JPH09289892A - C-mpl ligand agonist antibody - Google Patents

C-mpl ligand agonist antibody

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JPH09289892A
JPH09289892A JP8105101A JP10510196A JPH09289892A JP H09289892 A JPH09289892 A JP H09289892A JP 8105101 A JP8105101 A JP 8105101A JP 10510196 A JP10510196 A JP 10510196A JP H09289892 A JPH09289892 A JP H09289892A
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JP
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mpl
dna
antibody
protein
solution
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JP8105101A
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Japanese (ja)
Inventor
Shinya Yano
信也 矢野
Masaki Abe
正樹 阿部
Nana Sakaba
奈々 酒葉
Tetsuya Urasaki
哲也 浦崎
Susumu Nakada
進 中田
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Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new gene coding a chimeric protein containing an extracellular domain of c-MPL and a cell membrane-penetrating through type proteins other than the domain and used for treating aplastic anemia, malignant tumor, thrombocytepenia, etc. SOLUTION: This new gene codes a chimeric protein containing an extracellular domain of c-MPL or its part and a cell membrane-penetrating through type protein or its part and is useful for producing the chimeric protein necessary for preparation of c-MPL ligand agonist antibody and the antibody and the protein are effective for chemotherapy of aplastic anemia, malignant tumor, etc. and treatment of thrombocytepenia accompanied by radiotherapy and thrombocytepenia accompanied by bone marrow transplantation. The DNA is obtained by extracting mRNA from HEL 92.1.7 cell, synthesizing its cDNA, cloning the cDNA by PCR method using a primer and binding the resultant DNA of extracellular domain of c-MPL to DNA of interleukin-2 receptor, etc.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子工学、抗体工
学の分野に関する。また、本発明は、医薬、殊に血小板
産生刺激因子に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to the fields of genetic engineering and antibody engineering. The present invention also relates to a medicine, especially a platelet production stimulating factor.

【０００２】[0002]

【従来の技術】再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、又
は悪性腫瘍の化学療法、放射線療法には、血小板減少症
という症状が伴う。この血小板減少症の克服のために、
これまで血小板を増幅させる様々な技術の開発が試みら
れてきた。例えば、各種インターロイキン、エリスロポ
エチン（EPO）、顆粒球ーマクロファージコロニー刺激因
子（GM-CSF）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory
factor／LIF）、幹細胞成長因子（stem cell factor／S
CF）など多数のサイトカインが血小板への分化成熟に影
響を与えることが解明され、さらにIL-3やIL-6などの一
部のサイトカインについては血小板減少症に対する臨床
試験が行われてきた。これらサイトカインはいずれも血
小板産生の源である巨核球に特異的に作用する分子では
ない点が問題であった。BACKGROUND OF THE INVENTION Chemotherapy and radiation therapy for aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, or malignant tumors are accompanied by the phenomenon of thrombocytopenia. To overcome this thrombocytopenia,
Until now, development of various techniques for amplifying platelets has been attempted. For example, various interleukins, erythropoietin (EPO), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), leukemia inhibitory factor
factor / LIF, stem cell factor / S
It has been clarified that many cytokines such as CF) influence differentiation and maturation into platelets, and further some cytokines such as IL-3 and IL-6 have been clinically tested for thrombocytopenia. The problem is that none of these cytokines are molecules that act specifically on megakaryocytes, which are the source of platelet production.

【０００３】しかし、近年になって、血液学の分野にお
いて、マウスの骨髄増殖性疾患を引き起こすレトロウイ
ルスであるMPLウイルス（myeroproliferative leukemia
virus）のガン遺伝子「v-MPL」が発見され、宿主細胞
においても該「v-MPL」と相同なサイトカイン受容体フ
ァミリーに属する遺伝子「c-MPL」が単離され（Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,89:5640-5644(1992)）、該遺伝子が巨
核球前駆細胞に特異的に発現し、また該遺伝子のアンチ
センスが巨核球の増殖、分化、血小板形成を選択的に抑
止することが報告されたことから（Blood,82:1395-1401
(1993)）、血小板減少症を克服しようとする試みは、主
としてc-MPLに特異的に結合して、その活性化を行う「c
-MPLリガンド」即ち、スロンボポエチン（TPO）を単離
することに重点が置かれ始めた。この結果、最近になっ
て、ようやく該「c-MPLリガンド」の精製が成功し、さ
らにその遺伝子が単離された（Nature,369,533-538(199
4)）。このc-MPLリガンドは、シグナル配列部分を除く
と332アミノ酸からなり、Ｎ端側153アミノ酸部分は、エ
リスロポエチン（EPO）と約23％の相同性を示し、一
方、Ｃ末端の179アミノ酸は、アスパラギン結合型糖鎖
の修飾部位が６ヵ所存在することが報告されている（Na
ture,369:533-538(1994)、Cell,77:1117-1124(199
4)）。However, in recent years, in the field of hematology, MPL virus (myeroproliferative leukemia), which is a retrovirus that causes myeloproliferative diseases in mice.
virus) oncogene "v-MPL" was discovered, and a gene "c-MPL" belonging to the cytokine receptor family homologous to "v-MPL" was isolated in host cells (Proc.
tl.Acad.Sci.USA, 89: 5640-5644 (1992)), the gene is specifically expressed in megakaryocyte progenitor cells, and antisense of the gene selects megakaryocyte proliferation, differentiation, and platelet formation. Since it was reported that they would be effectively deterred (Blood, 82: 1395-1401
(1993)), an attempt to overcome thrombocytopenia mainly binds specifically to c-MPL and activates it.
-The emphasis has begun on isolating the "MPL ligand", namely thrombopoietin (TPO). As a result, only recently has the purification of the "c-MPL ligand" been successful, and the gene has been isolated (Nature, 369, 533-538 (199
Four)). This c-MPL ligand consists of 332 amino acids excluding the signal sequence portion, the N-terminal 153 amino acid portion shows about 23% homology with erythropoietin (EPO), while the C-terminal 179 amino acid has asparagine. It has been reported that there are 6 sites for modification of linked sugar chains (Na
ture, 369: 533-538 (1994), Cell, 77: 1117-1124 (199
Four)).

【０００４】c-MPLリガンドには、アスパラギン結合型
糖鎖結合配列やセリン／スレオニン結合型糖鎖結合配列
が複数存在する。また、セリンプロテアーゼによって切
断されうる部位が２箇所存在する。そこで、c-MPLリガ
ンドを医薬用途に用いるためにそれを大量に調製するこ
とには困難が伴う。また、調製されたc-MPLリガンドを
生体に投与すると速やかに酵素的分解を受け不活化され
てしまうため、インビボにおける血小板増加の応答は遅
く、頻回投与が避けられない。更に、c-MPLリガンドに
は、ある種の白血病細胞の増殖を刺激する活性、巨核球
分化の最終段階である血小板を刺激し血栓傾向をもたら
す活性などの好ましくない活性があることが報告されて
いる。加えて、高用量のc-MPLリガンドを投与すると、
むしろ薬効が低下するといった問題点がある。[0004] The c-MPL ligand has a plurality of asparagine-binding sugar chain binding sequences and a plurality of serine / threonine-binding sugar chain binding sequences. In addition, there are two sites that can be cleaved by serine protease. Therefore, it is difficult to prepare a large amount of the c-MPL ligand for use in medicine. In addition, when the prepared c-MPL ligand is administered to a living body, it is rapidly enzymatically degraded and inactivated, so that the response of thrombocytosis in vivo is slow and frequent administration is inevitable. Furthermore, it has been reported that the c-MPL ligand has an unfavorable activity such as an activity of stimulating proliferation of certain leukemia cells and an activity of stimulating platelets, which is the final stage of megakaryocyte differentiation, and causing a thrombotic tendency. There is. In addition, administration of high doses of c-MPL ligand
On the contrary, there is a problem that the medicinal effect decreases.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】前述のようにc-MPLリ
ガンドは、将来性の高い医薬として期待される反面、臨
床への応用に際しては様々な問題点を有していると考え
られる。そこで、優れた血小板刺激能を有する、持続が
長い、巨核球に選択的に作用する、骨髄集積性が高い、
大量に製造可能である、などの点で天然型c-MPLリガン
ドに比べて優れた性質を有する、巨核球、血小板系に作
用する血小板産生因子を開発することが重要な課題とな
っている。As described above, the c-MPL ligand is expected as a highly promising drug, but it is thought to have various problems in clinical application. Therefore, it has an excellent platelet stimulating ability, has a long duration, selectively acts on megakaryocytes, and has a high bone marrow accumulating property,
The development of a platelet-producing factor that acts on the megakaryocyte and platelet system, which has superior properties to the natural c-MPL ligand in that it can be produced in a large amount, has become an important issue.

【０００６】即ち、本発明は、優れた性質を有する巨核
球、血小板系に作用する血小板産生因子を開発すること
を課題とする。That is, an object of the present invention is to develop a megakaryocyte having excellent properties and a platelet producing factor which acts on the platelet system.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、血小板産
生を刺激する因子について鋭意研究した結果、血小板産
生能を有するc-MPLリガンドアゴニスト活性を有する抗
体及びその一部分を含み該アゴニスト活性を有するタン
パク質を見いだし、本発明を完成した。以下、本発明に
つき、詳細に説明する。[Means for Solving the Problems] As a result of intensive studies on factors that stimulate platelet production, the present inventors have found that an antibody having a c-MPL ligand agonist activity capable of producing platelets and a part of the antibody have the agonist activity. The protein possessed was found and the present invention was completed. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

【０００８】本発明者らは、c-MPLリガンドアゴニスト
活性を有する抗体を取得するためには、天然に存在する
形態に近い形の抗原を用いて免疫することが効果的であ
ると考えた。しかし、可溶化c-MPL細胞外ドメインの調
製は困難であり、またc-MPL全長遺伝子を発現させて
も、細胞表面の細胞膜上に局在するc-MPL分子の数は限
られている。The present inventors considered that it is effective to immunize with an antigen having a form close to a naturally occurring form in order to obtain an antibody having c-MPL ligand agonist activity. However, preparation of the solubilized c-MPL extracellular domain is difficult, and even when the full-length c-MPL gene is expressed, the number of c-MPL molecules localized on the cell surface cell membrane is limited.

【０００９】そこで、本発明者らは、 １）c-MPLが細胞膜外に効果的に発現されるために、c-M
PLの細胞外ドメイン部分を、Tac（即ち、インターロイ
キン−２受容体のα鎖）とのキメラタンパク質とし、 ２）免疫する細胞のうち、発現しているキメラタンパク
質部分以外の部分に対する抗体が産生されないよう、免
疫する細胞を免疫動物と同ー種同ー系統由来のものとし
た。Therefore, the present inventors have found that: 1) c-MPL is effectively expressed outside the cell membrane, and
The extracellular domain portion of PL is used as a chimeric protein with Tac (that is, the α-chain of interleukin-2 receptor), and 2) an antibody against a portion of the immunized cell other than the expressed chimeric protein portion is produced. To prevent this, the cells to be immunized were derived from the same strain as the immunized animal.

【００１０】具体的には、本発明者らは、まず、ヒトc-
MPL遺伝子の単離を行い、ヒトc-MPLの細胞外ドメインと
Tacとのキメラ遺伝子を作製した。次いで、該キメラ遺
伝子をマウスB300-19細胞へ導入し発現させ、さらにヒ
トc-MPLの細胞外ドメインが膜外に提示された該細胞を
用いてマウスを免疫し、抗ヒトc-MPLマウス抗体を得
た。そして、得られた抗ヒトc-MPLマウス抗体を、c-MPL
リガンドアゴニスト活性検出用にc-MPL全長遺伝子を導
入し形質転換したマウスBaF3細胞に対し作用させたとこ
ろ、この抗体が該アゴニスト活性を示すことが見いださ
れた。[0010] Specifically, the present inventors first of all, human c-
The MPL gene was isolated and the extracellular domain of human c-MPL
A chimeric gene with Tac was prepared. Then, the chimeric gene was introduced into mouse B300-19 cells to be expressed, and the cells in which the extracellular domain of human c-MPL was presented outside the membrane were used to immunize mice, and anti-human c-MPL mouse antibody was used. Got Then, the obtained anti-human c-MPL mouse antibody was added to c-MPL
When the c-MPL full-length gene was introduced into the mouse BaF3 cells transformed to detect the ligand agonist activity, the antibody was found to exhibit the agonist activity.

【００１１】即ち、本発明は、（１） c-MPLの細胞外
ドメイン又はその一部、及びc-MPL以外の細胞膜貫通型
タンパク質又はその一部を含む、キメラタンパク質をコ
ードするＤＮＡ、（２） c-MPL以外の細胞膜貫通型タ
ンパク質又はその一部が、Tac由来である（１）記載の
ＤＮＡ、（３） （１）又は（２）記載のDNAを含むベ
クター、（４） （３）記載のベクターを含む細胞、
（５） （１）又は（２）記載のＤＮＡがコードするタ
ンパク質を表面に有する細胞を動物に免疫する過程を含
む、抗c-MPL抗体又はその一部分を含みc-MPLリガンドア
ゴニスト活性を有するタンパク質の製造方法、（６）
（５）記載の方法により得ることができる、抗c-MPL抗
体又はその一部分を含みc-MPLリガンドアゴニスト活性
を有するタンパク質、（７） c-MPLリガンドアゴニス
ト活性を有する抗c-MPL抗体、又はその一部分を含み該
アゴニスト活性を有するタンパク質、（８） （６）又
は（７）記載の抗体又はタンパク質を有効成分とする医
薬組成物、に関する。That is, the present invention provides (1) a DNA encoding a chimeric protein containing an extracellular domain of c-MPL or a part thereof and a transmembrane protein other than c-MPL or a part thereof, (2 ) A cell transmembrane protein other than c-MPL or a part thereof is derived from Tac, (3) the vector containing the DNA of (1) or (2), (4) (3) Cells containing the vector described,
(5) A protein containing an anti-c-MPL antibody or a part thereof, which has a c-MPL ligand agonist activity, including a process of immunizing an animal with cells having the protein encoded by the DNA described in (1) or (2) on the surface. Manufacturing method (6)
(5) A protein containing an anti-c-MPL antibody or a part thereof which has a c-MPL ligand agonist activity, obtainable by the method according to (5), (7) an anti-c-MPL antibody having a c-MPL ligand agonist activity, or A protein containing a part thereof and having the agonist activity, (8) A pharmaceutical composition comprising the antibody or protein according to (6) or (7) as an active ingredient.

【００１２】[0012]

【発明の実施の形態】本明細書において「c-MPLリガン
ドアゴニスト活性」とは、c-MPLを介して細胞外シグナ
ルを細胞内に伝達する活性をさす。また、本発明に用い
られる「c-MPLの細胞外ドメイン」とは、c-MPLのうち細
胞膜外部に存在する領域をいい、より具体的には、c-MP
LのＮ末端側のアミノ酸配列部分に含まれる領域、即
ち、成熟c-MPLのN末端の1番目のGlnから466番目のTrpま
での領域をいう。なお、本発明においては「c-MPLの細
胞外ドメイン」の全長を用いる必要はなく、その一部で
抗原性を有する部位を用いることができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION As used herein, the term “c-MPL ligand agonist activity” refers to the activity of transducing an extracellular signal into cells via c-MPL. Further, the “extracellular domain of c-MPL” used in the present invention refers to a region of c-MPL that exists outside the cell membrane, and more specifically, c-MPL.
The region contained in the amino acid sequence portion on the N-terminal side of L, that is, the region from the first Gln to the 466th Trp at the N-terminus of mature c-MPL. In addition, in the present invention, it is not necessary to use the entire length of the “c-MPL extracellular domain”, and a part having an antigenicity can be used.

【００１３】また、本発明においては、「c-MPLの細胞
外ドメイン」と、「細胞膜貫通型タンパク質」との融合
タンパク質が発現した細胞が免疫用に用いられる。該
「細胞膜貫通型タンパク質」としてはTac（即ち、イン
ターロイキン−２受容体のα鎖）を用いることが好まし
い。その際、「細胞膜貫通型タンパク質」の全長を用い
る必要はなく、その一部でキメラタンパク質分子を膜表
面に保持する機能を有する部位を用いることができる。
ただし、Tacに対する抗体（抗Tac抗体）が存在するTac
のように細胞外ドメインを検出できる手段が確立されて
いる細胞膜貫通型タンパク質及びその検出できる部分を
用いることが望ましい。In the present invention, cells expressing a fusion protein of "the extracellular domain of c-MPL" and "cell transmembrane protein" are used for immunization. As the “cell transmembrane protein”, Tac (that is, α chain of interleukin-2 receptor) is preferably used. In that case, it is not necessary to use the entire length of the “cell transmembrane protein”, and a part thereof having a function of retaining the chimeric protein molecule on the membrane surface can be used.
However, Tac for which an antibody against Tac (anti-Tac antibody) exists
As described above, it is desirable to use a transmembrane protein and a detectable portion thereof for which the means for detecting the extracellular domain has been established.

【００１４】本発明におけるキメラタンパク質をコード
するDNAを組み込むベクターとしては、特に制限はない
が、例えば「pEF-BOS」「pSRα」等のベクターを用いる
と発現効率が良い点で有効である。該ベクターは、エレ
クトロポレーション法（電気的穿孔法）、リポフェクチ
ン法、リポフェクトアミン法、DEAE-デキストラン法な
どによって宿主細胞に導入することが可能である。The vector into which the DNA encoding the chimeric protein of the present invention is incorporated is not particularly limited, but use of vectors such as "pEF-BOS" and "pSRα" is effective in terms of good expression efficiency. The vector can be introduced into a host cell by an electroporation method (electroporation method), a lipofectin method, a lipofectamine method, a DEAE-dextran method, or the like.

【００１５】宿主細胞としては、本発明のキメラタンパ
ク質を細胞表面に保持できるものであれば、いかなる種
類の細胞も用いられるが、免疫に用いる場合には、細胞
自体の免疫原性をなくすため、哺乳動物細胞が好まし
く、更に好ましくは免疫動物と同ー種同ー系統由来の細
胞が用いられる。更に好ましくは、実施例で用いたB300
-19のように増殖速度が速い細胞が用いられる。As the host cell, any type of cell can be used as long as it can retain the chimeric protein of the present invention on the cell surface, but when it is used for immunization, it loses its immunogenicity. Mammalian cells are preferred, and cells derived from the same species and strain as the immunized animal are more preferably used. More preferably, B300 used in the examples
Cells with a high proliferation rate such as -19 are used.

【００１６】本発明における抗体には、ポリクロナール
抗体が含まれる。該ポリクロナール抗体は、例えば、c-
MPLの細胞外ドメインとTacのキメラタンパク質を発現し
たマウス細胞で感作し、c-MPLリガンドアゴニスト抗体
を産生するようになったBALB/c系マウス血清から抗体を
精製することによって得られる。ポリクローナル抗体を
精製するには例えば「Antibodies,A Laboratory Manua
l,Harlow及びLane編,1988年 Cold Spring Harbor Labor
atory 」に記載の方法が用いられる。The antibodies of the present invention include polyclonal antibodies. The polyclonal antibody is, for example, c-
It can be obtained by sensitizing with mouse cells expressing the extracellular domain of MPL and a chimeric protein of Tac, and purifying the antibody from BALB / c mouse serum that has been adapted to produce a c-MPL ligand agonist antibody. To purify a polyclonal antibody, see, eg, "Antibodies, A Laboratory Manua.
l, Harlow and Lane, 1988 Cold Spring Harbor Labor
The method described in "atory" is used.

【００１７】また、本発明の抗体には、モノクロナール
抗体も含まれる。該モノクロナール抗体は、例えば、c-
MPLの細胞外ドメインとTacのキメラタンパク質を発現し
たマウス細胞で感作し、c-MPLリガンドアゴニスト抗体
を産生するようになったBALB/c系マウスの脾細胞とマウ
スの骨髄腫細胞P3×63Ag8/U1(P3U1)とを常法により融合
し、これによって得たマウスハイブリドーマを培地又は
マウスの腹水中で培養することにより生産することが可
能である（例えば「Antibodies,A LaboratoryManual,Ha
rlow及びLane編,1988年 Cold Spring Harbor Laborator
y」参照）。The antibody of the present invention also includes a monoclonal antibody. The monoclonal antibody is, for example, c-
BALB / c mouse spleen cells and mouse myeloma cells P3 × 63Ag8 sensitized with mouse cells expressing the extracellular domain of MPL and chimeric protein of Tac to produce c-MPL ligand agonist antibody / U1 (P3U1) is fused by a conventional method, and it is possible to produce by culturing the mouse hybridoma thus obtained in a medium or ascites of a mouse (for example, "Antibodies, A Laboratory Manual, Ha
rlow and Lane, 1988 Cold Spring Harbor Laborator
y ”).

【００１８】このハイブリドーマを培養する培地として
は、例えばダルベッコ氏変法イーグル氏最少必須培地
（Dalbecco's modified minimum essential medium；
以下「ＤＭＥＭ」と略称する）にウシ胎仔血清、L-グル
タミン、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、2-メルカ
プトエタノール及び抗生物質（例えばペニシリンＧ、ス
トレプトマイシン、ゲンタマイシン等）を含有せしめた
培地等が使われる。As a medium for culturing this hybridoma, for example, Dalbecco's modified minimum essential medium;
Hereinafter, a medium containing fetal bovine serum, L-glutamine, glucose, sodium pyruvate, 2-mercaptoethanol and antibiotics (eg penicillin G, streptomycin, gentamicin, etc.) in "DMEM") is used.

【００１９】また、ハイブリドーマの培養は通常、培地
中で３７℃にて５％二酸化炭素、９５％空気の気相で２
〜４日間、或は2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン
（例えばプリスタン、アルドリッチ社製）で前処置され
たBALB/ｃ系マウスの腹腔内にて10〜20日間程度で行わ
れ、精製可能な量の抗体が産生される。Hybridomas are usually cultured in a medium at 37 ° C. in a gas phase of 5% carbon dioxide and 95% air.
~ 4 days, or about 10 to 20 days in the abdominal cavity of BALB / c mice pretreated with 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (eg, Pristane, manufactured by Aldrich), and purified. A possible amount of antibody is produced.

【００２０】このように製造されたモノクローナル抗体
は培養上清或は腹水からタンパク質の単離精製の常法に
より分離精製することができる。そのような方法として
は例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩
析、ＤＥＡＥ−セルロース、ハイドロキシルアパタイ
ト、プロテイン−Ａアガロース等によるカラムクロマト
グラフィー等が挙げられる。The monoclonal antibody thus produced can be separated and purified from the culture supernatant or ascites by a conventional method for protein isolation and purification. Examples of such methods include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, column chromatography with DEAE-cellulose, hydroxyapatite, protein-A agarose and the like.

【００２１】このように分離精製された抗体につき、常
法によりペプシン等のタンパク質分解酵素によって消化
を行い、引続きタンパク質の単離精製の常法によって単
離精製を行って活性ある一部分、例えばF(ab')2を得る
ことができる。さらにジチオスレイトール及びヨードア
セトアミドなどを用いて常法による抗体のＨ鎖とＨ鎖及
び/又はＨ鎖とＬ鎖を結んでいるジスルフィド結合の還
元アルキル化によって非共有結合のみでＨ鎖とＬ鎖が結
びついた抗体の還元アルキル体を得ることができる
（「役に立つ免疫実験法（講談社サイエンティフィッ
ク）」３９頁参照）。The antibody thus separated and purified is digested by a proteolytic enzyme such as pepsin by a conventional method, and then isolated and purified by a conventional method for protein isolation and purification, whereby an active portion such as F ( ab ') 2 can be obtained. Furthermore, by using dithiothreitol, iodoacetamide, etc., the H chain and the L chain of the antibody are non-covalent only by the reductive alkylation of the disulfide bond connecting the H chain and the H chain of the antibody and / or the H chain and the L chain. It is possible to obtain a reduced alkyl derivative of an antibody bound to (see "Useful Immunization Experimental Method (Kodansha Scientific)", page 39).

【００２２】なお、ヒトの治療に本発明のモノクローナ
ル抗体又は該抗体の一部を含むタンパク質を用いる場合
は、ヒト由来の部分の割合が高いモノクローナル抗体又
は該抗体の一部を含むタンパク質を用いることが望まし
い。そのようなモノクローナル抗体の例として、 可
変領域のみマウス等の動物由来のアミノ酸配列からな
り、定常領域はヒト由来のアミノ酸配列からなる抗体、
即ちいわゆる「キメラ抗体（chimeric antibody）」
相補性決定領域（又は超可変領域/以下「ＣＤＲ」
（complementarity-determing region）と略称）のみマ
ウス等の動物由来のアミノ酸配列からなり、その他の領
域はヒト由来のアミノ酸配列からなる抗体、即ちいわゆ
る「ヒト化抗体（humanized antibody）」が挙げられ、
これらのタイプの抗体も本発明に含まれる。「キメラ抗
体」については、公知の方法に従って、当業者が容易に
製造することが可能である（Nature,314,268-270(198
5):Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,84,3439-3443(1987):Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA.,84,214-218(1987),Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA.,81,6851-6855(1984)）。また、「ヒト化抗
体」についても、公知の方法に従って、当業者が容易に
製造することが可能である（Nature,321,522-525(198
6):Science,239,1534-1536(1988):Proc.Natl.Acad.Sci.
USA.,86,10029-10033(1989):Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,
88,2869-2873(1991)）。なお、これらの文献等によれ
ば、「ヒト化抗体」を製造する際、ＣＤＲ部位のみヒト
以外の生物のＣＤＲと置換されるヒト抗体（即ち「ヒト
化抗体」の基本骨格を構成する抗体/「ヒト受容体抗
体」と称する）として、該移植されるＣＤＲが由来する
ヒト以外の生物の抗体とホモロジーの高いヒト抗体を用
いることが好ましいとされている。When the monoclonal antibody of the present invention or a protein containing a part of the antibody is used for treating humans, a monoclonal antibody having a high proportion of human-derived parts or a protein containing a part of the antibody is used. Is desirable. As an example of such a monoclonal antibody, an antibody whose variable region consists of an amino acid sequence derived from an animal such as mouse and whose constant region consists of an amino acid sequence derived from human,
The so-called "chimeric antibody"
Complementarity determining region (or hypervariable region / hereinafter “CDR”)
(Abbreviated as (complementarity-determing region)) consists of an amino acid sequence derived from an animal such as a mouse, and the other region is an antibody consisting of an amino acid sequence derived from human, that is, a so-called "humanized antibody",
These types of antibodies are also included in the present invention. The “chimeric antibody” can be easily produced by those skilled in the art according to a known method (Nature, 314, 268-270 (198).
5): Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 84,3439-3443 (1987): Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA., 84,214-218 (1987), Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA., 81,6851-6855 (1984)). Also, the "humanized antibody" can be easily produced by those skilled in the art according to a known method (Nature, 321, 522-525 (198).
6): Science, 239, 1534-1536 (1988): Proc.Natl.Acad.Sci.
USA., 86,10029-10033 (1989): Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,
88, 2869-2873 (1991)). According to these documents and the like, when producing a “humanized antibody”, a human antibody in which only the CDR site is replaced with a CDR of a non-human organism (that is, an antibody constituting a basic skeleton of “humanized antibody” / As a "human receptor antibody"), it is said that it is preferable to use a human antibody having a high homology with the antibody of the organism other than the human from which the CDR to be transplanted is derived.

【００２３】本発明においては「キメラ抗体」又は「ヒ
ト化抗体」は、例えば、本発明の抗体を産生するハイブ
リドーマから、可変領域又はＣＤＲに対応する遺伝子を
単離して、ヒト抗体遺伝子と組み換え、宿主細胞に導入
して発現させることによって、当業者が容易に製造する
ことが可能である（Int.J.Cancer,44,424〜433(1989)、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,8095〜8099(1990)参照）。
また、遺伝子は配列決定後、対応する配列を合成したも
のを用いることも、ハイブリドーマやヒト抗体産生細胞
から得た遺伝子と合成した遺伝子を結合させて用いるこ
ともできる。更に、これら本発明にかかるキメラ抗体、
ヒト化抗体をコードする遺伝子として、エフェクター活
性を抑制するために、フレームワーク部分としてIgG4遺
伝子を用いることも可能である（J.Exp.Med.166,1351-1
361(1987)）。In the present invention, "chimeric antibody" or "humanized antibody" means, for example, by isolating a gene corresponding to a variable region or CDR from a hybridoma producing the antibody of the present invention and recombination with a human antibody gene, It can be easily produced by those skilled in the art by introducing it into a host cell and expressing it (Int. J. Cancer, 44, 424-433 (1989),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8095-8099 (1990)).
In addition, as the gene, it is possible to use the one obtained by synthesizing the corresponding sequence after sequencing, or by combining the gene obtained from the hybridoma or human antibody-producing cells with the synthesized gene. Furthermore, these chimeric antibodies according to the present invention,
As the gene encoding the humanized antibody, in order to suppress the effector activity, it is also possible to use IgG 4 gene as a framework portion (J.Exp.Med.166,1351-1
361 (1987)).

【００２４】なお、本発明の抗体をコードする遺伝子
は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマから、公知
の方法で単離することができる。（Cancer Research,4
7,999-1005(1987)、Proc.Natl.Acad.Sci.84,2936-2940
(1987)）また、c-MPLリガンドアゴニスト作用を有する
限り、本発明の抗体又はその一部分について、アミノ酸
の置換、欠失又は挿入等の変異を導入することができ
る。アミノ酸の変異の導入は、アミノ酸がコードされる
ＤＮＡに対して、塩基の置換、欠失又は挿入等の変異を
導入することによって行うことができる。なお、ＤＮＡ
への変異の導入は、公知の方法で行うことができる（Gi
llamn et al.,Gene,8,81〜97(1979)、Robertset al.,Na
ture,328,731〜734(1987)）。また、得られた変異塩基
配列のうち好適な性質を有するアミノ酸配列をコードす
る配列を選択するには、ファージディスプレー法を利用
した方法（Annu.Rev.ImMunol.,12,433-455(1994)）等が
用いられる。The gene encoding the antibody of the present invention can be isolated from the hybridoma producing the antibody of the present invention by a known method. (Cancer Research, 4
7,999-1005 (1987), Proc.Natl.Acad.Sci.84,2936-2940
(1987)) As long as it has a c-MPL ligand agonistic action, mutations such as amino acid substitution, deletion or insertion can be introduced into the antibody of the present invention or a part thereof. The amino acid mutation can be introduced by introducing mutations such as base substitution, deletion or insertion into the DNA encoding the amino acid. In addition, DNA
A mutation can be introduced into a known method (Gi
llamn et al., Gene, 8, 81-97 (1979), Roberts et al., Na
ture, 328,731〜734 (1987)). Moreover, in order to select a sequence encoding an amino acid sequence having suitable properties among the obtained mutant base sequences, a method utilizing the phage display method (Annu.Rev.ImMunol., 12,433-455 (1994)), etc. Is used.

【００２５】投与量は、投与ルート、疾患の症状、投与
対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜
決定される。本発明の医薬組成物は、非経口投与、即
ち、皮下、筋肉内又は静脈内投与に特に有効である。非
経口投与用組成物は、通常、投与可能な担体、好ましく
は水性担体に溶解した、抗体又はその一部分を含むタン
パク質の溶液からなる。種々の水性担体、例えば水、緩
衝水、0.4％の食塩水、0.3％のグリシン、5％のグルコ
ース、ヒトアルブミン溶液等を使用することができる。
これらの溶液は無菌であり、そして一般的に粒子形成性
物質を有していない。これらの組成物は、慣用で周知の
滅菌技術によって滅菌することができる。これら組成物
は、緩衝化剤、等張化剤等のような、生理的条件に近づ
けるのに必要な薬剤学的に許容される補助物、例えば、
酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
カルシウム、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を
含有することができる。非経口的に投与できる組成物の
実際の製造は、当該技術分野の熟練者に既知又は周知の
技術を用いて行うことが可能であり、例えば「Remingto
n's Pharmaceutical Science, 第15版, Mack Publishin
g Company, ペンシルベニア州イーストン(1980)」に記
載されている。The dose is appropriately determined depending on the individual case in consideration of the administration route, the symptoms of the disease, the age, sex, etc. of the administration subject. The pharmaceutical composition of the present invention is particularly effective for parenteral administration, that is, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration. A composition for parenteral administration usually consists of a solution of the antibody or a protein containing a part thereof dissolved in an administrable carrier, preferably an aqueous carrier. Various aqueous carriers can be used, such as water, buffered water, 0.4% saline, 0.3% glycine, 5% glucose, human albumin solution and the like.
These solutions are sterile and generally free of particle forming materials. These compositions may be sterilized by conventional and well known sterilization techniques. These compositions include pharmaceutically acceptable auxiliary substances, such as buffering agents, isotonicity agents, etc., required to approach physiological conditions, for example,
It may contain sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium lactate, sodium citrate and the like. The actual manufacture of compositions that can be administered parenterally can be carried out using techniques known or well known to those skilled in the art, such as "Remingto
n's Pharmaceutical Science, 15th Edition, Mack Publishin
g Company, Easton, PA (1980).

【００２６】本発明の抗体又はタンパク質又は医薬組成
物は、冷凍して貯蔵するか、凍結乾燥によって貯蔵し使
用する前に適当な溶媒に溶解して再生して使用すること
ができる。凍結乾燥及び再生は、当業者に既知の技術を
用いることができる。The antibody or protein or the pharmaceutical composition of the present invention can be stored frozen or stored by freeze-drying and dissolved in an appropriate solvent before use to be regenerated. Lyophilization and regeneration can use techniques known to those skilled in the art.

【００２７】[0027]

【実施例】以下、実施例をもって本発明につき詳述する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.

【００２８】また、実施例中の操作は特に記載しない限
り「Molecular Cloning A Laboratory Manual（Sandbro
ok, Fritsch, Maniatis 編集、第２版Cold Spring Harb
or Laboratory Press, 1989年）」に従った。In addition, the procedures in the examples are described in "Molecular Cloning A Laboratory Manual (Sandbro
Edited by ok, Fritsch, Maniatis, 2nd edition Cold Spring Harb
or Laboratory Press, 1989) ”.

【００２９】[実施例１] プライマーの合成と精製 １）プライマーの配列 文献［Isabelle Vigon,et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA
89, 5640(1992)］に報告されたc-MPL遺伝子の配列(Gen
Bank data base:accession no.M90102)をもとに次に示
すプライマーを合成した。c-MPL 5の下線部はc-MPL遺伝
子の配列（GenBank data baseに示された配列のヌクレ
オチド番号1〜27）、c-MPL-ECD 3、c-MPL-P 3の下線部は
c-MPL遺伝子の相補鎖の配列（各々同1455〜1473、及び1
889〜1908）に相当する。 c-MPL 5 : 5' GGGTCTAGAGTATGGTCCCCTCCTGGGCCCTCTTCATG 3'（配列番号:1） c-MPL-ECD 3 : 5' GGGCACCTGGTGCCAGGCGGTCTCGGTGGCG 3'（配列番号:2） c-MPL-P 3 : 5' GGGACTAGTTCAAGGCTGCTGCCAATAGC 3'（配列番号:3） ２）プライマーの合成 パーキンエルマー（PERKIN ELMER）社394型DNA/RNA 合
成機を用い、サイクルは40nM CE 、Endプロシージャーは
End CESSで行った。[Example 1] Synthesis and purification of primer 1) Sequence of primer Reference [Isabelle Vigon, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA]
89, 5640 (1992)], the sequence of the c-MPL gene (Gen
The following primers were synthesized based on Bank data base: accession no.M90102). The underlined parts of c-MPL 5 are the underlined parts of the sequence of c-MPL gene (nucleotide numbers 1-27 of the sequence shown in GenBank data base), c-MPL-ECD 3, and c-MPL-P 3.
Sequences of complementary strands of c-MPL gene (1455 to 1473 and 1 respectively)
889-1908). c-MPL 5: 5'GGGTCTAGAGT ATGGTCCCCTCCTGGGCCCTCTTCATG 3 '(SEQ ID NO: 1) c-MPL-ECD 3: 5'GGGCACCTGGTG CCAGGCGGTCTCGGTGGCG 3' (SEQ ID NO: 2) c-MPL-P 3: 5 'GGGACTAGT TCAAGGCTGCTGCCAATAGC SEQ ID NO: 3) 2) Synthesis of primer Using 394 type DNA / RNA synthesizer manufactured by Perkin Elmer Co., Ltd., cycle is 40 nM CE, End procedure is
I went to End CESS.

【００３０】３）プライマーの精製 ２）で合成した反応溶液を56℃で一夜加熱処理後、「Ol
igopurification Cartridge（Cruachem社）」を用い、
指示書通りに精製した。3) Purification of primer After heating the reaction solution synthesized in 2) at 56 ° C. overnight, “Ol
igopurification Cartridge "(Cruachem)
Purified as directed.

【００３１】[実施例２] poly A+RNAの調製 HEL92.1.7細胞（ATCCより入手した）9.7X107個から全RN
Aの調製をグアニジンチオシアネート法で行った。続い
てpoly A+RNAの調製を「Poly Attract mRNA Isolation
Systems（宝酒造、カタログ番号R012）」を用いて指示
書通りに行い、8.2μgのpoly A+RNAを回収した。[Example 2] Preparation of poly A + RNA Total RN from HEL92.1.7 cells (obtained from ATCC) 9.7X10 7
Preparation of A was performed by the guanidine thiocyanate method. Then, prepare poly A + RNA by `` Poly Attract mRNA Isolation
Systems (Takara Shuzo, Catalog No. R012) "was performed according to the instructions, and 8.2 µg of poly A + RNA was recovered.

【００３２】[実施例３] RT-PCRによるc-MPL細胞外領
域（c-MPL-ECD）遺伝子及びc-MPL全長Pタイプ（c-MPL-P
）遺伝子の増幅「 RNA PCR Kit with AMV Rtase（宝酒造）」を用いて行
った。まず、実施例2で調製したHEL92.1.7細胞由来poly
A+RNA 20ngと10 mM Tris-HCl, pH8.0、50 mM KCl、5 mM
MgCl2、1 mM dNTP Mixture、1 Unit/μl RNase Inhibito
r、2.5 μM Random9mer(dp(NNNNNNNNN))、0.25 Unit/μlA
MV 逆転写酵素を含む反応溶液20μlを0.5ml反応チュー
ブに調製し、ミネラルオイル50〜100μlを重層した。そ
のチューブをDNA サーマルサイクラー（Thermal Cycle
r）480（PERKIN ELMER社）にセットし、30℃で10分間、
42℃で30分間、99℃で5分間、5℃で5分間の反応を行っ
た。続いて、その反応チューブにキット反応溶液Bを添
加し、マイクロ遠心機で10秒間遠心し、10mMTris-HCl、5
0mM KCl、2mM MgCl2、2.5 Unit/100μl TaKaRa Taq、0.2μ
M上流PCRプライマー（c-MPL 5）、0.2μM下流PCRプライ
マー（c-MPL-ECD 3又はc-MPL-P 3）を含む最終反応溶液
100μlを調製した。この最終反応溶液の入ったチューブ
を再度DNAサーマルサイクラー480（PERKIN ELMER社）に
セットし、94℃で2分間、続いて94℃で1分間、60℃で2
分間、72℃で2分間のサイクルを50回行うことにより、c
-MPL細胞外領域遺伝子又はc-MPL全長Pタイプ遺伝子を増
幅した。反応液の一部をアガロースゲル電気泳動した結
果、c-MPL細胞外領域に相当する1.5Kbのバンド、c-MPL
全長Pタイプに相当する1.9Kbのバンドが主PCR産物とし
て確認された。[Example 3] c-MPL extracellular region (c-MPL-ECD) gene and c-MPL full length P type (c-MPL-P by RT-PCR)
) Gene amplification was performed using "RNA PCR Kit with AMV Rtase (Takara Shuzo)". First, HEL92.1.7 cell-derived poly prepared in Example 2
A + RNA 20 ng and 10 mM Tris-HCl, pH8.0, 50 mM KCl, 5 mM
MgCl 2 , 1 mM dNTP Mixture, 1 Unit / μl RNase Inhibito
r, 2.5 μM Random9mer (dp (NNNNNNNNN)), 0.25 Unit / μlA
20 μl of a reaction solution containing MV reverse transcriptase was prepared in a 0.5 ml reaction tube, and 50-100 μl of mineral oil was overlaid. Insert the tube into a DNA thermal cycler (Thermal Cycle
r) Set to 480 (PERKIN ELMER), and at 30 ℃ for 10 minutes,
The reaction was carried out at 42 ° C for 30 minutes, 99 ° C for 5 minutes, and 5 ° C for 5 minutes. Then, add the kit reaction solution B to the reaction tube, centrifuge for 10 seconds in a microcentrifuge, 10mM Tris-HCl, 5
0 mM KCl, 2 mM MgCl 2 , 2.5 Unit / 100 μl TaKaRa Taq, 0.2 μ
Final reaction solution containing M upstream PCR primer (c-MPL 5), 0.2 μM downstream PCR primer (c-MPL-ECD 3 or c-MPL-P 3)
100 μl was prepared. The tube containing the final reaction solution was set again in the DNA thermal cycler 480 (PERKIN ELMER), and the temperature was 94 ° C for 2 minutes, followed by 94 ° C for 1 minute and 60 ° C for 2 minutes.
For 2 minutes at 72 ° C for 2 minutes, c
-MPL extracellular region gene or c-MPL full length P type gene was amplified. As a result of agarose gel electrophoresis of a part of the reaction solution, a band of 1.5 Kb corresponding to the extracellular region of c-MPL, c-MPL
A 1.9 Kb band corresponding to the full-length P type was confirmed as the main PCR product.

【００３３】［実施例４］ c-MPL細胞外領域遺伝子及
びc-MPL全長Pタイプ遺伝子のクローニング １）実施例３のPCR産物のサブクローニング 「TacloningTM Kit（Invitrogen社）」を用い、実施例
３で増幅したPCR断片をpCRIIベクターにサブクローニン
グした。まず、実施例３の反応溶液を2％低融点アガロ
ースゲル（FMC社）で電気泳動し、それぞれ1.5kb、1.9Kb
のDNA断片を含むアガロースゲル小片を切り出した。そ
のアガロースゲル小片に5倍量の100mM Tris-HCl， pH8.
0-50mM EDTA溶液を加え65℃で5分間加熱し、アガロース
ゲルを融解した。該反応液を室温まで冷却し、フェノー
ル、フェノール−クロロホルム、クロロホルムの順で処
理した。続いて、水層に1/10倍容の3M酢酸ナトリウム、
2倍容のエタノールを加えエタノール沈澱した。沈澱を2
0μlの10mM Tris-HCl、１mMEDTA ,pH8.0溶液に再溶解し
た。このように調製したDNA断片溶液1μlに、滅菌水5μ
l、10 X ライゲーション緩衝液（宝酒造）2μl、pCRII
ベクター25ｎg/μl、T4 DNA ライゲース 1μlを加え、1
4〜15℃で4時間以上保温した。続いて、上記反応液を用
い、大腸菌JM109コンピテントセル（東洋紡）を添付の
指示書に従い形質転換し、選択プレートに塗布した。選
択プレートはアンピシリン酸ナトリウム（和光純薬）50
μg/mlを含むL-Broth寒天培地に2％ X-Gal(和光純薬）5
0μl、0.1M IPTG（Sigma社）20μlを塗布したものを用
いた。選択プレートを37℃で一夜保温し、出現した白い
コロニーを選択、常法に従いプラスミドDNAを調製し
た。それらを制限酵素EcoRIで切断、アガロースゲル電
気泳動を行い、それぞれ1.5Kb及び、1.9Kbの挿入断片を
有する組換えプラスミドを選択した。[Example 4] Cloning of c-MPL extracellular region gene and c-MPL full-length P type gene 1) Subcloning of PCR product of Example 3 Using "TacloningTM Kit (Invitrogen)" in Example 3 The amplified PCR fragment was subcloned into the pCRII vector. First, the reaction solution of Example 3 was electrophoresed on a 2% low melting point agarose gel (FMC) to give 1.5 kb and 1.9 Kb, respectively.
A small piece of agarose gel containing the DNA fragment was cut out. Add 5 volumes of 100 mM Tris-HCl, pH8 to each piece of agarose gel.
0-50 mM EDTA solution was added and heated at 65 ° C for 5 minutes to melt the agarose gel. The reaction solution was cooled to room temperature and treated with phenol, phenol-chloroform, and chloroform in this order. Then, 1/10 volume of 3M sodium acetate in the water layer,
Two volumes of ethanol were added and ethanol precipitation was performed. 2 precipitates
It was redissolved in 0 μl of 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 solution. 5 μl of sterile water was added to 1 μl of the DNA fragment solution prepared in this way.
l, 10 X ligation buffer (Takara Shuzo) 2 μl, pCRII
Add 25 ng / μl of vector and 1 μl of T4 DNA ligase, and add 1
It was kept at 4-15 ℃ for more than 4 hours. Subsequently, using the above reaction solution, Escherichia coli JM109 competent cell (Toyobo) was transformed according to the attached instruction sheet and applied to a selection plate. Selection plate is sodium ampicillate (Wako Pure Chemical Industries) 50
2% X-Gal (Wako Pure Chemical Industries) 5 in L-Broth agar containing μg / ml
0 μl, 20 μl of 0.1M IPTG (Sigma) were used. The selection plate was incubated overnight at 37 ° C., white colonies that appeared were selected, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method. These were cleaved with restriction enzyme EcoRI and subjected to agarose gel electrophoresis to select recombinant plasmids having insert fragments of 1.5 Kb and 1.9 Kb, respectively.

【００３４】２）DNA塩基配列の決定 「QIAGEN PLASMID MINI KIT（QIAGEN社）」及び、「QIA
prep-8 PLASMID KIT（QIAGEN社）」により調製したプラ
スミドについて塩基配列解析を行った。「Prism Ready
Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit
（Applied Biosystem社）」を用いシークエンス反応を
行い、373A型シークエンサー（パーキンエルマー社）で
解析した。尚、反応条件等は全て「Prism Ready Reacti
on DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit」及び
「Perkin Elmer373A型シークエンサー」に添付された指
示書に従った。2) Determination of DNA base sequence "QIAGEN PLASMID MINI KIT (QIAGEN)" and "QIAGEN
Nucleotide sequence analysis was performed on the plasmid prepared by "prep-8 PLASMID KIT (QIAGEN)". `` Prism Ready
Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit
(Applied Biosystem) ”, and analyzed by a 373A type sequencer (Perkin Elmer). All reaction conditions are “Prism Ready Reacti
The instructions attached to "on DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit" and "Perkin Elmer 373A type sequencer" were followed.

【００３５】その結果、c-MPL細胞外領域遺伝子では、
ヌクレオチド番号1249のGが欠失したpCRII-c-MPL-ECDク
ローン＃7（以下クローン＃7という）とヌクレオチド番
号922のCが欠失したpCRII-c-MPL-ECDクローン＃20（以
下クローン＃20という）が得られた。また、c-MPL全長P
タイプ遺伝子では、ヌクレオチド番号1237のCが欠失し
たpCRII-c-MPL-Pクローン＃1が得られた。As a result, in the c-MPL extracellular region gene,
PCRII-c-MPL-ECD clone # 7 in which G at nucleotide number 1249 is deleted (hereinafter referred to as clone # 7) and pCRII-c-MPL-ECD clone # 20 in which C at nucleotide number 922 is deleted (hereinafter clone # 20) was obtained. Also, c-MPL total length P
In the type gene, pCRII-c-MPL-P clone # 1 in which the C at nucleotide number 1237 was deleted was obtained.

【００３６】３）c-MPL細胞外領域遺伝子のクローニン
グ 実施例４−２）で調製したプラスミドDNAクローン＃7及
びクローン＃20を制限酵素BglII（宝酒造）で切断し
た。続いて、1％低融点アガロースゲル電気泳動を行
い、クローン＃7からは4.2kBのDNA断片を含むアガロー
スゲル小片を切り出した。また、クローン＃20からは1.
2kBのDNA断片を含むアガロースゲル小片を切り出した。
それらのアガロースゲル小片に等量のTE溶液を加え、65
℃で加熱してアガロースゲルを融解後、室温まで冷却
し、フェノール、クロロホルムの順で処理した。続い
て、クローン＃7については、プラスミドDNA溶液10μl
に、アルカリホスファターゼ（胎仔由来）（宝酒造）1
μl、滅菌水34μl、500 mM Tris-HCl，pH9.0、10 mM MgC
l2を含む反応溶液5μlを加えて脱リン酸化処理し、10μ
lのTE溶液に溶解した。方法は宝酒造遺伝子工学製品ガ
イドのプロトコールに従った。こうして調製したクロー
ン＃7からのDNA断片溶液5μlに、クローン＃20からのDN
A断片溶液5μl、「DNA Ligation kit Ver.1 （宝酒
造）」A液 50μl、B液 10μlを加え、16℃で8時間以上
保温した。続いて、該反応液を用い、大腸菌JM109コン
ピテントセル（東洋紡）を添付の指示書に従い形質転換
し、選択プレートに塗布した。選択プレートはアンピシ
リンナトリウム50μg/mlを含むL-Broth寒天培地を用い
た。選択プレートを37℃で一夜保温し、出現したコロニ
ーを選択、常法に従いプラスミドDNAを調製した。それ
らを制限酵素EcoRIで切断、アガロースゲル電気泳動を
行い、切断片の長さが1.5kbpと3.9kbpとなる目的のプラ
スミドDNA pCRII-c-MPL-ECDを選択した。3) Cloning of c-MPL extracellular region gene The plasmid DNA clone # 7 and clone # 20 prepared in Example 4-2) were cleaved with the restriction enzyme BglII (Takara Shuzo). Subsequently, 1% low-melting point agarose gel electrophoresis was performed, and a small piece of agarose gel containing a 4.2 kB DNA fragment was cut out from clone # 7. Also, from clone # 20 1.
A small piece of agarose gel containing the 2 kB DNA fragment was cut out.
Add an equal volume of TE solution to the agarose gel pieces and add 65
After the agarose gel was melted by heating at ℃, it was cooled to room temperature and treated with phenol and chloroform in this order. Then, for clone # 7, 10 μl of plasmid DNA solution
Alkaline phosphatase (from fetus) (Takara Shuzo) 1
μl, Sterilized water 34 μl, 500 mM Tris-HCl, pH 9.0, 10 mM MgC
Add 5 μl of reaction solution containing l 2 to dephosphorylate, and add 10 μl
l dissolved in TE solution. The method followed the protocol of Takara Shuzo genetic engineering product guide. 5 μl of the DNA fragment solution from clone # 7 thus prepared was added to DN from clone # 20.
5 μl of A fragment solution, 50 μl of “DNA Ligation kit Ver.1 (Takara Shuzo)” solution A and 10 μl of solution B were added, and the mixture was kept at 16 ° C. for 8 hours or more. Subsequently, using the reaction solution, Escherichia coli JM109 competent cell (Toyobo) was transformed according to the attached instruction sheet and applied to a selection plate. As the selection plate, L-Broth agar medium containing 50 μg / ml of sodium ampicillin was used. The selection plate was kept at 37 ° C. overnight, the colonies that appeared were selected, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method. These were cleaved with restriction enzyme EcoRI and subjected to agarose gel electrophoresis to select the desired plasmid DNA pCRII-c-MPL-ECD having cut pieces of 1.5 kbp and 3.9 kbp in length.

【００３７】４）c-MPL全長Pタイプ遺伝子のクローニン
グ 実施例４−３）で構築したpCRII-c-MPL-ECD、及び実施
例４−２）で塩基配列解析したpCRII-c-MPL-Pクローン
＃1のプラスミドDNAを常法に従い調製した。各々を制限
酵素BssHII（宝酒造）で消化した。続いて、各々の溶液
について１％低融点アガロースゲル電気泳動を行い、pC
RII-c-MPL-ECD からは3.8KbのDNA断片を含むアガロース
ゲル小片を、また、pCRII-c-MPL-Pクローン＃1からは2.
0KbのDNA断片を含むアガロースゲル小片を切り出した。
それらのアガロースゲル小片を６５℃で融解後、室温ま
で冷却し、フェノール、フェノール−クロロホルム、ク
ロロホルムの順で処理を行った。水層をエタノール沈澱
し、ｐＣＲＩＩ−ｃ−ＭＰＬ−ＥＣＤについては、脱リ
ン酸化処理した。こうして調製した各々のDNA断片溶液
を混合し、DNALigation kit Ver.1を用いて、16℃で1時
間半保温しライゲーションした。続いて、大腸菌JM109
コンピテントセルを形質転換し、選択プレートに塗布し
た。選択プレートはアンピシリンナトリウム50μg/mlを
含むL-Broth寒天培地を用いた。選択プレートを37℃で
一夜保温し、出現したコロニーを選択、常法に従ってプ
ラスミドDNAを調製した。プラスミドを制限酵素Bsu36I
（NEW ENGLAND BioLabs社）で切断、アガロースゲル電
気泳動を行い、1.1Kbと4.7Kbの断片を有する組換えプラ
スミドpCRII-c-MPL-Pを構築した。4) Cloning of c-MPL full-length P type gene pCRII-c-MPL-ECD constructed in Example 4-3) and pCRII-c-MPL-P analyzed in nucleotide sequence in Example 4-2) Clone # 1 plasmid DNA was prepared by a conventional method. Each was digested with the restriction enzyme BssHII (Takara Shuzo). Subsequently, 1% low melting point agarose gel electrophoresis was performed on each solution to obtain pC.
A small piece of agarose gel containing a 3.8 Kb DNA fragment from RII-c-MPL-ECD and 2.from pCRII-c-MPL-P clone # 1.
A small piece of agarose gel containing a 0 Kb DNA fragment was cut out.
The agarose gel pieces were melted at 65 ° C., cooled to room temperature, and treated in the order of phenol, phenol-chloroform, and chloroform. The aqueous layer was ethanol-precipitated, and pCRII-c-MPL-ECD was dephosphorylated. The respective DNA fragment solutions thus prepared were mixed and ligated using DNA Ligation kit Ver. 1 at 16 ° C for 1 and a half hours. Then E. coli JM109
Competent cells were transformed and plated on selection plates. As the selection plate, L-Broth agar medium containing 50 μg / ml of sodium ampicillin was used. The selection plate was incubated overnight at 37 ° C., the colonies that appeared were selected, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method. Plasmid restriction enzyme Bsu36I
Cleavage with (NEW ENGLAND BioLabs) and agarose gel electrophoresis were performed to construct a recombinant plasmid pCRII-c-MPL-P having 1.1 Kb and 4.7 Kb fragments.

【００３８】［実施例５］ プラスミドベクターpSRα-
fの構築 １）フラッグリンカー(flag linker)の構築 69塩基からなるオリゴヌクレオチドoligo-1（5 -GATCTG
GTACCTAACACCAGGTGAGGCGTGCCTCGGTAGACTACAAGGACGACGAT
GACAAATGATAAA-3 ／配列番号：4）と、同じく69塩基か
らなるオリゴヌクレオチドoligo-2（3 -ACCATGGATTGTGG
TCCACTCCGCACGGAGCCATCTGATGTTCCTGCTGCTACTGTTTACTATT
TCTAG-5／配列番号：5）を実施例１に準じて合成した。
oligo-1（300p mol）とoligo-2（300 pmol）とをリン酸
化緩衝液（1.5 nmol ATP，20単位のポリヌクレオチドキ
ナーゼを含む100 μlの緩衝液）に溶解し、37℃で1時間
反応させた。フェノール−クロロホルムで処理した後、
エタノールで沈澱させてオリゴヌクレオチドを回収し
た。リン酸化したoligo-1（100 pmol）とリン酸化したo
ligo-2 （100 pmol）とをアニーリング緩衝液（10mM T
ris-HCl,pH7.5 50mM NaCl, 10mM MgCl2）中で混合し、8
0℃で5分間、55℃で5分間、37℃で30分間、室温で30分
間反応させ、フラッグリンカーを作製した。[Example 5] Plasmid vector pSRα-
Construction of f 1) Construction of flag linker Oligo-1 (5-GATCTG) consisting of 69 bases
GTACCTAACACCAGGTGAGGCGTGCCTCGGTAGACTACAAGGACGACGAT
GACAAATGATAAA-3 / SEQ ID NO: 4) and an oligonucleotide oligo-2 (3 -ACCATGGATTGTGG) also consisting of 69 bases.
TCCACTCCGCACGGAGCCATCTGATGTTCCTGCTGCTACTGTTTACTATT
TCTAG-5 / SEQ ID NO: 5) was synthesized according to Example 1.
Dissolve oligo-1 (300 pmol) and oligo-2 (300 pmol) in phosphorylation buffer (100 μl buffer containing 1.5 nmol ATP, 20 units of polynucleotide kinase) and react at 37 ° C for 1 hour Let After treatment with phenol-chloroform,
The oligonucleotide was recovered by precipitation with ethanol. Phosphorylated oligo-1 (100 pmol) and phosphorylated o
ligo-2 (100 pmol) and annealing buffer (10 mM T
ris-HCl, pH 7.5 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 ) and mixed for 8
The reaction was performed at 0 ° C for 5 minutes, 55 ° C for 5 minutes, 37 ° C for 30 minutes, and room temperature for 30 minutes to prepare a flag linker.

【００３９】２）フラッグリンカーの挿入 プラスミドベクターpcDLSRα296(Mol.Cell.Biol.,8,466
-472(1988))を制限酵素PstI及びKpnIで切断した後、T4
DNAポリメラーゼ（宝酒造）で平滑末端化し、次にBglII
リンカー（宝酒造）をDNA Ligation kit（宝酒造）を用
いて反応させ、 BglII部位を導入したベクターpcDLSRα
296 （BglII）を作製した。得られたベクターpcDLSRα2
96 （BglII）10μgを制限酵素BglIIで切断し、アルカリ
ホスファターゼ（BAP：宝酒造）で処理した。制限酵素B
glIIで切断した後、 BAP処理したベクターpcDLSRα296
（BglII）0.03pmolと、実施例5-1)で作製したフラッグ
リンカー0.03 pmolとを、DNA Ligation kitを用いて結
合させた。反応液で大腸菌JM109を形質転換した。出現
したコロニーよりプラスミドDNAを調製し、制限酵素Kpn
I及び制限酵素HindIII切断した場合に切断片の長さが2.
5kbpと0.87kbpとなる、目的のプラスミドpSRα-fを選択
した。2) Insertion of flag linker Plasmid vector pcDLSRα296 (Mol. Cell. Biol., 8,466)
-472 (1988)) was digested with restriction enzymes PstI and KpnI, and then T4
Blunt ends with DNA polymerase (Takara Shuzo), and then BglII
Vector pcDLSRα with BglII site introduced by reacting linker (Takara Shuzo) with DNA Ligation kit (Takara Shuzo)
296 (BglII) was prepared. The obtained vector pcDLSRα2
96 (BglII) (10 μg) was cleaved with the restriction enzyme BglII and treated with alkaline phosphatase (BAP: Takara Shuzo). Restriction enzyme B
After cutting with glII, BAP-treated vector pcDLSRα296
(BglII) 0.03 pmol was ligated with the flag linker 0.03 pmol prepared in Example 5-1) using a DNA Ligation kit. Escherichia coli JM109 was transformed with the reaction solution. Plasmid DNA was prepared from the emerged colonies and the restriction enzyme Kpn
I and the restriction enzyme HindIII, the length of the cut piece is 2.
The desired plasmid pSRα-f, which has 5 kbp and 0.87 kbp, was selected.

【００４０】［実施例６］ プラスミドベクターpSRα-
fへのXbaIサイトの導入 実施例５で構築したpSRα-fプラスミドを「QIAGEN PLAS
MID MINI KIT」により調製した。プラスミドDNA溶液
に、制限酵素KpnIを加え、37℃で1時間保温した。続い
て、TE溶液に溶解した。この反応溶液8μl（0.4μg）
に、「DNA Blunting kit 10 X 緩衝液（宝酒造）」1μl
を加え、75℃で5分間処理した。続いて、T4 DNAポリメ
ラーゼ 1μlを加え、37℃で5分間保温した。直ちに、ボ
ルテックスで激しく撹拌し、氷上に保った。この反応溶
液に、リン酸化 XbaI linker 1μl（宝酒造）（100pmo
l）、「DNA Ligation kit Ver.1」A液60μl、B液12μl
を加え、16℃で8時間以上保温した。続いて、該反応液
を用い、大腸菌JM109コンピテントセルを添付の指示書
に従い形質転換し、選択プレートに塗布した。選択プレ
ートはアンピシリンナトリウム50μg/mlを含むL-Broth
寒天培地を用いた。選択プレートを37℃で一夜保温し、
出現したコロニーを選択、常法に従いプラスミドDNAを
調製した。それらを制限酵素XbaIで切断、アガロースゲ
ル電気泳動を行い、切断が確認された組換えプラスミド
を選択しpSRα-f（XbaI）とした。[Example 6] Plasmid vector pSRα-
Introduction of XbaI site into f The pSRα-f plasmid constructed in Example 5 was designated as "QIAGEN PLAS".
It was prepared by "MID MINI KIT". The restriction enzyme KpnI was added to the plasmid DNA solution, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. Then, it melt | dissolved in TE solution. 8 μl (0.4 μg) of this reaction solution
And 1 μl of “DNA Blunting kit 10 X buffer (Takara Shuzo)”
Was added and treated at 75 ° C. for 5 minutes. Then, 1 μl of T4 DNA polymerase was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Immediately, vortexed vigorously and kept on ice. To this reaction solution, add 1 μl of phosphorylated XbaI linker (Takara Shuzo) (100 pmo
l), "DNA Ligation kit Ver.1" A solution 60 μl, B solution 12 μl
Was added and the mixture was kept at 16 ° C for 8 hours or longer. Subsequently, using the reaction solution, Escherichia coli JM109 competent cells were transformed according to the attached instructions and applied to a selection plate. Selection plate is L-Broth containing ampicillin sodium 50 μg / ml
Agar medium was used. Incubate the selection plate at 37 ° C overnight,
Colonies that appeared were selected and plasmid DNA was prepared according to a conventional method. These were cleaved with a restriction enzyme XbaI and subjected to agarose gel electrophoresis, and a recombinant plasmid whose cleavage was confirmed was selected and designated as pSRα-f (XbaI).

【００４１】［実施例７］ プラスミドベクターpSRα-
f（XbaI）の制限酵素処理 実施例６で構築したpSRα-f(XbaI）プラスミドを常法に
従い大量調製した。プラスミドDNA溶液20μlに、滅菌水
11μl、10 X M 緩衝液4μl、10mg/mlリボヌクレアーゼ
A（和光純薬）1μl、XbaI（東洋紡）4μlを加え、37℃
で1時間保温した。続いて、この反応溶液40μlに、滅菌
水33μl、1mg/ml acetylated BSA（宝酒造）7.5μl、1M
Tris-HCl(pH8.0) 3.5μl、5M NaCl 1.25μl、制限酵素D
raIII（NEW ENGLAND BioLabs社）5μlを加え、37℃で1
時間保温した。続いて、フェノール−クロロホルム処理
を行い、水層にエタチンメイト（和光純薬）3μl、1/10
倍容の3M酢酸ナトリウム、2.5倍容のエタノールを加え
てエタノール沈澱し、沈澱を16μlの滅菌水に溶解し
た。こうして調製したDNA断片溶液に、500 mM Tris-HC
l,pH9.0、10 mM MgCl2を含む反応溶液2μl、及びアルカ
リホスファターゼ（E.coli C75）（宝酒造）2μlを加
え、37℃で30分間保温した。この溶液20μlを1％低融点
アガロースゲル（ＦＭＣ社）電気泳動を行い、3.5KbのD
NA断片を含むアガロースゲル小片を切り出した。そのア
ガロースゲル小片に等量の滅菌水を加え、65℃で10分間
保温しアガロースゲルを融解後、室温まで冷却、フェノ
ール処理、フェノール−クロロホルム処理、クロロホル
ム処理の順で行った。続いて、水層にエタチンメイト3
μl、1/10倍容の3M酢酸ナトリウム、2.5倍容のエタノー
ルを加えてエタノール沈澱し、沈澱を20μlの滅菌水に
溶解した。[Example 7] Plasmid vector pSRα-
Treatment of f (XbaI) with a restriction enzyme The pSRα-f (XbaI) plasmid constructed in Example 6 was prepared in a large amount according to a conventional method. Add 20 μl of plasmid DNA solution to sterile water.
11 μl, 10 μM buffer 4 μl, 10 mg / ml ribonuclease
Add 1 μl of A (Wako Pure Chemicals) and 4 μl of XbaI (Toyobo), 37 ℃
It was kept warm for 1 hour. Then, to 40 μl of this reaction solution, 33 μl of sterilized water, 7.5 μl of 1 mg / ml acetylated BSA (Takara Shuzo), 1M
Tris-HCl (pH8.0) 3.5 μl, 5M NaCl 1.25 μl, restriction enzyme D
Add 5 μl of raIII (NEW ENGLAND BioLabs) and add 1 at 37 ℃.
Incubated for hours. Subsequently, phenol-chloroform treatment was performed, and 3 μl of etatin mate (Wako Pure Chemical Industries) was added to the aqueous layer, 1/10.
Ethanol precipitation was carried out by adding 2 volumes of 3M sodium acetate and 2.5 volumes of ethanol, and the precipitate was dissolved in 16 μl of sterilized water. Add 500 mM Tris-HC to the DNA fragment solution thus prepared.
l, the reaction solution 2 [mu] l containing pH9.0,10 mM MgCl 2, and alkaline phosphatase (E. coli C75) (Takara Shuzo) 2 [mu] l was added and incubated at 37 ° C. 30 min. 20 μl of this solution was electrophoresed on a 1% low melting point agarose gel (FMC) to obtain 3.5 Kb D
A small piece of agarose gel containing the NA fragment was cut out. An equal amount of sterilized water was added to the small pieces of agarose gel, and the agarose gel was thawed by keeping the temperature at 65 ° C for 10 minutes, followed by cooling to room temperature, phenol treatment, phenol-chloroform treatment, and chloroform treatment in this order. Then, Etatine Mate 3 in the water layer
μl, 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol were added to perform ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in 20 μl of sterilized water.

【００４２】［実施例８］ pSRα-c-MPL-ECD-fの構築 実施例４で構築したpCRII-c-MPL-ECDのプラスミドDNAを
常法に従い大量調製した。プラスミドDNA溶液20μlに滅
菌水11μl、10X M 緩衝液4μl、10mg/ml リボヌクレア
ーゼA 1μl、XbaI 4μlを加え、37℃で1時間保温した。
続いて、この反応溶液40μlに、滅菌水33μl、1mg/ml a
cetylated BSA 7.5μl、1M Tris-HCl（pH8.0) 3.5μl、5M
NaCl 1.25μl、制限酵素 DraIII 5μlを加え、37℃で1
時間保温した。続いて、この溶液21μlを1％低融点アガ
ロースゲル電気泳動し、1.5KbのDNA断片を含むアガロー
スゲル小片を切り出した。そのアガロースゲル小片に等
量の滅菌水を加え、65℃で10分間保温し、アガロースゲ
ルを融解後、室温まで冷却、フェノール、フェノール−
クロロホルム、クロロホルムの順で処理した。続いて、
水層にエタチンメイト3μl、 0.1倍容の3Ｍ酢酸ナトリ
ウム、2.5倍容のエタノールを加えてエタノール沈澱
し、沈澱を20μlの滅菌水に溶解した。こうして調製し
たDNA断片溶液5μlに、実施例７で調製したDNA断片溶液
1μl（10 ng）、「DNA Ligation kit Ver.1 」A液36μ
l、B液6μl を加え、16℃で1時間半保温した。続いて、
該反応液にエタチンメイト3μl、 0.1倍容の3Ｍ酢酸ナ
トリウム、2.5倍容のエタノールを加えてエタノール沈
澱し、沈澱を3μlの滅菌水に溶解した。こうして調製し
たプラスミドDNA溶液に、大腸菌MC1061コンピテントセ
ル（10％glycerol）50μlを加えて氷上に1分間静置し
た。 BIO-RAD社ジーンパルサーを用いて遺伝子導入を行
った。大腸菌懸濁液を氷冷したエレクトロポーレーショ
ン用のキュベット（ BIO-RAD社）に入れた。キャパシタ
ンス 25uF、電圧 2.5kV、200Ωの条件でプラスミドDNAを
大腸菌に導入した。続いて、SOC培地500μl中で37℃、4
0分間振盪培養し、選択プレートに塗布した。選択プレ
ートはアンピシリンナトリウムを含むL-Broth寒天培地
を用いた。選択プレートを37℃で一夜保温し、出現した
コロニーを選択、常法に従いプラスミドDNAを調製し
た。それらを制限酵素BglIIで切断、アガロースゲル電
気泳動を行い、0.3Kb、1.3Kb及び3Kbの3つの断片を有す
る組換えプラスミドpSRα-c-MPL-ECD-fを選択した（図
１）。Example 8 Construction of pSRα-c-MPL-ECD-f The plasmid DNA of pCRII-c-MPL-ECD constructed in Example 4 was prepared in a large amount according to a conventional method. To 20 μl of the plasmid DNA solution, 11 μl of sterilized water, 4 μl of 10X M buffer, 1 μl of 10 mg / ml ribonuclease A and 4 μl of XbaI were added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 1 hour.
Then, to 40 μl of this reaction solution, 33 μl of sterilized water, 1 mg / ml a
cetylated BSA 7.5 μl, 1M Tris-HCl (pH8.0) 3.5 μl, 5M
Add 1.25 μl of NaCl and 5 μl of restriction enzyme DraIII, and add 1 at 37 ℃.
Incubated for hours. Subsequently, 21 μl of this solution was electrophoresed on a 1% low-melting point agarose gel to cut out an agarose gel piece containing a 1.5 Kb DNA fragment. Add an equal amount of sterilized water to the agarose gel piece and incubate at 65 ° C for 10 minutes, melt the agarose gel, then cool to room temperature, phenol, phenol-
It processed in order of chloroform and chloroform. continue,
Ethatine mate (3 μl), 0.1 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol were added to the aqueous layer for ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in 20 μl of sterilized water. The DNA fragment solution prepared in Example 7 was added to 5 μl of the DNA fragment solution thus prepared.
1 μl (10 ng), “DNA Ligation kit Ver.1” A solution 36 μ
l and 6 μl of solution B were added, and the mixture was kept at 16 ° C for 1 hour and a half. continue,
Ethetine mate (3 μl), 0.1 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol were added to the reaction solution for ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in 3 μl of sterilized water. To the thus prepared plasmid DNA solution, 50 μl of Escherichia coli MC1061 competent cell (10% glycerol) was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 1 minute. Gene transfer was performed using BIO-RAD Gene Pulser. The Escherichia coli suspension was placed in an ice-cooled electroporation cuvette (BIO-RAD). Plasmid DNA was introduced into Escherichia coli under the conditions of a capacitance of 25 uF, a voltage of 2.5 kV, and 200 Ω. Then, at 37 ℃ in 500 μl SOC medium,
The culture was shaken for 0 minutes and spread on a selection plate. As the selection plate, L-Broth agar medium containing sodium ampicillin was used. The selection plate was kept at 37 ° C. overnight, the colonies that appeared were selected, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method. These were cleaved with restriction enzyme BglII and subjected to agarose gel electrophoresis to select a recombinant plasmid pSRα-c-MPL-ECD-f having three fragments of 0.3 Kb, 1.3 Kb and 3 Kb (FIG. 1).

【００４３】［実施例９］ pSRα-c-MPL-ECD-fへのEco
RIサイトの導入（その１） 実施例８で構築したプラスミドDNA pCRII-c-MPL-ECD-f
を「QIAGEN PLASMID Mini KIT」により調製した。プラ
スミドDNA溶液26μl（10μg）に、滅菌水57μl、10X M
緩衝液10μl、制限酵素XbaI 7μlを加え、37℃で1時間
保温した。続いて、フェノール−クロロホルム処理を行
い、上清に1/10倍容の3M酢酸ナトリウム、2.5倍容のエ
タノールを加えてエタノール沈澱し、沈澱を9μlの滅菌
水に溶解した。こうして調製したDNA断片溶液に、「DNA
Blunting kit 10X 緩衝液（宝酒造）」１μlを加え、7
5℃で5分間処理した。続いて、T4 DNAポリメラーゼ 1μl
を加え、37℃で5分間保温した。直ちに、フェノール−
クロロホルム処理を行い、水層にエタチンメイト3μl、
1/10倍容の3M酢酸ナトリウム、2.5倍容のエタノールを加
えてエタノール沈澱し、沈澱を16μlの滅菌水に溶解し
た。こうして調製したDNA断片溶液に、500mM Tris-HC
l,pH9.0、10mM MgCl2を含む反応溶液2μl、及びアルカリ
ホスファターゼ（E.coli C75）2μlを加え、37℃で30分
間保温した。この溶液20μlを1％低融点アガロースゲル
電気泳動し、5KbのDNA断片を含むアガロースゲル小片を
切り出した。そのアガロースゲル小片に等量の滅菌水を
加え、65℃で10分間加熱し、アガロースゲルを融解後、
室温に冷却、フェノール、フェノール−クロロホルム、
クロロホルムの順で処理した。続いて、水層にエタチン
メイト3μl、1/10倍容の3M酢酸ナトリウム、2.5倍容の
エタノールを加えてエタノール沈澱し、沈澱を10μlの
滅菌水に溶解した。こうして調製したDNA断片溶液1μl
（35 ng）に、EcoRI linker 2μl （7 ng）、「DNA Lig
ation kit Ver.2 I液」3μl（宝酒造）を加え、16℃で1
時間保温した。続いて、該反応液を用い、大腸菌JM109
コンピテントセルを添付の指示書に従い形質転換し、選
択プレートに塗布した。選択プレートはアンピシリンナ
トリウム50μg/mlを含むL-Broth寒天培地を用いた。選
択プレートを37℃で一夜保温し、出現したコロニーを選
択、常法に従いプラスミドDNAを調製した。それらを制
限酵素EcoRIで切断、アガロースゲル電気泳動を行い、
切断が確認された組換えプラスミドpSRα-c-ECD-f(EcoR
I)を選択した。[Example 9] Eco to pSRα-c-MPL-ECD-f
Introduction of RI site (1) Plasmid DNA pCRII-c-MPL-ECD-f constructed in Example 8
Was prepared by "QIAGEN PLASMID Mini KIT". 26 μl (10 μg) of plasmid DNA solution, 57 μl of sterilized water, 10X M
A buffer solution (10 μl) and a restriction enzyme XbaI (7 μl) were added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Subsequently, phenol-chloroform treatment was carried out, and 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol were added to the supernatant for ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in 9 μl of sterilized water. In the DNA fragment solution prepared in this way,
Blunting kit 10X buffer (Takara Shuzo) ”
It was treated at 5 ° C for 5 minutes. Then, 1 μl of T4 DNA polymerase
Was added and the mixture was incubated at 37 ° C for 5 minutes. Immediately, phenol-
Chloroform treatment was performed, and 3 μl of etatin mate was added to the aqueous layer.
Ethanol precipitation was carried out by adding 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol, and the precipitate was dissolved in 16 μl of sterilized water. Add 500 mM Tris-HC to the DNA fragment solution thus prepared.
l, pH 9.0, 2 μl of a reaction solution containing 10 mM MgCl 2, and 2 μl of alkaline phosphatase (E. coli C75) were added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 30 minutes. 20 μl of this solution was electrophoresed on a 1% low melting point agarose gel, and a small piece of agarose gel containing a 5 Kb DNA fragment was cut out. Add an equal amount of sterilized water to the agarose gel piece and heat at 65 ° C for 10 minutes to melt the agarose gel,
Cooled to room temperature, phenol, phenol-chloroform,
It processed in order of chloroform. Subsequently, 3 μl of ethatin mate, 1/10 volume of 3 M sodium acetate, and 2.5 volume of ethanol were added to the aqueous layer for ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in 10 μl of sterilized water. 1 μl of DNA fragment solution prepared in this way
(35 ng), EcoRI linker 2 μl (7 ng), "DNA Lig
ation kit Ver.2 I solution ”3 μl (Takara Shuzo) was added and 1 at 16 ℃
Incubated for hours. Then, using the reaction solution, E. coli JM109
Competent cells were transformed according to the attached instruction and spread on a selection plate. As the selection plate, L-Broth agar medium containing 50 μg / ml of sodium ampicillin was used. The selection plate was kept at 37 ° C. overnight, the colonies that appeared were selected, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method. Cleave them with the restriction enzyme EcoRI, perform agarose gel electrophoresis,
Recombinant plasmid pSRα-c-ECD-f (EcoR
I) was selected.

【００４４】［実施例１０］ pSRα-c-MPL-ECD-f(EcoR
I)へのEcoRIサイトの導入（その２） 実施例９で構築したプラスミドDNAをQIAprep-8 PLASMID
KIT（QIAGEN社）により調製した。プラスミドDNA溶液1
00μlに、滅菌水25.5μl、10X NE 緩衝液 3 15μl、10m
g/ml acetylated BSA（NEW ENGLAND BioLabs社）1.5μ
l、10mg/ml Ribonuclease A 1μl、制限酵素DraIII 7
μlを加え、37℃で一夜保温した。続いて、フェノール
−クロロホルム処理を行い、水層に1/10倍容の3Ｍ酢酸
ナトリウム、2.5倍容のエタノールを加えてエタノール
沈澱し、沈澱を9μlの滅菌水に溶解した。こうして調製
したDNA断片溶液に、「DNA Blunting kit 10X 緩衝液」
1μlを加え、75℃で5分間処理した。続いて、T4 DNAポ
リメラーゼ 1μlを加え、37℃で5分間保温した。直ち
に、フェノール−クロロホルム処理を行い、水層にエタ
チンメイト3μl、1/10倍容の3Ｍ酢酸ナトリウム、2.5倍
容のエタノールを加えてエタノール沈澱し、沈澱を１６
μlの滅菌水に溶解した。こうして調製したDNA断片溶液
に、500mM Tris-HCl（pH9.0）、10mM MgCl2を含む反応
溶液2μl、及びアルカルフォスファターゼ(E.coli C75)
2μlを加え、65℃で30分間処理した。この溶液20μlを1
％低融点アガロースゲル電気泳動し、5KbのDNA断片を含
むアガロースゲル小片を切り出した。そのアガロースゲ
ル小片に等量の滅菌水を加え、６５℃で１０分間加熱
し、アガロースゲルを融解後、室温まで冷却し、フェノ
ール、フェノール−クロロホルム、クロロホルムの順で
処理した。続いて、水層にエタチンメイト3μl、1/10倍
容の3Ｍ酢酸ナトリウム、2.5倍容のエタノールを加えて
エタノール沈澱し、沈澱を7μlの滅菌水に溶解した。こ
うして調製したDNA断片溶液1.5μl（15 ng）に、EcoRI
リンカー 1μl（宝酒造）（0.5 pmol）、「DNA Ligatio
n kit Ver.2」I液2.5μlを加え、16℃で1時間保温し
た。続いて、該反応液を用い大腸菌JM109コンピテント
セルを添付の指示書に従い形質転換し、選択プレートに
塗布した。選択プレートはアンピシリンナトリウム50μ
g/mlを含むL-Broth寒天培地を用いた。選択プレートを3
7℃で一夜保温し、出現したコロニーを選択、常法に従
いプラスミドDNAを調製した。それらを制限酵素EcoRIで
切断、アガロースゲル電気泳動を行い、1.5Kbの挿入断
片を有する組換えプラスミドpSRα-c-MPL-ECD-f(EcoRI,
EcoRI)を選択した。Example 10 pSRα-c-MPL-ECD-f (EcoR
Introduction of EcoRI site into I) (2) The plasmid DNA constructed in Example 9 was treated with QIAprep-8 PLASMID.
It was prepared by KIT (QIAGEN). Plasmid DNA solution 1
To 00 μl, sterile water 25.5 μl, 10X NE buffer 3 15 μl, 10 m
g / ml acetylated BSA (NEW ENGLAND BioLabs) 1.5μ
l, 10mg / ml Ribonuclease A 1μl, restriction enzyme DraIII 7
μl was added and the mixture was kept at 37 ° C. overnight. Subsequently, phenol-chloroform treatment was performed, and 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol were added to the aqueous layer for ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in 9 μl of sterilized water. Add the DNA fragment solution prepared in this way to the "DNA Blunting kit 10X buffer".
1 μl was added and the mixture was treated at 75 ° C. for 5 minutes. Then, 1 μl of T4 DNA polymerase was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Immediately, phenol-chloroform treatment was carried out, and then 3 μl of ethatin mate, 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol were added to the aqueous layer for ethanol precipitation.
Dissolved in μl sterile water. The DNA fragment solution thus prepared, 500mM Tris-HCl (pH9.0) , the reaction solution 2 [mu] l, and Al Cal phosphatase containing 10mM MgCl 2 (E.coli C75)
2 μl was added and treated at 65 ° C. for 30 minutes. 20 μl of this solution
% Low melting point agarose gel electrophoresis was performed, and a small piece of agarose gel containing a 5 Kb DNA fragment was cut out. An equal amount of sterilized water was added to the agarose gel piece and heated at 65 ° C. for 10 minutes, the agarose gel was melted, cooled to room temperature, and treated with phenol, phenol-chloroform, and chloroform in this order. Subsequently, 3 μl of ethatin mate, 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol were added to the aqueous layer for ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in 7 μl of sterilized water. 1.5 μl (15 ng) of the thus prepared DNA fragment solution was added to EcoRI.
Linker 1 μl (Takara Shuzo) (0.5 pmol), “DNA Ligatio
n kit Ver.2 ”solution I (2.5 μl) was added, and the mixture was incubated at 16 ° C. for 1 hour. Subsequently, E. coli JM109 competent cells were transformed using the reaction solution according to the attached instruction manual and applied to a selection plate. Ampicillin sodium 50μ for selection plate
L-Broth agar medium containing g / ml was used. 3 selection plates
Incubation was carried out overnight at 7 ° C, emerged colonies were selected, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method. They were cleaved with restriction enzyme EcoRI and subjected to agarose gel electrophoresis, and recombinant plasmid pSRα-c-MPL-ECD-f (EcoRI,
EcoRI) was selected.

【００４５】［実施例１１］ pSP65-SRα-Tac(3)ベク
ターの制限酵素処理 文献（Michel streuli,EMBO J.8,787(1989)）記載のプ
ラスミドベクターpSV-SP2のプロモーターを文献（Mol.C
ell.Biol.,8,466-472(1988)）記載のプラスミドベクタ
ーpCDLSRα296中のプロモーターSRαに換え、poly Aの
上流にTac構造遺伝子を挿入し、EcoRI部位をつぶし、新
たにマルチクローニング部位を作り、pSP65-SRα-Tac
(3)ベクターとし、「QIAGEN PLASMID MINI KIT」により
調製したpSP65-SRα-Tac(3)ベクターを用いた。プラス
ミドDNA溶液29μlに、滅菌水56.5μl、10X H 緩衝液
（宝酒造）10μl、10mg/ml リボヌクレアーゼA 1μl、E
coRI 3.5μlを加え、37℃で1時間保温した。続いて、フ
ェノール−クロロホルム処理を行い、水層に1/10倍容の
3M酢酸ナトリウム、2.5倍容のエタノールを加えてエタノ
ール沈澱し、沈澱を16μlの滅菌水に溶解した。こうし
て調製したDNA断片溶液に、500mM Tris-HCl,pH9.0、10mM
MgCl2を含む反応溶液2μl、及びアルカリホスファター
ゼ（E.coli C75） 2μlを加え、37℃で30分間保温し
た。この溶液10μlを1％低融点アガロースゲル電気泳動
し、4.3KbのDNA断片を含むアガロースゲル小片を切り出
した。そのアガロースゲル小片に等量の滅菌水を加え、
65℃で10分間加熱し、アガロースゲルを融解後、室温ま
で冷却、フェノール、フェノール−クロロホルム、クロ
ロホルムの順で処理した。続いて、水層に1/10倍容の3
Ｍ酢酸ナトリウム、2.5倍容のエタノールを加えてエタ
ノール沈澱し、沈澱を10μlの滅菌水に溶解した。[Example 11] Treatment of pSP65-SRα-Tac (3) vector with restriction enzyme The promoter of the plasmid vector pSV-SP2 described in the literature (Michel streuli, EMBO J.8,787 (1989)) was used as a reference (Mol.C).
ell.Biol., 8,466-472 (1988)), the promoter SRα in the plasmid vector pCDLSRα296 was replaced with a Tac structural gene upstream of poly A, the EcoRI site was crushed, and a new multicloning site was created to create pSP65. -SRα-Tac
As the vector (3), the pSP65-SRα-Tac (3) vector prepared by “QIAGEN PLASMID MINI KIT” was used. To 29 μl of plasmid DNA solution, 56.5 μl of sterilized water, 10 μl of 10X H buffer (Takara Shuzo), 10 mg / ml ribonuclease A 1 μl, E
3.5 µl of coRI was added, and the mixture was kept at 37 ° C for 1 hour. Then, perform phenol-chloroform treatment and add 1/10 volume of the aqueous layer.
Ethanol was precipitated by adding 3M sodium acetate and 2.5 volumes of ethanol, and the precipitate was dissolved in 16 μl of sterilized water. To the DNA fragment solution thus prepared, 500 mM Tris-HCl, pH 9.0, 10 mM
2 μl of a reaction solution containing MgCl 2 and 2 μl of alkaline phosphatase (E. coli C75) were added, and the mixture was kept at 37 ° C. for 30 minutes. 10 μl of this solution was electrophoresed on a 1% low-melting point agarose gel to cut out a small piece of agarose gel containing a 4.3 Kb DNA fragment. Add an equal amount of sterile water to the agarose gel piece,
After heating at 65 ° C. for 10 minutes, the agarose gel was melted, cooled to room temperature, and treated with phenol, phenol-chloroform, and chloroform in this order. Next, 1/3 volume of 3 in the water layer
Ethanol was precipitated by adding M sodium acetate and 2.5 volumes of ethanol, and the precipitate was dissolved in 10 μl of sterilized water.

【００４６】［実施例１２］ プラスミドDNA pSP65-SR
α-c-MPL-ECD-Tac(3)の構築 実施例１０で構築したプラスミドDNAを「QIAGEN PLASMI
D MINI KIT」により調製した。プラスミドDNA溶液15μl
に、滅菌水70.5μl、10X H 緩衝液10μl、10mg/mlリボ
ヌクレアーゼA 1μl、EcoRI 3.5μlを加え、37℃で1時
間保温した。続いて、フェノール−クロロホルム処理を
行い、水層に1/10倍容の3M酢酸ナトリウム、2.5倍容の
エタノールを加えてエタノール沈澱し、沈澱を20μlの
滅菌水に溶解した。こうして調製した溶液10μlを1％低
融点アガロースゲル電気泳動し、1.5KbのDNA断片を含む
アガロースゲル小片を切り出した。そのアガロースゲル
小片に等量の滅菌水を加え、65℃で10分間加熱し、アガ
ロースゲルを融解後、室温まで冷却、フェノール、フェ
ノール−クロロホルム、クロロホルムの順で処理した。
続いて、水層にエタチンメイト3μl、1/10倍容の3M酢酸
ナトリウム、2.5倍容のエタノールを加えてエタノール沈
澱し、沈澱を6μlの滅菌水に溶解した。こうして調製し
たDNA断片溶液3μl（36 ng）に、実施例１１のDNA断片
溶液1μl（15 ng）、DNA Ligation kit Ver.2 I液4μl
を加え、16℃で1時間保温した。続いて、該反応液を用
い、大腸菌JM109コンピテントセルを添付の指示書に従
い形質転換し、選択プレートに塗布した。選択プレート
はアンピシリンナトリウム50μg/mlを含むL-Broth寒天
培地を用いた。選択プレートを37℃で一夜保温し、出現
したコロニーを選択し、プラスミドDNAを調製した。そ
れらを制限酵素KpnIで切断、アガロースゲル電気泳動を
行い、1.3Kb及び、5.3Kbの2つの断片を有する組換えプ
ラスミドpSP65-SRα-c-MPL-ECD-Tac(3 )を選択した（図
２）。Example 12 Plasmid DNA pSP65-SR
Construction of α-c-MPL-ECD-Tac (3) The plasmid DNA constructed in Example 10 was labeled with "QIAGEN PLASMI.
D MINI KIT ”. 15 μl of plasmid DNA solution
Sterile water (70.5 μl), 10 × H buffer (10 μl), 10 mg / ml ribonuclease A (1 μl) and EcoRI (3.5 μl) were added to the mixture, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Subsequently, phenol-chloroform treatment was performed, and 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol were added to the aqueous layer for ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in 20 μl of sterilized water. 10 μl of the thus prepared solution was electrophoresed on a 1% low melting point agarose gel, and a small piece of agarose gel containing a 1.5 Kb DNA fragment was cut out. An equal amount of sterilized water was added to the agarose gel piece and heated at 65 ° C. for 10 minutes to melt the agarose gel, which was then cooled to room temperature and treated with phenol, phenol-chloroform and chloroform in this order.
Subsequently, 3 μl of ethatin mate, 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol were added to the aqueous layer for ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in 6 μl of sterilized water. To 3 μl (36 ng) of the DNA fragment solution thus prepared, 1 μl (15 ng) of the DNA fragment solution of Example 11 and 4 μl of DNA Ligation kit Ver.2 I solution
Was added and the mixture was kept at 16 ° C for 1 hour. Subsequently, using the reaction solution, Escherichia coli JM109 competent cells were transformed according to the attached instructions and applied to a selection plate. As the selection plate, L-Broth agar medium containing 50 μg / ml of sodium ampicillin was used. The selection plate was incubated overnight at 37 ° C., the emerged colonies were selected, and plasmid DNA was prepared. These were cleaved with restriction enzyme KpnI and subjected to agarose gel electrophoresis to select a recombinant plasmid pSP65-SRα-c-MPL-ECD-Tac (3) having two fragments of 1.3 Kb and 5.3 Kb (Fig. 2). ).

【００４７】［実施例１３］ 形質転換細胞B300-19（M
pl-ECD-Tac）の獲得 １）プラスミドDNA pSP65-SRα-c-MPL-ECD-Tac(3 )の
制限酵素処理 「QIAGEN PLASMID Maxi KIT」により調製したプラスミ
ドDNAを用いた。滅菌水500μlに溶解したプラスミドDNA
のうち250μlに対し、滅菌水600μl、10X SspIbasal 緩
衝液（宝酒造）100μl、SspI（宝酒造）50μlを加え、37
℃で3時間保温した。続いて、フェノール−クロロホル
ム処理を2回行い、水層に1/10倍容の3M酢酸ナトリウ
ム、2.5倍容のエタノールを加えてエタノール沈澱し、
沈澱を100μlのTE溶液に溶解した。[Example 13] Transformed cells B300-19 (M
Acquisition of pl-ECD-Tac) 1) Plasmid DNA pSP65-SRα-c-MPL-ECD-Tac (3) was treated with a restriction enzyme. A plasmid DNA prepared by "QIAGEN PLASMID Maxi KIT" was used. Plasmid DNA dissolved in 500 μl of sterile water
To 250 μl of this, add 600 μl of sterilized water, 100 μl of 10X SspIbasal buffer (Takara Shuzo), 50 μl of SspI (Takara Shuzo), 37
Incubated at ℃ for 3 hours. Subsequently, phenol-chloroform treatment was carried out twice, and 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol were added to the aqueous layer for ethanol precipitation,
The precipitate was dissolved in 100 μl of TE solution.

【００４８】２）プラスミドDNA pSV2neoの調製 「QIAGEN PLASMID Maxi KIT」により調製したプラスミ
ドDNA pSV2neo（CLONTECH社）を用いた。滅菌水500μl
に溶解したプラスミドDNAのうち100μlに、滅菌水675μ
l、10X K 緩衝液（宝酒造）100μl、0.1％BSA（宝酒
造）100μl、制限酵素Pvu I 25μlを加え、37℃で3時間
保温した。続いて、フェノール−クロロホルム処理を2
回行い、水層に1/10倍容の3Ｍ酢酸ナトリウム、2.5倍容
のエタノールを加えてエタノール沈澱し、沈澱を100μl
のTE溶液に溶解した。2) Preparation of plasmid DNA pSV2neo The plasmid DNA pSV2neo (CLONTECH) prepared by "QIAGEN PLASMID Maxi KIT" was used. Sterile water 500 μl
To 100 μl of plasmid DNA dissolved in
l, 10X K buffer (Takara Shuzo) 100 µl, 0.1% BSA (Takara Shuzo) 100 µl, and restriction enzyme Pvu I 25 µl were added and incubated at 37 ° C for 3 hours. Then, apply phenol-chloroform treatment to 2
Repeat 1 times and add 1/10 volume of 3M sodium acetate and 2.5 volume of ethanol to the aqueous layer to precipitate with ethanol.
Dissolved in TE solution.

【００４９】３）B300-19細胞への遺伝子導入 BIO-RAD社ジーンパルサーを用いて遺伝子導入を行っ
た。107個のB300-19細胞［Reth MG,et al. EMBO J 5
(9), 2131(1986)］を10mlの37℃のRPMI Medium 1640（G
IBCO-BRL社）で2回洗浄し、450μl の37℃のRPMI Medi
um 1640に溶解した。こうして調製した細胞溶液を氷冷
したエレクトロポーレーション用のキュベットに入れ
た。続いて、キュベットに50μl（30μg）の実施例13-
1)で調製したプラスミドDNA及び3μgの「実施例１３−
２）」で調製したプラスミドDNAを加え、緩やかに混合
した。5分間氷冷後、キャパシタンス 500uF、電圧 25
0VでプラスミドDNAを細胞に導入した。5分間氷冷後、10
％FCS、50μM 2-メルカプトエタノールを含むRPMI Mediu
m 1640 15mlに希釈した。この細胞懸濁液3mlにFCS（GIB
CO-BRL社）10％、2-メルカプトエタノール 50μMを含
むRPMI Medium 1640 7mlを加え、100ulずつ96穴プレー
トに捲いた。又、残りの細胞懸濁液についても100ulず
つ96穴プレートに捲いた。37℃、5％CO2で20〜24時間培
養後に4mg/mlのG418（GIBCO-BRL社）100μlを加えた。
引き続き、37℃、5％CO2で7〜10日間培養後、出現した
コロニーを選択した。3) Gene transfer into B300-19 cells Gene transfer was carried out using Gene Pulser manufactured by BIO-RAD. 10 7 B300-19 cells [Reth MG, et al. EMBO J 5
(9), 2131 (1986)] of 10 ml of RPMI Medium 1640 (G
IBCO-BRL) and washed 450 times with 37 ℃ RPMI Medi.
It was dissolved in um 1640. The cell solution thus prepared was placed in an ice-cooled electroporation cuvette. Then, in a cuvette, 50 μl (30 μg) of Example 13-
The plasmid DNA prepared in 1) and 3 μg of “Example 13-
2) ”was added to the plasmid DNA and mixed gently. After ice cooling for 5 minutes, capacitance 500uF, voltage 25
Plasmid DNA was introduced into cells at 0V. After ice cooling for 5 minutes, 10
RPMI Mediu with% FCS, 50 μM 2-mercaptoethanol
m 1640 was diluted to 15 ml. FCS (GIB
7 ml of RPMI Medium 1640 containing 10% of 2-mercaptoethanol (50 μM, CO-BRL) was added, and each 100 ul was wound on a 96-well plate. In addition, the remaining cell suspension was also wound in a 96-well plate by 100 ul. After culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 for 20 to 24 hours, 100 μl of 4 mg / ml G418 (GIBCO-BRL) was added.
Subsequently, after culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 for 7 to 10 days, emerging colonies were selected.

【００５０】４）フローサイトメトリーによる細胞表面
上の発現量の検討 実施例１３−３）で獲得した形質転換細胞B300-19（Mpl
-ECD-Tac） 5x105個を培養し、遠心分離（1,200rpm、3
分、4℃）、沈澱した細胞を2％ FCS、0.02％NaN3を含
むPBSで2回洗浄した。続いて、FITC標識マウス抗ヒトTa
cモノクローナル抗体（生化学工業）を100μｌ（終濃度
2μg/ml）加えた。氷中で30分間静置後、遠心分離（2,0
00rpm、2分、4℃）、2％ FCS,0.02％ NaN3を含むPBSで
2回洗浄した。続いて、 「EPICS Profile（コールター
社）」を用いて指示書に従い解析した。その結果、B300
-19（Mpl-ECD-Tac）細胞クローンとして、＃A3、＃2-
2、＃4-3-1の3つの高発現形質転換細胞を獲得した（図
３）。これらのクローンは発現量が異なるだけで基本的
には同一の性状を持った細胞である。クローン＃4-3-1
は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し
た（生命研菌寄第15598号／FERM P-15598）。4) Examination of expression level on cell surface by flow cytometry Transformed cell B300-19 (Mpl obtained in Example 13-3)
-ECD-Tac) Cultivate 5x10 5 cells and centrifuge (1,200 rpm, 3
Min, 4 ° C.) and the precipitated cells were washed twice with PBS containing 2% FCS and 0.02% NaN 3 . Then, FITC-labeled mouse anti-human Ta
c Monoclonal antibody (Seikagaku) 100 μl (final concentration
2 μg / ml) was added. After leaving it on ice for 30 minutes, centrifuge (2,0
00 rpm, 2 minutes, 4 ℃), PBS containing 2% FCS, 0.02% NaN 3
Washed twice. Then, analysis was performed using "EPICS Profile (Coulter)" according to the instructions. As a result, B300
-19 (Mpl-ECD-Tac) cell clones # A3, # 2-
Two, highly transformed cells of # 4-3-1 were obtained (Fig. 3). These clones are basically cells having the same properties but different expression levels. Clone # 4-3-1
Has been deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Biotechnology Research Institute No. 15598 / FERM P-15598).

【００５１】［実施例１４］ 形質転換細胞Ba/F3(c-MP
L-P)の獲得 １）pEF-BOS-Mpl-Pの構築 実施例４で構築したpCRII-c-MPL-PのプラスミドDNAを常
法に従い調製し、制限酵素XbaI及びSpeI(宝酒造）で消
化した。また、pEF-BOS ベクター(Nucleic Acids Resea
rch 18(17),5322(1990))をXbaIで消化した。続いて、pC
RII-c-MPL-Pの溶液を1％低融点アガロースゲル電気泳動
し、1.9KｂのDNA断片を含むアガロースゲル小片を切り
出した。そのアガロースゲル小片を65℃で融解後、室温
まで冷却、フェノール、フェノール−クロロホルム、ク
ロロホルムの順で処理し、水層をエタノール沈澱した。
pEF-BOS ベクターについては、脱リン酸化処理（宝酒
造）した。こうして調製した各々のDNA断片溶液を混合
し、DNA ライゲーションキットを用いて、16℃で1時間
半保温しライゲーションした。続いて、該反応液を用
い、大腸菌JM109コンピテントセルを添付の指示書に従
い形質転換し、選択プレートに塗布した。選択プレート
はアンピシリンナトリウム50μg/mlを含むL-Broth寒天
培地を用いた。選択プレートを37℃で一夜保温し、出現
したコロニーを選択し、常法に従いプラスミドDNAを調
製した。それらを制限酵素XbaI及びAatII（東洋紡）で
切断、アガロースゲル電気泳動を行い、4.7Kbの断片を
有する組換えプラスミドpEF-BOS-c-MPL-Pを構築した
（図４）。Example 14 Transformed cells Ba / F3 (c-MP
Acquisition of LP) 1) Construction of pEF-BOS-Mpl-P The plasmid DNA of pCRII-c-MPL-P constructed in Example 4 was prepared by a conventional method and digested with restriction enzymes XbaI and SpeI (Takara Shuzo). In addition, pEF-BOS vector (Nucleic Acids Resea
rch 18 (17), 5322 (1990)) was digested with XbaI. Then pC
The RII-c-MPL-P solution was electrophoresed on a 1% low melting point agarose gel to cut out an agarose gel piece containing a 1.9 Kb DNA fragment. The small piece of agarose gel was melted at 65 ° C., cooled to room temperature, treated with phenol, phenol-chloroform, and chloroform in this order, and the aqueous layer was precipitated with ethanol.
The pEF-BOS vector was dephosphorylated (Takara Shuzo). The respective DNA fragment solutions thus prepared were mixed and ligated using a DNA ligation kit at a temperature of 16 ° C. for 1 and a half hours. Subsequently, using the reaction solution, Escherichia coli JM109 competent cells were transformed according to the attached instructions and applied to a selection plate. As the selection plate, L-Broth agar medium containing 50 μg / ml of sodium ampicillin was used. The selection plate was incubated overnight at 37 ° C., the emerging colonies were selected, and plasmid DNA was prepared according to a conventional method. These were cleaved with restriction enzymes XbaI and AatII (Toyobo) and subjected to agarose gel electrophoresis to construct a recombinant plasmid pEF-BOS-c-MPL-P having a 4.7 Kb fragment (FIG. 4).

【００５２】２）Ba/F3細胞への遺伝子導入 BIO-RAD社ジーンパルサーの説明書の例に従った。pEF-B
OS-Mpl-Pクローン＃110μg、pSV2bsr（科研製薬）1μg
を導入した。10％FCS、25unit/mlマウスIL3（Genzyme
社）を含むRPMI Medium 1640 30mlに希釈した。この細
胞懸濁液を37℃、5％CO2で培養をし、3日後にブラスト
サイジン（フナコシ社）を10μg/mlになるように添加
し、30日間、ブラストサイジン15μg/mlの条件下で培養
した。2) Gene introduction into Ba / F3 cells The example of the manual of Gene Pulser of BIO-RAD was followed. pEF-B
OS-Mpl-P clone # 110 μg, pSV2bsr (Kaken Pharmaceutical) 1 μg
Was introduced. 10% FCS, 25 unit / ml mouse IL3 (Genzyme
Diluted to 30 ml of RPMI Medium 1640 containing This cell suspension was cultured at 37 ° C and 5% CO 2 , and after 3 days, blasticidin (Funakoshi) was added to 10 μg / ml, and blasticidin was 15 μg / ml for 30 days. Cultured under.

【００５３】［実施例１５］ 細胞の免疫 14週齢のbalb/cマウス（雌2匹）を、実施例１３−４）
で作製した細胞＃A3,＃2-2,＃4-3-1で免疫した。各細胞
について0.5〜1.5x107個を120 X g で5分遠心し、PBSに
再浮遊させ、遠心を3回繰り返して洗浄した後、PBS 0.5
mlに再浮遊した。このように調製した細胞浮遊液を初回
免疫では背部皮下、腹腔内に半分ずつ、2回目以降の免
疫では腹腔内に23Gの注射針を用いて投与した。初回免
疫及び2回目はクローン＃A3、3,4回目は＃A3と＃2-2を等
量混合して、5回目の免疫は＃2-2、6,7,8回目の免疫は＃
4-3-1で行った。なお、これらの細胞は基本的には同一
の細胞であり、＃4-3-1のみでの継続免疫も追って試み
た。[Example 15] Immunization of cells Example 13-4) 14-week-old balb / c mice (two females) were immunized.
Immunization was carried out with cells # A3, # 2-2, # 4-3-1 prepared in 1. Centrifuge 0.5-1.5 x 10 7 cells for 5 minutes at 120 X g, resuspend in PBS, repeat centrifugation 3 times to wash, then PBS 0.5
Resuspended in ml. The cell suspension thus prepared was administered subcutaneously in the back and half in the abdominal cavity for the first immunization, and intraperitoneally for the second and subsequent immunizations using a 23G injection needle. Clone # A3 for the first immunization and # A3 for the 3rd and 4th immunization, and # 2-3 for the 4th immunization, 5th immunization # 2-2, 6,7,8 immunization #
I went to 4-3-1. These cells were basically the same cells, and we also tried continuous immunization with # 4-3-1 only.

【００５４】［実施例１６］ アゴニスト活性の検出 抗体産生は実施例１４で作製したBaF3-c-MPL＃9細胞を
用いて検出した。該細胞は図５に示すようなTPO依存性
を示した。実施例１８で免疫したマウスにつき6回免疫
後7日目に尾部より採血し、常法に則り血清を調製し
た。10 ng/ml TPO （PEPRO TECH社）を添加した10％FCS
添加 RPMI1640培地で9週間継続培養したBaF3-c-MPL＃9
を、TPO非存在下に96ウェルプレート（住友ベークライ
ト）に初期細胞密度2x105細胞/ml、200μl/wellで播種
した。抗血清は120倍からの3倍の希釈系列を作製して添
加した。[Example 16] Detection of agonist activity Antibody production was detected using the BaF3-c-MPL # 9 cells prepared in Example 14. The cells showed TPO dependence as shown in FIG. The mice immunized in Example 18 were bled from the tail 7 days after 6 times of immunization, and serum was prepared according to a conventional method. 10% FCS supplemented with 10 ng / ml TPO (PEPRO TECH)
BaF3-c-MPL # 9 continuously cultured for 9 weeks in supplemented RPMI1640 medium
Were seeded in a 96-well plate (Sumitomo Bakelite) in the absence of TPO at an initial cell density of 2 × 10 5 cells / ml and 200 μl / well. The antiserum was added by making a 3-fold dilution series from 120-fold.

【００５５】抗血清を添加してから5日後に、WST-1/1-m
ethoxy PMS（細胞計測キット，同仁）10μl/ウェルを添
加し、2時間37℃で孵置後の450-650 nmの吸光度を測定
して相対的な細胞数を測定することによって抗血清のBa
F3-c-MPL＃９細胞の増殖に対する影響を調べた。未免疫
のマウスの血清と、血清の入っていない培地のみの陰性
対照群に対し、Mpl-ECD-Tac/B300-19を免疫したマウス
の抗血清は少なくとも5,000倍希釈まで BaF3-c-MPL＃9
の増殖支持活性を示した（図６）。これと同様のTPOア
ゴニスト活性は、＃4-3-1のみで継続免疫したマウスの6
回目免疫後の血清においても認められた。Five days after the addition of antiserum, WST-1 / 1-m
Add 10 μl / well of ethoxy PMS (Cell Counting Kit, Dojin) and measure the relative cell number by measuring the absorbance at 450-650 nm after incubation at 37 ° C for 2 hours to measure the antiserum Ba.
The effect on proliferation of F3-c-MPL # 9 cells was examined. Anti-serum of mice immunized with Mpl-ECD-Tac / B300-19 was diluted to at least 5,000-fold against BaF3-c-MPL # against the negative control group containing only serum-free medium and serum-free medium. 9
Showed a growth-supporting activity (Fig. 6). Similar TPO agonist activity was observed in mice immunized with # 4-3-1 only.
It was also observed in the serum after the second immunization.

【００５６】[0056]

【発明の効果】本発明により、c-MPLリガンドアゴニス
ト活性を有する抗体、その一部分を含み該アゴニスト活
性を有するタンパク質、及び該抗体又はタンパク質を単
離する方法が提供された。本発明の抗体及びタンパク質
は、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、又は悪性腫瘍
の化学療法、放射線療法に伴う血小板減少症、骨髄移植
に伴う汎血球減少症、特に血小板減少症などに対して適
用されることが期待される。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides an antibody having a c-MPL ligand agonist activity, a protein having a part of the antibody having the agonist activity, and a method for isolating the antibody or protein. The antibody and protein of the present invention are effective against aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, or chemotherapy for malignant tumors, thrombocytopenia associated with radiation therapy, pancytopenia associated with bone marrow transplantation, and particularly thrombocytopenia. Expected to be applied.

【００５７】[0057]

【配列表】[Sequence list]

配列番号:1 配列の長さ:38 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列 GGGTCTAGAG TATGGTCCCC TCCTGGGCCC TCTTCATG 38 配列番号:2 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列 GGGCACCTGG TGCCAGGCGG TCTCGGTGGC G 31 配列番号:3 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列 GGGACTAGTT CAAGGCTGCT GCCAATAGC 29 配列番号:4 配列の長さ:69 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成DNA 配列 GATCTGGTAC CTAACACCAG GTGAGGCGTG CCTCGGTAGA CTACAAGGAC GACGATGACA 60 AATGATAAA 69 配列番号:5 配列の長さ:69 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:合成ＤＮＡ 配列 ＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴ ＧＴＧＧＴＣＣＡＣＴ ＣＣＧＣＡＣＧＧＡＧ ＣＣＡ
ＴＣＴＧＡＴＧ ＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣ ＴＡＣＴＧＴＴＴＡＣ ６０ ＴＡＴＴＴＣＴＡＧ
６９SEQ ID NO: 1 Sequence Length: 38 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GGGTCTAGAG TATGGTCCCC TCCTGGGCCC TCTTCATG 38 SEQ ID NO: 2 Sequence Length: 31 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence Type: Synthetic DNA Sequence GGGCACCTGG TGCCAGGCGG TCTCGGTGGC G 31 SEQ ID NO: 3 Sequence Length: 29 Sequence Type: Nucleic Acid Number of Strands: Single Strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA sequence GGGACTAGTT CAAGGCTGCT GCCAATAGC 29 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 69 Sequence type: Nucleic acid Strand number: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA sequence GATCTGGTAC CTAACACCAG GTGAGGCGTG CCTCGGTAGA CTACAAGGAC GACGATGACA 60 AATGATAAA 69 SEQ ID NO: 5 Sequence length: 69 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA sequence ACCATGGTAGTGTGGCCGCGACGCGACCTAGCCCGA
TCTGATG TTCCTGCTGC TACTGTTTTAC 60 TATTTCTAG
69

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】c-MPLの細胞外領域をコードするDNAを組み込ん
だベクターであるpSRα-c-Mpl-ECD-fの構築過程を示す
図である。FIG. 1 is a diagram showing the construction process of pSRα-c-Mpl-ECD-f, which is a vector incorporating a DNA encoding the extracellular region of c-MPL.

【図２】c-MPLの細胞外領域をコードするDNAとTac遺伝
子とのキメラ遺伝子を組み込んだベクターであるpSP65-
SRα-c-Mpl-ECD-Tac(3')の構築過程を示す図である。[Fig. 2] pSP65-, which is a vector incorporating a chimeric gene of Tac gene and DNA encoding the extracellular region of c-MPL.
It is a figure which shows the construction process of SR (alpha) -c-Mpl-ECD-Tac (3 ').

【図３】c-MPLの細胞外領域をコードするDNAとTac遺伝
子とのキメラ遺伝子による形質転換によって獲得した細
胞であるB300ー19（Mpl-ECD-Tac）の細胞表面上における
キメラ遺伝子産物の発現量を示す図である。FIG. 3 shows a chimeric gene product on the cell surface of B300-19 (Mpl-ECD-Tac), which is a cell obtained by transformation of a DNA encoding the extracellular region of c-MPL with a Tac gene. It is a figure which shows an expression level.

【図４】c-MPLリガンド（TPO）依存性のBaF3細胞を得る
ために、BaF3細胞の形質転換用に構築したベクターであ
るpEF-BOS-c-Mpl-Pの構築過程を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing a construction process of pEF-BOS-c-Mpl-P, which is a vector constructed for transformation of BaF3 cells in order to obtain BaF3 cells dependent on c-MPL ligand (TPO). .

【図５】c-MPLリガンド（TPO）依存性のBaF3細胞である
BaF3-cMpl＃9のc-MPLリガンド（TPO）依存性を示す図で
ある。FIG. 5 shows BaF3 cells dependent on c-MPL ligand (TPO).
It is a figure which shows c-MPL ligand (TPO) dependence of BaF3-cMpl # 9.

【図６】抗c-MPL抗体のc-MPLリガンドアゴニスト活性を
示す図である。FIG. 6 shows the c-MPL ligand agonist activity of anti-c-MPL antibody.

フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ Ｃ１２Ｎ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Continuation of front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location C07K 16/18 C12P 21/02 K C12N 5/10 21/08 C12P 21/02 A61K 37/02 21/08 C12N 5/00 B // (C12N 5/10 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91)

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 c-MPLの細胞外ドメイン又はその一部、
及びc-MPL以外の細胞膜貫通型タンパク質又はその一部
を含むキメラタンパク質をコードするＤＮＡ。1. An extracellular domain of c-MPL or a part thereof,
And a DNA encoding a chimeric protein containing a transmembrane protein other than c-MPL or a part thereof. 【請求項２】 c-MPL以外の細胞膜貫通型タンパク質又
はその一部が、Tac由来である請求項１記載のＤＮＡ。2. The DNA according to claim 1, wherein the transmembrane protein other than c-MPL or a part thereof is derived from Tac. 【請求項３】 請求項１又は２記載のDNAを含むベクタ
ー。3. A vector containing the DNA according to claim 1 or 2. 【請求項４】 請求項３記載のベクターを含む細胞。4. A cell containing the vector according to claim 3. 【請求項５】 請求項１又は２記載のＤＮＡがコードす
るタンパク質を表面に有する細胞を動物に免疫する過程
を含む、抗c-MPL抗体又はその一部分を含みc-MPLリガン
ドアゴニスト活性を有するタンパク質の製造方法。5. A protein containing an anti-c-MPL antibody or a part thereof, which has a c-MPL ligand agonist activity, comprising a step of immunizing an animal with cells having the protein encoded by the DNA of claim 1 or 2 on its surface. Manufacturing method. 【請求項６】 請求項５記載の方法により得ることがで
きる、抗c-MPL抗体、又はその一部分を含みc-MPLリガン
ドアゴニスト活性を有するタンパク質。6. A protein comprising the anti-c-MPL antibody, or a part thereof, which has the c-MPL ligand agonist activity and can be obtained by the method according to claim 5. 【請求項７】 c-MPLリガンドアゴニスト活性を有する
抗c-MPL抗体、又はその一部分を含み該アゴニスト活性
を有するタンパク質。7. A protein containing an anti-c-MPL antibody having c-MPL ligand agonist activity, or a part thereof, having the agonist activity. 【請求項８】 請求項６又は７記載の抗体又はタンパク
質を有効成分とする医薬組成物。8. A pharmaceutical composition comprising the antibody or protein according to claim 6 or 7 as an active ingredient.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999010494A3 (en) * 1997-08-25 1999-05-20 Genentech Inc Agonist antibodies to the thrombopoietin receptor, and their therapeutic uses
WO2005107784A1 (en) * 2004-05-11 2005-11-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedy for thrombopenia
US7993642B2 (en) 2003-12-12 2011-08-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-MPL antibodies
US8945543B2 (en) 2005-06-10 2015-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof
US9777066B2 (en) 2005-06-10 2017-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999010494A3 (en) * 1997-08-25 1999-05-20 Genentech Inc Agonist antibodies to the thrombopoietin receptor, and their therapeutic uses
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
US7993642B2 (en) 2003-12-12 2011-08-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-MPL antibodies
US8008073B2 (en) 2003-12-12 2011-08-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-Mpl antibodies
WO2005107784A1 (en) * 2004-05-11 2005-11-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedy for thrombopenia
US8945543B2 (en) 2005-06-10 2015-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof
US9777066B2 (en) 2005-06-10 2017-10-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(Fv)2

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