JPH09327292A - プロテインキナーゼｎの改変タンパク質 - Google Patents

プロテインキナーゼｎの改変タンパク質

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JPH09327292A
JPH09327292A JP8213245A JP21324596A JPH09327292A JP H09327292 A JPH09327292 A JP H09327292A JP 8213245 A JP8213245 A JP 8213245A JP 21324596 A JP21324596 A JP 21324596A JP H09327292 A JPH09327292 A JP H09327292A
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protein
protein kinase
amino acid
peptide
pkn
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JP8213245A
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Kozo Kaibuchi
淵 弘 三 貝
Isataka Ono
野 功 貴 小
Akihiko Iwamatsu
松 明 彦 岩
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Kirin Brewery Co Ltd
Original Assignee
Kirin Brewery Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 腫瘍形成または転移を抑制するペプチド等の
提供。 【解決手段】 活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、
かつプロテインキナーゼ活性を有さないプロテインキナ
ーゼＮの改変アミノ酸配列を有するペプチドまたはその
誘導体、およびプロテインキナーゼＮのプロテインキナ
ーゼの活性または活性の亢進を阻害し、かつプロテイン
キナーゼ活性を有さないプロテインキナーゼＮの改変ア
ミノ酸配列を有するペプチドまたはその誘導体であるこ
とを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、プロテインキナーゼＮの改変アミノ酸配列に
関し、更に詳細には、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を
有するＰＫＮの改変アミノ酸配列に関する。
【０００２】背景技術 生体内には、サブユニット構造を有さない分子量２〜３
万の一群の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク
質）が存在している。現在、低分子量Ｇタンパク質のス
ーパーファミリーには酵母から哺乳動物に至るまですで
に５０種類以上のメンバーが見出されている。低分子量
Ｇタンパク質は、アミノ酸配列の類似性からＲａｓ、Ｒ
ｈｏ、Ｒａｂ、その他の４つのファミリーに大別するこ
とができる。この低分子量Ｇタンパク質は種々の細胞機
能を制御していることが明らかになってきており、例え
ば、Ｒａｓタンパク質は細胞の増殖や分化等を、Ｒｈｏ
タンパク質は細胞の形態変化や細胞接着、細胞運動等を
それぞれ制御していると考えられている。
【０００３】このうちＲｈｏタンパク質は、ＧＤＰ／Ｇ
ＴＰ結合能および内在性ＧＴＰａｓｅ活性を示し、リゾ
ホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびある種の成長因子等
のような細胞外シグナルに対する細胞骨格応答に関係し
ているとされている。不活性型であるＧＤＰ結合Ｒｈｏ
タンパク質にある刺激が与えられると、Ｓｍｇ ＧＤ
Ｓ、ＤｂｌやＯｓｔのようなＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパ
ク質の働きによって活性型であるＧＴＰ結合Ｒｈｏタン
パク質（以下、「活性型Ｒｈｏタンパク質」という）に
変換される。そして、この活性型Ｒｈｏタンパク質が標
的タンパク質に作用することによってストレス繊維およ
び接着斑が形成され、細胞接着および細胞運動等が誘導
されると考えられている（実験医学 vol.12,No.8,97-10
2(1994) 、Takai, Y. et al. Trends Biochem. Sci., 2
0, 227-231 (1995) ）。一方、Ｒｈｏタンパク質内在性
ＧＴＰａｓｅにより活性型Ｒｈｏタンパク質はＧＤＰ結
合Ｒｈｏタンパク質に変換される。この内在性ＧＴＰａ
ｓｅの活性を亢進するタンパク質はＧＴＰａｓｅ活性化
タンパク質（ＧＡＰ）（Lamarche, N. & Hall,A. eta
l.,TIG, 10, 436-440 (1994) ）と呼ばれている。
【０００４】ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク
質、ＲｈｏＣタンパク質、Ｒａｃ１タンパク質、Ｒａｃ
２タンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク質のようなＲｈｏフ
ァミリーのタンパク質のアミノ酸配列は、お互いに５０
％以上の類似性がある。このＲｈｏファミリーのタンパ
ク質は、リゾフォスファチジル酸（ＬＰＡ）や増殖因子
のような細胞外シグナルに応答して、ストレス繊維（st
ress fiber）やフォーカルコンタクト（focal contact)
の形成を引き起こす反応に関与していると考えられてい
る（A. J. Ridley & A. Hall、Cell,70,389-399 (1992)
,A. J. Ridley &A. Hall, EMBO J.,1353,2600-2610(19
94)）。また、サブファミリーであるＲｈｏタンパク質
は、細胞の形態変化（H.F.Parterson et al., J.Cell B
iol.,111,1001-1007 (1990) ）、細胞接着（Morii,N. e
t al.,J. Biol.Chem. 267, 20921-20926 (1992) 、T. T
ominaga et al.,J.Cell Biol., 120, 1529-1537(1993)
、Nusrat, A. et al.,Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 9
2, 10629-10633 (1995)＊、Landanna, C. et al., Scie
nce 271, 981-983 (1996)＊）、細胞運動（K. Takaishi
et al.,Oncogene,9,273-279 (1994)）、細胞質***（c
ytokinesis ）（K. Kishi et al.,J. Cell Biol.,120,1
187-1195(1993) 、I. Mabuchi et al.,Zygote,1,325-33
1(1993)）のような細胞骨格の再編成をともなった生理
機能にも関連があると考えられている（本願の優先権主
張の基礎となる最初の出願の後に発行された刊行物に＊
印を付した。以下同じ。）。更に、Ｒｈｏタンパク質
は、平滑筋収縮（K. Hirata et al.,J. Biol. Chem.,26
7,8719-8722(1992) 、M. Noda et al., FEBS Lett., 36
7, 246-250(1995)、M. Gong et al.,Proc. Natl. Acad.
Sci.USA, 93,1340〜1345 (1996) ＊．K. Kimura et a
l., Science 273, 245-248(1996)＊）フォスファチジル
イノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）（J.
Zhang et al.,J. Biol. Chem.,268,22251-22254 (1993)
）、フォスファチジルイノシトール ４−リン酸 ５
−キナーゼ（ＰＩ ４，５−キナーゼ）(L.D. Chong et
al.,Cell,79,507-513(1994)）やｃ−ｆｏｓの発現（C.
S. Hill et al.,Cell,81,1159-1170(1995) ）の制御に
も関与していることが示唆されている。
【０００５】また、最近では、アミノ酸配列を一部置換
したＲｈｏタンパク質が細胞内に導入されるとＲａｓ依
存的な腫瘍形成が抑制されること等が見出され、Ｒｈｏ
タンパク質がＲａｓによる細胞の形質転換、すなわち腫
瘍形成、において重要な役割を果たしていることが明ら
かにされている（G.C.Prendergast et al.,Oncogene,1
0,2289-2296(1995)、Khosravi-Far,R.,et al.,Mol.Cel
l.Biol.,15,6443-6453(1995)＊およびR.Qiu et al.、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,92,11781-11785(1995) ＊、Lebo
witz,P.et al.,Mol.Cell.Biol.,15,6613-6622(1995)
＊）。
【０００６】また、Ｒｈｏタンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰ
変換タンパク質が変異すると、細胞が形質転換すること
が明らかにされている（Collard,J.,Int.J.Oncol.,8,13
1 〜138(1996）＊、Hart,M. et al.,J.Biol Chem.,269,
62-65 (1994)、Horii,Y. etal., EMBO J., 13,4776-478
6 (1994) ）。
【０００７】さらに、Ｒｈｏタンパク質はガン細胞の浸
潤、すなわちガン転移に関与していることが明らかにさ
れている（Yoshioka,K.et al.,FEBS Lett.,372,25 〜28
(1995) ）。ガン細胞の浸潤には、ガン細胞の細胞接着
能の変化が密接に関連しているが、Ｒｈｏタンパク質は
細胞接着に関与することが明らかにされている（前掲Mo
rii,N.et al.(1992)、Tominaga,T. et al.(1993)、Nusr
at,A.et al.(1995) 、Landanna,C.et al.(1996) ＊）。
【０００８】一方、最近、分子量約１２０ｋＤａの新し
いプロテインキナーゼ（以下、「ＰＫＮ」または「プロ
テインキナーゼＮ」という）が単離され、その全アミノ
酸配列が決定された。また、ＰＫＮは、プロテインキナ
ーゼＣのプロテインキナーゼ触媒領域と高い相同性を有
する触媒領域を有していることが明らかとなり、実際に
セリン／スレオニン・キナーゼ活性を有する（Mukai,H.
& Ono,Y,Biochem.Biophys.Res.Commun.199,897-904(19
94) 、Mukai,H.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.20
4,348-356(1994) およびMukai,H.et al.,Biochem.Bioph
ys.Acta 1261,296-300(1995)）。また、ＰＫＮの６４４
番目のＬｙｓをＡｒｇで置換するとプロテインキナーゼ
活性が失われる（前掲 Mukai, H. et al. ）。
【０００９】このプロテインキナーゼ活性はアラキドン
酸等の不飽和脂肪酸によって亢進する（Mukai, H. et a
l., Biochem. Biophys. Res. Commun., 204, 348-356
(1994); Kitagawa, M. et al., Biochem. J., 310, 65
7-664 (1994) ）。ヒト、ラットおよびアフリカツメガ
エルのＰＫＮのｃＤＮＡがクローニングされ、これらの
アミノ酸配列が決定されている（Mukai, H. & Ono, Y.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 199, 897-904 (199
4); Mukai, H. et al., Biochim. Biophys. Acta., 12
61, 296-300 (1995) ）。ヒトＰＫＮは９４２アミノ酸
残基からなるタンパク質で、そのカルボキシル末端の触
媒領域のアミノ酸配列はプロテインキナーゼＣの触媒領
域のアミノ酸配列と高いホモロジーを示す。このことか
らＰＫＮはプロテインキナーゼＣ関連キナーゼ１と呼ば
れることがある（Palmer, R. H. &Parker,P.J.,FEBS Le
tt.,356,5-8(1994)) 。
【００１０】ＰＫＮのアミノ末端の調節領域には、複数
のロイシン・ジッパー配列が存在し、最もアミノ末端側
に存在するロイシン・ジッパー配列のアミノ末端側には
ポリベーシック領域が存在する。また、ＰＫＮには少な
くとも２種類のアイソザイム（プロテインキナーゼＣ関
連キナーゼ２および３）が存在することが報告されてい
る（Palmer, R. H. & Parker, P. J., FEBS Lett. 356,
5-8 (1994) ）。
【００１１】ごく最近（本願の優先権主張の基礎となる
最初の出願の後において）、ＰＫＮとは異なる哺乳類の
Ｒｈｏ標的タンパク質として、シトロン（Madaule, P.
et al., FEBS Lett. 377, 243-248 (1995)＊）、ローフ
ィリン（Watanabe, G. et al., Nature 271, 645-648
(1996) ＊）、ｐ１６０ＲＯＣＫ（Ishizaki, T. et a
l., EMBO J. 15, 1885-1893 (1996) ＊）、Ｒｈｏ結合
キナーゼ（Matsui, T. etal., EMBO J. 15, 2208-2216
(1996) ＊）、ＲＯＫα（Leung, T. et al., J. Biol.
Chem. 270, 29051-29054 (1995)＊）、ローテキン（Rei
d, T. et al., J.Biol. Chem. 271, 13556-13560 (199
6) ＊）、ミオシン結合サブユニット（K. Kimura et a
l., Science 273, 245-248(1996)＊）が同定された。ま
た、酵母（Saccharomyces serevisiae）のＲｈｏ標的タ
ンパク質として、プロテイン・キナーゼＣ１（ＰＫＣ
１）（Nonaka, H. et al., EMBO J. 14, 5931-5938 (19
95) ＊）、１，３−β−グルカン合成酵素（Drgonova,
J. et al., Scinece 272, 277-279 (1996)＊; Qadota,
H. et al., Scinece 272, 279-281 (1996)＊）が同定さ
れた。
【００１２】また、細胞骨格を構成する主な繊維成分と
しては微小管、アクチンフィラメント、および中間径フ
ィラメントが挙げられるが、これらがリン酸化等される
こと等により細胞骨格が制御されていることが知られて
いる（ N. Inagaki et al.,Trend. Biochem. Sci., 19,
448-452(1994) ）。また、中間径フィラメントに関し
てはその構造がアミノ酸配列レベルで解明されている
（Julien, J. et al., Biochim. Biophys. Acta 909, 1
0-20 (1987)(ヒト−ニューロフィラメント−Ｌ)、Myer
s, M. et al., EMBO J., 6, 1617-1626 (1987) (ヒト−
ニューロフィラメント−Ｍ）、Lees, J., et al., EMBO
J., 7, 1947-1955 (1988)( ヒト−ニューロフィラメン
ト−Ｈ）、Honore', B., et al., Nucl. Acid.Res., 1
8, 6692 (1990) （ヒト−ビメンチン））。しかし、中
間径フィラメントとＰＫＮとの相互作用は、本発明者が
知る限り報告されていない。
【００１３】また、種々の細胞および組織由来の骨格
筋、平滑筋、および非筋肉のα−アクチニンを包む、細
胞骨格タンパク質α−アクチニンの多数の異なったアイ
ソフォームが特徴づけられている。ヒトにおいては、骨
格筋型α−アクチニン（ Beggs, A., et al., J. Biol.
Chem. 267, 9281-9288 (1992)においてＨｕＡｃｔＳｋ
１と呼ばれている）およびＨｕＡｃｔＳｋ１と強い配列
相同性（８９％の相同性および８０％の同一性）を有す
る非筋肉細胞骨格α−アクチニン（ Beggs, A.,et al.,
J. Biol. Chem. 267, 9281-9288 (1992)においてＨｕ
ＡｃｔＮｍと呼ばれている）のクローンだけが単離され
ている（ Millake, D. B., et al., Nucleic Acids Re
s. 17, 6725 (1989) 、および Youssoufian, H., et a
l., Am. J. Hum. Genet. 47,62-71 (1990)）。種々のα
−アクチニン間で報告されている機能的な差異は、Ｆ−
アクチンへの筋肉アイソフォームの結合はＣａ２＋によ
り阻害されるが、非筋肉アイソフォームの結合はＣａ
２＋非感受性であることである（Burridge, K. & Feram
iscoo, J. R. Nature 294, 565-567 (1981)、Bennett,
J. P., et al., Biochemistry 23, 5081-5086 (1984)
、 Duhaiman, A. S. & Bamburg, J. R. Biochemistry
23, 1600-1608 (1984) 、および Landon, F., et al.,
Eur. J. Biochem. 153, 231-237 (1985) ）。
【００１４】α−アクチニンは、スペクトリン、ジスト
ロフィンなどを包含むスペクトリンのスーパーファミリ
ーの１メンバーである（ Blanchard, A., et al., J. M
uscle Res. Cell Motil.10,280-289 (1989) 、Dubreui
l, R. R. Bioessays 13, 219-226 (1991)、および Benn
ett, V, Physiol. Rev. 70, 1029-1065 (1990) ）。フ
ァミリーのメンバーは、Ｎ−末端のアクチン結合ドメイ
ン、中央のロッド形スペクトリン様リピート、およびＣ
−末端のＥＦ−ハンド様ドメインにより特徴づけられ
る。α−スペクトリンはＥＦ−ハンド様ドメインの代わ
りにＮ−末端に２１個のロッド形リピートを含んでい
る。α−スペクトリンのＣ−末端はα−アクチニンに明
らかに一致しており、特にα−スペクトリンのリピート
２０はα−アクチニンのリピート３に対して非常に高い
相同性を示し（ Wasenius, V. M., et al., J. Cell Bi
ol. 108, 79-93 (1989) 、および Hong, W. J. & Doyl
e, D. J.Biol. Chem. 264, 12758-12764 (1989)）、各
タンパク質間でのリピートの位置は互いにほぼ一致して
いる。
【００１５】α−アクチニンは次の３つのドメインから
構成される：Ｎ−末端のアクチン結合ドメイン、内部に
４つの１２２アミノ酸のリピート（スペクトリン様リピ
ート）をもつ伸長ロッド形ドメイン、および１対の推定
上のらせん−ループ−らせんＣａ２＋結合モチーフを含
有するＣ−末端領域（しばしばＥＦ−ハンドと呼ばれ
る）（（Blanchard, A., et al., J. Muscle Res. Cell
Motil.10,280-289 (1989)）。しかし、α−アクチニン
とＰＫＮとの相互作用は、本発明者らが知る限り報告さ
れていない。
【００１６】更に、また、最近、増殖因子によって誘導
されるシグナル経路とストレスによって誘導されるシグ
ナル伝達経路が重複していることが多くのデータにより
示されている。Ｒｈｏファミリーの低分子量ＧＴＰａｓ
ｅの他のメンバーであるＲａｃおよびＣｄｃ４２は、増
殖因子だけでなく、前炎症性サイトカインおよび紫外線
のようなストレスにより活性化され、ストレスにより活
性化されるＭＡＰキナーゼの活性化に関与している（Mi
nden, A. Cell 81, 1147-1157(1995) 、Coso,O. et a
l., Cell 81, 1137-1146(1995) 、およびZhang, S. et
al., J. Biol. Chem. 270, 23934-23936(1995) ）。最
近、リゾホスファチジル酸（ＬＰＡ）、血清、およびス
トレス（例えば、亜ヒ酸塩および浸透圧ショック）は、
血清応答因子（ＳＲＦ）による血清応答エレメント（Ｓ
ＲＥ）の活性化を介してｃ−ｆｏｓ転写を調節するが、
この際に機能的なＲｈｏを必要とすることが報告されて
いる（Hill, C. S. et al., Cell 81. 1159-1170(199
5)）。ＳＲＦ活性化は、他のＲｈｏファミリータンパク
質（ＲａｃやＣｄｃ４２）では媒介されない（Hill, C.
S. et al., Cell 81. 1159-1170(1995)）。以上の知見
より、Ｒｈｏタンパク質下流に、細胞核へのシグナル伝
達を担う未知の経路の存在が示唆されている（Vojtek,
A. & Cooper, J., Cell 82, 527-529 (1995)）。
【００１７】なお、本願の優先権主張の基礎となる最初
の出願の後に発行された刊行物に＊を付した。
【００１８】
【発明の概要】今般、本発明者らは、活性型ＲｈｏＡタ
ンパク質が、ＰＫＮのアミノ末端領域に結合すること、
ＰＫＮのプロテインキナーゼ活性が活性型Ｒｈｏタンパ
ク質依存的に亢進されることを見い出した。また、ＰＫ
Ｎのアミノ末端の特定領域が、ＰＫＮと活性型Ｒｈｏタ
ンパク質との結合を阻害すること等を見い出した。
【００１９】また、本発明者らは、ＰＫＮが、細胞の形
態を制御する細胞骨格タンパク質類（中間系フィラメン
トおよびα−アクチニン）と結合する、および／または
これらをリン酸化すること等を見い出した。ニューロン
特異的中間径フィラメントの１つのサブユニットである
ニューロフィラメント（以下「ＮＦ」ということがあ
る）ＬがＰＫＮと結合すること、ＰＫＮのＮ末端調節領
域は、ＮＦＬだけでなく他の中間径フィラメントタンパ
ク質（ＮＦの他のサブユニット（ＭおよびＨ）およびビ
メンチン）のヘッド・ロッドドメインまたはα−アクチ
ニンのスペクトリン様リピートおよびＥＦモチーフハン
ドと結合すること、精製したラットＰＫＮはウシ脊髄か
ら抽出した天然のＮＦ、およびバクテリアで合成した中
間径フィラメントタンパク質（ＮＦの各サブユニットお
よびビメンチン）のヘッド・ロッドドメインをリン酸化
すること、ＰＫＮによるＮＦＬのリン酸化がインビトロ
でＮＦＬの重合を阻止すること等を見い出した。
【００２０】また、ＰＫＮのアミノ末端領域がＰＫＮの
カルボキシル末端領域と結合すること、およびＰＫＮの
アミノ末端の特定領域がＰＫＮのプロテインキナーゼの
擬似基質として働いている（ＰＫＮのプロテインキナー
ゼ活性を阻害する）こと等を見い出した。また、本発明
者らは、細胞をヒートショック、亜ヒ酸ナトリウム、ま
たは血清飢餓のようなストレスに曝すとＰＫＮが可逆的
に細胞質から核内に移行すること、等を見出した。
【００２１】本発明は以上の知見に基づくものである。
即ち、本発明は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し
かつプロテインキナーゼ活性を有さないプロテインキナ
ーゼＮの改変アミノ酸配列を有するペプチド、およびＰ
ＫＮとＲｈｏタンパク質との結合を阻害するペプチドの
提供をその目的とする。
【００２２】また、本発明は、細胞骨格タンパク質（中
間径フィラメントおよび／またはα−アクチニン）結合
能を有するペプチド、ＰＫＮのプロテインキナーゼ触媒
領域結合能を有するペプチド、ＰＫＮのプロテインキナ
ーゼの活性を阻害するペプチド、ＰＫＮの細胞質から核
への移行を阻害するペプチドおよびＰＫＮによりリン酸
化されるペプチドの提供をその目的とする。
【００２３】更に、本発明は、該ペプチドをコードする
塩基配列、該塩基配列を含んでなるベクター、該ベクタ
ーによって形質転換された宿主細胞、該ペプチドまたは
タンパク質の製造法、該タンパク質等を含んでなる腫瘍
形成または転移抑制剤、および活性型Ｒｈｏタンパク質
とＰＫＮとの結合を阻害する物質等のスクリーニング法
の提供をその目的とする。
【００２４】なお、本発明者らは、本発明によるタンパ
ク質が、前記したＲｈｏタンパク質結合性タンパク質
（シトロン、ローフィリン、ｐ１６０ＲＯＣＫ、Ｒｈｏ
結合キナーゼ、ＲＯＫα、ローテキン、ミオシン結合サ
ブユニット、プロテイン・キナーゼＣ１（ＰＫＣ１）、
および１，３−β−グルカン合成酵素）とは構造におい
て異なるものであることを確認している。尚、これらの
Ｒｈｏタンパク結合タンパク質は全て、本願の優先権主
張の基礎となる最初の出願の後において、同定されたも
のである。
【００２５】
【発明の具体的説明】定義 本発明において、「アミノ酸」とは、光学異性体、すな
わちＬ体およびＤ体、のいずれをも含む意味で用いられ
るものとする。従って、本発明において「ペプチド」と
は、Ｌ体のアミノ酸のみによって構成されているペプチ
ドだけでなく、Ｄ体のアミノ酸を一部または全部含むペ
プチドをも意味するものとする。
【００２６】また、本発明において、「アミノ酸」と
は、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸
のみならず、それら以外のα−アミノ酸、並びにβ−、
γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等を含む意
味で用いられるものとする。従って、下記のようにペプ
チドにおいて置換されるかまたはペプチド中に挿入され
るアミノ酸としては、天然のタンパク質を構成する２０
種のα−アミノ酸だけに限定されることはなく、それら
以外のα−アミノ酸並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸お
よび非天然のアミノ酸等であってもよい。このようなβ
−、γ−またはδ−アミノ酸としては、β−アラニン、
γ−アミノ酪酸あるいはオルニチンが挙げられ、また天
然タンパク質を構成するもの以外のアミノ酸あるいは非
天然のアミノ酸としては、３，４−ジヒドロキシフェニ
ルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルグリシ
ン、１，２，３，４−テトラハイドロイソキノリン−３
−カルボン酸あるいは二ペコチン酸等が挙げられる。
【００２７】活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質 本発明による活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質
は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテ
インキナーゼ活性を有さないプロテインキナーゼＮの改
変アミノ酸配列を有するペプチドまたはその誘導体であ
る。ここで、「改変アミノ酸配列」とは、１以上のアミ
ノ酸配列が付加および／または挿入され、および／また
は１以上のアミノ酸が置換および／または欠失されるこ
とによって改変されたアミノ酸配列をいう。従って、活
性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテインキ
ナーゼ活性を有さないＰＫＮの部分アミノ酸配列（ＰＫ
Ｎの全アミノ酸配列の一部の配列から構成される）も改
変アミノ酸配列の一態様である。また、本明細書におい
て「タンパク質」とは、ペプチドを含む意味で用いられ
るものとする。更にまた、本明細書において「ペプチ
ド」というときは、ペプチドの誘導体を含む意味で用い
られることがある。
【００２８】ＰＫＮの全アミノ酸配列は、例えば、ヒト
をその起源とするものは公知であり、その配列は配列番
号１に記載される通りである。ヒトのＰＫＮの配列と相
同性を有するヒト以外の種（例えば、ラット、ウシ、ア
フリカツメガエル等）のＰＫＮの全アミノ酸配列もここ
にいうＰＫＮの全アミノ酸配列に含まれるものとする。
【００２９】ＰＫＮは、例えば、そのｃＤＮＡ配列を細
菌等において常法に従って発現させることによって得る
ことができる。ｃＤＮＡ配列は前記アミノ酸配列の一部
をコードする塩基配列をプローブとして用い、市販のｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって
得ることができる。ヒト由来のＰＫＮの配列の単離は、
Mukai, H. & Ono, Y. Biochem. Biophys. Res. Commu
n. 199. 897-904 (1994) に記載の方法に従って行うこ
とができる。
【００３０】ＰＫＮには、アイソザイムが存在する。こ
のようなアイソザイムとしては、プロテインキナーゼＣ
関連キナーゼ２およびプロテインキナーゼＣ関連キナー
ゼ３が挙げられる（前掲Palmer,R. et al.）。本明細書
において「プロテインキナーゼＮ」というときにはＰＫ
Ｎのアイソザイムを含む意味で用いられるものとする。
【００３１】ＰＫＮの起源は特に限定されず、ヒトを含
むホ乳類由来のものであっても、それ以外を由来とする
ものであってもよい。ＰＫＮは例えば H. Mukai et a
l., Biochem. Biophys. Res. Commun., 204, 348-356
(1994) または実施例１に記載の方法に従って得ること
ができる。
【００３２】Ｒｈｏタンパク質としては、ＲｈｏＡタン
パク質、ＲｈｏＢタンパク質、ＲｈｏＣタンパク質、ま
たはＲｈｏＧタンパク質が挙げられる。また、本明細書
においてＲｈｏタンパク質は、Ｒｈｏタンパク質とＰＫ
Ｎとの結合が実質的に損われないように改変されたＲｈ
ｏタンパク質をも含むものとする。このような改変Ｒｈ
ｏタンパク質としては、１４番目のアミノ酸をバリンに
置換したＲｈｏＡ変異体（ＲｈｏＡVal14 ）、そのＣ末
端の脂質修飾部位を欠失したＲｈｏＡ変異体（ＣＬＶＬ
- ）、および１４番目のアミノ酸をバリンに置換し、か
つそのＣ末端の脂質修飾部位を欠失したＲｈｏＡ変異体
（ＲｈｏＡVal14ＣＬＶＬ- ）等が挙げられる。
【００３３】本発明において、「活性型Ｒｈｏタンパク
質結合能を有するアミノ酸配列」とは、当業者により活
性型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価され
るアミノ酸配列をいい、例えば、実施例１、４、５、お
よび１６〜１８と同様の条件において実験した場合に、
活性型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価さ
れるアミノ酸配列を意味するものとする。
【００３４】活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質
は、プロテインキナーゼ活性を有さない。本発明におい
て、「プロテインキナーゼ活性を有さない」とは、ＰＫ
Ｎのセリン／スレオニン・プロテインキナーゼ触媒能を
有さないことをいい、より具体的には配列番号１に記載
されるアミノ酸配列の５４１番または１１２番以降の配
列であって、１以上のアミノ酸配列が付加および／また
は挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換お
よび／または欠失されることによってセリン／スレオニ
ン・プロテインキナーゼ触媒能を有さない配列を、更に
ヒト以外の配列においてはこれらに相当する配列を、意
味するものとする。活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タン
パク質は、また、細胞骨格タンパク質（中間径フィラメ
ントおよび／またはα−アクチニン）に結合するペプチ
ド、またはストレス条件下このＰＫＮの細胞質から核へ
の移行を阻害するペプチドであることができる（後記実
施例参照）。
【００３５】本明細書において、「ペプチドの誘導体」
とは、ペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ基また
は各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全部、お
よび／またはペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末端）の
カルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボキシル
基の一部もしくは全部、および／または、ペプチドの各
アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の
官能基（例えば、水素基、チオール基、アミド基等）の
一部もしくは全部が、適当な他の置換基によって修飾を
受けたものをいう。適当な他の置換基による修飾は、例
えば、ペプチド中に存在する官能基の保護、安全性なら
びに組織移行性の向上、あるいは活性の増強等を目的と
して行われる。
【００３６】ペプチドの誘導体としては、具体的には、
（１）ペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ基また
は各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全部の水
素原子が、置換または非置換のアルキル基（直鎖、分岐
鎖または環状であってもよい）（例えば、メチル基、エ
チル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、
ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロプロピル基、シクロヘ
キシル基、ベンジル基）、置換または非置換のアシル基
（例えば、ホルミル基、アセチル基、カプロイル基、シ
クロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フタロイル
基、トシル基、ニコチノイル基、ピペリジンカルボニル
基）、ウレタン型保護基（例えば、ｐ−ニトロベンジル
オキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカル
ボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニ
ル基、ｔ−ブトキシカルボニル基）またはウレア型置換
基（例えば、メチルアミノカルボニル基、フェニルカル
ボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル基）等によ
って置換されたもの、並びに
【００３７】（２）ペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末
端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボ
キシル基の一部もしくは全部が、エステル型の修飾を受
けているもの（例えば、その水素原子がメチル、エチ
ル、イソプロピル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジ
ル、ｔ−ブチル、４−ピコリルにより置換されたも
の）、アミド型の修飾を受けているもの（例えば、非置
換アミド、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミド（例えば、メチル
アミド、エチルアミド、イソプロピルアミド）を形成し
ているもの、並びに
【００３８】（３）ペプチドの各アミノ酸の側鎖のアミ
ノ基およびカルボキシル基以外の官能基（例えば、水素
基、チオール基、アミノ基等）の一部もしくは全部が、
上述のアミノ基と同様の置換基あるいはトリチル基など
で修飾されたもの等が挙げられる。活性型Ｒｈｏタンパ
ク質結合性タンパク質の具体例としては、活性型Ｒｈｏ
Ａタンパク質結合能を有しかつセリン／スレオニン・プ
ロテインキナーゼ活性を有さない、ヒト−ＰＫＮの改変
アミノ酸配列を有するものが挙げられる。より具体的に
は、配列番号１の７〜５４０番のアミノ酸配列からなる
もの、７〜１５５番のアミノ酸配列からなるもの、１〜
５３８番のアミノ酸配列からなるもの、３〜１３５番の
アミノ酸配列からなるもの、および３３〜１１１番のア
ミノ酸配列からなるもの、並びに活性型Ｒｈｏタンパク
質結合能を有するこれらの改変アミノ酸配列（例えば、
部分配列）からなるものが挙げられる。
【００３９】活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質
としては、更に、配列番号１の７４〜９３番のアミノ酸
配列からなるもの、９４〜１１３番のアミノ酸配列から
なるもの、および８２〜１０３番のアミノ酸配列からな
るもの、並びに活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する
これらの改変アミノ酸配列（例えば、部分配列）からな
るものが挙げられる。配列番号１の８２〜１０３番のア
ミノ酸配列からなるペプチドは、後記実施例において示
されるように、Ｒｈｏタンパク質とＰＫＮとの結合阻害
能（すなわち、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能）におい
て優れたものである。
【００４０】細胞骨格タンパク質（例えば、中間径フィ
ラメントおよびα−アクチニン）に結合する活性型Ｒｈ
ｏタンパク質結合性タンパク質としては、例えば配列番
号１の１〜４７４番および１３６〜１８９番のアミノ酸
配列が挙げられる。
【００４１】細胞質から核へのプロテインキナーゼＮの
移行を阻害する活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク
質としては、例えば配列番号１のアミノ酸配列であっ
て、６４４番目のＬｙｓをＡｒｇで置換したもの（ＰＫ
Ｎ−ＰＫ- ）が挙げられる。
【００４２】活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質
は、活性型Ｒｈｏタンパク質と結合することができる。
また、Ｒｈｏタンパク質は腫瘍の形成、転移をはじめと
して細胞形態、細胞運動、細胞接着、細胞質***、遺伝
子転写活性化等の細胞の機能発現に密接にかかわってい
る（前掲Takai, Y., et al. 、前掲G.C.Prendergast.et
al.、Khosravi-Far, R., et al ．、R. Qiu et al. 、
Lebowitz 、P., et al., およびYoshioka,K.et al.
）。従って、活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク
質は、腫瘍の形成および転移の機構解明に有用であると
考えられる。また、活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タン
パク質は、細胞の機能解明に有用であると考えられる。
【００４３】活性型Ｒｈｏタンパク質−ＰＫＮ結合阻害
タンパク質 本発明による活性型Ｒｈｏタンパク質−ＰＫＮ結合阻害
タンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質とプロテインキ
ナーゼＮとの結合を阻害するプロテインキナーゼＮの改
変アミノ酸配列を有するペプチドまたはその誘導体から
なる。ここで、「改変アミノ酸配列」とは、前記と同様
の意味を表す。従って、活性型Ｒｈｏタンパク質とプロ
テインキナーゼＮとの結合を阻害するＰＫＮの部分アミ
ノ酸配列（ＰＫＮの全アミノ酸配列の一部の配列から構
成される）も改変アミノ酸配列の一態様である。
【００４４】本発明において、「活性型Ｒｈｏタンパク
質とプロテインキナーゼＮとの結合を阻害するアミノ酸
配列」とは、当業者により活性型Ｒｈｏタンパク質とＰ
ＫＮとの結合の阻害が認められたと評価されるアミノ酸
配列をいい、例えば、実施例１７と同様の条件において
実験した場合に、活性型Ｒｈｏタンパク質とＰＫＮとの
結合の阻害が認められたと評価されるアミノ酸配列を意
味するものとする。
【００４５】活性型Ｒｈｏタンパク質−ＰＫＮ結合阻害
タンパク質の具体例としては、配列番号１の７〜５４０
番のアミノ酸配列からなるもの、７〜１５５番のアミノ
酸配列からなるもの、１〜５４０番のアミノ酸配列から
なるもの、３〜１３５番のアミノ酸配列からなるもの、
および３３〜１１１番のアミノ酸配列からなるもの、並
びに活性型Ｒｈｏタンパク質とＰＫＮとの結合阻害能を
有するこれらの改変アミノ酸配列（例えば、部分配列）
からなるものが挙げられる。
【００４６】活性型Ｒｈｏタンパク質−ＰＫＮ結合阻害
タンパク質としては、更に、配列番号１の７４〜９３番
のアミノ酸配列からなるもの、９４〜１１３番のアミノ
酸配列からなるもの、および８２〜１０３番のアミノ酸
配列からなるもの、並びに活性型Ｒｈｏタンパク質とＰ
ＫＮとの結合阻害能を有するこれらの改変アミノ酸配列
（例えば、部分配列）からなるが挙げられる。配列番号
１の８２〜１０３番のアミノ酸配列からなるペプチド
は、後記実施例において示されるように、活性型Ｒｈｏ
タンパク質とＰＫＮとの結合阻害能において優れたもの
である。
【００４７】本発明による活性型Ｒｈｏタンパク質−Ｐ
ＫＮ結合阻害タンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結
合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有さないプ
ロテインキナーゼＮの改変アミノ酸配列からなることが
できる。
【００４８】また、活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タン
パク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質とプロテインキナー
ゼＮとの結合を阻害するとの性質を有していてもよい。
【００４９】従って、本発明によれば、活性型Ｒｈｏタ
ンパク質結合能を有し、プロテインキナーゼ活性を有さ
ず、そしてプロテインキナーゼＮと活性型Ｒｈｏタンパ
ク質との結合を阻害するプロテインキナーゼＮの改変ア
ミノ酸配列を有するペプチドまたはその誘導体が提供さ
れる。
【００５０】活性型Ｒｈｏタンパク質−ＰＫＮ結合阻害
タンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質とＰＫＮとの結
合を阻害することができる。また、Ｒｈｏタンパク質は
腫瘍の形成、転移をはじめとして細胞形態、細胞接着、
細胞運動、細胞質***遺伝子転写活性化等の細胞の機能
発現に密接にかかわっている（前掲Takai, Y., et al.
、前掲G.C.Prendergast.et al.、Khosravi-Far, R., e
t al ．R. Qiu et al.および Lebowitz 、P., et al
）。従って、活性型Ｒｈｏタンパク質−ＰＫＮ結合阻
害タンパク質は、腫瘍の形成および転移の機構解明に有
用であると考えられる。また、活性型Ｒｈｏタンパク質
−ＰＫＮ結合阻害タンパク質は、細胞の機能解明に有用
であると考えられる。
【００５１】中間径フィラメント結合性タンパク質 本発明による中間径フィラメント結合性タンパク質は、
中間径フィラメント結合能を有し、かつプロテインキナ
ーゼ活性を有さないプロテインキナーゼＮの改変アミノ
酸配列を有するペプチドまたはその誘導体からなる。こ
こで、「改変アミノ酸配列」とは、前記と同様の意味を
表す。従って、中間径フィラメント結合能を有し、かつ
プロテインキナーゼ活性を有さないＰＫＮの部分アミノ
酸配列（ＰＫＮの全アミノ酸配列の一部の配列から構成
される）も改変アミノ酸配列の一態様である。
【００５２】本発明において「中間径フィラメント」と
しては、ビメンチン、ニューロフィラメント−Ｌ（ＮＦ
Ｌ）、ニューロフィラメント−Ｍ（ＮＦＭ）、ニューロ
フィラメント−Ｈ（ＮＦＨ）、酸性ケラチン、中性ケラ
チン、塩基性ケラチン、デスミン、グリア線維酸性タン
パク質（ＧＦＡＰ）、ラミン、およびネスチンが挙げら
れる。
【００５３】本発明において、「中間径フィラメント結
合能を有するアミノ酸配列」とは、当業者により中間径
フィラメントや中間径フィラメントのヘッド・ロッドド
メインとの結合が認められたと評価されるアミノ酸配列
をいい、例えば、中間径フィラメント、ヒトＮＦＬの１
〜３４９番のアミノ酸配列、またはヒトＮＦＭの１〜４
１１番のアミノ酸配列との結合が認められたと評価され
るアミノ酸配列を意味するものとする。
【００５４】中間径フィラメント結合性タンパク質は、
プロテインキナーゼ活性を有さない。本発明において、
「プロテインキナーゼ活性を有さない」とは、ＰＫＮの
セリン／スレオニン・プロテインキナーゼ触媒能を有さ
ないことをいい、より具体的には配列番号１の４７５番
または５４１番以降のアミノ酸配列であって、１以上の
アミノ酸配列が付加および／または挿入され、および／
または１以上のアミノ酸が置換および／または欠失され
ることによってセリン／スレオニン・プロテインキナー
ゼ触媒能を有さない配列を、更にヒト以外の配列におい
てはこれらに相当する配列を、意味するものとする。
【００５５】中間径フィラメント結合性タンパク質の具
体例としては、中間径フィラメント結合能を有しかつセ
リン／スレオニン・プロテインキナーゼ活性を有さな
い、ヒト−ＰＫＮの改変アミノ酸配列を有するものが挙
げられる。より具体的には、配列番号１の１〜４７４番
のアミノ酸配列、１〜５４０番のアミノ酸配列、１〜３
２番のアミノ酸配列、１１２〜５４０番のアミノ酸配列
または１１２〜４７４番のアミノ酸配列からなるもの、
並びに中間径フィラメント結合能を有するこれらの改変
アミノ酸配列（例えば、部分配列）からなるものが挙げ
られる。
【００５６】中間径フィラメント結合性タンパク質は、
中間径フィラメント結合能を有する。また、中間径フィ
ラメントは細胞骨格の情報伝達に関し重要な役割を担っ
ていることが知られている（ N. Inagaki et al., Tren
d. Biochem. Sci., 19, 448-452 (1994)）。従って、中
間径フィラメント結合性タンパク質は、腫瘍の形成およ
び転移の機構の解明に有用であると考えられる。また、
中間径フィラメント結合性タンパク質は、かかる情報伝
達機構の解明に有用であると考えられる。
【００５７】α−アクチニン結合性タンパク質 本発明によるα−アクチニン結合性タンパク質は、α−
アクチニン結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性
を有さないプロテインキナーゼＮの改変アミノ酸配列を
有するペプチドまたはその誘導体からなる。ここで、
「改変アミノ酸配列」とは、前記と同様の意味を表す。
従って、α−アクチニン結合能を有し、かつプロテイン
キナーゼ活性を有さないＰＫＮの部分アミノ酸配列（Ｐ
ＫＮの全アミノ酸配列の一部の配列から構成される）も
改変アミノ酸配列の一態様である。
【００５８】本発明において「α−アクチニン」として
は、骨格筋型α−アクチニンおよび非骨格筋型α−アク
チニンが挙げられる。
【００５９】本発明において、「α−アクチニン結合能
を有するアミノ酸配列」とは、当業者によりα−アクチ
ニンやα−アクチニンの中間部（例えば、α−アクチニ
ンのスペクトリン様リピートおよびＥＦモチーフハン
ド、並びにヒト骨格筋型α−アクチニンの４２３〜６５
３番、６５３〜８３７番、４８６〜６０７番、３３３〜
８９４番のアミノ酸配列またはヒト非骨格筋型α−アク
チニンの４７９〜６００番、７１２〜８４３番のアミノ
酸配列）との結合が認められたと評価されるアミノ酸配
列をいう。
【００６０】α−アクチニン結合性タンパク質は、プロ
テインキナーゼ活性を有さない。本発明において、「プ
ロテインキナーゼ活性を有さない」とは、ＰＫＮのセリ
ン／スレオニン・プロテインキナーゼ触媒能を有さない
ことをいい、より具体的には配列番号１の４７５番また
は５４１番以降のアミノ酸配列であって、１以上のアミ
ノ酸配列が付加および／または挿入され、および／また
は１以上のアミノ酸が置換および／または欠失されるこ
とによってセリン／スレオニン・プロテインキナーゼ触
媒能を有さない配列を、更にヒト以外の配列においては
これらに相当する配列を、意味するものとする。
【００６１】α−アクチニン結合性タンパク質の具体例
としては、α−アクチニン結合能を有しかつセリン／ス
レオニン・プロテインキナーゼ活性を有さない、ヒト−
ＰＫＮの改変アミノ酸配列を有するものが挙げられる。
より具体的には、配列番号１の１〜５４０番、３〜１３
５番、１３６〜５４０番、または１３６〜１８９番のア
ミノ酸配列からなるもの、並びにα−アクチニン結合能
を有するこれらの改変アミノ酸配列（例えば、部分配
列）からなるものが挙げられる。
【００６２】α−アクチニン結合性タンパク質は、α−
アクチニン結合能を有する。また、α−アクチニンはア
クチン・フィラメント同志あるいはアクチン・フィラメ
ントと細胞接着装置等とをクロスリンクする細胞骨格タ
ンパク質であり、細胞形態、細胞接着、細胞運動等に関
し重要な役割を担っていることが知られている（前記従
来技術参照）。従って、α−アクチニン結合性タンパク
質は、ＲｈｏやＰＫＮによる細胞形態や細胞接着の制御
の機構の解明に有用であると考えられる。また、α−ア
クチニン結合性タンパク質は、かかる情報伝達機構の解
明に有用であると考えられる。
【００６３】ＰＫＮ触媒領域結合性タンパク質 本発明によるＰＫＮ触媒領域結合性タンパク質は、ＰＫ
Ｎ触媒領域結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性
を有さないＰＫＮの改変アミノ酸配列を有するペプチド
またはその誘導体からなる。ここで、「改変アミノ酸配
列」とは、前記と同様の意味を表す。従って、ＰＫＮ触
媒領域結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有
さないＰＫＮの部分アミノ酸配列（ＰＫＮの全アミノ酸
配列の一部の配列から構成される）も改変アミノ酸配列
の一態様である。
【００６４】本発明において、「プロテインキナーゼＮ
のプロテインキナーゼ触媒領域結合能を有するアミノ酸
配列」とは、当業者によりＰＫＮのプロテインキナーゼ
触媒領域との結合が認められたと評価されるアミノ酸配
列をいい、例えば、実施例１１または１２と同様の条件
において実験した場合に、ＰＫＮのプロテインキナーゼ
触媒領域との結合が認められたと評価されるアミノ酸配
列を意味するものとする。
【００６５】ここで、本発明によるＰＫＮ触媒領域結合
性タンパク質が結合するプロテインキナーゼＮのプロテ
インキナーゼ触媒領域としては、例えば、配列番号１の
５１１〜９４２番のアミノ酸配列、６１４〜９４２番の
アミノ酸配列、および６３４〜９４２番のアミノ酸配列
が挙げられる。
【００６６】ＰＫＮ触媒領域結合性タンパク質は、プロ
テインキナーゼ活性を有さない。本発明において、「プ
ロテインキナーゼ活性を有さない」とは、ＰＫＮのセリ
ン／スレオニン・プロテインキナーゼ触媒能を有さない
ことをいい、より具体的には配列番号１の５４１番また
は４７５番以降のアミノ酸配列であって、１以上のアミ
ノ酸配列が付加および／または挿入され、および／また
は１以上のアミノ酸が置換および／または欠失されるこ
とによってセリン／スレオニン・プロテインキナーゼ触
媒能を有さない配列を、更にヒト以外の配列においては
これらに相当する配列を、意味するものとする。
【００６７】ＰＫＮ触媒領域結合性タンパク質の具体例
としては、ＰＫＮ触媒領域結合能を有しかつセリン／ス
レオニン・プロテインキナーゼ活性を有さない、ヒト−
ＰＫＮの改変アミノ酸配列を有するものが挙げられる。
より具体的には、配列番号１に記載の１〜５４０番のア
ミノ酸配列からなるものおよび１〜４７４番のアミノ酸
配列からなるもの、並びにＰＫＮ触媒領域結合能を有す
るこれらの改変アミノ酸配列（例えば、部分配列）から
なるものが挙げられる。
【００６８】ＰＫＮ触媒領域結合性タンパク質は、ＰＫ
Ｎのプロテインキナーゼ触媒領域結合能を有する。従っ
て、ＰＫＮ触媒領域結合性タンパク質は、腫瘍の形成お
よび転移の機構の解明に有用であると考えられる。ま
た、ＰＫＮによる細胞情報伝達の解明に有用であると考
えられる。
【００６９】ＰＫＮプロテインキナーゼ活性阻害ペプチ
ド 本発明によるＰＫＮプロテインキナーゼ活性阻害ペプチ
ドは、プロテインキナーゼＮのプロテインキナーゼの活
性を阻害し、かつプロテインキナーゼ活性を有さないプ
ロテインキナーゼＮの改変アミノ酸配列を有するペプチ
ドまたはその誘導体である。ここで、「改変アミノ酸配
列」とは、前記と同様の意味を表す。従って、ＰＫＮの
プロテインキナーゼの活性を阻害し、かつプロテインキ
ナーゼ活性を有さないＰＫＮの部分アミノ酸配列（ＰＫ
Ｎの全アミノ酸配列の一部の配列から構成される）も改
変アミノ酸配列の一態様である。
【００７０】本発明において、「プロテインキナーゼＮ
のプロテインキナーゼの活性を阻害する」とは、当業者
によりＰＫＮのプロテインキナーゼの活性の阻害が認め
られたと評価されるアミノ酸配列をいい、例えば、実施
例１４または１５と同様の条件において実験した場合
に、ＰＫＮのプロテインキナーゼの活性の阻害が認めら
れたと評価されるアミノ酸配列を意味するものとする。
【００７１】ＰＫＮプロテインキナーゼ活性阻害ペプチ
ドは、プロテインキナーゼ活性を有さない。本発明にお
いて、「プロテインキナーゼ活性を有さない」とは、Ｐ
ＫＮのセリン／スレオニン・プロテインキナーゼ触媒能
を有さないことをいい、より具体的には配列番号１の５
４１番または４７５番以降のアミノ酸配列であって、１
以上のアミノ酸配列が付加および／または挿入され、お
よび／または１以上のアミノ酸が置換および／または欠
失されることによってセリン／スレオニン・プロテイン
キナーゼ触媒能を有さない配列を、更にヒト以外の配列
においてはこれらに相当する配列を、意味するものとす
る。
【００７２】ＰＫＮプロテインキナーゼ活性阻害ペプチ
ドの具体例としては、プロテインキナーゼＮのプロテイ
ンキナーゼの活性を阻害し、かつセリン／スレオニン・
プロテインキナーゼ活性を有さない、ヒト−ＰＫＮの改
変アミノ酸配列を有するものが挙げられる。より具体的
には、配列番号１の３９〜５３番のアミノ酸配列からな
るもの、およびプロテインキナーゼの活性阻害能を有す
るこの改変アミノ酸配列（例えば、部分配列）からなる
ものが挙げられる。
【００７３】ＰＫＮプロテインキナーゼ活性阻害ペプチ
ドは、ＰＫＮのプロテインキナーゼの活性を阻害する。
従って、ＰＫＮプロテインキナーゼ活性阻害ペプチド
は、腫瘍の形成および転移の機構の解明に有用であると
考えられる。また、ＰＫＮによる細胞情報伝達の解明に
有用であると考えられる。
【００７４】本発明によるＰＫＮ触媒領域結合性タンパ
ク質は、ＰＫＮのプロテインキナーゼ活性阻害能を有し
ていても良い。また、ＰＫＮプロテインキナーゼ活性阻
害ペプチドは、ＰＫＮのプロテインキナーゼ触媒領域結
合能を有していても良い。
【００７５】従って、本発明によれば、プロテインキナ
ーゼＮのプロテインキナーゼ触媒領域結合能を有し、プ
ロテインキナーゼＮのプロテインキナーゼ活性を阻害
し、そしてプロテインキナーゼ活性を有さないプロテイ
ンキナーゼＮの改変アミノ酸配列を有するペプチドまた
はその誘導体が提供される。前記改変アミノ酸配列は、
配列番号１の１〜５４０番のアミノ酸配列、１〜４７４
番のアミノ酸配列もしくは３９〜５３番のアミノ酸配
列、またはＰＫＮのプロテインキナーゼ触媒領域結合能
を有し、かつＰＫＮのプロテインキナーゼ活性阻害能を
有するその部分配列であることができる。従って、ＰＫ
Ｎプロテインキナーゼ活性阻害ペプチドは、腫瘍の形成
および転移の機構の解明に有用であると考えられる。ま
た、ＰＫＮプロテインキナーゼ活性阻害ペプチドは、Ｐ
ＫＮによる細胞情報伝達の解明に有用であると考えられ
る。
【００７６】被リン酸化ペプチド 本発明による被リン酸化ペプチドは、プロテインキナー
ゼＮによりリン酸化されるプロテインキナーゼＮの改変
アミノ酸配列を有するペプチドまたは誘導体である。こ
こで、「改変アミノ酸配列」とは、前記と同様の意味を
表す。従って、プロテインキナーゼＮによりリン酸化さ
れるＰＫＮの部分アミノ酸配列（ＰＫＮの全アミノ酸配
列の一部の配列から構成される）も改変アミノ酸配列の
一態様である。
【００７７】本発明において、「プロテインキナーゼＮ
によりリン酸化されるアミノ酸配列」とは、当業者によ
りＰＫＮによるリン酸化が認められたと評価されるアミ
ノ酸配列をいい、例えば、実施例９、１０または１３と
同様の条件において実験した場合に、ＰＫＮによるリン
酸化が認められたと評価されるアミノ酸配列を意味する
ものとする。
【００７８】被リン酸化ペプチドは、プロテインキナー
ゼ活性を有さない。本発明において、「プロテインキナ
ーゼ活性を有さない」とは、ＰＫＮのセリン／スレオニ
ン・プロテインキナーゼ触媒能を有さないことをいい、
より具体的には配列番号１の５４１番以降のアミノ酸配
列であって、１以上のアミノ酸配列が付加および／また
は挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換お
よび／または欠失されることによってセリン／スレオニ
ン・プロテインキナーゼ触媒能を有さない配列を、更に
ヒト以外の配列においてはこれらに相当する配列を、意
味するものとする。
【００７９】本発明による被リン酸化ペプチドの具体例
としては、ＰＫＮによりリン酸化されかつプロテインキ
ナーゼ活性を有さない、ヒト−ＰＫＮの改変アミノ酸配
列を有するものが挙げられる。より具体的には、配列番
号１の３９〜５３番のアミノ酸配列であって、４６番の
ＩｌｅがＳｅｒに置換されたもの、および配列番号２の
アミノ酸配列、並びにＰＫＮによりリン酸化されるこれ
らの改変アミノ酸配列（例えば、部分配列）が挙げられ
る。
【００８０】本発明による被リン酸化ペプチドは、ま
た、プロテインキナーゼＮによりリン酸化される中間径
フィラメントおよびそれらの改変アミノ酸配列を有する
ペプチドまたはその誘導体である。
【００８１】中間径フィラメントとしては、ビメンチ
ン、ニューロフィラメント−Ｌ、ニューロフィラメント
−Ｍ、ニューロフィラメント−Ｈ、酸性ケラチン、中性
ケラチン、塩基性ケラチン、デスミン、グリア線維酸性
タンパク質（ＧＦＡＰ）、ラミン、およびネスチン等が
挙げられる。
【００８２】ここで、「改変アミノ酸配列」とは、前記
と同様の意味を表す。従って、ＰＫＮによりリン酸化さ
れる中間径フィラメントの部分アミノ酸配列（中間径フ
ィラメントの全アミノ酸配列の一部の配列から構成され
る）も改変アミノ酸配列の一態様である。
【００８３】中間径フィラメントの部分アミノ酸配列と
しては、ビメンチンのヘッド・ロッドドメイン、ニュー
ロフィラメント−Ｌのヘッド・ロッドドメイン、ニュー
ロフィラメント−Ｍのヘッド・ロッドドメイン、ニュー
ロフィラメント−Ｈのヘッド・ロッドドメインが挙げら
れる。
【００８４】上記において例示される中間径フィラメン
トの全アミノ酸配列は、例えば、ヒトをその起源とする
ものは公知であり、その配列はJulien, J. et al., Bio
chim. Biophys. Acta 909, 10-20 (1987)(ニューロフィ
ラメント−Ｌ) 、Myers, M.et al., EMBO J., 6, 1617-
1626 (1987) (ニューロフィラメント−Ｍ）、Lees,J.,
et al., EMBO J., 7, 1947-1955 (1988)( ニューロフィ
ラメント−Ｈ）、Honore', B., et al., Nucl. Acid.Re
s., 18, 6692 (1990) （ビメンチン）に記載される。
【００８５】ヒトの中間径フィラメントの配列と相同性
を有するヒト以外の種（例えば、ラット、ウシ、アフリ
カツメガエル等）の中間径フィラメントの全アミノ酸配
列も、ここにいう中間径フィラメントの全アミノ酸配列
に含まれるものとする。
【００８６】本発明による被リン酸化ペプチドは、ま
た、中間径フィラメント以外の細胞骨格タンパク質（例
えばＧ−アクチンおよびカルデスモン）およびそれらの
改変アミノ酸配列を有するペプチドまたはその誘導体で
ある。
【００８７】中間径フィラメント、Ｇ−アクチンおよび
カルデスモンの起源は特に限定されず、ヒトを含むホ乳
類由来のものであっても、それ以外を由来とするもので
あってもよい。
【００８８】本発明による被リン酸化ペプチドは、腫瘍
の形成および転移の機構の解明に有用であると考えられ
る。また、ＰＫＮによる細胞情報伝達の解明に有用であ
ると考えられる。
【００８９】ＰＫＮ結合性細胞骨格タンパク質 本発明によるＰＫＮ結合性タンパク質は、ＰＫＮ結合能
を有する細胞骨格タンパク質（例えば、中間系フィラメ
ントおよびα−アクチニン）の改変アミノ酸配列を有す
るペプチドまたはその誘導体からなる。ここで、「改変
アミノ酸配列」とは、前記と同様の意味を表す。従っ
て、ＰＫＮ結合能を有する細胞骨格タンパク質の部分ア
ミノ酸配列（中間系フィラメントまたはα−アクチニン
の全アミノ酸配列の一部の配列から構成される）も改変
アミノ酸配列の一態様である。
【００９０】本発明において「中間径フィラメント」と
しては、ビメンチン、ニューロフィラメント−Ｌ（ＮＦ
Ｌ）、ニューロフィラメント−Ｍ（ＮＦＭ）、ニューロ
フィラメント−Ｈ（ＮＦＨ）、酸性ケラチン、中性ケラ
チン、塩基性ケラチン、デスミン、グリア線維酸性タン
パク質（ＧＦＡＰ）、ラミン、およびネスチンが挙げら
れる。
【００９１】本発明において「α−アクチニン」として
は骨格筋型と非骨格筋型とが挙げられる。本発明におい
て、「ＰＫＮ結合能を有するアミノ酸配列」とは、当業
者によりＰＫＮの結合が認められたと評価されるアミノ
酸配列をいう。
【００９２】ＰＫＮ結合性細胞骨格タンパク質の例とし
ては、中間径フィラメントのヘッド・ロッド・ドメイ
ン、α−アクチニンのスペクトリン様リピートおよびＥ
Ｆモチーフハンドが挙げられる。より具体的には、ヒト
−ニューロフィラメントＬの１〜３４９番のアミノ酸配
列、ヒト−ニューロフィラメント−Ｍの１〜４１１番の
アミノ酸配列、ヒト骨格筋型α−アクチニンの４２３〜
６５３番、６５３〜８３７番、４８６〜６０７番のアミ
ノ酸配列からなるもの、ヒト非骨格筋型α−アクチニン
の４７９〜６００番および７１２〜８４３番のアミノ酸
配列からなるもの、並びにＰＫＮ結合能を有するこれら
の改変アミノ酸配列（例えば、部分配列）からなるもの
が挙げられる。
【００９３】ＰＫＮ結合性細胞骨格タンパク質は、ＰＫ
Ｎ結合能を有する。従って、ＰＫＮ結合性タンパク質
は、腫瘍の形成および転移の機構の解明に有用であると
考えられる。また、ＰＫＮ結合性細胞骨格タンパク質
は、細胞情報伝達機構の解明に有用であると考えられ
る。
【００９４】塩基配列 本発明によれば、前記ペプチドをコードする塩基配列が
提供される。ＰＫＮに関する塩基配列の典型的配列は、
配列番号１のＤＮＡ配列の一部または全部を有するもの
である。なお、本明細書において塩基配列とは、ＤＮＡ
配列およびＲＮＡ配列のいずれをも意味するものとす
る。
【００９５】前記改変アミノ酸配列が与えられれば、そ
れをコードする塩基配列は容易に定まり、配列番号１ま
たは２に記載されるアミノ酸配列をコードする種々の塩
基配列を選択することができる。従って、本発明による
ペプチドをコードする塩基配列とは、配列番号１または
２に記載される一部または全部のＤＮＡ配列に加え、同
一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係
にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味す
るものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれ
る。
【００９６】本発明による塩基配列は、天然由来のもの
であっても、全合成したものであってもよい。また、天
然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであっ
てもよい。ＤＮＡの典型的な取得方法としては、染色体
ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工
学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配
列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプローブを用
いてスクリーニングを行う方法、等が挙げられる。
【００９７】活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質
および活性型Ｒｈｏタンパク質−ＰＫＮ結合阻害タンパ
ク質をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号
１の５５〜１６５６番、５５〜５０１番、３７〜１６５
０番、４３〜４４１番、１３３〜３６９番、２５６〜３
１５番、３１６〜３７５番、２８０〜３４５番のＤＮＡ
配列が挙げられる。
【００９８】中間径フィラメント結合性タンパク質をコ
ードする塩基配列としては、例えば、配列番号１の３７
〜１６５６番、３７３〜１６５６番、および３７３〜１
４５８番のＤＮＡ配列が挙げられる。
【００９９】α−アクチニン月号性タンパク質をコード
する塩基配列としては、例えば、配列飯盒１の３７〜１
６５６番、４３〜４４１番、４４２〜１６５６番、およ
び４４２〜６０３番のＤＮＡ配列が挙げられる。
【０１００】ＰＫＮ触媒領域結合性タンパク質をコード
する塩基配列としては、例えば、配列番号１の３７〜１
６５６番および３７〜１４５８番のＤＮＡ配列が挙げら
れる。ＰＫＮプロテインキナーゼ活性阻害ペプチドをコ
ードする塩基配列としては、例えば、配列番号１の１５
１〜１９５番のＤＮＡ配列が挙げられる。
【０１０１】ベクターおよび形質転換された宿主細胞 本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、宿主
細胞内で複製可能でかつその塩基配列がコードするタン
パク質を発現可能な状態で含んでなるベクターが提供さ
れる。更に、本発明によれば、このベクターによって形
質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクタ
ー系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合
タンパク質発現系などを用いることができる。融合タン
パク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトース結合タンパ
ク質）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラー
ゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）
・リピート、ｍｙｃ、Ｆａｓ等を用いたものが挙げられ
る。
【０１０２】ベクターとしては、プラスミドベクター
（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞動物細胞等での発
現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイ
ウイルスベクター、ＨＩＶベクター）、リポソームベク
ター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等が
挙げられる。
【０１０３】本発明によるベクターは、これを実際に宿
主細胞に導入して所望のアミノ酸配列を発現させるため
には、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を
制御する配列や微生物または動物培養細胞等を選択する
ための遺伝子マーカー等を含んでいてもよい。また、こ
のベクターは、本発明による塩基配列を反復した形（例
えば、タンデム）で含んでいてもよい。これらは常法に
従いベクターに存在させてよく、このベクターによる微
生物または動物培養細胞等の形質転換の方法も、この分
野で慣用されているものを用いることができる。
【０１０４】本発明によるベクター構築の手順および方
法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いる
ことができる。また、宿主細胞としては、例えば、大腸
菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、
リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、腫瘍
細胞等）が挙げられる。
【０１０５】上記形質転換された宿主細胞を適当な培地
で培養し、その培養物から上記本発明によるタンパク質
またはペプチドを得ることができる。従って、本発明の
別の面によれば、本発明によるタンパク質またはペプチ
ドの製造法が提供される。形質転換された宿主細胞の培
養およびその条件は、使用する細胞についてのそれと本
質的に同様であってよい。また、培養液からの本発明に
よるタンパク質等の回収、精製も常法に従って行うこと
ができる。
【０１０６】形質転換される細胞が例えばガン患者体内
のガン細胞（例えば、白血病細胞、消化器ガン細胞、肺
ガン細胞、スイ臓ガン細胞、卵巣ガン細胞、子宮ガン細
胞、メラノーマ細胞、脳腫腸細胞等）であるときは、そ
の前記の本発明による塩基配列を含むベクターをヒトを
含む生体内のガン細胞に適当な方法によって導入するこ
とによって、本発明によるタンパク質またはペプチドを
発現させることにより、悪性腫瘍等について遺伝子治療
を行うことができる。
【０１０７】例えば、本発明による活性型Ｒｈｏタンパ
ク質結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有さ
ないＰＫＮの改変アミノ酸配列、あるいはＰＫＮと活性
型Ｒｈｏタンパク質との結合を阻害するＰＫＮの改変ア
ミノ酸配列がヒトを含む生体内で発現されることによ
り、活性型Ｒｈｏタンパク質がこれに結合（ＰＫＮと活
性型Ｒｈｏタンパク質との結合を阻害）し、その結果と
して活性型Ｒｈｏタンパク質からＰＫＮへのシグナル伝
達が遮断され、Ｒｈｏタンパク質が関与する腫瘍の形成
または転移を抑制できると考えられる。
【０１０８】また、細胞骨格タンパク質結合性タンパク
質、すなわち中間径フィラメント結合性タンパク質およ
びα−アクチニン結合性タンパク質は、それぞれ、ＰＫ
Ｎから中間径フィラメントおよびα−アクチニンへのシ
グナル伝達を遮断することができ、プロテインキナーゼ
Ｎ触媒領域結合性タンパク質またはＰＫＮプロテインキ
ナーゼ活性阻害ペプチドはＰＫＮのリン酸化反応を阻害
することができる。後述するようにＲｈｏタンパク質は
腫瘍形成または転移に密接に関わっていることから、そ
の下流のシグナル伝達を司るＰＫＮ、さらにその下流の
シグナル伝達を司る細胞骨格タンパク質も腫瘍形成また
は転移に密接に関わっていると考えられる。従って、こ
れらのタンパク質をヒトを含む生体内で発現させること
によりＲｈｏタンパク質が関与する腫瘍の形成または転
移を抑制できると考えられる。遺伝子治療用のベクター
については、高久史磨監修の実験医学（増刊号）第１２
巻、第１５号「遺伝子治療の最前線」（１９９４年）を
参照できる。
【０１０９】用途／医薬組成物 前記のように本発明による活性型Ｒｈｏタンパク質結合
性タンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質と結合するこ
とにより（ＰＫＮと活性型Ｒｈｏタンパク質との結合を
阻害することにより）、活性型Ｒｈｏタンパク質からＰ
ＫＮへのシグナル伝達を遮断できると考えられる。ま
た、中間フィラメント結合性タンパク質およびα−アク
チニン結合性タンパク質は、ＰＫＮの調節領域と結合す
ることにより、それぞれＰＫＮから中間径フィラメント
およびα−アクチニンへのシグナル伝達を遮断できると
考えられる。更に、ＰＫＮ触媒領域結合性タンパク質お
よびＰＫＮプロテインキナーゼ活性阻害ペプチドは、Ｐ
ＫＮの触媒領域と結合することにより、ＰＫＮのリン酸
化反応を阻害できる。
【０１１０】一方、本発明による活性型Ｒｈｏタンパク
質結合性タンパク質は、ＰＫＮの細胞質から核への移行
を阻害する（後記実施例参照）ことからＲｈｏタンパク
質によるガン遺伝子転写活性を抑制し、従って腫瘍形成
を阻害できると考えられる。具体的には、以下の通りで
ある。
【０１１１】まず、前掲 Hill, C. S. et al. によれ
ば、リゾホスファチジル酸、血清、およびストレス（例
えば、亜ヒ酸塩および浸透圧ショック）により、ＳＲＦ
によるＳＲＥ活性化を介してｃ−ｆｏｓ転写が調節され
るが、この際に機能的なＲｈｏタンパク質が必要とされ
る。このことより、Ｒｈｏタンパク質の下流に位置し、
細胞核へのシグナル伝達を担う未知の経路が示唆され
た。
【０１１２】一方、本発明者らによって、ＰＫＮはＲｈ
ｏタンパク質の標的タンパク質であること（例えば、実
施例１および２）、およびヒートショック、亜ヒ酸ナト
リウムまたは血清飢餓によってＰＫＮの細胞内分布が細
胞質から核へシフトすることが明らかとなった（実施例
１９〜２１）。また、ＰＫＮ−ＰＫ- が過剰に発現され
た場合は、内在性の野生型ＰＫＮさえも核移行しなくな
る（実施例２２）。
【０１１３】従って、キナーゼが不活性化された活性型
Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質またはＰＫＮプロテ
インキナーゼ阻害ペプチドを、ＰＫＮの「ドミナント・
ネガティブ・インヒビター」として使用できる。即ち、
キナーゼ活性またはキナーゼドメインが不活性化された
または欠失した活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク
質またはＰＫＮプロテインキナーゼ阻害ペプチドを細胞
内に過剰発現させることによって、ＰＫＮ上流で働くシ
グナル伝達分子を中和させることができ、その結果、内
在性の野生型ＰＫＮが関与するシグナル伝達（細胞骨格
や核内へのシグナル伝達）を遮断できる。この結果、Ｒ
ｈｏによるガン遺伝子の転写活性化が抑制できると考え
られる。
【０１１４】従って、本発明によるタンパク質は、腫瘍
の形成または転移を抑制するのに有効であると考えられ
る。従って、活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質
およびＰＫＮプロテインキナーゼ活性阻害ペプチドは、
Ｒｈｏタンパク質が関与する（すなわち、Ｒｈｏタンパ
ク質を経由するシグナルの伝達による）腫瘍形成または
転移の抑制剤（以下「腫瘍形成等抑制剤」という）とし
て用いることができる。
【０１１５】ここで、腫瘍形成および転移としては、Ｒ
ｈｏが関与する腫瘍の形成、他の低分子量Ｇタンパク質
（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２、Ｒａｌ等）が
関与する腫瘍の形成、低分子量Ｇタンパク質のＧＤＰ／
ＧＴＰ交換タンパク質（例えば、Ｄｂｌ、Ｏｓｔ等）が
関与する腫瘍の形成、リソフォスファチジン酸（ＬＰ
Ａ）が関与する腫瘍の形成、受容体型チロシンキナーゼ
（例えば、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体等）、転写制
御タンパク質（ｍｙｃ、ｐ５３等）または種々のヒト腫
瘍ウイルスが関与する腫瘍の形成等が挙げられる。
【０１１６】本発明による腫瘍形成等抑制剤は、また、
経口または非経口投与（例えば、筋注、静注、皮下投
与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など）、好ましくは
経口投与することができ、薬剤として経口または非経口
投与に適した種々の剤型で、ヒトおよびヒト以外の動物
に使用される。
【０１１７】腫瘍形成等抑制剤は、例えばその用途に応
じて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒
剤、トローチ錠などの経口剤、静注および筋注などの注
射剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などのいず
れかの製剤形態に調製することができる。これらの各種
製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、
湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝
剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化
剤、安定化剤などを用いて常法により製造することがで
きる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば
乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネ
シウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン
酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチル
セルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレン
グリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノ
ール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウ
ム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどが挙げられ
る。
【０１１８】薬剤中における本発明のペプチド等の含有
量はその剤形に応じて異なるが、通常全組成物中約０．
１〜約５０重量％、好ましくは約１〜約２０重量％濃度
である。腫瘍形成および転移の治療のための投与量は、
用法、患者の年齢、性別、症状の程度などを考慮して適
宜決定されるが、通常成人１日当り約０．１〜約５００
ｍｇ、好ましくは約０．５〜約５０ｍｇ程度とするのが
よく、これを１日１回または数回に分けて投与すること
ができる。
【０１１９】本発明によれば、本発明によるタンパク質
またはペプチドを、腫瘍が形成されている細胞、または
その腫瘍が転移する恐れのある細胞に存在させることを
含んでなる、腫瘍形成または転移の抑制方法が提供され
る。この場合の有効投与量、投与方法、および投与形態
等は前記腫瘍形成等抑制剤に準ずることができる。
【０１２０】本発明によるタンパク質またはペプチドを
コードする塩基配列は、これを有する前記ベクターを用
いて標的細胞を形質転換し、腫瘍の形成または転移を抑
制する様な態様で用いることができる。すなわち該塩基
配列は腫瘍形成または転移抑制用遺伝子治療剤として用
いることができる。
【０１２１】スクリーニング法 本発明によれば、（１）スクリーニングの対象となる物
質を、活性型Ｒｈｏタンパク質とプロテインキナーゼＮ
または活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質とを含
むスクリーニング系に存在させ、そして
【０１２２】（２）活性型Ｒｈｏタンパク質と、プロテ
インキナーゼＮまたは活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タ
ンパク質との結合の阻害の程度を測定することを含む、
活性型Ｒｈｏタンパク質とプロテインキナーゼＮとの結
合を阻害する物質のスクリーニ９グ法が提供される。
【０１２３】ここで、「結合の阻害の程度を測定する」
方法としては、無細胞系での組換え型ＰＫＮとＧＴＰγ
Ｓ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質との結合をグルタチオ
ンセファロースビーズを用いて測定する方法、動物細胞
（細胞系）内でのＰＫＮとＲｈｏタンパク質との結合を
免疫沈降とイムノブロットとを用いて測定する方法、ツ
ー・ハイブリッド・システム（two hybrid system ）
（M.Kawabata 実験医学13,2111-2120(1995)、 A.B.Voj
etk et al.Cell 74,205-214(1993) ）、後記のようにＲ
ｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活性または活性の亢進の
阻害の程度を測定する方法が挙げられ、例えば、実施例
１、実施例４の（１）および（２）、実施例５、並びに
実施例１６〜１８に記載される方法に準じて結合の阻害
の程度を測定できる。また、本明細書において「結合の
阻害の程度を測定する」とは結合の有無の測定を含む意
味で用いられるものとする。
【０１２４】スクリーニング系は細胞系または無細胞系
のいずれであってもよく、細胞系としては、例えば、酵
母細胞、ＣＯＳ細胞、大腸菌、昆虫細胞、線虫細胞、リ
ンパ細胞、繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｂａｌｂ／
ｃ３Ｔ３細胞、Ｒａｔ−１細胞等）、ＣＨＯ細胞、血液
系細胞、および腫瘍細胞が挙げられる。スクリーニング
の対象となるものは、特に限定されないが、例えばペプ
チド、ペプチドのアナログ、微生物培養液、有機化合物
等が挙げられる。
【０１２５】本明細書において「スクリーニング」とは
「アッセイ」を含む意味で用いられるものとする。
【０１２６】本発明によれば、（１）スクリーニングの
対象となる物質を、活性型Ｒｈｏタンパク質と活性型Ｒ
ｈｏタンパク質結合性タンパク質とを含むスクリーニン
グ系に存在させ、そして（２）Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰ
ａｓｅの活性の阻害の程度を測定することを含む、Ｒｈ
ｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活性を阻害する物質のスク
リーニング法が提供される。
【０１２７】本発明によれば、また、（１）スクリーニ
ングの対象となる物質を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、
活性型Ｒｈｏタンパク質結合性タンパク質と、そしてＲ
ｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡ
Ｐ）とを含むスクリーニング系に存在させ、そして
（２）活性型Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活性また
は活性の亢進の阻害の程度を測定することを含む、Ｒｈ
ｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活性または活性の亢進を阻
害する物質のスクリーニング法が提供される。
【０１２８】「Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活性ま
たは活性の亢進の阻害の程度」を測定する方法として
は、無細胞系で、ＭＢＰ−ＰＫＮ（実施例４参照）存在
下で、［γ−32Ｐ］ＧＴＰ・ＧＳＴ−Ｒｈｏの放射能活
性の減少を測定する方法等が挙げられ、例えば、実施例
１８に記載される方法に準じてＲｈｏタンパク質ＧＴＰ
ａｓｅの活性またはその活性の亢進の阻害の程度を測定
できる。スクリーニング系およびスクリーニング系の対
象は、前記スクリーニング法と同様のものが挙げられ
る。
【０１２９】本発明によれば、また、（１）スクリーニ
ングの対象となる物質を、中間径フィラメントとプロテ
インキナーゼＮまたは中間径フィラメント結合性タンパ
ク質とを含むスクリーニング系に存在させ、そして
（２）中間径フィラメントと、プロテインキナーゼＮま
たは中間径フィラメント結合性タンパク質との結合の阻
害の程度を測定することを含む、中間径フィラメントと
プロテインキナーゼＮとの結合を阻害する物質のスクリ
ーニング法が提供される。
【０１３０】ここで、「結合の阻害の程度を測定する」
方法としては、無細胞系での組換え型プロテインキナー
ゼＮと組換え型中間径フィラメントとの結合をグルタチ
オンセファロースビーズを用いて測定する方法、酵母ツ
ー・ハイブリッド・システムを用いて測定する方法、お
よび動物細胞内での中間径フィラメントとＰＫＮとの結
合を免疫沈降とイムノブロットとを用いて測定する方法
等が挙げられ、例えば、実施例６〜８に記載される方法
に準じて結合の阻害の程度を測定できる。スクリーニン
グ系およびスクリーニングの対象は前記と同様のものが
挙げられる。
【０１３１】本発明によれば、更に、（１）スクリーニ
ングの対象となる物質を、中間径フィラメントとプロテ
インキナーゼＮまたはプロテインキナーゼ活性を有する
その改変アミノ酸配列を有するペプチドまたはその誘導
体とを含むスクリーニング系に存在させ、そして（２）
中間径フィラメントの重合の阻害の程度を測定すること
を含む、中間径フィラメントの重合を阻害する物質のス
クリーニング法が提供される。
【０１３２】ここで、「重合の阻害の程度を測定する」
方法としては、無細胞系において組換え中間径フィラメ
ントのヘッド・ロッド ドメイン同士の結合をグルタチ
オンセファロースビーズ（G-Beads ）を用いて測定する
方法等が挙げられ、例えば、実施例１０に記載される方
法に準じて重合の阻害の程度を測定できる。また、本明
細書において「重合の阻害の程度を測定する」とは、重
合の有無の測定を含む意味で用いられる。スクリーニン
グ系およびスクリーニングの対象は前記と同様のものが
挙げられる。
【０１３３】本発明によれば、（１）スクリーニングの
対象となる物質を、骨格筋型α−アクチニンとプロテイ
ンキナーゼＮまたはα−アクチニン結合性タンパク質と
を含むスクリーニング系に存在させ、そして（２）骨格
筋型α−アクチニンと、プロテインキナーゼＮまたはα
−アクチニン結合性タンパク質との結合の阻害の程度を
測定することを含む、骨格筋型α−アクチニンとプロテ
インキナーゼＮとの結合を阻害する物質のスクリーニン
グ法が提供される。
【０１３４】本発明によれば、また、（１）スクリーニ
ングの対象となる物質を、非骨格筋型α−アクチニン
と、プロテインキナーゼＮまたはα−アクチニン結合性
タンパク質と、カルシウムイオン（Ｃａ2+）とを含むス
クリーニング系に存在させ、そして（２）非骨格筋型α
−アクチニンと、プロテインキナーゼＮまたはα−アク
チニン結合性タンパク質との結合の阻害の程度を測定す
ることを含む、非骨格筋型α−アクチニンとプロテイン
キナーゼＮとの結合を阻害する物質のスクリーニング法
が提供される。
【０１３５】ここで、「結合の阻害の程度を測定する」
方法としては、無細胞系での組換え型プロテインキナー
ゼＮと組換え型α−アクチニンとの結合をグルタチオン
セファロースビーズを用いて測定する方法、酵母ツー・
ハイブリッド・システムを用いて測定する方法、および
動物細胞内でのα−アクチニンとＰＫＮとの結合を免疫
沈降とイムノブロットとを用いて測定する方法等が挙げ
られ、例えば、実施例２４〜２９に記載される方法に準
じて結合の阻害の程度を測定できる。スクリーニング系
およびスクリーニングの対象は前記と同様のものが挙げ
られる。
【０１３６】後記実施例によれば、スクリーニング系に
更にＰＩ４，５Ｐ２を存在させるとＰＫＮとα−アクチ
ニンとの結合が強固となる。従って、スクリーニングの
明確化の観点から、スクリーニング系にＰＩ４，５Ｐ２
を存在させることが好ましい。
【０１３７】本発明によれば、（１）スクリーニングの
対象となる物質を、プロテインキナーゼＮまたはプロテ
インキナーゼ活性を有するその改変アミノ酸配列を有す
るペプチドまたはその誘導体を含むスクリーニング系に
存在させ、そして（２）上記プロテインキナーゼＮのプ
ロテインキナーゼの活性の阻害の程度を測定することを
含む、プロテインキナーゼＮの活性を阻害する物質のス
クリーニング法が提供される。
【０１３８】本発明によれば、また、（１）スクリーニ
ングの対象となる物質を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、
プロテインキナーゼＮまたは活性型Ｒｈｏタンパク質結
合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有するその
改変アミノ酸配列を有するペプチドまたはその誘導体と
を含むスクリーニング系に存在させ、そして（２）上記
プロテインキナーゼＮのプロテインキナーゼの活性また
はその活性の亢進の阻害の程度を測定することを含む、
プロテインキナーゼＮの活性型Ｒｈｏタンパク質依存的
プロテインキナーゼの活性またはその活性の亢進を阻害
する物質のスクリーニング法が提供される。
【０１３９】「プロテインキナーゼの活性の阻害の程
度」または「プロテインキナーゼ活性の亢進の阻害の程
度」を測定する方法としては、プロテインキナーゼＮの
自己リン酸化活性、またはリン酸化により活性が変化す
る酵素の活性を測定する方法が挙げられ、例えば、実施
例３、実施例４の（３）、実施例９、実施例１０および
実施例１３〜１５に記載される方法に準じてプロテイン
キナーゼの活性またはその活性の亢進の阻害の程度を測
定できる。また、本明細書において「プロテインキナー
ゼの活性の阻害の程度」または「プロテインキナーゼの
活性亢進の阻害の程度」を測定するとは、プロテインキ
ナーゼの活性または活性亢進の阻害の有無の測定を含む
意味で用いられるものとする。
【０１４０】プロテインキナーゼの活性またはその活性
の亢進の阻害の程度は、ビメンチン、ニューロフィラメ
ント−Ｌ、ニューロフィラメント−Ｍ、ニューロフィラ
メント−Ｈ、ニューロフィラメントのトリプレットタン
パク質（ＮＦＬ、ＮＦＭおよびＮＦＨからなる複合
体）、αＰＫＣペプチド、δＰＫＣペプチド、配列番号
２に記載されるペプチド、カルデスモン、およびＧ−ア
クチンからなる群から選択される基質を用いて測定でき
る。スクリーニング系およびスクリーニングの対象は、
前記スクリーニング法と同様のものが挙げられる。
【０１４１】「プロテインキナーゼの活性の阻害の程
度」または「プロテインキナーゼ活性の亢進の阻害の程
度」を測定する方法としては、また、ＰＫＮの核移行を
免疫蛍光等によって測定する方法が挙げられ、実施例１
９〜２１に記載される方法に準じてプロテインキナーゼ
の活性の阻害の程度またはプロテインキナーゼ活性の亢
進の阻害の程度を測定できる。この場合、スクリーニン
グ系は細胞系（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｒａｔ−１
細胞、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞）を用いることができ
る。
【０１４２】活性型Ｒｈｏタンパク質は、前記のよう
に、腫瘍の形成、転移に密接に関わっていることが確認
されている。また、本発明により、ＰＫＮは活性型Ｒｈ
ｏタンパク質からのシグナル伝達を受け取ることが示さ
れたことにより、ＰＫＮもまた腫瘍の形成または転移に
密接にかかわっていると考えられる。従って、上記スク
リーニング法は、腫瘍形成または転移抑制物質のスクリ
ーニング法としても用いることができる。
【０１４３】
【実施例】下記例によって本発明を説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。以下、Ｒｈｏタン
パク質を単に「Ｒｈｏ」と、ＲｈｏＡタンパク質を単に
「ＲｈｏＡ」ということがある。
【０１４４】実施例１ 活性型Ｒｈｏタンパク質結合タ
ンパク質の精製 ２００ｇのウシ脳灰白質より粗膜画分を調製した。膜画
分のタンパク質を、４Ｍ ＮａＣｌを含む等量のホモジ
ェナイズ用バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ジチオス
レイトール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％シュークロ
ース）（１００ｍｌ）を添加することにより抽出した
後、抽出液をバッファーＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオ
スレイトール、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に対して透析し
た。その後、固形硫安を最終濃度が４０％飽和濃度とな
るように添加した。０−４０％硫安での沈澱物を１６ｍ
ｌのバッファーＡに溶解し、バッファーＡに対して透析
した後、１ｍｌのグルタチオン−セファロース・カラム
にかけた。素通り画分の８分の１量（２ｍｌ）を、予め
グアニン・ヌクレオチドで処理した相当するＧＳＴ−低
分子量Ｇタンパク質６ｎｍｏｌｅを含むグルタチオン−
セファロース・カラム０．２５ｍｌにかけた。２．５ｍ
ｌのバッファーＡで洗浄した後、１０ｍＭグルタチオン
を含むバッファーＡ（０．８２５ｍｌ）の添加により、
相当するＧＳＴ−低分子量Ｇタンパク質とともに結合タ
ンパク質を溶出した。分子量１２８ｋＤのタンパク質
（以下「ｐ１２８」という）を精製するため、素通り画
分を２４ｎＭのＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク
質を含むグルタチオン−セファロース・カラム１ｍｌに
かけた。ｐ１２８は、０．２ＭＮａＣｌを含むバッファ
ーＡの添加により溶出した。
【０１４５】この試料をバッファーＡに対して透析し、
バッファーＡで平衡化した０．３ｍｌのＤＥＡＥセファ
ロース・カラムにかけた。５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバ
ッファーＡ（１．５ｍｌ）で洗浄した後、タンパク質を
７５ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＡ（１．５ｍｌ）
で溶出し、０．３ｍｌずつの画分を集めた。各画分の３
０ μｌずつをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀染色によっ
て分析した。結果は図１に示される通りであった。示し
た結果は３回の独立した実験の代表例である。ｐ１２８
は分画１−３に単一のピークとして現れた。
【０１４６】ここで用いたＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質
およびＧＳＴ−Ｒａｃ１は、Shimizu, K. et al., J.Bi
ol. Chem. 269, 22917-22920 (1994) に記載の方法に従
って精製し、グアニンヌクレオチドをロードした。
【０１４７】実施例２ 活性型Ｒｈｏタンパク質に結合
するタンパク質がＰＫＮと同一であることの証明 精製ｐ１２８をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ポリビニリデ
ン・ジフルオライド・メンブレンにトランスファーし
た。ｐ１２８に相当するバンドをリジル−エンドペプチ
ダーゼ（アクロモバクター・プロテアーゼＩ）で消化し
た。結果として得られたペプチドをＣ１８カラム・クロ
マトグラフィーにより分画し、アミノ酸配列分析にかけ
て同定した。ペプチドに由来する５つの内部配列が得ら
れ、これらは配列番号１に記載のＰＫＮの配列の一部と
一致した。
【０１４８】また、抗ＰＫＮ抗体（Mukai,H.et al.,Bio
chem.Biophys.Res.Commun.204,348-356(1994) ）を用い
て、ｐ１２８のイムノブロット解析を実施したところ、
ｐ１２８と交差反応を示した。結果は図２に示される通
りであった。
【０１４９】実施例３ 活性型Ｒｈｏタンパク質に依存
的なＰＫＮキナーゼ活性 ２μＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（６００−８００ＭＢｑ／
ｍｍｏｌ）および精製ＰＫＮ（１０ｎｇのタンパク質
量）を含むキナーゼ・バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、５ ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２、０．０６％ＣＨＡＰＳ）５０μｌ中
で、４０μＭ αＰＫＣ存在下または非存在下で、キナ
ーゼ反応を実施した。３０℃で１０分間インキュベーシ
ョンした後、反応液をＳＤＳ−サンプル・バッファー中
で煮沸し、自己リン酸化反応を測定するためにＳＤＳ−
ＰＡＧＥにかけた。放射能で標識されたバンドをオート
ラジオグラフィーによって見ることができるようにし
た。キナーゼ活性を測定するために、反応液をワットマ
ンｐ８１ペーパー上にスポットした。αＰＫＣペプチド
への３２Ｐの取り込みは、シンチレーション・カウンテ
ィングにより測定した。
【０１５０】（１）ＰＫＮの自己リン酸化 様々な低分子量Ｇタンパク質（各５０ｐｍｏｌずつ）の
存在下でＰＫＮの自己リン酸化反応を測定した。結果は
図３に示される通りであった。
【０１５１】（２）αＰＫＣペプチドに対するＰＫＮキ
ナーゼ活性の活性型ＲｈｏＡタンパク質による容量依存
的な活性化 様々な容量のＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質また
はＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質の存在下
に、４０μＭのαＰＫＣペプチドを用いてキナーゼ反応
を実施した。結果は図４に示される通りであった。
【０１５２】（３）ＰＫＮのキナーゼ活性における様々
な低分子量Ｇタンパク質の効果 様々な低分子量Ｇタンパク質（５０ｐｍｏｌずつ）また
はアラキドン酸（２ｎｍｏｌ）の存在下に、４０μＭの
αＰＫＣペプチドを用いてキナーゼ反応を実施した。結
果は図５に示される通りであった。示した結果は３回の
独立した実験の代表例である。
【０１５３】実施例４ ＰＫＮと活性型Ｒｈｏタンパク
質との結合、およびインビボでＲｈｏタンパク質によっ
て誘導されるＰＫＮの自己リン酸化反応 （１）無細胞系での組換え型ＰＫＮとＧＴＰγＳ・ＧＳ
Ｔ−ＲｈｏＡタンパク質との結合 ＰＫＮのＮ末端領域は、ＰＫＮ全長ｃＤＮＡ（H.Mukai
& Y.Ono,Biochem.Biophys.Res,Commun.199,897-904(199
4)）を鋳型として、プライマー（５′−ＡＡＴＴＴＧＧ
ＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＡＧＴＧＡＧＣＣＴＣＧＣＡ−
３′および５′−ＴＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣ
ＡＴＴＧＣＴＧＴＡＧＧＴＣＴＧＧＡＴ−３′）を用い
て常法に従って、ＰＣＲ法により増幅することにより調
製した。ＰＫＮのＮ末端領域（配列番号１の７〜１５５
番のアミノ酸配列）をＭＢＰ融合タンパク質（以下、
「ＭＢＰ−ＰＫＮ」という）として発現させ、アミロー
ス樹脂（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）によ
って精製した。
【０１５４】ＭＢＰ−ＰＫＮ（０．２ｎｍｏｌ）を、
０．７５ ｎｍｏｌのＧＳＴ、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａ、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、ＧＴＰγＳ・ＧＳ
Ｔ−ＲｈｏＡＡｓｐ３８、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒａｃ、Ｇ
ＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒａｃ、ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａ
ｓまたはＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓを含む３０μ
ｌのグルタチオン−セファロース・ビーズと、１ｍｇ／
ｍｌのウシ血清アルブミンを含むバッファーＡ（０．７
５ｍｌ）中で混合した。０．２Ｍ ＮａＣｌを含む０．
１ｍｌのバッファーＡを三回添加した後、１０ｍＭグル
タチオンを含む０．１ｍｌのバッファーＡを三回添加す
ることにより、ＭＢＰ−ＰＫＮを溶出した。グルタチオ
ンで溶出された最初の各画分３０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけ、銀染色した。結果は図６に示される通りであ
った。また、配列番号１の７〜５４０番のアミノ酸配列
からなるＰＫＮのＮ末端領域をＭＢＰ融合タンパク質と
して発現させ、上記と同様の実験を行ったところ、同様
の結果が得られた。
【０１５５】（２）ＣＯＳ７細胞内におけるＰＫＮと活
性型ＲｈｏＡタンパク質との結合 ＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）内での複
合体形成アッセイのために、Mukai,H. & Ono.Y,Bioche
m.Biophys.Res.Commun.199,897-904(1994) に記載され
るように、ｐＭｈ−ＰＫＮ７およびｐＴＢ７０１−ＨＡ
−ＲｈｏＡまたはｐＴＢ７０１−ＨＡ−ＲｈｏＡ
Ｖａｌ１４をＣＯＳ７細胞へトランスフェクションし
た。４８時間後、細胞を回収し、ホモジェナイズ用のバ
ッファー（３０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
０．５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、５ｍＭ ＮａＦ、２．５μ
ｇ／ｍｌ ロイペプチン、０．０５％ ＮＰ−４０、
０．０５ＭＮａＣｌ）にけん濁した後、ダウンス・ホモ
ジェナイザーを用いてホモジェナイズした。各細胞質抽
出液より抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降した。
【０１５６】免疫沈降物中に、ＰＫＮまたはＲｈｏＡタ
ンパク質が存在をしているかどうかを調べるために、洗
浄した免疫沈降物および細胞質抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけ、抗ＰＫＮ抗体または抗ＨＡ抗体を用いて、イ
ムノブロットした。結果は図７に示される通りであっ
た。
【０１５７】（３）ＬＰＡによるＰＫＮ自己リン酸化反
応の促進 スイス３Ｔ３細胞を３５ｍｍディッシュで培養し、０．
５ｍＣｉの３２Ｐまたはチオフォスフェートで２時間標
識した。３２Ｐで標識したスイス３Ｔ３細胞をＬＰＡ
（２００ｎｇ／ｍｌ）によって１０分間刺激した。Ｒｈ
ｏタンパク質の選択的な阻害剤であるボツリヌス菌Ｃ３
酵素の影響を検討するために、Kumagai,K.et al.J.Bio
l.Chem.268,24535-24538(1993) に記載されるようにボ
ツリヌス菌Ｃ３酵素（１０μｇ／ｍｌ）で処理した。そ
の後細胞を溶解し、抗ＰＫＮ抗体を用いて免疫沈降し
た。洗浄した免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけオー
トラジオグラフィーした。結果は図８に示される通りで
あった。すなわち、ＬＡＰはスイス３Ｔ３細胞内でＰＫ
Ｎの自己リン酸化を約２倍に促進し、一方、この自己リ
ン酸化はボツリヌス菌Ｃ３酵素によって抑制された。示
した結果は３回の独立した実験の代表例である。
【０１５８】実施例５ 酵母ツー・ハイブリッド・シス
テムによるＲｈｏタンパク質とＰＫＮとの結合の測定 A.B.Vojetk et al.Cell 74,205-214（1993）に記載の方
法に準じて、野生型Ｈ−Ｒａｓ、Ｃ末端のＣＡＡＸ構造
（S.Ando et al. 実験医学11,1973-1980(1993)）を除去
した野生型ＲｈｏＡ、および変異型ＲｈｏＡＶａｌ１４
ｃＤＮＡ断片を、ｐＢＴＭ１１６ベクター（前掲A.B.Vo
jetk et al）内に導入することにより、これらとＬｅｘ
Ａを融合タンパク質として酵母細胞中で発現させるため
のベクター（それぞれ、ｐＢＴＭ１１６−ＲａｓＷＴ、
ｐＢＴＭ１１６−ＲｈｏＷＴ、ｐＢＴＭ１１６−Ｒｈｏ
Ｖａｌ１４とする）を構築し、これらを用いて酵母（Ｌ
４０株）を形質転換した。
【０１５９】また、ＰＫＮのＮ末端領域（配列番号１に
記載のアミノ酸配列の７〜１５５番の配列）のｃＤＮＡ
をｐＡＣＴベクター（クロンテック社製、MATCHMAKERラ
イブラリーキット）のＢａｍＨＩ部位内に導入すること
により、これとＧＡＬ４を融合タンパク質として酵母細
胞中で発現させるためのベクター（ｐＡＣＴＩＩＨＫ−
ＰＫＮ−Ｎとする）を構築した。この際に用いたＰＫＮ
のＮ末端領域に相当するｃＤＮＡ断片は実施例４の
（１）に記載される方法に従って得た。
【０１６０】ｐＢＴＭ１１６−ＲａｓＷＴ、ｐＢＴＭ１
１６−ＲｈｏＷＴ、ｐＢＴＭ１１６−ＲｈｏＶａｌ１４
で形質転換した酵母を、さらにｐＡＣＴＩＩＨＫ−ＰＫ
Ｎ−Ｎを用いて形質転換した。形質転換体はヒスチジン
要求性で選択した（A.B.Vojetk et al Cell 74,205-214
(1993)）。
【０１６１】その結果、図９に示したように、ＰＫＮの
Ｎ末端領域（アミノ酸配列の７〜１５５番）は、野生型
ＲｈｏＡおよび変異型ＲｈｏＡＶａｌ１４の両方に結合
することがわかった。
【０１６２】実施例６ 酵母ツー・ハイブリッド・シス
テムを使用したＰＫＮ結合タンパク質の単離 ヒトＰＫＮのＮ末端領域と結合するタンパク質を同定す
るために、酵母ツー・ハイブリッド・システムを使用し
た。キメラタンパク質としては、ヒトＰＫＮのＮ末端領
域に融合したＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン
を含んでいるものを用いた。即ち、配列番号１の１〜５
４０番のアミノ酸配列（この領域を以下「ＰＫＮＮ１」
という）をコードするＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメ
ントをベクターｐＧＢＴ９（Clontech Laboratories
社）に挿入した。このベクターはＧａｌ４のＤＮＡ結合
ドメイン（アミノ酸番号１〜１４７）とＰＫＮのＮ末端
調節領域の融合タンパク質をｃｒｉｐｐｌｅｄしたＡＤ
Ｈプロモーターにより発現される。ＴＲＰ１マーカーを
持つこのプラスミドを、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー
（Clontech Laboratories 社; 各プラスミドはＬＥＵ２
マーカーを有している）と共に酵母株ＹＧＨ１（ａ、ur
a3-52 、his3-200、ade2-101、lys2-801、trp1-901、le
u2-3、 Canr 、gal4-542、gal80-538 、LYS2::galIuas
- galItata-HIS3、URA3::galI-lacZ ）中にコトランス
フェクションした。形質転換体は、ロイシン、トリプト
ファンおよびヒスチジンを含まず１０ｍＭの３−アミノ
−１，２，４，トリアゾール（３−ＡＴ）を添加した酵
母ドロップアウト培地に播種した。
【０１６３】約１×１０６個の形質転換体を分析した。
増殖７〜１４日後に、ＨＩＳ＋コロニーについて、以下
のようにしてβ−ガラクトシダーゼ活性を調べた。コロ
ニー（または陽性コロニーに由来するパッチ）を直接プ
レートからＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ社）上に取り出し、液体窒素中で素早く凍結し（約
４０秒）、そして直ちに、β−ガラクトシダーゼアッセ
イ緩衝液（６０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、６０ｍＭ ＮａＨ
ＰＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍ
Ｍ ＤＴＴ、０．０１％ ５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａ
ｌ））中にあらかじめ浸漬しておいたＷｈａｔｍａｎ
３ＭＭフィルター上に置いた。フィルターをディッシュ
に入れ、３０℃でインキュベートした。プラスミドＤＮ
Ａを陽性コロニーから回収し、エレクトロポーレーショ
ンによって大腸菌ＨＢ１０１株中に導入した。主要な陽
性クローンは、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン−ＰＫＮ
またはＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン−ｐ５３腫瘍抑制
タンパク質と組み合わせて元の酵母宿主株に再度トラン
スフェクションした。ＰＫＮの存在下でのみマーカーを
発現したライブラリープラスミドを更に分析した。ＤＮ
Ａ配列分析により判定した結果、１６種の異なるｃＤＮ
Ａを含む８２個のプラスミドを単離した。塩基配列分析
の結果、これらのｃＤＮＡの１つはＮＦＬタンパク質の
ヘッド・ロッドドメインをコードしてることがわかっ
た。
【０１６４】実施例７ 酵母ツー・ハイブリッド・シス
テムを使用したＰＫＮと各種ＮＦ断片との結合の測定 ＰＫＮと各種ＮＦ間の結合の特異性を、ツー・ハイブリ
ッドコンストラクトであるｐＢＴＭ１１６（Vojtek, A.
B. et al., Cell, 74, 205-214 (1993)）（ｐＧＢＴ９
の代わりに）−ＰＫＮおよびｐＶＰ１６（Vojtek, A.
B. et al., Cell, 74, 205-214 (1993)）（ｐＧＡＤ１
０の代わりに）−ＮＦ、またはその逆の組み合せで、Ｌ
４０細胞中でｌａｃＺ発現能を測定することによって調
べた。その結果、下記に記載するように、ＰＫＮのＮ末
領域は、ＮＦの各サブユニット（ＮＦＬ、ＮＦＭ、ＮＦ
Ｈ）のヘッド・ロッドドメイン領域に結合することが明
かとなった。本発明者らが使用したＮＦの各サブユニッ
トの融合遺伝子の構造は図１０に示される通りであっ
た。
【０１６５】酵母発現ベクターは下記のようにして調製
した。ＶＰ１６転写活性化ドメイン−ヒトＮＦＬヘッド
・ロッドドメイン酵母発現用ベクターｐＶＰ／ＮＦＬ＃
２１は、ツー・ハイブリッドスクリーニングによって最
初に単離されたライブラリープラスミド＃２１のＥｃｏ
ＲＩインサート（アミノ酸番号１〜３４９）をｐＶＰ１
６（Vojtek, A. B. et al., Cell, 74, 205-214 (199
3)）中にサブクローニングすることによって作製した。
ＶＰ１６転写活性化ドメイン−ＮＦＬおよびＮＦＨのテ
イルドメイン、またはＶＰ１６転写活性化ドメイン−Ｎ
ＦＭのヘッド・ロッドおよびテイルドメインの酵母発現
用ベクターは、それぞれｐＧＳＴ／ＮＦＬｔ、ｐＧＳＴ
／ＮＦＨｔ、ｐＧＳＴ／ＮＦＭｈｒあるいはｐＧＳＴ／
ＮＦＭｔ（実施例８に記載）のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩイ
ンサートをｐＶＰ１６中にインフレームでサブクローニ
ングすることによって構築した（それぞれｐＶＰ／ＮＦ
Ｌｔ、ｐＶＰ／ＮＦＨｔ、ｐＶＰ／ＮＦＭｈｒ、ｐＶＰ
／ＮＦＭｔと呼ぶ）。ＶＰ１６−全長ＮＦＨ融合タンパ
ク質の発現用ベクターｐＶＰ／ＮＦＨｆは、ｐＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫベクター（Stratagene社）中
にＮＦＨの全長コード領域を含むプラスミド、ｐＢＨを
ＢｇｌＩＩで分解し、全長ｃＤＮＡインサートをｐＶＰ
１６にサブクローンした。ＶＰ１６−ＮＦＨヘッド・ロ
ッドドメイン融合タンパク質の発現用ベクターｐＶＰ／
ＮＦＨｈｒは、ｐＶＰ／ＮＦＨｆをＴｔｈ１１１ＩとＥ
ｃｏＲＩで消化後末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼでフ
ィル・インし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでこれらを結合さ
せて作製した。この操作によって、ＮＦＨのテイルドメ
インをコードするＴｔｈ１１１Ｉ部位のＤＮＡ配列Ｃ末
端が除去された。ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン−ＮＦ
Ｌヘッド・ロッドドメイン、またはＬｅｘＡ ＤＮＡ結
合ドメイン−ＮＦＬテイルドメインの酵母発現用ベクタ
ー ｐＢＴＭ／ＮＦＬ＃２１またはｐＢＴＭ／ＮＦＬｔ
は、ｐＶＰ１６の代わりにｐＢＴＭ１１６（Vojtek, A.
B. et al., Cell, 74, 205-214 (1993)）を使用したこ
とを除いて上記と同様に作製した。ＬｅｘＡ−、または
ＶＰ16−ＰＫＮＮ１発現用ベクターであるｐＢＴＭ／ま
たはｐＶＰ／ＰＫＮＮ１は、ヒトＰＫＮのＥｃｏＲＩ／
ＢａｍＨＩフラグメント（配列番号１の１〜５４０番の
アミノ酸配列に相当）をｐＢＴＭ１１６またはｐＶＰ１
６にサブクローニングして構築した。ＬｅｘＡ−または
ＶＰ１６−ＰＫＮＣ末端領域（配列番号１の５１１〜９
４２番のアミノ酸配列、この領域は、以下「ＰＫＮＣ
１」という）発現用ベクターｐＢＴＭ／またはｐＶＰ／
ＰＫＮＣ１は、ヒトＰＫＮのＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩフラ
グメントをｐＢＴＭ１１６またはｐＶＰ１６にサブクロ
ーニングすることによって構築した。
【０１６６】図１１（Ａ）は、ＰＫＮのＮ末端領域とＮ
ＦＬのヘッド・ロッドドメイン間の特異的結合を示して
いる。ＰＫＮのＮ末端領域が、ＮＦＬと同様にＮＦＭや
ＮＦＨと結合するかどうかを調べるために、ＮＦＭおよ
びＮＦＨのヘッド・ロッドドメインに相当する領域をｐ
ＶＰ１６にライゲートさせ、ｌａｃＺ発現をツー・ハイ
ブリッド・システムで測定した。その結果、ＰＫＮのＮ
末端領域はＮＦサブユニットの各ヘッド・ロッドドメイ
ンに結合した（図１１（Ｂ））。更にツー・ハイブリッ
ド・システムでは、様々な組織に普遍的に発現している
中間径フィラメントのメンバーであるビメンチンのヘッ
ド・ロッドドメインとも結合した（データ省略）。
【０１６７】実施例８ インビトロで翻訳されたＰＫＮ
とＧＳＴ−ＮＦの各サブユニット融合タンパク質との結
合の測定 本発明者らはまた、ＰＫＮとＮＦ間の結合を更に調べる
ために、下記に記載の方法に従って、インビトロ・トラ
ンスレーションにより作製したＰＫＮがＧＳＴ−ＮＦ
Ｌ、ＧＳＴ−ＮＦＭ、ＧＳＴ−ＮＦＨ、またはＧＳＴと
結合するかどうかについてインビトロ結合アッセイでテ
ストした。
【０１６８】（１）インビトロ翻訳によるＰＫＮの調製 インビトロ転写用部分ヒトＰＫＮを次のようにして作製
した; ＰＫＮのＮ末端領域（配列番号１の１〜４７４番
のアミノ酸配列、この領域は、以下「ＰＫＮＮ２」とい
う）発現用ベクターｐＰＫＮＮ２は、ｐｈＰＫＮ−Ｈ４
（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ中にヒトＰＫＮ
ｃＤＮＡを含むプラスミド（Mukai, H. & Ono, Y., B
iochem. Biophys. Res. Commun. 199 、897 〜904 (199
4)）をＢｓｔＥＩＩで消化し、末端をＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼでフィル・イン後セルフライゲートして作製し
た。こうすることによって、ＢｓｔＥＩＩ部位（開始Ａ
ＴＧコドンから１４２５ヌクレオチド）より下流のＣ末
端アミノ酸配列を除去し、停止コドンをプラスミド配列
内に入れた。ヒトＰＫＮの触媒ドメインが保持されてい
る配列番号１の６１４〜９４２番のアミノ酸配列（この
領域を以下「ＰＫＮＣ２」という）をコードするフラグ
メントは、ＰＣＲ増幅によって作製した。発現ベクター
ｐＰＫＮＣ２は、ＰＣＲ増幅フラグメントをｐＲｃ／Ｃ
ＭＶ（Invitrogen社）中にサブクローニングすることに
よって作製した。これらのプラスミドはＸｂａＩで切断
して線状化し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してｃ
ＲＮＡを転写させた。ＮＦＬ用には、ｐＢＬ（Nakagaw
a, T. et al., J. Cell. Biol.129 、411 〜429 (199
5)）をＨｉｎｄＩＩＩで切断して線状化し、Ｔ３ ＲＮ
Ａポリメラーゼを使用してｃＲＮＡを転写させた。イン
ビトロ翻訳用には、これらのｃＲＮＡを［３５Ｓ］メチ
オニンの存在下でウサギ赤芽球ライセート（Promega
社）中で翻訳させた。
【０１６９】（２）ＧＳＴ融合タンパク質の調製 ＧＳＴ−ＮＦＬ＃２１（ヒトＮＦＬの１〜３４９番のア
ミノ酸配列）発現用ベクターｐＧＳＴ／ＮＦＬ＃２１
は、プラスミド＃２１中のＥｃｏＲＩインサートをｐＧ
ＥＸ４Ｔベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ社）中にサブクローニングすることによって作製し
た。ＧＳＴ−ＮＦＬｄｅｌＡ（ヒトＮＦＬの１〜１７５
番および３３５〜３４９番のアミノ酸配列）発現用ベク
ターｐＧＳＴ／ＮＦＬｄｅｌＡは、ｐＧＳＴ／ＮＦＬ＃
２１をＰｓｔＩで消化して４８０ｂｐフラグメントを除
去し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでセルフライゲートさせて
作製した。ＧＳＴ−ＮＦＬｄｅｌＢ（ヒトＮＦＬの２４
５〜３４９番のアミノ酸配列）発現用ベクターｐＧＳＴ
／ＮＦＬｄｅｌＢは、ｐＧＳＴ／ＮＦＬ＃２１のＢｇｌ
ＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＸ４Ｔベクター
中にサブクローニングすることによって作製した。ＧＳ
Ｔ−ＮＦＬテイルドメイン融合タンパク質発現用ベクタ
ーｐＧＳＴ／ＮＦＬｔは、ｐＢＬの約７００ｂｐのＫｐ
ｎＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＸ４Ｔベクター
中にサブクローニングすることによって作製した。ＧＳ
Ｔ−ＮＦＭヘッド・ロッドドメイン（ヒトＮＦＭの１〜
４１１アミノ酸）融合タンパク質発現用ベクターｐＧＳ
Ｔ／ＮＦＭｈｒは、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーから
ＰＣＲ増幅し、これをｐＧＥＸ４Ｔベクター中にサブク
ローニングすることによって作製した。ＧＳＴ−全長Ｎ
ＦＬ発現用ベクターｐＧＳＴ／ＮＦＬｆは、ｐＢＬのＢ
ａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩインサートを、ｐＧＥＸ４Ｔベク
ター中にサブクローニングすることによって構築した。
ＧＳＴ−ＮＦＭテイルドメイン融合タンパク質発現用ベ
クター ｐＧＳＴ／ＮＦＭt は、ｐＢＭ（Nakagawa, T.
et al., J. Cell. Biol. 129 、411 〜429 (1995)）の
約１．０ｋｂｐのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、
ｐＧＥＸ４Ｔベクターにサブクローニングすることによ
って構築した。ＧＳＴ−全長ＮＦＨ融合タンパク質発現
用ベクター ｐＧＳＴ／ＮＦＨｆは、ｐＢＨ（Nakagaw
a, T. et al., J. Cell. Biol. 129 、411 〜429 (199
5)）をＢｇｌＩＩで消化後挿入フラグメントをｐＧＥＸ
４ＴのＢａｍＨＩ制限部位中にサブクローニングした。
ＧＳＴ−ＮＦＨヘッド・ロッドドメイン融合タンパク質
発現用ベクターｐＧＳＴ／ＮＦＨｈｒは、ｐＧＳＴ／Ｎ
ＦＨｆを、Ｔｔｈ１１１ＩとＥｃｏＲＩで消化し、末端
をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼでフィル・インした後、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼでそれらを一緒にライゲートするこ
とによって構築した。このようにして、ＮＦＨのテイル
ドメインにあるＴｔｈ１１１Ｉ部位以後のＣ末端ＤＮＡ
配列を除去した。ＧＳＴ−ＮＦＨテイルドメイン融合タ
ンパク質発現用ベクターｐＧＳＴ／ＮＦＨｔは、ｐＢＨ
をＴｔｈ１１１ＩとＢｇｌＩＩで消化した後、その末端
をフィル・インした約２ｋｂｐのフラグメントをｐＧＥ
Ｘ４Ｔ中にサブクローニングすることによって作製し
た。
【０１７０】ＧＳＴまたはＧＳＴ融合タンパク質の発現
は０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。細胞を５，
０００×ｇで５分間遠心し、得られたペレットを、１％
のトリトンＸ−１００を含み１Ｍ尿素を含むかまたは含
まないＧＳＴ溶解緩衝液（５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、
ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌ ロイペ
プチン、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に再懸
濁した。細胞は超音波処理で溶解した。細胞破片を遠心
（３０，０００×ｇで１０分間）除去し、上清をグルタ
チオン−セファロース ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ社）に加えた。セファロース ４Ｂは、４
０倍のカラム容量のＧＳＴ溶解緩衝液で洗浄した。ＧＳ
ＴおよびＧＳＴ融合タンパク質は、１Ｍ尿素を含むまた
は含まないＧＳＴ溶出緩衝液（１００ｍＭ トリス／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ グルタチオン、１２０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１
μｇ／ｍｌ ロイペプチン）で溶出した。溶出物は、１
ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴおよび０．１μｇ／ｍｌ
ロイペプチンを含む１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ
８．８）で一晩透析した。
【０１７１】（３）インビトロ結合実験 インビトロＮＦ結合実験用に、インビトロ・トランスレ
ーションにより作製した２．５μｌのＰＫＮＮ２または
ＰＫＮＣ２を、４００μｌのＧＳＴ結合緩衝液（２０ｍ
Ｍ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＤＴ
Ｔ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％トリトン−Ｘ１０
０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌロイペプチン）中
でＧＳＴ−ＮＦ融合タンパク質（各５μｇ）、またはＧ
ＳＴ（２５μｇ）と混合し、４℃で１時間インキュベー
トした。次に、非特異的な結合を阻害するために、１０
ｍｇ／ｍｌの大腸菌抽出物で予め処理した２５μｌのグ
ルタチオン−セファロース ４Ｂを加え、その後４℃で
更に３０分間回転しながら結合反応を行った。次にグル
タチオン−セファロース ４Ｂを、０．５Ｍ ＮａＣｌ
および０．５％トリトン−Ｘ１００を含むＧＳＴ洗浄緩
衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍ
Ｍ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌ ロイペ
プチン）中で３回洗浄後ＧＳＴ洗浄緩衝液で更に洗浄し
た。結合タンパク質をＧＳＴ溶出緩衝液で溶出して、１
０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。結合反応は、
ＦＵＪＩ ＢＡＳ１０００バイオイメージングアナライ
ザーで定量した。
【０１７２】その結果は図１２で示すように、インビト
ロ結合アッセイでは、ＰＫＮのＮ末端領域はＮＦＬのヘ
ッド・ロッドドメインと結合するがＰＫＮのＣ末端触媒
ドメインとＮＦＬのヘッド・ロッドドメインとの結合は
殆ど観察されなかった。また、インビトロで翻訳された
ＰＫＮとＧＳＴ−ＮＦの各サブユニット融合タンパク質
との結合能も調べた。その結果、ＰＫＮがインビトロで
ＮＦの各サブユニットとヘッド・ロッドドメインで直接
結合することを見いだした（図１３）。
【０１７３】実施例４および５に示したように、Ｒｈｏ
タンパク質はＰＫＮのＮ末端領域（配列番号１の７〜１
５５番のアミノ酸配列）と結合する。一方ＮＦのヘッド
・ロッドメインはＰＫＮのＮ末端調節領域（配列番号１
〜５４０または１〜４７４）とが結合する。そこで、Ｎ
Ｆのヘッド・ロッドドメインはＰＫＮのＲｈｏタンパク
質結合ドメインとの結合に関して、Ｒｈｏタンパク質と
競合するという可能性が考えられる。このことを調べる
ために、インビトロ結合アッセイで、ＰＫＮのＮ末端領
域（配列番号１の１〜５４０番のアミノ酸配列）との結
合に関してＲｈｏＡタンパク質とＮＦＬが競合するかど
うかを検討した。その結果、ＰＫＮのＮ末端領域との結
合に関して、バクテリアで合成したＮＦＬはバクテリア
で合成されたＲｈｏＡタンパク質と競合しなかった（デ
ータは省略）。このことから、ＰＫＮのＮ末端調節領域
内のＮＦ結合領域は、Ｒｈｏタンパク質結合領域（配列
番号１の３３〜１１１番のアミノ酸配列）（実施例１
６）とは異なる領域に存在することが明かとなった。即
ち、ＮＦ結合領域は配列番号１の１〜３２番または１１
２〜５４０番のアミノ酸配列に含まれると推定された。
更に前述のよう配列番号１〜４７４番のアミノ酸配列も
ＮＦと結合することから、ＮＦ結合領域は配列番号１の
１〜３２番または１１２〜４７４番のアミノ酸配列に含
まれると推定された。
【０１７４】実施例９ ＰＫＮによるＮＦのリン酸化 （１）ＰＫＮによる天然ＮＦのリン酸化 ＰＫＮによるＮＦの各サブユニットのリン酸化能を調べ
るために、脊髄からＮＦを精製し、ＰＫＮによるインビ
トロでのリン酸化反応に供した。ウシ脊髄からの天然の
ＮＦの調製は、Hisanaga, S. & Hirokawa, N., J. Mol.
Biol. 202、297 〜305 (1988)に記載の方法に従って実
施した。キナ−ゼアッセイは以下に記載の方法に従って
実施した。
【０１７５】脊髄の可溶性細胞質抽出物または精製ＮＦ
タンパク質を５分間沸騰して、内在性プロテインキナー
ゼ活性を不活化した後、被リン酸化基質として使用し
た。ＮＦのリン酸化反応は、２０ｍＭ トリス／ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００μＭ Ａ
ＴＰ、１８５ｋＢｑの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、ＮＦ各サ
ブユニット、ラット精巣から得た２０ｎｇ／ｍｌの精製
ＰＫＮ、４０μＭのアラキドン酸を含むかまたは含まな
いアッセイ混合物中で、３０℃にて各実験で示したよう
にして実施した。反応は、等量のＬａｅｍｌｉのサンプ
ル・バッファーを添加して種々の反応時間で終了させ、
７％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲルは真空下で乾
燥後、ＢＡＳ１０００バイオイメージングアナライザー
にかけた。ＮＦタンパク質の脱リン酸化反応は、子ウシ
腸アルカリホスファターゼを用いて、Carden, M.J. et
al., J. Biol. Chem. 260 、9805〜9817 (1985) に記載
された方法に従って実施し、５分間沸騰して酵素反応を
停止した。結果は図１４〜１８に示されるとおりであっ
た。ＰＫＮは３つのＮＦサブユニットを全て効率的にリ
ン酸化した。
【０１７６】ＰＫＮによる各サブユニットのリン酸化の
初速度は、アラキドン酸の存在下では非存在下よりも約
５〜１０倍高かった（図１４）。また、アラキドン酸の
存在下では、ＮＦサブユニットへのリン酸の取り込みは
反応開始後約６０分で最大値に達し、その後１２０分ま
でプラトー状態で持続した（図１５および図１６）。精
製したＰＫＮは希釈状態で不安定であるが、アラキドン
酸の非存在下でリン酸化レベルが６０分から１２０分ま
ででそれ程減少しなかった（データは省略）ので、リン
酸化速度の低下がＰＫＮの不活性化によるとは思われな
かった。本実験でイメージクオントによって予測する
と、タンパク質のサブユニット１ｍｏｌ当たりのＰＫＮ
による最大リン酸化の程度は、それぞれ約２ｍｏｌ／Ｎ
ＦＨ１ｍｏｌ、約６ｍｏｌ／ＮＦＭ１ｍｏｌおよび約１
ｍｏｌ／ＮＦＬ１ｍｏｌであった。インビボで最も強く
放射標識されるサブユニットであることが報告されてい
るＮＦＨは（Sihag, R.K. & Nixon, R.A., J. Biol. Ch
em. 264 、457 〜464 (1989)）、インビトロではＮＦＭ
より基質としては劣っていた。
【０１７７】このアッセイでは、ＮＦＨとＮＦＭは既に
一部がリン酸化されていたので、ＰＫＮによる被リン酸
化部位がマスクされている可能性もある。そこで、酵素
的に脱リン酸化したＮＦを使用して、他の被リン酸化部
位が存在するかを調べた。図１５に示したように、ＮＦ
ＨとＮＦＭの脱リン酸化に伴って電気泳動移動度が変化
した（Carden, M.J. et al., J. Biol. Chem. 260 、98
05〜9817 (1985) ）。アルカリホスファターゼでウシＮ
Ｆを脱リン酸化してもＰＫＮによるＮＦＨやＮＦＭサブ
ユニットのリン酸化に有意の差が見られなかったことか
ら、天然ＮＦがＰＫＮによるリン酸化を受け易い部位を
含んでいることが示唆された（図１５および１６）。
【０１７８】（２）ＰＫＮによる組換え型ＮＦのリン酸
化 ＰＫＮによるＮＦの被リン酸化部位が含まれる領域を同
定するために、バクテリアで合成したＧＳＴ−ＮＦの各
サブユニットのヘッド・ロッドドメインおよびテールド
メインを調製（実施例８）し、上記に記載の方法に従っ
て、インビトロでのリン酸化アッセイに供した。その結
果、図１７に示したように、３２Ｐは各ＧＳＴ−ＮＦの
ヘッド・ロッドドメインに、ＮＦＨ：ＮＦＭ：ＮＦＬに
対して３：１０：２の割合で取り込まれた。ＧＳＴ−各
サブユニットのテイルドメインは全く標識されなかっ
た。ＰＫＮはＧＳＴ−ビメンチンのヘッド・ロッドドメ
インもリン酸化した（データ省略）。この結果は、被リ
ン酸化部位が専らこれら中間径フィラメントのヘッド・
ロッドドメインに存在していることを示している。
【０１７９】実施例１０ インビトロでのＮＦＬのフィ
ラメント構造（重合）に与えるリン酸化の影響 ＮＦＬサブユニットがＮＦの「中核」を形成しているこ
とは広く受け入れられており、ＮＦＬが最初に会合しそ
して、その後ＮＦＭおよびＮＦＨサブユニットが共会合
あるいは重合の骨格やシグナルを供給することが示唆さ
れている。ＰＫＡやＰＫＣによるＮＦＬのリン酸化は、
ＮＦＬの重合を阻害し、フィラメントを脱重合すること
がインビトロで示されている（Gonda, Y. et al., Bioc
hem. Biophys. Res. Commun. 167、1316〜1325 (1990);
Nakamura, Y. et al., Biochem.Biophys. Res. Commu
n. 169、744 〜750 (1990); Hisanaga, S. & Hirokawa,
N., J. Mol. Biol. 211、871 〜882 (1990)）。そこ
で、ＮＦＬが重合するかどうかをインビトロ結合解析で
確認した。
【０１８０】バクテリアで産生したＧＳＴ−ＮＦＬのヘ
ッド・ロッドドメイン、またはＧＳＴ−全長ＮＦＬ融合
タンパク質をインビトロ・トランスレーションにより作
製した［３５Ｓ］標識ＮＦＬと共に、１ｍＭのＭｇＣｌ
２を含んだｐＨ８．５の緩衝液中で混合し、次いで反応
混合液のｐＨを７．２に調整して３５℃で１時間インキ
ュベートした。十分に洗浄した後、ビーズに結合したタ
ンパク質をオートラジオグラフィーで分析した。その結
果、図１８に示されるように、ＮＦＬの重合が検出され
た（レーン６および８）。
【０１８１】次に、このアッセイ系でＰＫＮによるＮＦ
Ｌのリン酸化がＮＦＬの重合を阻害するかどうかを調べ
た。ＧＳＴ−ＮＦＬのヘッド・ロッドドメインまたはＧ
ＳＴ−全長ＮＦＬをＰＫＮでリン酸化した後、反応混合
液に加え、インビトロ・トランスレーションにより作製
したＮＦＬと混合した。より具体的な方法は下記に記載
される通りである。
【０１８２】インビトロＮＦ重合実験用には、バクテリ
アで合成したＧＳＴ−ＮＦＬ、ＧＳＴ−ＮＦＬ＃２１の
リン酸化または非リン酸化タンパク質各５μｇを１ｍＭ
ＭｇＣｌ２、６０ｎｇＰＫＮ、１００μＭのＡＴＰ存
在下または非存在下で３０℃で２時間インキュベーショ
ンして調製した。インビトロ・トランスレーションによ
り作製したＮＦＬは、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む脱重合
緩衝液（２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン）中で上記混
合物または２５μｇのＧＳＴと共にインキュベートし、
次いで適量の１Ｍ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．８）を加えて
反応混合物のｐＨを７．２に調整後、３５℃で１時間イ
ンキュベートした。次に、非特異的な結合を阻害するた
めに、１０ｍｇ／ｍｌの大腸菌抽出物で予め処理した２
５μｌのグルタチオン−セファロース ４Ｂを加え、そ
の後結合反応を３０分間回転しながら４℃で行った。次
にグルタチオン−セファロース ４Ｂを、０．５％のト
リトン−Ｘ１００を含む脱重合緩衝液中で２回洗浄し、
更に脱重合緩衝液で洗浄した。結合タンパク質をＧＳＴ
溶出緩衝液で溶出し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
た。結合反応物はＦＵＪＩ ＢＡＳ１０００バイオイメ
ージングアナライザーで定量した。図１８に示されるよ
うに、ＰＫＮによるリン酸化の結果、ＧＳＴ−ＮＦＬの
ヘッド・ロッドドメインまたはＧＳＴ−全長ＮＦＬとイ
ンビトロ翻訳ＮＦＬとの結合はほとんど検出されなかっ
た（レーン７および９）。このことにより、ＰＫＮによ
るＮＦＬのリン酸化がＮＦＬの重合を阻害したことが示
された。
【０１８３】実施例１１ 酵母ツー・ハイブリッド・シ
ステムによるＰＫＮのアミノ末端領域とカルボキシル末
端領域との結合の検出 触媒領域が調節領域によってマスクされている（触媒領
域と調節領域が結合する）可能性を調べるために、酵母
ツー・ハイブリッド・アッセイを実施した。このための
ツー・ハイブリッド・システムの構築は下記に記載した
様に実施した。
【０１８４】ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域とＰＫＮのアミ
ノ末端領域（配列番号１の１〜５４０番のアミノ酸配
列）との融合タンパク質を発現させるためのプラスミド
ｐＢＴＭ／ＰＫＮ−Ｎは、ヒトＰＫＮ ｃＤＮＡのＥｃ
ｏＲ１／ＢａｍＨ１フラグメントをｐＢＴＭ１１６（Wa
tanabe, G. et al., Science 271, 645-648 (1996)）中
にサブクローニングすることにより構築した。ＶＰ１６
の転写活性化領域とＰＫＮのアミノ末端領域（配列番号
１の１〜５４０番のアミノ酸配列）との融合タンパク質
を発現するためのプラスミドｐＶＰ／ＰＫＮ−Ｎは、ヒ
トＰＫＮのＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１フラグメントをｐＶ
Ｐ１６（Vojetk, A. B. et al., Cell, 74, 205-214 (1
993)）中にサブクローニングすることにより構築した。
ｐＢＴＭ／ＰＫＮ−ＣおよびｐＶＰ／ＰＫＮ−Ｃは、ヒ
トＰＫＮのカルボキシル末端領域（配列番号１の５１１
〜９４２番のアミノ酸配列）をコードするヒトＰＫＮ
ｃＤＮＡのＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、それ
ぞれｐＢＴＭ１１６およびｐＶＰ１６中にサブクローニ
ングすることにより構築した。酵母Ｌ４０細胞にＬｅｘ
Ａ ＤＮＡ結合ドメインとＰＫＮ部分断片との融合タン
パク質をコードするプラスミド（ｐＢＴＭ／ＰＫＮ−Ｎ
またはｐＢＴＭ／ＰＫＮ−Ｃ）とＶＰ１６転写活性化ド
メインとＰＫＮ部分断片との融合タンパク質をコードす
る発現プラスミド（ｐＶＰ／ＰＫＮ−ＮまたはｐＶＰ／
ＰＫＮ−Ｃ）をコトランスフェクションした。結合はフ
ィルター・リフト・アッセイによってβ−ガラクトシド
活性を測定することにより検出した（Fields, S. & Son
g, O., Nature 340, 245-246 (1989) ）。
【０１８５】その結果、図１９に示す様に、ＰＫＮのア
ミノ末端領域を発現するベクター（ｐＢＴＭ／ＰＫＮ−
ＮまたはｐＶＰ／ＰＫＮ−Ｎ）とカルボキシル末端領域
を発現するベクター（ｐＶＰ／ＰＫＮ−ＣまたはｐＢＴ
Ｍ／ＰＫＮ−Ｃ）をコトランスフェクトした酵母細胞で
は、βーグルコシダーゼが発現することが確認された
（図１９の４）および５））。即ち、ＰＫＮの調節領域
（アミノ末端領域）と触媒領域（カルボキシル末端領
域）が結合することが示された。
【０１８６】実施例１２ インビトロでのＰＫＮの調節
領域（アミノ末端領域）と触媒領域（カルボキシル末端
領域）の結合の検出 ＰＫＮの調節領域（アミノ末端領域）と触媒領域（カル
ボキシル末端領域）が結合することを確認するために、
下記に記載した方法に従って、ＧＳＴ融合タンパク質と
インビトロで翻訳した３５Ｓで標識されたタンパク質を
用いたインビトロ結合アッセイを実施した。
【０１８７】（１）インビトロでの転写と翻訳 ヒトＰＫＮ部分断片は以下のように作製した。アミノ末
端領域に相当する発現ベクターｐＰＫＮ−Ｎを、ｐｈＰ
ＫＮ−Ｈ４（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩＳＫに挿入
されたヒトＰＫＮ ｃＤＮＡ）（Mukai, H. & Ono, Y.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 199, 897-904 (199
4)）をＢｓｔＥＩＩで消化、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて両末端をフィル・インし、セルフライゲーショ
ンすることにより作製した。得られたプラスミドは配列
番号１の１〜４７４までのアミノ酸残基をコードする。
このプラスミドよりｃＤＮＡ挿入断片を切り出し、ｐＲ
ｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン社）中にクローニングし
た。ヒトＰＫＮの触媒領域を含む配列番号１の６１４〜
９４２番のアミノ酸配列をコードする断片はＰＣＲ増幅
法によって作製した。ＰＫＮのカルボキシル末端領域を
含む発現ベクターｐＰＫＮ−Ｃは、この断片をｐＲｃ／
ＣＭＶ中にサブクローニングすることにより作製した。
これらのプラスミドを、ＸｂａＩで切断することにより
直鎖状にし、ｃＲＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用
いて転写した。ｃＲＮＡは、ニワトリ赤芽球ライゼート
（プロメガ社）中で、［３５Ｓ］メチオニン存在下で翻
訳した。
【０１８８】（２）ＧＳＴ融合タンパク質の調製 ＧＳＴとＰＫＮのアミノ末端領域（配列番号１の１〜５
４０番のアミノ酸配列）との融合タンパク質を発現させ
るためのｐＧＳＴ／ＰＫＮ−Ｎは、ｐｈＰＫＮ−Ｈ４の
ＢａｍＨ１挿入断片をｐＧＥＸ４Ｔ（ファルマシア・バ
イオテク社）中にサブクローニングすることにより作製
した。ＧＳＴとＰＫＮのカルボキシル末端領域（配列番
号１の６３４〜９４２番のアミノ酸配列）との融合タン
パク質を発現させるためのｐＧＳＴ／ＰＫＮ−Ｃは、ｐ
ｈＰＫＮ−Ｈ４のＥｃｏＲＩ挿入断片をｐＧＥＸ４Ｔベ
クター中にサブクローニングすることにより作製した。
ＧＳＴまたはＧＳＴ融合タンパク質の発現は０．１ｍＭ
ＩＰＴＧで誘導した。細胞を５，０００×ｇで５分間
遠心分離し、得られたペレットを１％トリトンＸ−１０
０を含むＧＳＴリシス・バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ
／ｍｌ ロイペプチン、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭ
ＳＦ］中にリサスペンドした。細胞は音波処理によって
溶菌させた。細胞の残骸を３０，０００×ｇで１０分間
遠心分離することにより除去し、上清にグルタチオン−
セファロース４Ｂ（ファルマシア・バイオテク社）を加
えた。樹脂をカラム・ボリュームの４０倍量のＧＳＴリ
シス・バッファーで洗浄した。ＧＳＴおよびＧＳＴ融合
タンパク質をＧＳＴ溶出バッファー［１００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ グルタチオ
ン、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ
／ｍｌ ロイペプチン、１ｍＭ ＤＴＴ］で溶出した。
溶出液を１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．
１μｇ／ｍｌ ロイペプチンを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して一晩かけて透析した。
【０１８９】（３）インビトロ結合アッセイ ２．５μｌのインビトロ翻訳したＰＫＮ−ＮまたはＰＫ
Ｎ−Ｃを、５μｇのＧＳＴ−ＰＫＮ−ＮまたはＧＳＴ−
ＰＫＮ−Ｃ融合タンパク質または２５μｇのＧＳＴ単独
と、４００μｌのＧＳＴ結合バッファー［２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＤＴＴ、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ トリトンＸ−１０
０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン］
中で混合し、４℃で１時間インキュベートした。その
後、非特異的な結合を阻害するために１０ｍｇ／ｍｌの
大腸菌抽出液で前処理したグルタチオン−セファロース
４Ｂ（２５μｌ）を添加し、結合混合液を４℃で更に３
０分間ローテーションした。グルタチオン−セファロー
ス４Ｂをその後、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％ト
リトンＸ−１００を含むＧＳＴ洗浄バッファー［２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチ
ン］で３回洗浄した。その後、結合したタンパク質をＧ
ＳＴ溶出バッファーで溶出し、１０％ＳＤＳにかけた。
結合反応の定量は、ＢＡＳ１０００バイオ・イメージン
グ・アナライザー（ＦＵＪＩ）を用いて実施した。
【０１９０】その結果、ＰＫＮの調節領域（アミノ末端
領域）と触媒領域（カルボキシル末端領域）の結合は、
ＧＳＴ融合タンパク質とインビトロで翻訳した３５Ｓで
標識されたタンパク質を用いたインビトロ結合アッセイ
によっても確認された（図２０、レーン６および８）。
以上の結果より、ＰＫＮのアミノ末端の制御領域がカル
ボキシル末端の触媒領域と直接結合することが示され
た。
【０１９１】実施例１３ ＰＫＮによる［Ｓｅｒ４６］
ＰＫＮ（３９−５３）ペプチドのリン酸化 自動ペプチド合成機（アプライド・バイオシステムス
社、モデル４０３Ａ）を用いて、［Ｓｅｒ４６］ＰＫＮ
（３９−５３）ペプチド（配列番号１の３９〜５３番の
アミノ酸配列に相当するが、ＩｌｅがＳｅｒに置換され
たもの；ＲＥＲＬＲＲＥＳＲＫＥＬＫＬＫ）を合成し、
ＰＫＮによりこのペプチドがリン酸化されるかどうかに
ついて検討した。
【０１９２】キナーゼ・アッセイは下記に記載する方法
により実施した。ラット睾丸細胞質由来の精製ＰＫＮ
（Kitagawa, M. et al., Biochem. J., 310, 657-664
(1995)）１ｎｇを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ ＡＴＰ、１
８．５ｋＢｑの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、４０μＭ アラ
キドン酸、実験毎に示したリン酸受容体および阻害剤を
含む反応液（最終容量２５μｌ）中で３０℃で５分間イ
ンキュベートした。反応は酵素標品の添加によって開始
し、反応液を７５ｍＭ リン酸塩に浸したワットマンＰ
８１ろ紙にスポットすることにより停止した。リン酸受
容体中への３２Ｐの取り込みは液体シンチレーション・
カウンティングにより測定した。結果は図２１に示され
る通りであった。
【０１９３】［Ｓｅｒ４６］ＰＫＮ（３９−５３）ペプ
チドはＰＫＮの基質として機能し、そのＫｍ値は約２５
μＭ、Ｖｍａｘが４００ｎｍｏｌｅｓ／分／ｍｇタンパ
ク質であることが明らかになった。図２１では、測定さ
れたデータのダブル・レシプロカル・プロットが示され
ている。結果は、デュプリケートして行った３回の独立
した実験からのｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．である。
【０１９４】実施例１４ 合成ペプチドを用いたＰＫＮ
のプロテインキナーゼ活性の阻害 実施例１１および１２に記載した様に、ＰＫＮのアミノ
末端領域（配列番号１の１〜５４０番または１〜４７４
番のアミノ酸配列、以下「調節領域」ということがあ
る）とカルボキシル末端領域（配列番号１の５１１〜９
４２番、６１４〜９４２番または６３４〜９４２番のア
ミノ酸配列、以下「触媒領域」ということがある）は結
合するので、ＰＫＮの調節領域内に触媒領域と結合する
配列が含まれていることが示された。本実施例では、こ
の擬似基質様配列を合成し、このペプチドのプロテイン
キナーゼ阻害活性を検討した。
【０１９５】まず、以下に示すＰＫＮの基質ペプチドお
よび擬似基質様ペプチドをそれぞれ、ラットのδＰＫＣ
（Ono, Y. et al., J. Biol. Chem. 263, 6927-6932 (1
988)）およびヒトＰＫＮ（Mukai, H. & Ono, Y., Bioch
em. Biophys. Res. Commun.,199, 897-904 (1994)）の
アミノ酸配列に従って、自動ペプチド合成機（アプライ
ド・バイオシステムス社、モデル４０３Ａ）を用いて合
成した：δＰＫＣペプチド（δＰＫＣのアミノ酸１３７
〜１５３に相当するが、ＡｌａがＳｅｒに置換されたも
の；ＡＭＦＰＴＭＮＲＲＧＳＩＫＱＡＫＩ）；ＰＫＮ
（３９−５３）ペプチド（配列番号１の３９〜５３番の
アミノ酸配列に相当；ＲＥＲＬＲＲＥＩＲＫＥＬＫＬ
Ｋ）；ＰＫＮ（５４−７３）ペプチド（配列番号１の５
４〜７３番のアミノ酸配列に相当；ＥＧＡＥＮＬＫＫＡ
ＴＴＤＬＧＫＳＬＧＰＶ）。
【０１９６】プロテインキナーゼ・アッセイは、実施例
１３に記載の方法に従って実施した。ただし、ＰＫＮは
δＰＫＣペプチドを基質として、ＰＫＮ（３９−５３）
ペプチド（図２２；黒丸）またはＰＫＮ（５４−７３）
ペプチド（図２２；白丸）をインヒビターとして用いて
測定した。δＰＫＣペプチドの濃度は、δＰＫＣペプチ
ドのＫｍ濃度（１０μＭ）とした。プロテインキナーゼ
反応は、様々な濃度のＰＫＮ（３９−５３）ペプチドま
たはＰＫＮ（５４−７３）ペプチドの存在下で実施し
た。
【０１９７】また、インヒビター・ペプチドの作用の特
異性を判定するために、ＰＫＡを酵素標品としてプロテ
インキナーゼ・アッセイを実施した。実験に用いたウシ
心臓ＰＫＡの触媒サブユニットはBechtel, P. J. et a
l., J. Biol. Chem.,252,2691-2697 (1977)に記載の方
法に従って精製した。ＰＫＡのプロテインキナーゼ活性
は、Kemptide（Kemp, B. E. et al., J. Biol. Chem.,
252, 4888-4894 (1977))を基質として使用しアラキドン
酸を含まないこと以外は実施例１３に記載の条件と同一
の条件で測定した。Kemptideの濃度はKemptideのＫｍ濃
度（１６μＭ）とし、ＰＫＮ（３９−５３）ペプチドを
インヒビターとして用いて測定した（図２２；白四角
形）。キナーゼ活性は実施例１３に記載された方法に従
って決定した。
【０１９８】その結果、ＰＫＮ（３９−５３）ペプチド
はδＰＫＣペプチドのリン酸化を濃度依存的に阻害し、
そのＩＣ５０（Ｋｍ濃度の基質ペプチドのリン酸化を５
０％阻害するのに必要なインヒビター・ペプチド濃度）
は約８０μＭであった（図２２；黒丸）。
【０１９９】対照的に、ＰＫＮ（５４−７３）ペプチド
にはほとんど阻害効果が認められなかった（図２２；白
丸）。ぺプチドの特異性は、もうひとつの塩基性アミノ
酸要求性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）を用いて確認さ
れた。即ち、ＰＫＮ（３９−５３）ぺプチドは、ＰＫＡ
に対して弱い阻害活性しか示さず、そのＩＣ５０は１，
０００μＭ以上であった（図２２；白四角形）。以上の
結果から、ＰＫＮ（３９−５３）ぺプチドがＰＫＮのプ
ロテインキナーゼ活性を特異的に阻害することが示され
た。ＰＫＮ（３９−５３）ペプチドがＰＫＮの擬似基質
として作用することが示唆された。
【０２００】実施例１５ ＰＫＮのプロテインキナーゼ
活性におけるＰＫＮ（３９−５３）ペプチドの効果 ＰＫＮ（３９−５３）がＰＫＮの擬似基質として作用す
ることを確認するために、精製ＰＫＮを用いて、ＡＴＰ
濃度を１００μＭに固定し、様々な濃度（１０−８０μ
Ｍ）のδＰＫＣぺプチドを用いて、カイネティック・ア
ッセイを実施した。ＰＫＮのタンパク質キナーゼ反応は
実施例１３および１４に準じて行った。４０−８０μＭ
のＰＫＮ（３９−５３）ぺプチド存在下での結果は、図
２３（Ａ）にダブル・レシプロカル・プロットで示され
ている。阻害は競合−非競合的に起こり、Ｋｍ／Ｖｍａ
ｘ（half-maximal velocity/maximal velocityを与える
のに必要な濃度）は阻害ぺプチド濃度に対して直線的な
セカンダリー・プロットになった（図２３（Ｂ））。み
かけ上の阻害定数（Ｋｉ）がダブル・レシプロカル・プ
ロットおよびインヒビター・ぺプチド濃度に対するＫｍ
／Ｖｍａｘの直線的なセカンダリー・プロットから得ら
れ、４１μＭであった（図２３（Ｂ））。一方、阻害ぺ
プチドにより種々のＡＴＰ濃度で非競合的な阻害プロッ
トが得られたことから、阻害はＡＴＰ結合部位で起きる
のではないことが示された（データ省略）。
【０２０１】以上の結果から、ＰＫＮ（３９−５３）ペ
プチドは、この酵素の自己阻害配列として働き、その阻
害はＡＴＰと非競合的であることが示された。
【０２０２】実施例１６ 酵母ツー・ハイブリッド・シ
ステムを用いたＰＫＮのＲｈｏタンパク質結合領域の検
索 ＰＫＮとＲｈｏＡタンパク質の結合をさらに詳細に特徴
づけるために、酵母ツー・ハイブリッド・システムを用
いて検討した。ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合領域に融合させた
ヒトＰＫＮのＮ末端調節領域を、ＶＰ１６活性化領域に
融合させたＲｈｏＡタンパク質またはＲｈｏＡタンパク
質変異体とともに、酵母Ｌ４０株中に発現させた。
【０２０３】本発明に用いた部分ＰＫＮｃＤＮＡの融合
遺伝子の構築のスキームは図２５に示した通りである。
様々な長さのヒトＰＫＮをコードするｃＤＮＡ断片を、
上流のＬｅｘＡ ＤＮＡ結合領域の配列とともにｐＢＴ
Ｍ１１６ベクター（実施例７）中に、あるいは上流のＶ
Ｐ１６転写活性化領域の配列とともにｐＶＰ１６ベクタ
ー（実施例７）中に、それぞれイン・フレームで挿入し
た。ヒトＲｈｏＡ、ＲｈｏＡＶａｌ１４およびＲｈｏＡ
Ａｌａ３７をコードするｃＤＮＡ断片をそれぞれ、ｐＧ
ＥＸ−ＲｈｏＡ、ｐＧＥＸ−ＲｈｏＡＶａｌ１４および
ｐＧＥＸ−ＲｈｏＡＡｌａ３７（実施例１）を制限酵素
で消化することによって調製し、ｐＢＴＭ１１６および
ｐＶＰ１６中にクローニングした。
【０２０４】発現用プラスミドを酵母Ｌ４０細胞にトラ
ンスフェクトし、トリプトファンおよびロイシンを欠い
た半固相培地に播いた。結合は、実施例６に記載の方法
に従って、β−ガラクトシダーゼ活性を指標としたフィ
ルター・リフト・アッセイを用いて検出した。その結
果、図２４に示すように、β−ガラクトシダーゼ活性が
ＰＫＮとＲｈｏＡＶａｌ１４（ＧＴＰａｓｅ活性を示さ
ない変異体）（Ridley, A. J. & Hall,A., Cell 70, 38
9-399 (1992)）を発現した形質転換体に誘導された。
しかしながら、ＰＫＮと野生型ＲｈｏＡを発現する形質
転換体や、ＰＫＮとＲｈｏＡＡｌａ３７（エフェクター
領域変異体）（実施例３および４、Paterson, H. F. et
al., J. Cell. Biol., 111, 1001-1007 (1990) ）を発
現する形質転換体では検出されなかった。
【０２０５】Ｒｈｏファミリーのメンバーは、Ｃ末端領
域にＣＡＡＸモチーフ（Ｃはシステイン、Ａは脂肪族ア
ミノ酸、Ｘは任意のアミノ酸）を有し、この領域はゲラ
ニルゲラニル化、プロテオリシスおよびカルボキシルメ
チル化というような一連の翻訳後修飾を受けることが知
られており、この修飾はＲｈｏタンパク質が細胞膜にタ
ーゲッティングされ、活性化されるのに重要であると考
えられている（Katayama, M. et al., J. Biol. Chem.,
266, 12639-12 645 (1991) 、Adamson, P. etal., J.
Biol. Chem., 267, 20033-20038 (1992) ）。従って、
ＲｈｏＡ融合タンパク質にＣＡＡＸモチーフが存在する
と、ＲｈｏＡ融合タンパク質が核内に効率的に移行しな
いと予想され、そのためツー・ハイブリッド・システム
でＲｈｏＡ融合タンパク質とＰＫＮ融合タンパク質の結
合が検出されにくいという可能性が考えられた。そこ
で、ＲｈｏＡ融合タンパク質と細胞膜との結合を抑制
し、ＲｈｏＡ融合タンパク質の核内への移行を効率化さ
せるために、Ｃ末端の脂質修飾部位を欠失させたＲｈｏ
Ａ変異体（以下「ＣＬＶＬ−」と表わす）を用いてツー
・ハイブリッド・システムを実施した。Ｃ末端の脂質修
飾部位を欠いたヒトＲｈｏＡ（「ＲｈｏＡ ＣＬＶ
Ｌ−」と呼ぶ）に相当するｃＤＮＡは、ＰＣＲ法によっ
て調製し、ｐＢＴＭ１１６およびｐＶＰ１６中に挿入し
た。
【０２０６】その結果、ＰＫＮはＲｈｏＡ ＣＬＶＬ−
およびＲｈｏＡＶａｌ１４ＣＬＶＬ−とは結合したが、
ＲｈｏＡＡｌａ３７ＣＬＶＬ−とは結合しなかった。同
様の結果はＬｅｘＡと融合したＲｈｏＡとＶＰ１６に結
合したＰＫＮとの組み合わせでも認められた（図２
４）。このように、活性型ＲｈｏＡタンパク質とＰＫＮ
との間の特異的な結合が、ツー・ハイブリッド・システ
ムによって再確認された。また、ＲｈｏＡタンパク質の
ＣＡＡＸモチーフは、ＰＫＮとの結合に必要ないことが
示された。
【０２０７】ＰＫＮのＲｈｏＡタンパク質結合領域を同
定するために、様々な部分ＰＫＮ断片を発現するプラス
ミドをＲｈｏＡＶａｌ１４ＣＬＶＬ−とともに酵母細胞
にトランスフェクションさせた。図２５に示した様に、
ツー・ハイブリッド・システムでは、ＲｈｏＡ
Ｖａｌ１４ＣＬＶＬ−は、配列番号１の１〜５３８番、
３〜１３５番および３３〜１１１番のアミノ酸配列に相
当する領域と結合した。この結果より、Ｒｈｏタンパク
質結合領域は配列番号１の３３〜１１１番のアミノ酸配
列に存在することが示された。
【０２０８】この領域は、ＰＫＮの最初のロイシン・ジ
ッパー様モチーフ（Mukai , H. etal., Biochem. Bioph
ys. Res. Commun., 204, 348-356 (1994)、Mukai, H. &
Ono , Y., Biochem. Biophys. Res. Commun., 199, 89
7-904 (1994) ）を含む。従って、このモチーフがＰＫ
ＮとＲｈｏＡ間の結合に何らかの役割を果たすことが推
測される。
【０２０９】実施例１７ 合成ペプチドを用いたＲｈｏ
タンパク質とＰＫＮの結合の阻害 次に、インビトロ・トランスレーションによって作製し
たＰＫＮとＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（実施例１）
との結合を、以下に記載した方法に従って、ＰＫＮの様
々なＮ末端領域に相当する合成ペプチドの存在下で測定
した。
【０２１０】実施例８に記載されている方法に従って、
配列番号１の１〜４７４番のアミノ酸配列に相当するタ
ンパク質をインビトロ・トランスレーションによって作
製した。ＧＴＰγＳまたはＧＤＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ
（１５ｎＭ）を、インビトロ・トランスレーションで作
製したＰＫＮ（１．５μｌ）とともに、トータル量２０
０μｌの結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴ
Ｔ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｇ／ｍｌ ロイペプチ
ン）中で６０分間、４℃でインキュベーションした。そ
の後、非特異的な結合を阻害するために大腸菌抽出液
（１０ｍｇ／ｍｌ）を含む結合バッファー中で予めイン
キュベーションしたグルタチオン・セファロース４Ｂ
（PharmaciaB iotech 社）（４０μｌ）を加え、３０分
間、４℃でローテーションした。結合しなかったタンパ
ク質を、０．２％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０と５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む結合バッファーで４回洗浄すること
により除去し、さらに結合バッファーで２回洗浄した。
特異的に結合したタンパク質は、１０ｍＭ還元グルタチ
オンを含む結合バッファーで溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
にかけ、ゲルをオートラジオグラフィーした。
【０２１１】ＰＫＮのＲｈｏＡタンパク質結合領域とし
て期待される合成ペプチド断片は、自動ペプチド合成機
（Applied Biosystems社モデル４３１）を用いて合成し
た。合成ペプチドを用いた実験は、様々な濃度のペプチ
ドを用いて、２００μｌの結合バッファー中で実施し
た。
【０２１２】その結果、図２６に示されるように、合成
ペプチドの非存在下では、インビトロ・トランスレーシ
ョンによって作製したＰＫＮはＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｒ
ｈｏＡに特異的に結合した。配列番号１の７４〜９３番
および９４〜１１３番のアミノ酸配列に相当する合成ペ
プチド断片は、ＰＫＮのＧＴＰγＳ・ＲｈｏＡへの結合
を濃度依存的な様式で阻害した（図２７）。阻害はそれ
ぞれ３０μＭおよび１００μＭ以上の濃度のペプチドで
認められた（図２７）。
【０２１３】更に、配列番号１の８２〜１０３番のアミ
ノ酸配列に相当する合成ペプチド断片もＰＫＮのＧＴＰ
γＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡへの結合を濃度依存的な様式で
阻害した（図２８）。阻害は３μＭ以上の濃度で認めら
れた（図２８）。以上の結果より、配列番号１の７４〜
１１３番のアミノ酸配列に相当する領域、特に８２〜１
０３番のアミノ酸配列に相当する領域は、結合に重要な
役割を果たすことが示された。
【０２１４】実施例１８ Ｒｈｏタンパク質のＧＴＰａ
ｓｅ活性に及ぼすＰＫＮのＮ末端領域の影響 活性化されたＣｄｃ４２Ｈｓ関連キナーゼｐ１２０
ＡＣＫやｐ２１−（Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ）活性化キナー
ゼｐ６５ＰＡＫのような低分子量Ｇタンパク質の活性型
に結合するタンパク質キナーゼは、これらの低分子量Ｇ
タンパク質に内在的に存在し、ＧＡＰに刺激されて亢進
するＧＴＰａｓｅ活性を阻害することが知られている
（Manser, E. et al., Nature, 367, 40-46 (1994)、 M
anser, E. et al., Nature, 363, 364-367 (1993) ）。
ＲｈｏＡのＧＴＰａｓｅ活性がＰＫＮとの結合によって
影響を受けるか否かについて検討するために、予め［γ
−３２Ｐ］ＧＴＰ（１．１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、DuPont
-New England Nuclear 社）をロードしたＧＳＴ−Ｒｈ
ｏＡまたはＧＳＴ−ＲｈｏＡＶａｌ１４の結合放射能活
性を、ＰＫＮの存在下または非存在下で測定した。
【０２１５】ＧＳＴに融合したヒトＰＫＮのＮ末端領域
（ＧＳＴ−ＰＫＮ）を発現させるためのベクターは、配
列番号１の１〜５３８番のアミノ酸配列をコードするｃ
ＤＮＡ断片をｐＧＥＸベクター（Pharmacia Biotech
社）中にサブクローニングすることによって作製した。
ＧＳＴ融合タンパク質は、実施例８に記載されている方
法に従って大腸菌において発現させ、グルタチオン・セ
ファロース４Ｂを用いたアフィニティー・クロマトグラ
フィーによって精製した。ＭＢＰ−ＰＫＮは、実施例４
に記載の方法に従って調製した。
【０２１６】内因性のＧＴＰａｓｅ活性を測定するため
のアッセイは、下記に記載した方法に従って実施した。
２μＭの精製したＧＳＴ−ＲｈｏＡを５μＭの［γ−
３２Ｐ］ＧＴＰ（１．１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ）とともに
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．３％ ＣＨＡＰＳ中で、３０
℃でインキュベーションした。交換反応は、反応液を氷
上に移した後、最終濃度が１０ｍＭになるようにＭｇＣ
ｌ２を添加することにより停止した。［γ−３２Ｐ］Ｇ
ＴＰをロードしたＧＳＴ−ＲｈｏＡまたはＧＳＴ−Ｒｈ
ｏＡＶａｌ１４（０．２μＭ）を、１０ｎＭのＧＳＴ−
ＰＫＮ（アミノ酸残基１−５４０）の存在下または非存
在下で、６０μｌの加水分解用バッファー（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＧＴＰ、０．１ｍｇ／
ｍｌ ウシ血清アルブミン）中で３０℃でインキュベー
トした。反応は約２ｍｌの氷冷したバッファー（２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を添加した後、ニトロ
セルロース・フィルター（ Schleicher & Schuell 社
ＢＡ−８５、０．４５μｍポアサイズ）を用いて迅速に
ろ過することによって停止した。フィルターを同じ氷冷
バッファーでさらに３回洗浄した後、フィルター上に集
まった放射能活性を測定した。
【０２１７】ＧＡＰに刺激されたＲｈｏＡのＧＴＰａｓ
ｅ活性は、５０ｎＭのＧＳＴに融合させたｐ１２２ Ｒ
ｈｏＧＡＰ（ＧＳＴ−ＲｈｏＧＡＰ）および様々な濃度
のＭＢＰ−ＰＫＮの存在下で、１００μｌの反応混合液
（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１ｍＭ ＧＴＰ、０．０７５％ ＣＨＡＰＳ、
０．２５ｍＭ Ｌ−α−ジミリストイルホスファチジル
コリン、１００ｎＭ ［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ結合型ＧＳ
Ｔ−ＲｈｏＡ ）中で２分間、２５℃で、［γ−
３２Ｐ］ＧＴＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡの放射能活性の減少
を測定することによってアッセイした（Homma, Y. &Emo
ri, Y., EMBO J. 14, 286-291 (1995) ）。
【０２１８】その結果、ＲｈｏＡに結合したＧＴＰの半
減期は１２分であり（図２９）、ＲｈｏＡＶａｌ１４の
それは１００分であった（データ省略）。配列番号１の
１〜５３８番のアミノ酸配列とＧＳＴとの融合タンパク
質を添加したところ、ＲｈｏＡに結合したＧＴＰの半減
期は１５分以上に上昇したが、ＧＳＴの添加ではＧＴＰ
加水分解速度への影響は認められなかった。これらの結
果より、ＰＫＮのＮ末端領域にはＲｈｏＡの内在性のＧ
ＴＰａｓｅ活性を阻害する活性が存在することが示され
た。また、阻害はＰＫＮ濃度に依存的であった（図３
０）。
【０２１９】図３１に示されるように、ＭＢＰ−ＰＫＮ
は、ＧＳＴ−ＲｈｏＧＡＰによって刺激されたＧＳＴ−
ＲｈｏＡのＧＴＰａｓｅ活性を濃度依存的に阻害した。
このことから、ＰＫＮのＮ末端領域がＲｈｏＡと結合す
ることによって、ＧＡＰとＲｈｏＡの結合を阻害するこ
とが示された。
【０２２０】以上の結果から、ＰＫＮのＮ末端領域がＲ
ｈｏＡと結合することによって、ＲｈｏＡタンパク質に
内在するＧＴＰａｓｅ活性を阻害することが示された。
また、このことにより、Ｒｈｏタンパク質のＧＴＰａｓ
ｅ活性を測定することによって、ＰＫＮとＲｈｏタンパ
ク質の結合の程度を測定することができることが明らか
となった。さらに、Ｒｈｏタンパク質のＧＡＰをスクリ
ーニング系に加えることにより、ＧＴＰａｓｅ活性の測
定をより明確に実施できることが示された。
【０２２１】実施例１９ ＰＫＮの細胞内分布に対する
ヒートショックの効果（１）：イムノブロッティングを
用いた生化学的な解析 ＰＫＮと特異的に反応するポリクローナル抗血清（αＮ
２、αＣ６、およびαＦ１）を使用したイムノブロッテ
ィングを実施することにより、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｒａｔ−
１、およびＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３の細胞ライゼート中のＰ
ＫＮの量を決定した。具体的には、下記に記載の方法に
従って実施した。
【０２２２】ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、１０％ウシ血清を含
有するダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増
殖させた。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞およびＲａｔ−１細
胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＤＭＥ
Ｍ中で増殖させた。５％ＣＯ 2 を含有する加湿した３７
℃のチャンバー中で細胞をインキュベートし、サブコン
フルエント成長期の細胞を使用して実験を実施した。こ
れらの細胞よりタンパク質を抽出し、 Kitagawa, M. et
al., Biochem. J. 310, 657-664(1995)に記載された方
法に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳導
（ＰＡＧＥ）（Laemmli, U. K. Nature 227, 680-685(1
970)）およびイムノブロットを実施した。
【０２２３】イムノブロットに用いたポリクローナル抗
血清は、下記の方法に従って調製した。αＮ２は、大腸
菌内に発現させることによって得たラットＰＫＮの１〜
３９１番に相当する断片でウサギを免疫することによっ
て調製した（Mukai, H. et al., Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 204, 348-356(1994) ）。αＣ６は、大腸菌
内に発現させることによって得たラットＰＫＮのアミノ
酸８６３−９４６に相当する断片で、前掲Mukai, H. et
al.(1994)に記載された方法に従って、ウサギを免疫す
ることによって調製した。αＦ１は、Ｓｆ９細胞に発現
させることによって得たラットＰＫＮの全コーディング
領域を抗原として使用して調製した（Mukai, H. & Ono,
Y., Biochem. Biophys. Res. Commun. 199, 897-904(1
994)）。αＮ２、αＣ６、およびαＦ１のエピトープ特
異的反応は、ＰＫＮのアミノ末端およびカルボキシル末
端の抗原性領域を使用したイムノブロッティング（前掲
Mukai, H. et al. (1994) ）により確認した。ブロット
はenhanced chemiluminescence法によって検出した。
【０２２４】結果は図３２に示した通りであった。即
ち、抗血清（αＮ２、αＣ６、およびαＦ１）は、３７
℃で培養したＮＩＨ３Ｔ３、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３および
Ｒａｔ−１細胞由来のＰＫＮを特異的に認識した。細胞
をヒートショック処理（４２℃で９０分間の処理）した
場合でも、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３、および
Ｒａｔ−１細胞中のＰＫＮの全量には影響が認められな
かった（データ省略）。因みに、ヒートショックは、培
養細胞のレプリカディッシュを、５％ＣＯ2 を含有する
３７℃のインキュベーターから４２℃のインキュベータ
ーへ移すことによって実施した。移した後の培養時間を
ヒート処理時間とした。
【０２２５】次に、サイトゾル、原形質膜、および核の
それぞれの画分中のＰＫＮの分布に及ぼすヒートショッ
クの効果を検討した。各細胞画分の調製は、下記に記載
の方法に従って実施した。まず、細胞を採取し、これを
１ｍｌ バッファーＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ フェニルメチルスル
ホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍｌ ロイ
ペプチン）の中に懸濁し、ダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホ
モジェナイザー中で３０ストロークしてホモジェナイズ
した。トータルの細胞ホモジェネートのタンパク質量を
Ｐｅｔｅｒｓｏｎの方法（Peterson, G. L. Anal. Bioc
hem. 83,346-356(1977)）により決定し、等量のタンパ
ク質を５００×ｇで７分間４℃において遠心して、核ペ
レットおよびpostnuclear 画分を得た。核ペレットをバ
ッファーＡで１回洗浄した。postnuclear 画分をさらに
１００，０００×ｇで１時間、４℃で遠心分離すること
により、サイトゾル（上清）および原形質膜（ペレッ
ト）を得た。これらの上清およびペレット画分を上記に
記載された方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイム
ノブロットにかけた。
【０２２６】結果は図３３に示した通りであった。即
ち、ヒートショック未処理細胞ではサイトゾル画分に大
部分のＰＫＮが検出されたが、ヒート処理した細胞では
核画分中に検出されるＰＫＮが増加するとともに、サイ
トゾル画分中に検出されるＰＫＮは減少した。また、原
形質膜画分中に検出されるＰＫＮ量には、ヒート処理に
よっても有意な変化は観察されなかった。
【０２２７】実施例２０ ＰＫＮの細胞内分布に対する
ヒートショックの効果（２）：免疫蛍光染色を用いた細
胞生物学的な解析 次に、抗血清（αＮ２、αＣ６、およびαＦ１）を使用
することによって、ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＰＫＮの
免疫蛍光の分布を調べた。免疫蛍光は下記に記載の方法
に従って実施した。
【０２２８】カバーガラス上で増殖した細胞をリン酸塩
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％ パラホ
ルムアルデヒドにより４℃で１時間固定し、ＰＢＳです
すぎ、次いで５％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ−Ｔ
（０．０５％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ）中
において１時間ブロックした。ＰＢＳで洗浄した後、約
１０μｇ／ｍｌの各抗血清濃度となるようにＰＢＳで希
釈した抗血清溶液で、細胞を４℃で一晩インキュベート
した。その後、カバーガラスをＰＢＳ−Ｔですすぎ、フ
ルオレセインイソチオシアネート異性体Ｉ（ＦＩＴＣ）
を結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Medical and biolog
ical laboratories 社）と６０分間インキュベートし
た。カバーガラスをＰＢＳ−Ｔ、次いでＰＢＳですす
ぎ、０．１％１，４−ジアザビシクロ（２，２，２）オ
クタン（ＤＡＢＣＯ）を含有するグリセロールでマウン
トし、Ｚｅｉｓｓレーザー走査顕微鏡で観察した。
【０２２９】結果は、図３４に示した通りであった。即
ち、未処理細胞では、細胞質領域にＰＫＮが検出され
た。イムノブロッティングの結果と一致して、ヒートシ
ョック細胞ではＰＫＮの免疫蛍光の顕著な増加が核に認
められた。因みに、一次抗血清を使用しないインキュベ
ーションにより測定した非特異的蛍光は無視しうる程度
であった（データ省略）。
【０２３０】核移行がＰＫＮに特異的か否かを検討する
ために、タンパク質ホスファターゼ２Ａ（αＰＰ２Ａ）
に対する抗血清を用いて免疫蛍光を観察した。その結
果、ヒートショック細胞と未処理細胞との間で、αＰＰ
２Ａの免疫反応性の細胞内分布に差は認められなかっ
た。従って、ＰＫＮの核移行はヒートショック処理によ
る非特異的な効果のためではないことが明らかとなっ
た。図３５に、これらの現象が、Ｒａｔ−１細胞とＢａ
ｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞においても同様に観察されたことが
示されている。
【０２３１】次に、ヒートショックによるＰＫＮの核へ
の移行が可逆的かどうかについて検討した。細胞にヒー
トショックを与えた後、３７℃で４時間培養したとこ
ろ、核周囲および細胞質領域へＰＫＮの免疫蛍光が再分
布した（図３４および図３５）。このことより、ＰＫＮ
の移行は可逆的であることがわかった。また、ヒートシ
ョック処理した細胞では、ＰＫＮの免疫蛍光は核膜より
むしろ核内に存在することが、共焦点顕微鏡を用いて観
察された（図３６）。
【０２３２】実施例２１ ＰＫＮの細胞内分布への亜ヒ
酸ナトリウム、血清飢餓および紫外線照射の効果：細胞
生物学的な検討 （１）亜ヒ酸ナトリウム処理によるＰＫＮの核移行 ＰＫＮの細胞内分布が化学的ショックによっても影響を
受けるかどうかについて検討した。有毒化合物および有
毒重金属もまた、実験系においてヒートショックタンパ
ク質およびストレス応答を誘導することがわかっている
（Maytin, E. V. & Young, D. A., J. Biol. Chem. 25
8, 12718-12722(1983) ）。ヒートショックにより誘導
されるストレスと類似する細胞応答が、亜ヒ酸ナトリウ
ム処理によっても生ずることが知られている（Welch,
W. J. & Suhan, J. P., J. Cell Biol. 103, 2035-2052
(1986) ）。そこで、亜ヒ酸ナトリウムを培地に添加し
てＲａｔ−１細胞を培養し、その影響を検討した。その
結果、５０μＭ 亜ヒ酸ナトリウムによる処理によって
もＰＫＮの核移行の誘導が、顕微鏡試験で観察された
（図３７）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＢａｌｂ／ｃ３Ｔ
３細胞を８０μＭ 亜ヒ酸ナトリウムで処理した場合で
も、同様な結果が得られた（データ省略）。
【０２３３】（２）血清飢餓によるＰＫＮの核移行 さらに、血清飢餓のような他のストレスによってもＰＫ
Ｎの核移行が誘導されるか否かについて検討した。血清
飢餓は、培地を１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（脂
質フリー）を含有する無血清培地と交換することによっ
て実施した。
【０２３４】その結果、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を血清飢餓状
態とした場合でも、核へのＰＫＮの移行が観察され（図
３８）、その後１０％ ウシ胎児血清を添加したとこ
ろ、ＰＫＮは細胞質領域に徐々に移行した。ＰＫＮが非
ストレス状態で観察される細胞内分布に戻るまでに、少
なくとも４時間を要した（図３８）。
【０２３５】（３）紫外線照射によるＰＫＮの細胞内分
布 紫外線照射は実験でストレスを誘導する別の手段であ
り、哺乳動物細胞の紫外線応答はＡＰ−１およびＮＦ−
κＢにより媒介される遺伝子発現の急速かつ選択的な増
加により特徴づけられている（Devary, Y. et al., Sci
ence 261, 1442-1445(1993) 、およびDevary, Y. et a
l., Mol. Cell Biol. 11, 2804-2811(1991)）。紫外線
照射に対するストレス応答の少なくとも一部は、ＪＮＫ
／ＳＡＰＫサブファミリーおよびｐ３８／ＲＫによって
媒介されることがわかっている（Davis, R. et al., TI
BS 19, 470-473 (1994) 、およびCano, E. & Mahadeva
n, C.,TIBS 20, 117-122 (1995) ）。そこで、ＰＫＮの
核移行が、紫外線照射によっても観察されるか否かにつ
いて検討した。紫外線照射は、細胞をＵＶ−Ｃで処理す
ることにより実施し、その後３７℃において１時間イン
キュベートした（Adler,V. et al., J. Biol. Chem. 27
0, 26071-26077(1995) ）。その結果、ＪＮＫの活性化
のために充分な４０Ｊ／ｍ２のＵＶ−Ｃ（Derijard, B.
et al., Cell 76, 1025-1037(1994) ）でＮＩＨ３Ｔ３
細胞を照射したが、ＰＫＮの移行は観察されなかった
（データ省略）。
【０２３６】実施例２２ ＰＫＮのキナーゼネガティブ
変異体タンパク質の過剰発現の効果 ストレスに誘導されるＰＫＮの細胞内分布の変化をさら
に解析するために、ＰＫＮ変異体を過剰発現させた場合
の効果について検討した。ヒトＰＫＮのキナーゼドメイ
ンにおける単一の点突然変異（Ｋ６４４Ｒ；ＰＫＮ−Ｐ
Ｋ- ）をプロテインキナーゼ・ネガティブ突然変異体と
して利用した。
【０２３７】まず、ＰＫＮ−ＰＫ- を安定に過剰発現す
るＮＩＨ３Ｔ３細胞を下記に記載の方法に従って構築し
た。ＡＴＰ結合部位と推定されているリジンを、インビ
トロ部位特異的突然変異法によりアルギニンに変換する
ことによって、ベクターｐｈＰＫＮＨ４−ＰＫ- を構築
した（Mukai, H. & Ono, Y., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 199, 897-904(1994)）。哺乳動物細胞における
ＰＫＮ−ＰＫ- の発現用ベクターｐＭｈＰＫＮ−ＰＫ-
は、ｐｈＰＫＮＨ４−ＰＫ- をＥｃｏＲＩで部分消化し
て得られる２．９ｋｂのｃＤＮＡをｐＴＢ７０１（Ono,
Y. et al., J.Biol. Chem. 263, 6927-6932 (1988)）
のＥｃｏＲ１部位に挿入することによって構築した。ネ
オマイシン耐性遺伝子を有するｐＷＬｎｅｏ（ストラタ
ジーン社）とともにｐＭｈＰＫＮ−ＰＫ- をＮＩＨ３Ｔ
３細胞に導入（５０：１のモル比で）し、４００μｇ／
ｍ１のＧ４１８に対して耐性のクローンを単離した。前
述（実施例１９）の方法に準じて、イムノブロッティン
グによりこれらのクローンから、最もＰＫＮ−ＰＫ- を
高発現しているクローン（ＰＫ- ／ｎｅｏ＃５）を選択
し、本実験に使用した。
【０２３８】次に、ＰＫＮ−ＰＫ- がキナーゼ活性を示
すか否かについて調べるために、細胞より免疫沈降させ
たＰＫＮ−ＰＫ- のキナーゼ活性を検討した。具体的に
は、下記に記載の方法に従って実施した。免疫沈降の実
験は０〜４℃において実施した。野生型ＮＩＨ３Ｔ３細
胞およびＰＫ- ／ｎｅｏ＃５細胞を、０．５ｍｌ バッ
ファーＢ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１３７ｍＭ
ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、
２０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイ
ペプチン、２．５ｍＭ フッ化ナトリウム、０．２５ｍ
Ｍ バナジン酸ナトリウム）中で１時間かけて溶解し
た。１５，０００×ｇで１０分間遠心分離することによ
って不溶性物質を除去し、上清を１μｌの１０倍希釈の
抗血清αＮ２（実施例１９）と２時間インキュベートし
た。４０μｌの５０％プロテインＡセファロースを添加
した後、混合物をさらに１時間インキュベートした。プ
ロテインＡセファロースに吸着された免疫沈降物をバッ
ファーＣ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、０．５Ｍ ＬｉＣｌ、２．５ｍＭフッ化ナトリウ
ム、０．２５ｍＭ バナジン酸ナトリウム）で２回洗浄
し、バッファーＤ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、２．５ｍＭ フッ化ナトリウム、０．２５ｍ
Ｍ バナジン酸ナトリウム）で２回洗浄した。各免疫沈
降物を、３０℃において、２５μｌの混合液（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ
2 、４０μＭ ＡＴＰ、１８５ｋＢｑの[ γ−32Ｐ] Ａ
ＴＰを含有し、外因性基質を含有しない）と５分間イン
キュベートした。５μｌの６×レムリ（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ）試料バッファー（Laemmli, U. K. Nature 227, 680
-685(1970)）を添加し、煮沸した後、混合液各２０μｌ
を７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。リン酸化は、イメー
ジアナライザ一（Ｆｕｊｉ ＢＡＳ１０００）を用いて
可視化し、定量した。
【０２３９】その結果、ＰＫＮ−ＰＫ- は、酵素活性が
不活性化されていることが確認された（図３９）。さら
に、ＰＫ- ／ｎｅｏ＃５細胞は、内在性の野生型ＰＫＮ
より約２０倍過剰にＰＫＮ−ＰＫ- 変異体タンパク質を
発現することが、イムノブロッティングにより示された
（図３９）。
【０２４０】図４０に示されるように、顕微鏡観察の結
果、ＰＫＮ−ＰＫ- を発現した細胞では、ＰＫＮの免疫
蛍光は細胞質領域に分布し、４２℃のヒート処理細胞と
未処理細胞との間に差異は認められなかった。ヒート処
理温度を４４℃にさらに上げたときでも、明らかな変化
は観察されなかった（図４０）。これらの結果より、Ｐ
ＫＮ−ＰＫ- 変異体タンパク質は核に移行しないことが
示された。共焦点顕微鏡による測定では、核の免疫蛍光
／細胞質の免疫蛍光の比は、未処理細胞とヒート処理細
胞間で有意な差がなかったので、ＰＫＮ−ＰＫ- タンパ
ク質が過剰に発現された場合は、内在性の野生型ＰＫＮ
さえも核移行しなくなると考えられた。
【０２４１】このように、ＰＫＮ−ＰＫ- を細胞内にお
いて過剰発現させると内在性のＰＫＮの細胞質から核へ
の移行が阻害される。従って、プロテインキナーゼ活性
またはプロテインキナーゼ領域を有しないＰＫＮ改変ア
ミノ酸配列を有するペプチドまたはその誘導体を細胞内
に発現させることにより、あるいはプロテインキナーゼ
活性またはプロテインキナーゼ活性の亢進を阻害する物
質で細胞を処理することによりＰＫＮの細胞質から核へ
の移行を妨げることできると考えられる。
【０２４２】実施例２３ 酵母ツー・ハイブリッド・シ
ステムを用いた活性型Ｒｈｏタンパク質とＰＫＮとの結
合を阻害する物質の探索法 酵母（S. cerevisiae ）Ｌ４０株（Mat a trp1 leu2 hi
s3 ade2 LYS2::(LexAop)4-HIS3 URA3::(LexAop)8-LacZ
）に、ＰＫＮ（１−５４０）をコードするｃＤＮＡ断
片が挿入されたｐＶＰ１６ベクターおよびヒトＲｈｏＡ
Val14 をコードするｃＤＮＡ断片が挿入されたｐＢＴＭ
１１６ベクターをコトランスフェクションすることによ
り形質転換体を得た（実施例１６）。形質転換体を、２
０ｍｌのアデニン（Ａｄｅ）およびヒスチジン（Ｈｉ
ｓ）含有ＢＭＭ（ＢＭＭ／Ａｄｅ／Ｈｉｓ）培地に植菌
し、３０℃で静置培養し、３×１０７細胞／ｍｌまで増
殖させた後、形質転換体を集菌した。ここで用いたＡｄ
ｅおよびＨｉｓ含有ＢＭＭ培地は、１リットル中に、デ
キストロース ２０ｇ、アスパラギン ２ｇ、ビオチン
２μｇ、パントテン酸カルシウム ２００μｇ、イノシ
トール １０ｍｇ、ナイアシン ２００μｇ、ピリドキ
シン塩酸塩 ２００μｇ、チアミン塩酸塩 ２００μ
ｇ，ほう酸 ３０μｇ、硫酸銅 ２０μｇ、ヨウ化カリ
ウム １００μｇ、塩化第二鉄 １２５μｇ、硫酸マグ
ネシウム ５０μｇ、モリブデンナトリウム １００μ
ｇ、硫酸亜鉛 １５０μｇ、リン酸カリウム（monobasi
c ） １．５μｇ、硫酸マグネシウム ５００ｍｇ、塩
化カルシウム ３３０ｍｇ、アデニン ２０ｍｇ、ヒス
チジン ２０ｍｇを含むように調製した。
【０２４３】集菌した形質転換体の１／２量を、４８℃
に保温した３００ｍｌの２％精製寒天末（ナカライテス
ク社）および０．００２％ ＳＤＳを含むＢＭＭ／Ａｄ
ｅ／Ｈｉｓ培地（Ｈｉｓ+ 培地）に、１×１０6 細胞／
ｍｌになるように懸濁した後、懸濁液を３０ｍｌずつ角
シャーレにプレーティングした。残りの１／２量の形質
転換体を同様に、３００ｍｌの２％精製寒天末および
０．００２％ ＳＤＳを含むＢＭＭ／Ａｄｅ培地（Ｈｉ
ｓ- 培地）に懸濁し、懸濁液を３０ｍｌずつ角シャーレ
（２３０×８０×１５ｍｍ）にプレーティングした。
【０２４４】様々な放線菌やかびの培養ブロスに直径６
ｍｍのペーパー・ディスク（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｔｈｉ
ｎ ＰＡＰＥＲ ＤＩＳＫ（東洋ろ紙社）を２組ずつ浸
し、ろ紙上で乾燥させた。乾燥後、２組のペーパー・デ
ィスクの内、一方をＨｉｓ+培地の形質転換体培養プレ
ートに、もう一方をＨｉｓ- 培地の形質転換体培養プレ
ートにのせ、３０℃で２〜３日間培養した。その後、各
ペーパー・ディスクの周りに出現した増殖阻止円の直径
を計測し、Ｈｉｓ+ 培地の形質転換体培養プレートとＨ
ｉｓ- 培地の形質転換体培養プレートに出現した阻止円
の大きさの差を測定した。
【０２４５】その結果、ほとんどの培養ブロスでは両方
のプレートで同程度の阻止円を出現させた。一方、ごく
まれにＨｉｓ+ 培地での阻止円に比べてＨｉｓ- 培地の
プレートで顕著に大きい阻止円を出現させた培養ブロス
が見出された（データ省略）。これらの培養ブロスはＨ
ｉｓ+ 培地では阻止円をほとんど出現させなかったの
で、酵母の増殖を妨げるのに充分な物質は含まれていな
いと考えられる。一方、Ｈｉｓ- 培地では阻止円を顕著
に出現させることから、この培養ブロス中には、Ｒｈｏ
ＡVal14 とＰＫＮ（１−５４０）との結合を阻害する物
質が含まれていると推測された。以上に記載の通り、酵
母ツー・ハイブリッド・システムによって、Ｒｈｏタン
パク質とＰＫＮとの結合を阻害する物質をスクリーニン
グすることが可能であることが明らかになった。
【０２４６】実施例２４ 酵母のツー・ハイブリッド・
システムによるα−アクチニンとＰＫＮとの結合の検出 Ｇａｌ４転写活性化ドメインに融合したヒト脳ｃＤＮＡ
ライブラリーおよびＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインに融合
したＰＫＮＮ１をコードするバイト構築物の双方で形質
転換された１０６の酵母コロニーをスクリーニングし
た。具体的には下記に記載の方法に従って実施した。
【０２４７】使用したヒトＰＫＮ、ヒト骨格筋型α−ア
クチニン（ Beggs, A., et al., J.Biol. Chem. 267, 9
281-9288 (1992)においてＨｕＡｃｔＳｋ１と呼ばれて
いる）および非骨格筋型α−アクチニン（ Beggs, A.,
et al., J. Biol. Chem. 267, 9281-9288 (1992)におい
てＨｕＡｃｔＮｍと呼ばれている）の融合コンストラク
トのスキームを図４１および図４２に示した。ヒトＰＫ
ＮのＮ−末端領域（アミノ酸１−５４０、この領域を
「ＰＫＮＮ１」と表示する）と結合するタンパク質のス
クリーニングは、実施例６に記載された方法に従って実
施した。一次陽性クローンを回収し、Ｇａｌ４ｂｄ−Ｐ
ＫＮまたはＧａｌ４ｂｄ−ｐ５３腫瘍サプレッサーと組
み合わせて元の酵母宿主株ＹＧＨ１（ａ、ｕｒａ３−５
２、ｈｉｓ３−２００、ａｄｅ２−１０１、ｌｙｓ２−
８０１、ｔｒｐ１−９０１、ｌｅｕ２−３、Ｃａｎｒ、
ｇａｌ４−５４２、ｇａｌ８０−５３８、ＬＹＳ２：：
ｇａｌｌuas −ｇａｌｌｔａt ａ−ＨＩＳ３、ＵＲＡ
３：：ｇａｌ１−ｌａｃＺ）中にトランスフェクション
した。ＰＫＮの存在下においてのみマーカーの発現を活
性化したプラスミドをさらに分析した。
【０２４８】ｃＤＮＡの塩基配列を決定したところ、１
６種の異なるｃＤＮＡを示す８２個のプラスミドが単離
された（実施例６）。この内、３個の陽性クローン（ク
ローン＃４、＃１０、および＃２５）は、骨格筋型α−
アクチニン（ＨｕＡｃｔＳｋ１）（Beggs, A., et al.,
J. Biol. Chem. 267, 9281-9288 (1992) ）をコードし
ていた。クローン＃４はアミノ酸３３３からＣ−末端の
ＨｕＡｃｔＳｋ１をコードし、クローン＃１０およびク
ローン＃２５の双方はアミノ酸３４４からＣ−末端のＨ
ｕＡｃｔＳｋ１をコードしていた。これらの３つのクロ
ーンは完全なＣ−末端を含んでいたが、Ｎ−末端のアク
チン結合ドメイン（Fukami, K.,et al.,J. Biol. Chcm.
271, 2646-2650 (1996) ）を欠如していた（図４
２）。これらのクローンは、もとの酵母宿主株ＹＧＨ１
にＰＫＮバイト構築物とともに共形質転換すると、高い
β−ガラクトシダーゼ活性を示した。
【０２４９】Ｌ４０細胞（ＭＡＴａ ｔｒｐ１ ｌｅｕ
２ ｈｉｓ３ ＬＹＳ２：：ｌｅｘＡ−ＨＩＳ３ ＵＲ
Ａ３：：ｌｅｘＡ−ｌａｃＺ）においてｌａｃＺの発現
を誘導する他の組み合わせのツー・ハイブリッド構築物
であるＬｅｘＡｂｄ（Ｇａｌ４ｂｄの代わりに）−ＰＫ
Ｎ、およびＧａｌ４ａｄ−α−アクチニンの結合能力を
測定することによって、この結合の特異性を試験した。
その結果、図４３に示すように、高いβ−ガラクトシダ
ーゼ活性がこの系においても検出されたことから、ＰＫ
Ｎのアミノ末端領域とα−アクチニンとの特異的結合が
示唆された。
【０２５０】ツー・ハイブリッド法を使用して、ＨｕＡ
ｃｔＳｋ１と結合するＰＫＮ上の領域を同定し、この領
域をインビトロおよびインビボでＰＫＮと結合するＲｈ
ｏＡの結合部位と比較した。ＲｈｏＡ結合部位はＰＫＮ
の第１ロイシンジッパー様配列に相当するＰＫＮのアミ
ノ酸３３−１１１上にマッピングされている（実施例１
６）が、α−アクチニンはＰＫＮのこの領域とほとんど
結合しなかった（図４２）。対照的に、α−アクチニン
はＰＫＮのアミノ酸１３６−１８９と強く結合したが、
ＲｈｏＡとＰＫＮのこの領域では結合は検出されなかっ
た（データ省略）。この領域は第２ロイシンジッパー様
配列およびこれに隣接するＮ−末端領域に相当し、後者
のＮ−末端領域は脊椎動物の進化を通じて保存される
（Mukai, H., et al., Biochim. Biophys. Acta 1261,
296-300 (1995)）。従って、α−アクチニンは、Ｒｈｏ
結合領域とは異なる領域に結合することが明らかになっ
た。これらの結果より、ＰＫＮがＲｈｏＡおよびα−ア
クチニンに同時に結合する可能性が示された。
【０２５１】実施例２５ インビトロにおけるＨｕＡｃ
ｔＳｋ１へのＰＫＮの結合の検出 α−アクチニンは次の３つのドメインから構成される：
Ｎ−末端のアクチン結合ドメイン、内部に４つの１２２
アミノ酸のリピート（スペクトリン様リピート）をもつ
伸長ロッド形ドメイン、および１対の推定上のらせん−
ループ−らせんＣａ２＋結合モチーフを含有するＣ−末
端領域（しばしばＥＦ−ハンドと呼ばれる）（（Blanch
ard, A., et al., J. Muscle Res. Cell Motil.10,280-
289 (1989)）。
【０２５２】ＰＫＮがα−アクチニンに直接結合するか
どうか、またα−アクチニンのどの領域がＰＫＮとの結
合に必要であるかを明らかにするために、ＨｕＡｃｔＳ
ｋ１の種々のトランケート構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）においてＧＳＴ融合タンパク質として生産させ（図
４２）、インビトロ転写させたＰＫＮのＮ−末端領域と
の結合を解析した。具体的には下記に記載の方法に従っ
て実施した。
【０２５３】ＨｕＡｃｔＳｋ１の全長のコーディング領
域のインビトロ転写のためのプラスミドを下記のように
して構築した：アクチン結合ドメインを含むＨｕＡｃｔ
Ｓｋ１のＮ−末端領域（アミノ酸１−４２２）をコード
するｃＤＮＡを、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからＰＣ
Ｒにより増幅し、ツー・ハイブリッドのスクリーニング
において単離されたクローン＃４のＣ−末端部分（アミ
ノ酸４２３−８９４）に連結した。ＨｕＡｃｔＳｋ１の
全長コーディング領域を含むｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＩＩＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中に
サブクローニングした。プラスミドをＸｈｏＩで切断す
ることによって線状化し、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを使
用してｃＲＮＡを転写した。
【０２５４】ＰＫＮのＮ−末端領域（アミノ酸１−４７
４、以下この領域を「ＰＫＮＮ２」という（実施例
８））のインビトロ転写は、実施例８に記載された方法
に従って実施した。インビトロ翻訳のために、実施例８
に記載された方法に従って、［３５Ｓ］メチオニンの存
在下においてウサギ網状赤血球ライゼート（プロメガ
社）によりｃＲＮＡを翻訳した。
【０２５５】インビトロ結合実験のために、２μｌのイ
ンビトロ翻訳ＰＫＮＮ２を、４００μｌ ＧＳＴ結合バ
ッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、
０．５ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５
％ トリトン−Ｘ１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／
ｍｌ ロイペプチン）の中で、５μｇの各ＧＳＴ−α−
アクチニン−融合タンパク質と、または２５μｇのＧＳ
Ｔ単独と混合し、４℃で１時間インキュベートした。１
０ｍｇ／ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物で前処理
して非特異的結合をブロックしたグルタチオン−セファ
ロース４Ｂの２５μｌを添加した後、結合反応を４℃で
さらに３０分間続けた。次いで、グルタチオン−セファ
ロース４Ｂを０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５％ トリ
トンＸ−１００を含有するＧＳＴ洗浄バッファー（２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ Ｄ
ＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチ
ン）で４回洗浄し、ＧＳＴ洗浄バッファーでさらに洗浄
した。結合したタンパク質をＧＳＴ溶出バッファー（１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭグ
ルタチオン、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１μｇ／ｍｌ ロイペプチ
ン）で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。画像形成分
析装置（ＦＵＪＩ ＢＡＳ１０００）により可視化し、
結合を定量した。
【０２５６】その結果、図４４に示すように、インビト
ロ翻訳されたＰＫＮＮ２は各ヒト骨格筋型α−アクチニ
ン断片（アミノ酸４２３−６５３、アミノ酸６５３−８
３７、およびアミノ酸４８６−６０７）に強く結合した
が、断片（アミノ酸８３７−８９４、およびアミノ酸６
０４−７１９）には結合しなかった。複合体は０．５％
トリトンＸ−１００／０．５Ｍ ＮａＣｌによる洗浄
に対して抵抗性であったので、この結合が非特異的な結
合でないことが示された。
【０２５７】以上の結果が示唆するように、組換えα−
アクチニンは組換えＰＫＮと直接結合し、スペクトリン
様リピート３およびＥＦ−ハンド様モチーフを含有する
領域に相当する、ＨｕＡｃｔＳｋ１の２つの異なった領
域が、ＰＫＮとの結合において重要な役割を果たす。一
方、ツー・ハイブリッドのデータ（実施例２４）から期
待されるように、ＲｈｏＡ結合領域（アミノ酸３３〜１
１１）を欠如するインビトロ翻訳されたＰＫＮのＮ−末
端領域（アミノ酸１３６−４７４）は、α−アクチニン
に対する直接結合に十分であった（図４４、レーン１８
−２０）。
【０２５８】実施例２６ インビトロでのＰＫＮと非骨
格筋型α−アクチニン（ＨｕＡｃｔＮｍ）の結合の検出
およびその結合のＣａ２＋依存性の証明 種々の細胞および組織由来の骨格筋、平滑筋、および非
筋肉のα−アクチニンを含む、α−アクチニンの多数の
異なったアイソフォームが特徴づけられている。これら
のα−アクチニン間で報告されている機能的な差異は、
Ｆ−アクチンへの非筋肉アイソフォームの結合はＣａ
２＋により阻害されるが、非筋肉アイソフォームの結合
はＣａ２＋非感受性であることである（ Burridge, K.
& Feramiscoo, J. R. Nature 294, 565-567 (1981)、Be
nnett, J. P., et al., Biochemistry 23, 5081-5086
(1984) 、 Duhaiman, A. S. & Bamburg, J. R. Biochem
istry23, 1600-1608 (1984) 、および Landon, F., et
al., Eur. J. Biochem. 153,231-237 (1985) ）。ヒト
においては、ＨｕＡｃｔＳｋ１と強い配列相同性（８９
％の相同性および８０％の同一性）を有する、非筋肉細
胞骨格アイソフォーム（ＨｕＡｃｔＮｍ（ Beggs, A.,
et al., J. Biol. Chem. 267, 9281-9288 (1992)）のク
ローンだけが単離されている（ Millake, D. B., et a
l., Nucleic Acids Res. 17, 6725 (1989) 、および Yo
ussoufian, H., et al., Am. J. Hum. Genet. 47,62-71
(1990)）。
【０２５９】そこで、本発明者らはインビトロ翻訳され
たＰＫＮＮ２がＨｕＡｃｔＳｋ１のＰＫＮ結合部位に相
当するＨｕＡｃｔＮｍの領域に結合できるかどうかを、
実施例２５に記載の方法に準じて検討した。実験に用い
たＨｕＡｃｔＮｍ断片の調製は、下記に記載の方法に従
って実施した。
【０２６０】ＨｕＡｃｔＮｍのスペクトリン様リピート
３（アミノ酸４７９−６００）およびＥＦ−ハンド様領
域（アミノ酸７１２−８４３）をコードするｃＤＮＡを
ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲにより増幅し、
ｐＧＥＸ４Ｔベクターに連結した。α−アクチニンのス
ペクトリンリピート２０およびＥＦ−ハンド様領域をコ
ードするｃＤＮＡをラット脳ｃＤＮＡライブラリーから
ＰＣＲにより増幅し、ｐＧＥＸ４Ｔベクターに連結し
た。ＧＳＴまたはＧＳＴ融合タンパク質の発現および精
製は製造業者（ファルマシア・バイオテク社）のインス
トラクションに従い実施した。グルタチオン−セファロ
ース４Ｂ（ファルマシア・バイオテク社）からの溶出液
を、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、および０．１
μｇ／ｍｌロイペプチンを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
／ＨＣｌ、ｐＨ７．５に対して一晩透析した。
【０２６１】その結果、図４５に示すように、ＰＫＮＮ
２は、ＨｕＡｃｔＮｍのスペクトリン様リピート３ドメ
インには結合することができたが、ＨｕＡｃｔＮｍのＥ
Ｆ−ハンド様ドメインへの結合はＣａ２＋非存在下にお
いて検出されなかった。しかしながら、ＰＫＮＮ２は１
ｍＭのＣａ２＋存在下においてＨｕＡｃｔＮｍのＥＦ−
ハンド様領域に効果的に結合することができた（図４
５）。
【０２６２】実施例２７ ＰＫＮとα−アクチニンとの
間の結合の特異性の検討 α−アクチニンは、スペクトリン、ジストロフィンなど
を包含むスペクトリンのスーパーファミリーの１メンバ
ーである（ Blanchard, A., et al., J. Muscle Res. C
ell Motil.10,280-289 (1989) 、Dubreuil, R. R. Bioe
ssays 13, 219-226 (1991)、および Bennett, V, Physi
ol. Rev. 70, 1029-1065 (1990) ）。ファミリーのメン
バーは、Ｎ−末端のアクチン結合ドメイン、中央のロッ
ド形スペクトリン様リピート、およびＣ−末端のＥＦ−
ハンド様ドメインにより特徴づけられる。α−スペクト
リンはＥＦ−ハンド様ドメインに対してＮ−末端に２１
個のロッド形リピートを含んでいる。α−スペクトリン
のＣ−末端はα−アクチニンに明らかに一致しており、
特にα−スペクトリンのリピート２０はα−アクチニン
のリピート３に対して非常に高い相同性を示し（ Wasen
ius, V. M., et al., J. Cell Biol. 108, 79-93 (198
9) 、および Hong, W. J. & Doyle, D. J. Biol. Che
m. 264, 12758-12764 (1989)）、各タンパク質間でのリ
ピートの位置は互いに一致しているように思われる。
【０２６３】ＰＫＮがα−アクチニンのリピート３に結
合したので、ＰＫＮがα−スペクトリンのリピート２０
に結合できるかどうかを検討した。図４６に示すよう
に、ＰＫＮとラットα−スペクトリンのリピート２０と
のインビトロの結合は、ＰＫＮがα−アクチニンのリピ
ート３に結合した同一の条件下においては検出されなか
った。これらの結果は、ＰＫＮがα−アクチニンのスペ
クトリン様リピートに特異的に結合することを示す。
【０２６４】実施例２８ α−アクチニンへのＰＫＮの
インビボ結合 インビボにおけるα−アクチニンとＰＫＮとの結合をＣ
ＯＳ７細胞を用いたコトランスフェクション実験により
試験した。クローン＃４タンパク質のアミノ末端へ、イ
ンフルエンザＨＡ由来の９アミノ酸のエピトープを融合
することにより、エピトープ標識化α−アクチニンを作
製し、抗ＨＡモノクローナル抗体１２ＣＡ５を使用して
標識化α−アクチニンポリペプチドを選択的に免疫沈降
することを可能にした（ Field, J., et al., Mol. Cel
l Biol. 8, 2159-2165 (1988) ）。このＨＡ標識化α−
アクチニンは、α−アクチニンの完全なＣ−末端領域は
含むが、Ｎ−末端のアクチン結合ドメインは欠如してい
る。具体的には、下記の方法に従って実験を実施した。
【０２６５】インフルエンザＨＡからの９アミノ酸のエ
ピトープをコードするｃＤＮＡをクローン＃４のアミノ
末端に融合することによって、ＨＡで標識したＨｕＡｃ
ｔＳｋ１ ｃＤＮＡ（アミノ酸３３３−８９４）を作製
した。このｃＤＮＡをｐＴＢ７０１の中にサブクローニ
ングすることによって、ベクターｐＨＡ−Ａｃｔを構築
した（ Ono. Y., et al., J. Biol. Chem. 263, 6927-6
932 (1988)）。ＨＡエピトープのみをコードするｃＤＮ
ＡをｐＴＢ７０１の中にサブクローニングすることによ
って、ＨｕＡｃｔＳｋ１を含まないコントロールｐＨＡ
ベクターを構築した。ベクターｐＨＡ−Ａｃｔまたはコ
ントロールｐＨＡベクターを、全長のヒトＰＫＮをコー
ドする発現ベクターｐＭｈＰＫＮ３（ Mukai, H. & On
o, Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 199, 897-904
(1994)）とともに、ＣＯＳ７細胞の中にコトランスフェ
クションした。４８時間後、細胞を溶解バッファー（２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％ Ｎｏｎ
ｉｄｅｔ Ｐ−４０、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０％
グリセロール、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフル
オライド、２０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／
ｍｌ ロイペプチン）の中で１時間溶解した。不溶性物
質を１５，０００×ｇにおいて１０分間遠心することに
よって除去し、上清を１２ＣＡ５と２時間インキュベー
トした。２０μｌの５０％プロテインＡセファロースを
添加した後、この混合物をさらに１時間インキュベート
した。プロテインＡセファロースに吸着された免疫沈降
物をＨＡ洗浄バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＬｉＣｌ）で２回洗浄し、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で２回洗浄し
た。得られた免疫沈降物をαＣ６および１２ＣＡ５を使
用してイムノブロッティングにより検出した。
【０２６６】実験に用いた抗ヘマグルチニン（ＨＡ）モ
ノクローナル抗体１２ＣＡ５はベーリンガー・マンハイ
ム社から購入した。ＰＫＮに対する特異的抗血清αＣ６
は、大腸菌で作製したラットＰＫＮ断片（アミノ酸８６
３−９４６）でウサギを免疫した後、常法に従って調製
した。
【０２６７】結果は図４７に示した通りであった。ＣＯ
Ｓ７細胞においてＨＡ標識化α−アクチニンと完全長Ｐ
ＫＮの共発現後、抗ＨＡ免疫沈降物は免疫反応性のＰＫ
Ｎをかなり含んでいた。これらの結果は、α−アクチニ
ンのＣ−末端領域がインビボでＰＫＮと結合することが
できることを示している。
【０２６８】実施例２９ ＰＫＮとα−アクチニンとの
間のＰＩ４，５Ｐ２依存的結合 α−アクチニンは種々の量の内在性ＰＩ４，５Ｐ２とイ
ンビボで結合し、α−アクチニンとＰＩ４，５Ｐ２との
間の特異的結合はα−アクチニンのＦ−アクチンゲル化
活性を調節する（ Fukami, K., et al., Nature 359, 1
50-152 (1992)）。これはＰＩ４，５Ｐ２がα−アクチ
ニンのコンフォメーションの変化を引き起こすことを示
している。外から添加されたＰＩ４，５Ｐ２はα−アク
チニンに強く結合することができ、この結合は堅固かつ
安定である（ Fukami, K., et al., Nature 359, 150-1
52 (1992) ）。
【０２６９】そこで、本発明者らはＰＩ４，５Ｐ２の存
在下または非存在下におけるα−アクチニンとＰＫＮの
結合活性を検討した。ＰＩ４，５Ｐ２の結合領域はα−
アクチニンのアクチン結合ドメインに存在する（ Fukam
i, K.,et al., J. Biol. Chcm. 271, 2646-2650 (199
6)）ので、インビトロ翻訳したアクチン結合ドメインを
含む全長のα−アクチニン（図４２）をこのインビトロ
結合試験において使用した。具体的には下記に記載の方
法に従って実施した。
【０２７０】α−アクチニンとＰＫＮとの間の結合に対
するホスファチジルイノシトール４，５ビスホスフェー
ト（ＰＩ４，５Ｐ２）（ベーリンガー・マンハイム社）
の効果を分析するために、２μｌのインビトロ翻訳され
た全長のＨｕＡｃｔＳｋ１を、４００μｌのバッファー
Ｐ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５
ｍＭ ＤＴＴ、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）の中で、５μｇのＧＳＴ−ＰＫＮＮ１融合タンパク
質と、または２５μｇのＧＳＴ単独と混合し、ＰＩ４，
５Ｐ２の存在下または非存在下で室温において１時間イ
ンキュベートした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出液で前
処理したグルタチオン−セファロース４Ｂの２５μｌを
添加した後、結合反応を４℃においてさらに３０分間続
けた。次いで、グルタチオン−セファロース４Ｂを０．
０１％のトリトンＸ−１００を含有するバッファーＰ中
で４回洗浄した。結合したタンパク質をＧＳＴ溶出バッ
ファーで溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。結合を画
像形成分析装置（ＦＵＪＩＢＡＳ１０００）により可視
化し、定量した。
【０２７１】結果は図４８に示した通りであった。全長
のα−アクチニンはＰＩ４，５Ｐ２の非存在下におい
て、非常に弱いが、特異的にＰＫＮに結合した。しかし
ながら、１０μＭ ＰＩ４，５Ｐ２を添加すると、ＰＫ
Ｎと全長のα−アクチニンの結合が促進された（図４８
Ａ）。従って、ＰＩ４，５Ｐ２はα−アクチニンのコン
フォメーションに影響を及ぼし、ＰＫＮの結合領域を露
出させると考えられる。
【０２７２】この結合活性は２．５〜１０μＭまではＰ
Ｉ４，５Ｐ２濃度の増加とともに増大したが、この濃度
以上では１００μＭまでは低下した（図４８Ｂ）。ＰＩ
４，５Ｐ２濃度依存性のこの二相性のパターンは、α−
アクチニンとＰＩ３−キナーゼとの結合においても報告
されている（ Shibasaki, F., et al., Biochem. J.30
2, 551-557 (1994) ）。Fukami et al. は、α−アクチ
ニンのゲル化活性に対するＰＩ４，５Ｐ２の効果がＰＩ
４，５Ｐ２の濃度が５〜１０μＭまでは増加するが、Ｐ
Ｉ４，５Ｐ２の濃度がそれ以上に増加するとＰＩ４，５
Ｐ２ミセルの形成のためにゲル化活性が元のレベルに減
少してしまうことを報告した（ Fukami,K., et al., Na
ture 359, 150-152 (1992) ）。ＰＫＮとのα−アクチ
ニンの結合に関するＰＩ４，５Ｐ２濃度依存的な二相性
の結合パターンも、同一の理由により説明することがで
きる。
【０２７３】実施例３０ ＰＫＮキナーゼ活性に対する
α−アクチニンの効果 ＰＫＮへのα−アクチニンの結合が、ＰＫＮの触媒機能
を調節または直接変化させるかどうかを検討した。具体
的には下記に記載の方法にしたがって実施した。実験に
用いたα−アクチニンはFeramisco et al.の方法により
ウシ大動脈から精製した（Feramisco, J. R. & Burridg
e, K. J. Biol. Chem. 255, 1194-1199(1980)）。ＰＫ
Ｎによるリン酸化実験は、３０℃において、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４ｍＭ ＭｇＣｌ
２ 、１００μＭ ＡＴＰ、１８５ｋＢｑ ［γ−３２
Ｐ］ＡＴＰ、被リン酸化のための基質（phosphate acce
ptor）、２０ｎｇ／ｍｌのラット睾丸から精製したＰＫ
Ｎ（ Abe, M., et al., J. Biochem. Tokyo 107, 507-5
09 (1990) ）を含むアッセイ混合液中で、各実験に示さ
れているように４０μＭ アラキドン酸の存在下または
非存在下で実施した。部分精製されたタンパク質を、被
リン酸化のための基質として使用する前に、３分間煮沸
して内因性キナーゼ活性を不活性化した。５分間インキ
ュベートした後、反応を等量のレムリ試料バッファー
（ Laemmli, U. K. Nature 2Z7, 680-685 (1970)）を添
加することにより停止させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離
した。ゲルを真空下で乾燥させ、リン酸化を可視化し、
イメージアナライザー（ＦＵＪＩ ＢＡＳ１０００）に
より定量した。δＰＫＣペプチド（ Mukai, H., et al.
Biochem, Biophys. Res. Commun. 204,348-356 (l99
4)）を被リン酸化のための基質として使用した場合に
は、混合液をワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ社）Ｐ８１上
にスポッティングし、７５ｍＭのリン酸の中に浸すこと
によって反応を停止させ、次いで１０分間洗浄を３回実
施した。ペプチドの中への32Ｐの取り込みを、シンチレ
ーションカウンティングにより評価した。
【０２７４】その結果、ウシ大動脈から精製されたα−
アクチニンは、ＰＫＮに対して＞１０００モル過剰量で
添加したとき、ＰＫＮの自己リン酸化を阻害せず、また
ＰＫＮによるＰＫＣ擬似基質ペプチドのリン酸化にも影
響を与えなかった（データ省略）。従って、α−アクチ
ニンはラット睾丸の可溶性画分から精製されたＰＫＮの
インビトロにおける直接のモジュレーターではないこと
が明らかになった。
【０２７５】実施例３１ α−アクチニンおよび他のア
クチン−細胞骨格関連タンパク質のＰＫＮによるリン酸
化 ＰＫＮがα−アクチニンに結合したので、本発明者らは
α−アクチニンそれ自体がＰＫＮの基質であるかどうか
を検討した。ラット睾丸から精製されたＰＫＮは、ウシ
大動脈から精製されたα−アクチニン（実施例３０）お
よび大腸菌で発現した組換えα−アクチニンをリン酸化
しなかった（データ省略）。
【０２７６】本発明者らは、フィラミン、メタ−ビンキ
ュリン、ビンキュリン、タリン、カルデスモン、および
アクチンを含む、他のアクチン−細胞骨格タンパク質の
中からＰＫＮ基質を探索した。アクチンは、 Mommaert
s, W.らの方法に従ってウサギ骨格筋から精製した（ Mo
mmaerts, W. F. H. M. J.Biol. Chem. 559, 559 (1951)
）。ビンキュリンは、Kobayashi et al.の方法により
ウシ大動脈から精製した（ Kobayashi, R. & Tashima,
Y. J. Muscle Res. Cell Motil. 11, 465-470 (199
0)）。カルデスモンは、Abe et al.の方法によりウシ大
動脈から部分精製した（ Abe, M., et al., J. Bioche
m. Tokyo 107, 507-509 (1990) ）。フィラミン、メタ
−ビンキュリン、およびタリンは Feramisco, J. R. &
Burridge, K. J.Biol. Chem. 255, 1194-1199 (1980)
に記載されている方法に従ってウシ大動脈から部分精製
した。
【０２７７】その結果、これらの中で、カルデスモンお
よびＧ−アクチンはＰＫＮのための好ましい基質である
ことが明らかとなった。図４９に示すように、Ｇ−アク
チンおよびカルデスモンのリン酸化は、アラキドン酸の
存在下において、それぞれ約２倍まで、および６倍以上
促進された。
【０２７８】アクチンやカルデスモンのようなアクチン
を基礎とした細胞骨格タンパク質のいくつかがよいＰＫ
Ｎ基質として機能したので、ＰＫＮは、Ｒｈｏタンパク
質およびホスホイノシチドの効果をこれらのタンパク質
をリン酸化することによって伝達すると推測された。
【０２７９】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：９４２および２９６８ 配列の型：アミノ酸および核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチドおよび cＤＮＡ 起源： 生物名：ヒト 配列 GAATTCCCGC GCAGAGACTC CAGGTCGCAG GTCGAC ATG GCC AGC GAC GCC GTG 54 Met Ala Ser Asp Ala Val 1 5 CAG AGT GAG CCT CGC AGC TGG TCC CTG CTA GAG CAG CTG GGC CTG GCC 102 Gln Ser Glu Pro Arg Ser Trp Ser Leu Leu Glu Gln Leu Gly Leu Ala 10 15 20 GGG GCA GAC CTG GCG GCC CCC GGG GTA CAG CAG CAG CTG GAG CTG GAG 150 Gly Ala Asp Leu Ala Ala Pro Gly Val Gln Gln Gln Leu Glu Leu Glu 25 30 35 CGG GAG CGG CTG CGG CGG GAA ATC CGC AAG GAG CTG AAG CTG AAG GAG 198 Arg Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ile Arg Lys Glu Leu Lys Leu Lys Glu 40 45 50 GGT GCT GAG AAC CTG CGG CGG GCC ACC ACT GAC CTG GGC CGC AGC CTG 246 Gly Ala Glu Asn Leu Arg Arg Ala Thr Thr Asp Leu Gly Arg Ser Leu 55 60 65 70 GGC CCC GTA GAG CTG CTG CTG CGG GGC TCC TCG CGC CGC CTC GAC CTG 294 Gly Pro Val Glu Leu Leu Leu Arg Gly Ser Ser Arg Arg Leu Asp Leu 75 80 85 CTG CAC CAG CAG CTG CAG GAG CTG CAC GCC CAC GTG GTG CTT CCC GAC 342 Leu His Gln Gln Leu Gln Glu Leu His Ala His Val Val Leu Pro Asp 90 95 100 CCG GCG GCC ACC CAC GAT GGC CCC CAG TCC CCT GGT GCG GGT GGC CCC 390 Pro Ala Ala Thr His Asp Gly Pro Gln Ser Pro Gly Ala Gly Gly Pro 105 110 115 ACC TGC TCG GCC ACC AAC CTG AGC CGC GTG GCG GGC CTG GAG AAG CAG 438 Thr Cys Ser Ala Thr Asn Leu Ser Arg Val Ala Gly Leu Glu Lys Gln 120 125 130 TTG GCC ATT GAG CTG AAG GTG AAG CAG GGG GCG GAG AAC ATG ATC CAG 486 Leu Ala Ile Glu Leu Lys Val Lys Gln Gly Ala Glu Asn Met Ile Gln 135 140 145 150 ACC TAC AGC AAT GGC AGC ACC AAG GAC CGG AAG CTG CTG CTG ACA GCC 534 Thr Tyr Ser Asn Gly Ser Thr Lys Asp Arg Lys Leu Leu Leu Thr Ala 155 160 165 CAG CAG ATG TTG CAG GAC AGT AAG ACC AAG ATT GAC ATC ATC CGC ATG 582 Gln Gln Met Leu Gln Asp Ser Lys Thr Lys Ile Asp Ile Ile Arg Met 170 175 180 CAA CTC CGC CGG GCG CTG CAG GCC GGC CAG CTG GAG AAC CAG GCA GCC 630 Gln Leu Arg Arg Ala Leu Gln Ala Gly Gln Leu Glu Asn Gln Ala Ala 185 190 195 CCG GAT GAC ACC CAA GGG AGT CCT GAC CTG GGG GCT GTG GAG CTG CGC 678 Pro Asp Asp Thr Gln Gly Ser Pro Asp Leu Gly Ala Val Glu Leu Arg 200 205 210 ATC GAA GAG CTG CGG CAC CAC TTC CGA GTG GAG CAC GCG GTG GCC GAG 726 Ile Glu Glu Leu Arg His His Phe Arg Val Glu His Ala Val Ala Glu 215 220 225 230 GGT GCC AAG AAC GTA CTG CGC CTG CTC AGC GCT GCC AAG GCC CCG GAC 774 Gly Ala Lys Asn Val Leu Arg Leu Leu Ser Ala Ala Lys Ala Pro Asp 235 240 245 CGC AAG GCA GTC AGC GAG GCC CAG GAG AAA TTG ACA GAA TCC AAC CAG 822 Arg Lys Ala Val Ser Glu Ala Gln Glu Lys Leu Thr Glu Ser Asn Gln 250 255 260 AAG CTG GGG CTG CTG CGG GAG GCT CTG GAG CGG AGA CTT GGG GAG CTG 870 Lys Leu Gly Leu Leu Arg Glu Ala Leu Glu Arg Arg Leu Gly Glu Leu 265 270 275 CCC GCC GAC CAC CCC AAG GGG CGG CTG CTG CGA GAA GAG CTC GCT GCG 918 Pro Ala Asp His Pro Lys Gly Arg Leu Leu Arg Glu Glu Leu Ala Ala 280 285 290 GCC TCC TCC GCT GCC TTC AGC ACC CGC CTG GCC GGG CCC TTT CCC GCC 966 Ala Ser Ser Ala Ala Phe Ser Thr Arg Leu Ala Gly Pro Phe Pro Ala 295 300 305 310 ACG CAC TAC AGC ACC CTG TGC AAG CCC GCG CCG CTC ACA GGG ACC CTG 1014 Thr His Tyr Ser Thr Leu Cys Lys Pro Ala Pro Leu Thr Gly Thr Leu 315 320 325 GAG GTA CGA GTG GTG GGC TGC AGA GAC CTC CCA GAG ACC ATC CCG TGG 1062 Glu Val Arg Val Val Gly Cys Arg Asp Leu Pro Glu Thr Ile Pro Trp 330 335 340 AAC CCT ACC CCC TCA ATG GGG GGA CCT GGG ACC CCA GAC AGC CGC CCC 1110 Asn Pro Thr Pro Ser Met Gly Gly Pro Gly Thr Pro Asp Ser Arg Pro 345 350 355 CCC TTC CTG AGC CGC CCA GCC CGG GGC CTT TAC AGC CGA AGC GGA AGC 1158 Pro Phe Leu Ser Arg Pro Ala Arg Gly Leu Tyr Ser Arg Ser Gly Ser 360 365 370 CTC AGT GGC CGG AGC AGC CTC AAA GCA GAA GCC GAG AAC ACC AGT GAA 1206 Leu Ser Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ala Glu Ala Glu Asn Thr Ser Glu 375 380 385 390 GTC AGC ACT GTG CTT AAG CTG GAT AAC ACA GTG GTG GGG CAG ACG TCT 1254 Val Ser Thr Val Leu Lys Leu Asp Asn Thr Val Val Gly Gln Thr Ser 395 400 405 TGG AAG CCA TGT GGC CCC AAT GCC TGG GAC CAG AGC TTC ACT CTG GAG 1302 Trp Lys Pro Cys Gly Pro Asn Ala Trp Asp Gln Ser Phe Thr Leu Glu 410 415 420 CTG GAA AGG GCA CGG GAA CTG GAG TTG GCT GTG TTC TGG CGG GAC CAG 1350 Leu Glu Arg Ala Arg Glu Leu Glu Leu Ala Val Phe Trp Arg Asp Gln 425 430 435 CGG GGC CTG TGT GCC CTC AAA TTC CTG AAG TTG GAG GAT TTC TTG GAC 1398 Arg Gly Leu Cys Ala Leu Lys Phe Leu Lys Leu Glu Asp Phe Leu Asp 440 445 450 AAT GAG AGG CAT GAG GTG CAG CTG GAC ATG GAA CCC CAG GGC TGC CTG 1446 Asn Glu Arg His Glu Val Gln Leu Asp Met Glu Pro Gln Gly Cys Leu 455 460 465 470 GTG GCT GAG GTC ACC TTC CGC AAC CCT GTC ATT GAG AGG ATT CCT CGG 1494 Val Ala Glu Val Thr Phe Arg Asn Pro Val Ile Glu Arg Ile Pro Arg 475 480 485 CTC CGA CGG CAG AAG AAA ATT TTC TCC AAG CAG CAA GGG AAG GCG TTC 1542 Leu Arg Arg Gln Lys Lys Ile Phe Ser Lys Gln Gln Gly Lys Ala Phe 490 495 500 CAG CGT GCT AGG CAG ATG AAC ATC GAT GTC GCC ACG TGG GTG CGG CTG 1590 Gln Arg Ala Arg Gln Met Asn Ile Asp Val Ala Thr Trp Val Arg Leu 505 510 515 CTC CGG AGG CTC ATC CCC AAT GCC ACG GGC ACA GGC ACC TTT AGC CCT 1638 Leu Arg Arg Leu Ile Pro Asn Ala Thr Gly Thr Gly Thr Phe Ser Pro 520 525 530 GGG GCT TCT CCA GGA TCC GAG GCC CGG ACC ACG GGT GAC ATA TCG GTG 1686 Gly Ala Ser Pro Gly Ser Glu Ala Arg Thr Thr Gly Asp Ile Ser Val 535 540 545 550 GAG AAG CTG AAC CTC GGC ACT GAC TCG GAC AGC TCA CCT CAG AAG AGC 1734 Glu Lys Leu Asn Leu Gly Thr Asp Ser Asp Ser Ser Pro Gln Lys Ser 555 560 565 TCG CGG GAT CCT CCT TCC AGC CCA TCG AGC CTG AGC TCC CCC ATC CAG 1782 Ser Arg Asp Pro Pro Ser Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ser Pro Ile Gln 570 575 580 GAA TCC ACT GCT CCC GAG CTG CCT TCG GAG ACC CAG GAG ACC CCA GGC 1830 Glu Ser Thr Ala Pro Glu Leu Pro Ser Glu Thr Gln Glu Thr Pro Gly 585 590 595 CCC GCC CTG TGC AGC CCT CTG AGG AAG TCA CCT CTG ACC CTC GAA GAT 1878 Pro Ala Leu Cys Ser Pro Leu Arg Lys Ser Pro Leu Thr Leu Glu Asp 600 605 610 TTC AAG TTC CTG GCG GTG CTG GGC CGG GGT CAT TTT GGG AAG GTG CTC 1926 Phe Lys Phe Leu Ala Val Leu Gly Arg Gly His Phe Gly Lys Val Leu 615 620 625 630 CTC TCC GAA TTC CGG CCC AGT GGG GAG CTG TTC GCC ATC AAG GCT CTG 1974 Leu Ser Glu Phe Arg Pro Ser Gly Glu Leu Phe Ala Ile Lys Ala Leu 635 640 645 AAG AAA GGG GAC ATT GTG GCC CGA GAC GAG GTG GAG AGC CTG ATG TGT 2022 Lys Lys Gly Asp Ile Val Ala Arg Asp Glu Val Glu Ser Leu Met Cys 650 655 660 GAG AAG CGG ATA TTG GCG GCA GTG ACC AGT GCG GGA CAC CCC TTC CTG 2070 Glu Lys Arg Ile Leu Ala Ala Val Thr Ser Ala Gly His Pro Phe Leu 665 670 675 GTG AAC CTC TTC GGC TGT TTC CAG ACA CCG GAG CAC GTG TGC TTC GTG 2118 Val Asn Leu Phe Gly Cys Phe Gln Thr Pro Glu His Val Cys Phe Val 680 685 690 ATG GAG TAC TCG GCC GGT GGG GAC CTG ATG CTG CAC ATC CAC AGC GAC 2166 Met Glu Tyr Ser Ala Gly Gly Asp Leu Met Leu His Ile His Ser Asp 695 700 705 710 GTG TTC TCT GAG CCC CGT GCC ATC TTT TAT TCC GCC TGC GTG GTG CTG 2214 Val Phe Ser Glu Pro Arg Ala Ile Phe Tyr Ser Ala Cys Val Val Leu 715 720 725 GGC CTA CAG TTT CTT CAC GAA CAC AAG ATC GTC TAC AGG GAC CTG AAG 2262 Gly Leu Gln Phe Leu His Glu His Lys Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys 730 735 740 TTG GAC AAT TTG CTC CTG GAC ACC GAG GGC TAC GTC AAG ATC GCA GAC 2310 Leu Asp Asn Leu Leu Leu Asp Thr Glu Gly Tyr Val Lys Ile Ala Asp 745 750 755 TTT GGC CTC TGC AAG GAG GGG ATG GGC TAT GGG GAC CGG ACC AGC ACA 2358 Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Met Gly Tyr Gly Asp Arg Thr Ser Thr 760 765 770 TTC TGT GGG ACC CCG GAG TTC CTG GCC CCT GAG GTG CTG ACG GAC ACG 2406 Phe Cys Gly Thr Pro Glu Phe Leu Ala Pro Glu Val Leu Thr Asp Thr 775 780 785 790 TCG TAC ACG CGA GCT GTG GAC TGG TGG GGA CTG GGT GTG CTG CTC TAC 2454 Ser Tyr Thr Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Leu Leu Tyr 795 800 805 GAG ATG CTG GTT GGC GAG TCC CCA TTC CCA GGG GAT GAT GAG GAG GAG 2502 Glu Met Leu Val Gly Glu Ser Pro Phe Pro Gly Asp Asp Glu Glu Glu 810 815 820 GTC TTC GAC AGC ATC GTC AAC GAC GAG GTT CGC TAC CCC CGC TTC CTG 2550 Val Phe Asp Ser Ile Val Asn Asp Glu Val Arg Tyr Pro Arg Phe Leu 825 830 835 TCG GCC GAA GCC ATC GGC ATC ATG AGA AGG CTG CTT CGG AGG AAC CCA 2598 Ser Ala Glu Ala Ile Gly Ile Met Arg Arg Leu Leu Arg Arg Asn Pro 840 845 850 GAG CGG AGG CTG GGA TCT AGC GAG AGA GAT GCA GAA GAT GTG AAG AAA 2646 Glu Arg Arg Leu Gly Ser Ser Glu Arg Asp Ala Glu Asp Val Lys Lys 855 860 865 870 CAG CCC TTC TTC AGG ACT CTG GGC TGG GAA GCC CTG TTG GCC CGG CGC 2694 Gln Pro Phe Phe Arg Thr Leu Gly Trp Glu Ala Leu Leu Ala Arg Arg 875 880 885 CTG CCA CCG CCC TTT GTG CCC ACG CTG TCC GGC CGC ACC GAC GTC AGC 2742 Leu Pro Pro Pro Phe Val Pro Thr Leu Ser Gly Arg Thr Asp Val Ser 890 895 900 AAC TTC GAC GAG GAG TTC ACC GGG GAG GCC CCC ACA CTG AGC CCG CCC 2790 Asn Phe Asp Glu Glu Phe Thr Gly Glu Ala Pro Thr Leu Ser Pro Pro 905 910 915 CGC GAC GCG CGG CCC CTT ACA GCC GCG GAG CAG GCA GCC TTC CTG GAC 2838 Arg Asp Ala Arg Pro Leu Thr Ala Ala Glu Gln Ala Ala Phe Leu Asp 920 925 930 TTC GAC TTC GTG GCC GGG GGC TGC TAGCCCCCTC CCCTGCCCCT GCCCCTGCCC 2892 Phe Asp Phe Val Ala Gly Gly Cys 935 940 CTGCCCGAGA GCTCTTAGTT TTTAAAAAGG CCTTTGGGAT TTGCCGGAAA AAAAAAAAAA 2952 AAAAAAAAAG GAATTC 2968
【０２８０】配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：ヒト 配列 Arg Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Arg Lys Glu Leu Lys Leu Lys 1 5 10 15
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＥＡＥセファロース・カラム・クロマトグラ
フィーによるｐ１２８の精製の結果を示した電気泳動写
真である。 レーン１：ＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質アフィニティー
・カラムからの０．２Ｍ ＮａＣｌ溶出画分、レーン
２：ＤＥＡＥセファロース・カラムからの７５ｍＭ Ｎ
ａＣｌ溶出画分。
【図２】抗ＰＫＮ抗体を用いて、ｐ１２８のイムノブロ
ット解析を実施した結果を示した電気泳動写真である。 レーン１：免疫前（プレイミュン）血清、レーン２：抗
ＰＫＮ抗体。
【図３】ＰＫＮの自己リン酸化反応を示した電気泳動写
真である。 レーン１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン
４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡＡｓｐ３８、レーン
５：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒａｃ、レーン６：ＧＴＰγＳ・
ＧＳＴ−Ｒａｃ、レーン７：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａ
ｓ、レーン８：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ。
【図４】αＰＫＣペプチドに対するＰＫＮキナーゼ活性
のＲｈｏＡタンパク質による容量依存的な活性化を示し
た図である。
【図５】ＰＫＮのキナーゼ活性における様々な低分子量
Ｇタンパク質の効果を示した図である。
【図６】無細胞系での組換え型ＰＫＮとＧＴＰγＳ・Ｇ
ＳＴ−ＲｈｏＡ間の複合体形成を示した電気泳動写真で
ある。 レーン１：ＧＳＴ、レーン２：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒｈｏ
Ａ、レーン３：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、レーン
４：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡＡｓｐ３８、レーン
５：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｒａｃ、レーン６：ＧＴＰγＳ・
ＧＳＴ−Ｒａｃ、レーン７：ＧＤＰ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａ
ｓ、レーン８：ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−Ｈ−Ｒａｓ。
【図７】ＣＯＳ７細胞内におけるＰＫＮとＲｈｏＡタン
パク質間の複合体形成を示した電気泳動写真である。
「ｂｌｏｔ」はブロット、「ＩＰ」は免疫沈降、「ｃｙ
ｔｏｓｏｌ」サイトゾルをそれぞれ表す。
【図８】ＬＰＡによるＰＫＮ自己リン酸化反応の促進を
示した電気泳動写真である。 レーン１：無添加、レーン２：Ｃ３、レーン３：ＬＰ
Ａ、レーン４：Ｃ３＋ＬＰＡ。
【図９】酵母ツー・ハイブリッド・システム（two hybr
id system ）によるＰＫＮとＲｈｏＡタンパク質との結
合を示した写真（生物の形態の写真）である。
【図１０】ＮＦの各サブユニットの融合構築物の構造を
模式的に示した図である。ＮＦの各サブユニットの全長
配列は薄黒色のボックスで示してある。太いボックスは
ＮＦの各サブユニットのロッドドメインの位置を示して
いる。ＶＰ１６トランスアクチベーションドメイン（網
目状のボックス）、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン（斜
線を付けたボックス）、またはグルタチオンＳトランス
フェラーゼ（黒色のボックス）をＮＦの種々の欠失変異
（白色のボックス）と融合させた。ライブラリーから単
離したｐＧＡＤ１０−ＮＦＬ＃２１は図の最下部に示し
た。破線で示したボックスは欠失した配列部分を示して
いる。ＴはＴｔｈ１１１Ｉを、ＸはＸｈｏＩを、ＰはＰ
ｓｔＩを、ＢはＢｇｌＩＩを、ＫはＫｐｎＩを、それぞ
れ示す。
【図１１】ツー・ハイブリッド・システムによるＰＫＮ
とＮＦの結合の測定を示した写真（生物の形態の写真）
である。 （Ａ）ＶＰ１６転写活性化ドメインプラスミド（ｐＶＰ
１６；ライン７および10）、またはＮＦＬのヘッド・ロ
ッドドメイン（ｐＶＰ−ＮＦＬ＃２１；ライン１〜
３）、ＮＦＬのテールドメイン（ｐＶＰ−ＮＦＬｔ；ラ
イン４〜６）、ＰＫＮＮ１（ｐＶＰ−ＰＫＮＮ１；ライ
ン８および１１）およびＰＫＮＣ１（ｐＶＰ−ＰＫＮＣ
１；ライン９および１２）をコードする融合プラスミド
を、ＤＮＡ結合ドメインプラスミド（ｐＢＴＭ１１６；
ライン１および４）、あるいはＮＦＬのヘッド・ロッド
ドメイン（ｐＢＴＭ−ＮＦＬ＃２１；ライン７〜９）、
ＮＦＬのテールドメイン（ｐＢＴＭ−ＮＦＬｔ；ライン
１０〜１２）、ＰＫＮＮ１（ｐＢＴＭ−ＰＫＮＮ１；ラ
イン２および５）およびＰＫＮＮ１（ｐＢＴＭ−ＰＫＮ
Ｃ１；ライン３および６）をコードする融合プラスミド
と共に酵母中に形質転換した。 （Ｂ）ＮＦＬ（ｐＶＰ−ＮＦＬ＃２１；ライン１）、Ｎ
ＦＭ（ｐＶＰ−ＮＦＭｈｒ；ライン２）、およびＮＦＨ
（ｐＶＰ−ＮＦＨｈｒ；ライン３）のヘッド・ロッドド
メイン、並びにＮＦＬ（ｐＶＰ−ＮＦＬｔ；ライン
４）、ＮＦＭ（ｐＶＰ−ＮＦＭｔ；ライン５）、および
ＮＦＨ（ｐＶＰ−ＮＦＨｔ；ライン６）のテールドメイ
ンをコードするＶＰ１６転写活性化融合プラスミドをＰ
ＫＮＮ１をコードするＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミ
ド（ｐＢＴＭ−ＰＫＮＮ１；ライン１〜６）と共に酵母
中に形質転換した。各形質転換では、非選択（Ｈｉｓ
＋）プレートから５つの独立したコロニーを単離し、寒
天プレート上にこすりつけ、３週間増殖させた後β−ガ
ラクトシダーゼの産生を調べた。データは独立した３回
の形質転換体の代表例である。
【図１２】インビトロでのＰＫＮとＮＦの結合を示した
電気泳動写真である。インビトロ・トランスレーション
により作製した３５Ｓ標識ＰＫＮのＮ末端領域（ＰＫＮ
Ｎ２）、あるいはＣ末端領域（ＰＫＮＣ２）を、バクテ
リアで合成したＧＳＴ（レーン４、６、１０、および１
２）またはＧＳＴ−ＮＦＬの種々の欠失フラグメント
（ＧＳＴ−ＮＦＬ＃２１、レーン１、５、７および１
１；ＧＳＴ−ＮＦＬｄｅｌＡ、レーン２および８；ＧＳ
Ｔ−ＮＦＬｄｅｌＢ、レーン３および９）と共にインキ
ュベートした。タンパク質をグルタチオン−セファロー
スビーズ（Ｇ−Ｂｅａｄｓ）で集め、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ、オートラジオグラフィーにより実施例７に記載した
方法で分析した。図中、「Ｉｎｐｕｔ」は、Ｇ−Ｂｅａ
ｄｓ処理前の結合反応液の１０μｌを示している。「Ｇ
−Ｂｅａｄｓ」はＧ−Ｂｅａｄｓ処理後の沈殿物を示
す。図は３回の独立した実験の典型的な結果である。
【図１３】インビトロでのＰＫＮとＮＦの結合を示した
電気泳動写真である。インビトロ・トランスレーション
により作製した３５Ｓ標識ＰＫＮＮ２を、バクテリアで
合成したＧＳＴ（レーン４および８）、またはＧＳＴと
融合したＮＦＬ（ＧＳＴ−ＮＦＬ＃２１、レーン１およ
び５）、ＮＦＭ（ＧＳＴ−ＮＦＭｈｒ、レーン２および
６）およびＮＦＨ（ＧＳＴ−ＮＦＨｈｒ、レーン３およ
び７）のヘッド・ロッドドメインと共にインキュベート
した。グルタチオン−セファロースビーズ（Ｇ−Ｂｅａ
ｄｓ）を加えた後、試料を図１２と同様に処理した。図
中、「Ｉｎｐｕｔ」は、Ｇ−Ｂｅａｄｓ処理する前の結
合反応液の１０μｌを示している。「＋Ｇ−Ｂｅａｄ
ｓ」はＧ−Ｂｅａｄｓで処理した後の沈殿物を示す。標
識されたタンパク質の位置は矢印で示してある。タンパ
ク質分子量マーカーの位置は図の左側に示した。図は３
回の独立した実験の典型的な結果である。
【図１４】ＰＫＮによるＮＦのリン酸化を示した電気泳
動写真である。ａおよびｂは、40μＭのアラキドン酸存
在下（レーン２）、非存在下（レーン１）で精製ラット
ＰＫＮと共に30℃で５分間インキュベートした精製ウシ
ＮＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色およびオートラジオグ
ラフをそれぞれ示す。ＮＦＨ、ＮＦＭおよびＮＦＬはそ
れぞれレーン２の左側にＨ、ＭおよびＬで示される。
【図１５】ＰＫＮによるＮＦのリン酸化を示した電気泳
動写真である。ＰＫＮによるトリプレットタンパク質
（ＮＦＬ、ＮＦＭおよびＮＦＨから成る複合体）を含む
精製したウシＮＦのリン酸化の経時変化を示す。ラット
精製ＰＫＮおよび40μＭのアラキドン酸と共に30℃で０
分間（レーン１および６）、10分間（レーン２および
７）、30分間（レーン３および８）、60分間（レーン４
および９）および120 分間（レーン５および１０）イン
キュベートした脱リン酸化（レーン１〜５）およびリン
酸化（レーン６〜１０）されたＮＦを示すＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥのオートラジオグラフ。ＮＦＬ、ＮＦＭおよびＮＦ
Ｈはそれぞれレーン５および１０の右側にＬ、Ｍおよび
Ｈで示した。ＰＫＮの自己リン酸化の位置は白矢印で示
した。分子量サイズマーカーの位置は左側に示した。
【図１６】ＰＫＮによるＮＦのリン酸化を示した図であ
る。各ＮＦタンパク質中に取り込まれた放射能標識の量
を示す。白丸：アルカリホスファターゼで予め処理した
ＮＦＬ（ｄＬで示す）、黒丸：アルカリホスファターゼ
で処理してないＮＦＬ（Ｌで示す）、白三角形：アルカ
リホスファターゼで予め処理したＮＦＨ（ｄＨで示
す）、黒三角形：アルカリホスファターゼで処理してな
いＮＦＨ（Ｈで示す）、白四角形：アルカリホスファタ
ーゼで予め処理したＮＦＭ（ｄＭで示す）、黒四角形：
アルカリホスファターゼで処理してないＮＦＭ（Ｍで示
す）。データは独立した３回の実験の代表例である。
【図１７】ＮＦの各サブユニットのヘッド・ロッドドメ
インが被リン酸化されることを示した電気泳動写真であ
る。（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ、ＰＫＮでリン酸化
されたＧＳＴとＮＦ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
のタンパク質染色およびオートラジオグラフを示す。Ｇ
ＳＴ−ＮＦＬ（ＧＳＴ−ＮＦＬ＃２１；レーン１）、Ｇ
ＳＴ−ＮＦＭ（ＧＳＴ−ＮＦＭｈｒ；レーン３）および
ＧＳＴ−ＮＦＨ（ＧＳＴ−ＮＦＨｈｒ；レーン５）のヘ
ッド・ロッドドメイン、並びにＧＳＴ−ＮＦＬ（ＧＳＴ
−ＮＦＬｔ；レーン２）、ＧＳＴ−ＮＦＭ（ＧＳＴ−Ｎ
ＦＭｔ；レーン４）およびＧＳＴ−ＮＦＨ（ＧＳＴ−Ｎ
ＦＨｔ；レーン６）のテールドメインを、ラット精製Ｐ
ＫＮおよび40μＭのアラキドン酸と共に実施例９に記載
したようにして30℃で10分間インキュベートした。ＧＳ
Ｔ−ＮＦＬ、ＮＦＭおよびＮＦＨのテールドメインの位
置は（Ａ）のレーン６の右側にそれぞれＬ、ＭおよびＨ
で示した。ＰＫＮの自己リン酸化の位置は（Ｂ）の白矢
印で示した。ＧＳＴ−ＮＦサブユニットのヘッド・ロッ
ドドメインの位置は黒矢印で示した。
【図１８】ＮＦＬの重合に与えるリン酸化の影響を示し
た電気泳動写真である。インビトロ・トランスレーショ
ンにより作製した３５Ｓ標識ＮＦＬとラット精製ＰＫＮ
を、バクテリアで合成したＧＳＴ（レーン５および１
０）、ＧＳＴ−ＮＦＬのヘッド・ロッドドメイン（ＧＳ
Ｔ−ＮＦＬ＃２１；レーン１、２、６および７）または
ＧＳＴ−全長ＮＦＬ（ＧＳＴ−ＮＦＬｆ；レーン３、
４、８および９）と共に、100 μＭのＡＴＰ存在下（レ
ーン２、４、７および９）および非存在下で（レーン
１、３、５、６、８、１０）インキュベートした。ＧＳ
ＴまたはＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファ
ロース−ビーズ（Ｇ−Ｂｅａｄｓ）と共に集め、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ、そして続いてオートラジオグラフィーで実
施例１０に記載したようにして分析した。「Ｉｎｐｕ
ｔ」はＧ−Ｂｅａｄｓで処理する前の反応液、「＋Ｇ−
Ｂｅａｄｓ」はＧ−Ｂｅａｄｓ処理した後の沈殿物を示
す。図は独立した３回の実験の典型的な結果である。
【図１９】ツー・ハイブリッド・システムによるＰＫＮ
のアミノ末端領域とカルボキシル末端領域との結合を示
した写真（生物の形態の写真）である。
【図２０】ＰＫＮの各部分のインビトロでの結合を示し
た電気泳動写真である。インビトロ翻訳し、３５Ｓで標
識したアミノ末端領域（レーン１、２、５、６）または
カルボキシル末端領域（レーン３、４、７、８）をバク
テリアで合成したＧＳＴ（レーン１、３、５、７）また
はＰＫＮのアミノ末端領域に融合したＧＳＴ（レーン
４、８）またはＰＫＮのカルボキシル末端領域に融合し
たＧＳＴ（レーン２、６）とともにインキュベートし
た。実施例２に記載の方法に従って、タンパク質をグル
タチオン・セファロースビーズ（Ｇ−Ｂｅａｄｓ）で集
め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、オートラジオグラフィーに
より分析した。インプットは沈降前に回収した１０μｌ
のイニシャル結合反応液を示している。標識したタンパ
ク質の位置は矢印で示した。「Ｉｎｐｕｔ」はＧ−Ｂｅ
ａｄｓで処理する前の反応液、「＋Ｇ−Ｂｅａｄｓ」は
Ｇ−Ｂｅａｄｓ処理した後の沈殿物を示す。タンパク質
マーカーの位置を右側に示した（ｋＤａ）。図は３回の
独立した実験からの代表例である。
【図２１】ＰＫＮによる［Ｓｅｒ４６］ＰＫＮ（３９−
５３）のリン酸化を示した図である。実施例１３に記載
された方法に従って、［Ｓｅｒ４６］ＰＫＮ（３９−５
３）ペプチドを精製ＰＫＮによってリン酸化した。デー
タのダブル・レシプロカル・プロットが示されている。
結果は、デュプリケートして行った独立した実験からの
ｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．である。
【図２２】合成ペプチドを用いたＰＫＮのプロテインキ
ナーゼ活性の阻害を示した図である。リン酸化されたペ
プチド基質を、相当するＫｍ濃度（δＰＫＣペプチドは
１０μＭ、Kemptideは１６μＭ）で、様々な濃度のＰＫ
Ｎ（３９−５３）ペプチドまたはＰＫＮ（５４−７３）
ペプチドの存在下で使用した。ＰＫＮはδＰＫＣペプチ
ドを基質として、ＰＫＮ（３９−５３）ペプチド（黒
丸）またはＰＫＮ（５４−７３）ペプチド（白丸）をイ
ンヒビターとして用いて測定した。ＰＫＡはKemptideを
基質とし、ＰＫＮ（３９−５３）ペプチドをインヒビタ
ーとして用いて測定した（白四角形）。プロテインキナ
ーゼ活性は実施例１３および１４に記載された方法に従
って決定した。結果は、デュプリケートして行った独立
した実験からのｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．である。
【図２３】ＰＫＮのプロテインキナーゼ活性におけるＰ
ＫＮ（３９−５３）ペプチドの効果を示した図である。 （Ａ）様々なＰＫＮ（３９−５３）濃度でのダブル・レ
シプロカル・プロット。ＰＫＮ（３９−５３）の濃度は
それぞれ、０（黒四角形）、４０（白四角形）、８０
（黒三角形）および１２０（白三角形）μＭである。δ
ＰＫＣペプチドの濃度はそれぞれ、１０、２０、４０、
８０μＭである。プロテインキナーゼ活性は実施例１３
および１４に記載された方法にしたがって決定した。 （Ｂ）阻害剤に対する見かけのＫｍ／Ｖｍａｘのセカン
ダリー・プロット。結果は、デュプリケートして行った
独立した実験からのｍｅａｎ±Ｓ．Ｅ．である。
【図２４】酵母ツー・ハイブリッド・システムを用いた
ＰＫＮとＲｈｏタンパク質との結合を示した写真（生物
の形態の写真）である。「ＰＫＮ」はＰＫＮのＮ末端調
節領域を示す。「ＣＬＶＬ−」はＣ末端の脂質修飾部位
を欠失したＲｈｏＡタンパク質の欠失変異体を示す。結
果は３回の独立した実験からの代表例である。
【図２５】酵母ツー・ハイブリッド・システムを用いた
ＰＫＮとＲｈｏタンパク質との結合を示した図である。
結合の程度は、β−ガラクトシダーゼ活性として示され
ている。ＰＫＮの全構造の模式図が図の最上段に、その
欠失変異体の構造がその下に、それぞれ描かれている。
「ＬＺ」はロイシン・ジッパー様モチーフを示す。「＋
＋＋」や「＋＋」はそれぞれアッセイの開始から２０お
よび６０分以内での強い発色を意味する。「−」は２４
時間以内に発色しなかったことを意味する。
【図２６】Ｒｈｏタンパク質とＰＫＮのＮ末端調節領域
との結合を示した電気泳動写真である。結果は３回の独
立した実験からの代表例である。「Ｉｎｐｕｔ」はＧ−
Ｂｅａｄｓで処理する前の反応液、「＋Ｇ−Ｂｅａｄ
ｓ」はＧ−Ｂｅａｄｓ処理した後の沈殿物を示す。
【図２７】ＰＫＮの部分ペプチドによるＲｈｏタンパク
質とＰＫＮのＮ末端調節領域との結合阻害を示した電気
泳動写真である。図に示した濃度のＰＫＮの部分ペプチ
ドの存在下で、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡをインビ
トロ翻訳したＰＫＮとともにインキュベーションした。
結果は３回の独立した実験からの代表例である。
【図２８】ＰＫＮの部分ペプチドによるＲｈｏタンパク
質とＰＫＮのＮ末端調節領域との結合阻害を示した電気
泳動写真である。写真に示した濃度のＰＫＮの部分ペプ
チドの存在下で、ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡをイン
ビトロ翻訳したＰＫＮとともにインキュベーションし
た。結果は３回の独立した実験からの代表例である。
【図２９】ＲｈｏＡタンパク質内在性ＧＴＰａｓｅ活性
に対するＰＫＮのＮ末端領域の影響を示した図である。
［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡ（黒丸、白
丸、バツ印）またはＧＳＴ−ＲｈｏＡＶａｌ１４（白三
角形）を、ＧＳＴ−ＰＫＮの存在下（黒丸）または非存
在下（白丸）またはＧＳＴ（バツ印）とともに、記載の
時間インキュベートし、結合している放射能活性をフィ
ルター結合アッセイによって測定した。各々のタンパク
質に結合している残存［γ−３２Ｐ］ＧＴＰが、インキ
ュベーションの０分時点で測定した残存［γ−３２Ｐ］
ＧＴＰのパーセントとして表現されている。結果は３回
の独立した実験からの代表例である。
【図３０】Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅ活性に対する
ＰＫＮのＮ末端領域の影響を示した図である。ＧＴＰａ
ｓｅに対するＰＫＮの用量依存的な効果が示されてい
る。［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡを１０分
間、様々な濃度のＰＫＮのＮ末端領域のＧＳＴ融合タン
パク質とともにインキュベーションした。結果は３回の
独立した実験からの代表例である。
【図３１】ＧＡＰによって刺激されたＲｈｏタンパク質
内在性ＧＴＰａｓｅ活性に対するＰＫＮの効果を示した
図である。１００ｎＭの［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ・ＧＳＴ
−ＲｈｏＡをＧＳＴ−ＲｈｏＧＡＰおよびＭＢＰ−ＰＫ
Ｎの存在下でインキュベーションした。結果は３回の独
立した実験からの代表例である。
【図３２】ＰＫＮのイムノブロッティングを示した電気
泳動写真である。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン１、４、
７、８）、Ｒａｔ−１細胞（レーン２、５）、およびＢ
ａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞（レーン３、６）からの細胞ライ
ゼート（５０μｇのタンパク質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、
次いでイムノブロットにかけた。タンパク質をクマジー
・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）で染色した（レーン
１〜３）。αＣ６（レーン４〜６）、αＮ２（レーン
７）、およびαＦ１（レーン８）を使用して、免疫染色
を実施した。マーカータンパク質の位置をｋＤａで、Ｐ
ＫＮの位置を矢印で示す。
【図３３】ＰＫＮの細胞内分布へのヒートショックの効
果を示した電気泳動写真である。細胞を４２℃において
９０分間処理し、ホモジェナイズし、サイトゾル
（Ｃ）、原形質膜（Ｍ）および核（Ｎ）の画分に分画し
た。αＣ６を使用するイムノブロッティングにより、Ｐ
ＫＮを検出した。対照未処理細胞（ａ）およびヒートシ
ョック細胞（ｂ）におけるＰＫＮの位置を矢印で示す。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞：各レーンは全部で１９μｇのタンパ
ク質を含有する。Ｒａｔ−１細胞：各レーンは全部で１
１μｇのタンパク質を含有する。Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細
胞：各レーンは全部で１１μｇのタンパク質を含有す
る。
【図３４】ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのヒートショックの効果
をＰＫＮ免疫染色によって示した写真（生物の形態の写
真）である。対照となる未処理細胞（ａ〜ｄ）、４２℃
において９０分間処理した細胞（ｅ〜ｈ）、およびヒー
トショック後９０分に３７℃において２４０分間インキ
ュベートした細胞（ｉ〜１）を各抗血清で免疫染色し
た。１次抗血清はαＣ６（ａ、ｅ、ｉ）、αＮ２（ｂ、
ｆ、ｊ）、αＦ１（ｃ、ｇ、ｋ）、およびαＰＰ２Ａ
（ｄ、ｈ、１）であった。
【図３５】Ｒａｔ−１およびＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞に
対するヒートショックの効果をＰＫＮ免疫染色によって
示した写真（生物の形態の写真）である。Ｒａｔ−１
（ａ、ｃ、ｅ）およびＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３（ｂ、ｄ、
ｆ）細胞を４２℃のヒートショックに曝した。１次抗血
清はαＣ６であった。対照未処理細胞（ａ、ｂ）；ヒー
トショック後９０分の細胞（ｃ、ｄ）；ヒートショック
（９０分間）後に３７℃において２４０分間インキュベ
ートした細胞（ｅ、ｆ）。
【図３６】ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのヒートショックの効果
を示した写真（生物の形態の写真）である。対照未処理
細胞（ａ）および４２℃において９０分間処理した細胞
（ｂ）をαＣ６で免疫染色し、共焦点レーザー走査顕微
鏡で観察した。細胞の下部からの光学的切断を、図示し
た深度において実施した。
【図３７】ＰＫＮの免疫蛍光染色に対する亜ヒ酸ナトリ
ウムの効果を示した写真（生物の形態の写真）である。
対照未処理細胞（ａ）および５０μＭの亜ヒ酸ナトリウ
ムで３７℃、２時問処理した細胞（ｂ）をαＣ６で免疫
染色した。
【図３８】ＰＫＮの免疫蛍光染色に対する血清飢餓の効
果を示した写真（生物の形態の写真）である。対照とな
る未処理細胞（ａ）、３７℃において２４時間血清飢餓
とした細胞（ｂ）、および血清飢餓の後３７℃において
１０％ ＦＣＳと４時間インキュベートした細胞（ｃ）
をαＣ６で免疫染色した。
【図３９】ＰＫＮ−ＰＫ- 変異体タンパク質を過剰に発
現するＰＫ- ／ｎｅｏ＃５細胞でのヒートショックの効
果をＰＫＮのイムノブロッティングおよび自己リン酸化
によって示した電気泳動写真である。野生型ＮＩＨ３Ｔ
３細胞（レーン１、３、５）およびＰＫ- ／ｎｅｏ＃５
細胞（レーン２、４、６）のライゼートをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ、そしてタンパク質をクマジー・ブリリアン
ト・ブルー（ＣＢＢ）を用いて染色し（レーン１、
２）、その後イムノブロッティングをαＣ６で実施した
（レーン３、４）。αＮ２を使用してこれらの細胞から
免疫沈降を実施した。免疫沈降物を自己リン酸化し、そ
してＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いでオートラジオグラ
フィーにかけた（レーン５、６）。マーカータンパク質
の位置をｋＤａで示し、そしてＰＫＮの位置を矢印で示
す。
【図４０】ＰＫＮ−ＰＫ- 変異体タンパク質を過剰に発
現するＰＫ- ／ｎｅｏ＃５細胞でのヒートショックの効
果をＰＫＮの免疫蛍光によって示した写真（生物の形態
の写真）である。対照となる未処理細胞（ａ）、４２℃
において９０分間処理した細胞（ｂ）、および４４℃に
おいて９０分間処理した細胞（ｃ）を抗血清αＣ６で免
疫染色した。核の中心における光学的切断を共焦点レー
ザ一顕微鏡を使用して細胞の下部から２．５μｍにおい
て実施した。
【図４１】ヒトＰＫＮの発現構築物、およびツー・ハイ
ブリッド・システムによるそれらの結合の結果を概略的
に表示した図である。タンパク質の全構造の概略は各図
面の上部に示されており、タンパク質の欠失突然変異体
をその下に整列させた。各ラインの前および後の数字
は、黒塗りのボックスまたは白抜きボックスにより示さ
れている各クローンの両末端のアミノ酸残基の位置を示
す。ツー・ハイブリッド・システムによる結合は、β−
ガラクトシダーゼ活性についてのフィルターアッセイに
より試験した。「＋＋＋」および「＋」は、それぞれ、
アッセイの開始後から２０分および２４時間以内の青色
の発色を示す。「±」はアッセイの開始から２４時間後
の淡い青色の発色を示し、「−」は２４時間以内の発色
がないことを示している。Ｇａｌ４ｂｄおよびＬｅｘＡ
ｂｄは、それぞれ、Ｇａｌ４およびＬｅｘＡのＤＮＡ結
合ドメインを示す。Ｇａｌ４ａｄおよびＶＰ１６ａｄ
は、それぞれ、Ｇａｌ４およびＶＰ１６の転写活性化ド
メインを示す。「ＬＺ」はロイシンジッパー様モチーフ
を示す。「ＢＲ」は塩基性アミノ酸に富んだ領域を示
す。黒塗りボックスはバイト構築物を示す。
【図４２】ＨｕＡｃｔＳｋ１（骨格筋型α−アクチニ
ン）およびＨｕＡｃｔＮｍ（非骨格筋型α−アクチニ
ン）の発現構築物、およびツー・ハイブリッド・システ
ムによるそれらの結合の結果を概略的に表示した図であ
る。図中の略号は図４１と同義である。「ＳＲ」はスペ
クトリン様リピートを示す。
【図４３】ツー・ハイブリッド・システムにおけるＰＫ
ＮとＨｕＡｃｔＳｋ１との結合を示した写真である。Ｐ
ＫＮＮ１（レーン１〜４）またはネズミ腫瘍サプレッサ
ーｐ５３（アミノ酸７２−３９０）（レーン５〜８）を
ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質とし
て発現させ、Ｇａｌ４活性化ドメインをもつ融合タンパ
ク質として発現したＳＶ４０のlarge Ｔ抗原（アミノ酸
８４−７０８）（レーン１および５）、クローン＃２１
タンパク質（２および６）、クローン＃４タンパク質
（３および７）、およびクローン＃１０タンパク質（４
および８）との結合をβ−ガラクトシダーゼ活性につい
てのフィルターアッセイにより試験した。クローン＃２
１はニューロフィラメントＬタンパク質のヘッド−ロッ
ドドメインをコードする（Mukai, H. et al., J. Biol.
Chem., 271, 9816-9822 (1996) ）。ＴｒｐおよびＬｅ
ｕを欠如する選択したプレートから分離した独立のコロ
ニーのフィルターアッセイ開始後１時間における、青色
の発色が示されている。
【図４４】ＰＫＮとＨｕＡｃｔＳｋ１との間のインビト
ロ結合分析を示した電気泳動写真である。３５Ｓ標識し
たインビトロ翻訳ＰＫＮのＮ−末端領域（アミノ酸１−
４７４、この領域はＰＫＮＮ２と表示した；レーン１〜
７および１１〜１７）またはＰＫＮ△Ｂａｌのそれ（ア
ミノ酸１３６−４７４；レーン８〜１０および１８〜２
０）を、大腸菌で合成したＧＳＴまたはＧＳＴと図４２
に示すようなＨｕＡｃｔＳｋ１の種々の欠失突然変異体
と融合タンパク質とをインキュベートした。初期の結合
反応混合液のアリコート（１０μｌ）を沈降の前に取り
出し、電気泳動にかけた（これらの電気泳動は上図に
「Ｉｎｐｕｔ」と表示した）。ＧＳＴまたはＧＳＴ融合
タンパク質をグルタチオン−セファロースビーズで集
め、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでオートラジオグ
ラフィーにより分析した（これらは下図に「Ｇ−ｂｅａ
ｄｓ」と表示した）。レーン１および１１、ＧＳＴ−Ｈ
ｕＡｃｔＳｋ１（３３３−４２３）；レーン２、８、１
２、および１８、ＧＳＴ−ＨｕＡｃｔＳｋ１（４２３−
６５３）；レーン３、９、１３、および１９、ＧＳＴ−
ＨｕＡｃｔＳｋ１（６５３−８３７）；レーン４および
１４、ＧＳＴ−ＨｕＡｃｔＳｋ１（８３７−８９４）；
レーン５および１５、ＧＳＴ−ＨｕＡｃｔＳｋ１（４８
６−６０７）；レーン６および１６、ＧＳＴ−ＨｕＡｃ
ｔＳｋ１（６０４−７１９）；レーン７、１０、１７、
および２０、ＧＳＴ。白色の矢じり印は標識化ＰＫＮＮ
２の位置を示し、黒色の矢じり印は標識化ＰＫＮ△Ｂａ
ｌの位置を示す。分子量マーカーはｋＤａで示されてい
る。
【図４５】ＰＫＮとＨｕＡｃｔＮｍとの結合を示した電
気泳動写真である。３５Ｓ標識化インビトロ翻訳ＰＫＮ
Ｎ２を、大腸菌で合成したＧＳＴまたは第４２図に示す
ようなＨｕＡｃｔＮｍのＧＳＴ融合された種々の欠失突
然変異体とインキュベートした。初期の結合反応混合液
のアリコート（１０μｌ）を沈降の前に取り出し、電気
泳動にかけた（これらを「Ｉｎｐｕｔ」と表示した）。
ＧＳＴまたはＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン−セ
ファロースビーズで集め、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、
次いでオートラジオグラフィーにより分析した。白色の
矢じり印は標識化タンパク質の位置を示す。分子量マー
カーはｋＤａで示されている。 Ａ：ＰＫＮとＨｕＡｃｔＮｍの欠失突然変異体との特異
的結合。レーン１および４、ＧＳＴ−ＨｕＡｃｔＮｍ
（アミノ酸４７９−６００）；レーン２および５、ＧＳ
Ｔ−ＨｕＡｃｔＮｍ（アミノ酸７１２−８３４）；レー
ン３および６、ＧＳＴ。 Ｂ：ＨｕＡｃｔＮｍのＥＦ−ハンド様領域との結合に対
するＣａ２＋の効果。ＧＳＴ−ＨｕＡｃｔＮｍ（アミノ
酸７１２−８３４）を、Ｃａ２＋の非存在下（レーン１
および３）または１ｍＭのＣａ２＋の存在下（レーン２
および４）において、インビトロ翻訳ＰＫＮとインキュ
ベートした。
【図４６】α−アクチニンのスペクトリン様リピートと
ＰＫＮとの特異的結合を示した電気泳動写真である。
３５Ｓ標識化インビトロ翻訳ＰＫＮＮ２を、大腸菌で合
成したＧＳＴまたはＧＳＴと融合したα−アクチニンの
スペクトリン様リピートまたはα−スペクトリンのスペ
クトリンリピートとインキュベートした。初期の結合反
応混合物のアリコート（１０μｌ）を沈降の前に取り出
し、電気泳動にかけた（これらを「Ｉｎｐｕｔ」と表示
した）。ＧＳＴまたはＧＳＴ融合タンパク質をグルタチ
オン−セファロースビーズで集め、１０％のＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ、次いでオートラジオグラフィーにより分析し
た。白色の矢じり印は標識化タンパク質の位置を示す。
分子量マーカーはｋＤａで示されている。レーン１およ
び５、ＧＳＴ−ＨｕＡｃｔＳｋ１のスペクトリン様リピ
ート３（アミノ酸４８６−６０７）；レーン２および
６、ＧＳＴ−ＨｕＡｃｔＮｍのスペクトリン様リピート
３（アミノ酸４７９−６００）；レーン３および７、Ｇ
ＳＴ−α−スペクトリンのスペクトリンリピート２０；
レーン４および８、ＧＳＴ。
【図４７】ＰＫＮとＨｕＡｃｔＳｋ１とのインビボ結合
を示した電気泳動写真である。ＨｕＡｃｔＳｋ１のアミ
ノ酸３３３−８９４に融合したＨＡエピトープをコード
するベクターｐＨＡ−Ａｃｔ（レーン１、３、５）、ま
たはｐＨＡベクター（２、４、６）を、全長のヒトＰＫ
Ｎをコードする発現ベクターｐＭｈＰＫＮ３（Mukai,
H. & Ono, Y., Biochem. Biopys. Res. Commun. 199, 8
97-904 (1994)）とともにＣＯＳ７細胞の中に共トラン
スフェクションした。細胞を抽出し、組換えポリペプチ
ドを抗ＨＡ抗体１２ＣＡ５を使用して免疫沈降させた。
各抽出物（レーン３〜６）および各免疫沈降物（レーン
１〜２）の中のＰＫＮおよびＨｕＡｃｔＳｋ１を、それ
ぞれ、抗ＰＫＮ抗血清αＣ６（レーン１〜４）および１
２ＣＡ５（レーン５および６）を使用して免疫沈降によ
り検出した。白色の矢印はＰＫＮの位置を示す。黒色の
矢印はＨＡ−ＨｕＡｃｔＳｋ１の位置を示す。
【図４８】ＰＫＮとα−アクチニンとの結合に対するＰ
Ｉ４，５Ｐ２の効果を示した電気泳動写真である。３５
Ｓで標識したインビトロ翻訳されたＨｕＡｃｔＳｋ１の
全長のコーディング領域を、大腸菌で合成したＧＳＴま
たはＧＳＴ融合ＰＫＮＮ１とインキュベートした。初期
の結合反応混合液のアリコート（１０μｌ）を沈降の前
に取り出し、電気泳動にかけた（これらを「Ｉｎｐｕ
ｔ」と表示した）。ＧＳＴまたはＧＳＴ融合タンパク質
をグルタチオン−セファロースビーズで集め、８％のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでオートラジオグラフィーにより
分析した。矢印は標識化ＨｕＡｃｔＳｋ１の位置を示
す。 Ａ：１０μＭのＰＩ４，５Ｐ２の非存在下（レーン１、
２、５、および６）または存在下（レーン３、４、７、
および８）における全長のα−アクチニンとＰＫＮとの
特異的結合。レーン１、３、５、および７、ＧＳＴ−Ｐ
ＫＮＮ１；レーン２、４、６、および８、ＧＳＴ。 Ｂ：全長のα−アクチニンとＰＫＮとの結合活性に対す
るＰＩ４，５Ｐ２の濃度の効果。レーン１および６、０
μＭのＰＩ４，５Ｐ２；レーン２および７、２．５μＭ
のＰＩ４，５Ｐ２；レーン３および８、１０μＭのＰＩ
４，５Ｐ２；レーン４および９、３０μＭのＰＩ４，５
Ｐ２；レーン５および１０、１００μＭのＰＩ４，５Ｐ
２。
【図４９】ＰＫＮによるアクチンおよびアクチン結合タ
ンパク質のリン酸化を示した電気泳動写真である。１０
０ｎｇの精製Ｇ−アクチン（レーン１〜３）またはカル
デスモン（レーン４〜６）を、ラット睾丸から精製され
たＰＫＮ非存在下（レーン１および４）か、または存在
下（レーン２、３、５、および６）のアッセイ混合液の
中で、４０μＭのアラキドン酸の非存在下（レーン２お
よび５）または存在下（レーン３および６）においてイ
ンキュベートした。１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥのオート
ラジオグラフィーにより、リン酸化を検出した。白色の
矢じり印はＰＫＮの自己リン酸化の位置を示す。黒色の
矢印はカルデスモンの位置を示し、黒色の矢じり印はＧ
−アクチンの位置を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 9452−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ａ６１Ｋ 37/52 ＡＤＵ // Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願平8−114226 (32)優先日 平８(1996)４月11日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 特許法第30条第１項適用申請有り 1995年Ｖｏｌ．67, Ｎｏ．７ 発行の「生化学Ｖｏｌ．67，Ｎｏ．７」に発 表

Claims (66)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、か
    つプロテインキナーゼ活性を有さないプロテインキナー
    ゼＮの改変アミノ酸配列を有する、ペプチドまたはその
    誘導体。
  2. 【請求項２】活性型Ｒｈｏタンパク質とプロテインキナ
    ーゼＮとの結合を阻害するプロテインキナーゼＮの改変
    アミノ酸配列を有する、ペプチドまたはその誘導体。
  3. 【請求項３】活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、プ
    ロテインキナーゼ活性を有さず、そして活性型Ｒｈｏタ
    ンパク質とプロテインキナーゼＮとの結合を阻害するプ
    ロテインキナーゼＮの改変アミノ酸配列を有する、ペプ
    チドまたはその誘導体。
  4. 【請求項４】Ｒｈｏタンパク質が、ＲｈｏＡタンパク
    質、ＲｈｏＢタンパク質、ＲｈｏＣタンパク質、および
    ＲｈｏＧタンパク質からなる群から選択されるものであ
    る、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまた
    はその誘導体。
  5. 【請求項５】活性型ＲｈｏＡタンパク質結合能を有し、
    かつセリン／スレオニン・プロテインキナーゼ活性を有
    さないヒト−プロテインキナーゼＮの改変アミノ酸配列
    を有する、ペプチドまたはその誘導体。
  6. 【請求項６】活性型ＲｈｏＡタンパク質結合能を有し、
    セリン／スレオニン・プロテインキナーゼ活性を有さ
    ず、そして活性型ＲｈｏＡタンパク質とプロテインキナ
    ーゼＮとの結合を阻害するヒト−プロテインキナーゼＮ
    の改変アミノ酸配列を有する、ペプチドまたはその誘導
    体。
  7. 【請求項７】改変アミノ酸配列が配列番号１の７〜５４
    ０番、７〜１５５番、１〜５４０番、３〜１３５番、も
    しくは３３〜１１１番のアミノ酸配列、または活性型Ｒ
    ｈｏタンパク質結合能および／または活性型Ｒｈｏタン
    パク質とプロテインキナーゼＮとの結合阻害能を有する
    これらの改変アミノ酸配列からなる、請求項１〜６のい
    ずれか一項に記載のペプチドまたはその誘導体。
  8. 【請求項８】改変アミノ酸配列が配列番号１の７４〜９
    ３番、９４〜１１３番、もしくは８２〜１０３番のアミ
    ノ酸配列、または活性型Ｒｈｏタンパク質結合能および
    ／または活性型Ｒｈｏタンパク質とプロテインキナーゼ
    Ｎとの結合阻害能を有するこれらの改変アミノ酸配列か
    らなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド
    またはその誘導体。
  9. 【請求項９】中間径フィラメント結合能を有し、かつプ
    ロテインキナーゼ活性を有さないプロテインキナーゼＮ
    の改変アミノ酸配列を有する、ペプチドまたはその誘導
    体。
  10. 【請求項１０】中間径フィラメントが、ビメンチン、ニ
    ューロフィラメント−Ｌ、ニューロフィラメント−Ｍ、
    ニューロフィラメント−Ｈ、酸性ケラチン、中性ケラチ
    ン、塩基性ケラチン、デスミン、グリア線維酸性蛋白質
    （ＧＦＡＰ）、ラミン、およびネスチンからなる群から
    選択されるものである、請求項９に記載のペプチドまた
    はその誘導体。
  11. 【請求項１１】前記改変アミノ酸配列が、配列番号１の
    １〜５４０番、１〜３２番、１１２〜５４０番もしくは
    １１２〜４７４番のアミノ酸配列または中間径フィラメ
    ント結合能を有するこれらの改変アミノ酸配列である、
    請求項９または１０に記載のペプチドまたはその誘導
    体。
  12. 【請求項１２】α−アクチニン結合能を有し、かつプロ
    テインキナーゼ活性を有さないプロテインキナーゼＮの
    改変アミノ酸配列を有する、ペプチドまたはその誘導
    体。
  13. 【請求項１３】α−アクチニンが、骨格筋型または非骨
    格筋型である、請求項１２に記載のペプチドまたはその
    誘導体。
  14. 【請求項１４】前記改変アミノ酸配列が、配列番号１の
    １〜５４０番、３〜１３５番、１３６〜５４０番、もし
    くは１３６〜１８９番のアミノ酸配列またはα−アクチ
    ニン結合能を有するこれらの改変アミノ酸配列である、
    請求項１２または１３に記載のペプチドまたはその誘導
    体。
  15. 【請求項１５】プロテインキナーゼＮのプロテインキナ
    ーゼ触媒領域結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活
    性を有さないプロテインキナーゼＮの改変アミノ酸配列
    を有する、ペプチドまたはその誘導体。
  16. 【請求項１６】前記改変アミノ酸配列が、配列番号１の
    １〜５４０番もしくは１〜４７４番のアミノ酸配列また
    はプロテインキナーゼＮのプロテインキナーゼ触媒領域
    結合能を有するこれらの改変アミノ酸配列である、請求
    項１５に記載のペプチドまたはその誘導体。
  17. 【請求項１７】プロテインキナーゼＮのプロテインキナ
    ーゼの活性を阻害し、かつプロテインキナーゼ活性を有
    さないプロテインキナーゼＮの改変アミノ酸配列を有す
    る、ペプチドまたはその誘導体。
  18. 【請求項１８】前記改変アミノ酸配列が、配列番号１の
    ３９〜５３番のアミノ酸配列またはプロテインキナーゼ
    の活性阻害能を有するその改変アミノ酸配列である、請
    求項１７に記載のペプチドまたはその誘導体。
  19. 【請求項１９】プロテインキナーゼＮのプロテインキナ
    ーゼ触媒領域結合能を有し、プロテインキナーゼＮのプ
    ロテインキナーゼ活性を阻害し、かつプロテインキナー
    ゼ活性を有さないプロテインキナーゼＮの改変アミノ酸
    配列を有する、ペプチドまたはその誘導体。
  20. 【請求項２０】前記改変アミノ酸配列が、配列番号１の
    １〜５４０番、１〜４７４番もしくは３９〜５３番のア
    ミノ酸配列、またはプロテインキナーゼＮのプロテイン
    キナーゼ触媒領域結合能を有し、かつプロテインキナー
    ゼＮのプロテインキナーゼ活性阻害能を有するこれらの
    改変アミノ酸配列である、請求項１９に記載のペプチド
    またはその誘導体。
  21. 【請求項２１】細胞質から核へのプロテインキナーゼＮ
    の移行を阻害する、請求項１〜２０のいずれか一項に記
    載のペプチドまたはその誘導体。
  22. 【請求項２２】プロテインキナーゼＮによりリン酸化さ
    れ、かつプロテインキナーゼ活性を有さないプロテイン
    キナーゼＮの改変アミノ酸配列を有する、ペプチドまた
    はその誘導体。
  23. 【請求項２３】前記改変アミノ酸配列が、配列番号２に
    記載される配列またはプロテインキナーゼＮによりリン
    酸化されるその改変アミノ酸配列である、請求項２２に
    記載のペプチドまたはその誘導体。
  24. 【請求項２４】プロテインキナーゼＮによりリン酸化さ
    れる中間径フィラメントの改変アミノ酸配列を有する、
    ペプチドまたはその誘導体。
  25. 【請求項２５】中間径フィラメントが、ビメンチン、ニ
    ューロフィラメント−Ｌ、ニューロフィラメント−Ｍ、
    ニューロフィラメント−Ｈ、酸性ケラチン、中性ケラチ
    ン、塩基性ケラチン、デスミン、グリア線維酸性タンパ
    ク質（ＧＦＡＰ）、ラミン、およびネスチンからなる群
    から選択されるものである、請求項２４に記載のペプチ
    ドまたはその誘導体。
  26. 【請求項２６】前記中間径フィラメントの改変アミノ酸
    配列が、ビメンチンのヘッド・ロッドドメイン、ニュー
    ロフィラメント−Ｌのヘッド・ロッドドメイン、ニュー
    ロフィラメント−Ｍのヘッド・ロッドドメイン、および
    ニューロフィラメント−Ｈのヘッド・ロッドドメインか
    らなる群から選択されるものである、請求項２４に記載
    のペプチドまたはその誘導体。
  27. 【請求項２７】前記中間径フィラメントの改変アミノ酸
    配列が、ヒト−ニューロフィラメント−Ｌの１〜３４９
    番のアミノ酸配列またはヒト−ニューロフィラメント−
    Ｍの１〜４１１番のアミノ酸配列である、請求項２６に
    記載のペプチドまたはその誘導体。
  28. 【請求項２８】プロテインキナーゼＮまたは中間フィラ
    メントがホ乳類由来のものである、請求項１〜２７のい
    ずれか一項に記載のペプチドまたはその誘導体。
  29. 【請求項２９】プロテインキナーゼＮまたは中間フィラ
    メントがヒト由来のものである、請求項２８に記載のペ
    プチドまたはその誘導体。
  30. 【請求項３０】プロテインキナーゼＮ結合能を有する細
    胞骨格タンパク質の改変アミノ酸配列を有する、ペプチ
    ドまたはその誘導体。
  31. 【請求項３１】細胞骨格タンパク質が、α−アクチニン
    または中間径フィラメントである、請求項３０に記載の
    ペプチドまたはその誘導体。
  32. 【請求項３２】前記α−アクチニンの改変アミノ酸配列
    が、ヒト骨格筋型α−アクチニンの４２３〜６５３番、
    ６５３〜８３７番、４８６〜６０７番、または３３３〜
    ８９４番のアミノ酸配列、またはヒト非骨格筋型α−ア
    クチニンの４７９〜６００番または７１９〜８４３番の
    アミノ酸配列である、請求項３１に記載のペプチドまた
    はその誘導体。
  33. 【請求項３３】前記中間径フィラメントの改変アミノ酸
    配列が、ヒト−ニューロフィラメント−Ｌの１〜３４９
    番のアミノ酸配列またはヒト−ニューロフィラメント−
    Ｍの１〜４１１番のアミノ酸配列である、請求項３１に
    記載のペプチドまたはその誘導体。
  34. 【請求項３４】請求項１〜３３のいずれか一項に記載の
    ペプチドまたはその誘導体をコードする、塩基配列。
  35. 【請求項３５】請求項３４に記載の塩基配列を含んでな
    る、ベクター。
  36. 【請求項３６】プラスミドベクター、ウイルスベクタ
    ー、およびリポソームベクターからなる群から選択され
    るものである、請求項３５に記載のベクター。
  37. 【請求項３７】請求項３５または３６に記載のベクター
    によって形質転換された、宿主細胞（ただし、ヒト細胞
    にあってはヒトから単離された細胞に限る）。
  38. 【請求項３８】大腸菌、酵母、昆虫細胞、線虫細胞、Ｃ
    ＯＳ細胞、リンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液
    系細胞、および腫瘍細胞からなる群から選択されるもの
    である、請求項３７に記載の宿主細胞。
  39. 【請求項３９】請求項３７または３８に記載の宿主細胞
    を培養し、そして培養物から請求項１〜３３のいずれか
    一項に記載のペプチドまたはその誘導体を単離すること
    を含んでなる、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の
    ペプチドまたはその誘導体の製造法。
  40. 【請求項４０】請求項１〜３３のいずれか一項に記載の
    ペプチドまたはその誘導体を含んでなる、腫瘍形成また
    は転移抑制剤。
  41. 【請求項４１】活性型Ｒｈｏタンパク質が関与する腫瘍
    形成または転移を抑制する、請求項４０に記載の腫瘍形
    成または転移抑制剤。
  42. 【請求項４２】請求項１〜２０のいずれか一項に記載の
    ペプチドをコードする塩基配列を含んでなる、腫瘍形成
    または転移抑制用遺伝子治療剤。
  43. 【請求項４３】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、活性型Ｒｈｏタンパク質とプロテインキナーゼＮま
    たは請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドまた
    はその誘導体とを含むスクリーニング系に存在させ、そ
    して（２）活性型Ｒｈｏタンパク質と、プロテインキナ
    ーゼＮまたは請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプ
    チドまたはその誘導体との結合の阻害の程度を測定する
    ことを含む、活性型Ｒｈｏタンパク質とプロテインキナ
    ーゼＮとの結合を阻害する物質のスクリーニング法。
  44. 【請求項４４】スクリーニング系が細胞系または無細胞
    系である、請求項４３に記載のスクリーニング法。
  45. 【請求項４５】スクリーニング系がツー・ハイブリッド
    ・システムである、請求項４３または４４に記載のスク
    リーニング法。
  46. 【請求項４６】細胞系が酵母細胞系である請求項４３〜
    ４５のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
  47. 【請求項４７】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、活性型Ｒｈｏタンパク質と請求項１〜８のいずれか
    一項に記載のペプチドまたはその誘導体とを含むスクリ
    ーニング系に存在させ、そして（２）Ｒｈｏタンパク質
    ＧＴＰａｓｅの活性の阻害の程度を測定することを含
    む、Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活性を阻害する物
    質のスクリーニング法。
  48. 【請求項４８】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１〜８のいずれ
    か一項に記載のペプチドまたはその誘導体と、そしてＲ
    ｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡ
    Ｐ）とを含むスクリーニング系に存在させ、そして
    （２）活性型Ｒｈｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活性また
    は活性の亢進の阻害の程度を測定することを含む、Ｒｈ
    ｏタンパク質ＧＴＰａｓｅの活性または活性の亢進を阻
    害する物質のスクリーニング法。
  49. 【請求項４９】スクリーニングの系が細胞系または無細
    胞系である、請求項４７または４８に記載のスクリーニ
    ング法。
  50. 【請求項５０】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、中間径フィラメントとプロテインキナーゼＮまたは
    請求項９〜１１のいずれか一項に記載のペプチドまたは
    その誘導体とを含むスクリーニング系に存在させ、そし
    て（２）中間径フィラメントと、プロテインキナーゼＮ
    または請求項９〜１１のいずれか一項に記載のペプチド
    またはその誘導体との結合の阻害の程度を測定すること
    を含む、中間径フィラメントとプロテインキナーゼＮと
    の結合を阻害する物質のスクリーニング法。
  51. 【請求項５１】スクリーニング系が細胞系または無細胞
    系である、請求項５０に記載のスクリーニング法。
  52. 【請求項５２】スクリーニング系がツー・ハイブリッド
    ・システムである、請求項５０または５１に記載のスク
    リーニング法。
  53. 【請求項５３】細胞系が酵母細胞系である請求項５０〜
    ５２のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
  54. 【請求項５４】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、中間径フィラメントとプロテインキナーゼＮまたは
    プロテインキナーゼ活性を有するその改変アミノ酸配列
    を有するペプチドまたはその誘導体とを含むスクリーニ
    ング系に存在させ、そして（２）中間径フィラメントの
    重合の阻害の程度を測定することを含む、中間径フィラ
    メントの重合を阻害する物質のスクリーニング法。
  55. 【請求項５５】スクリーニング系が細胞系または無細胞
    系である、請求項５４に記載のスクリーニング法。
  56. 【請求項５６】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、骨格筋型α−アクチニンとプロテインキナーゼＮま
    たは請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のペプチド
    またはその誘導体とを含むスクリーニング系に存在さ
    せ、そして（２）骨格筋型α−アクチニンと、プロテイ
    ンキナーゼＮまたは請求項１２〜１４のいずれか一項に
    記載のペプチドまたはその誘導体との結合の阻害の程度
    を測定することを含む、骨格筋型α−アクチニンとプロ
    テインキナーゼＮとの結合を阻害する物質のスクリーニ
    ング法。
  57. 【請求項５７】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、非骨格筋型α−アクチニンと、プロテインキナーゼ
    Ｎまたは請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のペプ
    チドまたはその誘導体と、カルシウムイオン（Ｃａ2+）
    とを含むスクリーニング系に存在させ、そして（２）非
    骨格筋型α−アクチニンと、プロテインキナーゼＮまた
    は請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のペプチドま
    たはその誘導体との結合の阻害の程度を測定することを
    含む、非骨格筋型α−アクチニンとプロテインキナーゼ
    Ｎとの結合を阻害する物質のスクリーニング法。
  58. 【請求項５８】前記スクリーニング系に更にＰＩ４，５
    Ｐ２を存在させる、請求項５６または５７に記載のスク
    リーニング法。
  59. 【請求項５９】スクリーニング系が細胞系または無細胞
    系である、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載のス
    クリーニング法。
  60. 【請求項６０】スクリーニング系がツー・ハイブリッド
    ・システムである、請求項５６〜５９のいずれか一項に
    記載のスクリーニング法。
  61. 【請求項６１】細胞系が酵母細胞またはＣＯＳ７細胞で
    ある、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載のスクリ
    ーニング法。
  62. 【請求項６２】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、プロテインキナーゼＮまたはプロテインキナーゼ活
    性を有するその改変アミノ酸配列を有するペプチドまた
    はその誘導体を含むスクリーニング系に存在させ、そし
    て（２）上記プロテインキナーゼＮのプロテインキナー
    ゼの活性の阻害の程度を測定することを含む、プロテイ
    ンキナーゼＮの活性を阻害する物質のスクリーニング
    法。
  63. 【請求項６３】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、プロテインキナーゼＮ
    または活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロ
    テインキナーゼ活性を有するその改変アミノ酸配列を有
    するペプチドまたはその誘導体とを含むスクリーニング
    系に存在させ、そして（２）上記プロテインキナーゼＮ
    のプロテインキナーゼの活性またはその活性の亢進の阻
    害の程度を測定することを含む、プロテインキナーゼＮ
    の活性型Ｒｈｏタンパク質依存的プロテインキナーゼの
    活性またはその活性の亢進を阻害する物質のスクリーニ
    ング法。
  64. 【請求項６４】プロテインキナーゼの活性またはその活
    性の亢進の阻害の程度を、ビメンチン、ニューロフィラ
    メント−Ｌ、ニューロフィラメント−Ｍ、ニューロフィ
    ラメント−Ｈ、ニューロフィラメント（ＮＦ）のトリプ
    レット（ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−ＭおよびＮＦ−Ｈからなる複
    合体）、αＰＫＣペプチド、δＰＫＣペプチド、配列番
    号２に記載されるペプチド、カルデスモン、およびＧ−
    アクチンからなる群から選択される基質を用いて測定す
    る、請求項６２または６３に記載のスクリーニング法。
  65. 【請求項６５】スクリーニング系が細胞系または無細胞
    系である、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載のス
    クリーニング法。
  66. 【請求項６６】腫瘍形成または転移抑制物質のスクリー
    ニング法である、請求項４３〜６５のいずれか一項に記
    載のスクリーニング法。
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JP4810095B2 (ja) * 2002-08-14 2011-11-09 サイレンス・セラピューティクス・アーゲー プロテインキナーゼｎベータの更なる使用

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