JPH09275983A - ｐ５３ 標的蛋白質ＧＭＬ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】癌抑制遺伝子p53 の新しい標的蛋白質を提供す
ることにある。 【解決手段】p53 応答配列を含むヒトコスミドクロ−ン
を単離し、p53 に応答する遺伝子の一つのエクソン部を
増幅し、エクソン部を両サイドに増幅などしてcDNA, ジ
ェノミックDNA を決定し、ＧＭＬと命名した。 【効果】癌組織におけるp53 遺伝子の変異は一定してい
ないことから、ＧＭＬ蛋白質またはＤＮＡの発現量を測
定することにより、p53 の機能判定、癌の診断手段とし
て期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】 癌抑制遺伝子ｐ53によって
発現が誘導される新しい遺伝子に関し、医学の分野に属
する。

【０００２】

【従来の技術】ｐ53は腫瘍ウイルスの蛋白質と結合する
細胞内蛋白質として1979年に発見された。1989年に大腸
癌や肺癌で、ｐ53遺伝子の突然変異がみつかり、その後
その変異が乳癌、膀胱癌、脳腫瘍をはじめ多種類の癌で
見つかったことから、癌の発生、進展に関与していると
考えられている。ｐ53の作用機構については長い間不明
であったが、正常型ｐ53を強制発現させると癌細胞の増
殖を抑制する能力があることから、癌抑制遺伝子として
機能すると推測された。

【０００３】このｐ53の生理機能として、細胞周期をＧ
１期での停止作用およびＤＮＡ損傷によるアポトーシス
作用などが知られているがその作用機構については長い
間不明であった。しかし最近、ｐ53が転写因子としての
活性を有することが判明し、ｐ53によって発現が誘導さ
れる遺伝子群が細胞増殖抑制というｐ53の生理機能に直
接かかわっていることが推測された。その後の研究によ
り、ｐ53によって発現が誘導される遺伝子としてｐ21／
ＷＡＦ１、ＭＤＭ２、ＧＡＤＤ45、ＢＡＸ、サイクリン
ＧおよびＩＧＦ−ＢＰ３などが報告された（El-Deiry,
W.S. et al., Cell, 75, 817-825,1993 . Wu, X. et a
l., Genes Dev., 7, 1126-1132,1993 . Kastan, M.B. e
t al., Cell, 71, 587-597,1992. Miyashita, T. & Ree
d, C.R. Cell, 80, 293-299,1995. Okamoto, K. & Beac
h, D. EMBO J., 13, 4816-4822,1994. Buckbinder, L.
et al., Nature, 377, 646-649,1995. ）。これら遺伝
子はプロモーター領域または隣接領域にｐ53結合性配列
を有することが見い出され、それらの発現はｐ53蛋白質
の発現と相関関係を有することが証明された。

【０００４】これまでｐ53標的遺伝子を同定するため
に、正常型ｐ53が欠損した癌細胞に正常型ｐ53を導入し
強制発現させて、発現量が増加しているｃＤＮＡをサブ
トラクション（消去）法でのスクリーニングやディフェ
レンシャルディスプレイ（differential display、分別
増幅）法によるスクリーニング法が用いられてきた。こ
れらの方法は比較的大量に発現される遺伝子については
同定は可能であるが、微量に発現する遺伝子や臓器特異
性を有する遺伝子の同定は困難である。

【０００５】分子生物学の進展に伴い、癌の原因は細胞
増殖制御などに関与する複数の遺伝子の変異が単一の体
細胞に段階的に蓄積することであると考えられるに至っ
ている。癌抑制遺伝子ｐ53の新規な標的遺伝子を解明
し、癌化機構の解明および医学への応用が待望されてい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ｐ53の新しい標的遺伝
子を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決しようとするための手段】これまでに酵母
（Saccharomyces cerevisiae）を用いるスクリーニング
法により、ｐ53によって転写が促進されるヒトゲノム配
列（ｐ53応答配列）が多数同定された（Tokino, T. et
al., Hum. Mol. Genet., 3, 1537-1542, 1994 ）。これ
らの配列のほとんどはｐ53結合部位のコンセンサス配列
である２コピーの5'-PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy-3'が存
在していた（El-Deiry, W.S. et al., NatureGenet.,
1, 45-49, 1992）。

【０００８】そこで本発明者らは、ｐ53応答配列を含有
し、ｐ53依存性に発現される遺伝子を同定することを目
的として、ｐ53応答配列をプローブとしてヒトコスミド
ライブラリーを鋭意スクリーニングし、陽性クロ−ンを
単離し、エクソン部を増幅、構造解析の結果、ｐ53の新
しい標的遺伝子を同定することに成功し本発明を完成す
るに至った。本発明のＤＮＡから演繹されるアミノ酸配
列はデータベースでの相同性検索の結果、グリコシルホ
スファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー分子（Br
akenhoff, R.H. et al., J. Cell Biol., 129, 1677-16
89, 1995）と顕著な類似性を有していたことからＧＭＬ
（GPI anchor molecular like protein）蛋白質と命名
した。

【０００９】すなわち本発明は、配列番号１に記載のア
ミノ酸配列の全部または一部を含む蛋白質およびそれを
コードするＤＮＡ。該ＤＮＡ含有ベクター、形質転換
体、該蛋白質の製造方法、該ＤＮＡに由来するＤＮＡプ
ローブ、プライマー、該遺伝子の解析方法、該蛋白質に
結合する抗体に関する。ＧＭＬ蛋白質のアミノ酸配列の
うち、１もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしく
は置換されたアミノ酸配列の全部または一部を含むも
の、およびそれをコードするＤＮＡも本発明に含まれ
る。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明者らは酵母でのｐ53の転写
活性化能を指標にして、ヒトゲノムＤＮＡからｐ53の応
答配列を単離した（Tokino, J. et al., Human Mol. Ge
net., 3, 1537-1542, 1994）。すなわち、ヒトゲノムＤ
ＮＡを制限酵素ＭｂｏＩで処理して得られたＤＮＡ断片
をＨＩＳ３レポータープラスミドｐＢＭ947 の上流に組
み込んだレポーターライブラリーを作製し、ヒトｐ53を
発現するプラスミドを保有する酵母にレポータープラス
ミドを導入し、Ｈｉｓ栄養要求性を指標にして1000クロ
ーンを単離した。このうち約1/4 のクローンがｐ53依存
性に転写を促進するコンセンサス配列を有していること
を報告した。

【００１１】これらクローンより、制限酵素によりｐ53
応答配列を切り取り構造解析したものの中から、配列番
号３に記載のコンセンサス配列を有するp53 応答配列を
標識しプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼー
ション法（Gene, 10, 63, 1980）によりヒトゲノムコス
ミドライブラリー（Tokino, T. et al., Am. J. Hum.Ge
net., 48, 258-268, 1991）をスクリーニングし、該プ
ローブとハイブリダイズするコスミドクローンを取得す
ることができる。このようにして得たコスミドクローン
を適当なプラスミドベクターにサブクローニングし、塩
基配列を決定することにより当ｐ53応答遺伝子のゲノム
塩基配列が決定できる。

【００１２】またこのようにして得たコスミドクローン
を制限酵素、例えばBam HIおよびBgl IIで消化し、得ら
れたＤＮＡ断片をｐＳＰＬ３などのトラッピングベクタ
ーに挿入し、エクソントラッピング法によりエクソン部
分を増幅させ、エクソン配列を単離・構造解析、さらに
GenBank などのパブリックデ−タベ−スに対する相同性
検索によりエクソン配列を得ることができる。次いでこ
のエクソン配列をヒト組織、例えば精巣から調製したpo
ly(A) ＲＮＡを鋳型にして、５’−, ３’−ＲＡＣＥ法
により該エクソンの両サイドを延長させ目的とするｃＤ
ＮＡを取得することができる。これらｃＤＮＡとジェノ
ミッククローンの構造決定された塩基配列を比較するこ
とによって、イントロン−エクソン結合部が解析され
る。

【００１３】塩基配列の構造はマキサム・ギルバート法
（Maxam, A.M. and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A., 74, 560, 1977 ）あるいはジデオキシ法
（Messing, J et al., Nucl. Acids Res., 9, 309, 198
1 ）によって決められる。ＧＭＬ蛋白質組換え発現ベク
ターおよびその形質転換体の作製は、上記記載の方法に
より得られたＧＭＬｃＤＮＡを適切なベクターに組み込
み、該ベクターを適切な宿主細胞に移入することにより
形質転換体を得ることができる。これを常法により培養
し培養物よりＧＭＬ蛋白質を大量に生産することができ
る。

【００１４】ＧＭＬ蛋白質をコードするｃＤＮＡをＧＭ
Ｌ蛋白質の発現に適したベクターのプロモーター下流に
制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法により再
結合して組換発現ベクターを作成することができる。使
用できるべクターとしては、大腸菌由来のプラスミドｐ
ＢＲ322 、ｐＵＣ18、枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ11
0 、酵母由来のプラスミドｐＲＢ15、バクテリオファー
ジλgt10、λgt11あるいはＳＶ40などが挙げられるが、
宿主内で複製、増幅可能なベクターであれば特に限定さ
れない。プロモーターおよびターミネーターに関しても
ＧＭＬ蛋白質をコードする塩基配列の発現に用いられる
宿主に対応したものであれば特に限定されず、宿主に応
じて適切な組み合わせも可能である。

【００１５】ＧＭＬ蛋白質をコードするｃＤＮＡはＧＭ
Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れでもよく、ま
た化学合成によって合成されたものでもよい。さらに発
現される蛋白質がＧＭＬ蛋白質の生理活性を有するもの
ならば、配列番号２記載の塩基配列に限定されるもので
はなく、アミノ酸配列の一部が付加、欠失もしくは置換
された、実質的に同等な蛋白質をコ−ドするＤＮＡであ
ってもよい。

【００１６】このようにして得られた組換え発現ベクタ
ーはコンビテント細胞法（J. Mol.Biol., 53, 154, 197
0）、プロトプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
75, 1929, 1978）、リン酸カルシウム法（Science, 22
1, 551, 1983 ）、インビトロパッケージング法（Porc.
Natl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975 ）、ウイルス
ベクター法（Cell, 37, 1053, 1984）などにより宿主に
導入し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸
菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞および動物細胞などが用い
られ、得られた形質転換体はその宿主に応じた適切な培
地中で培養される。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜８の
範囲で行われ、必要に応じて通気、攪拌が行われる。培
養物からのＧＭＬ蛋白質の分離・精製は公知の分離・精
製法を適宜組み合わせて実施すれば良い。これらの公知
の方法としては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲル炉過法、電
気泳動法、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティ
クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィな
どが挙げられる。このようにして得られたＧＭＬ蛋白質
は細胞内にマイクロインジェクション法により注入する
ことにより該細胞の増殖を抑制する活性を示すことが期
待される。

【００１７】組織または細胞でのＧＭＬ遺伝子の発現の
有無は組織または細胞から得られるｍＲＮＡまたは総Ｒ
ＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法にて解析することにより検討する
ことができる。例えば、検体試料からグアジニンチオシ
アネート法（Chirgwin, J.M.et al., Biochemistry, 1
8, 5294, 1979 ）などに基づいてＲＮＡを抽出する。必
要に応じて得られた総ＲＮＡをさらにオリゴ（ｄＴ）セ
ルロースカラムを用いるクロマトグラフィーによって精
製することによりｍＲＮＡを調製することができる。得
られたＲＮＡを鋳型とし、オリゴ（ｄＴ）またはランダ
ムヘキサデオキシヌクレオチドをプライマーとして、逆
転写酵素により単鎖ｃＤＮＡを合成する。 この単鎖ｃ
ＤＮＡを鋳型として、ＧＭＬのｃＤＮＡより適切なプラ
イマーを選択し、ＰＣＲを行いＰＣＲ産物の量を測定す
ればよい。

【００１８】ｍＲＮＡ量を測定する場合は、抽出したｍ
ＲＮＡをゲル上、電気泳動後、メンブレンに転写し標識
したＧＭＬＤＮＡプロ−ブとハイブリダイズさせるノー
ザンブロット分析することでも測定することができる。
エクソントラッピング法はBuckler らの方法に準ずれば
よい（Buckler, A.J.et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88, 4005-4009, 1991 ）。例えば、ヒトコスミド
ＤＮＡをBam HIおよびBgl IIの制限酵素を用いて完全に
切断し、スプライシングベクターｐＳＰＬ１のBam HI部
位にクローニングした後、大腸菌ＤＨ５αにトランスフ
ォームしてから、プラスミドＤＮＡを回収し、Cos ７細
胞へエレクトロポレーションによりトランスフェクショ
ン（形質転換）を行う。ついで約48時間後にCos ７細胞
より細胞質ＲＮＡを調製し、ベクターのＤＮＡ配列を基
に設計されたプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、
さらに内側のプライマーにより２nd−ＰＣＲを行うこと
により、未知のエクソンの増幅を行うことができる。得
られたエクソン部分はpBluescript IIなどのベクターに
クローニングし、塩基配列を決定することにより目的と
するエクソンを取得できる。 ＲＡＣＥ法はｍＲＮＡを
鋳型として、ｃＤＮＡの配列既知の部分の５’側を増幅
する５’−ＲＡＣＥと３’側を増幅する３’−ＲＡＣＥ
があるがFrohman らの方法により行うことができる（Fr
ohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
5, 8998-9002, 1988 ）。

【００１９】抗体の作成は、ＧＭＬ蛋白質を抗原とし
て、常法に従い例えばマウス、モルモット、ウサギ等の
動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し十分
に免疫した後、斯かる動物から採血、血清分離し抗ＧＭ
Ｌポリクロ−ナル抗体を作製することができる。なお、
市販のアジュバントも使用できる。モノクローナル抗体
は公知の方法により作製しえる。たとえば、ＧＭＬ蛋白
質で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウスミエローマ
細胞との細胞融合により得られるハイブリドーマを作成
後、該ハイブリドーマ培養上清、または該ハイブリドー
マ投与マウス腹水から抗ＧＭＬモノクローナル抗体を調
製することができる。抗原とするＧＭＬ蛋白質は全アミ
ノ酸構造を有する必要はなく、部分構造を有するペプチ
ドや他のペプチドとの融合蛋白質であってもよく、調製
法は生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。これ
ら抗体はヒト生体試料中のＧＭＬ蛋白質の同定や定量を
可能とし癌診断試薬などへの使用が期待される。ＧＭＬ
蛋白質の免疫学的測定法は、公知の方法に準ずればよ
く、たとえば蛍光抗体法、受身凝集反応法、酵素抗体法
などいずれの方法においても実施できる。

【００２０】以上の方法はすでに公知の方法により実施
することが可能である。

【００２１】

【実施例】以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。 実施例１．ゲノムＤＮＡからのエクソン配列のクローニ
ングおよび塩基配列の解析。 ｐ53応答配列（Tokino, T. et al., Hum. Mol. Genet.,
3, 1537-1542, 1994）を含むＤＮＡ断片（配列番号
３）を放射ラベルし、ヒトゲノムＤＮＡコスミドライブ
ラリーを常法によりコロニーハイブリダイゼーション法
でスクリーニングしてコスミドクローンｃ169 を得た。
このクローンのＤＮＡをBam HIとBgl IIで切断し、エク
ソントラップベクターｐＳＰＬ３（Gibco-BRL 社）に挿
入してエクソントラッピングを行い、一つのエクソン配
列を単離した。

【００２２】得られたエクソン配列をＢＬＡＳＴアルゴ
リズムを用いるホモロジー検索によって公開データベー
スの配列と比較したところ、GPI-anchored proteinの一
つ、Ｅ48（Brakenhoff, R.H. et al., J. Cell Biol.,
129, 1677-1689, 1995）とそのアミノ酸配列が顕著なホ
モロジーを示した。そこでこの新しい遺伝子をＧＭＬ
（GPI-anchored molecule-like protein）と命名した。
本発明のＧＭＬ蛋白質は、ＢＬＡＳＴＡプログラムによ
る解析から、ＧＰＩアンカーを有する膜蛋白質であるＥ
48抗原とホモロジーを有することが確認された。

【００２３】ＤＮＡシークエンシングは二本鎖ＤＮＡを
鋳型とし、AmpliTaqＦＳ ＤＮＡポリメラーゼを用いた
サイクルシークエンシングキット（dye-terminator使
用、Perkin Elmer社）を用いＡＢＩ377 型ＤＮＡシーク
エンサー（Applied Biosystems社）によっておこなっ
た。ＤＮＡ配列の確認はSequenase Version 2.0 （Unit
edStates Biochemical 社）を用いた³⁵Ｓ−ラベルによ
るマニュアルシークエンシングにより行った。

【００２４】実施例２．ＧＭＬ遺伝子の構造 実施例１によって得られたエクソン部をFromanらのＲＡ
ＣＥ法により両側へ延長させた。５’−および３’−Ｒ
ＡＣＥは精巣のpoly(A) ＲＮＡ（Clontech社）を用い、
Clontech社のキットによって行った。さらにコスミドク
ローンｃ169 に含まれている全ゲノムＤＮＡ配列を決定
し、コンピュータープログラムを用いてエクソンの可能
性のある配列を検索した。ＧＲＡＩＬによる検索と５’
−ＲＡＣＥ、３’−ＲＡＣＥによる検討を組み合わせる
ことにより、722bp よりなるほぼ全長の転写産物（Nort
hern blot 解析では転写産物のサイズはポリシグナルを
含めて0.9 kbと見積られている）を決定した。最初のＡ
ＴＧコドンは塩基番号90位に存在し、終止コドンは塩基
番号564 位に存在した（配列番号２）。474bp のＯＲＦ
（翻訳領域）より17kdの翻訳産物がコードされる。ゲノ
ムＤＮＡ配列決定により、機能をもつｐ53結合部位はコ
ーディング配列より19kb上流に位置することが明らかに
なった。ＧＭＬ蛋白質の保有するシステイン残基の11個
中10個までがこれらＧＰＩアンカーを有する蛋白質のフ
ァミリーに保存されていた。ＧＭＬ遺伝子は染色体上8q
24.3-q terにマップされ、Ｅ48およびＧＭＬを含むＧＰ
Ｉアンカーを有するタンパクファミリーの遺伝子がこの
領域に集まっている可能性が示された。

【００２５】実施例３．ＧＭＬ遺伝子（ｍＲＮＡ）の野
生型ｐ53による発現誘導の確認 ＧＭＬが野生型ｐ53によって誘導されるか否かを確認す
るため、野生型もしくは変異型ｐ53遺伝子を発現する細
胞株を作製し、その細胞より総ＲＮＡを抽出してＲＴ−
ＰＣＲによる解析を行った。大腸癌細胞株ＳＷ480 は片
方のｐ53のアレルが変異型（273 Arg to His）であり、
もう一方のアレルが欠失しており、この株の増殖は野生
型ｐ53を発現するベクターを導入することにより抑制さ
れることが知られている。

【００２６】そこで、まず、このＳＷ480 に野生型もし
くは変異型（Kern, S. et al., Science, 256, 827-83
0, 1992）ｐ53の発現ベクターをトランスフェクトし
た。１×10⁶ 個の細胞を25cm² のフラスコにまき24時間
培養した後、25μg のリポフェクチンと５μg のプラス
ミドＤＮＡを用いてトランスフェクションを行った。こ
れら細胞からTRizol試薬（Gibco-BRL 社）を用いて総Ｒ
ＮＡを抽出し、DNase Ｉ（Boeringer Mannheim社）で消
化してから、Superscript II（Gibco-BRL 社）を用いて
ｃＤＮＡを合成しＰＣＲの鋳型として用いた。ＰＣＲ反
応は200ng の総ＲＮＡから生成されたｃＤＮＡを12.5μ
l の反応液中に加えて、94℃、２分の変性の後、94℃、
30秒、55〜60℃、30秒、72℃、１分を25ないし35サイク
ルくり返して行った。ＰＣＲ増幅産物は３％のNuSieve
GTG ２：１アガロースゲルによる電気泳動によって分析
した。使用したプライマーの配列は配列番号４および５
に記載した。これらはセンスコ−ド73-93 位、アンチセ
ンスコ−ド247-268 位に相当する。この際、p53 標的遺
伝子p21/WAF1の発現量も測定し、プライマ−は配列番号
６および７を使用した。対照遺伝子として、GAPDH の発
現量を測定し、配列番号８および９をプライマ−として
使用した。

【００２７】その結果、図１に示す如く、ＧＭＬのｍＲ
ＮＡは、p21/WAF1と同様に野生型ｐ53発現ベクターでト
ランスフェクトした細胞でより強く発現していた。 実施例４．正常組織および食道癌細胞株におけるＧＭＬ
ｍＲＮＡの発現。 種々のヒト組織のpoly(A) ＲＮＡのノーザンブロット膜
（Clontech社）を使用し、³²Ｐで標識したヒトＧＭＬｃ
ＤＮＡ（配列番号２記載の73-673位ＤＮＡ、601bp ）を
プローブとして用いてハイブリダイゼーションを行っ
た。ハイブリダイゼーションはClontech社の指示通りに
行い、洗浄は 0.1×ＳＳＣ、 0.1％ＳＤＳで50℃、20分
行った。食道癌細胞株の総ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析は
実施例３に記載の方法で行った。ＰＣＲ反応は少なくと
も２回行い結果を確認した。ＲＮＡの完全性はすべての
検体に同様なシグナルを示す陽性対照のＧＡＰＤＨ遺伝
子の転写産物の増幅により確認した。このためのＧＡＰ
ＤＨ遺伝子のＰＣＲプライマーは配列番号８および９に
示した。

【００２８】測定の結果、16種の正常組織からのｍＲＮ
ＡのNorthern blot 解析からおよそ0.9 kbのＧＭＬｍＲ
ＮＡが精巣に発現していることが明らかになった。つい
で食道癌細胞株のパネル（Nishihira, T. et al., J. C
ancer Res. Clin. Oncol., 119, 441-449, 1993 ）を用
いてＲＴ−ＰＣＲ解析法により11種の細胞株におけるＧ
ＭＬの発現を検討した。その結果、図２に示されるごと
く11株のうち４株にＧＭＬｍＲＮＡが発現しており、さ
らに１株に弱く発現していた。

【００２９】実施例５．抗癌剤感受性とＧＭＬ発現の相
関。 ＧＭＬを発現しているか否かによって抗癌剤に対する耐
性がどう変化するか検討した。使用する食道癌細胞株は
薬剤添加24時間前に 100mmディシュ当り１×10 ⁶ 個の細
胞をプレーティングしておく。ブレオマイシンを24時間
添加したのち４日後の細胞の生存率を測定した。各々の
ポイントは少なくとも３回の独立した実験から得た平均
値を示し、すべての値は同時に行った対応する非処理・
コントロールに対しての相対的生存率として表示した。
なお、使用した食道癌細胞株の性質を表１に示した。そ
の結果、図３に示す如く、ＧＭＬを発現している５種の
食道癌細胞株はブレオマイシンに対し感受性を示した。
一方ＲＴ−ＰＣＲでＧＭＬ遺伝子の発現が認められなか
った６種の細胞株は同様のブレオマイシン処理に対し比
較的耐性であった。なお、CDDPに対しても同様の結果を
示した（図３）。

【００３０】この如く、ＧＭＬの発現と薬剤感受性、耐
性が食道癌細胞株において明らかな相関性を示したこと
は、ＧＭＬがｐ53によって誘発されるアポトーシスの経
路に重要な役割を果していることが示唆された。

【００３１】

【表１】

【００３２】実施例６ 形質転換体の作製 ＧＭＬ蛋白質（配列番号１）をコードするＤＮＡ（配列
番号２）を基質として、プライマーＧＭＬ−ＡとＧＭＬ
−Ｂを用いて、ＭＤＣ蛋白質の一部をコードするＤＮＡ
断片をＰＣＲで増幅する。用いたプライマーの配列は以
下の通りである。 ＧＭＬ−Ａ ５’-CACAGATCTGTGAAGTGATGCTCCTCT- ３’
( コーディング鎖、配列番号２の塩基番号 82-99に相
当) ＧＭＬ−Ｂ ５’-AACAAGCTTCATGGCAATATATTGCT-３’(
アンチセンス鎖、配列番号２の塩基番号 548-566に相
当、下線は終止コドンを示す) ベクター構築用に、プライマーの５’端にはそれぞれ B
gl II 、Hind III の切断部位配列を付加してある。

【００３３】ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動
によって分取し、 Bgl II と HindIII で切断した。こ
うして得られたＧＭＬ蛋白質の一部をコードするＤＮＡ
断片を、予め BamH I と Hind III で切断しておいた p
MAL-c2 (New England Biolabs 社製) ベクターに結合し
てプラスミド pMAL-GML を構築する。同様に、予め Bam
H I と Hind III で切断しておいた pQE-13 (Diagen 社
製)ベクターに結合してプラスミド pH6-GMLを構築す
る。

【００３４】pMAL-c2 ベクターに組み込んだ断片は、
Ｎ末端側にマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）を有する融
合蛋白質として発現されるので、その融合蛋白質はアミ
ロースカラムによってアフィニティー精製する。また、
pQE-13 ベクターに組み込んだ断片は、Ｎ末端側に６個
のヒスチジン残基よりなるペプチド（His ６）を有する
融合蛋白質として発現されるので、その融合蛋白質は金
属キレートカラムによってアフィニティー精製する。

【００３５】各プラスミド pMAL-GML および pH6-GMLを
用いて E.coli JM109 をトランスフォームし、アンピシ
リン耐性で選択してそれぞれの形質転換体を得る。 実施例７ 組換えＭＤＣ蛋白質の発現と精製 実施例６で得られたそれぞれの形質転換体を培養し、培
養物より組換えＭＤＣ融合蛋白質を抽出、精製する。

【００３６】すなわち、各形質転換体を 100ml のＬＢ
培地 (1%ポリペプトン、 0.5% 酵母抽出物, 1%NaCl) で
37 ℃ 一夜振とう培養する。培養液を予め 37 ℃ に
加温したＬＢ培地で１０倍に希釈し、さらに３０分〜９
０分培養して、対数増殖期の培養物を得る。培養物１リ
ッタ−にＩＰＴＧ（ Isopropyl-beta-D-thiogalactopyr
anoside ）を終濃度１ｍＭとなるように添加して３〜４
時間培養した。培養物から遠心分離により菌体を集め
る。

【００３７】プラスミド pMAL-GML による形質転換体の
場合は、菌体に１０ｍｌのカラムバッファー（20mM Tri
s-HCl pH7.4, 200mM NaCl）を加え超音波によって破砕
する。組換えＧＭＬ融合蛋白質は、破砕液の不溶性画分
に存在するので、これを遠心分離して変性バッファー
（8M 尿素、 20mM Tris-HCl pH8.5, 10mM ジチオスラ
イト−ル）に溶解する。次いで、これをカラムバッファ
ーに透析後、遠心分離して上清可溶画分を集める。透析
不溶性画分は、さらに変性、透析、遠心分離を繰返して
上清可溶画分を回収する。集めた可溶性画分をアミロー
スカラム (New England Biolabs 社製) にかけ、カラム
バッファーで洗浄後、１０ｍＭマルトースを含むカラム
バッファーで溶出する。溶出画分は、２８０ｎｍの吸光
度およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（クマシ
ーブルー染色）で解析して分画する。この結果、プラス
ミド pMAL-GML による形質転換体のそれぞれで、期待さ
れる分子量のＧＭＬ融合蛋白質が主要バンドとして検出
される画分が得られる。これらの融合蛋白質を以下、そ
れぞれ MBP-GMLと称する。

【００３８】同様に、プラスミド pH6-GMLによる形質転
換体の場合は、菌体に１０ｍｌのソニケーションバッフ
ァー（10mM リン 酸ナトリウム pH8.0, 200mM NaCl）を加え超
音波によって破砕する。組換えＧＭＬ融合蛋白質は、破
砕液の不溶性画分に存在するので、これを遠心分離して
バッファーＡ（6M塩酸ク゛アニシ゛ン, 100mM NaH₂PO₄, 10mMTr
is-HCl, pH8.0 ) に溶解し、遠心分離して上清可溶画分
を集め、Ｎｉ−ＮＴＡカラム (Diagen社製) にかけ、バ
ッファーＡ、次いでバッファーＢ（8M尿素, 100mM NaH₂
PO₄, 10mMTris-HCl, pH8.0 )で洗浄後、バッファーＣ
（8M尿素, 100mMNaH₂PO₄, 10mMTris-HCl, pH6.3 )、バ
ッファーＤ（8M尿素, 100mM NaH₂PO₄, 10mMTris-HCl, p
H5.9 )、バッファーＥ（8M尿素, 100mM NaH₂PO₄, 10mMT
ris-HCl, pH4.5 )およびバッファーＦ（6M塩酸ク゛アニシ゛ン,
200ｍＭ酢酸) で段階的に溶出する。溶出画分は、２８
０ｎｍの吸光度およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳
動法（クマシーブルー染色）で解析して分画する。この
結果、バッファーＦによる溶出液に、期待される約３４
Ｋｄの His６融合蛋白質が単一バンドとして検出される
画分が得らる。この融合蛋白質を以下、His ６-GMLと称
する。

【００３９】実施例８ モノクローナル抗体およびウサ
ギポリクローナル抗体の作製 実施例７で得られる２種の組換え融合蛋白質、His ６-G
ML、 MBP-GMLを、それぞれ、免疫抗原、抗体精製・スク
リーニング用抗原、測定用標準抗原として用いる。抗Ｇ
ＭＬ蛋白特異的モノクローナル抗体は、His ６-GMLをマ
ウスに免疫して作製する。すなわち、His ６-GMLの３Ｍ
尿素／ＰＢＳ溶液（５００−１０００ｕｇ／ｍｌ）を完
全アジュバントと１：１の割合で混合しマウスの腹腔内
に１００ｕｇ／匹にて２週間隔で４〜６回免疫を行な
う。免疫終了後、Ｐ３Ｕ１細胞とＢ細胞とのハイブリド
ーマをＰＥＧ１５００を用いて作製し、培養上清中の抗
体価をモニターし、抗ＧＭＬ蛋白特異的抗体を産生する
ハイブリドーマの選択を行う。抗体価の測定は、実施例
７で得た MBP-GML融合蛋白質を固相化（５ｕｇ／ｍｌ）
したポリスチレン製カップに培養上清１００ｕｌを加え
第一反応を行い、洗浄後、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ho
rse-raddish peroxidase）を加え第二反応を行なう。洗
浄後、酵素基質溶液（過酸化水素水およびＡＢＴＳ
（２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾチアゾ
リン−６−スルホン酸）混合液）を添加し、発色反応
（第三反応）を行いモニターする。

【００４０】ハイブリドーマを９６ウエルマルチプレー
トにて培養し、ＨＡＴ選択を行い、約２週間後に培養上
清中の抗体価を測定し抗原と特異的に反応するクローン
を選択する。更に、クローニング操作を行い、各ハイブ
リドーマ細胞３００万個を、予め約１週間前に０.5ml
のプリスタンを腹腔内に投与しておいた BALB/c マウス
の腹腔内に接種し、８〜１０日後に腹水を採取する。各
腹水よりプロテインＧカラムによるアフィニティークロ
マトグラフィーで抗体を精製する。

【００４１】同様に、実施例７で得られた His６-GMLを
免疫抗原として、ウサギに免疫し、抗ＧＭＬ蛋白ポリク
ローナル抗体を作製する。すなわち、マウスと同様、 H
is６-GMLの３Ｍ尿素／ＰＢＳ溶液（５００−１０００ｕ
ｇ／ｍｌ）を完全アジュバントと１：１の割合で混合し
免疫を行なう。免疫終了後、抗血清を得、実施例７で得
た MBP-GML融合蛋白質を固相化したポリスチレン製カッ
プを用いて、抗体価を測定する。抗血清を適宜希釈し、
その１００ｕｌをウエルに添加し、抗体価をヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ−ＨＲＰを用いて検討する。さらに、この抗血
清を、プロテインＧカラムおよび MBP-MDC(dC1) 融合蛋
白質を固相化したセファロースカラムによるアフィニテ
ィークロマトグラフィーで精製する。

【００４２】このようにして得られる精製モノクローナ
ル抗体および精製ウサギポリクローナル抗体を用いたＥ
ＬＩＳＡ法によるＧＭＬ蛋白質の定量法を確立する。す
なわち、ハイブリドーマ由来の精製モノクローナル抗体
を９６ウエルプレートに固相化し、ＢＳＡ（Bovine ser
um albumin）でブロッキング後、精製 MBP-GML溶液を被
検液として、0.156 〜5.00 ug/ml の範囲で 100 ul ／
ウエルずつ添加して室温１時間反応させる。ウエルを洗
浄後、精製ウサギポリクローナル抗体溶液（5ug/ml）を
100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させる。
ウエルを洗浄後、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（5ug/ml）を
100 ul ／ウエルずつ添加して室温１時間反応させる。
反応終了後２ｍＭアジ化ナトリウムを 100 ul ／ウエル
ずつ添加し、405nm と 490nm の吸光値を測定する。

【００４３】

【発明の効果】P53 遺伝子の変異は癌のおよそ50％に認
められ、その変移の検出は癌の発生、診断、治療などに
極めて重要な意義を有する。しかしながら癌組織でのP5
3 遺伝子の変異部位は一定しておらず、幾種類もの変異
が見いだされているため、p53 遺伝子の変移を検出・同
定するには多大の労力と時間を要した。それ故にP53 の
変異を測定する代わりに本発明の新しい標的たんぱく質
ＧＭＬ遺伝子の発現または蛋白質自体を測定することに
よって、P53 の変異、機能失活を判定することが可能と
なり、癌の診断手段として期待される。また、ＧＭＬ遺
伝子を癌病巣部に発現させる遺伝子治療への応用、P53
機能に依存せずにＧＭＬを発現させる薬剤のスクリ−ニ
ング法への応用、逆にＧＭＬの発現を抑制する医薬、ア
ンチセンス医薬への応用など期待される。

【００４４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１５８ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 トポロジ−：直鎖状 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリ−名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリ− 配列 Met Leu Leu Phe Ala Leu Leu Leu Ala Met Glu Leu Pro Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Ser Ala Thr Met Arg Ala Gln Trp Thr Tyr Ser Leu Arg Cys His 20 25 30 Asp Cys Ala Val Ile Asn Asp Phe Asn Cys Pro Asn Ile Arg Val Cys 35 40 45 Pro Tyr His Ile Arg Arg Cys Met Thr Ile Ser Ile Arg Ile Asn Ser 50 55 60 Arg Glu Leu Leu Val Tyr Lys Asn Cys Thr Asn Asn Cys Thr Phe Val 65 70 75 80 Tyr Ala Ala Glu Gln Pro Pro Glu Ala Pro Gly Lys Ile Phe Lys Thr 85 90 95 Asn Ser Phe Tyr Trp Val Cys Cys Cys Asn Ser Met Val Cys Asn Ala 100 105 110 Gly Gly Pro Thr Asn Leu Glu Arg Asp Met Leu Pro Asp Glu Val Thr 115 120 125 Glu Glu Glu Leu Pro Glu Gly Thr Val Arg Leu Gly Val Ser Lys Leu 130 135 140 Leu Leu Ser Phe Ala Ser Ile Ile Val Ser Asn Ile Leu Pro 145 150 155

【００４５】配列番号：２ 配列の長さ：７２２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリ−名：ヒトＤＮＡコスミドライブラリ− 配列 GTCGGCGCGG GAGGCTCAAA TGGCTGGAGG CGGCGGGCAC GCACACTGCG GGCTCCGAGG 60 GGCACAGGTC CAGGCTCCTG CGTGAAGTG ATG CTC CTC TTT GCC TTA CTC CTA 113 Met Leu Leu Phe Ala Leu Leu Leu 1 5 GCC ATG GAG CTC CCA TTG GTG GCA GCC AGT GCC ACC ATG CGC GCT CAG 161 Ala Met Glu Leu Pro Leu Val Ala Ala Ser Ala Thr Met Arg Ala Gln 10 15 20 TGG ACT TAC AGT TTG AGA TGC CAT GAC TGT GCG GTC ATA AAT GAC TTC 209 Trp Thr Tyr Ser Leu Arg Cys His Asp Cys Ala Val Ile Asn Asp Phe 25 30 35 40 AAC TGT CCC AAC ATT AGA GTA TGT CCG TAT CAT ATT AGG CGC TGT ATG 257 Asn Cys Pro Asn Ile Arg Val Cys Pro Tyr His Ile Arg Arg Cys Met 45 50 55 ACA ATC TCC ATT CGC ATA AAT TCT CGT GAA CTA CTT GTT TAT AAG AAC 305 Thr Ile Ser Ile Arg Ile Asn Ser Arg Glu Leu Leu Val Tyr Lys Asn 60 65 70 TGT ACA AAC AAC TGC ACA TTT GTA TAT GCA GCT GAA CAG CCT CCT GAA 353 Cys Thr Asn Asn Cys Thr Phe Val Tyr Ala Ala Glu Gln Pro Pro Glu 75 80 85 GCC CCA GGA AAA ATC TTC AAA ACT AAT AGC TTC TAC TGG GTT TGT TGT 401 Ala Pro Gly Lys Ile Phe Lys Thr Asn Ser Phe Tyr Trp Val Cys Cys 90 95 100 TGT AAT AGC ATG GTT TGC AAT GCA GGA GGA CCT ACT AAT CTT GAA AGG 449 Cys Asn Ser Met Val Cys Asn Ala Gly Gly Pro Thr Asn Leu Glu Arg 105 110 115 120 GAC ATG TTA CCC GAT GAA GTA ACT GAG GAG GAG CTT CCA GAA GGA ACT 497 Asp Met Leu Pro Asp Glu Val Thr Glu Glu Glu Leu Pro Glu Gly Thr 125 130 135 GTG AGG CTG GGG GTA TCA AAA CTG TTG CTG AGT TTT GCC TCT ATC ATA 545 Val Arg Leu Gly Val Ser Lys Leu Leu Leu Ser Phe Ala Ser Ile Ile 140 145 150 GTC AGC AAT ATA TTG CCA TGAGGACCCC ACCTTGGAGG GTCTGACCAT 593 Val Ser Asn Ile Leu Pro 155 CTTCACCTGT TCCGCAGAGA AATGTTGCTC TCCATTATTC CCTTCTAAGC CAGAGACCCT 653 TATCCACTGC TCCTCTAGGT GGCCCATTTA TGGTTTGTTG TAAGAGAAAA ATTAAAAAAA 713 TATTGTTTA 722

【００４６】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ATGCTTGCCC AGGCATGTCC AGGCTGGTCC

【００４７】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GGCTCCTGCG TGAAGTGATG C

【００４８】配列番号：５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 ATGGAGATTG TCATACAGCG CC

【００４９】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GTTCCTTGTG GAGCCGGAGC

【００５０】配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GGTACAAGAC AGTAGCAGGT C

【００５１】配列番号：８ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 CAACTACATG GTTTACATGT TC

【００５２】配列番号：９ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列 GCCAGTGGAC TCCACGAC

【００５３】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＷ480 細胞株におけるp53 によるＧＭＬ遺伝
子の発現。Ｗ：野生型p53 、Ｍ：変異型p53

【図２】食道癌細胞株におけるＧＭＬ遺伝子の発現。
Ｗ：野生型p53 、Ｍ：変異型p53

【図３】食道癌細胞株における、抗癌剤（Bleomycinn,C
DDP)感受性とＧＭＬ発現の相関。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 21/08 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む蛋
   白質をコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】配列番号２に記載のＤＮＡである、請求項
   １に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１
   もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換さ
   れたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】請求項１、２または３に記載のＤＮＡを含
   有するベクター。
5. 【請求項５】請求項４に記載のベクターを保持する形質
   転換体。
6. 【請求項６】配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む蛋
   白質。
7. 【請求項７】配列番号１に記載のアミノ酸配列の１もし
   くは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換された
   アミノ酸配列を含む蛋白質。
8. 【請求項８】請求項５に記載の形質転換体を培養し、発
   現産物を回収することを含む、請求項６または７に記載
   の蛋白質の製造方法。
9. 【請求項９】配列番号２に記載の塩基配列の全部または
   一部、またはその相補配列を含む１本鎖ＤＮＡからなる
   ＤＮＡプローブ。
10. 【請求項１０】配列番号２に記載の塩基配列の一部また
    はその相補配列を含む１本鎖ＤＮＡからなるＤＮＡプラ
    イマー。
11. 【請求項１１】請求項６に記載の蛋白質と結合するポリ
    クローナル抗体またはモノクローナル抗体
12. 【請求項１２】請求項９または１０に記載のプローブま
    たはプライマーを用いることを特徴とする請求項２に記
    載のＤＮＡの解析方法。