JPH09313197A - Method for testing drug sensitivity - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To easily and accurately test the drug sensitivity of even anaerobic or slightly aerobic microbe independent of pH by keeping a microorganism specimen in a medium, culturing the microorganism while preventing the convection of the medium and observing the proliferation state of the microorganism. SOLUTION: The drug sensitivity of even anaerobic or slightly aerobic microbe is tested by a method capable of easily and accurately getting the minimal inhibitory concentration (MIC) by preculturing a testing microorganism in a microbial specimen, adding the specimen to a semifluid medium containing agar in an amount of 0.05-1.0% as a gelling agent containing the drug for testing the sensitivity or adding the precultured microorganism together with the medium to a preparatorily provided medium container containing a prescribed amount of the drug for testing the sensitivity, keeping the microorganism in the medium, subjecting the microorganism to aerobic culture under a condition essentially not to cause the convection flow of the medium and observing the proliferation state of the microorganism at a part shielded from the outer environment with the medium.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、微生物の薬剤に対する
感受性を分析するための技術に関するものである。本発
明は、特にヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyl
ori；以下ＨＰと省略する）のような微好気的な培養条
件でなければ生育できない微生物、あるいは嫌気的な培
養環境を好む微生物の薬剤感受性試験において、炭酸ガ
ス培養を行うことなく正確な薬剤感受性を決定すること
ができる新規な試験方法に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a technique for analyzing the susceptibility of microorganisms to drugs. The invention is particularly applicable to Helicobacter pylori
ori; hereinafter abbreviated as HP)), in a drug susceptibility test of a microorganism that can grow only under microaerobic culture conditions, or a microorganism that prefers an anaerobic culture environment, an accurate drug without carbon dioxide culture The present invention relates to a new test method capable of determining sensitivity.

【０００２】ＨＰは胃粘膜組織から分離[1]されたグラ
ム陰性らせん状桿菌に分類される細菌である。Campylob
acter属に分類されていた時期もあったが、現在はHelic
obacter属とされている[2]。近年では、胃潰瘍や胃炎等
の胃疾患との関連が強く示唆されており[3]、ＨＰの除
菌による胃疾患の治療も試みられている。HP is a bacterium classified into Gram-negative spiral bacilli isolated from gastric mucosal tissue [1]. Campylob
It was once classified as acter, but now it is Helic
It is considered to be bacterium genus [2]. In recent years, it has been strongly suggested that it is associated with gastric diseases such as gastric ulcer and gastritis [3], and treatment of gastric diseases by sterilization of HP has also been attempted.

【０００３】感染症の治療には病原体に対して有効な抗
菌剤を選ぶ必要がある。薬剤の有効性を試験する分析技
術が感受性試験である。一般に感受性試験は、患者から
分離した病原体を候補となる薬剤とともに培養し、その
増殖の程度を観察することによって行われる。感染症の
治療に用いることができる抗菌性の薬剤には多くの種類
が有る。そして各薬剤について、標準的な菌株に対する
有効性を確認した結果をもとに設定した抗菌スペクトル
と呼ばれる情報が知られている。抗菌スペクトルをチェ
ックすれば、その薬剤がどのような菌種に対して有効な
のかをおおまかに知ることはできる。しかし実際に臨床
検体から分離される病原性微生物の薬剤感受性は、標準
的な菌株と必ずしも一致するとは限らない。むしろ、違
う菌株では薬剤感受性も異なっているケースが一般的で
ある。また基本的には感受性であるべき菌種であって
も、高度な薬剤耐性を獲得している耐性菌の存在も無視
することができない。このような背景から、実際に臨床
検体から分離された微生物の感受性を調査することは、
治療方針を決定する上で重要な情報を与える。For the treatment of infectious diseases, it is necessary to select an antibacterial agent effective against the pathogen. An analytical technique that tests the effectiveness of a drug is the susceptibility test. In general, a susceptibility test is performed by culturing a pathogen isolated from a patient together with a candidate drug and observing the degree of proliferation thereof. There are many types of antibacterial agents that can be used to treat infectious diseases. For each drug, there is known information called antibacterial spectrum, which is set based on the result of confirming the effectiveness against standard strains. By checking the antibacterial spectrum, it is possible to get a rough idea of what kind of bacteria the drug is effective against. However, the drug susceptibility of pathogenic microorganisms actually isolated from clinical specimens does not always match that of standard strains. Rather, different strains generally have different drug sensitivities. In addition, the existence of resistant strains that have acquired a high degree of drug resistance cannot be ignored, even if they are basically sensitive strains. From this background, investigating the susceptibility of microorganisms actually isolated from clinical specimens is
Gives important information in deciding treatment policy.

【０００４】[0004]

【従来技術の問題点】微生物の薬剤感受性試験は、古く
から行われている検査方法である。最も基本的な薬剤感
受性試験方法は、寒天平板希釈法と呼ばれる方法であ
る。この方法では、対象となる薬剤を段階的な濃度で添
加した寒天平板に一定の細胞数の被検微生物を接種し、
その増殖の程度を観察することにより感受性を決定す
る。薬剤感受性の程度は、最少発育阻止濃度（Minimum
Inhibitory Concentration；以下ＭＩＣと省略する）と
して数値化される。ＭＩＣは、その微生物の増殖を阻止
することができる最少の薬剤濃度と定義される。寒天平
板希釈法の他、阻止円法による感受性試験も公知であ
る。阻止円法は、被検微生物を混釈した固形培地に開け
た小さな穴に段階希釈した抗菌性薬剤を入れて培養し、
穴の周囲に形成される微生物が生育できない範囲（阻止
円）の大きさを測定することによって感受性を判定す
る。また阻止円法の操作を感受性ディスクの利用により
簡略化した方法も知られている。すなわち、あらかじめ
抗菌剤を含浸後乾燥したろ紙ディスクを用意しておき、
これを被検微生物を塗末した固形培地表面に置いて培養
し、ディスクの周辺に形成される阻止円の大きさを測定
して感受性を決定する方法（Disk Diffusion Susceptib
ility Test）である。この方法にはディスクに含有させ
る薬剤濃度の設定方法の違い等によって、３濃度ディス
ク法やカービー・バウアー法等のいくつかのバリエーシ
ョンが一般に知られている。ただし阻止円法ではＭＩＣ
を知ることができるのに対して、感受性ディスクを利用
する方法はいずれも感受性の程度を定性的に確認するた
めの簡便法と言うことができる。たとえ正確なＭＩＣ値
を知ることができなくても、感受性の程度を比較するこ
とができれば治療方針の決定が可能なため、感受性ディ
スクを用いる方法であっても十分に実用的なものであっ
た。[Problems of the prior art] The drug susceptibility test of microorganisms is an inspection method that has been performed for a long time. The most basic drug sensitivity test method is a method called agar plate dilution method. In this method, an agar plate to which the target drug was added in a stepwise concentration was inoculated with a test microorganism of a certain number of cells,
Sensitivity is determined by observing the extent of its proliferation. The degree of drug sensitivity depends on the minimum inhibitory concentration (Minimum
Inhibitory Concentration; hereinafter abbreviated as MIC). The MIC is defined as the lowest drug concentration capable of inhibiting the growth of that microorganism. Besides the agar plate dilution method, the susceptibility test by the inhibition circle method is also known. The inhibition circle method is to put a serially diluted antibacterial drug in a small hole opened in a solid medium in which a microorganism to be tested is poured, and culture it,
Susceptibility is determined by measuring the size of the area (inhibition circle) in which the microorganisms formed around the hole cannot grow. Also known is a method of simplifying the operation of the inhibition circle method by using a sensitive disk. That is, prepare a filter paper disk that has been impregnated with an antibacterial agent and then dried,
This is placed on the surface of a solid medium coated with a test microorganism and cultured, and the sensitivity is determined by measuring the size of the inhibition circle formed around the disk (Disk Diffusion Susceptib
ility Test). Several variations of this method, such as the three-concentration disc method and the Kirby-Bauer method, are generally known, depending on the difference in the method of setting the concentration of the drug contained in the disc. However, in the blocking circle method, MIC
On the other hand, any method using a sensitive disk can be said to be a simple method for qualitatively confirming the degree of sensitivity. Even if it is not possible to know the exact MIC value, it is possible to determine the treatment policy if the degree of sensitivity can be compared, so the method using a sensitive disk was sufficiently practical. .

【０００５】ところでこれらの先行技術においては、阻
止円の大きさを測定する操作が必要である。阻止円の測
定操作には、時間がかかること、機械化しにくいこと、
あるいは熟練が必要なこと等の問題点がともなう。また
長い培養時間を必要とする微生物では薬剤が広い範囲に
拡散してしまうので、正確な阻止円の測定が困難となる
ことが有る。阻止円の測定を行わない寒天平板希釈法で
も、被検微生物の増殖の判定は機械化することが困難な
ステップとなる。By the way, in these prior arts, it is necessary to perform an operation for measuring the size of the blocking circle. The measurement operation of the stop circle is time-consuming and difficult to mechanize,
Alternatively, there are problems such as the need for skill. In addition, in a microorganism that requires a long culture time, the drug spreads over a wide range, which may make it difficult to accurately measure the inhibition circle. Even with the agar plate dilution method in which the inhibition circle is not measured, the determination of the growth of the test microorganism is a difficult step to mechanize.

【０００６】このような問題点の解決のために、微量希
釈法（Micro Dilution Method）と呼ばれる技術が提案
された。微量希釈法では、前培養した被検菌を培地成分
と薬剤を分注したマイクロプレートのウエルに接種し、
ウエル中で微生物の増殖程度を測定する。微生物の繁殖
は、培養液の濁りとして光学的に測定しても良いし、あ
るいは酸化還元指示薬のような適当な指示薬を利用して
色変化として捉えることも可能である。このような測定
原理の採用によって、ＭＩＣ値を正確に求めることが可
能となり、しかも迅速で自動化の容易な感受性試験が実
用化された。現在では薬剤や培地成分をマイクロウエル
に充填した状態で乾燥、あるいは凍結したものが商業的
に供給されているので、前培養した被検菌を接種するだ
けで感受性試験を行うことができる。更に、培養後の微
生物の繁殖程度を自動的に読み取り、ＭＩＣを算出する
システムも市販されている。臨床検査標準委員会（Nati
onal Committee for Clinical Laboratory Standards；
以下ＮＣＣＬＳと省略する）でも、この微量希釈法に基
づいて感受性試験の標準法を定めている[4]。[0006] In order to solve such a problem, a technique called a Micro Dilution Method has been proposed. In the microdilution method, the precultured test bacteria are inoculated into the wells of the microplate in which the medium components and the drug are dispensed,
Measure the growth of microorganisms in the wells. The growth of microorganisms may be optically measured as the turbidity of the culture solution, or may be captured as a color change by using an appropriate indicator such as a redox indicator. By adopting such a measurement principle, it becomes possible to accurately obtain the MIC value, and moreover, a sensitivity test that is quick and easy to automate has been put into practical use. At present, since the dried or frozen drug or medium component filled in microwells is commercially supplied, the susceptibility test can be performed only by inoculating the precultured test bacteria. Further, a system for automatically reading the degree of reproduction of microorganisms after culturing and calculating MIC is commercially available. Laboratory Standards Committee (Nati
onal Committee for Clinical Laboratory Standards;
(Hereinafter abbreviated as NCCLS) also defines a standard method for susceptibility testing based on this microdilution method [4].

【０００７】微量希釈法は、好気的な微生物の薬剤感受
性試験においては迅速性や自動化の問題を解消した。し
かし、微好気的、あるいは嫌気的な微生物については問
題を生じることが有る。微好気的、あるいは嫌気的な環
境を好む微生物の培養にあたっては培養環境中の酸素濃
度を発育に適した範囲に制御しなければならない。この
ときにもっとも一般的に利用されるのが、二酸化炭素
（炭酸ガス）である。微量希釈法においても、嫌気性、
あるいは微好気性の微生物については二酸化炭素濃度の
高い条件のもとで培養を行う方法が知られている。The microdilution method has solved the problems of rapidity and automation in the drug sensitivity test of aerobic microorganisms. However, it may cause problems for microaerobic or anaerobic microorganisms. When culturing a microorganism that prefers a microaerobic or anaerobic environment, the oxygen concentration in the culture environment must be controlled within a range suitable for growth. At this time, carbon dioxide (carbon dioxide gas) is most commonly used. Anaerobic, even in the microdilution method
Alternatively, a method of culturing a microaerobic microorganism under conditions of high carbon dioxide concentration is known.

【０００８】たとえば、微好気性細菌であるＨＰの場
合、培養には微好気的環境（酸素濃度５%）を要求す
る。これまでに報告されている感受性試験方法において
も、酸素：５%、二酸化炭素：１０%、窒素：８５%とい
う条件で培養されている。[5][6]。この方法では、ＨＰ
の薬剤感受性試験を迅速に行うことができるとされてい
る。[0008] For example, HP, which is a microaerobic bacterium, requires a microaerobic environment (oxygen concentration of 5%) for culturing. Even in the susceptibility test methods reported so far, the culture was performed under the conditions of oxygen: 5%, carbon dioxide: 10%, and nitrogen: 85%. [5] [6]. In this method, HP
It is said that the drug susceptibility test can be carried out rapidly.

【０００９】しかしここで問題になるのは、培地のｐＨ
が二酸化炭素の吸収によって変化してしまう現象であ
る。周知のとおり二酸化炭素は水溶液（特にアルカリ）
によって容易に吸収され、ｐＨを低下させる作用を持
つ。培地のｐＨは微生物の生育と薬剤の抗菌活性の両方
に影響を与える可能性が有るので、その変動は薬剤感受
性試験の結果を不正確にする原因となりうる。事実、ク
ラリスロマイシンのようなマクロライド系抗生物質の抗
菌活性は、酸性域で低下し、アルカリ域では高まること
が知られている[7]。またペニシリン等のβラクタム剤
は、弱酸性で抗菌活性が増強され、アルカリでは低下す
るという報告が有る[8]。クラリスロマイシンはＨＰの
除菌治療に利用されることの多い薬剤なので、この薬剤
に対するＨＰの感受性試験の結果が培養条件によって左
右されることは大きな問題である。したがって培養環境
中の二酸化炭素濃度を高くして微好気的、あるいは嫌気
的な培養を行うことは、薬剤感受性試験においてできる
だけ避けるべき条件とされている。現実に本発明者らが
新たに得た知見によれば、一部の薬剤についてｐＨの変
動に伴ってＨＰに対するＭＩＣ値が変化する場合があ
る。またこれまでにＨＰに対するＭＩＣ測定における炭
酸ガス培養の問題点を指摘した報告も存在している
[9]。つまり、このような二酸化炭素濃度の高い環境の
もとで得られた薬剤感受性試験の結果は、ＨＰの薬剤感
受性を正確に反映していない可能性が有る。However, the problem here is the pH of the medium.
Is a phenomenon that changes due to absorption of carbon dioxide. As is well known, carbon dioxide is an aqueous solution (especially alkali)
It is easily absorbed by and has the effect of lowering the pH. Since the pH of the medium can influence both the growth of microorganisms and the antibacterial activity of the drug, its variation can cause the results of the drug susceptibility test to be inaccurate. In fact, it is known that the antibacterial activity of macrolide antibiotics such as clarithromycin decreases in the acidic range and increases in the alkaline range [7]. In addition, β-lactam agents such as penicillin have been reported to have weakly acidic antibacterial activity, and alkaline solutions [8]. Since clarithromycin is a drug that is often used for the eradication treatment of HP, it is a big problem that the results of the HP susceptibility test for this drug depend on the culture conditions. Therefore, increasing the carbon dioxide concentration in the culture environment to perform microaerobic or anaerobic culture is a condition that should be avoided as much as possible in the drug sensitivity test. Actually, according to the knowledge newly obtained by the present inventors, the MIC value for HP may change for some drugs with the change in pH. There are also reports to date that point out the problems of carbon dioxide culture in MIC measurement for HP.
[9]. That is, the result of the drug sensitivity test obtained under such an environment of high carbon dioxide concentration may not accurately reflect the drug sensitivity of HP.

【００１０】二酸化炭素ではなく、窒素やヘリウムを利
用して微好気的、あるいは嫌気的な条件を作り出すこと
もできるが、二酸化炭素に比べて経済的に不利である。
更に、通常の培養条件に比べて微好気的、あるいは嫌気
的な培養は培養条件を一定に保つ特殊な培養装置を要求
し、また操作も繁雑である。また二酸化炭素を吸収して
も培地のｐＨが大きく変動しないように緩衝剤を利用す
る技術も知られてはいるが、微生物の中には緩衝剤によ
って生育阻害を受けるものが有るので幅広い微生物に対
して応用できるわけではない。現実にＨＰではリン酸緩
衝液によって生育が阻害される現象を実施例で確認して
いるし、データは示さないもののＨＰはクエン酸緩衝液
やトリス−塩酸緩衝液によっても発育阻害を受ける。Although it is possible to create a slightly aerobic or anaerobic condition by utilizing nitrogen or helium instead of carbon dioxide, it is economically disadvantageous as compared with carbon dioxide.
In addition, microaerobic or anaerobic culturing requires special culturing equipment that keeps the culturing conditions constant compared to usual culturing conditions, and the operation is complicated. There is also known a technique of using a buffer so that the pH of the medium does not change greatly even if carbon dioxide is absorbed, but some microorganisms are growth-inhibited by the buffer, so a wide range of microorganisms can be used. It cannot be applied to it. Actually, it has been confirmed in Examples that the growth of HP is inhibited by a phosphate buffer, and although data are not shown, HP is also growth-inhibited by a citrate buffer or a Tris-HCl buffer.

【００１１】更に微好気的、あるいは嫌気的な環境を好
む微生物の薬剤感受性試験における問題として、精度管
理を行いにくいことを指摘しなければならない。ＭＩＣ
測定においては、たとえばＮＣＣＬＳのＭＩＣ測定精度
管理用菌株が知られている。しかしこの菌株は好気的な
微生物なので、微好気的で高い二酸化炭素濃度という条
件の元で好気的条件と同様に精度管理を行うことはでき
ない。これまでに好気性微生物の代用として嫌気性微生
物であるBacteroides fragilisを用いた嫌気培養におけ
る精度管理の報告[10]が有る。またＮＣＣＬＳは、Bact
eroides fragilis（ＡＴＣＣ２５２８５）他を使った嫌
気培養による精度管理基準を定めている[11]。しかし原
則として同じ培地、同じ培養条件で試験を行わなけれ
ば、厳密な意味での精度管理とは言いにくい。このよう
な背景から、嫌気的あるいは微好気的な微生物の薬剤感
受性試験を二酸化炭素を利用すること無く実施すること
ができる新しい技術の提供が望まれている。Further, it must be pointed out that it is difficult to perform quality control as a problem in a drug sensitivity test of a microorganism that prefers a microaerobic or anaerobic environment. MIC
In measurement, for example, NCCLS strains for MIC measurement accuracy control are known. However, since this strain is an aerobic microorganism, it is not possible to perform the quality control under the condition of slightly aerobic and high carbon dioxide concentration as in the aerobic condition. So far, there is a report [10] of quality control in anaerobic culture using Bacteroides fragilis, which is an anaerobic microorganism as a substitute for aerobic microorganisms. NCCLS is Bact
It has established a quality control standard by anaerobic culture using eroides fragilis (ATCC25285) and others [11]. However, as a general rule, unless the test is performed in the same medium and the same culture conditions, it cannot be said that the quality control is strictly controlled. From such a background, it is desired to provide a new technique capable of carrying out a drug susceptibility test of an anaerobic or microaerobic microorganism without using carbon dioxide.

【００１２】[0012]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、微好気的、
あるいは嫌気的な条件下での培養時にもｐＨの変化をも
たらすことのない新しい薬剤感受性試験技術の提供を課
題としている。本発明は、培地ｐＨの変動につながる二
酸化炭素を用いることなく微好気的、あるいは嫌気的な
培養環境を実現すると同時に、このような特殊な環境の
みならず通常の好気的な培養環境も容易に実現するもの
である。また本発明は、嫌気性、あるいは微好気性の微
生物の培養に当たって、特殊な装置や、繁雑な酸素濃度
や二酸化炭素濃度の制御を不要とする新しい薬剤感受性
試験技術の提供も課題とするものである。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is aerobic,
Alternatively, it is an object to provide a new drug susceptibility test technique that does not cause a change in pH even when culturing under anaerobic conditions. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention realizes a microaerobic or anaerobic culturing environment without using carbon dioxide that leads to a change in medium pH, and at the same time not only such a special environment but also a normal aerobic culturing environment. It is easily realized. Further, the present invention, in the culture of anaerobic or microaerobic microorganisms, a special device, and also to provide a new drug susceptibility test technology that does not require complicated oxygen concentration and carbon dioxide concentration control is there.

【００１３】[0013]

【課題を解決するための手段】本発明の課題は、微生物
試料を培地中に保持し、実質的に培地の対流が起きない
条件で培養を行い、前記微生物の増殖程度を観察する薬
剤感受性試験方法によって解決される。The object of the present invention is to carry out a drug susceptibility test in which a microorganism sample is held in a medium and cultured under conditions in which substantially no convection of the medium occurs, and the growth degree of the microorganism is observed. Solved by the method.

【００１４】本発明の微生物とは、増殖能力を備えた生
きた微生物を意味し、具体的には細菌、真菌、マイコプ
ラズマ、ウイルス、ならびにリケッチア等の微生物その
もの、あるいはこれらの微生物が感染した細胞を示すこ
とができる。そしてこれら微生物を培地中に保持すると
は、培地表面から離れた培地の中に存在させることを意
味している。培地中に保持される微生物は、培地中に分
散されていても良いし、その微生物の生育に適した部位
にのみ存在させることもできる。培地中に分散させた場
合には、当然のことながら培地の表面にも存在すること
になるが、本発明においては少なくとも培地中に細胞を
保持できれば良いのであって、その他の部位に細胞が存
在することがあってもかまわない。なお培地の流動性が
高い場合には、一般的な条件では微生物は培地中に保持
されることなく容器の底に沈んでしまう。このような状
態は本発明における培地中に保持された状態とは言わな
い。すなわち本発明においては、細胞が容器底から離れ
た位置に支持されている状態を少なくとも培養期間中に
維持できることを保持と表現する。ただし流動性が大き
い液体であっても比重を微生物と同じ程度に高めてやれ
ば、培地中に微生物を分散させた状態で保持することが
可能である。したがって、液状の培地の使用を否定する
ものではない。このような液体培地を用い、培養期間中
の温度変化が起きないようにすれば実質的には対流の無
い条件を実現することができる。The microorganism of the present invention means a living microorganism having a proliferative ability, and specifically includes microorganisms such as bacteria, fungi, mycoplasma, viruses, and rickettsia themselves, or cells infected with these microorganisms. Can be shown. Retaining these microorganisms in the medium means allowing them to exist in the medium separated from the medium surface. The microorganism retained in the medium may be dispersed in the medium, or may be present only at a site suitable for the growth of the microorganism. When dispersed in a medium, it naturally exists on the surface of the medium, but in the present invention, it is sufficient if at least the cells can be retained in the medium, and the cells are present at other sites. It doesn't matter what you do. If the fluidity of the medium is high, the microorganisms will not be retained in the medium under the general conditions and will sink to the bottom of the container. Such a state is not said to be retained in the medium in the present invention. That is, in the present invention, retention means that a state in which cells are supported at a position apart from the bottom of the container can be maintained at least during the culture period. However, even in the case of a liquid having high fluidity, it is possible to maintain the microorganism in a dispersed state in the medium by increasing the specific gravity to the same level as the microorganism. Therefore, the use of liquid medium is not denied. If such a liquid medium is used and the temperature does not change during the culturing period, it is possible to realize a condition substantially free from convection.

【００１５】本発明における培養条件には、微生物細胞
を培地中に保持するとともに少なくとも培養期間中に培
地の対流が実質的に生じないことが求められる。培地の
対流は、温度変化や物理的な撹拌によって培地の移動が
起きることと定義することができる。培地の対流を抑止
するには、固形状態の培地の使用が有利である。本発明
において特に有利な培地の形態が半流動培地である。培
地の対流は完全な固形培地でも阻止することができる。
しかしたとえばＨＰのような微好気性の環境を好む微生
物を１%を越えるような寒天濃度の高い固形培地中で培
養しようとすると、必ずしも十分な生育を期待できない
場合が有る。微好気的な環境にはある程度の酸素濃度が
求められるが、寒天濃度の高い培地では培地中への酸素
の透過が妨げられるためである。またＨＰのような運動
性を持つ微生物では、固形度の高い培地中で運動を抑制
されることによって生育が制限されるおそれが有る。こ
のように培地内部での微生物の増殖が培地の硬さに影響
される可能性を否定できない。また、寒天をゲル化剤に
用いた固形培地に溶解状態で微生物を接種するには、５
０−６０℃の温度条件が必要になる。このような温度で
は、被検微生物に対して障害を与えてしまう可能性が出
てくる。半流動培地では培地中の微生物の生育も十分に
期待でき、比較的低い温度でも液状を維持するので微生
物細胞に対する影響を最小限に抑えることができる。The culturing conditions in the present invention are required to hold the microbial cells in the medium and to substantially prevent convection of the medium at least during the culturing period. The convection of the medium can be defined as the movement of the medium caused by the temperature change or the physical agitation. The use of a solid-state medium is advantageous for suppressing the convection of the medium. A particularly advantageous form of medium in the present invention is a semi-solid medium. Convection of the medium can be prevented even with complete solid medium.
However, when a microorganism such as HP that favors a microaerobic environment is cultivated in a solid medium having a high agar concentration of more than 1%, it may not always be possible to expect sufficient growth. This is because a certain degree of oxygen concentration is required in a microaerobic environment, but in a medium having a high agar concentration, permeation of oxygen into the medium is hindered. Further, in a microorganism having mobility such as HP, growth may be restricted by suppressing the movement in a medium having a high solidity. In this way, it is undeniable that the growth of microorganisms inside the medium is affected by the hardness of the medium. In addition, to inoculate microorganisms in a dissolved state on a solid medium using agar as a gelling agent, 5
A temperature condition of 0-60 ° C is required. At such temperatures, there is a possibility that the test microorganisms may be damaged. In the semi-fluid medium, growth of microorganisms in the medium can be expected sufficiently, and since the liquid state is maintained even at a relatively low temperature, the influence on microbial cells can be minimized.

【００１６】半流動培地は、固形培地に比べて寒天など
の固形成分の含有量が低く、ある程度の流動性を保持し
ている培地の名称である。外部から撹拌、振盪等の物理
的な力を加えた時には流動性を示すが、静置していれば
対流を起こさないような性状を半流動状態と定義するこ
とができる。固形培地では寒天の場合１−２%w/vで用い
るが、半流動培地では０．０５−１．０%w/v、好ましく
は０．２−０．７%w/v、通常は０．３−０．５%w/vとい
う寒天濃度が一般的である。ただしこの寒天濃度は、２
５−４０℃程度の一般的な培養温度において半流動状態
を維持するのに必要な寒天濃度である。この温度範囲よ
りも低い場合には、より少量の、また高温での培養には
多量の寒天が必要となることは言うまでもない。半流動
状態は、寒天以外のゲル化剤によっても実現することが
できる。この場合、粘度５−１０cPの粘性率を与えるよ
うにゲル化剤を添加すれば同じ程度の流動性を培地に与
えることが可能である。The semi-fluid medium is the name of a medium which has a lower content of solid components such as agar than the solid medium and retains a certain degree of fluidity. A semi-fluid state can be defined as a property that shows fluidity when a physical force such as stirring or shaking is applied from the outside, but does not cause convection when left standing. For solid medium, agar is used at 1-2% w / v, but for semi-fluid medium, it is used at 0.05-1.0% w / v, preferably 0.2-0.7% w / v, usually 0. An agar concentration of 3-0.5% w / v is common. However, this agar concentration is 2
It is an agar concentration required to maintain a semi-fluid state at a general culture temperature of about 5-40 ° C. It goes without saying that when the temperature is lower than this temperature range, a smaller amount of the agar is required for the culture at a higher temperature. The semi-fluid state can also be realized by a gelling agent other than agar. In this case, if a gelling agent is added so as to give a viscosity of 5-10 cP, the same degree of fluidity can be given to the medium.

【００１７】本発明の薬剤感受性試験方法に利用しうる
培地に必要な物理的性状を与える成分は寒天に限定され
ない。微生物培養用培地に必要なゲル強度をもたらす成
分として、ゼラチン、シリカゲル、アクリルアミド、グ
ルコマンナン、あるいはメチルセルロース等の化合物が
知られている。これらのゲル化剤は、寒天に代えて、あ
るいは寒天と組み合わせて本発明による薬剤感受性試験
方法に利用することができる。The components that give the physical properties required for the medium that can be used in the drug sensitivity test method of the present invention are not limited to agar. Compounds such as gelatin, silica gel, acrylamide, glucomannan, and methylcellulose are known as components that provide the gel strength required for a microorganism culture medium. These gelling agents can be used in the drug sensitivity test method of the present invention instead of agar or in combination with agar.

【００１８】本発明の薬剤感受性試験方法は、一般的な
好気性の微生物のみならず微生物の中でも嫌気性、また
は微好気性の微生物を被検菌とする時に特に有用であ
る。従来これらの微生物は、一般には炭酸ガス培養を行
わなければ十分な増殖を期待できないとされていた。本
発明においては、培地の表面ではなく、表面から培地自
身によって遮断された培地中での微生物の増殖を観察す
ることで、好気培養であっても嫌気性、あるいは微好気
性の微生物の感受性試験を可能とする。先に述べた寒天
をゲル化剤として用いた半流動性培地を用いた場合、嫌
気的な培養環境は培地表面から離れた部位において実現
できる。被検微生物がどの程度の酸素感受性を持つかに
よって、増殖に好適な部位は変化し、きわめて限られた
範囲にしか増殖できないものもあれば、培地表面に近い
部分を除く広い範囲に増殖しうるものも存在する。いず
れにせよ培地中に分散させた状態で微生物を保持するこ
とができれば、その微生物に合った培養環境を与える部
位における微生物の増殖程度を観察することによって、
嫌気性微生物の薬剤感受性を決定することができる。こ
のような条件で薬剤感受性を判定することができる嫌気
性微生物として、たとえば次のような微生物を例示する
ことができる。The drug susceptibility testing method of the present invention is particularly useful when not only general aerobic microorganisms but also anaerobic or microaerobic microorganisms among microorganisms are used as test microorganisms. Conventionally, it has been generally said that these microorganisms cannot be expected to grow sufficiently unless they are cultured in carbon dioxide. In the present invention, by observing the growth of microorganisms in the medium, which is blocked by the medium itself from the surface, not on the surface of the medium, susceptibility of anaerobic or microaerobic microorganisms even in aerobic culture Allows testing. When the semi-fluid medium using agar as the gelling agent is used, an anaerobic culture environment can be realized at a site apart from the medium surface. The suitable site for growth changes depending on the degree of oxygen sensitivity of the test microorganism, and some can grow only within a very limited range, while others can grow over a wide range excluding the area close to the medium surface. Things also exist. In any case, if it is possible to hold the microorganism in a state of being dispersed in the medium, by observing the degree of growth of the microorganism at the site that provides a culture environment suitable for the microorganism,
The drug sensitivity of anaerobic microorganisms can be determined. Examples of anaerobic microorganisms whose drug sensitivity can be determined under such conditions include the following microorganisms.

【００１９】Clostridium difficile Clostridium perfringens Bacteroides fragilis Propionibacterium acnes Veillonella parvula Peptostoreptococcus anaerobiusClostridium difficile Clostridium perfringens Bacteroides fragilis Propionibacterium acnes Veillonella parvula Peptostoreptococcus anaerobius

【００２０】なお本発明における好気培養とは、培地が
接触する空気の組成を特に制御せず自然の空気がそのま
ま接触することを許す状態を意味する。言い換えれば、
培地自身が置かれている外部環境が好気的であることを
意味している。これに対してたとえば嫌気的な培養環境
と言う時には、培養している微生物の存在する環境がミ
クロに見た時に嫌気的であることと定義される。したが
ってたとえ培地そのものが好気的な状態に置かれていて
も、その内部に嫌気的な状態が生じていればその部分は
嫌気的環境である。The aerobic culture in the present invention means a state in which natural air is allowed to directly contact without controlling the composition of the air with which the medium comes into contact. In other words,
This means that the external environment in which the medium itself is placed is aerobic. On the other hand, for example, when an anaerobic culture environment is referred to, it is defined that the environment in which the microorganisms in culture are present is anaerobic when viewed microscopically. Therefore, even if the medium itself is placed in an aerobic state, if an anaerobic state occurs inside the medium, that part is an anaerobic environment.

【００２１】一方、微好気的な培養環境は、やはり寒天
による半流動培地を用いた時、培地表面に比較的近い部
位において実現される。この部位における増殖の程度を
観察することによって、微好気性微生物の薬剤感受性を
判定することができる。本発明によって薬剤感受性試験
を行うことができる微好気性微生物には、たとえば次の
ような微生物を例示することができる。中でもＨＰは、
近年胃疾患との関連性を強く疑われ注目されている微生
物である。ＨＰは培養環境に対して厳しい要求性を示す
が、本発明によれば半流動培地を利用した場合に培地表
面から１−５mmの範囲に良好な発育を見ることができ
る。On the other hand, a microaerobic culture environment is realized in a region relatively close to the surface of the medium when a semi-fluid medium made of agar is used. By observing the degree of growth at this site, the drug sensitivity of the microaerobic microorganism can be determined. Examples of the microaerobic microorganisms which can be subjected to the drug susceptibility test according to the present invention include the following microorganisms. Among them, HP
In recent years, it is a microorganism that has been strongly suspected to be associated with gastric disease and has been drawing attention. Although HP has severe requirements for the culture environment, according to the present invention, good growth can be seen in the range of 1-5 mm from the surface of the medium when a semi-solid medium is used.

【００２２】Helicobacter pylori Campylobacter jejunii Campylobacter fetus Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidisHelicobacter pylori Campylobacter jejunii Campylobacter fetus Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis

【００２３】本発明においては、培養は好気培養とす
る。従来は炭酸ガス培養が必要であった嫌気性微生物
や、微好気性微生物であっても培地中にそれぞれの微生
物に適した環境を維持することができるので培養条件は
好気的であっても差し支えない。むしろ培地ｐＨを低下
させる原因となる二酸化炭素濃度が、異常に高まらない
ように配慮することが必要である。もっとも通常の好気
的な培養条件では、培地と接触する空気は外部の環境と
流通しているので二酸化炭素濃度について特別な配慮が
求められることは少ないといえる。In the present invention, the culture is aerobic culture. Even if anaerobic microorganisms and microaerobic microorganisms that have conventionally required carbon dioxide culture can maintain an environment suitable for each microorganism in the medium, even if the culture conditions are aerobic It doesn't matter. Rather, it is necessary to take care so that the carbon dioxide concentration, which causes a decrease in medium pH, does not rise abnormally. Under the most usual aerobic culture conditions, the air contacting the culture medium circulates with the external environment, so it can be said that special consideration is not required for the carbon dioxide concentration.

【００２４】なおここまでは寒天による半流動培地の培
養環境について詳細に説明したが、実際の試験において
は培養環境と培地中の部位についてそれほど注意をむけ
る必要はない。なぜなら、培地中に微生物が分散するよ
うに接種しておけば、微生物はそれぞれの生育に適した
部位において選択的に増殖するためである。培地中にお
いては、培地表面から離れるにしたがって連続的に培養
環境が嫌気的になっていくので、どの部位に微生物が増
殖するのかをあらかじめ厳密に決めておく必要はないの
である。加えて、寒天平板希釈法のような従来の試験方
法では接種菌量によってＭＩＣが変動することが有る
が、本発明では接種菌量の影響を受けにくい。このよう
な特徴からも、本発明においては微生物の接種条件を厳
しく制限しなくてもよいのである。Up to this point, the culture environment of the semi-solid medium with agar has been described in detail, but in the actual test, it is not necessary to pay much attention to the culture environment and the site in the medium. This is because, if the microorganisms are inoculated so that they are dispersed in the medium, the microorganisms will selectively grow at sites suitable for their growth. In the medium, the culturing environment becomes anaerobic continuously as it moves away from the surface of the medium, so it is not necessary to strictly determine in advance which site the microorganism grows. In addition, in a conventional test method such as the agar plate dilution method, the MIC may vary depending on the inoculum size, but in the present invention, it is not easily affected by the inoculum size. In view of such characteristics, the inoculation condition of the microorganism does not have to be strictly limited in the present invention.

【００２５】本発明において、微生物の増殖程度は、肉
眼で判定してもよいし、機械的に測定することもでき
る。肉眼的に判定するには、半流動培地中に生じる濁帯
によって増殖を確認することができる。機械的に測定す
るには、この濁帯をイメージセンサによって読み取るこ
とも可能である。また、加温や撹拌などの操作によって
半流動性培地を液状化し増殖した微生物を培地中に均一
に分散させて、従来の微量希釈法と同様に濁度測定する
こともできる。更に、微生物の増殖を各種のインジケー
ターによって確認する手法が公知である。具体的には、
糖の発酵によって生成する酸をｐＨの変化によって捉え
る方法、微生物が産生する酵素によって分解され発色
（あるいは変色）する基質の利用等が知られている。こ
のような技術を本発明に応用することも可能である。た
とえばＨＰの場合、産生されるウレアーゼの基質である
尿素を用いその分解によって生じるｐＨの変化をカラー
インジケーターで捉えることができる。この他、被検微
生物の持つ遺伝子をハイブリダイゼーションアッセイ
や、ＰＣＲ法のような遺伝子増幅技術によって定量し、
増殖程度を観察することもできる。更に、微生物に固有
の抗原を免疫学的に測定する方法、微生物が含むＡＴＰ
を生物発光によって定量する方法等を応用することも可
能である。In the present invention, the degree of growth of microorganisms may be visually determined or mechanically measured. For macroscopic determination, the growth can be confirmed by the turbid zone formed in the semi-solid medium. For mechanical measurement, it is also possible to read this turbid zone with an image sensor. In addition, turbidity can be measured in the same manner as in the conventional microdilution method by liquefying the semi-fluid medium by operations such as heating and stirring and uniformly dispersing the grown microorganisms in the medium. Furthermore, a method of confirming the growth of microorganisms by various indicators is known. In particular,
It is known to use a substrate that captures an acid produced by fermentation of sugar by a change in pH, a substrate that is decomposed by an enzyme produced by a microorganism and develops (or changes color). It is also possible to apply such a technique to the present invention. In the case of HP, for example, urea, which is a substrate for urease produced, can be used to detect the change in pH caused by its decomposition with a color indicator. In addition to this, the genes of the test microorganisms are quantified by hybridization assay or gene amplification technology such as PCR,
The degree of proliferation can also be observed. Furthermore, a method for immunologically measuring an antigen specific to a microorganism, ATP contained in the microorganism
It is also possible to apply a method for quantifying the amount of bioluminescence by bioluminescence.

【００２６】以上のような本発明による薬剤感受性試験
方法を、嫌気性微生物、あるいは微好気性微生物の試験
に応用した具体的な操作例を次に示す。すなわち本発明
は、次の工程ａ）−ｄ）を含む、嫌気的、または微好気
的環境を好む微生物の薬剤感受性試験方法を提供する。 ａ）被検微生物を前培養する工程 ｂ）培養容器中の感受性試験の対象となる薬剤を含む培
地に工程ａ）の微生物を加えるか、または予め用意した
一定量の前記薬剤を含む培養容器に工程ａ）の微生物を
培地とともに加える工程 ｃ）培地中に微生物を保持し、かつ実質的に培地の対流
が起きない条件下、好気培養する工程 ｄ）培地によって外部の環境と遮断された部位における
微生物の増殖を観察する工程A specific operation example in which the above-described drug susceptibility test method according to the present invention is applied to a test for anaerobic microorganisms or microaerobic microorganisms will be described below. That is, the present invention provides a method for testing drug susceptibility of microorganisms that favor an anaerobic or microaerobic environment, including the following steps a) to d). a) step of pre-culturing a test microorganism b) addition of the microorganism of step a) to a medium containing a drug to be subjected to a susceptibility test in a culture container, or to a culture container containing a predetermined amount of the drug prepared in advance Step a) adding the microorganisms of the step a) together with the medium c) retaining the microorganisms in the medium and performing aerobic culture under conditions in which substantially no convection of the medium occurs d) a site cut off from the external environment by the medium Of observing the growth of microorganisms in

【００２７】工程ａ）の前培養には、通常ブイヨン培地
が利用される。このとき、培地ｐＨの変動は問題になら
ないので必要に応じて炭酸ガス培養を行ってもかまわな
い。被検微生物が十分に増殖したら、適当な細胞数とな
るように新しい培地や生理食塩水等で懸濁し接種材料と
する。接種する菌量は、１０³以上、好ましくは１０⁴−
１０⁷程度である。微量希釈法に基づくＮＣＣＬＳ標準
法では１０⁵を推奨しているが、後に実施例で述べるよ
うに本発明では接種菌量が１０⁴−１０⁶の範囲でＭＩＣ
は大きく変動することがない。ただ接種菌量が大きくな
るのにしたがって、ＭＩＣが若干大きめに出る傾向が有
るので、安全のために１０⁷程度の接種菌量とするのが
望ましい。前培養をブイヨンではなく固形培地で行うこ
ともできる。このときには培地表面のコロニーをかきと
って懸濁させる必要がある。一般的に言って嫌気的環境
を好む微生物は、たとえ炭酸ガス培養を行っても十分な
増殖速度を得にくいし、接種材料の調製に当たっても液
状の方が操作しやすいことから、この工程にはブイヨン
を用いるのが有利である。A broth medium is usually used for the preculture in step a). At this time, the fluctuation of the medium pH does not pose a problem, so carbon dioxide gas culture may be carried out if necessary. When the test microorganisms have sufficiently grown, they are suspended in a new medium or physiological saline so as to have an appropriate number of cells and used as an inoculum. The amount of bacteria to be inoculated is 10 ³ or more, preferably 10 ⁴ −
It is about 10 ⁷ . In the NCCLS standard method based on the microdilution method, 10 ⁵ is recommended, but as will be described later in the example, in the present invention, the inoculum size is in the range of 10 ⁴ -10 ⁶ to MIC.
Does not fluctuate significantly. However, as the inoculum size increases, the MIC tends to increase slightly, so for safety, it is desirable to set the inoculum size to about 10 ⁷ . It is also possible to carry out the pre-culture in solid medium instead of broth. At this time, it is necessary to scrape and suspend the colonies on the medium surface. Generally speaking, microorganisms that prefer an anaerobic environment are difficult to obtain a sufficient growth rate even if they are cultivated with carbon dioxide, and liquid is easier to operate even when preparing an inoculum. It is advantageous to use broth.

【００２８】なお前培養に用いる培養開始材料は、たと
えば実際の臨床検体から分離された微生物である。ＨＰ
の場合には、本発明者等が先に提案した抗菌剤を含むＨ
Ｐ輸送培地[12]で臨床検体を輸送し、チョコレート寒天
培地、血液寒天培地、スキロー培地、ＳＣＤＬ寒天培
地、ハート寒天培地、ＢＨＩ寒天培地、トリプトソイ寒
天培地、ミューラーヒントン寒天培地、およびブルセラ
寒天培地等の公知の分離用培地を利用して分離する。臨
床検体が、たとえば胃生検材料のような固形試料であれ
ばホモジナイズした後に寒天培地に接種する。なおＨＰ
のような微好気性細菌の分離を目的とするときには、短
時間であれば問題はないがその操作が長時間に及ぶ時に
はホモジナイズも微好気的雰囲気下で行う等の配慮が必
要である。更に分離用培地による培養も微好気状態で行
わなければならない。The culture starting material used for the preculture is, for example, a microorganism isolated from an actual clinical specimen. HP
In the case of H, H containing the antibacterial agent previously proposed by the present inventors.
Transport clinical samples on P transport medium [12], such as chocolate agar medium, blood agar medium, Schille medium, SCDL agar medium, Heart agar medium, BHI agar medium, tryptosoy agar medium, Mueller Hinton agar medium, Brucella agar medium, etc. Separation is performed using a known separation medium described in. If the clinical specimen is a solid sample such as a gastric biopsy material, it is homogenized and then inoculated on an agar medium. HP
For the purpose of separating microaerobic bacteria as described above, there is no problem in a short time, but when the operation takes a long time, it is necessary to consider that homogenization is performed in a microaerobic atmosphere. Further, the culture in the separation medium must be carried out in a microaerobic state.

【００２９】工程ｂ）は、培養を行う培地中で薬剤と接
触する状態で被検微生物を接種する工程である。ａ）で
得た接種材料を固化前の薬剤感受性試験用培地と混和
し、予め無菌的に用意した一定濃度の薬剤が入った培養
容器に分注すると良い。薬剤を予め培養容器に分注して
凍結させたものを用意しておけば、薬剤感受性試験用培
地を分注するだけで試験を開始できるので便利である。
薬剤は凍結以外にも乾燥させて保存しておくこともでき
る。乾燥させておく場合には、培養容器中で凍結乾燥さ
せておく他、薬剤を適当な担体に保持させた状態で乾燥
させたものを培地中に投入したり、あるいは培地を固化
させた後に表面に置くことによって薬剤を供給すること
ができる。担体としては、ろ紙、不織布、ポリエチレン
のような素材からなる多孔性樹脂等の吸収性のものや、
ＰＥＴフィルムのような非浸透性材料の上に塗布乾燥さ
せたもの等が知られている。また適当な賦形剤を使って
錠剤にしたものを利用することも可能である。Step b) is a step of inoculating the test microorganism in a culture medium in a state of being in contact with the drug. It is advisable to mix the inoculum obtained in a) with the drug susceptibility test medium before solidification and dispense into a culture container containing a drug of a certain concentration prepared aseptically in advance. It is convenient to dispense the drug in a culture container in advance and prepare a frozen product so that the test can be started simply by dispensing the drug sensitivity test medium.
In addition to freezing, the drug can be dried and stored. When dried, in addition to freeze-drying in a culture container, put the dried drug in a state that the drug is held in an appropriate carrier, or put it on the surface after solidifying the medium. The drug can be delivered by placing it in the. As the carrier, a filter paper, a non-woven fabric, an absorbent substance such as a porous resin made of a material such as polyethylene,
It is known to coat and dry a non-permeable material such as a PET film. It is also possible to use a tablet formed by using an appropriate excipient.

【００３０】本発明に利用する培養容器には、培養対象
としている微生物が生育可能な部位を与えることができ
る深さを持つものを利用する。たとえば寒天を利用した
半流動培地でＨＰを培養する時には、５−２０mm、もし
くはそれ以上の深さを培地に与える形状を持つことが条
件になる。また微生物の増殖程度を観察するために、容
器の少なくとも一部は透明であることが望ましい。複数
のウエルをマトリクス状に並べた、いわゆるマルチウエ
ルプレートが市販されているので、この種の容器を利用
すると培養スペースを有効に活用することができる。マ
ルチウエルプレートにはさまざまな大きさのウエルが用
意されているので、必要な深さを確保できるものを選ぶ
ようにする。The culture vessel used in the present invention has a depth enough to provide a site where the microorganism to be cultured can grow. For example, when culturing HP in a semi-solid medium using agar, it is necessary to have a shape that gives the medium a depth of 5-20 mm or more. Further, in order to observe the degree of growth of microorganisms, it is desirable that at least a part of the container is transparent. Since a so-called multi-well plate in which a plurality of wells are arranged in a matrix is commercially available, the culture space can be effectively used by using this type of container. There are various sizes of wells in the multi-well plate, so be sure to choose one that has the required depth.

【００３１】工程ｃ）では、培地中に細胞を保持し、か
つ実質的に培地の対流が起きない条件下、好気培養す
る。先に述べたように、このような培養条件を与える一
般的な培地は半流動培地である。In step c), cells are retained in the medium and aerobically cultivated under the condition that convection of the medium does not substantially occur. As mentioned above, a common medium that provides such culture conditions is a semi-solid medium.

【００３２】工程ｄ）で、培地によって外部環境と遮断
された部位における微生物の増殖を観察する。このよう
な操作によれば、培地中に分散した微生物がそれぞれに
合った環境を選んで増殖する。したがって、培地のどの
部位が被検微生物に適合しているのかを予め厳密に知る
必要はなく、単に増殖を観察すれば目的を達することが
できる。一連の操作は、薬剤感受性試験の対象としてい
る微生物のみならず、感受性の明らかな標準菌株ととも
に行って精度管理に生かすこともできる。In step d), the growth of microorganisms is observed at the site which is shielded from the external environment by the medium. According to such an operation, the microorganisms dispersed in the medium grow by selecting an environment suitable for each. Therefore, it is not necessary to strictly know in advance which part of the medium is suitable for the test microorganism, and the purpose can be achieved by simply observing the growth. A series of operations can be carried out not only for the microorganisms to be subjected to the drug susceptibility test but also for standard strains of which susceptibility is clear, and can be used for quality control.

【００３３】更に本発明は、微生物試料を培地中に保持
することができ、かつ培養条件下で培地の対流を起こさ
ない性状を維持する薬剤感受性試験用培地を提供する。
このような物理的な性状を持つ培地は、たとえば半流動
培地として既に公知である。この種の培地は、培地中に
微生物の増殖のための環境を与えることが既に知られて
いる。しかしこれを薬剤感受性試験に利用した時に、好
気的な培養条件で嫌気的な培養環境を実現し、炭酸ガス
の吸収に伴う培地ｐＨの低下、そしてｐＨ低下による薬
剤感受性の変化という問題を解消しうることは新しい知
見である。The present invention further provides a medium for drug susceptibility testing, which is capable of holding a microbial sample in a medium and maintaining the property of not causing convection of the medium under culture conditions.
A medium having such physical properties is already known as, for example, a semi-solid medium. It is already known that this type of medium provides an environment for the growth of microorganisms in the medium. However, when this was used for drug susceptibility testing, an anaerobic culture environment was realized under aerobic culture conditions, and the problem of the decrease in medium pH due to the absorption of carbon dioxide and the change in drug sensitivity due to pH decrease was solved. What can be done is a new finding.

【００３４】好適な本発明の薬剤感受性試験用培地は、
被検微生物の増殖を十分に支持することができる基礎的
な培養成分、培養条件のもとで前記物理的性状を維持す
ることができるゲル化剤、そして試験対象である薬剤を
含む。微生物の増殖を支持することができる基礎的な培
養成分の組成には、たとえば以下のような公知の培地組
成を利用すると良い。A suitable medium for drug sensitivity test of the present invention is
It includes a basic culture component capable of sufficiently supporting the growth of a test microorganism, a gelling agent capable of maintaining the physical properties under culture conditions, and a drug to be tested. For the composition of basic culture components that can support the growth of microorganisms, the following known medium composition may be used.

【００３５】ハートインフュージョンブイヨン培地’栄
研’の組成（１L中、栄研化学製） ウシ心臓浸出液 ５００g ペプトン １０g 塩化ナトリウム ５g ｐＨ ７．４±Composition of heart infusion broth medium'Eiken '(1 L, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) Bovine heart exudate 500 g Peptone 10 g Sodium chloride 5 g pH 7.4 ±

【００３６】 ミューラーヒントン培地の組成（１L中、ディフコ製） 牛肉抽出液 ３００g カザミノ酸 １７．５g デンプン １．５g ｐＨ ７．４±０．２Composition of Mueller Hinton medium (1 L, made by Difco) Beef extract 300 g Casamino acid 17.5 g Starch 1.5 g pH 7.4 ± 0.2

【００３７】 チオグリコレート培地の組成（１L中、ＢＢＬ社製） トリプチケースペプトン １７．００g ファイトンペプトン ３．００g ブドウ糖 ６．００g 塩化ナトリウム ２．５０g チオグリコール酸ナトリウム ０．５０g 寒天 ０．７０g Ｌ−シスチン ０．２５g 亜硫酸ナトリウム ０．１０g ｐＨ ７．０±Composition of thioglycollate medium (1 L, manufactured by BBL) Triptycase peptone 17.00 g Phyton peptone 3.00 g Glucose 6.00 g Sodium chloride 2.50 g Sodium thioglycolate 0.50 g Agar 0.70 g L-cystine 0.25 g sodium sulfite 0.10 g pH 7.0 ±

【００３８】チオグリコレート培地’栄研’の組成（１
L中、栄研化学製） 酵母エキス ５g トリプトン １５g ブドウ糖 ５g Ｌ−シスチン ０．５g チオグリコール酸ナトリウム ０．５g 塩化ナトリウム ２．５０g レサズリン ０．００１g 寒天 ０．８g ｐＨ ７．１±Composition of thioglycollate medium "Eiken" (1
L medium, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) Yeast extract 5 g Tryptone 15 g Glucose 5 g L-cystine 0.5 g Sodium thioglycolate 0.5 g Sodium chloride 2.50 g Resazurin 0.001 g Agar 0.8 g pH 7.1 ±

【００３９】チオグリコール酸培地ＩＩ’栄研’の組成
（１L中、栄研化学製） 酵母エキス ５g トリプトン １５g ブドウ糖 ５g Ｌ−シスチン ０．５g チオグリコール酸ナトリウム ０．５g 塩化ナトリウム ２．５０g ｐＨ ７．１±Thioglycolic Acid Medium II Composition of'Eiken '(1 L, manufactured by Eiken Kagaku) Yeast extract 5 g Tryptone 15 g Glucose 5 g L-cystine 0.5 g Sodium thioglycolate 0.5 g Sodium chloride 2.50 g pH 7 .1 ±

【００４０】以上のような基礎的な培地組成の内、特に
好ましいものがミューラーヒントン培地の組成である。
ミューラーヒントン培地は単純な培地組成を持ち、試験
の対象となる薬剤との相互作用の危険性が少ない。たと
えば培地成分として良く利用されるペプトンはサルファ
剤の拮抗物質を含むことが知られているが、ミューラー
ヒントン培地はペプトンを含まない。しかも幅広い微生
物に対して十分な発育支持能を示し、滅菌が容易で培地
自身の透明度も高く、薬剤感受性試験用の培地として好
ましい性状を備えていると言える。これらの公知の組成
に加えて、培養対象となる微生物の栄養要求性に合わせ
て付加的な栄養素を添加することができる。たとえば、
ＨＰのような栄養要求性の厳しい微生物の場合、動物血
液成分の添加が増殖促進に有効である。具体的には、ヒ
ツジ、ヤギ、ウシ、あるいはウマのような動物の血液、
または血清等を例示することができる。血液や血清を加
えるときには、５−２０%v/vの範囲で加えると良い。Ｈ
Ｐの場合には、ヘミンやメナジオンの添加も有効であ
る。Of the above basic medium compositions, the Mueller Hinton medium composition is particularly preferable.
Mueller Hinton medium has a simple medium composition and there is little risk of interaction with the drug under test. For example, peptone, which is often used as a medium component, is known to contain a sulfa drug antagonist, while Mueller Hinton medium does not contain peptone. In addition, it can be said that it has sufficient growth supporting ability for a wide range of microorganisms, is easy to sterilize, and has high transparency of the medium itself, and has favorable properties as a medium for a drug sensitivity test. In addition to these known compositions, additional nutrients can be added according to the auxotrophy of the microorganism to be cultured. For example,
In the case of microorganisms with severe nutritional requirements such as HP, addition of animal blood components is effective in promoting growth. Specifically, the blood of animals such as sheep, goats, cows, or horses,
Alternatively, serum and the like can be exemplified. When adding blood or serum, it is advisable to add it in the range of 5-20% v / v. H
In the case of P, addition of hemin or menadione is also effective.

【００４１】本発明においては、薬剤感受性試験のため
に培地中で被検微生物と薬剤とを接触させなければなら
ない。このためには、培地が固化する前に薬剤を無菌的
に添加して混和する。培地の形状が半流動培地であれ
ば、固化後に物理的に撹拌することも可能なため薬剤の
添加は可能であるが、培地中に酸素が入り込んだまま放
出されなくなるので嫌気的な培養環境を得にくくなるこ
とがある。このような理由により、薬剤の添加・混和は
固化前に行うことが望ましい。In the present invention, the test microorganisms and the drug must be contacted in the medium for the drug sensitivity test. For this purpose, the drug is aseptically added and mixed before the medium solidifies. If the shape of the medium is a semi-fluid medium, it is possible to add a drug because it can be physically stirred after solidification, but oxygen will not be released as oxygen enters the medium, so an anaerobic culture environment is created. It may be difficult to obtain. For these reasons, it is desirable to add / mix the chemicals before solidification.

【００４２】[0042]

【作用】本発明において、細胞を培地中に保持し、しか
も培養条件下で対流を起こさない性状を維持するという
培養条件は、好気的な培養条件のもとで嫌気的な環境を
実現する作用を有する。この作用により、本発明では培
地ｐＨ低下の原因となる高濃度の二酸化炭素との接触を
避けることが可能となる。微生物の酸素感受性に関与す
るのは、二酸化炭素濃度ではなく培養環境の酸化還元電
位である。嫌気培養に必要とされていた二酸化炭素を使
用することなく任意の嫌気的環境を作り出し、さまざま
な酸素感受性を持つ広い範囲の微生物に応じた培養環境
を容易に提供できるのが本発明の大きな特徴である。た
とえば一般的な液体培地の場合、培地の底に細胞を保持
することはできる。そして底に細胞を沈めた状態で静置
培養すれば、嫌気的な環境を与えることは可能である。
しかしこのような培養方法では、培地底部の環境に適応
できる微生物の培養に限られてしまう。培地の中の広い
範囲にわたって微生物を保持することができるという本
発明の特徴によって、はじめて広い範囲の微生物の培養
が可能となるのである。In the present invention, the culture condition of maintaining cells in the medium and maintaining the property of not causing convection under the culture condition realizes an anaerobic environment under the aerobic culture condition. Have an effect. Due to this action, in the present invention, it is possible to avoid contact with a high concentration of carbon dioxide, which causes a decrease in medium pH. It is not the carbon dioxide concentration, but the redox potential of the culture environment that contributes to the oxygen sensitivity of the microorganism. A major feature of the present invention is that any anaerobic environment can be created without using carbon dioxide, which was required for anaerobic culture, and a culture environment corresponding to a wide range of microorganisms having various oxygen sensitivities can be easily provided. Is. For example, in the case of a general liquid medium, it is possible to keep the cells at the bottom of the medium. An anaerobic environment can be provided by statically culturing the cells in the bottom.
However, such a culturing method is limited to culturing a microorganism that can adapt to the environment at the bottom of the medium. Due to the feature of the present invention that microorganisms can be retained over a wide range in the medium, a wide range of microorganisms can be cultured for the first time.

【００４３】[0043]

【発明の効果】本発明の薬剤感受性試験方法によって、
二酸化炭素濃度の高い培養条件によらず微好気的、ある
いは嫌気的な微生物の薬剤感受性試験を迅速性、簡便性
を犠牲にすることなく容易に行うことが可能となる。本
発明においては、微好気的、あるいは嫌気的な環境を実
現するために二酸化炭素濃度を高く設定するという従来
の方法とは違って、培地表面から距離を置いた位置で被
検微生物を培養する方法を採用している。そのため二酸
化炭素の吸収によって培地のｐＨが低下することがな
い。培地のｐＨが変動しないので、ｐＨの変動によって
ＭＩＣ値が変動するような微生物と薬剤の組み合わせで
あっても正確なＭＩＣ値を決定することが可能となる。
加えて本発明では、一部の微生物の生育に悪影響を及ぼ
す緩衝剤を使うことなく培地のｐＨを安定化するので、
幅広い微生物に適用することができる。According to the drug sensitivity test method of the present invention,
This makes it possible to easily carry out a drug susceptibility test for microaerobic or anaerobic microorganisms without sacrificing speed and convenience regardless of the culture conditions with a high carbon dioxide concentration. In the present invention, unlike the conventional method of setting a high carbon dioxide concentration in order to realize a microaerobic or anaerobic environment, the test microorganism is cultured at a position distant from the medium surface. Is adopted. Therefore, absorption of carbon dioxide does not lower the pH of the medium. Since the pH of the medium does not change, it is possible to determine an accurate MIC value even with a combination of a microorganism and a drug in which the MIC value changes due to the pH change.
In addition, the present invention stabilizes the pH of the medium without using a buffering agent that adversely affects the growth of some microorganisms.
It can be applied to a wide range of microorganisms.

【００４４】本発明の薬剤感受性試験方法は、培地表面
からの距離を変えるだけで好気的な環境から嫌気的な環
境まで任意の培養環境を容易に選択することができる。
これに対して従来の薬剤感受性試験では、培養環境を外
部環境の制御によって行っていた。そのため、特に微好
気的、あるいは嫌気的な培養環境を得るためには特殊な
装置や繁雑な操作を避けることができなかった。本発明
で培養条件として採用した好気的培養条件は、嫌気性、
あるいは微好気性の微生物を好気性微生物と同じ条件で
培養することを可能とする。言い換えれば被検微生物の
酸素感受性にかかわらず、ほぼ同じ培養条件で薬剤感受
性試験を実施できることを意味する。このような特徴に
よって、特殊な装置を必要としないばかりではなく、共
通の試験操作によって幅広い微生物の薬剤感受性試験を
行うことができるので試験精度の向上に貢献する。たと
えば、ＮＣＣＬＳのＭＩＣ測定精度管理用菌株であるS.
aureusやE.coliのような好気的微生物を利用した場合で
あっても、同じ培地、同じ培養条件で薬剤感受性試験を
行うことができる。このように被検微生物の酸素感受性
の影響を受けることなく、薬剤感受性試験の精度管理を
可能とする技術はこれまでに知られていない。In the drug sensitivity test method of the present invention, an arbitrary culture environment from an aerobic environment to an anaerobic environment can be easily selected simply by changing the distance from the medium surface.
On the other hand, in the conventional drug sensitivity test, the culture environment was controlled by controlling the external environment. Therefore, in order to obtain a particularly aerobic or anaerobic culture environment, a special device or complicated operation cannot be avoided. The aerobic culture conditions adopted as the culture conditions in the present invention are anaerobic,
Alternatively, it makes it possible to culture a microaerobic microorganism under the same conditions as the aerobic microorganism. In other words, it means that the drug sensitivity test can be carried out under almost the same culture condition regardless of the oxygen sensitivity of the test microorganism. Due to such characteristics, not only a special device is not required, but a wide range of microorganisms can be tested for drug susceptibility by a common test operation, which contributes to improvement in test accuracy. For example, S. cerevisiae, which is a strain for controlling MIC measurement of NCCLS.
Even when an aerobic microorganism such as aureus or E. coli is used, the drug sensitivity test can be performed in the same medium and the same culture conditions. Thus far, no technology has been known that enables the quality control of a drug susceptibility test without being affected by the oxygen sensitivity of a test microorganism.

【００４５】本発明の薬剤感受性試験方法によって得ら
れるＭＩＣ値は、ＮＣＣＬＳでも標準法として採用され
ている微量希釈法の結果と良好な相関を示す。したがっ
て、好気性微生物から嫌気的微生物まで同じ条件で培養
を行うことができる新しい薬剤感受性試験の基本的な技
術として有用である。The MIC value obtained by the drug susceptibility test method of the present invention shows a good correlation with the result of the microdilution method adopted as a standard method in NCCLS. Therefore, it is useful as a basic technique for a new drug susceptibility test that allows culturing under the same conditions from aerobic microorganisms to anaerobic microorganisms.

【００４６】本発明によって提供される薬剤感受性試験
用培地は、たとえば寒天のようなゲル化剤である程度の
固形性を与えられた性状を備えている。このような培地
では、被検微生物の増殖程度を肉眼でも容易に判別する
ことができる。他方もしも機械的に微生物の繁殖程度を
測定する必要があれば、培地を溶解することによって、
あるいは溶解しないまま強制的に撹拌して均一化し微量
希釈法と同じように濁度測定を行うこともできる。寒天
を利用した半流動性培地であれば、加温操作によって溶
解することができる。The medium for drug susceptibility test provided by the present invention has the property of being imparted with a certain degree of solidity by a gelling agent such as agar. In such a medium, the degree of growth of the test microorganism can be easily discriminated with the naked eye. On the other hand, if it is necessary to mechanically measure the degree of microbial growth, by dissolving the medium,
Alternatively, the turbidity can be measured in the same manner as the microdilution method by forcibly stirring and homogenizing without dissolving. A semi-fluid medium using agar can be dissolved by a heating operation.

【００４７】[0047]

【実施例】【Example】

１．試験菌株 胃潰瘍、十二指腸潰瘍患者胃粘膜組織より分離し、可能
な限り継代培養を避け、実験までに１０%ジメチルスル
ホキシド、馬血清を添加したBrucella broth(Difco)中
−８０℃で保存したＨＰ臨床分離株３０株、およびＡＴ
ＣＣより分譲を受けたＨＰ３株（ＡＴＣＣ４３５０４、
ＡＴＣＣ４３５７９、ＡＴＣＣ４３６２９）を試験菌と
した。また精度管理用菌株としてＮＣＣＬＳ指定標準株
であるStaphylococcus aureus（ＡＴＣＣ２９２１
３）、およびEscherichia coli（ＡＴＣＣ２５９２２）
の２株を用いた。1. Test strains HP clinical isolates from gastric mucosal tissues of patients with gastric ulcer and duodenal ulcer, avoiding subculture as much as possible, and stored in Brucella broth (Difco) supplemented with 10% dimethyl sulfoxide and horse serum at -80 ° C until the experiment. 30 isolates and AT
HP3 strain (ATCC43504,
ATCC43579 and ATCC43629) were used as test bacteria. In addition, Staphylococcus aureus (ATCC2921), which is a standard strain designated by NCCLS, is used as a quality control strain.
3), and Escherichia coli (ATCC25922)
2 strains were used.

【００４８】２．使用抗菌薬 力価の明らかな以下の４薬剤を用いた。 Ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ（ＡＭＰＣ 藤沢薬品製） Ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ（ＣＡＭ ダイナボット
製） Ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ（ＡＺＭ ファイザー製薬
製） Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ（ＣＰＦＸ バイエル薬品
製）2. Antibacterial agents used The following 4 drugs with known titers were used. Amoxillin (AMPC made by Fujisawa) Clarithromin (made by CAM Dynabot) Azithromycin (made by AZM Pfizer Pharmaceuticals) Ciprofloxacin (made by CPFX Bayer Yakuhin)

【００４９】３．使用培地 寒天平板希釈法には、リン酸緩衝液で３種類のｐＨ
（６、７、８）に調製したBrucella agar（Difco製）に
５%となるように馬脱繊血液を加えたものを使用した。
半流動培地は、ハートインフュージョン・ブイヨン培地
（Difco製、Heartinfusion broth；商品名）、ミューラ
ーヒントン・ブイヨン（Difco製、Mueller Hinton brot
h；商品名）、ブルセラ・ブイヨン（Difco製、Brucella
broth；商品名）およびチオグリコレート・ブイヨン
（ＢＢＬ製、Thioglycollate medium without indicato
r-135C；商品名）に、最終濃度０．２%となるようにBac
to Agar（Difco製、商品名）を加え、さらに馬血清を１
０%となるように加えたものを用いた。3. Use medium For agar plate dilution method, use phosphate buffer to adjust pH to 3 types.
The Brucella agar (manufactured by Difco) prepared in (6, 7, 8) to which horse defatted blood was added to 5% was used.
The semi-fluid medium is a heart infusion broth medium (Difco, Heartinfusion broth; trade name), Mueller Hinton broth (Difco, Mueller Hinton brot)
h; product name), Brucella bouillon (Difco, Brucella
broth; trade name) and thioglycollate broth (BBL, Thioglycollate medium without indicato)
r-135C; trade name) with a final concentration of 0.2% Bac
to Agar (manufactured by Difco, trade name) was added, and horse serum was further added
What was added so that it might become 0% was used.

【００５０】４．ＭＩＣ測定 接種菌液は、各被検微生物をコロンビア羊血液寒天培地
（ＢＢＬ製）で３５℃、二酸化炭素濃度１０%で７２時
間前培養した平板培地からミューラーヒントン・ブイヨ
ンに１０⁸CFU/mlとなるように懸濁させたものを用い
た。細胞数はミューラーヒントン・ブイヨンで１０倍希
釈系列を作成してコロンビア羊血液寒天培地にコンラー
ジ接種し、３５℃、二酸化炭素濃度１０%で７２時間培
養しコロニーをカウントすることによって決定した。寒
天平板希釈法は、日本化学療法学会標準法[13]に準じて
行った。すなわち、１００−０．０２５μg/mlの抗菌薬
希釈系列を含む測定培地に、前記接種菌液をミューラー
ヒントン・ブイヨンで１００倍希釈して約１０⁶CFU/ml
に調製した菌液をミクロプランター（大日本精機製）で
５μl接種し、３５℃、二酸化炭素１０%で７２時間培養
を行った。ＭＩＣは、コロニーを生じなかった最少濃度
から判定した。半流動培地による測定は、１２８−０．
００２μg/ml抗菌薬希釈系列を含む各測定培地を４０℃
に冷却し、前記接種菌液を４．０×１０⁷、１．０×１
０⁷および２．５×１０⁶CFU/mlとなるように接種して軽
く混和後、セラピッツ（φ１５mm×１００mm、小野薬品
製、商品名）に無菌的に２ml分注し固化させた。３５℃
好気条件で１−３日間培養後、各日、判定を行った。培
地中層部（微好気部分）における発育の程度を観察し、
濁帯の見られない濃度をＭＩＣとした。半流動培地での
日差再現性は、４種の薬剤のＭＩＣを３日間に分け測定
した。この実験条件では、ＨＰは培地表面から２−５mm
の範囲で増殖する。ＮＣＣＬＳ管理標準株については１
０⁶、１０⁵、１０⁴CFU/mlの３菌量で前記の操作を同様
に行いＭＩＣ値を求めた。4. MIC measurement The inoculum was 10 ⁸ CFU / ml of Mueller-Hinton broth from a plate medium prepared by pre-culturing each test microorganism in Colombian sheep blood agar (BBL) at 35 ° C and carbon dioxide concentration of 10% for 72 hours. What was suspended was used. The number of cells was determined by making a 10-fold dilution series with Mueller Hinton broth, inoculating it in Columbia sheep blood agar medium with conradi, and culturing at 35 ° C. for 10 hours at a carbon dioxide concentration of 10% for 72 hours and counting the colonies. The agar plate dilution method was performed according to the Japanese Society of Chemotherapy Standard Method [13]. That is, the inoculum was diluted 100-fold with Mueller Hinton broth into a measurement medium containing an antibacterial agent dilution series of 100-0.025 μg / ml to obtain about 10 ⁶ CFU / ml.
5 μl of the bacterial solution prepared in 1 above was inoculated with a micro planter (manufactured by Dainippon Seiki) and cultured at 35 ° C. and carbon dioxide 10% for 72 hours. The MIC was determined from the lowest concentration that did not produce colonies. The measurement using a semi-fluid medium was 128-0.
Each measurement medium containing 002μg / ml antimicrobial dilution series is 40 ℃
It is cooled to 4.0 × 10 ⁷ , 1.0 × 1.
The mixture was inoculated to give a concentration of 0 ⁷ and 2.5 × 10 ⁶ CFU / ml, mixed gently, and then 2 ml was aseptically dispensed into therapits (φ15 mm × 100 mm, Ono Yakuhin, trade name) to solidify. 35 ° C
After culturing under aerobic conditions for 1 to 3 days, the determination was performed on each day. Observe the degree of growth in the middle layer of the medium (microaerobic part),
The concentration at which no turbid zone was observed was defined as MIC. The reproducibility of the day difference in the semi-fluid medium was measured by dividing the MICs of the four drugs into 3 days. HP was 2-5 mm from the surface of the medium under these experimental conditions.
Proliferate in the range of. 1 for NCCLS Standard Stock
The MIC value was obtained by performing the above-mentioned operation in the same manner with three bacterial amounts of 0 ⁶ , 10 ⁵ , and 10 ⁴ CFU / ml.

【００５１】５．結果 5-1.寒天平板希釈法 ＭＩＣ測定値に培地ｐＨが影響すると考えられるＣＡＭ
およびＡＭＰＣの試験菌に対する寒天平板希釈法（炭酸
ガス培養；従来法）によるＭＩＣを図１（ＣＡＭ）およ
び図２（ＡＭＰＣ）に示した。試験菌３０株中、ｐＨ調
整のため添加した緩衝剤（リン酸）の影響によって発育
しなかった株は９株、すなわち発育が認められた２１株
の成績である。ＣＡＭにおいてｐＨ６．０でほとんどの
試験菌に対するＭＩＣ値が０．１０−０．０５μg/mlに
分布したのに対し、ｐＨ７．０およびｐＨ８．０に調整
した培地では約４−８倍低い、０．０１３μg/mlに分布
した。またこの傾向は低感受性株で顕著でｐＨ６．０に
おいて１２．５μg/ml以上の両株は、ｐＨ７．０で３．
１３μg/mlおよび０．７８μg/ml、ｐＨ８．０では２株
に対し０．７８μg/mlと１６倍以上低い値を示した。Ａ
ＭＰＣにおいては逆にｐＨ６．０でほとんどの株に対
し、０．０１３μg/mlと最も低い値を示した。ｐＨ７．
０ではｐＨ６．０に比べ約４倍高い０．０５μg/mlに分
布した。このように、ＨＰに対していずれの薬剤も測定
培地のｐＨによってＭＩＣ値が変動することが確認され
た。5. Results 5-1. Agar plate dilution method CAM that media pH is thought to influence MIC measurement values
MICs obtained by the agar plate dilution method (carbon dioxide gas culture; conventional method) for the test bacteria of AMPC and AMPC are shown in FIG. 1 (CAM) and FIG. 2 (AMPC). Among the 30 strains of the test bacteria, the strains that did not grow due to the effect of the buffering agent (phosphate) added for pH adjustment are 9 strains, that is, the 21 strains in which growth was recognized. In CAM, the MIC value for most of the test bacteria was distributed at 0.10-0.05 μg / ml at pH 6.0, whereas it was about 4-8 times lower in the medium adjusted to pH 7.0 and pH 8.0. It was distributed to 0.013 μg / ml. In addition, this tendency is remarkable in the low-susceptibility strain, and both strains of 12.5 μg / ml or more at pH 6.0 have pH of 3.0 at 3.
At 13 µg / ml, 0.78 µg / ml and pH 8.0, the values were 0.78 µg / ml, which was 16 times or more lower than those of the two strains. A
On the contrary, MPC showed the lowest value of 0.013 μg / ml against most strains at pH 6.0. pH 7.
At 0, it was distributed at 0.05 μg / ml, which was about 4 times higher than that at pH 6.0. As described above, it was confirmed that the MIC values of all drugs against HP varied depending on the pH of the measurement medium.

【００５２】5-2.各種半流動培地における試験菌株の発
育 寒天平板希釈法で発育した２１株のうち臨床分離株１０
株および標準菌株３株のハートインフュージョン、ミュ
ーラーヒントン、ブルセラおよびチオグリコレート半流
動培地における発育を表１に示した。培養１日目で明ら
かに試験菌の発育が認められた培地はブルセラで８株、
ハートインフュージョンおよびチオグリコレートで７
株、ミューラーヒントンで５株であった。しかしブルセ
ラおよびチオグリコレートでは１日目で発育しない株が
２株存在した。２日目では十分に発育の認められた株は
いずれの培地においても１２株で、残り１株は弱い発育
を示した。３日間の培養においても試験菌の発育性に差
はないことから、以下の検討をミューラーヒントン半流
動培地を用いて行った。また寒天平板希釈法で７２時間
以上の培養が必要だったＨＰが、本発明による薬剤感受
性試験方法では４８時間でＭＩＣの判定が可能となるこ
とが確認された。本発明によれば、迅速にＭＩＣを求め
られることが確認された。5-2. Growth of test strains in various semi-solid medium 10 clinical isolates out of 21 strains grown by agar plate dilution method
Table 1 shows the growth of the strain and three standard strains in heart infusion, Mueller Hinton, Brucella and thioglycollate semi-fluid medium. On the 1st day of culture, the medium in which the growth of the test bacteria was clearly observed was Brucella strain,
7 with Heart Infusion and Thioglycolate
Muller Hinton had 5 shares. However, with Brucella and thioglycollate, there were two strains that did not develop on the first day. On the second day, 12 strains showed sufficient growth in any medium, and the remaining 1 strain showed weak growth. Since there is no difference in the growth of the test bacteria even after 3 days of culture, the following studies were carried out using the Mueller Hinton semi-solid medium. Further, it was confirmed that HP, which had been required to be cultured for 72 hours or more in the agar plate dilution method, could be judged in MIC in 48 hours in the drug sensitivity test method according to the present invention. According to the present invention, it was confirmed that MIC can be promptly obtained.

【００５３】[0053]

【表１】 [Table 1]

【００５４】5-3.各種抗菌薬のＭＩＣ値に及ぼす接種菌
量の影響 ミューラーヒントン半流動培地を測定培地として、ＨＰ
臨床分離株５株ＡＴＣＣ標準株３株およびＮＣＣＬＳ精
度管理菌株２株の各種接種菌量における４薬剤のＭＩＣ
を測定した結果を表２に示す。ＨＰは４．０、１．０、
０．２５×１０⁷CFU/ml、S.aureusおよびE.coliは１
０⁶、１０⁵、１０⁴の３菌量で測定した。いずれの薬剤
においてもＨＰの一部の菌株に菌量が高くなるにつれＭ
ＩＣ値が上昇する結果が得られたが、どの接種菌量でも
ＭＩＣ値の差が２倍を越えることはなかった。一般にこ
の種の微生物学的試験方法においては、２倍を越えない
変動は許容範囲内とされている。またＣＡＭおよびＡＺ
Ｍに対し低感受性を示した臨床分離株２および臨床分離
株９２に対しても、安定した成績が得られた。精度管理
菌株の２菌種に対しても同様な結果で１０⁶−１０⁴CFU/
mlの接種菌量でＭＩＣ値が２倍を越えることはなかっ
た。これらの結果からＨＰの接種菌量は１．０×１０⁷C
FU/mlとした。また精度管理菌株はＮＣＣＬＳのガイド
ラインに従い、１．０×１０⁵CFU/mlを接種菌量とし
た。5-3. Effect of inoculum size on MIC value of various antibacterial agents HP using Mueller Hinton semi-fluid medium as a measuring medium
MIC of 4 drugs in various inoculum size of 5 clinical isolates 3 ATCC standard strains and 2 NCCLS quality control strains
Are shown in Table 2. HP is 4.0, 1.0,
0.25 × 10 ⁷ CFU / ml, 1 for S. aureus and E. coli
The amount of bacteria was measured as 0 ⁶ , 10 ⁵ , and 10 ⁴ . For both drugs, as the strain increased in some strains of HP, M
Although the IC value was increased, the difference in MIC value did not exceed 2 times at any inoculum size. In general, in this type of microbiological test method, fluctuations not exceeding 2 times are within an allowable range. CAM and AZ
Stable results were also obtained for clinical isolate 2 and clinical isolate 92, which showed low sensitivity to M. Similar results were obtained for 2 strains of quality control strains with 10 ⁶ -10 ⁴ CFU /
The MIC value did not exceed 2 times with the inoculum amount of ml. From these results, HP inoculum was 1.0 × 10 ⁷ C
FU / ml. For the quality control strain, 1.0 × 10 ⁵ CFU / ml was used as the inoculum amount in accordance with NCCLS guidelines.

【００５５】[0055]

【表２】 [Table 2]

【００５６】5-4.日差再現性 接種菌量の検討で用いたＨＰおよびS.aureus、E.coliを
試験菌株として、前述で定めた測定培地、接種菌量で３
日間連続で４薬剤のＭＩＣを測定し、本法の日差再現性
を検討した結果が表３である。ＨＰ８株およびS.aureu
s、E.coliに対し、用いた４薬剤いずれにおいても３日
間安定したＭＩＣが得られ、測定日間でＭＩＣの差が２
倍を越えることはなかった。一般にこの種の微生物学的
試験方法においては、２倍を越えない変動は許容範囲内
とされている。従って本法は、ＨＰに対するＭＩＣ測定
において安定した再現性が得られることが確認された。5-4. Reproducibility by day difference Using HP, S. aureus, and E. coli used in the examination of the inoculum size as test strains, the measurement medium and inoculum size defined above were 3
Table 3 shows the results obtained by measuring the MICs of four drugs for consecutive days and examining the reproducibility of the day difference of this method. HP8 strain and S. aureu
For s and E. coli, stable MICs were obtained for 3 days with all of the 4 drugs used, and the difference in MIC was 2 during the measurement days.
It never doubled. In general, in this type of microbiological test method, fluctuations not exceeding 2 times are within an allowable range. Therefore, it was confirmed that this method provides stable reproducibility in MIC measurement for HP.

【００５７】[0057]

【表３】 [Table 3]

【００５８】5-5.ＮＣＣＬＳ精度管理基準との比較 ＮＣＣＬＳ、ＭＩＣ測定精度管理基準[14]と本法で得ら
れたS.aureusおよびE.coliに対する４薬剤のＭＩＣ値を
図３に示した。尚、ＡＭＰＣの管理基準はＡＭＰＣ/cla
vulanicacidで代用した。ＡＭＰＣ、ＣＡＭおよびＡＺ
Ｍの３薬剤のS.aureusおよびE.coliに対する３回のＭＩ
Ｃ値は、全てＮＣＣＬＳ精度管理基準内であった。S.au
reusに対するＣＰＦＸのＭＩＣ値は０．２５−０．５μ
g/mlと管理基準内であったがE.coliに対しては３回のＭ
ＩＣ値はすべて０．０３μg/mlで管理基準より１管(２
倍)高い結果となった。しかし先に述べたとおり１管の
変動は一般には許容される誤差範囲であり、しかもその
測定値は安定している。したがって本発明の薬剤感受性
試験方法は、ＮＣＣＬＳのＭＩＣ測定精度管理用菌株に
よる精度管理が可能であることが確認された。5-5. Comparison with NCCLS Quality Control Standards NCCLS and MIC measurement quality control standards [14] and MIC values of four drugs against S. aureus and E. coli obtained by this method are shown in FIG. . The management standard of AMPC is AMPC / cla
Substituted with vulanic acid. AMPC, CAM and AZ
3 MI of 3 drugs of M against S. aureus and E. coli
All C values were within the NCCLS quality control standard. S.au
MIC value of CPFX for reus is 0.25-0.5μ
It was within the control standard of g / ml, but for E. coli 3 times M
All IC values were 0.03 μg / ml and 1 tube (2
It was a high result. However, as described above, the fluctuation of one tube is generally within an allowable error range, and the measured value is stable. Therefore, it was confirmed that the drug susceptibility testing method of the present invention can perform quality control by the NCCLS strain for MIC measurement quality control.

【００５９】引用文献： [1] Lancet i:1273-1275;1983 [2] Int.J.Syst.Bacteriol.39:397-405,1989 [3] Microbiol.Immunol.31:603-614,1987 [4] Methods for Dilution Antimaicrobial Susceptibi
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2 [10] Antimicrob.Agents Chemother. 37:1184-1186, 19
93 [11] Methods for Antimaicrobial Susceptibility Tes
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M100-S6. NCCLS, Vollanova, Pa. 1995

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】種々のｐＨにおける、ＨＰのクラリスロマイシ
ン（ＣＡＭ）に対する薬剤感受性FIG. 1. Drug sensitivity of HP to clarithromycin (CAM) at different pH.

【図２】種々のｐＨにおける、ＨＰのアモキシリン（Ａ
ＭＰＣ）に対する薬剤感受性FIG. 2. HP amoxicillin (A) at various pH.
Drug sensitivity to MPC)

【図３】標準菌株の４薬剤に対するＭＩＣとＮＣＣＬＳ
精度管理基準の比較FIG. 3: MIC and NCCLS for 4 drugs of standard strains
Comparison of quality control standards

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Office reference number FI technical display area C12R 1:01)

Claims (13)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】微生物試料を培地中に保持し、実質的に培
地の対流が起きない条件で培養を行い、前記微生物の増
殖程度を観察する薬剤感受性試験方法1. A drug susceptibility test method in which a microorganism sample is held in a culture medium, the culture is performed under conditions in which substantially no convection of the culture medium occurs, and the degree of growth of the microorganism is observed. 【請求項２】培地が半流動培地である請求項１の薬剤感
受性試験方法2. The drug sensitivity test method according to claim 1, wherein the medium is a semi-solid medium. 【請求項３】半流動培地が、ゲル化剤として寒天を０．
０５−１．０%含むものである請求項２の薬剤感受性試
験方法3. A semi-fluid medium containing agar as a gelling agent.
The method for testing drug susceptibility according to claim 2, wherein the content is 05-1.0%. 【請求項４】感受性を試験すべき微生物が、嫌気性、ま
たは微好気性の微生物である請求項１の薬剤感受性試験
方法4. The drug sensitivity test method according to claim 1, wherein the microorganism whose sensitivity is to be tested is an anaerobic or microaerobic microorganism. 【請求項５】感受性を試験すべき微生物が、微好気性の
微生物である請求項４の薬剤感受性試験方法5. The method for testing drug sensitivity according to claim 4, wherein the microorganism whose sensitivity is to be tested is a microaerobic microorganism. 【請求項６】微好気性の微生物が、Helicobacter pylor
iである請求項５の薬剤感受性試験方法6. A microaerobic microorganism is Helicobacter pylor.
i) The drug sensitivity test method according to claim 5. 【請求項７】微生物の増殖程度を肉眼で判定する請求項
１の薬剤感受性試験方法7. The drug susceptibility test method according to claim 1, wherein the degree of growth of microorganisms is visually determined. 【請求項８】微生物の増殖程度を光学測定により行う請
求項１の薬剤感受性試験方法8. The drug susceptibility test method according to claim 1, wherein the degree of growth of the microorganism is measured by optical measurement. 【請求項９】培地を溶解させてから光学測定を行う請求
項８の薬剤感受性試験方法9. The drug sensitivity test method according to claim 8, wherein the optical measurement is carried out after the medium is dissolved. 【請求項１０】次の工程ａ）−ｄ）を含む、嫌気的、ま
たは微好気的環境を好む微生物の薬剤感受性試験方法 ａ）被検微生物を前培養する工程 ｂ）培養容器中の感受性試験の対象となる薬剤を含む培
地に工程ａ）の微生物を加えるか、または予め用意した
一定量の前記薬剤を含む培養容器に工程ａ）の微生物を
培地とともに加える工程 ｃ）培地中に微生物を保持し、かつ実質的に培地の対流
が起きない条件下、好気培養する工程 ｄ）培地によって外部の環境と遮断された部位における
微生物の増殖を観察する工程10. A method for testing drug susceptibility of a microorganism that prefers an anaerobic or microaerobic environment, including the following steps a) to d): a) a step of pre-culturing a test microorganism; b) a sensitivity in a culture vessel. The microorganism of step a) is added to the medium containing the drug to be tested, or the microorganism of step a) is added together with the medium to a culture vessel containing a predetermined amount of the drug prepared in advance. C) The microorganism is added to the medium. Aerobically culturing under conditions in which convection of the medium is maintained and substantially no convection of the medium occurs. D) observing growth of microorganisms at a site shielded from the external environment by the medium 【請求項１１】微生物試料を培地中に保持することがで
き、かつ培養条件下で培地の対流を起こさない性状を維
持する薬剤感受性試験用培地11. A medium for drug susceptibility testing, which can hold a microbial sample in a medium and maintains a property that does not cause convection of the medium under culture conditions. 【請求項１２】培地が薬剤を含有している請求項１１の
薬剤感受性試験用培地12. The medium for drug sensitivity test according to claim 11, wherein the medium contains a drug. 【請求項１３】培地が半流動培地である請求項１１の薬
剤感受性試験用培地13. The medium for drug sensitivity test according to claim 11, wherein the medium is a semi-solid medium.