JPH09500285A - 乳頭腫ウイルス、その検出試薬、並びにそれにより引き起こされる疾病の治療薬 - Google Patents
乳頭腫ウイルス、その検出試薬、並びにそれにより引き起こされる疾病の治療薬Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は乳頭腫ウイルス主カプシドタンパク質のぺプチドをコード化するDNAに関するものである。さらに、本発明は、このようなDNAを含む乳頭腫ウイルスゲノムに関するものである。さらに、本発明は、この乳頭腫ウイルスゲノムによりコード化されるタンパク質と、ウイルス状粒子と、それらに向けられる抗体と、診断、治療およびワクチン接種におけるそれらの使用とに関するものである。
Description
【発明の詳細な説明】
乳頭腫ウイルス、その検出試薬、並びにそれにより引き起こされる疾病の治療薬
本発明は乳頭腫ウイルス主カプシドタンパク質のペプチドをコード化するDN
Aに関するものである。さらに、本発明はこのようなDNAを含有する乳頭腫ウ
イルスゲノムに関するものである。さらに、本発明は、この乳頭腫ウイルスゲノ
ムによりコード化されるタンパク質、ウイルス状粒子、およびそれらに対して向
けられる抗体、並びに診断、治療およびワクチン接種におけるそれらの使用に関
するものである。
ヒトおよび動物の上皮組織が乳頭腫ウイルスに感染することがよく知られてい
る。ヒト乳頭腫ウイルス(以下、HPウイルスと称する)が、生殖部位域におけ
る良性のコンジローム(例えば、いぼ)、および悪性の上皮腫瘍(例えば、皮膚
癌および子宮癌)に発見されている(zur Hausen,H.、Cancer Research、49、19
89、4677−4681頁を参照)。HPウイルスはまた、気道の悪性腫瘍の発生に関係
すると考えられている(zur Hausen,H.、Cancer Research、36、1976、530頁を
参照)。さらに、HPウイルスは、肺の鱗屑上皮細胞癌の発生に関して少なくと
も補助的な原因であると考えられている(Syrjeunen,K.J.、Lung、158、1980、1
31−142頁を参照)。
乳頭腫ウイルスは、コートのない二十面体カプシドを有し、このカプシドは約
7,900bpの環状二重鎖DNA分子を含んでいる。このカプシドは、主カプシド
タンパク質(L1)および副カプシドタンパク質(L2)からなる。共に発現さ
れた両方のタンパク質、または1つだけ発現されたL1により、生体外で、ウイ
ルス状粒子が発生する(Kirnbauer,R.等、Journal of Virology、1993、6929−6
936頁を参照)。
乳頭腫ウイルスは単層細胞培養内では増殖させられない。したがって、これら
のウイルスの特性付けは非常に困難であり、乳頭腫ウイルスの検出はすでに重要
な問題となっている。このことは特に皮膚癌内の乳頭腫ウイルスに当て嵌まる。
このウイルスの信頼できる検出、したがって、それらに対してよく計算された工
程は今でも可能にはなっていない。
したがって、特に皮膚癌において乳頭腫ウイルスを検出する役割を果たす試薬
を提供することが本発明の目的である。さらに、これらの乳頭腫ウイルスに対す
る治療工程に役立つ薬品を提供する。
本発明によると、この目的は、請求の範囲の内容を実施することにより達成さ
れる。
このように、本発明の内容は、乳頭腫ウイルス主カプシドタンパク質(L1)
のペプチドをコード化するDNAに関し、このペプチドは、第1図、第2図、第
3図、第4図、第5図、第6図、第7図、第8図、または第9図のアミノ酸配列
またはアミノ酸配列の少なくとも一部からなる。
「アミノ酸配列の少なくとも一部」という表現は、個々の図面のアミノ酸配列
には、1種類以上のアミノ酸の変種を含んでいてもよいとう事実を意味するもの
である。
本発明の別の内容は、乳頭腫ウイルス主カプシドタンパク質のペプチドをコー
ド化するDNAに関し、このDNAは、第1図、第2図、第3図、第4図、第5
図、第6図、第7図、第8図、または第9図の塩基配列または塩基配列の少なく
とも一部からなる。
「塩基配列の少なくとも一部」という表現は、個々の図面の塩基配列には、1
種類以上の塩基対の変種を含んでいてもよいとう事実を意味するものである。
第1図は、乳頭腫ウイルスのL1のペプチドをコード化するDNAの塩基配列
およびそれから派生したアミノ酸配列を示している。このDNAは、1994年 4月
12日にDSM9133の元でDSM(German Collection of Microorganisms and Ce
ll Cultures)にプラスミドVS93-1として寄託された。
第2図は、乳頭腫ウイルスのL1のペプチドをコード化するDNAの塩基配列
およびそれから派生したアミノ酸配列を示している。このDNAは、1994年 4月
12日にDSM9134の元でDSMにプラスミドCR148-59として寄託された。
第3図は、乳頭腫ウイルスのL1のペプチドをコード化するDNAの塩基配列
およびそれから派生したアミノ酸配列を示している。このDNAは、1994年 4月
12日にDSM9135の元でDSMにプラスミドVS40-7として寄託された。
第4図は、乳頭腫ウイルスのL1のペプチドをコード化するDNAの塩基配列
およびそれから派生したアミノ酸配列を示している。このDNAは、1994年 4月
12日にDSM9136の元でDSMにプラスミドVS20-4として寄託された。
第5図は、乳頭腫ウイルスのL1のペプチドをコード化するDNAの塩基配列
およびそれから派生したアミノ酸配列を示している。このDNAは、1994年 4月
12日にDSM9137の元でDSMにプラスミドVS102-4として寄託された。
第6図は、乳頭腫ウイルスのL1のペプチドをコード化するDNAの塩基配列
およびそれから派生したアミノ酸配列を示している。このDNAは、1994年 4月
12日にDSM9138の元でDSMにプラスミドVS73-1として寄託された。
第7図は、乳頭腫ウイルスのL1のペプチドをコード化するDNAの塩基配列
およびそれから派生したアミノ酸配列を示している。このDNAは、1994年 4月
12日にDSM9139の元でDSMにプラスミドVS42-1として寄託された。
第8図は、乳頭腫ウイルスのL1のペプチドをコード化するDNAの塩基配列
およびそれから派生したアミノ酸配列を示している。このDNAは、1994年 4月
12日にDSM9140の元でDSMにプラスミドVS92-1として寄託された。
第9図は、乳頭腫ウイルスのL1のペプチドをコード化するDNAの塩基配列
およびそれから派生したアミノ酸配列を示している。このDNAは、1994年 4月
12日にDSM9141の元でDSMにプラスミドVS75-3として寄託された。
上述したDNAは既知の乳頭腫ウイルスとの以下の配列相同性を有している:
第1図のDNA: HPウイルス29と82.7%
第2図のDNA: HPウイルス49と75%
第3図のDNA: HPウイルス49と78.5%
第4図のDNA: HPウイルス25と75.6%
第5図のDNA: HPウイルス17と79%
第6図のDNA: HPウイルス17と73.6%
第7図のDNA: HPウイルス15と73.1%
第8図のDNA: HPウイルス15と82.8%
第9図のDNA: HPウイルス12と75.7%
本発明によると、上述したDNAは、ベクターおよび発現ベクター内にそれぞ
れ存在していてもよい。当業者にはそれらの実例がよく知られている。E.co
liの発現ベクターの場合には、例えば、pGEMEX、pUC誘導体およびp
GEX−2Tがある。酵母内の発現に関しては、例えば、pY100およびYc
pad1について言及しなければならないが、動物細胞内の発現に関しては、例
えば、pKCR、pEF−BOS、cDM8およびpCEV4について示してい
る。当業者には、発現ベクター内に存在する上記DNAを発現するための適切な
細胞が分かっている。そのような細胞の例としては、E.coli株HB101
、DH1、x1776、JM101およびJM109、酵母株サッカロミセス属
セレビシアエ(cerevisiae)並びに動物細胞L、3T3、FM3A、CHO、C
Os、veroおよびHelaが挙げられる。当業者には、どのような方法で上
記DNAを発現ベクター内に挿入すべきであるかが分かっている。当業者には、
上述したDNAを、それぞれ別のタンパク質およびペプチドをコード化するDN
Aと組み合わせて挿入でき、そのために、上記DNAを融合タンパク質の形態で
発現できるという事実も知られている。
本発明の別の内容は、上記DNAを含む乳頭腫ウイルスゲノムに関するもので
ある。「乳頭腫ウイルスゲノム」という表現はまた、上記DNAを含む不完全ゲ
ノム、すなわち、乳頭腫ウイルスゲノムの断片も含んでいる。これは、例えば、
L1をコード化するDNAまたはその一部であってもよい。
上述した乳頭腫ウイルスゲノムの調製に関して、以下の工程からなる方法を使
用することができる:
(a) 上皮腫瘍の生検材料から全DNAを単離し、
(b) (a)の全DNAを上記DNAによりハイブリッド形成し、それによって
、(a)の全DNA内に含まれる乳頭腫ウイルスゲノムを検出し、
(c) ベクター内で、乳頭腫ウイルスゲノムを含む(a)の全DNAをクローニ
ングし、必要に応じて、得られたクローンをサブクローニングする。全ての工程
は、従来のDNA組換え技術から起因したものである。
細胞DNAの単離、ハイブリッド形成およびクローニングに関しては、補足と
して、サムブルック等のMolecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版、Co
ld Spring Harbor Laboratory、1989を参照のこと。
「上皮腫瘍」という表現は、ヒトおよび動物内の上皮組織のいかなる腫瘍をも
含む。そのような腫瘍の例としては、いぼ、生殖部位のコンジローム、および皮
膚癌が挙げられる。ここで、好ましくは後者を用いて、上記乳頭腫ウイルスゲノ
ムを単離する。
「ベクター」という表現は、それぞれ、染色体の並びに染色体外のDNAをク
ローニングするのに適したいかなるベクターをも含む。このようなベクターの例
としては、pWE15およびSuper Cos1のようなコスミド、並びに、
λファージ、例えば、λZAP発現ベクター、λZAPIIベクターおよびλg
t10ベクターのようなファージが挙げられる。ここでは、λファージが好まし
い。上述したベクターは公知であり、ストラタジーン(Stratagene)社から得ら
れる。
本発明による乳頭腫ウイルスゲノムは、染色体DNA内に組み込まれている場
合もあるし、染色体外の形態で存在する場合もある。当業者はこれを明らかにす
る方法を知っている。当業者はまた、乳頭腫ウイルスゲノムをクローニングする
最適な制限酵素を発見する方法も知っている。当業者は、既知の乳頭腫ウイルス
のゲノムを使用してこれを行なう。具体的には、当業者は、上述したHPウイル
スを観察することによってこれを行なう。
VS93-1- Gと称する乳頭腫ウイルスゲノムの調製を実施例として記載する。
この目的に関して、全DNAを鱗屑上皮細胞癌の生検材料から単離し、BamH
Iにより開裂し、アガロースゲル内で電気泳動により分離した。次いで、アガロ
ースゲルにブロッティング法を行ない、これにより、DNAをニトロセルロース
膜に移す。これは標識付けた試料としてHPウイルス29のDNAと必要に応じて
組み合わせて、第1図のDNAを用いるハイブリッド形成法に用いられる。全D
NA内に存在する乳頭腫ウイルスDNAによるハイブリッドが得られる。
さらに、BamHIにより開裂された上記全DNAをλファージ内にクローニ
ングする。対応するクローン、すなわち、乳頭腫ウイルスDNAを含むクローン
は、HPウイルス29のDNAと必要に応じて組み合わせて、第1図のDNAによ
るハイブリッド形成により同定する。次いで、乳頭腫ウイルスゲノムVS93-1-
Gを含むクローンを得るために、これらのクローンの挿入物(insert)にプラス
ミドベクター内で別のクローニングを行なう。このゲノムを塩基配列決定法によ
り確認する。
さらに、乳頭腫ウイルスゲノムを同様な方法により調製する。ゲノムを調製す
るために用いたDNAに対応して、それらゲノムを、それぞれ、CR148-59- G
、VS40-7- G、VS20-4- G、VS102-4-G、VS73-1- G、VS42-1- G、
VS92-1- GおよびVS75-3- Gと称する。
本発明の別の内容は、上記乳頭腫ウイルスゲノムによりコード化されるタンパ
ク質に関するものである。このようなタンパク質は、例えば、主カプシドタンパ
ク質(L1)または副カプシドタンパク質(L2)である。上述したタンパク質
をいつものとおりに生成する。乳頭腫ウイルスゲノムVS93-1- GのL1および
L2それぞれの生成について、実施例として記載する。この目的のために、第1
図のDNAに関連するHPウイルス29を使用する。このウイルスの完全な配列お
よびタンパク質をコード化する個々のDNA領域の位置が知られている。両方の
ゲノムの平行制限開裂、並びにL1およびL2それぞれをコード化するDNA各
々に関連する様々な断片による続いてのハイブリッド形成により乳頭腫ウイルス
ゲノムVS93-1- G上でこれらのDNAを同定する。これらのDNAを塩基配列
決定法により確認する。L1をコード化するDNAをVS93-1- G−L1−DN
Aと称し、L2をコード化するDNAをVS93-1- G−L2−DNAと称する。
さらに、L1およびL2それぞれをコード化するDNA各々を発現ベクター内
に挿入する。E.coli、酵母および動物細胞に関するそれらの例は上述して
ある。この点について、補足として、E.coli内の発現に関して、ベクター
pGEX−2Tについて言及する(Kirnbauer,R.等、前出を参照)。VS93-1-
G−L1−DNAおよびVS93-1- G−L2−DNAを挿入した後、それぞれ、
pGEX−2T−VS93-1- G−L1およびpGEX−2T−VS93-1- G−L
2が得られる。E.coliの形質転換後、これらの発現ベクターは、それぞれ
、グルタチオンS−トランスフェラーゼ−L1−融合タンパク質およびグルタチ
オンS−トランスフェラーゼ−L2−融合タンパク質を発現する。これらのタン
パク質をいつものように精製する。
L1およびL2それぞれをコード化する上記DNA各々の別の発現に関して、
それぞれ、バキュロウイルス(bacculovirus)系およびワクシニアウイルス系に
ついて言及する。バキュロウイルス系に関して、この目的に使用できる発現ベク
ターは、例えば、pEV mod.およびpSynwtVI-である(Kirnbauer
,R.等、前出を参照)。ワクシニアウイルス系に関して、特に、ワクシニアウイ
ルス「早期(early)」(p7.5k)および「後期(late)」(Psynth
、p11k)を含むベクターについて言及すべきである(Hagansee,M.E.等、Jo
urnal of Virology、1993、315-322頁を参照)。ここではバキュロウイルス系が
好ましい。L1およびL2それぞれをコード化する上記DNA各々をpEV m
od.内に挿入することにより、それぞれ、pEVmod.−VS93-1- G−L
1およびpEVmod.−VS93-1- G−L2が得られる。
前者の発現ベクターのみかまたは両方の発現ベクターにより、SF−9昆虫細
胞の感染後にウイルス状粒子が形成される。前者の場合、このような粒子はL1
タンパク質を含むが、後者の場合には、L1タンパク質に加えて、L2タンパク
質も含む。
上記VS93-1- G−L1−DNAおよびVS93-1- G−L2−DNAを互いに
発現ベクターpSybwtVI-内に挿入し、得られるpSynwtVI-VS93
-1- G−L1/L2をSF−9昆虫細胞に使用するので、後者の場合のウイルス
状粒子も得られる。上記ウイルス状粒子をいつものように精製する。これらの粒
子も本発明の内容である。
本発明の別の内容は、上述したタンパク質およびウイルス状粒子それぞれに対
して向けられる抗体に関するものである。このような抗体は普通に産生される。
VS93-1- GのL1を含むウイルス状粒子に対して向けられる抗体の産生に関し
て、実例として記載する。この目的のために、BALB/cマウス中にウイルス
状粒子を皮下に注射する。この注射を各々3週間ごとに繰り返す。最後の注射か
ら約2週間後、抗体を含有する血清を単離し、いつものように検査する。
好ましい実施の形態において、抗体はモノクローナル抗体である。その産生に
関して、上述した4回目の注射を行なった後にマウスからスプレノサイト(sple
nocite)を採取し、これらをいつものように骨髄腫細胞と融合する。既知の方法
にしたがって、さらなるクローニングも行なう。
本発明により、特に皮膚癌における乳頭腫ウイルスを検出することが可能にな
る。この目的のために、本発明によるDNAをそのまま使用することも、別のD
NA内に含めることもできる。後者は、乳頭腫ウイルスゲノムまたはその一部で
あってもよい。
さらに、本発明により、以前には知られていない乳頭腫ウイルスを調製するこ
とが可能になる。未知のウイルスは、特に皮膚癌内で発見される。さらに、本発
明は、これらの乳頭腫ウイルスから発生するウイルス状粒子およびタンパク質を
提供する。その上、これらのタンパク質および粒子それぞれに対して向けられる
抗体を提供する。
このように、本発明により、乳頭腫ウイルス病の場合の診断および治療工程を
行なうことが可能になる。さらに、本発明は、乳頭腫ウイルス感染に対するワク
チンを調製することを可能にする。したがって、本発明は乳頭腫ウイルス研究の
分野における躍進に値する。
本発明を実施例により説明する。
実施例1: 乳頭腫ウイルスゲノムVS93-1Gの同定
全DNAを免疫抑制されたヒトの鱗屑上皮細胞癌の生検材料WV
−8495から単離する。このDNAの10μgを制限酵素BamHIにより開裂し、
0.5%のアガロースゲル内で電気泳動により分離する。これと同時に、開裂して
いない上記DNAの10μgも分離する。電気泳動の結果を第10図に示す。この
結果から、DNA分子が染色体外DNAに典型的な形態、すなわち、「スーパー
コイル分子」および「開環状分子」それぞれの非開裂DNA内に存在しているこ
とが言える。このDNA分子はBamHIにより2つの断片に開裂されている。
上述したアガロースゲルにブロッティング法を行ない、それによ
にり、DNAをアガロースゲルからニトロセルロース膜に移す。これは第1図の
上記DNAがp32標識付け試料としてのHPウイルス29DNAと組み合わせて用
いられるハイブリッド形成法に使用される。上記DNA分子によるハイブリッド
形成を行なう。
DNA組換え技術の分野における当業者には、上記方法が知られ
ている。補足として、前出のサムブルック等の文献について言及する。
実施例2: 乳頭腫ウイルスゲノムVS93-1-Gのクローニング
実施例1から得られた、WV−8495の生検材料のDNAを制限酵
素BamHIにより開裂する。BamHIにより開裂し脱リンしたベクターλZ
AP発現が存在するリガーゼ反応内に、得られる断片を挿入する。
得られる組換えDNA分子を、バクテリアを感染させるために使
用するバクテリオファージ内に封じ込める。ストラタジーン社により得られるZ
AP発現ベクターキットをこれらの工程に用いる。次いで、得られるファージプ
ラークにハイブリッド形成法を施す。このハイブリッド形成において、実施例1
で用いた第1図のp32標識付けDNAをp32標識付けHPウイルス29DNAと組
み合わせて用いている。対応するファージプラークによるハイブリッドが得られ
る。VS93-1- Gの2つのBamHI断片をそこから単離して、BamHI開裂
し、脱リンしたプラスミドベクター、すなわち、pBluescriptととも
に別のリガーゼ反応内に挿入する。得られる組換えDNA分子をバクテリア、す
なわち、E.coli XI1−Blueの形質転換に用いる。乳頭腫ウイルス
ゲノムVS93-1- Gを含む細菌性クローンをそれぞれ制限開裂および上記DNA
試料によるハイブリッド形成により同定する。この細菌性クローンのプラスミド
をpBlue−VS93-1- Gと称する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
// C12Q 1/68 9453−4B C12Q 1/68 A
(C12N 15/09 ZNA
C12R 1:92)
(72)発明者 デ フィリエルスツール ハオゼン,エテ
ルミケル
ドイツ連邦共和国 ディー―69493 ヒル
シュベルグ イム シャイブリング 6
(72)発明者 リー,アイリーン
イギリス国 イー1 2ビーエル アシュ
フィールド ストリート 56 メディカル
カレッジ ロンドン ホスピタル
(72)発明者 ツール ハオゼン,ハラルド
ドイツ連邦共和国 ディー―69493 ヒル
シュベルク イム シャイブリング 6
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 乳頭腫ウイルス主カプシドタンパク質のペプチドをコード化するDNA であって、前記ペプチドが、第1図、第2図、第3図、第4図、第5図、第6図 、第7図、第8図、または第9図のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むことを 特徴とするDNA。 2. 前記ペプチドが、第1図、第2図、第3図、第4図、第5図、第6図、 第7図、第8図、または第9図のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求の範 囲第1項記載のDNA。 3. 前記乳頭腫ウイルス主カプシドタンパク質の前記ペプチドをコード化す る前記DNAが、第1図、第2図、第3図、第4図、第5図、第6図、第7図、 第8図、または第9図の塩基配列の少なくとも一部を含むことを特徴とする請求 の範囲第1項または第2項記載のDNA。 4. 前記乳頭腫ウイルス主カプシドタンパク質の前記ペプチドをコード化す る前記DNAが、第1図、第2図、第3図、第4図、第5図、第6図、第7図、 第8図、または第9図の塩基配列を含むことを特徴とする請求の範囲第1項から 第3項いずれか1項記載のDNA。 5. 請求の範囲第1項から第4項いずれか1項記載のDNAを含むことを特 徴とする乳頭腫ウイルスゲノム。 6. 請求の範囲第5項記載の乳頭腫ウイルスゲノムを産生する方法であって 、 (a) 上皮腫瘍の生検材料から全DNAを単離し、 (b) 請求の範囲第1項から第4項いずれか1項記載のDNAにより工程(a) の前記全DNAをハイブリッド形成し、それにより、(a)の前記全DNA内に含 まれる乳頭腫ウイルスゲノムを検出し、 (c) 前記乳頭腫ウイルスゲノムを含む(a)の前記全DNAをベクター内でク ローニングし、必要に応じて、得られるクローンをサブクローニングする 各工程からなり、前記各工程の全てが従来のDNA組換え技術から起因すること を特徴とする方法。 7. 請求の範囲第5項記載の乳頭腫ウイルスゲノムによりコード化されるこ とを特徴とするタンパク質。 8. 前記タンパク質が乳頭腫ウイルス主カプシドタンパク質であることを特 徴とする請求の範囲第7項記載のタンパク質。 9. 前記タンパク質が乳頭腫ウイルス副カプシドタンパク質であることを特 徴とする請求の範囲第7項記載のタンパク質。 10. 請求の範囲第7項から第9項いずれか1項記載のタンパク質をコード化 するDNAを含むことを特徴とする発現ベクター。 11. 請求の範囲第10項記載の発現ベクターを含むことを特徴とする形質転 換体。 12. 請求の範囲第7項から第9項いずれか1項記載のタンパク質を生成する 方法であって、適切な条件下で請求の範囲第11項記載の形質転換体を培養する 工程を含むことを特徴とする方法。 13. 請求の範囲第8項記載の乳頭腫ウイルス主カプシドタンパク質を含むこ とを特徴とするウイルス状粒子。 14. 請求の範囲第9項記載の乳頭腫ウイルス副カプシドタンパク質をさらに 含むことを特徴とする請求の範囲第13項記載のウイルス状粒子。 15. 請求の範囲第7項から第9項いずれか1項記載のタンパク質に対して向 けられることを特徴とする抗体。 16. 請求の範囲第13項または第14項記載のウイルス状粒子に対して向け られることを特徴とする抗体。 17. 請求の範囲第1項から第5項いずれか1項記載のDNAの、診断のため の試薬としての使用。 18. 請求の範囲第7項から第9項いずれか1項記載のタンパク質の、診断、 治療および/またはワクチン接種のための試薬としての使用。 19. 請求の範囲第13項または第14項記載のウイルス状粒子の、診断、治 療および/またはワクチン接種のための試薬としての使用。 20. 請求の範囲第15項または第16項記載の抗体の、診断および/または 治療のための試薬としての使用。
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