JPH09313175A - 高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにそれを利用する過酸化水素含有排水の処理方法 - Google Patents
高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにそれを利用する過酸化水素含有排水の処理方法Info
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Abstract
属に属す新規微生物から抽出した新規カタラーゼならび
にこのカタラーゼを使用して水産加工場等の排水中の過
酸化水素を分解させる排水処理方法を提供する。 【解決手段】 この新規カタラーゼは、ビブリオ属・S
−1−6細菌株より分離精製されたもので、従来市販の
カタラーゼに比較して強度の過酸化水素分解活性を有
し、しかも、その活性の温度やpHの変化に対する依存
度が少ない。したがって、このカタラーゼを水産加工場
等の排水中に投与することによって、温度やpH等に関
する幅広い条件の下でも、排水中の過酸化水素を効果的
に分解消滅させることができる。
Description
生産菌である、強度の過酸化水素分解活性を有するビブ
リオ(Vibrio)属・S―1―6細菌株より生産さ
れる高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにこの
高力価カタラーゼを用いる過酸化水素含有排水の処理方
法に関するものである。
哺乳動物では肝臓、赤血球、高等植物では、クロロプラ
ストに多量に含まれており、微生物では嫌気的に生育す
るものを除いてほとんど全ての細菌に存在することが知
られている。
漂白剤、殺菌剤として注目されており、工業的には、製
紙工業、繊維工業、油脂工業、皮革工業において、漂
白、脱リグニン、顕色剤、脱タンニン等のために用いら
れており、食品分野では、牛乳の殺菌、数の子の漂白に
使われ、一般家庭内で使われる洗濯用の漂白剤としても
注目されており、環境対策上問題の多い塩素系漂白剤の
代替品としても、年々その必要性は高まってきている。
身の分解により、水と酸素という安全な物質となるの
で、処理さえ安全かつ迅速に行なえば2次汚染の心配は
ないが、排水として高濃度の過酸化水素含有水が直接流
出した際には、過酸化水素が自然に分解されるとはい
え、通常は、排水中に可成の量の過酸化水素が残留する
ことになり、反応性が高く殺菌作用が強い点から考えて
も、周辺地域に対して重大な環境汚染を引き起こすこと
が予想されるので、それを排水中から完全に除去する対
策を講じる必要がある。
法としては以下の方法があるが、それぞれ問題点があ
る。活性汚泥法や曝気による方法では、活性汚泥の機能
の維持や管理の面でコストがかかり、また、過酸化水素
処理能力上からも問題がある。金属触媒に接触させる方
法や活性炭に接触させて分解する方法は、時間がかか
り、微量な過酸化水素を除去できないという問題があ
る。
る方法は、過酸化水素量に対して還元剤を等量を添加し
なければならないので、処理操作の管理の面で煩雑であ
るばかりでなく、還元剤を入れ過ぎた場合には、残留し
た還元剤による自然破壊が行なわれる問題がある。
めて少量でも排水中の過酸化水素を短時間で分解するこ
とができるが、カタラーゼ自体が高価であるので、その
コスト低減が重要な課題になっている。
含む水産加工場の排水の環境の下でも、十分活発に生存
し、しかも過酸化水素を分解する能力を有する微生物を
発見し、これを特願平7−90024号として出願し
た。この微生物は、ビブリオ属に属する新規微生物であ
って、本発明者によってビブリオ(Vibrio)属・
S−1−6細菌株と命名されて、工業技術院生命工学技
術研究所に寄託され、受託番号・PERM P−145
31号として平成6年9月9日に登録された。
は、菌体そのものを排水中に投与するので、比較的多量
の菌体を必要とする欠点があった。また、細菌を培養し
た場所と投与する場所が離れている場合には、菌体の保
存や輸送上の問題があった。
除くために、鋭意研究した結果、ビブリオ(Vibri
o)属・S−1−6細菌株(以下S−1−6細菌株と称
する)より分離したカタラーゼが新規物質であり、しか
も高力価の過酸化水素分解能を有することを突き止め、
本発明を完成することができた。
過酸化水素分解性を有するS―1―6細菌株より生産さ
れる新規な物質である。また、本発明の高力価カタラー
ゼの製造方法は、過酸化水素分解性を有するS―1―6
細菌株を培養し、該培養物からカタラーゼを分離精製す
ることを特徴とするものである。
―6細菌株を集菌した後、細胞破壊装置によって、菌体
を破壊し、遠心分離によって膜画分と可溶性画分に分離
する。得られた可溶性画分をクロマトグラフィーにかけ
て、カタラーゼ画分を分離する。さらに、このカタラー
ゼ画分をゲル濾過によって精製、濃縮することにより、
本カタラーゼを得ることができる。
理方法は、過酸化水素分解性を有するS―1―6細菌株
より得られた高力価カタラーゼを、過酸化水素含有排水
に接触させることを特徴とするものである。
本発明者が、北海道留萌市の井原水産株式会社の本社工
場の排水中から採取したもので、魚体や魚卵由来の有機
化合物を含有する水産加工工場の排水中でも長期的に生
存が可能な細菌で、しかも、強度の過酸化水素分解活性
を有している。
しく説明する。S−1−6細菌株の細菌学的性質は、以
下の通りである。 1.形態的所見(25℃、24時間培養) 幹菌 長さ1.0〜1.5μm×幅0.4μm 鞭毛:無 運動性:無 胞子の有無:生産されない グラム染色:グラム陰性
度:不透明
エン酸培地での生育: 陽性 (7)有機窒素源要求性: 陰性 (8)マッコンキ−寒天培地での生育: 陽性 (9)硫化水素の産生: 陰性 (10)ONPG利用: 陽性 (11)シアン耐性: 陰性 (12)尿素分解: 陰性 (13)マロン酸の利用: 陰性 (14)リパ−ゼ産生: 陰性 (15)インド−ル生成: 陰性 (16)VPテスト: 陰性 (17)MRテスト: 陽性 (18)O/129感受性試験: 陽性 (19)酸素に対する態度: 好気性
応、Fは発酵を示す) キシロ−ス: F ラフィノ−ス: N ブドウ糖: F マンノ−ス: F イノシト−ル: N マンイト−ル: F スクロ−ス: F フルクト−ス: F グルシト−ル: N マルト−ス: F ガラクト−ス: F ラムノ−ス: N アラビノ−ス: F トレハロ−ス: N (22)硝酸塩還元: 陽性
使用する培地全体の1%となるよう作成し、それぞれの
基質についてその利用の有無を確認した。) 〈次の培地成分で培養し、各試薬との反応を見た。〉 各種基質成分 10g NH4Cl 2g Na2HPO4 2g KH2PO4 1g MgSO2 0.1g CaCl2・2H2O 0.05g ※Trace Element 1ml 蒸留水 1l
43.2mol%
−1−6細菌株はビブリオ属の新規微生物と同定され
る。なお、その菌学的性質は運動性が無く、灰褐色のコ
ロニ−を形成し、グラム陰性菌に属する過酸化水素分解
細菌といえる。
め、実験方法等は、坂崎利一他2名著「新細菌培地学講
座 上下巻」、Cowan & Steel's 著「医学細菌同定の手
引き<第3版>」および長谷川武治編著「改訂版 微生
物の分類と同定 上下巻」に準拠した。
無機塩を含むものを使用することができる。窒素源とし
ては酵母エキス、ペプトン、肉エキスを使用することが
でき、炭素源としてはグルコ−ス等公知の材料が用いら
れる。
地を以下に例示する。 ポリペプトン 1.0重量% 酵母エキス 0.5重量% NaCl 0.5重量% 寒天 1.5重量% なお、本発明において、PYS培地とは、上記成分か
ら、寒天成分を除いたものを指す。
に詳しく説明する。本発明のカタラーゼの蛋白質のN末
端のアミノ配列を調べたところ、これまでに報告されて
いるカタラーゼの中で相同するものは見当らなかったの
で、本発明のカタラーゼは新規なカタラーゼであるもの
と思考される。
ラーゼと既知の微生物が有するカタラーゼのN末端のア
ミノ酸配列を比較すると、以下のごとくなる。 S−1−6: SDDGKXYPVGHMGGDFEA
PVVXGN,バチルス サブチルス(Bacillus subti
lis): MSDDQNKRVNEHSKDEQLEQYRTD
N,ロドバクター カプスラータス(Rhodobacter caps
ulatus):MDGKDKATGKCPVMHGAMTA
AGUS, エセリヒア コリ HP II(Escherichia coli HP I
I):MSQHNEKNPHQHQSPLHDSSEA
KPG.
ある。A:Alanine,C:Cysteine,D:Aspartis aci
d,E:Glutamic acid,F:Phenylalanine,G:Glyci
ne,H:Histidine,I:Isoleucine,K:Lysine,
L:Leucine,M:Methionine,N:Asparagine,P:P
roline,Q:Glutamine,R:Arginine,S:Serine,
T:Threonine,V:Valine,W:Tryptophan,Y:Tyr
osine.
気泳動(ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアクリ
ルアミド中で行なうゲル電気泳動)における分子量が5
7,000で、ゲル濾過における溶液中の分子量がその
約4倍であることから、4量体で存在する事が確認され
た。また、本発明のカタラーゼのピリジンフェロヘモク
ロムの吸収極大が557nm、525nm、419nm
に見られたことからプロトヘムを活性中心に持つことが
明らかになった。
分解活性を有するので、これを、水産加工場等から排出
される過酸化水素含有排水中に投与すれば、排水中の過
酸化水素を効率よく分解消滅させることができる。本発
明のカタラーゼの排水に対する添加量は、約0.4%の
過酸化水素含有水10リットルに対して、0.5mg〜
3.0mg、好ましくは1.0mg〜2.0mgであ
る。
は、本カタラーゼを直接排水中に投与する方法、透析膜
等の袋に収納してこの袋を排水中に浸漬する方法、本カ
タラーゼを水に溶解して排水中に投与する方法等任意で
ある。
より排出される過酸化水素含有排水の処理ににおいて、
特に顕著な効果を奏するので、この排水の処理について
主として述べているが、これ以外の過酸化水素含有排
水、例えば、パルプ工場、食品工場、薬品工場、半導体
工場等より排出される過酸化水素含有排水の処理に適用
できることは勿論である。
の排水中から採取したS―1―6細菌株を使用する。P
YS培地としては、蒸留水1リットル中に、ポリペプト
ン10g(日本製薬株式会社)、酵母エキス5g(極東
製薬工業株式会社)、塩化ナトリウム5g(和光純薬工
業株式会社)を溶かしたものを使用する。
5gの寒天粉末を加え、寒天を温めて溶かして試験管に
分注し、斜面培地にした物を使用し、この培地にS―1
―6細菌株を植菌して培養しておく。
記PYS培地を800ml入れ、このPYS培地に上記
植え継ぎ用の培地で培養したS―1―6細菌株を一白金
耳分採取し、これを植菌後、27℃、100rpmの振
とうシェーカーにかけて48時間培養してS―1―6細
菌株を増殖する。その結果、1リットルあたり3g(湿
菌体)前後のS―1―6細菌株が得られた。
菌株を遠心分離によって集菌した後、加圧型細胞破壊装
置(フレンチプレス)により菌体を破砕し、遠心により
未破砕の菌体を取り除き、得られた無細胞抽出液を超遠
心により膜画分と可溶性画分に分ける。
(カラム充填剤としてDEAE―Toyopearl・
東ソー株式会社製、使用)にかけた後、溶出したカタラ
ーゼ画分を10mMのトリス―HCl緩衝液で2倍に希
釈した後、DEAE―Toyopearlに再度かけ溶
出させた後、カタラーゼ画分を2mlになるまで濃縮
し、ゲル濾過(カラム充填剤としてセファクリルS―3
00;ファルマシア バイオテク株式会社製、使用)に
より精製することにより、本発明のカタラーゼを得た。
(1)温度活性測定と(2)pH活性測定の2つ方法に
よって測定した。なお、対象としては市販の牛肝臓製カ
タラーゼを使用した。
ラーゼは、電気泳動で均一な精製標品が得られたことが
確認された。精製されたカタラーゼの吸収スペクトル
は、406nmに吸収極大を示し、還元剤であるジチオ
ナイトによって明らかな還元は見られなかった。
を求める。例 85mm(記録紙上のy軸の値(mm)
を1分間あたりに換算した物:過酸化水素の減少の幅)
×1.5Abs(吸光値としての測定の幅)÷150m
m(記録紙上としてのy軸の全幅:1.5Absの範
囲)=1分間あたりの吸光値の減少値。
過酸化水素のミリモル吸光係数である0.0436で割
り、さらに添加した酵素の質量(mg)で割ることによ
りμmol / min / mg protein( Unit / mg ) が求まる。
なお、酵素の含有量(mg/ml)は、蛋白溶液の濃度
の測定法であるローリー法を用いて調べ、そのときの検
量線に使われたサンプルは、牛血清アルブミンである。
調べたい酵素のタンパク含量は、その日に作られた検量
線から推定されている。測定の単位である 1μmol / m
in / mg protein は、酵素1mgが1分間あたり1μmo
lの過酸化水素を分解したということを表している。
応溶液である30mM過酸化水素を含んだ100mMリ
ン酸バッファーpH7は、測定したい温度(10〜60
℃10℃ごと)と同温になるまで恒温水槽の中に入れて
置き、同温となった際、反応液1mlを石英製の光透過
のキュベットに入れ、マイクロシリンジによる酵素の添
加とかき混ぜ棒による攪拌で反応を開始し、過酸化水素
の吸光波長である240nmでの吸光値の減少の初速度を
見積もることによって測定した。
−6細菌株のカタラーゼ、市販の牛肝臓カタラーゼとも
ほとんどその活性の強度は温度に依存せず、前者は後者
より幅広い温度域において高い活性を持つことが明らか
になった。
設定し、反応溶液である30mMの過酸化水素を含んだ
100mMの各種異なるpHのバッファー(pH4〜1
0、範囲はpH1刻み)を測定温度の20℃になるまで
恒温水槽の中に入れておく、反応液1mlを石英製の光
透過のキュベットに入れ、マイクロシリンジによる酵素
の添加とかき混ぜ棒による攪拌で反応を開始し、過酸化
水素の吸光波長である240nmでの吸光値の減少の初速
度を見積もることによって測定した。
−6細菌株より得られたカタラーゼの最適pHはpH6
〜8であった。また、pHにより活性の強度は変化する
ものの、いずれのpHにおいても市販の牛肝臓から得ら
れたカタラーゼよりもかなり高い活性を示すことが明ら
かとなった。
内容を次に示す。酢酸緩衝液(100mMの酢酸溶液と
100mMの酢酸ナトリウム溶液を混ぜ合わせpHを調
節して作る混合緩衝液、pH4〜5)、コハク酸緩衝液
(無水コハク酸とNaOHとを混合した緩衝液、pH4
〜6)、リン酸緩衝液(100mMのリン酸一水素二ナ
トリウムと100mMのリン酸二水素ナトリウムとの混
合緩衝液、pH6〜8)、ほう酸緩衝液(ほう酸―Na
OH緩衝液で、この溶液には、NaOHでpHを合わす
前に、ほう酸の量と同量の100mMのKClが含まれ
ている、pH8〜10)、炭酸水素ナトリウム緩衝液
(炭酸水素ナトリウム―NaOH緩衝液、pH9〜1
0)、上記の緩衝液の濃度は全て100mMである。
のカタラーゼのカタラーゼ活性の温度依存性を比較した
結果、本発明のカタラーゼは測定を行った5℃〜60℃
までの幅の広い温度領域で活性をほとんど失わず(ただ
し、5℃では、若干活性が落ちた)、市販のカタラーゼ
のおよそ2〜3倍強い活性を示し、工業的利用に適して
いることが示された。
のカタラーゼとのカタラーゼ活性のpH依存性を比較し
た結果、いずれのpHにおいても本発明のカタラーゼは
市販品よりも活性が上回っていた。
化するものの、広範囲のpHで高い活性を示すことか
ら、上記活性の温度依存性の結果と総合すると、本発明
のカタラーゼは、広範囲の条件で応用可能な極めて工業
的利用価値の高いものと判定することできる。
容易に採集できる細菌を母体として、極めて安価に量産
できると共に、過酸化水素に対する活性が高力価である
ことから、過酸化水素含有排水に投与する場合、従来の
カタラーゼに比べてその投入量を減らすことができるの
で、排水処理のコストを大幅に低減することができる。
果を示すもで、図1−aは、本発明のカタラーゼと対象
とする市販のカタラーゼとの温度変化による酵素活性の
変化を比較して示したグラフ、図1−bは、本発明のカ
タラーゼと対象とする市販のカタラーゼとのpH変化に
よる酵素活性の変化を比較して示したグラフである。
Claims (3)
- 【請求項1】 過酸化水素分解性を有するビブリオ(V
ibrio)属・S―1―6細菌株より生産される高力
価カタラーゼ。 - 【請求項2】 過酸化水素分解性を有するビブリオ(V
ibrio)属・S―1―6細菌株を培養し、該培養物
からカタラーゼを分離精製することを特徴とする高力価
カタラーゼの製造方法。 - 【請求項3】 過酸化水素分解性を有するビブリオ(V
ibrio)属・S―1―6細菌株より得られた高力価
カタラーゼを、過酸化水素含有排水に接触させることを
特徴とする過酸化水素含有排水の処理方法。
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---|---|---|---|
JP15635696A JP4080011B2 (ja) | 1996-05-29 | 1996-05-29 | 高力価カタラーゼおよびその製造方法ならびにそれを利用する過酸化水素含有排水の処理方法 |
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