JPH09252794A - ポリ−γ−グルタミン酸の単離法 - Google Patents
ポリ−γ−グルタミン酸の単離法Info
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- JPH09252794A JPH09252794A JP6437796A JP6437796A JPH09252794A JP H09252794 A JPH09252794 A JP H09252794A JP 6437796 A JP6437796 A JP 6437796A JP 6437796 A JP6437796 A JP 6437796A JP H09252794 A JPH09252794 A JP H09252794A
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Abstract
溶液より、ポリ−γ−グルタミン酸を単離する方法とし
て、従来行なわれていたアルコール沈殿法、塩析法によ
らずに分離膜を用いて効率よくポリ−γ−グルタミン酸
を分離、取得し得る方法を提供する。 【解決手段】 菌体を含むポリ−γ−グルタミン酸の水
溶液に、無機酸を添加し、pHを1.5〜3.5とした
後、精密ろ過膜を用いて菌体を除去し、次いでその透過
液を限外ろ過膜を用いて透析処理することを特徴として
構成されている。
Description
薬等の分野において機能性高分子として有用な高純度の
ポリ−γ−グルタミン酸(以下、単に「γ−PGA」と
略記する)を、γ−PGA醗酵液から効率よく単離する
方法に関する。
よって産生されることはよく知られており、一般に数万
から数百万の分子量を有している。蓄積量の増大に伴な
い培養後の培養液は粘稠性の帯びたものとなり、γ−P
GAの単離操作を困難ならしめる要因となっている。
くは銅塩として沈澱する方法〔M.Bovarnick
:J. Biol. Chem.,145, 415(194
2)〕,アルコール沈殿法〔藤井久雄;農化, 37, 4
07(1963)〕,塩類による析出法(永井利影;特
公昭52−8872号公報)等が知られている。
量のアルコール・塩類を必要とすること、回分処理であ
り又、生成するγ−PGAが粘着性物質のため、器壁等
に付着しやすく、スケール上の制約が生じること、更に
又、微量のアルコール成分や無機物がγ−PGAポリマ
ー中に取り込まれ、これらの混入のないγ−PGAを得
ることは難しい等、工業的規模での実施には必ずしも適
した方法とは言えない。
Aを単離しようとする試みも行われている。例えば、特
開平1−174397号公報には、先ず、遠心分離また
は微細孔を有するフィルターろ過により菌体を除去し、
3〜4倍量のエタノールなどを添加してγ−PGAを沈
殿させ、そして沈殿物を水に溶解させ、不溶物を除去
し、低分子物を透析、限外ろ過などにより除去し、有機
溶媒による再沈殿を繰り返してγ−PGAを単離する方
法が開示されている。又、特開平7−135991号公
報によれば、共存する糖質の(固定した微生物あるいは
酸素による)除去、エタノールによるγ−PGAの沈殿
分離、透析あるいは分離膜による低分子物質の除去、分
離γ−PGAの凍結乾燥を含む方法が提案されている。
公報及び同7−135991号公報記載の方法でも、や
はりエタノール添加によるγ−PGAの沈殿分離工程を
経由するものであり、前述したようにアルコール沈殿の
場合には乾燥してもγ−PGAからアルコールを完全に
除去することは困難であったり、菌体分離は遠心分離で
行うことができたが、菌体含有液の高い粘度のため、分
離膜による菌体分離は困難であった。
法のようにアルコール沈澱や塩析法によらずに、分離膜
による効率的なγ−PGAの単離法を提供することにあ
る。
解決すべく鋭意検討した結果、発酵液の如く、菌体や培
地栄養成分の夾雑物を含有するγ−PGA水溶液のpH
を酸性にすると、該水溶液の粘度が300センチポイズ
(cp)以下になり、精密濾過膜処理が可能になること
を見出した。また、アルコール沈殿法などの沈殿法を用
いなくても、精密濾過膜を用いる除菌工程及び限外濾過
膜を用いる透析処理工程からなる2段階の膜処理のみに
よって、高純度のγ−PGAを高収率で分離取得し得る
ことも見出した。本発明は、これらの知見に基づいてな
されたものである。
Aの水溶液に無機酸を添加し、pHを1.5〜3.5と
した後、精密濾過膜を用いて菌体を除去し、次いで得ら
れた透過液を限外濾過膜を用いて透析処理することを特
徴とするγ−PGAの単離法である。
しては、公知の方法により微生物例えばバチルス・ズブ
チルスに属する納豆菌を培養して得られるγ−PGA含
有発酵液が挙げられる。該γ−PGA含有発酵液に無機
酸、例えば塩酸、硫酸等を添加し、pHを3.5以下、
好ましくは1.5〜3.5、特に好ましくは2.0〜
2.5に調整する。溶液の粘度が一般に約300cp以
下、特に200cp以下になるように添加するのが好ま
しい。
いて除菌する。この際、菌体以外に菌体由来の蛋白質、
糖類等の凝集沈殿物も同時に除去される。他方、酸性条
件下で溶存するγ−PGAは無機塩類、単糖、オリゴ糖
等の低分子化合物と共に膜を透過する。精密ろ過膜の材
質は耐酸性のものであればよく、例えばテフロン、ポリ
スルホン、ポリ塩化ビニル、ポリイミド、ポリアミド、
ポリカーボネート等が好適なものとして挙げられる。ま
た、セラミック膜等の無機材質からなら精密濾過膜も使
用に好適である。精密ろ過膜の膜孔径は一般的に0.0
1〜0.5μm、特に0.05〜0.2μmであるのが
好ましい。具体例を商品名で示せばグレースジャパン
(株)製 H15MP01−43、旭化成工業(株)製 P
SP−013等が挙げられる。膜の形状は平膜状、管
状、スパイラル状、中空子状等のいずれの形状であって
もよい。装置は通常の膜分離装置を用い、循環液の温度
は10〜60℃、好ましくは30〜50℃にコントロー
ルし、圧力は特に制限はないが透過速度を上げるために
膜が耐えられるかぎりの圧をかけ膜分離を行う。循環液
量が少量になったところで純水を加え、透過液のホール
ド分を流し出す。次いで、透過液について限外ろ過膜を
用いて透析処理を行なう。
ポリマー膜であればよく、例えば、ポリアミド、ポリス
ルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ四フッ化エチレ
ン、ポリエーテルサルホン等が用いられる。具体例を商
品名で示せば、ダイセル化学工業(株)製 FUS−30
81、グレースジャパン(株)製 H15P30−43、
日東電工(株)製 NTU−3250 C3R等が挙げられ
る。膜の形状としては、平膜状、管状、スパイラル状、
中空子状等のいずれの形状であってもよい。使用する限
外ろ過膜の分画分子量は一般的に2,000〜200,
000、好ましくは3,000〜40,000である。
装置は通常の膜分離装置を用い、循環液の温度は10〜
60℃、好ましくは30〜50℃にコントロールし、圧
力は特に制限はないが透過速度を上げるために膜が耐え
られるかぎりの圧をかけ膜分離を行う。透過液量と同量
の純水を循環液に加え、循環液量が常に等量になるよう
コントロールする。透過液の電導度をチェックし、10
mS/cmより低くなったところで膜分離を中止する。
無機塩類や単糖類、オリゴ糖等の低分子化合物は膜を透
過するが、他方、γ−PGAは膜を透過しないで濃縮さ
れて濃縮液として得られる。得られた濃縮液は、充分高
純度であり、エタノール沈殿等の沈殿精製方法を用いる
ことなく、そのまま乾燥することにより、固体化された
高純度のγ−PGAを得ることができる。乾燥法として
は、凍結乾燥法、噴霧乾燥法等が適用される。
する。 参考例:γ−PGAの製造 市販の納豆より分離した納豆菌を、3Lのミニジャーを
用いて、麦芽エキス0.3%、酵母エキス0.3%、ポ
リペプトン0.5%、グルコース1.0%からなる培養
液(pH6.0)で32℃、24時間シード培養した。
次に500Lのジャーを用いて、グルコース7.5%、
硫安1.5%、硫酸マグネシウム7水和物0.035
%、硫酸マンガン0.005%、リン酸水素カリウム
0.15%、グルタミン酸モノナトリウム塩5.0%、
塩化ナトリウム1.0%からなる培養液(pH6.4)
にシード培養後の培養液を0.5%接種し、37℃、4
8時間メイン培養した。培養後の培養液についてGPC
法によりγ−PGAの含量を測定したところ、0.80
g/dlであった。
調整した。精密ろ過膜を内蔵したMFモジュールとして
旭化成工業(株)製 module PSP−013
(孔径0.1μm、膜面積0.017m2、モジュール材質
はポリスルホン、スパイラルタイプ)を用い、温度30
℃、圧力1.0Kgf/cm2、循環線速0.12m/
secの条件で菌体分離を行った。循環液量が100m
lになったところで水600mlを加え、再度膜分離を
行い、循環液が100ml、透過液が700mlとなっ
たところで膜処理を終了した。培養液のγ−PGAの9
4%が透過液側に移行した。この透過液を今度は旭化成
工業(株)製 UF module SIP−0013(分子
量分画6000、膜面積0.017m2)を用い、透過液
量と同量の水を循環液側に加えつつ、温度30℃、圧力
1.0Kgf/cm2、循環線速0.11m/secの条
件で膜処理を行った。差し水量が600mlになったと
ころで差し水を終了し、循環液を濃縮した。循環液量が
65mlになったところで膜処理を終了した。この濃縮
液には培養液のγ−PGAの91%が含まれていた。得
られた濃縮液を凍結乾燥することにより総収率87%で
固体化したγ−PGAを1.4g得た。このγ−PGA
中にはカルシウム0.04%、糖0.45%、リン0.
03%含まれていた。
白を変成させた後、塩酸でpH3に調整し、旭化成工業
(株)製 module MICROZAPV−313
(孔径0.1μm、膜面積2.9m2)を用い、温度4
0〜50℃、圧力1.0〜1.2Kg/cm2、循環線
速1.2m/secの条件で菌体分離を行った。次にこ
の透過液を日東電工(株)製 UF module NTU
−3000C3RX(分子量分画20,000、膜面積
3.9m2)を用い、温度40〜50℃・圧力1.0〜
1.2Kg/cm2、循環線速1.1m/secの条件で
透析処理を行った後、循環液を180Lまで濃縮した。
得られた濃縮液を凍結乾燥することにより総収率85%
で固体化したγ−PGAを6.8Kg得た。
調整し、遠心分離機により菌体を分離した後、得られた
菌体分離液を3倍量のエタノール中に滴下した。生成し
た沈殿をろ過し粗γ−PGAを得た。これを200ml
の水に溶解させ、旭化成工業(株)製 UF module
SIP−0013(分子量分画6000、膜面積0.0
17m2)を用い、透過液量と同量の水を循環液側に加
えつつ、温度30℃、圧力1.0Kgf/cm2、循環線
速0.11m/secの条件で膜処理を行なった。差し
水量が600mlになったところで差し水を終了し、循
環液を濃縮した。循環液量が65mlになったところで
膜処理を終了した。次に、循環液を3倍量のエタノール
中に滴下し、精製した沈殿をろ過し、棚段乾燥機で減圧
乾燥することにより、総収率57%でγ−PGAを0.
91g得た。このγ−PGA中にカルシューム0.10
%、糖0.40%、リン0.10%が含まれており、ま
た2%の残存エタノールも確認された。
り、菌体を含むγ−PGAの水溶液のpHを酸性にする
ことで精密ろ過膜による菌体分離を可能にすることがで
きるようになり、結果として精密ろ過膜処理と限外ろ過
膜処理の2段階の膜処理のみによって高純度のγ−PG
Aを高収率に得ることができる。また、本発明の分離膜
によるγ−PGAの単離法は、全ての工程を水媒体で処
理することにより、従来行われていたアルコール沈殿や
塩析工程での煩雑な粘性固体の分離工程を省略し、効率
的でスケールアップが容易であるという利点がある。ま
た単離のために必要な副原料は無機酸のみであり、しか
もアルコール等の可燃性有機溶剤は不必要であることか
ら、防災設備の面でも有利である上に、得られるγ−P
GA中にアルコールが残存することもない。本法では、
精製のために膜設備のみで良いため、単離コスト面でも
効果的な方法であるといえる。
Claims (3)
- 【請求項1】 菌体を含むポリ−γ−グルタミン酸の水
溶液に無機酸を添加し、pHを1.5〜3.5とした
後、精密濾過膜を用いて菌体を除去し、次いで得られた
透過液を限外濾過膜を用いて透析処理することを特徴と
するポリ−γ−グルタミン酸の単離法。 - 【請求項2】 限外濾過膜を用いて透析処理して得られ
た濃縮液をそのまま凍結乾燥または噴霧乾燥することを
特徴とする請求項1に記載のポリ−γ−グルタミン酸の
単離法。 - 【請求項3】 精密濾過膜の膜孔径が0.05〜0.2
μmであり、限外濾過膜の分子量分画が3,000〜4
0、000であることを特徴とする請求項1または請求
項2に記載のポリ−γ−グルタミン酸の単離法。
Priority Applications (1)
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JP6437796A JP3759229B2 (ja) | 1996-03-21 | 1996-03-21 | ポリ−γ−グルタミン酸の単離法 |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
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Family
ID=13256559
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JP6437796A Expired - Lifetime JP3759229B2 (ja) | 1996-03-21 | 1996-03-21 | ポリ−γ−グルタミン酸の単離法 |
Country Status (1)
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006034235A (ja) * | 2004-07-29 | 2006-02-09 | Fukuoka Prefecture Shoyu Jozo Kyodo Kumiai | 高分子化合物を生産する微生物の培養装置及び培養方法 |
WO2007105790A1 (ja) * | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | アミノ酸の精製方法 |
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CN107267411B (zh) * | 2017-05-22 | 2020-06-02 | 广西大学 | 一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型产生菌及其发酵方法 |
-
1996
- 1996-03-21 JP JP6437796A patent/JP3759229B2/ja not_active Expired - Lifetime
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WO2007105790A1 (ja) * | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | アミノ酸の精製方法 |
US7750183B2 (en) | 2006-03-15 | 2010-07-06 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Methods for purifying amino acids |
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