JPH0937778A - Hiv−2レトロウイルスの回収及び精製方法 - Google Patents
Hiv−2レトロウイルスの回収及び精製方法Info
- Publication number
- JPH0937778A JPH0937778A JP8193779A JP19377996A JPH0937778A JP H0937778 A JPH0937778 A JP H0937778A JP 8193779 A JP8193779 A JP 8193779A JP 19377996 A JP19377996 A JP 19377996A JP H0937778 A JPH0937778 A JP H0937778A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hiv
- virus
- cdna
- probe
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 43
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title description 2
- 238000007670 refining Methods 0.000 title 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 claims abstract description 244
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 81
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 80
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 27
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 23
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 8
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 207
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 abstract description 44
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 34
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 34
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 abstract description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 abstract description 2
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 abstract description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 129
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 86
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 57
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 52
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 46
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 45
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 42
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 42
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 38
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 30
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 27
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 27
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 26
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 15
- 101710072850 Poxin Proteins 0.000 description 14
- 101710142282 Protein P26 Proteins 0.000 description 14
- 102100032106 Transmembrane emp24 domain-containing protein 3 Human genes 0.000 description 14
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 102100033254 Tumor suppressor ARF Human genes 0.000 description 11
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 11
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 11
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N Cysteine Chemical compound SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 8
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 8
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 7
- 108010015780 Viral Core Proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 7
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 7
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 5
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 5
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 5
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 5
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 4
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 208000019902 chronic diarrheal disease Diseases 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102100020780 DNA polymerase delta subunit 4 Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 3
- 101710152529 Fibrohexamerin Proteins 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 3
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 3
- 101710147507 Neutrophil gelatinase-associated lipocalin Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000205707 Cystoisospora belli Species 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 206010023076 Isosporiasis Diseases 0.000 description 2
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- 101800000507 Non-structural protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 206010030154 Oesophageal candidiasis Diseases 0.000 description 2
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 102400001093 PAK-2p27 Human genes 0.000 description 2
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 241001529934 Simian T-lymphotropic virus 3 Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 201000005655 esophageal candidiasis Diseases 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 101800000629 p34 Proteins 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 2
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700016947 Bos taurus structural-GP Proteins 0.000 description 1
- 201000004813 Bronchopneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010006473 Bronchopulmonary aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 102100039398 C-X-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 206010007953 Central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010057854 Cerebral Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000223935 Cryptosporidium Species 0.000 description 1
- 102100028717 Cytosolic 5'-nucleotidase 3A Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101000889128 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 1
- 108010001584 Human immunodeficiency virus 2 reverse transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000567229 Isospora Species 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 206010025327 Lymphopenia Diseases 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102400001092 PAK-2p34 Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000233870 Pneumocystis Species 0.000 description 1
- 206010035742 Pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 101710192141 Protein Nef Proteins 0.000 description 1
- 208000004430 Pulmonary Aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241001466984 Simian T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710194518 T4 protein Proteins 0.000 description 1
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001064 anti-interferon Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 201000009636 cerebral lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000000423 heterosexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000020442 loss of weight Diseases 0.000 description 1
- 208000010949 lymph node disease Diseases 0.000 description 1
- 231100001023 lymphopenia Toxicity 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005088 multinucleated cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 201000000317 pneumocystosis Diseases 0.000 description 1
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 208000015768 polyposis Diseases 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004217 thyroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000721 thyroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
- G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
- G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
- G01N2333/162—HIV-1, HIV-2 env, e.g. gp160, gp110/120, gp41, V3, peptid T, DC4-Binding site
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 HIV-2 レトロウイルスを回収し精製する。
【解決手段】 HIV-2 レトロウイルスを産生するため
に、ヒトT4リンパ球又は前記T4リンパ球から誘導されT4
表現型を含む永久細胞株を、HIV-2 ウイルスの単離物に
予め感染させた後に培養し、特に逆転写酵素活性レベル
が所定閾値に到達したときに前記リンパ球又は細胞株の
培地中に遊離された量のウイルスを分画遠心によって回
収し精製することを特徴とする方法。
に、ヒトT4リンパ球又は前記T4リンパ球から誘導されT4
表現型を含む永久細胞株を、HIV-2 ウイルスの単離物に
予め感染させた後に培養し、特に逆転写酵素活性レベル
が所定閾値に到達したときに前記リンパ球又は細胞株の
培地中に遊離された量のウイルスを分画遠心によって回
収し精製することを特徴とする方法。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト後天性免疫不
全症候群(エイズ)へと進展するリンパ節障害を発症さ
せる能力をもつ新規なクラスのウイルス(HIV-2 )を回
収し精製する方法に係る。
全症候群(エイズ)へと進展するリンパ節障害を発症さ
せる能力をもつ新規なクラスのウイルス(HIV-2 )を回
収し精製する方法に係る。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】エイズ
発病の原因であることが認識されLAV として知られる最
初のレトロウイルスの単離及び特性決定に関しては、F.
BARRE-SINOUSSI等の論文で1983年に既に発表されている
(Science、vol.220 、No.45-49、20、p.868-871)。ま
た、エイズウイルスに対する抗体の存在を診断するため
に上記LAV ウイルスのある種の抽出物及び特にある種の
タンパク質を使用することは欧州特許出願第138667号に
詳細に記載されている。その後、LAV に類似の別の菌株
及びいくつかの変異株が単離された。これらの例として
HTLV−III 及びARV と指称されるものがある。
発病の原因であることが認識されLAV として知られる最
初のレトロウイルスの単離及び特性決定に関しては、F.
BARRE-SINOUSSI等の論文で1983年に既に発表されている
(Science、vol.220 、No.45-49、20、p.868-871)。ま
た、エイズウイルスに対する抗体の存在を診断するため
に上記LAV ウイルスのある種の抽出物及び特にある種の
タンパク質を使用することは欧州特許出願第138667号に
詳細に記載されている。その後、LAV に類似の別の菌株
及びいくつかの変異株が単離された。これらの例として
HTLV−III 及びARV と指称されるものがある。
【0003】1986年5 月にNatureに発表された新しい命
名法に従って、前記リンパ節障害及びエイズをヒトで誘
発し得るレトロウイルスは一般名HIV と指称されること
になった。これは「Human Immunodeficiency Virus(ヒ
ト免疫不全ウイルス)」の略号である。LAV 及びその変
異株によって形成されるレトロウイルスのサブグループ
は最初は「LAV タイプI」即ち「LAV-I」と指称され
た。本文中ではこのサブグループを以後HIV-1 と指称す
るが、HIV-1 ウイルスクラスに属するレトロウイルスの
菌株(特にLAAV、IDAV-4及びIDAV-2)のなかで前記欧州
特許出願第138667号に記載された菌株を示すときはLAV
なる用語を維持することを理解されたい。この菌株は後
述する比較実験で LAVBRU として使用されており、1983
年7 月15日にフランス、パリのパスツール研究所のColl
ection Nationale des Cultures deMicro-Organismes(C
NCM) に受託番号I-232 で寄託された。
名法に従って、前記リンパ節障害及びエイズをヒトで誘
発し得るレトロウイルスは一般名HIV と指称されること
になった。これは「Human Immunodeficiency Virus(ヒ
ト免疫不全ウイルス)」の略号である。LAV 及びその変
異株によって形成されるレトロウイルスのサブグループ
は最初は「LAV タイプI」即ち「LAV-I」と指称され
た。本文中ではこのサブグループを以後HIV-1 と指称す
るが、HIV-1 ウイルスクラスに属するレトロウイルスの
菌株(特にLAAV、IDAV-4及びIDAV-2)のなかで前記欧州
特許出願第138667号に記載された菌株を示すときはLAV
なる用語を維持することを理解されたい。この菌株は後
述する比較実験で LAVBRU として使用されており、1983
年7 月15日にフランス、パリのパスツール研究所のColl
ection Nationale des Cultures deMicro-Organismes(C
NCM) に受託番号I-232 で寄託された。
【0004】本発明の主題を成す新規なレトロウイル
ス、及びこれまで「LAV タイプII」即ち「LAV-II」と指
称され本発明レトロウイルス同様にヒトリンパ球で増殖
し得る関連ウイルス菌株を以後「HIV-2 」と指称する。
但し、後述するある種のHIV-2単離物は、単離物提供患
者を示す3 文字を付けて表記されていることを理解され
たい。
ス、及びこれまで「LAV タイプII」即ち「LAV-II」と指
称され本発明レトロウイルス同様にヒトリンパ球で増殖
し得る関連ウイルス菌株を以後「HIV-2 」と指称する。
但し、後述するある種のHIV-2単離物は、単離物提供患
者を示す3 文字を付けて表記されていることを理解され
たい。
【0005】「HIV-2 」グループは、in vitroでヒトT4
リンパ球に親和性をもち、ヒトリンパ球で増殖するとこ
れらリンパ球に対する細胞変性効果をもち、全身性及び
持続性の多発腺症又はエイズの1 つの形態を発症させる
ウイルスのグループであると定義できる。後述する条件
下でHIV-2 レトロウイルスはHIV-1 タイプウイルスとは
異なることが証明された。また、HIV-2 レトロウイルス
及びHIV-1 タイプウイルスは双方とも、既知のその他の
ヒトレトロウイルス(HTLV−I及びHTLV−II)とも異な
る。
リンパ球に親和性をもち、ヒトリンパ球で増殖するとこ
れらリンパ球に対する細胞変性効果をもち、全身性及び
持続性の多発腺症又はエイズの1 つの形態を発症させる
ウイルスのグループであると定義できる。後述する条件
下でHIV-2 レトロウイルスはHIV-1 タイプウイルスとは
異なることが証明された。また、HIV-2 レトロウイルス
及びHIV-1 タイプウイルスは双方とも、既知のその他の
ヒトレトロウイルス(HTLV−I及びHTLV−II)とも異な
る。
【0006】ウイルス中にはかなり広い遺伝分散性が存
在するが、今日までアメリカ、ヨーロッパ、ハイチ及び
アフリカ人の患者から単離された種々のHIV-1 菌株は共
通の抗原部位をもつ。この部位は主要タンパク質、即ち
コアタンパク質 p25、エンベロープ糖タンパク質gp110
及びトランスメンブランタンパク質gp41-43 に保持され
ている。このため、例えば始原型LAV 菌株をキャリアの
出身地にかかわりなく総てのキャリアの総てのHIV-1 ク
ラスウイルスに対する抗体の検出のための抗原の菌株と
して使用することが可能である。従ってこの菌株は、特
にELISA 法として公知の免疫蛍光法、ウエスタンブロッ
ト(イムノインプリンティング)法、RIPA(免疫沈降ア
ッセイ)法等を用いて供血者及び患者で抗HIV-1 抗体を
検出するために広く使用されている。
在するが、今日までアメリカ、ヨーロッパ、ハイチ及び
アフリカ人の患者から単離された種々のHIV-1 菌株は共
通の抗原部位をもつ。この部位は主要タンパク質、即ち
コアタンパク質 p25、エンベロープ糖タンパク質gp110
及びトランスメンブランタンパク質gp41-43 に保持され
ている。このため、例えば始原型LAV 菌株をキャリアの
出身地にかかわりなく総てのキャリアの総てのHIV-1 ク
ラスウイルスに対する抗体の検出のための抗原の菌株と
して使用することが可能である。従ってこの菌株は、特
にELISA 法として公知の免疫蛍光法、ウエスタンブロッ
ト(イムノインプリンティング)法、RIPA(免疫沈降ア
ッセイ)法等を用いて供血者及び患者で抗HIV-1 抗体を
検出するために広く使用されている。
【0007】しかしながら、西アフリカ出身の患者のHI
V-1 溶菌液について行なった血清学的研究によれば、こ
れらの溶菌液は臨床的及び免疫学的にはエイズの徴候を
示したにもかかわらず血清反応は陰性又は極めて弱い陽
性でしかなかった。
V-1 溶菌液について行なった血清学的研究によれば、こ
れらの溶菌液は臨床的及び免疫学的にはエイズの徴候を
示したにもかかわらず血清反応は陰性又は極めて弱い陽
性でしかなかった。
【0008】これらの患者の1 人の培養リンパ球から初
めてHIV-2 が単離された。このソースから単離されたHI
V-2 の電子顕微鏡で観察された構造及びSDS ゲル電気泳
動におけるタンパク質プロフィールはHIV-1 に類似して
いた。しかしながら総体的に、この新規なレトロウイル
スHIV-2 はタンパク質の抗原ホモロジー及び遺伝物質の
ホモロジーの双方の見地からはHIV-1 との関連が薄い。
めてHIV-2 が単離された。このソースから単離されたHI
V-2 の電子顕微鏡で観察された構造及びSDS ゲル電気泳
動におけるタンパク質プロフィールはHIV-1 に類似して
いた。しかしながら総体的に、この新規なレトロウイル
スHIV-2 はタンパク質の抗原ホモロジー及び遺伝物質の
ホモロジーの双方の見地からはHIV-1 との関連が薄い。
【0009】この新しいレトロウイルス、又はこれと等
価の抗原特性及び免疫特性をもつレトロウイルスは、ア
フリカ住民又はアフリカ滞在経験者から初めて検出され
たエイズ形態を誘発するウイルス又はウイルス変異株の
感染を診断するための抗原ソースを構成する。
価の抗原特性及び免疫特性をもつレトロウイルスは、ア
フリカ住民又はアフリカ滞在経験者から初めて検出され
たエイズ形態を誘発するウイルス又はウイルス変異株の
感染を診断するための抗原ソースを構成する。
【0010】典型的にはこのウイルスは、輸血及び薬物
常用の経験のない28歳の異性愛患者からヘパリンの存在
下に採取された血液から単離された。患者は1983年以来
かなり慢性の下痢が続きときどき発熱して体重が極度に
減少した(17kg)。その後カンジダCandida 及びセラチア
Seratia に感染しエイズに典型的な食道カンジダ症(can
didiasis)を示した。
常用の経験のない28歳の異性愛患者からヘパリンの存在
下に採取された血液から単離された。患者は1983年以来
かなり慢性の下痢が続きときどき発熱して体重が極度に
減少した(17kg)。その後カンジダCandida 及びセラチア
Seratia に感染しエイズに典型的な食道カンジダ症(can
didiasis)を示した。
【0011】この患者はまた、貧血、皮膚アネルギー及
びリンパ球減少を示し、T4リンパ球/T8リンパ球の比が
0.15でT4リンパ球レベルは血清mm3 当たり100 未満であ
る。培養リンパ球はフィトヘマグルチニン及びコンカナ
バリンA の刺激に反応しなかった。この患者はまたS.en
teriditis による再発性菌血症、cryptosporidioses、イソ
スホ゜ラ・ヘ゛リィ(Isospora belli)による感染症及び脳トキソプ
ラズマ症に罹患していた。
びリンパ球減少を示し、T4リンパ球/T8リンパ球の比が
0.15でT4リンパ球レベルは血清mm3 当たり100 未満であ
る。培養リンパ球はフィトヘマグルチニン及びコンカナ
バリンA の刺激に反応しなかった。この患者はまたS.en
teriditis による再発性菌血症、cryptosporidioses、イソ
スホ゜ラ・ヘ゛リィ(Isospora belli)による感染症及び脳トキソプ
ラズマ症に罹患していた。
【0012】これらの併発症状はHIV-1 ウイルスによっ
て生じるタイプの「エイズ関連症候群」即ちARC(AIDS-R
elated Complex) の徴候である。またこれらの種々の所
見は米国、アトランタのCenter of Disease Control(CD
C)で採用された判定基準とも一致した。
て生じるタイプの「エイズ関連症候群」即ちARC(AIDS-R
elated Complex) の徴候である。またこれらの種々の所
見は米国、アトランタのCenter of Disease Control(CD
C)で採用された判定基準とも一致した。
【0013】
【課題を解決するための手段】HIV-2 レトロウイルスを
産生するために、ヒトT4リンパ球又は前記T4リンパ球か
ら誘導されT4表現型を含む永久細胞株を、HIV-2 ウイル
スの単離物に予め感染させた後に培養し、特に逆転写酵
素活性レベルが所定閾値に到達したときに前記リンパ球
又は細胞株の培地中に遊離された量のウイルスを特にシ
ョ糖又はmetrizamide の勾配中で分画遠心によって回収
し精製することを特徴とする方法を提供する。
産生するために、ヒトT4リンパ球又は前記T4リンパ球か
ら誘導されT4表現型を含む永久細胞株を、HIV-2 ウイル
スの単離物に予め感染させた後に培養し、特に逆転写酵
素活性レベルが所定閾値に到達したときに前記リンパ球
又は細胞株の培地中に遊離された量のウイルスを特にシ
ョ糖又はmetrizamide の勾配中で分画遠心によって回収
し精製することを特徴とする方法を提供する。
【0014】
【発明の実施の形態】患者からリンパ球を培養しレトロ
ウイルスを単離するためには、BARRE-SINOUSSIの論文及
び欧州特許出願第84/401.834−0.138.667 号に記載のHI
V-1 の単離方法を使用する。これらの方法を以下に簡単
に説明する。フィトヘマグルチニン(PHA) で3 日間刺激
したリンパ球を、10%のウシ胎児血清と10-5M のβ- メ
ルカプトエタノールとインターロイキン-2と抗-(ヒトイ
ンターフェロンα)血清とを添加したRPMI1640培地で培
養する。
ウイルスを単離するためには、BARRE-SINOUSSIの論文及
び欧州特許出願第84/401.834−0.138.667 号に記載のHI
V-1 の単離方法を使用する。これらの方法を以下に簡単
に説明する。フィトヘマグルチニン(PHA) で3 日間刺激
したリンパ球を、10%のウシ胎児血清と10-5M のβ- メ
ルカプトエタノールとインターロイキン-2と抗-(ヒトイ
ンターフェロンα)血清とを添加したRPMI1640培地で培
養する。
【0015】ウイルスの産生を逆転写酵素活性によって
追跡した。培養上清中でピークウイルス活性は14日から
22日の間に生じ以後減少した。細胞培養物の減衰及び死
亡を追跡した。電子顕微鏡で観察するとHIV-1 の場合と
同様にHIV-2 に感染したリンパ球の切片は成熟に達した
ビリオンをもち感染細胞の表面でウイルス粒子が出芽し
ている。これらの単離ウイルスの培養物の産生に使用さ
れた細胞系は場合に応じてHUT 、CEM 又はMOLTのタイプ
の細胞系でもよく又はT4レセプターを担持するいかなる
樹立リンパ球細胞株でもよい。
追跡した。培養上清中でピークウイルス活性は14日から
22日の間に生じ以後減少した。細胞培養物の減衰及び死
亡を追跡した。電子顕微鏡で観察するとHIV-1 の場合と
同様にHIV-2 に感染したリンパ球の切片は成熟に達した
ビリオンをもち感染細胞の表面でウイルス粒子が出芽し
ている。これらの単離ウイルスの培養物の産生に使用さ
れた細胞系は場合に応じてHUT 、CEM 又はMOLTのタイプ
の細胞系でもよく又はT4レセプターを担持するいかなる
樹立リンパ球細胞株でもよい。
【0016】次にウイルスを供血者のリンパ球の培養物
中で増殖させ、次いでHUT78 のごとき白血病起源の連続
細胞系で増殖させた。この抗原及び核酸がHIV-1 のもの
とは実質的に異なることが特性決定によって判明した。
ウイルスを前記のごとき従来の文献に記載の方法で精製
した。このウイルスの最初の単離物はブタペスト条約に
基づき1985年12月19日に受託番号I-502 でCNCMに寄託さ
れ、その後LAV-II MIRと命名された。2 番目の単離物は
同様にブタペスト条約に基づき1986年2 月21日に受託番
号I-532 でCNCMに寄託され、LAV-II RODと命名された。
これら単離物はしばしば単にMIR 又はROD と指称され
る。
中で増殖させ、次いでHUT78 のごとき白血病起源の連続
細胞系で増殖させた。この抗原及び核酸がHIV-1 のもの
とは実質的に異なることが特性決定によって判明した。
ウイルスを前記のごとき従来の文献に記載の方法で精製
した。このウイルスの最初の単離物はブタペスト条約に
基づき1985年12月19日に受託番号I-502 でCNCMに寄託さ
れ、その後LAV-II MIRと命名された。2 番目の単離物は
同様にブタペスト条約に基づき1986年2 月21日に受託番
号I-532 でCNCMに寄託され、LAV-II RODと命名された。
これら単離物はしばしば単にMIR 又はROD と指称され
る。
【0017】一般的に本発明は、I-502 又はI-532 とし
てCNCMに寄託されたHIV-2 ウイルスと同じ免疫特性をも
つ構造タンパク質を含む等価のいかなるウイルス(例え
ば1986年12月19日にブタペスト条約に基づき受託番号I-
642 及びI-643 で夫々寄託されたHIV-2-IRMO及び HIV-2
-EHO)をも包含しまたそのいかなる変異株をも包含す
る。等価基準の定義に関しては後述する。
てCNCMに寄託されたHIV-2 ウイルスと同じ免疫特性をも
つ構造タンパク質を含む等価のいかなるウイルス(例え
ば1986年12月19日にブタペスト条約に基づき受託番号I-
642 及びI-643 で夫々寄託されたHIV-2-IRMO及び HIV-2
-EHO)をも包含しまたそのいかなる変異株をも包含す
る。等価基準の定義に関しては後述する。
【0018】本発明は、T4リンパ球又はT4表現型を担持
するリンパ球から誘導された永久細胞系中でHIV-2 ウイ
ルス又はその変異株を産生する方法に係る。この方法で
は、HIV-2 ウイルスに予め感染させたこれら細胞系を培
養し、特に逆転写酵素活性レベルが特定閾値に到達する
と培地中に遊離されたウイルス量を回収する。
するリンパ球から誘導された永久細胞系中でHIV-2 ウイ
ルス又はその変異株を産生する方法に係る。この方法で
は、HIV-2 ウイルスに予め感染させたこれら細胞系を培
養し、特に逆転写酵素活性レベルが特定閾値に到達する
と培地中に遊離されたウイルス量を回収する。
【0019】HIV-2 を培養するための好ましい永久細胞
系は例えばHUT78 細胞タイプである。HIV-2 に感染した
HUT78 系は1986年2 月6 日に受託番号I-519 でCNCMに寄
託された。培養は例えば以下のごとく行なわれる。
系は例えばHUT78 細胞タイプである。HIV-2 に感染した
HUT78 系は1986年2 月6 日に受託番号I-519 でCNCMに寄
託された。培養は例えば以下のごとく行なわれる。
【0020】感染HUT78 細胞 (106 /ml)を感染正常ヒト
リンパ球 (106 /ml)と共生培養する。培地は10%ウシ胎
児血清を含むRPMI1640である。15〜21日後にHUT78 細胞
中の細胞変性効果を観察する。この観察の1 週間後に培
地上清中の逆転写酵素を定量し、上清からのウイルス回
収を開始する。
リンパ球 (106 /ml)と共生培養する。培地は10%ウシ胎
児血清を含むRPMI1640である。15〜21日後にHUT78 細胞
中の細胞変性効果を観察する。この観察の1 週間後に培
地上清中の逆転写酵素を定量し、上清からのウイルス回
収を開始する。
【0021】培養に好適な別の細胞系はCEM なる指称で
知られる細胞系である。
知られる細胞系である。
【0022】CEM 細胞の感染及び感染したCEM 細胞の培
養は特に以下のごとく行なわれる。
養は特に以下のごとく行なわれる。
【0023】HIV-2 ウイルスに予め感染させたT4リンパ
球と非感染CEM 細胞とをCEM の感染に必要な期間だけ共
生培養する。次に例えば後述するごとき適当な培地中で
培養条件を維持し、感染細胞の逆転写酵素活性が十分な
レベルに到達すると産生ウイルスを培地から回収する。
球と非感染CEM 細胞とをCEM の感染に必要な期間だけ共
生培養する。次に例えば後述するごとき適当な培地中で
培養条件を維持し、感染細胞の逆転写酵素活性が十分な
レベルに到達すると産生ウイルスを培地から回収する。
【0024】特に、本文中で以後ROD と指称される患者
に由来のHIV-2 菌株で予め5 日間感染させたヒトT4リン
パ球とCEM とを後述する条件下で共生培養する。
に由来のHIV-2 菌株で予め5 日間感染させたヒトT4リン
パ球とCEM とを後述する条件下で共生培養する。
【0025】フィトヘマグルチニンで予め活性化した感
染T4リンパ球は、感染開始の3 日後に106 の正常T リン
パ球当たり5000cpm の逆転写酵素活性をもつことを示し
た。上清中の逆転写酵素活性の測定値が100,000cpmにな
るまで培養を継続した。次にこれらT4リンパ球をCEM 細
胞(3×106 感染正常T リンパ球)と接触させ、以下の培
地中で再インキュベートした。培地:2.92mg/mlのL-グ
ルタミンと10%補体除去ウシ胎児血清と2 μg/mlのポリ
ブレン(Polybrene) と0.05%の抗インターフェロンα血
清と100,000 μg/mlのペニシリンと10μg/mlのストレプ
トマイシンと10,000μg/mlのネオマイシンとを含むRPMI
1640。
染T4リンパ球は、感染開始の3 日後に106 の正常T リン
パ球当たり5000cpm の逆転写酵素活性をもつことを示し
た。上清中の逆転写酵素活性の測定値が100,000cpmにな
るまで培養を継続した。次にこれらT4リンパ球をCEM 細
胞(3×106 感染正常T リンパ球)と接触させ、以下の培
地中で再インキュベートした。培地:2.92mg/mlのL-グ
ルタミンと10%補体除去ウシ胎児血清と2 μg/mlのポリ
ブレン(Polybrene) と0.05%の抗インターフェロンα血
清と100,000 μg/mlのペニシリンと10μg/mlのストレプ
トマイシンと10,000μg/mlのネオマイシンとを含むRPMI
1640。
【0026】培地を毎週2 回交換する。
【0027】上清中で測定された逆転写酵素活性の測定
値を以下に示す。
値を以下に示す。
【0028】 0日 1,000(バックグラウンド) 15日 20,000 21日 200,000 35日 1,000,000 HIV-2 ウイルスに感染したCEM 培養物は1986年3 月24日
にパスツール研究所のCNCMに受託番号I-537 で寄託され
た。
にパスツール研究所のCNCMに受託番号I-537 で寄託され
た。
【0029】HIV-2 の構造に含まれる抗原及び核酸のい
くつかの特性は以下の条件下で行なった実験によって明
らかにされた。多くの場合これらの特性は別のタイプの
レトロウイルス、特にHIV-1 及びSIV における同じ特性
との比較によってよりはっきりする。
くつかの特性は以下の条件下で行なった実験によって明
らかにされた。多くの場合これらの特性は別のタイプの
レトロウイルス、特にHIV-1 及びSIV における同じ特性
との比較によってよりはっきりする。
【0030】次に添付図面について説明する。
【0031】第1図A、B及びCは、HIV-1 及びHIV-2
に夫々感染した患者の血清及びSTLV-III感染したアカゲ
ザルの血清とHIV-1 ウイルス抽出物との交差沈降実験に
関する。
に夫々感染した患者の血清及びSTLV-III感染したアカゲ
ザルの血清とHIV-1 ウイルス抽出物との交差沈降実験に
関する。
【0032】第2図A及びBは、SDS ポリアクリルアミ
ドゲル中のHIV-1 、HIV-2 及びSTLV-IIIの夫々のタンパ
ク質の電気泳動移動度の比較結果を示す。
ドゲル中のHIV-1 、HIV-2 及びSTLV-IIIの夫々のタンパ
ク質の電気泳動移動度の比較結果を示す。
【0033】第3図はHIV-1 、HIV-2 及びSTLV-IIIのゲ
ノム配列とHIV-1 ウイルスの種々のサブゲノム配列とを
含むプローブとの間の交差ハイブリダイゼーションの結
果を示す。
ノム配列とHIV-1 ウイルスの種々のサブゲノム配列とを
含むプローブとの間の交差ハイブリダイゼーションの結
果を示す。
【0034】第4図はHIV-2 ROD のRNA から誘導された
cDNAの制限マップを示す。
cDNAの制限マップを示す。
【0035】第5図はHIV-2 から誘導されたcDNAのE2フ
ラグメントの制限マップを示す。このフラグメントはHI
V-2 の 3′LTR 領域に対応する領域を含む。
ラグメントの制限マップを示す。このフラグメントはHI
V-2 の 3′LTR 領域に対応する領域を含む。
【0036】第6図はE2の一部分のヌクレオチド配列を
示す。この配列はHIV-2 のU3/R領域に対応する。
示す。この配列はHIV-2 のU3/R領域に対応する。
【0037】第7図は、 −一方ではHIV-1 の構造要素(第7A図)と HIV-1 3′ L
TRを含む領域に位置合わせされHIV-2 cDNAのE2領域から
誘導された配列を示し、 −他方ではHIV-2 のE2領域から誘導された配列と多数の
欠失及び挿入とを考慮して該配列に位置合わせされたHI
V-1 の対応配列とに存在する共通ヌクレオチドを示す
(第7B図)。
TRを含む領域に位置合わせされHIV-2 cDNAのE2領域から
誘導された配列を示し、 −他方ではHIV-2 のE2領域から誘導された配列と多数の
欠失及び挿入とを考慮して該配列に位置合わせされたHI
V-1 の対応配列とに存在する共通ヌクレオチドを示す
(第7B図)。
【0038】第8図はHIV-2 に由来のcDNAから得られた
幾つかの挿入によって修飾されたファージのいくつかの
クローン(クローンROD4、ROD27 及び ROD35)の構造を
概略的に示す。プラスミドpUC18 中でサブクローニング
されたROD4、ROD27 及びROD35 に由来の配列も図中に概
略的に示されている。サブクローニング配列は元のROD
4、ROD27 及びROD35 の領域と対応するように配置され
ている。
幾つかの挿入によって修飾されたファージのいくつかの
クローン(クローンROD4、ROD27 及び ROD35)の構造を
概略的に示す。プラスミドpUC18 中でサブクローニング
されたROD4、ROD27 及びROD35 に由来の配列も図中に概
略的に示されている。サブクローニング配列は元のROD
4、ROD27 及びROD35 の領域と対応するように配置され
ている。
【0039】第9図は、(a) 完全HIV-1 ゲノムの種々の
領域から取出された11個のフラグメント(このフラグメ
ントは図の下部に概略的に示されている)及びROD4に存
在するHIV-2 cDNAと(b) 同じcDNAをもつHIV-2 から得ら
れたフラグメントとの間のハイブリダイゼーションの相
対強度を示す。
領域から取出された11個のフラグメント(このフラグメ
ントは図の下部に概略的に示されている)及びROD4に存
在するHIV-2 cDNAと(b) 同じcDNAをもつHIV-2 から得ら
れたフラグメントとの間のハイブリダイゼーションの相
対強度を示す。
【0040】一般に、比較試験で使用された後述するHI
V-2 抗原は、CNCMに受託番号I-502で寄託されたHIV-2 M
IR 株から得られ、HIV-2 のゲノムDNA 由来のDNA 配列
は、CNCMに受託番号I-532 で寄託されたHIV-2 ROD 株か
ら得られる。
V-2 抗原は、CNCMに受託番号I-502で寄託されたHIV-2 M
IR 株から得られ、HIV-2 のゲノムDNA 由来のDNA 配列
は、CNCMに受託番号I-532 で寄託されたHIV-2 ROD 株か
ら得られる。
【0041】I.抗原特にタンパク質及び糖タンパク質 最初にHUT78 中で培養したウイルスを[35S]システイ
ンと[35S]メチオニンとによって代謝的に標識するた
め、対応する非標識アミノ酸を除去した培地中で上記の
放射性アミノ酸の存在下に感染細胞を14〜16時間インキ
ュベートした。[35S]システイン標識に関しては明細
書末尾に添付した参考文献目録の文献(21)に記載の方法
を用いる。次に透明な上清を採取し、20%ショ糖のバッ
ファ上でウイルスを 100,000 gで1 時間超遠心した。変
性条件下(SDS) のポリアクリルアミドゲル(12.5%)又
はポリアクリルアミドゲル(10%)+ビスアクリルアミ
ド(0.13%)と SDS(最終濃度 0.1%)とから成るゲル
中で電気泳動にかけてウイルスの主要抗原を分離した。
分子量標準として以下のカラーマーカーを使用した。
ンと[35S]メチオニンとによって代謝的に標識するた
め、対応する非標識アミノ酸を除去した培地中で上記の
放射性アミノ酸の存在下に感染細胞を14〜16時間インキ
ュベートした。[35S]システイン標識に関しては明細
書末尾に添付した参考文献目録の文献(21)に記載の方法
を用いる。次に透明な上清を採取し、20%ショ糖のバッ
ファ上でウイルスを 100,000 gで1 時間超遠心した。変
性条件下(SDS) のポリアクリルアミドゲル(12.5%)又
はポリアクリルアミドゲル(10%)+ビスアクリルアミ
ド(0.13%)と SDS(最終濃度 0.1%)とから成るゲル
中で電気泳動にかけてウイルスの主要抗原を分離した。
分子量標準として以下のカラーマーカーを使用した。
【0042】 ミオシン 200kd ホスホリラーゼB 97.4kd BSA 68kd 卵アルブミン 43kd α- キモトリプシン 25.7kd β- ラクトグロブリン 18.4kd リゾチーム 14.3kd 別の実験では別の分子量マーカーを使用した。例えば特
に第1a図、第1b図及び第1c図では(図中文字M で示す)
別の分子量マーカーを使用した。患者の血清中に存在す
る抗体を使用し免疫沈降(RIPA)又はイムノインプリン
ティング(ウエスタンブロット)後に抗原は容易に識別
され得る。見掛け移動度によって測定した見掛け分子量
はHIV-1 抗原の分子量に極めて近い値である。
に第1a図、第1b図及び第1c図では(図中文字M で示す)
別の分子量マーカーを使用した。患者の血清中に存在す
る抗体を使用し免疫沈降(RIPA)又はイムノインプリン
ティング(ウエスタンブロット)後に抗原は容易に識別
され得る。見掛け移動度によって測定した見掛け分子量
はHIV-1 抗原の分子量に極めて近い値である。
【0043】一般的に本文中の以下の記載では、「p 」
及び/又は「gp」に続く数字は対応するタンパク質及び
/又は糖タンパク質の分子量の概数を1000で除算した値
に対応する。例えば、p36 は分子量約36,000である。し
かしながらこれらの分子量の値は分子量の測定に使用さ
れた方法次第で5 %、10%又はそれ以上の範囲内のばら
つきがあることを理解されたい。
及び/又は「gp」に続く数字は対応するタンパク質及び
/又は糖タンパク質の分子量の概数を1000で除算した値
に対応する。例えば、p36 は分子量約36,000である。し
かしながらこれらの分子量の値は分子量の測定に使用さ
れた方法次第で5 %、10%又はそれ以上の範囲内のばら
つきがあることを理解されたい。
【0044】実験の反復によってHIV-2 抗原の見掛け分
子量をより正確に測定できた。従って、最初に約13,00
0、18,000及び25,000と夫々推定された3 つのコアタン
パク質は実際には12,000、16,000及び26,000に近い見掛
け分子量を有していた。これらのタンパク質を本文中で
は以後略号p12 、p16 及びp26 で示す。
子量をより正確に測定できた。従って、最初に約13,00
0、18,000及び25,000と夫々推定された3 つのコアタン
パク質は実際には12,000、16,000及び26,000に近い見掛
け分子量を有していた。これらのタンパク質を本文中で
は以後略号p12 、p16 及びp26 で示す。
【0045】見掛け分子量が32,000から42,000〜45,000
までの範囲の値であると推定されたタンパク質又は糖タ
ンパク質のバンドの存在に関しても同様に考察できる。
測定の反復によって最終的に見掛け分子量36,000に対応
するバンドを正確に定義できた。 本文中の以下の記載で
はこのバンドを略号p36 で示す。42,000〜45,000(p42)
の別のバンドも常に観察される。恐らくp36 又はp42 の
いずれかがウイルスのトランスメンブランタンパク質を
構成しているのであろう。
までの範囲の値であると推定されたタンパク質又は糖タ
ンパク質のバンドの存在に関しても同様に考察できる。
測定の反復によって最終的に見掛け分子量36,000に対応
するバンドを正確に定義できた。 本文中の以下の記載で
はこのバンドを略号p36 で示す。42,000〜45,000(p42)
の別のバンドも常に観察される。恐らくp36 又はp42 の
いずれかがウイルスのトランスメンブランタンパク質を
構成しているのであろう。
【0046】また、分子量130-140kd のオーダの主要エ
ンベロープ糖タンパク質が常に観察される。この糖タン
パク質を本文中で以後gp140 と指称する。
ンベロープ糖タンパク質が常に観察される。この糖タン
パク質を本文中で以後gp140 と指称する。
【0047】一般に分子量は±5 %の精度で測定される
が、 gp140(分子量140 ±10%)で観察されたようにこ
の精度は高分子量の抗原では多少低くなり得ることに留
意するとよい。このグループの抗原を([35S]システイン
で標識して) 検出する場合、実験室で使用される検出系
においては抗HIV-1 抗体を含む患者の血清又はDIAGNOST
ICS PASTEUR により商標「ELAVIA」として市販のHIV-1
溶菌液を使用する試験によって微弱にしか認識されな
い。この血清によってp26 タンパク質だけが僅かに免疫
沈降した。エンベロープタンパク質は沈降しなかった。
新しいウイルス(HIV-2) に感染した患者の血清はHIV-1
のp34 タンパク質を微かに認識した。使用検出系におい
て、別のHIV-1 タンパク質は認識されなかった。
が、 gp140(分子量140 ±10%)で観察されたようにこ
の精度は高分子量の抗原では多少低くなり得ることに留
意するとよい。このグループの抗原を([35S]システイン
で標識して) 検出する場合、実験室で使用される検出系
においては抗HIV-1 抗体を含む患者の血清又はDIAGNOST
ICS PASTEUR により商標「ELAVIA」として市販のHIV-1
溶菌液を使用する試験によって微弱にしか認識されな
い。この血清によってp26 タンパク質だけが僅かに免疫
沈降した。エンベロープタンパク質は沈降しなかった。
新しいウイルス(HIV-2) に感染した患者の血清はHIV-1
のp34 タンパク質を微かに認識した。使用検出系におい
て、別のHIV-1 タンパク質は認識されなかった。
【0048】対照的に、HIV-2 は、アカゲザルマカック
属(captive macaque of rhesus species) から最近単離
されたレトロウイルスから同様の条件下で分離され同等
の構造タンパク質又は糖タンパク質とある程度の免疫学
的相関を示すある種のタンパク質をもつ。この免疫学的
相関は別のタンパク質及び糖タンパク質では消失してい
る。サルのエイズの病因物質と推定されるこのレトロウ
イルスは、単離に成功した研究者(参考文献(16)〜(1
8))によってSTLV-III macと命名された。便宜上以下の
記載では、このレトロウイルスを単にSTLV-III(又は
「Simian Immunodeficiency Virus 」の略号で SIV)と
指称する。
属(captive macaque of rhesus species) から最近単離
されたレトロウイルスから同様の条件下で分離され同等
の構造タンパク質又は糖タンパク質とある程度の免疫学
的相関を示すある種のタンパク質をもつ。この免疫学的
相関は別のタンパク質及び糖タンパク質では消失してい
る。サルのエイズの病因物質と推定されるこのレトロウ
イルスは、単離に成功した研究者(参考文献(16)〜(1
8))によってSTLV-III macと命名された。便宜上以下の
記載では、このレトロウイルスを単にSTLV-III(又は
「Simian Immunodeficiency Virus 」の略号で SIV)と
指称する。
【0049】また、野性ミドリザルから別のレトロウイ
ルスが単離されSTLV-IIIAGM 又は SIVAGM と命名され
た。しかしながらアカゲザルに存在するウイルスと対照
的に、アフリカ産ミドリザルに存在する「STLV-II
IAGM 」はエイズタイプの疾患を全く誘発しないと考え
られる。
ルスが単離されSTLV-IIIAGM 又は SIVAGM と命名され
た。しかしながらアカゲザルに存在するウイルスと対照
的に、アフリカ産ミドリザルに存在する「STLV-II
IAGM 」はエイズタイプの疾患を全く誘発しないと考え
られる。
【0050】しかしながら、レトロウイルスSTLV-III m
acに対してもSTLV-IIIAGM に対してもHIV-2 の構造タン
パク質及び糖タンパク質の免疫学的相関は限られており
従って核酸配列の関係は限られている。ヒト又はサルに
感染し得るレトロウイルスの違いは実験によって初めて
確認され、以下の事実が判明した。
acに対してもSTLV-IIIAGM に対してもHIV-2 の構造タン
パク質及び糖タンパク質の免疫学的相関は限られており
従って核酸配列の関係は限られている。ヒト又はサルに
感染し得るレトロウイルスの違いは実験によって初めて
確認され、以下の事実が判明した。
【0051】HIV-2 ウイルスは、N.L.Letvin等、 Scien
ce(1985)、vol.230 、71-75 によって記載されたような
STLV-III mac増殖可能な処理条件下でin vivo 注射され
たときアカゲザルのリンパ球中で慢性的に増殖しない。
ce(1985)、vol.230 、71-75 によって記載されたような
STLV-III mac増殖可能な処理条件下でin vivo 注射され
たときアカゲザルのリンパ球中で慢性的に増殖しない。
【0052】このように、HIV-2 ウイルスが自然条件下
ではサルで増殖できないという推定に基づいて、HIV-2
ウイルスとSTLV-IIIウイルス単離物とを生物学的に識別
し得る。
ではサルで増殖できないという推定に基づいて、HIV-2
ウイルスとSTLV-IIIウイルス単離物とを生物学的に識別
し得る。
【0053】前記に引用した方法を使用し、STLV-IIIか
ら以下のタンパク質が得られた。
ら以下のタンパク質が得られた。
【0054】−分子量27キロダルトンのオーダの主要コ
アタンパク質 p27、 −主要エンベロープ糖タンパク質 gp140、 −ウイルスを[35S]システインで予め標識したときは
RIPAで観察されないがイムノインプリンティング(ウエ
スタンブロット)試験では広いバンドとして観察できる
おそらくはトランスメンブランタンパク質 p32。
アタンパク質 p27、 −主要エンベロープ糖タンパク質 gp140、 −ウイルスを[35S]システインで予め標識したときは
RIPAで観察されないがイムノインプリンティング(ウエ
スタンブロット)試験では広いバンドとして観察できる
おそらくはトランスメンブランタンパク質 p32。
【0055】HIV-2 の主要エンベロープ糖タンパク質
は、免疫学的にはHIV-1 の主要エンベロープの糖タンパ
ク質よりもSTLV-IIIの主要エンベロープの糖タンパク質
に近いことが判明した。
は、免疫学的にはHIV-1 の主要エンベロープの糖タンパ
ク質よりもSTLV-IIIの主要エンベロープの糖タンパク質
に近いことが判明した。
【0056】これらの知見は、分子量の観点だけでなく
免疫学的観点からも証明される。即ち、HIV-2 及びSTLV
-IIIの主要糖タンパク質の分子量は 130〜140 キロダル
トンであるのに対してHIV-1 の主要糖タンパク質の分子
量は約110 キロダルトンであり、またHIV-2 に感染した
患者から採取された血清特にHIV-2 gp140 に対して形成
された抗体はSTLV-III gp140を認識するがHIV-1 gp110
を認識しない。しかしながら、HIV-2gp140と反応しなか
った抗HIV-1 血清はHIV-2 抽出物中に存在する[35S]
システイン標識26kdタンパク質を沈降させる。
免疫学的観点からも証明される。即ち、HIV-2 及びSTLV
-IIIの主要糖タンパク質の分子量は 130〜140 キロダル
トンであるのに対してHIV-1 の主要糖タンパク質の分子
量は約110 キロダルトンであり、またHIV-2 に感染した
患者から採取された血清特にHIV-2 gp140 に対して形成
された抗体はSTLV-III gp140を認識するがHIV-1 gp110
を認識しない。しかしながら、HIV-2gp140と反応しなか
った抗HIV-1 血清はHIV-2 抽出物中に存在する[35S]
システイン標識26kdタンパク質を沈降させる。
【0057】HIV-2 の主要コアタンパク質はHIV-1 のp2
5 とSTLV-IIIのp27 との中間の平均分子量(約26,000)
をもつ。
5 とSTLV-IIIのp27 との中間の平均分子量(約26,000)
をもつ。
【0058】これらの観察は、前記患者の一人から単離
されたHIV-2 から得られたウイルス抽出物を用いて行な
った実験によって得られた。同様な結果は二番目の患者
由来のHIV-2 抽出物についても得られた。
されたHIV-2 から得られたウイルス抽出物を用いて行な
った実験によって得られた。同様な結果は二番目の患者
由来のHIV-2 抽出物についても得られた。
【0059】HIV-1 、HIV-2 及びSTLV-IIIに夫々感染し
た細胞を、非標識システインを含まず200 μCi/ml の[
35S]システインを含む培地中で16時間インキュベート
した。透明上清を60,000 gで90分間遠心した。ペレット
をRIPAバッファ(1)に溶解し、種々の血清と共に免疫
沈降させ、ドデシル硫酸ナトリウムを詰めたポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけた(SDS-PAGE)。
た細胞を、非標識システインを含まず200 μCi/ml の[
35S]システインを含む培地中で16時間インキュベート
した。透明上清を60,000 gで90分間遠心した。ペレット
をRIPAバッファ(1)に溶解し、種々の血清と共に免疫
沈降させ、ドデシル硫酸ナトリウムを詰めたポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけた(SDS-PAGE)。
【0060】観察された結果を第1a図、第1b図及び第1c
図に示す。
図に示す。
【0061】第1a図は、CEM C1.13 細胞系から得られた
HIV-1 のウイルス抽出物と以下の血清の夫々との間の免
疫沈降の観察結果を示す。
HIV-1 のウイルス抽出物と以下の血清の夫々との間の免
疫沈降の観察結果を示す。
【0062】−抗HIV-1 陽性血清(バンド 1)、 −前記の第1患者から得られた血清(バンド 2)、 −健康なアフリカ人抗HIV-1 抗体キャリアの血清(バン
ド3 )、 −STLV-IIIに感染したアカゲザルマカック属から得られ
た血清(バンド 4)、及び、 −前記の第2 患者から得られた血清(バンド 5)。
ド3 )、 −STLV-IIIに感染したアカゲザルマカック属から得られ
た血清(バンド 4)、及び、 −前記の第2 患者から得られた血清(バンド 5)。
【0063】第1b図は、第1 患者から採取されHUT78 細
胞と予め培養したHIV-2 抗原と種々の血清との間、即
ち、前記第1 患者の血清(バンド 1)、抗HIV-1 陽性血
清(バンド 2)、STLV-III感染アカゲザルマカック属の
血清(バンド 3)及び前記第2患者の血清(バンド 4)
との間の免疫沈降の観察結果を示す。
胞と予め培養したHIV-2 抗原と種々の血清との間、即
ち、前記第1 患者の血清(バンド 1)、抗HIV-1 陽性血
清(バンド 2)、STLV-III感染アカゲザルマカック属の
血清(バンド 3)及び前記第2患者の血清(バンド 4)
との間の免疫沈降の観察結果を示す。
【0064】最後に第1c図は、サルのエイズをもつアカ
ゲザルマカック属から得られたSTLV-III単離物の抗原間
の免疫沈降の観察結果を示す。バンド 1〜5 に関して使
用した血清は第1a図の場合と同じである。
ゲザルマカック属から得られたSTLV-III単離物の抗原間
の免疫沈降の観察結果を示す。バンド 1〜5 に関して使
用した血清は第1a図の場合と同じである。
【0065】M は、ミオシン (200kd)、ガラクトシダー
ゼ (130kd)、ウシ血清アルブミン(69kd)、ホスホリラー
ゼ B(93kd)、卵アルブミン(46kd)及び炭酸アンヒドラー
ゼ(30kd)のごときマーカーを示す。
ゼ (130kd)、ウシ血清アルブミン(69kd)、ホスホリラー
ゼ B(93kd)、卵アルブミン(46kd)及び炭酸アンヒドラー
ゼ(30kd)のごときマーカーを示す。
【0066】第2a図及び第2b図は、HIV-1 、HIV-2 及び
STLV-IIIのタンパク質の電気泳動移動度の比較結果を示
す。
STLV-IIIのタンパク質の電気泳動移動度の比較結果を示
す。
【0067】第2a図は、[35S]システインで標識した
ウイルス抽出物のSDS-PAGE免疫沈降後に行なった実験に
関する。種々のバンドは以下のウイルス抽出物に関す
る:患者1 から採取され同じ患者の血清によって免疫沈
降したウイルス(バンド 1)、抗HIV-1 又は抗HIV-2 抗
体を保有しないヒトの陰性コントロール血清で免疫沈降
した同じウイルス抽出物(バンド 2)、STLV-IIIに感染
したアカゲザルマカック属の血清で免疫沈降させたSTLV
-IIIウイルス抽出物(バンド3 )、同じウイルス抽出物
と陰性コントロール血清との間で観察された免疫沈降
(バンド 4)、ヨーロッパ人エイズ患者の血清で免疫沈
降させたHIV-1 抽出物。
ウイルス抽出物のSDS-PAGE免疫沈降後に行なった実験に
関する。種々のバンドは以下のウイルス抽出物に関す
る:患者1 から採取され同じ患者の血清によって免疫沈
降したウイルス(バンド 1)、抗HIV-1 又は抗HIV-2 抗
体を保有しないヒトの陰性コントロール血清で免疫沈降
した同じウイルス抽出物(バンド 2)、STLV-IIIに感染
したアカゲザルマカック属の血清で免疫沈降させたSTLV
-IIIウイルス抽出物(バンド3 )、同じウイルス抽出物
と陰性コントロール血清との間で観察された免疫沈降
(バンド 4)、ヨーロッパ人エイズ患者の血清で免疫沈
降させたHIV-1 抽出物。
【0068】第1b図はウエスタンブロット(イムノイン
プリンティング)実験で得られた結果を示す。感染又は
未感染のHUT-78細胞の細胞溶菌液をSDS-PAGE電気泳動に
かけ、前記第1 患者の血清(100倍希釈) と反応させる前
に電気泳動によってニトロセルロースフィルターに移
す。次にニトロセルロースフィルターを洗い、 125I標
識ヤギ抗ヒトIgG で可視化した結合抗体を検出する。
プリンティング)実験で得られた結果を示す。感染又は
未感染のHUT-78細胞の細胞溶菌液をSDS-PAGE電気泳動に
かけ、前記第1 患者の血清(100倍希釈) と反応させる前
に電気泳動によってニトロセルロースフィルターに移
す。次にニトロセルロースフィルターを洗い、 125I標
識ヤギ抗ヒトIgG で可視化した結合抗体を検出する。
【0069】バンド1,2 及び3 で観察されたスポットは
夫々前記血清と抽出物との間の凝集反応、即ち、未感染
HUT-78細胞の抽出物(バンド 1)、HIV-2 ウイルスに感
染したHUT-78細胞の抽出物(バンド 2)、STLV-IIIに感
染したHUT-78細胞の抽出物(バンド 3)との間の凝集反
応を示す。バンドの側部余白の数字は殆どの代表的ウイ
ルスタンパク質の概算分子量に対応する(分子量キロダ
ルトン)。
夫々前記血清と抽出物との間の凝集反応、即ち、未感染
HUT-78細胞の抽出物(バンド 1)、HIV-2 ウイルスに感
染したHUT-78細胞の抽出物(バンド 2)、STLV-IIIに感
染したHUT-78細胞の抽出物(バンド 3)との間の凝集反
応を示す。バンドの側部余白の数字は殆どの代表的ウイ
ルスタンパク質の概算分子量に対応する(分子量キロダ
ルトン)。
【0070】II.核酸 1)HIV-2 レトロウイルスのRNA 「スポットブロット」法でフィルターに付着させたウイ
ルスのRNA は、ストリンジェント条件下ではHIV-1 のDN
A とハイブリダイズしなかった。
ルスのRNA は、ストリンジェント条件下ではHIV-1 のDN
A とハイブリダイズしなかった。
【0071】「ストリンジェント条件」とは、HIV-2 の
RNA と32P で放射能標識(又はその他の方法で標識)し
た選択プローブとのハイブリダイゼーション反応をプロ
ーブの洗浄後に行なう処理条件を意味する。ハイブリダ
イゼーションは膜で、特に 0.1%SDS/5 ×SSC 中の50%
ホルムアミド(容量/容量)水溶液の存在下に42℃で18
時間行なわれる。ハイブリダイゼーション反応が生じた
膜を次に、0.15%のSDS と 0.1×SSC とを含むバッファ
中で65℃で洗浄する。
RNA と32P で放射能標識(又はその他の方法で標識)し
た選択プローブとのハイブリダイゼーション反応をプロ
ーブの洗浄後に行なう処理条件を意味する。ハイブリダ
イゼーションは膜で、特に 0.1%SDS/5 ×SSC 中の50%
ホルムアミド(容量/容量)水溶液の存在下に42℃で18
時間行なわれる。ハイブリダイゼーション反応が生じた
膜を次に、0.15%のSDS と 0.1×SSC とを含むバッファ
中で65℃で洗浄する。
【0072】「ノンストリンジェント条件」とは、ハイ
ブリダイゼーション反応と洗浄とが行なわれる処理条件
を意味すると理解されたい。即ち、30%のホルムアミド
を含む 5×SSC バッファ、 0.1%SDS 中で32P 標識(又
はその他の方法で標識)した選択プローブと42℃で18時
間接触させることによってハイブリダイゼーションを生
起し、 0.1%SDS と 2×SSC とを含むバッファ中で50℃
で膜の洗浄を行なう。
ブリダイゼーション反応と洗浄とが行なわれる処理条件
を意味すると理解されたい。即ち、30%のホルムアミド
を含む 5×SSC バッファ、 0.1%SDS 中で32P 標識(又
はその他の方法で標識)した選択プローブと42℃で18時
間接触させることによってハイブリダイゼーションを生
起し、 0.1%SDS と 2×SSC とを含むバッファ中で50℃
で膜の洗浄を行なう。
【0073】また、λJ19(Cell、1985、vol.40、p.9)由
来のHIV-1 のDNA をベクターpUC18中でクローニングし
て得られた組換プラスミドpBT1から成るハイブリダイゼ
ーションプローブを用いてハイブリダイゼーション実験
を行なった。ノンストリンジェント条件下では、HIV-2
のRNA とHIV-1 由来のクローン化DNA との間で弱いハイ
ブリダイゼーションしか観察されなかった。
来のHIV-1 のDNA をベクターpUC18中でクローニングし
て得られた組換プラスミドpBT1から成るハイブリダイゼ
ーションプローブを用いてハイブリダイゼーション実験
を行なった。ノンストリンジェント条件下では、HIV-2
のRNA とHIV-1 由来のクローン化DNA との間で弱いハイ
ブリダイゼーションしか観察されなかった。
【0074】HIV-1 のクローン化配列を含む別のプロー
ブも使用した。
ブも使用した。
【0075】(a) HIV-1 ゲノムのサブクローンから産生
されファージM13 に挿入されたHIV-1のサブゲノムDNA
の一本鎖プローブ。クローン領域はプロテアーゼ遺伝子
又はエンドヌクレアーゼ遺伝子に関連した。
されファージM13 に挿入されたHIV-1のサブゲノムDNA
の一本鎖プローブ。クローン領域はプロテアーゼ遺伝子
又はエンドヌクレアーゼ遺伝子に関連した。
【0076】ノンストリンジェント条件下でHIV-1 のエ
ンドヌクレアーゼ領域の1 つのプローブ(塩基3760と41
30との間のヌクレオチド配列)だけがHIV-2 と弱いハイ
ブリダイゼーションを生じた。「プロテアーゼ」プロー
ブ(塩基1680と1804との間のHIV-1 ヌクレオチド配列)
はノンストリンジェントな条件下でもHIV-2 とハイブリ
ダイズしなかった。
ンドヌクレアーゼ領域の1 つのプローブ(塩基3760と41
30との間のヌクレオチド配列)だけがHIV-2 と弱いハイ
ブリダイゼーションを生じた。「プロテアーゼ」プロー
ブ(塩基1680と1804との間のHIV-1 ヌクレオチド配列)
はノンストリンジェントな条件下でもHIV-2 とハイブリ
ダイズしなかった。
【0077】(b) (pUC18 中でサブクローニングされ
る) HIV-1の「エンベロープ」領域をコードする配列か
ら成るプローブpRS3は、ノンストリンジェント条件下で
HIV-2 とハイブリダイズしなかった。
る) HIV-1の「エンベロープ」領域をコードする配列か
ら成るプローブpRS3は、ノンストリンジェント条件下で
HIV-2 とハイブリダイズしなかった。
【0078】スポットブロット法はまたドットブロット
法としても知られる(スポットずつ転移)。
法としても知られる(スポットずつ転移)。
【0079】HIV-1 、HIV-2 及びSTLV-IIIのゲノムRNA
とHIV-1 ウイルスの種々のサブゲノム配列を含むプロー
ブとの間のハイブリダイゼーションの結果を第3図に示
す。
とHIV-1 ウイルスの種々のサブゲノム配列を含むプロー
ブとの間のハイブリダイゼーションの結果を第3図に示
す。
【0080】(各スポット毎に 0.5〜1 mlの割合の)種
々の培地の上清を45,000rpm で5 分間遠心した。ペレッ
トを 0.1%SDS を含むNTE バッファに再懸濁させニトロ
セルロースフィルターに付着させた。該フィルターを 2
×SSC 培地(0.3M NaCl 、0.03M クエン酸ナトリウム)
に予め浸漬した。(80℃で2 時間)ベーキング後、フィ
ルターをHIV-1 のゲノムサブフラグメントを含む種々の
プローブと共にノンストリンジェント条件下(30%ホル
ムアミド、 5×SSC 、40℃)でハイブリダイズし、 0.1
%SDS を含む 2×SSC を用いて50℃で洗浄し、増感スク
リーンと共に−70℃で48時間オートラジオグラフにかけ
た。
々の培地の上清を45,000rpm で5 分間遠心した。ペレッ
トを 0.1%SDS を含むNTE バッファに再懸濁させニトロ
セルロースフィルターに付着させた。該フィルターを 2
×SSC 培地(0.3M NaCl 、0.03M クエン酸ナトリウム)
に予め浸漬した。(80℃で2 時間)ベーキング後、フィ
ルターをHIV-1 のゲノムサブフラグメントを含む種々の
プローブと共にノンストリンジェント条件下(30%ホル
ムアミド、 5×SSC 、40℃)でハイブリダイズし、 0.1
%SDS を含む 2×SSC を用いて50℃で洗浄し、増感スク
リーンと共に−70℃で48時間オートラジオグラフにかけ
た。
【0081】プローブ 1〜4 は、(25)に記載の「プライ
ムカット」法で得られた一本鎖プローブである。この方
法を簡単に説明すると、M13 ウイルスに由来のサブゲノ
ムHIV-1 挿入物(30)を担持する一本鎖フラグメントをM1
3(BIOLADS)から得られたオリゴマーフラグメント(17ヌ
クレオチド)に結合した。次に、α位で32P 標識したdA
TP、dGTP、dTTP及びdCTB(Amersham 、3000Ci/mmol)の存
在下に、TMバッファ(10mM トリス、pH7.5 、 10mM MgCl
2 )中のKlenow酵素で相補鎖を合成した。次に、DNA を
適当な制限酵素で消化し、熱変性し、変性ポリアクリル
アミドゲル(TDEバッファ中に 6%アクリルアミド、8M尿
素含有)で電気泳動にかけた。次にゲルを5 分間オート
ラジオグラフにかけた。次に、プローブを切断し、300m
M のNaCl、 0.1%SDS バッファに溶出した。これら一本
鎖プローブの比活性(SA)を定量して 5×108 −109 崩壊
量/分/マイクログラム(dpm/μg)を得た。
ムカット」法で得られた一本鎖プローブである。この方
法を簡単に説明すると、M13 ウイルスに由来のサブゲノ
ムHIV-1 挿入物(30)を担持する一本鎖フラグメントをM1
3(BIOLADS)から得られたオリゴマーフラグメント(17ヌ
クレオチド)に結合した。次に、α位で32P 標識したdA
TP、dGTP、dTTP及びdCTB(Amersham 、3000Ci/mmol)の存
在下に、TMバッファ(10mM トリス、pH7.5 、 10mM MgCl
2 )中のKlenow酵素で相補鎖を合成した。次に、DNA を
適当な制限酵素で消化し、熱変性し、変性ポリアクリル
アミドゲル(TDEバッファ中に 6%アクリルアミド、8M尿
素含有)で電気泳動にかけた。次にゲルを5 分間オート
ラジオグラフにかけた。次に、プローブを切断し、300m
M のNaCl、 0.1%SDS バッファに溶出した。これら一本
鎖プローブの比活性(SA)を定量して 5×108 −109 崩壊
量/分/マイクログラム(dpm/μg)を得た。
【0082】種々のプローブ中に存在する特性配列を以
下に示す。
下に示す。
【0083】プローブ1:ヌクレオチド990-1070、 プローブ2:ヌクレオチド980-1260、 プローブ3:ヌクレオチド2170-2240 、 プローブ4:ヌクレオチド3370-3640 。
【0084】上記ヌクレオチドの番号は参考文献(30)に
基づく。
基づく。
【0085】最後に、プローブ5 はλJ19(31) 中のHIV
クローンのEcoRI-SacIフラグメントを担持するプラスミ
ドpUC18 から成る。これをニックトランスレーションに
よって処理するとSA約108 dpm/μg が得られた。
クローンのEcoRI-SacIフラグメントを担持するプラスミ
ドpUC18 から成る。これをニックトランスレーションに
よって処理するとSA約108 dpm/μg が得られた。
【0086】プローブ中に存在するサブゲノムフラグメ
ントの完全HIV-1 に対する相対配置を第3図に示す。種
々のスポットは夫々以下に対応する。
ントの完全HIV-1 に対する相対配置を第3図に示す。種
々のスポットは夫々以下に対応する。
【0087】スポットA:HIV-1 に感染したCEM C1.13
細胞の培養物から得られたウイルス、 スポットB:STLV-IIIに感染したHUT-78細胞から得られ
たウイルス、 スポットC及びD:前記二人のアフリカ人患者の夫々の
ウイルスから得られた単離物、 スポットE:非感染HUT-78細胞から得られた陰性コント
ロール細胞抽出物、 スポットF:ザイール人エイズ患者から採取されTCGFの
存在下に正常T リンパ球中で培養したウイルス。
細胞の培養物から得られたウイルス、 スポットB:STLV-IIIに感染したHUT-78細胞から得られ
たウイルス、 スポットC及びD:前記二人のアフリカ人患者の夫々の
ウイルスから得られた単離物、 スポットE:非感染HUT-78細胞から得られた陰性コント
ロール細胞抽出物、 スポットF:ザイール人エイズ患者から採取されTCGFの
存在下に正常T リンパ球中で培養したウイルス。
【0088】スポットC以外の全部のスポットは、逆転
写酵素活性25,000dpm に対応するウイルス量で得られ
た。スポットCは15,000dpm に対応した。
写酵素活性25,000dpm に対応するウイルス量で得られ
た。スポットCは15,000dpm に対応した。
【0089】以下の観察が得られた。
【0090】高度に感染した細胞の培養上清から高い逆
転写酵素活性を示すウイルス粒子が単離及び精製された
が、精製ウイルス粒子から得られた2 種類のHIV-2 単離
物のゲノムRNA は前記ストリンジェント条件下でいかな
るプローブともハイブリダイズしなかった。。
転写酵素活性を示すウイルス粒子が単離及び精製された
が、精製ウイルス粒子から得られた2 種類のHIV-2 単離
物のゲノムRNA は前記ストリンジェント条件下でいかな
るプローブともハイブリダイズしなかった。。
【0091】前記ノンストリンジェント条件下では以下
の観察が得られた。全部のプローブがコントロールHIV-
1 調製物から得られたゲノムRNA 及びザイール人エイズ
患者の別の単離物から得られたゲノムRNA と強くハイブ
リダイズした。
の観察が得られた。全部のプローブがコントロールHIV-
1 調製物から得られたゲノムRNA 及びザイール人エイズ
患者の別の単離物から得られたゲノムRNA と強くハイブ
リダイズした。
【0092】得られたプローブの2 つ(両方ともHIV-1
のgag 領域から得られたヌクレオチド990-1070及び990-
1260)は、HIV-2 レトロウイルスの抽出物からのスポッ
トとわずかにハイブリダイズした。これらの2 つのプロ
ーブの1 つだけ(ヌクレオチド990-1260)がSTLV-IIIス
ポットとわずかにハイブリダイズした(第3図)。pol
領域(ヌクレオチド2170-2240)のフラグメントを含むプ
ローブに関しては、STLV-IIIとのハイブリダイズが観察
され、またはるかに少ないがHIV-2 のRNA とのハイブリ
ダイズも観察された。pol 領域の別のプローブ(ヌクレ
オチド 3370-3640)はHIV-2 及びSTLV-IIIのいずれのス
ポットともハイブリダイズしなかった。
のgag 領域から得られたヌクレオチド990-1070及び990-
1260)は、HIV-2 レトロウイルスの抽出物からのスポッ
トとわずかにハイブリダイズした。これらの2 つのプロ
ーブの1 つだけ(ヌクレオチド990-1260)がSTLV-IIIス
ポットとわずかにハイブリダイズした(第3図)。pol
領域(ヌクレオチド2170-2240)のフラグメントを含むプ
ローブに関しては、STLV-IIIとのハイブリダイズが観察
され、またはるかに少ないがHIV-2 のRNA とのハイブリ
ダイズも観察された。pol 領域の別のプローブ(ヌクレ
オチド 3370-3640)はHIV-2 及びSTLV-IIIのいずれのス
ポットともハイブリダイズしなかった。
【0093】最後に、ニックトランスレーションで修飾
されHIV-2 の完全env 遺伝子とLTR(ヌクレオチド5290-9
130)とを含むプローブはSTLV-IIIのRNA 及びHIV-2 のRN
A のいずれともハイブリダイズしなかった。
されHIV-2 の完全env 遺伝子とLTR(ヌクレオチド5290-9
130)とを含むプローブはSTLV-IIIのRNA 及びHIV-2 のRN
A のいずれともハイブリダイズしなかった。
【0094】また注目すべきは、HIV-1 の(プロテアー
ゼ領域に対応する)pol読み取りフレームの 5′末端を含
む別のプローブもHIV-2 のRNA 及びSTLV-IIIのRNA のい
ずれともハイブリダイズしないことである。
ゼ領域に対応する)pol読み取りフレームの 5′末端を含
む別のプローブもHIV-2 のRNA 及びSTLV-IIIのRNA のい
ずれともハイブリダイズしないことである。
【0095】従って前記の結果より、HIV-2 ウイルスは
構造的見地からHIV-1 よりSTLV-IIIに近いと考えられ
る。しかしながらHIV-2 はSTLV-IIIともかなり異なって
おりこれがHIV-2 ウイルスの感染能力に関する種々の観
察結果の裏付けとなる。即ちHIV-2 ウイルスのサルに対
する感染能力は実質的に零であるが、STLV-IIIウイルス
は同じ種のサルに対して明白な感染能力を示す。
構造的見地からHIV-1 よりSTLV-IIIに近いと考えられ
る。しかしながらHIV-2 はSTLV-IIIともかなり異なって
おりこれがHIV-2 ウイルスの感染能力に関する種々の観
察結果の裏付けとなる。即ちHIV-2 ウイルスのサルに対
する感染能力は実質的に零であるが、STLV-IIIウイルス
は同じ種のサルに対して明白な感染能力を示す。
【0096】HIV-2 の制限マップ及びゲノムRNA 配列又
はこのゲノムRNA から得られたcDNAの制限マップ及び配
列は当業者には容易に推定できる。なぜならCNCMに寄託
されたHIV-2 株が適当な増幅後これらの制限マップ及び
ヌクレオチド配列の決定に必要な遺伝材料を与えるから
である。本発明のHIV-2 単離物の1 つのゲノムの制限マ
ップが確定される条件及びこれらゲノムに由来のcDNAの
いくつかの部分の配列が決定される条件に関しては後述
する。
はこのゲノムRNA から得られたcDNAの制限マップ及び配
列は当業者には容易に推定できる。なぜならCNCMに寄託
されたHIV-2 株が適当な増幅後これらの制限マップ及び
ヌクレオチド配列の決定に必要な遺伝材料を与えるから
である。本発明のHIV-2 単離物の1 つのゲノムの制限マ
ップが確定される条件及びこれらゲノムに由来のcDNAの
いくつかの部分の配列が決定される条件に関しては後述
する。
【0097】第4図はHIV-2 レトロウイルスの代表であ
るレトロウイルスのゲノムの制限マップを示す。第5図
はこのcDNAの実質的なフラグメントの制限マップを示
す。最後に、このフラグメントの一部分の配列決定を行
なった。
るレトロウイルスのゲノムの制限マップを示す。第5図
はこのcDNAの実質的なフラグメントの制限マップを示
す。最後に、このフラグメントの一部分の配列決定を行
なった。
【0098】第6図はこの配列及びこの配列が含む多数
の制限部位を示す。クローン化完全cDNA又はこのcDNAの
クローン化フラグメント自体を特異的ハイブリダイゼー
ションプローブとして使用し得る。
の制限部位を示す。クローン化完全cDNA又はこのcDNAの
クローン化フラグメント自体を特異的ハイブリダイゼー
ションプローブとして使用し得る。
【0099】2)HIV-2 のRNA に夫々由来するcDNA及び
該cDNAのフラグメント このcDNAが得られる条件を以下に説明する。
該cDNAのフラグメント このcDNAが得られる条件を以下に説明する。
【0100】このcDNA製造の第1 段階では、HIV-2 の逆
転写酵素を使用し感染CEM 細胞の上清から得られた精製
ビリオンに洗剤によって活性化される内因性反応を行な
わせることによって、プライマーとして機能するオリゴ
(dT)又はイニシエータcDNA鎖を産生する。CEM 細胞株は
G.E.Foley 等、Cancer18:522-529(1965)に記載されたリ
ンパ芽様球 CD4+細胞株であった。この文献は本明細書
に含まれるものとする。これらの使用CEM 細胞株をROD
単離物で感染させると、かなりの量のHIV-2 が連続的に
産生されることが判明した。
転写酵素を使用し感染CEM 細胞の上清から得られた精製
ビリオンに洗剤によって活性化される内因性反応を行な
わせることによって、プライマーとして機能するオリゴ
(dT)又はイニシエータcDNA鎖を産生する。CEM 細胞株は
G.E.Foley 等、Cancer18:522-529(1965)に記載されたリ
ンパ芽様球 CD4+細胞株であった。この文献は本明細書
に含まれるものとする。これらの使用CEM 細胞株をROD
単離物で感染させると、かなりの量のHIV-2 が連続的に
産生されることが判明した。
【0101】(ヌクレオチドと細菌DNA ポリメラーゼと
の存在下に)第2 鎖を合成後、二重鎖cDNAを細菌ファー
ジベクターM13 TG130 に挿入した。104 個の組換M13 フ
ァージのファージライブラリーを得、これをHIV-1 プロ
ーブによるin situ スクリーニングで処理した。HIV-1
プローブはLAV 単離物のRNA に由来のcDNAの 3′末端か
ら得られた1.5kb のフラグメントを含む(第7A図参
照)。約50個の陽性プラークが検出され、これらを精製
し、挿入物の交差ハイブリダイゼーションと末端の配列
決定とによってその特性を決定した。
の存在下に)第2 鎖を合成後、二重鎖cDNAを細菌ファー
ジベクターM13 TG130 に挿入した。104 個の組換M13 フ
ァージのファージライブラリーを得、これをHIV-1 プロ
ーブによるin situ スクリーニングで処理した。HIV-1
プローブはLAV 単離物のRNA に由来のcDNAの 3′末端か
ら得られた1.5kb のフラグメントを含む(第7A図参
照)。約50個の陽性プラークが検出され、これらを精製
し、挿入物の交差ハイブリダイゼーションと末端の配列
決定とによってその特性を決定した。
【0102】この処理手順によって LTR(S.Wain Hobso
n 等、Cell 40:9-17(1985)に記載の「long terminal re
peat」の略号)領域のポリアデニル化RNA の 3′末端に
ほぼ相補的な配列を含む種々のクローンを単離した(上
記参考文献は本明細書に含まれるものとする)。
n 等、Cell 40:9-17(1985)に記載の「long terminal re
peat」の略号)領域のポリアデニル化RNA の 3′末端に
ほぼ相補的な配列を含む種々のクローンを単離した(上
記参考文献は本明細書に含まれるものとする)。
【0103】HIV-1 の 3′LTR 領域とハイブリダイズす
る該当M13 クローンのグループの最大挿入物は、E2と指
称される約2kb のクローンである。HIV-1 の 3′LTR ク
ローンと同様にクローンE2はポリ(A) 末端部分から上流
にヌクレオチド約20個を隔てて位置するAATAAAシグナル
とHIV-2 の 3′LTR 領域に対応する 3′LTR 領域とを含
む。部分的配列決定後、このHIV-2 の 3′LTR 領域がHI
V-1 のホモロジー領域と近縁でないことが判明した。
る該当M13 クローンのグループの最大挿入物は、E2と指
称される約2kb のクローンである。HIV-1 の 3′LTR ク
ローンと同様にクローンE2はポリ(A) 末端部分から上流
にヌクレオチド約20個を隔てて位置するAATAAAシグナル
とHIV-2 の 3′LTR 領域に対応する 3′LTR 領域とを含
む。部分的配列決定後、このHIV-2 の 3′LTR 領域がHI
V-1 のホモロジー領域と近縁でないことが判明した。
【0104】第5図はプラスミドpSPE2 に組み込まれた
E2のフラグメント(細長い矩形領域)の制限マップを示
す。これはHIV-2 のR 領域部分とU3領域とを含む。図は
R 領域とU3領域との境界を示さない。
E2のフラグメント(細長い矩形領域)の制限マップを示
す。これはHIV-2 のR 領域部分とU3領域とを含む。図は
R 領域とU3領域との境界を示さない。
【0105】E2部分の配列を第6図に示す。第6図はま
た、特異的制限部位の位置も示す。HIV-1 とHIV-2 との
3′LTR 領域が互いに近縁でないことが第7図に示され
る。実際、2 つのLTR 配列の約50%がある程度の挿入と
欠失とを伴って位置合わせしているだけである(約50%
の配列ホモロジー)。これと対照的に、アメリカ人及び
アフリカ人のHIV-1 の種々の単離物の対応領域は挿入又
は欠失を伴うことなく95%を上回る配列ホモロジーを示
す。
た、特異的制限部位の位置も示す。HIV-1 とHIV-2 との
3′LTR 領域が互いに近縁でないことが第7図に示され
る。実際、2 つのLTR 配列の約50%がある程度の挿入と
欠失とを伴って位置合わせしているだけである(約50%
の配列ホモロジー)。これと対照的に、アメリカ人及び
アフリカ人のHIV-1 の種々の単離物の対応領域は挿入又
は欠失を伴うことなく95%を上回る配列ホモロジーを示
す。
【0106】クローンE2をHIV-2 の特異的プローブとし
て使用し、別のクローン中に存在するHIV-2 から得られ
た配列をハイブリダイゼーションフィルター上で同定し
た。
て使用し、別のクローン中に存在するHIV-2 から得られ
た配列をハイブリダイゼーションフィルター上で同定し
た。
【0107】このプローブはまたストリンジェント条件
下でHIV-2 のゲノムRNA を検出する。このプローブはま
た、ROD 単離物又は別のHIV-2 単離物に感染したCEM 又
は同様の細胞のDNA を所謂サザンブロット法で検出し得
る。非感染細胞又はHIV-1 感染細胞に由来のcDNAとこの
プローブとの同じストリンジェント条件下でのハイブリ
ダイゼーション試験ではシグナルは全く検出されなかっ
た。これらの結果より、HIV-1 に比較してHIV-2 が外因
性であることが確認された。組み込まれないウイルスDN
A に対応すると推定される約10kbの種は、HIV-2 感染細
胞の未消化DNAの主成分として検出された。ウイルスDNA
の環状に対応すると推定される見掛けサイズ6kb の別
のDNA も検出された。
下でHIV-2 のゲノムRNA を検出する。このプローブはま
た、ROD 単離物又は別のHIV-2 単離物に感染したCEM 又
は同様の細胞のDNA を所謂サザンブロット法で検出し得
る。非感染細胞又はHIV-1 感染細胞に由来のcDNAとこの
プローブとの同じストリンジェント条件下でのハイブリ
ダイゼーション試験ではシグナルは全く検出されなかっ
た。これらの結果より、HIV-1 に比較してHIV-2 が外因
性であることが確認された。組み込まれないウイルスDN
A に対応すると推定される約10kbの種は、HIV-2 感染細
胞の未消化DNAの主成分として検出された。ウイルスDNA
の環状に対応すると推定される見掛けサイズ6kb の別
のDNA も検出された。
【0108】HIV-2 ゲノムの別の部分も同定された。こ
のために、ゲノムライブラリーをファージラムダL47 内
に構築した。ファージラムダL47.1 はW.A.M.Loenen等、
Gene10 249-259(1980) に記載されている。この参考文
献は本明細書に含まれるものとする。
のために、ゲノムライブラリーをファージラムダL47 内
に構築した。ファージラムダL47.1 はW.A.M.Loenen等、
Gene10 249-259(1980) に記載されている。この参考文
献は本明細書に含まれるものとする。
【0109】酵素Sau3A Iで消化後、HIV-2 ROD に感染
したCEM 細胞株に由来のDNA を消化することによって得
られたフラグメントでゲノムライブラリーを構築した。
したCEM 細胞株に由来のDNA を消化することによって得
られたフラグメントでゲノムライブラリーを構築した。
【0110】HIV-2 cDNAの標識E2挿入物を含むクローン
で約 2×106 個の組換プラークをinsitu スクリーニン
グした。10個の組換ファージをプラーク上で検出し精製
した。これらのファージのうちの3 つのファージの制限
マップを、ストリンジェント条件下のE2挿入物とのサザ
ンブロットハイブリダイゼーション能力及びノンストリ
ンジェント条件下のHIV-1 のサブゲノムプローブとのサ
ザンブロットハイブリダイゼーション能力によって特性
決定した。
で約 2×106 個の組換プラークをinsitu スクリーニン
グした。10個の組換ファージをプラーク上で検出し精製
した。これらのファージのうちの3 つのファージの制限
マップを、ストリンジェント条件下のE2挿入物とのサザ
ンブロットハイブリダイゼーション能力及びノンストリ
ンジェント条件下のHIV-1 のサブゲノムプローブとのサ
ザンブロットハイブリダイゼーション能力によって特性
決定した。
【0111】完全HIV-2 ゲノムを含む全環状ウイルスDN
A から誘導され9.5kb の挿入物を含むクローンが同定さ
れた。これを「ラムダROD4」と命名した。組み込まれた
プロウイルスから誘導された別の2 つのクローン、ラム
ダROD27 及びラムダROD35 はウイルスコード配列のLTR
配列と隣接細胞DNA 配列とを担持する。各クローンの配
列を第8図に示す。
A から誘導され9.5kb の挿入物を含むクローンが同定さ
れた。これを「ラムダROD4」と命名した。組み込まれた
プロウイルスから誘導された別の2 つのクローン、ラム
ダROD27 及びラムダROD35 はウイルスコード配列のLTR
配列と隣接細胞DNA 配列とを担持する。各クローンの配
列を第8図に示す。
【0112】ラムダクローンのフラグメントをプラスミ
ドベクターpUC18 中でサブクローニングした。λROD4、
λROD27 及びλROD35 のフラグメント及び上記プラスミ
ドベクター中の夫々のサブクローンも第8図に示す。以
下のサブクローンが得られた。
ドベクターpUC18 中でサブクローニングした。λROD4、
λROD27 及びλROD35 のフラグメント及び上記プラスミ
ドベクター中の夫々のサブクローンも第8図に示す。以
下のサブクローンが得られた。
【0113】−HIV-2 ゲノムの5.2kb 領域と隣接の細胞
配列(EcoRI 部位周囲の 5′LTR 及び5′コードウイル
ス配列)とを含むラムダROD 27に由来のpROD27-5′。
配列(EcoRI 部位周囲の 5′LTR 及び5′コードウイル
ス配列)とを含むラムダROD 27に由来のpROD27-5′。
【0114】−約5kb のHind IIIフラグメントを含むラ
ムダROD4に由来のpROD4.8 。このフラグメントはHIV-2
ゲノムの中央部分に対応する。
ムダROD4に由来のpROD4.8 。このフラグメントはHIV-2
ゲノムの中央部分に対応する。
【0115】−互いにオーバーラップするHIV-2 挿入物
を含むpROD27-5′及びpROD4.8 。
を含むpROD27-5′及びpROD4.8 。
【0116】−ラムダROD4の1.8kb のHind IIIフラグメ
ントを含むpROD4.7 。このフラグメントはpROD4.8 中で
サブクローニングされたフラグメントに対して3 方向に
配置されており、約0.8kb のコードウイルス配列とファ
ージラムダ(ラムダL47.1)の左アームのBamHI 及びHind
IIIのクローニング部位間に存在する部分とを含む。
ントを含むpROD4.7 。このフラグメントはpROD4.8 中で
サブクローニングされたフラグメントに対して3 方向に
配置されており、約0.8kb のコードウイルス配列とファ
ージラムダ(ラムダL47.1)の左アームのBamHI 及びHind
IIIのクローニング部位間に存在する部分とを含む。
【0117】−EcoRI 部位に対して3 方向のHIV-2 コー
ド配列全部と 3′LTR と約4kb の細胞起源の隣接ヌクレ
オチド配列とを含むpROD35。
ド配列全部と 3′LTR と約4kb の細胞起源の隣接ヌクレ
オチド配列とを含むpROD35。
【0118】大腸菌HB101 中に存在するpROD27-5′及び
pROD35は1986年11月21日にCNCMに夫々受託番号I-626 及
びI-633 で寄託された。
pROD35は1986年11月21日にCNCMに夫々受託番号I-626 及
びI-633 で寄託された。
【0119】大腸菌TG1 中に存在するpROD4.7 及びpROD
4.8 は1986年11月21日にCNCMに夫々受託番号I-627 及び
I-628 で寄託された。
4.8 は1986年11月21日にCNCMに夫々受託番号I-627 及び
I-628 で寄託された。
【0120】第4図にその制限マップを示す完全HIV-2
ROD ゲノムを、EcoRI で予め直線化したpROD35とpROD27
-5′とから再構築した。pROD27-5′のEcoRI 挿入物をpR
OD35のEcoRI 部位に正しい方向で結合した。
ROD ゲノムを、EcoRI で予め直線化したpROD35とpROD27
-5′とから再構築した。pROD27-5′のEcoRI 挿入物をpR
OD35のEcoRI 部位に正しい方向で結合した。
【0121】HIV-2 とその他のヒト又はサルのレトロウ
イルスとの相関の程度を相互ハイブリダイゼーション試
験によって検定した。HIV-1 及びHIV-2 ゲノムの種々の
領域間の相対的ホモロジーは、クローンHIV-1 ゲノムに
由来のフラグメントと放射能標識ラムダROD4に由来のフ
ラグメントのハイブリダイゼーション試験によって決定
された。HIV-1 ゲノムに対するこれらのフラグメント
(番号 1〜11)の相対位置を第9図の下部に示す。
イルスとの相関の程度を相互ハイブリダイゼーション試
験によって検定した。HIV-1 及びHIV-2 ゲノムの種々の
領域間の相対的ホモロジーは、クローンHIV-1 ゲノムに
由来のフラグメントと放射能標識ラムダROD4に由来のフ
ラグメントのハイブリダイゼーション試験によって決定
された。HIV-1 ゲノムに対するこれらのフラグメント
(番号 1〜11)の相対位置を第9図の下部に示す。
【0122】極めて弱いストリンジェント条件下で(42
℃)さえ、HIV-1 ゲノムとHIV-2 ゲノムとは夫々のgag
遺伝子(スポット 1及び2 )、pol の逆転写酵素領域
(スポット 3)、pol の末端領域、 Q(又はsor )遺伝
子(スポット 5)及びF (又は3′orf )遺伝子及び
3′LTR (スポット11)のレベルでのみハイブリダイズ
した。HIV-2 の第1 のcDNAクローンの検出に使用された
HIV-1 フラグメントは、スポット11のサブクローンに対
応し、ノンストリンジェント条件下でHIV-2 と比較的良
くハイブリダイズする。スポット 5から得られたシグナ
ルはストリンジェントな洗浄後にも存続するただ1 つの
シグナルである。エンベロープ遺伝子、tat遺伝子領域
及びpol 部分はばらつきが大きいようである。これらの
データ及びLTR から得られた配列(第3図)は、HIV-2
が(少なくともそのエンベロープに関しては)HIV-1 の
変異株ではないことを示す。
℃)さえ、HIV-1 ゲノムとHIV-2 ゲノムとは夫々のgag
遺伝子(スポット 1及び2 )、pol の逆転写酵素領域
(スポット 3)、pol の末端領域、 Q(又はsor )遺伝
子(スポット 5)及びF (又は3′orf )遺伝子及び
3′LTR (スポット11)のレベルでのみハイブリダイズ
した。HIV-2 の第1 のcDNAクローンの検出に使用された
HIV-1 フラグメントは、スポット11のサブクローンに対
応し、ノンストリンジェント条件下でHIV-2 と比較的良
くハイブリダイズする。スポット 5から得られたシグナ
ルはストリンジェントな洗浄後にも存続するただ1 つの
シグナルである。エンベロープ遺伝子、tat遺伝子領域
及びpol 部分はばらつきが大きいようである。これらの
データ及びLTR から得られた配列(第3図)は、HIV-2
が(少なくともそのエンベロープに関しては)HIV-1 の
変異株ではないことを示す。
【0123】HIV-2 はHIV-1 よりもSIV に近縁である
(M.D.Daniel等、Science 228:1201-1204(1985) 、この
文献は本明細書に含まれるものとする)。
(M.D.Daniel等、Science 228:1201-1204(1985) 、この
文献は本明細書に含まれるものとする)。
【0124】エンベロープタンパク質を含むすべてのSI
V タンパク質は、HIV-2 感染患者の血清によって免疫沈
降するが、HIV-1 とHIV-2 との血清学的交差反応性はコ
アタンパク質に限定されている。しかしながら、SIV と
HIV-2 とは前記のごとく夫々のタンパク質の分子量の違
いによって識別できる。
V タンパク質は、HIV-2 感染患者の血清によって免疫沈
降するが、HIV-1 とHIV-2 との血清学的交差反応性はコ
アタンパク質に限定されている。しかしながら、SIV と
HIV-2 とは前記のごとく夫々のタンパク質の分子量の違
いによって識別できる。
【0125】ヌクレオチド配列に関しては、HIV-2 はや
はりSIV と近縁である。
はりSIV と近縁である。
【0126】更に、HIV-2 の特性決定によって、標的細
胞の表面に対するウイルスの結合及びウイルスのインタ
ーナリゼーションを誘発するエンベロープ糖タンパク質
の領域を規定することが可能である。相互作用はCD4 分
子自体を介して生じる。HIV-1 とHIV-2 とは同じレセプ
ターを使用すると考えられる。
胞の表面に対するウイルスの結合及びウイルスのインタ
ーナリゼーションを誘発するエンベロープ糖タンパク質
の領域を規定することが可能である。相互作用はCD4 分
子自体を介して生じる。HIV-1 とHIV-2 とは同じレセプ
ターを使用すると考えられる。
【0127】従ってHIV-1 とHIV-2 とのenv 遺伝子間に
は大きい違いが存在するが、これら2 つの形態のHIV の
エンベロープの限られた対応(homologous)領域は、T4
リンパ球の共通レセプターに結合する成分であると考え
ることができる。これらの部位の作用により、HIV ウイ
ルスに対するヒトの防御免疫応答を誘発するペプチドの
免疫原性を担持するエピトープが形成される。
は大きい違いが存在するが、これら2 つの形態のHIV の
エンベロープの限られた対応(homologous)領域は、T4
リンパ球の共通レセプターに結合する成分であると考え
ることができる。これらの部位の作用により、HIV ウイ
ルスに対するヒトの防御免疫応答を誘発するペプチドの
免疫原性を担持するエピトープが形成される。
【0128】ウイルス又はプロウイルスのキャリアの遺
伝物質とのハイブリダイズ反応におけるプローブを形成
するため、特にリンパ球中のHIV-2 ウイルスRNA の存在
を検出するために有利な配列は、ROD4とE2 cDNA との5k
b のHind フラグメントの結合によって得られたヌクレ
オチド配列を含む。実験は如何なる方法で行なってもよ
く、特にノーザンブロット、サザンブロット及びドット
ブロット方法を使用し得る。
伝物質とのハイブリダイズ反応におけるプローブを形成
するため、特にリンパ球中のHIV-2 ウイルスRNA の存在
を検出するために有利な配列は、ROD4とE2 cDNA との5k
b のHind フラグメントの結合によって得られたヌクレ
オチド配列を含む。実験は如何なる方法で行なってもよ
く、特にノーザンブロット、サザンブロット及びドット
ブロット方法を使用し得る。
【0129】更に、レトロウイルスゲノムのいくつかの
部分の同定及びHIV-2 のレトロウイルスゲノムに由来の
cDNAの種々の部分を含む多数の組換DNA の産生の実施例
に関する以下の記載より本発明の特徴が一層明らかにさ
れるであろう。但し本発明はこれらの実施例の記載に限
定はされない。
部分の同定及びHIV-2 のレトロウイルスゲノムに由来の
cDNAの種々の部分を含む多数の組換DNA の産生の実施例
に関する以下の記載より本発明の特徴が一層明らかにさ
れるであろう。但し本発明はこれらの実施例の記載に限
定はされない。
【0130】
【実施例】実施例I HIV-2 の診断キットに使用されるDNA プローブ 精製ビリオンから得られたゲノムRNA に相補的なcDNAを
以下の方法で調製した。
以下の方法で調製した。
【0131】HIV-2 のHIV-2 ROD 単離物に感染したCEM
細胞を48時間培養した後に得られた上清を超遠心した。
前記の欧州特許出願第84/401.234-0138667号に記載の方
法と実質的に同じ方法を使用して、ビリオンを含む遠心
ペレットをショ糖勾配で遠心し、新しい遠心ペレットを
形成した。
細胞を48時間培養した後に得られた上清を超遠心した。
前記の欧州特許出願第84/401.234-0138667号に記載の方
法と実質的に同じ方法を使用して、ビリオンを含む遠心
ペレットをショ糖勾配で遠心し、新しい遠心ペレットを
形成した。
【0132】精製したHIV-2 調製物を使用し、洗剤によ
り活性化された内因性反応を用いてcDNAを合成した。
り活性化された内因性反応を用いてcDNAを合成した。
【0133】要約すると、ビリオン調製物を50mMのトリ
ス-HClと5mM のMgCl2 と10mMのDTTと 0.025%のトライ
トン洗剤(商品名TRITON)と各50μM の4 種類のデオキ
シヌクレオシドトリホスフェートとオリゴ(dT)イニシエ
ータとを含む反応混合物に添加した。反応を37℃で90分
間維持した。
ス-HClと5mM のMgCl2 と10mMのDTTと 0.025%のトライ
トン洗剤(商品名TRITON)と各50μM の4 種類のデオキ
シヌクレオシドトリホスフェートとオリゴ(dT)イニシエ
ータとを含む反応混合物に添加した。反応を37℃で90分
間維持した。
【0134】第1 反応媒体中に存在するタンパク質をフ
ェノールで抽出し、RNアーゼ、大腸菌DNA ポリメラーゼ
1 及び4 種類のデオキシヌクレオチドの存在下に15℃で
1 時間及び22℃で1 時間維持して第2 のDNA 鎖を合成し
た。この二重鎖cDNAにT4 DNAポリメラーゼを作用させて
平滑末端を形成した。この処理手順に用いたすべての試
薬は市販されており(AMERSHAM cDNAキット)、製造業者
の処方通りに使用した。
ェノールで抽出し、RNアーゼ、大腸菌DNA ポリメラーゼ
1 及び4 種類のデオキシヌクレオチドの存在下に15℃で
1 時間及び22℃で1 時間維持して第2 のDNA 鎖を合成し
た。この二重鎖cDNAにT4 DNAポリメラーゼを作用させて
平滑末端を形成した。この処理手順に用いたすべての試
薬は市販されており(AMERSHAM cDNAキット)、製造業者
の処方通りに使用した。
【0135】(1)T4 DNA リガーゼ(BIOLABSの市販製品)
の存在下にEcoRI 部位を含むアダプター(リンカー)(Ph
armacia の市販製品)をcDNAの平滑末端に結合し、(2)
これらのリンカーを制限エンドヌクレアーゼEcoRI で消
化し、(3)AcA 34(LKB-IBF)上でゲル濾過(商品名ULTROG
ELのゲルカラム)することによってリンカーフラグメン
トを除去し、 EcoRIで開裂したM13TG130ベクターにcDNA
を挿入する。大腸菌TG1 株の形質転換後にcDNAのライブ
ラリーが得られた。約104 個の組換M13 プラークが得ら
れた。
の存在下にEcoRI 部位を含むアダプター(リンカー)(Ph
armacia の市販製品)をcDNAの平滑末端に結合し、(2)
これらのリンカーを制限エンドヌクレアーゼEcoRI で消
化し、(3)AcA 34(LKB-IBF)上でゲル濾過(商品名ULTROG
ELのゲルカラム)することによってリンカーフラグメン
トを除去し、 EcoRIで開裂したM13TG130ベクターにcDNA
を挿入する。大腸菌TG1 株の形質転換後にcDNAのライブ
ラリーが得られた。約104 個の組換M13 プラークが得ら
れた。
【0136】cDNAライブラリーからHIV-2 cDNAを含む組
換M13 クローンを選択するためにプラークハイブリダイ
ゼーション方法を使用した。M13 プラークのDNA をニト
ロセルロースフィルターに移し、欧州特許出願に記載の
LAV(又はHIV)ウイルスの「ラムダJ19 」クローンに由来
のサブゲノムHIV-1 プローブとハイブリダイズした。こ
のプローブは、HIV-1 DNA の約1500塩基対(bp)の長さの
部分から成る挿入物を含んでいた。この挿入物はenv 遺
伝子の読み取りフレーム内及びHIV-1 の 3′LTR のR セ
グメント内の2 つのHindIII 制限部位によって結合され
た。このプローブは、env 遺伝子の 3′末端と完全F 遺
伝子とU3セグメントとLTR のR セグメントの一部分とを
含み、約1500塩基対(bp)の長さであった。
換M13 クローンを選択するためにプラークハイブリダイ
ゼーション方法を使用した。M13 プラークのDNA をニト
ロセルロースフィルターに移し、欧州特許出願に記載の
LAV(又はHIV)ウイルスの「ラムダJ19 」クローンに由来
のサブゲノムHIV-1 プローブとハイブリダイズした。こ
のプローブは、HIV-1 DNA の約1500塩基対(bp)の長さの
部分から成る挿入物を含んでいた。この挿入物はenv 遺
伝子の読み取りフレーム内及びHIV-1 の 3′LTR のR セ
グメント内の2 つのHindIII 制限部位によって結合され
た。このプローブは、env 遺伝子の 3′末端と完全F 遺
伝子とU3セグメントとLTR のR セグメントの一部分とを
含み、約1500塩基対(bp)の長さであった。
【0137】1.5kb のHindIII 挿入物を含むプローブ
を、(AMERSHAM キットを使用して)イニシエータとKlen
ow DNAポリメラーゼIとの存在下に15℃で4 時間インキ
ュベートすることによって、 [32P-]dCTP 及び-dTTP(30
00Ci×10-3モル) で標識した。ライブラリーのcDNAクロ
ーンのハイブリダイゼーション試験を弱いストリンジェ
ント条件下で1 晩行なった。用いたハイブリダイゼーシ
ョン媒体の溶液は、37℃で 5×SSC と 5×Denhart と25
%のホルムアミドと100 μg/mlの変性サケ***DNA と標
識プローブ(specificity 109 cpm/μg で 2×107 cpm
)を含んでいた。
を、(AMERSHAM キットを使用して)イニシエータとKlen
ow DNAポリメラーゼIとの存在下に15℃で4 時間インキ
ュベートすることによって、 [32P-]dCTP 及び-dTTP(30
00Ci×10-3モル) で標識した。ライブラリーのcDNAクロ
ーンのハイブリダイゼーション試験を弱いストリンジェ
ント条件下で1 晩行なった。用いたハイブリダイゼーシ
ョン媒体の溶液は、37℃で 5×SSC と 5×Denhart と25
%のホルムアミドと100 μg/mlの変性サケ***DNA と標
識プローブ(specificity 109 cpm/μg で 2×107 cpm
)を含んでいた。
【0138】以下の組成の3 種類の溶液を順次用いてフ
ィルターを3 段階洗浄した。
ィルターを3 段階洗浄した。
【0139】第1 段階洗浄:5×SSC 、 0.1%SDS 、25
℃、 4×15分間 第2 段階洗浄:2×SSC 、 0.1%SDS 、42℃、 2×30分間 第3 段階洗浄:0.1×SSC 、 0.1%SDS 、65℃、 2×30分
間。
℃、 4×15分間 第2 段階洗浄:2×SSC 、 0.1%SDS 、42℃、 2×30分間 第3 段階洗浄:0.1×SSC 、 0.1%SDS 、65℃、 2×30分
間。
【0140】各洗浄段階後にフィルターをオートラジオ
グラフィーにかけた。
グラフィーにかけた。
【0141】第1 段階の洗浄後に複数の陽性クローンが
検出され、第2 段階の洗浄後にもまだ検出された。しか
しながら第3 段階の洗浄後にはすべてのシグナルが消失
した。これは、陽性クローンがHIV-1 ゲノムと近縁でな
いが、それにもかかわらず前記選択を行なうには十分で
あることを示す。陽性クローンを継代培養し、プラーク
に再度付着させ、第1 段階の洗浄と同程度のストリンジ
ェント条件下で同じプローブと再度ハイブリダイズし
た。これらのクローンの大部分がまだ陽性であった。
検出され、第2 段階の洗浄後にもまだ検出された。しか
しながら第3 段階の洗浄後にはすべてのシグナルが消失
した。これは、陽性クローンがHIV-1 ゲノムと近縁でな
いが、それにもかかわらず前記選択を行なうには十分で
あることを示す。陽性クローンを継代培養し、プラーク
に再度付着させ、第1 段階の洗浄と同程度のストリンジ
ェント条件下で同じプローブと再度ハイブリダイズし
た。これらのクローンの大部分がまだ陽性であった。
【0142】また中程度のストリンジェント条件下で完
全ヒトDNA プローブを使用し、 5×SSC 、 5×Denhart
及び40%ホルムアミド中でハイブリダイズし、次に50℃
の 1×SSC 、 0.1%SDS で洗浄することによってクロー
ンを選択した。さっきの陽性クローンは全く検出されず
従って特異的反復DNA 又はリボソームRNA のcDNAに対応
しなかった。
全ヒトDNA プローブを使用し、 5×SSC 、 5×Denhart
及び40%ホルムアミド中でハイブリダイズし、次に50℃
の 1×SSC 、 0.1%SDS で洗浄することによってクロー
ンを選択した。さっきの陽性クローンは全く検出されず
従って特異的反復DNA 又はリボソームRNA のcDNAに対応
しなかった。
【0143】陽性のM13 組換クローンを液体媒体中で培
養し以下のごく特性決定した。
養し以下のごく特性決定した。
【0144】(1)挿入物のサイズ 各クローンからM13 一本鎖タイプのDNA を取り出し、M1
3 17-merイニシエータ配列とKlenow酵素とを用いて第2
鎖を形成した。挿入物を EcoRI(BOEHRINGER)で切除しア
ガロースゲル電気泳動で分析した。大部分の挿入物が 2
00〜600 及び200bp を含んでいたが、クローンE2.1だけ
は例外で約2kbpの長さであった。
3 17-merイニシエータ配列とKlenow酵素とを用いて第2
鎖を形成した。挿入物を EcoRI(BOEHRINGER)で切除しア
ガロースゲル電気泳動で分析した。大部分の挿入物が 2
00〜600 及び200bp を含んでいたが、クローンE2.1だけ
は例外で約2kbpの長さであった。
【0145】(2)ヌクレオチド配列の解析 Proc.Natl.Acad.Sci. 74:5463-7(1977) に記載のSanger
等のジデオキシ方法を用いて複数のクローンを部分的に
配列決定した。この文献は本明細書に含まれるものとす
る。種々の独立クローンは同様のヌクレオチド配列を含
んでいたが、 3′末端のポリ(A) 鎖は例外で異なる長さ
を有していた。これらの結果は、これらのcDNAクローン
がRNA 鋳型から誘導されたことを示す。詳細な配列解析
によればHIV-2 ゲノムの 3′末端を含むcDNAクローンは
HIV-1 と近縁関係でないことが判明した。
等のジデオキシ方法を用いて複数のクローンを部分的に
配列決定した。この文献は本明細書に含まれるものとす
る。種々の独立クローンは同様のヌクレオチド配列を含
んでいたが、 3′末端のポリ(A) 鎖は例外で異なる長さ
を有していた。これらの結果は、これらのcDNAクローン
がRNA 鋳型から誘導されたことを示す。詳細な配列解析
によればHIV-2 ゲノムの 3′末端を含むcDNAクローンは
HIV-1 と近縁関係でないことが判明した。
【0146】(3)HIV-2 のゲノムRNA とDNA とのハイ
ブリダイゼーション (a) HIV-2 のゲノムRNA の産生 感染上清を遠心した(50,000回転、30分)。沈降物のペ
レットを10mMトリス pH7.5、1mM EDTA、 0.1% SDSに再
懸濁させた。挿入クローンの1 つF1.1を標識し、ドット
ブロット法により種々のウイルス単離物のゲノムRNA と
のハイブリダイゼーションプローブとして使用した。
ブリダイゼーション (a) HIV-2 のゲノムRNA の産生 感染上清を遠心した(50,000回転、30分)。沈降物のペ
レットを10mMトリス pH7.5、1mM EDTA、 0.1% SDSに再
懸濁させた。挿入クローンの1 つF1.1を標識し、ドット
ブロット法により種々のウイルス単離物のゲノムRNA と
のハイブリダイゼーションプローブとして使用した。
【0147】ドットブロット法は以下のステップを含
む。
む。
【0148】(i)20×SSC (3M NaCl 、0.3 クエン酸
ナトリウム)に予め浸漬したニトロセルロース膜にサン
プル(HIV-2 溶解液)のスポットを付着させて風乾し、
(ii)膜を80℃で2 時間ベーキングし、(iii) ハイブリ
ダイゼーションを行なう。
ナトリウム)に予め浸漬したニトロセルロース膜にサン
プル(HIV-2 溶解液)のスポットを付着させて風乾し、
(ii)膜を80℃で2 時間ベーキングし、(iii) ハイブリ
ダイゼーションを行なう。
【0149】このハイブリダイゼーションは、強いスト
リンジェント条件下で行なった(5×SSC 、 5×Denhart
、50%ホルムアミド、42℃) 。次に 0.1×SSC 、 0.1
%SDS、65℃で洗浄した。これらの条件下でプローブ
は、クローンcDNAのオリジンとなるLAV-II RODを含む別
々の2 種類のHIV-2 単離物のスポットと盛んにハイブリ
ダイズした。STLV-III mac(サルT リンパ向性ウイルス
(SIVとしても公知) 、タイプIII アカゲザルマカック属
(macaque) )によって形成されるスポットで弱いハイブ
リダイゼーションシグナルが検出され、HIV-1 単離物で
はハイブリダイゼーションが全く検出されなかった。
リンジェント条件下で行なった(5×SSC 、 5×Denhart
、50%ホルムアミド、42℃) 。次に 0.1×SSC 、 0.1
%SDS、65℃で洗浄した。これらの条件下でプローブ
は、クローンcDNAのオリジンとなるLAV-II RODを含む別
々の2 種類のHIV-2 単離物のスポットと盛んにハイブリ
ダイズした。STLV-III mac(サルT リンパ向性ウイルス
(SIVとしても公知) 、タイプIII アカゲザルマカック属
(macaque) )によって形成されるスポットで弱いハイブ
リダイゼーションシグナルが検出され、HIV-1 単離物で
はハイブリダイゼーションが全く検出されなかった。
【0150】32P 標識プローブとして2kb 挿入物を含む
クローンE2.1を使用してサザンブロット実験を行なう
と、このクローンと非感染細胞のDNA とのハイブリダイ
ゼーションは全く検出されなかったが、強いストリンジ
ェント条件下でHIV-2 に感染した分離細胞中でバンドが
検出された。HIV-2 は、制限マップレベルでHIV-1 と等
価の多形性を示す。感染細胞の完全細胞DNA ではサザン
ブロット法によって2 種類のシグナルが検出される。即
ち、(1) 組み込まれた形態のウイルスの場合、分子量MW
が約20kb以上のDNA 画分中でシグナルが検出され、(2)
ゲノムに組み込まれないウイルスの場合、低分子量(9,1
0kb)の画分中でシグナルが検出される。
クローンE2.1を使用してサザンブロット実験を行なう
と、このクローンと非感染細胞のDNA とのハイブリダイ
ゼーションは全く検出されなかったが、強いストリンジ
ェント条件下でHIV-2 に感染した分離細胞中でバンドが
検出された。HIV-2 は、制限マップレベルでHIV-1 と等
価の多形性を示す。感染細胞の完全細胞DNA ではサザン
ブロット法によって2 種類のシグナルが検出される。即
ち、(1) 組み込まれた形態のウイルスの場合、分子量MW
が約20kb以上のDNA 画分中でシグナルが検出され、(2)
ゲノムに組み込まれないウイルスの場合、低分子量(9,1
0kb)の画分中でシグナルが検出される。
【0151】これらの特性はレトロウイルスに高度に特
異的である。
異的である。
【0152】感染細胞のSTLV-III (SIV-3)を用いて行っ
たいくつかの実験によって、サルレトロウイルスがHIV-
2 に相対的には近縁でないことが確認された(シグナル
は弱いストリンジェント条件下でしか検出されない)。
これらの実験は上記プローブがHIV-2 を特異的に検出し
得ることを示す。
たいくつかの実験によって、サルレトロウイルスがHIV-
2 に相対的には近縁でないことが確認された(シグナル
は弱いストリンジェント条件下でしか検出されない)。
これらの実験は上記プローブがHIV-2 を特異的に検出し
得ることを示す。
【0153】(4) 細菌プラスミドベクター中でのHIV-2
のcDNAのサブクローニング 陽性M13 クローンE2.1を選択し、プラスミドベクター中
でサブクローニングした。組換M13(TG130)ファージE2の
DNA を、(HIV-2 RODから得られた)HIV-2ゲノムの 3′部
分を内包する2kb 挿入物を含む一本鎖DNA(M-13-ROD-E2)
の形態に精製した。この挿入物をMelton、D.A.、357 Nu
cleic Acid Res. 12:035-7056(1984) に記載のプラスミ
ドpSP65 に移した。
のcDNAのサブクローニング 陽性M13 クローンE2.1を選択し、プラスミドベクター中
でサブクローニングした。組換M13(TG130)ファージE2の
DNA を、(HIV-2 RODから得られた)HIV-2ゲノムの 3′部
分を内包する2kb 挿入物を含む一本鎖DNA(M-13-ROD-E2)
の形態に精製した。この挿入物をMelton、D.A.、357 Nu
cleic Acid Res. 12:035-7056(1984) に記載のプラスミ
ドpSP65 に移した。
【0154】17-merイニシエータ配列(AMERSHAM)と4
つのヌクレオチドA,C,T,G とDNA ポリメラーゼI(Kleno
w)との存在下に第2 鎖をin vitro構築した。 EcoRI挿入
物をEcoRI消化によって切除し、アガロースゲルで精製
し、 EcoRIで予め消化したpSP65 に結合した。結合混合
物を使用して大腸菌DH1 株を形質転換し、アンピシリン
耐性能に基づいて組換体を選択した。同定された組換体
を50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地(Luria 培地)
で培養した。これらのプラスミドを精製し、正しく挿入
されたフラグメントの存在をモニターした。
つのヌクレオチドA,C,T,G とDNA ポリメラーゼI(Kleno
w)との存在下に第2 鎖をin vitro構築した。 EcoRI挿入
物をEcoRI消化によって切除し、アガロースゲルで精製
し、 EcoRIで予め消化したpSP65 に結合した。結合混合
物を使用して大腸菌DH1 株を形質転換し、アンピシリン
耐性能に基づいて組換体を選択した。同定された組換体
を50μg/mlのアンピシリンを含むLB培地(Luria 培地)
で培養した。これらのプラスミドを精製し、正しく挿入
されたフラグメントの存在をモニターした。
【0155】得られたクローンの1 つをpSPE2 と命名
し、1986年9 月5 日に受託番号I-595でフランス、パリ
のCNCMに寄託した。
し、1986年9 月5 日に受託番号I-595でフランス、パリ
のCNCMに寄託した。
【0156】HIV-2 のcDNAに由来し前記プローブに挿入
された挿入物は、E2の一部と一致する前記に定義したヌ
クレオチド配列を含んでいた。
された挿入物は、E2の一部と一致する前記に定義したヌ
クレオチド配列を含んでいた。
【0157】実施例II HIV-2 ビリオンのゲノムRNA に相補的なDNA に相補的な
cDNAのクローニング ROD 単離物に感染したCEM 株からの細胞上清5 l からHI
V-2 のビリオンを精製した。洗剤で活性化した内因性反
応を使用しオリゴ(dT)イニシエータの存在下に沈降精製
ウイルスと接触させてcDNAの第1 鎖を合成した。これに
はAlizon等、Nature 312、757-760(1984) の方法を使用
した。RNA/cDNAハイブリッドをフェノール/クロロホル
ム混合物で抽出しエタノールで沈殿させることによって
精製した。cDNAの第2 鎖をGubler及びHoffman の方法で
DNA ポリメラーゼI/RNアーゼHの存在下に産生した。
該文献の記載は本明細書に含まれるものとする。
cDNAのクローニング ROD 単離物に感染したCEM 株からの細胞上清5 l からHI
V-2 のビリオンを精製した。洗剤で活性化した内因性反
応を使用しオリゴ(dT)イニシエータの存在下に沈降精製
ウイルスと接触させてcDNAの第1 鎖を合成した。これに
はAlizon等、Nature 312、757-760(1984) の方法を使用
した。RNA/cDNAハイブリッドをフェノール/クロロホル
ム混合物で抽出しエタノールで沈殿させることによって
精製した。cDNAの第2 鎖をGubler及びHoffman の方法で
DNA ポリメラーゼI/RNアーゼHの存在下に産生した。
該文献の記載は本明細書に含まれるものとする。
【0158】AMERSHAMによる市販のcDNA合成キットの成
分を使用しDNA ポリメラーゼT4の存在下に二本鎖cDNAに
平滑末端を形成した。
分を使用しDNA ポリメラーゼT4の存在下に二本鎖cDNAに
平滑末端を形成した。
【0159】PHARMACIA による市販の EcoRIアダプター
(リンカー)をcDNAの末端に結合した。このように修飾
されたcDNAが、 EcoRIの存在下での消化後に、同じくAM
ERSHAMにより市販されておりそれ自体 EcoRIによって予
め消化されたデホスホリル化ファージベクターM13tg130
に挿入された。大腸菌TG1 株の形質転換後にcDNAバンド
が得られた。HIV-1 から得られた上記の1.5kb のHindII
I フラグメントを含むクローンJ19 とのハイブリダイゼ
ーションによって複製できるフィルターで組換プラーク
(104 )をin situ スクリーニングした。
(リンカー)をcDNAの末端に結合した。このように修飾
されたcDNAが、 EcoRIの存在下での消化後に、同じくAM
ERSHAMにより市販されておりそれ自体 EcoRIによって予
め消化されたデホスホリル化ファージベクターM13tg130
に挿入された。大腸菌TG1 株の形質転換後にcDNAバンド
が得られた。HIV-1 から得られた上記の1.5kb のHindII
I フラグメントを含むクローンJ19 とのハイブリダイゼ
ーションによって複製できるフィルターで組換プラーク
(104 )をin situ スクリーニングした。
【0160】フィルターを、 5×SSC 、 5×DENHARDT溶
液、25%ホルムアルデヒド及び変性サケ***DNA(100 μ
g/ml) を含む培地の存在下に37℃で4 時間プレハイブリ
ダイズし、次に付加標識プローブ(4×107 cpm)の存在下
に同じバッファ(Tm −42℃)で16時間ハイブリダイズし
て106 cpm/mlを含む最終ハイブリダイゼーションバッフ
ァ溶液を得た。
液、25%ホルムアルデヒド及び変性サケ***DNA(100 μ
g/ml) を含む培地の存在下に37℃で4 時間プレハイブリ
ダイズし、次に付加標識プローブ(4×107 cpm)の存在下
に同じバッファ(Tm −42℃)で16時間ハイブリダイズし
て106 cpm/mlを含む最終ハイブリダイゼーションバッフ
ァ溶液を得た。
【0161】5×SSC 、 0.1%SDS 溶液で25℃で2 時間
洗浄した(20 ×SSC は3MのNaClと0.3Mのクエン酸ナトリ
ウムとの溶液に対応することが理解されよう)。陽性反
応したプラークを精製し、M13 一本鎖DNA を調製し、Sa
nger等の方法で末端を配列決定した。
洗浄した(20 ×SSC は3MのNaClと0.3Mのクエン酸ナトリ
ウムとの溶液に対応することが理解されよう)。陽性反
応したプラークを精製し、M13 一本鎖DNA を調製し、Sa
nger等の方法で末端を配列決定した。
【0162】HIV-1 及びHIV-2 に感染した細胞のDNA 並
びにHIV-1 、HIV-2 及びSIV ビリオンのRNA と、HIV-2
のクローンcDNAから誘導されたプローブとのハイブリダ
イゼーション HIV-1 及びHIV-2 を夫々連続的に産生する感染CEM 細胞
からDNA を抽出した。これら2 種類のレトロウイルスの
DNA サンプルをある場合には20μg の PstIで消化しあ
る場合には消化しないで、 0.8%アガロースゲル電気泳
動にかけ、サザン法によってナイロン膜に移した。 0.1
%のSDS を含み同じ逆転写酵素活性をもつNTE バッファ
中に採取した少量の感染上清を、 2×SSC 溶液に予め浸
漬したニトロセルロースに付着させた。
びにHIV-1 、HIV-2 及びSIV ビリオンのRNA と、HIV-2
のクローンcDNAから誘導されたプローブとのハイブリダ
イゼーション HIV-1 及びHIV-2 を夫々連続的に産生する感染CEM 細胞
からDNA を抽出した。これら2 種類のレトロウイルスの
DNA サンプルをある場合には20μg の PstIで消化しあ
る場合には消化しないで、 0.8%アガロースゲル電気泳
動にかけ、サザン法によってナイロン膜に移した。 0.1
%のSDS を含み同じ逆転写酵素活性をもつNTE バッファ
中に採取した少量の感染上清を、 2×SSC 溶液に予め浸
漬したニトロセルロースに付着させた。
【0163】50%のホルムアミドと 5×SSC と 5×Denh
art と100 mg/ml の変性サケ***DNA とを含む溶液中で
42℃で4 時間プレハイブリダイゼーションを行なった。
同じバッファに10%の硫酸デキストランと106 cpm/mlの
E2標識挿入物(比活性109 cpm/μg )とを添加した溶液
中で42℃で16時間ハイブリダイゼーションを行なった。
次に 0.1×SSC 、 0.1%SDS 溶液を夫々用いて30分間ず
つ2 回洗浄した。増感スクリーンに16時間露光し、0.4N
NaOH 中でサザンスポットをデハイブリダイズし、中和
し、同じ条件下で109 cpm/μg で標識したHIV-1 プロー
ブと共に再びハイブリダイズした。
art と100 mg/ml の変性サケ***DNA とを含む溶液中で
42℃で4 時間プレハイブリダイゼーションを行なった。
同じバッファに10%の硫酸デキストランと106 cpm/mlの
E2標識挿入物(比活性109 cpm/μg )とを添加した溶液
中で42℃で16時間ハイブリダイゼーションを行なった。
次に 0.1×SSC 、 0.1%SDS 溶液を夫々用いて30分間ず
つ2 回洗浄した。増感スクリーンに16時間露光し、0.4N
NaOH 中でサザンスポットをデハイブリダイズし、中和
し、同じ条件下で109 cpm/μg で標識したHIV-1 プロー
ブと共に再びハイブリダイズした。
【0164】実施例 III HIV-2 プロウイルスの完全DNA のファージラムダ中での
クローニング HIV-2 ROD (第2図、バンド a及びc )に感染したCEM
細胞のDNA を Sau3AIで部分消化する。 9〜15kbの画分
を5 −40%ショ糖勾配で選択し、ラムダL47.1ベクター
の BamHIアームに結合した。in vitroパッケージング及
び大腸菌LA101株への付着後に得られたプラーク(2×10
6 ) を、E2クローン化cDNAの挿入物とのハイブリダイゼ
ーションによってin situ スクリーニングした。約10個
の陽性クローンをプラーク上で精製し、大腸菌C600 rec
BCで増殖させた。クローンラムダROD4、ROD27 及びROD3
5 を増幅した。夫々の制限マップを作成し、サザン法で
HIV-2 のcDNAクローンと共にストリンジェント条件下で
ハイブリダイゼーションを行ない、HIV-1 のgag-pol プ
ローブと共にノンストリンジェント条件下でハイブリダ
イゼーションを行なうことによってDNA の特性決定を行
なった。
クローニング HIV-2 ROD (第2図、バンド a及びc )に感染したCEM
細胞のDNA を Sau3AIで部分消化する。 9〜15kbの画分
を5 −40%ショ糖勾配で選択し、ラムダL47.1ベクター
の BamHIアームに結合した。in vitroパッケージング及
び大腸菌LA101株への付着後に得られたプラーク(2×10
6 ) を、E2クローン化cDNAの挿入物とのハイブリダイゼ
ーションによってin situ スクリーニングした。約10個
の陽性クローンをプラーク上で精製し、大腸菌C600 rec
BCで増殖させた。クローンラムダROD4、ROD27 及びROD3
5 を増幅した。夫々の制限マップを作成し、サザン法で
HIV-2 のcDNAクローンと共にストリンジェント条件下で
ハイブリダイゼーションを行ない、HIV-1 のgag-pol プ
ローブと共にノンストリンジェント条件下でハイブリダ
イゼーションを行なうことによってDNA の特性決定を行
なった。
【0165】第8図は、得られた3 つの組換ファージRO
D4、ROD27 及びROD35 の構造を概略的に示す。
D4、ROD27 及びROD35 の構造を概略的に示す。
【0166】これらの図の細長い矩形部分は、最初に感
染したCEM 細胞のDNA から得られたプロウイルス配列に
対応する。白い部分はレトロウイルス配列に対応する。
陰影部分は細胞DNA の部分に対応する。黒い部分は前記
ウイルス配列中のLTR に対応する。
染したCEM 細胞のDNA から得られたプロウイルス配列に
対応する。白い部分はレトロウイルス配列に対応する。
陰影部分は細胞DNA の部分に対応する。黒い部分は前記
ウイルス配列中のLTR に対応する。
【0167】文字L 及びR で示す細線は、クローニング
に使用したラムダL47.1 ファージベクターからでるアー
ムに対応する。いくつかの制限部位も図示されている。
特にB は BamHI、E は EcoRI、H はHindIII 、K は Kpn
I、Psは PstI、Pvは PvuI、S は SacI、X は XbaI
部位である。
に使用したラムダL47.1 ファージベクターからでるアー
ムに対応する。いくつかの制限部位も図示されている。
特にB は BamHI、E は EcoRI、H はHindIII 、K は Kpn
I、Psは PstI、Pvは PvuI、S は SacI、X は XbaI
部位である。
【0168】これらのウイルス配列はE2配列と共通部分
をもつ。E2とのハイブリダイゼーションによって決定さ
れたこれらの部分の相対位置も図示されている。
をもつ。E2とのハイブリダイゼーションによって決定さ
れたこれらの部分の相対位置も図示されている。
【0169】ROD4は環状ウイルスDNA から誘導される。
ROD27 及びROD35 は細胞DNA 構造中に組み込まれたプロ
ウイルスから誘導される。
ROD27 及びROD35 は細胞DNA 構造中に組み込まれたプロ
ウイルスから誘導される。
【0170】最後に、上記条件下でサブクローニングさ
れた挿入物、及び対応するROD4、ROD27 及びROD35 配列
に対する該挿入物の相対位置も図示されている。
れた挿入物、及び対応するROD4、ROD27 及びROD35 配列
に対する該挿入物の相対位置も図示されている。
【0171】図示の挿入物は特に、プラスミドpROD27-
5′、pROD35-3′、pPOD4.6 、pROD4.8 及びpROD4.7 の
挿入物である。
5′、pROD35-3′、pPOD4.6 、pROD4.8 及びpROD4.7 の
挿入物である。
【0172】第9図は、完全LAV ゲノムから誘導された
核酸を含むM13 サブクローンから得られた一本鎖DNA の
種々の部分から夫々得られたサブフラグメント 1〜11と
ROD4との間に生じたハイブリダイゼーションスポットの
相対強度を示す。(配列決定に基づいて決定された)完
全LAV ゲノムに対するこれらの種々のフラグメントの相
対位置は図の下部に示される。スポット12はファージラ
ムダのコントロールDNA を用いて産生されたコントロー
ルスポットに対応する。
核酸を含むM13 サブクローンから得られた一本鎖DNA の
種々の部分から夫々得られたサブフラグメント 1〜11と
ROD4との間に生じたハイブリダイゼーションスポットの
相対強度を示す。(配列決定に基づいて決定された)完
全LAV ゲノムに対するこれらの種々のフラグメントの相
対位置は図の下部に示される。スポット12はファージラ
ムダのコントロールDNA を用いて産生されたコントロー
ルスポットに対応する。
【0173】スポットトランスファー(ドットブロッ
ト)法でのハイブリダイゼーション実験は、HIV-2 の完
全cDNAを含むラムダROD4組換体をプローブとして用い実
施例IIの弱いストリンジェント条件下で行なわれた。
次に以下の条件で順次洗浄した。 2×SSC 、 0.1%SDS
、25℃(Tm-42℃) 、 1×SSC 、 0.1%SDS 、60℃(Tm-2
0℃) 、 0.1%×SSC 、 0.1%SDS 、60℃(Tm-3 ℃) 。
ト)法でのハイブリダイゼーション実験は、HIV-2 の完
全cDNAを含むラムダROD4組換体をプローブとして用い実
施例IIの弱いストリンジェント条件下で行なわれた。
次に以下の条件で順次洗浄した。 2×SSC 、 0.1%SDS
、25℃(Tm-42℃) 、 1×SSC 、 0.1%SDS 、60℃(Tm-2
0℃) 、 0.1%×SSC 、 0.1%SDS 、60℃(Tm-3 ℃) 。
【0174】図示のスポットはラジオグラフに1 晩露光
後に得られた。
後に得られた。
【0175】実施例IV 生物媒体中のHIV-2 ウイルスの存在のin vitro診断試験 材料及び方法 被検者 リスボンのEgas Moniz病院の1985年9 月から1986年9 月
の間の入院患者又は外来患者のうちからHIV-2 感染患者
を選択した。この選択のために、アフリカ出身者又はア
フリカ滞在経験者全員の血清について、 HIV-1(免疫蛍
光法-IFA- 又はELISA )及びHIV-2(IFA)の双方に対する
抗体検査を行なった。血清学的にHIV-2感染が検出され
た被検者のみに以下の試験を行なった。
の間の入院患者又は外来患者のうちからHIV-2 感染患者
を選択した。この選択のために、アフリカ出身者又はア
フリカ滞在経験者全員の血清について、 HIV-1(免疫蛍
光法-IFA- 又はELISA )及びHIV-2(IFA)の双方に対する
抗体検査を行なった。血清学的にHIV-2感染が検出され
た被検者のみに以下の試験を行なった。
【0176】ウイルス単離 12人の被検者について前記の方法でHIV 単離を行なっ
た。即ち、被検者の末梢血液リンパ球(PBL) をPHA で刺
激し、正常なヒトPHA-刺激PBL と共生培養し、インター
ロイキン-2(IL-2)の存在下に維持した。培養物の細胞傷
害性の存在と上清中の逆転写酵素活性(RT)とをモニタし
た。
た。即ち、被検者の末梢血液リンパ球(PBL) をPHA で刺
激し、正常なヒトPHA-刺激PBL と共生培養し、インター
ロイキン-2(IL-2)の存在下に維持した。培養物の細胞傷
害性の存在と上清中の逆転写酵素活性(RT)とをモニタし
た。
【0177】免疫蛍光アッセイ(IFA) IFA スライドを以下のごとく調製した。HIV-2 感染した
MOLT-4細胞をPBS で2回洗浄し、IFA ガラススライドに
層状に流し(104 細胞/ウエル)、風乾し、冷アセトン
で固定した。IFA のためにこれらの細胞を10倍希釈した
試験血清と37℃で45分間反応させ、洗浄し、乾燥し、フ
ルオレセイン結合ヤギ抗ヒトIgG 、A 、M(100 倍希釈)
と37度で30分間反応させた。洗浄後、細胞を 0.006%の
Evans blueで対比染色し、90%グリセロール、10%PBS
中に封入し蛍光顕微鏡で観察した。
MOLT-4細胞をPBS で2回洗浄し、IFA ガラススライドに
層状に流し(104 細胞/ウエル)、風乾し、冷アセトン
で固定した。IFA のためにこれらの細胞を10倍希釈した
試験血清と37℃で45分間反応させ、洗浄し、乾燥し、フ
ルオレセイン結合ヤギ抗ヒトIgG 、A 、M(100 倍希釈)
と37度で30分間反応させた。洗浄後、細胞を 0.006%の
Evans blueで対比染色し、90%グリセロール、10%PBS
中に封入し蛍光顕微鏡で観察した。
【0178】ELISA 市販の試験血清ELAVIA(Pasteur Diagnostics) 又はABBO
TTを使用し数人の被検者の血清のHIV-1 抗体を試験し
た。
TTを使用し数人の被検者の血清のHIV-1 抗体を試験し
た。
【0179】放射性免疫沈降アッセイ(RIPA) HIV-1 又はHIV-2 に感染したCEM 細胞を35S システイン
(200μCi/ml) の存在下に16時間培養した。上清を収集
し、ウイルス粒子をペレット化し、RIPAバッファ(トリ
ス-HCl 50mM pH7.5 、NaCl 150mM、EDTA 1mM、 1%トラ
イトンX100、デオキシコール酸ナトリウム 0.1%、SDS
0.1%)に溶菌した。各反応毎に、105cpm に対応する
希釈度の50μl の溶菌液を5 μl の試験血清と4 ℃で18
時間反応させた。免疫複合体をSepharose-プロテインA
(PHARMACIA)に結合させ、洗浄し、2 分間沸騰させて溶
出した。次に溶出抗原をSDS ポリアクリルアミドゲル電
気泳動及びオートラジオグラフィーで分析した。
(200μCi/ml) の存在下に16時間培養した。上清を収集
し、ウイルス粒子をペレット化し、RIPAバッファ(トリ
ス-HCl 50mM pH7.5 、NaCl 150mM、EDTA 1mM、 1%トラ
イトンX100、デオキシコール酸ナトリウム 0.1%、SDS
0.1%)に溶菌した。各反応毎に、105cpm に対応する
希釈度の50μl の溶菌液を5 μl の試験血清と4 ℃で18
時間反応させた。免疫複合体をSepharose-プロテインA
(PHARMACIA)に結合させ、洗浄し、2 分間沸騰させて溶
出した。次に溶出抗原をSDS ポリアクリルアミドゲル電
気泳動及びオートラジオグラフィーで分析した。
【0180】ドットブロットハイブリダイゼーション 被検者のPBL から単離したウイルスをペレット化し、ト
リス-HCl 10mM pH7.5、NaCl 10m、EDTA 1mM、SDS 0.5
%に溶菌した。50,000cpm のRT活性に対応する各溶菌液
1 μl をニトロセルロースに付着させた。強いストリン
ジェント条件下でハイブリダイゼーションと洗浄とを行
なった。ハイブリダイゼーションは、 6×SSC 、 5×De
nhart 、50%ホルムアミド中で42℃で18時間行ない、洗
浄は、 0.1×SSC 、 0.1%SDS 中で65℃で行なった。比
活性108 cpm/μg に32P 標識したHIV-1 及びHIV-2 プロ
ーブを使用した。HIV-1 プローブは LAVBRU 単離物の完
全ゲノムに対応し、HIV-2 プローブは LAV-2ROD 単離物
からの2kb のcDNAから誘導されていた。
リス-HCl 10mM pH7.5、NaCl 10m、EDTA 1mM、SDS 0.5
%に溶菌した。50,000cpm のRT活性に対応する各溶菌液
1 μl をニトロセルロースに付着させた。強いストリン
ジェント条件下でハイブリダイゼーションと洗浄とを行
なった。ハイブリダイゼーションは、 6×SSC 、 5×De
nhart 、50%ホルムアミド中で42℃で18時間行ない、洗
浄は、 0.1×SSC 、 0.1%SDS 中で65℃で行なった。比
活性108 cpm/μg に32P 標識したHIV-1 及びHIV-2 プロ
ーブを使用した。HIV-1 プローブは LAVBRU 単離物の完
全ゲノムに対応し、HIV-2 プローブは LAV-2ROD 単離物
からの2kb のcDNAから誘導されていた。
【0181】結 果 被検者集団 血清学的及び/又はウイルス学的にHIV-2 感染の徴候を
もつ30人の被検者で試験した。12人が男性、18人が女性
であった。年令は11歳から55歳で平均年令35歳である。
一人を除く全員が西アフリカに数年滞在した経験があ
る。26人はギニアビサウ(Guinea-Bissau) の住民であ
り、2 人はケープヴェルデ島(Cape VerdeIslands )出
身である。1 人はアンゴラ出身でケープヴェルデ島に数
年住んでいた11歳の少年である。試験集団中の唯一の欧
米人は8 年間ザイールに住み西アフリカには全く滞在し
たことのない40歳のポルトガル人男性である。
もつ30人の被検者で試験した。12人が男性、18人が女性
であった。年令は11歳から55歳で平均年令35歳である。
一人を除く全員が西アフリカに数年滞在した経験があ
る。26人はギニアビサウ(Guinea-Bissau) の住民であ
り、2 人はケープヴェルデ島(Cape VerdeIslands )出
身である。1 人はアンゴラ出身でケープヴェルデ島に数
年住んでいた11歳の少年である。試験集団中の唯一の欧
米人は8 年間ザイールに住み西アフリカには全く滞在し
たことのない40歳のポルトガル人男性である。
【0182】臨床所見 30人中17人がCDC 基準によればエイズであった。これら
の患者のおもな症状は慢性の下痢であり、多くの場合こ
れに伴って1 年で体重が10kg以上減少していた。10人の
患者では下痢が腸内日和見感染と関連し、7 人の患者で
は病原体が戦争イソスポラ(Isospora belli)だけであ
り、1 人ではCryptosporidium だけであり、2 人は両方
の病原体をもっていた。3 人の患者で腸内日和見病原体
は検出されなかった。17人のエイズ患者のうちの8 人で
食道カンジダ症が診断された。6 人のエイズ患者が呼吸
器症候群を示した。2 人が肺結核と診断され、1 人で別
のまだ同定されないマイコバクテリウムが検出された。
2 人の患者に肺アスペルギルス症(asperogillosis)があ
り1 人は結核を併発した。別の2 人のエイズ患者は病原
体が同定できない肺炎(pneumonitis) のエピソードを繰
り返し、1 人の患者はカリニニューモシスティス(Pneum
ocystis)肺炎であった。これだけは死後診断で判明し
た。17人のエイズ患者のうち4 人がカポジ肉腫をもち、
3 人ではこれが皮膚だけにあったが、1 人の患者では死
後所見によって散在性内臓病巣が判明した。2 人のエイ
ズ患者で中枢神経系障害が観察された。1 人は脳リンパ
腫であり1人は原因不明の亜急性脳炎である。
の患者のおもな症状は慢性の下痢であり、多くの場合こ
れに伴って1 年で体重が10kg以上減少していた。10人の
患者では下痢が腸内日和見感染と関連し、7 人の患者で
は病原体が戦争イソスポラ(Isospora belli)だけであ
り、1 人ではCryptosporidium だけであり、2 人は両方
の病原体をもっていた。3 人の患者で腸内日和見病原体
は検出されなかった。17人のエイズ患者のうちの8 人で
食道カンジダ症が診断された。6 人のエイズ患者が呼吸
器症候群を示した。2 人が肺結核と診断され、1 人で別
のまだ同定されないマイコバクテリウムが検出された。
2 人の患者に肺アスペルギルス症(asperogillosis)があ
り1 人は結核を併発した。別の2 人のエイズ患者は病原
体が同定できない肺炎(pneumonitis) のエピソードを繰
り返し、1 人の患者はカリニニューモシスティス(Pneum
ocystis)肺炎であった。これだけは死後診断で判明し
た。17人のエイズ患者のうち4 人がカポジ肉腫をもち、
3 人ではこれが皮膚だけにあったが、1 人の患者では死
後所見によって散在性内臓病巣が判明した。2 人のエイ
ズ患者で中枢神経系障害が観察された。1 人は脳リンパ
腫であり1人は原因不明の亜急性脳炎である。
【0183】4人の患者がエイズ関連症候群(ARC) の徴
候を示した。2 人はしつこい発熱を伴う散在性リンパ節
障害があり、1 人は体重減少を伴う慢性下痢があり、1
人は気管支肺炎の再発エピソード及び多発性リンパ節障
害があった。
候を示した。2 人はしつこい発熱を伴う散在性リンパ節
障害があり、1 人は体重減少を伴う慢性下痢があり、1
人は気管支肺炎の再発エピソード及び多発性リンパ節障
害があった。
【0184】残りの9 人の患者のうち、6 人はHIV 感染
に関連すると思われる症状はなく、1 人は肺結核だけ、
1 人はしつこい散在性リンパ節障害だけ、1 人は脳梅毒
であった。12箇月の試験期間中7 人の患者が死亡し、死
亡者全員がエイズであった。
に関連すると思われる症状はなく、1 人は肺結核だけ、
1 人はしつこい散在性リンパ節障害だけ、1 人は脳梅毒
であった。12箇月の試験期間中7 人の患者が死亡し、死
亡者全員がエイズであった。
【0185】血清学的研究 各患者に対しHIV-1 及びHIV-2 の双方の抗体に対する血
清試験を少なくとも1回行なった。患者全員の血清をIFA
でHIV-2 抗体検査すると全部が陽性であった。そのう
ちの21人についてはRIPAでHIV-2 抗体検査を行なった。
全員の血清がgp140 と指称されるウイルスの高分子量エ
ンベロープ糖タンパク質をはっきりと沈降した。そのう
ちの16人の血清はまた主要コアタンパク質p26 とも反応
し、1 人の血清だけがp16 と指称される別のウイルスコ
アタンパク質と反応した。
清試験を少なくとも1回行なった。患者全員の血清をIFA
でHIV-2 抗体検査すると全部が陽性であった。そのう
ちの21人についてはRIPAでHIV-2 抗体検査を行なった。
全員の血清がgp140 と指称されるウイルスの高分子量エ
ンベロープ糖タンパク質をはっきりと沈降した。そのう
ちの16人の血清はまた主要コアタンパク質p26 とも反応
し、1 人の血清だけがp16 と指称される別のウイルスコ
アタンパク質と反応した。
【0186】種々のアッセイを使用し血清の交差反応性
HIV-1 抗体の存在を検査した。24の血清でIFA 試験を行
なった。12の血清は陰性であり、10の血清は弱反応性で
あり、2 つの血清が陽性であった。21の血清をELISA で
検査した。16の血清が陰性で、5 つの血清が陽性であっ
た。最後に、11の血清中のHIV-1 タンパク質に対する抗
体検査をRIPAで行なった。3 つの血清はウイルスタンパ
ク質と全く反応せず、2 つの血清だけがpol 遺伝子産生
物p34 を沈降させ、5 つの血清が主要コアタンパク質p2
5 と反応した。2 つの血清はHIV-1 のエンベロープ糖タ
ンパク質gp110と微弱に反応した。これら2 つの血清及
びIFA 又はELISA のHIV-1 抗体検査で陽性の血清全部
は、RIPAでHIV-2 のgp140 と強い反応性をもち、これは
HIV-1 感染でなくHIV-2 があることの指標となる。検査
集団に入れなかった一人の患者だけが血清学的にHIV-1
に感染しHIV-2 に感染していなかった。この患者は中央
アフリカ(サントメ(San Tome)島)出身の21歳の女性エ
イズ患者である。
HIV-1 抗体の存在を検査した。24の血清でIFA 試験を行
なった。12の血清は陰性であり、10の血清は弱反応性で
あり、2 つの血清が陽性であった。21の血清をELISA で
検査した。16の血清が陰性で、5 つの血清が陽性であっ
た。最後に、11の血清中のHIV-1 タンパク質に対する抗
体検査をRIPAで行なった。3 つの血清はウイルスタンパ
ク質と全く反応せず、2 つの血清だけがpol 遺伝子産生
物p34 を沈降させ、5 つの血清が主要コアタンパク質p2
5 と反応した。2 つの血清はHIV-1 のエンベロープ糖タ
ンパク質gp110と微弱に反応した。これら2 つの血清及
びIFA 又はELISA のHIV-1 抗体検査で陽性の血清全部
は、RIPAでHIV-2 のgp140 と強い反応性をもち、これは
HIV-1 感染でなくHIV-2 があることの指標となる。検査
集団に入れなかった一人の患者だけが血清学的にHIV-1
に感染しHIV-2 に感染していなかった。この患者は中央
アフリカ(サントメ(San Tome)島)出身の21歳の女性エ
イズ患者である。
【0187】ウイルス単離 12人の患者で末梢血液リンパ球からレトロウイルスの単
離試験を行なった。典型的細胞変性効果の存在及び培養
上清中の粒子関連逆転写酵素活性のピークの存在に従っ
て11のサンプルからHIV を単離した。
離試験を行なった。典型的細胞変性効果の存在及び培養
上清中の粒子関連逆転写酵素活性のピークの存在に従っ
て11のサンプルからHIV を単離した。
【0188】11の単離物の全部がドットブロットハイブ
リダイゼーション法によってHIV-2と同定された。10個
の単離物のウイルスドットは、ストリンジェント条件下
のハイブリダイゼーション及び洗浄によって、クローン
HIV-2 cDNAから誘導されたHIV-2 プローブと強くハイブ
リダイズすることが知見されたが、同じ条件下でHIV-1
プローブとは全くハイブリダイズしなかった。1 つの単
離物だけはHIV-2 プローブと弱くハイブリダイズしHIV-
1 とはハイブリダイズしなかった。
リダイゼーション法によってHIV-2と同定された。10個
の単離物のウイルスドットは、ストリンジェント条件下
のハイブリダイゼーション及び洗浄によって、クローン
HIV-2 cDNAから誘導されたHIV-2 プローブと強くハイブ
リダイズすることが知見されたが、同じ条件下でHIV-1
プローブとは全くハイブリダイズしなかった。1 つの単
離物だけはHIV-2 プローブと弱くハイブリダイズしHIV-
1 とはハイブリダイズしなかった。
【0189】免疫学的検査 13人の患者についてヘルパーT 細胞(CD4+)と同定され
た循環リンパ球の数を測定しヘルパーT 細胞とサプレッ
サーT 細胞との比を算出した。これらの患者のうちの11
人がエイズであった。即ち、ヘルパーT 細胞の平均絶対
カウント数が 243+300/μl であり、ヘルパー対サプレ
ッサー比の平均は0.25+0.15であった。臨床的にARC を
示す一人の患者ではヘルパーT リンパ球の数は240/μl
で比は0.18であった。脳梅毒にかかっておりHIV 関連症
候群の徴候を全く示さない別の患者ではヘルパーT リン
パ球のカウント数は690/μl で比は0.82であった。
た循環リンパ球の数を測定しヘルパーT 細胞とサプレッ
サーT 細胞との比を算出した。これらの患者のうちの11
人がエイズであった。即ち、ヘルパーT 細胞の平均絶対
カウント数が 243+300/μl であり、ヘルパー対サプレ
ッサー比の平均は0.25+0.15であった。臨床的にARC を
示す一人の患者ではヘルパーT リンパ球の数は240/μl
で比は0.18であった。脳梅毒にかかっておりHIV 関連症
候群の徴候を全く示さない別の患者ではヘルパーT リン
パ球のカウント数は690/μl で比は0.82であった。
【0190】考 察 この研究でエイズもしくはARC に罹患しているか又は見
掛けはHIV 関連症候群を示さない30人の西アフリカ人被
検者のHIV-2 感染が証明された。この結果から得られた
結論は、HIV-2 が西アフリカ人エイズ患者の主要病因物
質と考えられることである。我々の患者において観察さ
れた血清学的及びウイルス学的プロフィールによれば、
HIV-2 感染がしばしばHIV-1 感染と関連していなかっ
た。HIV-1とHIV-2 とは抗原的及び遺伝的に大きい違い
があるにもかかわらず、同様のCD4+T リンパ球親和性
をもち、同様の細胞変性効果をもち、同様の形態をも
ち、いくつかの構成タンパク質中に共通の免疫反応エピ
トープをもつ。この研究でHIV感染していた西アフリカ
人被検者全員がHIV-2 感染であり、HIV-1 感染は一人も
いないことが判明した。従って新規なウイルスHIV-2 は
西アフリカのエイズの主因であろう。
掛けはHIV 関連症候群を示さない30人の西アフリカ人被
検者のHIV-2 感染が証明された。この結果から得られた
結論は、HIV-2 が西アフリカ人エイズ患者の主要病因物
質と考えられることである。我々の患者において観察さ
れた血清学的及びウイルス学的プロフィールによれば、
HIV-2 感染がしばしばHIV-1 感染と関連していなかっ
た。HIV-1とHIV-2 とは抗原的及び遺伝的に大きい違い
があるにもかかわらず、同様のCD4+T リンパ球親和性
をもち、同様の細胞変性効果をもち、同様の形態をも
ち、いくつかの構成タンパク質中に共通の免疫反応エピ
トープをもつ。この研究でHIV感染していた西アフリカ
人被検者全員がHIV-2 感染であり、HIV-1 感染は一人も
いないことが判明した。従って新規なウイルスHIV-2 は
西アフリカのエイズの主因であろう。
【0191】HIV-2 関連エイズの症候群は中央アフリカ
のHIV-1 関連エイズの症候群と違ってはいなかった。最
も共通的な症候は、かなりの体重減少を伴う慢性下痢で
ありこの多くは戦争イソスポラ及び/又はCryptosporid
ium に起因する。その他の日和見感染症例えばカンジダ
症、マイコバクテリウム症(結核菌を含む)及びトキソ
プラズマ症もHIV-1 関連アフリカ人エイズの場合と同様
であった。欧米人のエイズ患者の間で最も多い合併症で
あるカリニ・ニューモシスティス肺炎は研究中に一例し
か観察されずクリプトコッカス髄膜炎は検出されなかっ
た。
のHIV-1 関連エイズの症候群と違ってはいなかった。最
も共通的な症候は、かなりの体重減少を伴う慢性下痢で
ありこの多くは戦争イソスポラ及び/又はCryptosporid
ium に起因する。その他の日和見感染症例えばカンジダ
症、マイコバクテリウム症(結核菌を含む)及びトキソ
プラズマ症もHIV-1 関連アフリカ人エイズの場合と同様
であった。欧米人のエイズ患者の間で最も多い合併症で
あるカリニ・ニューモシスティス肺炎は研究中に一例し
か観察されずクリプトコッカス髄膜炎は検出されなかっ
た。
【0192】しかしながら、HIV-2 感染エイズ患者で観
察された免疫異常はHIV-1 関連エイズの場合と同様であ
る。
察された免疫異常はHIV-1 関連エイズの場合と同様であ
る。
【0193】HIV-2 抗原と反応性の血清抗体を有してい
た30人の被検者全員のうちで7 人だけがIFA 又はELISA
で検出できるHIV-1 特異的抗体を有していた。RIPAでは
この7 人の被検者全員が強力な免疫反応エピトープを共
有する別の主要コアタンパク質p25(HIV-1)又はp26(HIV-
2)と反応性の抗体を有していた。5 人の被検者にはこの
ような抗体がなく、この5 人全員がELISA でHIV-1 陰性
であり、IFA では3 人がボーダーラインで2 人が陰性で
あった。何人かの被検者は完全にはアッセイできなかっ
たが、9 人の被検者はHIV-1 特異的IFA 及び/又はELIS
A に弱い反応性又は陰性を示し、HIV-2 のウイルスコア
タンパク質p26 に対する血清抗体を有していた。これら
の知見は、アフリカ及びその他の地域で使用されるHIV
血清試験にHIV-2 抗原を含ませることが重要であること
を示す。
た30人の被検者全員のうちで7 人だけがIFA 又はELISA
で検出できるHIV-1 特異的抗体を有していた。RIPAでは
この7 人の被検者全員が強力な免疫反応エピトープを共
有する別の主要コアタンパク質p25(HIV-1)又はp26(HIV-
2)と反応性の抗体を有していた。5 人の被検者にはこの
ような抗体がなく、この5 人全員がELISA でHIV-1 陰性
であり、IFA では3 人がボーダーラインで2 人が陰性で
あった。何人かの被検者は完全にはアッセイできなかっ
たが、9 人の被検者はHIV-1 特異的IFA 及び/又はELIS
A に弱い反応性又は陰性を示し、HIV-2 のウイルスコア
タンパク質p26 に対する血清抗体を有していた。これら
の知見は、アフリカ及びその他の地域で使用されるHIV
血清試験にHIV-2 抗原を含ませることが重要であること
を示す。
【0194】11人の患者の末梢リンパ球からレトロウイ
ルスを単離した。全部の場合に、ウイルスを2 週間以内
に増殖させ培養上清中の逆転写酵素活性の存在と細胞変
性効果の存在とによって特性決定を行なった。しかしな
がら、この細胞変性効果は単離物サンプル毎にかなりの
ばらつきがある。いくつかの単離物ではかなりの細胞溶
解と共に多数の大きい融合細胞が形成されており、別の
単離物では小さい融合細胞が少しだけ形成され培養物の
生存能力には殆ど影響を与えない。
ルスを単離した。全部の場合に、ウイルスを2 週間以内
に増殖させ培養上清中の逆転写酵素活性の存在と細胞変
性効果の存在とによって特性決定を行なった。しかしな
がら、この細胞変性効果は単離物サンプル毎にかなりの
ばらつきがある。いくつかの単離物ではかなりの細胞溶
解と共に多数の大きい融合細胞が形成されており、別の
単離物では小さい融合細胞が少しだけ形成され培養物の
生存能力には殆ど影響を与えない。
【0195】1 つを除く全部の単離物から得られたRNA
は、強いストリンジェント条件下でゲノムの 3′末端を
示すHIV-2 cDNAクローンから誘導されたプローブとはっ
きりとハイブリダイズすることが知見された。これらの
単離物は同じ条件下でHIV-1プローブとは全くハイブリ
ダイズしなかった。これは、これら被検者に感染してい
る単離物全部が同タイプのウイルスに属することを証明
する。1 つの単離物だけはHIV-1 ときわめて弱くハイブ
リダイズした。しかしながらこのウイルスはRIPAでHIV-
2 の抗原全部と反応する血清抗体をもつ患者から単離さ
れた。
は、強いストリンジェント条件下でゲノムの 3′末端を
示すHIV-2 cDNAクローンから誘導されたプローブとはっ
きりとハイブリダイズすることが知見された。これらの
単離物は同じ条件下でHIV-1プローブとは全くハイブリ
ダイズしなかった。これは、これら被検者に感染してい
る単離物全部が同タイプのウイルスに属することを証明
する。1 つの単離物だけはHIV-1 ときわめて弱くハイブ
リダイズした。しかしながらこのウイルスはRIPAでHIV-
2 の抗原全部と反応する血清抗体をもつ患者から単離さ
れた。
【0196】本発明は更に、HIV-2 ウイルス及びその変
異株だけでなく、HIV-2 に特異的な免疫学的特性をもち
ヒトに感染する等価のウイルス一般をすべて包含する。
本発明は、CNCMに寄託されたHIV-2 ウイルスがもつ特性
だけでなく以下の特性をもつウイルス一般をすべて包含
する。
異株だけでなく、HIV-2 に特異的な免疫学的特性をもち
ヒトに感染する等価のウイルス一般をすべて包含する。
本発明は、CNCMに寄託されたHIV-2 ウイルスがもつ特性
だけでなく以下の特性をもつウイルス一般をすべて包含
する。
【0197】HIV-2 レトロウイルスの好適標的は、ヒト
Leu3細胞(又はT4リンパ球)及びこれらのT4リンパ球か
ら誘導された「樹立(immortalized)」細胞、例えば本明
細書で前記したHUT78 系の細胞から成る。言い替える
と、該レトロウイルスはこれらの細胞に対して特異的親
和性をもつ。該レトロウイルスはT4タンパク質を発現す
るHUT 、CEM 、MOLT又は同タイプの永久株中で培養され
る。該レトロウイルスはT8リンパ球に感染しない。該レ
トロウイルスはヒトT4リンパ球に細胞傷害性である。T4
リンパ球に対するHIV-2 ウイルスの細胞変性効果は特に
多核細胞の出現によって証明される。該レトロウイルス
はMg2+イオンの存在を要する逆転写酵素活性をもち、ポ
リアデニレートオリゴデオキシチミジレート(ポリ(A)-
オリゴ(dT)、12〜18)に強いアフィニティをもつ。該レ
トロウイルスはショ糖濃度勾配中で密度約1.16をもつ。
該レトロウイルスは、 平均直径約140nm でコア平均直径
約41nmである。このウイルスの溶解液は、HTLV-1ウイル
ス又はHTLV-2ウイルスのp24タンパク質と免疫交差しな
いp26 タンパク質を含む。従ってこれらのp26 タンパク
質の分子量はHIV-1 の対応するp25 タンパク質の分子量
よりやや(約1,000 程度だけ)大きく、SIV の対応する
p27 タンパク質の分子量よりやや(やはり約1,000 程度
だけ)小さい。HIV-2 の溶解液は更に、RIPA(radioimm
unoprecipitation assayの略号)実験でHTLV-1又はHTLV
-2のp19 タンパク質によって免疫認識されないp16 タン
パク質を含む。これらは更に、分子量 130,000〜140,00
0 のオーダのエンベロープ糖タンパク質を含み、このタ
ンパク質はHIV-1 のgp110 と免疫交差しないが、STLV-I
IIのgp140 エンベロープ糖タンパク質と免疫交差する。
その溶解液はまた、夫々36,000及び42,000〜45,000のオ
ーダの分子量をもち(35S)システインで標識され得るタ
ンパク質又は糖タンパク質を含む。HIV-2 のゲノムRNA
はストリンジェント条件下でHIV-1 のゲノムRNA とハイ
ブリダイズしない。該RNA は、HIV-1 から誘導されenv
遺伝子と該遺伝子に隣接のLTR とを含むヌクレオチド配
列とノンストリンジェント条件下でハイブリダイズしな
い。該RNA は特に、HIV-1 のヌクレオチド配列5290-913
0 及びHIV-1 ゲノムのpol 領域の配列、特にヌクレオチ
ド配列2170-2240 とのいずれにもハイブリダイズしな
い。該RNA は、HIV-1 領域のヌクレオチド配列、特にヌ
クレオチド配列990-1070及び990-1260とノンストリンジ
ェント条件下で弱くハイブリダイズする。
Leu3細胞(又はT4リンパ球)及びこれらのT4リンパ球か
ら誘導された「樹立(immortalized)」細胞、例えば本明
細書で前記したHUT78 系の細胞から成る。言い替える
と、該レトロウイルスはこれらの細胞に対して特異的親
和性をもつ。該レトロウイルスはT4タンパク質を発現す
るHUT 、CEM 、MOLT又は同タイプの永久株中で培養され
る。該レトロウイルスはT8リンパ球に感染しない。該レ
トロウイルスはヒトT4リンパ球に細胞傷害性である。T4
リンパ球に対するHIV-2 ウイルスの細胞変性効果は特に
多核細胞の出現によって証明される。該レトロウイルス
はMg2+イオンの存在を要する逆転写酵素活性をもち、ポ
リアデニレートオリゴデオキシチミジレート(ポリ(A)-
オリゴ(dT)、12〜18)に強いアフィニティをもつ。該レ
トロウイルスはショ糖濃度勾配中で密度約1.16をもつ。
該レトロウイルスは、 平均直径約140nm でコア平均直径
約41nmである。このウイルスの溶解液は、HTLV-1ウイル
ス又はHTLV-2ウイルスのp24タンパク質と免疫交差しな
いp26 タンパク質を含む。従ってこれらのp26 タンパク
質の分子量はHIV-1 の対応するp25 タンパク質の分子量
よりやや(約1,000 程度だけ)大きく、SIV の対応する
p27 タンパク質の分子量よりやや(やはり約1,000 程度
だけ)小さい。HIV-2 の溶解液は更に、RIPA(radioimm
unoprecipitation assayの略号)実験でHTLV-1又はHTLV
-2のp19 タンパク質によって免疫認識されないp16 タン
パク質を含む。これらは更に、分子量 130,000〜140,00
0 のオーダのエンベロープ糖タンパク質を含み、このタ
ンパク質はHIV-1 のgp110 と免疫交差しないが、STLV-I
IIのgp140 エンベロープ糖タンパク質と免疫交差する。
その溶解液はまた、夫々36,000及び42,000〜45,000のオ
ーダの分子量をもち(35S)システインで標識され得るタ
ンパク質又は糖タンパク質を含む。HIV-2 のゲノムRNA
はストリンジェント条件下でHIV-1 のゲノムRNA とハイ
ブリダイズしない。該RNA は、HIV-1 から誘導されenv
遺伝子と該遺伝子に隣接のLTR とを含むヌクレオチド配
列とノンストリンジェント条件下でハイブリダイズしな
い。該RNA は特に、HIV-1 のヌクレオチド配列5290-913
0 及びHIV-1 ゲノムのpol 領域の配列、特にヌクレオチ
ド配列2170-2240 とのいずれにもハイブリダイズしな
い。該RNA は、HIV-1 領域のヌクレオチド配列、特にヌ
クレオチド配列990-1070及び990-1260とノンストリンジ
ェント条件下で弱くハイブリダイズする。
【0198】ヒトに感染してエイズの形態の1 つを誘発
する能力をもち、前記のごとき本質的特性を備え、CNCM
に寄託されたHIV-2 ウイルス株(又はそのゲノムRNA か
ら誘導されたcDNA又はcDNAフラグメント)とストリンジ
ェント条件下でハイブリダイズし得るゲノムRNA をもつ
いかなるレトロウイルスもHIV-2 と等価と考えてよいこ
とが理解されよう。
する能力をもち、前記のごとき本質的特性を備え、CNCM
に寄託されたHIV-2 ウイルス株(又はそのゲノムRNA か
ら誘導されたcDNA又はcDNAフラグメント)とストリンジ
ェント条件下でハイブリダイズし得るゲノムRNA をもつ
いかなるレトロウイルスもHIV-2 と等価と考えてよいこ
とが理解されよう。
【0199】本発明は更に、HIV-2 から得られる各抗
原、特に精製状態のタンパク質及び糖タンパク質に係
る。「精製」タンパク質又は糖タンパク質なる用語は夫
々、特に前記の実験条件下でポリアクリルアミドゲル電
気泳動に単一バンドを生じるタンパク質又は糖タンパク
質を意味する。各抗原を得るために任意の適当な分離及
び/又は精製方法を使用し得る。使用可能な方法の例と
してR.C.MONTELARO 等、J.of Viro-logy 1982年6 月、p
p1029-1038 に記載の方法がある。
原、特に精製状態のタンパク質及び糖タンパク質に係
る。「精製」タンパク質又は糖タンパク質なる用語は夫
々、特に前記の実験条件下でポリアクリルアミドゲル電
気泳動に単一バンドを生じるタンパク質又は糖タンパク
質を意味する。各抗原を得るために任意の適当な分離及
び/又は精製方法を使用し得る。使用可能な方法の例と
してR.C.MONTELARO 等、J.of Viro-logy 1982年6 月、p
p1029-1038 に記載の方法がある。
【0200】本発明は一般的に、HIV-2 に由来しHIV-2
の抗原化合物の免疫特性と等価の免疫特性をもつすべて
の抗原、特にタンパク質、糖タンパク質又はポリペプチ
ドに係る。この場合、2 つの抗原が同じ抗体、特にHIV-
2 感染患者の血清から単離された抗体によって認識され
るとき、又は、2 つの抗原が後述する「免疫学的等価」
条件を充足するときに2 つの抗原が「等価」であると考
えられる。
の抗原化合物の免疫特性と等価の免疫特性をもつすべて
の抗原、特にタンパク質、糖タンパク質又はポリペプチ
ドに係る。この場合、2 つの抗原が同じ抗体、特にHIV-
2 感染患者の血清から単離された抗体によって認識され
るとき、又は、2 つの抗原が後述する「免疫学的等価」
条件を充足するときに2 つの抗原が「等価」であると考
えられる。
【0201】抗原のフラグメント(又は化学合成によっ
て再構築されたペプチド)は、該フラグメントの供給源
となった抗原との免疫交差反応を生じる限り等価ポリペ
プチド、タンパク質又は糖タンパク質であると考えてよ
い。言い替えると本発明は、同じ抗体によって認識され
得る同一の又は同様のエピトープを前記抗原と共有する
いかなるポリペプチドをも包含する。このタイプに属す
るポリペプチドは、対応するポリペプチド配列をコード
するDNA の対応配列の発現産物である。
て再構築されたペプチド)は、該フラグメントの供給源
となった抗原との免疫交差反応を生じる限り等価ポリペ
プチド、タンパク質又は糖タンパク質であると考えてよ
い。言い替えると本発明は、同じ抗体によって認識され
得る同一の又は同様のエピトープを前記抗原と共有する
いかなるポリペプチドをも包含する。このタイプに属す
るポリペプチドは、対応するポリペプチド配列をコード
するDNA の対応配列の発現産物である。
【0202】HIV-2 ウイルスは、HIV-2 ウイルスと接触
した全ての人間で抗体を検出するための抗原ソースとし
て使用できることが判明した。
した全ての人間で抗体を検出するための抗原ソースとし
て使用できることが判明した。
【0203】本発明は一般的に、生物流体血清中、特に
HIV-2 と接触したヒトの血清中で、HIV-2 の抗原の少な
くとも1 つに対する抗体の存在を診断するために使用で
きる組成物に係る。この組成物は、前記の欧州特許出願
に記載のごとき診断方法においてHIV-1 のかわりにHIV-
2 の抽出物、溶菌液又は精製抗原を使用して対応する種
々のエイズを選択的に診断するために使用され得る。こ
れに関連して本発明は特に、内部タンパク質であるタン
パク質p12,p16,p26 の少なくとも1 つ又はp36又はgp140
を含む組成物に係る。これらの例として以下のタンパ
ク質を同時に含む組成物がある。
HIV-2 と接触したヒトの血清中で、HIV-2 の抗原の少な
くとも1 つに対する抗体の存在を診断するために使用で
きる組成物に係る。この組成物は、前記の欧州特許出願
に記載のごとき診断方法においてHIV-1 のかわりにHIV-
2 の抽出物、溶菌液又は精製抗原を使用して対応する種
々のエイズを選択的に診断するために使用され得る。こ
れに関連して本発明は特に、内部タンパク質であるタン
パク質p12,p16,p26 の少なくとも1 つ又はp36又はgp140
を含む組成物に係る。これらの例として以下のタンパ
ク質を同時に含む組成物がある。
【0204】−p26 及びgp36 −p26,p36 及びgp140 −p12,p16 及びp26 −p16,p26 及びgp140 等。
【0205】これらの組成物が幾つかの例にすぎないこ
とは明らかであろう。特に、本発明はこのグループのタ
ンパク質及び/又は糖タンパク質を含むウイルス抽出物
又は溶菌液又は前記タンパク質又は糖タンパク質の1 つ
以上の分離に使用される全ての画分に係る。
とは明らかであろう。特に、本発明はこのグループのタ
ンパク質及び/又は糖タンパク質を含むウイルス抽出物
又は溶菌液又は前記タンパク質又は糖タンパク質の1 つ
以上の分離に使用される全ての画分に係る。
【0206】本発明はまた、HIV-2 のタンパク質及び/
又は糖タンパク質と例えばHIV-1 のタンパク質及び/又
は糖タンパク質との組み合わせを含む組成物に係る。こ
の組み合わせは例えば、 −HUV-1 又はHIV-2 のコアタンパク質、特にHIV-1 のp2
5 とHIV-2 のp26 、又はHIV-1 のp18 とHIV-2 のp16 で
もよく、 −HIV-1 のエンベロープ糖タンパク質とHIV-2 のエンベ
ロープ糖タンパク質、特にHIV-1 のgp110 とHIV-2 のgp
140 、又はHIV-1 のp42 とHIV-2 のp36 もしくはp42〜p
45 でもよく、 −HIV-1 のタンパク質及び/又は糖タンパク質とHIV-2
のタンパク質及び/又は糖タンパク質との混合物でもよ
い。
又は糖タンパク質と例えばHIV-1 のタンパク質及び/又
は糖タンパク質との組み合わせを含む組成物に係る。こ
の組み合わせは例えば、 −HUV-1 又はHIV-2 のコアタンパク質、特にHIV-1 のp2
5 とHIV-2 のp26 、又はHIV-1 のp18 とHIV-2 のp16 で
もよく、 −HIV-1 のエンベロープ糖タンパク質とHIV-2 のエンベ
ロープ糖タンパク質、特にHIV-1 のgp110 とHIV-2 のgp
140 、又はHIV-1 のp42 とHIV-2 のp36 もしくはp42〜p
45 でもよく、 −HIV-1 のタンパク質及び/又は糖タンパク質とHIV-2
のタンパク質及び/又は糖タンパク質との混合物でもよ
い。
【0207】かかる診断用組成物は、病因物質が広い範
囲に及ぶエイズ又はエイズ関連症候群の診断手段を提供
する。言うまでもなく、HIV-2 のタンパク質及び/又は
糖タンパク質だけを含む組成物を診断手段として使用す
ると、病因レトロウイルスの種類をより選択的に診断で
きる。
囲に及ぶエイズ又はエイズ関連症候群の診断手段を提供
する。言うまでもなく、HIV-2 のタンパク質及び/又は
糖タンパク質だけを含む組成物を診断手段として使用す
ると、病因レトロウイルスの種類をより選択的に診断で
きる。
【0208】本発明はまた、DNA 又はDNA フラグメン
ト、より特定的にはHIV-2 レトロウイルスのRNA から誘
導されたクローンDNA 及びcDNAから得られたDNA フラグ
メントに係る。本発明は特に、すべての等価のDNA 、特
にHIV-2 のDNA との配列ホモロジー、特にCNCMに寄託さ
れたHIV-2 の菌株のenv 領域及びpol 領域をコードする
配列との配列ホモロジーを少なくとも50%、好ましくは
70%、より好ましくは90%までの範囲でもつDNA を包含
する。一般的に本発明は、前記のごときノンストリンジ
ェント条件下で「spot blot 」法によってHIV-2 のDNA
又はRNA とハイブリダイズし得る任意の等価のDNA(又は
RNA)に係ると言うことができる。
ト、より特定的にはHIV-2 レトロウイルスのRNA から誘
導されたクローンDNA 及びcDNAから得られたDNA フラグ
メントに係る。本発明は特に、すべての等価のDNA 、特
にHIV-2 のDNA との配列ホモロジー、特にCNCMに寄託さ
れたHIV-2 の菌株のenv 領域及びpol 領域をコードする
配列との配列ホモロジーを少なくとも50%、好ましくは
70%、より好ましくは90%までの範囲でもつDNA を包含
する。一般的に本発明は、前記のごときノンストリンジ
ェント条件下で「spot blot 」法によってHIV-2 のDNA
又はRNA とハイブリダイズし得る任意の等価のDNA(又は
RNA)に係ると言うことができる。
【0209】本発明はまた、動物にHIV-2 を接種して動
物体内に産生させ得る血清に係る。従ってより特定的に
は本発明は、ウイルスの各抗原、特にウイルスのタンパ
ク質又は糖タンパク質に特異的なポリクローナル抗体に
係る。また、従来の方法で産生できHIV-2 の種々のタン
パク質に対して夫々より特異的なモノクローナル抗体に
係る。
物体内に産生させ得る血清に係る。従ってより特定的に
は本発明は、ウイルスの各抗原、特にウイルスのタンパ
ク質又は糖タンパク質に特異的なポリクローナル抗体に
係る。また、従来の方法で産生できHIV-2 の種々のタン
パク質に対して夫々より特異的なモノクローナル抗体に
係る。
【0210】これらのポリクローナル又はモノクローナ
ル抗体は種々の用途で使用できる。主な用途としては対
応するタンパク質の中和、又は全ウイルスの感染性阻害
等がある。また例えば、生物学的製剤中のウイルス抗原
の検出のために使用してもよく、又は例えばアフィニテ
ィクロマトグラフィーカラムで対応タンパク質及び/又
は糖タンパク質の精製処理を行なうために使用してもよ
い。
ル抗体は種々の用途で使用できる。主な用途としては対
応するタンパク質の中和、又は全ウイルスの感染性阻害
等がある。また例えば、生物学的製剤中のウイルス抗原
の検出のために使用してもよく、又は例えばアフィニテ
ィクロマトグラフィーカラムで対応タンパク質及び/又
は糖タンパク質の精製処理を行なうために使用してもよ
い。
【0211】一般的に、HIV-1 及びHTLV-IIIと命名され
たウイルスに関して入手し得る技術文献(特に本文中で
参照した文献)は、これら文献に記載の技術をHIV-2 ウ
イルス又は等価ウイルスの単離に同様の条件下で使用で
き、且つ、これらウイルスから種々の成分(特にタンパ
ク質、糖タンパク質、ポリペプチド及び核酸)を産生す
るために同様の条件下で使用できる限り本明細書に含ま
れるものとする。またこれらの種々の成分の用途、特に
LAS 又はエイズの対応する形態の診断手段としての使用
に関してもこれら技術文献の教示を使用し得る。
たウイルスに関して入手し得る技術文献(特に本文中で
参照した文献)は、これら文献に記載の技術をHIV-2 ウ
イルス又は等価ウイルスの単離に同様の条件下で使用で
き、且つ、これらウイルスから種々の成分(特にタンパ
ク質、糖タンパク質、ポリペプチド及び核酸)を産生す
るために同様の条件下で使用できる限り本明細書に含ま
れるものとする。またこれらの種々の成分の用途、特に
LAS 又はエイズの対応する形態の診断手段としての使用
に関してもこれら技術文献の教示を使用し得る。
【0212】本発明は特に、エイズのin vitro診断方法
に係る。該方法は、診断対象となる被検者の血清又はそ
の他の生物媒体を、HIV-2 のタンパク質もしくは糖タン
パク質の少なくとも1 つ又は該ウイルスの抽出物又は溶
菌液を含む組成物と接触させ免疫反応を検出する。かか
る組成物の例は前記に記載した。
に係る。該方法は、診断対象となる被検者の血清又はそ
の他の生物媒体を、HIV-2 のタンパク質もしくは糖タン
パク質の少なくとも1 つ又は該ウイルスの抽出物又は溶
菌液を含む組成物と接触させ免疫反応を検出する。かか
る組成物の例は前記に記載した。
【0213】好ましい方法は例えば、ELISA 又は免疫蛍
光法タイプの免疫酵素反応を含む。力価は直接もしくは
間接免疫蛍光法又は直接もしくは間接イムノエンザイム
アッセイにより測定することができる。
光法タイプの免疫酵素反応を含む。力価は直接もしくは
間接免疫蛍光法又は直接もしくは間接イムノエンザイム
アッセイにより測定することができる。
【0214】従って本発明はまた、ウイルス抽出物(1種
類以上のHIV-2 ウイルス単独の抽出物又は1 種類以上の
HIV-2 ウイルス抽出物と1 種類以上のHIV-1 ウイルス抽
出物との混合物)に係る。これらの抽出物は標識されて
いる。酵素、蛍光、放射能等の適当なラベルを使用し得
る。
類以上のHIV-2 ウイルス単独の抽出物又は1 種類以上の
HIV-2 ウイルス抽出物と1 種類以上のHIV-1 ウイルス抽
出物との混合物)に係る。これらの抽出物は標識されて
いる。酵素、蛍光、放射能等の適当なラベルを使用し得
る。
【0215】かかる力価測定は例えば以下の処理を含
む。
む。
【0216】−特定量の本発明の抽出物又は前記組成物
をマイクロタイタープレートのウェルに付着させる。
をマイクロタイタープレートのウェルに付着させる。
【0217】−in vitroでその存在を検出すべき抗体を
主として含む血清を漸増希釈度でウェルに導入する。
主として含む血清を漸増希釈度でウェルに導入する。
【0218】−マイクロタイタープレートをインキュベ
ートする。
ートする。
【0219】−マイクロタイタープレートを適当なバッ
ファで慎重に洗浄する。
ファで慎重に洗浄する。
【0220】−マイクロタイタープレートのウェルにヒ
ト免疫グロブリンに特異的な標識抗体を導入する。少な
くとも特定波長バンドで基質の放射線吸収が変化するよ
うに、基質を水解し得る選択酵素で標識する。
ト免疫グロブリンに特異的な標識抗体を導入する。少な
くとも特定波長バンドで基質の放射線吸収が変化するよ
うに、基質を水解し得る選択酵素で標識する。
【0221】−好ましくはコントロールとの比較によっ
て基質の加水分解の程度を疾患の潜伏又は発病の測定値
として検出する。
て基質の加水分解の程度を疾患の潜伏又は発病の測定値
として検出する。
【0222】本発明はまた前記診断用のアセンブリ即ち
キットに係る。
キットに係る。
【0223】該キットは、 −例えば放射性標識、酵素標識又は免疫蛍光標識された
前記タイプのウイルスの抽出物又はより高度に精製され
た画分と、 −抗ヒト免疫グロブリン又はプロテイン A(好ましくは
アガロースビーズのごとき水不溶性の担体に結合)と、 −健康状態のよいヒトから得られたリンパ球抽出物と、 −バッファ及び必要に応じて標識物質を可視化する基質
とを含む。
前記タイプのウイルスの抽出物又はより高度に精製され
た画分と、 −抗ヒト免疫グロブリン又はプロテイン A(好ましくは
アガロースビーズのごとき水不溶性の担体に結合)と、 −健康状態のよいヒトから得られたリンパ球抽出物と、 −バッファ及び必要に応じて標識物質を可視化する基質
とを含む。
【0224】前記の記載より、本発明が前記のプローブ
を用いて後述する種々の段階を行なうHIV-2 ウイルス又
はその変異株の診断方法を包含することが理解されよ
う。該段階はHIV-2 ウイルスの特徴的特性が発揮される
ような特定順序で行なわれる。
を用いて後述する種々の段階を行なうHIV-2 ウイルス又
はその変異株の診断方法を包含することが理解されよ
う。該段階はHIV-2 ウイルスの特徴的特性が発揮される
ような特定順序で行なわれる。
【0225】本発明は当然、HIV-2 ウイルスの被疑キャ
リアの血清又は別の生物流体又は組織のサンプル中のHI
V-2 ウイルスの有無を診断するプローブとしてのcDNA又
はそのフラグメント(又はこれらを含む組換体)の使用
に係る。これらのプローブも(放射性、酵素、蛍光ラベ
ル等によって)標識されているのが好ましい。HIV-2ウ
イルス又はHIV-2 の変異株の診断方法を行なうために用
いられる特に有利なプローブの特徴は、HIV-2 ウイルス
のゲノムに相補的なcDNAの全部もしくは一部を含むか、
又は、特に前記で同定された種々のクローン中に存在す
るフラグメントを含むことである。特に、クローンE2中
に存在するHIV-2 のcDNA、より特定的には前記クローン
E2のHIV 配列の 3′末端(LTR) 及び/又は 5′末端の配
列、又はHIV-2 ウイルスのcDNAのenv 領域を含むcDNAが
有利である。
リアの血清又は別の生物流体又は組織のサンプル中のHI
V-2 ウイルスの有無を診断するプローブとしてのcDNA又
はそのフラグメント(又はこれらを含む組換体)の使用
に係る。これらのプローブも(放射性、酵素、蛍光ラベ
ル等によって)標識されているのが好ましい。HIV-2ウ
イルス又はHIV-2 の変異株の診断方法を行なうために用
いられる特に有利なプローブの特徴は、HIV-2 ウイルス
のゲノムに相補的なcDNAの全部もしくは一部を含むか、
又は、特に前記で同定された種々のクローン中に存在す
るフラグメントを含むことである。特に、クローンE2中
に存在するHIV-2 のcDNA、より特定的には前記クローン
E2のHIV 配列の 3′末端(LTR) 及び/又は 5′末端の配
列、又はHIV-2 ウイルスのcDNAのenv 領域を含むcDNAが
有利である。
【0226】本発明のHIV-2 ウイルスの診断方法及び診
断用キットに於いて使用されるプローブは前記プローブ
に限定されない。逆に、HIV-2 ウイルス又はHIV-2 の変
異株又は構造的に近縁のウイルスのゲノムから得られた
ヌクレオチド配列であってエイズの形態の1つを発生さ
せ得るヒトの生物流体中のHIV-2 抗体を検出せしめるよ
うなヌクレオチド配列全部を包含する。しかしながら、
最初からヒト感染性のHIV-2 から得られたヌクレオチド
配列の使用が勿論好ましい。
断用キットに於いて使用されるプローブは前記プローブ
に限定されない。逆に、HIV-2 ウイルス又はHIV-2 の変
異株又は構造的に近縁のウイルスのゲノムから得られた
ヌクレオチド配列であってエイズの形態の1つを発生さ
せ得るヒトの生物流体中のHIV-2 抗体を検出せしめるよ
うなヌクレオチド配列全部を包含する。しかしながら、
最初からヒト感染性のHIV-2 から得られたヌクレオチド
配列の使用が勿論好ましい。
【0227】検出は公知のいかなる方法で行なってもよ
い。特に、血清又はその他の生物媒体例えば脳脊髄液、
唾液等に存在する細胞から得られた核酸とプローブとを
接触させるか、又はプローブとハイブリダイゼーション
可能な状態の核酸を含むこれら媒体自体とプローブとを
接触させる。この接触はこれらのプローブと核酸とのハ
イブリダイゼーションが生じ得る条件下で行なわれる。
次に生じたハイブリダイゼーションを検出する。HIV ウ
イルスのタイプの識別が不要な場合には、ハイブリダイ
ゼーション反応を含む前記診断が、HIV-1 又はHIV-2 か
ら夫々得られたプローブの混合物を用いて行なわれても
よい。
い。特に、血清又はその他の生物媒体例えば脳脊髄液、
唾液等に存在する細胞から得られた核酸とプローブとを
接触させるか、又はプローブとハイブリダイゼーション
可能な状態の核酸を含むこれら媒体自体とプローブとを
接触させる。この接触はこれらのプローブと核酸とのハ
イブリダイゼーションが生じ得る条件下で行なわれる。
次に生じたハイブリダイゼーションを検出する。HIV ウ
イルスのタイプの識別が不要な場合には、ハイブリダイ
ゼーション反応を含む前記診断が、HIV-1 又はHIV-2 か
ら夫々得られたプローブの混合物を用いて行なわれても
よい。
【0228】一般に、HIV-2 ウイルスの被疑キャリアの
血清又はその他の流体又は組織のサンプル中のHIV-2 ウ
イルス又はその変異株の有無を診断する方法は以下の段
階を含む。
血清又はその他の流体又は組織のサンプル中のHIV-2 ウ
イルス又はその変異株の有無を診断する方法は以下の段
階を含む。
【0229】(1) 標識プローブを調製する。
【0230】(2) 適当な膜上で被疑キャリアのサンプル
中の細胞のDNA と前記標識プローブとを接触させ、スト
リンジェント条件下で少なくとも1 回のハイブリダイゼ
ーションを行なう。
中の細胞のDNA と前記標識プローブとを接触させ、スト
リンジェント条件下で少なくとも1 回のハイブリダイゼ
ーションを行なう。
【0231】(3) ハイブリダイゼーションのストリンジ
ェント条件を維持する溶液で前記膜を洗浄する。
ェント条件を維持する溶液で前記膜を洗浄する。
【0232】(4) 免疫検出法によってHIV-2 ウイルスの
有無を検出する。
有無を検出する。
【0233】本発明方法の別の好ましい具体例によれ
ば、前記ハイブリダイゼーションをノンストリンジェン
ト条件下で行ないハイブリダイゼーション条件に適応し
た条件下で膜の洗浄を行なう。
ば、前記ハイブリダイゼーションをノンストリンジェン
ト条件下で行ないハイブリダイゼーション条件に適応し
た条件下で膜の洗浄を行なう。
【0234】本発明は特に、以下のヌクレオチド配列を
夫々含むGAG 及びENV 遺伝子をもつcDNAに対応するウイ
ルスRNA をもつことを特徴とするHIV-2 ウイルスに係
る。
夫々含むGAG 及びENV 遺伝子をもつcDNAに対応するウイ
ルスRNA をもつことを特徴とするHIV-2 ウイルスに係
る。
【0235】これらの配列はゲノムHIV-2 ROD に対応す
るcDNAの対応領域の配列決定により得られた。これらの
配列はこれらがコードするアミノ酸と一致する。
るcDNAの対応領域の配列決定により得られた。これらの
配列はこれらがコードするアミノ酸と一致する。
【0236】 前記のごとく本発明は、そのRNA が同様の特性をもち、
特にHIV-2 ROD の対応するGAG 及びENV 配列と50%以
上、好ましくは70%、更に好ましくは90%以上のヌクレ
オチド配列ホモロジーをもつ配列を含むGAG 及びENV 領
域をもつすべてのHIV-2 ウイルスに係る。
特にHIV-2 ROD の対応するGAG 及びENV 配列と50%以
上、好ましくは70%、更に好ましくは90%以上のヌクレ
オチド配列ホモロジーをもつ配列を含むGAG 及びENV 領
域をもつすべてのHIV-2 ウイルスに係る。
【0237】より特定的には本発明は、その構造がGAGR
ODN にも含まれているp16 、p26 及びp12 を夫々コード
するcDNAフラグメントに係る。本発明は特に、 −(p16をコードする) ヌクレオチド1 からヌクレオチド
405 の配列 −(p26をコードする) ヌクレオチド406 からヌクレオチ
ド1155の配列 −(p12をコードする) ヌクレオチド1156からヌクレオチ
ド1566の配列に係る。
ODN にも含まれているp16 、p26 及びp12 を夫々コード
するcDNAフラグメントに係る。本発明は特に、 −(p16をコードする) ヌクレオチド1 からヌクレオチド
405 の配列 −(p26をコードする) ヌクレオチド406 からヌクレオチ
ド1155の配列 −(p12をコードする) ヌクレオチド1156からヌクレオチ
ド1566の配列に係る。
【0238】また本発明は特に、ENVRに内包されヌクレ
オチド1 からヌクレオチド2574にわたるgp140 をコード
するcDNAフラグメントに係る。
オチド1 からヌクレオチド2574にわたるgp140 をコード
するcDNAフラグメントに係る。
【0239】本発明は更に、前記ヌクレオチド配列によ
ってコードされるアミノ酸配列の修飾を含まないような
遺伝コード縮退を利用するヌクレオチド置換によって前
記ヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列に係
る。
ってコードされるアミノ酸配列の修飾を含まないような
遺伝コード縮退を利用するヌクレオチド置換によって前
記ヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列に係
る。
【0240】同様に本発明は、前出のアミノ酸配列に対
応するアミノ酸配列をもつタンパク質又は糖タンパク
質、及び等価のペプチド、即ち前記ペプチドの総合的免
疫特性に影響を与えないアミノ酸の付加、置換又は欠失
によって前出のペプチドから得られるペプチドに係る。
応するアミノ酸配列をもつタンパク質又は糖タンパク
質、及び等価のペプチド、即ち前記ペプチドの総合的免
疫特性に影響を与えないアミノ酸の付加、置換又は欠失
によって前出のペプチドから得られるペプチドに係る。
【0241】本発明は特に、ENVRN によってコードされ
るアミノ酸配列を示すエンベロープ糖タンパク質に係
る。
るアミノ酸配列を示すエンベロープ糖タンパク質に係
る。
【0242】本発明はまた、体重1kg 当たり10〜500 、
好ましくは50〜100 mgの投与単位を投与できるように配
合されたHIV-2 ウイルスのエンベロープ抗原、特にHIV-
2 ウイルスのgp140 を含むことを特徴とする免疫原組成
物に係る。
好ましくは50〜100 mgの投与単位を投与できるように配
合されたHIV-2 ウイルスのエンベロープ抗原、特にHIV-
2 ウイルスのgp140 を含むことを特徴とする免疫原組成
物に係る。
【0243】最後に本発明は、前記タンパク質(p12、p1
6 又はp26)のいずれか又はgp140 の構造をもつタンパク
質又は前記タンパク質の所定部分を産生する方法に係
る。該方法では、ベクター内の挿入物を発現せしめる細
胞宿主を適当に選択し、該細胞宿主を形質転換させ得る
該ベクターに対応する核酸配列を挿入し、前記核酸を含
む前記ベクターによって前記選択宿主を形質転換し、前
記修飾ベクターによって形質転換された細胞宿主を培養
し、発現されたタンパク質を回収し精製する。
6 又はp26)のいずれか又はgp140 の構造をもつタンパク
質又は前記タンパク質の所定部分を産生する方法に係
る。該方法では、ベクター内の挿入物を発現せしめる細
胞宿主を適当に選択し、該細胞宿主を形質転換させ得る
該ベクターに対応する核酸配列を挿入し、前記核酸を含
む前記ベクターによって前記選択宿主を形質転換し、前
記修飾ベクターによって形質転換された細胞宿主を培養
し、発現されたタンパク質を回収し精製する。
【0244】HIV-1 のゲノムから誘導された核酸配列の
発現産物から成るペプチド又はタンパク質を産生するた
めの1985年10月18日出願の欧州特許出願第85 905513.9
号に開示された方法を、HIV-2 から誘導される前記ペプ
チド又はタンパク質の産生に応用することも可能であ
る。該欧州特許出願の記載は特に関連技術として本明細
書に含まれるものとする。 HIV-2 タンパク質の分子量
(MP)をHIV-1 の分子量と比較して以下に示す。
発現産物から成るペプチド又はタンパク質を産生するた
めの1985年10月18日出願の欧州特許出願第85 905513.9
号に開示された方法を、HIV-2 から誘導される前記ペプ
チド又はタンパク質の産生に応用することも可能であ
る。該欧州特許出願の記載は特に関連技術として本明細
書に含まれるものとする。 HIV-2 タンパク質の分子量
(MP)をHIV-1 の分子量と比較して以下に示す。
【0245】 HIV-2 のタンパク質のMP(kd) HIV-1 のタンパク質のMP(kd) 完全gag 58.3 完全gag 55.8 p16 15 p16 14.9 p26 27.6 p12 15.8 env 98.6 env 97.4 外部env 57.4 トランスメンブランenv 41.2 HIV-2 Mir 及びHIV-2 ROD は、1987年1 月9 日にSalisb
ury (英国)の「National Collection of Animal Cell
Cultures 」(ECACC) に、夫々受託番号87 011001 及び
87 011002 で寄託された。
ury (英国)の「National Collection of Animal Cell
Cultures 」(ECACC) に、夫々受託番号87 011001 及び
87 011002 で寄託された。
【0246】更に、プラスミドpROD35及びpROD27.5は、
1987年1 月9 日にAberdeen(英国)の「National Colle
ction of Industrial Bacteria」(NCIB)に、夫々受託番
号12398及び12 399で寄託された。
1987年1 月9 日にAberdeen(英国)の「National Colle
ction of Industrial Bacteria」(NCIB)に、夫々受託番
号12398及び12 399で寄託された。
【0247】本明細書で言及したすべての参考文献は本
発明に含まれるものとする。
発明に含まれるものとする。
【0248】1−F. Barre-Sinoussi et al., Science
220, 868(1983). 2−L. Montagnier et al., In : Human Tcell leukemi
a orlymphoma viruses(Gallo, R.C., Essex, M.E., Gro
ss, L., eds.) Cold Spring Harbor Laboratory,New Yo
rk, 363 (1984). 3−M. Popovic, M.G. Sarngadharan, E. Read, R.C. G
allo, Science 224, 497(1984). 4−J. Levy et al., Science 225, 840 (1984). 5−P. Sonigo et al., Cell 42, 369 (1985). 7−J. W. Curran et al., Science 229, 1352 (1985). 8−A. Ellrodt et al., Lancet i, 1383 (1984). 9−P. Piot et al., Lancet ii, 65 (1984). 10−F. Brun-Vezinet et al., Science 226, 453 (198
4). 11−N. Clumeck et al., N. Engl. J. Med. 313, 182
(1985). 12−A. B. Rabson and M. A. Martin, Cell 40, 477 (1
985). 13−S. Benn et al., Science 230, 949 (1985). 14−M. Alizon, Manuscript in preparation. 15−F. Brun-Bezinet, Unpublished data. 16−M. D. Daniel et al., Science 228, 1201 (1985). 17−P. J. Kanki et al., Science 228, 1199 (1985). 18−N. L. Letwin et al., Science 230, 71 (1985). 19−A. Gatzar et al., Blood 55, 409 (1980). 20−D. Klatzmann et al., Science 225, 59 (1984). 21−L. Montagier et al., Virology 144, 283 (1985). 22−J. S. Allan et al., Science 228, 1091 (1985). 23−F. CHIVel, Manuscript in preparation. 24−F. diMarzo Veronese et al., Science 229, 1402
(1985). 25−V. S. Kalyanarman et al., Science 218, 571 (19
82). 26−I. S. Y. Chen, J. McLaughlin, J. C. Gasson, S.
C. Clark and D.W. Golde, Nature 305, 502 (1983). 27−F. Barin et al., Lancet ii, 1387 (1985). 28−P. J. Kanki, J. Alroy, M. Essex, Science 230,
951 (1985). 29−H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
6, 4350 (1979). 30−S. Wain-Hobson, P. Sonigo, O.M Danos, S. Cole
et M. Alizon Cell 40,9 (1985). 31−M. Alizon et al., Nature 312, 757 (1984).
220, 868(1983). 2−L. Montagnier et al., In : Human Tcell leukemi
a orlymphoma viruses(Gallo, R.C., Essex, M.E., Gro
ss, L., eds.) Cold Spring Harbor Laboratory,New Yo
rk, 363 (1984). 3−M. Popovic, M.G. Sarngadharan, E. Read, R.C. G
allo, Science 224, 497(1984). 4−J. Levy et al., Science 225, 840 (1984). 5−P. Sonigo et al., Cell 42, 369 (1985). 7−J. W. Curran et al., Science 229, 1352 (1985). 8−A. Ellrodt et al., Lancet i, 1383 (1984). 9−P. Piot et al., Lancet ii, 65 (1984). 10−F. Brun-Vezinet et al., Science 226, 453 (198
4). 11−N. Clumeck et al., N. Engl. J. Med. 313, 182
(1985). 12−A. B. Rabson and M. A. Martin, Cell 40, 477 (1
985). 13−S. Benn et al., Science 230, 949 (1985). 14−M. Alizon, Manuscript in preparation. 15−F. Brun-Bezinet, Unpublished data. 16−M. D. Daniel et al., Science 228, 1201 (1985). 17−P. J. Kanki et al., Science 228, 1199 (1985). 18−N. L. Letwin et al., Science 230, 71 (1985). 19−A. Gatzar et al., Blood 55, 409 (1980). 20−D. Klatzmann et al., Science 225, 59 (1984). 21−L. Montagier et al., Virology 144, 283 (1985). 22−J. S. Allan et al., Science 228, 1091 (1985). 23−F. CHIVel, Manuscript in preparation. 24−F. diMarzo Veronese et al., Science 229, 1402
(1985). 25−V. S. Kalyanarman et al., Science 218, 571 (19
82). 26−I. S. Y. Chen, J. McLaughlin, J. C. Gasson, S.
C. Clark and D.W. Golde, Nature 305, 502 (1983). 27−F. Barin et al., Lancet ii, 1387 (1985). 28−P. J. Kanki, J. Alroy, M. Essex, Science 230,
951 (1985). 29−H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
6, 4350 (1979). 30−S. Wain-Hobson, P. Sonigo, O.M Danos, S. Cole
et M. Alizon Cell 40,9 (1985). 31−M. Alizon et al., Nature 312, 757 (1984).
【図1】第1図A、B及びCは、HIV-1 及びHIV-2 に夫
々感染した患者の血清及びSTLV-III感染したアカゲザル
の血清とHIV-1 ウイルス抽出物との交差沈降実験に関す
る。
々感染した患者の血清及びSTLV-III感染したアカゲザル
の血清とHIV-1 ウイルス抽出物との交差沈降実験に関す
る。
【図2】第2図A及びBは、SDS ポリアクリルアミドゲ
ル中のHIV-1 、HIV-2 及びSTLV-IIIの夫々のタンパク質
の電気泳動移動度の比較結果を示す。
ル中のHIV-1 、HIV-2 及びSTLV-IIIの夫々のタンパク質
の電気泳動移動度の比較結果を示す。
【図3】第3図はHIV-1 、HIV-2 及びSTLV-IIIのゲノム
配列とHIV-1 ウイルスの種々のサブゲノム配列とを含む
プローブとの間の交差ハイブリダイゼーションの結果を
示す。
配列とHIV-1 ウイルスの種々のサブゲノム配列とを含む
プローブとの間の交差ハイブリダイゼーションの結果を
示す。
【図4】第4図はHIV-2 ROD のRNA から誘導されたcDNA
の制限マップを示す。
の制限マップを示す。
【図5】第5図はHIV-2 から誘導されたcDNAのE2フラグ
メントの制限マップを示す。このフラグメントはHIV-2
の 3′LTR 領域に対応する領域を含む。
メントの制限マップを示す。このフラグメントはHIV-2
の 3′LTR 領域に対応する領域を含む。
【図6】第6図はE2の一部分のヌクレオチド配列を示
す。この配列はHIV-2 のU3/R領域に対応する。
す。この配列はHIV-2 のU3/R領域に対応する。
【図7】第7図は、 −一方ではHIV-1 の構造要素(第7A図)と HIV-1 3′ L
TRを含む領域に位置合わせされHIV-2 cDNAのE2領域から
誘導された配列を示し、 −他方ではHIV-2 のE2領域から誘導された配列と多数の
欠失及び挿入とを考慮して該配列に位置合わせされたHI
V-1 の対応配列とに存在する共通ヌクレオチドを示す
(第7B図)。
TRを含む領域に位置合わせされHIV-2 cDNAのE2領域から
誘導された配列を示し、 −他方ではHIV-2 のE2領域から誘導された配列と多数の
欠失及び挿入とを考慮して該配列に位置合わせされたHI
V-1 の対応配列とに存在する共通ヌクレオチドを示す
(第7B図)。
【図8】第8図はHIV-2 に由来のcDNAから得られた幾つ
かの挿入によって修飾されたファージのいくつかのクロ
ーン(クローンROD4、ROD27 及び ROD35)の構造を概略
的に示す。プラスミドpUC18 中でサブクローニングされ
たROD4、ROD27 及びROD35 に由来の配列も図中に概略的
に示されている。サブクローニング配列は元のROD4、RO
D27 及びROD35 の領域と対応するように配置されてい
る。
かの挿入によって修飾されたファージのいくつかのクロ
ーン(クローンROD4、ROD27 及び ROD35)の構造を概略
的に示す。プラスミドpUC18 中でサブクローニングされ
たROD4、ROD27 及びROD35 に由来の配列も図中に概略的
に示されている。サブクローニング配列は元のROD4、RO
D27 及びROD35 の領域と対応するように配置されてい
る。
【図9】第9図は、(a) 完全HIV-1 ゲノムの種々の領域
から取出された11個のフラグメント(このフラグメント
は図の下部に概略的に示されている)及びROD4に存在す
るHIV-2 cDNAと(b) 同じcDNAをもつHIV-2 から得られた
フラグメントとの間のハイブリダイゼーションの相対強
度を示す。
から取出された11個のフラグメント(このフラグメント
は図の下部に概略的に示されている)及びROD4に存在す
るHIV-2 cDNAと(b) 同じcDNAをもつHIV-2 から得られた
フラグメントとの間のハイブリダイゼーションの相対強
度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C12N 5/10 9281−4B C12N 5/00 B (C12P 21/02 C12R 1:91) (31)優先権主張番号 86 01985 (32)優先日 1986年2月13日 (33)優先権主張国 フランス(FR) (31)優先権主張番号 86 03881 (32)優先日 1986年3月18日 (33)優先権主張国 フランス(FR) (31)優先権主張番号 86 04215 (32)優先日 1986年3月24日 (33)優先権主張国 フランス(FR) (31)優先権主張番号 835228 (32)優先日 1986年3月3日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 916080 (32)優先日 1986年10月6日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 933184 (32)優先日 1986年11月21日 (33)優先権主張国 米国(US) (72)発明者 ドニーズ・ゲタール フランス国、75015・パリ、リユ・アンセ ルム・ペイヤン、4・ベ (72)発明者 マルク・アリゾン フランス国、75005・パリ、リユ・ドユ・ カルデイナル・ルモワンヌ、71 (72)発明者 フランソワ・クラベル フランス国、75016・パリ、リユ・ドウ・ ラソンプシオン、83 (72)発明者 ミレイユ・ギユイヤデール フランス国、75016・パリ、スクワール・ ロカマドウール、2 (72)発明者 ピエール・ソニゴ フランス国、75015・パリ、リユ・ギユタ ンベール、23 (72)発明者 フランソワーズ・ブラン−ベジネ フランス国、75005・パリ、ブルバール・ サン−ジエルマン、24 (72)発明者 マレアンヌ・レイ フランス国、75004・パリ、リユ・ドユ・ タンプル、10 (72)発明者 クリスチーヌ・リジウ フランス国、75015・パリ、リユ・ドウ・ ダンシグ、21 (72)発明者 クリスチーヌ・カトラマ フランス国、75004・パリ、リユ・ドウ・ ジヤラント、8
Claims (1)
- 【請求項1】 HIV-2 レトロウイルスを産生するため
に、ヒトT4リンパ球又は前記T4リンパ球から誘導されT4
表現型を含む永久細胞株を、HIV-2 ウイルスの単離物に
予め感染させた後に培養し、特に逆転写酵素活性レベル
が所定閾値に到達したときに前記リンパ球又は細胞株の
培地中に遊離された量のウイルスを特にショ糖又はmetr
izamide の勾配中で分画遠心によって回収し精製するこ
とを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (24)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8600910A FR2593189B1 (fr) | 1986-01-22 | 1986-01-22 | Nouveau retrovirus susceptible de provoquer le sida, antigenes obtenus a partir de ce retrovirus et anticorps correspondants et leurs applications au diagnostic du sida |
FR8600911A FR2593190B1 (fr) | 1986-01-22 | 1986-01-22 | Nouveau retrovirus susceptible de provoquer le sida, antigenes obtenus a partir de ce retrovirus et anticorps correspondants et leurs applications au diagnostic du sida |
FR8601635A FR2593922B1 (fr) | 1986-02-06 | 1986-02-06 | Nouveau retrovirus susceptible de provoquer le sida, antigenes obtenus a partir de ce retrovirus et anticorps correspondants et leurs applications au diagnostic du sida |
FR8601985A FR2594229B1 (fr) | 1986-02-13 | 1986-02-13 | Nouveau retrovirus du type lav-ii susceptible de provoquer le sida, antigenes obtenus a partir de ce retrovirus et anticorps correspondants et leurs applications au diagnostic du sida |
US06/835,228 US4839288A (en) | 1986-01-22 | 1986-03-03 | Retrovirus capable of causing AIDS, antigens obtained from this retrovirus and corresponding antibodies and their application for diagnostic purposes |
FR8603881A FR2596063B1 (fr) | 1986-03-18 | 1986-03-18 | Nouveau retrovirus susceptible de provoquer le sida, antigenes obtenus a partir de ce retrovirus et anticorps correspondants et leurs applications au diagnostic du sida |
FR8604215A FR2597500B1 (fr) | 1986-03-24 | 1986-03-24 | Nouveau retrovirus susceptible de provoquer le sida, antigenes obtenus a partir de ce retrovirus et anticorps correspondants et leurs applications au diagnostic du sida |
US91608086A | 1986-10-06 | 1986-10-06 | |
US93318486A | 1986-11-21 | 1986-11-21 | |
US86911 | 1986-11-21 | ||
US8604215 | 1986-11-21 | ||
US864215 | 1986-11-21 | ||
US835228 | 1986-11-21 | ||
US8603881 | 1986-11-21 | ||
US933184 | 1986-11-21 | ||
US861985 | 1986-11-21 | ||
US8601985 | 1986-11-21 | ||
US916080 | 1986-11-21 | ||
US86910 | 1986-11-21 | ||
US861635 | 1986-11-21 | ||
US8601635 | 1986-11-21 | ||
US8600911 | 1986-11-21 | ||
US8600910 | 1986-11-21 | ||
US863881 | 2004-06-08 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6329070A Division JPH07233196A (ja) | 1986-01-22 | 1994-12-28 | エイズに対するワクチンの有効成分 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0937778A true JPH0937778A (ja) | 1997-02-10 |
JP2771519B2 JP2771519B2 (ja) | 1998-07-02 |
Family
ID=27576220
Family Applications (7)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5012972A Expired - Lifetime JP2611106B2 (ja) | 1986-01-22 | 1993-01-28 | エイズの原因となる新規なレトロウイルス |
JP6329070A Pending JPH07233196A (ja) | 1986-01-22 | 1994-12-28 | エイズに対するワクチンの有効成分 |
JP7257991A Expired - Lifetime JP2801162B2 (ja) | 1986-01-22 | 1995-10-04 | エイズの原因となるレトロウイルスに対する抗体 |
JP7278085A Expired - Lifetime JP2735521B2 (ja) | 1986-01-22 | 1995-10-25 | エイズの原因となる新規なレトロウイルスの抗原 |
JP8033969A Expired - Lifetime JP2874846B2 (ja) | 1986-01-22 | 1996-02-21 | エイズの原因となる新規なレトロウイルスに由来する核酸 |
JP8193779A Expired - Lifetime JP2771519B2 (ja) | 1986-01-22 | 1996-07-23 | Hiv−2レトロウイルスの回収及び精製方法 |
JP10119235A Expired - Lifetime JP2931294B2 (ja) | 1986-01-22 | 1998-04-28 | エイズの原因となるレトロウイルスに対する抗体を分泌するハイブリドーマ |
Family Applications Before (5)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5012972A Expired - Lifetime JP2611106B2 (ja) | 1986-01-22 | 1993-01-28 | エイズの原因となる新規なレトロウイルス |
JP6329070A Pending JPH07233196A (ja) | 1986-01-22 | 1994-12-28 | エイズに対するワクチンの有効成分 |
JP7257991A Expired - Lifetime JP2801162B2 (ja) | 1986-01-22 | 1995-10-04 | エイズの原因となるレトロウイルスに対する抗体 |
JP7278085A Expired - Lifetime JP2735521B2 (ja) | 1986-01-22 | 1995-10-25 | エイズの原因となる新規なレトロウイルスの抗原 |
JP8033969A Expired - Lifetime JP2874846B2 (ja) | 1986-01-22 | 1996-02-21 | エイズの原因となる新規なレトロウイルスに由来する核酸 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10119235A Expired - Lifetime JP2931294B2 (ja) | 1986-01-22 | 1998-04-28 | エイズの原因となるレトロウイルスに対する抗体を分泌するハイブリドーマ |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0239425B1 (ja) |
JP (7) | JP2611106B2 (ja) |
AR (1) | AR243931A1 (ja) |
AT (2) | ATE47725T1 (ja) |
AU (1) | AU601397B2 (ja) |
DE (3) | DE3752319T2 (ja) |
DK (2) | DK175959B1 (ja) |
ES (1) | ES2150897T3 (ja) |
GR (3) | GR880300056T1 (ja) |
HK (1) | HK62091A (ja) |
NZ (1) | NZ219024A (ja) |
OA (1) | OA08468A (ja) |
PT (1) | PT84182B (ja) |
SG (1) | SG28591G (ja) |
WO (1) | WO1987004459A1 (ja) |
Families Citing this family (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0249611A4 (en) * | 1985-11-14 | 1988-04-26 | Harvard College | T-LYMPHOTROPHIC VIRUS. |
ATE417108T1 (de) * | 1987-01-16 | 2008-12-15 | Pasteur Institut | Hiv-2 und siv-1 nukleotidsequenzen |
JP2948823B2 (ja) * | 1987-01-16 | 1999-09-13 | アンステイテユ・パストウール | ヒト免疫不全レトロウィルス(hiv)関連抗原性ペプチド、そのウィルス感染の検出及びワクチンへの使用 |
NZ223980A (en) * | 1987-03-23 | 1991-02-26 | Hiver Ltd | An aids-type virus vaccine comprising an antibody equivalent which recognises an epitope on a cd4 cell-marker |
SE8701765L (sv) * | 1987-04-28 | 1988-10-29 | Statens Bakteriologiska Lab | Analysmetod och medel foer denna |
US4812556A (en) * | 1987-05-18 | 1989-03-14 | Virovahl | Synthetic peptide antigen for the detection of HIV-2 infection |
FR2620030B1 (fr) * | 1987-09-07 | 1990-03-23 | Transgene Sa | Vecteur d'expression des proteines du virus hiv-2, un agent causal du sida, culture cellulaire infectee ou transformee par ce vecteur, proteines obtenues, vaccin et anticorps obtenus |
US5780038A (en) * | 1987-11-16 | 1998-07-14 | Roche Diagnostic Systems, Inc. | HIV-2 envelope polypeptides |
ES2054769T3 (es) * | 1987-11-16 | 1994-08-16 | Hoffmann La Roche | Polipeptidos hiv-2 recombinantes. |
EP0327801A1 (en) * | 1988-01-08 | 1989-08-16 | Deutsches Primatenzentrum Gesellschaft Mbh | HIV-2-type retroviruses of primates, vaccines, diagnostic and pharmaceutical compositions |
US6210874B1 (en) | 1988-01-27 | 2001-04-03 | Biochem Immunosystems, Inc. | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies |
WO1989009815A1 (en) * | 1988-04-04 | 1989-10-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Novel virus of the hiv-2 family and methods of detection therefor |
US5208321A (en) | 1988-06-09 | 1993-05-04 | Institut Pasteur | HIV-2 transmembrane glycoprotein homodimer (GP 80) |
US6197496B1 (en) | 1988-06-09 | 2001-03-06 | Institut Pasteur | Immunological reagents and diagnostic methods for the detection of human immunodeficiency virus type 2 utilizing multimeric forms of the envelope proteins gp300, p200, and p90/80 |
ES2072853T3 (es) | 1988-06-09 | 1995-08-01 | Innogenetics Nv | Retrovirus hiv-3 y su utilizacion. |
EP0345559A3 (en) * | 1988-06-10 | 1990-07-11 | Abbott Laboratories | Hiv-2 variants |
EP0347365B1 (en) † | 1988-06-14 | 1996-08-28 | QIAGEN GmbH | HIV-2 virus variants |
DK0424519T3 (da) * | 1989-05-12 | 1996-05-13 | Pasteur Institut | Antigeneer fra det transmembranale kappeglycoprotein fra et humant retrovirus af HIV-2-typen samt an tigener, der har et immunologisk slægtskab dermed |
FR2646854A1 (fr) * | 1989-05-12 | 1990-11-16 | Pasteur Institut | Antigenes de la glycoproteine transmembranaire d'enveloppe d'un retrovirus humain du type hiv-2 antigenes presentant avec eux une parente immunologique |
ES2083388T3 (es) * | 1989-05-31 | 1996-04-16 | Pasteur Institut | Anticuerpos dirigidos contra proteinas y glucoproteinas del retrovirus vih-2 eho - aplicaciones para el diagnostico. |
FR2647809B1 (fr) * | 1989-06-02 | 1991-09-20 | Pasteur Institut | Amorces oligonucleotidiques pour l'amplification du genome des retrovirus du type hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications au diagnostic in vitro des infections dues a ces virus |
EP2011888B1 (fr) | 1989-06-02 | 2010-04-28 | Institut Pasteur | Séquences nucléotidiques issues du genome des rétrovirus du type HIV-1, HIV-2 et SIV, et leurs applications notamment pour l'amplification des genomes de ces rétrovirus et pour le diagnostic in vitro des infections dues à ces virus |
FR2647810B1 (fr) * | 1989-06-02 | 1994-07-22 | Pasteur Institut | Amorces oligonucleotidiques pour l'amplification du genome des retrovirus du type hiv-2 et siv, et leurs applications au diagnostic in vitro des infections dues a ces virus |
US7022814B1 (en) | 1992-01-21 | 2006-04-04 | Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Nucleotide sequences derived from the genome of retroviruses of the HIV-1, HIV-2 and SIV type, and their uses in particular for the amplification of the genomes of these retroviruses and for the in vitro diagnosis of the diseases due to these viruses |
DE69129207T2 (de) * | 1990-01-16 | 1998-10-08 | Orgenics Ltd | Peptide, von Virus-HIV-Hüllen-Glycoproteinen abstammend, deren Verwendung zum Nachweis einer Infektion dieser Viren und für die Impfung gegen AIDS |
FR2657016B1 (fr) * | 1990-01-16 | 1995-08-25 | Clonatec Sa | Peptides derivant de la glycoproteine d'enveloppe du virus-hiv-2, leurs applications a la detection d'une infection due a ce virus et a la vaccination contre le sida. |
DE69009066T3 (de) * | 1990-06-15 | 2001-07-19 | Innogenetics N.V., Gent | SIV cpz-ant Retrovirus und seine Anwendungen. |
GB9108652D0 (en) * | 1991-04-23 | 1991-06-12 | Antisoma Ltd | Immunoreactive compounds |
ATE174382T1 (de) * | 1992-10-06 | 1998-12-15 | Dade Behring Marburg Gmbh | Retrovirus aus der hiv-gruppe und dessen verwendung |
DE4233646C2 (de) * | 1992-10-06 | 2003-10-23 | Dade Behring Marburg Gmbh | Retrovirus aus der HIV-Gruppe und dessen Verwendung |
DE4405810A1 (de) | 1994-02-23 | 1995-08-24 | Behringwerke Ag | Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung |
US5962665A (en) | 1997-06-16 | 1999-10-05 | Abbott Laboratories | Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2 |
FR2767337B1 (fr) | 1997-08-14 | 2002-07-05 | Pasteur Institut | Sequences nucleiques de polypeptides exportes de mycobacteri es, vecteurs les comprenant et applications au diagnostic et a la prevention de la tuberculose |
AU2002230545B2 (en) | 2000-10-23 | 2006-09-21 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting human immunodeficiency virus 2 (HIV-2) |
ATE549421T1 (de) | 2003-12-19 | 2012-03-15 | Gen Probe Inc | Zusammensetzungen, verfahren und kits zum nachweis der nukleinsäuren von hiv-1 und hiv-2 |
JP6721772B1 (ja) | 2019-03-26 | 2020-07-15 | 斉藤 幹雄 | 清掃装置 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4652599A (en) * | 1984-04-23 | 1987-03-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of continuous production of retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS using permissive cells |
ATE92502T1 (de) * | 1984-10-18 | 1993-08-15 | Pasteur Institut | Huellenantigene vom menschlichen immunodefizienz- virus und deren verwendungen. |
US4600413A (en) * | 1984-12-10 | 1986-07-15 | Sundstrand Corporation | Centrifugal deaerator and pump |
JP3105581B2 (ja) * | 1991-07-03 | 2000-11-06 | 内橋エステック株式会社 | 面状温度ヒュ−ズ |
-
1987
- 1987-01-22 PT PT84182A patent/PT84182B/pt unknown
- 1987-01-22 EP EP87400151A patent/EP0239425B1/fr not_active Expired
- 1987-01-22 WO PCT/FR1987/000025 patent/WO1987004459A1/fr unknown
- 1987-01-22 OA OA59050A patent/OA08468A/xx unknown
- 1987-01-22 AT AT87400151T patent/ATE47725T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-01-22 ES ES89101328T patent/ES2150897T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-22 AU AU68911/87A patent/AU601397B2/en not_active Expired
- 1987-01-22 DE DE3752319T patent/DE3752319T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-22 DE DE198787400151T patent/DE239425T1/de active Pending
- 1987-01-22 AT AT89101328T patent/ATE195148T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-01-22 EP EP89101328A patent/EP0320495B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-22 NZ NZ219024A patent/NZ219024A/en unknown
- 1987-01-22 DE DE8787400151T patent/DE3760912D1/de not_active Expired
- 1987-01-22 AR AR87306572A patent/AR243931A1/es active
- 1987-09-21 DK DK198704934A patent/DK175959B1/da not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-05-20 GR GR88300056T patent/GR880300056T1/el unknown
-
1989
- 1989-12-08 GR GR89400288T patent/GR3001096T3/el unknown
-
1991
- 1991-04-22 SG SG285/91A patent/SG28591G/en unknown
- 1991-08-08 HK HK620/91A patent/HK62091A/xx not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-01-28 JP JP5012972A patent/JP2611106B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-12-28 JP JP6329070A patent/JPH07233196A/ja active Pending
-
1995
- 1995-10-04 JP JP7257991A patent/JP2801162B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-25 JP JP7278085A patent/JP2735521B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-02-21 JP JP8033969A patent/JP2874846B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-23 JP JP8193779A patent/JP2771519B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-04-28 JP JP10119235A patent/JP2931294B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-10-30 GR GR20000402397T patent/GR3034708T3/el not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-02-04 DK DK200500170A patent/DK176253B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2611106B2 (ja) | エイズの原因となる新規なレトロウイルス | |
US5030718A (en) | Retrovirus capable of causing AIDS, antigens obtained from this retrovirus and corresponding antibodies and their application for diagnostic purposes | |
JP4113318B2 (ja) | HIV−グループの免疫不全ウイルスのRNAに対して相補的なcDNA | |
Clavel et al. | Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS | |
US5066782A (en) | Retrovirus capable of causing AIDS, means and method for detecting it in vitro | |
US5597896A (en) | Retrovirus human immunodeficiency virus type 2(HIV2), capable of causing AIDS, antigens obtained from this retrovirus and corresponding antibodies and their application for diagnostic purposes | |
US5580739A (en) | Peptides of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) and in vitro diagnostic methods and kits employing the peptides for the detection of HIV-2 | |
US6265149B1 (en) | In vitro diagnostic methods and kits for the detection of HIV-2-specific antibodies | |
JP2009240315A (ja) | Hiv−1のoグループ(またはサブグループ)レトロウイルス性抗原のヌクレオチド配列 | |
US5830641A (en) | In vitro diagnostic assays for the detection of HIV-1 or HIV-2 employing viral-specific antigens and antibodies | |
US20030082523A1 (en) | Human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) env polypeptide and diagnostic assays | |
US5268265A (en) | Immunological complex comprising an antigen of Simian Immunodeficiency Virus (SIV) and an antibody against human immunodeficiency virus type 2 (HIV 2), and method and kit for detecting antibodies to HIV-2 reactive with antigens of SIV | |
KR910002428B1 (ko) | Aids를 유발시킬수 있는 신규 레트로비루스의 제조방법 | |
JP2865203B2 (ja) | エイズの原因となる新規なレトロウィルスの抗原の混合物 | |
CA1338323C (en) | Retrovirus capable of causing aids, means and methods for detecting it in vitro |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |