JPH09178753A - Pyrogen adsorptive body and method for quantitating pyrogen using it - Google Patents
Pyrogen adsorptive body and method for quantitating pyrogen using itInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、医療領域で極めて
重要な問題と考えられる、発熱性物質の定量方法に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for quantifying a pyrogenic substance which is considered to be a very important problem in the medical field.
【０００２】[0002]
【従来の技術】臨床医学の領域では注射剤に混入する不
純物により、静脈注射後に悪寒戦りつを伴う発熱がある
ことは、好ましいことではない。それ故に注射剤の製造
工程では、これらの悪寒戦りつを伴う発熱性物質の混入
を防止することは、極めて重要である。また、製造され
た注射剤が発熱性物質を含有しないことを確認すること
も極めて重要なことである。2. Description of the Related Art In the field of clinical medicine, it is not preferable to have a fever accompanied by a chilling sensation after intravenous injection due to impurities mixed in an injection. Therefore, in the manufacturing process of the injection, it is extremely important to prevent the mixture of the heat-generating substance accompanied with these chilling pits. It is also extremely important to confirm that the manufactured injection does not contain a pyrogen.
【０００３】ウサギを用いてin vivoで発熱性物質の有
無を検出する試験を発熱性物質試験という。近年、ウサ
ギを用いた発熱性物質試験に代わり、カブトガニの血球
成分を用いたin vitroのリムルス（Limulus）試験が汎
用されるようになっている。日本ではリムルス試験に用
いられるカブトガニの血球成分に標準規格が定められて
おらず、また、抽出成分の純度や、反応試薬中に存在す
る反応阻害物質の問題等、克服すべき問題が多い。A test for detecting the presence or absence of a pyrogen in vivo using a rabbit is called a pyrogen test. In recent years, an in vitro Limulus test using blood cell components of horseshoe crab has been widely used instead of a pyrogenic test using rabbits. In Japan, no standard has been established for the blood cell components of horseshoe crab used in the Limulus test, and there are many problems to be overcome, such as the purity of the extracted components and the problem of reaction inhibitors present in the reaction reagents.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は従来、
血液及び蛋白製剤を検査対象としたリムルス試験にもと
められた前処理、後処理の問題、リムルス試験の特異性
の欠如の問題（(１→３)-β-D-Glucan に対する非特異
反応の問題）を一挙に克服しようとするものである。The object of the present invention is to
Pre-treatment, post-treatment problems and lack of specificity of Limulus test for blood and protein preparations in Limulus test (problem of non-specific reaction to (1 → 3) -β-D-Glucan) ) All at once.
【０００５】即ち、被検検体が血液または蛋白製剤であ
る場合、従来のリムルス試験では、検体中の非特異的な
アミダーゼ活性及びリムルス反応阻害物質（α2−プラ
スミンインヒビター、アンチトロンビンＩＩＩ、α1−
アンチトリプシン）を除去する為、クロロホルム法、エ
ーテル法、酸処理法、アルカリ処理法等の前処理が必須
であった。That is, when the test sample is blood or a protein preparation, in the conventional Limulus test, non-specific amidase activity and Limulus reaction inhibitor (α 2 -plasmin inhibitor, antithrombin III, α 1) in the sample are used. −
In order to remove (antitrypsin), pretreatment such as chloroform method, ether method, acid treatment method and alkali treatment method was essential.
【０００６】また従来のリムルス試験では、被検検体が
ビリルビン等により黄褐色に呈色していた場合、エンド
トキシンの作用により、合成基室から最終的に遊離され
るｐ−ニトロアニリンの吸収波長（４０５ｎｍ）と検体
の黄褐色の吸収波長（４００ｎｍ付近）が重なり合い、
正確な値が得られなかった。この為 ｐ−ニトロアニリ
ンを更にジアゾ化し、黄褐色系色素の影響を除く必要が
あった。Further, in the conventional Limulus test, when the test sample was colored yellowish brown due to bilirubin or the like, the absorption wavelength of p-nitroaniline finally released from the synthetic base chamber by the action of endotoxin ( (405 nm) and the yellow-brown absorption wavelength (near 400 nm) of the sample overlap,
The exact value was not obtained. Therefore, it was necessary to further diazotize p-nitroaniline to eliminate the influence of yellowish brown dyes.
【０００７】更に、従来のリムルス試験では、カブトガ
ニ血球抽出液全体を用いている為、凝固因子の一つであ
るFactorGを介してエンドトキシン以外の物質（(１→
３)-β-D-Glucan、真菌多糖、クレスチン、レンチナ
ン、ザイモサン、セルロース系血液透析膜の洗浄液等）
に対しても反応するという問題があった。この問題を解
決する為には、カブトガニ血球抽出液からFactorGを除
去する操作が必要であった。Further, in the conventional Limulus test, since the whole horseshoe crab blood cell extract is used, substances other than endotoxin ((1 →
3) -β-D-Glucan, fungal polysaccharide, krestin, lentinan, zymosan, washing solution for cellulosic hemodialysis membrane, etc.)
There was a problem of reacting to. In order to solve this problem, it was necessary to remove Factor G from the horseshoe crab blood cell extract.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明の発明者らは発熱
性物質の定量方法について鋭意検討した結果、ポリペプ
チド系抗生物質によって捕捉されたエンドトキシン（リ
ポ多糖）が、リムルス試験によって検出・定量可能であ
ることを見出し本発明を完成した。[Means for Solving the Problems] The inventors of the present invention have made earnest studies on a method for quantifying a pyrogenic substance, and as a result, detected and quantified endotoxin (lipopolysaccharide) captured by a polypeptide antibiotic by a Limulus test. The inventors have found that it is possible and completed the present invention.
【０００９】すなわち、本発明は、発熱性物質の定量に
用いる器具であって、発熱性物質と結合するポリペプチ
ド系抗生物質を固定化したゲル状の発熱性物質吸着体を
固相化した容器、試験管、ビース、ボール、磁性粒子、
チップ、薄板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタープ
レート、ストリップ及びろ紙ディスクからなる群から選
ばれる器具を提供する。That is, the present invention is an instrument for quantifying a heat-generating substance, which is a container in which a gel-like heat-generating substance adsorbent having a polypeptide-type antibiotic substance binding to the heat-generating substance immobilized thereon is immobilized. , Test tubes, beads, balls, magnetic particles,
Provided is an instrument selected from the group consisting of chips, lamellas, pieces, membranes, rods, microtiter plates, strips and filter paper discs.
【００１０】また、本発明は、前記器具を用いて発熱性
物質を定量する方法であって、前記器具に発熱性物質を
吸着した後、放射イムノアッセイ法、非放射イムノアッ
セイ法、及びリムルス試験法からなる群から選ばれる方
法により吸着された発熱性物質を定量することを特徴と
する方法を提供する。The present invention also relates to a method for quantifying a pyrogen using the above-mentioned instrument, which comprises the steps of, after adsorbing the pyrogen, the radioimmunoassay method, non-radioimmunoassay method and Limulus test method. Provided is a method characterized by quantifying an adsorbed pyrogenic substance by a method selected from the group consisting of:
【００１１】また、本発明は、前記器具を用いて発熱性
物質を定量する為に構成された発熱性物質定量キットを
提供する。The present invention also provides a pyrogenic substance quantification kit constructed to quantify the pyrogenic substance using the above-mentioned device.
【００１２】[0012]
【発明の実施の形態】以下に、本発明の実施の形態を説
明する。本発明者らは、（１）発熱性物質の定量に用い
る器具であって、発熱性物質と結合するポリペプチド系
抗生物質（ポリミキシン類（Polymyxin A, B, C, D, E,
F, K, M, P, S,T）、コリスチン類(Colistin A, B,
C)、グラミシジンＳ類、タイロシジン類等）を固定化し
たゲル状の発熱性物質吸着体を固相化した容器、試験
管、ビース、ボール、磁性粒子、チップ、薄板、小片、
薄膜、小棒、マイクロタイタープレート、ストリップ及
びろ紙ディスクからなる群から選ばれる器具、（２）発
熱性物質の定量に用いる器具であって、反応性官能基を
固相化し、その官能基に発熱性物質と結合するリガンド
として上記ポリペプチド系抗生物質を共有結合させた容
器、試験管、ビース、ボール、磁性粒子、チップ、薄
板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタープレート、ス
トリップ及びろ紙ディスクからなる群から選ばれる器
具、を用いて発熱性物質を吸着した後、従来のリムルス
試験で発熱性物質の定量を行なう方法が、従来の難問を
一挙に解決することを発見した。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Embodiments of the present invention will be described below. The present inventors (1) are instruments used for the quantification of pyrogenic substances, which are polypeptide-type antibiotics (Polymyxin A (B, C, D, E,
F, K, M, P, S, T), colistins (Colistin A, B,
C), gramicidin Ss, tyrocidines, etc.)-Immobilized gel-like exothermic substance adsorbents, test tubes, beads, balls, magnetic particles, chips, thin plates, small pieces,
An instrument selected from the group consisting of a thin film, a small rod, a microtiter plate, a strip and a filter paper disc, and (2) an instrument used for quantifying an exothermic substance, in which a reactive functional group is immobilized and the functional group generates heat. From containers, test tubes, beads, balls, magnetic particles, chips, thin plates, small pieces, thin films, small rods, microtiter plates, strips and filter paper disks to which the above-mentioned polypeptide antibiotics are covalently bonded as a ligand that binds to a volatile substance It has been discovered that a method of quantifying the exothermic substance by a conventional Limulus test after adsorbing the exothermic substance using a device selected from the group, solves the conventional difficult problems at once.
【００１３】即ち、本発明に関わる器具を使用し、発熱
性物質を特異的に吸着した後、リムルス試験、或いは、
放射イムノアッセイ法、非放射イムノアッセイ法等によ
り、発熱性物質を定量することにより、従来技術で不可
欠であった検体の前処理、後処理の必要が全く無くなる
という利点が生ずる。また、本発明に関わる器具が発熱
性物質（エンドトキシン）のみを特異的に吸着する為、
カブトガニ血球注出液全体を用いてリムルス試験を行な
っても(１→３)-β-D-Glucan等に対する非特異反応に配
慮する必要はない。尚、上記反応性官能基としては、例
えば-N=CH-(CH2)n-CH=NH、-NH-(CH2)n-OH、-CO-(CH2)n-
COOH、-NH-(CH2)n-NH2、-N=CH-(CH2)n-COOH、-NH-(CH2)
n-COOH、-N=CH-(CH2)n-NH2(n=1,2,3,4,5…)、-CONH2等
が挙げられる。That is, after using the device according to the present invention to specifically adsorb a heat-generating substance, a Limulus test or
By quantifying a pyrogen by a radioimmunoassay method, a non-radioimmunoassay method, or the like, there is an advantage that the pretreatment and the posttreatment of the specimen, which are indispensable in the prior art, are completely eliminated. Further, since the device according to the present invention specifically adsorbs only the pyrogen (endotoxin),
Even if the Limulus test is performed using the whole horseshoe crab hemocyte infusate, it is not necessary to consider the non-specific reaction to (1 → 3) -β-D-Glucan and the like. As the reactive functional groups, for example, -N = CH- (CH 2) n -CH = NH, -NH- (CH 2) n -OH, -CO- (CH 2) n -
COOH, -NH- (CH 2) n -NH 2, -N = CH- (CH 2) n -COOH, -NH- (CH 2)
Examples include n -COOH, -N = CH- (CH 2 ) n -NH 2 (n = 1,2,3,4,5 ...), -CONH 2 and the like.
【００１４】１９９５年代に、米国産カブトガニ（Limu
lus polyphemus）の血球抽出成分（Amebocyte Lysate）
がグラム陰性細菌のエンドトキシン（リポ多糖）によ
り、ゲル化されることが報告されて以来、当該現象は、
リムルス試験（ＬＡＬテストともいう）として、エンド
トキシンの検出及び定量に利用されてきた。リムルス試
験は、エンドトキシンとカブトガニの血球抽出成分が反
応してできるゲルを判定の指標とする(i)ゲル化法・比
濁時間法と、合成基質を用いて発色したものを吸光度で
測定する(ii)合成基質法に大別される。In the 1995's, American horseshoe crab (Limu
lus polyphemus) blood cell extract component (Amebocyte Lysate)
Has been reported to be gelled by endotoxin (lipopolysaccharide) of Gram-negative bacterium,
The Limulus test (also referred to as LAL test) has been used for detection and quantification of endotoxin. In the Limulus test, the gel formed by the reaction of endotoxin and the blood cell extract of horseshoe crab is used as an index for determination. (I) Gelation method / turbidimetric time method, and what is developed using a synthetic substrate is measured by absorbance ( ii) Broadly classified into synthetic substrate methods.
【００１５】従来、リムルス試験は、(i)ゲル化法・比
濁時間法でも、(ii)合成基質法でも、遊離状態のエンド
トキシン（リポ多糖）とカブトガニの血球抽出成分が反
応することによって反応が進行するものと考えられてき
た。本発明の発明者らは、ポリペプチド系抗生物質によ
って捕捉されたエンドトキシン（リポ多糖）もまた、リ
ムルス試験によって検出・定量することが可能であるこ
とを発見し、本発明を完成したものである。Conventionally, in the Limulus test, both (i) gelation method and turbidimetric time method and (ii) synthetic substrate method are carried out by reacting endotoxin (lipopolysaccharide) in a free state with blood cell extract of horseshoe crab. Have been thought to proceed. The inventors of the present invention have discovered that endotoxin (lipopolysaccharide) captured by a polypeptide antibiotic can also be detected and quantified by the Limulus test, and completed the present invention. .
【００１６】ポリペプチド系抗生物質によってエンドト
キシン（リポ多糖）が捕捉されることは、同業者によっ
てすでに解明されているが、ポリペプチド系抗生物質に
よって捕捉されたエンドトキシン（リポ多糖）が、リム
ルス試験によって検出・定量可能であることは、本発明
においてはじめて見い出されたことである。It has already been elucidated by a person skilled in the art that the endotoxin (lipopolysaccharide) is captured by the polypeptide antibiotic, but the endotoxin (lipopolysaccharide) captured by the polypeptide antibiotic is confirmed by the Limulus test. The fact that it can be detected and quantified is the first discovery in the present invention.
【００１７】[0017]
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例には、なんら限定さ
れるものではない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
【００１８】[0018]
【実施例１】 ＜ポリミキシンＢを固定化したゲル状の発熱性物質吸着
体を固相化した小片の調製＞ポリミキシンＢを定法に従
い、架橋アガロース担体（Sepharose CL-4B）に結合さ
せた（結合量５ｍｇ／ｍｌ）。次に、当該担体を定法に
従い、凍結乾燥した。次に瞬間接着材を用いて、当該担
体を縦横２ｃｍ、厚さ１ｍｍの正方形のポリスチレン製
小片の両面に塗布した。[Example 1] <Preparation of a small piece of gel-like pyrogenic substance adsorbent having polymyxin B immobilized thereon> Polymyxin B was bound to a crosslinked agarose carrier (Sepharose CL-4B) according to a standard method (binding Amount 5 mg / ml). Next, the carrier was freeze-dried according to a standard method. Next, the carrier was applied to both sides of a square polystyrene piece having a length and width of 2 cm and a thickness of 1 mm by using an instant adhesive.
【００１９】[0019]
【実施例２】容量５ｍｌのガラス製試験管に実施例１で
調製した小片とエンドトキシン溶液（緩衝液に溶解した
エンドトキシン、又は血清に溶解したエンドトキシン；
濃度はいずれも０．５００ＥＵ／ｍｌ）２ｍｌを秤量
し、室温で３０分インキュベート（incubate）した。次
に、当該試験管のリン酸緩衝液（又は血清）を除去した
後、小片の入った当該試験管をリン酸緩衝液３ｍｌで３
回洗浄した。最後に、発熱性物質定量用試薬エンドスペ
シー（(１→３)-β-D-Glucanは検出しない）及びトキシ
カラー（(１→３)-β-D-Glucanも検出する）を用いて、
発熱性物質の定量を行ない、その結果を表１に示した。
尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべてエンド
トキシンフリー及び(１→３)-β-D-Glucanフリーのもの
を用いた。[Example 2] The small piece prepared in Example 1 and an endotoxin solution (endotoxin dissolved in a buffer, or endotoxin dissolved in serum;
2 ml (weighing 0.500 EU / ml) was weighed and incubated at room temperature for 30 minutes. Next, after removing the phosphate buffer solution (or serum) from the test tube, the test tube containing the small pieces was washed with 3 ml of the phosphate buffer solution to 3 times.
Washed twice. Finally, using the reagent endospy for quantifying pyrogenic substances ((1 → 3) -β-D-Glucan is not detected) and Toxicolor ((1 → 3) -β-D-Glucan is also detected)
The amount of the exothermic substance was quantified, and the results are shown in Table 1.
The instruments, buffers, etc. used in the above operation were endotoxin-free and (1 → 3) -β-D-Glucan-free.
【００２０】[0020]
【表１】 [Table 1]
【００２１】表１に示したように、本発明に関わる発熱
性物質吸着物質を固相化した小片は、発熱性物質の良好
な吸着性能を示した。また、エンドスペシー及びトキシ
カラーによるエンドトキシンの定量結果も良好であっ
た。検体が緩衝液であっても、血清であっても、検査結
果に影響はなかった。As shown in Table 1, the small pieces on which the exothermic substance-adsorbing substance according to the present invention was solid-phased showed good adsorption performance of the exothermic substance. Moreover, the endotoxin and endotoxin quantification results were also good. Whether the sample was a buffer solution or serum, the test results were not affected.
【００２２】[0022]
【実施例３】 ＜ポリミキシンＢを固定化したアフィニティクロマトグ
ラフィー担体を用いた発熱性物質の定量＞ポリミキシン
Ｂを定法に従い、架橋アガロース担体（Sepharose CL-4
B）に結合させた（結合量５ｍｇ／ｍｌ）。次に、容量
５ｍｌのガラス製試験管に当該担体５０ｕｌとエンドト
キシン溶液（緩衝液に溶解したエンドトキシン、又は血
清に溶解したエンドトキシン；濃度はいずれも０．５０
０ＥＵ／ｍｌ）１ｍｌを秤量し、充分に撹拌した後、室
温で３０分インキュベートした。次に、当該試験管のリ
ン酸緩衝液（又は血清）を除去した後、小片の入った当
該試験管をリン酸緩衝液３ｍｌで３回洗浄した（ポリミ
キシンＢを固定化したアフィニティクロマトグラフィー
担体とリン酸緩衝液の分離は遠心分離により行った）。
最後に、発熱性物質定量用試薬エンドスペシー（(１→
３)-β-D-Glucanは検出しない）及びトキシカラー（(１
→３)-β-D-Glucanも検出する）を用いて、発熱性物質
の定量を行ない、その結果を表２に示した。尚、以上の
操作に用いた器具、緩衝液等はすべてエンドトキシンフ
リー及び(１→３)-β-D-Glucanフリーのものを用いた。Example 3 <Quantification of Pyrogenic Substance Using Affinity Chromatography Carrier Having Polymyxin B Immobilized> Polymyxin B was cross-linked according to a standard method (Sepharose CL-4).
B) was bound (bound amount 5 mg / ml). Next, in a glass test tube having a volume of 5 ml, 50 ul of the carrier and an endotoxin solution (endotoxin dissolved in a buffer solution or endotoxin dissolved in serum; the concentration is 0.50 for each).
1 EU (0 EU / ml) was weighed, thoroughly stirred, and then incubated at room temperature for 30 minutes. Next, after removing the phosphate buffer solution (or serum) of the test tube, the test tube containing the small pieces was washed 3 times with 3 ml of the phosphate buffer solution (with an affinity chromatography carrier on which polymyxin B was immobilized). The phosphate buffer was separated by centrifugation).
Finally, the reagent end specie ((1 →
3) -β-D-Glucan is not detected) and toxicolor ((1
→ 3) -β-D-Glucan is also detected) to determine the amount of the pyrogenic substance, and the results are shown in Table 2. The instruments, buffers, etc. used in the above operation were endotoxin-free and (1 → 3) -β-D-Glucan-free.
【００２３】[0023]
【表２】 [Table 2]
【００２４】[0024]
【実施例４】マイクロプレート（住友ベークライト社
製）に反応性官能基-N=CH-(CH2)3-CH=NHを結合させて固
相化し、その官能基の末端アミノ基に、発熱性物質と結
合するリガンドであるポリミキシンＢを共有結合させ
て、発熱性物質吸着マイクロタイタープレートを調製し
た。Example 4 microplate reactive functional group -N to (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) = CH- (CH 2) 3 bound to -CH = NH immobilized by, the terminal amino group of a functional group, fever Polymyxin B, which is a ligand that binds to a thermogenic substance, was covalently bonded to prepare a pyrogen-adsorbing microtiter plate.
【００２５】その発熱性物質吸着マイクロタイタープレ
ート（ブロック済）に、エンドトキシン溶液（緩衝液に
溶解したエンドトキシン、又は血清に溶解したエンドト
キシン；濃度はいずれも２．５００ＥＵ／ｍｌ）２００
ｕｌを秤量し、室温で３０分インキュベートした。次
に、マイクロタイタープレートの各穴をリン酸緩衝液２
００ｕｌで３回洗浄した。最後に、発熱性物質定量用試
薬エンドスペシー（(１→３)-β-D-Glucanは検出しな
い）及びトキシカラー（(１→３)-β-D-Glucanも検出す
る）を用いて、発熱性物質の定量を行ない、その結果を
表３に示した。尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等
はすべてエンドトキシンフリー及び(１→３)-β-D-Gluc
anフリーのものを用いた。An endotoxin solution (endotoxin dissolved in a buffer solution or endotoxin dissolved in serum; concentration is 2.500 EU / ml in each case) on the pyrogenic substance-adsorbing microtiter plate (blocked) 200
The ul was weighed and incubated at room temperature for 30 minutes. Next, place each well of the microtiter plate in phosphate buffer solution 2
Wash 3 times with 00 ul. Finally, using the reagent endospy for quantifying pyrogenic substances ((1 → 3) -β-D-Glucan is not detected) and Toxicolor ((1 → 3) -β-D-Glucan is also detected) The amount of the volatile substances was quantified, and the results are shown in Table 3. All the equipment and buffers used in the above operations were endotoxin-free and (1 → 3) -β-D-Gluc.
I used an free one.
【００２６】[0026]
【表３】 [Table 3]
【００２７】[0027]
【実施例５】マイクロプレート（住友ベークライト社
製）に反応性官能基-NH-(CH2)2-NH-を結合させて固相化
し、その官能基の末端アミノ基に、発熱性物質と結合す
るリガンドであるポリミキシンＢを共有結合させて、発
熱性物質吸着マイクロタイタープレートを調製した。Example 5 microplate (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) to a reactive functional group -NH- (CH 2) 2 -NH- and is not immobilized by binding to the terminal amino group of a functional group, and pyrogen A binding ligand, polymyxin B, was covalently bound to prepare a pyrogen-adsorbing microtiter plate.
【００２８】その発熱性物質吸着マイクロタイタープレ
ート（ブロック済）に、リン酸緩衝液に溶解した（１→
３）-β-D-Glucan溶液（１ｕｇ／ｍｌ）１００ｕｌを秤
量し、室温で３０分インキュベートした。次に、マイク
ロタイタープレートの各穴をリン酸緩衝液２００ｕｌで
３回洗浄した。最後に、発熱性物質定量用試薬エンドス
ペシー（(１→３)-β-D-Glucanは検出しない）及びトキ
シカラー（(１→３)-β-D-Glucanも検出する）を用い
て、発熱性物質の定量を行ない、その結果を表４に示し
た。尚、以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべてエ
ンドトキシンフリー及び(１→３)-β-D-Glucanフリーの
ものを用いた。The exothermic substance-adsorbing microtiter plate (blocked) was dissolved in a phosphate buffer (1 →
3) 100 ul of -β-D-Glucan solution (1 ug / ml) was weighed and incubated at room temperature for 30 minutes. Each well of the microtiter plate was then washed 3 times with 200ul of phosphate buffer. Finally, using the reagent endospy for quantifying pyrogenic substances ((1 → 3) -β-D-Glucan is not detected) and Toxicolor ((1 → 3) -β-D-Glucan is also detected) The amount of the volatile substances was quantified, and the results are shown in Table 4. The instruments, buffers, etc. used in the above operation were endotoxin-free and (1 → 3) -β-D-Glucan-free.
【００２９】[0029]
【表４】 [Table 4]
【００３０】表４に示したように、本発明に関わる発熱
性物質吸着マイクロタイタープレートは、発熱性物質の
特異な吸着性能を示した。即ち、(１→３)-β-D-Glucan
は上記マイクロタイタープレートには吸着されず、従っ
て、エンドスペシー及びトキシカラーの両者によって
(１→３)-β-D-Glucanは検出されなかった。As shown in Table 4, the exothermic substance-adsorbing microtiter plate according to the present invention showed a specific adsorbing performance for the exothermic substance. That is, (1 → 3) -β-D-Glucan
Is not adsorbed to the microtiter plate, and is therefore both an end specie and a toxicolor.
(1 → 3) -β-D-Glucan was not detected.
【００３１】[0031]
【実施例６】ビーズに反応性官能基-N=CH-(CH2)3-COOH
を結合させて固相化し、その官能基の末端カルボキシル
基に、発熱性物質と結合するリガンドであるポリミキシ
ンＢをアミド化法により共有結合させて、発熱性物質吸
着ビーズを調製した。Example 6 reactive functional groups -N beads = CH- (CH 2) 3 -COOH
Was immobilized to form a solid phase, and the terminal carboxyl group of the functional group was covalently bonded to the terminal carboxyl group of polymyxin B, which is a ligand that binds to a heat-generating substance, by an amidation method to prepare heat-generating substance-adsorbing beads.
【００３２】小試験管にリン酸緩衝液２ｍｌ、発熱性物
質吸着ビーズ（ブロック済）、非溶血血清に溶解したエ
ンドトキシン又は溶血血清に溶解した標準エンドトキシ
ン（濃度は何れも５．０００ＥＵ／ｍｌ）２００ｕｌ、
を秤量し、室温で３０分インキュベートした。次に、前
記ビーズをリン酸緩衝液２ｍｌで３回洗浄した。次に、
発熱性物質定量用試薬トキシカラー((１→３)-β-D-Glu
canも検出する）を用いて、発熱性物質の定量を行な
い、その結果を表５に示した。尚、以上の操作に用いた
器具、緩衝液等はすべてエンドトキシンフリー及び(１
→ ３)-β-D-Glucanフリーのものを用いた。In a small test tube, 2 ml of phosphate buffer solution, pyrogenic substance adsorbing beads (blocked), endotoxin dissolved in non-hemolytic serum or standard endotoxin dissolved in hemolytic serum (concentration is 5.000 EU / ml) 200 ul ,
Was weighed and incubated at room temperature for 30 minutes. Next, the beads were washed 3 times with 2 ml of phosphate buffer. next,
Toxicolor reagent for quantifying pyrogens ((1 → 3) -β-D-Glu
The amount of pyrogenic substances was quantified by using (also detecting can), and the results are shown in Table 5. All equipment, buffers, etc. used for the above operations are endotoxin-free and (1
→ 3) -β-D-Glucan free one was used.
【００３３】[0033]
【表５】 [Table 5]
【００３４】表５に示したように、本発明に関わる発熱
性物質吸着ビーズは、発熱性物質の良好な吸着性能を示
した。また、トキシカラーによるエンドトキシンの定量
結果も良好であった。即ち、溶血（ヘモグロビン）によ
る４１５ｎｍの吸収がｐ−ニトロアニリンの４０５ｎｍ
の吸収を妨害することはなかった。As shown in Table 5, the exothermic substance-adsorbing beads according to the present invention showed good adsorbing ability for exothermic substances. In addition, the quantification result of endotoxin by Toxicolor was also good. That is, absorption at 415 nm due to hemolysis (hemoglobin) is 405 nm of p-nitroaniline.
Did not interfere with the absorption of.
【００３５】[0035]
【実施例７】ビーズに反応性官能基-N=CH-(CH2)3-NH2を
結合させて固相化し、その官能基の末端アミノ基に、発
熱性物質と結合するリガンドであるコリスチンを共有結
合させて、発熱性物質吸着ビーズを調製した。Example 7 A ligand that binds a reactive functional group —N═CH— (CH 2 ) 3 —NH 2 to beads to immobilize it, and binds an exothermic substance to the terminal amino group of the functional group Colistin was covalently attached to prepare pyrogen-adsorbing beads.
【００３６】小試験管に緩衝液２ｍｌ、発熱性物質吸着
ビーズ（ブロック済）、Ａ液（非溶血血清にエンドトキ
シン１．０００ＥＵ／ｍｌを溶解したもの）、またはＢ
液（非溶血血清にエンドトキシン１．０００ＥＵ／ｍｌ
とレンチナン１００ｎｇ／ｍｌを溶解したもの）２００
ｕｌを秤量し、室温で３０分インキュベートした。次
に、前記ビーズをリン酸緩衝液２ｍｌで３回洗浄した。
次に、発熱性物質定量用試薬エンドスペシー（(１→３)
-β-D-Glucanは検出しない）を用いて、発熱性物質の定
量を行ない、その結果を表６に示した。尚、以上の操作
に用いた器具、緩衝液等はすべてエンドトキシンフリー
及び(１→３)-β-D-Glucanフリーのものを用いた。In a small test tube, 2 ml of buffer solution, beads adsorbing a pyrogen (blocked), solution A (a solution of endotoxin 1.000 EU / ml dissolved in non-hemolytic serum), or B
Liquid (endotoxin in non-hemolyzed serum 1.000 EU / ml
And lentinan 100 ng / ml dissolved) 200
The ul was weighed and incubated at room temperature for 30 minutes. Next, the beads were washed 3 times with 2 ml of phosphate buffer.
Next, the reagent end specie for quantifying pyrogens ((1 → 3)
(-β-D-Glucan is not detected) was used to quantify the amount of the pyrogen, and the results are shown in Table 6. The instruments, buffers, etc. used in the above operation were endotoxin-free and (1 → 3) -β-D-Glucan-free.
【００３７】[0037]
【表６】 [Table 6]
【００３８】表６に示したように、本発明に関わる発熱
性物質吸着ビーズは、発熱性物質の良好な吸着性能を示
した。また、エンドスペシーによるエンドトキシンの定
量結果も良好であった。即ち、レンチナンによる非特異
反応は認められなかった。As shown in Table 6, the exothermic substance-adsorbing beads according to the present invention showed a good adsorbing performance for the exothermic substance. In addition, the endotoxin quantification result by endoscopy was also good. That is, no nonspecific reaction due to lentinan was observed.
【００３９】[0039]
【実施例８】反応性官能基-N=CH-(CH2)3-CH=NHを結合さ
せて固相化し、その官能基の末端アミノ基に、発熱性物
質と結合するリガンドであるコリスチンを共有結合させ
たポリスチレン製小試験管を調製した。Example 8 reactive functional group -N = CH- (CH 2) 3 -CH = to bind the NH immobilized by, the terminal amino group of a functional group, a ligand that binds to pyrogens colistin A polystyrene small test tube to which was covalently bonded was prepared.
【００４０】この小試験管(ブロック済)に緩衝液２ｍ
ｌ、エンドトキシンＡ液 （リン酸緩衝液にエンドトキ
シン１．５００ＥＵ／ｍｌを溶解）または、エンドトキ
シンＢ液（リン酸緩衝液にエンドキシン１．５００ＥＵ
／ｍｌ及びメシル酸ガベキサート８０ｕｇ／ｍｌを溶
解）２００ｕｌを秤量し、室温で３０分インキュベート
した。次に、前記小試験管をリン酸緩衝液２ｍｌで３回
洗浄した。次に、発熱性物質定量用試薬エンドスペシー
（(１→３)-β-D-Glucanは検出しない）及びトキシカラ
ー（(１→３)-β-D-Glucanも検出する）を用いて、発熱
性物質の定量を行ない、その結果を表７に示した。尚、
以上の操作に用いた器具、緩衝液等はすべてエンドキシ
ンフリー及び(１→３)-β-D-Glucanフリーのものを用い
た。2 m of buffer solution in this small test tube (blocked)
l, endotoxin A solution (dissolving 1.500 EU / ml endotoxin in phosphate buffer) or endotoxin B solution (1.500 EU endophosphate in phosphate buffer)
/ Ml and 80 ug / ml of gabexate mesylate were dissolved) and 200 ul were weighed and incubated at room temperature for 30 minutes. Next, the small test tube was washed 3 times with 2 ml of phosphate buffer. Then, using the reagent endospy for quantifying pyrogenic substances ((1 → 3) -β-D-Glucan is not detected) and Toxicolor ((1 → 3) -β-D-Glucan is also detected) The amount of the volatile substances was quantified, and the results are shown in Table 7. still,
The instruments, buffers, etc. used in the above operation were endoxin-free and (1 → 3) -β-D-Glucan-free.
【００４１】[0041]
【表７】 [Table 7]
【００４２】表７に示したように、本発明に関わる発熱
性物質吸着小試験管は、発熱性物質の良好な吸着性能を
示した。また、エンドスペシー及びトキシカラーによる
エンドトキシンの定量結果も良好であった。即ち、メシ
ル酸ガベキサートの影響は認められなかった。As shown in Table 7, the small exothermic substance adsorption test tubes according to the present invention showed good adsorption performance of the exothermic substance. Moreover, the endotoxin and endotoxin quantification results were also good. That is, no effect of gabexate mesylate was observed.
【００４３】[0043]
【実施例９】反応性官能基-N=CH-(CH2)3-CH=NHを結合さ
せて固相化し、その官能基の末端アミノ基に、発熱性物
質と結合するリガンドであるポリミキシンＢを共有結合
させたポリスチレン製小試験管を調製した。Example 9 Polymyxin, which is a ligand that binds to an exothermic substance at the terminal amino group of the reactive functional group -N = CH- (CH 2 ) 3 -CH = NH, is immobilized and immobilized. A polystyrene small test tube to which B was covalently bonded was prepared.
【００４４】この小試験管（ブロック済）に緩衝液２ｍ
ｌ、エンドトキシンＡ液（リン酸緩衝液にエンドトキシ
ン０．５００ＥＵ／ｍｌを溶解）または、エンドトキシ
ンＢ液（リン酸緩衝液にエンドトキシン０．５００ＥＵ
／ｍｌ及びアプロチニン１０ｕ／ｍｌを溶解）２００ｕ
ｌを秤量し、室温で３０分インキュベートした。次に、
前記小試験管をリン酸緩衝液２ｍｌで３回洗浄した。次
に、発熱性物質定量用試薬エンドスペシー（(１→３)-
β-D-Glucanは検出しない）及びトキシカラー（(１→
３)-β-D-Glucanも検出する）を用いて、発熱性物質の
定量を行ない、その結果を表８に示した。尚、以上の操
作に用いた器具、緩衝液等はすべてエンドトキシンフリ
ー及び(１→３)-β-D-Glucanフリーのものを用いた。2 m of buffer solution in this small test tube (blocked)
1, endotoxin A solution (dissolving endotoxin 0.500 EU / ml in phosphate buffer) or endotoxin B solution (endotoxin 0.500 EU in phosphate buffer)
/ Ml and aprotinin 10u / ml dissolved) 200u
1 was weighed and incubated at room temperature for 30 minutes. next,
The small test tube was washed 3 times with 2 ml of phosphate buffer. Next, the reagent endoscopy ((1 → 3)-
β-D-Glucan is not detected) and Toxicolor ((1 →
(3) -β-D-Glucan is also detected), and the amount of the pyrogenic substance was quantified, and the results are shown in Table 8. The instruments, buffers, etc. used in the above operation were endotoxin-free and (1 → 3) -β-D-Glucan-free.
【００４５】[0045]
【表８】 [Table 8]
【００４６】表８に示したように、本発明に関わる発熱
性物質吸着小試験管は、発熱性物質の良好な吸着性能を
示した。また、エンドスペシー及びトキシカラーによる
エンドトキシンの定量結果も良好であった。即ち、アプ
ロチニンの影響は認められなかった。尚、実施例１〜実
施例９に用いたエンジスペシー及びトキシカラーは、何
れも（株）生化学工業（東京）の製品である。As shown in Table 8, the small exothermic substance adsorption test tube according to the present invention showed good adsorption performance of the exothermic substance. Moreover, the endotoxin and endotoxin quantification results were also good. That is, no influence of aprotinin was observed. The engineering specie and toxicolor used in Examples 1 to 9 are products of Seikagaku Corporation (Tokyo).
【００４７】[0047]
【発明の効果】本発明に関わる器具を使用し、発熱性物
質を特異的に吸着した後、リムルス試験、或いは、放射
イムノアッセイ法、非放射イムノアッセイ法等により、
発熱性物質を定量することにより、従来技術で不可欠で
あった検体の前処理、後処理の必要が全く無くなるとい
う利点が生ずる。また、本発明に関わる器具が発熱性物
質（エンドトキシン）のみを特異的に吸着する為、カブ
トガニ血球注出液全体を用いてリムルス試験を行なって
も(１→３)-β-D-Glucan等に対する非特異反応に配慮す
る必要はなく、高い精度で発熱性物質を定量することが
できる。[Effects of the Invention] Using the device according to the present invention, after specifically adsorbing a pyrogen, by a Limulus test, or a radioimmunoassay method, a non-radioimmunoassay method, etc.,
By quantifying the pyrogen, there is an advantage that the pretreatment and posttreatment of the specimen, which is indispensable in the prior art, is completely eliminated. Further, since the device according to the present invention specifically adsorbs only a pyrogen (endotoxin), even if a Limulus test is performed using the whole horseshoe crab effusion, (1 → 3) -β-D-Glucan etc. It is not necessary to consider the non-specific reaction to, and the pyrogen can be quantified with high accuracy.
Claims (5)
て、発熱性物質と結合するポリペプチド系抗生物質を固
定化したゲル状の発熱性物質吸着体を固相化した容器、
試験管、ビース、ボール、磁性粒子、チップ、薄板、小
片、薄膜、小棒、マイクロタイタープレート、ストリッ
プ及びろ紙ディスクからなる群から選ばれる器具。1. A device for use in quantifying a heat-generating substance, which is a container in which a gel-like heat-generating substance adsorbent, on which a polypeptide antibiotic binding to the heat-generating substance is immobilized, is immobilized.
An instrument selected from the group consisting of test tubes, beads, balls, magnetic particles, chips, lamellas, pieces, thin films, rods, microtiter plates, strips and filter paper discs.
生物質を固定化したアフィニティークロマトグラフィー
担体である、請求項１記載の器具。2. The device according to claim 1, wherein the exothermic substance adsorbent is an affinity chromatography carrier on which a polypeptide antibiotic is immobilized.
て、反応性官能基を固相化し、その官能基に発熱性物質
と結合するリガンドとしてポリペプチド系抗生物質を共
有結合させた容器、試験管、ビース、ボール、磁性粒
子、チップ、薄板、小片、薄膜、小棒、マイクロタイタ
ープレート、ストリップ及びろ紙ディスクからなる群か
ら選ばれる器具。3. A device for use in quantifying an exothermic substance, which comprises a reactive functional group immobilized on a solid phase and a polypeptide antibiotic covalently bound to the functional group as a ligand for binding to the exothermic substance. An instrument selected from the group consisting of test tubes, beads, balls, magnetic particles, chips, lamellas, pieces, thin films, rods, microtiter plates, strips and filter paper discs.
用いて発熱性物質を定量する方法であって、前記器具に
発熱性物質を吸着した後、放射イムノアッセイ法、非放
射イムノアッセイ法、及びリムルス試験法からなる群か
ら選ばれる方法により吸着された発熱性物質を定量する
ことを特徴とする方法。4. A method for quantifying a pyrogenic substance using the instrument according to claim 1, wherein the instrument is a radioimmunoassay method or a non-radioimmunoassay method after adsorbing the pyrogenic substance. , And a method selected from the group consisting of the Limulus test method, to quantify the adsorbed pyrogenic substance.
用いて発熱性物質を定量する為に構成された発熱性物質
定量キット。5. A pyrogenic substance quantification kit configured for quantifying a pyrogenic substance using the device according to claim 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33614896A JPH09178753A (en) | 1996-12-16 | 1996-12-16 | Pyrogen adsorptive body and method for quantitating pyrogen using it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33614896A JPH09178753A (en) | 1996-12-16 | 1996-12-16 | Pyrogen adsorptive body and method for quantitating pyrogen using it |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3169479A Division JP2690415B2 (en) | 1991-01-26 | 1991-01-26 | Pyrogenic substance adsorbent and method for quantifying exothermic substance using the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09178753A true JPH09178753A (en) | 1997-07-11 |
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ID=18296193
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33614896A Pending JPH09178753A (en) | 1996-12-16 | 1996-12-16 | Pyrogen adsorptive body and method for quantitating pyrogen using it |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09178753A (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1139100A2 (en) * | 2000-03-30 | 2001-10-04 | Ebara Corporation | Reactive probe chip, composite substrate and method for fabrication of the same |
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-
1996
- 1996-12-16 JP JP33614896A patent/JPH09178753A/en active Pending
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