【発明の詳細な説明】
ヘリコバクター・ピロリのヘマグルチニン/プロテアーゼタンパク質、
それをコードする核酸およびそれに対する特異的抗体
本発明はヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pyloriまたはH.pylori)のヘ
マグルチニン/プロテアーゼタンパク質、それをコードする核酸およびそれに対
する特異的抗体、そして特にヘリコバクター・ピロリの同定およびヘリコバクタ
ー・ピロリ感染の診断におけるその用途に関する。
ヘリコバクター・ピロリ[正式にはカンピロバクター・ピロリジス(Campyloba
cter pyloridisまたはC.pylori]は、胃の粘膜層の下に生存すると思われる螺旋
形状のグラム陰性微生物である。1982年のその最初の単離以来、ヘリコバク
ター・ピロリは、胃および十二指腸のガン性疾患および胃ガンと関連があるとみ
なされている。ヘリコバクター・ピロリはヒトの最も慢性の感染因子であること
が開示されている。技術の現状における評論としては、C.A.M.マクナルティの「
J.Infection」,1986年,13,107−113;C.S.グッドウィンらの「J.Cl
in.Pathol.」,1986年,39,353−365;およびユーロガスト研究グル
ープの「Lancet」,1993年,341,1359−1362が挙げられる。
ヘリコバクター・ピロリの疾患を引き起こす能力に必要とされるタンパク質を
コードする遺伝子の数は知られておらず、ヘリコバクター・ピロリのウイルレン
ス(毒力)決定素は、これまでに同定されていない。この微生物がもつ決定素の
幾つかが、病原因子の可能性があるものとして提案されている。たとえば、この
微生物は、腸の上皮細胞に至る経路において通常は細菌に対する障壁となる腸の
粘膜層などの高粘度の液体中を、複数の鞭毛の働きによってすばやく螺旋状運動
をすることができる。また、ヘリコバクター・ピロリは、そのムチナーゼ消化酵
素産生能力によって胃の中で拡散することができる。顕微鏡を用いたヘリコバク
ター・ピロリ感染患者の胃の生検から、ヘリコバクター・ピロリが胃の上皮細胞
上の特定の部位に存在する生物であることが示されている。生化学的研究におい
ては、ヘリコバクター・ピロリをそれらの部位に付着せしめるヘマグルチニンの
同定が報告されている。
細胞外酵素であるメタロプロテアーゼは、哺乳動物に疾患を引き起こす、細菌
がもつ普通の微生物病原因子である。亜鉛メタロプロテアーゼは急速な基質回転
率および広範な基質プロファイルをもつことが知られている。技術の現状におけ
る評論としては、フラウスト・ダ・シルバ,J.J.R.およびウィリアムズ,R.J.P.の
「ザ・バイオロジカル・ケミストリー・オブ・ジ・エレメンツ」,1993年,ク
レアンドン・プレス,オクスフォード,チャプター11;およびバリー,B.L.およ
びオールド,D.S.の「バイオケミストリー」,29,5647−5659が挙げら
れる。
シュードモナス・アエルギノーサの亜鉛メタロプロテアーゼ(これはエラスタ
ーゼとして公知である)は、嚢胞性繊維症の患者において該微生物によって引き
起こされる肺組織破壊プロセスにおいて重要であることが示されている(ビバー
,R.A.およびイグリュースキー,B.H.の「J.Bacteriol.」,1988年,170,4
309−4314)。同様に、ビブリオ・コレラエの亜鉛メタロプロテアーゼ(
ムチナーゼまたはヘマグルチニン/プロテアーゼ(HAP)として公知である)
は、コレラ感染中のこれらの微生物の付着および脱離において重要であることが
示されている。技術の現状における文献としては、ハース,C.C.およびフィンケ
ルシュタイン,R.A.の「J.Bacteriol.」,1991年,173,3311−3317
;およびフィンケルシュタインらの「Infect.Immunol.」,1992年,60,47
2−478が挙げられる。
ところで、我々は驚くべきことに、ビブリオ・コレラエhap遺伝子とほとんど
等しいウイルレンス遺伝子(ヘリコバクター・ピロリhap遺伝子と命名した)が
ヘリコバクター・ピロリのゲノムに存在することを発見した。ポリメラーゼ鎖反
応(PCR)または他のハイブリダイゼーション法による該ヘリコバクター・ピ
ロリhap核酸配列の検出、抗体検出法によるヘリコバクター・ピロリHAPタン
パク質のエピトープの検出、またはELISAなどによる該ヘリコバクター・ピ
ロリHAPタンパク質に対する抗体の検出は、ヘリコバクター・ピロリが媒介す
る哺乳動物の胃および十二指腸の疾患の診断において有用性をもつ。
ヘリコバクター・ピロリが媒介する胃の疾患の診断に関する先行技術には、ヘ
リコバクター・ピロリRNAとハイブリッド形成しうるカンピロバクターDNA
プローブが包含される(EP−A−0350205)。ヘリコバクター・ピロリ
ウレアーゼ遺伝子配列に特異的なヘリコバクター・ピロリオリゴヌクレオチドが
、WO91/09049に開示されている。血清イムノアッセイによるヘリコバ
クター・ピロリ感染の血清学的検出および診断、ならびにヘリコバクター・ピロ
リ抗原および抗原フラグメントの検出が、WO89/08843、WO89/0
9497およびEP−A−0329570に開示されている。
胃炎、胃潰瘍または消化性潰瘍あるいは胃ガンの早期診断手段として、ヘリコ
バクター・ピロリのDNA、RNAまたはヘリコバクター・ピロリの特定のタン
パク質に対する抗体、あるいは患者由来の臨床サンプル中(胃粘膜、唾液、***
物、血漿または血清中など)のヘリコバクター・ピロリタンパク質自体を検出す
る確実な手段をもつことが強く求められている。
したがって、本発明は、図1の核酸配列の全部または一部からなる、ヘリコバ
クター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列
を提供する。本発明のヘリコバクター・ピロリhap遺伝子の配列決定によってヘ
リコバクター・ピロリに対して特異的な選択されたオリゴヌクレオチドまたはタ
ンパク質のエピトープ配列を構築する可能性が生じる。配列決定されたヘリコバ
クター・ピロリhap遺伝子は、コード領域においてビブリオ・コレラエhap遺伝子
と99%以上同じであることがわかっている。1kbのコード配列および約50
0bpの3'フランキング配列を示すクローン化された1.5kbのヘリコバクタ
ー・ピロリhap遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列を図1に示す。
該核酸配列はヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質の少なくともひとつの
抗原決定基をコードするのが好ましい。該核酸配列は図1の1番から936番の
塩基配列を含むのが好ましい。また本発明は、上記ヘリコバクター・ピロリhap
の核酸配列と相補的な核酸配列をも提供する。該核酸配列には、ゲノムDNA、
相補的DNA(cDNA)、合成DNAまたは組換えDNAあるいはRNAが含
まれる。
該核酸配列は、図1に示す核酸配列の一部に対して特異的結合親和性をもつ1
5番〜50番のヌクレオチド、好ましくは18番〜50番のヌクレオチドからな
るオリゴヌクレオチドあるいはそれに対する相補的核酸配列をもつ。該オリゴヌ
クレオチドは15番〜30番のヌクレオチド、好ましくは15番〜25番のヌク
レオチドであってもよい。該オリゴヌクレオチドは、少なくとも15またはそれ
以上のヌクレオチド配列からなり、図1に示す16番〜18番、220番〜22
2番または43番〜45番のヌクレオチドを包含するのが好ましい。
好ましいオリゴヌクレオチド配列は、以下の配列のいずれかである。
該オリゴヌクレオチドはDNAまたはRNA配列も含む。
本発明の範囲内のオリゴヌクレオチドは一本鎖および二本鎖の両方を包含する
が、どのようなハイブリッド形成操作においても、このような二本鎖プローブは
変性して一本鎖プローブとなることが必要であることが理解されよう。
さらに本発明は、前記核酸配列のいずれかを含むベクターを提供する。本発明
は、pUC18およびpUC19などのクローニングベクターならびにpASK
60−Strepなどの発現ベクターを含む公知のいずれかのベクター系を用いるこ
とを特に企図している。さらに本発明は、ひとつまたはそれ以上のこのようなベ
クターで形質転換された宿主細胞を提供する。また本発明は、該DNA配列を含
むひとつまたはそれ以上のベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、該培養
物から該DNA配列を単離することを特徴とする前記DNA配列の生産方法を提
供する。このような方法は当業者には公知の条件および操作にしたがって行われ
る。
さらに本発明は、図1のアミノ酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター
・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグメントを提供する。HAPタンパク
質
のフラグメントが、ヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質の抗原決定基であ
るのが好ましい。HAPタンパク質のフラグメントが、図1の1番〜936番の
塩基の配列によってコードされるのが好ましい。
本発明の範囲内のヘリコバクター・ピロリタンパク質またはそのフラグメント
には、ヘリコバクター・ピロリから精製されるかまたは組換えタンパク質として
、大腸菌またはバシラス・サブチリス内で産生された、ヘリコバクター・ピロリ
HAPタンパク質自体が包含されるが、胃粘膜または胃腸管の他の分泌物または
産物中のヘリコバクター・ピロリタンパク質の検出などの次に続く診断操作も本
発明の範囲であることが理解されよう。
また本発明は、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、該培養
物から該タンパク質またはそのフラグメントタンパク質を単離することを特徴と
する前記ヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグメントの生
産方法をも提供する。
本発明では、定義された核酸配列には、同一の核酸配列のみならず、特に、類
似コドンが得られるような塩基の置換などの、天然の核酸配列から幾らかの少数
の塩基を変更したものも含まれることが理解されよう(異なるコドンが同一のア
ミノ酸を特定する)。さらに、定義されたタンパク質、ポリペプチドまたはアミ
ノ酸配列には、同一のアミノ酸配列のみならず、特に、保守的アミノ酸置換など
の天然のアミノ酸配列から少数のアミノ酸を変更したものも含まれる(アミノ酸
による置換はその側鎖に関したものである)。天然のアミノ酸から変化したもの
であるが、天然の配列でコードされるポリペプチドと免疫学的に同一であるポリ
ペプチドが得られるようなアミノ酸配列も本発明に包含される。これには、対応
して変更されたコード核酸配列が包含される。
本発明はまた、ヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグメ
ントの抗原決定基を認識するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供す
る。本発明のヘリコバクター・ピロリ特異的抗体には、ヘリコバクター・ピロリ
HAPタンパク質またはそのフラグメントに対するポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体の両方が含まれるが、胃粘膜または胃腸管の他の分泌物または産物
中のヘリコバクター・ピロリの検出などの次に続く診断操作も本発明の範囲であ
ることが理解されよう。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は当業界では公知の標準的方法で生
産されるが、たとえば、クーラー,F.およびミルスタイン,C.の(1975年)「
Nature」,256,495〜497に開示されている技術によってモノクローナル
抗体を生産する。
本発明にしたがって、特異的ヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質は、実
験動物において該ヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質に対する抗体を作る
のに有用であり、これらの特異的抗ヘリコバクター・ピロリHAP抗体は、患者
からの臨床サンプル中のヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質の検出に有用
である。該ヘリコバクター・ピロリHAPタンバク質はELISAまたはウエス
タンブロット分析において有用であり、ヘリコバクター・ピロリから精製するか
または組換えDNA技術によって生産することができ、このための技術はよく知
られており、十分に当業者の能力の範囲内である。
さらに本発明は、ヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグ
メントの抗原決定基を認識するモノクローナル抗体を生産することができるハイ
ブリドーマを提供する。
さらに本発明は、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)または転写補助増幅システム
(TAS)などの当業界で公知の等価の技術によって前記核酸配列を増幅する方
法を提供する。好ましくは、下記のオリゴヌクレオチド対を用いてPCR法を行
う。
さらに本発明は、図1の核酸配列またはその一部を含む核酸プローブを提供す
る。また本発明は、当業界で公知の適当な条件下で被検サンプルを前記核酸プロ
ーブと接触させ、ヘリコバクター・ピロリ核酸配列(単数または複数)と該プロ
ーブとのハイブリッド形成を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ
核酸の同定方法を提供する。特定のプローブまたはプローブ対の選択は、当業界
で公知の多数の因子に依存するが、特に緊縮要求(すなわち、標的DNAにおい
て相補配列との不適当な組み合わせを寛容に扱うような能力あるいはそのための
プローブ)が選択の基準となる。明らかに、長いプローブほど標的DNAに対す
るプローブのハイブリッド形成に影響を及ぼすことなく局所的不適合に抵抗する
能力が優れている。プローブの選択に影響を及ぼす因子はよく認識されており、
十分に当業者の能力の範囲内である。
さらに本発明は、被検サンプル中において、PCRまたは等価の技術により図
1のヘリコバクター・ピロリ核酸配列を増幅させ、増幅された核酸配列を検出す
ることを特徴とするヘリコバクター・ピロリ核酸の同定方法を提供する。
PCR増幅が、本発明のヘリコバクター・ピロリ特異的ヌクレオチドを用いる
ヘリコバクター・ピロリ検出の好ましい方法であるが、他の検出操作も使用でき
、それらは当業界で公知である。このために、放射標識、蛍光標識または酵素標
識などの種々の異なる標識をした本発明のヘリコバクター・ピロリ特異的オリゴ
ヌクレオチドまたは核酸プローブが提供されるが、すべてが、研究中の未同定の
核酸サンプルと結合してハイブリッド形成したヌクレオチドのいずれの検出をも
可能にする。
さらに本発明は、被検サンプルを本発明抗体と接触させ、抗体−抗原複合体の
存在を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質の抗
原決定基の同定方法を提供する。また同じく本発明は、被検サンプルを前記ヘリ
コバクター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグメント、あるいはビブリ
オ・コレラエHAPタンパク質またはそのフラグメントに接触させ、抗原−抗体
複合体の存在を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ感染の同定方
法も提供する。被検サンプルは通常、歯垢、唾液、胃液または***物を用いるが
、
あるいは胃粘膜サンプルを用いてもよい。本発明のヘリコバクター・ピロリ核酸
配列について前に記載したように、アミノ酸配列、ポリペプチド、タンパク質お
よび抗体についても、蛍光、放射または酵素標識などの種々の異なる標識をする
ことができ、それらはすべて、それぞれ研究中の抗体またはアミノ酸サンプルに
対して、該アミノ酸配列または抗体を検出可能にする。
ヘリコバクター・ピロリHAP抗原(HAPタンパク質またはそのフラグメン
ト)またはビブリオ・コレラエHAP抗原は、交差反応性抗体をもつ患者を検出
するためのイムノアッセイに用いることができる。逆に、抗体を用いて、交差反
応性のヘリコバクター・ピロリHAP抗原をもつ患者を検出するためのイムノア
ッセイを行うことができる。このように、ヘリコバクター・ピロリ感染に関連す
る胃および十二指腸疾患との相関性を作ることができる。本発明によって企図さ
れたイムノアッセイは、公知の診断法を含む。該イムノアッセイは、直接抗原−
抗体反応、競合、シングルまたはダブルサンドイッチアッセイなどに基づいて行
ってよく、ビオチンおよびアビジンを利用する方法などの増幅システムを包含す
ることができる。
該アッセイは、免疫診断プレートまたはガラスビーズなどの固相担体に付着さ
れた構成要素を含んでよく、免疫沈降を含むこともできる。イムノアッセイは通
常、標識抗体/抗原の使用を含み、該標識は蛍光標識、化学発光標識、放射標識
または着色分子による標識であってよい。
さらに本発明は、ヘリコバクター・ピロリhap核酸もしくはHAPタンパク質
またはそのフラグメントを用いて製造したヘリコバクター・ピロリに関連する胃
疾患の診断用の材料およびキット提供する。したがって、本発明は、1種または
それ以上の、図1の核酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリH
APタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列;図1のアミノ酸
配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそ
のフラグメント;あるいはビブリオ・コレラエHAPタンパク質またはそのフラ
グメント;もしくはヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグ
メントの抗原決定基を認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を特徴
とするキットを提供する。さらに本発明は、少なくともひとつの前記オリゴヌク
レオチド対を特徴とするポリメラーゼ鎖反応または同様な技術を用いるヘリコバ
クター・ピロリの同定用キットを提供する。
本発明キットは適当に標識された試薬、緩衝液などの付加的試薬および材料、
アッセイの結果の検出手段およびアッセイ器具を包含する。該キットの構成要素
は適当なキット容器にパッケージングしてもよい。
また本発明は、図1の核酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロ
リHAPタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列;図1のアミ
ノ酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質また
はそのフラグメント;あるいはビブリオ・コレラエHAPタンパク質またはその
フラグメント;もしくはヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそのフ
ラグメントの抗原決定基を認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を
用いたヘリコバクター・ピロリ感染の診断法も提供する。
したがって、本発明は、本発明のヘリコバクター・ピロリhap核酸配列または
そのフラグメントあるいはタンパク質配列またはそのフラグメントもしくはヘリ
コバクター・ピロリHAPタンパク質に対する抗体を用いた、ヘリコバクター・
ピロリに関連する胃の疾患の診断用キットまたは他の材料の製造を包含する。ヘ
リコバクター・ピロリhap核酸配列またはそのフラグメントあるいはタンパク質
配列またはそのフラグメントもしくは抗ヘリコバクター・ピロリHAP抗体は、
ヘリコバクター・ピロリに関連する胃の疾患の診断に用いた1種またはそれ以上
の他の核酸配列またはそのフラグメントあるいはタンパク質配列またはそのフラ
グメントもしくは抗体と組み合わせてもよい。
図面を参照しながら本発明をさらに説明する。
図1は、約1kbのコード領域および約5000bpの3'フランキング配列
を示すヘリコバクター・ピロリNCTC11638由来のクローン化された1.
5kbのヘリコバクター・ピロリhap遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列で
ある。ヘリコバクター・ピロリhap遺伝子のこの領域の配列は、EMBLヌクレ
オチド・シーケンス・データ・ライブラリに受託番号Z27239で寄託されて
いる。
図2は、プラスミドpUC19中のヘリコバクター・ピロリhap遺伝子の1.5
kbフラグメントの遺伝子マップである。該ヘリコバクター・ピロリ遺伝子フラ
グメントは、2カ所のBamH1部位の間に位置する。
図1では、番号付けはEcoR1部位の最初のアデノシン塩基(A)から始めて
いる。PCRプライマーは、206番〜225番(HpHAP3)および762
番〜780番(HpHAP4)の位置にある点線の上線で示される。ビブリオ・
コレラエhap遺伝子からの3塩基インフレーム欠失(記号△H)は222番の位
置であり、798番の位置にひとつ付加され、843番の位置にひとつ欠失(T
の)がある以外は、ビブリオ・コレラエhap遺伝子と同一の領域が1番の位置か
らコード領域(二重線の下線)を越えて伸びている。停止コドンは***で示され
る。
同定されたヘリコバクター・ピロリhap核酸配列内で、2つの領域がタンパク
質の活性部位成分のコード領域を含むことが確認されている。
該2つの領域はチロシンをコードする16番〜18番の核酸およびヒスチジン
をコードする220番〜222番の核酸の周囲である。グルタミン酸をコードす
る43番〜45番の核酸の周囲の領域は、推定の亜鉛結合コード領域として同定
されている。
図1の配列内で、遺伝子含有配列のうち、ある領域が、カンピロバクターDN
Aと交差ハイブリッド形成しないことが確認されている。これらは、1番〜17
4番のヌクレオチドを含む。
次の実施例により本発明をさらに詳しく説明する。
実施例1
ヘリコバクター・ピロリ菌株の成長およびDNAとタンパク質の抽出
DNA抽出用のローンとして、ヘリコバクター・ピロリ菌株のNCTC(ナシ
ョナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャー,ロンドン)11637、1
1638、11916およびHP34(ノッチンガムのザ・ユニバーシティ・ホ
スピタルのクイーンズ・メディカル・センターの患者の内視鏡生検から臨床単離
)
を、5%のウマ血液(オキソイド)を含むコロンビア血液寒天上で、微好気性(
microaerphilic)条件下(カンピーパク、BBL)で2日間37℃にて成長させ
た。4つのプレートから、得られる成長物を採収し、まずグラム染色して特徴的
な形体を同定した。1mlの溶解緩衝液(50mM EDTA、100mM NaCl)
で細胞を洗浄し、400μlの溶解緩衝液に再懸濁し、20%N−ラウロイルサ
ルコシン(シグマ)を含有する30μlの溶解緩衝液を加えた。室温で5分間イ
ンキュベーション後、TE(10mM トリス−HCl、pH8、1mM EDTA
)で飽和したフェノールで懸濁物を繰り返し抽出した。次いで核酸を一夜エタノ
ール沈澱させ、遠心分離して集め、70%エタノールで洗浄し、ペレットを10
分間風乾した。次いでDNAをプロテイナーゼKで処理し、使用説明書にしたが
ってキアゲンミニカラムで精製した。ひとつの採収プレートの培養物を、500
mlの三角フラスコ中の2%β−シクロデキストリン(シグマ)および0.2mlの
再構築されたヘリコバクター・ピロリ選択性サプリメント(オキソイド)を含む
100mlのブルセラ・ブロス(ディフコ)に加え、ヘリコバクター・ピロリ菌株
NCTC11638を液体培地中で成長させた。該フラスコを嫌気性ジャーに入
れ、37℃、微好気性条件下(カンピーパク、BBL)で緩やかに振とうしなが
ら(100r.p.m)3日間インキュベートした。遠心分離によってヘリコバクタ
ー・ピロリ細胞を集め、ミルトン,D.L.、ノルヴィスト,A.およびウオルフ・ワッ
ツ,H.の「J.Bacteriol.」,1992年,174,7235〜7244に記載の方法
で、上清中のタンパク質を沈澱させた。2つのプレートの成長物を1.5mlのタ
ンパク質−抽出緩衝液(10mM トリス、pH7.5、1mM MgCl2、0.1
5mM EDTA、1mM DTT、1mM PMSF、2μgml-1ペプスタチンA(
シグマ)、0.5μgml-1ロイペプチン(シグマ))中に再懸濁させ、200μl
の10%SDSを加え、5分間沸騰させることによって細胞タンパク質を抽出し
た。次いで懸濁液を5分間氷冷し、12500r.p.m.で5分間遠心分離を行って
上清を集めた。ブラッドフォード,M.(1976年)「Anal.Biochem.」,72,24
7〜252の記載に従い、タンパク質濃度を測定した(バイオ−ラドのキット)
。
実施例2
酵素ヘリコバクター・ピロリプロテアーゼの同定
レムリ,UK.(1970年)の「Nature」,227,680〜685に記載の操作に
したがって、40μgの全細胞およびヘリコバクター・ピロリNCTC1163
8由来の上清タンパク質およびシュードモナス・アエルギノーサの臨床単離物を
、5%アクリルアミド積み重ねゲルおよび13%分解ゲルからなる垂直ミニゲル
(ホッファー・サイエンティフィック)上で分離した。20mAで電気泳動を行
った。ゲルの半分を直接染色し、他の半分をインキュベートしてから染色して、
プロテアーゼ活性を示した。直接染色したゲルを、脱染色溶液(40%メタノー
ル、10%酢酸、50%水)中の0.1%クーマシーブリリアントブルーR−2
50の溶液中に1時間置き、次いで脱染色溶液中に数回液を交換して置いた。未
染色ゲルをインキュベートし、アミドブラックの代わりにゲルを最終的にクーマ
シーブリリアントブルーR−250で染色する以外は、ミルトンらの「J.Bacteri
ol.」,1992年,174,7235〜7244に記載の方法によって、このゲル
のプロテアーゼ活性を検出した。透明になったバンド(ゼラチンおよび他のタン
パク質の消化)によってゲル中のプロテアーゼ活性を同定した。プロテアーゼ活
性は、ヘリコバクター・ピロリ細胞、上清およびシュードモナス・アエルギノー
サの行跡中に明らかに存在した。該ヘリコバクター・ピロリの行跡には、多数の
タンパク分解性バンドが存在した。上述の操作にしたがって運転された負荷ゲル
(100μgの全ヘリコバクター・ピロリタンパク質)は、約35kDaに透明
なプロテアーゼバンドを示した。
移動緩衝液(40mMトリス、pH8、30mMグリシン、20%メタノール、
1.3mM SDS)および使用説明書にしたがってATTO AE−6675ホリ
ズブロット・トランスファー・ユニット(ジェネチィック・リサーチ・インター
ナショナル)を用いてセミドライブロッティング法を行い、電気泳動分離物をニ
トロセルロース膜上に移した。次いでニトロセルロース膜を乾燥し、ブロッキン
グ溶液(1%ウシ血清アルブミン/洗浄緩衝液(10mMトリス、pH7.5、1
00mM NaCl、0.1%Tween20))中に、一定の揺れを加えながら室温
で1時間置いた。ウサギ抗シュードモナス・アエルギノーサエラスターゼ(ベバ
ーおよびイグリュースキー,1988年「J.Bacteriol.」,170:4309〜4
314)または公知の技術を用いて大腸菌で吸収された合同ヒト血清のいずれか
で膜をプローブした。該ブロッキング緩衝液に1:1000の比率で第1抗体を
加え、1〜4時間インキュベーションを行った。次いで洗浄緩衝液で2回膜を簡
単に洗浄した(揺らせながら15分間が一回、そして5分間が一回)。洗浄緩衝
液中、1:1000の比率で膜にHRP−標識抗体(抗ウサギまたは抗−ヒト)
を加え、上述のようにして1時間インキュベートした。次いで上述のようにして
膜を15分間が一回、そして5分間が4回洗浄緩衝液で洗浄する。次いでECL
基質試薬(アメシャム)を用いて膜を展開し、フジRX X線フィルムを露光さ
せ、使用説明書にしたがって現像した。20mMグリシン、pH2.5、0.05
5%Tween20中で、振とうしながら、室温にて一夜インキュベーションを行う
ことによってストリップした後に、ブロットの再プローブ処理を行った。HRP
標識抗−ウサギ抗体でプローブした後、シュードモナス・アエルギノーサの行跡
中に強いバンドが見られ、シュードモナス・アエルギノーサエラスターゼと同じ
分子量のバンドがヘリコバクター・ピロリの細胞タンパク質抽出物に見られた。
ヘリコバクター・ピロリに対する高い力価の抗体をもつ5人の患者からの合同血
清でプローブした後、抗シュードモナス・アエルギノーサエラスターゼ抗体によ
って先に同定された該バンド(35kDa)に対する強い応答を含む多数のバン
ドが観察された。ヘリコバクター・ピロリに感染していない5人の患者からの合
同血清をプローブしても、バンドは見られなかった。したがって、シュードモナ
ス・アエルギノーサエラスターゼとサイズおよび免疫学的反応性が同じタンパク
質が、ヘリコバクター・ピロリNCTC11638の細胞内および上清タンパク
質抽出物に存在することが示された。
実施例3
ヘリコバクター・ピロリhap遺伝子のクローニング
5μgのHindIIIおよびMamHIで切断されたヘリコバクター・ピロリNC
TC11638ゲノムDNAを、スミスらの(1992年)「Gene」,114:
211〜216に記載の方法で分離し、ハイボンドN(アメシャム)上にブロッ
トした。HRPで直接標識した、200ngのビブリオ・コレラエhap遺伝子DN
Aの3.2kbHindIIIフラグメントおよび5ngのHindIII切断ファージ
ラムダDNAで、該ゲノムブロットを一夜プローブ処理し(アメシャムECLキ
ット)、洗浄し、展開し、使用説明書にしたがってフジRX X線フィルムを露
光させた。ヘリコバクター・ピロリDNAの4kbのHindIIIおよび1.5k
bのBamHIフラグメントは、ビブリオ・コレラエhap遺伝子プローブと強くハ
イブリッド形成した。
4kb(HindIII)および1.5kb(BamHI)の両方のフラグメントを
、ヘリコバクター・ピロリNCTC11638ゲノムDNAから次の方法でクロ
ーン化した。
10μgの2部のゲノムDNAをBamHIまたはHindIIIのいずれかで切断
し、0.5xTBEミニゲル上でサイズ分離した。スミス,A.W.,(1990年)
博士論文(イギリス、ノッチンガム、ノッチンガム大学)に記載の方法で、4k
bのHindIIIフラグメントおよび1.5kbのBamHIフラグメントをゲルか
ら抽出し、HindIIIまたはBamHIのいずれかで切断(それぞれ)され、ウ
シアルカリフォスファターゼ処理されたpUC18、pUC19(図2)および
pAT153に別々にライゲートした。得られるプラスミドを大腸菌株DH5α
に入れて形質転換を行い、100mg/lのアンピシリンを含有する1ブロス寒天平
板上に植え、37℃で一夜インキュベートした。ハイボンドN上へコロニーを乗
せ、使用説明書にしたがって前記のように製造した3.2kbのHindIIIビブ
リオ・コレラエ(ECL)プローブを用いるコロニーハイブリッド形成法によっ
てスクリーニングして所望の組換え体を同定した。使用説明書にしたがって、市
販のユニバーサルおよびリバースのシーケンシングプライマーおよびシーケナー
ゼ・バージョン2(ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレイショ
ン)を用い、両方向に1.5kbのBamHIフラグメントの配列を構築した。
1.5kbのフラグメントの配列を構築してみると、開始コドンは示さなかっ
たが、コード領域においてヒスチジン残基の3塩基インフレーム欠失(図1の△
H)があるだけでビブリオ・コレラエhap遺伝子の配列と99%以上同一である
約1kbの領域を示した。配列は停止コドンの約50bp下流で完全に分岐し、
完全分岐前に異なる他の塩基がある。さらに、クローン化した配列は、ビブリオ
・コレラエhapの遺伝子座の3'フランキング領域とはまったく異なっている。こ
のようなコード配列保存は非常に珍しいことであり、共通先駆遺伝子または遺伝
子内遺伝子転移のどちらによっても説明するのが難しい。ヘリコバクター・ピロ
リのG+C%は34〜37%であり、一方ビブリオ・コレラエでは46〜48%
であり、たとえアミノ酸配列がなお保存されるとしても、このことによる2つの
属の間のコドン利用の差異はDNA配列を分岐させることになる。
実施例4
ヘリコバクター・ピロリのゲノムDNAのPCR
使用説明書にしたがってダイナザイム(フローゲン)熱安定性ポリメラーゼを
用い、4種の菌株、NCTC11638、NCTC11637、NCTC119
16およびHP34由来の50ngのヘリコバクター・ピロリゲノムDNAを増幅
した。用いたプライマーは、ヘリコバクター・ピロリhap遺伝子に特異性のある
5'−GCACAGGCAACAGGAACC−3'および5'−AACGAGG
CCTGAATTCTCGC−3'またはヘリコバクター・ピロリureA中の41
1bpフラグメントの増幅で用いた文献開示のプライマー[クレイトンらの「J.Clin
.Microbiol」, 1992年,30,192−200;およびロペツらの「Mol.Cel
l.Probes」,1993年,7,439−446]のいずれかであった。
反応サイクルのプロファイルは、次のとおりであった:1サイクルが95℃で
5分、30サイクルが94℃で30秒;52℃(hap)または48℃(ureA)の
いずれかで1分;72℃で1分30秒、および1サイクルが72℃で5分。実施
例2で記載したように、1.5%トリス酢酸寒天ゲル上でPCR生産物を分離し
、臭化エチジウムで染色し、ブロットし、ハイブリッド形成した。
HP34のサザンブロット分析において見られたものと同様な多形性が顕著で
あったが、4種の菌株すべてにおいて、クローン化したhap遺伝子配列から予測
された575bpの産物が得られた。同様に、4種の菌株すべてにおいて、ure
A遺伝子由来の411bp産物が得られ、これによって該ゲノムDNAの起点が
確認された。9種のヘリコバクター類、ヘリコバクター・アシノニクス、ヘリコ
バクター・フェリス、ヘリコバクター・フェネリアエ、ヘリコバクター・カニス
、ヘリコバクター・ムリダラム、ヘリコバクター・ネメストリナエ、ヘリコバク
ター・ムステラエ、ヘリコバクター・シナエジおよびヘリコバクター・ピロリN
CTC11638のゲノムDNAを、HAP遺伝子プライマーを用いて増幅し、
9種すべてにおいて、575bpのフラグメントを得た。ヘリコバクター・アシ
ノニクス、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・カニス、ヘリコバクタ
ー・ネメストリナエにおいて幾つかの多形性が目立って観測され、このことはこ
れら9種のゲノムDNAのサザンブロット分析からも明らかであった。この分離
物をブロットし、ビブリオ・コレラエhap遺伝子でプローブ処理し、ヘリコバク
ター・ピロリのゲノムDNAのPCR産物については、575bpのhapフラグ
メントのみハイブリッド形成を行った(411bp(ureA)フラグメントはし
なかった)。9種すべてのヘリコバクター類からの該575bpのPCR産物が
、ビブリオ・コレラエhap遺伝子プローブとのハイブリッド形成を示した。
ヘリコバクター・ピロリhap遺伝子とビブリオ・コレラエhap遺伝子の間に遺伝
子欠失があるため、非プルーフリーディング酵素を用いるPCRでは、どのよう
な相同なビブリオ・コレラエhap遺伝子配列が存在しようとも、増幅はおこなわ
れない。
【手続補正書】特許法第184条の8
【提出日】1995年6月26日
【補正内容】
請求の範囲
1.図1の核酸配列の全部を含むヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質を
コードする核酸配列。
2.図1の206番〜225番、762番〜780番、1番〜936番または
1番〜174番の塩基配列を含むヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質をコ
ードする核酸配列。
3.図1の核酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリHAPタ
ンパク質またはそのフラグメントをコードする、ヘリコバクター・ビロリから誘
導された核酸配列。
4.ヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質の抗原決定基をコードする請求
項1〜3のいずれかひとつに記載の核酸配列。
5.請求項1、2または4のいずれかひとつの核酸配列に相補的である核酸配
列。
6.ゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは組換えDNAである請求項1
、2、4または5のいずれかひとつに記載の核酸配列。
7.下記配列:
をもつ図1の核酸配列のフラグメントに対する特異的結合親和性をもつ18番か
ら50番のヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチド。
8.請求項6に記載の組換え核酸配列を特徴とするベクター。
9.pUC18またはpUC19である請求項8に記載のベクター。
10.発現ベクターである請求項8に記載のベクター。
11.発現ベクターpASK60−Strep.である請求項10に記載のベクタ
ー。
12.請求項8〜11のいずれかひとつに記載のベクターで形質転換された宿
主細胞。
13.請求項12に記載の宿主細胞を培養し、該培養物から核酸配列を単離す
ることを特徴とする請求項6に記載の組換え核酸配列の生産方法。
14.図1のアミノ酸配列または図1の1番から936番の塩基配列でコード
されるフラグメントを含むヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質。
15.ヘリコバクター・ピロリから誘導された、図1のアミノ酸配列の全部ま
たは一部を含むヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグメン
ト。
16.請求項10または11に記載のベクターから発現された請求項14に記
載のヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質。
17.請求項12に記載の宿主細胞を培養し、該培養物から生産されたタンパ
ク質またはそのフラグメントを単離することを特徴とする請求項14に記載のヘ
リコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。
18.ヘリコバクター・ピロリから誘導されたHAPタンパク質またはそのフ
ラグメントである抗原の抗原決定基を認識するポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体の生産方法
19.オリゴヌクレオチド対:
を用いることによってポリメラーゼ鎖反応が遂行される、ポリメラーゼ鎖反応ま
たは等価の技術によるヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラ
グメントをコードする核酸配列、あるいはその相補配列の増幅方法。
20.図1の核酸配列の全部または一部を含む核酸配列またはそのフラグメン
ト、あるいはその相補配列、もしくは請求項7に記載のオリゴヌクレオチドを特
徴とする核酸プローブ。
21.適当な条件下で被検サンプルを請求項20に記載の核酸プローブと接触
させ、ヘリコバクター・ピロリ核酸配列(単数または複数)と該プローブとのハ
イブリッド形成を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ核酸の同定
方法。
22.被検サンプル中において、ポリメラーゼ鎖反応または等価の技術により
図1の核酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリ核酸配列(単数
または複数)を増幅させ、増幅された核酸配列(単数または複数)を検出するこ
とを特徴とするヘリコバクター・ピロリ核酸の同定方法。
23.被検サンプルをヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質の抗原決定基
を認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体と接触させ、抗体−抗原複
合体の存在を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリHAPタンパク
質の抗原決定基の同定方法。
24.被検サンプルを図1のアミノ酸配列の全部または一部を含むヘリコバク
ター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグメント、あるいはビブリオ・コ
レラエHAPタンパク質またはそのフラグメントに接触させ、抗原−抗体複合体
の存在を検出することを特徴とするヘリコバクター・ピロリ感染の同定方法。
25.図1の核酸配列の全部または一部を含む、ヘリコバクター・ピロリHA
Pタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列を特徴とするヘリコ
バクター・ピロリ核酸配列の同定用キット。
26.請求項1〜7のいずれかひとつに記載の核酸配列を特徴とする請求項2
5に記載のキット。
27.オリゴヌクレオチド対プライマーを特徴とする、ポリメラーゼ鎖反応ま
たは等価の技術を用いるヘリコバクター・ピロリhap遺伝子核酸配列の同定用キ
ット。
28.図1のアミノ酸配列の全部または一部を含むヘリコバクター・ピロリH
APタンパク質またはそのフラグメント、あるいはビブリオ・コレラエHAPタ
ンパク質またはそのフラグメントを特徴とする、抗ヘリコバクター・ピロリHA
Pタンパク質抗体の存在によるヘリコバクター・ピロリ感染の診断用キット。
29.ヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグメントの抗
原決定基を認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を特徴とするヘリ
コバクター・ピロリHAPタンパク質抗原決定基の同定用キット。
30.ヘリコバクター・ピロリ感染の診断における、図1の核酸配列の全部ま
たは一部を含むヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそのフラグメン
トをコードする核酸配列の使用。
31.核酸配列が、相補配列、ゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは組
換えDNAである請求項30に記載の使用。
32.ヘリコバクター・ピロリ感染の診断における、図1のアミノ酸配列の全
部または一部でコードされるヘリコバクター・ピロリHAPタンパク質またはそ
のフラグメント、あるいはビブリオ・コレラエHAPタンパク質またはそのフラ
グメントの使用。
33.ヘリコバクター・ピロリ感染の診断における、ヘリコバクター・ピロリ
の抗原決定基を認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の使用。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
C12N 9/52 9152−4B C12N 9/52
15/02 9358−4B C12P 21/08
C12P 21/08 9453−4B C12Q 1/68 A
C12Q 1/68 8310−2J G01N 33/569 F
G01N 33/569 8310−2J 33/577 B
33/577 9284−4C A61K 39/395 D
// A61K 39/395 9284−4C R
9162−4B C12N 15/00 C
(C12N 15/09 ZNA
C12R 1:01)
(C12N 1/21
C12R 1:19)
(C12N 9/52
C12R 1:19)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AM,AT,AU,BB,BG,BR,
BY,CA,CH,CN,CZ,DE,DK,ES,F
I,GB,GE,HU,JP,KE,KG,KP,KR
,KZ,LK,LU,LV,MD,MG,MN,MW,
NL,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,S
E,SI,SK,TJ,TT,UA,US,UZ,VN