JPH0947502A - Cultivated skin and method for making the same - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To smoothly supply enough nutriments for epidermis cells and/or fibroblasts on collagen nonwoven fabric of a cultivated skin and to smoothly discharge exuding liquid from the surface of a wound to which the cultivated skin is applied. SOLUTION: The substrate of this cultivated skin is made of collagen nonwoven fabric which is strong enough to be easily handled. When the cultivated skin with the substrate is applied to the surface of a wound, nutriments can be smoothly supplied to cells seeded and cultivated on the cultivated skin from the surface of the wound to which the cultivated skin is applied, and the liquid exuding from the surface of the wound and staying there can be smoothly discharged.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は培養皮膚およびその
製造法に関する。さらに詳しくは、熱傷、創傷、褥瘡ま
たは皮膚潰瘍などの皮膚欠損創に用いて、欠損組織を早
期に再建させるまたは治療するための培養皮膚およびそ
の製造法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to cultured skin and a method for producing the same. More particularly, it relates to a cultured skin for use in a skin defect wound such as a burn, a wound, a pressure ulcer or a skin ulcer, for early reconstruction or treatment of the defect tissue and a method for producing the same.

【０００２】[0002]

【従来の技術】従来より浅達性II度熱傷や軽度の褥瘡な
ど真皮の浅い部分に達する皮膚欠損創の治療としては創
傷被覆材の適用あるいは軟膏塗布ガーゼなどの適用が一
般的である。しかしながら、深達性II度熱傷、III度熱
傷あるいはII度以上の褥瘡など真皮の深い部分に達する
広範囲の皮膚欠損を負ったばあい、自己の表皮細胞増殖
による皮膚組織の再建は期待できない。そこで、まず壊
死組織あるいは不良肉芽組織を切除し、創傷被覆材を適
用して良好な肉芽組織を再建したのち、自家分層植皮を
行なうことにより皮膚を再建するという治療が行われて
きた。しかし、自家分層植皮を行なうばあい、自己の健
全な部位から採皮するが、採皮した部位には傷跡が残る
という整容についての問題が生じる。また患部が極めて
広範囲であるばあいには、自家分層植皮は困難である。2. Description of the Related Art Conventionally, the application of a wound dressing or an ointment-applied gauze is generally used for the treatment of skin defect wounds that reach the shallow portion of the dermis such as superficial degree II burns and mild pressure ulcers. However, reconstruction of skin tissue by self-proliferation of epidermal cells cannot be expected in the case of extensive skin defect reaching deep part of dermis such as deep-seated II burn, III burn or pressure ulcer more than II. Therefore, a treatment has been performed in which necrotic tissue or poor granulation tissue is first excised, a wound dressing is applied to reconstruct a good granulation tissue, and then autologous split layer skin grafting is performed to reconstruct the skin. However, in the case of autologous split-layer skin grafting, the skin is harvested from a healthy part of the self, but there is a problem with dressing that scars remain at the skinned part. Also, when the affected area is extremely wide, it is difficult to carry out autologous split-layer skin grafting.

【０００３】この問題を解決するために、わずかな皮膚
片から表皮細胞あるいは線維芽細胞を採取し、培養フラ
スコ内で大量培養する技術が開発され、これらの培養細
胞を用いた種々の培養皮膚が開発されてきている。In order to solve this problem, a technique has been developed in which epidermal cells or fibroblasts are collected from a small amount of skin and mass-cultured in a culture flask, and various cultured skins using these cultured cells have been developed. Has been developed.

【０００４】ハワード・グリーン（Ｈ．Ｇｒｅｅｎ）、
ジェームズ・レインワルド（Ｊ．Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ）
らが開発した培養表皮シートは、切手大の皮膚を採取
し、表皮細胞を培養フラスコ内で大量培養して表皮シー
トをうるものであるが、該シートを培養フラスコから剥
離する際の酵素処理によって最も重要な細胞である基底
細胞が損傷を受けるために自家移植において生着率が低
いという問題点が指摘されている（黒柳能光、生体材料
９巻、１９９１年２月号参照）。Howard Green,
James Reinwald
The cultured epidermis sheet developed by et al. Is obtained by collecting stamp-sized skin and culturing the epidermal cells in a large amount in a culture flask to obtain an epidermis sheet, which is treated by an enzyme when peeling the sheet from the culture flask. It has been pointed out that the engraftment rate is low in autologous transplantation because the most important cells, basal cells, are damaged (see Norimitsu Kuroyanagi, Vol. 9, Biomaterials, February 1991).

【０００５】また、ユージーン・ベル（Ｅ．Ｂｅｌｌ）
ら（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１１巻、１０５
２〜１０５４頁、１９８１年３月号参照）は、皮膚から
分離、採取した表皮細胞および線維芽細胞を培養フラス
コ中で大量に培養し、線維芽細胞を組み込んだコラーゲ
ンゲル上に表皮細胞を重層化させた培養皮膚を開発し
た。Also, Eugene Bell
Et al. (Science), Volume 211, 105
2-1054, March 1981), a large amount of epidermal cells and fibroblasts separated and collected from the skin are cultured in a culture flask, and the epidermal cells are layered on a collagen gel incorporating the fibroblasts. The developed cultured skin was developed.

【０００６】さらに、スティーブン・ボイス（Ｓ．Ｂｏ
ｙｃｅ）ら（サージェリー（ＳＵＲＧＥＲＹ）、１０３
巻、４２１〜４３１頁、１９８８年４月号参照）は、皮
膚から採取した表皮細胞を培養フラスコ中で大量に培養
し、これを少量のコンドロイチン−６−硫酸を添加した
コラーゲンスポンジ上に播種し重層化させた培養皮膚を
開発している。Furthermore, Stephen Voice (S. Bo
yce) et al. (SURGERY, 103
Vol., 421-431, April 1988), cultivate a large amount of epidermal cells collected from the skin in a culture flask, and inoculate this on a collagen sponge added with a small amount of chondroitin-6-sulfate. We are developing layered cultured skin.

【０００７】また、アテロコラーゲンを基材とする培養
皮膚が、特開昭第６２−２４６３７１号公報および特開
平第４−３３２５６１号公報に記載されている。特開昭
第６２−２４６３７１号公報には、アテロコラーゲンシ
ートを基材とする培養皮膚が記載されているが、シート
に貫通孔がないので、移植床からもたらされる細胞増殖
などに欠かすことのできない栄養分がシートを透過して
シート上の表皮細胞にまで供給され難いために自家移植
において表皮の生着率が低いという問題があった。さら
に、貫通孔がないことで、移植した培養皮膚面の患部に
浸出液が過度に滞留し、この排出が円滑になされず感染
の温床となるという問題もあった。Further, cultured skin based on atelocollagen is described in JP-A-62-246371 and JP-A-4-332561. Japanese Unexamined Patent Publication No. 62-246371 describes cultured skin using an atelocollagen sheet as a base material, but since the sheet has no through holes, nutrients indispensable for cell proliferation and the like brought from the transplant bed. However, since it is difficult to permeate through the sheet to be supplied to the epidermal cells on the sheet, there is a problem that the epidermal engraftment rate is low in autologous transplantation. Furthermore, since there is no through-hole, there is a problem that the exudate excessively stays in the affected area of the transplanted cultured skin surface, and this discharge is not smoothed and becomes a hotbed of infection.

【０００８】特開平第４−３３２５６１号公報には、細
胞播種前にあらかじめアテロコラーゲンゲルなどでコー
ティングすることを必須とした貫通孔を設けたアテロコ
ラーゲンスポンジを基材とする培養皮膚が記載されてい
る。Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 4-332561 describes a cultured skin having an atelocollagen sponge as a base material having through holes which must be coated with atelocollagen gel or the like before cell seeding.

【０００９】こうした培養皮膚は工程が煩雑であるばか
りでなく、コストの高いものとなり、さらにスポンジ形
状では強度にも問題があったため、より簡便で安価でか
つ強度のある代替品または手法の開発が望まれていた。Since such cultured skin is not only complicated in process but also costly and there is a problem in strength with the sponge shape, development of a simpler, cheaper and stronger alternative or method is required. Was wanted.

【００１０】[0010]

【発明が解決しようとする課題】本発明はかかる問題を
解消するためになされたものであり、熱傷、創傷、褥瘡
または皮膚潰瘍などの皮膚欠損創に用いて、欠損した組
織を早期に再建させるための培養皮膚を提供することを
目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above problems, and can be used for skin defect wounds such as burns, wounds, pressure ulcers or skin ulcers to promptly reconstruct the defective tissue. The purpose is to provide a cultured skin for.

【００１１】さらに詳しくは、培養皮膚を適用した創面
から培養皮膚の細胞への栄養分供給を円滑にすると共に
適用創面に過度に滞留する浸出液の排出が円滑に行なわ
れうる機能を有する、強度のある培養皮膚を安価に提供
することを目的とする。More specifically, it has the function of facilitating the supply of nutrients from the wound surface to which the cultured skin is applied to the cells of the cultured skin and the smooth discharge of the exudate excessively accumulated on the applied wound surface. The purpose is to provide cultured skin at low cost.

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】前記の目的は、培養皮膚
用基材として不織布を用いることにより、貫通孔を設け
ることなく、培養皮膚適用時に前記培養皮膚適用創面か
ら培養皮膚に播種され培養増殖された細胞への栄養供
給、および適用創面に滞留する浸出液の排出が円滑に行
なわれうる、強度のある培養皮膚を提供することであ
る。[Means for Solving the Problems] The above-mentioned object is to use a non-woven fabric as a substrate for cultured skin, so that when the cultured skin is applied, the cultured skin-applied wound surface is seeded onto the cultured skin to apply the cultured proliferation without the through holes. The purpose of the present invention is to provide a strong cultured skin, which can smoothly supply nutrients to the treated cells and discharge the exudate accumulated on the applied wound surface.

【００１３】したがって本発明は、コラーゲン不織布の
少なくとも片面に皮膚由来の線維芽細胞を播種培養する
工程を含んでなる培養皮膚の製造法、コラーゲン不織布
の片面に表皮細胞を播種培養する工程を含んでなる培養
皮膚の製造法、ならびにコラーゲン不織布の少なくとも
片面に皮膚由来の線維芽細胞を播種培養し、かつ該不織
布の片面に表皮細胞を播種培養する工程を含んでなる培
養皮膚の製造法に関する。Accordingly, the present invention comprises a method for producing a cultured skin comprising a step of seeding and culturing skin-derived fibroblasts on at least one side of a collagen nonwoven fabric, and a step of seeding and culturing epidermal cells on one side of the collagen nonwoven fabric. And a method for producing cultured skin, which comprises the steps of seed-culturing skin-derived fibroblasts on at least one surface of a collagen nonwoven fabric, and seed-culturing epidermal cells on one surface of the nonwoven fabric.

【００１４】前記コラーゲンはアテロコラーゲンであっ
てよい。The collagen may be atelocollagen.

【００１５】さらに本発明はコラーゲン不織布と培養さ
れた皮膚由来の細胞からなる培養皮膚、コラーゲン不織
布と培養された皮膚由来の線維芽細胞からなる培養皮膚
であって、該線維芽細胞が前記不織布の少なくとも片面
に播種培養された培養皮膚、コラーゲン不織布と培養さ
れた表皮細胞からなる培養皮膚であって、該表皮細胞が
前記不織布の片面で播種培養された培養皮膚およびコラ
ーゲン不織布と培養された皮膚由来の線維芽細胞および
表皮細胞からなる培養皮膚であって、該線維芽細胞が前
記不織布の少なくとも片面に播種培養され、かつ該表皮
細胞が前記不織布の片面に播種培養された培養皮膚に関
する。Furthermore, the present invention provides a cultured skin comprising collagen-derived nonwoven and cultured skin-derived cells, and a cultured skin comprising collagen nonwoven-derived cultured skin-derived fibroblasts, wherein the fibroblasts are At least one surface of the cultured skin seeded and cultured, a cultured skin consisting of a collagen non-woven fabric and cultured epidermal cells, wherein the epidermal cells are seed-cultured on one side of the non-woven fabric and the skin cultured with the collagen non-woven fabric Of the above-mentioned fibroblasts and epidermal cells, wherein the fibroblasts are seed-cultured on at least one surface of the nonwoven fabric, and the epidermal cells are seed-cultured on one surface of the nonwoven fabric.

【００１６】前記培養皮膚において、コラーゲンはアテ
ロコラーゲンであってよい。In the cultured skin, the collagen may be atelocollagen.

【００１７】[0017]

【発明の実施の形態】本発明の培養皮膚用不織布に用い
られるコラーゲンは、たとえばアテロコラーゲンなどの
ように生体適合性を有するものであることが好ましい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The collagen used in the nonwoven fabric for cultured skin of the present invention is preferably biocompatible such as atelocollagen.

【００１８】本発明に用いられるコラーゲン不織布の作
製法はとくに限定されないが、一般的な湿式抄紙法によ
り作製される。すなわち、塩酸、酢酸などを用いてｐＨ
を１．５〜４、好ましくは２〜３に調整し、濃度を０．
５〜５ｗ／ｖ％、好ましくは１〜３ｗ／ｖ％にしたコラ
ーゲン水溶液（紡糸原液）を紡糸ノズルから濃厚塩溶液
へ紡出することによりコラーゲン繊維をえる。紡糸ノズ
ルは、０．１〜０．４ｍｍ、好ましくは０．１５〜０．
３ｍｍの直径を有するものであってもよい。前記濃厚塩
溶液は、２０〜２６ｗ／ｖ％に調整された塩化ナトリウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの水溶液で
あってよい。えられたコラーゲン繊維の繊度は０．８〜
１５デニール、好ましくは２〜１０デニールである。繊
維の太さが０．８デニールより細いものは実用上製造し
にくいため好ましくなく、１５デニールより太いと結合
点が少なくなるため強度が低下し、しなやかさに欠ける
ため好ましくない。えられたコラーゲン繊維は室温にて
風乾したのち、カッター、はさみなどの切断手段を用い
て繊維を３〜１０ｍｍ、好ましくは４〜８mmの長さの短
繊維となるよう切断される。ついで、コラーゲン短繊維
を水不溶性とするためにポリエポキシ化合物、アルデヒ
ド化合物などにより架橋する。この方法は、たとえばつ
ぎのようにして遂行できる。えられたコラーゲン短繊維
を０．０１〜０．５ｖ／ｖ％のグルタルアルデヒドなど
を含有する８〜１５ｗ／ｖ％の塩化ナトリウム水溶液あ
るいは硫酸ナトリウム水溶液などに１〜３時間浸漬す
る。The method for producing the collagen nonwoven fabric used in the present invention is not particularly limited, but it is produced by a general wet papermaking method. That is, pH is adjusted using hydrochloric acid, acetic acid, etc.
Is adjusted to 1.5-4, preferably 2-3, and the concentration is adjusted to 0.
Collagen fibers are obtained by spinning an aqueous collagen solution (spinning stock solution) at 5 to 5 w / v%, preferably 1 to 3 w / v%, from a spinning nozzle into a concentrated salt solution. The spinning nozzle is 0.1 to 0.4 mm, preferably 0.15 to 0.
It may have a diameter of 3 mm. The concentrated salt solution may be an aqueous solution of sodium chloride, sodium sulfate, ammonium sulfate or the like adjusted to 20 to 26 w / v%. The fineness of the obtained collagen fiber is 0.8 ~
It is 15 denier, preferably 2 to 10 denier. Fibers having a thickness of less than 0.8 denier are not preferred because they are difficult to practically produce, and fibers having a thickness of less than 15 denier are not preferred because the number of bonding points decreases and the strength decreases, resulting in lack of flexibility. The obtained collagen fibers are air-dried at room temperature and then cut into short fibers having a length of 3 to 10 mm, preferably 4 to 8 mm, using a cutting means such as a cutter or scissors. Then, in order to make the collagen short fibers insoluble in water, they are crosslinked with a polyepoxy compound, an aldehyde compound or the like. This method can be performed as follows, for example. The obtained collagen short fibers are immersed for 1 to 3 hours in an 8 to 15 w / v% sodium chloride aqueous solution or a sodium sulfate aqueous solution containing 0.01 to 0.5 v / v% glutaraldehyde.

【００１９】充分に水洗したのち、蒸留水などに分散さ
せ叩解処理して均一な分散液（スラリー）をうる。抄紙
は、たとえばナイロン、ポリエステルなどの繊維、ステ
ンレスなどの金属または樹脂から作製された５０〜１０
０程度のメッシュの篩上で手抄する。もしくは前記短繊
維の分散液を抄紙機にかけて抄紙する。えられるシート
状のものを脱水し、２５〜３５℃でゆるやかに風乾する
かまたは室温にて減圧乾燥することによりコラーゲン不
織布がえられる。After thoroughly washing with water, the product is dispersed in distilled water and beaten to obtain a uniform dispersion (slurry). Papermaking is made of, for example, fibers such as nylon and polyester, metal such as stainless steel, or resin 50 to 10
Hand paper on a sieve of about 0 mesh. Alternatively, the dispersion of the short fibers is applied to a paper machine to make paper. A collagen nonwoven fabric can be obtained by dehydrating the obtained sheet-like product and gently air-drying at 25 to 35 ° C. or vacuum drying at room temperature.

【００２０】さらに、強度をさらに付与するばあいに
は、コラーゲンまたはゼラチンの希薄な水溶液を不織布
表面に噴霧し、乾燥させる。たとえば、乾燥させた不織
布にグルタルアルデヒド０．０１ｖ／ｖ％を含む０．０
１〜０．５ｗ／ｖ％コラーゲン水溶液を１００ｍＬ／ｍ
²程度で噴霧して、風乾する。そののち水洗し、再度乾
燥させる。Further, in order to impart further strength, a dilute aqueous solution of collagen or gelatin is sprayed on the surface of the nonwoven fabric and dried. For example, 0.0 including glutaraldehyde 0.01 v / v% in a dried non-woven fabric.
100 mL / m of 1-0.5 w / v% collagen aqueous solution
Spray at about ² and air dry. After that, it is washed with water and dried again.

【００２１】基材の強度の評価には、引張強度を採用す
ることが好ましい。具体的には試料（不織布）をダンベ
ル形状に切り抜き、培地または生理的食塩水に浸漬させ
て充分に含浸させて万能材料試験機にて引張強度を求め
た。For the evaluation of the strength of the base material, it is preferable to adopt the tensile strength. Specifically, a sample (nonwoven fabric) was cut into a dumbbell shape, immersed in a medium or physiological saline to be sufficiently impregnated, and the tensile strength was determined by a universal material testing machine.

【００２２】また、コラーゲン不織布の大きさおよび厚
さは患部の大きさ、深さなどにより適宜選択されるが、
不織布としての特性を生かすには厚さ０．５ｍｍ程度ま
でのものが好ましい。The size and thickness of the collagen non-woven fabric are appropriately selected depending on the size and depth of the affected area.
In order to make the best use of the characteristics of the non-woven fabric, it is preferable that the thickness is up to about 0.5 mm.

【００２３】このようにしてえられる培養皮膚の基材と
なるコラーゲン不織布は、培養皮膚適用時に適用創面か
ら培養皮膚面または培養皮膚に組込まれた細胞への栄養
供給、および適用創面に過度に滞留する浸出液の排出が
円滑に行なわれうる。The collagen non-woven fabric, which is the base material of the cultured skin thus obtained, supplies nutrients from the surface of the applied wound to the surface of the cultured skin or the cells incorporated in the cultured skin when the cultured skin is applied, and excessively stays on the surface of the applied wound. The exudate discharged can be discharged smoothly.

【００２４】本発明の培養皮膚不織布には、その少なく
とも片面において皮膚由来の細胞、たとえば表皮細胞お
よび／または線維芽細胞が播種され培養される。前記表
皮細胞とは、基底細胞を含む角質化細胞および表皮細胞
層に通常存在するその他の細胞を意味するが、このうち
培養増殖させるのは角質化細胞である。前記線維芽細胞
とは、ここでは皮膚の真皮中の主要な細胞であり、コラ
ーゲンをはじめとする結合組織成分を産生し、これらの
成分と結合して結合組織を形成している細胞をいう。The cultured skin nonwoven fabric of the present invention is seeded and cultured with skin-derived cells, such as epidermal cells and / or fibroblasts, on at least one side thereof. The epidermal cells mean keratinized cells including basal cells and other cells normally present in the epidermal cell layer, of which keratinized cells are proliferated in culture. The fibroblasts herein are the main cells in the dermis of the skin, and are cells that produce connective tissue components such as collagen, and combine with these components to form connective tissue.

【００２５】本発明の培養皮膚は、播種される細胞に応
じて以下の３種類を作製することが可能である： 本発明のコラーゲン不織布の好ましくは両面、少なく
とも片面に皮膚由来の線維芽細胞のみを播種培養させた
培養皮膚（複合培養真皮）、 本発明のコラーゲン不織布の片面に表皮細胞を播種培
養させた培養皮膚（複合培養表皮）および 本発明のコラーゲン不織布の少なくとも片面に皮膚由
来の線維芽細胞を播種培養させ、かつ前記不織布の片面
に表皮細胞を播種培養させた培養皮膚（複合培養皮
膚）。このばあい、先に皮膚由来の線維芽細胞を播種培
養する工程を行なう方が表皮細胞の脱落を防ぐことがで
きるのでより好ましい。The cultured skin of the present invention can be prepared in the following three types depending on the cells to be inoculated: The collagen nonwoven fabric of the present invention preferably has only skin-derived fibroblasts on both sides, at least on one side. Cultured skin (composite cultured dermis) seeded and cultured, cultured skin obtained by seed culture of epidermal cells on one side of the collagen nonwoven fabric of the present invention (composite cultured epidermis), and skin-derived fibroblasts on at least one side of the collagen nonwoven fabric of the present invention Cultured skin in which cells are seed-cultured and epidermal cells are seed-cultured on one surface of the non-woven fabric (composite culture skin). In this case, it is more preferable to perform the step of seeding and culturing the skin-derived fibroblasts in advance so that the epidermal cells can be prevented from falling off.

【００２６】前記の３種類の培養皮膚は、患部の面積、
深さなどの状態や合併症の有無など患者の症状によって
適宜使い分けることでより効果が発揮される。また、こ
れらの培養皮膚を自家、他家で適宜使い分けることでよ
り効率的な治療が期待できる。The above-mentioned three types of cultured skin are
The effect is more exerted by properly using it depending on the patient's symptom such as the condition such as depth and the presence or absence of complications. In addition, more efficient treatment can be expected by properly using these cultured skins in-house and in-house.

【００２７】前記表皮細胞は以下の手順で調製される。
清潔な環境下で採取された皮膚（表皮および真皮の一
部、または皮膚全層）を消毒し、抗生物質を含有する生
理食塩水またはハンクス（Ｈａｎｋ'ｓ）液などの緩衝
液に浸漬する。この皮膚をディスパーゼ濃度を１０００
Ｕ／ｍＬに調製したダルベッコ変法イーグル最少必須培
地（ＤＭＥＭ）（以下、「ディスパーゼ溶液」という）
に浸漬したのち表皮と真皮に分離する。えられた表皮を
トリプシン濃度０．２５ｗ／ｖ％、エチレンジアミン四
酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）濃度を０．５ｍＭに調製し
たハンクス液（以下、「トリプシン溶液」という）中に
移し、３７℃、約１５分間浸漬したのち１０ｖ／ｖ％ウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（以下、この培地
を「ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ」という）などの培地中に
移し、振とうすることにより細胞を分散させ、約４００
×ｇ、５分間の遠心分離にて採取させることによってう
ることができる。えられた表皮細胞はたとえば、グリー
ン（Ｇｒｅｅｎ）培地、ＮＣＴＣ１６８培地、ＭＣＤＢ
１５３培地、とくに好ましくはグリーン培地を加えて表
皮細胞懸濁液とする。The epidermal cells are prepared by the following procedure.
The skin (a part of the epidermis and the dermis, or the entire skin layer) collected in a clean environment is disinfected and immersed in a physiological saline solution containing an antibiotic or a buffer solution such as Hank's solution. The dispase concentration of this skin is 1000
Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium (DMEM) prepared to U / mL (hereinafter referred to as "dispase solution")
After soaking in, separate into epidermis and dermis. The obtained epidermis was transferred to a Hanks solution (hereinafter, referred to as "trypsin solution") in which the trypsin concentration was 0.25 w / v% and the sodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA) concentration was 0.5 mM, and the temperature was 37 ° C for about 15 minutes. After soaking, the cells are dispersed in a medium such as DMEM containing 10 v / v% fetal calf serum (FCS) (hereinafter, this medium is referred to as “DMEM + 10% FCS”) and shaken to disperse the cells to about 400
It can be obtained by centrifuging at xg for 5 minutes. The obtained epidermal cells are, for example, Green medium, NCTC168 medium, MCDB.
153 medium, particularly preferably Green medium, is added to make an epidermal cell suspension.

【００２８】前記グリーン培地とはＤＭＥＭとハム（Ｈ
ａｍ'ｓ）Ｆ−１２を３：１に混合し、ヒドロコルチゾ
ン（０．４μｇ/ｍＬ）、インスリン（５μｇ/ｍＬ）、
トランスフェリン（５μｇ/ｍＬ）、トリヨードチロニ
ン（０．００１３μｇ/ｍＬ）、コレラトキシン（０．
０１μｇ/ｍＬ）、アデニン（２４．３μｇ/ｍＬ）、表
皮細胞増殖因子（０．０１μｇ/ｍＬ）と抗生物質を添
加し、１０ｖ／ｖ％ＦＣＳを含んでなる表皮細胞増殖培
地である（セル（Ｃｅｌｌ）４０巻、６７７〜６８３
頁、１９８５年３月号参照）。The green medium is DMEM and ham (H
am's) F-12 was mixed at a ratio of 3: 1, and hydrocortisone (0.4 μg / mL), insulin (5 μg / mL),
Transferrin (5 μg / mL), triiodothyronine (0.0013 μg / mL), cholera toxin (0.
01 μg / mL), adenine (24.3 μg / mL), epidermal growth factor (0.01 μg / mL) and antibiotics were added, and the epidermal cell growth medium contained 10 v / v% FCS (cell ( Cell) 40 volumes, 677-683
Page, March 1985 issue).

【００２９】前記表皮細胞を高効率で増殖させるには、
たとえばマイトマイシン処理や放射線照射などによって
増殖能を消失させたマウス由来の線維芽細胞である３Ｔ
３細胞を支持細胞として接着させた培養フラスコ中で培
養を行なうことが好ましい。In order to grow the epidermal cells with high efficiency,
For example, 3T, a mouse-derived fibroblast whose proliferative capacity has been lost by treatment with mitomycin, irradiation, etc.
It is preferable to carry out the culture in a culture flask to which 3 cells are adhered as supporting cells.

【００３０】具体的には、この３Ｔ３細胞を培養したの
ち、培地を除去してハンクス液ですすぎ、これを除去す
る。ついでマイトマイシンＣ ４μｇ/ｍＬ含有ＤＭＥ
Ｍ溶液を細胞全体が充分浸されるだけ加え（７５ｃｍ²
培養フラスコであれば２〜４ｍＬ程度が好ましい）、３
７℃にて２時間程度静置したのち緩衝液で洗浄し、マイ
トマイシンＣを除去する。こうして、３Ｔ３細胞は生き
たままで増殖能のみが消失せしめられる。えられた増殖
能を有しない３Ｔ３細胞を採取して、前記グリーン培地
に懸濁し、１×１０³〜５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、
好ましくは５×１０³〜３×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の
密度になるよう調製したのち培養フラスコへ播種する。
この培養フラスコに前記表皮細胞を３Ｔ３細胞を播種し
たのちに、５×１０³〜５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、
好ましくは１×１０⁴〜２×１０⁵cells/cm²の細胞密度
にて播種して接着させる。Specifically, after culturing the 3T3 cells, the medium is removed and rinsed with Hank's solution to remove it. Then DME containing mitomycin C 4 μg / mL
Add M solution (75 cm ²
If it is a culture flask, about 2 to 4 mL is preferable), 3
After leaving it at 7 ° C. for about 2 hours, it is washed with a buffer solution to remove mitomycin C. In this way, the 3T3 cells are alive, and only the proliferative ability is lost. The obtained 3T3 cells having no proliferative ability were collected, suspended in the above green medium, and 1 × 10 ^{3 to} 5 × 10 ⁴ cells / cm ² ,
Preferably, it is prepared to have a density of 5 × 10 ^{3 to} 3 × 10 ⁴ cells / cm ² , and then seeded in a culture flask.
After seeding the epidermal cells with 3T3 cells in this culture flask, 5 × 10 ^{3 to} 5 × 10 ⁵ cells / cm ² ,
Preferably, the cells are seeded and adhered at a cell density of 1 × 10 ^{4 to} 2 × 10 ⁵ cells / cm ² .

【００３１】たとえば約２×２cmの分層皮膚からえた前
記表皮細胞を５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃に
て培養する。３Ｔ３細胞はこの培養継続中に表皮細胞が
コロニーを形成する過程において培養フラスコ底面より
脱離して培地中に浮き上がり、培地を交換する際に除去
されるので、最終的にえられる表皮細胞にはほとんど含
まれない。For example, the epidermal cells obtained from a split-layered skin of about 2 × 2 cm are cultured at 37 ° C. in a 5% CO ₂ incubator. 3T3 cells are detached from the bottom of the culture flask during the process of forming colonies of the epidermal cells during the continuation of the culture and float in the medium, and are removed when the medium is replaced. Not included.

【００３２】表皮細胞が培養増殖したところで、この培
養フラスコにディスパーゼ溶液を加え３７℃にて約２時
間静置して表皮細胞を培養フラスコから剥がし、さらに
トリプシン溶液により分散させ遠心分離して表皮細胞を
採取し、グリーン培地を添加して細胞懸濁液をえる。表
皮細胞は、必要に応じて継代培養して多量の表皮細胞を
えておく。えられた表皮細胞をたとえば約６×１０ｃｍ
のコラーゲン不織布上に５×１０⁴〜２×１０⁵ｃｅｌｌ
ｓ／ｃｍ²の播種密度にて播種する。When the epidermal cells were cultured and proliferated, the dispase solution was added to the culture flask and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for about 2 hours to remove the epidermal cells from the culture flask, further dispersed with a trypsin solution and centrifuged to separate the epidermal cells. Are collected and a green medium is added to obtain a cell suspension. The epidermal cells are subcultured as necessary to obtain a large amount of epidermal cells. The obtained epidermal cells are, for example, about 6 × 10 cm
5 × 10 ⁴ to 2 × 10 ⁵ cells on the collagen non-woven fabric
Seed at a seeding density of s / cm ² .

【００３３】細胞播種前に不織布をＦＣＳに浸漬し、３
７℃にて約２０時間静置し、こののち余分なＦＣＳを除
去しておいた不織布に前記細胞を播種すると接着が良好
となる。表皮細胞が不織布に接着したのち、グリーン培
地を加えて５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃にて３
日ごとに培地を交換しながら７〜２１日間培養する。こ
のようにして複合培養表皮がえられる。Before the cell seeding, the non-woven fabric was dipped in FCS for 3
Adhesion becomes good when the cells are allowed to stand at 7 ° C. for about 20 hours and then the non-woven fabric from which excess FCS has been removed is seeded with the cells. After the epidermal cells have adhered to the non-woven fabric, add green medium and add 3% at 37 ° C in a 5% CO ₂ incubator.
Incubate for 7 to 21 days while changing the medium every day. In this way, a composite culture epidermis is obtained.

【００３４】前記線維芽細胞は、バイオプシーにより採
取された皮膚を前記と同様に表皮と真皮に分離したの
ち、えられた真皮をハサミ、ホモジナイザーなどを用い
て砕き、コラゲナーゼをＤＭＥＭに溶解させ０．５ｗ／
ｖ％に調製した溶液（以下、「コラゲナーゼ溶液」とい
う）に加え、約３時間、約３７℃にて振とうして結合組
織を溶解させたうえで約４００×ｇ〜約１０００×ｇ、
好ましくは約６００×ｇ〜約８００×ｇで遠心分離する
ことにより採取する。えられた線維芽細胞は、ＤＭＥＭ
＋１０％ＦＣＳなどを培地として５％ＣＯ₂インキュベ
ーター中３７℃にて初代培養し、必要に応じて多くの線
維芽細胞をうるように継代培養する。The fibroblasts were obtained by separating the skin collected by biopsy into the epidermis and the dermis in the same manner as described above, crushing the obtained dermis with scissors, a homogenizer, etc., and dissolving collagenase in DMEM. 5w /
In addition to the solution prepared to v% (hereinafter referred to as “collagenase solution”), the connective tissue was dissolved by shaking at about 37 ° C. for about 3 hours, and then about 400 × g to about 1000 × g,
It is preferably collected by centrifugation at about 600 xg to about 800 xg. The obtained fibroblasts are DMEM
Primary culture is carried out at 37 ° C. in a 5% CO ₂ incubator using + 10% FCS or the like as a medium, and subcultured so as to obtain many fibroblasts if necessary.

【００３５】えられた線維芽細胞をたとえば約６×１０
ｃｍのコラーゲン不織布に播種するばあい、播種前にま
ず、前記した複合培養表皮作製におけると同様に不織布
にＦＣＳを含ませておく。培養した線維芽細胞をトリプ
シン溶液を用いて培養フラスコから剥がし、遠心分離す
ることで採取して、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを用いて懸
濁液を調製する。この細胞懸濁液を５×１０³〜５×１
０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、好ましくは５×１０⁴〜２×１
０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の播種密度にてコラーゲン不織布
に播種する。細胞が不織布に接着したのち、ＤＭＥＭ＋
１０％ＦＣＳを加え、５％ＣＯ₂インキュベーター中３
７℃にて３日ごとに培地を交換しながら３〜２１日間培
養を行なう。このようにして複合培養真皮をうることが
できる。複合培養真皮は少なくとも不織布の片面に皮膚
由来の線維芽細胞を播種し、培養してえられる。The obtained fibroblasts are treated with, for example, about 6 × 10 5.
When seeding a cm non-woven fabric, first, before seeding, the non-woven fabric is allowed to contain FCS in the same manner as in the preparation of the composite culture epidermis described above. The cultured fibroblasts are detached from the culture flask using trypsin solution, collected by centrifugation, and a suspension is prepared using DMEM + 10% FCS. 5 × 10 ^{3 to} 5 × 1 of this cell suspension
0 ⁵ cells / cm ² , preferably 5 × 10 ⁴ to 2 × 1
The collagen non-woven fabric is seeded at a seeding density of 0 ⁵ cells / cm ² . After cells adhere to the non-woven fabric, DMEM +
Add 10% FCS 3 in 5% CO ₂ incubator
Culturing is performed at 7 ° C for 3 to 21 days while changing the medium every 3 days. In this way, a composite cultured dermis can be obtained. The composite cultured dermis is obtained by seeding and culturing skin-derived fibroblasts on at least one side of the nonwoven fabric.

【００３６】表皮細胞および真皮細胞の両方を併せて有
する複合培養皮膚は、以下のように作製される。前記し
た複合培養真皮の作製工程にて皮膚由来の線維芽細胞を
播種し、細胞を良好に不織布に接着させたのち該不織布
を裏返し、前記複合培養表皮の作製における工程を行い
複合培養皮膚をうる。A composite cultured skin having both epidermal cells and dermal cells together is prepared as follows. Skin-derived fibroblasts are seeded in the above-mentioned step of producing the composite cultured dermis, the cells are satisfactorily adhered to the non-woven fabric, and then the non-woven fabric is turned over, and the step in the production of the above-mentioned composite cultured epidermis is performed to obtain the composite cultured skin. .

【００３７】このようにしてえられた培養皮膚は、創面
に適用される前に、ＤＭＥＭを用いて洗浄し、ＦＣＳを
除いた栄養培地に置き換えておくことが好ましい。The culture skin thus obtained is preferably washed with DMEM and replaced with a nutrient medium without FCS before being applied to the wound surface.

【００３８】貫通孔を設けられていない基材を用いた培
養皮膚では、培養皮膚全体に栄養成分が供給され難く培
養細胞の増殖、代謝を阻害することがあった。またその
下部に浸出液が過度に滞留し、感染の温床となることが
あるのに対し、本発明の不織布を用いた培養皮膚におい
ては、貫通孔を設けずとも培養皮膚全体に栄養成分が供
給されやすくなり、培養細胞の増殖、代謝を円滑にする
と共に適用創面における浸出液の排出が良好に行なわ
れ、良好な肉芽組織を形成するうえで極めて有用であ
る。また複合培養表皮または複合培養皮膚を自家移植す
るばあいには生着率を高める効果がある。With cultured skin using a base material having no through holes, it was difficult to supply nutrient components to the entire cultured skin, and the growth and metabolism of cultured cells were sometimes inhibited. In addition, the exudate excessively accumulates in the lower part of the culture, which may become a hotbed for infection.On the other hand, in the cultured skin using the nonwoven fabric of the present invention, nutrient components are supplied to the entire cultured skin without providing through holes. This facilitates the growth and metabolism of the cultured cells and allows the exudate to be satisfactorily discharged on the surface of the applied wound, which is extremely useful for forming a good granulation tissue. Moreover, when autologous transplantation of the composite culture epidermis or the composite culture skin is effective in increasing the survival rate.

【００３９】前記細胞を不織布に良好に接着させるため
に、細胞接着因子としてフィブロネクチンやラミニンな
どを本発明の不織布に被覆しておくとさらに良好な培養
皮膚がえられる。In order to adhere the cells to the non-woven fabric well, if the non-woven fabric of the present invention is coated with fibronectin or laminin as a cell adhesion factor, a better cultured skin can be obtained.

【００４０】[0040]

【実施例】以下に本発明を参考例および実施例をあげて
さらに詳細に説明するが、本発明はもとよりこれら実施
例に限定されるものではない。The present invention will be described in more detail below with reference to reference examples and examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００４１】参考例 コラーゲン不織布の作製 ２ｗ／ｖ％に調製したアテロコラーゲン（（株）高研
製）の水溶液（塩酸でｐＨ３に調整）５０ｍｌを孔径
０．２ｍｍのノズルを通して５Ｌの２６ｗ／ｖ％塩化ナ
トリウム水溶液を入れた凝固浴へ湿式法により紡糸し、
えられた再生コラーゲン繊維を室温で乾燥したのち、カ
ッターで切断して長さ４〜８ｍｍ繊度１０デニールの短
繊維を作製した。グルタルアルデヒドを０．０５ｖ／ｖ
％となるように含有した１０ｗ／ｖ％塩化ナトリウム水
溶液２００ｍｌに、前記コラーゲン短繊維を加えて３０
℃にて２時間撹拌し、３０分間静置した。短繊維を取り
出し、流水中に５時間浸漬して充分に洗浄し、蒸留水1
Ｌに均一に分散させてえられた短繊維分散液を１２×１
０ｃｍ、１００メッシュのステンレス篩上で手抄により
抄紙した。これを脱水し、そのまま３０℃にて風乾させ
た。これにグルタルアルデヒド０．０１ｖ／ｖ％を含む
０．１ｗ／ｖ％コラーゲン水溶液を噴霧器より１００ｍ
Ｌ／ｍ²噴霧し、３０℃で風乾した。これを流水洗浄し
て再び風乾して、１２×１０ｃｍのシート状のコラーゲ
ン不織布をえた。Reference Example Preparation of Collagen Nonwoven Fabric 50 ml of an aqueous solution of atelocollagen (manufactured by Koken Co., Ltd.) adjusted to 2 w / v% (pH adjusted to 3 with hydrochloric acid) was passed through a nozzle having a hole diameter of 0.2 mm to 5 L of 26 w / v% sodium chloride. Spinning by a wet method into a coagulation bath containing an aqueous solution,
The obtained regenerated collagen fiber was dried at room temperature and then cut with a cutter to prepare a short fiber having a length of 4 to 8 mm and a fineness of 10 denier. Glutaraldehyde 0.05v / v
30% by adding the collagen short fibers to 200 ml of a 10 w / v% sodium chloride aqueous solution containing 30% by weight.
The mixture was stirred at 0 ° C. for 2 hours and allowed to stand for 30 minutes. Take out the short fibers, soak them in running water for 5 hours to thoroughly wash them, and then use distilled water 1
12 x 1 of the short fiber dispersion obtained by uniformly dispersing in L
Paper was made by hand on a 0 cm, 100 mesh stainless sieve. This was dehydrated and air dried at 30 ° C. as it was. A 0.1 w / v% collagen aqueous solution containing 0.01 v / v% of glutaraldehyde was added to the sprayer 100 m.
It was sprayed with L / m ² and air dried at 30 ° C. This was washed with running water and air-dried again to obtain a 12 × 10 cm sheet-like collagen nonwoven fabric.

【００４２】実施例１ 複合培養真皮の作製 清潔な環境下でバイオプシーされたヒトの皮膚片（約２
×２ｃｍ、厚さ約０．５ｍｍ）をイソジン溶液（明治製
菓（株）製）に浸漬して消毒し、ついでストレプトマイ
シン（１０００μｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１０００Ｕ
/ｍＬ）およびアンホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍＬ）
を含有したハンクス液に室温、３０分間浸漬した。Example 1 Preparation of Composite Cultured Dermis Human skin pieces biopsied in a clean environment (about 2
× 2 cm, thickness about 0.5 mm) is immersed in Isodine solution (manufactured by Meiji Seika Co., Ltd.) to disinfect, and then streptomycin (1000 μg / mL) and penicillin (1000 U)
/ mL) and amphotericin B (2.5 μg / mL)
It was immersed for 30 minutes at room temperature in a Hanks' solution containing.

【００４３】つぎにディスパーゼ溶液（ディスパーゼは
合同酒精（株）製、ＤＭＥＭはライフテックテクノロジ
ーズ社製）１０ｍＬに４℃にて２０時間浸漬し、ピンセ
ットを用いて表皮と真皮に分離し、えられた真皮部分を
ハサミでペースト状になるまで砕いてコラゲナーゼ溶液
（コラゲナーゼは和光純薬工業（株）製、ＤＭＥＭはラ
イフテックテクノロジーズ社製）１０ｍＬで約３時間、
３７℃にて振とうし結合組織を除去したのち、約７００
×ｇ、５分間の遠心分離にて沈殿させることによって線
維芽細胞をえた。えられた線維芽細胞はＤＭＥＭ（ライ
フテックテクノロジーズ社製）＋１０％ＦＣＳを用いて
５％ＣＯ₂インキュベーター中３７℃にて培養フラスコ
中で３日ごとに培地を交換しながら継代培養し、増殖さ
せた。Next, it was immersed in 10 mL of a dispase solution (Dispase manufactured by Godo Shusei Co., Ltd., DMEM manufactured by Lifetech Technologies Co., Ltd.) at 4 ° C. for 20 hours, and separated into epidermis and dermis using tweezers. Crush the dermis portion into a paste with scissors and collagenase solution (collagenase manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., DMEM manufactured by Lifetech Technologies, Inc.) in 10 mL for about 3 hours,
After shaking to remove connective tissue at 37 ° C., about 700
Fibroblasts were obtained by sedimentation by centrifugation at xg for 5 minutes. The obtained fibroblasts are subcultured by using DMEM (manufactured by Lifetech Technologies) + 10% FCS in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C in a culture flask while substituting the medium every 3 days for growth. Let

【００４４】こののち、トリプシン溶液（トリプシンは
ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂ．）
製、ＥＤＴＡは（株）同仁化学製）で細胞を剥がし、５
×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の播種密度にて参考例で作製
したコラーゲン不織布に播種した。コラーゲン不織布
は、線維芽細胞を播種する前にまず５ｍｌのＦＣＳに浸
漬し、３７℃にて２０時間静置した。細胞播種後、室温
にて６時間静置したのちＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ ２０
ｍｌを加え、５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃に
て７日間、３日ごとに培地を交換しながら培養し複合培
養真皮をえた。After this, a trypsin solution (trypsin is DIFCO Lab.)
And EDTA for Dojindo Co., Ltd.)
The collagen non-woven fabric prepared in Reference Example was seeded at a seeding density of × 10 ⁴ cells / cm ² . The collagen non-woven fabric was first immersed in 5 ml of FCS before seeding with fibroblasts, and allowed to stand at 37 ° C. for 20 hours. After seeding the cells, the cells were allowed to stand at room temperature for 6 hours, and then DMEM + 10% FCS 20
ml was added, and the cells were cultured in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C. for 7 days while changing the medium every 3 days to obtain a complex-cultured dermis.

【００４５】ヌードマウスの背部に直径２ｃｍの全層欠
損を作製した。えられた複合培養真皮を欠損部形状に合
わせて切取り、適用し、被覆材と共に周囲を縫合し弾性
包帯で固定した。２週間後、欠損部は浸出液の滞留を認
めず、良性肉芽組織が形成されており、創縁より表皮組
織の進展が認められており、順調な治癒を示した。A 2 cm diameter full-thickness defect was prepared on the back of a nude mouse. The obtained composite cultured dermis was cut out according to the shape of the defect, applied, and the surroundings were sewn together with the covering material and fixed with an elastic bandage. Two weeks later, no leaching fluid was retained in the defect, benign granulation tissue was formed, and epidermal tissue was observed to develop from the wound edge, indicating a successful healing.

【００４６】実施例２ 複合培養皮膚の作製 表皮細胞は、ヒトの皮膚片（約２×２ｃｍ、厚さ約０．
５ｍｍ）から実施例１に記載したと同様に分離した表皮
を、トリプシン溶液１０ｍｌで１５分間、３７℃にて浸
漬して処理したのちＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中に移し、
振とうすることにより細胞を分散させ、約４００×ｇ、
５分間の遠心分離にて沈殿させることによって集め、本
明細書に記載した組成よりなるグリーン培地に懸濁し
た。表皮細胞は以下の支持細胞を用いて培養増殖させ
た。マウス由来線維芽細胞である３Ｔ３細胞はＤＭＥＭ
＋１０％ＦＣＳ中、サブコンフルエントとなるまで５％
ＣＯ₂インキュベーター中３７℃にて培養フラスコ中で
培養した。ついで、培地を除去してハンクス液ですす
ぎ、ＤＭＥＭを加えてここに最終濃度が０．０００４％
になるようにマイトマイシンＣ（和光純薬工業（株）
製）含有生理的食塩水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加
した。この培養フラスコを３７℃で２時間静置したの
ち、ハンクス液を用いて洗浄してマイトマイシンＣを除
き、増殖能が消失した３Ｔ３細胞をトリプシン溶液にて
培養フラスコから剥がし、遠心分離して採取した。えら
れた３Ｔ３細胞は、グリーン培地に懸濁し、計数後２×
１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の密度となるよう調製して培養
フラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ₂インキューベー
タ中で培養した。Example 2 Preparation of Composite Cultured Skin Epidermal cells were human skin pieces (about 2 × 2 cm, thickness about 0.
5 mm) and the epidermis separated in the same manner as described in Example 1 were immersed in 10 ml of trypsin solution for 15 minutes at 37 ° C., treated, and then transferred into DMEM + 10% FCS.
Disperse the cells by shaking, about 400 × g,
It was collected by sedimentation by centrifugation for 5 minutes and suspended in a green medium of the composition described herein. The epidermal cells were cultured and grown using the following feeder cells. 3T3 cells, which are mouse-derived fibroblasts, are DMEM
5% in + 10% FCS until sub-confluent
It was cultivated in a culture flask at 37 ° C. in a CO ₂ incubator. Then remove the medium and rinse with Hank's solution, add DMEM to a final concentration of 0.0004%.
Mitomycin C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Manufactured by K.K.) containing physiological saline solution (0.1 mg / mL) was added. After this culture flask was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours, it was washed with Hank's solution to remove mitomycin C, and the 3T3 cells in which the proliferation ability had disappeared were peeled from the culture flask with a trypsin solution and collected by centrifugation. . The obtained 3T3 cells were suspended in Green medium and counted 2 ×.
It was prepared to have a density of 10 ⁴ cells / cm ² , seeded in a culture flask, and cultured at 37 ° C. in a 5% CO ₂ incubator.

【００４７】このようにして調製した３Ｔ３細胞を播種
した翌日、前記表皮細胞をこれに播種し、３７℃にて５
％ＣＯ₂インキュベーター中で培養増殖させた。The next day after seeding the thus prepared 3T3 cells, the epidermal cells were seeded thereon, and the cells were incubated at 37 ° C. for 5 hours.
Cultures were grown in a% CO ₂ incubator.

【００４８】実施例１で作製した複合培養真皮の培地を
除去し、複合培養真皮を反転させ、前記で培養増殖させ
た表皮細胞を２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の密度で播種
した。これをクリーンベンチの中で６時間静置したの
ち、グリーン培地２０ｍｌを加えて５％のＣＯ₂インキ
ュベーター中で３７℃にて１４日間培養し、複合培養皮
膚をえた。The medium of the composite cultured dermis produced in Example 1 was removed, the composite cultured dermis was inverted, and the epidermal cells cultured and proliferated as described above were seeded at a density of 2 × 10 ⁵ cells / cm ² . This was left to stand in a clean bench for 6 hours, 20 ml of a green medium was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. for 14 days in a 5% CO ₂ incubator to obtain a complex culture skin.

【００４９】試験例 培養皮膚のマトリックス（基材）としての不織布とコラ
ーゲンスポンジとの比較 １ｗ／ｖ％コラーゲン水溶液をｐＨ４に調整したうえで
ホモジネートし、気泡を含ませた。こののち、このコラ
ーゲン水溶液を樹脂製の型（６×１０ｃｍ）に流し込み
アンモニアガス雰囲気下２時間静置してゲル化させた。
こののち、１５時間流水中にて洗浄し、これを凍結真空
乾燥して約１５００μＷ/ｃｍ²、３０分間紫外線（ＵＶ
Ｐ社製）を照射して約６×１０ｃｍのコラーゲンスポン
ジをえた。ここで作製した、スポンジ形状のものは培地
中に浸漬後ピンセットで持ち上げると切れやすいが該不
織布は、切れずに扱いやすいものであった。Test Example Comparison of non-woven fabric as a matrix (base material) for cultured skin and collagen sponge A 1 w / v% collagen aqueous solution was adjusted to pH 4 and homogenized to contain air bubbles. After this, this collagen aqueous solution was poured into a resin mold (6 × 10 cm) and allowed to stand in an ammonia gas atmosphere for 2 hours for gelation.
After that, it was washed in running water for 15 hours, freeze-dried and freeze-dried at about 1500 μW / cm ² for 30 minutes.
(Manufactured by Company P) to obtain a collagen sponge of about 6 × 10 cm. The sponge-shaped one produced here was easy to cut by immersing it in a medium and then lifting it with tweezers, but the nonwoven fabric was easy to handle without breaking.

【００５０】参考例でえたコラーゲン不織布と前記コラ
ーゲンスポンジをダンベル形状（ストレート部分の幅２
ｍｍ）にしたものを１０分間生理食塩水に浸漬し、乾か
ないうちに２５℃、ＲＨ５０％引張強度試験を行った。
試験は、万能材料試験機（インストロン社製、Ｎｏ．４
３０１）によって行った。The collagen nonwoven fabric obtained in the reference example and the collagen sponge were dumbbell-shaped (the width of the straight portion was 2
mm) was immersed in physiological saline for 10 minutes, and a RH 50% tensile strength test was conducted at 25 ° C. before it was dried.
The test is a universal material testing machine (Instron, No. 4)
301).

【００５１】 Ｌｏａｄ Ｓｔｒｅｓｓ （最大荷重時） （最大荷重時） （Ｎ） （Ｎ／ｍｍ²） コラーゲン不織布 ０．１１２ ０．２６４ （ｎ＝６） コラーゲンスポンジ ０．０９７ ０．１０８ （ｎ＝６）Load Stress (at maximum load) (at maximum load) (N) (N / mm ² ) Collagen nonwoven fabric 0.112 0.264 (n = 6) Collagen sponge 0.097 0.108 (n = 6)

【００５２】[0052]

【発明の効果】本発明によれば、取扱いやすい強度を有
し、また培養皮膚適用時に前記培養皮膚適用創面から培
養皮膚に播種培養された細胞への栄養供給、および適用
創面に過度に滞留する浸出液の排出が円滑に行なわれう
るコラーゲン不織布を基材とする培養皮膚を提供するこ
とが可能となる。EFFECTS OF THE INVENTION According to the present invention, it has a strength that is easy to handle, and at the time of applying the cultured skin, it supplies nutrients to the cells seeded and cultured on the cultured skin from the wound surface to which the cultured skin is applied, and excessively stays on the applied wound surface. It is possible to provide a cultured skin having a collagen nonwoven fabric as a base material on which the exudate can be discharged smoothly.

Claims (9)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 コラーゲン不織布の少なくとも片面に皮
膚由来の線維芽細胞を播種培養する工程を含んでなる培
養皮膚の製造法。1. A method for producing cultured skin, which comprises a step of seeding and culturing skin-derived fibroblasts on at least one surface of a collagen nonwoven fabric. 【請求項２】 コラーゲン不織布の片面に表皮細胞を播
種培養する工程を含んでなる培養皮膚の製造法。2. A method for producing cultured skin, which comprises a step of seeding and culturing epidermal cells on one side of a collagen nonwoven fabric. 【請求項３】 コラーゲン不織布の少なくとも片面に皮
膚由来の線維芽細胞を播種培養し、かつ該不織布の片面
に表皮細胞を播種培養する工程を含んでなる培養皮膚の
製造法。3. A method for producing a cultured skin, which comprises a step of seeding and culturing skin-derived fibroblasts on at least one side of a collagen nonwoven fabric, and seeding and culturing epidermal cells on one side of the nonwoven fabric. 【請求項４】 コラーゲンがアテロコラーゲンである請
求項１、２または３記載の製造法。4. The method according to claim 1, 2 or 3, wherein the collagen is atelocollagen. 【請求項５】 コラーゲン不織布と培養された皮膚由来
の細胞からなる培養皮膚。5. A cultured skin comprising collagen non-woven fabric and cultured skin-derived cells. 【請求項６】 コラーゲン不織布と培養された皮膚由来
の線維芽細胞からなる培養皮膚であって、該線維芽細胞
が前記不織布の少なくとも片面に播種培養された培養皮
膚。6. A cultured skin comprising a collagen nonwoven fabric and cultured skin-derived fibroblasts, wherein the fibroblasts are seed-cultured on at least one side of the nonwoven fabric. 【請求項７】 コラーゲン不織布と培養された表皮細胞
からなる培養皮膚であって、該表皮細胞が前記不織布の
片面に播種培養された培養皮膚。7. A cultured skin comprising collagen non-woven fabric and cultured epidermal cells, wherein the epidermal cells are seed-cultured on one surface of the non-woven fabric. 【請求項８】 コラーゲン不織布と培養された皮膚由来
の線維芽細胞および表皮細胞からなる培養皮膚であっ
て、該線維芽細胞が前記不織布の少なくとも片面に播種
培養され、かつ該表皮細胞が前記不織布の片面に播種培
養された培養皮膚。8. A cultured skin consisting of skin-derived fibroblasts and epidermal cells cultured with a collagen non-woven fabric, wherein the fibroblasts are seed-cultured on at least one side of the non-woven fabric, and the epidermal cells are the non-woven fabric. Cultured skin seeded and cultured on one side. 【請求項９】 コラーゲンがアテロコラーゲンである請
求項５、６、７または８記載の培養皮膚。9. The cultured skin according to claim 5, 6, 7 or 8, wherein the collagen is atelocollagen.