JPH09201190A - Highly iron-containing plant produced by molecular breeding and method for producing the plant - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To increase the iron content in a plant by molecular breeding. SOLUTION: A plant cell having an extraneous ferritin gene (e.g. soybean ferritin cDNA) which has been transduced in an expressible state. A plant (e.g. lettuce) having the plant cells in which extraneous ferritin genes have been transduced in an expressive state. A progeny (e.g. seed) derived from the plant and still able to express the extraneous ferritin gene. The extraneous gene is transduced into a plant cell to obtain a transformed plant cell, and the transformed plant cell is regenerated into a plant. Thus, a plant increased in iron content is obtained. A plant transformant having a plant cell into which an extraneous ferritin gene has been transduced is prepared, and then the plant cells among the transformants are made to express the extraneous ferritin genes. Thus, the iron contents in the plant cells are increased.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は分子育種法による高
鉄含量植物の作出に関するものである。より詳しくは、
本発明は、分子育種法を利用することにより、外来フェ
リチン遺伝子を導入した植物細胞、植物およびその後
代、ならびに上記植物の作出方法および外来フェリチン
遺伝子を植物に導入して植物中の鉄含量を増加させる方
法に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to the production of high iron content plants by the molecular breeding method. More specifically,
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention utilizes a molecular breeding method to increase the iron content of a plant cell by introducing an exogenous ferritin gene, a plant and its progeny, and a method for producing the plant and introducing the exogenous ferritin gene into the plant. It is about how to make.

【０００２】[0002]

【従来の技術】生物にとって必須元素である鉄は、植物
体においてはフェレドキシン等の機能分子として利用さ
れている他に、フェリチンと呼ばれる、内部に鉄を貯蔵
するタンパク質に存在することが知られている。通常の
金属タンパク質は１分子あたり数個の金属原子と結合し
ているのに対し、フェリチンは１分子あたり最高４５０
０個の鉄原子を貯蔵することができる。このため、植物
体中のフェリチン含有量を高めることで、フェレドキシ
ン等の機能分子に影響を与えることなく、植物体中の鉄
含量だけを増加させることができると考えられる。フェ
リチンは動・植物を問わず生物に広く存在する成分で、
分子量が約４５００００の巨大なタンパク質であり、日
常摂取している肉や野菜の中にも含まれている。また、
ヒトやウマ等のフェリチンはタンパク質の分子マーカー
として市販されているものがあり、植物ではダイズおよ
びトウモロコシ等から遺伝子をクローニングした例も報
告されている〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8222
-8226 (1991), Plant Molecular Biology 19: 563-575
(1992)〕。2. Description of the Related Art Iron, which is an essential element for living organisms, is used in plants as a functional molecule such as ferredoxin, and is known to exist in a protein called ferritin that stores iron inside. There is. Normal metalloproteins are bound to several metal atoms per molecule, whereas ferritin has a maximum of 450 per molecule.
It is possible to store zero iron atoms. Therefore, it is considered that by increasing the ferritin content in the plant, it is possible to increase only the iron content in the plant without affecting functional molecules such as ferredoxin. Ferritin is a component that exists widely in organisms regardless of animals and plants,
It is a huge protein with a molecular weight of about 450,000, and it is also contained in the meat and vegetables we eat daily. Also,
There are some commercially available ferritins such as humans and horses as molecular markers for proteins, and examples of cloning genes from plants such as soybean and corn have also been reported in plants [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 8222
-8226 (1991), Plant Molecular Biology 19: 563-575.
(1992)].

【０００３】一方、次代の食物供給手段の一つとして、
野菜工場の開発が現在進められている。野菜工場におけ
る共通した特徴は、温度や光条件の制御による生産性の
向上および安定化を図り、極力外部との交流を遮断する
と共に水耕栽培方式を採用することにより、無農薬で清
浄な野菜生産を可能にしたことである。しかし、このよ
うな野菜工場での栽培を目標にした専用の品種は現在存
在せず、もっぱら土耕栽培で使用されている品種を用い
ているのが現状である。これは、近年の野菜工場の著し
い発達に、従来の交配を基本とした育種が対応できなか
ったことが原因の一つと考えられる。従って、野菜工場
の特質、すなわち物理環境や植物栄養学的な制御技術の
進歩に対応した植物の早期育成が望まれている。On the other hand, as one of the next-generation food supply means,
The development of a vegetable factory is currently underway. The common feature of vegetable factories is to improve and stabilize the productivity by controlling the temperature and light conditions, to cut off the exchange with the outside as much as possible, and to adopt the hydroponic cultivation method, which makes it a pesticide-free and clean vegetable. This is what made production possible. However, there is currently no dedicated variety aiming at cultivation in such a vegetable factory, and the present situation is to use a variety exclusively used for soil cultivation. This is considered to be one of the reasons why conventional breeding based on mating could not cope with the recent remarkable development of vegetable factories. Therefore, early growth of plants corresponding to the characteristics of vegetable factories, that is, the progress of physical environment and control technology of plant nutrition is desired.

【０００４】野菜工場で栽培される野菜はホウレンソ
ウ、レタス、ミツバ等が主なものである。これらのう
ち、レタスは水耕栽培に適しているため野菜工場におけ
る生産量が多く、市場でもサラダ用等として需要が多
い。レタスは元来ホウレンソウ等に比べて鉄含量が低い
が、シュウ酸等の人体に好ましくない成分は多量には含
んでおらず、品種改良によってレタスの鉄含量を高める
ことができれば、「鉄を豊富に含むサラダ用の野菜」と
いう新しいコンセプトを消費者に提案できるようにな
り、野菜工場用の新品種としての需要が見込まれる。The vegetables cultivated in the vegetable factory are mainly spinach, lettuce, honeywort and the like. Among these, lettuce is suitable for hydroponic cultivation, and therefore has a large amount of production in vegetable factories, and there is a large demand in the market for lettuce. Although lettuce originally has a lower iron content than spinach, it does not contain large amounts of oxalic acid and other undesirable components to the human body. The new concept of "vegetables for salads included in" can be proposed to consumers, and demand for new varieties for vegetable factories is expected.

【０００５】なお、通常の栽培技術として、培養液中の
鉄濃度を上げることにより植物体中の鉄含量を増加させ
ることは知られている。これは、高度な培養液管理を必
要とし、一般には適用しにくい。また、不適切な管理に
より、この栽培技術をレタスに適用しても、鉄含量が増
加しないばかりでなく、高い鉄濃度により生長が阻害さ
れるという弊害が生じる可能性がある。As a usual cultivation technique, it is known to increase the iron content in the plant by increasing the iron concentration in the culture solution. This requires a high degree of culture control and is generally difficult to apply. Further, due to improper management, even if this cultivation technique is applied to lettuce, not only the iron content does not increase, but also a high iron concentration may hinder the growth.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、レタ
ス等の植物の鉄含量の増加を分子育種法により可能にす
ることを課題としてなされたものであり、より具体的に
は、外来フェリチン遺伝子を導入した植物細胞、植物お
よび後代、ならびに上記植物の作出方法および外来フェ
リチン遺伝子を植物に導入して植物中の鉄含量を増加さ
せる方法の提供を課題とする。Therefore, the present invention has been made as a subject to make it possible to increase the iron content of plants such as lettuce by a molecular breeding method. More specifically, the foreign ferritin gene is provided. It is an object of the present invention to provide a plant cell into which is introduced, a plant and progeny, a method for producing the plant and a method for introducing an exogenous ferritin gene into a plant to increase the iron content in the plant.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者は、ダイズ由来
のフェリチン遺伝子を外来遺伝子として植物細胞に導入
し、その外来遺伝子の細胞内での発現、形質転換植物体
の再生および該植物体での鉄含量等について検討したと
ころ、このような遺伝子組換えの手法により、植物体中
の鉄含量を増加させ得ることを見出し、さらに鋭意検討
の末、本発明を完成させた。Means for Solving the Problems The present inventor has introduced a soybean-derived ferritin gene as a foreign gene into plant cells, expressing the foreign gene in the cell, regenerating a transformed plant, and transforming the plant. As a result of studying the iron content and the like of the above, it was found that the iron content in the plant can be increased by such a gene recombination method, and the present invention was completed after further intensive studies.

【０００８】すなわち、本発明は、外来フェリチン遺伝
子が発現可能に導入された植物細胞に関する。また、本
発明は、外来フェリチン遺伝子が発現可能に導入された
植物細胞を有する植物に関する。さらに、本発明は、上
記植物から得られる依然として外来フェリチンを発現可
能である後代に関する。That is, the present invention relates to a plant cell into which an exogenous ferritin gene has been introduced so that it can be expressed. The present invention also relates to a plant having a plant cell into which an exogenous ferritin gene has been introduced so that it can be expressed. Furthermore, the present invention relates to progeny obtained from the above plants, which are still capable of expressing foreign ferritin.

【０００９】本発明において外来フェリチン遺伝子と
は、形質転換される植物細胞以外の細胞であって、前記
形質転換される植物細胞とは同種であっても異種であっ
てもよい細胞に由来するフェリチン遺伝子のうち、植物
細胞に導入されて鉄を多量に貯蔵できるフェリチンを発
現し得るものを意味する。この外来フェリチン遺伝子に
は、該遺伝子から発現されたフェリチンが活性であれば
（すなわち、該フェリチンが鉄貯蔵機能等の特有の性質
を有すれば）、その塩基配列の一部が遺伝子工学的に改
変された遺伝子や、一の遺伝子に対して縮重の関係にあ
るコドンを有する遺伝子を包含することはいうまでもな
い。また、本発明において植物細胞とは、単一の植物細
胞のみならず、該細胞の集合体で芽や根というような分
化構造を有していないカルスと呼ばれるもの等を包含す
る。本発明において植物とは、上記植物細胞から再生さ
れた完全な植物体およびカルスから該植物体に至る途上
にある不定芽や不定胚等をも意味する。さらに、本発明
において後代とは、上記植物から得られる、次代の植物
体となり得る種子、塊茎、ムカゴ等を意味する。In the present invention, the exogenous ferritin gene is a ferritin derived from a cell other than a plant cell to be transformed, which may be the same or different from the plant cell to be transformed. Among the genes, it is meant a gene capable of expressing ferritin that can be introduced into plant cells and store a large amount of iron. In this foreign ferritin gene, if the ferritin expressed from the gene is active (that is, if the ferritin has specific properties such as iron storage function), a part of its nucleotide sequence is genetically engineered. It goes without saying that a modified gene and a gene having a codon having a degenerate relationship with one gene are included. Further, in the present invention, the plant cell includes not only a single plant cell but also a so-called callus that is an aggregate of the cells and does not have a differentiated structure such as a bud or a root. In the present invention, the plant also means a complete plant regenerated from the above plant cells and adventitious buds, adventitious embryos and the like on the way from callus to the plant. Further, in the present invention, the progeny means seeds, tubers, squirrels, etc. obtained from the above-mentioned plants and capable of becoming the next-generation plants.

【００１０】本発明はまた、外来フェリチン遺伝子を植
物細胞内に導入して形質転換植物細胞を得、該形質転換
植物細胞を植物に再生することからなる鉄含量の増加し
た植物の作出方法に関する。The present invention also relates to a method for producing a plant having an increased iron content, which comprises introducing a foreign ferritin gene into a plant cell to obtain a transformed plant cell and regenerating the transformed plant cell into the plant.

【００１１】本発明において、植物細胞内への外来フェ
リチン遺伝子の導入は公知のあらゆる方法により行い得
るが、例示すれば、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミ
ドに所望の外来フェリチン遺伝子を発現可能に組み込
み、それをアグロバクテリウム・チュメファシエンス(A
grobacterium tumefaciens) またはアグロバクテリウム
・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)を介して導入
することができる。Ｔｉプラスミドを用いた場合、外来
フェリチン遺伝子の導入はリーフディスク法により植物
細胞に直接行われ得る。また、植物プロトプラストを予
め調製した後、外来フェリチン遺伝子を保持するプラス
ミドを用いてエレクトロポレーション法、マイクロイン
ジェクション法、ポリエチレングリコール法、直接塗布
法により外来フェリチン遺伝子を植物細胞中に導入する
こともできる。In the present invention, the foreign ferritin gene can be introduced into plant cells by any known method. For example, a desired foreign ferritin gene can be incorporated into a Ti plasmid or Ri plasmid so that the foreign ferritin gene can be expressed. Agrobacterium tumefaciens (A
grobacterium tumefaciens) or Agrobacterium rhizogenes. When the Ti plasmid is used, the introduction of the exogenous ferritin gene can be carried out directly into plant cells by the leaf disc method. In addition, after preparing a plant protoplast in advance, it is also possible to introduce the exogenous ferritin gene into plant cells by electroporation, microinjection, polyethylene glycol, or direct application using a plasmid carrying the exogenous ferritin gene. .

【００１２】本発明はさらに、外来フェリチン遺伝子を
導入した植物細胞を有する植物形質転換体を得、該形質
転換体中の植物細胞に外来フェリチン遺伝子を発現させ
て植物細胞中の鉄含量を増加させる方法に関する。The present invention further obtains a plant transformant having a plant cell into which an exogenous ferritin gene has been introduced, and expresses the exogenous ferritin gene in the plant cell in the transformant to increase the iron content in the plant cell. Regarding the method.

【００１３】[0013]

【発明の実施の形態】本発明の一つの好ましい態様を以
下に示す。しかしながら、本発明が該態様に限定される
ものでないことはいうまでもない。カナマイシン耐性遺
伝子（ＮＰＴ ＩＩ）およびカリラワー・モザイク・ウ
イルスの３５Ｓプロモーターにより転写制御されている
β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を有するバイナ
リーベクターのＧＵＳを切除した箇所に７８０塩基対
（ｂｐ）を有するダイズフェリチンｃＤＮＡを連結した
プラスミドｐＢＧ−１を導入したアグロバクテリウム・
チュメファシエンスＬＢＡ４４０４株（ＦＥＲＭ Ｐ−
１５３９３）の培養懸濁液に、植物、例えばレタス、ミ
ツバ、ブロッコリー、カリフラワー、セロリ、サラダ
菜、キャベツ、ホウレンソウ、ダイズ、ニンジン、キュ
ウリ、トマト、ジャガイモ等のリーフディスクを浸漬し
た後、カナマイシン耐性をマーカーとして形質転換体を
選抜する。その後、必要に応じ、該形質転換体の継代培
養を繰り返し、カルス、不定芽そして植物体、さらには
種子、塊茎等の後代を作出することができる。それら各
工程における条件等は使用した植物等に応じ適宜選択さ
れる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION One preferred embodiment of the present invention will be described below. However, it goes without saying that the present invention is not limited to this aspect. Soybean ferritin having 780 base pairs (bp) at the excision site of GUS of a binary vector having a kanamycin resistance gene (NPT II) and a β-glucuronidase gene (GUS) transcriptionally regulated by the 35S promoter of the callillawer mosaic virus Agrobacterium into which the plasmid pBG-1 in which the cDNA was ligated was introduced.
Tumefaciens LBA4404 strain (FERM P-
15393) is immersed in a culture suspension of plants such as lettuce, honeybee, broccoli, cauliflower, celery, salad vegetables, cabbage, spinach, soybean, carrot, cucumber, tomato, potato and the like, and then kanamycin resistance is used as a marker. The transformants are selected as. Thereafter, if necessary, subculture of the transformant can be repeated to produce callus, adventitious buds and plants, and further progeny such as seeds and tubers. The conditions and the like in each of these steps are appropriately selected according to the plant and the like used.

【００１４】[0014]

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。The present invention will be described below based on examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００１５】実施例１：レタスの形質転換 最初に本実施例で使用される材料および行われる試験の
方法について説明し、次にその試験の結果およびそれに
基づく考察を記載する。 Ａ．材料および方法 Ａ．１ 水耕培養液中の鉄濃度の変化に伴うレタス鉄含
量 （１）レタスの栽培 野菜工場において頻繁に作付けられているリーフレタス
型のレタス（Lactucasativa L，品種：リーフレタスグ
リーン；サカタのタネ）をウレタンキューブに播種し、
２５℃、１６時間日長、１００００ルクスで育苗した
後、２週間目に２５℃に制御した自然光温室内のＮＦＴ
式水耕栽培ベッドへ移植し栽培を継続した。水耕培養液
は１／２濃度の園試処方とし、その中に含まれる鉄の濃
度を０、０．１６、１．６、１６ｍｇ／ｌの４種類に設
定した。なお、１／２濃度の園試処方の鉄濃度は１．６
ｍｇ／ｌである。水耕栽培ベッドへ移植して３０日後に
地上部を約１２ｇ生重採取した。 （２）鉄含量の測定 サンプリングしたレタスの地上部を６０℃の通風乾燥器
で乾燥し、粉砕した試料０．５ｇに濃硝酸５ｍｌを添加
後、試料と硝酸がなじんでから３０％過酸化水素水１ｍ
ｌを加えた。以後、この操作を数回繰り返し、液が透明
になった後に、蒸発乾固させた。これに、１Ｎ ＨＣｌ
２５ｍｌ加え、無機成分を抽出後、濾紙で濾過した液を
河野の方法〔電力中央研究所報告：Ｕ８９０１３（１９
８９）〕に従って、ＩＣＰ（高周波誘導結合型プラズマ
発光分光分析計；セイコー電子工業）分析に供した。Example 1 Transformation of Lettuce First, the materials used in this example and the method of the test carried out are described, and then the results of the test and the discussion based thereon are described. A. Materials and Methods A. 1 Lettuce iron content according to changes in iron concentration in hydroponic culture medium (1) Cultivation of lettuce Leaf lettuce type lettuce (Lactucasativa L, variety: leaf lettuce green; Sakata seed) that is frequently planted in vegetable factories. Sow the urethane cubes,
NFT in a natural light greenhouse controlled at 25 ° C for 2 weeks after raising seedlings at 25 ° C, 16-hour photoperiod, 10,000 lux
It was transplanted to a hydroponics bed and cultivation was continued. The hydroponic culture solution was a half-concentration garden prescription, and the concentration of iron contained therein was set to four kinds of 0, 0.16, 1.6, and 16 mg / l. The iron concentration of the half-concentration garden trial formula is 1.6
mg / l. Thirty days after transplanting to a hydroponic culture bed, about 12 g of the above-ground portion was freshly sampled. (2) Measurement of iron content The above-ground part of the lettuce sampled was dried with a forced air dryer at 60 ° C, and 5 ml of concentrated nitric acid was added to 0.5 g of the crushed sample. 1m water
1 was added. Thereafter, this operation was repeated several times, and after the liquid became transparent, it was evaporated to dryness. To this, 1N HCl
After adding 25 ml and extracting the inorganic component, the liquid filtered with a filter paper was used as the method of Kawano [Central Research Institute of Electric Power Industry: U89013 (19).
89)], and subjected to ICP (high frequency inductively coupled plasma emission spectrophotometer; Seiko Denshi Kogyo) analysis.

【００１６】Ａ．２ レタスにおけるフェリチン遺伝子
の存在確認 Shure らの方法〔Cell. 35 225-233 (1983) 〕を改変し
て、全ＤＮＡをレタス（品種：リーフレタスグリーン）
の成熟葉から抽出した。まず、成熟葉３ｇを液体窒素存
在下で乳鉢と乳棒で細かく破砕した。そして、抽出液
（０．３５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），０．０２Ｍ ＥＤＴＡ，２％サルコ
シル，５％ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ＥＤＴＡ）緩衝液
で飽和させたフェノール，５．０Ｍ尿素）２０ｍｌと１
０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）１．４７ｍｌを
加え、６５℃で５分間静置した後、ゆっくりと室温に戻
した。試料液に等量のフェノール・クロロホルムを加
え、３０分震盪後、スイングローター（ＬＣ−１２０；
トミー社）を用いて２８００ｒｐｍで２０分間遠心分離
した。上清を新しい容器に移し、等量のフェノール・ク
ロロホルムを加え同様な操作を繰り返した。次に遠心分
離後の上清に等量の水飽和エーテルを加え、２０分震盪
した後、再びスイングローターを用いて２８００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した。上清に１／１０量の３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．２）を添加した後、エタノールを
加えてＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを減圧乾燥
後、６００μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。A. 2 Confirmation of the presence of the ferritin gene in lettuce By modifying the method of Shure et al. [Cell. 35 225-233 (1983)], the total DNA was lettuce (variety: leaf lettuce green).
It was extracted from mature leaves of. First, 3 g of mature leaves were finely crushed with a mortar and pestle in the presence of liquid nitrogen. Then, the extract (0.35M NaCl, 0.05M Tris-HC
20 ml of 1 (pH 7.5), 0.02 M EDTA, 2% sarcosyl, 5% TE (Tris-HCl, EDTA) buffer saturated phenol, 5.0 M urea)
1.47 ml of 0% SDS (sodium dodecyl sulfate) was added, and the mixture was allowed to stand at 65 ° C. for 5 minutes and then slowly returned to room temperature. An equal amount of phenol / chloroform was added to the sample solution, and after shaking for 30 minutes, a swing rotor (LC-120;
It was centrifuged at 2800 rpm for 20 minutes using a Tommy company. The supernatant was transferred to a new container, an equal amount of phenol / chloroform was added, and the same operation was repeated. Next, an equal amount of water-saturated ether was added to the supernatant after centrifugation, shaken for 20 minutes, and then again using a swing rotor at 2800 rpm.
For 20 minutes. After adding 1/10 amount of 3M sodium acetate (pH 5.2) to the supernatant, ethanol was added to precipitate the DNA. The precipitated DNA was dried under reduced pressure and then dissolved in 600 μl of TE buffer.

【００１７】ＤＮＡ（５μｇ）を制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ
で消化後、完全に消化されていることをミニゲルによる
電気泳動で確認した後、アガロースゲル電気泳動によっ
て、ＤＮＡを分離した。次にナイロン膜（Hybond-N⁺ ；
アマルシャム社）にＤＮＡを転写してサザンハイブリダ
イゼーションに供試した。ハイブリダイゼーションには
ジゴキシゲニンでラベルしたダイズフェリチンｃＤＮＡ
（後述）をプローブとしてナイロン膜６０ｃｍ² あたり
４０ｎｇを用いた。プレハイブリダイゼーションおよび
ハイブリダイゼーションの温度は６８℃とし、ときどき
攪拌した。検出は、アルカリホスファターゼによる免疫
学的検出法（DIG-ELISA DNA Labeling and Detection K
it; ベーリンガー・マンハイム社製のものを使用）に基
づいて行った。DNA (5 μg) was digested with the restriction enzyme EcoRI
After digestion with, the complete digestion was confirmed by electrophoresis on a mini gel, and then DNA was separated by agarose gel electrophoresis. Next, nylon membrane (Hybond-N ⁺ ；
The DNA was transferred to Amersham) and subjected to Southern hybridization. Soybean ferritin cDNA labeled with digoxigenin for hybridization
40 ng per 60 cm ² of nylon membrane was used as a probe (described later). Pre-hybridization and hybridization temperatures were 68 ° C. with occasional agitation. For detection, an immunological detection method using alkaline phosphatase (DIG-ELISA DNA Labeling and Detection K
it; the one manufactured by Boehringer Mannheim is used).

【００１８】プローブ用のダイズフェリチンｃＤＮＡを
得るために、次項Ａ．３（１）に示すダイズと同様な方
法で栽培し、培養液交換後９６時間の成葉をサンプリン
グして、そこから全ＲＮＡを抽出した。次に、全ＲＮＡ
を鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcriptase-
Polymerase Chain Reaction ）を行った。逆転写反応に
はランダムプライマーを用い、ＰＣＲ反応には表３のプ
ライマーＧ−１、Ｇ−１Ｒを用いた。得られたＰＣＲ産
物をシークエンスすると既知フェリチンシークエンスと
相同性が９４％であったので、以後、このＰＣＲ産物を
プローブとして実験に用いた。In order to obtain soybean ferritin cDNA for the probe, the following item A. Cultivation was carried out in the same manner as soybean shown in 3 (1), and 96 hours after the exchange of the culture solution, adult leaves were sampled, and total RNA was extracted therefrom. Next, total RNA
RT-PCR (Reverse Transcriptase-
Polymerase Chain Reaction) was performed. Random primers were used for the reverse transcription reaction, and primers G-1 and G-1R in Table 3 were used for the PCR reaction. When the obtained PCR product was sequenced, the homology with the known ferritin sequence was 94%, and hence this PCR product was used as a probe in the experiments.

【００１９】Ａ．３ レタスとダイズにおけるフェリチ
ン遺伝子の発現と遺伝子の単離 （１）鉄欠乏に対する発現量の変化 レタス（品種：リーフレタスグリーン）を上記Ａ．１
（１）と同様に播種、育成後、１／２濃度の園試処方培
養液で湛液式栽培した。播種して１ヵ月後に鉄を除いた
１／２濃度の園試処方培養液と交換した。さらに５日経
過後、１／２濃度の園試処方培養液と交換した。この時
点を０時間として、以後、１２、２４、４８時間後に成
葉１ｇをサンプリングした。ダイズ（Glycine max ，品
種：北の四季；大谷種苗園）についても同様な実験を行
い、成葉のサンプリングを行った。ただし、ダイズの場
合は１２時間後のサンプリングは行わなかった。サンプ
ルを液体窒素中で破砕した後、２ｍｌのグアニジンチオ
シアネート液を加え、ホモジナイザーで２分間処理した
後、処理液を１００００ｒｐｍで１０分間室温にて遠心
分離した。上清１．４ｍｌに対しＣｓＣｌ０．７ｇを加
え完全に溶解させた。その後、５．７Ｍ ＣｓＣｌ０．
８ｍｌに重層した。スイングローター（ＴＬＳ５５；ベ
ックマン社）を用い５５０００ｒｐｍで３時間、２０℃
にて超遠心分離を行った。沈澱を蒸留滅菌水に溶解した
後、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を
加え、エタノール沈澱処理をした。沈澱をＴｒｉｓ−Ｓ
ＤＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１
％ＳＤＳ）溶液１ｍｌに溶解させ、フェノール・クロロ
ホルム抽出を２回およびクロロホルム抽出を１回行い、
再びエタノール沈澱処理を行った。沈澱を３００μｌ蒸
留滅菌水に溶解させ、４０μｇ／μｌとなるように調整
した。得られた全ＲＮＡを１レーンあたり２０μｇずつ
アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ナイロ
ン膜（Ａ．２に記載と同様のもの）へＲＮＡをキャピラ
リーブロットした。ハイブリダイゼーションはG. Engle
r-Blumらの方法〔Anal. Biochem. 210. 235-244 (199
3)〕に準拠した。プローブはＡ．２のサザンハイブリダ
イゼーションに供したものと同じものを使用した。A. 3 Expression of ferritin gene and isolation of gene in lettuce and soybean (1) Change in expression level with respect to iron deficiency Lettuce (cultivar: leaf lettuce green) was prepared according to the above-mentioned A. 1
After sowing and growing in the same manner as in (1), a submerged cultivation was carried out with a half-concentration garden prescription culture solution. One month after seeding, the culture medium was replaced with a 1/2 concentration garden test formulation culture medium without iron. After a further 5 days, the culture medium was replaced with a half-concentration garden test formulation. At this point of time as 0 hour, 1 g of the adult leaf was sampled after 12, 24 and 48 hours. The same experiment was conducted on soybean (Glycine max, variety: northern four seasons; Otani seed nursery), and adult leaves were sampled. However, in the case of soybean, sampling after 12 hours was not performed. After crushing the sample in liquid nitrogen, 2 ml of guanidine thiocyanate solution was added and treated with a homogenizer for 2 minutes, and then the treated solution was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes at room temperature. 0.7 g of CsCl was added to 1.4 ml of the supernatant to completely dissolve it. Then, 5.7M CsCl0.
Layered on 8 ml. Swing rotor (TLS55; Beckman) at 55000 rpm for 3 hours at 20 ° C.
Ultracentrifugation was performed. After the precipitate was dissolved in distilled sterilized water, 1/10 amount of 3M sodium acetate (pH 5.2) was added and ethanol precipitation treatment was performed. Precipitate Tris-S
DS (50 mM Tris-HCl (pH 9.0), 1
% SDS) solution, and phenol / chloroform extraction twice and chloroform extraction once,
The ethanol precipitation treatment was performed again. The precipitate was dissolved in 300 μl distilled sterilized water and adjusted to 40 μg / μl. The total RNA thus obtained was subjected to agarose gel electrophoresis in an amount of 20 μg per lane. After electrophoresis, RNA was capillary-blotted onto a nylon membrane (similar to that described in A.2). Hybridization is G. Engle
r-Blum et al. [Anal. Biochem. 210. 235-244 (199
3)] The probe is A. The same one used for Southern hybridization of 2 was used.

【００２０】（２）遺伝子の単離と塩基配列の決定 ノーザンハイブリダイゼーションの結果から、最も発現
量の高かった２４時間後のダイズ成熟葉から抽出した全
ＲＮＡをｐｏｌｙ（ｔ）カラムに２回通して、ｍＲＮＡ
を精製した。そして、タンパク質への翻訳開始点から終
結点までを含む領域において増幅が行われるようにＰＣ
Ｒプライマーをデザイン（表３，Ｇ−１，Ｇ−２Ｒ）
し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、逆転写反応のプライ
マーは１６ｍｅｒのｄＴＴＰとした。反応条件は表３の
とおりである。反応終了後、ＰＣＲ産物をゲルから切出
し、ＰＣＲ ＩＩベクター（インビトロゲン社）へ連結
して、塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、蛍光
式オートシーケンサー（３７３Ａ−１８；ＡＢＩ社）を
用いた。(2) Isolation of Gene and Determination of Nucleotide Sequence From the result of Northern hybridization, total RNA extracted from mature soybean leaves 24 hours after which expression was highest was passed twice through a poly (t) column. And mRNA
Was purified. Then, a PC is used so that amplification is performed in the region including the translation initiation point to the protein termination point.
Design R primer (Table 3, G-1, G-2R)
Then, RT-PCR was performed. The primer for the reverse transcription reaction was 16mer dTTP. The reaction conditions are shown in Table 3. After completion of the reaction, the PCR product was cut out from the gel and ligated to PCR II vector (Invitrogen) to determine the nucleotide sequence. A fluorescent auto sequencer (373A-18; ABI) was used for the determination of the base sequence.

【００２１】Ａ．４ レタスへの外来遺伝子導入法の確
立 （１）外来遺伝子の導入と選抜 構築したプラスミドｐＢＧ−１（図２）をアグロバクテ
リウム（Agrobacterium tumefaciens LBA4404 ）へバイ
ナリーベクター法により導入した。なお、形質転換効率
や、形質転換後の鉄含有量の違いに対して、品種により
影響の表れかたが異なってくる可能性を考慮し、３種の
リーフレタス型のレタス（品種；グリーンウエーブ，マ
ミー：共にタキイ種苗，テルミー：サカタのタネ）を供
試材料とした。無菌播種して５日目のレタスの両端を切
除した子葉をｐＢＧ−１を導入したアグロバクテリウム
培養懸濁液中に５分間浸漬させた。そして、余分な懸濁
液を濾紙で除去後、ＭＳ培地（０．１ｍｇ／ｌ ＮＡ
Ａ，０．１ｍｇ／ｌ ＢＡ）に置床した。２日後、５０
ｍｇ／ｌカナマイシンと１００ｍｇ／ｌセファロリジン
を含有する培地へ外植体を継代した。以後、Enomoto ら
の方法〔Plant Cell Reports 9: 6-9 (1990)〕に従っ
た。形質転換体の選抜には５０ｍｇ／ｌカナマイシンを
用いた。A. 4. Establishment of method for introducing foreign gene into lettuce (1) Introduction and selection of foreign gene The constructed plasmid pBG-1 (Fig. 2) was introduced into Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens LBA4404) by the binary vector method. In consideration of the possibility that different varieties may affect the efficiency of transformation and the difference in iron content after transformation, different types of lettuce-type lettuce (variety; green wave) , Mommy: Both seedlings were used as test materials, and Terumi: Sakata seeds). The cotyledons obtained by aseptically seeding and excising both ends of the lettuce on the 5th day were immersed in a pBG-1-introduced Agrobacterium culture suspension for 5 minutes. After removing the excess suspension with filter paper, MS medium (0.1 mg / l NA
A, 0.1 mg / l BA). 2 days later, 50
Explants were passaged into medium containing mg / l kanamycin and 100 mg / l cephaloridine. Thereafter, the method of Enomoto et al. [Plant Cell Reports 9: 6-9 (1990)] was followed. 50 mg / l kanamycin was used for selection of transformants.

【００２２】（２）ＰＣＲによる確認 独立した外植体由来の形質転換レタスおよびコントロー
ルとして１／２濃度の園試処方培養液で培養したレタス
（品種；テルミー）から成葉０．１〜０．２ｇ採取し、
サザンハイブリダイゼーションの場合と同じ方法で全Ｄ
ＮＡを抽出し、５０μｌの滅菌蒸留水に溶解した。１μ
ｌＤＮＡ溶液と各１μｌのプライマー（５０μＭ）２
種、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ４μｌ混合液、×１０ＰＣＲ
緩衝液およびＴａｑポリメラーゼ１ユニットを混合し、
全体の容量を５０μｌに調整した。ＰＣＲ反応は変性９
４℃で１５秒、アニール５５〜６０℃で３０秒、伸長７
２℃で３０秒を３５サイクル行った。ここで用いたプラ
イマー、Ｇ−２、Ｇ−２Ｒ、Ｇ−３、Ｇ−３Ｒの塩基配
列と外来ＤＮＡへの結合領域をそれぞれ表３および図３
（Ｃ）に示す。(2) Confirmation by PCR Transformed lettuce derived from an independent explant and, as a control, lettuce (variety: telmy) cultured in a 1/2 concentration garden trial formulation medium were grown to 0.1 to 0. Collect 2g,
All D in the same way as for Southern hybridization
NA was extracted and dissolved in 50 μl of sterile distilled water. 1μ
lDNA solution and 1 μl of each primer (50 μM) 2
Seed, 2.5 mM dNTP 4 μl mixture, × 10 PCR
Mix buffer and 1 unit of Taq polymerase,
The total volume was adjusted to 50 μl. PCR reaction is denatured 9
15 seconds at 4 ℃, 30 seconds at 55-60 ℃ annealing, extension 7
Thirty-five cycles of 30 seconds were performed at 2 ° C. The nucleotide sequences of the primers used here, G-2, G-2R, G-3, and G-3R, and the binding region to foreign DNA are shown in Table 3 and FIG. 3, respectively.
It is shown in (C).

【００２３】Ｂ．結果 Ｂ．１ 培養液中の鉄濃度とレタスの鉄含量 培養液中の鉄濃度１．６ｍｇ／ｌで栽培したリーフレタ
ス型レタスの鉄含量は３６μｇ／ｇ乾重となり、文献値
〔四訂日本食品成分表，医歯薬出版（１９８４）〕によ
るクリスプヘッド型レタスの５２μｇ／ｇ乾重に対し
て、乾重率を９．６％とした場合、約７０％の鉄含有量
となった（表１）。しかし、培養液の鉄濃度を１０倍の
１６ｍｇ／ｌにして栽培したレタスの鉄含量は４２７μ
ｇ／ｇ乾重となり、ホウレンソウの文献値（同上）に匹
敵する値を示した。次に、各栽培区での植物体の生育状
況を見ると、鉄濃度１．６ｍｇ／ｌで栽培したレタスに
比べて１６ｍｇ／ｌで栽培したレタスの生長は劣ってお
り、生育の初期段階では、黄化を起こしている個体も見
られた。また、葉端は褐変しており、鉄の過剰によると
考えられる障害を起こしていた。なお、０ｍｇ／ｌおよ
び０．１６ｍｇ／ｌで栽培したレタスは、育苗後、水耕
ベッドへ移植した時点からほとんど生育を示さず、白色
化し枯死する個体も多数見られた。よって、レタス中の
鉄含量を測定することはできなかった。B. Results B. 1 Iron concentration in culture medium and iron content of lettuce The iron content of leaf lettuce type lettuce cultivated at an iron concentration of 1.6 mg / l in the culture medium was 36 μg / g dry weight, which was a literature value [4th Edition Japanese Food Ingredients Table , Ito Denryaku Shuppan (1984)], the iron content was about 70% when the dry weight ratio was 9.6% with respect to the dry weight of 52 μg / g of crisp head type lettuce (Table 1). . However, the iron content of lettuce cultivated with the iron concentration of the culture broth being 10 times 16 mg / l was 427 μm.
It became g / g dry weight, which was comparable to the literature value of spinach (same as above). Next, looking at the growth situation of the plants in each cultivation area, the growth of lettuce cultivated at 16 mg / l was inferior to that of lettuce cultivated at an iron concentration of 1.6 mg / l. , Some individuals had yellowing. In addition, the leaf ends were browning, causing damage that was probably due to excess iron. In addition, lettuce cultivated at 0 mg / l and 0.16 mg / l showed almost no growth from the time of transplanting to a hydroponic bed after raising the seedlings, and many individuals were whitened and died. Therefore, it was not possible to measure the iron content in the lettuce.

【００２４】[0024]

【表１】 [Table 1]

【００２５】Ｂ．２ レタスフェリチン遺伝子とその発
現 レタスにダイズやトウモロコシに存在するフェリチン遺
伝子が存在するか否かを確認するために、既に存在が確
認されているダイズフェリチンｃＤＮＡの部分配列をプ
ローブとしてサザンブロット分析を行った。その結果、
レタス全ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉで消化した場合
に８．２ｋｂｐのバンドが１本検出された。コントロー
ルとして用いた未消化ＤＮＡでは、高分子量付近におい
てバンドが検出された。各々のバンドの濃度はほぼ等し
く、かつ、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉで消化した場合のバン
ドは１本であったことから、レタスにもフェリチン遺伝
子が存在し、その遺伝子は染色体上の１遺伝子座にのみ
存在することが示唆された。B. 2 Lettuce ferritin gene and its expression In order to confirm whether or not the ferritin gene present in soybean or maize is present in lettuce, Southern blot analysis is carried out using a partial sequence of the soybean ferritin cDNA that has already been confirmed as a probe. It was as a result,
When the lettuce total DNA was digested with the restriction enzyme EcoRI, one band of 8.2 kbp was detected. In the undigested DNA used as a control, a band was detected near the high molecular weight. The concentration of each band was almost the same, and since there was only one band when digested with the restriction enzyme EcoRI, the ferritin gene was present in lettuce, and that gene was present only at one locus on the chromosome. It was suggested to exist.

【００２６】さらに、ダイズやトウモロコシのフェリチ
ン遺伝子では、培養液中の鉄濃度の急激な変化に対して
反応し、発現量が高まることが知られており、レタスの
フェリチン遺伝子についても同様なことが期待された。
そこで、５日間の鉄欠乏状態から急激に鉄を供給するこ
とによって生じる刺激（以後、鉄刺激と記載する，Ａ．
３（１）参照）を与えたレタスおよびダイズの植物体か
らＲＮＡを抽出して、フェリチン遺伝子の鉄刺激に対す
る発現の様子を調べる目的でノーザンブロット分析を行
った。その結果、ダイズでは刺激を与えてから、２４時
間後に発現量が強まり、４８時間後には減少した。ま
た、鉄刺激を与えられていない状態の０時間においても
いくらかの発現を示した。一方、レタスでは、鉄刺激に
よる発現量の変化や、鉄刺激を与えられていない状態に
おいて発現は見られなかった。なお、レタスとダイズの
遺伝子レベルでの相同性を比較すると、タンパク質をコ
ードしている領域の相同性は９５％と高いにもかかわら
ず、このような違いが生じた原因は、遺伝子の制御領域
の違いによるものと考えられる。Further, it is known that the ferritin gene of soybean and corn responds to a rapid change in iron concentration in the culture solution and its expression level increases, and the ferritin gene of lettuce also has the same effect. Was expected
Therefore, stimulation caused by rapid iron supply from an iron deficiency state for 5 days (hereinafter referred to as iron stimulation, A.
RNA was extracted from lettuce and soybean plants given 3 (1)), and Northern blot analysis was carried out for the purpose of investigating the expression of the ferritin gene upon iron stimulation. As a result, the expression level increased in soybean 24 hours after the stimulation, and decreased 48 hours after the stimulation. In addition, some expression was shown even at 0 hours in the absence of iron stimulation. On the other hand, lettuce showed no change in the expression level due to iron stimulation and no expression in the state where iron stimulation was not given. In addition, when comparing the homology at the gene level between lettuce and soybean, even though the homology of the protein-coding region was high at 95%, the cause of this difference was due to the regulatory region of the gene. It is thought that it is due to the difference of.

【００２７】以上のことから、レタスにはフェリチン遺
伝子が存在しているが、その発現は弱いか、またはダイ
ズとは異なる発現の様式を有することがわかった。この
ことは、培養液の鉄濃度を変化させることによって、フ
ェリチンの発現量を高め、レタスの鉄含量を増加させる
ことが困難なことを示している。From the above, it was found that the ferritin gene is present in lettuce but its expression is weak or has an expression pattern different from that of soybean. This indicates that it is difficult to increase the expression level of ferritin and increase the iron content of lettuce by changing the iron concentration of the culture solution.

【００２８】Ｂ．３ ダイズフェリチン遺伝子の単離 レタスでは鉄刺激によるフェリチン遺伝子の発現は認め
られなかったので、既に存在が知られているダイズから
遺伝子を単離し、それをレタスに導入することとした。
鉄刺激によって発現量の増加した葉から抽出したｍＲＮ
Ａを鋳型としＲＴ−ＰＣＲによってフェリチンｃＤＮＡ
を合成した。さらに、これらのｃＤＮＡがフェリチンｃ
ＤＮＡであることをサザンハイブリダイゼーションによ
って確認した後、このｃＤＮＡをベクターｐＣＲ ＩＩ
にクローニングし、塩基配列を決定した（図１）。得ら
れた遺伝子は７８０ｂｐであり、ＰＣＲ反応で予定して
いた領域を増幅しており、翻訳開始コドンであるＡＴＧ
と終結コドンのＴＡＧを保持していた。既知ダイズフェ
リチン遺伝子との相同性は９５％であった。また、遺伝
子の配列から予想されるアミノ酸配列の相同性は９４％
だった。さらにアミノ酸配列の比較において、既知配列
と今回得られた配列のうち、親水性や疎水性等の類似の
性質を有するアミノ酸を同じものと仮定した場合、その
相同性は９８％となった。以上の結果から、得られたダ
イズｃＤＮＡはフェリチン遺伝子と結論づけられた。B. 3. Isolation of soybean ferritin gene Since expression of ferritin gene by iron stimulation was not observed in lettuce, it was decided to isolate the gene from soybean, which is already known to exist, and to introduce it into lettuce.
MRN extracted from leaves whose expression level was increased by iron stimulation
Ferritin cDNA by RT-PCR using A as a template
Was synthesized. Furthermore, these cDNAs are ferritin c
After confirming that the DNA is DNA by Southern hybridization, this cDNA is designated as vector pCR II.
Was cloned into and the nucleotide sequence was determined (Fig. 1). The obtained gene was 780 bp, which amplified the region expected in the PCR reaction, and was the translation initiation codon ATG.
And retained the termination codon TAG. The homology with the known soybean ferritin gene was 95%. In addition, the amino acid sequence homology predicted from the gene sequence is 94%.
was. Furthermore, in the comparison of amino acid sequences, when the amino acids having similar properties such as hydrophilicity and hydrophobicity were assumed to be the same among the known sequence and the sequence obtained this time, the homology was 98%. From the above results, it was concluded that the obtained soybean cDNA was a ferritin gene.

【００２９】Ｂ．４ ベクターの構築 プラスミドｐＢＩ１２１は、カナマイシン耐性遺伝子
（ＮＰＴ ＩＩ）およびカリラワー・モザイク・ウイル
スの３５Ｓプロモーターにより転写制御されているβ−
グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）を有するバイナリー
ベクターである。このｐＢＩ１２１を制限酵素ＳｍａＩ
とＳａｃＩで消化した後、アガロース電気泳動により分
画し、ＮＰＴ ＩＩを含む断片を回収した（図２）。一
方、フェリチンｃＤＮＡをクローニングしたプラスミド
ｐＣＲ ＩＩを制限酵素ＥｃｏＲ ＶおよびＳａｃＩで
消化後、フェリチンｃＤＮＡを含む断片を回収した。そ
して、ＮＰＴ ＩＩを含む断片とフェリチンｃＤＮＡの
２つのＤＮＡ断片をリガーゼにより連結し、新しくバイ
ナリーベクターｐＢＧ−１を構築した。このｐＢＧ−１
を導入したアグロバクテリウム・チュメファシエンスＬ
ＢＡ４４０４株（ＡＴ−ｐＢＧ１と命名）は通産省 工
業技術院 生命工学工業技術研究所 特許微生物寄託セ
ンターに１９９６年１月１７日寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ
−１５３９３の受託番号を有する。B. 4. Construction of vector 4 Plasmid pBI121 is β- which is transcriptionally regulated by the kanamycin resistance gene (NPT II) and the 35S promoter of Kaliliwer mosaic virus.
It is a binary vector having the glucuronidase gene (GUS). This pBI121 is a restriction enzyme SmaI
And digested with SacI and fractionated by agarose electrophoresis to recover the NPT II-containing fragment (FIG. 2). On the other hand, the plasmid pCR II in which the ferritin cDNA was cloned was digested with the restriction enzymes EcoR V and Sac I, and then the fragment containing the ferritin cDNA was recovered. Then, the fragment containing NPT II and the two DNA fragments of ferritin cDNA were ligated by ligase to construct a new binary vector pBG-1. This pBG-1
Introduced Agrobacterium tumefaciens L
The BA4404 strain (named AT-pBG1) was deposited on January 17, 1996 at the Patent Microorganism Depositary Center, Ministry of International Trade and Industry, Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, and FERM P.
It has a deposit number of -15393.

【００３０】フェリチンｃＤＮＡを制御する３５Ｓプロ
モーターは、植物の遺伝子組換え実験において最も汎用
されているプロモーターであり、発現量が大きいこと
と、発現時期や発現する組織の範囲が広いことで知られ
ている。従って、ｐＢＧ−１をレタスへ導入した場合、
３５Ｓプロモーターによりフェリチン遺伝子は恒常的に
発現され、レタス中のフェリチン含量が上昇することが
予測される。さらに、ｐＢＧ−１はＮＰＴ ＩＩを保持
していることから、植物へｐＢＧ−１が導入された場
合、カナマイシンにより選抜することが可能となる。以
上のことから、ｐＢＧ−１を導入後、カナマイシンの選
抜を受けた形質転換レタスは、外来のフェリチン遺伝子
の恒常的な発現により高いフェリチン含有量となり、さ
らに、その結果として、鉄含量が高まることが期待され
る。The 35S promoter controlling ferritin cDNA is the most widely used promoter in plant gene recombination experiments, and is known for its large expression level and its wide range of expression time and tissues. There is. Therefore, when pBG-1 was introduced into lettuce,
The ferritin gene is constitutively expressed by the 35S promoter, and the ferritin content in lettuce is expected to increase. Furthermore, since pBG-1 retains NPT II, it becomes possible to select with kanamycin when pBG-1 is introduced into a plant. From the above, after the introduction of pBG-1, the transformed lettuce selected for kanamycin has a high ferritin content due to the constitutive expression of the exogenous ferritin gene, and as a result, the iron content increases. There is expected.

【００３１】Ｂ．５ 形質転換体の作出 形質転換体であるカナマイシン耐性個体を選抜する目的
で、Ａ．４（１）に示したようにレタス外植体をカナマ
インシ５０ｍｇ／ｌ含有ＭＳ固体培地で培養した。生長
の早い個体では培養３０日後には不定芽の形成が見られ
た。数回の継代の後、不定芽を切り分け、植物ホルモン
を含まない培地へ移植し、発芽を促した。培養開始後９
０日程度で、馴化可能となった。表２はレタスの品種毎
に遺伝子導入効率を調査した結果であり、カナマイシン
に対しての抵抗性と感受性を表示した。品種によりばら
つきは大きく、供試数に対する抵抗性を示した個体の割
合は２〜１２％であった。選抜の精度に関しては、コン
トロールの個体が１００％感受性を示したことから、品
種間差や、導入した遺伝子が要因となるエスケープ（非
形質転換体に含まれるカナマイシン耐性個体）はほとん
どないものである。B. 5 Production of Transformant For the purpose of selecting a kanamycin resistant individual as a transformant, A. As shown in 4 (1), the lettuce explants were cultured in MS solid medium containing 50 mg / l of Scutellaria sinensis. The formation of adventitious shoots was observed after 30 days of culture in the fast-growing individuals. After several passages, adventitious buds were cut out and transferred to a medium containing no plant hormone to promote germination. 9 after the start of culture
It became possible to get accustomed in about 0 days. Table 2 shows the results of investigation of gene transfer efficiency for each lettuce variety, which shows the resistance and sensitivity to kanamycin. The variation was large depending on the variety, and the proportion of individuals showing resistance to the number of samples was 2 to 12%. Regarding the accuracy of selection, since the control individuals showed 100% sensitivity, there were almost no escapes (kanamycin-resistant individuals contained in non-transformants) due to differences among varieties or the introduced gene. .

【００３２】以上のことから、選抜したレタスに外来遺
伝子が導入されている可能性が示されたが、さらにこの
ことを確実に示すため、カナマイシン耐性を示したレタ
スから全ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ分析によって２
次スクリーニングを行った。図３（Ｃ）に示した位置に
プライマーがアニールするようにプライマーをデザイン
した。ＮＰＴ ＩＩの検出にはＧ−３、Ｇ−３Ｒプライ
マー、フェリチンｃＤＮＡの検出にはＧ−２、Ｇ−２Ｒ
プライマーを用いた（表３）。予測されるＰＣＲ産物の
サイズはＮＰＴ ＩＩは５９３ｂｐ、フェリチンｃＤＮ
Ａは３８７ｂｐである。ＰＣＲの結果、カナマイシン耐
性レタスから抽出したＤＮＡを鋳型にした場合、両方の
遺伝子共に、予測されるサイズのバンドが検出された。
これに対し、コントロールの非形質転換レタスから抽出
したＤＮＡを鋳型にした場合、両方の遺伝子共に、予測
されるサイズのバンドが検出されなかった。以上の結果
から、カナマイシン耐性レタスは外来遺伝子である、Ｎ
ＰＴ ＩＩおよびフェリチンｃＤＮＡを保持しているこ
とが明らかになった。供試したレタス品種によって、形
質転換効率に相違が見られたが（表２）、カナマイシン
で選抜された個体は、全ての外来遺伝子を保持していた
ことから、供試レタスへの外来遺伝子導入法は確立され
たといえる。From the above, the possibility that a foreign gene was introduced into the selected lettuce was shown. To further confirm this fact, total genomic DNA was extracted from lettuce showing kanamycin resistance, 2 by PCR analysis
The next screening was performed. The primer was designed so that the primer would anneal to the position shown in FIG. 3 (C). G-3 and G-3R primers for detecting NPT II, G-2 and G-2R for detecting ferritin cDNA
Primers were used (Table 3). Predicted PCR product size is 593 bp for NPT II, ferritin cDNA
A is 387 bp. As a result of PCR, when DNA extracted from kanamycin-resistant lettuce was used as a template, a band of the expected size was detected in both genes.
On the other hand, when the DNA extracted from the control non-transformed lettuce was used as a template, no band of the expected size was detected in both genes. From the above results, kanamycin resistant lettuce is a foreign gene, N
It was revealed to carry PT II and ferritin cDNA. Although there was a difference in the transformation efficiency depending on the lettuce varieties tested (Table 2), the individual selected with kanamycin retained all the foreign genes, and therefore the foreign gene was introduced into the tested lettuce. It can be said that the law has been established.

【００３３】[0033]

【表２】 [Table 2]

【００３４】[0034]

【表３】 [Table 3]

【００３５】Ｃ．考察 Ｃ．１ レタスフェリチン遺伝子 フェリチンは広く生物界に存在していると考えられてい
るが、高等植物では、ダイズやエンドウ等の豆類やトウ
モロコシからしか遺伝子は単離されていない。これらの
植物の種子は子葉が発達した無胚乳種子または特異的に
発達した胚乳を有する種子である。そして、これらの植
物は発芽時に貯蔵している鉄を用いると考えられてい
る。従って、貯蔵器官として特に発達した種子を持たな
いレタス等の植物からフェリチン遺伝子を単離すること
は非常に困難である。なぜならば、遺伝子の単離は通
常、目的のタンパク質を精製後、アミノ酸配列を解読
し、それを基にして類推したＤＮＡを合成、さらにそれ
をプローブとして単離を行うので、レタスのようにフェ
リチンを大量に貯蔵する器官を持たない場合は、遺伝子
の単離が難しくなる。このような状況の中、本発明者
は、初めて豆類やコーン以外の植物のフェリチン遺伝子
の存在を示し、このレタスフェリチン遺伝子は豆類やコ
ーンと同じようにコピー数が少なく、ジーンファミリー
を形成していない可能性を示した。C. Discussion C. 1 Lettuce Ferritin Gene Ferritin is considered to exist widely in the living world, but in higher plants, the gene has been isolated only from beans such as soybean and pea and corn. The seeds of these plants are seed-free endosperm seeds or seeds with specifically developed endosperm. And, it is considered that these plants use iron stored at the time of germination. Therefore, it is very difficult to isolate the ferritin gene from a plant such as lettuce, which does not have a particularly developed seed as a storage organ. This is because the gene is usually isolated after purifying the protein of interest, decoding the amino acid sequence, synthesizing a DNA analogy based on it, and isolating it using it as a probe. If you don't have an organ that stores a large amount of, it becomes difficult to isolate the gene. In such a situation, the present inventor has shown for the first time the presence of the ferritin gene in plants other than beans and corn, and this lettuce ferritin gene has a small copy number like beans and corn, forming a gene family. There was no possibility.

【００３６】Ｃ．２ レタスフェリチン遺伝子の発現 ダイズとレタスに対して同様な鉄刺激を与えた場合
（Ｂ．２参照）、全く異なる遺伝子の発現を示した。す
なわち、ダイズでは鉄刺激後ｍＲＮＡへの転写が高ま
り、その後、速やかに転写が抑制されたが、レタスの場
合、特に変化は見られなかった。従って、このような鉄
刺激に対しては、レタスフェリチン遺伝子は反応しない
といえる。一方、培養液中の鉄濃度を通常の１．６ｍｇ
／ｌから１０倍の１６ｍｇ／ｌにして栽培した場合で
も、レタスは生育することができ、その際の鉄含量は著
しく増加していた（表１）ことから、レタスにはフェリ
チンが存在する可能性が示唆された。これらの２つの現
象から、レタスではフェリチン遺伝子の発現機構がダイ
ズ等とは異なり、一過的な鉄刺激には反応しないが、継
続的な鉄のストレスに対しては、何らかの反応性を示す
ものと予測される。従って、レタスの場合、フェリチン
の生理的機能として、動物において見られるように、鉄
貯蔵のみならず、鉄の解毒という機能を合わせ持ってい
る可能性がある。C. 2 Expression of lettuce ferritin gene When the same iron stimulation was given to soybean and lettuce (see B.2), expression of completely different gene was shown. That is, in soybean, transcription to mRNA was increased after iron stimulation, and then the transcription was rapidly suppressed, but in the case of lettuce, no particular change was observed. Therefore, it can be said that the lettuce ferritin gene does not react to such iron stimulation. On the other hand, the iron concentration in the culture solution is 1.6 mg
Even if it was cultivated at 10 mg / l to 16 mg / l, lettuce could grow, and the iron content at that time was significantly increased (Table 1). Therefore, lettuce may contain ferritin. Sex was suggested. From these two phenomena, the expression mechanism of ferritin gene in lettuce is different from soybean and so on and does not respond to transient iron stimulation, but it shows some reactivity to continuous iron stress. Is predicted. Therefore, in the case of lettuce, ferritin may have not only iron storage but also iron detoxification as a physiological function of ferritin.

【００３７】Ｃ．３ フェリチン遺伝子を導入したレタ
ス 収穫の２４時間前から高濃度のクエン酸鉄アンモニウム
溶液（鉄濃度１６０ｍｇ／ｌ）に根を浸漬することによ
り、レタス地上部の鉄含量を増加させたことが報告され
ている〔日本土壌肥料学雑誌 ６５：（４）４３６−４
４０（１９９４）〕。この方法は、根の吸水力を利用し
た一過性のものであり、クエン酸鉄アンモニウムによっ
て、根の吸水力が著しく低下しない短時間処理が有効と
考えられている。また、長時間のクエン酸鉄アンモニウ
ム溶液への根の浸漬により鉄塩の過剰障害が観察されて
いる。このことから、遺伝子操作によりレタス中でフェ
リチンを大量に合成し、その中に過剰の鉄を貯蔵させる
ことができる本発明の方法と、上記栽培方法を組み合わ
せることにより、レタスの栽培方法の有効性が格段に向
上するものである。C. 3 Lettuce with ferritin gene introduced It was reported that the iron content in the aerial part of lettuce was increased by immersing the roots in high concentration ammonium iron citrate solution (iron concentration 160 mg / l) 24 hours before harvesting. There [Japan Soil Fertilizer Journal 65: (4) 436-4
40 (1994)]. This method is a transient method utilizing the water absorption of roots, and it is considered that a short-time treatment that does not significantly reduce the water absorption of roots by ammonium iron citrate is considered to be effective. In addition, excessive damage of iron salts has been observed due to long-term immersion of roots in ammonium ferric citrate solution. From this, a large amount of ferritin is synthesized in lettuce by genetic manipulation, the method of the present invention capable of storing excess iron in it, by combining the above cultivation method, the effectiveness of the cultivation method of lettuce Will be greatly improved.

【００３８】本発明における不定芽形成率（供試数に対
する抵抗性個体の割合）は２〜１２％であったが（表
２）、Enomoto らの結果では２４％であったことが報告
されている〔Plant Cell Reports 9: 6-9 (1990)〕。こ
の形質転換効率の違いは品種間差および外来遺伝子の相
違によると考えられる。The adventitious bud formation rate (ratio of resistant individuals to the number of test pieces) in the present invention was 2 to 12% (Table 2), but it was reported by Enomoto et al. That it was 24%. [Plant Cell Reports 9: 6-9 (1990)]. It is considered that this difference in transformation efficiency is due to differences in varieties and differences in foreign genes.

【００３９】これまでレタスの形質転換体作出の報告例
はいくつかみられるが、それらは全て形質転換系の開発
が主目的である。そのため、導入された遺伝子は、選抜
のための抗生物質耐性遺伝子やプロモーターの機能を解
析するためのレポーター遺伝子等である。従って、実際
の農業や野菜工場のために、必要な形質の改良を目的と
した遺伝子の導入は本発明が初めてである。また、レタ
ス以外の植物においては花色を抑制する遺伝子や、耐
病、耐虫性の遺伝子、光合成機能を補強するための遺伝
子等の導入の報告はあるものの、食味や栄養素に着目し
た報告は、貯蔵タンパク質遺伝子以外はほとんどなされ
ておらず、フェリチン遺伝子を人為的に導入することに
よる本発明の形質転換体の作出は、これまでにない新し
い成分育種の可能性を示したものといえる。There have been some reports on the production of lettuce transformants, but the main purpose of all of them is to develop a transformation system. Therefore, the introduced gene is an antibiotic resistance gene for selection, a reporter gene for analyzing the function of a promoter, or the like. Therefore, the present invention is the first to introduce a gene for the purpose of improving necessary traits for actual agriculture and vegetable factories. Also, in plants other than lettuce, although there are reports of introduction of genes that suppress flower color, disease resistance, insect resistance genes, genes for reinforcing photosynthetic functions, etc., reports focusing on taste and nutrients are stored. Almost nothing has been done except for protein genes, and it can be said that the production of the transformant of the present invention by artificially introducing the ferritin gene shows the possibility of new component breeding that has never existed before.

【００４０】実施例２：タバコの形質転換 本実施例においても、まず使用される材料および行われ
る試験の方法について説明し、次にその試験の結果等を
記載する。 Ａ．材料および方法 Ａ．１ 形質転換タバコの作出 （１）無菌播種後、プラントボックス内で維持・継代し
ていたタバコ（Nicotiana tabacum c.v. Petit-Havana
SR1 ）から、約７ｍｍ角のリーフディスクを切り出し
た。次に、実施例１に記載したように調製したダイズフ
ェリチン遺伝子を有するプラスミドｐＢＧ１を導入した
アグロバクテリウムの培養懸濁液の濃度が約ＯＤ５９５
＝１になるように培地で希釈し、リーフディスクをその
中に２分間、浸漬させた。リーフディスクは以後、実施
例１に記載の方法に従って選抜を行った。ただし、スク
リーニング用の化合物としてカナマイシンとクラフォラ
ンを使用した。得られた形質転換体の葉０．１ｇからフ
ェノール・ウレア法によりＤＮＡを抽出し、下の（２）
の方法に従うＰＣＲ法にて遺伝子導入を確認した個体
（図４）を以後の実験に供した。形質転換体は１／５０
００ａポットによる土耕と園試処方の培養液を用いた水
耕により栽培した。どちらも開花後、袋を被せ、自殖・
結実させた。Example 2 Transformation of Tobacco In this example as well, the materials used and the method of the test conducted are first described, and then the results of the test are described. A. Materials and Methods A. 1 Production of transformed tobacco (1) Tobacco (Nicotiana tabacum cv Petit-Havana) that was maintained and passaged in the plant box after aseptic seeding
A leaf disk of about 7 mm square was cut out from SR1). Next, the concentration of the culture suspension of Agrobacterium introduced with the plasmid pBG1 having the soybean ferritin gene prepared as described in Example 1 was about OD595.
It was diluted with the medium to = 1 and the leaf disc was immersed therein for 2 minutes. Leaf disks were subsequently selected according to the method described in Example 1. However, kanamycin and Claforan were used as compounds for screening. DNA was extracted from the obtained transformant leaves (0.1 g) by the phenol-urea method, and the following (2)
The individual (FIG. 4) whose gene introduction was confirmed by the PCR method according to the above method was used for the subsequent experiments. Transformant is 1/50
It was cultivated by soil cultivation with a 00a pot and hydroponics using a culture solution of a garden trial formulation. After both flowers bloom, they are covered with bags and self-pollinated.
Fruited.

【００４１】（２）ＰＣＲ 葉から抽出したＤＮＡは２０μｇ／ｍｌでＲＮａｓｅを
含むＴＥ緩衝液４０μｌに溶解した。そのＤＮＡ溶液１
μｌを鋳型とし、全液量を５０μｌとして反応を行っ
た。反応条件は下の表４に示す。このＰＣＲに使用した
プライマーは上流側が５’−ＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣ
ＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴ−３’、下流側が５’−ＣＡＴＴ
ＧＴＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＣＡＣＡＣＴ−３’である。
また、本試験において使用されるプライマーにより増幅
される断片のサイズは６９８ｂｐであり、形質転換体を
検出するのに適するようにプロモーターの一部とフェリ
チンｃＤＮＡの一部を含むようにデザインされた。(2) PCR The DNA extracted from the leaves was dissolved in 40 μl of TE buffer containing RNase at 20 μg / ml. The DNA solution 1
The reaction was carried out with 50 μl of the total liquid volume using μl as the template. The reaction conditions are shown in Table 4 below. The primer used for this PCR was 5'-GACGCACAATCC on the upstream side.
CACTATCCTT-3 ', downstream 5'-CATT
GTTGCGATCTGCCACACT-3 '.
In addition, the size of the fragment amplified by the primers used in this test was 698 bp, and it was designed to contain a part of the promoter and a part of the ferritin cDNA so as to be suitable for detecting transformants.

【００４２】[0042]

【表４】 [Table 4]

【００４３】Ａ．２ 抗体の作成 ダイズフェリチンの構造遺伝子を発現ベクターｐＱＥ３
０（Qiagen社）に連結した後、大腸菌（Escherichia co
li Ｍ１５）に導入した。ＩＰＴＧで誘導することによ
りフェリチンのサブユニットのペプチドを過剰発現させ
た。次に、大腸菌を破壊後、ペプチドを抽出・精製し、
緩衝液をＰＢＳに交換後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりペ
プチドの濃度を測定した。精製したペプチド２００μｇ
をフロイントの完全アジュバントと混合後、ウサギ皮下
に２週間毎に注射した。最後の注射から１週間後に全採
血を行い、血清を採取した。得られた、抗フェリチン抗
血清の特異性をウエスタンブロット法により調べた。そ
の結果、上記抗血清は、ダイズフェリチン遺伝子を組み
込んだ大腸菌から抽出したタンパク質（抗原）と、ダイ
ズから抽出したタンパク質にのみ反応した。しかし、レ
タスやタバコから抽出したタンパク質や、精製したヒ
ト、ウマのフェリチンには反応しなかった（図５）。従
って、本抗血清はダイズフェリチンに対して特異性があ
り、形質転換レタス中の外来遺伝子由来のフェリチンを
検出することが可能であると考えられた。次に、この抗
血清の抗体価をエリザ（ＥＬＩＳＡ）法にて常法に従い
測定した。抗原量０．４〜１００ｎｇにおいて、抗フェ
リチン抗血清との反応は直線性を示し、抗原を４ｎｇと
したとき、抗フェリチン抗血清の希釈倍率は１０³ 〜１
０⁴ において直線性を示した。A. 2 Construction of antibody Expression vector of pQE3 expressing soybean ferritin structural gene
0 (Qiagen) and then E. coli (Escherichia co
li M15). The peptide of the subunit of ferritin was overexpressed by inducing with IPTG. Next, after destroying E. coli, the peptide is extracted and purified,
After exchanging the buffer solution with PBS, the peptide concentration was measured by the Bradford method. 200 μg of purified peptide
Was mixed with Freund's complete adjuvant and subcutaneously injected every two weeks in rabbits. One week after the last injection, whole blood was collected and serum was collected. The specificity of the obtained anti-ferritin antiserum was examined by Western blotting. As a result, the antiserum reacted only with the protein (antigen) extracted from E. coli in which the soybean ferritin gene had been incorporated and the protein extracted from soybean. However, it did not react with proteins extracted from lettuce or tobacco, or with purified human or equine ferritin (Fig. 5). Therefore, it was considered that this antiserum has specificity to soybean ferritin and is capable of detecting ferritin derived from a foreign gene in transformed lettuce. Next, the antibody titer of this antiserum was measured by an ELISA method according to a conventional method. When the antigen amount was 0.4 to 100 ng, the reaction with the anti-ferritin antiserum showed linearity, and when the antigen was 4 ng, the dilution ratio of the anti-ferritin antiserum was 10 ³ to 1
A linearity was shown at 0 ⁴ .

【００４４】Ａ．３ タンパク質の検出 タバコおよびレタスの成葉０．１ｇを１．５ｍｌエッペ
ンドルフ型チューブに入れ、抽出液（８０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７），２％ＳＤＳ，２％２−ＭＥ，２０
％グリセロール）と海砂を加え磨砕した。３分間沸騰水
中に入れた後、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し
たものをタンパク質抽出液とした。 ・ウエスタンブロット分析 試料のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄの方法により
測定し、１２．５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。次いで、ゲルからは、
セミブロットシステムにより膜面積１ｃｍ² あたり２．
５ｍＡで９０分間（緩衝液：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，０．１９２Ｍグリシン，５％メタノール）イモビロ
ン膜へ電気的にタンパク質を転写した。転写後、膜をＴ
ＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ，ｐＨ７．５）で数回洗浄し、５％スキムミルクを
加えたＴＢＳ中４℃で１２時間ゆっくり攪拌しながら、
インキュベートした。膜を０．０５％ツイーン２０を含
むＴＢＳ（以後、ＴＴＢＳと記載する）で１５、１０、
５分間の３回洗浄した。そして、抗フェリチン抗血清を
５％スキムミルクを加えたＴＴＢＳで２０００倍希釈し
た溶液に３０分間入れ、ゆっくり攪拌した。攪拌後、Ｔ
ＴＢＳで上記と同様の時間で３回洗浄した。次に、膜を
ＴＴＢＳで１０００倍希釈した抗ウサギＩｇＧ抗ヤギ血
清溶液で３０分間インキュベートした。再び、ＴＴＢＳ
で上記と同様の時間で３回洗浄した。最後に、染色キッ
トを所定量希釈して、それを膜上にゆっくり注ぎ、静置
した。数分後、反応によるバンドが現れたら、蒸留水で
膜を洗浄し、反応を停止させた。A. 3 Detection of protein 0.1 g of adult tobacco and lettuce leaves was placed in a 1.5 ml Eppendorf tube, and the extract (80 mM Tris
-HCl (pH 7), 2% SDS, 2% 2-ME, 20
% Glycerol) and sea sand were added and ground. The mixture was placed in boiling water for 3 minutes and then centrifuged at 12000 rpm for 20 minutes to obtain a protein extract. -Western blot analysis The protein concentration of the sample was measured by the method of Bradford, and 12.5% polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed. Then from the gel,
Membrane area 1cm ² per 2 by a semi-blot system.
90 minutes at 5 mA (buffer: 0.1 M Tris-HC
1, 0.192 M glycine, 5% methanol) The protein was electrically transferred to the immobilon membrane. After transfer, T
BS (20 mM Tris-HCl, 500 mM Na
Cl, pH 7.5) several times and slowly stirred for 12 hours at 4 ° C. in TBS containing 5% skim milk,
Incubated. The membrane was made of TBS containing 0.05% Tween 20 (hereinafter referred to as TTBS) 15,10,
Washed 3 times for 5 minutes. Then, the antiferritin antiserum was placed in a solution diluted 2000-fold with TTBS containing 5% skim milk for 30 minutes and slowly stirred. After stirring, T
It was washed with TBS three times at the same time as above. The membrane was then incubated for 30 minutes with an anti-rabbit IgG anti-goat serum solution diluted 1000-fold with TTBS. Again, TTBS
And washed 3 times in the same time as above. Finally, a predetermined amount of the staining kit was diluted, and it was slowly poured on the membrane and allowed to stand. After a few minutes, when a band due to the reaction appeared, the membrane was washed with distilled water to stop the reaction.

【００４５】Ａ．４ 鉄含量の測定 頂芽から３、４葉を採取し、６０℃で８日間通風乾燥さ
せた。乾燥した葉を十分に破砕し、０．１ｇを秤量後、
直径１７ｍｍ、高さ１０５ｍｍの試験管に入れた。濃硝
酸を２ｍｌ添加後、６０℃に一昼夜加温して乾燥させ
た。再び、濃硝酸を２ｍｌ添加し、内容物を溶解させた
後、３０％過酸化水素水０．２ｍｌを１時間毎に５回添
加した。添加するときには常温におき、添加後は６０℃
に加温した。最後に、温度を８０℃まで上昇させ、内容
物を完全に蒸発乾固させた。これに、２Ｎ ＨＣｌを
２．５ｍｌ添加し、無機成分を抽出した。抽出溶液５０
μｌを４０倍希釈し、フレームレス原子吸光度計（セイ
コー電子工業）で測定した。A. 4 Measurement of iron content Three or four leaves were collected from the apical bud and dried by ventilation at 60 ° C for 8 days. After crushing the dried leaves sufficiently and weighing 0.1 g,
It was placed in a test tube having a diameter of 17 mm and a height of 105 mm. After adding 2 ml of concentrated nitric acid, the mixture was heated to 60 ° C. for 24 hours and dried. Again, 2 ml of concentrated nitric acid was added to dissolve the contents, and then 0.2 ml of 30% hydrogen peroxide water was added 5 times every hour. When adding, leave at room temperature, and after adding, 60 ℃
Was heated. Finally, the temperature was raised to 80 ° C. and the contents were completely evaporated to dryness. To this, 2.5 ml of 2N HCl was added to extract an inorganic component. Extraction solution 50
μl was diluted 40 times and measured with a flameless atomic absorption spectrometer (Seiko Denshi Kogyo).

【００４６】Ｂ．結果 Ｂ．１ 外来フェリチン遺伝子の発現 フェリチン遺伝子が導入されたタバコを水耕により栽培
し、最後に培養液を交換した１週間後に葉を採取した。
形質転換タバコではフェリチンサブユニットがウエスタ
ンブロットにより検出されたが、コントロールのタバコ
では検出されなかった（図６）。このことから、導入遺
伝子は、構成的に作用すると考えられている３５Ｓプロ
モーターによって、制御されており、タバコ内でも同様
に構成的に発現されていることがわかった。しかし、個
体間で、全タンパク質あたりのフェリチンサブユニット
量に差があった。これは、導入遺伝子が、タバコの染色
体のどの部分に組み込まれたかによる、位置効果の影響
であると推測される。また、検出された分子量は２６０
００であり、導入遺伝子由来のペプチドの３１０００
（図６のレーンＭ）より小さかった。導入した遺伝子か
ら推定されるペプチドの分子量は３１０００であるが、
この遺伝子にはペプチドの色素体への輸送に必要なシグ
ナルペプチドをコードしていると考えられている塩基配
列を含んでいる。従って、この現象は、形質転換体で発
現したペプチドは翻訳された後、色素体へ運搬され、そ
の場所において内在性のフェリチンと同様に改変された
ことを示唆するものであり、外来遺伝子由来のフェリチ
ンが色素体で機能可能であることが認められた。B. Results B. 1 Expression of exogenous ferritin gene Tobacco in which the ferritin gene was introduced was cultivated by hydroponics, and one week after the culture medium was finally exchanged, leaves were collected.
The ferritin subunit was detected by Western blot in transformed tobacco but not in control tobacco (FIG. 6). From this, it was found that the transgene is regulated by the 35S promoter, which is considered to act constitutively, and is similarly constitutively expressed in tobacco. However, there were differences in the amount of ferritin subunits per total protein among individuals. It is speculated that this is the effect of location effects depending on which part of the tobacco chromosome the transgene was integrated into. In addition, the detected molecular weight is 260
00, and 31,000 of the peptides derived from the transgene
(Lane M in FIG. 6). Although the molecular weight of the peptide estimated from the introduced gene is 31,000,
This gene contains a nucleotide sequence thought to encode a signal peptide required for transport of the peptide to the plastid. Therefore, this phenomenon suggests that the peptide expressed in the transformant was translated and then transported to the plastid, where it was modified in the same manner as endogenous ferritin. It was found that ferritin can function in the plastid.

【００４７】Ｂ．２ 形質転換タバコの鉄含量 フェリチンの検出の場合と同時に、同じ個体から葉を採
取した。栽培した形質転換タバコと、コントロールの鉄
含量を比較した結果を図７に示す。コントロールは実際
に測定した６個体のうち鉄含量が最大と、最小の価を除
外した４個体を採用した。また、形質転換体は上位４個
体を採用した。コントロールの鉄含量の平均は８８．２
μｇ／乾重ｇ、形質転換体の鉄含量の平均はコントロー
ルの約１２０％の１０７．５μｇ／乾重ｇであった。次
に、両者の平均値の差をｔ−検定により計算したとこ
ろ、５％水準で有意差が認められた。この差は、外来の
ダイズフェリチン遺伝子由来のフェリチンが植物体中で
機能分子として働き、そこに鉄が貯えられたことに起因
するものである。B. 2 Iron content of transformed tobacco At the same time when ferritin was detected, leaves were collected from the same individual. FIG. 7 shows the result of comparison between the cultivated transformed tobacco and the control iron content. As a control, among the 6 individuals actually measured, 4 individuals having the highest iron content and the lowest iron value were adopted. The top four individuals were used as transformants. The average iron content of the control is 88.2.
The average iron content of the transformants was 107.5 μg / g of dry weight, which was about 120% of the control. Next, when the difference between the two average values was calculated by t-test, a significant difference was recognized at the 5% level. This difference is due to the fact that ferritin derived from the exogenous soybean ferritin gene worked as a functional molecule in the plant and iron was stored therein.

【００４８】Ｂ．３ 形質転換タバコの形態 上記のようにして得られた形質転換タバコの形態を図８
および図９に示す。これらの図は共に鉢上げ６０日後の
植物体を示すものであり、図８はその葉（形質転換体が
右側であり、左側は未処理のコントロール）を示し、図
９はその草姿〔形質転換体は（Ｂ）、コントロールは
（Ａ）〕を示す。これらの結果から、外来フェリチン遺
伝子導入により形質転換されたタバコ植物体と形質転換
されていない通常の植物体に外観上の差異は認められな
かった。B. 3 Morphology of transformed tobacco The morphology of the transformed tobacco obtained as described above is shown in FIG.
And FIG. Both of these figures show a plant body after 60 days of potting, FIG. 8 shows its leaves (the transformant is on the right side, the left side is an untreated control), and FIG. 9 shows its grass appearance [traits. The transformant shows (B) and the control shows (A)]. From these results, no difference in appearance was observed between the tobacco plant transformed by the introduction of the foreign ferritin gene and the normal plant not transformed.

【００４９】[0049]

【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明は、
分子育種法による高鉄含量植物の作出を初めて可能にし
たものである。より具体的には、本発明は、外来フェリ
チン遺伝子を発現可能に導入することにより、植物の生
長が阻害されることなく、しかも鉄含量が増加した形質
転換植物細胞、形質転換植物体およびその後代、ならび
にそれら植物体等の作出方法および植物体中の鉄含量の
増加方法の提供を可能にした。フェリチンは１分子あた
り最高４５００個もの鉄原子を貯蔵でき、しかも肉や野
菜の日常われわれが摂取している食品に含有されてい
る。このため、本発明は、シュウ酸等の人体に望ましく
ない成分を含むために問題のあったホウレンソウに代わ
る、「鉄を豊富に含むサラダ用野菜」としてのレタスや
ミツバ等を提供することができるものである。また、本
発明は、レタスやミツバ等の水耕栽培に適する植物に容
易に適用できるため、野菜工場における野菜品種の育成
に効果的である。このように、本発明は、無農薬、完
熟、新鮮等の種々の特徴を有する野菜工場での栽培のた
めの専用品種の開発に極めて有効である。さらに、本発
明の分子育種法による高鉄含量植物の作出は、水耕栽培
を主とする野菜工場のみならず、土地耕栽培にも適用可
能であることはいうまでもない。特に、フェリチンは鉄
の貯蔵と共に、植物体外の一過性の鉄の増加や現象に対
する解毒作用ともいうべき緩衝作用があることが報告さ
れているので、従来では作付けが不可能とされている、
土壌中に鉄分の少ない地域や逆に過剰な地域において
も、本発明のフェリチン遺伝子が組み込まれた植物は生
育可能であり、栽培可能であるという利点も有する。As described in detail above, the present invention provides
For the first time, the production of high iron content plants by the molecular breeding method was made possible. More specifically, the present invention introduces an exogenous ferritin gene in an expressible manner so that plant growth is not inhibited and the iron content is increased, and transformed plant cells, transformed plant bodies and progeny thereof are obtained. And a method for producing such plants and a method for increasing the iron content in the plants. Ferritin can store up to 4500 iron atoms per molecule and is contained in the foods we eat daily, such as meat and vegetables. Therefore, the present invention can provide lettuce, honeybee, and the like as "salad vegetables containing abundant iron" in place of spinach, which has been problematic because it contains undesired components such as oxalic acid. It is a thing. Further, the present invention can be easily applied to plants suitable for hydroponics such as lettuce and honeywort, and is therefore effective in growing vegetable varieties in a vegetable factory. As described above, the present invention is extremely effective in the development of a dedicated variety for cultivation in a vegetable factory having various characteristics such as pesticide-free, ripe, and fresh. Further, it goes without saying that the production of the high iron content plant by the molecular breeding method of the present invention can be applied not only to a vegetable factory mainly for hydroponic cultivation but also to land cultivation. In particular, ferritin has been reported to have a buffering action that should be called detoxification action against transient iron increase and phenomenon outside the plant together with iron storage, so it is conventionally impossible to plant,
The plant in which the ferritin gene of the present invention is incorporated can grow and be cultivated even in a region where the soil has a low iron content, or conversely, a region where the iron content is excessive.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明の実施例において使用されるダイズフェ
リチンｃＤＮＡ、およびそれから予測されるアミノ酸配
列と既知配列との相同性を示す図面である。（Ａ）：本
実施例で得られたダイズフェリチンｃＤＮＡの塩基配
列。タンパク質への翻訳シグナル配列（ＡＴＧ，ＴＧＡ
の太文字で表記）を有する。全長７８０ｂｐ。（Ｂ）：
塩基配列から予測されるアミノ酸配列（上段）と既知ダ
イズフェリチンのアミノ酸配列（下段）。＊は同じアミ
ノ酸、・は類似のアミノ酸を示す。FIG. 1 is a drawing showing the homology between the soybean ferritin cDNA used in the examples of the present invention and the amino acid sequence predicted therefrom and the known sequence. (A): Nucleotide sequence of soybean ferritin cDNA obtained in this example. Translation signal sequence for proteins (ATG, TGA
In bold). Total length 780bp. (B):
Amino acid sequence predicted from the base sequence (upper row) and known soybean ferritin amino acid sequence (lower row). * Indicates the same amino acid, and * indicates similar amino acid.

【図２】本発明の実施例において使用される外来フェリ
チン遺伝子を導入するためのベクターｐＢＧ−１の構築
を示す図面である（Ａｍｐ＋：アンピシリン耐性遺伝
子，ＮＰＴ ＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子，３５Ｓプ
ロモーター，ＧＵＳ：β−グルクロニダーゼ遺伝子，Ｎ
ｏｓＴ：ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター）。FIG. 2 is a drawing showing the construction of a vector pBG-1 for introducing an exogenous ferritin gene used in Examples of the present invention (Amp +: ampicillin resistance gene, NPT II: kanamycin resistance gene, 35S promoter, GUS. : Β-glucuronidase gene, N
osT: nopaline synthase gene terminator).

【図３】本発明の実施例１において行われたＰＣＲ分析
の結果を示す図面である。（Ａ）カナマイシン耐性遺伝
子および（Ｂ）ダイズフェリチンｃＤＮＡの検出（Ｃ：
非形質転換体，Ｐ：ポジティブコントロール，Ｂ：ブラ
ンク，Ｍ：サイズマーカー）。（Ｃ）：外来ＤＮＡがレ
タス染色体に組み込まれている様子を示す模式図（太線
はＰＣＲプライマーがアニールする位置。影部分と斜線
部分はそれぞれ、レタス染色体およびベクターの非翻訳
領域を示す。ＮｏｓＰ：ノパリン合成酵素遺伝子プロモ
ーター，ＮＰＴ ＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子，Ｔ：
ノパリン合成遺伝子ターミネーター，３５Ｓ−Ｐ：カリ
フラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター，フェリ
チン：ダイズフェリチンｃＤＮＡ）。FIG. 3 is a drawing showing the results of PCR analysis performed in Example 1 of the present invention. Detection of (A) kanamycin resistance gene and (B) soybean ferritin cDNA (C:
(Non-transformant, P: positive control, B: blank, M: size marker). (C): A schematic diagram showing how foreign DNA is integrated into the lettuce chromosome (thick lines indicate the positions where the PCR primers anneal. The shaded and shaded portions indicate the untranslated regions of the lettuce chromosome and vector, respectively. NosP: Nopaline synthase gene promoter, NPT II: kanamycin resistance gene, T:
Nopaline synthesis gene terminator, 35S-P: cauliflower mosaic virus 35S promoter, ferritin: soybean ferritin cDNA).

【図４】本発明の実施例２において行われたＰＣＲ分析
の結果を示す図面である。（Ａ）：プラスミドｐＢＧ−
１の物理地図（太線はＰＣＲプライマーがアニールする
位置。ＮｏｓＰ：ノパリン合成酵素遺伝子プロモータ
ー，ＮＰＴ ＩＩ：カナマイシン耐性遺伝子，Ｔ：ノパ
リン合成遺伝子ターミネーター，３５Ｓ−Ｐ：カリフラ
ワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター，フェリチ
ン：ダイズフェリチンｃＤＮＡ）。（Ｂ）：ダイズフェ
リチンｃＤＮＡの検出（Ｃ：非形質転換体，Ｐ：ポジテ
ィブコントロール，Ｂ：ブランク，Ｍ：サイズマーカ
ー）。FIG. 4 is a drawing showing the results of PCR analysis performed in Example 2 of the present invention. (A): Plasmid pBG-
1 physical map (thick line indicates the position where the PCR primer anneals. NosP: nopaline synthase gene promoter, NPT II: kanamycin resistance gene, T: nopaline synthase gene terminator, 35S-P: cauliflower mosaic virus 35S promoter, ferritin: soybean ferritin cDNA). (B): Detection of soybean ferritin cDNA (C: non-transformant, P: positive control, B: blank, M: size marker).

【図５】本発明の実施例２において作成した抗体の特異
性の検討結果を示す図面である。 （Ａ）：クーマシーブルー染色。（Ｂ）：ウエスタンブ
ロット。Ｍ：マーカー，レーン１：大腸菌に発現させた
ダイズフェリチンサブユニット，レーン２：レタス全タ
ンパク質，レーン３：タバコ全タンパク質，レーン４：
ダイズ全タンパク質，レーン５：ウマフェリチン，レー
ン６：ヒトフェリチン。FIG. 5 is a drawing showing the results of examining the specificity of the antibody prepared in Example 2 of the present invention. (A): Coomassie blue staining. (B): Western blot. M: marker, lane 1: soybean ferritin subunit expressed in E. coli, lane 2: lettuce total protein, lane 3: tobacco total protein, lane 4:
Soybean total protein, lane 5: horse ferritin, lane 6: human ferritin.

【図６】ウエスタンブロットによる通常栽培におけるフ
ェリチンの発現の検出を示す図面である（実施例２参
照）。Ｍ：大腸菌に発現させたダイズフェリチンサブユ
ニット，Ｃ：非形質転換体。FIG. 6 is a drawing showing detection of ferritin expression in normal cultivation by Western blot (see Example 2). M: soybean ferritin subunit expressed in E. coli, C: non-transformant.

【図７】成熟葉の乾燥重あたりの鉄含量を示すグラフで
ある（実施例２参照）。Ｃ：非形質転換体，Ｔ：形質転
換体（各々４個体ずつの平均±標準誤差を示す）。FIG. 7 is a graph showing the iron content per dry weight of mature leaves (see Example 2). C: non-transformant, T: transformant (an average of 4 individuals ± standard error is shown).

【図８】本発明の実施例２で得られた形質転換タバコの
葉を非形質転換体のものと対比して示す生物の形態を示
す写真である。FIG. 8 is a photograph showing the morphology of organisms showing the leaves of the transformed tobacco obtained in Example 2 of the present invention in comparison with those of non-transformants.

【図９】本発明の実施例２で得られた形質転換タバコの
草姿を非形質転換体のものと対比して示す生物の形態を
示す写真である。（Ａ）：非形質転換体，（Ｂ）：形質
転換体。FIG. 9 is a photograph showing the morphology of the organism showing the grass appearance of the transformed tobacco obtained in Example 2 of the present invention in comparison with that of the non-transformed tobacco. (A): non-transformant, (B): transformant.

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 外来フェリチン遺伝子が発現可能に導入
された植物細胞。1. A plant cell into which an exogenous ferritin gene has been introduced so that it can be expressed. 【請求項２】 外来フェリチン遺伝子が発現可能に導入
された植物細胞を有する植物。2. A plant having a plant cell into which an exogenous ferritin gene has been introduced in an expressible manner. 【請求項３】 請求項２記載の植物から得られる依然と
して外来フェリチンを発現可能である後代。3. A progeny obtained from the plant according to claim 2, which is still capable of expressing exogenous ferritin. 【請求項４】 外来フェリチン遺伝子を植物細胞内に導
入して形質転換植物細胞を得、該形質転換植物細胞を植
物に再生することからなる鉄含量の増加した植物の作出
方法。4. A method for producing a plant having an increased iron content, which comprises introducing an exogenous ferritin gene into a plant cell to obtain a transformed plant cell and regenerating the transformed plant cell into a plant. 【請求項５】 外来フェリチン遺伝子を導入した植物細
胞を有する植物形質転換体を得、該形質転換体中の植物
細胞に外来フェリチン遺伝子を発現させて植物細胞中の
鉄含量を増加させる方法。5. A method for obtaining a plant transformant having a plant cell into which a foreign ferritin gene has been introduced, and expressing the foreign ferritin gene in the plant cell in the transformant to increase the iron content in the plant cell.