JPH09252786A - プロトン−ａｔｐアーゼ遺伝子 - Google Patents
プロトン−ａｔｐアーゼ遺伝子Info
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- JPH09252786A JPH09252786A JP8124124A JP12412496A JPH09252786A JP H09252786 A JPH09252786 A JP H09252786A JP 8124124 A JP8124124 A JP 8124124A JP 12412496 A JP12412496 A JP 12412496A JP H09252786 A JPH09252786 A JP H09252786A
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- Japan
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- cdna
- atpase
- proton
- cell membrane
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 イデユコゴメ（Cyanidium caldarium）
からｍＲＮＡを分離し、これをｃＤＮＡに変換し、細胞
膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡを得
る。 【効果】 本酵素の大量生産が可能となり、また、本遺
伝子の導入により耐酸性の形質転換植物の作出が可能と
なる。
からｍＲＮＡを分離し、これをｃＤＮＡに変換し、細胞
膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡを得
る。 【効果】 本酵素の大量生産が可能となり、また、本遺
伝子の導入により耐酸性の形質転換植物の作出が可能と
なる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、好酸性の紅藻イデ
ユコゴメの細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコードする
遺伝子に関する。更に詳細には、本発明は、イデユコゴ
メが強酸性環境下でも生育できる主要なしくみの一つで
あるプロトンポンプの本体である細胞膜プロトン−ＡＴ
ＰアーゼをコードするｃＤＮＡ及び、該酵素に関するも
のである。
ユコゴメの細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコードする
遺伝子に関する。更に詳細には、本発明は、イデユコゴ
メが強酸性環境下でも生育できる主要なしくみの一つで
あるプロトンポンプの本体である細胞膜プロトン−ＡＴ
ＰアーゼをコードするｃＤＮＡ及び、該酵素に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】酸性温泉に生息する紅藻イデユコゴメ
（Cyanidium caldarium）は、ｐＨ２で最もよく増殖
し、ｐＨ０でも生育できる単細胞（直径２〜５μｍ、球
状）の真核藻である。イデユコゴメが極限酸性環境下で
も生育できる主要なしくみの一つは、強力なプロトンポ
ンプによって細胞内に流入してきたプロトン（Ｈ+）を
細胞外にくみだし、細胞内を常に中性ｐＨに維持するこ
とができることである。
（Cyanidium caldarium）は、ｐＨ２で最もよく増殖
し、ｐＨ０でも生育できる単細胞（直径２〜５μｍ、球
状）の真核藻である。イデユコゴメが極限酸性環境下で
も生育できる主要なしくみの一つは、強力なプロトンポ
ンプによって細胞内に流入してきたプロトン（Ｈ+）を
細胞外にくみだし、細胞内を常に中性ｐＨに維持するこ
とができることである。
【０００３】プロトンポンプの本体は、細胞膜に存在す
るプロトン−ＡＴＰアーゼ（Ｈ+輸送性ＡＴＰアーゼ：
Ｐｒｏｔｏｎ−Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ＡＴＰａ
ｓｅ）である。真核細胞のプロトン−ＡＴＰアーゼは、
細胞膜に存在するＰ−ＡＴＰａｓｅ、ミトコンドリアや
クロロプラストの内膜などに存在するＦ−ＡＴＰａｓ
ｅ、液泡やリソソームなどの膜に存在するＶ−ＡＴＰａ
ｓｅ、の３種類に分類される。イデユコゴメのプロトン
−ＡＴＰアーゼは、Ｐ−ＡＴＰａｓｅに分類され、ＡＴ
Ｐを消費して、プロトン（Ｈ+）の能動輸送を行う蛋白
質であるが、その詳細な性質は明らかではない。Ｐ−Ａ
ＴＰａｓｅは、膜貫通部分と親水性の頭から成り、その
サブユニットの分子量は約１００，０００である。
るプロトン−ＡＴＰアーゼ（Ｈ+輸送性ＡＴＰアーゼ：
Ｐｒｏｔｏｎ−Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ＡＴＰａ
ｓｅ）である。真核細胞のプロトン−ＡＴＰアーゼは、
細胞膜に存在するＰ−ＡＴＰａｓｅ、ミトコンドリアや
クロロプラストの内膜などに存在するＦ−ＡＴＰａｓ
ｅ、液泡やリソソームなどの膜に存在するＶ−ＡＴＰａ
ｓｅ、の３種類に分類される。イデユコゴメのプロトン
−ＡＴＰアーゼは、Ｐ−ＡＴＰａｓｅに分類され、ＡＴ
Ｐを消費して、プロトン（Ｈ+）の能動輸送を行う蛋白
質であるが、その詳細な性質は明らかではない。Ｐ−Ａ
ＴＰａｓｅは、膜貫通部分と親水性の頭から成り、その
サブユニットの分子量は約１００，０００である。
【０００４】しかしながら、イデユコゴメのプロトン−
ＡＴＰアーゼについては、そのアミノ酸配列も明らかに
されていないし、それをコードする遺伝子のクローニン
グに成功した例も報告されていない。
ＡＴＰアーゼについては、そのアミノ酸配列も明らかに
されていないし、それをコードする遺伝子のクローニン
グに成功した例も報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】プロトンポンプである
プロトン−ＡＴＰアーゼの生理作用を研究するために
は、本酵素の大量生産が必要であり、そのためにはプロ
トン−ＡＴＰアーゼ遺伝子のクローニングが必要であ
る。また、プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子の導入によっ
て耐酸性の形質転換植物の作出が可能である。そして更
に、消化性潰瘍に有効なプロトンポンプインヒビターの
開発も可能である。
プロトン−ＡＴＰアーゼの生理作用を研究するために
は、本酵素の大量生産が必要であり、そのためにはプロ
トン−ＡＴＰアーゼ遺伝子のクローニングが必要であ
る。また、プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子の導入によっ
て耐酸性の形質転換植物の作出が可能である。そして更
に、消化性潰瘍に有効なプロトンポンプインヒビターの
開発も可能である。
【０００６】このような有用性に鑑み、本発明は、プロ
トン−ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子のクローニング
及び同酵素の構造解明を目的としてなされたものであ
る。
トン−ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子のクローニング
及び同酵素の構造解明を目的としてなされたものであ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、本発明者らは各方
面から検討した結果、既知の細胞膜プロトン−ＡＴＰア
ーゼのアミノ酸配列における共通配列をもとにして作製
したＤＮＡプローブを用いて、イデユコゴメのプロトン
−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡをクローン化する
ことに成功した。そして更に、ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列を解析することによって、イデユコゴメのプロトン
−ＡＴＰアーゼのアミノ酸配列を明らかにするのに成功
し、ついに本発明の完成に至った。以下、本発明につい
て詳述する。
成するためになされたものであって、本発明者らは各方
面から検討した結果、既知の細胞膜プロトン−ＡＴＰア
ーゼのアミノ酸配列における共通配列をもとにして作製
したＤＮＡプローブを用いて、イデユコゴメのプロトン
−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡをクローン化する
ことに成功した。そして更に、ｃＤＮＡのヌクレオチド
配列を解析することによって、イデユコゴメのプロトン
−ＡＴＰアーゼのアミノ酸配列を明らかにするのに成功
し、ついに本発明の完成に至った。以下、本発明につい
て詳述する。
【０００８】本発明にしたがって好酸性の紅藻イデユコ
ゴメの細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤ
ＮＡのクローニングを行うには、常法にしたがってイデ
ユコゴメのｍＲＮＡを抽出した後、このｍＲＮＡからリ
バーストランスクリプターゼ反応によりｃＤＮＡを合成
し、このｃＤＮＡをλファージベクターに組み込み、ｃ
ＤＮＡライブラリーを作成する。
ゴメの細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤ
ＮＡのクローニングを行うには、常法にしたがってイデ
ユコゴメのｍＲＮＡを抽出した後、このｍＲＮＡからリ
バーストランスクリプターゼ反応によりｃＤＮＡを合成
し、このｃＤＮＡをλファージベクターに組み込み、ｃ
ＤＮＡライブラリーを作成する。
【０００９】一方、既知の細胞膜プロトン−ＡＴＰアー
ゼのアミノ酸配列における共通配列をもとにし、イデユ
コゴメのｍＲＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、ＤＮＡプ
ローブを作成しておく。このＤＮＡプローブを用いて、
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行う。
ゼのアミノ酸配列における共通配列をもとにし、イデユ
コゴメのｍＲＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、ＤＮＡプ
ローブを作成しておく。このＤＮＡプローブを用いて、
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行う。
【００１０】ポジティブクローンの内の１つのλファー
ジＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、これをプラスミドベ
クターにサブクローニングし、組換えプラスミドｐＢＩ
ＡＡ−１を得る。大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォーム
し、得られた形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩＡＡ−１と命名し、これを
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−
５４５５として国際寄託した。
ジＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、これをプラスミドベ
クターにサブクローニングし、組換えプラスミドｐＢＩ
ＡＡ−１を得る。大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォーム
し、得られた形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩＡＡ−１と命名し、これを
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−
５４５５として国際寄託した。
【００１１】組換えプラスミドｐＢＩＡＡ−１を各種制
限酵素で切断して、ｃＤＮＡの制限酵素地図を作成し、
デレーションミュータントを作成し、ｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列を分析し、イデユコゴメのプロトン−ＡＴＰ
アーゼのアミノ酸配列を決定する。
限酵素で切断して、ｃＤＮＡの制限酵素地図を作成し、
デレーションミュータントを作成し、ｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列を分析し、イデユコゴメのプロトン−ＡＴＰ
アーゼのアミノ酸配列を決定する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明にしたがって、好酸性の紅
藻イデユコゴメの細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコー
ドするｃＤＮＡをクローニングするには、図１の手順で
行う。すなわち、具体的には次のようにして行えばよ
い。
藻イデユコゴメの細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼをコー
ドするｃＤＮＡをクローニングするには、図１の手順で
行う。すなわち、具体的には次のようにして行えばよ
い。
【００１３】（１）イデユコゴメの細胞膜プロトン−Ａ
ＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡの部分断片のクローニ
ング （２）ｃＤＮＡプローブの作製 （３）イデユコゴメのｃＤＮＡライブラリーのスクリー
ニング （４）ポジティブクローンのｃＤＮＡのクローニング （５）ｃＤＮＡの制限酵素地図の作製及びサブクローニ
ング （６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
ＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡの部分断片のクローニ
ング （２）ｃＤＮＡプローブの作製 （３）イデユコゴメのｃＤＮＡライブラリーのスクリー
ニング （４）ポジティブクローンのｃＤＮＡのクローニング （５）ｃＤＮＡの制限酵素地図の作製及びサブクローニ
ング （６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
【００１４】このようにしてイデユコゴメの細胞膜プロ
トン−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡの全塩基配列
を決定し、配列表の配列番号１に示した。また本発明に
は、本酵素のアミノ酸配列が変化しないようにｃＤＮＡ
の塩基配列の一部を塩基の置換、削除、挿入、及び／又
は、転移を行うことによって得られるｃＤＮＡも包含さ
れ、また、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列
を有する同酵素も包含される。
トン−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡの全塩基配列
を決定し、配列表の配列番号１に示した。また本発明に
は、本酵素のアミノ酸配列が変化しないようにｃＤＮＡ
の塩基配列の一部を塩基の置換、削除、挿入、及び／又
は、転移を行うことによって得られるｃＤＮＡも包含さ
れ、また、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列
を有する同酵素も包含される。
【００１５】以下、本発明の実施例について述べる。
【００１６】
【実施例１】 （１）イデユコゴメの細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼを
コードするｃＤＮＡの部分断片のクローニング ●既知の細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼのアミノ酸配列
をアライメントすることにより共通配列（図２）を見い
だした。 ●この配列をコードするオリゴヌクレオチド（図３）を
合成した。 ●図３の合成ＤＮＡをプライマーとして用い、常法に従
って調製したイデユコゴメのｍＲＮＡを鋳型にしてＰＣ
Ｒを行った。 ●ＰＣＲ産物をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II
ＫＳ（＋）のＥｃｏＲＩ部位へ連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９を形質転換した。 ●ＰＣＲ産物が連結された組換えプラスミドｐＢＡＴＰ
−１７を形質転換体から回収した。 ●ｐＢＡＴＰ−１７を鋳型として、ＤＮＡシークエンス
を行った結果、連結されたＰＣＲ産物は、既知の細胞膜
プロトン−ＡＴＰアーゼと相同性があるアミノ酸配列を
コードしていることがわかった（図４）。
コードするｃＤＮＡの部分断片のクローニング ●既知の細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼのアミノ酸配列
をアライメントすることにより共通配列（図２）を見い
だした。 ●この配列をコードするオリゴヌクレオチド（図３）を
合成した。 ●図３の合成ＤＮＡをプライマーとして用い、常法に従
って調製したイデユコゴメのｍＲＮＡを鋳型にしてＰＣ
Ｒを行った。 ●ＰＣＲ産物をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II
ＫＳ（＋）のＥｃｏＲＩ部位へ連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＪＭ１０９を形質転換した。 ●ＰＣＲ産物が連結された組換えプラスミドｐＢＡＴＰ
−１７を形質転換体から回収した。 ●ｐＢＡＴＰ−１７を鋳型として、ＤＮＡシークエンス
を行った結果、連結されたＰＣＲ産物は、既知の細胞膜
プロトン−ＡＴＰアーゼと相同性があるアミノ酸配列を
コードしていることがわかった（図４）。
【００１７】（２）ｃＤＮＡプローブの作製 ●ｐＢＡＴＰ−１７をＥｃｏＲＩで処理してｃＤＮＡ断
片を切り出し、ＧｌａｓｓＭａｘTMＤＮＡ Ｉｓｏｌａ
ｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｓｙｓｔｅ
ｍ（ライフテックオリエンタル社製）を用いてｃＤＮＡ
断片を精製した。 ●Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌ
ｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテックオリエンタル社
製）を用いて、精製ｃＤＮＡ断片を32Ｐでラベルし、ｃ
ＤＮＡプローブを作製した。
片を切り出し、ＧｌａｓｓＭａｘTMＤＮＡ Ｉｓｏｌａ
ｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｓｙｓｔｅ
ｍ（ライフテックオリエンタル社製）を用いてｃＤＮＡ
断片を精製した。 ●Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌ
ｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテックオリエンタル社
製）を用いて、精製ｃＤＮＡ断片を32Ｐでラベルし、ｃ
ＤＮＡプローブを作製した。
【００１８】（３）イデユコゴメのｃＤＮＡライブラリ
ーのスクリーニング ●イデユコゴメのｍＲＮＡから、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰ
ＴTM ＬａｍｂｄａＳｙｓｔｅｍ（ライフテックオリエ
ンタル社製）を用いてλｇｔ２２ＡｃＤＮＡライブラリ
ーを作製した。 ●既知の方法に従い、ｃＤＮＡプローブによるプラーク
ハイブリダイゼーションによって、ｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングした。 （ｉ）イデユコゴメｃＤＮＡライブラリーをプレーティ
ング細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０）に感染させ、１
５０ｍｍプレートにプラークを形成させる。 （ii）１つのプレートから２枚のポジティブチャージド
ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+，Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ社製）にプラークをレプリカして、レプリカフィ
ルターを作製する。 （iii）レプリカフィルターを次の順で処理する。 ａ）１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ ＮａＯＨの溶液に
７分間浸す。 ｂ）１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）の溶液に５分間、２回浸す。 ｃ）０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２×
ＳＳＣ［２０×ＳＳＣ：１７５．３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ，
８８．２ｇ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐ
Ｈ７．０］の溶液に３０秒間浸す。 ｄ）ろ紙で水分を除く。 ｅ）ＵＶを５分間照射し、ＤＮＡを固定化させる。 （iv）処理されたレプリカフィルターを、６×ＳＳＰＥ
［２０×ＳＳＰＥ：１７５．３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ，２
７．６ｇ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ，７．４ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４］、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液
［５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液：１０ｇ／Ｌ Ｆｉｃｏ
ｌｌ（Ｔｙｐｅ４００；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、１
０ｇ／Ｌ ｐｏｌｙ−ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎ
ｅ，１０ｇ／Ｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕ
ｍｉｎ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ−Ｖ；Ｓｉｇｍａ社製）］，
１０％ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ，０．５％
（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，１００μｇ／ｍＬ変性サケ***ＤＮ
Ａ断片から成るプレハイブリダイゼーション溶液に浸
し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行
う。 （ｖ）フィルターを、ｃＤＮＡプローブを加えたプレハ
イブリダイゼーション溶液に浸し、４２℃で一晩ハイブ
リダイゼーションを行う。 （vi）フィルターを次の順で処理する。 ａ）２×ＳＳＣ溶液で３回洗浄する。 ｂ）２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳの溶液で、５０℃で１
５分間、２回洗浄する。 ｃ）ろ紙で水分を除く。 （vii）オートラジオグラフィを行い、Ｘ線フィルムを
現像する。 （viii）Ｘ線フィルム上のシグナルとプラークを対応さ
せ、ポジティブクローンを決定する。 （ix）ポジティブクローンのプラークを切取り、ＳＭ溶
液［５．８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ，２．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），０．０１％（ｗ／ｖ）ｇｅｌａｔｉｎ］を１ｍＬ
とクロロホルムを２０μＬ加え、ボルテックスして、フ
ァージ溶液を調製する。 （ｘ）上記ファージ溶液を適当に希釈して、プラークを
形成させる。 （xi）以後、（ii）から（viii）の操作を行って、プラ
ークの純化を行う。 ●約１００，０００個のプラークをスクリーニングした
結果、１０個のポジティブクローンが得られた。
ーのスクリーニング ●イデユコゴメのｍＲＮＡから、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰ
ＴTM ＬａｍｂｄａＳｙｓｔｅｍ（ライフテックオリエ
ンタル社製）を用いてλｇｔ２２ＡｃＤＮＡライブラリ
ーを作製した。 ●既知の方法に従い、ｃＤＮＡプローブによるプラーク
ハイブリダイゼーションによって、ｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングした。 （ｉ）イデユコゴメｃＤＮＡライブラリーをプレーティ
ング細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０）に感染させ、１
５０ｍｍプレートにプラークを形成させる。 （ii）１つのプレートから２枚のポジティブチャージド
ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ+，Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ社製）にプラークをレプリカして、レプリカフィ
ルターを作製する。 （iii）レプリカフィルターを次の順で処理する。 ａ）１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ ＮａＯＨの溶液に
７分間浸す。 ｂ）１．５Ｍ ＮａＣｌ，０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）の溶液に５分間、２回浸す。 ｃ）０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２×
ＳＳＣ［２０×ＳＳＣ：１７５．３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ，
８８．２ｇ／Ｌ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐ
Ｈ７．０］の溶液に３０秒間浸す。 ｄ）ろ紙で水分を除く。 ｅ）ＵＶを５分間照射し、ＤＮＡを固定化させる。 （iv）処理されたレプリカフィルターを、６×ＳＳＰＥ
［２０×ＳＳＰＥ：１７５．３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ，２
７．６ｇ／Ｌ ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ，７．４ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４］、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液
［５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液：１０ｇ／Ｌ Ｆｉｃｏ
ｌｌ（Ｔｙｐｅ４００；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、１
０ｇ／Ｌ ｐｏｌｙ−ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎ
ｅ，１０ｇ／Ｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕ
ｍｉｎ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ−Ｖ；Ｓｉｇｍａ社製）］，
１０％ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ，０．５％
（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，１００μｇ／ｍＬ変性サケ***ＤＮ
Ａ断片から成るプレハイブリダイゼーション溶液に浸
し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行
う。 （ｖ）フィルターを、ｃＤＮＡプローブを加えたプレハ
イブリダイゼーション溶液に浸し、４２℃で一晩ハイブ
リダイゼーションを行う。 （vi）フィルターを次の順で処理する。 ａ）２×ＳＳＣ溶液で３回洗浄する。 ｂ）２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳの溶液で、５０℃で１
５分間、２回洗浄する。 ｃ）ろ紙で水分を除く。 （vii）オートラジオグラフィを行い、Ｘ線フィルムを
現像する。 （viii）Ｘ線フィルム上のシグナルとプラークを対応さ
せ、ポジティブクローンを決定する。 （ix）ポジティブクローンのプラークを切取り、ＳＭ溶
液［５．８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ，２．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），０．０１％（ｗ／ｖ）ｇｅｌａｔｉｎ］を１ｍＬ
とクロロホルムを２０μＬ加え、ボルテックスして、フ
ァージ溶液を調製する。 （ｘ）上記ファージ溶液を適当に希釈して、プラークを
形成させる。 （xi）以後、（ii）から（viii）の操作を行って、プラ
ークの純化を行う。 ●約１００，０００個のプラークをスクリーニングした
結果、１０個のポジティブクローンが得られた。
【００１９】（４）ポジティブクローンのｃＤＮＡのク
ローニング ●１０個のポジティブクローンの内１つのλｇｔ２２Ａ
ファージＤＮＡを鋳型にして、λｇｔ１１ Ｆｏｒｗａ
ｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとλｇｔ１１ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐ
ｒｉｍｅｒ（ライフテックオリエンタル社製）を用いて
ＰＣＲを行い、ポジティブクローンのｃＤＮＡを増幅し
た。 ●増幅したＤＮＡをｄＧ ｔａｉｌし、ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ II ＳＫ（-）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社
製）のＰｓｔＩ部位にｄＣ ｔａｉｌしたものにアニー
リングさせて、組換えプラスミドｐＢＩＡＡ−１を得
た。それによって大腸菌を形質転換して、形質転換体Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ
ＡＡ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５５）を得た。
ローニング ●１０個のポジティブクローンの内１つのλｇｔ２２Ａ
ファージＤＮＡを鋳型にして、λｇｔ１１ Ｆｏｒｗａ
ｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとλｇｔ１１ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐ
ｒｉｍｅｒ（ライフテックオリエンタル社製）を用いて
ＰＣＲを行い、ポジティブクローンのｃＤＮＡを増幅し
た。 ●増幅したＤＮＡをｄＧ ｔａｉｌし、ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ II ＳＫ（-）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社
製）のＰｓｔＩ部位にｄＣ ｔａｉｌしたものにアニー
リングさせて、組換えプラスミドｐＢＩＡＡ−１を得
た。それによって大腸菌を形質転換して、形質転換体Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＩ
ＡＡ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４５５）を得た。
【００２０】（５）ｃＤＮＡの制限酵素地図の作製およ
びサブクローニング ●ｐＢＩＡＡ−１を各種制限酵素で切断して、ｃＤＮＡ
の制限酵素地図を作製した（図５）。 ●ｐＢＩＡＡ−１中のｃＤＮＡを制限酵素で処理し、ベ
クターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（+）へサブ
クローニングした。 ●また、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、デレーションミュ
ータントの作製を行った。
びサブクローニング ●ｐＢＩＡＡ−１を各種制限酵素で切断して、ｃＤＮＡ
の制限酵素地図を作製した（図５）。 ●ｐＢＩＡＡ−１中のｃＤＮＡを制限酵素で処理し、ベ
クターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（+）へサブ
クローニングした。 ●また、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて、デレーションミュ
ータントの作製を行った。
【００２１】（６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定 ●図５に従って、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を分析し
た。 ●ＣｌａＩからＮｏｔＩまでのｃＤＮＡの長さは３４５
１ｂｐで、９５５のアミノ酸をコードしていた（図６〜
図８）。 ●ヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸配列は、ト
マト細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼのアミノ酸配列と５
７．２％の相同性があった（図９〜図１０）。また、分
子量は約１０５，０００と計算された。これらのことか
ら、クローン化されたｃＤＮＡはイデユコゴメの細胞膜
プロトン−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡであると
結論された。
た。 ●ＣｌａＩからＮｏｔＩまでのｃＤＮＡの長さは３４５
１ｂｐで、９５５のアミノ酸をコードしていた（図６〜
図８）。 ●ヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸配列は、ト
マト細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼのアミノ酸配列と５
７．２％の相同性があった（図９〜図１０）。また、分
子量は約１０５，０００と計算された。これらのことか
ら、クローン化されたｃＤＮＡはイデユコゴメの細胞膜
プロトン−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡであると
結論された。
【００２２】
【発明の効果】本発明によって、イデユコゴメのプロト
ン−ＡＴＰアーゼｃＤＮＡのクローニングがはじめて可
能となり、その塩基配列が明らかにされ、また同酵素の
アミノ酸配列も明らかにされ、その結果、更に次のよう
な効果が奏される。
ン−ＡＴＰアーゼｃＤＮＡのクローニングがはじめて可
能となり、その塩基配列が明らかにされ、また同酵素の
アミノ酸配列も明らかにされ、その結果、更に次のよう
な効果が奏される。
【００２３】（１）プロトン−ＡＴＰアーゼの大量生産 クローン化されたイデユコゴメのプロトン−ＡＴＰアー
ゼｃＤＮＡを大腸菌、酵母、バキュロウイルスなどに導
入し、本蛋白質の大量生産系を確立することにより、プ
ロトン−ＡＴＰアーゼの調製が容易となる。
ゼｃＤＮＡを大腸菌、酵母、バキュロウイルスなどに導
入し、本蛋白質の大量生産系を確立することにより、プ
ロトン−ＡＴＰアーゼの調製が容易となる。
【００２４】（２）耐酸機構の解明 イデユコゴメのプロトン−ＡＴＰアーゼｃＤＮＡのクロ
ーン化および組換えプロトン−ＡＴＰアーゼの調製によ
って、イデユコゴメの耐酸機構の鍵を握るプロトン−Ａ
ＴＰアーゼの生化学的性質、高次構造、機能調節などを
明らかにすることができ、耐酸機構の解明につながる。
ーン化および組換えプロトン−ＡＴＰアーゼの調製によ
って、イデユコゴメの耐酸機構の鍵を握るプロトン−Ａ
ＴＰアーゼの生化学的性質、高次構造、機能調節などを
明らかにすることができ、耐酸機構の解明につながる。
【００２５】（３）プロトン−ＡＴＰアーゼ遺伝子の導
入による耐酸性の形質転換植物の作出プロトン−ＡＴＰ
アーゼ遺伝子を、酸性ｐＨでは生育できない微生物、藻
類、植物に導入することにより、耐酸性を付与すること
ができる。藻類や植物など光合成生物（独立栄養生物）
を酸性条件下でも生育できるように改変することができ
れば、たとえば、酸性雨によって被害を受けた湖沼や森
林の再生、新たな生態系の構築に有用である。
入による耐酸性の形質転換植物の作出プロトン−ＡＴＰ
アーゼ遺伝子を、酸性ｐＨでは生育できない微生物、藻
類、植物に導入することにより、耐酸性を付与すること
ができる。藻類や植物など光合成生物（独立栄養生物）
を酸性条件下でも生育できるように改変することができ
れば、たとえば、酸性雨によって被害を受けた湖沼や森
林の再生、新たな生態系の構築に有用である。
【００２６】（４）プロトンポンプインヒビターの開発 プロトンインヒビターには、消化性潰瘍の治癒効果があ
ることが知られている。イデユコゴメのプロトン−ＡＴ
Ｐアーゼは新しいプロトンポンプインヒビター（消化性
潰瘍の治療薬）の開発が可能となる。
ることが知られている。イデユコゴメのプロトン−ＡＴ
Ｐアーゼは新しいプロトンポンプインヒビター（消化性
潰瘍の治療薬）の開発が可能となる。
【００２７】
【配列表】本発明に係るイデユコゴメの細胞膜プロトン
−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡの塩基配列及び同
酵素のアミノ酸配列を、下記表１、表２、表３、表４に
示す。
−ＡＴＰアーゼをコードするｃＤＮＡの塩基配列及び同
酵素のアミノ酸配列を、下記表１、表２、表３、表４に
示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
【表３】
【００３１】
【表４】
【図１】イデユコゴメの細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼ
のクローニング方法を示す。
のクローニング方法を示す。
【図２】各種の細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼのアミノ
酸配列を示す。
酸配列を示す。
【図３】センス及びアンチセンスプライマーを示す。
【図４】ＰＣＲ産物と他の細胞膜プロトン−ＡＴＰアー
ゼのアミノ酸配列の比較を示す。
ゼのアミノ酸配列の比較を示す。
【図５】ｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。
【図６】イデユコゴメの細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼ
ｃＤＮＡの塩基配列とそれにコードされているアミノ酸
配列からなる配列を示す。
ｃＤＮＡの塩基配列とそれにコードされているアミノ酸
配列からなる配列を示す。
【図７】同配列の続きの配列を示す。
【図８】同配列の続きの配列を示す。
【図９】イデユコゴメとトマトの細胞膜プロトン−ＡＴ
Ｐアーゼのアミノ酸配列の比較を示す。
Ｐアーゼのアミノ酸配列の比較を示す。
【図１０】同配列の続きの比較を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示す細胞膜プロト
ン−ＡＴＰアーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子の
ｃＤＮＡ。 - 【請求項２】 細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼが紅藻イ
デユコゴメ（Cyanidium caldarium）由来であることを
特徴とする請求項１に記載のｃＤＮＡ。 - 【請求項３】 該細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼのアミ
ノ酸配列が変化しないように請求項１又は２のｃＤＮＡ
の塩基配列の一部を塩基の置換、削除、挿入、及び／又
は、転移を行うことによって得られるｃＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項１又は２に記載のｃＤＮＡを含ん
だ組換えプラスミド。 - 【請求項５】 請求項４に記載の組換えプラスミドを大
腸菌に移入することによって得られた形質転換体。 - 【請求項６】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
で示される細胞膜プロトン−ＡＴＰアーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8124124A JPH09252786A (ja) | 1996-03-25 | 1996-03-25 | プロトン−ａｔｐアーゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8124124A JPH09252786A (ja) | 1996-03-25 | 1996-03-25 | プロトン−ａｔｐアーゼ遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09252786A true JPH09252786A (ja) | 1997-09-30 |
Family
ID=14877527
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8124124A Pending JPH09252786A (ja) | 1996-03-25 | 1996-03-25 | プロトン−ａｔｐアーゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09252786A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011052621A1 (ja) * | 2009-10-30 | 2011-05-05 | 学校法人立教学院 | シアニジウム類由来のプロトンatpアーゼ遺伝子を用いた耐性植物体の作出方法及び該遺伝子の用途 |
-
1996
- 1996-03-25 JP JP8124124A patent/JPH09252786A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011052621A1 (ja) * | 2009-10-30 | 2011-05-05 | 学校法人立教学院 | シアニジウム類由来のプロトンatpアーゼ遺伝子を用いた耐性植物体の作出方法及び該遺伝子の用途 |
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