptides having the activity of sphere antigens or those flakes that specifically react with fusion proteins It is intended to include a statement. Antibodies are fragmented using conventional techniques And the fragment in the same manner as described above for whole antibodies, Can be screened for use. For example, F (ab ')2Fragmen Can be generated by treating the antibody with pepsin. Got F (ab ')2The fragment is processed to reduce disulfide bridges and the Fab 'fragment Can be generated. The antibody according to the invention further comprises an anti-B lymphocyte antigen. Includes bispecific and chimeric molecules having a (ie B7-2, B7-3) moiety Intended to be.   Particularly preferred antibodies are hybridomas HA3.1F9, HA5.2B7 and H. It is an anti-human B7-2 monoclonal antibody produced by F2.3D1. this The production and characterization of these antibodies is described in detail in Example 8. Monochrome Null antibody HA3.1F9 has been determined to be of the IgG isotype; monochrome Internal antibody HA5.2B7 was determined to be of the IgG2b isotype; The monoclonal antibody HF2.3D1 was determined to be of IgG2a isotype Was. The hybridoma cells have an ATCC accession number (hybridoma H A3.1F9), ATCC acceptance number (HA5.2B7) and ATC C Acceptance number (HF2.3D1), as required by the Budapest Treaty Nau American Type Culture Collection on July 19, 1994 Deposited.   When antibodies produced in a non-human subject are used therapeutically in humans, To a greater or lesser extent, they are perceived to be foreign and may cause an immune response in the patient. . One apro that is preferable to systemic immunosuppression that minimizes or eliminates this problem. Is a chimeric antibody derivative, that is, a variable region of a non-human animal and a human constant region. Producing a bound antibody molecule. Chimeric antibody molecules include, for example, Antigen-binding domain derived from an antibody of mouse, rat, or other species with a constant region The main may be included. Various approaches for producing chimeric antibodies have been described. And recognizes the novel B lymphocyte antigen gene product of the present invention. It can be used for the production of chimeric antibodies containing the epiglobin globulin variable region. For example Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , Volume 81 6851 (1985); Takeda et al., Nature, 314, 452 (198). 5), Cavily et al., US Pat. No. 4,816,567; Boss, et al., US Pat. No. 481. 6397; Tanaguchi et al., European Patent Publication EP171496; European Patent Publication 017. See 3494, British Patent GB21777096B. Such a chimeric anti The body is expected to be less immunogenic in human subjects than the corresponding non-chimeric antibody It is.   For therapeutic purposes in humans, peptides having the activity of the B lymphocyte antigens described herein. A monoclonal or chimeric antibody that specifically reacts with a peptide It can be further humanized by producing mela, but in this case, Part of the variable region, especially the conserved framework region of the antigen binding domain, is of human origin And only the hypervariable regions are of non-human origin. Total of "humanized" chimeric antibodies The theory is S. L. Morrison (1985), Science, Volume 229, 1202-1 207 and Oy et al. (1986), BioTechniques, Vol. It is provided on the page. Such altered immunoglobulin molecules are known in the art. Any of several techniques (eg, Tengu et al., Proc. Natl. A. cad. Sci. U. S. A. 80, 7308-7313 (1983); Zubo et al., Immunology Today, Vol. 4, 7279 (1983); Olson et al., Meth. Enzymol. 92, 3-16 (1982)). Therefore, it can be prepared, and preferably PCT publication WO92 / 06193 or Prepared according to the teaching of EP0239400. Humanized antibodies are eg En Limited, 2 Holy Road, Twickenham, Middlesex, It can be produced commercially by the UK. Suitable "humanized" antibodies are alternatively C Can be generated by DR or CEA substitutions (US for winter Patent 52255539; Jones et al. (1986), Nature, 321, 55. 2-525; Verhoyan et al. (1988), Science, 239, 15 34; and Bydler et al. (1988), J. Am. Immunol. 141 Volume 40 See pages 53-4060). Humanized antibodies with reduced immunogenicity Preferred for immunotherapy in a subject. Immunotherapy with humanized antibodies is concomitant It appears to reduce the need for immunosuppression, and also in chronic disease situations or antibody treatment. Results in increased long-term efficacy for treatment of situations requiring repeated placement be able to.   Instead of humanizing monoclonal antibodies from mouse or other species, human proteins It is also possible to produce human monoclonal antibodies against white. Human B lymphocyte Tran with a human antibody repertoire that can be immunized with an antigen, eg, B7-2 A transgenic mouse was created. Then, these immunized transgenes Of human mouse that specifically reacts with human B lymphocyte antigen using spleen cells of mouse It is possible to produce hybridomas that secrete noclonal antibodies (eg, Wood etc. PCT release WO91 / 00906, Kucharapati etc. PCT release WO91 / 10741; Rombberg et al., PCT published WO92 / 03918; Kay etc, PCT Publication 92/03917; Ronberg et al. (1994), Nature, 368: 856-859; L. Green et al. (1994), Nature Genet. 7: 13-21; L. Morrison et al. (1994), Proc . Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Black Zimman et al. (1993), Year Immunol. 7: 33-40; Tu Irons et al. (1993), PNAS, 90, 3720-3724; and Bra. Judgman et al. (1991), Eur. J. Immunol. , Volume 132 1323-1 See page 326).   The monoclonal antibody composition according to the present invention is in the field of recombinant DNA technology. And other methods well known to those with ordinary knowledge. Can be. Another method, called the "combinational antibody display" method, uses specific antigen features. It was developed to identify and isolate antibody fragments with opposite isomerism, which It can be used for the production of a monoclonal antibody that binds to the B lymphocyte antigen of the present invention. Yes (for an explanation of the combination antibody display, see eg Sustain etc. 1989), PNAS, 86, 5728; Hughes et al. (1989), Scie. nce, 246, 1275; and Orlando, et al. (1989), PNAS, 86, page 3833). After immunizing animals with B lymphocyte antigen, The antibody repertoire of the pooled B cell pool is cloned. Oligomer primer Digestion of immunoglobulin molecules by using a mixture of primers and PCR. Methods for directly obtaining the DNA sequence of the variable region of a cluster are generally known. An example For example, 5'leader (signal peptide) sequence and / or framework 1 Mixed oligonucleotide primers corresponding to the (FR1) sequence, as well as conserved To the 3'constant region primer prepared from several mouse antibodies. It can be used for PCR amplification of heavy and light chain variable regions (Laurit (1991), Biotechniques, Vol. 11, pages 152-156). Similar strategy used to amplify human heavy and light chain variable regions from human antibodies Can (Larrick et al. (1991), Methods: Companio) n to Methods in Enzymology, Vol. 2, pp. 106-110 ).   In an exemplary embodiment, for example, activated B cells from a peripheral blood cell, bone marrow, or spleen sample. RNA is isolated from the cells using standard protocols (see, eg, US Pat. No. 4, 683202; Orlando, et al., PNAS (1989), Vol. 86, 3833-3. 837; Sustain et al., PNAS (1989), Vol. 86, 5728-5732. And Hughes et al. (1989), Science, 246, 1275-128. 1 page). The first cDNA strand contains a constant region for the heavy chain and for each of the kappa and lambda light chains. Using primers specific for the signal sequence and the signal sequence. To achieve. Using variable region PCR primers, the variable regions of both heavy and light chains Can be used alone or in combination to amplify a display package. Ligation into the appropriate vector for further manipulation. For amplification protocol Are useful oligonucleotide primers unique or degenerate? , Or inosine can be incorporated at the degenerate position. Vector amplified fragment Clone into open reading frame for predetermined expression in Therefore, a restriction endonuclease recognition sequence should also be incorporated into this primer. Can be.   V gene line cloned from immunization-induced antibody repertoire The blurry is preferably a fiber for forming an antibody display library. Expressed by a population of display packages derived from filamentous phage be able to. Ideally, this display package is extremely versatile. Stable antibody display library sampling, rapid resolution after each affinity separation step And easy isolation of antibody genes from purified display packages Including possible systems. Available for generation of phage display libraries Commercially available kits (eg, Pharmacia recombinant phage antibody system, catalog number 27-9400-01; and Stratagene's SurfZAP ™ fur. DiDisplay Kit, Catalog No. 240612), plus a variety of antibody displays Examples of methods and reagents specifically amenable to use in generating spray libraries include, for example: For example, Radnor et al., US Pat. No. 5,223,409; Kung et al., International Publication No. WO92. / 18619; Dower et al., International Publication No. WO91 / 17271; Winter International publication WO92 / 20791; Markland et al., International publication WO92 / 1 5679; Breitling, International Publication WO93 / 01288; McCaffer T. et al., International Publication No. WO92 / 01047; Garrard, et al., International Publication No. WO92 / 09690; Radnor et al., International Publication No. WO90 / 02809; Fach et al. (1991), Bio / Technology, 9: 1370-1372; Lee et al. (1992), Hum Antibode Hybridomas, Vol. 81 -85; Hughes et al. (1989), Science, 246, 1275-12. 81; Griffuts et al. (1993, EMBO J 12: 725-734; Ho) Kinds et al. (1992) J Mol Biol 226, 889-896; Laxon et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Gram Et al. (1992), PNAS, 89, 3576-3580; Garad et al. (1991). ), Bio / Technology, 9: 1373-1377; Mu et al. (1991), Nuc Acid Res 19: 4133-4137; And Barbus et al. (1991), PNAS, 88, pages 7978-7982. You can get out.   In some embodiments, the heavy and light chain V region domains are on the same polypeptide. Expressed and linked by a variable linker to form a single chain Fv fragment, Then, the scFV gene is introduced into the desired expression vector or phage genome. Can be cloned. McCafferty, Nature (1990) ), Variability (Gly.Four -Ser)ThreeComplete V of antibody linked by linkerHAnd VLUse domain The display package can be separated based on the antigen affinity. Single-chain antibody can be generated. Then, the activity of B lymphocyte antigen Isolated scFV antibody that immunoreacts with a peptide that is used in the method of the invention. Can be formulated into a medicinal preparation for.   If displayed on the surface of a display package (eg filamentous phage) For example, this antibody library is used for the B limb sphere antigen protein or its peptide fragment. And express antibodies with specificity for B lymphocyte antigens Identify and isolate the desired package. The nucleic acid encoding the selected antibody is labeled Recovered from the display package (eg from the phage genome) and standardized recombination It can be subcloned into other expression vectors by DNA technology.   The antibody of the present invention is a receptor: ligand interaction that is required for co-stimulation of T cells. Blockade can be used therapeutically to inhibit T cell activation . These so-called "blocking antibodies" refer to in vitro costimulatory agents described herein. It inhibits T cell proliferation and / or cytokine production when added to the assay. It can be identified by their ability. Of blocking antibodies that inhibit T cell function The ability is to immunosuppress and / or tolerate these antibodies when administered in vivo. Can bring.   C. Protein purification.   Polyclonal or monoclonal antibodies according to the invention, eg B7-2 activity Alternatively, an antibody that specifically reacts with a recombinant or synthetic peptide having B7-3 activity The body may further be used to isolate native B lymphocyte antigens from cells. it can. For example, using an antibody that reacts with this peptide, Is immunoaffinity chromatography from native B7-2 activated B lymphocytes Can be isolated by In addition, native B7-3 is a monoclonal Isolated from B cells by immunoaffinity chromatography using antibody BB-1 be able to.   D. Other therapeutic reagents.   The nucleic acid sequences and novel B lymphocyte antigens described herein are T cell mediated Upregulation (eg amplification) or downregulation (eg establishment of suppression or tolerance) of epidemiological reactions Can be used to develop therapeutic reagents with the ability to You. For example, soluble, monomeric forms of the B7-2 antigen or B7-2 fusion protein, eg Peptides having B7-2 activity, including B7-2Ig, and initial activation Anti-B7-inability to send costimulatory signals to signal-receiving T cells 2 antibody is used to block the B7-2 ligand on T cells, thereby immunizing the subject. Can provide specific means of inducing epidemic control and / or inducing tolerance You. Such blocking or inhibiting B lymphocyte antigens and fusion proteins and blocking antibodies The body is a T cell when added to an in vitro costimulation assay as described herein above. It can be identified by its ability to inhibit proliferation and / or cytokine production. Wear. In contrast to the monomeric form, stimulated B7-2, eg intact cell surface B7- 2 retains the ability to transmit costimulatory signals to T cells, resulting in Increased secretion of cytokines compared to activated T cells that have not received a secondary signal Add   In addition, a second peptide having the activity of another B lymphocyte antigen (eg B7-1). Using a fusion protein consisting of a first peptide having the activity of B7-2 fused to Can modify the T cell-mediated immune response. Alternatively, B lymphocyte antigen , Two separate peptides having, for example, the activities of B7-2 and B7-1, or , A combination of blocking antibodies (eg anti-B7-2 and anti-B7-1 monoclonal anti- Body) as a single composition or administered separately (simultaneously or sequentially) And upregulate or downregulate a T cell-mediated immune response in a subject. You. Furthermore, one or more having B7-2 activity and / or B7-1 activity Therapeutically effective amounts of the above peptides can be used with other immunomodulatory reagents to affect the immune response. It can have a sound. Examples of other immunomodulatory reagents include blocking antibodies such as CD2. 8 or CTLA4, against other T cell markers, or Against itokine, fusion proteins such as CTLA4Ig, or immunosuppressants , For example, cyclosporin A or FK506.   The peptide produced from the nucleic acid molecule according to the present invention is further produced by T cell destruction It can be useful in the assembly of therapeutic agents that block T cell function. For example, As listed, the secreted form of the B lymphocyte antigen is expressed by standard genetic engineering techniques. Can be assembled. Soluble form of B7-1, B7-2 or B7-3 By linking toxins such as ricin, a substance that can prevent T cell activation is produced. Can be achieved. One or a combination of immunotoxins into the patient's body, eg For example, infusion of B7-2-lysine, B7-1-lysine can result in T cells, especially higher CD It can result in the death of activated T cells expressing 28 and CTLA4. One price of The soluble form of B7-2 alone is also useful in blocking B7-2 function as described above. In this case, carrier molecules may also be used.   Another way to interfere with the function of B lymphocyte antigens is with antisense or trypsin. This is due to the use of Rex oligonucleotides. For example, B7-1, B7 -2 or an oligonucleotide complementary to a region near the B7-3 translation initiation site (For example, for B7-1, TGGCCCATGGCTTCAGA (SEQ ID NO: 20) Nucleotides 326-309, and GCCAAAA for B7-2. TGGATCCCCA (SEQ ID NO: 21) can be synthesized. 1 or it The above antisense oligonucleotides, typically at 200 μg / ml, B7-1, B7-2 and / or B It can interfere with the synthesis of 7-3. Antisense oligonucleotides in cells Is taken up and hybridizes with the appropriate B lymphocyte antigen mRNA to prevent translation. Get out. Alternatively, by binding to double-stranded DNA to form a triplex assembly Oligonucleotides that prevent unwinding and transcription of DNA can also be used. In either result, synthesis of one or more B lymphocyte antigens is blocked You.   E. FIG. For therapeutic use by down-regulation of immune response.   The structures and functions of the novel B lymphocyte antigens disclosed herein are not provided. , Down-regulates the function of B lymphocyte antigens in several ways, which results in an immune response. Can be adjusted downward. Down-regulation blocks the already ongoing immune response. Or may be in a blocking form or may include prevention of induction of an immune response . The function of activated T cells is to suppress T cell responses or to activate T cells. To induce specific tolerance or by both it can. Immunosuppression of the T cell response generally refers to T cells being constantly exposed to suppressive drugs. Is a vigorous, non-antigen-specific process that requires Tolerance does not affect T cells Inducing responsiveness or anergy, which is generally antigen-specific. And persists after exposure to tolerizing agents, distinguishing it from immunosuppression Wear. Operationally, tolerance is T upon re-exposure to specific antigen in the absence of tolerizing agent. Cell counter It can be proved by the lack of response.   Downregulating or interfering with one or more B lymphocyte antigen functions, eg Prevention of high-level lymphokine synthesis by activated T cells is impaired in tissues, skin and organs. It may be useful in the context of transplantation as well as in graft-versus-host disease (GVHD). For example, Blocking T cell function must result in reduced tissue destruction during tissue transplantation. Typical In a tissue transplant, rejection of the graft may result in T cells that are exogenous. It begins with the recognition of, followed by an immune response that destroys the graft. B7 lymph Inhibits or blocks the interaction of sphere antigen with its natural ligand on immune cells (For example, a soluble monomeric peptide having B7-2 activity alone or Or another monomeric form having the activity of another B lymphocyte antigen (eg, B7-1, B7-3) Peptide or blocking antibody) prior to transplantation. Binding of the molecule to its natural ligand on immune cells without the transmission of costimulatory signals. Can be made. Blocking B-lymphoblast antigen function in this manner is associated with immune cells, eg, For example, it prevents cytokine synthesis by T cells and thus acts as an immunosuppressive means I do. Moreover, the lack of co-stimulation is sufficient for the anergy of T cells, which Tolerance can be induced in the subject. Long-term tolerance by B lymphocyte antigen blocking reagent Induction of E. coli can circumvent the need for repeated administration of these blocking reagents. Enough exemption for the target In order to achieve epidemic control or tolerance, the function of the combined B lymphocyte antigens should be blocked. It may also be necessary to decline. For example, having the activity of each of those antigens Administration of soluble forms of the peptides or blocking antibodies prior to transplantation (separate or Or in a single composition), B7-2 and B7-1, B7- 2 and B7-3, B7-1 and B7-3 or B7-2, B7-1 and B It may be desirable to block 7-3 functions. Alternatively, the inhibitory form of B Lymphocyte antigens against other inhibitors such as other T cell markers or Blocking antibodies to tokines, other fusion proteins such as CTLA4Ig, or immunization It can also be used with depressants.   The effectiveness of certain blocking agents in preventing organ transplant rejection or GVHD has been shown to humans. Can be evaluated using an animal model that is expected to be effective. B7-1's Functionally important aspects are structurally conserved among species and, therefore, other B lymphocyte antigens. May also function across species, thus activating reagents composed of human proteins. It can be used in physical systems. An example of a suitable system that can be used is the same system in rats. Includes interspecies heart transplants and xenogeneic islet cell transplants in mice. As for the gap, Renshaw et al., Science, 257, pp. 789-792 (199 2) and Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 CTLA4Ig fusion protein as described in Vol. 11102-11105 (1992). It was used to investigate the immunosuppressive effect of white in vivo. In addition, GVHD Mouse model (Paul, Fundamental Immunology, Raven Press) , New York, 1989, pp. 846-847). To determine the effect of in vivo B lymphocyte antigen function blockade on disease progression it can.   For example, a peptide having B7-2 activity alone or having B7-1 activity Use in combination with peptide and / or peptide having B7-3 activity Therefore, blocking B lymphocyte antigen function also cures autoimmune diseases. It may be useful for medical treatment. Many autoimmune diseases are T cells that are responsive to self tissue. Cells are the result of inappropriate activation of the cytoplasm, which is involved in the pathology of this disease. And promotes the production of autoantibodies. Prevention of activation of autoreactive T cells Symptoms may be reduced or eliminated. B lymphocyte antigen receptor: ligand interaction Of T cells by administration of reagents that block co-stimulation of T cells by destroying Induced by autoantibodies or T cells that inhibit activation and may be involved in the disease process It is possible to prevent the production of cytokines. In addition, blocking reagents are self-reactive It induces T cell antigen-specific tolerance, which leads to long-term cure from the disease. You. The effectiveness of blocking agents to prevent or reduce autoimmune disease has been demonstrated by several well-established agents. It can be measured using a determined animal model of human autoimmune disease. An example Include mouse experimental autoimmune encephalitis, MRL / lpr / lpr mice or NZ Systemic lupus erythematosus in B hybrid mice, mouse autoimmune collagen function Arthritis, diabetes mellitus in NOD and BB rats, and experimental weight in mice Includes myasthenia gravis (Paul, Fundamental Immunology, Rave) N. Press, New York, 1989, 840-856).   IgE antibody response in atopic allergy is highly T cell-dependent Therefore, inhibition of T cell activation induced by B lymphocyte antigens is And may be therapeutically useful in treating allergic reactions. Inhibitory B7-2 protein, For example, a peptide having B7-2 activity alone or with another B lymphocyte antigen, eg For example, when administered to an allergic patient in combination with a peptide having the activity of B7-1, The patient's T cell-mediated allergic reaction can be inhibited. B cell phosphorus in T cells Inhibition of papillary antigen co-stimulation may result in exposure to allergens bound to appropriate MHC molecules. Can be accompanied. The nature of the allergic reaction depends on the route of entry of the allergen and mast cells. Or systemic or local, depending on the pattern of IgE deposition on basophilic cells. Can be Therefore, by appropriately administering the inhibitory B7-2 protein, the T cell-mediated allele It may be necessary to inhibit the gee reaction locally or systemically.   Inhibition of T cell activation by blocking B lymphocyte antigen function is associated with viral sensitization of T cells. It can also be therapeutically important during dyeing. For example, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) In), viral replication is stimulated by T cell activation. B7-2 machine Blockade of activity leads to lower levels of viral replication, thereby leading to AIDS translocation. Improve the fault. Furthermore, the combined B lymphocyte antigens, namely B7-1, B7- Blocking the functions of 2 and B7-3 may also be required. Amazingly, HTLV-I infected T cells express B7-1 and B7-2. This expression Is important in the growth of HTLV-I-infected T cells, and also in B7-2 and And / or blockade of B7-1 function with B7-3 function is HTLV-I induced white blood It may slow down the progression of the disease. Alternatively, a sufficient amount of the plasmid can be isolated and used. For the purpose of producing Torovirus, by contact with the stimulated B7-2 protein And may stimulate the replication of the virus by activating T cells.   F. Therapeutic use by up-regulating the immune response.   Upregulation of B lymphocyte antigen function as a means of upregulating the immune response is also curable. It can be useful for medical treatment. Up-regulation of the immune response promotes the existing immune response or Can be in the form of manifestation of the first immune response. For example, the B lymphocyte antigen function Enhancement of the immune response by violence can be useful in the case of viral infections. C Ils infection is largely cleared by cytolytic T cells. According to the invention, T B7-2 with its natural ligand on cells, and thus B7-1 and B7-3, It may result in an increase in at least some T cell cytolytic activity. In addition, B7 -2, B7-1 and B7-3 activate and activate CD8 + cytotoxic T cells early. It is believed that they are involved in success. Activity of B lymphocyte antigen alone or with another In a multivalent form in combination with a peptide having Thus, adding Tide to stimulate T cell activity via the costimulatory pathway is thus , Therapeutically useful in situations where faster or complete clearance of the virus would be advantageous Will be These are viral skin diseases such as herpes or shingles. A multivalent soluble peptide having B7-2 activity, including Such peptide and / or peptide having B7-1 activity and / or B7 A combination of peptides with -3 activity is applied topically to the skin. In addition, Systemic viral diseases such as influenza, colds, and encephalitis are stimulatory It may be ameliorated by systemic administration of the Npasphere antigen.   Alternatively, removing T cells from a patient and expressing a peptide having B7-2 activity (Alone or with a peptide having B7-1 activity and / or having a B7-3 activity APC pulsed with viral antigen) in combination with Or a stimulated form of a soluble peptide having B7-2 activity (alone or B7-1 activity In combination with active peptide and / or peptide having B7-3 activity Co-treatment of T cells in vitro with APCs pulsed with viral antigen. Reintroducing the same stimulated and this in vitro activated T cells into the patient Can also enhance antiviral immune response in infected patients . Another way to enhance the antiviral immune response is to separate infected cells from the patient. , They encode peptides having the activity of the B lymphocyte antigens described herein I Cell surface is transfected with the B lymphocyte antigen. , For example, all or part of B7-2 or B7-3 is expressed, and Leveraging the transfected cells back into the patient. So Infected cells can then transmit costimulatory signals to T cells in vivo, And thus could be able to activate T cells.   Stimulated B lymphocyte antigen used prophylactically in vaccines against various pathogens You can also. Immunity to pathogens such as viruses is Peptide having B7-2 activity or B lymphocyte antigen activity By vaccination with a viral protein with a stimulatory form of another peptide Can be induced. Alternatively, peptides with pathogenic and B lymphocyte antigen activity may be used. Expression vectors encoding genes for both peptides, eg viral proteins. A nucleic acid encoding white and a pep having B7-2 activity as described herein. Vaccinia virus assembled to express a nucleic acid encoding tide The expression vector can also be used for vaccination. For example, B7-2 activity Peptide and MHC class I α chain protein and β2Same as microglobulin Cells with a class I MHC protein B7-2 presentation also results in activation of cytolytic CD8 + T cells Provides immunization from Ruth infection. Pathogens for which the vaccine may be useful include B Hepatitis C, hepatitis C, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, H IV-1, HIV-2, tuberculosis, malaria and schistosomiasis are included.   In another embodiment, one or more soluble having B lymphocyte antigen activity To administer a stimulated form of the peptide to patients with tumors to induce antitumor immunity Can provide a co-stimulatory signal for T cells of the.   G. FIG. Modification of tumor cells to express co-stimulatory molecules.   Tumor cells fail to elicit costimulatory signals on T cells because Lack of expression in the offspring, even if the tumor cells are capable of expressing such molecules Failure to express co-stimulatory molecules and insufficient expression of co-stimulatory molecules on the surface of tumor cells Or lack of expression of appropriate costimulatory molecules (eg B7-2 and And / or expression of B7 but not B7-3). Therefore, the present invention According to one embodiment of the method, the tumor cells are treated with B7-2 and / or B7-2 at the tumor cell surface. Encodes B7-2 and / or B7-3 in a form suitable for expression of B7-3 Transfecting the tumor cells with B7-2 and / or Modifies to express B7-3. Alternatively, the tumor cells can be Contact with a substance that induces or enhances the expression of B7-2 and / or B7-3 of To modify. In yet another aspect, B7-2 and / or B7-3 is attached to the surface of tumor cells to produce modified tumor cells. this These and other aspects are described in further detail in the subsections below.   (1) Transfection of tumor cells with nucleic acid encoding costimulatory molecule Yon.   The isolated tumor cells are suitable for expressing the molecule on the surface of the tumor cells. In the form of a nucleic acid encoding B7-2 and / or B7-3 and B7-1. By transfecting, B7-2 or B7-3 alone or B7- This tumor cell can be modified ex vivo to be expressed in combination with 1. Wear. The term "transfection" or "transfected with" means Means the introduction of a causative nucleic acid into mammalian cells, electroporation, calcium phosphate Precipitation, DEAE dextran treatment, lipofection, microinjection Nucleic acid into mammalian cells, including infection with viral vectors and viral vectors. It includes a variety of techniques useful for entry. Transfect mammalian cells Suitable methods for doing this include Sambrook et al. (Molecular Cloning: Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratories Tory Press (1989) and other laboratory textbooks. it can. The nucleic acid to be introduced encodes, for example, B7-2 and / or B7-3. Encoding the DNA, including B7-2 and / or B7-3 A sense strand RNA, or encoding B7-2 and / or B7-3 It may be a recombinant expression vector containing the cDNA. Encodes human B7-2 The nucleotide sequence of the cDNA is shown in the sequence listing.   Introducing a nucleic acid encoding B7-2 and / or B7-3 into tumor cells A preferred approach for encoding B7-2 and / or B7-3 A nucleic acid, such as a cDNA, that contains a viral vector. Use An example of a viral vector that can be used is a retroviral vector (MA Eglite). Et al., Science, 230, 1395-1398 (1985); Da Nos and R.S. Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6460-6464 (1988); D. Markovitz et al. Vir ol. , 62: 1201-1124 (1988)), adenovirus vector. (MA Rosenfeld et al., Cell, 68, pp. 143-155 (1992). )) And adeno-associated virus vectors (JD Tratchin et al., Mol. Ce. ll. Biol. 5: 3251-3260 (1985)). Hui Infection of tumor cells with a loose vector causes most of the cells to accept the nucleic acid and Thereby avoiding the need for selection of cells that have received the nucleic acid, and also for example viral The part encoded in the viral vector by the cDNA contained in the vector Offspring are efficiently expressed in cells that have taken up the viral vector nucleic acid. Has advantages.   Alternatively, B7-2 and / or B7-3 is B7-2 and / or B7 A plasmid expression vector containing a nucleic acid encoding 7-3, such as cDNA, Can be used to express on tumor cells. A preferred plasmid expression vector is CDM8 (B. Seed, Nature, 329: 840 (1987)) and pMT2. PC (Kaufman et al., EMBO J., Vol. 6, pages 187-195 (1987)) Include. Suitable vectors for expressing nucleic acids in host cells, eg tumor cells And methods are described in further detail herein.   Transfection of a tumor cell is a modification of the tumor cell When it leads to efficient expression of B7-2 and / or B7-3 on the surface of cells , For example, when using viral expression vectors, the tumor cells may be further isolated or Can be used without subcloning. Alternatively, transfect A homogeneous population of transfected tumor cells is limited to one transfected tumor cell. World Diluted and cloned, and then the single tumor cell was cloned using standard techniques. It can be prepared by expanding into a population.   (2) Induction or enhanced expression of costimulatory molecules on the surface of tumor cells.   Capable of expressing B7-2 and / or B7-3 but not capable of doing so Or B7-3 and / or B7-3 in insufficient amounts to activate T cells. Induce or express B7-2 and / or B7-3 expression on the emerging tumor cells. By inducing a co-stimulatory signal in T cells by enhancing the bell, Tumor cells can be modified. B7-2 and / or B7- on tumor cells Expression of B7-2 and / or B7-3 in order to induce or enhance expression of 3 Exciting substances can be used. For example, tumor cells can be It can be contacted with this substance. Origination of B7-2 and / or B7-3 Substances that stimulate the current state, for example, increase the transcription of the B7-2 and / or B7-3 genes. Strengthen to enhance translation of B7-2 and / or B7-3 mRNA Or by stability of B7-2 and / or B7-3 to the cell surface It can act by enhancing sex or transport. For example, the expression of B7 is c Can be upregulated intracellularly by a second messenger pathway involving AMP Are known. N. Navavie et al., Nature, 360, 266-268 (1 992). B7-2 and B7-3 are similarly inducible by cAMP. That is, tumor cells have increased intracellular cAMP levels, or cAMP analogs A substance similar to cAMP, such as dibutyryl cAMP, Can stimulate B7-2 and / or B7-3 expression on the tumor cell surface of You. Cell surface MHC class II molecules on B cells against MHC class II molecules Induction of B7 expression on normal quiescent B cells by cross-linking with an antibody Is also known. L. Quorova et al., J. Exp. Med. , Volume 173 75 9-762 (1991). Similarly, cell surface MHC class II molecules on B cells B7-2 and B7-3 can be induced on resting B cells by cross-linking. Therefore, the tumor cells expressing MHC class II molecules on their surface are treated with anti-MHC clones. B7-2 and / or B7-3 on the tumor cell surface after treatment with Ras II antibody Expression can be induced or enhanced. In addition, the expression of B7-2 on B cells Interleukin 4 (IL-4), which has been shown to induce, is used to Expression of B7-2 on vesicles can be upregulated (RM Stack et al., J. Mol. Cell. Biochem. Suppl. 1 (18) 434 (1994) .   Induce or enhance B7-2 and / or B7-3 expression on the surface of tumor cells Another substance that can be used for transcription is the transcription of the gene encoding the co-stimulatory molecule. Is a nucleic acid encoding a transcription factor that up-regulates. Co-stimulatory molecular gene Transfecting this nucleic acid into tumor cells to enhance transcription, resulting in It can lead to increased cell surface levels of co-stimulatory molecules.   (3) Binding of costimulatory molecules to the surface of tumor cells.   In another embodiment, B7-2 and / or B7-3 are attached to the surface of tumor cells. When combined, these tumor cells induce co-stimulatory signals in T cells. Modify as possible. For example, B7-2 and / or B7-3 molecules are Standard recombinant DNA technology and expression allowing production and isolation of homologous molecules Can be obtained using the system. Alternatively, B using standard protein purification techniques 7-2 and / or B7-3 can be isolated from cells expressing a co-stimulatory molecule. Can also be. For example, the B7-3 protein is an anti-B protein such as the BB1 monoclonal antibody. Can be isolated from activated B cells by immunoprecipitation using the 7-3 antibody . The isolated co-stimulatory molecule is then allowed to bind to tumor cells. "Combined" again Means "attached" by which B7-2 and / or B7-3 Bind to tumor cells, resulting in co-stimulatory molecules being present on the surface of tumor cells and Chemical, enzymatic or other means capable of inducing a costimulatory signal in (Eg, antibody). For example, B7-2 and / or B7-3 are commercially available Of tumor cells using commercially available crosslinking reagents (Pierce, Rockford, IL) The surface can be chemically crosslinked. B7-2 and / or B7-3 Another approach to binding vesicles is to use costimulatory molecules and cell surface molecules on tumor cells. The use of bispecific antibodies that bind to both. Bound to the surface of tumor cells Retains the ability to elicit costimulatory signals in T cells when challenged, B7 -2 And / or fragments, mutants or variants of B7-3 are also used Can be   (4) Modification of tumor cells to express multiple co-stimulatory molecules   Another aspect of the invention is that it has been modified to express multiple costimulatory molecules. It is a tumor cell. Transient expression of a co-stimulatory molecule on activated B cells resulted in B7, Different for B7-2 and B7-3. For example, B7-2 is a B cell activity After transcription, it is expressed early, while B7-3 is expressed later. That is, different joint A virulent molecule can serve distinct functions during the course of an immune response. Effective T cells Response of T cells to co-stimulatory signals from multiple co-stimulatory molecules May be necessary. Therefore, the present invention produces one or more costimulatory molecules. Includes tumor cells that have been modified to manifest. For example, tumor cells are B7-2 and And B7-3 can be modified to express both. Alternatively, B7-2 Tumor cells modified to express B7 are further modified to express B7-1 You can also. Similarly, tumor cells modified to express B7-3 were transformed into B7- It can be further modified to express 1. B7-1, B7-2 and B7 Tumor cells can also be modified to express -3. Described herein Multiple co-stimulatory molecules (eg B7-1 and B7-2) can be generated by any technique. Tumor cells can be modified to express.   Tumor cells may not express any costimulatory molecules prior to modification Or one co-stimulatory molecule may be expressed but another may not. Tumor cells, as described herein, contain nucleic acids encoding co-stimulatory molecules. Induces Co-stimulatory Molecule Expression by Transfecting Human Tumor Cells Or by attaching a costimulatory molecule to the tumor cell. It can be decorated. For example, transfection with a nucleic acid encoding B7-2 Tumor cells were further transfected with a nucleic acid encoding B7-1. can do. Human B7-1 cDNA and deduced amino acid sequence It is shown in the sequence listing. Alternatively, more than one type of modification can be made. For example, B Tumor cells transfected with a nucleic acid encoding 7-2 were transformed into B7-1 It can be stimulated with a substance that induces expression.   (5) Further tumor cell modification to express MHC molecules.   Yet another aspect of the invention is that the co-stimulatory molecule is expressed and one or more M The expression of HC molecules on their surface allows T cells to produce co-stimulatory signals and primary It is characterized by tumor cells that have been modified to elicit both antigen-specific signals. Repair Before decoration, tumor cells may not be able to express MHC molecules and May have the ability to express, but may not be able to express such molecules, or T cells May not express sufficient amounts of MHC molecules on tumor cells to trigger activation Yes. Tumor cells are either MHC class I or MHC class II molecules, and Can be modified to express both. Tumor cells to express MHC molecules One approach to modifying cells is to encode one or more MHC molecules Transfecting tumor cells with one or more nucleic acids that are present. Another The method involves inducing or increasing the expression of one or more MHC molecules on tumor cells. Tumor cells can also be modified with potentiating agents. Tumor peptide on CD4+ MHC class II presented directly to T cells+Tumor cell capacity MHC class II+MH on tumor cells because it avoids the need for PC Induction or enhancement of expression of C class II molecules leads to CD4 on tumors+T cell activity It can be especially beneficial for sexualization. Soluble tumor antigen (tumor cell debris or fraction (Produced protein form) is a professional MHC class II+Taking by APC This may improve the immunogenicity of the tumor as it cannot be used for embedding.   One aspect of the invention is B7-2 and / or B7-3 and 1 or A modified tumor cell that expresses more than one MHC class II molecule on the cell surface You. MHC class II molecules are structurally cleaved to which the antigenic peptide binds. It has a function of presenting the bound peptide to the antigen-specific TcR, including It is a cell surface α / β heterodimer. Multiple different MHC class II proteins White is a different MHC class II protein expressed on professional APC Bind to different antigenic peptides. Therefore, the emission of multiple MHC class II molecules Presently, antigenic peptides that can be presented by APCs or modified tumor cells Increase the spectrum of the source. The α and β chains of MHC class II molecules are different Coded by the gene. For example, human MHC class II protein HLA-DR Is encoded by the HLA-DRα and HLA-DRβ genes. Further In addition, many polymorphic alleles of the MHC class II gene have been identified in humans and other Present in the seed. The T cells of a particular individual are antigenic peptides bound to their MHC molecules. Responsive to stimulation by tid, a phenomenon called MHC restriction. In addition, T-cells are a polymorphic allele of the MHC molecule found on cells of other individuals. It is also possible to respond to the stimulus caused by, which is a phenomenon called homogeneity. MHC For a review of class II structure and function, see Germain and Marguri. , Ann. Rev .. Immunol. 11: 403-450, 1993, Please refer to.   Another aspect of the invention is B7-2 and / or B7-3 and 1 or It is a modified tumor cell that expresses the above MHC class I molecules on the cell surface. There are multiple MHC class I genes, as well as MHC class II genes. Many polymorphic alleles of the gene have been found in humans and other species. Like MHC class II proteins, class I proteins are required for presentation to T cells. It binds to peptide fragments of the antigen. The functional cell surface class I molecule is β2 It is composed of MHC class I α chain protein bound to microglobulin protein.   (6) Transfection of tumor cells with nucleic acid encoding MHC molecule N.   One or more MHC class II alpha chains and one or more MHC chains Ras II β chain in a form suitable for expression of MHC class II molecules on the surface of tumor cells The isolated tumor cells are transduced with one or more encoding nucleic acids. Expresses one or more MHC class II molecules by sfecting Tumor cells can be modified ex vivo. Surface heterodimer Both the α and β chain proteins must be present in the tumor cells to form Neither of these chains alone would be expressed on the cell surface. Many mouse and human The nucleic acid sequence of the Ras II gene is known. For example, L. Hoods, Ann. R ev. Immunol. 1, 529-568 (1983) and C.I. Orph Ray and J. L. Stromminger, Advances in Human G See enetics, 15: 197-247 (1987). Preferred In other words, the introduced MHC class II molecule is a self MHC class II molecule. Another As a method, the MHC class II molecule is a foreign allogeneic MHC class II molecule Good. Specific foreign MHC class II molecules to be introduced into tumor cells are Cells expressing a foreign MHC class II molecule in T cells derived from a subject Induces to increase and / or secrete cytokines when stimulated by cells Can be selected by their ability to induce (ie, by the ability to induce a homologous reaction) it can. Tumor cells to be transfected should be MHC class II molecules may not be expressed on the surface or T cell response May be expressed in insufficient amounts to stimulate. Alternatively, transfer Tumor cells expressing MHC class II molecules prior to transfection were treated with additional different M Depending on the HC class II gene or other polymorphic pairs of MHC class II genes It is further transfected with the upright gene and the tumor cells are It is also possible to increase the spectrum of antigenic fragments that can be displayed.   As evidenced by proliferation by T cells and / or lymphokine production , MHC that retains the ability to bind peptide antigens and activate T cell responses Fragments, mutants or variants of the Ras II molecule are within the scope of the invention. It is thought to be. Preferred variants are cytoplasmic domains of one or both of the α and β chains. Mains are truncated MHC class II molecules. End of cytoplasmic domain Truncation involves binding of peptides by MHC class II molecules and MHC class II Cross-linking of cell surface MHC class II molecules that allows cell surface expression of the molecule Intracellular signa produced by the cytoplasmic domain of the MHC class II protein chain during development It is known to prevent the induction of endogenous B7 expression elicited by leukemia. L. Quorova et al., J. Exp. Med. 173, 759-762 (1991). N .; Navavi et al., Nature, 360, 266-268 (1992). B Expression of 7-2 and B7-3 is also due to cross-linked surface MHC class II molecules. Tsu Induced and thus truncation of MHC class II molecules is B7-2 and / or Or it may also interfere with the induction of B7-3. Constitutive origination of B7-2 and / or B7-3 In co-transfected tumor cells, the endogenous costimulatory molecule Inhibit the expression of, for example, suppress possible down-regulatory feedback mechanisms May be desirable. Truncated cytoplasmic domain MHC class IIα And transfection of tumor cells with nucleic acids encoding β-chain proteins , Endogenous B7-1 expression and possibly endogenous B7-2 and B7-3 expression. Will also hinder. Such mutants are, for example, MHC class II chain genes. Introducing a stop codon after the nucleotide encoding the transmembrane region in Can be generated by Cytoplasmic domain of either α-chain or β-chain protein Or a more complete B7 (and possibly B7-2 and / or Is capable of truncating both α and β chains to inhibit B7-3) induction. Wear. For example, Griffith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4847-4852 (1988), Navavi et al., J. Am. Immunol. , 142, 1444-1447 (1989).   Tumor cells transfected with nucleic acid encoding MHC class I α chain protein Can be modified to express an MHC class I molecule. For examples of nucleic acids, see L. Hoods, Ann. Rev .. Immunol. Volume 1 529-568 (1983) and C.I. Aufrey and J. L. Stromin Garr, Advances in Human Genetics, Volume 15 197 See page -247 (1987). If desired, the tumor cells are If it does not express globulin, encode it as β2 microglobulin protein. It is also possible to transfect the nucleic acid. For examples of nucleic acids, see D. Gusou et al., J. Immunol. 139, pp. 3132-3138 (1987). And J. R. Pans et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2253-2257 (1981). MHC class II minutes MHC class I gene or MHC class I expressed in tumor cells as in offspring By increasing the number of polymorphic alleles of the gene, the tumor cells Can increase the vector of antigenic fragments that can be presented to Wear.   One or more molecules, eg B7-2 and / or B7-3 molecules, MHC class I Tumor cells with nucleic acids encoding I α chain protein and MHC class II β chain protein When transfecting, this transfection can be performed simultaneously or sequentially. Can be If transfections are to be done simultaneously, code The molecules are the same unless the sequence to be used exceeds the capacity of the particular vector used. It can be introduced on the nucleic acid. Alternatively, encoding the molecule by separate nucleic acids You can also Sequential transfection and tumor cell selection marker Associated with the first introduced nucleic acid, one selection marker when selected using , While a different selectable marker is used in association with the next introduced nucleic acid. Can be   Expression of MHC molecules (class I or class II) on the cell surface of tumor cells is For example, using fluorescently labeled monoclonal antibodies against different MHC molecules It can be measured by immunofluorescence of tumor cells. Non-polymorphism of specific MHC molecules Sex region (non-allele specific) or polymorphic region of a particular MHC molecule (allele) Specific antibody) can be used. These are then known to the person skilled in the art.   (7) Enhancement of induction or expression of MHC molecules on tumor cells.   Ex vivo modification of tumor cells to express MHC molecules on the surface of tumor cells Another approach induces or enhances the expression of MHC molecules on the tumor cell surface Therefore, it is necessary to use a substance that stimulates the expression of MHC molecules. For example, tumor The cells can be contacted with the substance in vitro in a culture medium. MHC molecule The substance that stimulates the expression of, for example, MHC class I and / or class II MHC class I and / or class II by enhancing gene transcription by enhancing translation of mRNA, or by MHC class I and / or Enhances cell surface stability or transport of class II proteins You can work by Cell surface expression of MHC class II molecules by some substances Have been shown to enhance the levels of. For example, M. Cockfield etc. J. Immunol. 144, 2967-2974 (1990); J . Noel et al. Immunol. 137, 1718-1723 (1986 ); J. Mondo et al., J. mmunol. 127, 881-888 (19 81); C.I. L. William et al. Exp. Med. , Volume 170 1559-1 567 (1989); Celada and R.M. Maki, J. Immunol. 1 46, 114-120 (1991) and L.S. H. Grimcher and C.I. J . Kara, Ann. Rev .. Immunol. 10, pp. 13-49 (1992) And their references. These substances include cytokines, etc. Antibodies to cell surface molecules of, and phorbol esters. Extensive One that up-regulates MHC class I and class II molecules in the pericellular type The substance is the cytokine interferon gamma. That is, for example, B7-2 and Tumor cells that have been modified to express B7-3 and / or B7-1 are interfering with -Further modification by contact with ferron γ to enhance expression of MHC molecule be able to.   It can also be used to induce or enhance the expression of MHC molecules on the surface of tumor cells Another substance up-regulates transcription of MHC class I or class II genes A nucleic acid that encodes a transcription factor. Such nucleic acids are transduced into tumor cells. Can be induced to enhance transcription of the MHC gene, resulting in M Increases cell surface levels of HC proteins. MHC class I and class II inheritance The offspring are regulated by different transcription factors. However, multiple MHC Multiple MHC class I genes work in concert, as does the Ras II gene. It is cursed. Therefore, it encodes a transcription factor that regulates the expression of the MHC gene. Transfection of tumor cells with nucleic acids can result in several different tumor cell surface The expression of MHC molecules can be enhanced. What regulates the expression of the MHC gene Several transcription factors have been identified, cloned, and characterized. An example For example, W. Rice et al., Genes Dev. 4, pp. 1528-1540 (19 90); C. Liu et al., Science, 247, pp. 1581-1584 ( 1 988); K. Didier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7322- 7326 (1988).   (8) Inhibition of expression of non-mutated chain in tumor cells.   Another aspect of the invention is a T cell costimulatory molecule (eg, B7-2 and / or Or tumor cells modified to express B7-3 and B7-1), wherein M Provide a tumor cell in which expression of a protein bound to HC class II, a non-mutant chain, is inhibited Is what you do. Expression of non-mutant chain is inhibited, and endogenous TAA peptide and MHC Binding to class II molecules is facilitated and antigen-MHC complexes are created. This compound Coalescence leads to T cells to induce T cell activation in association with co-stimulatory signals. Antigen-specific signals can be elicited. MHC class II molecule is It has been shown to be capable of presenting causative peptides. J. G. FIG. Nacturn, etc. , Nature, 343: 74-76 (1990); Weiss and B.W. Bo J. Cell, pp. 767-776 (1991). However, the MHC class Α- and β-chain proteins are expressed in the endoplasmic reticulum in cells that naturally express During the intracellular trafficking of this protein, it is bound to the non-mutant chain (hereinafter Ii). Ii is In part, by interfering with the binding of endogenous peptides to MHC class II molecules. Is believed to function. W. Elliott et al. Immunol. Volume 138 2949-2952 (1987); Stockinger, etc., Cell, Volume 56 683-689 (1989); Nature (Lo ndon), 343, 133-139 (1990); Bucket, Cell 63: 707-716 (1990); Lottore, Nature, 3 48, 600-605 (1990); Peters et al., Nature, 34 9: 669-676 (1991); Roche et al., Nature, Volume 345 615-618 (1990); Taton et al., Nature, 348 Vol. 39 -44 (1990). Is TAA endogenously synthesized in tumor cells? Therefore, peptides derived from these are considered to be available intracellularly. Accordingly Inhibition of Ii expression in tumor cells expressing Ii It may increase the likelihood of binding to class II molecules. Consistent with this work, Ii Gene By MHC Class II+, Ii-Supertransfection of tumor cells It has been shown to prevent stimulation of tumor-specific immunity by ulcer cells. V. K. Clement Tsu et al., J. Immunol. 149: 2391-2396 (1992).   Prior to modification, expression of Ii in tumor cells was determined by Northern blotting. Ii by detection of the presence or absence of Ii mRNA or by immunoprecipitation It can be evaluated by detecting the presence or absence of the protein. Inhibits the expression of Ii The preferred approach to do this is in the coding or regulatory region of the Ii gene. By introducing antisense nucleic acid into tumor cells, It was once described. N. Koch et al., EMBO J. , Volume 6 1677-1 683 (1987). For example, a nucleoside near the translation initiation site of Ii mRNA Oligonucleotides complementary to tide can be synthesized. 1 or it The above antisense oligonucleotide is typically added to a medium containing tumor cells, It can be added at an oligonucleotide concentration of 200 μg / ml. This Ann Thisense oligonucleotides are taken up by tumor cells and interact with Ii mRNA. Ibidize and interfere with translation. In another embodiment, the recombinant expression vector is Nucleic acid is used to bind to the coding or regulatory region of the Ii gene. Encode the sequence of the Ii gene in such a way that a sense mRNA is produced I have. Therefore, tumors transfected with this recombinant expression vector The cell is a continuous source of Ii antisense nucleic acids to prevent production of Ii proteins. including. Alternatively, the expression of Ii in a tumor cell may cause the expression of Ii in this tumor cell. Can also be inhibited by treatment with a substance that interferes with. For example, Ii Expression of genes, translation of Ii mRNA or stability or intracellular transport of Ii protein Drugs that inhibit can be used.   (9) The type of tumor cell to be modified.   Tumor cells that have undergone a modification as described herein include B7-2 and / or According to the invention for expressing B7-3 alone or in combination with B7-1. Transfected or treated by one or more of the included approaches. Tumor cells which can be If necessary, further modify this tumor cell To express an MHC molecule or an inhibitor of Ii expression. tumor Tumors that capture cells are naturally occurring in, for example, human patients. Well or, for example, experimentally induced or induced in an animal subject May be. Tumor cells are, for example, solid tumors of organs, such as lung, liver, breast, It can be obtained from tumors such as intestines and bones. Malignant tumors of solid organs include carcinoma , Sarcoma, melanoma and neuroblastoma. Tumor cells are lymphoma, bone marrow Obtained from blood-borne (ie dispersed) malignancies such as tumors or leukemias You can also.   Tumor cells to be modified have MHC on their cell surface prior to transfection. Those that express the molecule, and none or low levels of MHC class I and / or Or expressing class II molecules. A few of the normal cell types are MH Express C class II molecules. Therefore, many tumor cells naturally have MHC class I It is expected that it will not express the I molecule. These tumors are B7-2 and / or Or can be modified to express B7-3 and MHC class II molecules You. Some types of tumors, such as melanoma (Van Duinen et al., Cancer Res. 48, 1019-1025, 1988), and diffuse large cell lymphoma ( Okeen et al., Cancer, 66, 1147-1153, 1990), head and neck Squamous cell carcinoma (Matijusen et al., Int. J. Cancer) Vol. 0, 1991) and colorectal cancer (Muller et al., Int. J. Cancer, 6). Vol. 155-162, 1991) naturally express surface MHC class II molecules. Has been found to work. Tumor cells that naturally express class II molecules are B7-2 And / or B7-3, and additionally, to express other class II molecules. Decorate to increase the spectrum of TAA peptides that can be presented by the tumor cells. Let Can be Most non-malignant tumor cell types express MHC class I molecules. However, transformation into malignant tumors often involves MHC clusters at the surface of tumor cells. It is accompanied by down-regulation of expression of the S molecule. A. Shiba et al., Brit. J. Cancer, 50, 699-709 (1984). Importantly, the MHC Loss of expression of Ras I antigen may lead to greater aggression and / or metastasis of tumor cells. With ability. P. I. Schlier et al., Nature, 305, 771-775. (1983); C.I. A. Holden et al., J. Am. Acad. Dermatol . 9: 867-871 (1983); Vanillash et al., J. Immun ol. 129, 1318-1323 (1982). Inhibition of MHC class I expression Types of tumors shown to be harmed include melanoma, colorectal cancer and squamous epithelium. Cancer is included. Van Duinen et al., Cancer Res. , Volume 10 19-1025 (1988); Moller et al., Int. J. Cancer, Volume 6 1 55-162 (1991); Shiba et al., Brit. J. Cancer, 50 699-709 (1984); C.I. A. Holden et al., J. Am. Acad . Dermatol. 9: 867-871 (1983). Generation of class I molecules Tumor cells that cannot express or express only low levels of MHC class I molecules are , A tumor cell surface modified by one or more of the techniques described herein. Induces or enhances the expression of MHC class I molecules in mice and enhances the immunogenicity of tumor cells Can be advanced.   (10) Modification of tumor cells in vivo.   Another aspect of the invention is B7-2 and / or B7-3 and B7-1. To induce tumor cells to induce a co-stimulatory signal in T cells. Method for increasing the immunogenicity of this tumor cell by modification in vivo I will provide a. In addition, tumor cells are further modified in vivo to express MHC molecules. And induce a first, antigen-specific signal in T cells. it can. Nucleic acid encoding B7-2 and / or B7-3 and B7-1 Into the tumor cell in a form suitable for expression of the co-stimulatory molecule on the surface of the tumor cell. By doing so, this tumor cell can be modified in vivo. Similarly, M The antisense sequence of the HC class I or class II molecule or Ii gene is encoded. The nucleic acid that is being loaded can be introduced into the tumor cell in vivo. In one aspect Then, as one form of gene therapy, B7-2 And / or nucleic acid encoding B7-3 and B7-1 into tumor cells. You can send it by Vivo. Vectors useful for in vivo gene therapy were previously described. Listed, retrovirus vectors, adenovirus vectors and adenoviruses. Includes related viral vectors. For example, M. A. Rosenfeld, Cel 1, 68: 143-155 (1992); F. Anderson, Science Ce, 226, 401-409 (1984); Friedman, Science Ce, 244, 1275-1281 (1989). Alternatively Direct injection of naked nucleic acid into tumor cells to deliver nucleic acid to tumor cells in vivo It can be crowded. For example, G. Asadi et al., Nature, Volume 332, 815- See page 818 (1991). Commercially available equipment for sending in It is (Bio-Rad). If desired, the nucleic acid can be lipophilic so that it is suitable for injection. It can be complexed with a carrier such as a chromosome. Complex formation with liposome Nucleic acid encoding an isolated MHC class I molecule is directly incorporated into the tumor of melanoma patients. Injected. M. Hoffman, Science, 256, pp. 305-309 (19 92).   The tumor cells can be B7-2 and / or B7-3 and / or B7-3 and / or And a substance that induces or enhances the expression of B7-1 (and MHC molecule if necessary) It can also be modified in vivo by use. This substance is systemically It can be administered intravenously, or preferably locally to tumor cells.   (11) Effector phase of anti-tumor T cell mediated immune response.   The modified tumor cells according to the present invention are antigen-specific siRNAs in tumor-specific T cells. Antitumor T cell-mediated immune response by inducing gnual and costimulatory signals Extremely useful. Following this inducible or afferent phase of the immune response, T cells The effector population of is generated. These effector T cell populations are CD4 It may include both + T cells and CD8 + T cells. This effector population is an example For example, it is responsible for elimination of tumor cells by lysis of the tumor cells. Once T cells are active When activated, expression of co-stimulatory molecules leads to recognition of target cells by effector T cells Alternatively, it is not required on target cells for T cell effector function. F. A. Her Ding and J. P. Allison, J. Exp. Med. 177, 1791- 1796 (1993). Therefore, it is induced by the modified tumor cells of the present invention. Anti-Tumor T Cell-Mediated Immune Responses Generate Modified Tumor Cells and Co-stimulatory Molecules It is effective against both unmodified tumor cells that do not show up.   Furthermore, cell surface MH required for the afferent and efferent phases of the T cell-mediated immune response. The density and / or type of C molecules can be different. It is necessary for the initial activation of T cells Less MHC molecules or only certain types of MHC molecules (eg in MHC class II But not MHC class I) on tumor cells for recognition by effector T cells. May be needed in. Therefore, it naturally expresses small amounts of MHC molecules, but more Tumor cells modified to express large amounts of MHC molecules are compared to unmodified tumor cells. Can induce an effective T cell-mediated immune response. Alternatively, naturally MH It expresses C class I molecules but not MHC class II molecules, where MHC Tumor cells that have been modified to express the Ras II molecule are expressed in parental MHC class I +, Russ II-T cell mediated immunity comprising effector T cell populations capable of eliminating tumor cells A reaction can be induced.   (12) A composition for treating tumor cells.   Another aspect of the invention is biology suitable for in vivo pharmaceutical administration to a subject. A composition of modified tumor cells of a compatible type. This composition is An amount of modified tumor cells and a physiologically acceptable carrier. Modified tumor The amount of cells is chosen to be therapeutically effective. “Preferable for in vivo pharmaceutical administration The term "suitable biologically compatible form" refers to the tumor cell rather than its toxic effect. It means that the therapeutic effect of ulcer cells is superior. "A physiologically acceptable carrier" Is a carrier that is biologically compatible with the subject. An example of an acceptable carrier is saline. And aqueous buffer solutions. In all cases, the composition must be sterile. It must be fluid to the extent that easy injectability is achieved. " versus The term "elephant" is meant to include living organisms in which tumors can develop or be experimentally induced. Intended. Examples of subjects include humans, dogs, cats, mice, rats, and their Transgenic species are included.   Administration of the therapeutic compositions of the present invention will be effective for a period of time to achieve the desired result. And doses can be carried out using known methods. For example, qualified The therapeutically effective amount of tumor cells depends on age, sex and individual weight, tumor cell type and May vary depending on the degree of tumor burden, as well as factors such as the subject's immunological competence You. Dosage regimens may be adjusted to provide the optimum therapeutic response. For example, A single dose of modified tumor cells can be administered, or several doses can be given. It can be administered in sequence. Administration is intravenous, intramuscular, intraperitoneal and subcutaneous It may be by injection, including injection.   (13) In vitro activation of tumor-specific T lymphocytes.   Induce an anti-tumor T cell-mediated immune response by inducing costimulatory signals in T cells Another approach to guide or redeem is T lymph from subjects with tumors. Spheres were obtained and tumor cells and B7-2 alone or in combination with B7-1 and And / or activating it in vitro by stimulating it with a stimulated form of B7-3. It is to sexualize. T cells can be obtained from a subject, for example peripheral blood. Peripheral blood Further fractionated to remove red blood cells and enriched in T lymphocytes or T lymphocyte subpopulations. No or it can be isolated. T cells are stimulated with B7-2 and / or Or from a subject combined with B7-3 (eg, from a biopsy, or blood-derived malignancy). By culturing with tumor cells obtained from peripheral blood (in the case of tumors), or Alternatively, by exposing to modified tumor cells as described herein. Can be activated in vitro. The word "stimulating" is A stimulatory molecule cross-links with its receptor on T cells to produce co-stimulatory signals in T cells. It means that you can trigger a le. The stimulatory form of a co-stimulatory molecule is, for example, Immobilization of soluble polyvalent molecules of the offspring, or co-stimulatory molecules, eg bound to a solid support It can be a mold. B retains the ability to induce co-stimulatory signals in T cells 7-2 and / or B7-3 fragments, mutants or variants (eg Fusion proteins) can also be used. In a preferred embodiment, B7-2 And / or provide co-stimulation to T cells using the soluble extracellular portion of B7-3 I do. To activate the tumor-specific T cells, the T cells were treated with tumor cells and B7-2 cells. And / or in vitro with B7-3 or with modified tumor cells. After feeding, the T cells can be administered to the subject by, for example, intravenous injection. .   (14) A therapeutic use of modified tumor cells.   The modified tumor cells according to the present invention are used to increase the immunogenicity of tumors. To a subject who has or is at risk of developing a tumor. Therapeutically to induce or enhance T lymphocyte mediated anti-tumor immunity. Can be. Methods for treating a subject having a tumor include removing tumor cells from the subject. Obtain and transfect the tumor cells with them, eg with an appropriate nucleic acid By modifying it ex vivo to express a T cell costimulatory molecule, and Administering to the subject a therapeutically effective dose of modified tumor cells of. Tumor cells Suitable nucleic acids to be introduced are those described herein, alone or in B7-1, M. Encodes an HC molecule (class I or class II) or an Ii antisense sequence A nucleic acid encoding B7-2 and / or B7-3, which is combined with the nucleic acid Include. Alternatively, after obtaining tumor cells from the subject, B7-2 and / or Using substances that induce or enhance expression of B7-3 (and possibly B7 -1 or MHC molecules are also used) It can be modified in vivo.   Tumor cells may be targeted, for example, by surgical removal of tumor cells, eg, tumor biopsy. Or from a blood sample of interest in the case of a blood-derived malignancy. In the case of an experimentally induced tumor, the cells used to induce the tumor, eg the tumor Cell lines of cells can be used. Solid tumor samples are the largest Generates a single cell suspension of tumor cells prior to modification due to efficiency of transfection Can be processed to Possible treatments include manual dispersion or ligation of cells. Enzymatic digestion of the tissue fibers, for example by collagenase, is included.   Tumor cells can be transfected immediately after they are obtained from the subject, and Allows further characterization of the tumor cell (eg, measurement of cell surface molecule expression) Therefore, in vitro culture can be performed before transfection in order to obtain the ability. Tiger The nucleic acid selected for transfection is of the protein expressed by the tumor cell. It can be decided after character determination. For example, MH on the cell surface of the tumor cells Assessing C protein expression and / or its Ii protein expression in tumor cells be able to. No or limited amount or type of MHC molecules (class I or Tumors expressing class II) are transfected with nucleic acid encoding MHC proteins. Tumors that are capable of infection with the Ii protein and that express Ii protein. Can be perfect. If necessary, after transfection, Selectable markers (eg drug resistance) introduced into tumor cells along with the target nucleic acid Screening tumor cells for introduction of the nucleic acid by using Can be.   Modified tumor cells cannot grow further in a subject prior to administration to the subject To prevent possible growth of the modified tumor cells. be able to. Possible treatments are irradiation or mitomycin C treatments, these are , Destroys the proliferative potential of tumor cells while at the same time antigen-specific and co-stimulating T cells. The ability of the tumor cell to provoke an intense signal and thus stimulate an immune response. maintain.   The modified tumor cells are administered to the subject by injecting the tumor cells into the subject. Can be given. The route of injection may be, for example, intravenous, intramuscular, intraperitoneal or cutaneous. Can be below. Administration of modified tumor cells to the site of the original tumor It may be beneficial for inducing a local T cell mediated immune response against the tumor. Disseminated Administration of modified tumor cells by the method (eg, intravenous injection) is associated with systemic antitumor immunity. And may further protect against the metastatic spread of tumor cells from the original site. Modification Tumor cells can be administered prior to or in conjunction with other forms of treatment. , Or after other treatments such as chemotherapy or surgical intervention it can.   Additionally, one or more types of modified tumor cells can be administered to the subject. For example, Effective T cell responses may require exposure to one or more types of co-stimulatory molecules. Yes. Furthermore, continuous exposure of T cells to different costimulatory molecules over time , May be important for the production of effective reactions. For example, when activating B Vesicles are known to express B7-2 early in its response (approximately 24 stimuli). After hours). B7-1 and B7-3 are subsequently expressed by B cells (approx. 48-72 hours later). That is, T cells are able to react with B7-1 and / or B during the immune reaction. Exposure to B7-2 is required early in the induction of immune response by exposure to 7-3 May. Therefore, it is necessary to generate an effective immune response against tumor cells in the subject. In order to allow different types of modified tumor cells to be administered at different times You. For example, administering to the subject tumor cells that have been modified to express B7-2 Can be. After this administration, B7-3 was expressed from the same tumor (alone or Tumor cells that have been modified (to B7-1) can be administered to the subject. Wear.   Another method of treating a subject with a tumor, alone or with B7-1, MH B7-2 and / or B7-3 with an inhibitor of C molecule and / or Ii expression Tumor cells in vivo to express This method is Effective vectors and vectors for in vivo gene therapy as described in the previous section of the text. By using a delivery method to provide a nucleic acid encoding the protein to be expressed , May include modifying tumor cells in vivo. Alternatively, B7-2 and And / or B7-3, and possibly B7-1 or MHC molecule expression Alternatively, one or more substances that enhance may be administered to a tumor-bearing subject. Wear.   Modified tumor cells according to the invention prevent or treat metastatic spread of tumors It can also be used in a method for preventing or treating the recurrence of a tumor. Wear. As demonstrated in detail in one of the examples below, B7-1 expressing tumor cells -Induced antitumor immunity depends on whether re-exposed tumor cells express B7-1 Regardless, it is effective against subsequent challenge with tumor cells. That is, this specification Administration of modified tumor cells or in vivo modification of tumor cells as described in , Cells of the original, unmodified tumor as well as metastasis of the original tumor or possible reconstruction of the original tumor Long Can provide tumor immunity against.   Furthermore, the present invention provides CD4+To specifically induce an antitumor response in T cells Compositions and methods. CD4+T cells bind to MHC class II molecules. It is activated by the associated antigen. TAA peptide fragment and MHC CD4 is associated with the ras II molecule+Recognition of these antigenic peptides by T cells Give birth to. Express MHC class II molecules with B7-2 and / or B7-3 Modified to or with B7-2 and / or B7-3 Providing a subject with a tumor cell that has been modified in vivo to express Useful for directing tumor antigen presentation to the MHC class II pathway, and Is more specific for tumor cells+Antigen recognition by T cells and its activation Is brought about. CD4 with anti-CD4 or anti-CD8 antibody+Or CD8+T thin In vivo depletion of either cell is used to identify specific anti-tumor immunity (eg, C D4+) It can be demonstrated that it is mediated by a T cell subpopulation.   Subjects first exposed to modified tumor cells will then be exposed to unmodified tumor cells. It shows an effective anti-tumor specific T cell response to exposure. That is, the target is an antitumor feature. Shows differential immunity. As an immunogen that induces anti-tumor immunity in another human subject The general use of the modified tumor cells of the invention from one human subject is related It is hampered by the lack of organizational compatibility between humans. However, future tumors Use modified tumor cells from an individual to protect against potential emergence Inducing antitumor immunity in another individual is useful in the case of familial malignancies May be. In this situation, the tumor cells Having donors are closely related to (tumor-free) recipients of modified tumor cells And therefore the donor and recipient share the MHC antigen. A type of malignant tumor, For example, a strong hereditary component has been identified for certain breast and rectal cancers. Specific malignancy In a family who has a known susceptibility to a tumor and one currently has the tumor, Tumor cells from one of them, B7-2 and / or B7-3 alone or B Modified to be expressed in combination with 7-1 to make it a susceptible histocompatibility family member When administered, induces the recipient's anti-tumor immune response to the type of tumor the family is susceptible to. Can be guided. This anti-tumor response was subsequently detected in immunized recipients. Can provide protective immunity against the appearance of the tumor.   (15) Tumor-specific T cell tolerance.   In the case of experimentally induced tumors, the subject (eg, mouse) is treated with unmodified tumor cells. Can be exposed to modified tumor cells according to the invention before being more challenged You. That is, first the subject is B7-2 and / or that activates TAA-specific T cells. Or with B7-3 and B7-1 is exposed to TAA peptides on tumor cells . The activated T cells are then challenged for subsequent challenge by unmodified tumor cells. And become effective. In the case of spontaneous tumors, as in human patients, The elephant's immune system was modified to allow unmodified tumor cells prior to exposure to the modified tumor cells of the present invention. Exposed to cells. That is, this subject has T on tumor cells in the absence of co-stimulatory signals. First exposed to AA peptide. This situation is not exposed to unmodified tumor cells. And induces tolerance of TAA-specific T cells in contacting and contacting T cells It is. Target secondary damage to modified tumor cells capable of inducing costimulatory signals The dew was found to be a remission of TAA-specific T cells that were anergized by primary exposure to this tumor. It may not be enough to beat Yong. Therefore, it has already been exposed to unmodified tumor cells. The use of modified tumor cells to induce anti-tumor immunity in selected subjects is small. Diagnosed early with a small tumor burden, eg, a small localized tumor that has not metastasized Can be most effective in patients. In this situation, the tumor cells Confined to a limited area and therefore part of the T cell repertoire is a tumor It is only exposed to the antigen and becomes anergic. For example, localized tumor surgery Tumors by systemic methods after selective removal and modification of isolated tumor cells Administration of cells included non-anergic T cells alone or in combination with B7-1 Exposure to tumor antigens with B7-2 and / or B7-3, thereby eliminating non-Ane. It is possible to induce an antitumor response in rugged T cells. This anti-tumor reaction , For possible tumor regrowth, or for which the original may not have been detected Can be effective against tumor micrometastases. Pervasive against tumor cells in a subject In order to overcome peripheral T cell tolerance that has spread to the Shi It may be necessary to provide the subject with the modified tumor cells to the subject. Cytokines that function as T cell growth factors, such as IL-2, are associated with modified tumors. It can be provided to the subject along with the ulcer cells. IL-2 in an in vitro system When an exogenous IL-2 was added at the time of secondary alloantigen stimulation, it was previously anergized. It has been shown that the T cell alloantigen-specific response can be restored. P. Tongue, etc. J. Exp. Med. 177: 165-173 (1993).   Anti-tumor T cell response in a subject despite the subject's T cell tolerance to the tumor Another approach to generate is another subject not exposed to the tumor (naive Stimulate antitumor response in T cells derived from Stimulated T cells from the Is to be able to mount an immune response against the tumor cells. This T cell By in vitro stimulation with the modified tumor cells according to the invention, Antitumor response is induced in T cells derived from naive donors. Such an adopted immunogen Our approach generally relies on tissue fit between the transferred T cells and the tumor-bearing recipient. Differences in compatibility prevent it in outbred populations. However, allogeneic bone Applying advances in marrow transplantation to this situation, adoptive transfer of cells by recipient Vesicle reception and graft-versus-host disease prevention. First, the tumor Allogeneic bone marrow from a naive donor by known methods Prepare for transplant and perform transplant. Host preparation involves whole body irradiation, which The immune system of the host, including T cells that are tolerant to the tumor and the tumor cells themselves Destroy. Bone marrow transplant is a transfer of bone marrow transplants such as depletion of mature T cells. Treatment to prevent graft-versus-host disease, treatment of the host with an immunosuppressant, or host Substances such as CTLA4Ig for inducing donor T cell tolerance to tissues Treatment of the host with. Next, the tumor cells remaining in the host or the original tumor of the host To provide the host with antitumor-specific T cells capable of responding to regrowth or metastasis Therefore, T cells from naive donors were treated with B7-2 and / or B7-2 cells as described herein. Or tumor cells derived from this host, modified to express B7-3. Stimulate with Toro. That is, the donor T cells first enter into the tumor cells with the costimulatory signal. Are exposed to and are therefore activated to respond to this tumor cell. Then these activities Transfer of Specified Antitumor-Specific T Cells to a Host Reactive with Unmodified Tumor Cells Enter. Since the host has been reconstituted by the donor's immune system, this host has not been transferred. Treatment of the host to prevent graft-versus-host disease. , Will interfere with the reactivity of the transferred T cells with normal host tissues.H. Administration of B lymphocyte antigen pharmaceutical preparation   The peptides of the present invention are useful for enhancing or suppressing the immune response mediated by T cells. It is administered to the subject in a biologically compatible dosage form suitable for internal pharmaceutical administration. "Living A biologically compatible dosage form suitable for internal administration means that the therapeutic effect exceeds the toxic effect. Means a formulation of the administered protein. The term subject causes an immune response It is intended to include organisms such as mammals. Examples of subjects include humans, dogs, Includes cats, mice, rats as well as transgenic species thereof. Listed here Administration of the peptide having the activity of the novel B lymphocyte antigen Therapeutically active amount and medicament in combination with a peptide having the activity of a species B lymphocyte antigen It can take any pharmaceutical dosage form containing a pharmaceutically acceptable carrier. Treatment of the present invention Administration of a therapeutically effective amount of a therapeutic composition refers to the dose and time required to achieve the desired result. Is defined as an effective amount. For example, treatment of peptides with B7-2 activity Therapeutically effective dose produces the desired response in the condition, age, sex and individual weight and individual It may also vary depending on factors such as the peptide's capacity. Optimal therapeutic response in dose range May be adjusted to obtain For example, you may administer several divided doses daily. However, the dose may be reduced in proportion to the actual situation of the treatment.   The active compound (eg, peptide) can be injected (subcutaneous, intravenous, etc.), orally, It may also be administered in any convenient manner such as inhalation, transdermal administration or rectal administration. After administration Depending on the route, active compounds may act by enzymes or acids that may inactivate the compound. And other materials that protect the compound from natural conditions.   In order to administer a peptide having B7-2 activity other than parenteral administration, Coated with a substance that blocks inactivation of the peptide, or administered simultaneously with it. And may be needed. For example, a peptide with B7-2 activity It should be administered in a suitable carrier, diluent or adjuvant, or should be co-administered with the enzyme inhibitor. Or administered in a suitable carrier such as liposomes. Pharmaceutically acceptable Diluents included include saline and aqueous buffer solutions. Adjuvant is understood in the broadest sense, Includes any immunostimulatory compound such as interferon. Ajuban here Resorcinols, polyoxyethylene oleyl ether and n-hexene It is also intended to include nonionic surfactants such as sadecyl polyethylene ether. Is illustrated. Enzyme inhibitors include pancreatic trypsin inhibitor, diisopropyl fluoro Also includes phosphate (DEP) and trasylol. In oil-in-water for liposomes Aqueous emulsions and conventional liposomes (Strejan et al. (1984), J. Am. Neuroimmunol. , 7:27).   The active compounds can also be administered parenterally or intraperitoneally. The dispersant is glycerin, Manufacturing in liquid polyethylene glycols and their mixtures and in oils You can also Under normal conditions of storage and use, these preparations will contain microbial growth. Preservatives to prevent the can also be included.   Pharmaceutical compositions suitable for injection include sterile aqueous solutions (where water soluble) or water. Includes powders and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersions. all In the case of, the composition must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. There must be. It must be stable under the conditions of manufacture and storage, It must be protected from the contamination of microorganisms such as mold. The carrier is, for example, Water, ethanol, polyols (eg glycerin, propylene glycol and Solvent or dispersion medium containing liquid polyethylene glycol etc.) and mixtures thereof Can be Appropriate fluidity is achieved by the use of coatings such as lecithin In the case of a dispersant, maintain it by maintaining the required particle size and using a surfactant, etc. can do. Prevention of the action of microorganisms can be performed, for example, by using paraben, chlorobutano Various antibacterial agents and anti-carcinogenic agents such as phenol, phenol, ascorbic acid and thimerosal. Bi agent Can be achieved by Often within the composition, for example, sugar, mannite Alcohol, polyalcohols such as sorbitol, and isotonic agents such as sodium chloride. It seems to be preferable. Prolonged absorption of injectable compositions can be Agents that delay absorption such as aluminum monostearate and gelatin Can be included.   Sterile injectable solutions should contain suitable amounts of active compound (eg, peptide with B7-2 activity). Is added to a suitable solvent, optionally containing one or a combination of the above components, followed by It can be produced by filtering the bacteria. Generally, dispersants are based on the active compound. To be added in a sterile vehicle that contains the basic dispersion medium and the required other ingredients from above. It is manufactured by For sterile powders to make sterile injectable solutions, The methods are vacuum drying and freeze drying, where the active ingredient ( For example peptide) plus a powder of the desired additional ingredient.   When the active compound is appropriately protected as described above, the protein may be inactive, for example. It may also be administered orally with a diluent or an assimilable edible carrier. Use here “Pharmaceutically acceptable carrier” includes all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial agents. It also includes agents and antifungal agents, isotonic agents, absorption delaying agents and the like. Of pharmaceutically active substances The use of such media and agents for treatment is well known in the art. This activity This therapeutic group unless the compound is contraindicated in its usual vehicle or drug Use in a product is intended. A supplementary activation compound is included in this composition. It is also possible to add substances.   Formulating parenteral compositions in unit dose form for ease of administration and uniformity of dose It is particularly advantageous. The unit dosage form used here is the mammal to be treated. Suitable for uniform administration to the subject, each unit is pre-calculated to obtain the desired therapeutic effect Physically separated, containing a predetermined amount of the active compound and the required pharmaceutical carrier Indicates the unit used. The unit dosage formulation of the present invention comprises (a) a unique feature of the active compound. The specific therapeutic effect to be achieved and (b) the sensitivity of each individual. Direct dependence, as determined by the inevitable restrictions on the technique of mixing the active compounds in order to I do.I. Recognition of cytokines induced by co-stimulation   Nucleic acid sequences encoding peptides having novel B lymphocyte antigen activity described herein To respond to stimulation by a type of B lymphocyte antigen, such as B7-2 And can recognize cytokines produced by T cells. T cells In vitro phorbol ester, anti-CD3 antibody or preferably antigen and MH Suboptimal (subopti) due to primary activation signals such as with C class II molecules and a nucleic acid encoding a peptide having B7-2 activity. By cells that have been transfected to express the peptide on their surface, or Stimulated to co-stimulatory (cos) of the B7-2 antigen, such as by the soluble, explosive form of peptide. signal) signal is received. Known cytokines released into the medium For blocking cytokines that inhibit T cell proliferation by ELISA Ability of antibodies to inhibit the growth of other cell types induced by cytokines and cytokines Can be recognized by. IL-4 ELISA kit and IL-7 blocking antibody Available from Genzyme (Cambridge, MA). IL-9 and And blocking antibodies against IL-12 are from Genetics Institute (Ca mbridge, MA).   The in vitro T cell co-stimulation assay is a novel site that can be induced by costimulation. It can also be used in a method for recognizing kine. If invited by co-stimulation The specific activity elicited, eg, T cell proliferation, is a blocker anti-antibody against known cytokines. If not blocked by the addition of the body, its activity is due to the action of unknown cytokines Maybe. After co-stimulation, this cytokine was purified from the medium by standard methods. It should be possible to measure its activity by its ability to induce T cell proliferation.   In vitro T cells as defined above for recognizing cytokines that prevent induction of tolerance Co-stimulation test can be used. In this case, a primary activation signal for T cells Given, followed by contact with the selected cytokine without giving a co-stimulatory signal. After the T cells were washed and rested, they were given a primary activation signal and costimulatory sig Give both nulls. If T cells respond (eg, proliferate or IL-2 , The cells have acquired resistance and their cytokines are tolerant. It did not prevent sexual induction. However, if T cells respond, Tolerance induction was prevented by the cytokine. Prevent tolerance induction Cytokines can induce tolerance in transplant recipients or patients with autoimmune disease In vivo associated with drugs that block B lymphocyte antigens as a more effective means Can be a target for blockade. For example, a B7-2 blocker may be a cytokine The subject could be administered with a blocking antibody.J. Recognition of molecules that prevent co-stimulation   A peptide having the activity of the novel B lymphocyte antigen of the present invention (for example, B7-2 and Another application of B7-3) is to co-stimulate one or more of these peptides. Blocking agent and / or blocking intracellular signal transduction of T cells after stimulation Is used in a screening assay to discover undiscovered molecules. example Solid phase binding using peptides having B lymphocyte antigen activity, such as B7-2 The assay is based on the antigen and the appropriate T cell ligand (eg CTLA4, CD28). It could be used to recognize molecules that block binding to. In addition In addition, the in vitro T cell costimulatory assay described above uses the molecule for T cell proliferation and / or Or the ability to block cytokine production (but binding of B lymphocyte antigen to its receptor) Block the intracellular signal transduction via T cells after co-stimulation. It could be used to find harmful molecules. For example, cyclo Sporin A compounds activate T cell activation but not CD28 / CTLA4 pathway Blocked by a stimulus via the receptor pathway. Therefore, in the co-stimulation Contains signaling pathways. Intracellular sig through the CD28 / CTLA4 pathway Molecules that inhibit the null transmission are similar to the effects of immunosuppressants (cyclosporin A) in vivo. Similar) would be effective.K. Recognition of molecules that regulate B lymphocyte antigen expression   Monoclonal antibodies produced using the protein and peptide of the present invention are Can be used in a screening assay for molecules that regulate B lymphocyte antigen expression. An example For example, molecules that bring about intracellular signal transduction leading to B lymphocyte antigen induction, such as B7-2 or B7-3 is one or more B lymphocyte antigens on the cell surface Can be recognized by assaying the expression of Antisense in the presence of a molecule -Reduction of immunofluorescence staining by B7-2 antibody causes the molecule to block intracellular signals It seems to point out that. Molecules that enhance B lymphocyte antigen expression are immunofluorescent Provides color enhancement. In addition, there is a contribution to the expression of B lymphocyte antigens such as B7-2. The effect of the offspring is to use B7-2 cDNA as a probe to It can be determined by detecting the level. For example, a peptide with B7-2 activity The presenting cell is brought into contact with a test molecule to increase or decrease the B7-2 mRNA concentration in the cell. B7-2c labeled with a Northern hybridization assay or a detectable marker MRNA or total poly (A) using a DNA probe+) Regular dots of RNA It can be detected by standard techniques such as blot assays. Regulates B lymphocyte antigen expression Molecules that enhance the immune response either alone or in combination with soluble blockers or stimulants. Would be therapeutically useful due to its attenuation. For example, a molecule that blocks the expression of B7-2 Could be administered with a B7-2 blocker for immunosuppressive purposes. The above test method IL-4, γINF, IL-10, IL-12, GM-C Includes cytokines such as SF and prostaglandins.   The present invention is illustrated by the following examples, which are not intended to be limiting. Honcho All references and contents of published patent applications cited in the detailed text are for reference only. To be presented to.   The following methodology was used in Examples 1, 2 and 3.Methods and materials A. cell   Mononuclear cells were separated into normal human spleen by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation. It was isolated from the free cell suspension of the viscera and was subjected to E- and Separated into E + fractions (Boyd, AW et al. (1985) J. Immun ol. , 134: 1516). B cells from E-fraction to monocyte plastic Adhesion and anti-CD4, -CD8, -CD11b, -CD14 and -CD1 Anti-MsIgG and anti-MsIgM coated magnetic beads using 6 monoclonal antibody (Advanced / Magnetics, Cambridge, MA) Treatment with 2 times treatment with residual T, removal of natural killer cells (NK) and residual monocytes Refined. CD4 + T cells were attached to the plastic from the E + fraction of the same spleen. NK, B cells and residual monocyte magnetic beads and anti-CD20, -CD11b, -Separated after removal with CD8 and CD16 monoclonal antibodies. CD28 + T-cells from this E + fraction also showed anti-CD20, CD11b, -CD14 and -Separated with CD16 monoclonal antibody. Indirect immunofluorescence method for purification effect And flow using EPICS flow cytometer (Coulter) It was analyzed by cytometry. B cell products> 95% CD20 +, <2% CD3 + , <1% CD14 +. > 98% CD3 +,> 98 for CD4 + T cell products % CD4 +, <1% CD8 +, <1% CD20 +, <1% CD14 +. > 98% CD3 +,> 98% CD28 +, <1% CD2 for CD28 + T cell products 0+, <1% CD14 +.B. Monoclonal antibodies and fusion proteins   Monoclonal antibodies were used as purified Ig unless otherwise stated: anti- B7: 133, IgM is a blocking antibody, previously reported (Freedma n, A. S. (1987), Immunol. 137: 3260-3 267); anti-B7: B1.1, IgG1 (RepliGen, Cambr. idge, MA) (Nickoloff, B et al. (1993) Am.JP atol. , 142: 1029-1040) are non-blocking monoclonal antibodies. BB-1: IgM is a blocking antibody (Dr. E. Clark, University of Washington. , Seattle, WA) (Yokochi, T. et al. (1982), J. Im. munol. , 128: 823-827); anti-CD20: B1, I. gG2a (Stasenko, P. et al. (1980), J. Immunol. 125: 1678-1685); anti-B5, IgM (Freedman, A. (1985), J. Immunol. , Volume 134: 2228-223 5); anti-CD8: 7PT3F9, IgG2a; anti-CD4: 19Thy5D. 7, IgG2a; anti-CD11b: Mo1, IgM and anti-CD14: Mo2. , IgM (Todd, R et al. (1981), J. Immunol., 126 volumes. : 14 35-1442); anti-MHC class II: 9-49, IgG2a (Dr.R. . Todd, University of Michigan, Ann Arbor, (Todd, RI, etc.) (1984), Hum. Immunol. 10: 23-40); anti-C D28: 9.3, IgG2a (Dr. C. June, Naval.Rearse ch. Institute, Bethesda), (Hansen, JA. (1980), Immunogenetics, 10: 247-260. ); Anti-CD16: 3G8, IgG1 (used as ascites), (Dr. J. Ri. tz, Dana-Farber, Cancer, Institute, Boost on); anti-CD3: OKT3, IgG2a hybridoma is American type Purified monoclonal antibody obtained from the Lucher Collection on a plastic plate 1 Attached at a concentration of μg / mL. The anti-CD28 Fab fragment was produced by the manufacturer (Pierc e company, Rockford, IL) 9.3 monoclonal antibody Generated by digestion with papain and purified on a protein A column. Human CTLA4 The fusion protein (CTLA4Ig) and the control fusion protein (control-Ig) were previously reported. (Gimmi, CD, et al. (1993), Proc. Natl. Acad. . Sci. USA, 90: 6586-6590). Bous siotis, V .; J. Exp. Med. (Received for print).C. Transfection of CHO cells   B7-1 transfectant (CHO-B7) is a B7-1 negative Chinese Made from a hamster ovary (CHO) cell line, fixed with paraformaldehyde, Previous reports (Gimmi, CD, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 6575-6579).D. In vitro B cell activation and selection of B7 + and B7- cells   Complete culture of splenic B cells in a tissue culture flask {10% heat inactivated fetal bovine blood Clear (FCS) -added RPMI1640, 2 mM-glutamine, 1 mM-pyruvic acid Sodium, penicillin (100 units / mL), streptomycin sulfate (10 0 μg / mL) and gentamicin sulfate (5 μg / mL)} 2 × 106 Cells / mL were cultured and sIg was added to Affi-Gel702 beads (Bio-Rad). Co., Richmond, CA) (Boyd, AW, et al. (1985), J. Immunol. , 134: 1516). By anti-human IgM cross-linking or by Affi-Gel702 beads It was activated by cross-linking with the MHC class II 9-49 antibody bound to. B cells are activated for 72 hours and used as an activated whole B cell population or anti- B7 (B1.1) monoclonal antibody and fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled goat anti-mouse immunoglobulin (Fisher, Pi Indirect staining with ttsburg, PA) and flow cytometry cell sorting ( (EPICS / Elite / flow / cytometer, Coulter) Were fractionated into B7-1 + and B7-1− populations for use.E. FIG. Immunofluorescence and flow cytometry   Surface phenotype analysis for 6, 12, 24, 48, 72 and 94 hours of interaction. Anti-B against B cell populations activated by differentially linked MHC class II or sIg 7 (133), BB-1 monoclonal antibody, control IgM antibody, CTLA4Ig Or stained with Control-Ig. Primary suspension of cell suspension at 10 μg / mL Staining was performed by a two-step indirect membrane staining method using an appropriate secondary reagent after the primary antibody. Concrete Immunoreactivity with anti-B7 (133) and BB-1 monoclonal antibodies Secondary test with goat anti-mouse Ig or immunoglobulin FITC (Fisher) The immunoreactivity with the fusion protein was examined by the indirect staining method used as a drug. CTLA4Ig or Biotinylated Control-Ig and Streptavidin-Flu The study was performed using icoerythrin as a secondary reagent. 10% for dilution and cleaning agents PBS with AB serum was used. Fix cells with 0.1% paraformaldehyde And analyze with a flow cytometer (EPICS / Elite / Coulter) did.F. Proliferation assay   T cells are 96 well flat-bottom microtiter plates 1 x 10 per plateFive37 ° C at cell concentration 5% CO for 3 days2Cultured in Genotype-activated B cells (total B cell population or Irradiated (2500 rads) with B7 + and B7− fractions) and 1 × 10 5 per wellFiveCell concentration The medium was added to the medium. Factors needed to reach a final total volume of 200 μL per well Added at various concentrations. When designated, T cells were treated with anti-CD28 Fab (final concentration 10 μg / mL) for 30 minutes at 4 ° C., then added to the experimental plate Was. Similarly, CHO-B7 or B cells received CTLA4Ig or control Ig (10 μg / mL) for 30 minutes at 4 ° C. With indicators of mitogenic activity The thymidine incorporation during the last 15 hours of culture was {methyl-ThreeH} thymidine (Du ・ Incubation with 1 μCi (37 kBq) of Pont, Boston, MA) After the evaluation. The cells were harvested by filtration and the radioactivity on the dry filter plate was adjusted to Pharma Cia beta plate liquid scintillation counter.G. IL-2 and IL-4 assays   The concentrations of IL-2 and IL-4 were determined by the ELISA method (R & D Systems, M. ineapolis, MN and BioSource, Camarillo, The assay was carried out in the supernatant collected 24 hours after the start of culture by (CA).Example 1   Novel CTLA4 ligands that induce T cell proliferation on activated B cells Expression   Cross-linked surface Ig showed that human resting B cells showed maximal B7-1 at 72 hours (50-8). 0%) so that activated human B lymphocytes are quasi-mitogenic. (Submitogenically) activated T cells are expanded to produce IL The ability to secrete -2 was measured. Figure 1 shows the results for anti-CD3 monoclonal antibody. Transgenic B7 (B7-1) of human spleen CD28 + T cells activated mitogenically Activated for 72 hours with defective CHO cells (CHO-B7) or anti-Ig It shows a co-stimulatory reaction with the isogenic splenic B cells.ThreeH-thymidine incorporation is 72 hours The assay was performed during the final 15 hours of culture. IL-2 was measured by ELISA after 24 hours of culture. The supernatant was assayed (detection limit: 31 to 2000 pg / mL). Figure 1 shows 17 times Indicates the test result.   Quasimitotically activated CD28 + T cells were presented with CHO-B7 (Fig. 1, a). It proliferated in response to the resulting B7-1 costimulation and secreted high concentrations of IL-2. Proliferation Both IL-2 secretion and B7-1 molecules on CHO cells are anti-B7-1 monoclonal anti- Blocked in the body or by a fusion protein of CTLA4, a high affinity receptor It was completely stopped by doing. Similarly, proliferation and IL-2 secretion are associated with Fab anti-CD2. 8 monoclonal antibody is blocked by blocking B7-1 signaling through CD28. Removed. The control monoclonal antibody or control fusion protein was ineffective. Proliferation Almost the same stimulation of IL-2 secretion with spleen B cells activated with anti-Ig for 72 hours Thus shown (Fig. 1, b). Anti-B7-1 monoclonal antibody is CHO-B7 Was able to completely eliminate the proliferation and IL-2 secretion caused by Monoclonal antibodies reliably block only 50% of the proliferation induced by activated B cells. It did not stop, while IL-2 secretion was completely blocked. Anti-B7-1 monochrome In contrast to partial blocking of antibody-induced proliferation, CTLA4Ig also binds to Fab. The anti-CD28 monoclonal antibody also completely blocked proliferation and IL-2 secretion. this These results show that activated human B cells are able to induce T cell proliferation and IL-2 secretion in an additional manner. Suitable for the hypothesis that one or more CTLA4 / CD28 ligands are expressed Combine.Example 2   Activated human spleen B cells emit a CTLA4 ligand different from B7-1. Reveal   From the above observation, another CTLA4 binding counter-receptor was found to be an activated B cell. It was decided to confirm whether it would be expressed on the cell. Therefore, anti-human splenic B cells Anti-B7-activated with Ig for 72 hours and then did not block B7-1-mediated co-stimulation It was stained with 1 monoclonal antibody (B1.1). Isothiocyanate fluoresce In (FITC) and mAbB1.1 for cell selection by flow cytometry Go to B7-1+Fraction and B7-1-The fractions were separated. The obtained post-separation positive population is 99% B7-1+And the negative population after isolation is 98% B7-1.-(Fig. 2).   To examine the costimulatory capacity of each population, human splenic CD28 + T cells were irradiated with B7-1. + Or B7-1-anti-Ig activated (72 h) anti-CD in the presence of splenic B cells It was stimulated quasi-mitotically with 3 monoclonal antibodies.Three72 H-thymidine incorporation The last 15 hours of time culture were examined. IL-2 was cultured at 24 hours by ELISA The supernatant after a period of time was evaluated (detection limit of assay: 31 to 2000 pg / mL). . FIG. 3 shows the results of 10 experiments. B7-1 + B cells are anti-CD3 activated T cells To It induced proliferation and secretion of IL-2 (Fig. 3a) but not IL-4. Not yet As observed with the fraction-activated B cell population, anti-B7-1 monoclonal antibody ( 133) blocked proliferation by only 50%, but IL-2 secretion was completely abolished. . As mentioned above, CTLA4Ig binding by Fab anti-CD28 monoclonal antibody was performed. Blockade of CD28 or CD28 completely blocked both proliferation and IL-2 secretion. Contrast monochrome Local antibody and control-Ig were not inhibitory. Caused by B7 + B cells Potential CTLA4 / C of other species that may be responsible for residual non-B7-mediated proliferation Attempts to discover D28-binding costimulatory ligands have directed against proliferation and IL-2 secretion. The effect of the BB-1 monoclonal antibody was tested. As mentioned above, BB-1 monoc The lonal antibody completely blocked proliferation and IL-2 secretion (Fig. 3a). Figure 3b We present the costimulatory capacity of B7-1-activated human splenic B cells. Irradiation B7-1-activation (72 hours) B cells showed clear synergistic sigma with quasi-mitogenic activated CD4 + lymphocytes. Will transmit the null. This costimulation was detected by IL-2 (Fig. 3b) or I. Does the anti-B7-1 monoclonal antibody prevent proliferation without L-4 accumulation? Was. However, CTLA4Ig, a Fab anti-CD28 monoclonal antibody And the BB-1 monoclonal antibodies all blocked proliferation completely.   B7-1+And B7-1-Phenotypic analysis of activated splenic B cells showed functional The result was confirmed. Figure 4 shows fractionated B7-1+And B7-1-B activated in 3 shows cell surface expression of B7-1, B7-2 and B7-3 on cells. As shown in FIG. As such, B7-1 + -activated splenic B cells are anti-B7-1 (133) monoclonal. And antibody BB-1 monoclonal antibody and bound CTLA4Ig. versus In contrast, B7-activated splenic B cells are anti-B7-1 (133) monoclonal antibody. Staining with BB-1 monoclonal antibody and CTLA4Ig. Colored. These phenotypes and functional consequences are associated with B7-1 + and B7-1− activity. Human B lymphocytes that had been sexually activated (72 hours) were detected in 1) T cells that were activated in a quasi-mitogenic manner. Induces proliferation without exportable IL-2 secretion, and 2) BB-1 monochrome Is recognized by the null antibody but not by the anti-B7-1 monoclonal antibody Demonstrate expression of CTLA4 binding counter-receptor. So this Et al. CTLA4 / CD28 ligand is transiently expressed after B cell activation and Distinguish based on reactivity with CTLA4Ig and anti-B7 monoclonal antibody Can be FIG. 4 shows the results of 5 experiments.Example 3 After activation of human B cells, three different CTLA4 / CD28 ligands Express   To determine the sequential expression of CTLA4 binding counter-receptors after activation, Activate human spleen B cells by surface Ig or MHC class II cross-linking, The expression of B7-1, B7-3 and B7-2 binding proteins was analyzed by flow cytometry. It was examined by analysis. Ig or MHC class II cross-linking has a similar pattern. CTLA4Ig binding was induced (FIGS. 5 and 6). FIG. 5 shows anti-B7-1 and B The results of 25 B-1 binding experiments and 5 CTLA4Ig binding experiments are shown. You. FIG. 6 shows the results of 25 experiments of anti-B7-1 binding and the results of CTLA4Ig binding. These are the results of 5 trials. These experimental results show that before 24 hours It shows that neither was expressed. 24 hours after activation, many cells had CTLA It expresses a protein that binds to 4Ig (B7-2), but 20% or less It expresses B7-1 or B7-3. 48 hours after MHC class II cross-linking Maximally induced B7-1 and B7-3, and Ig cross-linking was maximal at 72 hours. Induces expression and then decreases. These results show that the new CTLA4 binding Counter-receptor is expressed at 24 hours, and different types of B7-1 and B7-3 It suggests that it appears to be temporally consistent with the temporal expression of the protein.   A series of experiments were performed to transiently express this CTLA4 binding counter-receptor. And the ability to co-stimulate T cell proliferation and / or IL-2 secretion differ It was judged whether or not. Human spleen CD28 + quasi-mitotically stimulated with anti-CD3 T cells were previously cross-linked with sIg for 24, 48 or 72 hours in vitro. Cultures were performed for 72 hours in the presence of activated human splenic B cells that had been activated. IL-2 minutes Lactation was assessed in the supernatant after 24 hours by ELISA and T cell proliferation was 72 hours in culture. During the last 15 hours ofThreeEvaluation was by H-thymidine incorporation. Figure 7 shows 5 experiments Indicates the result. As seen in Figure 7a, 24-hour activated B cells had moderate levels of I. It gave a costimulatory signal with L-2 production, but its extent of proliferation was 48 hours. And significantly less than that observed with human B cells activated for 72 hours (72 hours) (ThreeH-Chimi Note the scale of gin uptake). No anti-B7-1 (133) or BB-1 They neither blocked proliferation nor IL-2 accumulation. In contrast CTLA4Ig and anti- The CD28 Fab monoclonal antibody completely abolished proliferation and IL-2 accumulation. B cells activated for 48 hours undergo co-stimulation, resulting in almost maximal proliferation and IL-. 2 secretion was reached (Fig. 7b). Here, anti-B7-1 (133) monoclonal antibody The body blocked proliferation by approximately 50%, but completely blocked IL-2 accumulation. BB-1 Mono The clonal antibody completely blocked proliferation and IL-2 secretion. As mentioned above, C TLA4Ig and Fab anti-CD28 also completely block proliferation and IL-2 production did. Finally, 72-hour activated B cells are induced by 48-hour activated B cells The same T cell response was induced. If the quasi-mitogenic signal is phorbol If transmitted from myristate acetate (PMA), human splenic B cells will also be transmitted. Similar results if activated by MHC class II rather than Ig cross-linking Is observed. These results indicate that there are three types of CTLA4 binding molecules and they are temporarily active. Being expressed in activated B cells, each of which can stimulate quasi-mitogenic proliferation in T cells Is shown. Two of these molecules are early CTLA4 binding counter-receptors ( B7-2) and B7-1 (133) induce IL-2 production, while B7 -3 induces proliferation without detectable IL-2 production.   Previous reports include anti-B7 monoclonal antibody, 133 and monoclonal anti- Conflicting evidence was submitted as to whether or not body BB-1 recognizes the same molecule (Freedman, AS, et al. (1987), Immunol., 137. Volume: 3260-3267; Yokochi, T .; (1982), J. I mmunol. 128: 823-827; Freeman, G .; J. Such (1989), J. Immunol. , 143: 2714-2722). Both monoclonal antibodies recognize molecules expressed 48 hours after human B cell activation However, some reports recognize B7 (B7-1) and monoclonal antibody BB-1. Are expressed differently in different cell lines and on B cell neoplasms. (Freedman, AS et al. (1987), I. mmunol. 137: 3260-3267; Yokochi, T .; Such (1982), J. Immunol. 128: 823-827; Fre eman, G .; J. (1989), J. Immunol. , 143: 2 714-2722; Clark, E .; And Yokochi, T .; (1984) , Leukocyte-Typing, 1st-International · References, Workshop, pp. 339-346; Clark, E. . (1984), Leukocyte-Typing, 1st-Inte. national. References. Workshop, p. 740). In addition, immunoprecipitation of these IgM monoclonal antibodies and Western blotty Have suggested that they recognize different molecules (Clark, E. and Yo. Kochi, T .; (1984), Leukocyte · Typing, 1st ・ International ・ References ・ Workshop, 3 39-346; Clark, E .; (1984), Leukocyte-Ty ping, 1st. International · References · Wo rkshop, p. 740). The original anti-B7 monoclonal antibody 133 is anti-free. Produced by immunization with globulin-activated human B lymphocytes, while BB-1 Monoclonal antibodies were generated by immunization with a baboon cell line. Therefore, BB -1 monoclonal antibody is a human cell epitopic that is conserved between baboons and humans Should recognize the loop.   After molecular cloning and expression of human B7 gene (B7-1), B7 transfer E.COS cells were similarly treated with anti-B7 (133) and BB-1 monoclonal antibody. Were found to be stained, both of which were identical broad molecular bands (44-54k D) was strongly suggested, suggesting that they recognize the same molecule (Freema) n, G. J. (1989), J. Immunol. , 143: 2714 ~ 2722). This finding is a molecule recognized by the BB-1 monoclonal antibody The gene coding for was previously assigned to chromosome 12 (Katz, FE, et al. (1985), Eur. J. Immunol. , Pages 103-6), on the other hand, two No Gu The loop placed the B7 gene on chromosome 3 (Freeman, GJ, et al. (19 1992), Blood, 79: 489-494; Selvakumar, A. . Et al. (1992), Immunogenetics, 36: 175-18. 1 page), which was unexpected. After that, B7 (B7-1) and BB-1 monochrome Another difference in phenotype expression among the molecules recognized by the null antibody was noted. BB -1 monoclonal antibody was used for thymic epithelial cells (Turka, LA, etc. (1991). Year), J.M. Immunol. 146: 1428-36; Munro, J .; M. , Blood, posted) and keratinocytes (Nickoloff, B. (1993) Am. J. Pathol. , Volume 142: 1029-1 040; Augustin, M .; (1993), J. Invest. D ermatol. , 100: 275-281), while anti-B 7 did not stain this. Recently, Nickoloff et al. (1993), A m. J. Pathol. , 142: 1029-1040, BB-1 and anti- -In keratinocytes using B7 (B1.1 and 133) monoclonal antibodies Reported discordant expression of the BB-1 monoclonal antibody and the molecule recognized by B7. Was. Nickoloff et al. Expresses B7 mRNA in these BB-1 positive cells. Monoclonal antibody B bound to CD28-transfected COS cells but not It was also demonstrated that there is additional evidence for the presence of different proteins that bind B-1.   This time, another CTLA4 recognized by BB-1 monoclonal antibody B7-3 The presence of a counter-receptor and the functional function of this protein are B7-1 ( It is confirmed to be different from 133). B7-1 after activation of B cells Expression of B7-3 and B7-3 seems to be temporally consistent in B7-positive B cells. These studies demonstrate that the B7-3 molecule is also expressed on B7-negative activated B cells You. More importantly, the B7-3 molecule has detectable IL-2 or IL-4. It seems that T cell proliferation can be induced without production. This result is ICAM -1 can costimulate T cell proliferation without detectable IL-2 or IL-4 production (Boussiotis, V. et al., J. Exp. Med. Printing) Similar to previous observations. These data show that BB-1 monoclonal antibody is B7. -1 Recognizing an epitope on white matter and this epitope has a costimulatory function However, it is also present in a different protein B7-3. Phenotype and shield BB-1 monoclonal antibody is one of these proteins (B7-negative cells) It has been demonstrated that it is possible to recognize either (above) or both (on B7 positive cells). In contrast, Anti-B7 monoclonal antibodies 133 and B1.1 recognize only B7-1 protein I do. Taken together, these results indicate that surface immunoglobulin or MHC class II 48 hours after activation of B cells by cross-linking of B cells, one of the B cells was anti-B7 and B One recognized by both B-1 monoclonal antibodies and the other recognized by BB-1 At least two different CTLAs recognized only by noclonal antibodies It is suggested to express the 4-binding counter-receptor.   B7-2 antigen is not detected on activated B cells after 12 hours, but at 24 hours Is strongly expressed and exhibits a function. Proliferation and IL-2 production are Fab anti-CD28 monoc Completely inhibited by lonal, this molecule signals via CD28. Seems to be doing. Anti-B7 monoclonal antibody completes IL-2 production Since it is blocked, IL-2 secretion is caused by B7-1 costimulation 48 hours after activation. It seems that   From previous studies and the results described here, B7 up to 48 hours after B cell activation (B7-1) is not expressed (Freedman, AS, et al. (1987), Immunol. 137: 3260-3267; Freedman, A .; S. (1991), Cell Immunol. Volume 137: 429-4 37) Demonstrated inability to co-stimulate T cell proliferation or IL-2 secretion Is done. Activation of T cells via TCR in the absence of costimulation (Gim mi, C.I. D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6586-6590; Schwartz, R .; H. Etc. (1 989), Cold, Spring, Harb. Symp. Quant. Bi ol. 54: 605-10; Beverly, B .; Etc. (1992), Int. Immunol. 4: 661-671) and the absence of IL-2 ( Boussiotis, V.I. J. Exp. Med. , Posted; Bever l y, B. (1992), Int. Immunol. Volume 4: 661-67 P. 1; Wood, M .; (1993), J. Exp. Med. Volume 177: 597-603) have been proven to cause anergy. B7-1 is I If it were the only co-stimulatory molecule capable of inducing L-2 secretion, IL-2 production would be Since there is no co-stimulatory B7-1, T-cells will be apoptotic for the first 24 hours after activation. It seems to be made energy. Therefore, other IL-2 secretions in the first 24 hours The presence of early inducible costimulatory molecules that can co-stimulate steroids is effective rather than anergy It seems to be necessary to induce an immune response. B cell activation 12 hours and 24 hours Of the early CTLA4 binding counter-receptor, B7-2, during this function Fulfill.   Two of these added CTLA4 binding counter-receptors, biological and Two new findings of potential clinical significance have provided light. First, B7 (B 7-1) A deletion mouse was developed, and its antigen-presenting cells also bind to CTLA4Ig. It was found to do (Freeman and Sharpe, preparing for posting). This ma Uss are healthy and isolated mononuclear cells are detected when cultured with T cells in vitro. Induces possible levels of IL-2. Therefore, another CD28 co-op The IL-2 or other IL-2 production pathway should be functioning. Secondly, mice and hi The most potent reagents that induce antigen-specific anergy in CT systems are CTLA4Ig and Fab anti-CD28, whereas anti-B7 monoclonal antibody is much weaker. I (Harding, FA, et al. (1992), Nature, 356: 607-609; Lenschow, D .; J. Etc. (1992), Scie 257, 789-792; Chen, L. et al. (1992), C Ell, 71: 1093-1102; Tan, P. et al. (1993), J . Exp. Med. 177: 165-173). These observations are also for IL-2 Hypothesis that there is a different CTLA4 / CD28 ligand capable of inducing the In consideration of the results submitted here, the CTLA4 binding counter receptor Suggest that all three species may be essential for the induction of T cell immunity. Further T cells Their blockade may be necessary for the induction of anergy. Same result But Identification of two CTLA4 binding ligands corresponding to human B7-1 and B7-2 molecules Obviously, it was also observed in the mouse system. APC in B7-deficient mice binds to CTLA4 In combination, IL-2 secretion can be induced. Taken together, these observations in the murine system There are multiple CTLA4 binding counter-receptors, which sequentially co-activate T cells. Indicates stimulation.Example 4   Cloning, sequencing and expression of B7-2 antigen A. Construction of cDNA library   Literature description (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A, 84: 3365 (1987)) from human anti-IgM activated B cells. Li (A)+PCDM8 vector (Seed, Nature, 32 9: 840 (1987)). Spleen B Cells are placed in a tissue culture flask in a complete culture medium {10% heat-inactivated fetal bovine serum (FC S) addition RPMI1640, 2 mM-glutamine, 1 mM-Natripyruvate , Penicillin (100 units / mL), streptomycin sulfate (100 μg / mL) mL) and gentamicin sulfate (5 μg / mL)} 2 × 106Cells / mL Culture and sIg and Affi-Gel 702 beads (Bio-Rad, Rich mond, CA) (Boyd, AW, et al. (1985), J. Immuno. l. , 134: 1516) with binding affinity purified rabbit anti-human IgM. Were activated by cross-linking. Activated B cells 1/6, 1/2, 4, 8, 12, Harvested after 24, 48, 72 and 96 hours.   Activated B cells were treated with 4M-guanidine thiocyanate, 0.5% sarcosyl, 25 mM-EDTA, pH 7.5, 0.13% Sigma Antiform A and RNA was prepared by homogenizing in a solution of 0.7% mercaptoethanol. For RNA, this homogenate was added to 5.7 M-CsCl, 10 mM-EDTA, 25 Centrifuge for 24 hours at 32,000 rpm from mM-sodium acetate, pH 7. Purified. RNA pellet was 5% sarcosyl, 1 mM-EDTA, 10 mM- Dissolved in Tris, pH 7.5, 50% phenol, 49% chloroform, 1% a. Extraction was performed with 2 volumes of a mixture of soamyl alcohol. RNA was precipitated from ethanol twice Was. Poly (A) used to construct the cDNA library+RNA is oligo (dT)- Purified by two cycles of cellulose selection.   Anti-IgM activated human B cell poly (A)+RNA 5.5 μg to 50 mM-to Squirrel, pH 8.3, 75 mM-KCl, 3 mM-MgCl210 mM-dithio Threitol, 500 μM-dATP, dCTP, dGTP, dTTP, oligo (DT)12-1850 μg / mL, RNasin 180 Units / mL and Molo Reaction solution containing 10000 units / mL of the reverse transcriptase of ney-MLV in a total volume of 55 μL Complementary DNA was synthesized at 37 ° C. for 1 hour. After reverse transcription, the solution is 25 mM-Tris , PH 8.3, 100 mM-KCl, 5 mM-MgCl2, 250 μM-dA each TP, dCTP, dGTP, dTTP, 5 mM-dithiothreitol, DNA Adjust to 1250 units / mL Limerase and 8.5 units / mL Ribonuclease H CDNA was converted to double-stranded DNA by incubation at 16 ° C for 2 hours. . EDTA was added to 18 mM and the solution was 50% phenol, 49% chloropho It was extracted with an equal volume of rum and 1% isoamyl alcohol mixed solution. DNA is 2.5M-acetic acid Ethanol was added in the presence of ammonium and 4 μg of linear polyacrylamide as a carrier. Precipitated with 2 volumes of knoll. Separately anti-IgM activated human B cell poly (A)+RNA 4 μg to 50 mM Tris, pH 8.8, oligo (dT)12-1850 μg / m L, RNasin 327 units / mL and AMV reverse transcriptase 952 units / mL CDNA was synthesized at 42 ° C. for 0.67 hours in a reaction solution containing 100 μL in total volume. Reverse After the transfer, the reverse transcriptase was inactivated by heating at 70 ° C. for 10 minutes. 320 μL of water and 0 . 1M-Tris, pH 7.5, 25 mM-MgCl2, 0.5M-KCl, bovine Solution of serum albumin 250 μg / mL and 50 mM dithiothreitol 8 0 μL and 200 μM-dATP, dCTP, dGTP, dTT for each solution P, 150 units / mL of DNA polymerase, 8 units / mL of ribonuclease H Prepared and incubated at 16 ° C for 2 hours to convert cDNA to double-stranded DNA . EDTA was added to 18 mM and the solution was 50% phenol, 49% chloropho It was extracted with an equal volume of rum and 1% isoamyl alcohol mixed solution. DNA is 2.5M-acetic acid In the presence of ammonium and 4 μg of linear polyacrylamide as carrier It was precipitated with 2 volumes of ethanol.   DNA from 4 μg of AMV reverse transcription and 2 μg of Moloney MLV reverse transcription Mixed. A non-self-complementary BstXI adapter was added to DNA as follows. Poly (A)+Sequence CTT of kinased double-stranded cDNA from 6 μg of RNA 3.6 μg of TAGAGCACA (SEQ ID NO: 15) oligonucleotide and Oligonucleotide 2 of the sequence CTCTAAAG (SEQ ID NO: 16) that has been treated with nuclease . 4 μg and 6 mM-Tris, pH 7.5, 6 mM-MgCl25 mM-Na Cl, bovine serum albumin 350 μg / mL, 7 mM-mercaptoethanol, 0.1 mM-ATP, 2 mM-dithiothreitol, 1 mM-spermidine and And T4 DNA ligase 600 units in a total volume of 0.45 mL at 15 ° C. Incubated for hours. Add EDTA to 34 mM and add 50% solution Extract with an equal volume of phenol, 49% chloroform, 1% isoamyl alcohol mixture Was. DNA was precipitated from 2 volumes of ethanol in the presence of 2.5M ammonium acetate. I let you.   DNA larger than 600 bp was selected as follows: 1 adapter DNA 0 mM-Tris, pH 8, 1 mM-EDTA, 600 mM-NaCl, 0.1% Redissolve in Sarkosyl and load with the same buffer on a Sepharose CL-4B column. I did a matography. DNA in the void volume of the column (including DNA of 600 bp or more Was collected and subjected to ethanol precipitation.   The pCDM8 vector was prepared by BstXI digestion and agarose gel purification, Used for cDNA cloning. Poly (A)+Adapter D from 6 μg RNA NA was added to 2.25 μg of BstXI-cut pCDM8 in 6 mM-Tris, pH 7.5. , 6 mM-MgCl25 mM-NaCl, bovine serum albumin 350 μg / m L, 7 mM-mercaptoethanol, 0.1 mM-ATP, 2 mM-dithiothre Itol, 1 mM-spermidine and 600 units of T4 DNA ligase in a total volume of 1 . It was ligated in a solution in 5 mL at 15 ° C. for 24 hours. Ligation reaction mixture Were transformed into sensitive Escherichia coli MC1061 / P3 and a total of 4 independent cDNA clones were obtained. 290000 pieces were obtained.   Plasmid DNA is prepared from 500 mL of the culture solution of the cDNA library transformant. Manufactured. The plasmid DNA was purified by the alkaline digestion method and then purified by CsCl Banded and separated with two equilibrium gradients (Maniatis et al. Molecular. Cloning: A ・ Laboratory ・ Manual, Cold ・ Spr ing Harbor, NY (1987)).B. Cloning procedure   In the first stage of screening, 100 mm shear of 50% confluent growing COS cells 30 cells of anti-IgM activated human B cell library DNA 0.05 μg / mL DEAE-dextran method (Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 3365 (1987)). I did it. Cells were trypsinized and reseeded 24 hours later. 47 hours later, cells In PBS / 0.5 mM-EDTA, pH 7.4 / 0.02% sodium azide The plate was incubated at 37 ° C. for 30 minutes and peeled. Removed cells from CTLA4I g and CD28Ig 10 μg / mL for 45 minutes at 4 ° C. Wash the cells, Affinity-purified goat anti-human IgG antibody is spread on a culture dish coated at room temperature. Attached. After 3 hours, the plate is plated with PBS / 0.5 mM-EDTA, pH 7.4. /0.02% sodium azide, twice with 5% FCS and 0.15M NaCl, 0 . Gently washed once with 01M-Hepes, pH 7.4, 5% FCS. Epi Somatic DNA was collected from cultured cells and transformed into E. coli DH10B / P3. Exchange did. Plasmid DNA was used for spheroplast fusion (Seed et al., P. rc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 3365 (1987). )) And re-introduced into COS cells, and the expression and culture were repeated twice.   In the second and third stages of selection, 47 hours later, the detached COS cells were first treated with α -Incubation with B7-1 mAbs (133 and B1.1, 10 μg / mL) And coat C7-1 cells expressing B7-1 with α-mouse IgG and IgM It was removed with magnetic beads. COS cells were then transferred to human CTLA4Ig (hCTLA4I g) and human CD28Ig (hCD28Ig) treated with 10 μg / mL, human Culture B7-2 expressing COS cells on a dish of goat anti-human IgG antibody plate. Nourished and selected. After the third step, plasmid DNA was prepared from each colony and COS cells were transfected by the AE-dextran method. Transfer B7-2 expression on intact COS cells was detected by indirect immunofluorescence with CTLA4Ig. Analysis.   After the final stage of selection, plasmid DNA was produced from each colony. Candidate claw Of the 48, a total of 4 contained a cDNA insert of approximately 1.2 kb. These 4 clones were transfected into COS cells. All 4 clones By indirect immunofluorescence and flow cytometric analysis using CTLA4Ig. Then, B7-2 expression was strongly positive.C. Sequencing   The B7-2 cDNA insert of clone 29 was cloned into pCDM8 using the following strategy. Sequenced in the current vector. The first sequencing was done with primer T7, cloned CDM8R (In Vitrogen) (see Table I). Sequencing depends on the dye termination reaction And ABI automatic DNA sequencer (ABI, Foster City, CA) Performed using With the DNA sequences obtained using these primers The following sequencing primers were designed (see Table I). This sequencing and the next B7-2 cDNA is completely sequenced on both strands through a cycle of immer selection Continued until.   Human B7-2 clone 29 contains an insert of 1120 base pairs and 987 nucleotides. Containing a single long open reading frame and a 3'non-coding sequence of approximately 27 nucleotides (Figure 8, SEQ ID NO: 1). The open reading frame of this protein is predicted to code The amino acid sequence is shown below the nucleotide sequence in FIG. Is a coded protein Human B7-2 is predicted to be 329 amino acids in length (SEQ ID NO: 2). This protein The white matter sequence exhibits many features common to other type 1 Ig superfamily membrane proteins. Protein translation is a consensus eukaryotic translation initiation site (Kozak, M (1987 ), Nucl. Acids Res. , 15: 8125-8148) Toko ATG codon (nucleotides 107 to 10) based on the DNA homology in the region of It is predicted to start from 9). Amino terminal of human B7-2 protein (Amino acid 1 23) has a predicted cleavage site (von Heijn) between the 23rd and 24th alanines. e (1986), Nucl. Acids Res. , 14: 4683). It has the characteristics of a secretory signal peptide. Unmodified processing at this site A 306 amino acid human B7-2 membrane-bound protein with a molecular weight of approximately 34 kDa I think Will be This protein is an extracellular Ig superpharmaceutical with approximately amino acid residues 24-245. Millie V and C-like domains, a hydrophilic transmembrane of approximately amino acid residues 246-268 Consists of a domain and a long cytoplasmic domain of approximately amino acid residues 269-329 I think that the. Homology with the Ig superfamily is at positions 40 to 110 and 15 Adjacent Ig-like domains in the extracellular region bound by cysteines 7 to 218 Due to two ins. Extracellular domain is a potential N-linked glycosylation site Including eight. CDNA insert of clone 29 encoding human B7-2 protein E. coli transfected with a vector containing Deposited with Lican Type Culture Collection (ATCC) with deposit number 69357 Was done.   GenBank and nucleotide sequences of both human B7-2 And the EMBL database, only the human and murine B7-1 proteins were relevant. It turned out that they are connected. When three B7 protein sequences are aligned (Fig. 13), human B7- It can be seen that 2 has about 26% amino acid identity with human B7-1. Figure 13 is human B7-2 (hB7-2) (SEQ ID NO: 2), human B7-1 (hB7-1) (SEQ ID NO: 28 and 29) and murine B7 (mB7) (SEQ ID NOs: 30 and 31) A comparison of amino acid sequences is shown. Human B7-1 and murine B7 (hereinafter murine B7- 1)) to Genbank under accession number # M27533. And X60958. The vertical line in FIG. 13 is hB7-2. And hB7-1 or mB7. hB7-1 and mB Identical amino acids between 7 and 7 are not shown. hB7-2 protein is Ig superpha Common Cysteine possessed by Millie (40th and 110th positions of IgV domain, IgC domain) Defined by the main 157 and 217 positions) and a number of other common amino acids. 2 shows the same general structure as hB7-1 described above. hB7-1 and mB7 are both human CT These related proteins are known to bind to LA4 and human CD28. Although the common amino acid between the two white matter contains a CTLA4 or CD28 binding sequence Seems necessary. An example of this sequence is KYMGRTSFD (positions 81-89, h B7-2) (SEQ ID NO: 17) or KSQDNVTELYDVS (188-20) It is position 0, hB7-2) (SEQ ID NO: 18). Other related sequences are apparent from sequence comparisons Others are aspartic acid and glutamic acid, alanine and glycine and other Consider homologously related amino acids, such as recognized function-related amino acids Can be inferred by. The B7 sequence is probably involved in intracellular signaling Arou protoplasm part WKWKKKKRPRNSYKC (269-282, hB7 -2) (SEQ ID NO: 19) has a highly positively charged domain.Example 5   Properties of recombinant B7-2 antigen A. B7-2 binds to CTLA4Ig but binds to anti-B7-1 and anti-B7-3 Does not bind to noclonal antibody   COS cells were transferred to vector DNA (pCDNAI) or B7-1 (B7-1). Or any of the expression plasmids containing B7-2 (B7-2) did. After 72 hours, transfected COS cells were treated with 0.5 mM EDTA and EDTA. And incubate in PBS containing 0.02% sodium azide for 30 minutes at 37 ° C. And detached. The cells were subjected to indirect immunofluorescence and isocytosis for cell surface expression. Fluorescein thiocyanate conjugated (FITC) goat anti-mouse Ig or goat It was analyzed by a flow cytometry analysis method using anti-human IgG-FITC (Fig. 9). The cell surface expression of B7-1 is mAbs 133 (anti-B7-1) and BB- 1 (anti-B7-1 and anti-B7-3) and with CTLA4Ig. Method B7-2 was reacted with CTLA4Ig only. B7 transfectant Yes No shifts were stained with the isotype control (IgM or control Ig). Vector -Transfected COS cells were not stained with any of the detection reagents. Sa Moreover, no cells were stained with the FITC-labeled detection reagent. This is B7-2 Encodes a protein that is a CTLA4 counter-receptor, but B7- It is proved that neither 1 nor B7-3 is different.B. B7-2 expression in unstimulated and activated human B cells, cell lines and myeloma RNA blot analysis   Description of human spleen B cells by removing T cells and mononuclear cells (Freed man, A .; S. Freeman, G .; J. Horowitz, J .; C. , Daley, J .; Nadler, L .; M. J. Immunol. (1987 (Year), 137: 3260-3267). Spleen B cells were treated with anti-I Activated with g beads and cells were harvested at the indicated time points (Freeman Do (1987), supra). Reported using E-rosetted and attached bone marrow specimens (Fr eeman, G .; J. J. Immunol. (1989), Volume 143: 2714-2722) to purify human myeloma by removing T cells and monocytes. did. Homogenization of RNA with guanidine thiocyanate and cesium chloride It was prepared by centrifugation. Equal amount of RNA (20 μg) on agarose gel Electrophoresed, stained,32Hybridized to P-labeled B7-2 cDNA. Figure 10 A is non-stimulated and anti-Ig activated human spleen B cells and Raji (B cell -Kit lymphoma), Daudi (B-cell Burkitt lymphoma), RPMI82 26 (myeloma), K562 (erythroleukemia) and REX (T cell acute lymphoblast white RNA blot analysis of cell lines containing (hematosis). Figure 10b shows human myeloma RNA blot analysis is shown.   1.35, 1.65 and 3.0 upon hybridization to B7-2 cDNA Three kb mRNA transcripts were detected (FIG. 10b). RNA blot Analysis showed that B7-2 mRNA was expressed in unstimulated human splenic B cells, and after activation 4 It proved to double. B7-2 mRNA is a B cell neoplastic system (Raji, Daudi) and myeloma (RPMI8226), but erythroleukemia K56 2 and the T cell line REX. In contrast, we previously used B7- 1mRNA is not expressed in resting B cells but transiently expressed after activation. Reported (Freeman, GJ, et al. (1989), supra). Human myeloma B7-2 mRNA was expressed in 6 of 6 patients from a study of mRNA isolated from However, B7-1 was found in only one of the six (F reeman, G .; J. (1989), supra). So B7-1 and B7 It is clear that the expression with -2 is regulated independently.C. Costimulation   Human CD28+T cells have been previously reported in literature (Gimmi, CD, et al. (199 3 years), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 90: 6586- 6590) by immunomagnetic bead removal method as described in B cells, natural killer cells and Separation was performed using a monoclonal antibody against macrophages. B7-1, B7 2 and COS cells transfected with vector 7 after transfection Harvested for 2 hours and incubated with mitomycin C 25 μg / mL for 1 hour And then thoroughly washed. 10FiveCD28+And T cells with phorbol myristay Tol acetate (PMA) 1 ng / mL and the indicated number of COS transfections Incubation with the body (Fig. 11). As shown in FIG. 11a, Growth was 3H-thymi incorporated during the last 12 hours of a 72 hour incubation. It was measured with gin (1 μCi). FIG. 11b was harvested 24 hours after the start of culture. T cells measured by ELISA (Biosource, CA) using supernatant Shows IL-2 production by vesicles.D. B7-2 co-stimulation is not blocked by anti-B7-1 and anti-B7-3 mAbs. But blocked by CTLA4Ig and anti-CD28 Fab   Human CD28+T cells against B cells, natural killer cells and macrophages Previous reports using mAbs (Gimmi, CD, Freeman, G. et al. J. Gribben, J .; G. FIG. Gray, G .; Nadler, L .; M. ( 1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:65 Separation by immunobead removal method as described on pages 86-6590). B7-1, B7- 2 and vector-transfected COS cells after transfection Harvested at 72 hours, incubated with mitomycin C 25 μg / mL for 1 hour And then thoroughly washed. CD28+T cell 10FiveHolbor mil stay Toacetate (PMA) 1 ng / mL and COS transfectant 2 × 10FourPieces And incubated with it. Blocker (10 μg / mL) is shown at the left end of Figure 12. As shown, 1) no monoclonal antibody (no blocking agent), 2) mAb133 (anti-antibody) -B7-1 mAb), 3) mAb BB-1 (anti-B7-1 and anti-B7-3m). Ab), 4) mAb B5 (control IgM mAb), 5) anti-CD28 Fab (mA). b 9.3), 6) CTLA-Ig and 7) control Ig. 12 a is 72 Time Last 12 hours of incubationThreeFor uptake of H-thymidine (1 μCi) Shows the more measured proliferation. FIG. 12b is a supernatant liquid harvested 24 hours after the start of culture. Shows IL-2 production measured by ELISA (Biosource, CA) using You.   COS cells transfected with B7-1 and B7-2 show extensive stimulation / When stimulated by responder cell ratio, it stimulated a corresponding level of T cell proliferation (Fig. 11). Similar to B7-1, co-stimulation of C7 cells transfected with B7-2 is widespread. IL-2 production was shown at the stimulator / responder cell ratio (FIG. 11). By contrast, the vector -Transfected COS cells co-stimulate neither T cell proliferation nor IL-2 production. won.E. FIG. B7-2 costimulation is not blocked by anti-B7-1 and anti-B7-3 mAbs. But blocked by CTLA4-Ig and anti-CD28 Fab   Human CD28+T cells against B cells, natural killer cells and macrophages Previous report using a mAb (Gimmi, CD, Freeman, G.J. . Gribben, J .; G. FIG. Gray, G .; Nadler, L .; M. (1 993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 658 Separation by immunobead removal method as described in pages 6 to 6590). B7-1, B7-2 And COS cells transfected with vector 7 after transfection Harvest at 2 hours, incubate with mitomycin C 25 μg / mL for 1 hour And then thoroughly washed. CD28+T cell 10FiveHolbor myristate Acetate (PMA) Ing / mL and COS Transfectant 2x10Four Incubated with the individual. The blocking agent (10 μg / mL) is the left end of FIG. As shown in 1), 1) Monoclonal antibody-free (no blocking agent), 2) mAb133 ( Anti-B7-1 mAb), 3) mAb BB-1 (anti-B7-1 and anti-B7-3). mAb), 4) mAb B5 (control IgM mAb), 5) anti-CD28 Fab (m). Abs 9.3), 6) CTLA-Ig and 7) control Ig are included. 12 a is 7 Incorporated in the last 12 hours of a 2 hour incubationThreeH-thymidine (1μ Shows proliferation measured by Ci). Figure 12b was collected 24 hours after the start of culture. Up IL-2 production measured by ELISA (Biosource, CA) using clear fluid Is shown.   To distinguish B7-2 from B7-1 and B7-3, B7-1 and B7 CD28 quasi-mitogenically activated with a mAb to -3+T cell Proliferation and IL-2 production were blocked. B7-1 and B7-2COS transfer Vectors co-stimulated T cell proliferation and IL-2 production (FIG. 12). mAb1 33 (Freedman, AS, et al. (1987), supra) (anti-B7-1). And BBI (Boussiotis, VA et al. (In review), Proc. atl. Acad. Sci. USA; Yokochi, T .; Holly, R .; D. Clark, E .; A. (1982), J. Immunol. , Volume 128 : 823-827) (anti-B7-1 and anti-B7-3) are induced by B7-1. Completely blocked induced proliferation and IL-2 production, but transfecting B7-2 There was no effect on the co-stimulation by the cut COS cells. Isotype matched pair Teru B5 mAb was ineffective. B7-2 signals down the CD28 / CTLA4 pathway Anti-CD28 Fab and CTLA4-Ig fusion protein to determine whether to follow The white matter was examined to determine if they blocked B7-2 costimulation. Anti-CD Both 28Fab and CTLA4-Ig are B7-1 or B7-2COS It blocked proliferation and IL-2 production induced by transfectants, while The control Ig fusion protein was ineffective (Fig. 12). CTLA4-Ig is a proliferative B It blocked 7-2 costimulation by 90%, but in another experiment the inhibition was greater ( 98-100%). All blockers are in combination with PMA and phytohemagglutinin It did not inhibit more induced T cell proliferation or IL-2 production.   Similar to B7-1, B7-2 binds to CD28 and CTLA4 T cell surface molecules. Counter counter-receptor. Both proteins are similar in the following respects: 1) A 2) Structurally related to the Ig superfamily, expressed on the PC surface, And IgC domain and 26% amino acid identity; 3) T cell stimulation To produce and proliferate IL-2. However, B7-1 and B7-2 are yes Basically, there are some differences. First, B7-2 mRNA is constitutive to unstimulated B cells. B7-1 mRNA is not expressed until the 4th hour, and is expressed on the cell surface. Surface proteins are not detected until 24 hours (Freedman, AS, etc. (1 987), supra; Freeman, G .; J. (1989), supra). Non Stimulated human B cells do not express CTLA4 counter-receptor on the cell surface and Does not costimulate cell proliferation (Boussiotis, VA, et al., Supra). That Therefore, the expression of B7-2 mRNA in unstimulated B cells is activated on the cell surface after activation. Rapidly expresses B7-2 protein, probably from stored mRNA or protein It seems to make you. Co-stimulation with B7-2 transfectants was partially It is sensitive to paraformaldehyde immobilization, while B7-2 costimulation is resistant. (Gimmi, CD, et al. (1991), Proc. Natl. Aca. d. Sci. USA 88: 6575-6579). Second, cell lines and humans Expression of B7-1 and B7-2 in B cell neoplasms is substantially different. Third In addition, the B7-2 protein has a longer cytoplasmic domain than B7-1, which is Will play a role in differentiation. These are the phenotypes and functional differences It is suggested that these homologous molecules may have distinct biologically distinct functions.Example 6   Cloning and sequencing of murine B7-2 antigen A. Construction of cDNA library   Literature description (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A, 84: 3365 (1987)), dibutyryl cyclic AMP (cA MP) -activated M12 cells (murine B-cell tumor line) to poly (A)+Using RNA PCDM8 vector (Seed, Nature, 329: 840 (198) 7)) and constructed cDNA.   1x10 M12 cells6Complete culture medium in tissue culture flasks up to cells / mL {10% heat inactivated fetal calf serum (FCS) added RPMI1640, 2 mM-glu Tamine, 1 mM-sodium pyruvate, penicillin (100 units / mL), sulfur Streptomycin acid (100 μg / mL) and gentamicin sulfate (5 μg / ML)} and activated with 300 μg / mL dibutyryl cAMP (Na bavi, N.M. Et al. (1992), Nature, 360: 266-268. page). Activated M12 cells were harvested after 0, 6, 12, 18, 24 and 30 hours. Was.   For RNA, activated M12 cells were treated with 4M-guanidine thiocyanate, 0.5% sarco Sil, 25 mM-EDTA, pH 7.5, 0.13% Sigma Antiphore It was prepared by homogenizing in a mixed solution of Mumu A and 0.7% mercaptoethanol. The homogenate was added to 5.7 M-CsCl, 10 mM-EDTA, 25 mM-acetic acid sodium salt. Purify RNA by centrifuging at 32000 rpm for 24 hours in a mixed solution of helium and pH 7. did. The RNA pellet was treated with 5% sarcosyl, 1 mM-EDTA, 10 mM-tri. Soluble in pH 7.5, 50% phenol, 49% chloroform, 1% iso It was extracted with 2 volumes of amyl alcohol. RNA was precipitated twice from ethanol. c Poly (A) used for DNA library construction+RNA is oligo (dT) cellulo It was purified by two cycles of selection.   Complementary DNA is 50 mM-Tris, pH 8.3, 75 mM-KCl, 3 mM-M gCl210 mM-dithiothreitol, 500 μM-dATP, dCTP, dGTP, dTTP, oligo (dT)12-1850 μg / mL, RNasin18 Reaction solution of 0 unit / mL and Moloney-MLV reverse transcriptase 10,000 unit / mL Poly () of murine M12 cells activated with dibutyryl cAMP in a total volume of 55 μL. A)+It was synthesized from 5.5 μg of RNA at 37 ° C. for 1 hour. 25m of solution after reverse transcription M-Tris, pH 8.3, 100 mM-KCl, 5 mM-MgCl2, Each 250 μM-dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 5 mM-dithiothreitol , DNA polymerase 1250 units / mL, ribonuclease H 8.5 units / m Prepare L and incubate for 2 hours at 16 ℃ to convert cDNA into double-stranded DNA Converted Add EDTA to 18 mM and add 50% phenol, 49% Extraction was performed with an equal volume of loroform and a 1% isoamyl alcohol mixed solution. 2.5M DNA -2 volumes of ethanol in the presence of ammonium acetate and linear polyacryl as carrier It was precipitated with 4 μg of luamide. After reverse transcription, heat the reverse transcriptase to 70 ° C for 10 minutes. Was inactivated. 320 μL of water and 0.1 M-Tris, pH 7.5, 25 mM- MgCl2, 0.5M-KCl, 250 μg / mL bovine serum albumin and 5 0 80 μL of a mixed solution of mM-dithiothreitol was added, and the solution was adjusted to 200 μM-dA each. TP, dCTP, dGTP, dTTP, DNA polymerase 150 units / mL, Prepare ribonuclease H8 unit / mL and incubate at 16 ℃ for 2 hours Then, the cDNA was converted into double-stranded DNA. Add EDTA to 18 mM Mixed with 50% phenol, 49% chloroform, 1% isoamyl alcohol Extracted. The DNA was treated with 2 volumes of ethanol in the presence of 2.5 M ammonium acetate. And 4 μg of linear polyacrylamide as carrier.   Add 2 μg of non-self-complementary BstXI adapter to this DNA as follows. Ta: Poly (A)+The double-stranded cDNA from 5.5 μg of RNA was sequenced CTTTAGA 3.6 μg of kinase-treated oligonucleotide of GCACA (SEQ ID NO: 15) and And the sequence CTCTAAAAG (SEQ ID NO: 16) for the kinase treatment oligonucleotide 2 . 4 μg and 6 mM-Tris, pH 7.5, 6 mM-MgCl25 mM-NaC 1, bovine serum albumin 350 μg / mL, 7 mM-mercaptoethanol, 0 . 1 mM-ATP, 2 mM-dithiothreitol, 1 mM-spermidine and 16 at 15 ° C. in a total volume of 0.45 mL containing 600 units of T4 DNA ligase Incubated for hours. Add EDTA to 34 mM and add 50% solution. Extracted with an equal volume of a mixture of ethanol, 49% chloroform, 1% isoamyl alcohol. Was. DNA was precipitated from 2 volumes of ethanol in the presence of 2.5M ammonium acetate. I let you.   DNA above 600 bp was selected as follows: 10 mM adapter DNA -Tris, pH 8, 1 mM-EDTA, 600 mM-NaCl, 0.1% Zarco Redissolve in sill and chromatograph on Sepharose CL-4B column with the same buffer. Ruffy. DNA in the void volume of the column (including DNA of 600 bp or more) Collected and precipitated with ethanol.   pCDM8 vector for cDNA cloning was digested with BstXI and Prepared by Roth gel purification. Poly (A)+Adapt from 5.5 μg of RNA Target DNA to 6 mM-Tris, pH 7.5, 6 mM-MgCl25 mM-Na Cl, bovine serum albumin 350 μg / mL, 7 mM-mercaptoethanol, 0.1 mM-ATP, 2 mM-dithiothreitol, 1 mM-spermidine and And a solution containing 600 units of T4 DNA ligase in a total volume of 1.5 mL at 24 ° C at 15 ° C. At time, 2.25 μg of BstXI cut pCDM8 was ligated. Binding reaction mixture The product was transformed into competent E. coli MC1061 / P3 and all independent cDNA clones 200 × 106I got   Plasmid DNA from 500 mL of original cDNA library transformant culture Manufactured. The plasmid DNA was purified by an alkaline digestion procedure, followed by CsCl Banded twice in an equilibrium gradient (Maniatis et al., Molecular. r ・ Cloning: A ・ Laboratory ・ Manual, Cold ・ S pring Harbor, NY (1987)).B. Cloning procedure   The first stage of screening is 100 mm shear of 50% confluent growing COS cells. 30 cells of activated M12 murine B cell library DNA at 0.05 μg / mL DEAE-dextrin method (Seed et al., Proc. Natl. Acad. S ci. USA, 84: 3365 (1987)). did. Cells were trypsinized and reseeded 24 hours later. 47 hours later, In PBS / 0.5 mM-EDTA, pH 7.4 / 0.02% sodium azide, Desorption was carried out by incubation at 37 ° C for 30 minutes. The detached cells are transferred to human CTLA4 Ig and murine CD28Ig were treated with 10 μg / mL for 45 minutes at 4 ° C. Wash cells , Spray onto a culture dish coated with affinity-purified goat anti-human IgG antibody, and It was attached at a warm temperature. After 3 hours, plate the plate with PBS / 0.5 mM-EDTA, pH7. . 4 / 0.02% sodium azide, 5% FCS twice and 0.15M Na Gently wash once with Cl, 0.01 M-Hepes, pH 7.4, 5% FCS did. Episomal DNA was harvested from cultured cells and transformed into E. coli DH10B / P3 Transformed. Spheroplast fusion of plasmid DNA (Seed) Etc., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 3365 ( 1987)) and reintroduced into COS cells, and repeated the expression and culture cycle twice. did. In the second and third stages of selection, 47 hours later, the detached COS cells were first treated. Incubation with α-murine B7-1 mAb (16-10A1, 10 μg / mL) Show And coat COS cells expressing B7-1 with α-mouse IgG and IgM The magnetic beads were removed. COS cells were then transfected with human CTLA4Ig and murine CD28Ig was treated with 10 μg / mL, and murine B7-2 expressing COS cells were goat. Selection was performed by culturing on a dish coated with anti-human IgG antibody. After the third stage, each A plasmid DNA was prepared from Ronnie and the COS was determined by the DEAE-dextran method. Cells were transfected. B7-2 on transfected COS cells Expression was analyzed by indirect immunofluorescence with CTLA4Ig.   After the final stage of selection, plasmid DNA was produced from each colony. Candidate claw Of the eight, a total of six contained a cDNA insert of approximately 1.2 kb. Black COS cells were transfected with 8 plasmid DNAs. 1.2 Kb Indirect immunization with CTLA4Ig for all 6 clones with cDNA insert B7-2 expression was strongly positive by fluorescence and flow cytometric analysis.C. Sequencing   The B7-2 cDNA insert of clone 4 was expressed in pCDM8 using the following strategy. Sequenced in the K. Sequencing primer T7, clone The CDM8R (I homologous to the CDM8 vector sequence flanking the cloned B7-2 cDNA. nVitrogen) (see Table II). Sequencing is the dye termi Noether reaction and ABI automatic DNA sequencer (ABI, Foster Cit y, CA). The DNA sequences obtained using these primers are The following sequencing primers were used to design (see Table II). This sequencing and Complete the cycle of next-stage primer selection for murine B7-2 cDNA for both strands. Continued until sequenced.   One of the resulting murine B7-2 clones (mB7-2, clone 4) was 116. A three base pair insert and a single long open reading frame of 927 nucleotides and approximately Includes a 126 nucleotide 3'non-coding sequence (Figure 14, SEQ ID NO: 22) Was. The amino acid sequence predicted to be encoded by the open reading frame of this protein is shown in Figure 1. It is shown below the nucleotide sequence of 4. The encoded murine B7-2 protein has a length It is predicted to be 309 amino acid residues (SEQ ID NO: 23). This protein sequence is Shows a number of features common to the type I Ig superfamily membrane proteins of. Protein translation Consensus Eukaryotic translation initiation site (Kozak, M (1987), Nucl . Acids Res. , 15: 8125-8148). Methionine codon (ATG, nucleotides 111-111) based on the DNA homology of 113). Amino terminal of the murine B7-2 protein (amino Acids 1 to 23) between the alanine at position 23 and the valine at position 24 (v) on Heijne (1987), Nucl. Acids Res. , Volume 14 : 4683). Process at this site Singing is a 286 amino acid murine B7-2 membrane with an unmodified molecular weight of approximately 32 kDa. It is believed to result in a binding protein. This protein contains approximately amino acid residues 24-246. Extracellular Ig superfamily V and C-like domains of C, approximately amino acid residue 24 7-265 hydrophilic transmembrane domain and approximately the length of amino acid residues 266-309 It is thought to be composed of a protoplasmic domain. Homology with Ig Superfamily The sex is the type of cysteine to which the cysteines at positions 40 to 110 and 157 to 216 bind. Due to two adjacent Ig-like domains in the extracellular region. Extracellular domain is N-linked It also contains 9 potential glycosylation sites, probably similar to murine B7-1 It is glycosylated. Glycosylation of the murine B7-2 protein has a molecular weight of about 5 Increase to 0-70 kDa. The cytoplasmic domain of murine B7-2 is Is likely to be followed by a It contains a common region with amino acids charged in a lath. Nucleotide of murine B7-2 Oh Of both amino acid and amino acid sequences with GenBank and EMBL databases And significant homology between human and murine B7-1 (amino acid sequence identity about 26%) showed that. Murine B7-2 has 50% identity and 6 similarity with human homologue hB7-2. 7%. The cDNA insert encoding murine B7-2 (clone 4) E. coli (DH1) transfected with a vector containing (plasmid pmBx4) 06 / p3) is the American Type Culture Collection on August 18, 1993. (ATCC) with deposit number 69388.D. Costimulation   CD4+Mouse T cells are primarily Tris-NHFourTreatment with Cl to remove red blood cells Purified. T cells were concentrated through a nylon wool column. CD4+T cells Treated twice with mAb mixture of anti-MHC class II and anti-CD28 and rabbit complement. And refined. Mouse B7-1 (Dana-Farber Cancer Institute, Boston , Dr. Gordon Freeman, MA; Freeman, G .; J . (1991), J. Exp. Med. 174: 625-631 C.), COS cells transfected with murine B7-2 and vector. 72 hours after transfection, harvested with mitomycin C 25 μg / mL and 1 Incubate for hours and wash thoroughly. Mouse CD4+T cell 10FiveThe individual Rubor myristate acetate (PMA) 1 ng / mL and COS transformer Perfect body 2 × 10FourIncubated with individual (Table III). T cell proliferation Incorporated in the last 12 hours of a 72 hour incubationThreeH-thymidine (1 μCi). Example 7  Construction and characterization of human B7-2 immunoglobulin fusion protein A. Production of human B7-2Ig fusion protein   A fusion protein in which the extracellular portion of human B7-2 is bound to an immunoglobulin constant region Manufactured. Immunoglobulin constant regions are essential effects of immunoglobulin structure. It may also include genetic modifications, including modifications that diminish or eliminate target activity. Total In general, the DNA encoding the extracellular portion of hB7-2 Hinge, CH2 and CH3 regions of modified human IgCγ1 or human IgCγ4 Bound to the DNA encoding the region. This is as described in the subsection below. I went.B. Preparation of gene fusion   The DNA fragment corresponding to the desired DNA sequence is Prepared by merase chain reaction (PCR). Generally, PCR reactions are (1 μM each), dNTP (200 μM each), 1 ng template DNA, And Taq polymerase (Saiki et al. (1988), Science, 2 39: 487-491) containing Taq polymerase buffer (Gene Am). p-PCR kit, Perkin-Elmer / Cetus, Norwalk, CT) Prepared in a final volume of 100 μL. DNA amplification by PCR is thermosaid Each is a denaturation step using Clark (Ericomp San Diego, CA) (94 ° C. for 1 minute), regeneration step (54 ° C. for 30 seconds) and chain extension step (72 ° C.) For 1 minute) for 25 to 30 cycles. Each hB7-2-Ig The structure of the gene fusion is based on the extracellular domain of B7-2 and human IgCγ1 or I. of a secretagogue signal that binds to the hinge, CH2 and CH3 domains of gCγ4 Consists of an array. The sequences of IgCγ1 and IgCγ4 are within the hinge region Nucleo with a cysteine residue capable of forming a disulfide bond replaced by a serine residue Includes tide conversion and additionally the CH2 domain IgC binding to Fc receptors and complement It may include nucleotide changes that replace amino acids that are likely to be required for activation.   Sequence analysis confirmed the structure of the mγ4 and mγ1 clones, using each construction 293 cells were transfected and examined for transient expression. hIgG / ELIS Transients approximately equal to 100 ng protein / mL cell supernatant for both constructs by A Expression level was observed / confirmed. Transfection and fusion of NSO cell lines Permanent expression of protein was performed.C. Construction of hB7-2Ig fusion protein gene   (1) Preparation of signal sequence   Suitable for secretion of B7-2Ig fusion protein from mammalian cells using PCR amplification An immunoglobulin signal sequence was produced. This Ig signal sequence is a murine IgG A plasmid containing a heavy chain gene (Orlandi, R. et al. (1989), Pr. oc. Acad. Natl. Sci. USA, 86: 38333837). Oligonucleotide 5'-GGCACTAGGTCTCCAGCTTTGAGA TCACAGTTCTCTCTAC-3 '(# 01) (SEQ ID NO :) in the forward direction Oligonucleotide 5'-G as a forwarder / primer CTTGAATCTTCAGAGGAGCCGGAGTGGACACCTGTGG -3 '(# 02) (SEQ ID NO :) is used as a reverse PCR primer (reverse It was used as a PCR / primer). Forward PCR primer (sequence No. :) contains the recognition sequence for the restriction enzyme BsaI and contains the 5'starting sequence of the Ig signal sequence. It is homologous to the sequence for thionine. Reverse PCR primer (SEQ ID NO :) is hB 7-2 is derived from the extracellular domain 5'terminal and the Ig signal sequence 3'terminal It consists of an array. Murine Ig signal template using these primers PCR amplification of rate DNA gives a 224 bp product, which is BsaI restricted. Site followed by the first 20 nucleotides encoding the extracellular domain of hB7-2 It is composed of the sequence of the Ig signal region fused to the sequence of Otide. signal The binding point between the sequence and hB7-2 is correct for protein translation initiated by the signal sequence It continues through hB7-2 in the reading frame.   (2) Preparation of hB7.2 gene segment   The extracellular domain of the hB7-2 gene is an expression vector pCDNAI (Freem). Ann et al., Science, 262: 909-11 (1994)). Prepared by PCR amplification of a plasmid containing the hB7-2 cDNA:   The extracellular domain of hB7-2 is the oligonucleotide 5'-GCTCCTCTG. AAGATTCAAGC-3 '(# 03) (SEQ ID NO :) as a forward primer Oligonucleotide 5'-GGCACTATGATCAGGGGGAGGGC Use TGAGGTCC-3 '(# 04) (SEQ ID NO :) as the reverse primer. It was prepared by PCR amplification. Forward PCR primer is B7-2 extracellular An inverted PCR primer containing a sequence corresponding to the first 20 nucleotides of the main Is the last 22 nucleotides of the B7-2 extracellular domain followed by Bcl It contains sequences corresponding to the I restriction site and 7 non-coding nucleotides. Primer PCR amplification with # 03 and # 04 was similar to extracellular IgV and IgC of hB7-2 Provide a 673 bp product corresponding to the domain followed by the unique BclI restriction site I can.   The signal sequence was bound to the extracellular portion of hB7-2 by PCR as follows. DNA corresponding to the signal sequence and hB7-2 extracellular domain obtained above Of the PCR product of the above is mixed in an equimolar amount, heated to 100 ° C to denature, and heated to 54 ° C to 30 ° C. The complementary ends to anneal, leaving both strands dNTP and Toq polymerase Was satisfied with. PCR amplification by adding PCR primers # 01 and # 04 To prepare a complete fragment to prepare the BsaI restriction site followed by the extracellular domain of hB7-2. Consists of a main fused signal sequence followed by a BclI restriction site ~ 880 fragments were obtained.   (3) Cloning and modification of immunoglobulin fusion domain   Plasmid pSP721gG1 is human IgG1 heavy chain genomic DNA 2000b p segment (Ellison, JW, et al. (1982), Nucl. Ac. ids Res. 10: 4071-4079) cloning vector p At the multiple cloning site of SP72 (Promega, Madison, WI) It was cloned and prepared. Plasmid pSP721gG1 is human heavy chain IgCγ Of the genome encoding the CH1, hinge, CH2 and CH3 domains of one gene It contained DNA. The hinge-CH2-CH3 portion of the heavy chain along with the intermediate DNA PCR primers designed to amplify were prepared as follows. Forward PC R primer 5'-GCATTTTAAGCTTTTTCCTGATCAGGA GCCCAAAATTCTCTGACAAAACTCACACATCTCCACC GTCTCCAGGTAAGCC-3 '(SEQ ID NO :) is HindIII and Nucleotides containing a BclI restriction site and changing three cysteine residues to serines It was homologous with respect to the hinge domain sequence except for 5 substitutions. Reverse PCR plastic Immers 5'TAATACGACTCACTATAGG-3 '(SEQ ID NO :) Same as commercially available T7 primer (Promega, Madison, WI) there were. Amplification with these primers resulted in HindIII and 5'-terminal It binds to the BclI restriction site and binds BamH1, Sma1, Kpn1, S at the 3'-terminal. binds to the ac1, EcoR1, Cla1, EcoR5 and Bg111 restriction sites A 1050 bp fragment was obtained. This fragment contained the IgC hinge domain However, there, three cysteine codons were replaced with serine codons, followed by With a CH2 domain, an intron, a CH3 domain and a subsequent 3'sequence. I was After PCR amplification, the DNA fragment was digested with HindIII and EcoR1, It was cloned into the expression vector pNRDSH digested with the same restriction enzymes. With this Rasmid pNRDSH / IgG1 was obtained.   Using a similar PCR strategy, hinge-CH2 of the human IgCγ4 constant region. The -CH3 domain was cloned. Contains the complete IgCγ4 heavy chain genomic sequence (Ellison, J., Buxbaum, J. and Hood, LE (1 981), DNA) 1: 11-18) Plasmid p428D (Medic) al Research, Council, London, UK) Ochid 5'GAGCATTTTCCTGATCAGGAGTCCAAAATG GTCCCCCCATCCCATCATCCCCAGGTAAGCCAACCC- 3 '(SEQ ID NO :) was used as a forward PCR primer and oligonucleotide 5'G CAGAGAGAATCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCCAGGT GTGGGGGACAGTGGACCCCTCTGCCCTCCC-3 '(SEQ ID NO: No. :) was used as a template for PCR amplification using as a reverse PCR primer. square The forward PCR primer (SEQ ID NO :) was followed by a BclI restriction site followed by IgCγ4 Including the sequence encoding the domain. The cysteine residue in the hinge region remains with serine Nucleotide substitutions were made to replace the groups. Reverse PCR primer Row number :) contains the PspAI restriction site (5'CCCGGG-3 '). These programs PCR amplification with the Limer gave a 1179 bp DNA fragment. PCR product B pNRDSH / IgG1 digested with clI and PspAI and digested with the same restriction enzymes Was ligated to obtain the plasmid pNRDSH / IgG4. Ig in this reaction Cγ4 domain is a replacement for the IgCγ1 domain that was present in pNRDSH / IgG1 It was a substitute.   Amino acids that are thought to be involved in binding to Fc receptors in the CH2 domain within IgC Modification by exchanging was carried out as follows. The plasmid pNRDSH / IgG1 The plasmid pNRDSH / IgG was used as a template for modification of the gCγ1CH2 domain. 4 was used as a template for modification of the IgCγ4CH2 domain. Plasmid pNRDS H / IgG1 is a forward PCR primer (SEQ ID NO :) and an oligonucleotide 5'-GGGTTTTTGGGGGAGAAGGAGAGACTGACGGGTG CCCCCTCGCGCTTCAGGTGCTGAGGAAG-3 '(SEQ ID NO: Was used as the reverse PCR primer for PCR amplification. Forward PCR primer (Distribution The sequence number :) was previously described and the reverse PCR primer (SEQ ID NO :) was amino Acids 234, 235 and 237 (Canfield, SM and Morri). son, S.M. L. (1991), J. Exp. Med. , 173: 1483 ˜1491) from Leu to Ala, Leu to Glu and Gly to A, respectively. CH of IgG1 except for 5 nucleotide substitutions designed to convert to la It is homologous to the amino-terminal part of the two domains. Fix by amplification of these PCR primers 2 composed of decorative hinge domain, intron and modified CH2 domain part A 39 bp DNA fragment is obtained. About plasmid pNRDSH / IgG1 Is an oligonucleotide 5'-CATCTCTTCCTCAGCACCTGAAG CCGAGGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCC-3 ' (SEQ ID NO :) as the forward primer and the oligonucleotide (SEQ ID NO :) as PCR amplification using the reverse PCR primer was also performed. Forward PCR primer ( SEQ ID NO :) is complementary to the primer (SEQ ID NO :) and is the amino acid of CH2. Includes 5 complementary nucleotide changes required for substitution. Reverse PCR primer (sequence The number :) is described before. Amplification with these primers was modified CH2 Consists of main part, intron, CH3 domain and 3'additional sequence A 875 bp fragment was given. Modified hinge domain, modified CH2 domain and C Complete IgCγ1 segment composed of H3 domain is subjected to one more PCR reaction Prepared by The products of the two PCR reactions were purified, mixed and denatured (9 5 minutes at 5 ° C) and then refolding (30 minutes at 54 ° C) to insert the complementary ends of the two fragments. Kneeled. Both chains were filled with dNTP and Taq polymerase (fill l · in), and the entire fragment was subjected to forward PCR primer (SEQ ID NO :) and reverse P Amplification was performed using the CR primer (SEQ ID NO :). The resulting 1050 bp fragment Was purified, digested with HindIII and EcoRI, and previously digested with the same restriction enzymes Ligation into pNRDSH gave plasmid pNRDSHIgG1m.   The two amino acids at positions 235 and 237 of the immunoglobulin are respectively Leu to G Change from lu and Gly to Ala to receive Fc in the IgCγ4CH2 domain The volume bound was removed. Forward primer for plasmid pNRDSH / IgG4 (SEQ ID NO :) and the oligonucleotide 5'-CGCACGTGACCTCA. GGGGTCCGGGAGATCATGAGAGAGTGTCCTTGGGTTTTT GGGGGGGAACAGGAAGACTGATGGGTGCCCCCTCGAAC TCAGGTGCTGAGGG-3 '(SEQ ID NO :) was used as the reverse primer. PCR amplification was also performed. The forward primer was previously described, and the reverse PCR Immers have C except for 3 nucleotide substitutions designed for the amino acid substitutions. It is homologous to the amino-terminal part of the H2 domain. This primer is It also contains a PmII restriction site for cloning. Modification by amplification with these primers 256 composed of di-region, intron and modified 5'portion of CH2 domain A bp fragment was obtained.   Oligonucleotide 5'-CCTCAGCACCTGAGTTCGAGGGG GCACCCATCAGTCTCCTGTTCCCCCCAAAAACCCAAGG ACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCCTGAGGTCACGT GCG-3 '(SEQ ID NO :) was used as a forward primer and oligonucleotide ( The plasmid pNRDSH / IgG is also used as the reverse PCR primer with the column number :). 4 was PCR amplified. The forward PCR primer (SEQ ID NO :) A complementary nucleotide complementary to the column number :) and required for CH2 amino acid replacement Includes 3 changes in tide. The reverse PCR primer (SEQ ID NO :) was previously described. You. Amplification with these primers modified CH2 domain part, intron, CH A 1012 bp fragment composed of 3 domains and a 3'addition sequence was obtained. Modification Completely composed of hinge domain, modified CH2 domain and CH3 domain The IgCγ4 segment was prepared in one additional PCR reaction. 2 times PCR reaction The reaction product was purified, mixed, denatured (95 ° C, 1 min) and then regenerated (54 ° C, After 30 seconds, the complementary ends of the two fragments were annealed. Both chains are dNTP and T Sequential PCR primer (SEQ ID NO: :) and the reverse PCR primer (SEQ ID NO :). Got The 1179 bp fragment was purified, digested with BcII and PspAI, and digested with the same restriction enzymes. The plasmid pNRDSH / Ig was ligated to pNRDSH that had been digested with the enzyme. G4m was obtained.   (4) Assembly of final hB7-2Ig gene   PCR fragment corresponding to the Ig signal-hB7-2 gene fusion prepared above Was digested with BsaI and BclI restriction enzymes to obtain HindIII and Bcl in advance. PNRDSH / IgG1, pNRDSH / IgG1m, pN digested with I It was ligated to RDSH / IgG4 and pNRDSH / IgG4m. Combined plastic Sumid CaCl2Competent cells E. coli JM109 and transformed Picillin (50 μg / mL) Molecular Cloning: A Lab oratory Manual (1982), Maniatis, T .; , Fi tsch, E .; E. FIG. And Sambrook, J .; Hen, Cold Spring -Harbor-Laboratory) was selected on L-agar. Transformation Plasmids isolated from recombinant E. coli were analyzed by restriction enzyme digestion. Predicted Sequencing the restriction plasmid to signal hB7-2-IgG gene fusion segment I confirmed all parts.D. Expression cloning of hB7-2V-IgG1 and hB7-2C-IgG1   The variable and constant domains of human B7-2 are separately in pNRDSH / IgG1. Cloned. These clonings were performed using PCR. Variable and The portion of hB7-2 corresponding to the constant region is intron / exon map and published. Determined from the gene structure analysis.   (1) Assembly of hB7-2VIg   The hB7-2V domain Ig sequence was assembled using a PCR strategy similar to that described above. The signal sequence was converted to onco by PCR amplification of a plasmid containing the oncoM gene. Oligonucleotide 5'-GCAACCGGAAGCTTGCCA from M gene CCATGGGGGGTACTGCTCACACAGAGAGACG-3 '(# 05 ) (SEQ ID NO :) as a forward PCR primer and 5'-AGTCTCATTG AAATAAGCTTGAATCTTCAGAGGAGCCCATGCTGGGCC Reverse ATGCTTGGAAACAGGAG-3 '(# 06) (SEQ ID NO :) Induced using as a primer. Forward PCR primer (# 05) is Hin It contains a dIII restriction site and the amino terminal portion of the oncoM signal sequence. Opposite PCR for PCR (# 06) is onc fused to the 5'terminal of hB7-2IgV-like domain It includes a sequence corresponding to the 3'portion of the oM signal sequence.   The hB7-2IgV-like domain is an oligonucleotide 5'-CTCCTGTTT. CCAAGCATGGCCAGCATGGCTCCCTCTGAAGATTCAG GCTATTTTCAATGAGAC-3 '(# 07) (SEQ ID NO :) in the forward direction , Oligonucleotide 5'-TGTGTGTGGAGATTCTCATTACTG ATCAAGCACTGACAGTTCAGAATTCATC-3 '(# 08) P of hB7-2 cDNA using (SEQ ID NO :) as a reverse PCR primer Obtained by CR amplification. PCR amplification with these primers will yield H having the 3'terminal portion of the gnall sequence at the 5'terminal and the BclI restriction site at the 3'terminal The B7-2IgV domain was obtained. Signal and IgV domain in PCR reaction Joined. Where the oncoM signal and IgV domain DNA fragment are equimolar The amounts were mixed, denatured, annealed and the chains were filled. Forward primer # 05 And a HindIII restriction site in subsequent PCR amplification using reverse primer # 08 Position followed by the oncoM signal fused to the B7-2IgV domain, followed by Bc A DNA fragment containing the 11 restriction site was obtained. This PCR fragment was designated HindIII and Expression vector pNRDSH / IgG digested with BclI and digested with the same restriction enzymes 1 to obtain pNRDSH / B7-2CIg.   (2) Assembly of hB7-2CIg   The expression plasmid for the hB7-2IgC domain is specific for the IgC domain Prepared as described above for IgV except that different PCR primers were used. I made it. The signal sequence oncoM is used to direct oligonucleotide # 05 in the forward PCR Oligonucleotide 5'-AGAAATTTGGTACTATTT CAGGTTGACTGAAGTTTAGCCATGCTGGCCATGCTTG GAAACAGGAG-3 '(# 09) (SEQ ID NO :) in the reverse PCR primer Manufactured as The hB7-2IgC domain is an oligonucleotide 5 ' -CTCCTGTTTCCAAGCATGGCCAGCATGGCTAACTT CAGTCAACCTGAAATATAGTACAATTTC-3 '(# 11) ( SEQ ID NO :) was used as the reverse PCR primer. Both PCR products Were mixed with each other and amplified with primers # 05 and # 11 to obtain the signal sequence oncoM. The hB7-2IgC domain was assembled. This PCR product is then transferred to HindIII And the expression vector pNRDSH digested with BclI and digested with similar restriction enzymes / IgG1 and the final expression plasmid pNRDSH / hB7-2CIg G1 was obtained.E. FIG. Assay for competitive binding by human B7-2Ig fusion protein   Various B7 family-Ig fusion proteins immobilized on biotinylated CTLA4Ig B7-2 The ability to competitively inhibit binding to Ig was measured. Competitive binding assay is as follows McPherson (McPherson, GA (1985), J. . Pharmacol. Methods, 14: 213-228). analyzed. Soluble hCTLA4Ig125About 2 × 106Ratio of cpm / pmol Actively labeled. hB7-2-Ig fusion protein 10 μg / mL pH 8.0 10 Microtiter plates were coated overnight with 50 μL / well of mM-Tris solution. C Binding buffer (10% heat inactivated FBS, 0.1% BSA and 50 mM-B). Blocked with DMEM with ES, pH 6.8) for 2 hours at room temperature. Each well Full length B7-2 (hB7-2Ig), full length B7-1 (hB7-1Ig), B 7-2 (hB7-2VIg) variable region-like domain and B7-2 (hB7-2C) Ig) In the presence or absence of an unlabeled competing Ig fusion protein containing a constant region-like domain Labeled CTLA4-Ig (4 nM) was added to and allowed to bind at room temperature for 2.5 hours. C The cells were washed once with ice cold binding buffer and then four times with ice cold PBS. The well 0. The bound radioactivity was recovered by treating with 5N-NaOH for 5 minutes, and the dissolved substance was removed. Counted with a line counter.   The results of these tests are shown in FIG. 15. Here, hB7-2Ig (10-20 n M) and hB7-2VIg (30-40 nM) are both immobilized B7-2 proteins Binding to CTLA4Ig is inhibited. hB7-2CIg is soluble CTLA B7-2 binding region was found to be in the variable region-like domain without competing with 4.F. Assay for competitive binding for B7-1 and B7-2 fusion proteins   The ability of various types of recombinant CTLA4 to bind to hB7-1 or hB7-2 It was evaluated by competitive binding ELISA assay as follows. Purified recombinant hB7-Ig Coster EIA / RIA96 overnight at room temperature in 50 μL (20 μg / mL PBS). Well microtiter dish (Costar, Cambridge, MA, US Bound to A). Each well was washed 3 times with 200 μL of PBS and 1% BSA-P BS was added (200 / well) to block unbound areas for 1 hour at room temperature. Each way Were washed as above. Biotinylated hCTLA4IgG1 (ref, MFG R, 1 μg / mL, serial 2-fold dilution, up to 15.6 ng / mL, 50 μL). And incubated at room temperature for 2.5 hours. Each well is Washed. The bound biotinylated CTLA4Ig is streptavidin-HRP. (Pierce / Chemical, Rockford, IL) 1: 2000 The diluted solution 501/1 was added at room temperature for 30 minutes for detection. Wash wells as above Then, add 50 μL of ABTS (Zymed, California) for 30 minutes Afterwards, a blue color was observed at 405 nm. Figure 1 shows a graph of typical binding test results. 6 is shown. Biotinylated CTLA4 proved to be unsaturated with varying amounts of competing proteins IgG1 aliquot (ie 70 ng / mL, 1.5 nM) was mixed and Various types of CTLA4 were labeled with biotinylated CTLA4IgG1 Competing performance was evaluated (Figure 15). Expected for biotinylated CTLA4 IgG1 A decrease in the signal (absorbance at 405 nm) indicates competition for binding to hB7-1.   Considering the above evidence that CTLA4 is a high affinity receptor for B7-1, The binding strength of CTLA4 and CD28 to B7-1 and B7-2 was compared. B7 -1-Ig or B7-2-Ig was labeled with biotin to give various concentrations of unlabeled B7 CTLA4-Ig immobilized in the presence or absence of -1-Ig or B7-2-Ig Was bound. The experiment125Even with I-labeled B7-1-Ig or B7-2-Ig Restored. Using this solid phase binding assay, the binding strength of B7-2 to CTLA4 (2.7 nM) is about twice as large as that observed in B7-1 (4.6 nM). Was measured. IC determined experimentally50Values are shown in the upper right corner of the figure. For CD28 Both B7-1 and B7-2 have low affinity and it is not possible to draw a reliable conclusion. It was difficult.Example 8   Production and characterization of monoclonal antibody against human B7-2 A. Immunity and cell fusion   Balb / c female mice (Taconic Laboratories, Germantown, N. Complete Freund's adjuvant (obtained from Y) (Sigma / Chemi) cal, St. Louis, MO) emulsified human B7.2-Ig 50 [mu] g or CHO-human B7.2 cells 106The individual was intraperitoneally administered to immunize. mouse Incomplete Freund's Adjuvant (Sigma / Chemical, StLo ui, MO) emulsified in human B7.2-Ig 10-25 μg twice or Following initial immunization with CHO-human B7.2 cells, the following 2 months with an interval of 14 days were added. It was boosted. Blood was collected from the retro-orbital region of mice, and serum was used for human B7.2-Ig. The presence or absence of antibodies reactive to this immunogen was assayed by ELISA. hCTL ELISA for A4-Ig was also performed to control for Ig tail directed antibody response And Human hB7.2-Ig25 was administered via tail vein to mice showing strong serum reaction. μg to phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2 (GIBCO, Grand · Is) Land, NY) to give an intravenous booster immunization. 3 days after this booster After 4 days, neither the heavy chain nor the light chain of immunoglobulin can be secreted into the mouse spleen (Kearn ey et al. (1979), J. Immunol. , 123: 1548) SP 2/0 myeloma cells (American, Type, Culture, Colle action, Rockville, MD, No. CRL8006) 5: 1 I entered. The method developed by Kohler and Milstein (Nature ( 1 1975), 256: 495).B. Antibody screening   10 to 21 days later, supernatant of well containing hybridoma colonies from injection Were screened for the presence of antibodies reactive to human B7.2 as follows. : Each well of a flat-bottom 96-well plate (Costar, catalog number 3590) was human Coat with 50 μL of B7.2-Ig 1 μg / mL solution or lysine-coated plate at 4 ° C. 3T3-hB7.2 cells 5 x 10 in phosphate buffered saline, pH 7.2FourCoat in pieces I did it. Aspirate the human B7.2-Ig solution or treat the cells with glutaraldehyde. Attach to plate, wash each well 3 times with PBS, then 1% BSA (PBS) solution (1 00 μL / well) for 1 hour at room temperature. This blocking incubator After the incubation, the wells were washed 3 times with PBS, and the hybridoma supernatant was added at 50 μL per well. In addition, it was incubated at room temperature for 1.5 hours. After this incubation Wells were washed 3 times with PBS, then horseradish peroxidase at room temperature. -Binding, affinity purification, goat anti-mouse IgG or IgM heavy and light chains-specific Antibodies (HRP, Zymed Laboratories, San Franc) Isco, CA) 1: 4000 dilution with 50 pL per well for 1.5 h. Incubated. The wells are then washed 3 times with PBS and subsequently the bound antibody is examined. 1 mM with 30% hydrogen peroxide 1: 1000 dilution added as substrate for outgoing HRP -2,2-Azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABT S) 0.1 M sodium citrate, pH 4.2 in 50 μL per well Incubated for 30 minutes. Then, an automatic reading spectrophotometer (Dynatec OD by h, VA)410The absorbance was measured with.   Three hybridomas, HA3.1F9, HA5.2B7 and HF2.3D1 It was confirmed to produce an antibody against human B7.2-Ig. HA3.1F9 is IgG1 isotype, HA5.2B7 are IgG2b isotype and HF2.3 D1 was determined to be the IgG2a isotype. Two more of these hybridomas It was confirmed to be a monoclonal by subcloning twice. Each hybridoma Cells are American type culture collections that meet the provisions of the Budapest Treaty. ATCC deposit number --- (Hybridoma HA3.1F9), ATCC receipt number No .---- (Hybridoma HA5.2B7) and ATCC Deposit No .---- (High Bridoma HF 2.3D1) was deposited on July 19, 1994.C. Competitive ELISA   Above from hybridoma HA3.1F9, HA5.2B7 and HF2.3D1 The clear fluid was further analyzed by competitive ELISA and immobilized hB7-2 immunoglobulin fusion Of a monoclonal antibody that blocks the binding of biotinylated hCTLA4Ig to proteins The performance was examined. Biotinylation of hCTLA4Ig is performed by Immun from Pierce. Using pure NHS-LC Biotin (catalog number 21335) went. The B7-2 immunoglobulin fusion protein used was hB7.2-Ig (complete Long hB7-2), hB7.2-VIg (hB7-2 of variable domain only) and It was hB7.2-CIg (hB7-2 with constant domain only). hB7.1- Ig fusion protein was used as a control. For ELISA, use 96-well plate with Ig fusion Coated protein (20 μg / mL solution at 50 μL / well) was coated overnight at room temperature. We The cells were washed 3 times with PBS and washed with 10% fetal bovine serum (FBS) and 0.1% fetal bovine serum. Block with lubumin (BSA) in PBS for 1 hour at room temperature, then add 3 with PBS. Washed twice. 50 μL of Bio-hCTLA4-Ig (70 ng / mL) was added to each well. 50 μL of competitive monoclonal antibody supernatant was added. Control antibody is anti-B7.1 mAb (EW3.5D12) and anti-hB7-2 mAb B70 (IgG2bκ. , Pharmingen). Wash each well again and strepto Avidin-conjugated horseradish peroxidase (from Pierce Talog # 21126, 1: 2000 dilution, 50 μL / well) and add 3 at room temperature Incubated for 0 minutes. The wells were washed again and subsequently used as a substrate for HRP 30% hydrogen peroxide added at 1: 1000 dilution to detect antibody S 0.1 M-sodium citrate, pH 4.2 3 in 50 μL per well Incubated for 0 minutes. Then, an automatic reading spectrophotometer (Dynatec) OD by h, VA)410The absorbance was measured with. The results shown in Table IV below are hive Each produced from lidoma HA3.1F9, HA5.2B7 and HF2.3D1 mAb is hCLTA4Ig full length hB7.2-Ig or hB7.2-VIg. (HCLTA4Ig hB7.2 -Does not bind to CIg). D. Flow cytometry   Above from hybridoma HA3.1F9, HA5.2B7 and HF2.3D1 The clear fluid was also analyzed by flow cytometry. The supernatant collected from the clones CHO and 3T3 cells transfected to express hB7.2 (C HO-hB7.2 and 3T3-hB7.2) on or transfected controls. Screened by flow cytometry on 3T3 cells (3T3-Neo) did. Flow cytometry was performed as follows: 1 x 10 cells.61% BS Wash 3 times with PBS solution A, then 1x10 cells6Hybridoma supernatant per cell Incubated in 50 μL of liquid or culture for 30 minutes at 4 ° C. Incu After basation, cells were washed 3 times with 1% BSA in PBS, then fluorescein. In-conjugated goat anti-mouse IgG or IgM antibody (Zymed Laborat ories, San Francisco, CA) 1:50 dilution 1 x 106 Incubated at 4 ° C. for 30 minutes with 50 μL per cell. Then the cells Wash 3 times with 1% BSA in PBS and fix with 1% paraformaldehyde solution did. The cell preparation was then placed on a FACScan flow cytometer (Becton D ickinson, San Jose, CA). 17, 18 and The results shown in Figure 19 are for hybridoma HA3.1F9, HA5.2B7 and HF2. The monoclonal antibodies produced by 3D1 bind to hB7-2 on the cell surface, respectively. It proves that they will fit.E. FIG. Inhibition of human T cell proliferation by anti-hB7-2 mAb   The hybridoma supernatant containing anti-human B7-2 mAb is human T cell hB7-2. The ability to block costimulation was investigated. In this assay, purified CD28+Human T Cells were treated with a sub-mitogenic amount of PMA (1 ng / mL) to obtain the primary signal, Co-stimulatory signals were obtained in CHO cells expressing hB7-2 on the surface. T cell proliferation After 3 days in cultureThreeH-thymidine was added and measured during the remaining 18 hours. table As shown in VThreeResting T cells by H-thymidine (510 pm) uptake assay Showed no growth. Release of signal 1 by PMA caused some proliferation (3 800 pm), primary (PMA) and costimulatory (COS / hB7-2) The highest proliferation (9020 cpm) was observed in T cells that received both gnul. Inspected All three anti-hB7-2 mAbs treated the co-stimulatory signal-induced proliferation with PMA alone. These mAbs reduced to the proliferation seen in physiologic cells, and these mAbs stimulated B7 / CD28 It was shown to block T cell proliferation by blocking T. Example 9  Regression of transplanted tumor cells transfected to express B7-2   In this example untransfected or transfected with B7-2 When J558 plasmacytoma cells were transplanted into animals for use in tumor regression studies, The effect of B7-2 expressed on the surface of tumor cells on tumor cell growth was examined.   J558 plasmacytoma cells (American Type Culture Collection, Roc kville, obtained from MD, # TIB6) to mouse B7-2 (pAWNE03) ) Or B7-1 (pNRDSH or pAWNE03) and neomycin resistance An expression vector containing a cDNA encoding a sex gene was transfected. Ne Select stable transfectants on the basis of resistance to omycin on tumor cells Anti-B7-2 or anti-B7-1 antibody for cell surface expression of B7-2 or B7-1 Was confirmed by FACS analysis using.   B7-2 on tumor cells with 5 to 10 isogenic Balb / c mice per group Designed to determine if cell surface expression results in regression of transplanted tumor cells It was used in the experiment. Untransfected and transfected J558 cells Incubate in a test tube, collect, and collect Hank's buffered salt solution (GIBCO, Grand. 10 minutes after washing with Island, New York8Resuspend at a concentration of cells / mL did. A part of the skin on the right side of the abdomen of each mouse was depilated with a depilatory, and after 24 hours, the mouse was removed. Tumor cells 5 × 10 per animal6Individuals were implanted intradermally or subcutaneously. Every 2 or 3 days Tumor volume was measured (with 3 vertical linear measurements) using calipers and a ruler. A typical experiment lasted 18-21 days, at the end of which untransfected control J Tumor size was greater than 10% of mouse body volume in mice implanted with 558 cells. Was. As shown in FIG. 20, mice were transfected to express B7-2 on the surface. Ejected J558 cells were excluded. No tumor growth was observed even after 3 weeks Was. Similar results were obtained from J55 transfected to express B7-1 on the surface. It was also observed in 8 cells. In contrast, untransfected (wild type) J558 cells Then, on day 12, the animal had a large tumor that could not be treated. This example shows tumor cells B7-2 of tumor cells as by transfection of B7-2 cDNA into Cell surface expression induces sufficient antitumor response in susceptible animals to cause tumor cell rejection Is to prove thatEquality   A person of ordinary skill in the art will be able to use the specific embodiments of the invention described herein without undue experimentation Being able to recognize or be convinced of numerous equivalents. Such an equal range Are intended to be covered by this claim.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 19/00 19/00 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/566 15/02 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/566 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ０８／１４７，７７３ (32)優先日 1993年11月３日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 ナドラー，リー・エム アメリカ合衆国02159マサチューセッツ州、 ニュートン、クロス・ヒル・ロード36番 (72)発明者 グレイ，ゲーリー・エス アメリカ合衆国02146マサチューセッツ州、 ブルックリン、ミルトン・ロード32番 (72)発明者 グリーンフィールド，エドワード アメリカ合衆国02368マサチューセッツ州、 ランドルフ、アービング・ロード301番 【要約の続き】 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Office reference number FI A61K 39/395 9051-4C A61K 48/00 48/00 8615-4C C07H 21/04 B C07H 21/04 8517- 4H C07K 14/705 C07K 14/705 16/28 16/28 19/00 19/00 9637-4B C12P 21/02 C C12N 5/10 0276-2J G01N 33/566 15/02 9281-4B C12N 5/00 B C12P 21/02 9162-4B 15/00 C G01N 33/566 9051-4C A61K 37/02 ABA // (C12P 21/02 C12R 1:91) (31) Priority claim number 08 / 147,773 (32 ) Priority date November 3, 1993 (33) Priority claiming country United States (US) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU) , MC, NL, PT, SE), U, CA, JP (72) Inventor Nadler, Lee M. No. 36, Cross Hill Road, Newton, MA 02159 Massachusetts (72) Inventor, Gray, Gary Es United States 02146 Milton Road, Brooklyn 32, USA No. (72) Inventor Greenfield, Edward United States 02368 Irving Road 301, Randolph, Massachusetts [Continued Summary]

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドをコードするヌクレオ チド配列を含んでなる単離した核酸。 ２．cＤＮＡ配列である請求項１に記載の単離した核酸。 ３．cＤＮＡがヒト起源である請求項２に記載の単離した核酸。 ４．cＤＮＡが図８(配列番号１)に示すヌクレオチド配列を含んでなる請求項 ３に記載の単離した核酸。 ５．cＤＮＡが図８(配列番号１)に示す核酸配列のコーディング領域を含んで なる請求項３に記載の単離した核酸。 ６．cＤＮＡがミュリン起源である請求項２に記載の単離した核酸。 ７．cＤＮＡが図１４(配列番号２２)に示すヌクレオチド配列を含んでなる請 求項６に記載の単離したヌクレオチド。 ８．cＤＮＡが図１４(配列番号２２)に示すヌクレオチド配列のコーディング 領域を含んでなる請求項６に記載の単離した核酸。 ９．ペプチドが図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列を含んでなる請求項１に 記載の単離した核酸。 １０．ペプチドが図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列を含んでなる請求 項１に記載の単離した核酸。 １１．ペプチドが図８(配列番号２)のアミノ酸配列を含んでなる配列と少なく とも５０％相同性である請求項１に記載の単離した核酸。 １２．ペプチドが図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチド をコードする核酸に高または低ストリンジェンシィ条件下にハイブリダイズする 核酸によりコードされている請求項１に記載の単離した核酸。 １３．ペプチドが長さで少なくとも２０のアミノ酸残基である請求項１に記載 の単離した核酸。 １４．ペプチドが図１４(配列番号２３)のアミノ酸配列を含んでなる配列と少 なくとも５０％相同性である請求項１に記載の単離した核酸。 １５．ペプチドが図１４(配列番号２３)に示すアミノ酸配列を含んでなるペプ チドをコードする核酸に、高または低ストリンジェンシィ条件下にハイブリダイ ズする核酸によりコードされている請求項１に記載の単離した核酸。 １６．ペプチドが長さで少なくとも２０のアミノ酸残基である請求項１５に記 載の単離した核酸。 １７．ペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５を 含んでなる請求項１に記載の単離した核酸。 １８．Ｂリンパ球抗原Ｂ７−２の活性を有するペプチドをコードするヌクレオ チド配列を含んでなる単離したＤＮＡであって、該ペプチドは、式： Ｘn−Ｙ−Ｚm （式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５を含んで なり、 Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣接するアミノ 酸残基から選択されるアミノ酸残基であり、 Ｚmは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するア ミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基であり、 n＝０〜２３、m＝０〜８４である。） によって表わされるアミノ酸配列を有する、単離したＤＮＡ。 １９．n＝０、m＝０である請求項１８に記載の単離したＤＮＡ。 ２０．長さで少なくとも２０のアミノ酸残基またはそれ以上であって、図８( 配列番号２)に示す配列を含んでなるアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同 性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離したＤＮＡ 。 ２１．Ｂ７−２活性を有する第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列、 および第１のペプチドの溶解性、結合親和性または価数を変化させる部分に対応 する第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、Ｂ７−２融合 タンパク質をコードする単離した核酸。 ２２．ＤＮＡである請求項２１に記載の単離した核酸。 ２３．第１のペプチドがヒトＢ７−２タンパク質の細胞外ドメインを含んでな る請求項２２に記載の単離した核酸。 ２４．第１ペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４ ５を含んでなる請求項２３に記載の単離した核酸。 ２５．第１のペプチドがヒトＢ７−２の可変領域様ドメインを含んでなる請求 項２３に記載の単離した核酸。 ２６．第１のペプチドがヒトＢ７−２の定常領域様ドメインを含んでなる請求 項２３に記載の単離した核酸。 ２７．第２のペプチドが免疫グロブリン定常領域を含んでなる請求項２２に記 載の単離した核酸。 ２８．免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＣ γ１ドメインである請求項２７に記載の単離した核酸。 ２９．免疫グロブリン定常領域が、定常領域媒介生物学的エフェクター機能を 減少させるよう修飾されている請求項２７に記載の単離した核酸。 ３０．生物学的エフェクター機能が、補体活性化、Ｆcレセプター相互作用、 並びに補体活性化およびＦcレセプター相互作用よりなる群から選択される請求 項２９に記載の単離した核酸。 ３１．免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含むＣγ４ ドメインである請求項３０に記載の単離した核酸。 ３２．ＣＨ２ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基が、置換、付加、また は削除により修飾されている請求項３１に記載の単離した核酸。 ３３．Ｂ７−２活性を有する第１のペプチド、および第１のペプチドの溶解性 、結合親和性、または価数を変化させる部分に対応する第２のペプチドを含んで なる単離されたＢ７−２融合タンパク質。 ３４．第１のペプチドがヒトＢ７−２タンパク質の細胞外ドメインを含んでな る請求項３３に記載の単離されたＢ７−２融合タンパク質。 ３５．第１のペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２ ４５を含んでなる請求項３４に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ３６．第１のペプチドがヒトＢ７−２の可変領域様ドメインを含んでなる請求 項３４に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ３７．第１のペプチドがヒトＢ７−２の定常領域様ドメインを含んでなる請求 項３４に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ３８．第２のペプチドが免疫グロブリン定常領域を含んでなる請求項３３に記 載の単離されたＢ７−２融合タンパク質。 ３９．免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＣ γ１ドメインである請求項３８に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ４０．免疫グロブリン定常領域が、定常領域媒介生物学的エフェクター機能を 減少させるよう修飾されている請求項３８に記載の単離したＢ７−２融合タンパ ク質。 ４１．生物学的エフェクター機能が、補体活性化、Ｆcレセプター相互作用、 並びに補体活性化およびＦcレセプター相互作用よりなる群から選択される請求 項４０に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ４２．免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むＣ γ４ドメインである請求項４１に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質。 ４３．ＣＨ２ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基が、置換、付加または 削除により修飾されている請求項４２に記載の単離したＢ７−２融合タンパク質 。 ４４．請求項３３に記載の融合タンパク質および薬学的に許容し得る担体を含 んでなる医薬的投与に適した組成物。 ４５．請求項３４に記載の融合タンパク質および薬学的に許容し得る担体を含 んでなる医薬的投与に適した組成物。 ４６．請求項３６に記載の融合タンパク質および薬学的に許容し得る担体を含 んでなる医薬的投与に適した組成物。 ４７．請求項３８に記載の融合タンパク質および薬学的に許容し得る担体を含 んでなる医薬的投与に適した組成物。 ４８．請求項１に記載の核酸を含んでなる組換え発現ベクター。 ４９．核酸がcＤＮＡ配列である請求項４８に記載の組換え発現ベクター。 ５０．cＤＮＡがヒト由来であり、図８(配列番号１)に示すヌクレオチド配列 を含んでなる、請求項４９に記載の組換え発現ベクター。 ５１．プラスミドである請求項４９に記載の組換え発現ベクター。 ５２．請求項７に記載の核酸を含んでなる組換え発現ベクター。 ５３．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドの発現を指向できる 請求項４８に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。 ５４．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドの発現を指向できる 、請求項５０に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。 ５５．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドの発現を指向できる 請求項５２に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。 ５６．請求項５４に記載の宿主細胞により発現された、Ｂ７−２リンパ球抗原 、Ｂ７−２の活性を有する単離された組換えペプチド。 ５７．細胞表面でのペプチドの発現に適した形の、Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２ の活性を有するペプチドをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞。 ５８．核酸が組換え発現ベクター中の図８(配列番号１)に示すヌクレオチド配 列を含んでなるcＤＮＡである請求項５７に記載の細胞。 ５９．Ｔ細胞共刺激分子を発現するよう修飾された腫瘍細胞。 ６０．Ｂ７−２の発現に適した形のヒトＢ７−２をコードする核酸でトランス フェクトされた請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６１．Ｂ７−２を発現するよう刺激された請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６２．腫瘍細胞と結合したヒトＢ７−２抗原を有する請求項５９に記載の腫瘍 細胞。 ６３．Ｔ細胞共剌激分子Ｂ７−１を発現する請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６４．Ｔ細胞共剌激分子Ｂ７−３を発現する請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６５．ＭＨＣクラスＩ分子を発現する請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６６．ＭＨＣクラスII分子を発現する請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６７．ＭＨＣクラスII関連タンパク質、インバリアント鎖を通常は発現し、該 インバリアント鎖の発現が阻害されている請求項５９に記載の腫瘍細胞。 ６８．Ｂ７−２発現に適した形の、Ｔ細胞共刺激分子、Ｂ７−２をコードする 核酸でトランスフェクトされた腫瘍細胞。 ６９．核酸が組換え発現ベクター中のcＤＮＡである請求項６８に記載の腫瘍 細胞。 ７０．Ｂ７−１発現に適した形の、Ｔ細胞共剌激分子、Ｂ７−１をコードする 核酸で更にトランスフェクトされた請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ７１．Ｂ７−３発現に適した形の、Ｔ細胞共刺激分子、Ｂ７−３をコードする 核酸で更にトランスフェクトされた請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ７２．(a)少なくとも１つのＭＨＣクラスIIα鎖タンパク質、および (b)少なくとも１つのＭＨＣクラスIIβ鎖タンパク質、 をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１つの核酸で更にトランスフェクト された請求項６８に記載の腫瘍細胞であって、該核酸はＭＨＣクラスIIα鎖タン パク質およびＭＨＣクラスIIβ鎖タンパク質の発現に適した形である、腫瘍細胞 。 ７３．腫瘍細胞のトランスフェクション前にはＭＨＣクラスII分子を発現しな い請求項７２に記載の腫瘍細胞。 ７４．ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現に適した形の少なくとも１つのＭＨＣ クラスＩα鎖タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸で更にトランスフェ クトされた請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ７５．β−２ミクログロブリンタンパク質の発現に適した形のβ−２ミクログ ロブリンタンパク質をコードする核酸で更にトランスフェクトされた請求項７４ に記載の腫瘍細胞。 ７６．ＭＨＣクラスII関連タンパク質、インバリアント鎖を通常は発現し、該 インバリアント鎖の発現が阻害されている請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ７７．インバリアント鎖遺伝子の制御またはコーディング領域にアンチセンス である核酸による腫瘍細胞のトランスフェクションによりインバリアント鎖の発 現が阻害されている請求項７６に記載の腫瘍細胞。 ７８．サルコーマである請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ７９．リンパ腫である請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ８０．黒色腫、神経芽細胞腫、白血病、およびカルチノーマよりなる群から選 択される請求項６８に記載の腫瘍細胞。 ８１．(a)患者から腫瘍細胞を得て； (b)Ｂ７−２の発現に適した形のＢ７−２をコードする核酸で腫瘍細胞をトラン スフェクトし；そして (c)該腫瘍細胞を患者に投与する、 ことを含んでなる、腫瘍を有する患者を処置する方法。 ８２．腫瘍細胞をＢ７−１をコードする核酸で更にトランスフェクトする請求 項８１に記載の方法。 ８３．ＭＨＣクラスIIα鎖タンパク質およびＭＨＣクラスIIβ鎖タンパク質の 発現に適した形の、少なくとも１つのＭＨＣクラスIIα鎖タンパク質および少な くとも１つのＭＨＣクラスIIβ鎖タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸 で、腫瘍細胞を更にトランスフェクトする請求項８１に記載の方法。 ８４．ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現に適した形の、少なくとも１つのＭＨ ＣクラスＩα鎖タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸で、腫瘍細胞を更 にトランスフェクトする請求項８１に記載の方法。 ８５．β−２ミクログロブリンタンパク質の発現に適した形の、β−２ミクロ グロブリンタンパク質をコードする核酸で、腫瘍細胞を更にトランスフェクトす る請求項８４に記載の方法。 ８６．ＭＨＣクラスII関連タンパク質、インバリアント鎖の発現が腫瘍細胞中 で阻害されている請求項８１に記載の方法。 ８７．インバリアント鎖遺伝子の制御またはコーディング領域に対しアンチセ ンスである核酸で腫瘍細胞をトランスフェクトすることによりインバリアント鎖 の発現が腫瘍細胞中で阻害されている請求項８６に記載の方法。 ８８．腫瘍がサルコーマである請求項８１に記載の方法。 ８９．腫瘍がリンパ腫である請求項８１に記載の方法。 ９０．腫瘍が黒色腫、神経芽細胞腫、白血病およびカルチノーマよりなる群か ら選択される請求項８１に記載の方法。 ９１．(a)患者から腫瘍細胞を得て； (b)該腫瘍細胞を (ｉ)Ｂ７−２ (ii)ＭＨＣクラスIIα鎖タンパク質；および (iii)ＭＨＣクラスIIβ鎖タンパク質 をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１つの核酸で腫瘍細胞をトランスフ ェクトし(該核酸は、Ｂ７−２、ＭＨＣクラスIIα鎖タンパク質およびＭＨＣク ラスIIβ鎖タンパク質の発現に適した形である)；そして (c)患者に該腫瘍細胞を投与する； ことを含んでなる、腫瘍細胞を有する患者中でＣＴ４＋Ｔリンパ球による抗腫瘍 応答を誘導する方法。 ９２．Ｔ細胞共剌激分子、Ｂ７−２を発現するよう腫瘍細胞をインビボで修飾 することを含んでなる腫瘍を有する患者の処置方法。 ９３．Ｂ７−２発現に適した形のＢ７−２をコードする核酸をインビボで患者 に送ることにより、腫瘍細胞をインビボで修飾する請求項９２に記載の方法。 ９４．適当なビヒクル中の核酸を腫瘍中に注入することにより核酸をインビボ で患者に運ぶ請求項９３に記載の方法。 ９５．(a)患者から腫瘍細胞とＴリンパ球を得て； (b)患者からの腫瘍細胞と共に、および剌激形のＢ７−２と共に、患者からのＴ リンパ球をインビトロで培養し； (c)Ｔリンパ球を患者に投与する； ことを含んでなる、腫瘍を有する患者を処置する方法。 ９６．請求項１に記載の核酸の組換え発現により製造される、Ｂリンパ球抗原 、Ｂ７−２の活性を有するペプチド。 ９７．請求項４に記載の核酸の組換え発現により製造される、Ｂリンパ球抗原 、Ｂ７−２の活性を有するペプチド。 ９８．請求項５に記載の核酸の組換え発現により製造される、Ｂリンパ球抗原 、Ｂ７−２の活性を有するペプチド。 ９９．図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列を含んでなる請求項９８に記載の ペプチド。 １００．請求項１８に記載のＤＮＡの組換え発現により製造される、Ｂリンパ 球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチド。 １０１．請求項２０に記載のＤＮＡの組換え発現により製造される、Ｂリンパ 球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチド。 １０２．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドの実質的に純粋な 製剤。 １０３．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−３の活性を有するペプチドの実質的に純粋な 製剤。 １０４．式： Ｘn−Ｙ−Ｚm (式中、Ｙは図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基５５〜６８、図８(配列 番号２)に示す配列のアミノ酸残基８１〜８９、図８(配列番号２)に示す配列の アミノ酸残基１２８〜１４２、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１６ ０〜１６９、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基１８８〜２００、図８ (配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２６９〜２８２よりなる群から選択され るアミノ酸残基であり、 Ｘnは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのアミノ末端に隣接するアミノ 酸残基から選択されるアミノ酸残基であり、 Ｚmは図８(配列番号２)に示す配列においてＹのカルボキシ末端に隣接するア ミノ酸残基から選択されるアミノ酸残基であり、 n＝０〜３０で、m＝０〜３０である。） によって表わされるアミノ酸配列を有するペプチド。 １０５．n＝０でm＝０である請求項１０４に記載のペプチド。 １０６．ヒトＢリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチドをコードする 核酸の組換え発現により製造されるペプチドと特異的に反応する抗体。 １０７．ヌクレオチド配列が図８(配列番号１)に示すヌクレオチド配列のコー ディング領域を含んでなる請求項１０６に記載の抗体。 １０８．モノクローナル抗体である請求項１０６に記載の抗体。 １０９．ＩgＧ１抗体である請求項１０８に記載の抗体。 １１０．ＩgＧ２ａ抗体である請求項１０８に記載の抗体。 １１１．ＡＴＣＣ受託番号 により表わされるハイブリドーマＨＦ ２.３Ｄ１。 １１２．請求項１１１に記載のハイブリドーマにより製造されるモノクローナ ル抗体。 １１３．ＡＴＣＣ受託番号 により表わされるハイブリドーマＨＡ ５.２Ｂ７。 １１４．請求項１１３に記載のハイブリドーマにより製造されるモノクローナ ル抗体。 １１５．ＡＴＣＣ受託番号 により表わされるハイブリドーマＨＡ ３.１Ｆ９。 １１６．請求項１１５に記載のハイブリドーマにより製造されるモノクローナ ル抗体。 １１７．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７の活性を有するペプチドを発現するようトラン スフェクトされた細胞を有する非ヒトのトランスジェニック動物。 １１８．マウスである請求項１１７に記載の非ヒトのトランスジェニック動物 。 １１９．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２をコードする変化させた遺伝子を有する細 胞を含む非ヒトのノックアウト動物。 １２０．マウスである請求項１１９に記載の非ヒトのノックアウト動物。 １２１．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の活性を有するペプチド、および薬学的に 許容し得る担体を含んでなる、医薬的投与に適した組成物。 １２２．Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−１の活性を有するペプチドを更に含んでなる 請求項１２１に記載の組成物。 １２３．ペプチドが図８(配列番号２)に示すアミノ酸配列を含んでなる請求項 １２１に記載の組成物。 １２４．ペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５ を含んでなる請求項１２３に記載の組成物。 １２５．請求項５３に記載の宿主細胞を培地中で培養してペプチドを発現させ 、培地からペプチドを単離することを含んでなる、Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２の 活性を有するペプチドを製造する方法。 １２６．請求項５４に記載の宿主細胞から培地中で培養してペプチドを発現さ せ、培地からペプチドを単離することを含んでなる、Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−２ の活性を有するペプチドの製造方法。 １２７．免疫細胞を、Ｂ７−２のその天然リガンドとの結合を阻害する薬剤と 接触させ、それによってＢ７−２−リガンド相互作用による免疫細胞の共刺激を 阻害することを含んでなる、免疫細胞の表面上でのＢリンパ球抗原、Ｂ７−２の その天然リガンドとの相互作用を阻害する方法。 １２８．薬剤が、Ｂ７−２結合活性を有するが共刺激シグナルを免疫細胞に伝 達する能力を欠いているペプチドである請求項１２６に記載の方法。 １２９．ペプチドが可溶性の、モノマー性のペプチドである請求項１２８に記 載の方法。 １３０．ペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５ を含んでなる請求項１２９に記載の方法。 １３１．薬剤が、Ｂ７−２の活性を有する第１のペプチド、および第１のペプ チドの溶解性、結合親和性、または価数を変化させる部分を含む第２のペプチド を含んでなるＢ７−２融合タンパク質である、請求項１３０に記載の方法。 １３２．第１のペプチドがヒトＢ７−２タンパク質の細胞外ドメインを含んで なる請求項１３１に記載の方法。 １３３．第１のペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜 ２４５を含んでなる請求項１３２に記載の方法。 １３４．第２のペプチドが免疫グロブリン定常領域を含んでなる請求項１３１ に記載の方法。 １３５．免疫グロブリン定常領域が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む Ｃγ１ドメインである請求項１３４に記載の方法。 １３６．薬剤がＢ７−２と反応性の抗体である請求項１３１に記載の方法。 １３７．抗体がモノクローナル抗体である請求項１３６に記載の方法。 １３８．患者に、Ｂ７−２結合活性を有するが共剌激シグナルＴ細胞に伝達す る能力を欠いた薬剤を、患者におけるＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分 泌を阻害するのに有効な量投与することを含んでなる、患者中のＴ細胞媒介免疫 応答を下方制御する方法。 １３９．薬剤がＢ７−２結合活性を有するが、共剌激シグナルをＴ細胞に伝達 する能力を欠いたペプチドである請求項１３８に記載の方法。 １４０．薬剤がＢ７−２と反応性の抗体である請求項１３８に記載に方法。 １４１．抗体がモノクローナル抗体である請求項１４０に記載の方法。 １４２．患者に、Ｂ７−１結合活性を有するが、Ｔ細胞に共刺激シグナルを伝 達する能力を欠いた薬剤を投与することを更に含んでなる請求項１３８に記載の 方法。 １４３．薬剤が、Ｂ７−１結合活性を有するが、Ｔ細胞に共刺激シグナルを伝 達する能力を欠いたペプチドである請求項１４２に記載の方法。 １４４．薬剤がＢ７−１と反応性の抗体である請求項１４２に記載の方法。 １４５．抗体がモノクローナル抗体である請求項１４４に記載の方法。 １４６．ＣＤ２８と反応性の抗体、ＣＴＬＡ４と反応性の抗体、サイトカイン と反応性の抗体、ＣＴＬＡ４Ｉg融合タンパク質、ＣＤ２８Ｉg融合タンパク質、 および免疫抑制剤よりなる群から選択する免疫調節剤を患者に投与することを更 に含んでなる請求項１３８に記載の方法。 １４７．患者に阻害形のＢ７−２タンパク質を投与し、それによりＢ７−２− リガンド相互作用による免疫細胞の共剌激を阻害することを含んでなる、Ｂリン パ球抗原、Ｂ７−２の免疫細胞表面上での、その天然リガンドとの相互作用によ り媒介される患者の自己免疫疾患を治療する方法。 １４８．自己免疫病が、真性糖尿病、慢性関節リウマチ、多発硬化症、重症筋 無力症、全身性エリテマトーデス、および自己免疫甲状腺炎よりなる群から選択 される請求項１４７に記載の方法。 １４９．阻害形のＢ７−２タンパク質が、Ｂ７−２結合活性を有するか共剌激 シグナルを免疫細胞に伝達する能力を欠いたタンパク質である請求項１４７に記 載の方法。 １５０．ペプチドが、可溶性モノマー性ペプチドである請求項１４９に記載の 方法。 １５１．ペプチドが図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４５ を含んでなる請求項１５０に記載の方法。 １５２．阻害形のＢ７−２タンパク質が、Ｂ７−２タンパク質の膜外ドメイン を含む第１のペプチド、および免疫グロブリン定常ドメインを含む第２のペプチ ドを含んでなるＢ７−２免疫グロブリン融合タンパク質(Ｂ７−２Ｉg)である請 求項１４７に記載の方法。 １５３．Ｂ７−２タンパク質の細胞外ドメインが、図８(配列番号２)に示す配 列のアミノ酸残基２４〜２４５を含んでなる請求項１５２に記載の方法。 １５４．阻害形のＢ７−２タンパク質がＢ７−２と反応性の抗体である請求項 １４７に記載の方法。 １５５．抗体がモノクローナル抗体である請求項１５４に記載の方法。 １５６．患者に、Ｂ７−１結合活性を有するが、Ｔ細胞への共剌激シグナルを 伝達する能力を欠いているペプチドを投与することを更に含んでなる請求項１４ ９に記載の方法。 １５７．患者に、Ｂ７−１に反応性の抗体、ＣＤ２８に反応性の抗体、ＣＴＬ Ａ４に反応性の抗体、サイトカインに反応性の抗体、ＣＴＬＡ４Ｉg融合タンパ ク質、ＣＤ２８Ｉg融合タンパク質、および免疫抑制剤よりなる群から選択され る免疫調節剤を投与することを更に含んでなる請求項１４７に記載の方法。 １５８．患者に阻害形のＢ７−２タンパク質を投与し、それによってＢ７−２ リガンド相互作用による免疫細胞の共刺激を阻害することを含んでなる、免疫細 胞表面でのＢリンパ球抗原、Ｂ７−２のその天然のリガンドとの相互作用により 媒介される患者におけるアレルギーを治療する方法。 １５９．阻害形のＢ７−２タンパク質が、Ｂ７−２結合活性を有するが免疫細 胞に共刺激シグナルを伝達する能力を欠いたペプチドである請求項１５８に記載 の方法。 １６０．被移植者におけるドナーＴ細胞増殖および／またはサイトカイン分泌 を抑制し、それによって被移植者における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を阻止す る方法であって、該方法は移植されるべきドナーＴ細胞を、Ｂ７−２結合活性を 有するがＴ細胞への共刺激シグナルを伝達する能力を欠いている薬剤と接触させ ることを含んでなる方法。 １６１．薬剤がＢ７−２結合活性を有するが、Ｔ細胞へ共剌激シグナルを伝達 する能力を欠いているペプチドである請求項１６０に記載の方法。 １６２．ペプチドが図８（配列番号２）に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４ ５を含んでなる請求項１６１に記載の方法。 １６３．薬剤がＢ７−２と反応性の抗体である請求項１６０に記載の方法。 １６４．抗体がモノクローナル抗体である請求項１６３に記載の方法。 １６５．組織また器官移植の被移植者での移植拒絶を抑制する方法であって、 該方法は被移植者に、Ｂ７−２結合活性を有するが、Ｔ細胞へ共刺激シグナルを 伝達する能力を欠いている薬剤を投与することを含んでなる方法。 １６６．薬剤が、Ｂ７−２結合活性を有するが、Ｔ細胞へ共剌激シグナルを伝 達する能力を欠いているペプチドである請求項１６５に記載の方法。 １６７．ペプチドが、図８(配列番号２)に示す配列のアミノ酸残基２４〜２４ ５を含んでなる請求項１６６に記載の方法。 １６８．薬剤がＢ７−２と反応性の抗体である請求項１６５に記載の方法。 １６９．抗体がモノクローナル抗体である請求項１６８に記載の方法。 １７０．患者におけるＴ細胞媒介免疫応答を上方調節する方法であって、該方 法はＢ７−２活性を有するペプチドを、患者におけるＴ細胞増殖および／または サイトカイン分泌を剌激するのに有効な量患者に投与することを含んでなる方法 。 １７１．患者にＢ７−１活性を有するペプチドを投与することを更に含んでな る請求項１７０に記載の方法。 １７２．患者に病原体またはその部分を投与し、それによって患者における抗 病原体免疫応答を誘導することを更に含んでなる請求項１７０に記載の方法。 １７３．病原体がウイルスである請求項１７２に記載の方法。 １７４．Ｂ７−２抗原の発現を調節する分子を同定する方法であって、該方法 は、 a) Ｂ７−２活性を有するペプチドを発現する細胞を、試験すべき分子と、該分 子と細胞との相互作用に適当な条件下に接触させ;そして b) Ｂ７−２活性を有するペプチドの細胞発現に及ぼすその分子の影響を測定す る； ことを含んでなる方法。 １７５．Ｂ７−２活性を有するペプチドの細胞発現に及ぼす分子の影響を細胞 表面でのペプチドの存在を検出することにより測定する請求項１７４に記載の方 法。 １７６．細胞表面でのペプチドの存在を、ペプチドと反応性の抗体、またはＣ ＴＬＡ４Ｉg若しくはＣＤ２８Ｉg融合タンパク質を用いる免疫蛍光法により検出 する請求項１７５に記載の方法。 １７７．Ｂ７−２活性を有するペプチドの細胞表現に及ぼす分子の影響を、細 胞中のペプチドをコードするmＲＮＡの存在を検出することにより測定する請求 項１７４に記載の方法。 １７８．mＲＮＡの存在をＢ７−２cＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより 検出する請求項１７７に記載の方法。 １７９．Ｂ７−２抗原による共刺激に応答して免疫細胞により産生されるサイ トカインの同定方法であって、該方法は、 a) 活性化免疫細胞、およびＢ７−２活性を有するペプチドを発現する細胞を、 適当な細胞培養培地中で接触させ;そして b) 細胞培養培地中のサイトカインの存在を測定する； ことを含んでなる方法。 １８０．免疫細胞がＴ細胞である請求項１７９に記載の方法。 １８１．細胞培養培地中のサイトカインの存在を、媒地をサイトカイン反応性 の抗体と接触させることにより測定する請求項１７９に記載の方法。 １８２．Ｂ７−２抗原による免疫細胞の共剌激を阻害する分子を同定する方法 であって、該方法は a) 一次活性化シグナルを受取った免疫細胞を、剌激形のＢ７−２タンパク質お よび試験すべき分子と、その分子の免疫細胞および剌激形のＢ７−２タンパク質 との相互作用に適当な条件下に接触させ;そして b) 剌激形のＢ７−２タンパク質による免疫細胞の共刺激に及ぼすその分子の影 響を測定する； ことを含んでなる方法。 １８３．免疫細胞がＴ細胞である請求項１８２に記載の方法。 １８４．Ｔ細胞の共剌激に及ぼす分子の影響を、Ｔ細胞増殖および／またはサ イトカイン産生により測定する請求項１８３に記載の方法。 １８５．共刺激形のＢ７−２が、細胞表面でＢ７−２活性を有するペプチドを 発現する細胞である請求項１８２に記載の方法。 １８６．免疫細胞の表面でのＢ７−２抗原のリガンドへの結合を阻害する分子 を同定する方法であって、該方法は、 a) ラベルしたＢ７−２リガンドおよび試験すべき分子を、Ｂ７−２活性を有す るペプチドと接触させ； b) 結合しなかったラベルしたＢ７−２リガンドを除去し;そして c) Ｂ７−２活性を有するペプチドに結合したラベルしたＢ７−２リガンドの量 を、Ｂ７−２リガンドのＢ７−２抗原への結合を阻害する該分子の能力の指標と して測定する； ことを含んでなる方法。 １８７．免疫細胞がＴ細胞であり、Ｂ７−２リガンドがＣＴＬＡ４またはＣＤ ２８である請求項１８６に記載の方法。 １８８．ペプチドを固相支持体に固定化する請求項１８６に記載の方法。 １８９．刺激形のＢ７−２タンパク質に応答する免疫細胞による細胞内信号伝 達を阻害する分子を同定する方法であって、該方法は、 a) １次活性化シグナルを受け取っており、細胞表面でＢ７−２リガンドを発現 する免疫細胞を、刺激形のＢ７−２タンパク質および試験すべき分子と、該分子 の免疫細胞および刺激形のＢ７−２タンパク質との相互作用に適当な条件下に接 触させ;そして b) 刺激形のＢ７−２タンパク質に応答する免疫細胞による細胞内信号伝達に及 ぼす該分子の影響を測定する； ことを含んでなる方法。 １９０．免疫細胞がＴ細胞である請求項１８９に記載の方法。 １９１．免疫細胞による細胞内信号伝達に及ぼす分子の影響を、Ｔ細胞増殖お よび／またはサイトカイン産生を検出することにより測定する請求項１９０に記 載の方法。 １９２．剌激形のＢ７−２が、細胞表面上でＢ７−２活性を有するペプチドを 発現する細胞である請求項１８９に記載の方法。 １９３．Ｂ７−３活性を有するペプチドを有する細胞物質を、Ｂ７−３と反応 性の抗体と、抗体のペプチドへの結合に適当な条件下に接触させ、抗体からペプ チドを単離することを含んでなる、Ｂリンパ球抗原、Ｂ７−３の単離方法。[Claims]   1. Nucleotide encoding a peptide having the activity of B lymphocyte antigen, B7-2 An isolated nucleic acid comprising a tide sequence.   2. The isolated nucleic acid of claim 1 which is a cDNA sequence.   3. The isolated nucleic acid of claim 2, wherein the cDNA is of human origin.   4. The cDNA comprises the nucleotide sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 1). 3. The isolated nucleic acid according to 3.   5. The cDNA contains the coding region for the nucleic acid sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 1). The isolated nucleic acid of claim 3, wherein   6. The isolated nucleic acid of claim 2, wherein the cDNA is of murin origin.   7. A contract in which the cDNA comprises the nucleotide sequence shown in Figure 14 (SEQ ID NO: 22). The isolated nucleotide according to claim 6.   8. The cDNA encodes the nucleotide sequence shown in Figure 14 (SEQ ID NO: 22). 7. The isolated nucleic acid of claim 6, which comprises a region.   9. The peptide according to claim 1, which comprises the amino acid sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). The isolated nucleic acid as described.   10. A peptide comprising the amino acid sequence shown in Figure 14 (SEQ ID NO: 23). Item 2. The isolated nucleic acid according to Item 1.   11. The peptide is less than the sequence comprising the amino acid sequence of Figure 8 (SEQ ID NO: 2) The isolated nucleic acid of claim 1, wherein both are 50% homologous.   12. The peptide comprises the amino acid sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2) Hybridizes to a nucleic acid that encodes for high or low stringency conditions The isolated nucleic acid of claim 1, which is encoded by the nucleic acid.   13. The peptide according to claim 1, which is at least 20 amino acid residues in length. Isolated nucleic acid of.   14． The peptide is a sequence comprising the amino acid sequence of Figure 14 (SEQ ID NO: 23) and a small number. The isolated nucleic acid of claim 1 which is at least 50% homologous.   15. A peptide whose peptide comprises the amino acid sequence shown in Figure 14 (SEQ ID NO: 23). Hybridizes to the nucleic acid encoding tide under high or low stringency conditions. 2. The isolated nucleic acid of claim 1, which is encoded by the nucleic acid encoding the nucleic acid.   16. 16. The peptide according to claim 15, wherein the peptide is at least 20 amino acid residues in length. The isolated nucleic acids listed.   17． The peptide replaces amino acid residues 24-245 of the sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2). The isolated nucleic acid of claim 1, which comprises.   18. Nucleotide encoding a peptide having the activity of B lymphocyte antigen B7-2 An isolated DNA comprising a tide sequence, the peptide having the formula:               Xn-Y-Zm (In the formula, Y includes amino acid residues 24-245 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). Become   Xn is an amino acid adjacent to the amino terminus of Y in the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). An amino acid residue selected from acid residues,   Zm is the nucleotide adjacent to the carboxy terminus of Y in the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). An amino acid residue selected from mino acid residues,   n = 0 to 23 and m = 0 to 84. ) An isolated DNA having an amino acid sequence represented by:   19. 19. The isolated DNA according to claim 18, wherein n = 0 and m = 0.   20. 8 or more amino acid residues in length or more, At least about 50% homology with the amino acid sequence comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 2) Isolated DNA comprising a nucleotide sequence encoding a peptide having sex .   21. A nucleotide sequence encoding a first peptide having B7-2 activity, And corresponding to the portion that changes the solubility, binding affinity or valency of the first peptide A B7-2 fusion comprising a nucleotide sequence encoding a second peptide An isolated nucleic acid encoding a protein.   22. 22. The isolated nucleic acid of claim 21, which is DNA.   23. The first peptide does not include the extracellular domain of human B7-2 protein. 23. The isolated nucleic acid according to claim 22.   24. The first peptide is amino acid residues 24 to 24 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). 24. The isolated nucleic acid of claim 23, which comprises 5.   25. The first peptide comprises the variable region-like domain of human B7-2. Item 24. The isolated nucleic acid according to Item 23.   26. The first peptide comprises the constant region-like domain of human B7-2. Item 24. The isolated nucleic acid according to Item 23.   27. 23. The method of claim 22, wherein the second peptide comprises an immunoglobulin constant region. The isolated nucleic acids listed.   28. The immunoglobulin constant region is C, including the hinge, CH2 and CH3 regions. 28. The isolated nucleic acid of claim 27, which is the y1 domain.   29. The immunoglobulin constant region functions as a constant region-mediated biological effector. 28. The isolated nucleic acid of claim 27, which has been modified to reduce.   30. Biological effector functions include complement activation, Fc receptor interaction, And a member selected from the group consisting of complement activation and Fc receptor interaction. Item 31. The isolated nucleic acid according to Item 29.   31. Cγ4 whose immunoglobulin constant region comprises hinge, CH2 and CH3 31. The isolated nucleic acid of claim 30, which is a domain.   32. At least one amino acid residue in the CH2 domain is substituted, added, or 32. The isolated nucleic acid of claim 31, wherein is modified by deletion.   33. First peptide having B7-2 activity, and solubility of the first peptide , A second peptide corresponding to the moiety that alters binding affinity, or valency An isolated B7-2 fusion protein.   34. The first peptide does not include the extracellular domain of human B7-2 protein. 34. The isolated B7-2 fusion protein of claim 33.   35. The first peptide is amino acid residues 24-2 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). 35. The isolated B7-2 fusion protein of claim 34, which comprises 45.   36. The first peptide comprises the variable region-like domain of human B7-2. Item 34. An isolated B7-2 fusion protein according to Item 34.   37. The first peptide comprises the constant region-like domain of human B7-2. Item 34. An isolated B7-2 fusion protein according to Item 34.   38. 34. The method of claim 33, wherein the second peptide comprises an immunoglobulin constant region. The above isolated B7-2 fusion proteins.   39. The immunoglobulin constant region is C, including the hinge, CH2 and CH3 regions. 39. The isolated B7-2 fusion protein of claim 38, which is the γ1 domain.   40. The immunoglobulin constant region functions as a constant region-mediated biological effector. 39. The isolated B7-2 fusion tamper of claim 38, which has been modified to reduce. Quality.   41. Biological effector functions include complement activation, Fc receptor interaction, And a member selected from the group consisting of complement activation and Fc receptor interaction. Item 40. An isolated B7-2 fusion protein according to item 40.   42. The immunoglobulin constant region is C, including the hinge, CH2 and CH3 regions. 42. The isolated B7-2 fusion protein of claim 41, which is a γ4 domain.   43. At least one amino acid residue in the CH2 domain has a substitution, addition or 43. An isolated B7-2 fusion protein according to claim 42 modified by deletion. .   44. 34. A fusion protein according to claim 33 and a pharmaceutically acceptable carrier. A composition suitable for pharmaceutical administration comprising:   45. A fusion protein according to claim 34 and a pharmaceutically acceptable carrier. A composition suitable for pharmaceutical administration comprising:   46. 37. A fusion protein according to claim 36 and a pharmaceutically acceptable carrier. A composition suitable for pharmaceutical administration comprising:   47. 39. A fusion protein according to claim 38 and a pharmaceutically acceptable carrier. A composition suitable for pharmaceutical administration comprising:   48. A recombinant expression vector comprising the nucleic acid according to claim 1.   49. 49. The recombinant expression vector according to claim 48, wherein the nucleic acid is a cDNA sequence.   50. The cDNA is of human origin and has the nucleotide sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 1). 50. The recombinant expression vector of claim 49, which comprises:   51. The recombinant expression vector according to claim 49, which is a plasmid.   52. A recombinant expression vector comprising the nucleic acid according to claim 7.   53. Can direct the expression of B lymphocyte antigen, a peptide having B7-2 activity A host cell transfected with the expression vector of claim 48.   54. Can direct the expression of B lymphocyte antigen, a peptide having B7-2 activity 51. A host cell transfected with the expression vector of claim 50.   55. Can direct the expression of B lymphocyte antigen, a peptide having B7-2 activity 53. A host cell transfected with the expression vector of claim 52.   56. B7-2 lymphocyte antigen expressed by the host cell of claim 54. , An isolated recombinant peptide having the activity of B7-2.   57. B lymphocyte antigen, B7-2, in a form suitable for cell surface peptide expression. A cell transfected with a nucleic acid encoding a peptide having the activity of.   58. The nucleic acid is the nucleotide sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 1) in the recombinant expression vector. 58. The cell of claim 57 which is a cDNA comprising a row.   59. Tumor cells modified to express a T cell costimulatory molecule.   60. A nucleic acid encoding human B7-2 in a form suitable for expression of B7-2 is trans 60. A tumor cell according to claim 59 which is defective.   61. 60. The tumor cell of claim 59, stimulated to express B7-2.   62. 60. The tumor of claim 59 having human B7-2 antigen associated with the tumor cells. cell.   63. 60. The tumor cell of claim 59, which expresses the T cell stimulatory molecule B7-1.   64. 60. The tumor cell of claim 59, which expresses the T cell co-stimulatory molecule B7-3.   65. 60. The tumor cell of claim 59, which expresses an MHC class I molecule.   66. 60. The tumor cell of claim 59, which expresses an MHC class II molecule.   67. MHC class II related proteins, invariant chains are normally expressed, 60. The tumor cell of claim 59, wherein expression of the invariant chain is inhibited.   68. Encodes B7-2, a T cell costimulatory molecule, in a form suitable for B7-2 expression Tumor cells transfected with nucleic acid.   69. 69. The tumor of claim 68, wherein the nucleic acid is cDNA in a recombinant expression vector. cell.   70. Encodes B7-1, a T cell co-stimulatory molecule, in a form suitable for B7-1 expression 69. The tumor cell of claim 68, further transfected with a nucleic acid.   71. Encodes T7 costimulatory molecule, B7-3, in a form suitable for B7-3 expression 69. The tumor cell of claim 68, further transfected with a nucleic acid.   72. (a) at least one MHC class II α chain protein, and (b) at least one MHC class II β chain protein, Further transfecting with at least one nucleic acid comprising DNA encoding 69. The tumor cell of claim 68, wherein the nucleic acid is a MHC class II alpha chain protein. Tumor cells in a form suitable for expression of proteins and MHC class II β chain proteins .   73. Do not express MHC class II molecules prior to transfection of tumor cells 73. The tumor cell of claim 72.   74. At least one MHC in a form suitable for expression of MHC class I protein Further transfection with at least one nucleic acid encoding a class I α chain protein 69. The tumor cell of claim 68, which has been excised.   75. β-2 microglobulin in a form suitable for expression of β-2 microglobulin protein 75. Further transfected with a nucleic acid encoding a lobulin protein. The tumor cell according to.   76. MHC class II related proteins, invariant chains are normally expressed, 69. The tumor cell according to claim 68, wherein expression of an invariant chain is inhibited.   77. Antisense to regulatory or coding regions of invariant chain genes Of invariant chain by transfection of tumor cells with a nucleic acid that is 77. The tumor cell of claim 76, which is inhibited.   78. 69. The tumor cell of claim 68, which is a sarcoma.   79. 69. The tumor cell of claim 68, which is a lymphoma.   80. Selected from the group consisting of melanoma, neuroblastoma, leukemia, and carcinoma 69. The tumor cell of claim 68, which is selected.   81. (a) Obtaining tumor cells from the patient; (b) Transfecting tumor cells with a nucleic acid encoding B7-2 in a form suitable for B7-2 expression. To be perfect; and (c) administering the tumor cells to a patient, A method of treating a patient having a tumor comprising:   82. Claim for further transfecting tumor cells with a nucleic acid encoding B7-1. Item 81. The method according to Item 81.   83. Of MHC class II α chain protein and MHC class II β chain protein At least one MHC class II α-chain protein in a form suitable for expression and At least one nucleic acid encoding at least one MHC class II β chain protein 82. The method of claim 81, further transfecting the tumor cells with.   84. At least one MH in a form suitable for expression of MHC class I proteins The tumor cells are further modified with at least one nucleic acid encoding a C class I α chain protein. 82. The method of claim 81, which is transfected into.   85. β-2 microglobulin in a form suitable for expression of β-2 microglobulin protein Further transfect tumor cells with nucleic acid encoding a globulin protein 85. The method according to claim 84.   86. Expression of MHC class II related protein and invariant chain in tumor cells 82. The method of claim 81, wherein the method is inhibited by   87. Antisense to the regulatory or coding region of the invariant chain gene Invariant chain by transfecting tumor cells with nucleic acid 87. The method of claim 86, wherein the expression of is inhibited in tumor cells.   88. 82. The method of claim 81, wherein the tumor is sarcoma.   89. 82. The method of claim 81, wherein the tumor is a lymphoma.   90. Whether the tumor is a group consisting of melanoma, neuroblastoma, leukemia and carcinoma 82. The method of claim 81 selected from:   91. (a) Obtaining tumor cells from the patient; (b) the tumor cells (i) B7-2 (ii) MHC class II α chain protein; and (iii) MHC class II β chain protein A tumor cell with at least one nucleic acid comprising a DNA encoding (The nucleic acid is B7-2, MHC class II α chain protein and MHC Suitable form for expression of ras II β chain protein); and (c) administering the tumor cells to a patient; Antitumor with CT4 + T lymphocytes in a patient with tumor cells comprising How to induce a response.   92. In vivo modification of tumor cells to express the T cell co-stimulatory molecule, B7-2 A method of treating a patient having a tumor comprising:   93. Patients in vivo with a nucleic acid encoding B7-2 in a form suitable for B7-2 expression 93. The method of claim 92, wherein the tumor cells are modified in vivo by sending to.   94. Nucleic acid is injected in vivo by injecting the nucleic acid in a suitable vehicle into the tumor. 94. The method of claim 93, wherein the method is delivered to the patient by.   95. (a) Obtaining tumor cells and T lymphocytes from the patient; (b) T from a patient, with tumor cells from the patient, and with B7-2 in an exacerbated form. Culturing the lymphocytes in vitro; (c) administering T lymphocytes to the patient; A method of treating a patient having a tumor comprising:   96. A B lymphocyte antigen produced by recombinant expression of the nucleic acid of claim 1. , A peptide having the activity of B7-2.   97. A B lymphocyte antigen produced by recombinant expression of the nucleic acid according to claim 4. , A peptide having the activity of B7-2.   98. B lymphocyte antigen produced by recombinant expression of the nucleic acid according to claim 5. , A peptide having the activity of B7-2.   99. 99. The method of claim 98, which comprises the amino acid sequence set forth in Figure 8 (SEQ ID NO: 2). peptide.   100. B lymphoma produced by recombinant expression of the DNA of claim 18. A peptide having the activity of a sphere antigen, B7-2.   101. A B lymphoid produced by recombinant expression of the DNA according to claim 20. A peptide having the activity of a sphere antigen, B7-2.   102. B lymphocyte antigen, a peptide having the activity of B7-2, which is substantially pure Formulation.   103. B lymphocyte antigen, a peptide having the activity of B7-3, substantially pure Formulation.   104. formula:                 Xn-Y-Zm (In the formula, Y represents amino acid residues 55 to 68 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2), and FIG. Amino acid residues 81 to 89 of the sequence shown in No. 2) of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID No. 2) Amino acid residues 128-142, amino acid residue 16 of the sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2) 0-169, amino acid residues 188-200 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2), FIG. Selected from the group consisting of amino acid residues 269-282 of the sequence shown in (SEQ ID NO: 2) Is an amino acid residue   Xn is an amino acid adjacent to the amino terminus of Y in the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). An amino acid residue selected from acid residues,   Zm is the nucleotide adjacent to the carboxy terminus of Y in the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). An amino acid residue selected from mino acid residues,   n = 0 to 30 and m = 0 to 30. ) A peptide having an amino acid sequence represented by:   105. 105. The peptide of claim 104, wherein n = 0 and m = 0.   106. Human B lymphocyte antigen, which encodes a peptide having the activity of B7-2 An antibody that specifically reacts with a peptide produced by recombinant expression of a nucleic acid.   107. The nucleotide sequence is shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 1). 107. The antibody of claim 106, which comprises a coding region.   108. The antibody according to claim 106, which is a monoclonal antibody.   109. The antibody according to claim 108, which is an IgG1 antibody.   110. 109. The antibody of claim 108, which is an IgG2a antibody.   111. ATCC accession number Hybridoma HF represented by 2.3D1.   112. Monocloner produced by the hybridoma of claim 111. Antibody.   113. ATCC accession number Hybridoma HA represented by 5.2B7.   114. Monoclona produced by the hybridoma of claim 113. Antibody.   115. ATCC accession number Hybridoma HA represented by 3.1F9.   116. A monochroma produced by the hybridoma according to claim 115. Antibody.   117. B lymphocyte antigen, a tran to express a peptide having the activity of B7 Non-human transgenic animals with flawed cells.   118. The non-human transgenic animal according to claim 117, which is a mouse .   119. B lymphocyte antigen, a cell with altered genes encoding B7-2 Non-human knockout animal containing vesicles.   120. The non-human knockout animal according to claim 119, which is a mouse.   121. B lymphocyte antigen, a peptide having the activity of B7-2, and pharmaceutically A composition suitable for pharmaceutical administration, comprising an acceptable carrier.   122. B lymphocyte antigen, further comprising a peptide having the activity of B7-1 The composition of claim 121.   123. The peptide comprises the amino acid sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2). 121. The composition according to 121.   124. The peptide is amino acid residues 24-245 of the sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2). 124. The composition of claim 123, comprising:   125. 54. A host cell according to claim 53 is cultured in a medium to express the peptide. , A B lymphocyte antigen, B7-2, comprising isolating the peptide from the medium. A method for producing a peptide having activity.   126. 55. Expressing a peptide by culturing in culture medium from the host cell of claim 54. B lymphocyte antigen, B7-2, comprising isolating the peptide from the culture medium. A method for producing a peptide having the above activity.   127. An agent that inhibits immune cells from binding B7-2 to its natural ligand Contact, thereby co-stimulating immune cells by B7-2-ligand interactions Inhibiting the B lymphocyte antigen, B7-2, on the surface of immune cells comprising inhibiting A method of inhibiting its interaction with a natural ligand.   128. The drug has B7-2 binding activity but transmits a costimulatory signal to immune cells. 127. The method of claim 126, which is a peptide lacking the ability to reach.   129. 129. The method of claim 128, wherein the peptide is a soluble, monomeric peptide. How to list.   130. The peptide is amino acid residues 24-245 of the sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2). 130. The method of claim 129, comprising:   131. The drug comprises a first peptide having B7-2 activity, and a first peptide. A second peptide containing a moiety that alters the solubility, binding affinity, or valency of tide. 131. The method of claim 130, which is a B7-2 fusion protein comprising   132. The first peptide comprises the extracellular domain of the human B7-2 protein 132. The method of claim 131, which comprises:   133. The first peptide corresponds to amino acid residues 24 to 24 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). 136. The method of claim 132, which comprises 245.   134. 131. The second peptide comprises an immunoglobulin constant region. The method described in.   135. The immunoglobulin constant region comprises the hinge, CH2 and CH3 regions The method according to claim 134, which is a Cγ1 domain.   136. 132. The method of claim 131, wherein the agent is an antibody reactive with B7-2.   137. 138. The method of claim 136, wherein the antibody is a monoclonal antibody.   138. In patients, it has B7-2 binding activity but transmits to co-stimulatory signal T cells Drugs that lack the ability to T cell mediated immunity in a patient comprising administering an amount effective to inhibit secretion How to down control the response.   139. The drug has B7-2 binding activity but transmits a co-stimulatory signal to T cells 138. The method of claim 138, which is a peptide lacking the ability to act.   140. 139. The method of claim 138, wherein the agent is an antibody reactive with B7-2.   141. 140. The method of claim 140, wherein the antibody is a monoclonal antibody.   142. The patient has B7-1 binding activity but transmits co-stimulatory signals to T cells. 138. The method of claim 138, further comprising administering a drug that lacks the ability to reach. Method.   143. The drug has B7-1 binding activity but transmits a costimulatory signal to T cells. 143. The method of claim 142, which is a peptide lacking the ability to reach.   144. 143. The method of claim 142, wherein the agent is an antibody reactive with B7-1.   145. 145. The method of claim 144, wherein the antibody is a monoclonal antibody.   146. Antibody reactive with CD28, antibody reactive with CTLA4, cytokine Antibody reactive with CTLA4Ig fusion protein, CD28Ig fusion protein, And administering an immunomodulator selected from the group consisting of immunosuppressants to the patient. 138. The method of claim 138, comprising:   147. The patient is administered an inhibitory form of the B7-2 protein, whereby B7-2- B-phosphorus, comprising inhibiting the stimulation of immune cells by ligand interaction By interacting with the natural ligand of the papillary antigen, B7-2, on the surface of immune cells. A method of treating a patient-mediated autoimmune disease.   148. Autoimmune disease, diabetes mellitus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, severe muscle Selected from the group consisting of asthenia, systemic lupus erythematosus, and autoimmune thyroiditis 148. The method of claim 147, wherein:   149. Does the inhibitory form of B7-2 protein have B7-2 binding activity? 148. A protein according to claim 147, which is a protein lacking the ability to transmit a signal to immune cells. How to list.   150. 150. The peptide of claim 149, wherein the peptide is a soluble monomeric peptide. Method.   151. The peptide is amino acid residues 24-245 of the sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2). 151. The method of claim 150, comprising:   152. The inhibitory form of the B7-2 protein is the transmembrane domain of the B7-2 protein. A first peptide comprising: and a second peptide comprising an immunoglobulin constant domain Is a B7-2 immunoglobulin fusion protein (B7-2Ig) The method according to claim 147.   153. The extracellular domain of the B7-2 protein has the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). 153. The method of claim 152, which comprises a string of amino acid residues 24-245.   154. The inhibitory form of B7-2 protein is an antibody reactive with B7-2. 147.   155. 155. The method of claim 154, wherein the antibody is a monoclonal antibody.   156. Patients have B7-1 binding activity but receive co-stimulatory signals to T cells 15. The method further comprising administering a peptide lacking the ability to transduce. 10. The method according to 9.   157. Patients with B7-1 reactive antibody, CD28 reactive antibody, CTL A4 reactive antibody, cytokine reactive antibody, CTLA4Ig fusion tamper Protein, CD28Ig fusion protein, and immunosuppressant 148. The method of claim 147, further comprising administering an immunomodulatory agent.   158. The patient is administered an inhibitory form of the B7-2 protein, whereby B7-2 An immune cell comprising inhibiting costimulation of immune cells by ligand interactions. By interaction of the B lymphocyte antigen, B7-2, with its natural ligand on the cell surface A method of treating allergies in a mediated patient.   159. The inhibitory form of B7-2 protein has B7-2 binding activity but 159. The peptide of claim 158, which is a peptide lacking the ability to transmit a costimulatory signal to the cell the method of.   160. Donor T cell proliferation and / or cytokine secretion in transplant recipients And thereby prevent graft-versus-host disease (GVHD) in transplant recipients A method for activating B7-2 binding activity of donor T cells to be transplanted. Contact with a drug that has but lacks the ability to transmit costimulatory signals to T cells A method comprising:   161. The drug has B7-2 binding activity, but transmits co-stimulatory signals to T cells 166. The method of claim 160, wherein the peptide lacks the ability to   162. The peptide is amino acid residues 24-24 of the sequence shown in Figure 8 (SEQ ID NO: 2). 163. The method of claim 161, comprising 5.   163. 163. The method of claim 160, wherein the agent is an antibody reactive with B7-2.   164. 165. The method of claim 163, wherein the antibody is a monoclonal antibody.   165. A method of inhibiting transplant rejection in a tissue or organ transplant recipient. The method has a B7-2 binding activity in the recipient but a costimulatory signal to T cells. A method comprising administering an agent that lacks the ability to transmit.   166. The drug has B7-2 binding activity but transmits a co-stimulatory signal to T cells 166. The method of claim 165, wherein the peptide lacks the ability to reach.   167. The peptide is amino acid residues 24 to 24 of the sequence shown in FIG. 8 (SEQ ID NO: 2). 166. The method of claim 166, comprising 5.   168. 166. The method of claim 165, wherein the agent is an antibody reactive with B7-2.   169. 169. The method of claim 168, wherein the antibody is a monoclonal antibody.   170. A method for upregulating a T cell mediated immune response in a patient, comprising: The method provides peptides having B7-2 activity with T cell proliferation and / or in a patient. A method comprising administering to a patient an amount effective to stimulate cytokine secretion. .   171. Further comprising administering to the patient a peptide having B7-1 activity. 170. The method of claim 170, wherein   172. Administering a pathogen or a portion thereof to a patient, thereby 170. The method of claim 170, further comprising inducing a pathogen immune response.   173. 173. The method of claim 172, wherein the pathogen is a virus.   174. A method of identifying a molecule that regulates expression of a B7-2 antigen, the method comprising: Is a) cells expressing a peptide having B7-2 activity are Contacted under conditions suitable for the interaction of the offspring with the cells; and b) measuring the effect of the molecule on the cellular expression of a peptide having B7-2 activity R; A method comprising:   175. The effect of molecules on the cellular expression of peptides having B7-2 activity 175. The method of claim 174, which is measured by detecting the presence of peptides on the surface. Law.   176. The presence of the peptide on the cell surface is determined by the antibody reactive with the peptide, or C Detected by immunofluorescence using TLA4Ig or CD28Ig fusion protein 176. The method of claim 175, wherein   177. The effect of molecules on the cellular expression of peptides with B7-2 activity was investigated in detail. Claim to measure by detecting the presence of mRNA encoding the peptide in the cell Item 174. The method of item 174.   178. The presence of mRNA was detected by hybridization with B7-2 cDNA. 179. The method of claim 177 of detecting.   179. Cytokines produced by immune cells in response to costimulation with the B7-2 antigen. A method for identifying tocaine, the method comprising: a) activated immune cells and cells expressing a peptide having B7-2 activity, Contacting in a suitable cell culture medium; and b) measuring the presence of cytokines in the cell culture medium; A method comprising:   180. 179. The method of claim 179, wherein the immune cells are T cells.   181. Presence of cytokines in cell culture medium, cytokine response to medium 179. The method according to claim 179, which is measured by contacting with the antibody of.   182. Method for identifying a molecule that inhibits immune cell co-stimulation by B7-2 antigen And the method is a) The immune cells that have received the primary activation signal are stimulated with the stimulated B7-2 protein. And the molecule to be tested and the immune cell of the molecule and the stimulated form of the B7-2 protein Contacted under conditions suitable for interaction with; b) The effect of the molecule on the co-stimulation of immune cells by the exaggerated form of B7-2 protein. Measure the sound; A method comprising:   183. 183. The method of claim 182, wherein the immune cells are T cells.   184. The effect of molecules on T cell co-stimulation can be measured by T cell proliferation and / or support. 184. The method according to claim 183, which is measured by itocaine production.   185. The costimulatory form of B7-2 is a peptide that has B7-2 activity on the cell surface. 183. The method of claim 182, which is a expressing cell.   186. Molecules that inhibit the binding of B7-2 antigen to its ligand on the surface of immune cells A method of identifying a) labeled B7-2 ligand and molecule to be tested have B7-2 activity Contacting the peptide with b) removing unbound labeled B7-2 ligand; and c) Amount of labeled B7-2 ligand bound to a peptide having B7-2 activity As an indicator of the ability of the molecule to inhibit the binding of B7-2 ligand to B7-2 antigen. And measure it; A method comprising:   187. The immune cells are T cells and the B7-2 ligand is CTLA4 or CD 186. The method of claim 186, which is 28.   188. 187. The method of claim 186, wherein the peptide is immobilized on a solid support.   189. Intracellular signaling by immune cells in response to stimulated forms of B7-2 protein A method of identifying a molecule that inhibits a) Receiving the primary activation signal and expressing B7-2 ligand on the cell surface Stimulating the B7-2 protein and a molecule to be tested, Cells under suitable conditions for their interaction with the immune cells and the stimulated form of B7-2 protein. Touched; and b) affecting intracellular signaling by immune cells in response to stimulated forms of B7-2 protein. Measuring the effect of the molecule; A method comprising:   190. 189. The method of claim 189, wherein the immune cells are T cells.   191. The effect of molecules on intracellular signal transduction by immune cells was investigated by T cell proliferation and proliferation. And / or measure by detecting cytokine production. How to list.   192. Stimulated form of B7-2 is a peptide with B7-2 activity on the cell surface. 189. The method of claim 189, which is a expressing cell.   193. Reacting cellular material having a peptide having B7-3 activity with B7-3 Antibody and the peptide from the antibody under suitable conditions for binding the antibody to the peptide. A method of isolating B lymphocyte antigen, B7-3, comprising isolating Tide.
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