JPH09313175A - 高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにそれを利用する過酸化水素含有排水の処理方法 - Google Patents
高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにそれを利用する過酸化水素含有排水の処理方法Info
- Publication number
- JPH09313175A JPH09313175A JP15635696A JP15635696A JPH09313175A JP H09313175 A JPH09313175 A JP H09313175A JP 15635696 A JP15635696 A JP 15635696A JP 15635696 A JP15635696 A JP 15635696A JP H09313175 A JPH09313175 A JP H09313175A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- catalase
- hydrogen peroxide
- waste water
- activity
- vibrio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 強度の過酸化水素分解活性を有するビブリオ
属に属す新規微生物から抽出した新規カタラーゼならび
にこのカタラーゼを使用して水産加工場等の排水中の過
酸化水素を分解させる排水処理方法を提供する。 【解決手段】 この新規カタラーゼは、ビブリオ属・Ｓ
−１−６細菌株より分離精製されたもので、従来市販の
カタラーゼに比較して強度の過酸化水素分解活性を有
し、しかも、その活性の温度やｐＨの変化に対する依存
度が少ない。したがって、このカタラーゼを水産加工場
等の排水中に投与することによって、温度やｐＨ等に関
する幅広い条件の下でも、排水中の過酸化水素を効果的
に分解消滅させることができる。
属に属す新規微生物から抽出した新規カタラーゼならび
にこのカタラーゼを使用して水産加工場等の排水中の過
酸化水素を分解させる排水処理方法を提供する。 【解決手段】 この新規カタラーゼは、ビブリオ属・Ｓ
−１−６細菌株より分離精製されたもので、従来市販の
カタラーゼに比較して強度の過酸化水素分解活性を有
し、しかも、その活性の温度やｐＨの変化に対する依存
度が少ない。したがって、このカタラーゼを水産加工場
等の排水中に投与することによって、温度やｐＨ等に関
する幅広い条件の下でも、排水中の過酸化水素を効果的
に分解消滅させることができる。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、新規のカタラーゼ
生産菌である、強度の過酸化水素分解活性を有するビブ
リオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属・Ｓ―１―６細菌株より生産さ
れる高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにこの
高力価カタラーゼを用いる過酸化水素含有排水の処理方
法に関するものである。
生産菌である、強度の過酸化水素分解活性を有するビブ
リオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属・Ｓ―１―６細菌株より生産さ
れる高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにこの
高力価カタラーゼを用いる過酸化水素含有排水の処理方
法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】カタラーゼは、動植物中に広く分布し、
哺乳動物では肝臓、赤血球、高等植物では、クロロプラ
ストに多量に含まれており、微生物では嫌気的に生育す
るものを除いてほとんど全ての細菌に存在することが知
られている。
哺乳動物では肝臓、赤血球、高等植物では、クロロプラ
ストに多量に含まれており、微生物では嫌気的に生育す
るものを除いてほとんど全ての細菌に存在することが知
られている。
【０００３】現在、過酸化水素は有害性の低い酸化剤、
漂白剤、殺菌剤として注目されており、工業的には、製
紙工業、繊維工業、油脂工業、皮革工業において、漂
白、脱リグニン、顕色剤、脱タンニン等のために用いら
れており、食品分野では、牛乳の殺菌、数の子の漂白に
使われ、一般家庭内で使われる洗濯用の漂白剤としても
注目されており、環境対策上問題の多い塩素系漂白剤の
代替品としても、年々その必要性は高まってきている。
漂白剤、殺菌剤として注目されており、工業的には、製
紙工業、繊維工業、油脂工業、皮革工業において、漂
白、脱リグニン、顕色剤、脱タンニン等のために用いら
れており、食品分野では、牛乳の殺菌、数の子の漂白に
使われ、一般家庭内で使われる洗濯用の漂白剤としても
注目されており、環境対策上問題の多い塩素系漂白剤の
代替品としても、年々その必要性は高まってきている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】過酸化水素は、それ自
身の分解により、水と酸素という安全な物質となるの
で、処理さえ安全かつ迅速に行なえば２次汚染の心配は
ないが、排水として高濃度の過酸化水素含有水が直接流
出した際には、過酸化水素が自然に分解されるとはい
え、通常は、排水中に可成の量の過酸化水素が残留する
ことになり、反応性が高く殺菌作用が強い点から考えて
も、周辺地域に対して重大な環境汚染を引き起こすこと
が予想されるので、それを排水中から完全に除去する対
策を講じる必要がある。
身の分解により、水と酸素という安全な物質となるの
で、処理さえ安全かつ迅速に行なえば２次汚染の心配は
ないが、排水として高濃度の過酸化水素含有水が直接流
出した際には、過酸化水素が自然に分解されるとはい
え、通常は、排水中に可成の量の過酸化水素が残留する
ことになり、反応性が高く殺菌作用が強い点から考えて
も、周辺地域に対して重大な環境汚染を引き起こすこと
が予想されるので、それを排水中から完全に除去する対
策を講じる必要がある。
【０００５】現在、過酸化水素が残留する排水の処理方
法としては以下の方法があるが、それぞれ問題点があ
る。活性汚泥法や曝気による方法では、活性汚泥の機能
の維持や管理の面でコストがかかり、また、過酸化水素
処理能力上からも問題がある。金属触媒に接触させる方
法や活性炭に接触させて分解する方法は、時間がかか
り、微量な過酸化水素を除去できないという問題があ
る。
法としては以下の方法があるが、それぞれ問題点があ
る。活性汚泥法や曝気による方法では、活性汚泥の機能
の維持や管理の面でコストがかかり、また、過酸化水素
処理能力上からも問題がある。金属触媒に接触させる方
法や活性炭に接触させて分解する方法は、時間がかか
り、微量な過酸化水素を除去できないという問題があ
る。
【０００６】重亜硫酸ナトリウム等の還元剤と反応させ
る方法は、過酸化水素量に対して還元剤を等量を添加し
なければならないので、処理操作の管理の面で煩雑であ
るばかりでなく、還元剤を入れ過ぎた場合には、残留し
た還元剤による自然破壊が行なわれる問題がある。
る方法は、過酸化水素量に対して還元剤を等量を添加し
なければならないので、処理操作の管理の面で煩雑であ
るばかりでなく、還元剤を入れ過ぎた場合には、残留し
た還元剤による自然破壊が行なわれる問題がある。
【０００７】この点、カタラーゼを添加する方法は、極
めて少量でも排水中の過酸化水素を短時間で分解するこ
とができるが、カタラーゼ自体が高価であるので、その
コスト低減が重要な課題になっている。
めて少量でも排水中の過酸化水素を短時間で分解するこ
とができるが、カタラーゼ自体が高価であるので、その
コスト低減が重要な課題になっている。
【０００８】本発明者は、先に、高濃度の過酸化水素を
含む水産加工場の排水の環境の下でも、十分活発に生存
し、しかも過酸化水素を分解する能力を有する微生物を
発見し、これを特願平７−９００２４号として出願し
た。この微生物は、ビブリオ属に属する新規微生物であ
って、本発明者によってビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属・
Ｓ−１−６細菌株と命名されて、工業技術院生命工学技
術研究所に寄託され、受託番号・ＰＥＲＭ Ｐ−１４５
３１号として平成６年９月９日に登録された。
含む水産加工場の排水の環境の下でも、十分活発に生存
し、しかも過酸化水素を分解する能力を有する微生物を
発見し、これを特願平７−９００２４号として出願し
た。この微生物は、ビブリオ属に属する新規微生物であ
って、本発明者によってビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属・
Ｓ−１−６細菌株と命名されて、工業技術院生命工学技
術研究所に寄託され、受託番号・ＰＥＲＭ Ｐ−１４５
３１号として平成６年９月９日に登録された。
【０００９】しかし、特願平７−９００２４号の発明
は、菌体そのものを排水中に投与するので、比較的多量
の菌体を必要とする欠点があった。また、細菌を培養し
た場所と投与する場所が離れている場合には、菌体の保
存や輸送上の問題があった。
は、菌体そのものを排水中に投与するので、比較的多量
の菌体を必要とする欠点があった。また、細菌を培養し
た場所と投与する場所が離れている場合には、菌体の保
存や輸送上の問題があった。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記欠点を
除くために、鋭意研究した結果、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉ
ｏ）属・Ｓ−１−６細菌株（以下Ｓ−１−６細菌株と称
する）より分離したカタラーゼが新規物質であり、しか
も高力価の過酸化水素分解能を有することを突き止め、
本発明を完成することができた。
除くために、鋭意研究した結果、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉ
ｏ）属・Ｓ−１−６細菌株（以下Ｓ−１−６細菌株と称
する）より分離したカタラーゼが新規物質であり、しか
も高力価の過酸化水素分解能を有することを突き止め、
本発明を完成することができた。
【００１１】すなわち、本発明の高力価カタラーゼは、
過酸化水素分解性を有するＳ―１―６細菌株より生産さ
れる新規な物質である。また、本発明の高力価カタラー
ゼの製造方法は、過酸化水素分解性を有するＳ―１―６
細菌株を培養し、該培養物からカタラーゼを分離精製す
ることを特徴とするものである。
過酸化水素分解性を有するＳ―１―６細菌株より生産さ
れる新規な物質である。また、本発明の高力価カタラー
ゼの製造方法は、過酸化水素分解性を有するＳ―１―６
細菌株を培養し、該培養物からカタラーゼを分離精製す
ることを特徴とするものである。
【００１２】カタラーゼの分離精製は、培養したＳ―１
―６細菌株を集菌した後、細胞破壊装置によって、菌体
を破壊し、遠心分離によって膜画分と可溶性画分に分離
する。得られた可溶性画分をクロマトグラフィーにかけ
て、カタラーゼ画分を分離する。さらに、このカタラー
ゼ画分をゲル濾過によって精製、濃縮することにより、
本カタラーゼを得ることができる。
―６細菌株を集菌した後、細胞破壊装置によって、菌体
を破壊し、遠心分離によって膜画分と可溶性画分に分離
する。得られた可溶性画分をクロマトグラフィーにかけ
て、カタラーゼ画分を分離する。さらに、このカタラー
ゼ画分をゲル濾過によって精製、濃縮することにより、
本カタラーゼを得ることができる。
【００１３】さらに、本発明の過酸化水素含有排水の処
理方法は、過酸化水素分解性を有するＳ―１―６細菌株
より得られた高力価カタラーゼを、過酸化水素含有排水
に接触させることを特徴とするものである。
理方法は、過酸化水素分解性を有するＳ―１―６細菌株
より得られた高力価カタラーゼを、過酸化水素含有排水
に接触させることを特徴とするものである。
【００１４】本発明に用いられるＳ―１―６細菌株は、
本発明者が、北海道留萌市の井原水産株式会社の本社工
場の排水中から採取したもので、魚体や魚卵由来の有機
化合物を含有する水産加工工場の排水中でも長期的に生
存が可能な細菌で、しかも、強度の過酸化水素分解活性
を有している。
本発明者が、北海道留萌市の井原水産株式会社の本社工
場の排水中から採取したもので、魚体や魚卵由来の有機
化合物を含有する水産加工工場の排水中でも長期的に生
存が可能な細菌で、しかも、強度の過酸化水素分解活性
を有している。
【００１５】次に、Ｓ−１−６細菌株についてさらに詳
しく説明する。Ｓ−１−６細菌株の細菌学的性質は、以
下の通りである。 １．形態的所見（２５℃、２４時間培養） 幹菌 長さ１．０〜１．５μｍ×幅０．４μｍ 鞭毛：無 運動性：無 胞子の有無：生産されない グラム染色：グラム陰性
しく説明する。Ｓ−１−６細菌株の細菌学的性質は、以
下の通りである。 １．形態的所見（２５℃、２４時間培養） 幹菌 長さ１．０〜１．５μｍ×幅０．４μｍ 鞭毛：無 運動性：無 胞子の有無：生産されない グラム染色：グラム陰性
【００１６】２．培養所見（２５℃、２４時間培養） （１）肉汁寒天平板培地 コロニーの形状及び性質 外形：円形、大きさ：均質、表面：平板、色：白、透明
度：不透明
度：不透明
【００１７】３．生理学的所見 （１）ＤＮＡの分解：陽性 （２）ゼラチン分解：陰性 （３）カゼイン分解：陰性 （４）デンプン分解：陽性 （５）ＮａＣｌ存在による生育： ０．０％： 陽性 ０．５％： 陽性 ６．０％： 陽性
【００１８】（６）シモンズ及びクリスチャンセンのク
エン酸培地での生育： 陽性 （７）有機窒素源要求性： 陰性 （８）マッコンキ−寒天培地での生育： 陽性 （９）硫化水素の産生： 陰性 （１０）ＯＮＰＧ利用： 陽性 （１１）シアン耐性： 陰性 （１２）尿素分解： 陰性 （１３）マロン酸の利用： 陰性 （１４）リパ−ゼ産生： 陰性 （１５）インド−ル生成： 陰性 （１６）ＶＰテスト： 陰性 （１７）ＭＲテスト： 陽性 （１８）Ｏ／１２９感受性試験： 陽性 （１９）酸素に対する態度： 好気性
エン酸培地での生育： 陽性 （７）有機窒素源要求性： 陰性 （８）マッコンキ−寒天培地での生育： 陽性 （９）硫化水素の産生： 陰性 （１０）ＯＮＰＧ利用： 陽性 （１１）シアン耐性： 陰性 （１２）尿素分解： 陰性 （１３）マロン酸の利用： 陰性 （１４）リパ−ゼ産生： 陰性 （１５）インド−ル生成： 陰性 （１６）ＶＰテスト： 陰性 （１７）ＭＲテスト： 陽性 （１８）Ｏ／１２９感受性試験： 陽性 （１９）酸素に対する態度： 好気性
【００１９】（２０）各種温度帯での生育： ２℃ ＋ ５℃ ＋ １０℃ ＋ ２５℃ ＋ ３０℃ ＋ ３５℃ ＋ ４０℃ ＋ ５０℃ −
【００２０】（２１）ＯＦ試験：（ただし、Ｎは無反
応、Ｆは発酵を示す） キシロ−ス： Ｆ ラフィノ−ス： Ｎ ブドウ糖： Ｆ マンノ−ス： Ｆ イノシト−ル： Ｎ マンイト−ル： Ｆ スクロ−ス： Ｆ フルクト−ス： Ｆ グルシト−ル： Ｎ マルト−ス： Ｆ ガラクト−ス： Ｆ ラムノ−ス： Ｎ アラビノ−ス： Ｆ トレハロ−ス： Ｎ （２２）硝酸塩還元： 陽性
応、Ｆは発酵を示す） キシロ−ス： Ｆ ラフィノ−ス： Ｎ ブドウ糖： Ｆ マンノ−ス： Ｆ イノシト−ル： Ｎ マンイト−ル： Ｆ スクロ−ス： Ｆ フルクト−ス： Ｆ グルシト−ル： Ｎ マルト−ス： Ｆ ガラクト−ス： Ｆ ラムノ−ス： Ｎ アラビノ−ス： Ｆ トレハロ−ス： Ｎ （２２）硝酸塩還元： 陽性
【００２１】（２３）基質利用性テスト：（基質成分を
使用する培地全体の１％となるよう作成し、それぞれの
基質についてその利用の有無を確認した。） 〈次の培地成分で培養し、各試薬との反応を見た。〉 各種基質成分 １０ｇ ＮＨ4Ｃｌ ２ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4 ２ｇ ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ ＭｇＳＯ2 ０．１ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０５ｇ ※Trace Element １ｍｌ 蒸留水 １ｌ
使用する培地全体の１％となるよう作成し、それぞれの
基質についてその利用の有無を確認した。） 〈次の培地成分で培養し、各試薬との反応を見た。〉 各種基質成分 １０ｇ ＮＨ4Ｃｌ ２ｇ Ｎａ2ＨＰＯ4 ２ｇ ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ ＭｇＳＯ2 ０．１ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０５ｇ ※Trace Element １ｍｌ 蒸留水 １ｌ
【００２２】※Trace Element ＥＤＴＡ １．８ｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５．０ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ５．０ｇ ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ １．５ｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．４ｇ （ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏ ０．２５ｇ Ｈ3ＢＯ3 ０．１ｇ 蒸留水 １００ｍｌ −結果− ブドウ糖： 陽性 マンニト−ル： 陽性 β−ハイドロキシブチレ−ト： 陰性 コントロ−ル（基質無）： 陰性
【００２３】 （２４）オキシダ−ゼ試験： 陽性 （２５）カタラーゼ試験： 陽性 （２６）Ｃ＋Ｇ（シトシン＋グアニン）mol％in DNA：
４３．２mol％
４３．２mol％
【００２４】ＣＧ含有量等上記の生化学的性質より、Ｓ
−１−６細菌株はビブリオ属の新規微生物と同定され
る。なお、その菌学的性質は運動性が無く、灰褐色のコ
ロニ−を形成し、グラム陰性菌に属する過酸化水素分解
細菌といえる。
−１−６細菌株はビブリオ属の新規微生物と同定され
る。なお、その菌学的性質は運動性が無く、灰褐色のコ
ロニ−を形成し、グラム陰性菌に属する過酸化水素分解
細菌といえる。
【００２５】本発明において、菌学的性質を調べるた
め、実験方法等は、坂崎利一他２名著「新細菌培地学講
座 上下巻」、Cowan & Steel's 著「医学細菌同定の手
引き＜第３版＞」および長谷川武治編著「改訂版 微生
物の分類と同定 上下巻」に準拠した。
め、実験方法等は、坂崎利一他２名著「新細菌培地学講
座 上下巻」、Cowan & Steel's 著「医学細菌同定の手
引き＜第３版＞」および長谷川武治編著「改訂版 微生
物の分類と同定 上下巻」に準拠した。
【００２６】使用する培地としては、窒素源、炭素源、
無機塩を含むものを使用することができる。窒素源とし
ては酵母エキス、ペプトン、肉エキスを使用することが
でき、炭素源としてはグルコ−ス等公知の材料が用いら
れる。
無機塩を含むものを使用することができる。窒素源とし
ては酵母エキス、ペプトン、肉エキスを使用することが
でき、炭素源としてはグルコ−ス等公知の材料が用いら
れる。
【００２７】本発明において使用するのに適した寒天培
地を以下に例示する。 ポリペプトン １．０重量％ 酵母エキス ０．５重量％ ＮａＣｌ ０．５重量％ 寒天 １．５重量％ なお、本発明において、ＰＹＳ培地とは、上記成分か
ら、寒天成分を除いたものを指す。
地を以下に例示する。 ポリペプトン １．０重量％ 酵母エキス ０．５重量％ ＮａＣｌ ０．５重量％ 寒天 １．５重量％ なお、本発明において、ＰＹＳ培地とは、上記成分か
ら、寒天成分を除いたものを指す。
【００２８】次に、本発明のカタラーゼについて、さら
に詳しく説明する。本発明のカタラーゼの蛋白質のＮ末
端のアミノ配列を調べたところ、これまでに報告されて
いるカタラーゼの中で相同するものは見当らなかったの
で、本発明のカタラーゼは新規なカタラーゼであるもの
と思考される。
に詳しく説明する。本発明のカタラーゼの蛋白質のＮ末
端のアミノ配列を調べたところ、これまでに報告されて
いるカタラーゼの中で相同するものは見当らなかったの
で、本発明のカタラーゼは新規なカタラーゼであるもの
と思考される。
【００２９】すなわち、Ｓ−１−６細菌株の有するカタ
ラーゼと既知の微生物が有するカタラーゼのＮ末端のア
ミノ酸配列を比較すると、以下のごとくなる。 Ｓ−１−６： ＳＤＤＧＫＸＹＰＶＧＨＭＧＧＤＦＥＡ
ＰＶＶＸＧＮ，バチルス サブチルス（Bacillus subti
lis）： ＭＳＤＤＱＮＫＲＶＮＥＨＳＫＤＥＱＬＥＱＹＲＴＤ
Ｎ，ロドバクター カプスラータス（Rhodobacter caps
ulatus）：ＭＤＧＫＤＫＡＴＧＫＣＰＶＭＨＧＡＭＴＡ
ＡＧＵＳ， エセリヒア コリ ＨＰ II（Escherichia coli HP I
I）：ＭＳＱＨＮＥＫＮＰＨＱＨＱＳＰＬＨＤＳＳＥＡ
ＫＰＧ．
ラーゼと既知の微生物が有するカタラーゼのＮ末端のア
ミノ酸配列を比較すると、以下のごとくなる。 Ｓ−１−６： ＳＤＤＧＫＸＹＰＶＧＨＭＧＧＤＦＥＡ
ＰＶＶＸＧＮ，バチルス サブチルス（Bacillus subti
lis）： ＭＳＤＤＱＮＫＲＶＮＥＨＳＫＤＥＱＬＥＱＹＲＴＤ
Ｎ，ロドバクター カプスラータス（Rhodobacter caps
ulatus）：ＭＤＧＫＤＫＡＴＧＫＣＰＶＭＨＧＡＭＴＡ
ＡＧＵＳ， エセリヒア コリ ＨＰ II（Escherichia coli HP I
I）：ＭＳＱＨＮＥＫＮＰＨＱＨＱＳＰＬＨＤＳＳＥＡ
ＫＰＧ．
【００３０】なお、各アミノ酸の略記号は下記の通りで
ある。Ａ：Alanine，Ｃ：Cysteine，Ｄ：Aspartis aci
d，Ｅ：Glutamic acid，Ｆ：Phenylalanine，Ｇ：Glyci
ne，Ｈ：Histidine，Ｉ：Isoleucine，Ｋ：Lysine，
Ｌ：Leucine，Ｍ：Methionine，Ｎ：Asparagine，Ｐ：P
roline，Ｑ：Glutamine，Ｒ：Arginine，Ｓ：Serine，
Ｔ：Threonine，Ｖ：Valine，Ｗ：Tryptophan，Ｙ：Tyr
osine．
ある。Ａ：Alanine，Ｃ：Cysteine，Ｄ：Aspartis aci
d，Ｅ：Glutamic acid，Ｆ：Phenylalanine，Ｇ：Glyci
ne，Ｈ：Histidine，Ｉ：Isoleucine，Ｋ：Lysine，
Ｌ：Leucine，Ｍ：Methionine，Ｎ：Asparagine，Ｐ：P
roline，Ｑ：Glutamine，Ｒ：Arginine，Ｓ：Serine，
Ｔ：Threonine，Ｖ：Valine，Ｗ：Tryptophan，Ｙ：Tyr
osine．
【００３１】また、本発明のカタラーゼは、ＳＤＳ―電
気泳動（ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアクリ
ルアミド中で行なうゲル電気泳動）における分子量が５
７，０００で、ゲル濾過における溶液中の分子量がその
約４倍であることから、４量体で存在する事が確認され
た。また、本発明のカタラーゼのピリジンフェロヘモク
ロムの吸収極大が５５７ｎｍ、５２５ｎｍ、４１９ｎｍ
に見られたことからプロトヘムを活性中心に持つことが
明らかになった。
気泳動（ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアクリ
ルアミド中で行なうゲル電気泳動）における分子量が５
７，０００で、ゲル濾過における溶液中の分子量がその
約４倍であることから、４量体で存在する事が確認され
た。また、本発明のカタラーゼのピリジンフェロヘモク
ロムの吸収極大が５５７ｎｍ、５２５ｎｍ、４１９ｎｍ
に見られたことからプロトヘムを活性中心に持つことが
明らかになった。
【００３２】本発明のカタラーゼは、強度の過酸化水素
分解活性を有するので、これを、水産加工場等から排出
される過酸化水素含有排水中に投与すれば、排水中の過
酸化水素を効率よく分解消滅させることができる。本発
明のカタラーゼの排水に対する添加量は、約０．４％の
過酸化水素含有水１０リットルに対して、０．５ｍｇ〜
３．０ｍｇ、好ましくは１．０ｍｇ〜２．０ｍｇであ
る。
分解活性を有するので、これを、水産加工場等から排出
される過酸化水素含有排水中に投与すれば、排水中の過
酸化水素を効率よく分解消滅させることができる。本発
明のカタラーゼの排水に対する添加量は、約０．４％の
過酸化水素含有水１０リットルに対して、０．５ｍｇ〜
３．０ｍｇ、好ましくは１．０ｍｇ〜２．０ｍｇであ
る。
【００３３】本発明のカタラーゼの排水への投与方法
は、本カタラーゼを直接排水中に投与する方法、透析膜
等の袋に収納してこの袋を排水中に浸漬する方法、本カ
タラーゼを水に溶解して排水中に投与する方法等任意で
ある。
は、本カタラーゼを直接排水中に投与する方法、透析膜
等の袋に収納してこの袋を排水中に浸漬する方法、本カ
タラーゼを水に溶解して排水中に投与する方法等任意で
ある。
【００３４】なお、本発明のカタラーゼは、水産加工場
より排出される過酸化水素含有排水の処理ににおいて、
特に顕著な効果を奏するので、この排水の処理について
主として述べているが、これ以外の過酸化水素含有排
水、例えば、パルプ工場、食品工場、薬品工場、半導体
工場等より排出される過酸化水素含有排水の処理に適用
できることは勿論である。
より排出される過酸化水素含有排水の処理ににおいて、
特に顕著な効果を奏するので、この排水の処理について
主として述べているが、これ以外の過酸化水素含有排
水、例えば、パルプ工場、食品工場、薬品工場、半導体
工場等より排出される過酸化水素含有排水の処理に適用
できることは勿論である。
【００３５】
【実施例】北海道留萌市の井原水産株式会社の本社工場
の排水中から採取したＳ―１―６細菌株を使用する。Ｐ
ＹＳ培地としては、蒸留水１リットル中に、ポリペプト
ン１０ｇ（日本製薬株式会社）、酵母エキス５ｇ（極東
製薬工業株式会社）、塩化ナトリウム５ｇ（和光純薬工
業株式会社）を溶かしたものを使用する。
の排水中から採取したＳ―１―６細菌株を使用する。Ｐ
ＹＳ培地としては、蒸留水１リットル中に、ポリペプト
ン１０ｇ（日本製薬株式会社）、酵母エキス５ｇ（極東
製薬工業株式会社）、塩化ナトリウム５ｇ（和光純薬工
業株式会社）を溶かしたものを使用する。
【００３６】植え継ぎ用の培地は、上記ＰＹＳ培地に１
５ｇの寒天粉末を加え、寒天を温めて溶かして試験管に
分注し、斜面培地にした物を使用し、この培地にＳ―１
―６細菌株を植菌して培養しておく。
５ｇの寒天粉末を加え、寒天を温めて溶かして試験管に
分注し、斜面培地にした物を使用し、この培地にＳ―１
―６細菌株を植菌して培養しておく。
【００３７】そして、２リットルの振とうフラスコに上
記ＰＹＳ培地を８００ｍｌ入れ、このＰＹＳ培地に上記
植え継ぎ用の培地で培養したＳ―１―６細菌株を一白金
耳分採取し、これを植菌後、２７℃、１００ｒｐｍの振
とうシェーカーにかけて４８時間培養してＳ―１―６細
菌株を増殖する。その結果、１リットルあたり３ｇ（湿
菌体）前後のＳ―１―６細菌株が得られた。
記ＰＹＳ培地を８００ｍｌ入れ、このＰＹＳ培地に上記
植え継ぎ用の培地で培養したＳ―１―６細菌株を一白金
耳分採取し、これを植菌後、２７℃、１００ｒｐｍの振
とうシェーカーにかけて４８時間培養してＳ―１―６細
菌株を増殖する。その結果、１リットルあたり３ｇ（湿
菌体）前後のＳ―１―６細菌株が得られた。
【００３８】上記の条件の培地で培養したＳ―１―６細
菌株を遠心分離によって集菌した後、加圧型細胞破壊装
置（フレンチプレス）により菌体を破砕し、遠心により
未破砕の菌体を取り除き、得られた無細胞抽出液を超遠
心により膜画分と可溶性画分に分ける。
菌株を遠心分離によって集菌した後、加圧型細胞破壊装
置（フレンチプレス）により菌体を破砕し、遠心により
未破砕の菌体を取り除き、得られた無細胞抽出液を超遠
心により膜画分と可溶性画分に分ける。
【００３９】可溶性画分を陰イオンクロマトグラフィー
（カラム充填剤としてＤＥＡＥ―Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ・
東ソー株式会社製、使用）にかけた後、溶出したカタラ
ーゼ画分を１０ｍＭのトリス―ＨＣｌ緩衝液で２倍に希
釈した後、ＤＥＡＥ―Ｔｏｙｏｐｅａｒｌに再度かけ溶
出させた後、カタラーゼ画分を２ｍｌになるまで濃縮
し、ゲル濾過（カラム充填剤としてセファクリルＳ―３
００；ファルマシア バイオテク株式会社製、使用）に
より精製することにより、本発明のカタラーゼを得た。
（カラム充填剤としてＤＥＡＥ―Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ・
東ソー株式会社製、使用）にかけた後、溶出したカタラ
ーゼ画分を１０ｍＭのトリス―ＨＣｌ緩衝液で２倍に希
釈した後、ＤＥＡＥ―Ｔｏｙｏｐｅａｒｌに再度かけ溶
出させた後、カタラーゼ画分を２ｍｌになるまで濃縮
し、ゲル濾過（カラム充填剤としてセファクリルＳ―３
００；ファルマシア バイオテク株式会社製、使用）に
より精製することにより、本発明のカタラーゼを得た。
【００４０】本発明のカタラーゼの活性は、後述の
（１）温度活性測定と（２）ｐＨ活性測定の２つ方法に
よって測定した。なお、対象としては市販の牛肝臓製カ
タラーゼを使用した。
（１）温度活性測定と（２）ｐＨ活性測定の２つ方法に
よって測定した。なお、対象としては市販の牛肝臓製カ
タラーゼを使用した。
【００４１】その結果、実施例の方法で精製されたカタ
ラーゼは、電気泳動で均一な精製標品が得られたことが
確認された。精製されたカタラーゼの吸収スペクトル
は、４０６ｎｍに吸収極大を示し、還元剤であるジチオ
ナイトによって明らかな還元は見られなかった。
ラーゼは、電気泳動で均一な精製標品が得られたことが
確認された。精製されたカタラーゼの吸収スペクトル
は、４０６ｎｍに吸収極大を示し、還元剤であるジチオ
ナイトによって明らかな還元は見られなかった。
【００４２】（１）温度活性測定 活性測定の計算方法 まず、１分間あたりの２４０ｎｍにおける吸光値の減少
を求める。例 ８５ｍｍ（記録紙上のｙ軸の値（ｍｍ）
を１分間あたりに換算した物：過酸化水素の減少の幅）
×１．５Ａｂｓ（吸光値としての測定の幅）÷１５０ｍ
ｍ（記録紙上としてのｙ軸の全幅：１．５Ａｂｓの範
囲）＝１分間あたりの吸光値の減少値。
を求める。例 ８５ｍｍ（記録紙上のｙ軸の値（ｍｍ）
を１分間あたりに換算した物：過酸化水素の減少の幅）
×１．５Ａｂｓ（吸光値としての測定の幅）÷１５０ｍ
ｍ（記録紙上としてのｙ軸の全幅：１．５Ａｂｓの範
囲）＝１分間あたりの吸光値の減少値。
【００４３】求めた１分間あたりの吸光値の減少値を、
過酸化水素のミリモル吸光係数である０．０４３６で割
り、さらに添加した酵素の質量（ｍｇ）で割ることによ
りμmol / min / mg protein( Unit / mg ) が求まる。
なお、酵素の含有量（ｍｇ／ｍｌ）は、蛋白溶液の濃度
の測定法であるローリー法を用いて調べ、そのときの検
量線に使われたサンプルは、牛血清アルブミンである。
調べたい酵素のタンパク含量は、その日に作られた検量
線から推定されている。測定の単位である １μmol / m
in / mg protein は、酵素１ｍｇが１分間あたり１μmo
lの過酸化水素を分解したということを表している。
過酸化水素のミリモル吸光係数である０．０４３６で割
り、さらに添加した酵素の質量（ｍｇ）で割ることによ
りμmol / min / mg protein( Unit / mg ) が求まる。
なお、酵素の含有量（ｍｇ／ｍｌ）は、蛋白溶液の濃度
の測定法であるローリー法を用いて調べ、そのときの検
量線に使われたサンプルは、牛血清アルブミンである。
調べたい酵素のタンパク含量は、その日に作られた検量
線から推定されている。測定の単位である １μmol / m
in / mg protein は、酵素１ｍｇが１分間あたり１μmo
lの過酸化水素を分解したということを表している。
【００４４】恒温循環水槽を吸光度測定器に繋いで、反
応溶液である３０ｍＭ過酸化水素を含んだ１００ｍＭリ
ン酸バッファーｐＨ７は、測定したい温度（１０〜６０
℃１０℃ごと）と同温になるまで恒温水槽の中に入れて
置き、同温となった際、反応液１ｍｌを石英製の光透過
のキュベットに入れ、マイクロシリンジによる酵素の添
加とかき混ぜ棒による攪拌で反応を開始し、過酸化水素
の吸光波長である２４０nmでの吸光値の減少の初速度を
見積もることによって測定した。
応溶液である３０ｍＭ過酸化水素を含んだ１００ｍＭリ
ン酸バッファーｐＨ７は、測定したい温度（１０〜６０
℃１０℃ごと）と同温になるまで恒温水槽の中に入れて
置き、同温となった際、反応液１ｍｌを石英製の光透過
のキュベットに入れ、マイクロシリンジによる酵素の添
加とかき混ぜ棒による攪拌で反応を開始し、過酸化水素
の吸光波長である２４０nmでの吸光値の減少の初速度を
見積もることによって測定した。
【００４５】その結果、図１−ａに示すように、Ｓ−１
−６細菌株のカタラーゼ、市販の牛肝臓カタラーゼとも
ほとんどその活性の強度は温度に依存せず、前者は後者
より幅広い温度域において高い活性を持つことが明らか
になった。
−６細菌株のカタラーゼ、市販の牛肝臓カタラーゼとも
ほとんどその活性の強度は温度に依存せず、前者は後者
より幅広い温度域において高い活性を持つことが明らか
になった。
【００４６】（２）ｐＨ活性測定 恒温水槽を吸光度測定器に繋いで、測定温度を２０℃と
設定し、反応溶液である３０ｍＭの過酸化水素を含んだ
１００ｍＭの各種異なるｐＨのバッファー（ｐＨ４〜１
０、範囲はｐＨ１刻み）を測定温度の２０℃になるまで
恒温水槽の中に入れておく、反応液１ｍｌを石英製の光
透過のキュベットに入れ、マイクロシリンジによる酵素
の添加とかき混ぜ棒による攪拌で反応を開始し、過酸化
水素の吸光波長である２４０nmでの吸光値の減少の初速
度を見積もることによって測定した。
設定し、反応溶液である３０ｍＭの過酸化水素を含んだ
１００ｍＭの各種異なるｐＨのバッファー（ｐＨ４〜１
０、範囲はｐＨ１刻み）を測定温度の２０℃になるまで
恒温水槽の中に入れておく、反応液１ｍｌを石英製の光
透過のキュベットに入れ、マイクロシリンジによる酵素
の添加とかき混ぜ棒による攪拌で反応を開始し、過酸化
水素の吸光波長である２４０nmでの吸光値の減少の初速
度を見積もることによって測定した。
【００４７】その結果、図１−ｂに示すように、Ｓ−１
−６細菌株より得られたカタラーゼの最適ｐＨはｐＨ６
〜８であった。また、ｐＨにより活性の強度は変化する
ものの、いずれのｐＨにおいても市販の牛肝臓から得ら
れたカタラーゼよりもかなり高い活性を示すことが明ら
かとなった。
−６細菌株より得られたカタラーゼの最適ｐＨはｐＨ６
〜８であった。また、ｐＨにより活性の強度は変化する
ものの、いずれのｐＨにおいても市販の牛肝臓から得ら
れたカタラーゼよりもかなり高い活性を示すことが明ら
かとなった。
【００４８】上記ｐＨ活性測定に使用した各種緩衝液の
内容を次に示す。酢酸緩衝液（１００ｍＭの酢酸溶液と
１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液を混ぜ合わせｐＨを調
節して作る混合緩衝液、ｐＨ４〜５）、コハク酸緩衝液
（無水コハク酸とＮａＯＨとを混合した緩衝液、ｐＨ４
〜６）、リン酸緩衝液（１００ｍＭのリン酸一水素二ナ
トリウムと１００ｍＭのリン酸二水素ナトリウムとの混
合緩衝液、ｐＨ６〜８）、ほう酸緩衝液（ほう酸―Ｎａ
ＯＨ緩衝液で、この溶液には、ＮａＯＨでｐＨを合わす
前に、ほう酸の量と同量の１００ｍＭのＫＣｌが含まれ
ている、ｐＨ８〜１０）、炭酸水素ナトリウム緩衝液
（炭酸水素ナトリウム―ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ９〜１
０）、上記の緩衝液の濃度は全て１００ｍＭである。
内容を次に示す。酢酸緩衝液（１００ｍＭの酢酸溶液と
１００ｍＭの酢酸ナトリウム溶液を混ぜ合わせｐＨを調
節して作る混合緩衝液、ｐＨ４〜５）、コハク酸緩衝液
（無水コハク酸とＮａＯＨとを混合した緩衝液、ｐＨ４
〜６）、リン酸緩衝液（１００ｍＭのリン酸一水素二ナ
トリウムと１００ｍＭのリン酸二水素ナトリウムとの混
合緩衝液、ｐＨ６〜８）、ほう酸緩衝液（ほう酸―Ｎａ
ＯＨ緩衝液で、この溶液には、ＮａＯＨでｐＨを合わす
前に、ほう酸の量と同量の１００ｍＭのＫＣｌが含まれ
ている、ｐＨ８〜１０）、炭酸水素ナトリウム緩衝液
（炭酸水素ナトリウム―ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ９〜１
０）、上記の緩衝液の濃度は全て１００ｍＭである。
【００４９】
【発明の効果】本発明によるカタラーゼと市販の牛肝臓
のカタラーゼのカタラーゼ活性の温度依存性を比較した
結果、本発明のカタラーゼは測定を行った５℃〜６０℃
までの幅の広い温度領域で活性をほとんど失わず（ただ
し、５℃では、若干活性が落ちた）、市販のカタラーゼ
のおよそ２〜３倍強い活性を示し、工業的利用に適して
いることが示された。
のカタラーゼのカタラーゼ活性の温度依存性を比較した
結果、本発明のカタラーゼは測定を行った５℃〜６０℃
までの幅の広い温度領域で活性をほとんど失わず（ただ
し、５℃では、若干活性が落ちた）、市販のカタラーゼ
のおよそ２〜３倍強い活性を示し、工業的利用に適して
いることが示された。
【００５０】また、本発明のカタラーゼと市販の牛肝臓
のカタラーゼとのカタラーゼ活性のｐＨ依存性を比較し
た結果、いずれのｐＨにおいても本発明のカタラーゼは
市販品よりも活性が上回っていた。
のカタラーゼとのカタラーゼ活性のｐＨ依存性を比較し
た結果、いずれのｐＨにおいても本発明のカタラーゼは
市販品よりも活性が上回っていた。
【００５１】このように、活性の強度はｐＨによって変
化するものの、広範囲のｐＨで高い活性を示すことか
ら、上記活性の温度依存性の結果と総合すると、本発明
のカタラーゼは、広範囲の条件で応用可能な極めて工業
的利用価値の高いものと判定することできる。
化するものの、広範囲のｐＨで高い活性を示すことか
ら、上記活性の温度依存性の結果と総合すると、本発明
のカタラーゼは、広範囲の条件で応用可能な極めて工業
的利用価値の高いものと判定することできる。
【００５２】また、本発明のカタラーゼは、排水中から
容易に採集できる細菌を母体として、極めて安価に量産
できると共に、過酸化水素に対する活性が高力価である
ことから、過酸化水素含有排水に投与する場合、従来の
カタラーゼに比べてその投入量を減らすことができるの
で、排水処理のコストを大幅に低減することができる。
容易に採集できる細菌を母体として、極めて安価に量産
できると共に、過酸化水素に対する活性が高力価である
ことから、過酸化水素含有排水に投与する場合、従来の
カタラーゼに比べてその投入量を減らすことができるの
で、排水処理のコストを大幅に低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のカタラーゼの酵素活性の比較試験の結
果を示すもで、図１−ａは、本発明のカタラーゼと対象
とする市販のカタラーゼとの温度変化による酵素活性の
変化を比較して示したグラフ、図１−ｂは、本発明のカ
タラーゼと対象とする市販のカタラーゼとのｐＨ変化に
よる酵素活性の変化を比較して示したグラフである。
果を示すもで、図１−ａは、本発明のカタラーゼと対象
とする市販のカタラーゼとの温度変化による酵素活性の
変化を比較して示したグラフ、図１−ｂは、本発明のカ
タラーゼと対象とする市販のカタラーゼとのｐＨ変化に
よる酵素活性の変化を比較して示したグラフである。
Claims (3)
- 【請求項１】 過酸化水素分解性を有するビブリオ（Ｖ
ｉｂｒｉｏ）属・Ｓ―１―６細菌株より生産される高力
価カタラーゼ。 - 【請求項２】 過酸化水素分解性を有するビブリオ（Ｖ
ｉｂｒｉｏ）属・Ｓ―１―６細菌株を培養し、該培養物
からカタラーゼを分離精製することを特徴とする高力価
カタラーゼの製造方法。 - 【請求項３】 過酸化水素分解性を有するビブリオ（Ｖ
ｉｂｒｉｏ）属・Ｓ―１―６細菌株より得られた高力価
カタラーゼを、過酸化水素含有排水に接触させることを
特徴とする過酸化水素含有排水の処理方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15635696A JP4080011B2 (ja) | 1996-05-29 | 1996-05-29 | 高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにそれを利用する過酸化水素含有排水の処理方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15635696A JP4080011B2 (ja) | 1996-05-29 | 1996-05-29 | 高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにそれを利用する過酸化水素含有排水の処理方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09313175A true JPH09313175A (ja) | 1997-12-09 |
| JP4080011B2 JP4080011B2 (ja) | 2008-04-23 |
Family
ID=15625973
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15635696A Expired - Fee Related JP4080011B2 (ja) | 1996-05-29 | 1996-05-29 | 高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにそれを利用する過酸化水素含有排水の処理方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4080011B2 (ja) |
-
1996
- 1996-05-29 JP JP15635696A patent/JP4080011B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4080011B2 (ja) | 2008-04-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Harms et al. | Tissierella creatinophila sp. nov., a Gram-positive, anaerobic, non-spore-forming, creatinine-fermenting organism | |
| JPS61280272A (ja) | ウリカ−ゼおよびその製造法 | |
| JP2001037469A (ja) | エピクロロヒドリンの微生物分解 | |
| Jacobs et al. | Formation of protoporphyrin from coproporphyrinogen in extracts of various bacteria | |
| US4542098A (en) | Production of glucose dehydrogenase and use of the resultant enzyme in the enzymatic synthesis of L-carnitine | |
| Yumoto et al. | Isolation of Vibrio sp. S-1 exhibiting extraordinarily high catalase activity | |
| NL1001583C2 (nl) | Omzetting van chloriet in chloride en zuurstof. | |
| JP3041840B2 (ja) | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 | |
| Karube et al. | Production of L-glutamate by immobilized protoplasts | |
| JPH09313175A (ja) | 高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにそれを利用する過酸化水素含有排水の処理方法 | |
| Karube et al. | Hydrogen evolution by co-immobilized chloroplasts and Clostridium butyricum | |
| JPH0117674B2 (ja) | ||
| JP3154348B2 (ja) | スカトール分解能を有する微生物およびスカトールの微生物的分解法 | |
| US4503147A (en) | Monomethylamine-oxidizing enzyme | |
| FR2653135A1 (fr) | L-carnitine deshydrogenase stable et procede pour sa production. | |
| Esikova et al. | Bacteria that degrade low-molecular linear epsilon-caprolactam oligomers | |
| JP3076856B2 (ja) | 細菌によるアルギン酸の分解法 | |
| JPS5917982A (ja) | 第一および第二アルコ−ルデヒドロゲナ−ゼ酵素およびその使用 | |
| Nakamura et al. | Pathway of sulfite oxidation in Thiobacillus thiooxidans JCM 7814 | |
| JPH08256763A (ja) | ビブリオ属の新規微生物およびそれを用いた排水処理方法 | |
| Langley et al. | Survival of Salmonella Typhosa during Anaerobic Digestion: II. The Mechanism of Survival | |
| Novotný et al. | Participation of quinone and cytochrome b in tetrathionate reductase respiratory chain of Citrobacter freundii. | |
| CA1309678C (en) | Urease and method of producing the same | |
| RU2096451C1 (ru) | Штамм бактерий pseudomonas species, способный специфически окислять l-пролин | |
| JPS6075283A (ja) | 新菌株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 19970911 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20030521 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20030521 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060829 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061017 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070828 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070927 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071204 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071206 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080129 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080206 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110215 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110215 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140215 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |