JPH09500025A

JPH09500025A - Sepsis model

Info

Publication number: JPH09500025A
Application number: JP7514946A
Authority: JP
Inventors: ラエスク−マンユーン、; タクダブリュー．マク、
Original assignee: アムジェンカナダインコーポレイテッド
Priority date: 1993-11-29
Filing date: 1994-11-28
Publication date: 1997-01-07
Also published as: WO1995014377A3; WO1995014377A2; CA2175250A1; AU1075895A; EP0734201A1

Abstract

(57)【要約】ダブルノックアウトダブルトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。この哺乳動物は、敗血症を治療もしくは予防するための療法を評価するモデルとして有用である。 (57) [Summary] Double knockout double transgenic non-human mammals are provided. This mammal is useful as a model for assessing therapy to treat or prevent sepsis.

Description

【発明の詳細な説明】敗血症モデル発明の背景発明の技術分野本発明は、組換ＤＮＡ技術により生産される非ヒト哺乳動物に関する。より詳細には本発明は、敗血症および他の病気に対し感受性であると共に有効な治療化合物をスクリーニングするのに有用である非ヒト哺乳動物に関するものである。関連技術の説明インビボスクリーニング系化合物をそのヒト治療剤としての能力について評価するには、インビボ系における化合物の効能に関するデータおよび情報を必要とする。理想的には、データ収集に用いるインビボ系は人間がよい。しかしながら倫理的および実用的な理由から、人間でない実験動物が薬物開発のためのインビボスクリーニングの系として典型的に用いられる。実験動物は有力な治療剤の効能を評価すると共に治療剤の生じうる副作用を確認するモデル系として使用するのに役立つが、この種のモデルは限界を有している。１つの重要な限界は、病気の抵抗性および感受性における実験動物と人間との間の相違である。これら相違は、しばしば免疫系の構造および機能における種間の相違に基づいている。したがって、化合物をヒトにおけるその治療価値につき評価するには、ヒト免疫系に類似する免疫系を持った動物モデルを得ることが有用である。トランスジェニックおよびノックアウト技術組換ＤＮＡ技術における最近の進歩は、研究者がたとえばマウスのような動物を遺伝子的に操作することを可能にした。トランスジェニック哺乳動物の発生およびノックアウト哺乳動物の発生の技術は、内生の遺伝子を発現しない動物（ノックアウト動物）を生産すべく或いは１個もしくはそれ以上の外因性もしくは非相同性の遺伝子を有する動物（トランスジェニック動物）を生産すべく研究者により用いられている。トランスジェニック哺乳動物の生産は、しばしばトランスジーン（transgene ）と呼ばれる新規な核酸配列を哺乳動物の１個もしくはそれ以上の染色体に挿入することを含む。典型的にはＤＮＡで構成されるトランスジーンは特定のポリペプチドをコードする。トランスジーンは典型的にはマイクロインジェクションにより卵子の前核（pronucleus）に挿入され、ここで発育中の胚のＤＮＡに組込まれる。次いで、この胚は妊娠継続のため「代理宿主」に移植される。代理宿主の子孫を新規なＤＮＡの存在について評価する。トランスジーンの発現、すなわちトランスジーンＤＮＡ配列によりコードされる蛋白質の産生は哺乳動物に新規な表現型を付与することができる。哺乳動物に挿入するトランスジーン、用いる制御要素（たとえばプロモータおよびエンハンサー／サイレンサー）、並びにトランスジーンの発現パターンおよび発現レベルに応じ、哺乳動物は多かれ少なかれ特定の病気または一連の病気に対し感受性となりうる。この種のトランスジェニック哺乳動物は、病気を治療もしくは予防するのに有用である化合物ををスクリーニングすると共に試験し、かつ／または病気の治療もしくは診断に有用な方法を開発するのに価値がある。ノックアウト哺乳動物の生産は、「ノックアウト」すべき遺伝子の発現を抑制するよう設計された核酸配列（一般にＤＮＡ）を胚性幹細胞（すなわちＥＳ細胞）と呼ばれる未分化細胞ラインに挿入することを必要とする。核酸配列がＥＳ細胞に挿入された後、このＥＳ細胞を発育中の哺乳動物胚に注入し、ここで望ましくは発育中に胚に組込まれて胚の１部となる。次いで胚を妊娠継続のため代理宿主に移植する。免疫系成分全ゆる哺乳動物種の免疫系は、極めて複雑に共同作用して哺乳動物をたとえば各種の病原体、毒素などの危険な外来物質から保護する多くの特異的細胞で構成されている。免疫系における多くの細胞タイプはその作用を発揮して、ＭＨＣ（主要組織適合性遺伝子複合体）として知られる一連の蛋白質を介し外来物質の一部を認識する。マウスのＭＨＣはＨ−２複合体（「Ｈ−２」）として知らていれる。ヒトのＭＨＣはＨＬＡ複合体（「ＨＬＡ」）と呼ばれる。ＨＬＡ複合体は１００個以上の遺伝子で構成されている［クライン（Klein）等、Sci．Am.、第２６９巻、第７８〜８３頁（１９９３）］。ＭＨＣの顕著な特徴は、ＭＨＣ座（座は遺伝子の染色***置として規定される）の多くがヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列において、異常なほど多くの対立遺伝子もしくは変異体を有している点である。ＭＨＣ蛋白は一般にＭＨＣクラスＩ（「ＭＨＣＩ」）およびＭＨＣクラスII（「ＭＨＣ II」）と呼ばれる２種類に分類される。ＭＨＣクラスＩ蛋白は膜結合性蛋白質であって、ほとんど全ての有核細胞の表面で発現されている。ＭＨＣクラスII蛋白も膜結合性蛋白質であるが、或る種の免疫系細胞（すなわち樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞）の表面でのみ発現されている。ＭＨＣクラスII蛋白は免疫系での外来物質の認識および攻撃に対し重要な役割を演ずる。大抵の外来物質が体内に浸入すると先ず最初にたとえばマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）により認識され、マクロファージはこの物質に結合すると共にこれを摂取し、処理する。処理された物質の各部分はマクロファージの表面上のＭＨＣクラスII蛋白に結合することができる。マクロファージの表面でＭＨＣに結合した物質の「誇示」に関するこの提示は、免疫系の他の細胞（たとえば或る種のＴ細胞）が外来物質を認識してこれに反応することを可能にする。Ｔ細胞は「活性化」状態となり、増殖すると共に外来物質に対し有害な化合物を放出するよう誘発される。さらに、Ｔ細胞の活性化は免疫系の他の細胞を活性化させて物質に対する攻撃を開始させるのに役立つ。Ｔ細胞（すなわち免疫系細胞の１つのタイプ）はその細胞表面に各種の蛋白質を発現する。これら蛋白質の多くは細胞外の物質の認識および結合および／または細胞シグナリングに関与する。２つの重要なＴ細胞表面分子はＣＤ４およびＣＤ８である。ＣＤ４は分子量約５５ｋＤの糖蛋白モノマーである。ネズミＣＤ４はＬ３Ｔ４にコードされ、約２６ｋｂのおおきさである。ＣＤ８はジスルフィド結合したヘテロダイマーである。ヒトにおいては、２個のＣＤ８モノマーをコードする遺伝子はＣＤ８αおよびＣＤ８βと呼ばれる。マウスにおいては、ＣＤ８ヘテロダイマーを構成するモノマーは遺伝子Ｌｙｔ−２およびＬｙｔ−３にコードされている。Ｌｙｔ−２は約４．４ｋｂのおおきさであって５個のエクソンを有している。未成熟Ｔ細胞はその細胞表面にてＣＤ４とＣＤ８との両者を発現する。細胞が成熟すると、これらはＣＤ４もしくはＣＤ８のいずれかの発現を停止する。すなわち成熟Ｔ細胞は、これらがＣＤ４もしくはＣＤ８を発現するかどうかに基づいて分類される。一般に、ＣＤ４のみを発現する成熟Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞と呼ばれ、ＭＨＣクラスII分子に結合した抗原を認識してこれと反応する。一般に、ＣＤ８のみを発現する成熟Ｔ細胞は細胞障害Ｔ細胞と呼ばれ、ＭＨＣクラスＩ分子に結合した抗原を認識してこれと反応する。ＭＨＣ、ＣＤ４およびＣＤ８の各分子は種の間でアミノ酸配列が相違している。すなわち、１つの種は病原体もしくは物質を外来物として認識すると共にこれに対する反応を開始する一方、他の種はそのようには作用しない。さらに、いずれかの毒素もしくは病原体に対する反応は種内の間の差も存在する（すなわち、異なる種および同一種の異なるメンバーは特定の毒素もしくは病原体に対し極めて感受性であるのに対し、他の種は体内におけるその存在に対して寛容性が高い）。これはＭＨＣ座の多くの異なる対立遺伝子の変化に起因する（上記した通り）。各々の種の個々のメンバーは各ＭＨＣ座にてこれら対立遺伝子型の１個のみ或いは多くとも２個を発現し、異なる対立遺伝子型は異なる病原体を提示もしくは結合する能力において相違する。免疫系の分子の活性および認識における種間の差を理解する試みにおいて、研究者等は（１）免疫系の蛋白質をコードするヒトのトランスジーンを有し、かつ／または（２）免疫系の蛋白質をコードする１個もしくはそれ以上の内生の遺伝子を発現しないような実験動物を作り上げた。ニシムラ（Nishimura）等、［J．Immunol.、第１４５巻、第３５３〜３６０頁（１９９０）］は、ヒトのＨＬＡ−ＤＱｗ６蛋白（すなわちＭＨＣクラスII蛋白ファミリーの１員）のαおよびβ鎖をコードするトランスジーンを持ったマウスについて記載している。バザガ−ギルバート（Barzaga-Gilbert）等、［J．Exp．Med．、第１７５巻、第１７０７〜１７１５頁（１９９２）］は、ヒトのＣＤ４をコードするトランスジーンを持ったマウスについて記載している。得られたトランスジェニックマウスの数種の系統はＴ細胞上にヒトおよびネズミの両ＣＤ４分子を発現しているが、それらは異なるレベルであった。キリーン（Killeen）等、［EMBO J.、第１２巻、第１５４７〜１５５３頁（１９９３）］は、内生のＣＤ４の発現を欠くが、ヒトのＣＤ４をコードするトランスジーンを持ったマウスについて記載している。ロベイ（Robey）等、［Cell、第６４巻、第９９〜１０７頁（１９９１）］は、ヒトのＣＤ２調節配列の制御下でネズミのＣＤ８を発現するトランスジェニックマウスについて記載している。テー（Teh）等、［Nature、第３４９巻、第２４１〜２４３頁（１９９１）］は、ネズミのｌｃｋプロモータの制御下でネズミのＣＤ４トランスジーンを有するマウスについて記載している。報告によれば、得られたトランスジェニックマウスは全ての胸腺細胞サブセットおよび全ての末梢Ｔ細胞にてＣＤ４を発現した。クリンペンフォルト（Krimpenfort）等、［１９９２年１２月２９日発行の米国特許第５，１７５，３８４号］は、成熟Ｔ細胞もしくは形質細胞を実質的に欠失したトランスジェニックマウスを記載している。１９９２年１２月２２日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／２２６４５号は、報告によれば免疫欠損性であって、野生型マウスと比較し他の種から一層容易に組織／器官移植体を維持しうるようなトランスジェニックマウスについて記載している。ラヘムツラ（Rahemtulla）等、［Nature、第３５３巻、第１８０〜１８４頁（１９９１）］は、内生のＣＤ４を発現しないマウスについて記載している。フング−ロイング（Fung-Leung）等、［Cell第６５巻、第４４３〜４４９頁（１９９１）］は、内生のＣＤ８分子の発現を欠くマウスについて記載している。シルハム（Schilham）等、［Eur．J．Immunol.、第２３巻、第１２９９〜１３０４頁（１９９３）］は、内生のＣＤ４およびＣＤ８の両者の発現を欠くマウスについて記載している。敗血症（sepsls）ヒトの血液もしくは組織内の生物体および／またはそれらの毒素を原因とする病気は、敗血症として知られる症状をもたらす。たとえば大腸菌（E coli）、肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、緑膿菌（Pseudomon as aeruginosa）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes ）および髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）のような微生物により誘発される敗血症の徴候は発熱、下痢、血圧低下、血液漏洩および／または各種の器官における播種性の血液凝固を包含する。敗血症のよる死亡率は約３５％であり［アルドリッジ（Aldridge）、TIBTech、第１１巻、第３７３〜３７５頁（１９９３）］、敗血症ショックでは５０％に到ると推定されている。敗血症の１つの重大な形態は敗血症性ショックと呼ばれ、敗血症を有する個人は大きな血圧低下を体験する。敗血症ショックの治療は即座の血圧回復を必要とし、典型的には体液および／または変力剤、並びに広いスペクトルを有する抗生物質を投与して行われる。敗血症の原因として確認されている多数の毒素が存在する。これらにはエキソトキシン（侵襲生物により分泌される毒素）およびエンドトキシン（侵襲生物の細胞壁の成分である毒素、たとえばＬＰＳ、すなわちリポ多糖類）がある。鋭意検討された１群のエキソトキシンはブドウ球菌エンテロトキシン（Staphy lococcal enterotoxin）および関連のエンテロトキシンである。これらのエンテロトキシンは、各種の連鎖球菌（Streptococcus）およびブドウ球菌（Staphylococcus）により産生され、病原体に対する攻撃を開始するために生体の免疫系を活性化するのと同様なメカニズムで作用する蛋白質である。エンテロトキシンのこの群のメンバーは「スーパー抗原」として知られる。ＭＨＣII およびＴ細胞に結合するスーパー抗原のメカニズムは他の抗原のメカニズムとは異なる。スーパー抗原はＴ細胞リセプタとＭＨＣII分子とに同時に結合し、これによりＴ細胞の抗原結合特異性とは無関係に多数のＴ細胞を活性化する。この結果、多量のサイトカインが体内に放出され、最終的にショックをもたらす。通常の抗原に対する結合メカニズムは、特定のＭＨＣII分子における極めて明確なグルーブに結合することである。次いでこの抗原／ＭＨＣII複合体は極めて特異性の高いＴ細胞サブセット（すなわち特定の抗原／ＭＨＣII複合体に対し特異性であるリセプタをＴ細胞の表面に発現しているＴ細胞、１０⁷のＴ細胞で１個）によってのみ認識される。したがって典型的には、全Ｔ細胞集団の４０％までを作用させることができるスーパー抗原の反応に比べて、正常な抗原の結合により少数のＴ細胞が活性化されるにすぎないものである。広いスペクトルを有する抗生物質療法がしばしば敗血症の治療に使用されるが、必ずしも有効でなく、多くの悪い副作用を示す。敗血症の原因によっては、ステロイドも免疫系の活性を調整することが示されている。さらに、たとえば新鮮な凍結血漿のような血液製剤またはたとえばヘパリンのような抗凝固剤も、凝固をもたらす免疫系の補体カスケード活性の作用に対抗すべく使用することができる。たとえば敗血症のような或る種のヒトの疾病をインビボで評価するための哺乳動物モデルを開発することが当業界で必要とされ、このモデルは（１）病気に対し感受性であり、さらに（２）ヒトで生ずる際の病気の進行にきわめて近似したようなものである。発明の要点一面において本発明は内生のＣＤ４およびＣＤ８の発現を欠く非ヒト哺乳動物もしくはその後代を提供し、この哺乳動物はヒトのＣＤ４もしくはその生物学上活性な断片をコードするＤＮＡからなるヌクレオチド配列と、ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子もしくはその生物学上活性な断片をコードするＤＮＡからなるヌクレオチド配列とが挿入されている。他面において本発明は、哺乳動物にて内生のＣＤ８をコードするヌクレオチド配列の発現を抑制し；哺乳動物にて内生のＣＤ４をコードするヌクレオチド配列の発現を抑制し；ＨＬＡＤＱ座のαおよびβ鎖の対立遺伝子もしくはその生物学上活性な断片を哺乳動物に挿入し；さらにヒトのＣＤ４もしくはその生物学上活性な断片のためのヌクレオチド配列を哺乳動物に挿入することからなる哺乳動物もしくはその後代の作製方法をも提供する。さらに他面において本発明は抗敗血症作用のための化合物のスクリーニング方法をも提供し、この方法は内生のＣＤ４およびＣＤ８の発現を欠く哺乳動物（この哺乳動物はヒトのＣＤ４もしくはその生物学上活性な断片をコードするＤＮＡからなるヌクレオチド配列と、ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子もしくはその生物学上活性な断片をコードするＤＮＡからなるヌクレオチド配列とが挿入されている）を敗血症を誘発する能力を持った化合物もしくは生物体に露呈することからなり、この哺乳動物に治療上有効な量の化合物を投与し、敗血症または敗血症様症状について哺乳動物をスクリーニングすることを特徴とする。図面の簡単な説明第１図はＬｙｔ−２、すなわちマウスのＣＤ８遺伝子（ｍＣＤ８−／−）の発現を抑制すべく使用されるノックアウト構成物を示し、黒枠はＬｙｔ−２のエクソンを表し（ローマ数字で示す）、コード化領域を示す陰影領域と共に示してある。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子はハッチングで示され、選択した制限酵素も示している。第２図はマウスのＣＤ４遺伝子（ｍＣＤ４−／−）の発現を抑制すべく使用されるノックアウト構成物を示し、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子はハッチングで示されている。黒枠はｍＣＤ４遺伝子のエクソンを表し（ローマ数字で示す）、選択した制限酵素も示している。第３図は、ヒトのＣＤ４（ｈＣＤ４）トランスジェニックマウスを得るため使用するトランスジーン構成物を示している。ｈＣＤ２の５′プロモータ領域およびｈＣＤ２の３′調節領域を、ｈＣＤ４ｃＤＮＡ挿入体およびｈＣＤ２ミニジーン（このｈＣＤ２ミニジーンは、ｈＣＤ２エクソンＩゲノム配列ならびに遺伝子の残部に対するｈＣＤ２のｃＤＮＡコード化領域とで構成されている）と同じように示し、選択した制限酵素も示している。第４図はダブルノックアウトダブルトランスジェニックマウスを得るために用いる育種方式を示し、ｈＣＤ４はヒトのＣＤ４トランスジェニックマウスを示し、ＤＱｗ６はヒトのＤＱｗ６（αおよびβ鎖）トランスジェニックマウスを示し；ｍＣＤ４はマウスの内生のＣＤ４を示し；ｍＣＤ８はマウスの内生のＣＤ８（Ｌｙｔ−２遺伝子）を示している。記号「ｈＣＤ４＋／−」はｈＣＤ４トランスジーンに対するマウスの異型接合を意味し；記号「ｍＣＤ４／８−／−」および「ｍＣＤ４／８＋／−」はＣＤ４およびＣＤ８の異型接合ノックアウトであるマウスを意味する。第５図は新たに殺生したマウスの遺伝子型が異なる生体外（ex vivo）の細胞においてＳＥＢの量を減少させながら刺戟した際のＴ細胞の反応もしくは増殖（３Ｈチミジン取り込みにより示される）を測定した投与量−応答曲線を示し、ＳＥＢの濃度をＸ軸に示し、黒丸印はダブルノックアウトダブルトランスジェニックマウス（ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８ −／−、ＤＱｗ６＋、ｈＣＤ４＋）を示し、白丸印はｈＣＤ４トランスジーンを有するダブルノックアウト（ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）を示し、黒四角印はＣ５７ＢＬ／６野生型を示し、白五角形印はダブルノックアウトマウスを示している。発明の詳細な説明「ノックアウト」と言う用語は、哺乳動物の単一細胞、選択された細胞もしくは全ての細胞にて内生のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの少なくとも１部の発現を部分的または完全に減少させることを意味する。「ノックアウト構成物」という用語は、細胞内で内生のＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドの発現を減少もしくは抑制すべく設計されたヌクレオチド配列を意味する。ノックアウト構成物として使用されるヌクレオチド配列は典型的には（１）内生の遺伝子（エクソン配列、イントロン配列および／またはプロモータ配列）の抑制すべき部分からのＤＮＡ、および（２）細胞内でノックアウト構成物の存在を検出すべく使用されるマーカー配列である。ノックアウト構成物は細胞中に挿入されて、ネイティブなＤＮＡ配列の転写を妨げ或いは中断するような位置で細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。この種の挿入は一般に相同組換によって生ずる（すなわちノックアウト構成物を細胞中に挿入したとき、内生のＤＮＡ配列に対し相同性であるノックアウト構成物の領域が互いにハイブリダイズして、ノックアウト構成物が内生のＤＮＡの対応する位置に組み込まれるように組換が生ずる）。ノックアウト構成物のヌクレオチド配列は、（１）抑制すべき遺伝子の１個もしくはそれ以上のエクソンおよび／またはイントロンの全体もしくは部分配列、（２）抑制すべき遺伝子の全体もしくは部分プロモータ配列、または（３）それらの組合せで構成することができる。典型的には、ノックアウト構成物は、通常注入された発育中の胚と同じ種の胚から誘導された未分化細胞である胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に挿入され、一般に相同組換の方法によりＥＳ細胞のゲノムＤＮＡに組込まれる。次いで、このＥＳ細胞を発育中の胚に注入して一体化させる。「遺伝子の破壊」、「遺伝子破壊」、「発現の抑制」および「遺伝子抑制」という表現は、内生の遺伝子の１つの領域（一般に１個もしくはそれ以上のエクソン）および／または遺伝子のプロモータ領域にヌクレオチド配列を挿入して細胞におけるその遺伝子の発現を減少もしくは防止することを意味する。挿入は一般に相同組換により行われる。本発明における目的で「遺伝子」、「ヌクレオチド配列」および「核酸配列」という用語は全て、ポリペプチドまたはポリペプチドの断片をコードするヌクレオチドもしくはコドンの配列を意味する。例として、ヌクレオチド配列ノックアウト構成物は、抗生物質耐性遺伝子からなるヌクレオチド配列を、破壊すべき内生のＤＮＡ配列（プロモータおよび／またはコード化領域）に対し相補性である分離したヌクレオチド配列の１部に挿入して作製することができる。抗生物質耐性配列構成物を含有するこの分離されたヌクレオチド配列が細胞内に挿入されると、構成物は典型的にはゲノムＤＮＡに組み込まれる。すなわち、細胞の多くの後代はもはや少なくとも幾つかの細胞で遺伝子を発現しないだろうし、または減少したレベルでしかこれを発現しないだろう。何故なら、遺伝子のヌクレオチド配列が抗生物質耐性遺伝子により破壊されているからである。「マーカー配列」という用語は、（１）興味の対象の遺伝子（たとえばＣＤ４および／またはＣＤ８）の発現を破壊するより大きなヌクレオチド配列構成物（すなわち「ノックアウト構成物」）の１部として使用されるヌクレオチド配列、および（２）ノックアウト構成物をゲノムに組込んだ細胞を識別する手段として使用されるヌクレオチド配列を意味する。マーカー配列はこれら目的に役立つ任意の配列としうるが、典型的には細胞に対し検出可能な形質を付与する蛋白をコードする配列、たとえば抗生物質耐性遺伝子または細胞には一般的に見出すことができない分析可能な酵素である。マーカー配列が蛋白をコードする場合、マーカー配列は典型的にはマーカーの発現を調節する相同性もしくは非相同性のプロモータのいずれかを含有している。「トランスジーン」という用語は、プロモータに作用的に結合していてもしていなくてもよいが、哺乳動物または哺乳動物の胚の１個もしくはそれ以上の細胞に挿入される分離されたヌクレオチド配列を意味する。トランスジーンは、哺乳動物の内生の遺伝子における特定ヌクレオチド配列に対し相同性もしくは非相同性のいづれかであるか、或いはハイブリッド配列であるヌクレオチド配列である。（すなわち、トランスジーンの１つもしくはそれ以上の部分は哺乳動物の遺伝子に対し相同性であり、１つもしくはそれ以上の部分は非相同性である）。トランスジーンヌクレオチド配列は哺乳動物に内因的に存在するポリペプチドもしくはポリペプチドの変異体をコードすることができ、哺乳動物に自然には存在しないポリペプチド（すなわち外生のポリペプチド）をコードすることができ、或いは内生および外生のポリペプチドのハイブリッドをコードすることができる。トランスジーンがプロモータと作用的に結合していれば、このプロモータは哺乳動物および／またはトランスジーンに対し相同性もしくは非相同性となりうる。或いは、プロモータは内生および外生のプロモータ要素（エンハンサ、サイレンサ、サップレッサなど）のハイブリッドとすることもできる。「ＣＤ４」という用語は哺乳動物種のヘルパーＴ細胞で主として発現されている細胞表面糖蛋白質を意味し、主として抗原を結合してＴ細胞リセプタにより認識されるＭＨＣII分子に対するコリセプタ（co-receptor）として、認識および結合を介して細胞のシグナリングに関与するものと信じられている。ここで用いるヒトのＣＤ４は野生型ヌクレオチド配列を有することができ、或いは挿入可能、欠失可能および／または置換可能な変異体とすることもできる。同様に、マウスのＣＤ４も野生型ヌクレオチド配列を有することができ、或いは挿入可能、欠失可能および／または置換可能な変異体とすることもできる。ここで用いる挿入可能、欠失可能およ／または置換可能な変異体は特に対立遺伝子型変異体を包含する。「ＣＤ８」という用語は、哺乳動物種で２つの非相同性のモノマーポリペプチドで構成された細胞表面糖蛋白質を意味する。ＣＤ８は主として細胞障害Ｔ細胞の表面で発現され、主として抗原を結合してＴ細胞リセプタにより認識されるＭＨＣＩ分子に対するコリセプタ（co-receptor）として、認識および結合を介して細胞のシグナリングに関与するものと信じられている。ここで用いるヒトのＣＤ８モノマーは野生型のαおよびβ鎖ヌクレオチド配列を有することができ、或いは挿入可能、欠失可能および／または置換可能なその変異体とすることもでき、特に対立遺伝子型変異体を包含する。マウスのＣＤ８モノマーはＬｙｔ−２およびＬｙｔ−３遺伝子の野生型ヌクレオチド配列を有することができ、或いは挿入可能、欠失可能および／または置換可能なその変異体とすることもでき、特に対立遺伝子型変異体を包含する。「ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子」という用語は、ヒト主要組織適合性遺伝子複合体クラスII（ＭＨＣII）ＤＱ座の任意の或いは全ての変異体を意味し、その座における全てのポリペプチドもしくはモノマー（すなわちαおよびβ鎖）を包含し、これらを組合せてＤＱ座の産物として知られた最終蛋白質を生じさせる。例として、ＤＱｗ６対立遺伝子はαおよびβモノマーで構成され、これらモノマーは一緒になってＤＱ座における１個の対立遺伝子産物を構成する。「作用的に結合」という用語は各種ヌクレオチド配列に関する配置を意味し、各要素は機能的に連結して互いに相互作用することができる。この種の要素は限定はしないが１種もしくはそれ以上のプロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化配列およびトランスジーンを包含する。ヌクレオチド配列要素は、適正に配置し或いは作用的に結合されると、一緒になって作用し、相互の活性を調整すると共に最終的にトランスジーンの発現レベルに影響を及ぼす。「調整」とは、特定の要素の活性レベルの増加、減少または維持を意味する。他の要素に対する各々の要素の位置は各々の要素の５′末端および３′末端によって現すことができ、特定ないずれの要素の間の距離は介在する要素間のヌクレオチドまたは塩基対の個数によって示すことができる。「生物学上活性な断片」という用語は、遺伝子もしくはトランスジーンの全長ゲノムもしくはｃＤＮＡヌクレオチド配列より短いヌクレオチド配列を意味するが、生物学上活性な断片の遺伝子（もしくはトランスジーン）の産物が全長配列の遺伝子産物が有する生物学的活性の少なくとも１部を有するのに十分な長さの全長ヌクレオチド配列中の一部を有することを意味する。「齧歯動物」は、系統発生的な齧歯類の全動物を意味し、それから将来発生する全ての後代を包含する。「ネズミ」と言う用語は、ネズミ科の全ての動物を意味し、ラットおよびマウスを包含する。「後代」という用語は、特定の哺乳動物（すなわちゲノムＤＮＡ中に挿入されたノックアウト構成物を有する哺乳動物）から発生し、或いは子孫となる将来の全ての世代を意味する。したがって継承の世代における任意の後代がここに含まれ、後代（すなわちＦ１、Ｆ２、Ｆ３……の世代）は無限にこの定義に含まれる。「哺乳動物」という用語はヒト以外の全哺乳動物を意味し、哺乳動物の後代をも包含する。「免疫調整する」および「免疫調整」という用語は、特定の種に対し、免疫系の或る特定成分の平均的な活性と対比してその成分の活性レベルの変化を意味する。すなわち、ここで用いる免疫調整とは活性の上昇もしくは低下を意味する。免疫調整はＢ細胞、いずれかのもしくは全ての種類のＴ細胞、抗原提示細胞および免疫機能に関与すると思われる他のすべての細胞のレベルもしくは機能を分析することによって検出できる。追加的に或いは代案として、免疫調整は（１）免疫系における役割を有すると思われる特定の遺伝子の発現レベル、（２）免疫系における役割を有するたとえばサイトカイン（インターロイキンなど）のような特定な化合物もしくは他の分子のレベル、および／または（３）免疫系の機能に関与する特定の酵素、蛋白質などのレベルを評価して検出することもできる。「敗血症」という用語は、哺乳動物の血液および／または組織内の生物体および／またはそれらの毒素が原因となる病気を意味する。「抗敗血症作用」という用語は、敗血症の徴候または敗血症の症状が減少もしくは無くなる状況を意味する。「治療処方」という用語は特定の効果（すなわち悪性症状もしくは病気を減少もしく無くすこと）を達成するよう計画された治療を意味する。この治療は１種もしくはそれ以上の化合物を同時にまたは異なる時において同一の量もしくは異なる量で投与することを包含する。代案として或いは追加的に、治療はたとえば放射線照射、特定のダイエット、物理療法など他の療法も行うことを包含する。ノックアウト技術１．ノックアウト遺伝子の選択本発明は、免疫系の少なくとも２個の遺伝子が破壊もしくはノックアウトされている哺乳動物を企図する。しかしながら、本発明の範囲内には２個より多い遺伝子がノックアウトされた哺乳動物も包含される。本発明において、ノックアウトもしくは破壊されるべき遺伝子はＣＤ４およびＣＤ８から選択される。破壊されるべき遺伝子に関して少なくとも幾つかの配列情報を、ノックアウト構成物およびスクリーニングプローブとの両者を作製するために入手しなければならない。配列情報は、ノックアウト構成物の挿入により遺伝子操作すべき動物以外の種からとすることもできるが、好適には各々の種からのヌクレオチド配列が実質的に相同性であると合理的に考えられる種から提供される。一般に、ノックアウト構成物を含むヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ配列からの１個もしくはそれ以上のエクソンおよび／またはイントロン領域、および／またはプロモータ領域で構成されている。しかしながら、使用されるＤＮＡは代案としてｃＤＮＡ配列とすることもできるが、ｃＤＮＡは充分に大きいものとする。一般に、ノックアウト構成物に使用するＤＮＡは少なくとも約１キロベース（ｋｂ）の長さであり、好ましくは３〜４ｋｂの長さであって、これによりノックアウト構成物をＥＳ細胞に導入した際にゲノムＤＮＡに対する相同組換もしくはハイブリッド化に充分な相補的配列が与えられる。典型的には、ダブルノックアウト哺乳動物の作製を容易にするため、同一種の２匹の哺乳動物のそれぞれから１個の遺伝子をノックアウトする。これら哺乳動物を次いで互いに交配し、次いで子孫を相互に交配させて、最終的にノックアウトされた両方の選択遺伝子を有する単一の哺乳動物を得る。或いは最初から１個以上のノックアウトされた遺伝子有するに単一の哺乳動物を得ることもできる（たとえば１個以上のノックアウト構成物を下記するようにＥＳ細胞に導入する）。２個以上の遺伝子をノックアウトする場合も上記手順にしたがうことができる。すなわちそれぞれ１個のノックアウト構成物を有する数匹の哺乳動物を作製し、これら哺乳動物を適切にもしくはノックアウト構成物の全部を有する１匹の哺乳動物を得られるように交配および戻し交配する。例として、遺伝子Ａのいずれのコピーをも発現しないマウス（すなわち、遺伝子Ａノックアウト；同型接合）と、遺伝子Ｂのいずれのコピーをも発現しないマウス（すなわち、遺伝子Ｂノックアウト；同型接合）とを交配し、子孫「Ｆ₁」を得、これは両変異につき異型接合である（すなわち両変異遺伝子の２つのコピー［Ａ＋／−、Ｂ＋／−］の一方を有する）。次いで子孫（Ｆ₁）を交配させ、遺伝子が分離（メンデル方式）すれば子孫（Ｆ₂）の１／１６が両変異につき同型接合となり、すなわちダブルノッタアウトとなる（すなわちＡ−／−、Ｂ−／ −）。これら遺伝子型を有するマウスを適する分析によりスタリーニングして、各遺伝子産物の発現がないことを確認することができる。ノックアウト構成物を構成するヌクレオチド配列は、たとえばサムブルック（ Sambrok）等［Molecular Cloning：A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８９）］により記載されたような当業界で周知された方法を用いて得ることができる。この種の方法は、たとえばゲノム配列に対しゲノムクローンが同定されるような適する相同性レベルを有するＣＤＮＡプローブによりゲノムライブラリーをスクリーニングすることを含む。或いは、ｃＤＮＡ配列をノックアウト構成物の１部として使用する場台は、ｃＤＮＡライブラリーをオリゴヌクレオチドプローブもしくは抗体でスクリーニングしてｃＤＮＡを得ることもできる（ライブラリーが発現ベクター中でクローン化される場合）。プロモータ配列をノックアウト構成物に使用する場合、合成ＤＮＡプローブをプロモータ配列を含むゲノムライブラリーをスクリーニングするよう設計することができ、或いは適する相同性プロモータをスクリーニング用プローブとして使用することもできる。ノックアウト構成物を含むヌクレオチド配列を得るための他の方法は、たとえばエンゲルス（Engels）等［Agnew Chem．Int．Ed．Eng.、第２８巻、第７１６〜７３４頁（１９８９）］に記載されたような方法を用いて、この配列を合成的に製造することである。これら方法は特に核酸合成のホスホトリエステル法、ホスホルアミダイト法およびＨ−ホスホネート法を包含する。ノックアウト構成物を含むヌクレオチド配列は、その後の遺伝子操作に充分な量を得なければならない。所望量を得るためのヌクレオチド配列の増幅は、（１）配列を適するベクターに挿入し、ベクターを急速に増幅しうる細菌もしくは他の細胞をトランスフォームさせることにより或いは（２）ＰＣＲ増幅により、或いは（３）エンゲルス（Engels）等（上記）により示された方法を用いる合成により行うことができる。２．ノックアウト構成物の調製ノックアウト構成物を含むヌクレオチド配列は典型的には、マーカー遺伝子をコードする新たなＤＮＡ配列をこのヌクレオチド配列内の適正な位置に挿入しうるような位置にて切断すベく選択された１種もしくはそれ以上の制限酵素で切断される。マーカー遺伝子挿入の適正な位置は、ネイティブ遺伝子の発現を防止もしくは減少させるよう作用する位置である。この位置は、たとえば切断すべき配列内における制限部位の位置、およびエクソン配列もしくはプロモータ配列またはその両者を中断するかどうか（すなわちプロモータ機能を抑制するか或いはネイティブなエクソンの合成を抑制するのに必要な正確な挿入位置）など種々の因子に依存する。好ましくは、ＤＮＡを切断すべく選択される酵素はより長いアームとより短いアームとを発生し、短い方のアームは少なくとも約３００塩基対（ｂＰ）の長さである。或る種の場合、抑制すべき遺伝子の１個もしくはそれ以上のエクソンの１部または全部を実際に除去して、マーカー遺伝子をノックアウト構成物に挿入した際に原ゲノム配列に匹敵しうるノックアウト構成物の長さを保持するようにすることが望ましい。これらの場合、ゲノムＤＮＡを適する制限エンドヌクレアーゼで切断して適正寸法の断片を除去することができる。残留片をマーカー配列と下記のように結合する。マーカー遺伝子は検出可能および／または分析可能な任意のヌクレオチド配列としうるが、典型的にはこれは抗生物質耐性遺伝または他の遺伝子であって、そのゲノムにおける発現もしくは存在を容易に検出することができるものである。マーカー遺伝子は、一般にそれ自身のプロモータまたは挿入した細胞で活性を示すか或いは容易に活性化しうるいずれのソースからの他の強力なプロモータに作用的に結合される。しかしながら、マーカー遺伝子は抑制すべき遺伝子のプロモータの制御下で転写されるように結合したそれ自身のプロモータを有する必要はない。さらに、マーカー遺伝子は一般にその３′末端に結合したポリアデニル化（ポリＡ）配列を有する。この配列は遺伝子の転写を停止させるよう作用する。好適なマーカー遺伝子は、たとえばｎｅｏ（ネオマイシン耐性遺伝子）のようないずれかの抗生物質耐性遺伝子およびβ−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）である。ノックアウト構成物を含むヌクレオチド配列が適する制限酵素で切断された後、マーカー遺伝子配列を当業者に周知された方法、たとえばサムブルック（Sambrook）等（上記）に記載により結合する。一緒に結合するＤＮＡ断片の各末端は互いに適合性でなければならない。これは、適合性末端を発生する酵素で断片を切断するか或いは結合前に各末端を平滑断端化とすることにより達成される。平滑断端化は当業界で周知された幾つかの方法、たとえば粘着末端を埋めるクレノウ断片（ＤＮＡポリメラーゼＩ）を使用して行われる。結合したノックアウト構成物は胚性幹細胞に直接挿入することができるし（下記に説明）、或いは挿入の前に適切なベクター中に挿入して増幅させた後に挿入することもできる。好適なベクターは、細菌細胞にて急速に増幅するようなもの、たとえばｐブルースクリプトII ＳＫベクター（pBluescript II SK、ストラタジーン（Stratagene）社、サンディエゴ、ＣＡ）またはｐＧＥＭ７（プロメガ・コーポレーション（Promega Corp．）社、マジソン、ＷＩ）である。３．胚性幹細胞のトランスフェクション本発明は、限定はしないがたとえばラット、ハムスターおよびマウスのような齧歯動物を包含する任意の種の非ヒト哺乳動物からノックアウト哺乳動物を生産することを企図する。好適な齧歯動物はネズミ科の動物、たとえばラットおよびマウスを包含する。一般にノックアウト哺乳動物を生産すべく使用する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、得られるノックアウト哺乳動物と同一の種である。たとえば、ノックアウトマウスを得るためには一般にマウスの胚性幹細胞が使用される。胚性幹細胞は、たとえばドエッチェマン（Doetschman）等［J．Embryol．Exp ．Morphol．、第８７巻、第２７〜４５頁（１９８５）］により記載されたような当業者に周知された方法を用いて得ることができかつ維持することができる。いずれのＥＳ細胞ラインも使用しうるが、選択する細胞ラインは典型的には発育中の胚の生殖（germ）ラインと一体化し、その１部となることによりノックアウト構成物の生殖ラインの伝播を行うことができる細胞の能力により選択される。すなわち、この能力を有すると思われるいずれのＥＳ細胞ラインもここで使用するのに適している。ＥＳ細胞の生産につき典型的に使用される１つのマウス株は１２９Ｊ株である。好適なＥＳ細胞ラインはネズミの細胞ラインＤ３［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ２０８５２、カタログＮｏ．ＣＲＬ１９３４］である。細胞はノックアウト構成物を挿入するために、たとえばロバートソン（Robertson）［Teratocarcinomas and Embryonic St em Cells：A Practical Approach、Ｅ．Ｊ．ロバートソン（Robertson）編、ＩＲＬプレス社、ワシントン、Ｄ．Ｃ．（１９８７）］或いはブラッドレー（Brad ley）等［Current Topics in Devel．Biol．、第２０巻、第３５７〜３７１頁（１９８６）］、或いはホーガン（Hogan）等［Manipulatingthe Mouse Embryo：A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８６）］により示されたような当業者に周知の方法で培養され、作製される。ＥＳ細胞中へのノックアウト構成物の挿入は、たとえばエレクトロポレーション（電気穿孔法）、マイクロインジェクション（微小注入法）およびリン酸カルシウム処理を包含する当業者に周知された各種の方法により行うことができる［ロベル・バッジ（Lovell-Badge）、ロバートソン（Robertson）編、上記参照］。挿入の好適方法はエレクトロポレーションである。細胞中に挿入すべき各ノックアウト構成物は最初に鎖状（linear）型でなければならない。したがって、ノックアウト構成物がベクター中に挿入されたならば、ＤＮＡをベクター配列内でのみ切断してノックアウト構成物配列内では切断しないように選択した適切な制限エンドヌクレアーゼで切断して鎖状化を行う。挿入するには、ノックアウト構成物をＥＳ細胞に当業者に知らているように選択した挿入法に対して適切な条件下で添加する。１個以上の構成物をＥＳ細胞に導入する場合は、各ノックアウト構成物を同時に或いは１個づつ別に導入することができる。ＥＳ細胞をエレクトロポレーションすべき場合は、ＥＳ細胞およびノックアウト構成物ＤＮＡを、エレクトロポレーション装置を用い、製造業者の使用指針にしたがい電気パルスをかける。エレクトロポレーションの後、典型的にはＥＳ細胞を適するインキュベーション条件下で回収する。次いで細胞をノックアウト構成物の存在についてスクリーニングする。スクリーニングは各種の方法を用いて行うことができる。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合には、ＥＳ細胞を致死濃度の抗生物質の存在下で培養することができる。生き残ったＥＳ細胞は恐らくノックアウト構成物が組込まれている。マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子以外のものであれば、ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡのサウザン・ブロットによりマーカー配列のみにハイブリッドするよう設計されたＤＮＡの配列でプローブすることができる。或いは、ＰＣＲを使用することもできる。最後に、マーカー遺伝子が酵素活性を検出できる酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子であれば、酵素基質を適する条件下で細胞に添加し、酵素活性を分析することができる。当業者は他の有用なマーカーおよび所定の細胞におけるその存在の検出手段を熟知している。この種の全てのマーカーが本発明の範囲内に包含されることを意図する。ノックアウト構成物はＥＳ細胞ゲノムで数個の位置に組み込まれ、ランダムな挿入現象の発生により各ＥＳ細胞ゲノムにおける異なる位置に組み込まれるであろう。所望の挿入位置は、ノックアウトすべきＤＮＡ配列に対し相補的な位置である。典型的には、ノックアウト構成物を取り込んだＥＳ細胞の約１〜５％未満が実際にノックアウト構成物を所望位置に組み込んでいる。ノックアウト構成物の適正な組み込みを有するＥＳ細胞を同定するには、全ＤＮＡをＥＳ細胞から、たとえばサムブルック（Sambro ok）等（上記）により記載されたような標準的な方法を用いて抽出する。次いでＤＮＡを、特定の制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡに対して特異的なパターンでハイブリッドするよう設計されたプローブを用いてサウザン・ブロットによりプローブする。代案として或いは追加的に、ゲノムＤＮＡを、特定の大きさと配列のＤＮＡ断片を増幅させるよう格別に設計したプローブを用いてＰＣＲにより増幅させることもできる（すなわち、適正位置にノックアウト構成物を有するような細胞のみが適正な大きさのＤＮＡ断片を生じる）。４．胚の注入／移植正しい位置にノックアウト構成物を有する適切なＥＳ細胞が同定された後、これら細胞を胚中に挿入する。挿入は当業者に知られた各種の方法で行うことができるが、好適方法はマイクロインジェクション法である。マイクロインジェクションでは、約１０〜３０個の細胞をマイクロピペットに集め、これを適正な発育段階にある胚に注入して、ノックアウト構成物を有する外来のＥＳ細胞を発育中の胚と一体化する。ＥＳ細胞の挿入に用いられる胚の適切な発育段階は極めて種依存性であるが、マウスでは約３．５日である。胚は、妊娠した雌の子宮を灌流することにより得られる。これを行うのに適する方法は当業者に公知であり、ブラッドレー（Brad ley）により示されている［ロバートソン（Robertson）編、上記］。適齢／発育段階にあるいずれの胚も使用に適しているが、好適な胚は雄である。マウスにおいて、好適な胚はＥＳ細胞遺伝子によりコードされる毛色とは異なる毛色をコードする遺伝子も有することができる。この方法にて、子孫をモザイクの毛色の探索によりノックアウト構成物の存在につき容易にスクリーニングすることができる（これはＥＳ細胞が発育中の胚に組み込まれたことを示す）。たとえばＥＳ細胞ラインが白毛に関する遺伝子を有する場合、選択される胚は黒毛もしくは褐色毛の遺伝子を有する。ＥＳ細胞が胚中に導入された後、この胚を妊娠させるため偽妊娠仮親の子宮に移植することができる。任意の仮親を使用しうるが、典型的には仮親は良好に育て、増やすことができる能力、並びに子供の面倒をみる能力につき選択される。この種の仮親は典型的には同じ種の精管切除された雄と交配して作製される。偽妊娠仮親の状態が移植の成功に重要であり、これは種依存性である。マウスではこの段階は約２〜３日目の偽妊娠である。５．ノックアウト遺伝子の存在のスクリーニング仮親から生まれた子孫を先ず最初にモザイク毛色によりスクリーニングすることができ、（上記した）毛色選択技術を用いることができる。追加として或いは代案として、子孫の尾組織からのＤＮＡを上記したようなサウザン・ブロットおよび／またはＰＣＲによりノックアウト構成物の存在につきスクリーニングすることができる。モザイクとして出現する子孫がその生殖ラインにノックアウト構成物を有すると思われれば、これらを同型接合ノックアウト動物を得るために互いに交配させる。子孫が生殖ラインの伝播を有するかどうか不明瞭である場合は、これらを親株もしくは他の株と交配し、子孫を異型接合性についてスクリーニングすることができる。異型接合体は、上記したようにＤＮＡのサウザン・ブロットおよび／またはＰＣＲ増幅により確認される。次いで異型接合体を互いに交配させて同型接合ノックアウト子孫を得る。同型接合体は、この交配の結果であるマウスから、並びに既知の異型接合体および野生型マウスであるマウスからの相当量のゲノムＤＮＡをサウザン・ブロットして同定することができる。サウザン・ブロットをスクリーニングするプローブは上記したように設計することができる。ノックアウト子孫を同定し、特性化する他の手段も可能である。たとえばノーザン・ブロットを用いて、ノックアウト遺伝子、マーカー遺伝子またはその両者のいずれかをコードする転写体の存在もしくは不存在にいてｍＲＮＡをプローブすることができる。さらにウエスタン・ブロットを用いて、これら子孫の各種の組織にてノックアウト遺伝子の発現レベルを評価することもでき、その際ウエスタン・ブロットはノックアウト遺伝子によりコードされる蛋白質に対する抗体でプローブし或いはマーカー遺伝子が発現しているマーカー遺伝子産物に対する抗体でプローブする。最後に、その場での分析（in situ analysis）（たとえば細胞を固定し、抗体で標識する）および／または子孫からの各種の細胞のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析を適する抗体を用いて行い、ノックアウト構成物の遺伝子産物の存在もしくは不存在を探索することもできる。トランスジーン技術１．トランスジーンの選択典型的には本発明に有用なトランスジーンは免疫反応、造血、炎症、細胞増殖および増殖、細胞系列分化および／またはストレス反応に関与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。好適トランスジーンはヒトの免疫系のポリペプチド（たとえばＣＤ４）およびＨＬＡＤＱ座の全ゆる対立遺伝子型を含むものである。特に好適なトランスジーンはヒトのＣＤ４およびＨＬＡＤＱ座対立遺伝子ＤＱｗ６（αおよびβ鎖の両者）である。本発明の範囲内には、哺乳動物への２個もしくはそれ以上のトランスジーンの挿入も包含される。本発明に有用なトランスジーンは個々に調製し、挿入することができ、或いは挿入するための１個の構成物として一緒に得ることもできる。トランスジーンは各トランスジーンの発現を始動させるべく選択されるプロモータおよび／または哺乳動物の両者に対し相同性もしくは非相同性である。さらに、トランスジーンは全長のｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ配列でもよいし、または少なくとも幾つかの生物学的活性、すなわち野生型である同一の種の非トランスジェニック哺乳動物には容易に観察されないあるレベルの作用（生化学的、細胞学的および／または形態学的）を示すそれらのいずれかの断片、サブユニットもしくは変異体でもよい。必要に応じ、トランスジーンはハイブリッドヌクレオチド配列とすることもでき、すなわち相同性および／または非相同性のｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ断片から構成されるひとつのものとすることができる。さらにトランスジーンは、必要に応じ１種もしくはそれ以上の自然に生じたＣＤＮＡおよび／またはゲノム配列の変異体でもよいし、またはその対立遺伝子型変異体でもよい。各トランスジーンは、当業界で周知された１つもしくはそれ以上の方法を用いて適する量で分離し、入手することができる。トランスジーンを分離するのに有用なこれら方法および他の方法は、たとえばサムブルック（Sa mbrook）等［Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８９）］、並びにベルガー（Berger）およびキンメル（Kimmel）［Method s in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques、第１５２巻、アカデミック・プレス・インコーポレーション社、サンディエゴ、ＣＡ（１９８７）］に示されている。各トランスジーンのヌクレオチド配列が公知である場合、トランスジーンは全体的に或いは部分的に、たとえばエンゲルス（Engels）等に記載されたような化学的合成法［Angew．Chem．Int．Ed．Engl．、第２８巻、第７１６〜７３４頁（１９８９）］で合成することができる。これら方法は特に核酸合成のホスホトリエステル法、ホスホルアミダイト法およびＨ−ホスホネート法を包含する。或いはトランスジーンは、トランスジーンＤＮＡと選択的にハイブリッドする１種もしくはそれ以上の核酸プローブ（クローン化すべきトランスジーンに対し許容しうる相同性レベルを有するオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片など）を用いて、適切なｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。トランスジーンを得るための他の適する方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。しかしながら、この方法を使用して成功するためには、トランスジーンのヌクレオチド配列に関する充分な情報を、適するヌクレオチド配列の増幅に対して有用な適するオリゴヌクレオチドプライマーを設計するため入手することが必要である。選択される方法がオリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブの使用（たとえばＰＣＲ、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーのスクリーニング）を必要とする場合は、プローブもしくはプライマーとして選択されるオリゴヌクレオチド配列をライブラリースクリーニングもしくはＰＣＲの際に生ずる非特異性結合の量を最小化させるのに充分な長さと充分な明瞭性とを有するようにすべきである。プローブもしくはプライマーの実際の配列は一般に、他の生物からの同一もしくは類似した遺伝子の保存されているか或いは高度の相同性を有する配列もしくは領域に基づいている。必要に応じ、プローブもしくはプライマーを縮重（de generate）することもできる。トランスジーンのアミノ酸配列のみが公知である場合は、推定可能かつ機能的な核酸配列を各アミノ酸残基に対する既知の好適なコドンを用いトランスジーンについて推定することもできる。この配列を次いで化学的に合成することができる。本発明は突然変異したトランスジーン配列の使用をも含む。突然変異したトランスジーンは、野生型配列と対比して１個もしくはそれ以上のヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を有するトランスジーンである。ヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入は、野生型アミノ酸配列とはアミノ酸配列が相違する遺伝子産物（すなわち蛋白質）を生じうる。この種の突然変異体の作製は当業界で周知され、たとえばウエルス（Wells）等［Gene、第３４巻、第３１５頁（１９８５）］およびサムブルック（Sambrook）等（上記）に記載されている。２．調節要素の選択本発明のトランスジーンは典型的にはプロモータに作用的に結合され、プロモータは特定の方法で各トランスジーンの発現を調節するよう選択されている。各トランスジーンは同一または異なるプロモータにより調節することができる。選択されるプロモータは相同性（すなわちトランスジーンでトランスフェクトされる哺乳動物と同一種）または非相同性（すなわちトランスジーンでトランスフェクトされる哺乳動物の種とは異なる種）でもよい。たとえば各プロモータのソースはいずれの単細胞、すなわち原核性もしくは真核性生物からのもの、或いはいずれの脊椎動物もしくは非脊椎動物からのものとすることができる。本発明のより好適なプロモータは、たとえばヒトのＣＤ２プロモータ、ヒトのＣＤ４プロモータ、ＨＬＡＤＱｗ６のαおよびβプロモータ、マウスのＣＤ４プロモータ、マウスのｐ５６^lckプロモータ、マウスのＩ−ＥのαプロモータおよびマウスＨ−２^kプロモータのような免疫系の遺伝子の発現を調節するヒトやマウスのプロモータがあげられる。特に好適なプロモータはヒトのＣＤ２プロモータ、並びにＨＬＡＤＱｗ６のαおよび βプロモータである。本発明のプロモータは単独で用いることもできるが、一層厳密な発現の調節を可能とするように相同性および／または非相同性のエンハンサおよび／またはサイレンサと組合せて使用するができる。本発明におけるプロモータのヌクレオチド配列は当業界で周知された幾つかの方法により得ることができる。典型的には、本発明に有用なプロモータは予めマッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ切断により同定されており、したがって適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適正な組織ソースのゲノムＤＮＡから分離することができる。或る種の場合、プロモータは配列決定がなされていてもよい。ヌクレオチド配列が既知であるプロモータについては、このプロモータをトランスジーン合成について上記した方法により合成することができる。プロモータ配列の全部もしくは１部のみが既知である場合は、ＰＣＲを用いて或いはゲノムライブラリーを適するオリゴヌクレオチドおよび／または同一もしくは異なる種からのプロモータ配列断片でスクリーニングすることによりプロモータを得ることができる。プロモータ配列が不明であれば、プロモータを含有するＤＮＡの断片を、たとえばコード化配列または他の遺伝子を含有しているより大きなＤＮＡ片から分離することができる。分離は、適正なＤＮＡ断片を分離すべく慎重に選択された１種もしくはそれ以上の酵素を用いる制限エンドヌクレアーゼ切断により行うことができる。切断の後、所望の断片をアガロースゲル精製［キアゲン（Qiagen、登録商標）カラム（キアゲン・コーポレーション（Qiagen Corp.）社、チャットワース、ＣＡ）］または当業者に知られた他の方法により分離する。この目的を達成するのに適する酵素の選択は当業者には既に自明である。３．他のベクター成分の選択トランスジーンおよびプロモータの他に、本発明のトランスジーンを調製するのに有用なベクターは典型的には（１）トランスジーンを挿入する哺乳動物におけるトランスジーンの最適な発現、および（２）細菌もしくは哺乳動物の宿主細胞におけるベクターの増幅につき有用な１種もしくはそれ以上の他の要素をも含有する。これら要素のそれぞれは、それらの各々の活性を最大化させるように各要素に対しベクター内に適切に配置される。この種の配置は当業者に周知されている。以下の要素を必要に応じベクター中に含ませることができる。ｉ．シグナル配列要素トランスジーンによりコードされるポリペプチドを分泌させる本発明の実施形態の場合、しばしばシグナル配列と称する小型ポリペプチドを存在させて、トランスジーンによりコードされるポリペプチドをこれが合成される細胞から外へ向かわせるように指令する。典型的には、シグナル配列をトランスジーンのコード化領域にてコード化領域の５′末端の方向または５′末端の位置に配置する。多くのシグナル配列が同定されており、機能的でありかつトランスジェニック組織に対し適合性であるいずれのものでもトランスジーンと結合して使用することができる。したがって、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列はトランスジーンに対して相同性もしくは非相同性であり、さらにトランスジェニック哺乳動物に対しても相同性もしくは非相同性である。さらに、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は上記した各方法を用いて化学的に合成することもできる。しかしながら、本発明の目的で好適なシグナル配列はトランスジーンと共に自然に存在するものである（すなわちトランスジーンに対し相同性である）。ｉｉ．膜固定ドメイン要素或る種の場合、特定の細胞内膜の表面または形質膜上で発現されるトランスジーンを得ることが望ましい。自然に生じる膜蛋白質は、蛋白質を膜に固定するよう作用するアミノ酸の範囲をポリペプチドの１部として有する。しかしながら、膜上に自然には見いだされない蛋白質については、この種のアミノ酸の範囲を付加してこの特徴を付与することもできる。しばしば、固定ドメインはポリペプチド配列の内部にあり、したがってこれをコードするヌクレオチド配列を処理してトランスジーンヌクレオチド配列の内部領域に挿入する。しかしながら他の場合には、固定ドメインをコードするヌクレオチド配列をトランスジーンヌクレオチド配列の５′もしくは３′末端につけることもできる。この場合、固定ドメインをコードするヌクレオチド配列を先ず最初にトランスジーンをコードするヌクレオチド配列とは別の成分としてベクター中の適切な位置に挿入する。シグナル配列の場合と同様、固定ドメインはどのようなソースからのものでもよく、したがってトランスジーンおよびトランスジェニック哺乳動物の両者に対して相同性もしくは非相同性となる。或いは、固定ドメインは上記の方法を用いて化学的に合成することもできる。ｉｉｉ．複製要素のオリジン部この成分は典型的には購入した市販の原核性の発現ベクターの１部であって、宿主細胞におけるベクターの増幅を促進する。選択したベクターが複製部位のオリジン部を持たなければ、既知の配列に基づき化学的に合成し、ベクター中に結合することができる。ｉｖ．転写停止要素ポリアデニル化配列もしくはポリＡ配列としても知られるこの要素は典型的にはベクター中のトランスジーンヌクレオチド配列に対し３′に位置し、トランスジーンの転写を停止させるよう作用する。この要素をコードするヌクレオチド配列がライブラリーから容易にクローン化されるかまたはベクターの１部として市販されており購入することができるし、また、これはたとえば上記したようなヌクレオチド配列合成方法を用いて容易に合成することができる。ｖ．イントロン要素多くの場合、トランスジーンの転写はベクター上の１個もしくはそれ以上のイントロンの存在により増大する。イントロンは、特にトランスジーンがゲノムＤＮＡ配列の全長または断片である場合にトランスジーンヌクレオチド配列内に自然に生じているものである。イントロンがヌクレオチド配列内に自然に存在していなければ（大抵のｃＤＮＡの場合）、イントロンは他のソースから得ることもできる。イントロンはトランスジーンおよび／またはトランスジェニック哺乳動物に対し相同性もしくは非相同性である。プロモータおよびトランスジーンに対するイントロンの位置が重要である。何故なら、イントロンは有効になるように転写されなければならないからである。たとえばトランスジーンがｃＤＮＡ配列である場合、イントロンの好ましい位置は転写開始部位に対し３′であり、ポリＡ転写停止配列に対し５′である。好ましくはｃＤＮＡトランスジーンでは、イントロンはトランスジーンヌクレオチド配列の一方の側または他方の側（すなわち５′もしくは３′）に位置して、トランスジーンヌクレオチド配列を中断しないようにする。ウィルス、原核性および真核性（植物もしくは動物）生物を包含するいずれのソースからのどのようなイントロンを用いても本発明を実施することができるが、ただしこれはイントロンが挿入される宿主細胞に対し適合性でなければならない。さらに本発明には合成イントロンも包含される。必要に応じ、１個以上のイントロンをベクター中で使用することもできる。ｖｉ．選択可能なマーカー要素選択可能なマーカー遺伝子は、選択培地で増殖させたトランスフェクトされた細胞の生存および増殖に必要な蛋白質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、たとえば原核性宿主細胞についてはアンピシリン、テトラサイクリンもしくはカナマイシンおよび哺乳動物細胞についてはネオマイシン、ヒグロマイシンもしくはメトトレキセートに対し耐性を付与し；（ｂ）細胞の栄養素要求性欠損を補強し；または（ｃ）たとえばこの遺伝子はバチルス（Bacillus）の培養のためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のように複合培地からは得られない重要な栄養素を供給する蛋白質をコードしている。上記した全要素、並びに本発明に有用な他の要素は当業者に周知されており、たとえばサムブルック（Sambrook）等［Molecular Cloning: ALaboratory Manua l）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８９）］およびベルガー（Berger）等編、［Gu ide to MolecularCloning Techniques、アカデミック・プレス・インコーポレーション社、サンディエゴ、ＣＡ（１９８７）］に記載されている。４．ベクターの作製本発明によるトランスジェニック哺乳動物の作製に最も有用なベクターは、原核性細胞宿主に対し適合性であるベクターである。しかしながら、真核性宿主細胞およびこれら細胞に対し適合性であるベクターも本発明の範囲内である。或る種の場合、種々のベクター要素のいくつか、たとえばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＥＭベクター（プロメガ・コーポレーション（Promeg a Corp.）社、マジソン、ＷＩ）、たとえばｐＢＩＩＳＫ＋／−のようなｐブルースクリプト（pBluescript、登録商標）ベクター、［ストラトジーン・コーポレーション（Stratagene Corp.）社、ラ・ヨラ、ＣＡ］などに既に市販され入手しうるベクターがあり、これらは全て原核性細胞宿主に適したものである。この場合、トランスジーンをベクター中へ挿入することのみが必要である。しかしながら、使用すべき１種もしくはそれ以上の要素がベクター内に既に存在していないときは、これらを個々に入手し、ベクター中に結合する。各要素を入手し、これらを結合する方法は当業者に周知されており、トランスジーンを得るための上記方法と同じものである（すなわちＤＮＡの合成、ライブラリーのスクリーニングなど）。トランスジーンヌクレオチド配列を増幅し、および／または哺乳動物の胚をトランスフェクトするのに使用するベクターは、当業界で周知された方法により作製される。この種の方法はたとえばＤＮＡおよび／またはＲＮＡの制限エンドヌクレアーゼによる切断、結合、アガロースおよびアクリルアミドゲルによる精製、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのカラムクロマトグラフィーによる精製、ＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出、ＤＮＡ配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅などサムブルック（Sambrook）等（上記）に示された標準的な技術を包含する。本発明を実施すべく使用する最終ベクターは典型的には、たとえば入手しうる市販のベクターのような出発ベクターから作製される。このベクターは、完成ベクターに含まれるべきいくつかの要素を含有していても、していなくともよい。所望ないずれの要素も出発ベクターに存在しなければ、各要素を個々にベクター中に結合させることができ、これはベクター中に結合すべき要素の末端およびベクターの末端を結合に対して適合するようにベクターを適する制限エンドヌクレアーゼで切断することによって行うことができる。或る種の場合、満足すべき結合を得るために、一緒に結合すべき末端を「平滑断端化（blunt）」しておく必要がある。平滑断端化は、先ず最初に４種全てのヌクレオチドの存在下にクレノウＤＮＡポリメラーゼもしくはＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて「粘着末端（sticy end）」を充填することにより行われる。この手法は当業界で周知されており、たとえばサムブルック（Sambrook）等（上記）に記載されている。代案として、ベクター中に挿入すべき２種もしくはそれ以上の要素を先ず最初に互いに結合し（これらが互いに隣接した配置の場合）、次いでベクター中に結合する。ベクターを作製する他の１つの方法は、種々の要素の全ての結合を１つの反応混合物にて同時に行うことである。この場合、各要素の不適切な結合もしくは挿入により多くのナンセンスもしくは機能しないベクターが得られるが、機能するベクターを制限エンドヌクレアーゼ切断により同定し、選択することができる。ベクターが作製された後、これを増幅するため原核性宿主細胞にトランスフェクトすることができる。増幅に典型的に使用される細胞はイー・コリ（E．coll ）ＤＨ５−α［ギブコ／ＢＲＬ（Gibco/BRL）社、グランド・アイランド、ＮＹ］およびＤＨ５−αと同様な特性を有する他のイー・コリ（Ｅ．coli）菌株である。哺乳動物宿主細胞を使用する場合は、たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞［ＣＨＯ細胞；ウルラブ（Urlab）等、Proc．Natl．Acad．Scl．USA、第７７巻、第４２１６頁（１９８０）］およびヒト胚性腎細胞ライン２９３［グラハム（Graham）等、J．Gen．Virol.、第３６巻、第５９頁（１９７７）］などの細胞ラインが適している。増幅させるため選択された宿主細胞ラインへのベクターのトランスフェクションは、たとえばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストランなどの方法を用いて行うことができる。選択される方法は部分的に、トランスフェクトすべき宿主細胞の種類に依存する。これら方法および他の適する方法は当業者に周知されており、サムブルック（Sambrook）等（上記）に示されている。ベクターを充分に増幅させるのに十分な時間（一般にイー・コリ（E．coli）細胞では１晩）細胞を培養した後、ベクター（しばしば、この段階にてプラスミドと呼ばれる）を細胞から分離し、精製する。典型的には、細胞を溶解し、プラスミドを他の細胞内容物から抽出する。プラスミド精製に適する方法は特にアルカリ溶解ミニ−プレプ（alkaline lysis mini-prep）法［サムブルック（Sambro ok）等、上記］を包含する。５．挿入用プラスミドの作製典型的にはトランスジーンを含有するプラスミドを、胚に挿入する前に選択された制限エンドヌクレアーゼにより鎖状にする。或る種の場合、トランスジーン、プロモータおよび調節要素とをベクターの他の部分から鎖状の断片として分離することによって、トランスジーン、プロモータ、イントロン（１個のみを使用する場合）、エンハンサ、ポリＡ配列および必要に応じシグナル配列もしくは膜固定ドメインとを含む鎖状ヌクレオチド配列のみを胚に注入することが好ましい。これは、これらの要素を含む核酸配列領域を取り出すようにプラスミドを切断し、この領域をアガロースゲル電気泳動または他の適する精製法により精製して行うことができる。６．トランスジェニック哺乳動物の作製本発明を実施すべく使用する哺乳動物の特定の系統を一般的に良好な健康状態、良好な胚収率、胚における良好な前核可視性および良好な繁殖適性により選択する。さらに、ハプロタイプが重要な因子である。たとえばトランスジェニックマウスを作製する場合、たとえばＣ５７ＢＬ／６またはＣ５７ＢＬ／６ × ＤＢＡ／２のＦ₁、もしくはＦＶＢ系統のような株がしばしば使用される［チャールス・リバー・ラブス（Charles River Labs）社、ボストン、ＭＡ、ジャクソン・ラボラトリース（The Jackson Laboratory）社、バー・ハーバー、ＭＥまたはタコニック・ラブス（Taconic Labs．）社から市販され入手できる］。好適な株はたとえばＣ５７ＢＬ／６もしくはＤＢＡ／１のようなＨ−２^b、Ｈ−２^dもしくはＨ−２^qハプロタイプを有するものである。本発明を実施すべく使用する系統自身もトランスジェニックとすることができ、および／またはノックアウト（すなわち、部分的または完全に抑制された１個もしくはそれ以上の遺伝子を有する哺乳動物）とすることができる。好ましくは、同一の系統を最初のノックアウト哺乳動物およびトランスジェニック哺乳動物の両者を作製するために使用する。これは、その後の交配および戻し交配をより効率的にする。胚を入手し、代理宿主として振る舞うように使用する哺乳動物の年齢は使用する動物種に依存するが、当業者により容易に決定される。たとえばマウスを使用する場合、***前の雌が好適である。何故なら、これらはより多くの胚を産生すると共にホルモン注射に対し良好に反応するからである。同様に、種動物として使用する雄の哺乳動物は、一般にいろいろな選択基準のうち性的成熟の年齢により選択される。卵子の生産、交配、および／または胚を再移植するために雌にホルモンまたは他の化合物を投与することが必要である。ホルモン／補助因子の種類および使用量、並びにホルモン投与のタイミングは哺乳動物の種により変化する。この種の考慮は当業者に容易に了解されよう。典型的には、前処理された雌（すなわち受精しうる卵子を生産する雌）を種雄と交配させ、次いで得られた受精胚をトランスジーンの導入のため取り出す。或いは、卵子および***を適する雌および雄から得、インビトロで受精させ、トランスジーンの導入に適する胚を得ることもできる。一般に、受精した胚を適する培地で前核が出現するまでインキュベートする。ほぼこの時点にて、トランスジーンを含むヌクレオチド配列を雌または雄の前核に下記するように導入する。たとえばマウスのような或る種においては、雄の前核が好適である。胚へのトランスジーンヌクレオチド配列の導入は、当業界で知られた任意の手段、たとえばマイクロインジェクション、エレクトロポレーションもしくはリポフェクションによって行うことができる。胚中にトランスジーンヌクレオチド配列を導入した後、胚をインビトロで種々の時間にわたりインキュベートするか、或いは代理宿主に再移植するか、或いはその両者を行うことができる。成熟するまでのインビトロでのインキュベートも本発明の範囲内である。１つの一般的な方法は、胚を動物種に応じて約１〜７日間にわたりインビトロでインキュベートし、次いでこれらを代理宿主に再移植することである。再移植は標準的な方法を用いて行われる。一般に、代理宿主を麻酔し、次いで胚を卵管に挿入する。特定の宿主に移植される胚の個数は動物種により変化するが、一般にこの種が自然に生む子孫の数に匹敵する。代理宿主のトランスジェニック子孫は、いずれかの適する方法によりトランスジーンの存在および／または発現についてスクリーニングされる。スクリーニングはしばしばサウザン・ブロットもしくはノーザン・ブロット分析により、トランスジーンの少なくとも１部に対し相補的であるプローブを用いて行われる。トランスジーンによりコードされる蛋白質に対する抗体を用いるウエスタン・ブロット分析も、トランスジーン産物の存在につきスクリーニングするための代案法もしくは迫加法として用いることができる。典型的には、ＤＮＡを尾組織（尾の先端から約１ｃｍを除去する）から調製し、トランスジーンについてサウザン分析もしくはＰＣＲによって分析する。また、いずれの組織もしくは細胞もこの分析に用いることができるが、最高レベルでトランスジーンを発現すると思われる組織もしくは細胞をサウザン分析もしくはＰＣＲを用いてトランスジーンの存在および発現について試験する。トランスジーンの存在を評価する代案もしくは追加の方法は限定はしないが、たとえば酵素および／または免疫学的分析、特定のマーカーもしくは酵素活性に対する組織学的染色、フローサイトメトリー（流動細胞計測法）分析などのような適切な生化学的分析法を包含する。血液の分析も、血液におけるトランスジーン産物の存在を検出すると共に各タイプの血液細胞および他の血液成分のレベルに対するトランスジーンの作用を評価するのに有用である。トランスジェニック哺乳動物の後代は、トランスジェニック哺乳動物を適する相手と交配させるか、或いはトランスジェニック哺乳動物から得られた卵子および／または***をインビトロで受精させることによって得ることができる。相手との交配を行う場合、この相手はトランスジェニックおよび／またはノックアウトであってもなくてもよい。トランスジェニックである場合、これは同一もしくは異なるトランスジーンまたはその両者を含有するだろう。或いは、相手は親系列であってもよい。インビトロでの受精を用いる場合、受精した胚を代理宿主に移植するか、或いはインビトロでインキュベートするか、或いはその両者を行うことができる。いずれの方法を用いても、後代を上記の方法或いは他の適する方法によりトランスジーンの存在について評価する。ノックアウト／トランスジェニック哺乳動物の作製１個以上のノックアウト構成物および／または１個以上のトランスジーンを含有する哺乳動物は、幾つかある方法の内いずれかの方法で作製される。好適な作製方法は、それぞれ所望のノックアウト構成物もしくはトランスジーンのうちひとつを含有する一連の哺乳動物を得ることである。このような哺乳動物を一連の交配、戻し交配および選別により互いに育種して、最終的に全ての所望のノックアウト構成物および／またはトランスジーンを含有する単一の哺乳動物を得る。この哺乳動物はノックアウト構成物および／またはトランスジーンが存在するという点を除いて野生型と他の点においてはコンジェニック（遺伝的に同一）となる。例として、第４図はＣＤ４、ＣＤ８ダブルノックアウト（ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）であり、２個のトランスジーン（ヒトのＤＱｗ６のαおよびβ 鎖［ＤＱｗ６］およびヒトのＣＤ４［ｈＣＤ４］）を有するマウスを得るための育種方式を示している。典型的には、交配および戻し交配は、育種法における各特定の段階の目標に応じて子孫と同胞株もしくは親株とを交配させて行われる。或る場合には、各々のノックアウト構成物および／またはトランスジーンが染色体中で適正な位置にある単一の子孫を得るために、多数の子孫を得ることが必要となるだろう。たとえばＣＤ４およびＣＤ８をコードするネズミの遺伝子は同じ染色体上に比較的近接して位置している。すなわち、ノックアウトされたＣＤ４およびＣＤ８の両者を有するマウスを得るには、実質的に２つの実用的な選択枝がある。第１に、単一のＥＳ細胞にＣＤ４およびＣＤ８ノックアウト構成物の両者を注入してダブルノックアウトを作製するように試み、各構成物が同じＥＳ細胞中で同じ染色体に組込まれ、次いでこのＥＳ細胞が胚中に適切に一体化され、その結果ＥＳ細胞が胚に挿入されるようになることを期待する。これら全ての現象が最終産物を得るのに必要なこととして生ずる確率は極めて低い。代案として、一方がＣＤ４ノックアウト構成物を含有し、他方がＣＤ８ノックアウト構成物を含有する２種のノックアウト哺乳動物を得ることができる。次いで、これら哺乳動物を最初に交配し、続いて、同じ染色体上に両者のノックアウト構成物を含有する子孫が得られるまで子孫を交配しスクリーニングを続ける（マウスにおいて、この結果は乗換え（cross over）現象が適正位置、すなわちＣＤ４遺伝子とＣＤ８遺伝子との間で生じなければ得ることができない。何故なら、ＣＤ４およびＣＤ８をコードする遺伝子は同じ染色体上に存在するからである）。いずれの場合にも、数回の交配からの１００もしくはそれ以上の子孫をスクリーニングして、ノックアウト構成物および／またはトランスジーンを適正な染色体の位置に含有する単一の哺乳動物を同定する必要がある。トランスジェニック／ノックアウト哺乳動物の使用本発明の哺乳動物およびその後代は、発現されるトランスジーンおよびこれらが含有するノックアウト構成物に応じて各種の用途を有する。哺乳動物を使用して、たとえば敗血症または他の免疫学的障害などの病気の予防もしくは治療に有用な薬物もしくは治療処方をスクリーニングすることができる。有用な薬物のスクリーニングは、先ず最初に哺乳動物に病気を誘発させ（すなわち哺乳動物に敗血症をもたらす病原体もしくは毒素に露呈する）、次いで候補となる薬物を広範囲の投与量で哺乳動物に投与し、種々の時点で評価している病気もしくは障害に対する薬物の作用を分析することを含む。代案として或いは追加的に、薬物を病気の誘発に露呈する前に或いはそれと同時に投与することもできる。病気もしくは症状を治療するのに使用する薬物をスクリーニングする他、本発明の哺乳動物は病気もしくは症状を予防もしくは治癒することを目的とした治療養生法を設計するにも有用である。たとえば哺乳動物を特定のダイエット、運動、放射線処置および／または１種もしくはそれ以上の化合物もしくは物質と組合せて、病気もしくは症状の発症前もしくはそれと同時にまたはその後に処方することができる。この種の全体的な療法もしくは養生法は、化合物単独での治療よりも病気もしくは症状を克服するのに一層効果的であるかもしれない。化合物および／または治療養生法の効能を評価する分析は、たとえばＴ細胞およびＢ細胞レベルの増加もしくは減少、免疫グロブリン産生の増加もしくは減少、たとえばサイトカイン（たとえば腫瘍壊死因子など）のような化学メッセンジャーのレベルの増加もしくは減少、および／または免疫反応に関与する特定遺伝子の発現レベルの増加もしくは減少を調べることを含む。さらに血圧、体温、体重、心拍、挙動、毛の外観（波打ち毛（ruffled fur））などのような基準も評価することができる。たとえば、敗血症の患者はしばしば血圧の低下、発熱、体重減少および／または血液凝固などを体験する。患者に対してこの種のことを予防もしくは減少させうる治療剤を投与することが望ましい。本発明の哺乳動物を用いて、種々の化合物を単独で或いは組合せてスクリーニングすることにより、このような病気の徴候の出現が減少するかまたは軽減するかどうかについて決定することができる。さらに本発明の哺乳動物は、免疫系の発生を評価し、特定遺伝子の突然変異の効果を検討するにも有用である。本発明のトランスジェニックノックアウト哺乳動物は、１種もしくはそれ以上の細胞ラインを得るためにも使用することができる。このような細胞ラインは、たとえば特定の組織もしくは器官に対するトランスジーンノックアウトの作用を評価し、組織におけるトランスジーンの活性レベルに影響を及ぼしうる化合物をスクリーニングするなど多くの用途を有する。この種の化合物は、トランスジーンの活性を調節するための治療剤として有用である。この種の細胞ラインの産出は当業者に知られた各種の方法により行うことができる。実際の培養条件は、培養すべき組織および細胞の種類に依存する。細胞に関して細胞の成長および増殖に対する最適条件を決定するために過度な実験をすることなしに、異なる濃度のマクロおよびミクロ栄養素、増殖因子、血清などを含有する各種の培地を試験することができる。同様に、たとえば細胞密度、培地温度およびインキュベーター中の二酸化炭素濃度などの他の培養条件も容易に評価することができる。この過程に影響を及ぼす化合物の改変および同定も可能である。本発明の他の用途は当業者に容易に明かとなるであろう。以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は本発明の範囲を決して限定するものでない。実施例実施例１：ＣＤ８ノックアウトマウスマウス株Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡを使用し、これらはジャクソン・ラボラトリース（Jackson Laboratories）社（バー・ハーバー、ＭＥ）から購入した。Ｌｙｔ−２遺伝子のエクソン１〜３を含有する約２．２ｋｂ（キロベース）のマウスのゲノムのＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を分離して、ＣＤ８ノックアウト構成物の出発物質として使用した。断片をエクソン１の内側部位を切断するＥｃｏＲＩで切断した。細菌性ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）をこのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ｎｅｏＤＮＡ構成物は、プラスミドｐＭＣＩｎｅｏＰｏｌＡ［トーマス（thomas）等、Cell、第５１巻、第５０３頁（１９８７）］から前記プラスミドを制限エンドヌクレアーゼで切断し、ｎｅｏＤＮＡを抽出し、精製することにより入手した。この構成物の略図を第１図に示す。構成物をベクター中に挿入し、イー・コリ（E．Coli）細胞で増幅させた後、ＤＮＡ構成プラスミドを標準的なアルカリ溶解およびＣｓＣｌ濃度勾配精製法によって精製した。プラスミドを精製した後、Ｌｙｔ−２／ｎｅｏ構成物を制限エンドヌクレアーゼ切断により鎖状となし、次いでエレクトロポレーションの手法を用いてＤ３ネズミ胚性幹細胞にエレクトロポレーションした［ドエチマン（Doetschman）等、J．Embryol．Exp．Morph．、第８７巻、第２７〜４５頁（１９８５）］。エレクトロポレーションには、約５ｎモルの鎖状化した構成物を約８００μｌの容積の培地中の約５×１０⁶のＥＳ細胞に添加した。これら細胞を約０．３４キロボルトおよび２５０μＦにてパルス処理し、次いで各バイアル（vial）における細胞を胚性繊維芽フィーダー細胞を含有する２枚の１０ｃｍ細胞培養プレートに載せた。これら培養プレートは１％ゼラチンでプレコートされ、これらのプレートは、１５％のウシ胎仔血清［ギブコ／ＢＲＬ（Gibco/BRL）社、グランド・アイランド、ＮＹまたはハイクローン・ラブス（Hyclone Labs）社、ローガン、ＵＴからの均等物］と白血病増殖阻止因子［フング・ロイング（Fung-Leung）等、Cell、第６５巻、第４４３〜４４９頁（１９９１）］とを添加した１０ｍｌのＤＭＥＭ培地［ギブコ／ＢＲＬ（Gibc o/BRL）社、グランド・アイランド、ＮＹ］を含有している。２日の後、約２５０〜３００μｇ／ｍｌの抗生物質Ｇ４１８を培養物に添加してｎｅｏ選択を開始し、培地はほぼ２日毎に交換した。Ｇ４１８の存在下で生存した細胞はほとんど、発現に対して適切な配置でｎｅｏ遺伝子を有するノックアウト構成物を含有している。次いで、これら細胞をスクリーニングして、ノックアウト構成物がＤＮＡに組込まれたことを確かめた。スクリーニングはＰＣＲを用いて行った。Ｌｙｔ−２／ｎｅｏノックアウト構成物を含有するＤ３細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に受託番号ＣＲＬ−１１１１６として寄託した。Ｌｙｔ−２／ｎｅｏ構成物を含有する細胞ラインを、ロバートソン（Robertso n）により記載された方法［Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell: A Pra ctical Approach、ＩＲＬプレス社、ワシントン、Ｄ．Ｃ．（１９８７）］にしたがい、トリプシン処理によってネズミ胚にマイクロインジェクションできるようにした。注入した胚は、雄マウスと交配させた雌マウスの子宮を灌流することにより得た３．５日齢の胚である。胚中へ胚性幹細胞を注入した後、これら胚を妊娠継続のため偽妊娠の雌に移植した。子孫をノックアウト構成物を有するマウスを検出しうるように互いに或いは適する毛色を有するマウスと交配した。これらマウスの子孫を、ｎｅｏ遺伝子を検出するように設計されたプローブを用いて尾組織から得られたＤＮＡのサウザン・ブロットをプローブし、ノックアウト構成物の存在について評価した。実施例２：ＣＤ４ノックアウトマウスイントロン４の１部とエクソン４、５および６の全長とに跨がるマウスのゲノムＣＤ４のｃＤＮＡ配列の約２．８ｋｂ断片を分離した。ポリＡ停止シグナルおよびチミジンキナーゼプロモータ（単純疱疹ウィルスから）を含有する約１．２ｋｂの細菌性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子構成物をＸｈｏＩおよびＳａｌＩによる切断を用いてプラスミドｐＭＣＩｎｅｏＰｏｌＡ［トーマス（Thomas ）等、Cell、第５１巻、第５０３〜５１２頁（１９８７）］から得た。ｎｅｏ− ポリＡ挿入物を分離し、次いで予めＫｐｎＩ、これはＣＤ４の転写方向に対しアンチセンス方向でエクソン５の内側部位を切断するものであるが、ＫｐｎＩで切断したＣＤ４構成物に結合した。得られたノックアウト構成物を第２図に示す。構成物をイー・コリ（E．coll）細胞で増幅させ、次いで構成物を含有するプラスミドを精製した。ノックアウト構成物を制限エンドヌクレアーゼ切断により鎖状とし、次いでＤＮＡを精製した。次いで約５ｎモルのこのＤＮＡをＤ３胚性幹細胞にエレクトロポレーションし、次いでエレクトロポレーションされた細胞を選択すると共に実施例１に記載したようにスクリーニングした。ＣＤ４ノックアウト構成物を含有するＤ３細胞ラインをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に受託番号ＣＲＬ−１１１１４として寄託した。ＣＤ４／ｎｅｏ構成物を含有するＥＳ細胞を同定した後、これら細胞を３．５日齢のネズミの胚にマイクロインジェクションした。この胚は雄と交配させた雌から得た。次いで胚を妊娠継続のため偽妊娠の仮親に移植した。これらマウスの子孫を、尾組織から得られたＤＮＡのサウザン・ブロットをプローブすることによりノックアウト構成物の存在について評価した。実施例３：ＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトマウス上記したＣＤ４およびＣＤ８ノックアウトマウスを用いて、ｍＣＤ４−／−／ｍＣＤ８−／−ダブルノックアウトマウスを得た。ｍＣＤ４＋／−ｍＣＤ８＋／＋マウスをｍＣＤ４＋／＋ｍＣＤ８−／−マウスと交配し、ｍＣＤ４＋／−ｍＣＤ８＋／−異型接合のＦ₁子孫を得た。異型接合の同胞を交配し、子孫を次のようにしてスクリーニングした。約２０μｌの血液を各マウスの尾静脈から得、ヘパリン処理された毛細管に集めた。血液を免疫蛍光染色緩衝液（「ＩＢＳ」、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸塩緩衝生理的食塩水［サムブルック（Sambrook）等、上記］と０．１％のナトリウムアジドと５％のウシ胎仔血清とで構成される）で１回洗浄した。ついで各血液試料を以下のモノクローナル抗体と共にインキュベートした（ＰＥはフィコエリトリンであり、ＦＩＴＣはフルオレセインイソチオシアネートである）：（１）ＰＥ−結合抗−ヒトＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ；ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Becton-Dickinson Co.）社）（２）ＦＩＴＣ−結合抗−ＨＬＡＤＱ（Ｌｅｕ１０；ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Becton-Dickinson Co.）社）（３）ＰＥ−結合抗−マウスＬ３Ｔ４（ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Be cton-Dickinson Co.）社）（４）ＦＩＴＣ−結合抗−マウスＬｙｔ−２（ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Becton-Dickinson Co.）社）。インキュベーションは全て４℃で２０分間行った。次いで赤血球をＦＡＣＳ溶解緩衝液（ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Becton-Dickinson Co.）社）を用いて２分間溶解させ、次いでＩＢＳで２回洗浄した。次いで細胞をＬｙｓｉｓIIソフトウェアー（ベクトン・ジキンソン・カンパニー（Becton-Dickinson Co.）社）を用いるフローサイトメトリー（流動細胞計測法）分析により分析した。野生型および異型接合型のＣＤ４／ＣＤ８ノックアウト変異体を互いに染色の強度に基づき区別した。同型接合型のＣＤ４／ＣＤ８ノックアウト変異体をＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋細胞の完全な不存在下で同定した（抗体による免疫蛍光染色の欠如に基づいて）。両者の座における変異について子孫の同型接合の頻度は２％であった（２００個のうち４個）。これは、両遺伝子とも第６染色体にあるので、未連鎖遺伝子に対して予想される頻度（１／１６）よりも低い［パルネス（Parnes）、Adv．Imm unol.、第４４巻、第２６５頁（１９８９）］。実施例４：ヒトのＣＤ４トランスジェニックマウスヒトのＣＤ４（ｈＣＤ４）トランスジェニックマウスを次のように作製した：約２．８ｋｂのヒトのＣＤ４のｃＤＮＡ配列［マドン（Maddon）等、Cell、第４２巻、第９３〜１０４頁（１９８５）］を、人工的に作製されたヒトのＣＤ２プロモーターレギュレータカセットのＥｃｏＲＩ部位に挿入した［グリーブス（ Greaves）等、Cell、第５６巻、第９７９〜９８６頁（１９８９）］。このカセットは約４．８ｋｂのｈＣＤ２の５′配列と約５．５ｋｂのｈＣＤ２の３′配列とを含有する。ＣＤ２カセット中へのＣＤ４のｃＤＮＡの挿入はＣＤ２の第１エクソンを除去して、ＣＤ２の５′プロモータ配列とＣＤ２の３′調節イントロン配列とを完全に残すようにした。第３図に示す最終的な構成物はコピー数依存性であって、トランスジェニックマウスのゲノムにおける組込部位とは無関係にリンパ球で特異的に発現される。この構成物を上記の手順を用いてＣＢＡ／Ｃａ × Ｃ５７ＢＬ／１０の胚に注入した。子孫をトランスジーン構成物の存在についてスクリーニングし、この構成物を有する子孫を５世代にわたりＣ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配した。Ｆ５世代の子孫を次いでＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトマウスと交配させて、ヒトのＣＤ４トランスジーンを含有するＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトであるマウスを得た。実施例５：ヒトのＭＨＣII ＤＱｗ６トランスジェニクマウストランスジーンであるヒトのＨＬＡ−ＤＱｗ６のαとＨＬＡ−ＤＱｗ６のβとを有するＣ５７Ｂ４６マウスを次のようにして作製した。ＨＬＡ−ＤＱｗ６のα鎖をコードする遺伝子を、クローニングベクターとしてのλシャロン４Ａを用い、予めＥＢＶ（エプスタイン−バールウィルス）でトランスフォームされているヒトのＢリンパ芽球細胞ライン（ＥＢ−ＴＯＫ）から得られたＤＮＡのゲノムライブラリーから分離した。この細胞ラインはＨＬＡ− ＤＲ２−ＤＱｗ６−Ｄｗ１２ハプロタイプに関し同型接合型である。この遺伝子は、約０．８ｋｂの５′配列と全長のコード化領域と約６ｋｂの３ ′未翻訳配列とを含む約１３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片として得られた。ＤＱｗ６のβ鎖をコードする遺伝子をツカモト（Tsukamoto）等［Immunogenet ics、第２５巻、第３４３〜３４６頁（１９８７）］に記載されているようにして分離した。約１８ｋｂのＤＱｗ６のβ鎖ヌクレオチド配列のＥｃｏＲＩ断片を、ＤＱｗ６のβのエクソン６および幾つかの３′未翻訳配列とを含有するＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩのｃＤＮＡ配列に結合させ、完全なＤＱｗ６のβ遺伝子を得た。ＤＱｗ６のαおよびβの両遺伝子をＥｃｏＲＩによる制限エンドヌクレアーゼ切断により鎖状とした。ＤＱｗ６のαおよびβ遺伝子の混合物を次いでＣ５７Ｂ４６マウスの胚にマイクロインジェクションした。この胚を妊娠継続のため仮親に移植した。子供をトランスジーンの存在について次のようにスクリーニングした。尾組織を各マウスから得、この組織からのＤＮＡをＳＤＳ−プロテイナーゼＫ法により調製した。ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、次いで０．９％のアガロースゲル上で電気泳動した。次いでサウザン・ブロット分析を行って、トランスジーンを含有する子供を確認した。次いでＭＨＣIIトランスジェニックマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと１０世代にわたり戻し交配を行った。Ｆ１０世代の子孫を次いで互いに交配し、同型接合のＤＱｗ６＋／＋トランスジェニックマウスを得た。次いで同型接合体をＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックマウスと交配させて、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトでありかつＤＱｗ６のαおよびβトランスジーンを含有するマウスを得た。実施例６：ＣＤ４−／−／ＣＤ８−／−ｈＤＱｗ６のｈＣＤ４マウスヒトのＣＤ４トランスジーンを含有するＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトマウスを、ＤＱｗ６トランスジーンを含有するＣＤ４／ＣＤ８ダブルノックアウトマウスと交配させて、ダブルノックアウトダブルトランスジェニックマウスである子孫を得た。これらマウスを上記の免疫蛍光染色法を用いてノックアウト構成物およびトランスジーンの存在についてそれらのタイプを決定した。この子孫を得るために使用した完全育種方式を第５図に示す。実施例７：敗血症感受性のスクリーニングＳＥＢ（（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、Staphylococcus enterotoxin B）、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）社、セントルイス、ＭＯ）とＬＰＳ（リポ多糖類、シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical C o.）社）と抗−ＣＤ３モノクローナル抗体（ファルミンゲン（Pharmingen）社、サンディエゴ、ＣＡ）との作用を野生型、トランスジェニック、ノックアウトおよびダブルノックアウトダブルトランスジェニックの各マウス、それらは全て６〜１２週齢のマウスであるが、それらのマウスについて評価した。特に、次のマウスについて評価した：（１）ヒトのＣＤ４＋、ＤＱｗ６＋、マウスのＣＤ４−／−、マウスのＣＤ８− ／−（ｈＣＤ４＋、ＤＱｗ６＋、ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）（２）ヒトのＣＤ４＋、マウスのＣＤ４−／−、マウスのＣＤ８−／−（ｈＣＤ４＋、ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）（３）ＤＱｗ６＋、マウスのＣＤ４−／−、マウスのＣＤ８−／−（ＤＱｗ６＋、ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）（４）マウスのＣＤ４−／−、マウスのＣＤ８−／−（ｍＣＤ４−／−、ｍＣＤ８−／−）（５）ＤＱｗ６（６）野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）（７）野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）野生型の齧歯動物は一般にエンテロトキシンの作用に対し耐性である。したがって、感作剤であるＤ−ガラクトサミン（Ｄ−ｇａｌ）約２０ｍｇ（１００μｌのＰＢＳ中）を各マウスに対し試験物質の注入の約５〜１５分前に腹腔内投与した。各試験物質の投与は約１００μｌのＰＢＳ中で腹腔内に行った。投与した各試験物質の量を第１表に示す。ＳＥＢもしくはＬＰＳに露呈してから７２時間以内に死亡したマウスの個数を第１表に示す。驚くことに、ダブルノックアウトダブルトランスジェニックマウスは、他の全ての評価した遺伝子型と比較してこれらマウスにおける致死率が極めて高く、ＳＥＢに対する極めて高い感受性を示している。種々の遺伝子型のマウスからのＴ細胞のＳＥＢに対すインビトロでの投与反応性を評価するため、６〜１２週齢のマウスから収集された脾臓から、脾臓組織を針金網を通すことによって単一細胞懸濁物を作製した。次いで、これら細胞を９６穴マイクロタイタープレートに約１×１０⁶／穴の密度で入れ、１０％の熱で失活させたウシ胎仔血清（ＦＣＳ；ハイクローン・ラブス（Hyclone Labs）社）と５０μＭのβ−メルカプトエタノールと０．０１％のペニシリンと０．０１％のストレプトマイシンとを補充した約２００μｌのイスコウブ（Iscove）改良ジュルベッコ（Dulbecco）培地（ＩＭＤＭ）に懸濁した。次いで第５図に示したように細胞をＳＥＢの濃度を減少させながら刺激した。３７℃および５％のＣＯ₂ 下で約７２時間インキュベートした後、細胞を約１６時間にわたり約１μＣｉの３Ｈ−チミジンを用いて脈動した。次いで細胞を放射能についてカウントした。結果を第５図に示す。黒丸印はダブルノックアウトダブルトランスジェニックを示し、白丸印はｈＣＤ４トランスジーンを有するダブルノックアウトを示し、黒四角印はＣ５７Ｂ４６野生型を示し、白五角形印はダブルノックアウトを示す。これから判るように、ダブルノックアウトダブルトランスジェニックマウスのＴ細胞は、野生型および他の変異遺伝子型と比較してＳＥＢの存在に対し反応性が大であった。Detailed Description of the Invention Sepsis model Background of the Invention TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to non-human mammals produced by recombinant DNA technology. More detailed Specifically, the present invention provides a susceptible and effective therapeutic treatment for sepsis and other diseases. It relates to non-human mammals useful for screening compounds. Description of related technologyIn vivo screening system To evaluate compounds for their potential as human therapeutics, in vivo systems were used. Need data and information on the efficacy of the compounds. Ideally, the data The in vivo system used for collection is human. However ethical and practical reasons Suggests that non-human laboratory animals could be used as an in vivo screening system for drug development. Then typically used. Experimental animals should evaluate the efficacy of potential therapeutic agents and identify possible side effects of the therapeutic agents. Although useful as a model system to recognize, this type of model has limitations. You. One important limitation is that laboratory animals and humans in disease resistance and susceptibility Is the difference between. These differences are It is often based on species differences in the structure and function of the immune system. Therefore , A compound similar to the human immune system to evaluate its therapeutic value in humans. It would be useful to have an animal model with an immune system thatTransgenic and knockout technology Recent advances in recombinant DNA technology have led researchers to study animals such as mice. It has become possible to genetically manipulate. Outbreak of transgenic mammals And knockout mammalian development techniques have been developed for animals that do not express endogenous genes (no Animal) or one or more exogenous or non-exogenous Ask researchers to produce animals (homologous animals) with homologous genes More used. The production of transgenic mammals often involves the production of a transgene. ) Is inserted into one or more mammalian chromosomes. Including doing. A transgene, typically composed of DNA, is a specific polypeptide. Code the peptide. Transgenes are typically used for microinjection More inserted into the pronucleus of the egg, where it integrates into the DNA of the developing embryo. It is. The embryo is then transferred to a "surrogate host" for continued pregnancy. Surrogate host Offspring are evaluated for the presence of new DNA. Expression of transgene, ie transgene DN Production of the protein encoded by the A sequence confers a novel phenotype on mammals. Can be. The transgene to be inserted into the mammal, the control element used (eg Lomomotor and enhancer / silencer), and transgene expression Depending on the turn and expression level, mammals are more or less specific for a particular disease or condition. Can be susceptible to a series of diseases. This type of transgenic mammal is To screen for compounds that are useful in treating or preventing qi Value for testing and / or developing useful methods for treatment or diagnosis of disease There is. Knockout Mammal Production Suppresses Expression of "Knockout" Genes A nucleic acid sequence (generally DNA) designed to ) Called an undifferentiated cell line. Nucleic acid sequence is ES After being inserted into the vesicle, the ES cells are injected into the developing mammalian embryo, where It becomes part of the embryo when it is incorporated into the embryo during development. Subsequent lodging for the embryo to continue pregnancy Mainly transplanted.Immune system components The immune systems of all mammalian species work in a very complex way to Consists of many specific cells that protect against various foreign agents such as various pathogens and toxins Have been. Many cell types in the immune system exert their effects and lead to MHC (major tissue fit). Recognizes some foreign substances through a series of proteins known as the compatibility gene complex) You. Mouse MHC is known as the H-2 complex ("H-2"). Human MHC is called the HLA complex ("HLA"). 100 or more HLA complexes [Klein et al., Sci. Am., Vol. 269, Vol. 78-83 (1993)]. The hallmark of MHC is the MHC locus, which is defined as the chromosomal location of the gene. A) is unusually large in nucleotide and corresponding amino acid sequence It has the allele or variant of. MHC proteins are generally MHC Called Class I (“MHC I”) and MHC Class II (“MHC II”) There are two types. MHC class I proteins are membrane-bound proteins, and It is expressed on the surface of all nucleated cells. MHC class II protein is also a membrane-bound protein Quality but certain immune system cells (ie dendritic cells, macrophages and B (Cells) only. MHC class II proteins play important roles in the recognition and attack of foreign substances in the immune system Act. When most foreign substances enter the body, first of all Macrophage is recognized by antigen-presenting cells (APCs) such as It binds to and is ingested and processed. Each part of the processed material is Surface of the page It can bind to the above MHC class II proteins. MH on the surface of macrophages This presentation of the "show off" of the substance bound to C is a consequence of other cells of the immune system (eg It enables certain types of T cells) to recognize and respond to foreign substances. T thin Cells become "activated", proliferate and release compounds harmful to foreign substances Be triggered to do. Moreover, activation of T cells activates other cells of the immune system. Help launch an attack on the substance. T cells (ie, one type of immune system cell) contain various proteins on their cell surface. Is expressed. Many of these proteins recognize and / or bind extracellular substances and / or Is involved in cell signaling. Two important T cell surface molecules are CD4 and C It is D8. CD4 is a glycoprotein monomer with a molecular weight of approximately 55 kD. Mouse CD4 Is encoded in L3T4 and has a size of about 26 kb. CD8 is a disulfide It is a linked heterodimer. In humans, two CD8 monomers The genes that are labeled are called CD8α and CD8β. In mice, CD8 The monomers that make up the heterodimer are the genes for the genes Lyt-2 and Lyt-3. Has been Lyt-2 has a size of about 4.4 kb and contains 5 exons. Have. Immature T cells express both CD4 and CD8 on their cell surface. Cells Upon maturation, they stop expression of either CD4 or CD8. sand Wachinari Mature T cells are classified based on whether they express CD4 or CD8 Is done. Generally, mature T cells that express only CD4 are called helper T cells, It recognizes and reacts with the antigen bound to MHC class II molecules. Generally, CD8 Mature T cells that express only T cells are called cytotoxic T cells and bind to MHC class I molecules. Recognize the combined antigen and react with it. MHC, CD4 and CD8 molecules differ in amino acid sequence between species . That is, one species recognizes the pathogen or substance as foreign and The other species do not act that way while initiating a reaction to. In addition, There are also intra-species differences in response to some toxins or pathogens (ie, Different species and different members of the same species are highly specific for a particular toxin or pathogen And other species are more tolerant of their presence in the body ). This is due to the alteration of many different alleles at the MHC locus (as described above). ). Individual members of each species have only one of these allelic forms at each MHC locus Alternatively, at most two may be expressed and different alleles may represent different pathogens. Differ in their ability to bind. In an attempt to understand interspecies differences in molecular activity and recognition of the immune system, research Researchers have (1) a human transgene encoding a protein of the immune system, and And / or (2) one or it which encodes a protein of the immune system Experimental animals were constructed so as not to express the above endogenous genes. Nishimura et al. [J. Immunol., Volume 145, pp. 353-360. (1990)] is a human HLA-DQw6 protein (that is, MHC class II protein). Mouse having a transgene encoding α and β chains of a family member) Is described. Barzaga-Gilbert et al., [J. Exp. Med. , Volume 175, Pp. 1707-1715 (1992)] is a trans that encodes human CD4. Gene-bearing mice are described. Obtained transgenic mau Although several strains of S. cerevisiae express both human and murine CD4 molecules on T cells, , They were at different levels. Killeen et al., [EMBO J., Vol. 12, pp. 1547-1553 (1 993)] lacks expression of endogenous CD4, but is a transgene encoding human CD4. It describes mice with sgene. Robey et al. [Cell, 64, 99-107 (1991)] , Expresses murine CD8 under the control of human CD2 regulatory sequences. Describes Kumaus. Teh et al., [Nature, Vol. 349, pp. 241-243 (1991)]. Has the murine CD4 transgene under the control of the murine lck promoter Mau Are described. Reportedly, the transgenic mice obtained were CD4 was expressed on all thymocyte subsets and all peripheral T cells. Krimpenfort et al. [US issued December 29, 1992] No. 5,175,384] substantially lacks mature T cells or plasma cells. Lost transgenic mice are described. PCT patent application WO 92/22645, published December 22, 1992, reports It is reportedly immunodeficient and more easily assembled from other species than wild-type mice. Describe transgenic mice capable of maintaining woven / organ transplants I have. Rahemtulla et al., [Nature, Vol. 353, pp. 180-184 ( 1991)] describe mice that do not express endogenous CD4. Fung-Leung et al., [Cell Vol. 65, pp. 443-449 ( 1991)] describe mice lacking expression of the endogenous CD8 molecule. Schilham et al., [Eur. J. Immunol., Volume 23, 1299-13 04 (1993)] is a mouse lacking expression of both endogenous CD4 and CD8. Is described.Sepsis Organisms and / or organisms in human blood or tissue Diseases caused by these toxins cause a condition known as sepsis. for example For example, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas as aeruginosa), Enterobacter aerogenes ) And Neisseria meningitidis Signs of sepsis include fever, diarrhea, decreased blood pressure, blood leaks and / or various organs. Disseminated blood coagulation. The mortality rate due to sepsis is about 35%. Aldridge, TIBTech, Vol. 11, pp. 373-375 (1993). ], It is estimated to reach 50% in septic shock. One significant form of sepsis is called septic shock, and individuals with sepsis Experiences a large drop in blood pressure. Treatment of septic shock requires immediate blood pressure recovery And typically bodily fluids and / or inotropic agents, and broad spectrum antibiotics It is performed by administering a substance. There are numerous toxins that have been identified as the cause of sepsis. Exo for these Toxins (toxins secreted by invasive organisms) and endotoxins (of invasive organisms) There are toxins that are components of the cell wall, such as LPS, or lipopolysaccharide. A group of exotoxins that have been thoroughly studied is Staphylococcus enterotoxin (Staphy lococcal enterotoxin) and related enterotoxins. These entertainment Rotoxin is used in various Streptococcus and grapevines. Produced by Staphylococcus to initiate an attack on the pathogen It is a protein that acts by the same mechanism that activates the body's immune system. EN Members of this group of telotoxins are known as "superantigens." MHCII And the mechanism of superantigen binding to T cells is different from that of other antigens different. Superantigen binds to T cell receptor and MHCII molecule simultaneously, Activates a large number of T cells regardless of the antigen binding specificity of T cells. This result As a result, a large amount of cytokine is released into the body, which eventually causes shock. The binding mechanism for normal antigens is extremely clear in a particular MHCII molecule. It is to connect to the correct groove. This antigen / MHCII complex is then extremely A highly specific T cell subset (ie, specific for a particular antigen / MHCII complex). T cells expressing a heterologous receptor on the surface of T cells, 10⁷1 with T cells Individual). Therefore, typically 40% of the total T cell population is In comparison with the reaction of superantigens that can act on Only a smaller number of T cells are activated. Although broad spectrum antibiotic therapy is often used to treat sepsis , Not always effective and shows many bad side effects. Depending on the cause of sepsis, Teroids have also been shown to regulate the activity of the immune system. Furthermore, for example, fresh Blood products such as frozen plasma or Anticoagulants such as heparin also activate the immune system's complement cascade, which leads to coagulation. It can be used to counteract the effects of sexuality. Mammals for in vivo evaluation of certain human diseases such as sepsis There is a need in the industry to develop animal models, which are (1) (2) It is very similar to the progression of the disease when it occurs in humans. It is like. The gist of the invention In one aspect, the invention provides a non-human mammal lacking endogenous CD4 and CD8 expression. Or a progeny thereof, wherein the mammal is human CD4 or its biological The nucleotide sequence consisting of the DNA encoding the active fragment and the HLA DQ locus Nucleus consisting of DNA encoding an allele or a biologically active fragment thereof The octido sequence has been inserted. In another aspect, the invention provides nucleotides that encode endogenous CD8 in mammals. Suppresses expression of sequence; nucleotide sequence encoding endogenous CD4 in mammals Suppress the expression of HLA DQ locus α and β chain alleles or organisms thereof Inserting a scientifically active fragment into a mammal; A mammal comprising inserting a nucleotide sequence for an active fragment into a mammal Also provided is a method for producing a product or a progeny thereof. In yet another aspect, the present invention provides a method of screening compounds for antiseptic activity. Also provided is a method for treating a mammal deficient in endogenous CD4 and CD8 expression. Mammals encode DNA encoding human CD4 or a biologically active fragment thereof. HLA DQ locus allele or its biology A nucleotide sequence consisting of DNA encoding the upper active fragment is inserted. ) To a compound or organism capable of inducing sepsis. And administer a therapeutically effective amount of the compound to this mammal to induce sepsis or septicemia. The method is characterized by screening a mammal for the condition. Brief description of the drawings FIG. 1 shows the expression of Lyt-2, the mouse CD8 gene (mCD8 − / −). The knockout construct used to suppress the disease is shown, the black box indicates the Lyt-2 ex Representing a song area (denoted by Roman numerals), it is shown with a shaded area to indicate the coding area. You. Neomycin phosphotransferase gene is indicated by hatching and selection The restriction enzymes used are also shown. Figure 2 is used to suppress the expression of the mouse CD4 gene (mCD4-/-). Showing the knockout constructs, neomycin phosphotransferase gene Are indicated by hatching. The black frame represents the exon of the mCD4 gene (Roman Numbers), also shows the selected restriction enzymes ing. FIG. 3 shows the method used to obtain human CD4 (hCD4) transgenic mice. 3 shows a transgene construct for use. hCD2 5'promoter region and And the 3'regulatory region of hCD2 with the hCD4 cDNA insert and hCD2 minidi (This hCD2 minigene contains hCD2 exon I genomic sequences and Composed of the hCD2 cDNA coding region for the rest of the offspring) And the selected restriction enzymes are also shown. Figure 4 is used to obtain double knockout double transgenic mice Showing a breeding system in which hCD4 is a human CD4 transgenic mouse , DQw6 represents a human DQw6 (α and β chain) transgenic mouse MCD4 indicates mouse endogenous CD4; mCD8 indicates mouse endogenous CD8 ( (Lyt-2 gene). The symbol "hCD4 +/-" is the hCD4 trans Means mouse heterozygous for Gene; the symbols "mCD4 / 8-/-" and "MCD4 / 8 +/-" is a heterozygous knockout of CD4 and CD8. Means us. Figure 5 shows ex vivo cells with different genotypes in newly killed mice. In T., the reaction or proliferation of T cells when stimulated while reducing the amount of SEB ( 3D shows the measured dose-response curve, as indicated by 3H thymidine incorporation. The concentration of EB is shown on the X-axis, and the black circles are dashes. Bull knockout double transgenic mouse (mCD4-/-, mCD8 − / −, DQw6 +, hCD4 +), and white circles indicate hCD4 transgene Having double knockout (mCD4 − / −, mCD8 − / −), and a black square Mark indicates C57BL / 6 wild type, white pentagon mark indicates double knockout mouse. doing. Detailed description of the invention The term "knockout" refers to a single mammalian cell, selected cells or Is at least a polypeptide encoded by an endogenous DNA sequence in all cells. It also means that part of the expression is partially or completely reduced. The term "knockout construct" refers to a DNA sequence that is endogenous to a cell in the cell. Nucleotides designed to reduce or suppress the expression of the encoded polypeptide Means an array. Typical nucleotide sequences used as knockout constructs (1) endogenous genes (exon sequences, intron sequences and / or From the part to be suppressed (motor sequence) and (2) knockout in the cell Is a marker sequence used to detect the presence of the genotype. Knockout configuration An object is inserted into a cell to prevent or interrupt the transcription of a native DNA sequence Such a position is integrated into the genomic DNA of the cell. This kind of insertion is generally a homologous set Caused by substitution (ie, when the knockout construct is inserted into the cell, of The regions of the knockout construct that are homologous to the DNA sequence hybridize to each other. So that the knockout construct is integrated at the corresponding position in the endogenous DNA. Recombination occurs). The nucleotide sequence of the knockout construct is (1) The entire exon and / or intron of one or more of the genes Preferably, a partial sequence, (2) the whole or partial promoter sequence of the gene to be suppressed, Alternatively, (3) they may be combined. Typically, the knockout construct is an embryo of the same species as the normally injected developing embryo. Are inserted into embryonic stem cells (ES cells), which are undifferentiated cells derived from It is integrated into the genomic DNA of ES cells by the same recombination method. Next, this ES The vesicles are injected into the developing embryo for integration. "Gene disruption", "gene disruption", "expression suppression" and "gene suppression" The expression refers to one region of an endogenous gene (generally one or more And / or a nucleotide sequence inserted in the promoter region of the gene Means to reduce or prevent the expression of that gene in. Insertion is general Is carried out by homologous recombination. For the purposes of the present invention, "gene", "nucleotide The terms "sequence" and "nucleic acid sequence" all refer to a polypeptide or polypeptide Means a sequence of nucleotides or codons encoding a fragment of As an example, Nucleotide sequence knockout constructs consist of an antibiotic resistance gene An endogenous DNA sequence (promoter and / or encoding Region) and insert into a part of a separated nucleotide sequence that is complementary to be able to. This isolated nucleotide containing an antibiotic resistance sequence construct When the sequence is inserted intracellularly, the construct is typically integrated into the genomic DNA . That is, many progeny of cells no longer express the gene in at least some cells Will not, or will only express this at reduced levels. Why Et al., Because the nucleotide sequence of the gene is destroyed by an antibiotic resistance gene It is. The term "marker sequence" refers to (1) the gene of interest (eg CD4 And / or CD8) disrupting expression of larger nucleotide sequence constructs ( A nucleotide sequence used as part of a "knockout construct"), And (2) as a means to identify cells that have integrated the knockout construct into their genome Means the nucleotide sequence used. Marker sequences are useful for these purposes. The sequence may be any sequence, but typically a protein that confers a detectable trait on the cell is Commonly found in a sequence to be carried, such as an antibiotic resistance gene or cell It is an enzyme that cannot be analyzed. If the marker sequence encodes a protein, the marker The Kerr sequence is typically a homologous or heterologous pro- gram that regulates expression of the marker. Mo Contains any of the data. The term “transgene” means that a promoter is operably linked to it One or more cells of the mammal or mammalian embryo, which need not be present Means an isolated nucleotide sequence inserted into. Transgene Homologous or non-homologous to a specific nucleotide sequence in an animal endogenous gene A nucleotide sequence of either sex or a hybrid sequence . (Ie, one or more parts of the transgene are mammalian genetics Is homologous to the offspring and one or more parts are non-homologous). Tiger The nucleotide sequence or polypeptide may be an endogenous polypeptide in a mammal. Can encode variants of the polypeptide and are not naturally present in mammals. Or can encode an exogenous polypeptide (ie, an exogenous polypeptide), or Can encode a hybrid of endogenous and exogenous polypeptides. G If the lance gene is operably linked to a promoter, this promoter will It may be homologous or heterologous to the entity and / or the transgene. Some Or, a promoter is an endogenous or exogenous promoter element (enhancer, silencer , Suppressor, etc.) can also be a hybrid. The term "CD4" is mainly expressed in helper T cells of mammalian species Cell surface glycoprotein, For MHCII molecules mainly bound to antigens and recognized by T cell receptors As a co-receptor, cellular signalling through recognition and binding It is believed to be involved in The human CD4 used here is wild-type May have an octido sequence, or may be insertable, deletable and / or substituted It can also be a possible variant. Similarly, mouse CD4 also contains wild-type nucleoti Can have an inserted sequence, or can be inserted, deleted and / or replaced It can also be a mutant. Insertable, deletable and / or position as used herein Substitutable variants include in particular allelic variants. The term "CD8" refers to two heterologous monomeric polypeptides in mammalian species. It means a cell surface glycoprotein composed of globulin. CD8 is mainly cytotoxic T cells Is expressed on the surface of M and is mainly bound to the antigen and recognized by the T cell receptor As a co-receptor for HCI molecules, through recognition and binding It is believed to be involved in cell signaling. Human C used here The D8 monomer can have wild-type α and β chain nucleotide sequences, or Or it may be insertable, deletable and / or replaceable variants thereof , In particular allelic variants. Mouse CD8 monomer is Lyt-2 and And the wild-type nucleotide sequence of the Lyt-3 gene, or Enterable, deletable and / or replaceable variants thereof It is also possible to include, in particular, allelic variants. The term "HLA DQ locus allele" refers to the human major histocompatibility gene multiplex. Mean class II (MHCII) means any or all variants of the DQ locus, which locus Includes all polypeptides or monomers in (ie α and β chains) And combine them to produce the final protein known as the product of the DQ locus. An example , The DQw6 allele is composed of α and β monomers, Taken together make up one allele product at the DQ locus. The term "operably linked" means the arrangement with respect to various nucleotide sequences, The elements can be functionally linked and interact with each other. This kind of element is limited Not defined, but one or more promoters, enhancers, polyadenylations Includes sequences and transgenes. Nucleotide sequence elements should be placed properly. Or, when they are operatively linked, they act together to regulate their mutual activity. Ultimately affect the expression level of the transgene. "Adjustment" is a specific By increasing, decreasing or maintaining the activity level of an element. Each for other elements The position of the elements can be represented by the 5'end and 3'end of each element, The distance between any given elements is the number of nucleotides or base pairs between the intervening elements. It can be shown by a number. The term "biologically active fragment" refers to a gene or Is a nucleotide shorter than the full-length genomic or cDNA nucleotide sequence of the transgene. Reotide sequence, which refers to a biologically active fragment of a gene (or transgene) Product has at least part of the biological activity of the full-length gene product. Means having a portion in a full-length nucleotide sequence that is long enough to have . "Rodent" means all phylogenetic rodent animals, from which future development occurs It includes all progeny. The term "murine" refers to all animals of the murine family, rat and mouse. Inclusive The term "progeny" refers to a particular mammal (ie, inserted into genomic DNA A mammal having a knockout composition) or a progeny of a future It means all generations. Thus any progeny in the generation of inheritance is included here And the progeny (ie, generations of F1, F2, F3 ...) are infinitely included in this definition. . The term “mammal” refers to all mammals other than humans, and refers to the progeny of the mammal. Is also included. The terms "immunomodulatory" and "immunomodulatory" refer to the immune system against a particular species. Means a change in the activity level of a particular ingredient compared to the average activity of that ingredient You. That is, immunomodulation as used herein means increase or decrease in activity. Immunomodulation involves B cells, T cells of any or all types, antigen presenting cells and And levels of all other cells that may be involved in immune function or It can be detected by analyzing the function. In addition or as an alternative, immune regulation (1) the expression level of a specific gene that is considered to have a role in the immune system, ( 2) For example, cytokines (interleukins, etc.) that have a role in the immune system Of specific compounds or other molecules such as) and / or (3) immunity It is also possible to evaluate and detect the levels of specific enzymes, proteins, etc. involved in system functions. it can. The term "sepsis" refers to organisms within the blood and / or tissues of mammals and And / or diseases caused by those toxins. The term "antiseptic effect" is used to reduce the symptoms of sepsis or the symptoms of sepsis. It means a situation that disappears. The term "therapeutic prescription" refers to a particular effect (ie, reduction of malignancy or illness). Treatment is planned to achieve this. This treatment is one Or more than one compound at the same time or at different times in the same or different amounts Administration in an amount. Alternatively or additionally, the treatment may be, for example It also includes giving other therapies such as radiation, specific diets, physical therapy.Knockout technology 1. Knockout gene selection The present invention provides for the disruption or knockout of at least two genes of the immune system. A living mammal is contemplated. I However, within the scope of the present invention, mammals in which more than two genes have been knocked out. Animals are also included. In the present invention, the genes to be knocked out or disrupted are CD4 and Selected from CD8. At least some sequences with respect to the gene to be destroyed Information to generate both knockout constructs and screening probes Have to get in order. Sequence information is provided by inserting a knockout construct It may be from a species other than the animal to be genetically engineered, but is preferably from each species. Provided by a species reasonably considered to be substantially homologous in their nucleotide sequence Is done. Generally, the nucleotide sequence containing the knockout construct is genomic DNA. One or more exons and / or intron regions from the sequence, And / or promoter region. However, the DN used A can be a cDNA sequence as an alternative, but the cDNA is large enough. And Generally, the DNA used in a knockout construct is at least about 1 kilo The length of the base (kb), preferably 3-4 kb, by which Homologous recombination for genomic DNA when a knockout construct is introduced into ES cells Alternatively, sufficient complementary sequence is provided for hybridization. Typically, to facilitate the production of double knockout mammals, One gene is knocked out from each of the two mammals. These feedings Next thing Mating each other and then mating the offspring to each other and finally knocked out. A single mammal having both selection genes is obtained. Or more than one from the beginning It is also possible to obtain a single mammal with the gene knocked out (even if For example, one or more knockout constructs are introduced into ES cells as described below). You can follow the above procedure when knocking out two or more genes . That is, we made several mammals, each with one knockout construct , One of these mammals with appropriate or all of the knockout constructs Cross and backcross to obtain dairy animals. As an example, a mouse that does not express any copy of gene A (ie Child A knockout; homozygous) and a mouse that does not express any copy of gene B. And a progeny "F"₁" Which is heterozygous for both mutations (ie two copies of both mutant genes). -[A +/-, B +/-]. Then descendants (F₁), If the genes are separated (Mendel's method), the offspring (F₂) 1/16 is the same for both mutations Type joining, that is, double knot out (that is, A-/-, B- / -). Staring mice with these genotypes by suitable analysis, It can be confirmed that there is no expression of each gene product. The nucleotide sequences that make up the knockout construct are, for example, Sambrook ( Sambrok) et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Gu Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N Y (1989)], using methods well known in the art. be able to. This type of method can be used, for example, to compare genomic clones to genomic sequences. Genomic DNA with a cDNA probe having an appropriate level of homology as defined. Includes screening of burreries. Alternatively, the cDNA sequence can be knocked out. The cDNA library was used as a part of the CDNA can also be obtained by screening with a tide probe or antibody ( If the library is cloned in an expression vector). The promoter sequence is A synthetic DNA probe containing a promoter sequence when used in a knockout construct Can be designed or suitable for screening genomic libraries Homologous promoters can also be used as screening probes. Other methods for obtaining nucleotide sequences containing knockout constructs include Engels et al. [Agnew Chem. Int. Ed. Eng., Volume 28, 716 ~ 734 (1989)], using the method described above to synthesize this sequence synthetically. Is to manufacture. These methods are especially the phosphotriester method of nucleic acid synthesis, Formamidai Method and H-phosphonate method. The nucleotide sequence containing the knockout construct is sufficient for subsequent genetic manipulation. You have to get the amount. Amplification of the nucleotide sequence to obtain the desired amount is (1 ) Bacteria or other organisms that can insert the sequence into a suitable vector and rapidly amplify the vector. Or by (2) PCR amplification, or (3) For synthesis using the method shown by Engels et al. (Supra) Can be done more.2. Knockout composition preparation Nucleotide sequences that include knockout constructs typically include a marker gene. Insert the new coding DNA sequence at the correct position within this nucleotide sequence. Cleavage at a position such that it is cleaved with one or more selected restriction enzymes Is done. Proper location of marker gene insertion also prevents native gene expression It is a position where it acts so as to decrease. This position is for example The position of the restriction site within the sequence, and the exon or promoter sequences or Whether it interrupts both (ie suppresses promoter function or Various factors such as the exact insertion position required to suppress the positive exon synthesis) Depends on the child. Preferably, the enzyme selected to cleave the DNA is a longer arm. And a shorter arm, the shorter arm of at least about 300 base pairs ( bP) length. In some cases, In fact, some or all of one or more exons of the gene to be repressed Removed to give the original genomic sequence when the marker gene was inserted into the knockout construct. It is desirable to have comparable knockout construction lengths. This In these cases, cut the genomic DNA with a suitable restriction endonuclease to obtain the proper size. Can be removed. Join the residual fragment with the marker sequence as follows: . Marker gene is any detectable and / or analyzable nucleotide sequence However, this is typically an antibiotic resistance gene or other gene The expression or presence in the genome of can be easily detected. Marker genes are generally active in their own promoters or inserted cells. Or to other powerful promoters from any source that can be easily activated. Be purposely combined. However, the marker gene is the promoter of the gene to be suppressed. Need to have its own promoter linked to be transcribed under the control of the data Absent. In addition, the marker gene is generally polyadenylated at its 3'end. (Poly A) sequence. This sequence acts to stop transcription of the gene. Suitable marker genes are eg neo (neomycin resistance gene) Any antibiotic resistance gene and β-gal (β-galactosidase) You. Nucleotide sequences containing knockout constructs are suitable After cleaving with the restriction enzyme, the marker gene sequence is prepared by a method well known to those skilled in the art. For example, it is bound as described in Sambrook et al. (Supra). Join together The ends of the DNA fragments that are present must be compatible with each other. This is a compatible end Either cleave the fragment with an enzyme that produces Is achieved by Blunt stumping is done by several methods well known in the art, such as This is done using the Klenow fragment (DNA polymerase I) filling in the sticky ends. The bound knockout construct can be directly inserted into embryonic stem cells (see below). Note), or after inserting into a suitable vector and amplifying before insertion. You can also. Suitable vectors are those that amplify rapidly in bacterial cells. , For example, pBluescript II SK vector (pBluescript II SK, Stra Stratagene, San Diego, CA or pGEM7 (Promega) -Promega Corp., Madison, WI).3. Transfection of embryonic stem cells The invention includes, but is not limited to, rat, hamster and mouse. Produce knockout mammals from non-human mammals of any species, including rodents Intend to do. Suitable rodents are rodents such as rats and Includes mice. Embryos commonly used to produce knockout mammals The sex stem cells (ES cells) are the same species as the resulting knockout mammal. Was For example, mouse embryonic stem cells are commonly used to obtain knockout mice. It is. Embryonic stem cells are described in, for example, Doetschman [J. Embryol. Exp . Morphol. , 87, pages 27-45 (1985)]. Can be obtained and maintained using methods well known to those skilled in the art. Although any ES cell line can be used, the cell line of choice is typically a developing cell line. By integrating with the germ line of the embryo inside and forming a part of it, the knockout Selected by the ability of the cell to carry the reproductive line of the plant constituent. That is, any ES cell line that appears to have this ability is used here. Suitable for One mouse strain typically used for the production of ES cells is 129J strain. The preferred ES cell line is the murine cell line D3 [US American Type Culture Collection , 12301 Park Lawn Drive, Rockville, MD 20852, Kata Log No. CRL 1934]. The cell inserts the knockout construct For example, Robertson [Teratocarcinomas and Embryonic St em Cells: A Practical Approach, E. J. Edited by Robertson, I RL Press, Washington, D.M. C. (1987)] or Bradley (Brad ley), etc. [Current Topics in Devel. Biol. , Vol. 20, 357-371 (1986)], or Ho Hogan et al. [Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Code Lud Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring -Harbor, NY (1986)] by methods well known to those skilled in the art. Nourished and made. Insertion of the knockout construct into ES cells is for example performed by electroporation. (Electroporation), microinjection (microinjection) and calcium phosphate It can be carried out by various methods known to those skilled in the art including sium treatment [ Robert-Badge, edited by Robertson, see above] . The preferred method of insertion is electroporation. Each knockout construct to be inserted into a cell must first be linear. Must. Therefore, if the knockout construct was inserted into the vector , Only in the vector sequence and not in the knockout construct sequence. Cleavage by cutting with an appropriate restriction endonuclease chosen not to. For insertion, the knockout construct was selected into ES cells as known to those of skill in the art. Add under conditions appropriate to the chosen insertion method. ES cells with one or more constituents When introducing, knock-out components should be introduced at the same time or separately. Can be. If ES cells are to be electroporated, the ES cells and knockout Using the component DNA as a guide for the manufacturer using an electroporation device Apply an electric pulse accordingly. After electroporation, typically ES The cells are harvested under suitable incubation conditions. Then knock out the cells. Screen for the presence of products. Screening can be performed using various methods. The marker gene is anti If it is a biomaterial resistance gene, culture ES cells in the presence of a lethal concentration of antibiotics. Can be nourished. The surviving ES cells probably have a knockout construct incorporated. Have been. If the marker gene is other than the antibiotic resistance gene, ES cells Hybridize to marker sequence only by Southern blot of genomic DNA Can be probed with a sequence of DNA designed to. Alternatively, use PCR Can also be used. Finally, the marker gene If it is a gene encoding β-galactosidase, an enzyme substrate is suitable. It can be added to cells under conditions and assayed for enzymatic activity. Those skilled in the art will find other useful It is familiar with markers and means for detecting their presence in a given cell. This species Are intended to be included within the scope of the invention. Knockout constructs are integrated at several positions in the ES cell genome and Due to the occurrence of insertion phenomenon, each ES Will be integrated at different positions in the cell genome. The desired insertion position is It is a position complementary to the DNA sequence to be cut out. Typically, a knockout Approximately 1 to less than 5% of the ES cells that have taken up the It is installed at the desired position. ES with proper integration of knockout components To identify the cells, total DNA is extracted from the ES cells, eg, Sambro ok) et al. (supra) and extracted using standard methods. Then A specific pattern for DNA cleaved by a specific restriction enzyme By Southern blot using a probe designed to hybridize with To probe. Alternatively or additionally, genomic DNA may be distributed to a specific size and size. By PCR using a probe specifically designed to amplify the DNA fragments in the row It can also be amplified (ie it has a knockout construct in place) Only such cells produce DNA fragments of the correct size).4. Embryo injection / transplant After identifying suitable ES cells with the knockout construct in the correct location, These cells are inserted into the embryo. Insertion can be accomplished by a variety of methods known to those of skill in the art. However, the preferred method is the microinjection method. Micro Injector In this, about 10 to 30 cells are collected in a micropipette, and this is used for proper growth. Foreign ES cells with knockout constructs injected into staged embryos Integrate with the developing embryo. Although the appropriate developmental stage of the embryo used for ES cell insertion is highly species-dependent, It is about 3.5 days in mice. Embryos obtained by perfusing the uterus of a pregnant female Can be Suitable methods for doing this are known to the person skilled in the art and are described in Bradley. ley) [edited by Robertson, supra]. Suitable embryos are males, although any embryo of suitable age / developmental stage is suitable for use . In the mouse, the preferred embryo has a different coat color than that encoded by the ES cell gene. It can also have a gene encoding a hair color. In this way, descendants Easily screen for the presence of knockout constructs by searching for the coat color (This indicates that the ES cells have integrated into the developing embryo). Was For example, when the ES cell line has a gene for white hair, the selected embryo is black hair. Alternatively, it has a brown hair gene. After the ES cells are introduced into the embryo, they are transferred to the uterus of a pseudopregnant foster mother to make the embryo pregnant. Can be transplanted. Although any foster parent can be used, typically the foster parent is well-growth. The ability to increase and take care of the child. This type of foster parent is typically made by mating with a vasectomized male of the same species. false The status of the first-gestation mother is critical to the success of the transplant, which is species-dependent. With a mouse This stage is a pseudopregnancy of about 2-3 days.5. Screening for the presence of knockout genes Screen the offspring born from the foster mother first with the mosaic hair color. And the hair color selection technique (described above) can be used. In addition or Alternatively, DNA from the tail tissue of the offspring can be cloned into a Southern blot as described above. And / or PCR for the presence of knockout constructs be able to. Offspring that appear as mosaics will knock out on the reproductive line. If they are believed to have a product, they are mutated to obtain homozygous knockout animals. Let it mate. If it is unclear whether the offspring have transmission of the reproductive line , Cross these with the parent or other strains and screen the offspring for heterozygosity. Can be used. As described above, the heterozygote is a Southern blot of DNA. And / or PCR amplification. The heterozygotes are then bred to each other to obtain homozygous knockout progeny. Same type The zygotes are derived from mice that are the result of this mating, as well as known heterozygotes and fields. Southern blotting of a substantial amount of genomic DNA from a live mouse Can be identified. The probe to screen the Southern blot is above It can be designed as described. Other means of identifying and characterizing knockout progeny are possible. For example no Knockout genes, marker genes, or both using Zan-blot Nozomi MRNA can be probed in the presence or absence of a transcript encoding it. Can be. In addition, Western blot was used to analyze various tissues of these offspring. The expression level of the knockout gene can also be evaluated by The blot is probed with an antibody against the protein encoded by the knockout gene. Or antibody against the marker gene product expressing the marker gene. Robe. Finally, in situ analysis (eg And FACS (fluorescence) of various cells from progeny Marker-based cell sorting) analysis is performed using a suitable antibody to determine the gene for the knockout construct. It is also possible to search for the presence or absence of the product.Transgene technology 1. Transgene selection Typically, the transgenes useful in the present invention are immune reactions, hematopoiesis, inflammation, cell proliferation. And polypeptides involved in proliferation, cell line differentiation and / or stress response Is a nucleotide sequence encoding The preferred transgene is the human immune system. Contains all allelic forms of the lipopeptide (eg CD4) and the HLA DQ locus. It is a thing. Particularly preferred transgenes are the human CD4 and HLA DQ loci. Allele DQw6 (both α and β chains). Within the scope of the invention is the inclusion of two or more transgenes in a mammal. Insertions are also included. The transgenes useful in the present invention can be individually prepared and inserted, or It can also be obtained together as a single component for insertion. Transgene A promoter and / or selected to drive expression of each transgene It is homologous or heterologous to both mammals. In addition, Transgene Can be a full-length cDNA or genomic DNA sequence, or at least some Biological activity of non-transgenic mammals of the same species that are wild-type Some level of effects not readily observed in animals (biochemical, cytological and / or (Or morphologically) any of those fragments, subunits or variants Good. If necessary, the transgene can be a hybrid nucleotide sequence. That is, that is, homologous and / or heterologous cDNA and / or genomic It can be one composed of nom DNA fragments. Further Tran The Sgene may be one or more naturally occurring CDNA and / or Or may be a variant of the genomic sequence, or an allelic variant thereof . Each transgene uses one or more methods well known in the art. It can be obtained by separating in an appropriate amount. Used to separate transgenes These and other methods for mbrook) et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring ・ Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)], and Berger and Kimmel [Method. s in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Volume 152, Aka Demic Press Corporation, San Diego, CA (1987) ]. If the nucleotide sequence of each transgene is known, the transgene is Physically or partially, for example as described in Engels et al. Synthetic method [Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 28, 716-734 ( 1989)]. These methods are especially useful for nucleic acid synthesis. The ester method, the phosphoramidite method and the H-phosphonate method are included. Some Is a transgene that selectively hybridizes with transgene DNA. Or more nucleic acid probes (acceptable for the transgene to be cloned) Oligonucleotides, cDNAs or genomic DNAs with different levels of homology Fragment) to screen the appropriate cDNA or genomic library. It can be obtained by Another suitable method for obtaining a transgene is the polymerase chain reaction (PCR ). However, to use this method successfully Nu no n Sufficient information about the nucleotide sequence is available for amplification of the appropriate nucleotide sequence. Must be available to design useful and suitable oligonucleotide primers It is. The method of choice was the use of oligonucleotide primers or probes. For example, PCR, screening of cDNA or genomic library) , The oligonucleotide selected as the probe or primer. Nonspecific binding that occurs during library screening or PCR Should be of sufficient length and of sufficient clarity to minimize the amount of You. The actual sequence of the probe or primer will generally not be identical to that of other organisms. Or, if there are conserved or highly homologous sequences of similar genes, Ku is based on area. If necessary, degenerate the probe or primer (de You can also generate). Predictable and functional if only the amino acid sequence of the transgene is known A different nucleic acid sequence using known suitable codons for each amino acid residue. Can also be estimated. This sequence can then be chemically synthesized You. The invention also includes the use of mutated transgene sequences. Mutated tiger Nsgene has one or more nucleotide substitutions relative to the wild-type sequence. , Transgenes having deletions and / or insertions. Nu Cleotide substitutions, deletions and / or insertions are amino acids that differ from the wild type amino acid sequence. Gene products (ie, proteins) that differ in acid sequence can be generated. This kind of mutation Body preparation is well known in the art, for example, Wells et al. [Gene, Vol. 34. , 315 (1985)] and Sambrook et al. (Supra). Have been.2. Choice of regulatory elements The transgene of the invention is typically operably linked to a promoter and The data has been selected to regulate the expression of each transgene in a particular way. Each transgene can be regulated by the same or different promoters . Selected promoters are homologous (ie transgene-transfected) The same species as the mammal) or heterologous (ie transgene to trans (Species different from the mammalian species to be affected). For example, for each promoter Source can be from any single cell, prokaryotic or eukaryotic organism, or Can be from any vertebrate or invertebrate. The present invention A more preferred promoter of E. coli is, for example, the human CD2 promoter or human CD4 promoter. Lomota, HLA DQw6 α and β promoters, mouse CD4 promoter P, mouse^lckPromoter, mouse IE α promoter and mouse H-2^kIn humans and mice that regulate the expression of genes in the immune system, such as promoters There is a promoter. Especially good Suitable promoters include the human CD2 promoter and the HLA DQw6 α and It is a β promoter. The promoter of the present invention can be used alone, but more precise regulation of expression can be achieved. Homology and / or non-homologous enhancers and / or services to allow It can be used in combination with a silencer. The nucleotide sequences of promoters in the present invention may be any of several well-known in the art. It can be obtained by the method. Typically, promoters useful in the present invention are pre-defined Has been identified by wrapping and / or restriction endonuclease cleavage, Therefore, genomic DN of the appropriate tissue source using appropriate restriction endonucleases Can be separated from A. In some cases, the promoter is sequenced May be. For promoters with known nucleotide sequences, use this promoter The data can be synthesized by the methods described above for transgene synthesis. If all or only part of the promoter sequence is known, use PCR Alternatively, the genomic library may be a suitable oligonucleotide and / or Or by screening with promoter sequence fragments from different species. Data can be obtained. If the promoter sequence is unknown, the DNA fragment containing the promoter is Isolated from larger pieces of DNA containing coding sequences or other genes, for example Do Can be. If the isolation is one carefully selected to isolate the correct DNA fragment, Or by restriction endonuclease digestion with more enzymes. You. After cleavage, the desired fragment was purified by agarose gel [Qiagen® ) Column (Qiagen Corp., Chatworth, CA)] or other methods known to those skilled in the art. Achieve this goal The selection of suitable enzymes for is already obvious to the person skilled in the art.3. Selection of other vector components In addition to transgenes and promoters, the transgenes of the invention are prepared. Vectors useful for Optimal expression of the transgene, and (2) bacterial or mammalian host cells. Cell containing one or more other elements useful for amplification of the vector in the cell. Have. Each of these elements has its own Appropriately placed in the vector for the element. This kind of arrangement is well known to those skilled in the art. I have. The following elements can be included in the vector as needed. i.Signal array element Embodiments of the invention which secrete the polypeptide encoded by the transgene In some cases, the presence of a small polypeptide, often referred to as a signal sequence, It was synthesized as a polypeptide encoded by The cells to move out. Typically, the signal sequence is In the coding region of Sgene, the direction of the 5'end or the position of the 5'end of the coding region Place it in the table. Many signal sequences have been identified, are functional and Anything that is compatible with the transgenic tissue will bind to the transgene and Can be used. Thus, the nucleotide encoding the signal sequence The sequence may be homologous or heterologous to the transgene, and It is also homologous or non-homologous to the transgenic mammal. In addition, Cigna The nucleotide sequence encoding the nucleotide sequence is chemically synthesized using the methods described above. You can also. However, a signal sequence suitable for the purposes of the present invention is a trans It exists naturally with the gene (ie homology to the transgene) Is). ii.Membrane anchoring domain element In some cases, transgenes expressed on the surface of specific intracellular membranes or on the plasma membrane It is desirable to obtain A naturally-occurring membrane protein anchors the protein on the membrane. It has a range of acting amino acids as part of the polypeptide. However, For proteins not found naturally on the membrane, this range of amino acids is used. In addition, this feature can be added. Often, the fixed domain is a polypeptide. Nucleotide sequence that is internal to the Transgene Nucle Insert into the internal region of the octido sequence. However, in other cases, the fixed domain 5'of the transgene nucleotide sequence or It can also be attached to the 3'end. In this case, the nucleo that encodes the fixed domain The tide sequence is designed differently than the nucleotide sequence encoding the transgene. Insert at the appropriate position in the vector as a minute. Fixed, as with the signal sequence The domain can be from any source and therefore the transgene or Homologous or non-homologous to both transgenic and transgenic mammals . Alternatively, the fixed domain can be chemically synthesized using the methods described above. iii.Origin of duplicate element This component is typically part of a commercially available prokaryotic expression vector purchased, Promotes amplification of vector in host cells. The selected vector is the replication site If it has no lysine moiety, it is chemically synthesized based on the known sequence and ligated into the vector. Can be combined. iv.Transcription stop element This element, also known as the polyadenylation sequence or polyA sequence, is typically Is located 3'to the transgene nucleotide sequence in the vector and Acts to stop transcription of the gene. The nucleotide sequence that encodes this element Rows are easily cloned from the library or marketed as part of the vector. Has been sold It can be purchased, and it also contains nucleotide sequences such as those described above. It can be easily synthesized using a column synthesis method. v.Intron element In many cases, transcription of the transgene will result in one or more genes on the vector. Increased by the presence of the tron. Intron, especially transgene is genome D If it is the full length or a fragment of the NA sequence, the It is a natural occurrence. Introns naturally occur within nucleotide sequences If not (most cDNAs), introns can be obtained from other sources. it can. Introns are transgene and / or transgenic mammals Homologous or non-homologous to things. Pairs with promoters and transgenes The position of the intron is important. Because the intron is valid It must be transcribed. For example, transgene is a cDNA sequence , The preferred position of the intron is 3'to the transcription start site, 5'to A transcription termination sequence. Preferably in the cDNA transgene, Trons are on one or the other side of the transgene nucleotide sequence (ie, Position 5'or 3 ') and do not interrupt the transgene nucleotide sequence. To be. Includes virus, prokaryotic and eukaryotic (plant or animal) organisms What intron from any source Can also be used to practice the invention, provided that the intron is inserted. It must be compatible with the host cell in which it will be administered. Furthermore, the present invention provides a synthetic intro Are also included. If necessary, use more than one intron in the vector. Can also be. vi.Selectable marker elements Selectable Marker Genes Transfected in Selection Medium It encodes a protein required for cell survival and proliferation. Typical selectable marker inheritance The offspring are (a) antibiotics or other toxins, such as those for prokaryotic host cells. For ampicillin, tetracycline or kanamycin and mammalian cells Confers resistance to neomycin, hygromycin or methotrexate (B) reinforce the auxotrophy of the cell; or (c) eg this gene. Contains a D-alanine racemase encoding a Bacillus culture. Encodes proteins that provide important nutrients not available from complex media, such as genes doing. All of the above elements, as well as other elements useful in the invention, are well known to those of skill in the art, For example, Sambrook et al. [Molecular Cloning: ALaboratory Manua l) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Pulling Harbor, NY (1989)] and Berger et al., [Gu ide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press Inco Corporation, San Diego, CA (1987)].4. Vector production The most useful vectors for producing transgenic mammals according to the present invention are Vectors that are compatible with nuclear cell hosts. However, eukaryotic host cells Vesicles and vectors compatible with these cells are also within the scope of the invention. In some cases, some of the various vector elements, such as pUC18, pUC 19, pBR322, pGEM vector (Promega Corporation (Promeg a Corp.), Madison, WI), for example pBLISK +/− -Script (pBluescript, registered trademark) vector, [Stratgene Corp. Already available from Stratagene Corp., La Yorra, CA, etc. There are possible vectors, all of which are suitable for prokaryotic cell hosts. this In some cases, it is only necessary to insert the transgene into the vector. However, one or more elements to be used are already present in the vector. If not present, these are individually obtained and ligated into the vector. Each element Methods for obtaining and linking these are well known to those of skill in the art, and transgene is obtained. Is the same as the method described above (ie, DNA synthesis, library screening Cleaning etc.). Amplify transgene nucleotide sequences and / or clone mammalian embryos. The vector used to transfect is constructed by methods well known in the art. Made. This type of method is, for example, a DNA and / or RNA restriction endonuclease. Clease cleavage, ligation, purification on agarose and acrylamide gels Of DNA, DNA and / or RNA by column chromatography, DNA Phenol / chloroform extraction, DNA sequencing, polymerase chain reaction Amplification, including standard techniques such as those shown in Sambrook et al. (Supra). I do. The final vector used to practice the invention is typically available, for example, It is made from a starting vector such as a commercially available vector. This vector is a complete vector. It may or may not contain some elements to be included in the actor. If none of the desired elements are present in the starting vector, then add each element individually to the vector. Can be ligated into the vector at the end and base of the element to be ligated into the vector. The vector is designed with suitable restriction endonucleases so that the ends of the This can be done by cutting with ase. In some cases, satisfactory results In order to obtain a match, the ends to be joined together must be "blunted". It is necessary. The blunting is first performed by creno-cleavage in the presence of all four nucleotides. C DNA polymerase or T4 DNA polymerase It is done by filling in the "sticy end" with. This method Well known in the art and described, for example, in Sambrook et al. (Supra). Have been. Alternatively, first enter two or more elements to be inserted into the vector. To each other (if they are placed next to each other) and then into the vector. Combine. Another way to create a vector is to combine all of the various elements in one reaction. It is to do it simultaneously in the mixture. In this case, improper combination or insertion of each element Import gives more nonsense or non-functioning vector, but works Vectors can be identified and selected by restriction endonuclease cleavage. Once the vector is constructed, it is transferred to a prokaryotic host cell for amplification. You can Cells typically used for amplification are E. coli. ) DH5-α [Gibco / BRL], Grand Island, NY ] And other E. coli strains with similar properties to DH5-α You. When using mammalian host cells, for example, Chinese hamster ovary cells. Cells [CHO cells; Urlab et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 77th Vol. 4216 (1980)] and human embryonic kidney cell line 293 [Graham. (Graham) et al. Gen. Virol., Vol. 36, p. 59 (1977)], etc. Line is suitable ing. Transfection of vector into selected host cell lines for amplification For example, calcium phosphate method, electroporation method, microin Injection method, lipofection or DEAE-dextran It can be performed using: The method chosen should, in part, be transfected It depends on the type of host cell. These and other suitable methods are well known to those of skill in the art. And is shown in Sambrook et al. (Supra). Sufficient time (typically E. coli) for sufficient amplification of the vector After culturing the cells overnight, the vector (often at this stage Cells) and are purified from the cells. Cells are typically lysed and The sumid is extracted from other cell contents. Suitable methods for plasmid purification are especially The potassium lysis mini-prep method [Sambro ok) etc. above].5. Preparation of insertion plasmid Plasmids containing the transgene are typically selected prior to insertion into the embryo. The resulting restriction endonuclease is made into a chain. In some cases, transgene Separate promoters and regulatory elements from other parts of the vector as chain fragments By transgene, promoter, intron (use only one If you do), Enhancer, poly A sequence and optionally signal sequence or membrane anchoring domain It is preferable to inject only the chain nucleotide sequence containing and into the embryo. This is The plasmid is cut to remove the nucleic acid sequence region containing these elements, and Can be purified by agarose gel electrophoresis or other suitable purification method. Wear.6. Production of transgenic mammals The particular strain of mammal used to practice the invention is generally in good health. , Good embryo yield, good pronucleus visibility in embryo and good fertility I do. Furthermore, the haplotype is an important factor. For example transgenic When producing a mouse, for example, C57BL / 6 or C57BL / 6 x D BA / 2 F₁, Or strains such as FVB strains are often used [char Charles River Labs, Boston, MA, Jackson -The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME or It is commercially available from Taconic Labs.]. Preferred stock Is H-2 such as C57BL / 6 or DBA / 1^b, H-2^dIf Is H-2^qIt has a haplotype. System used to carry out the present invention You can be transgenic yourself and / or knock out That is, having one or more genes that are partially or completely suppressed Mammal). Preferred In other words, the same strain is used for the first knockout mammal and the transgenic mammal. Used to make both animals. This allows for subsequent mating and backcrossing Be more efficient. The age of the mammal used to obtain the embryo and use it to act as a surrogate host It depends on the species of the animal, but is easily determined by a person skilled in the art. Use mouse for example If so, pre-adolescent females are preferred. Because they produce more embryos In addition, it responds well to hormone injection. Similarly, male mammals used as seed animals generally have different selection criteria. Of these, it is selected according to the age of sexual maturity. Hormones to females for egg production, mating, and / or reimplantation of embryos It is necessary to administer other compounds. Hormone / cofactor types and uses The amount, as well as the timing of hormone administration, will vary with the species of mammal. Of this kind Consideration will be readily appreciated by those skilled in the art. Pretreated females (ie, females that produce fertile eggs) are typically sire And then the resulting fertilized embryos are removed for transgene transfer. Some Eggs and sperms are obtained from suitable females and males, fertilized in vitro, It is also possible to obtain embryos suitable for the introduction of insulin. In general, fertilized embryos will appear in a suitable medium until the pronuclei appear. Incubate with At about this point, the nucleotide containing the transgene Sequences are introduced into female or male pronuclei as described below. For example, like a mouse In some species, the male pronucleus is preferred. Introduction of the transgene nucleotide sequence into the embryo is accomplished by any method known in the art. Stages, such as microinjection, electroporation or lipo It can be done by ffection. Transgene nucleotide distribution in the embryo Incubate the embryos in vitro for various times after introducing the row, or Alternatively, it can be reimplanted into a surrogate host, or both. Mature In vitro incubation up to is also within the scope of the invention. One common The method involves incubating embryos in vitro for about 1-7 days depending on the animal species. And then reimplant them into surrogate hosts. Reimplantation is done using standard methods. Generally, the surrogate host is anesthetized and then Insert the embryo into the oviduct. The number of embryos transferred to a specific host varies depending on the animal species However, this species is generally comparable in number to the natural offspring. Transgenic offspring of the surrogate host may be transduced by any suitable method. Screened for the presence and / or expression of the gene. Screeninin Often analyzed by Southern or Northern blot analysis. It is performed with a probe that is complementary to at least a portion of the gene. G Lance Jean Western blot analysis using antibodies against the protein encoded by Alternative or additional method for screening for the presence of transgene products Can be used as a law. Typically, the DNA is tail tissue (about 1 from the tip of the tail). cm), and analyze the transgene by Southern analysis or P Analyze by CR. Also, any tissue or cells should be used for this analysis. Tissue that appears to express the transgene at the highest level, or Cells were analyzed for the presence and expression of the transgene using Southern analysis or PCR. Test for Alternative or additional methods of assessing the presence of the transgene include, but are not limited to For example for enzyme and / or immunological analysis, for specific markers or enzyme activity For histological staining, flow cytometry (flow cytometry) analysis, etc. Including any suitable biochemical assay. Analysis of blood is also a transgene in blood Detection of the presence of product and the level of each type of blood cell and other blood components It is useful for assessing the effects of transgenes on. Progeny of transgenic mammals suit transgenic mammals Eggs and eggs obtained from a transgenic mammal that are mated with the other And / or fertilization of sperm in vitro. Opponent When mating with It may or may not be transgenic and / or knockout. Trance If transgenic, this may be the same or different transgene or both. Will contain the person. Alternatively, the other party may be a parent line. In vitro receiving When using the sperm, either transfer the fertilized embryo into a surrogate host or in vitro. It can be cuvated, or both. Which method is used In addition, the progeny were tested for the presence of the transgene by the methods described above or other suitable Evaluate.Knockout / transgenic mammal production Containing one or more knockout constructs and / or one or more transgenes The mammal having is produced by any of several methods. Suitable work The manufacturing method depends on the desired knockout composition or transgene. To obtain a series of mammals containing Totsutsu. A series of such mammals Breed each other by crossing, backcrossing and selection to finally get all the desired knocks A single mammal containing the out-composition and / or transgene is obtained. This mammal has the presence of knockout constructs and / or transgenes. Except that, it is congenic (genically identical) in all other respects with the wild type. You. As an example, FIG. 4 shows CD4, CD8 double knockout (mCD4-/-, mCD8 − / −) and two transgenes (human DQw6 α and β). Chain [DQw6] and human CD 4 [hCD4]) has been shown to show a breeding system for obtaining mice. Typically, crosses and backcrosses meet the goals of each particular stage of the breeding process. Then, the offspring is crossbred with the sibling strain or the parent strain. In some cases, each The knockout construct and / or the transgene are in the correct position in the chromosome. It will be necessary to obtain multiple offspring to obtain a single offspring. for example For example, the murine genes encoding CD4 and CD8 are relatively close on the same chromosome. Is located. That is, both knocked out CD4 and CD8 There are essentially two practical options for obtaining mice with. First, single Of CD4 and CD8 knockout constructs into ES cells of In the same ES cell, each construct was assembled on the same chromosome. And then the ES cells are properly integrated into the embryo so that the ES cells I hope it will be inserted into. All these phenomena get the end product The probability that it will occur as a necessary thing is extremely low. Alternatively, one contains the CD4 knockout construct and the other contains the CD8 knockout Two knockout mammals containing out constituents can be obtained. Next Then, these mammals are first bred, and then both knockouts on the same chromosome. The offspring are mated and screened until offspring containing the Mouse smell Therefore, this result shows that the crossover phenomenon is at the proper position, that is, the CD4 gene. It cannot be obtained unless it occurs with the CD8 gene. Because CD4 and And the genes encoding CD8 are located on the same chromosome). In each case, screen 100 or more offspring from several crosses. For proper staining of knockout constructs and / or transgenes It is necessary to identify the single mammal that contains the body location.Use of transgenic / knockout mammals The mammals of the invention and their progeny are expressed transgenes and these Has various uses depending on the knockout composition contained therein. Using mammals For the prevention or treatment of diseases such as sepsis or other immunological disorders. The appropriate drug or treatment regimen can be screened. Useful drugs Cleaning first causes disease in mammals (ie, defeats mammals). Exposed to pathogens or toxins that cause blood disease), followed by a wide range of candidate drugs Administered to mammals at doses of Including analyzing the effects of the drug on. Alternatively or additionally, It can also be given before or at the same time as being exposed to the induction of qi. In addition to screening for drugs used to treat diseases or conditions, Ming Ming is a disease or illness It is also useful in designing a therapeutic regimen aimed at preventing or healing the condition You. For example, mammals to specific diets, exercises, radiation treatments and / or 1 Onset of disease or symptom in combination with species or more compounds or substances It can be prescribed before or at the same time as or after. This kind of overall Treatment or regimen overcomes the disease or symptom over treatment with the compound alone. May be more effective at Assays to assess the efficacy of compounds and / or therapeutic regimens can be performed, for example, on T cell and And B cell levels increased or decreased, immunoglobulin production increased or decreased , Chemical messages such as cytokines (eg tumor necrosis factor) Gene levels associated with increased or decreased levels of larval and / or immune responses Including an increase or decrease in the expression level of the offspring. Further blood pressure, body temperature, body Criteria such as weight, heartbeat, behavior, hair appearance (ruffled fur) are also evaluated Can be valued. For example, patients with sepsis often have lower blood pressure, fever, weight loss and / or Experiences blood clotting. To prevent or reduce this kind of thing for the patient It is desirable to administer an effective therapeutic agent. Various compounds can be prepared using the mammal of the present invention. Screening of the products alone or in combination may show signs of such diseases. A determination can be made as to whether the appearance of symptoms is reduced or alleviated. In addition, the mammals of the present invention evaluate the development of the immune system and identify mutations in specific genes. It is also useful for examining the effect. The transgenic knockout mammal of the invention may be one or more Can also be used to obtain cell lines. Such a cell line For example, the effects of transgene knockout on specific tissues or organs Evaluate compounds that may affect the level of transgene activity in tissues It has many uses such as screening. This kind of compound is It is useful as a therapeutic agent for controlling the activity of the protein. The production of this type of cell line can be performed by various methods known to those skilled in the art. Wear. The actual culture conditions depend on the tissue and cell type to be cultured. On cells Undue experimentation to determine optimal conditions for cell growth and proliferation Different concentrations of macro and micro nutrients, growth factors, serum, etc. Various media containing can be tested. Similarly, eg cell density, medium Other culture conditions such as temperature and carbon dioxide concentration in the incubator are easily evaluated Can be valued. It is possible to modify and identify compounds that affect this process. is there. Other uses for the present invention will be readily apparent to those skilled in the art. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples in no way limit the scope of the invention. Example Example 1CD8 knockout mouse The mouse strains C57BL / 6, BALB / c and DBA were used, which Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) Purchased from. Approximately 2.2 kb (kilobase) containing exons 1 to 3 of the Lyt-2 gene The HindIII-BamHI DNA fragment of the mouse genome was isolated and isolated with the CD8 knockout. Used as starting material for quout composition. Cleave the fragment inside exon 1 It was cut with EcoRI. Bacterial neomycin resistance gene (neo) Inserted at the coRI site. The neoDNA construct is the plasmid pMCIneoP olA [Thomas et al., Cell, Vol. 51, p. 503 (1987)] The above plasmid is cleaved with a restriction endonuclease to extract neoDNA, Obtained by purification. A schematic diagram of this construct is shown in FIG. Check the composition DNA constructs, after amplification in E. Coli cells. Smid was purified by standard alkaline lysis and CsCl gradient purification . After purification of the plasmid, the Lyt-2 / neo construct was restricted with the endonuclease. It becomes a chain by cleavage and then next To electroporate D3 murine embryonic stem cells using electroporation [Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morph. , 87, pp. 27-45 (1985)]. About 5n for electroporation Molar chained constructs were added to about 5 x 10 in about 800 μl volume of medium.⁶ES ES Was added to the cells. Pulse these cells at approximately 0.34 kilovolts and 250 μF Treat cells in each vial with embryonic fibroblast feeder cells It was placed in two 10 cm cell culture plates containing. These culture plates are 1% Pre-coated with gelatin, these plates are 15% fetal bovine serum [gib Co / BRL (Gibco / BRL), Grand Island, NY or High Clone ・ Equivalent from Labs (Hyclone Labs), Logan, UT] and leukemia growth arrest Factor [Fung-Leung et al., Cell, Volume 65, 443-449 Page (1991)] and 10 ml of DMEM medium [Gibco / BRL (Gibc O / BRL), Grand Island, NY]. 2 days later, about 25 Initiate neo selection by adding 0-300 μg / ml of antibiotic G418 to the culture Then, the medium was replaced almost every two days. Almost all cells survived in the presence of G418 , Containing a knockout construct having the neo gene in the proper orientation for expression ing. These cells are then screened and the knockout construct is DN Make sure it is built into A Was. Screening was performed using PCR. The D3 cells containing the Lyt-2 / neo knockout construct were Entrusted to the American Type Culture Collection Deposited under the number CRL-11116. Cell lines containing the Lyt-2 / neo construct were transferred to Robertson (Robertso n) [Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell: A Pra ctical Approach, IRL Press, Washington, D.C. C. (1987)] Therefore, trypsin treatment allows microinjection into murine embryos. I'm sorry. Injected embryos perfuse the uterus of female mice mated with male mice Is a 3.5-day-old embryo obtained by. After injecting embryonic stem cells into embryos, transplant these embryos into pseudopregnant females to continue pregnancy did. Mutants to detect progeny knockouts in mice with each other Were bred with mice with suitable coat color. The progeny of these mice were probed with a probe designed to detect the neo gene. Probe a Southern blot of DNA obtained from tail tissue using It was evaluated for the presence of the porcine composition. Example 2:CD4 knockout mouse Mouse geno spanning part of intron 4 and full length of exons 4, 5 and 6 An approximately 2.8 kb fragment of the CD4 cDNA sequence was isolated. Poly A stop signal And chimi A 1.2 kb fragment containing the gin kinase promoter (from herpes simplex virus). The fungal neomycin phosphotransferase gene construct was labeled with XhoI and Sa The plasmid pMCIneoPolA [Thomas (Thomas ) Et al., Cell, Vol. 51, pp. 503-512 (1987)]. neo- The poly A insert was isolated and then pre-populated with KpnI, which is directed against the CD4 transcription direction. It cuts the inner part of exon 5 in the antisense direction, but it cuts it with KpnI. It bound to the truncated CD4 construct. The resulting knockout composition is shown in FIG. The construct was amplified in E. coll cells and then the plasmid containing the construct was amplified. The sumid was purified. The knockout construct is chained by restriction endonuclease cleavage, then D NA was purified. Then, about 5 nmole of this DNA was electrophoresed into D3 embryonic stem cells. Select cells that have been electroporated and then electroporated and Screened as described in Example 1. An American type D3 cell line containing the CD4 knockout construct Contract number C for the American Type Culture Collection Deposited as RL-11114. After identifying ES cells containing the CD4 / neo construct, these cells were treated with 3.5 Microinjection was performed on embryos of day-old mice. This embryo is a female mated with a male Get from Was. The embryos were then transferred to pseudo-pregnant foster mothers to continue pregnancy. The progeny of these mice were subjected to Southern blotting of DNA obtained from tail tissue. The presence of knockout constructs was assessed by lobe. Example 3CD4 / CD8 double knockout mouse Using the CD4 and CD8 knockout mice described above, mCD4-/-/ m CD8 − / − double knockout mice were obtained. mCD4 +/- mCD8 + / + Mice were crossed with mCD4 + / + mCD8 − / − mice to give mCD4 +/− mCD 8 +/- Heteromorphic F₁Got offspring. Mating heterozygous siblings and offspring as And screened. About 20 μl of blood was obtained from the tail vein of each mouse and Collected in phosphorus-treated capillaries. Blood is immunofluorescent staining buffer (“IBS”, cal Phosphate buffered saline without sium and magnesium [Sambrook (Sambrook et al., Supra) with 0.1% sodium azide and 5% fetal bovine serum. It was washed once). Next, each blood sample was tested for the following monoclonal antibody Incubated with (PE is phycoerythrin, FITC is fluor Is a rescein isothiocyanate): (1) PE-conjugated anti-human CD4 (Leu3a; Becton Dickinson Campa Knee (Becton-Dickinson Co.) (2) FITC-conjugated anti-HLA DQ (Leu10; Becton-Dickinson Co.) (3) PE-conjugated anti-mouse L3T4 (Becton Dickinson Company (Be cton-Dickinson Co.) company) (4) FITC-conjugated anti-mouse Lyt-2 (Becton Dickinson Company -(Becton-Dickinson Co.). All incubations were performed at 4 ° C for 20 minutes. Then red blood cells are FACS lysed Dissolution buffer (Becton-Dickinson Co.) Used for 2 minutes to dissolve and then washed twice with IBS. The cells were then transferred to Lysis II software (Becton Dickinson Company). -(Becton-Dickinson Co.) Co., Ltd. flow cytometry Method) analysis. Wild-type and heterozygous CD4 / CD8 knockout Mutants were distinguished from each other based on their staining intensity. CD4 / CD8 type of homozygous type Knockout mutants were identified in the complete absence of CD4 + or CD8 + cells (Based on lack of immunofluorescent staining with antibody). The frequency of homozygous offspring for mutations at both loci was 2% (200 4 of them). This is because both genes are on chromosome 6 Lower than expected frequency (1/16) [Parnes, Adv. Imm unol., 44, 265 (1989)]. Example 4:Human CD4 transgenic mouse Human CD4 (hCD4) transgenic mice were generated as follows: About 2.8 kb of human CD4 cDNA sequence [Maddon et al., Cell, 42, 93-104 (1985)], artificially produced human CD2. It was inserted into the EcoRI site of the promoter regulator cassette [Gleaves ( Greaves), et al., Cell, 56, 979-986 (1989)]. This case Is about 4.8 kb of hCD2 5'sequence and about 5.5 kb of hCD2 3'sequence. Contains and. Insertion of the CD4 cDNA into the CD2 cassette results in the first CD2 enzyme. Removing the exon, the CD2 5'promoter sequence and the CD2 3'regulatory intron I tried to leave the array and. The final construct shown in Figure 3 is copy number dependent , Which is independent of the integration site in the transgenic mouse genome. It is specifically expressed on parasites. Inject this construct into CBA / Ca x C57BL / 10 embryos using the above procedure I entered. Screen offspring for the presence of transgene constructs and Adult-bearing offspring were backcrossed with C57BL / 6 mice for 5 generations. F5 The offspring of the generation were then mated with CD4 / CD8 double knockout mice and CD4 / CD8 double knockout containing the CD4 transgene I got a mouse. Example 5:Human MHCII DQw6 Transgenic Mouse Α of transgene human HLA-DQw6 and β of HLA-DQw6 A C57B46 mouse having a mouse was prepared as follows. The gene encoding the α chain of HLA-DQw6 was used as a cloning vector. Λ Sharon 4A of EBV (Epstein-Barr virus) From the human B-lymphoblast cell line (EB-TOK) that has been transformed The obtained DNA was separated from the genomic library. This cell line is HLA- It is homozygous for the DR2-DQw6-Dw12 haplotype. This gene contains approximately 0.8 kb of 5'sequence, full length coding region and approximately 6 kb of 3'sequence. It was obtained as an approximately 13 kb EcoRI fragment containing the'untranslated sequence. The gene encoding the β chain of DQw6 has been described by Tsukamoto et al. [Immunogenet ics, Vol. 25, pp. 343-346 (1987)]. Separated. Approximately 18 kb of EcoRI fragment of DQw6 β chain nucleotide sequence , Containing the exon 6 of β of DQw6 and some 3'untranslated sequences. Ligation into the cDNA sequence of RI-PstI gave the complete β gene of DQw6. Restriction endonuclease for both DQw6 α and β genes by EcoRI A chain was formed by cutting. The mixture of DQw6 α and β genes was then cloned into C57B46 mouse embryos. Clo injection. This embryo was transplanted to a foster mother to continue pregnancy. Children were screened for the presence of the transgene as follows. Tail tissue Was obtained from each mouse, and the DNA from this tissue was analyzed by the SDS-proteinase K method. Prepared. Cleave the DNA with BamHI and then on a 0.9% agarose gel Electrophoresis was performed. Subsequent Southern blot analysis to contain transgene I confirmed the child to do. Next, MHCII transgenic mice were used for 10 generations with C57BL / 6 mice. Backcrossing was carried out. F10 generation offspring then crossed with each other and homozygous DQw6 + / + transgenic mice were obtained. Then homozygous for CD4 / CD8 double knockout, crossed with CD4 / CD8 double knockout And mice containing the DQw6 α and β transgenes were obtained. Example 6:CD4-/-/ CD8-/-hDQw6 hCD4 mouse CD4 / CD8 double knockout mice containing human CD4 transgene CD4 / CD8 double knockout containing DQw6 transgene It is a double knockout double transgenic mouse that has been crossed with a mouse. I got the offspring. These mice above The presence of the knockout construct and the transgene was examined using immunofluorescence staining. Decided their type. The full breeding method used to obtain this offspring is It is shown in FIG. Example 7:Sepsis susceptibility screening SEB ((Staphylococcus enterotoxin B) , Sigma Chemical Co., St. Louis, M. O) and LPS (lipopolysaccharide, Sigma Chemical Company) o.) and anti-CD3 monoclonal antibody (Pharmingen, San Diego, CA) and wild-type, transgenic, knockout And double knockout double transgenic mice, all 6 ~ 12-week old mice were evaluated. In particular, Rating Us: (1) Human CD4 +, DQw6 +, mouse CD4 − / −, mouse CD8− /-(HCD4 +, DQw6 +, mCD4-/-, mCD8-/-) (2) Human CD4 +, mouse CD4 − / −, mouse CD8 − / − (hCD 4+, mCD4-/-, mCD8-/-) (3) DQw6 +, mouse CD4 − / −, mouse CD8 − / − (DQw6 + , MCD4-/-, mCD8-/-) (4) Mouse CD4-/-, mouse CD8-/-(mCD4-/-, mCD 8-/-) (5) DQw6 (6) Wild type (C57BL / 6) (7) Wild type (BALB / c) Wild-type rodents are generally resistant to the effects of enterotoxins. But Thus, about 20 mg (100 μl) of D-galactosamine (D-gal) which is a sensitizer. PBS) in each mouse about 5 to 15 minutes before the injection of the test substance. Was. Administration of each test substance was performed intraperitoneally in about 100 μl of PBS. Each administered The amount of test substance is shown in Table 1. The number of mice that died within 72 hours of being exposed to SEB or LPS It is shown in Table 1. Surprisingly, double knockout double transgenic mice The mortality rate in these mice was extremely high compared to all the evaluated genotypes, and It shows extremely high sensitivity to EB. In vitro administration response of T cells from mice of various genotypes to SEB To evaluate sex, spleen tissue was collected from spleens collected from 6-12 week old mice. Single cell suspensions were made by passing through a wire mesh. Then, these cells About 1 x 10 in a 6-well microtiter plate⁶/ Put in the density of holes and with 10% heat Inactivated fetal bovine serum (FCS; Hyclone Labs) And 50 μM β-mercaptoethanol, 0.01% penicillin and 0.01% Approximately 200 μl of Iscove modified dilute supplemented with Streptomycin Suspended in Dulbecco's medium (IMDM). Then I showed it in Figure 5. The cells were stimulated with decreasing concentrations of SEB. 37 ° C and 5% CO₂ After incubating under about 72 hours, the cells were incubated for about 16 hours with about 1 μCi Pulsated with 3H-thymidine. The cells were then counted for radioactivity. The results are shown in FIG. Black circles are double knockout double transgenic , A white circle indicates a double knockout having the hCD4 transgene, Black squares indicate C57B46 wild type, white pentagons indicate double knockout. . As you can see, double knockout double transgenic mouse T cells are responsive to the presence of SEB compared to wild type and other mutant genotypes Was big.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者マク、タクダブリュー. カナダ国エム４ダブリュー２ダブリュー３オンタリオ州トロントグレンロード 130────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, C N, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, GE, HU , JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW, NL, NO, N Z, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SI, SK , TJ, TT, UA, UZ, VN (72) Inventor Mac, Taku W. Canada M4 W2 W -3 Toronto Glen, Ontario Road 130

Claims

【特許請求の範囲】１．内生のＣＤ４およびＣＤ８の発現を欠く非ヒト哺乳動物またはその後代であって、前記哺乳動物は（ａ）ヒトのＣＤ４をコードするトランスジーンまたはその生物学上活性な断片と；（ｂ）ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子をコードするトランスジーンまたはその生物学上活性な断片とを備えることを特徴とする非ヒト哺乳動物またはその後代。２．ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子がＤＱｗ６である請求の請求項１に記載の哺乳動物。３．各トランスジーンがプロモータに作用的に結合している請求項１に記載の哺乳動物。４．プロモータがヒトのＣＤ２プロモータ、ヒトのＣＤ４プロモータ、ＨＬＡＤＱｗ６のαおよびβプロモータ、マウスのＣＤ４プロモータ、マウスのｐ５６１ｃｋプロモータ、マウスのＩＥ−αプロモータおよびマウスのＨ２ｋプロモータよりなる群から選択されるプロモータである請求項３に記載の哺乳動物。５．ヒトのＣＤ４をコードするトランスジーンがヒトのＣＤ２プロモータに作用的に結合し、ＨＬＡＤＱｗ６のαおよびβ鎖をコードするトランスジーンがその内生のＤＱｗ６のαおよびβプロモータにそれぞれ作用的に結合している請求項４に記載の哺乳動物。６．哺乳動物もしくはその後代を作製するに方法であって、（ａ）哺乳動物における内生のＣＤ８の発現を抑制し、（ｂ）哺乳動物における内生のＣＤ４の発現を抑制し、（ｃ）ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子をコードするトランスジーンまたはその生物学上活性な断片を哺乳動物に挿入し、（ｄ）ヒトのＣＤ４をコードするトランスジーンまたはその生物学上活性な断片を哺乳動物に挿入することを備える哺乳動物もしくはその後代の作製方法。７．ＨＬＡＤＱ座の対立遺伝子がＤＱｗ６である請求項６に記載の方法。８．敗血症防止作用について治療処方を評価する方法であって、（ａ）請求項１に記載の哺乳動物に治療処方物を投与する際、治療処方物の投与の前に、または投与と同時に、または投与の後に敗血症を誘発する能力を持った化合物および／または生物に露呈しながら治療処方物を投与し、（ｂ）哺乳動物を敗血症または敗血症様徴候につきスクリーニングすることを特徴とする治療処方物の評価方法。[Claims] 1. In a non-human mammal or progeny lacking endogenous CD4 and CD8 expression The mammal is (A) A transgene encoding human CD4 or a biologically active fragment thereof With a piece; (B) A transgene encoding an allele of the HLA DQ locus or its life With physically active fragments A non-human mammal or progeny thereof, which comprises: 2. The allele of the HLA DQ locus is DQw6. Dairy animals. 3. The transgene of claim 1, wherein each transgene is operably linked to a promoter. Mammals. 4. Promoter is human CD2 promoter, human CD4 promoter, HLA DQw6 α and β promoters, mouse CD4 promoter, mouse p5 61ck promoter, mouse IE-α promoter and mouse H2k promoter The mammal according to claim 3, which is a promoter selected from the group consisting of 5. A transgene encoding human CD4 was engineered into the human CD2 promoter. A transgene encoding the α and β chains of HLA DQw6 A contract operatively linked to the endogenous DQw6 α and β promoters, respectively. The mammal according to claim 4. 6. A method for producing a mammal or a progeny thereof, comprising: (A) suppresses the expression of endogenous CD8 in mammals, (B) suppresses the expression of endogenous CD4 in mammals, (C) A transgene encoding an allele of the HLA DQ locus or its live form Inserting the physically active fragment into the mammal, (D) A transgene encoding human CD4 or a biologically active fragment thereof. Insert a piece into a mammal A method for producing a mammal or a progeny thereof, which comprises: 7. The method according to claim 6, wherein the allele of the HLA DQ locus is DQw6. 8. A method of evaluating a treatment regimen for sepsis prevention action, comprising: (A) When administering the therapeutic formulation to the mammal of claim 1, the therapeutic formulation is administered. Has the ability to induce sepsis before, at the same time as, or after administration A therapeutic formulation while exposing the compound and / or organism to (B) Screening mammals for sepsis or sepsis-like symptoms A method for evaluating a therapeutic formulation, which comprises: