JPH09241159A

JPH09241159A - Ｈｓｐ６０ファミリーに属するタンパク質のアトラクチレノライドｉｉｉ含有合成抑制剤

Info

Publication number: JPH09241159A
Application number: JP8078213A
Authority: JP
Inventors: Yoichi Shobu; 洋一清輔; Toshimi Shiragami; 俊美白神; Masayoshi Morino; 眞嘉森野; Chikao Yoshikumi; 親雄吉汲
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1996-03-06
Filing date: 1996-03-06
Publication date: 1997-09-16

Abstract

(57)【要約】【課題】分子量５７キロダルトンから６８キロダルト
ンまでの間の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０ファミ
リー）がその発症に関与する自己免疫疾患（例えば、Ｉ
型糖尿病や慢性関節リウマチなど）の患者の生理学的状
態を有効に改善させ、前記病気を効果的に治療すること
ができる、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の
合成抑制剤を提供する。【解決手段】アトラクチレノライドIII 又はその立体
異性体を有効成分として含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アトラクチレノラ
イドIII 又はその立体異性体を有効成分として含有す
る、分子量が５７キロダルトン（ｋＤ）から６８ｋＤま
での間の熱ショックタンパク質群（以下、ＨＳＰ６０フ
ァミリーと称する）に属するタンパク質の合成抑制剤に
関する。本発明によるＨＳＰ６０ファミリーに属するタ
ンパク質の合成抑制剤は、特に、ＨＳＰ６０ファミリー
に属するタンパク質の組織内合成を抑制することによ
り、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質が発症に
関与するものと考えられている自己免疫疾患、例えば、
Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどの病気の患者の生理
学的状態を有効に改善させ、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウ
マチなどの自己免疫疾患を効果的に治療することができ
る。

【０００２】

【従来の技術】近年、自己免疫疾患が大きな問題となっ
ている。自己免疫疾患とは、本来ならば自己の身体を構
成する成分に対しては攻撃しないはずの免疫系が、自己
の組織と反応して破壊してしまう病気であり、例えば、
Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどが含まれる。例え
ば、近年わが国では、経済・社会・文化の発達と、生活
水準の向上や生活様式の変化に伴って、糖尿病患者は著
しく増加し、病態も重症化、複雑化してきた。糖尿病学
の進歩によって、患者の予後は改善したとはいえ、特有
な網膜症、腎症及び神経障害が多発し、加えて動脈硬化
も促進され、健康と社会活動に多大な支障をきたしてい
る。糖尿病のうち、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿
病；insulin-dependent diabetes mellitus ；ＩＤＤ
Ｍ）の発生率は、多くの国でこの数十年間に数倍に増加
し、現在生きているヒトの１％は７０才になるまでにＩ
型糖尿病に罹病するものと予想されている。

【０００３】Ｉ型糖尿病は、インスリン産生細胞である
膵臓ランゲルハンス島のβ細胞だけが自己免疫的に破壊
されるためにインスリン欠乏状態となる疾患で、臓器特
異的な自己免疫疾患である（Atkinson, M. A. et al.:
"Sci. Am.", 263 : 42-49, 1990; Todd JA.: "Immunol.
Today", 11: 122-129, 1990)。Ｉ型糖尿病をおこす自
己免疫過程は、非常に厳密に膵臓だけに限られており、
しばしば大人になる前に発症してくることが多い。Ｉ型
糖尿病が臨床的に発症するときには、膵島の炎症（膵島
炎）があり、インスリンを産生しているβ細胞の大半が
特異的に失われる（Atkinson, M. A., et al.: "Sci. A
m.", 263 : 62-67, 1990)。糖尿病の臨床症状は、β細
胞の大部分（おそらく９０％以上）が再生できない程度
にまで破壊された後に初めて現れ、患者の生存はインス
リンの外的供給に依存することになる。即ち、臨床診断
によって発見することができる時期には、この自己免疫
反応が既に不可逆的な損傷を与えており、しかもその多
くは顕著な自覚症状を示さない等、Ｉ型糖尿病は多くの
問題を含んでいる。

【０００４】また、慢性関節リウマチは、関節滑膜を病
変の主座とする慢性炎症性疾患である。病変部位はとき
として関節滑膜のみにとどまらず、全身に及ぶこともま
れではない。関節滑膜に初発した炎症は、やがて滑膜増
殖、更に軟骨及び骨の破壊を起こし、関節組織の破壊が
引き起こされる。その結果、患者は社会的にも家庭的に
も著しく制限を受けるのみならず、経済的負担も無視で
きないものとなる。慢性関節リウマチの患者数は人口の
０．１〜０．３％とされる。これは慢性関節リウマチの
確診例であって、疑診例などや慢性関節リウマチの周辺
疾患を含めると患者数はその１０倍前後にも増えるもの
と思われる。

【０００５】一方、熱ショックタンパク質（heat shock
protein；ＨＳＰ、ストレスタンパク質ともいう）は、
細胞を何らかのストレス、例えば、熱、重金属、薬剤、
アミノ酸類似体、又は低酸素（低濃度酸素）などで刺激
することにより、細胞に発現される一群のタンパク質で
ある。熱ショックタンパク質は、自然界に普遍的に存在
しており、細菌、酵母、植物、昆虫、及びヒトを含む高
等動物により産生される。

【０００６】ＨＳＰは、その種類は多種多様であるが、
分子量の大きさからＨＳＰ９０ファミリー（例えば、９
０ｋＤ又は１１０ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳＰ７０ファ
ミリー（例えば、７０〜７３ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳ
Ｐ６０ファミリー（例えば、５７〜６８ｋＤのＨＳＰな
ど）、低分子ＨＳＰファミリー（例えば、２０ｋＤ、２
５〜２８ｋＤ、又は４７ｋＤのＨＳＰなど）の４ファミ
リーに大別することができる。なお、本明細書において
は、特定分子量を有するＨＳＰを、ＨＳＰとその直後に
記載する数字とによって示すものとし、例えば、分子量
６０ｋＤのＨＳＰを『ＨＳＰ６０』と称するものとす
る。以上のように、ＨＳＰには多くの種類が存在する
が、これらは分子量だけでなく、構造、機能、又は性質
などもそれぞれ異なるものである。ストレスへの応答に
加えて、これらのタンパク質の中には構成的に合成され
るものがあり、正常な環境の下で、タンパク質のフォー
ルディング、アンフォールディング、タンパク質サブユ
ニットの会合、タンパク質の膜輸送のような、必須の生
理的な役割を演じていることが示されている。熱ショッ
クタンパク質としてのこれらの機能は、分子シャペロン
と称される。

【０００７】自己免疫疾患の病因に関して注目されてい
ることのひとつに、分子相同性（molecular mimicry)が
ある。すなわち、自己抗原が微生物などの外来抗原と共
通抗原性をもっている場合、微生物感染によって生成さ
れる抗体や感作リンパ球が交叉反応によって自己の組織
を攻撃してしまう結果、自己免疫疾患が発症するものと
考えられている（Atkinson, M. A. et al.: "Sci. A
m.", 263 : 42-49, 1990;Shinha, A. A. et al.: "Scie
nce", 248 : 1380-1388, 1990)。例えば、細菌のＨＳＰ
６０ファミリーに属するタンパク質は、結核、らい病、
梅毒、在郷軍人病、又はライム病などの主たる抗原であ
り（Young, R. A. et al.: "Cell", 59:5-8, 1989)、
かつ、細菌のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質
は強い免疫原性を有し、及び自己の（宿主であるヒト
の）タンパク質との分子相同性を有するために、感染症
がトリガーとなった分子相同性による自己免疫疾患が発
症するものと考えられている。

【０００８】例えば、糖尿病の患者やその家族の血中に
検出される６４ｋＤタンパク質と反応する抗体（６４ｋ
Ｄ自己抗体）はβ細胞特異的であるし、また糖尿病と診
断される直前によく出現しやすい。すなわち、Ｉ型糖尿
病において発症の原因と考えられている膵島細胞抗原
は、分子量６４ｋＤの糖タンパク質（Baekkeskov, S. e
t al.: "Nature", 298 : 167-169, 1982)である。６４
ｋＤタンパク質に対する抗体はヒトの糖尿病のみならず
（Atkinson, M. A. et al.: "Lancet", 335 : 1357-136
0, 1990)、ＢＢラット（Baekkeskov, S. et al.: "Scie
nce", 224 : 1348-1350, 1984)やＮＯＤマウス（Atkins
on, M. A. et al.: "Diabetes", 37: 1587-1590, 1988)
などのように、自然にＩ型糖尿病を発症し、ヒトのＩ型
糖尿病の多くの特徴を示す、Ｉ型糖尿病のモデル動物に
おいても検出される。Ｉ型糖尿病における膵臓β細胞の
６４ｋＤタンパク質は、サイトカインや熱刺激で誘導さ
れるので、熱ショックタンパク質である可能性がある。

【０００９】Ｉ型糖尿病のモデル動物であるＮＯＤマウ
スにおける膵臓ランゲルハンス島β細胞の６４ｋＤタン
パク質は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のＨ
ＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に対する抗体と
免疫学的に交叉反応性を示す自己抗原であることが示さ
れている。このように、ＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質と６４ｋＤタンパク質自己抗原との間に免疫
学的交叉が観察されることにより、膵臓β細胞の６４ｋ
Ｄタンパク質がＨＳＰ６０ファミリーの一員である可能
性があり、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の
エピトープと交叉する自己免疫の機序が、Ｉ型糖尿病の
発症に関与することが示唆されている。また、結核菌の
ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に特異性を有
するＴリンパ球のクローンを移入すると、幼若ＮＯＤマ
ウスにランゲルハンス島炎と高血糖を引き起こす。ま
た、結核菌のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質
を免疫原性のある投与方法、すなわちアジュバントとと
もにＮＯＤマウスに注射すると、糖尿病を早期に発症さ
せ得る（Elias, D. et al.: "Proc. Natl. Acad. Sci.
USA", 87: 1576-1580, 1990)。マイコバクテリアのＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質に対する動物の免
疫反応がＩ型糖尿病を引き起こすというこれらの事実
は、マイコバクテリアのＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質に対する抗体と交叉反応する抗原に対する免
疫系による攻撃が、β細胞に障害を与えることを示して
いる。

【００１０】また、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタン
パク質は、慢性関節リウマチの動物モデルであるラット
のアジュバント関節炎や、ヒトのリウマチ関節炎に関連
していることが知られている。例えば、慢性関節リウマ
チの場合、細菌の菌体タンパク質である熱ショックタン
パク質のなかでもＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパ
ク質は、関節軟骨に存在するプロテオグリカンと分子相
同性をもっていることが明らかとなっている。ラットの
アジュバント関節炎ではＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質反応性Ｔリンパ球の関与が示されている（"C
urr. Top. Microbiol. Immunol.", 145 : 27-83, 198
9)。この疾患は、放射線照射を受けた免疫学的に無防備
の（ｎａｔｉｖｅ）ラットに、結核菌のＨＳＰ６０ファ
ミリーに属するタンパク質に対して反応性のＴリンパ球
のクローンを移入することにより、前記ラットに移すこ
とができることが見出された（"Science", 219 : 56-5
8, 1983; "Nature", 331: 171-173, 1988)。このＴリ
ンパ球は同時に関節のプロテオグリカンとも交叉反応性
を示す（"Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 82: 5117-512
0, 1985)。このＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク
質で誘導される調節性Ｔリンパ球は、溶連菌やプリステ
インによる関節炎でも認められている。従って、アジュ
バント関節炎は、抗ＨＳＰ６０ファミリーに属するタン
パク質Ｔリンパ球により引き起こされる自己免疫疾患の
ようである。また、ヒトの若年性関節リウマチでもＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質反応性Ｔリンパ球
の関与が考えられている。

【００１１】また、慢性関節リウマチの患者の滑液中か
らマイコバクテリア由来のＨＳＰ６０ファミリーに属す
るタンパク質に対して、特異的に反応するＴリンパ球が
取り出されている（"Lancet", II: 478-480, 1988; "Na
ture", 339 : 226, 1989; "Annu. Rev. Immunol.", 1
1: 637, 1993)。このように、マイコバクテリアのＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質と交叉反応性を示
すタンパク質が高濃度に慢性関節リウマチの軟骨／パン
ヌス接合部に認められるのに対し、正常な組織や他の疾
患による慢性の炎症を呈する組織においては認められな
い（"Scand. J. Immunol.", 31: 283-288, 1990)。更
に、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に対する
抗体がヒト及びラットの慢性関節リウマチで検出される
（Kaufmann,S. H. E., et al.: "Immunol. Today", 11:
129-136, 1990)ことからも、慢性関節リウマチの病因
がマイコバクテリアのＨＳＰ６０ファミリーに属するタ
ンパク質と構造の類似した自己抗原に対する自己免疫で
あるという可能性がある。従ってＨＳＰ６０ファミリー
に属するタンパク質に対する免疫応答の存在はラット及
びヒトの両方の関節炎に関連している。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどの自己免
疫疾患の患者の生理学的状態を有効に改善することがで
き、それらの自己免疫疾患を効果的に治療することので
きる方法を開発するために、ＨＳＰ６０ファミリーに属
するタンパク質に対して合成抑制作用を示す化合物に関
して種々検討を重ねてきた。その結果、本発明者らは、
意外にも、ビャクジュツの成分であるアトラクチレノラ
イドIII 、又はその立体異性体が、病態を示す組織の細
胞におけるＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の
合成を特異的に抑制することを見出した。すなわち、ア
トラクチレノライドIII 又はその立体異性体を投与する
ことにより、細胞内でのＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質の合成が抑制され、従って、Ｉ型糖尿病や慢
性関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療が可能である
ことを見出したのである。本発明はこうした知見に基づ
くものであり、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどの自
己免疫疾患を効果的に治療することのできる、ＨＳＰ６
０ファミリーに属するタンパク質の合成抑制剤を提供す
ることを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、アト
ラクチレノライドIII 又はその立体異性体を有効成分と
して含有することを特徴とする、分子量５７キロダルト
ンから６８キロダルトンまでの間の熱ショックタンパク
質（すなわち、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク
質）の合成抑制剤に関する。本明細書において、「ＨＳ
Ｐ６０ファミリー」とは、前記のとおり、分子量が５７
ｋＤ〜６８ｋＤの熱ショックタンパク質群を意味する。
また、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質として
は、例えば、ＨＳＰ６０（すなわち、分子量６０ｋＤの
熱ショックタンパク質）、ＨＳＰ５８（すなわち、分子
量５８ｋＤの熱ショックタンパク質）、ＨＳＰ６５（す
なわち、分子量６５ｋＤの熱ショックタンパク質）、又
はＧｒｏＥＬ（すなわち、原核生物、例えば、大腸菌な
どの分子量約６４ｋＤの熱ショックタンパク質）などを
挙げることができる。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明の合成抑制剤は、有効成分としてアトラク
チレノライドIII 又はその立体異性体を含有する。本発
明の合成抑制剤において有効成分として使用することの
できるアトラクチレノライドIII 〔アトラクチレノリド
III ；ＡｔｒａｃｔｙｌｅｎｏｌｉｄｅIII ；Ｃｏｄｏ
ｎｏｌａｃｔｏｎｅ；４ａ，５，６，７，８，８ａ，
９，９ａ−オクタヒドロ−９ａ−ヒドロキシ−３，８ａ
−ジメチル−５−メチレン−ナフト（２，３−ｂ）フラ
ン−２（４Ｈ）−オン；Ｃ₁₅Ｈ₂₀Ｏ₃ ＝２４８．３２〕
は、式（Ｉ）：

【化１】で表される化合物であり、例えば、ビャクジュツ等の生
薬に含まれている。前記アトラクチレノライドIII に
は、立体異性体が存在し、本発明では、それらの任意の
純粋な立体異性体又はそれらの混合物を用いることがで
きる。

【００１５】本発明の合成抑制剤に含有されるアトラク
チレノライドIII 又はその立体異性体は、化学合成によ
って、又は天然物から抽出して精製することによって、
調製することができる。あるいは、市販品を用いてもよ
い。本発明の合成抑制剤において有効成分として用いる
アトラクチレノライドIII又はその立体異性体を、天然
物から抽出する場合には、例えば、アトラクチレノライ
ドIII 又はその立体異性体を含有する植物の全体又は一
部分（例えば、全草、葉、根、根茎、茎、根皮、若しく
は花）をそのまま用いて、又は簡単に加工処理（例え
ば、乾燥、切断、若しくは粉末化）したもの（例えば、
生薬）を用いて抽出することができる。抽出条件は一般
的に植物抽出に用いられる条件ならば特に制限はない。

【００１６】本発明におけるアトラクチレノライドIII
を生薬から抽出する場合、これに限定するものではない
が、例えば、ビャクジュツから抽出することが好まし
い。ビャクジュツ（白朮；Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ
Ｒｈｉｚｏｍｅ；ＡｔｒａｃｔｙｌｏｄｉｓＲｈｉｚ
ｏｍａ）とは、オケラ（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓｊ
ａｐｏｎｉｃａＫｏｉｄｚｕｍｉｅｘＫｉｔａｍ
ｕｒａ）の根茎（ワビャクジュツ）又はオオバナオケラ
（ＡｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓｏｖａｔａＤｅＣａｎ
ｄｏｌｌｅ）の根茎（カラビャクジュツ）を意味し、そ
れらの部分を単独であるいは任意に組み合わせて使用す
ることができる。

【００１７】本発明による合成抑制剤において有効成分
として用いることのできるビャクジュツ抽出物は、前記
のアトラクチレノライドIII を含有していればよく、従
って、ビャクジュツの粗抽出物を用いることができる。
本発明で用いることのできるビャクジュツ抽出物の製造
方法としては、ビャクジュツを、水（例えば、温水、好
ましくは熱湯）によって抽出するか、又は有機溶媒を用
いて抽出することによって、得ることができる。有機溶
媒としては、例えば、炭素数１〜６のアルコール（例え
ば、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピ
ルアルコール、イソプロピルアルコール、若しくはブチ
ルアルコール）、エステル（例えば、酢酸メチル、酢酸
エチル、酢酸プロピル、若しくは酢酸ブチル）、ケトン
（例えば、アセトン若しくはメチルイソブチルケト
ン）、エーテル、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、シクロ
ヘキサン、トルエン、ベンゼン、炭化水素のハロゲン誘
導体（例えば、四塩化炭素、ジクロロメタン、若しくは
クロロホルム）、ピリジン、グリコール（例えば、プロ
ピレングリコール、若しくはブチレングリコール）、ポ
リエチレングリコール、又はアセトニトリルなどを用い
ることができ、これらの有機溶媒を単独、又は適宜組み
合わせ、一定の比率で混合し、更には無水又は含水状態
で用いることができる。好ましくは、ｎ−ヘキサン、ｎ
−ヘキサン／酢酸エチル混合溶媒、メチルアルコール、
含水メチルアルコール、含水アセトニトリル、石油エー
テル／エーテル混合溶媒、又は酢酸エチル等が望まし
い。水抽出又は有機溶媒抽出の方法としては、通常の生
薬抽出に用いられる方法を用いることができ、例えば、
（乾燥）ビャクジュツ１重量部に対し、水又は有機溶媒
３〜３００重量部を用いて、攪拌しながら、その沸点以
下の温度で加熱還流、あるいは常温で超音波抽出するこ
とが望ましい。抽出工程は、通常は５分〜７日間、好ま
しくは１０分〜２４時間実施し、必要に応じて、攪拌等
の補助的手段を加えることにより、抽出時間を短縮する
ことができる。

【００１８】抽出工程終了後、濾過又は遠心分離等の適
当な方法により、水又は有機溶媒抽出液から、不溶物を
分離して粗抽出物を得ることができる。なお、本発明の
合成抑制剤における有効成分として、天然物より抽出、
分画したアトラクチレノライドIII 又はその立体異性体
を用いる場合には、抽出液を特に精製することなく、そ
のまま使用してもよい。常法による熱水抽出物又は有機
溶媒抽出物の他に、前記の粗抽出物を各種有機溶媒又は
吸着剤等により、更に処理した精製抽出物も、本発明の
合成抑制剤の有効成分として用いることができる。これ
らの粗抽出物及び各種の精製処理を終えた精製抽出物を
含むビャクジュツ抽出物は、抽出したままの溶液を用い
ても、溶媒を濃縮したエキスを用いても良いし、溶媒を
留去し乾燥した粉末、更には結晶化して精製したもの、
あるいは粘性のある物質を用いても良く、またそれらの
希釈液を用いることもできる。こうして得られたビャク
ジュツ抽出物は、ビャクジュツに含まれるアトラクチレ
ノライドIII を含み、同時に原料のビャクジュツに由来
する不純物を含んでいる。

【００１９】本発明の合成抑制剤は、アトラクチレノラ
イドIII 若しくはその立体異性体、又はアトラクチレノ
ライドIII 若しくはその立体異性体を含有する植物の抽
出物、例えば、アトラクチレノライドIII 若しくはその
立体異性体を含有する生薬（特にはビャクジュツ）の抽
出物を、それ単独で、又は好ましくは製剤学的若しくは
獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、動
物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与すること
ができる。投与剤型としては、特に限定がなく、例え
ば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁
液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは
丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐
剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口
剤を挙げることができる。これらの経口剤は、例えば、
ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスター
チ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメ
チルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリド
ン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エ
ステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチ
レングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又
は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊
剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存
剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐
剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造する
ことができる。例えば、１重量部のアトラクチレノライ
ドIII と９９重量部の乳糖とを混合して充填したカプセ
ル剤などである。

【００２０】非経口投与方法としては、注射（皮下、静
脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなか
で、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の
調製においては、有効成分としてのアトラクチレノライ
ドIII 若しくはその立体異性体、又はアトラクチレノラ
イドIII 若しくはその立体異性体を含有する植物の抽出
物、例えば、アトラクチレノライドIII 若しくはその立
体異性体を含有する生薬（特にはビャクジュツ）の抽出
物の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の
水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶
性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化
剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳
化剤等を任意に用いることができる。また、本発明の合
成抑制剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の
手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の合成抑
制剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込
ませて、このペレットを治療すべき組織中に外科的に移
植することができる。

【００２１】本発明の合成抑制剤は、これに限定される
ものではないが、アトラクチレノライドIII 又はその立
体異性体を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１
〜８０重量％の量で含有することができる。また、アト
ラクチレノライドIII 若しくはその立体異性体を含有す
る植物の抽出物、例えば、アトラクチレノライドIII 若
しくはその立体異性体を含有する生薬（特にはビャクジ
ュツ）の抽出物を有効成分として含有する本発明の合成
抑制剤は、その中に含まれるアトラクチレノライドIII
又はその立体異性体が前記の量範囲になるように適宜調
整して、調製することができる。なお、アトラクチレノ
ライドIII 若しくはその立体異性体を含有する植物の抽
出物、例えば、アトラクチレノライドIII 若しくはその
立体異性体を含有する生薬（特にはビャクジュツ）の抽
出物を有効成分として含有する合成抑制剤を、経口投与
用製剤とする場合には、製剤学的に許容することのでき
る担体を用いて、製剤化することが好ましい。

【００２２】本発明の合成抑制剤を用いる場合の投与量
は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程
度、又は投与方法などにより異なり、特に制限はない
が、アトラクチレノライドIII 量として通常成人１人当
り１ｍｇ〜１０ｇ程度を、１日１〜４回程度にわけて、
経口的に又は非経口的に投与する。更に、用途も医薬品
に限定されるものではなく、種々の用途、例えば、機能
性食品や健康食品として飲食物の形で与えることも可能
である。

【００２３】

【作用】上記したように、本発明の合成抑制剤に含有さ
れるアトラクチレノライドIII又はその立体異性体は、
細胞内のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の合
成を特異的に抑制する作用があるので、前記アトラクチ
レノライドIII 又はその立体異性体を投与すると細胞で
のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の生合成が
特異的に減少する。従って、前記アトラクチレノライド
III 又はその立体異性体は、ＨＳＰ６０ファミリーに属
するタンパク質がその発症に関連する自己免疫疾患、例
えば、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどの予防及び治
療に使用することができる。

【００２４】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：ヒト培養癌細胞のＨＳＰ発現量の測定（１）ヒト培養癌細胞の培養以下の各種ヒト培養癌細胞を、５％二酸化炭素条件下
で、熱ショック処理時以外は、３７℃で培養した。前立
腺癌細胞株ＤＵ１４５（ＡＴＣＣＨＴＢ８１）
は、１０％非働化ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略称す
る）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。子宮癌
細胞株ＨｅＬａＳ３（ＡＴＣＣＣＣＬ２．２）
は、１０％非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地中で培養し
た。

【００２５】（２）アトラクチレノライドIII 処理及び
熱ショック処理播種２日後の前記各種ヒト培養癌細胞の培地中に、最終
濃度１００μＭになるようにアトラクチレノライドIII
（松浦薬業）を添加し、２４時間培養した。その後、４
５℃にて１５分間熱ショック処理をしてから、３７℃に
て終夜培養した。対照試験は、アトラクチレノライドII
I を添加しないこと以外は前記と同様に実施した。

【００２６】（３）ヒト培養癌細胞でのＨＳＰ発現量の
測定前項（２）で処理した各細胞を、以下に示す方法により
ホモジナイズし、ＨＳＰ発現量をウェスタンブロット法
にて測定した。すなわち、前項（２）で処理した細胞
を、リン酸緩衝生理食塩水〔組成：ＫＣｌ＝０．２ｇ／
ｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ＝０．２ｇ／ｌ，ＮａＣｌ＝８ｇ／
ｌ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄ （無水）＝１．１５ｇ／ｌ；以下、
ＰＢＳ（−）と称する〕で洗浄した後、ライシスバッフ
ァー（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）〔１．０％ＮＰ−４
０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−Ｎ−エ
チルマレイミド、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オリド、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペ
プスタチン〕１ｍｌを加え、氷上で２０分間静置した。
その後、４℃で１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心
を行った。遠心後の上清１０μｌをＰＢＳ（−）７９０
μｌに加え、更にプロテインアッセイ染色液（Dye Reag
ent Concentrate : バイオラッド，カタログ番号500-00
06）２００μｌを加えた。５分間、室温にて静置した
後、５９５ｎｍで吸光度を測定してタンパク質定量を行
った。

【００２７】タンパク質定量を行った試料を用いて、Ｌ
ａｅｍｍｌｉのバッファー系（Laemmli, N. K., "Natur
e", 283 : pp. 249-256, 1970)にて、等量のタンパク質
を含むライセートのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。電気泳動後、ブロッティング及びそれに
続くブロッキングを行った。すなわち、タンパク質転写
装置（Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell：バ
イオ・ラッド，カタログ番号170-3946）を用いて、室温
にて１００Ｖにて、０．４５μｍニトロセルロース膜
（Schleicher & Schuell，カタログ番号401196）にゲル
を密着させ、３時間ブロッティングを行った。ブロッテ
ィングバッファーとしては、０．０２５Ｍトリス及び
０．１９２ＭグリシンよりなりｐＨ８．５に調整された
トリスグリシンバッファー（Tris Gly Running and Blo
tting Buffer；Enprotech, 米国マサチューセッツ州，
カタログ番号 SA100034)にメチルアルコールを２０％に
なるように加えて調製したバッファーを用いた。ブロッ
ティング後、ニトロセルロース膜を１０％スキムミルク
（雪印乳業）−ＰＢＳ（−）溶液に室温にて３０分間、
インキュベートし非特異的結合をブロックした。

【００２８】ブロッキング後、ニトロセルロース膜の上
で、抗ヒトＨＳＰ６０マウスモノクローナル抗体（Stre
ssGen, Victoria, B.C., Canada, カタログ番号 SPA-8
06）により、１次抗体反応を行った。この抗ヒトＨＳＰ
６０マウスモノクローナル抗体は、大腸菌を用いるリコ
ンビナントＤＮＡ法により作製したヒトＨＳＰ６０を免
疫原として作製した抗体であり（"J. Exp. Med." 175
, 1805-1810, 1992)、哺乳類ＨＳＰ６０（霊長類ＨＳ
Ｐ６０、マウスＨＳＰ６０、ラットＨＳＰ６０、及びハ
ムスターＨＳＰ６０）と特異的に反応する（"J. Exp. M
ed." 175 , 1805-1810, 1992)。この抗ヒトＨＳＰ６０
マウスモノクローナル抗体が認識するエピトープは、ヒ
トＨＳＰ６０アミノ酸配列の第３８３番目〜第４４７番
目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列中に局在する
（"J. Exp. Med." 175 , 1805-1810,1992)。１次抗体
反応後、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、溶液を取り替えて
２回の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーによって
行い、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バ
イオ・ラッド，カタログ番号170-6531）溶液で１５分間
ずつ、溶液を取り替えて４回の洗浄を行った。最終的
に、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、２回の洗浄を行った。

【００２９】洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスＩｇＧ抗体（CAPPEL，カタログ番号55550)を、２
％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５０００倍に
希釈して調製した抗体溶液５ｍｌを用いて、２時間、２
次抗体反応を行った。反応終了後、ニトロセルロース膜
に関して、ＰＢＳ（−）溶液で５分間ずつ溶液を変えて
２回、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液
で１５分間ずつ溶液を変えて５回の洗浄をスロー・ロッ
キング・シェイカーにより行った。最後にＰＢＳ（−）
溶液で５分間ずつ２回の洗浄を行った。余分なＰＢＳ
（−）溶液を除去した後、ウェスタンブロッティング検
出試薬（ECL Western blotting detectionreagent；Ame
rsham，カタログ番号RPN2106)をニトロセルロース膜上
に振りかけ、１分間インキュベートした後、余分な検出
試薬を除去し、ニトロセルロース膜をラップに包み、反
応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT, AR, カタログ
番号165 1454）に密着させて露光し、現像してＨＳＰ６
０の有無の検討を行った。結果を表１に示す。表中、
「↓」は、対照に比べて、アトラクチレノライドIII 処
理によりＨＳＰ６０発現量が減少したことを意味する。

【００３０】

【表１】癌種癌細胞ＨＳＰ６０発現量変化子宮ＨｅＬａＳ３ ↓ 前立腺ＤＵ１４５ ↓

【００３１】対照試験、すなわち、アトラクチレノライ
ドIII を添加しなかった細胞では、分子量約６０ｋＤの
バンドが一本検出された。なお、分子量は、前記抗ヒト
ＨＳＰ６０マウスモノクローナル抗体との結合、及び分
子量マーカー（卵白オバルブミン及びウシ血清アルブミ
ン）により決定した。表１に示すとおり、アトラクチレ
ノライドIII は、子宮癌細胞株ＨｅＬａＳ３及び前立
腺癌細胞株ＤＵ１４５において、ＨＳＰ６０の発現を
抑制した。すなわち、アトラクチレノライドIII は、Ｈ
ＳＰ６０の発現を抑制する合成抑制剤の活性を有するも
のと結論することができる。

【００３２】

【発明の効果】以上詳述したように、アトラクチレノラ
イドIII 又はその立体異性体は、細胞内のＨＳＰ６０フ
ァミリーに属するタンパク質の発現を抑制する合成抑制
剤の活性を有する。従って、アトラクチレノライドIII
又はその立体異性体を投与することにより、例えば、Ｈ
ＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質が発症に関与す
る自己免疫疾患（例えば、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマ
チなど）の患者の生理学的状態を有効に改善させ、前記
病気を効果的に治療することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アトラクチレノライドIII 又はその立体
異性体を有効成分として含有することを特徴とする、分
子量５７キロダルトンから６８キロダルトンまでの間の
熱ショックタンパク質の合成抑制剤。
【請求項２】アトラクチレノライドIII 又はその立体
異性体を含有する植物の抽出物を有効成分として含有す
ることを特徴とする、分子量５７キロダルトンから６８
キロダルトンまでの間の熱ショックタンパク質の合成抑
制剤。
【請求項３】ビャクジュツの抽出物を有効成分として
含有することを特徴とする、分子量５７キロダルトンか
ら６８キロダルトンまでの間の熱ショックタンパク質の
合成抑制剤。