JPH09176195A - High-purity human serum albumin-containing composition obtained by human serum albumin derived from genetic engineering - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an inexpensive human serum albumin preparation, capable of stably feeding collecting source, free from danger of mixing of virus, etc., and suitable for medical uses by purifying human serum albumin derived from generic engineering by combination of specific steps. SOLUTION: This human serum albumin-containing composition is obtained purifying human serum albumin derived from generic engineering and contains no producing host-related ingredients or other impurity ingredients and sufficiently suppressed in coloring. The composition is preferably obtained by carrying out ultrafiltration, heat treatment and acid treatment of cultured supernatant of a host producing human serum albumin and carrying out ultrafiltration of the treated material and subjecting the treated material to each treatment due to cation exchanger, hydrophobic chromatography, anionic exchanger, salting out, etc.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子操作由来のヒ
ト血清アルブミンより得られる高純度のヒト血清アルブ
ミン含有組成物、特に、遺伝子操作由来のヒト血清アル
ブミンを特定の工程を組み合わせて精製することにより
得られうる高純度のヒト血清アルブミン含有組成物に関
する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a high-purity human serum albumin-containing composition obtained from human serum albumin derived from genetic engineering, and in particular to human serum albumin derived from genetic engineering by purifying it by combining specific steps. It relates to a highly pure human serum albumin-containing composition that can be obtained.

【０００２】[0002]

【従来の技術】アルブミン、特にヒト血清アルブミン
（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構
成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中
で正常な浸透圧を維持する責を負う。また種々の血清分
子のキャリアーとしての機能を持っている。ＨＳＡは種
々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショッ
クや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に
関連するいくつかの症状を改善させるために、通常はＨ
ＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や胎児性赤芽
球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とす
ることがある。従って、ＨＳＡを投与する基本的な治療
上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす
低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失が
ある様な状態を治療する点に存する。2. Description of the Related Art Albumin, particularly human serum albumin (hereinafter also referred to as "HSA"), is a major protein constituent of plasma. This protein is made in the liver and is primarily responsible for maintaining normal osmotic pressure in the bloodstream. It also functions as a carrier for various serum molecules. HSA is administered in various clinical settings. For example, in patients with shock or burns, H2 is usually used to restore blood volume and thereby improve some of the trauma-related symptoms.
Requires frequent administration of SA. Patients suffering from hypoproteinemia or erythroblastosis may also require treatment with HSA. Therefore, the basic therapeutic significance of administering HSA lies in treating conditions such as fluid loss from blood vessels, as in hypoproteinemia, which results in surgery, shock, burns, and edema. .

【０００３】現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の
分画からの産物として製造されている。この製造法の欠
点は不経済であることと、血液の供給が困難であるとい
うことである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ま
しくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡ
の代替の原料を開発することが有益となろう。Currently, HSA is produced primarily as a product from a collected blood fraction. The drawbacks of this manufacturing method are that it is uneconomical and that the supply of blood is difficult. Blood may also contain undesired substances such as hepatitis virus. Therefore, HSA
It would be beneficial to develop alternative raw materials for.

【０００４】ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によっ
て、多種多様の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、多くの哺乳動物ポリペプチド類が既に種
々の微生物により生産されている。ＨＳＡについても、
遺伝子操作の技術により大量生産し、それを高度精製す
る技術が確立されつつある。With the advent of recombinant DNA technology, a variety of useful polypeptides can be produced by microorganisms, and many mammalian polypeptides have already been produced by various microorganisms. For HSA,
A technique for mass-producing by genetic engineering technology and highly purifying it is being established.

【０００５】ＨＳＡを血漿から単離、精製する方法とし
ては各種研究がなされ、実用化されている。例えば、コ
ーンのエタノール分画法、ＰＥＧ分画法、硫安分画法等
が知られている。また最近では、陰イオン交換体処理と
６０℃，１０時間の加熱処理を組み合わせる方法（特開
平２−１９１２２６号公報）、陰イオン交換体処理、陽
イオン交換体処理および６０℃，１０時間の加熱処理を
組み合わせる方法（特開平３−１７１２３号公報）等も
開発されている。Various studies have been conducted and put to practical use as a method for isolating and purifying HSA from plasma. For example, the Cohn ethanol fractionation method, the PEG fractionation method, the ammonium sulfate fractionation method and the like are known. Recently, a method of combining anion exchanger treatment and heat treatment at 60 ° C. for 10 hours (JP-A-2-191226), anion exchanger treatment, cation exchanger treatment and heating at 60 ° C. for 10 hours. A method of combining treatments (Japanese Patent Laid-Open No. 3-17123) has also been developed.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】しかし、遺伝子操作に
より得られるＨＳＡを精製するには、上記の血漿由来の
ＨＳＡでの方法をそのまま適用することは適切とは言え
ない。なぜならば、除去すべき夾雑成分が血漿由来ＨＳ
Ａと遺伝子操作由来ＨＳＡとでは全く異なっているから
である。また、着色物質の除去という遺伝子操作由来の
ＨＳＡに特有の問題も存在する。したがって、本発明の
課題は、遺伝子操作により得られ、かつ産生宿主関連成
分あるいはその他の夾雑成分を含まず、着色も充分に抑
えられたＨＳＡを提供することにある。However, in order to purify HSA obtained by genetic engineering, it cannot be said that it is appropriate to directly apply the above-mentioned method for plasma-derived HSA. This is because the contaminants that should be removed are HS derived from plasma.
This is because A is completely different from HSA derived from genetic manipulation. In addition, there is a problem peculiar to HSA derived from genetic engineering, that is, removal of a coloring substance. Therefore, an object of the present invention is to provide an HSA that is obtained by genetic engineering, does not contain components related to the production host or other contaminants, and has sufficiently suppressed coloring.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑みて、鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作により得
られるＨＳＡを効率良く精製する方法を開発し、以て高
純度の遺伝子操作由来ＨＳＡ含有組成物を製造すること
に成功して本発明を完成するに至った。即ち、本発明
は、遺伝子操作により得られる分子量６万７千のヒト血
清アルブミンを含有し、且つ以下の特徴を有するヒト血
清アルブミン含有組成物； （１）ヒト血清アルブミンの二量体、重合体または分解
物を実質的に含まない （２）産生宿主に由来する夾雑成分あるいは多糖類を実
質的に含まない、である。特に、本発明は、さらに該ヒ
ト血清アルブミン含有組成物の溶液が、（ｉ）Ａ₃₅₀ ／
Ａ₂₈₀ が０．０１〜０．０５、（ii）Ａ₄₅₀ ／Ａ₂₈₀ が
０．００１〜０．０２の着色度を有することを特徴とす
る上記ヒト血清アルブミン含有組成物である。就中、本
発明は、さらにヒト血清アルブミン以外のヒト由来成分
を含まないことを特徴とする上記ヒト血清アルブミン含
有組成物である。当該ヒト血清アルブミン含有組成物
は、例えば、下記の第一から第四の方法により得られう
るが、それらに限定はされない。[Means for Solving the Problems] In view of the above circumstances, the inventors of the present invention have conducted extensive studies and as a result, have developed a method for efficiently purifying HSA obtained by genetic engineering, thereby producing a gene of high purity. The present invention has been completed by successfully producing an operation-derived HSA-containing composition. That is, the present invention is a human serum albumin-containing composition containing human serum albumin having a molecular weight of 67,000 obtained by genetic engineering and having the following characteristics: (1) Human serum albumin dimer or polymer Alternatively, it is substantially free of degradation products (2) is substantially free of contaminants or polysaccharides derived from the production host. In particular, the present invention further provides a solution of the human serum albumin-containing composition comprising (i) A ₃₅₀ /
A ₂₈₀ is 0.01 to 0.05, is the human serum albumin-containing composition characterized in that it has a (ii) A ₄₅₀ / A ₂₈₀ is the coloring degree of 0.001 to 0.02. In particular, the present invention is the above-mentioned human serum albumin-containing composition, which further contains no human-derived component other than human serum albumin. The human serum albumin-containing composition can be obtained, for example, by the following first to fourth methods, but is not limited thereto.

【０００８】即ち、第一の方法は、遺伝子操作により得
られるヒト血清アルブミンを以下の〜を含む工程を
用いて精製することを特徴とするヒト血清アルブミンの
製造方法； ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分
子量１０万〜５０万、及び１０００〜５万の限外濾過膜
を用いて処理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８〜１０、塩濃度
０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する、そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する、
である。That is, the first method is a method for producing human serum albumin, which comprises purifying human serum albumin obtained by genetic engineering using the steps including the following steps; The culture supernatant is treated with an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of 100,000 to 500,000 and 1,000 to 50,000. Heat treatment is performed at 50 to 70 ° C. for 30 minutes to 5 hours. Acid treatment at pH 3-5. Treatment is carried out using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of 100,000 to 500,000. After contacting with a cation exchanger under conditions of pH 3 to 5 and salt concentration of 0.01 to 0.2M, elution is performed under conditions of pH 8 to 10 and salt concentration of 0.2 to 0.5M. The non-adsorbed fraction is recovered by contacting the carrier for hydrophobic chromatography under the conditions of pH 6 to 8 and salt concentration of 0.01 to 0.5M, and pH 6 to 8 and salt concentration of 0.01 to 0.1M. Contacting the anion exchanger under conditions to collect the non-adsorbed fraction,
It is.

【０００９】また、第二の方法は、前記第一の発明の工
程の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度１〜３Ｍの条件下
で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜
８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で溶出する工程
を含むヒト血清アルブミンの製造方法である。In the second method, instead of the step of the first invention, after contacting the carrier for hydrophobic chromatography under conditions of pH 6 to 8 and salt concentration of 1 to 3M, the pH is adjusted to 6 to 6.
8. A method for producing human serum albumin, which comprises a step of eluting under a condition of a salt concentration of 0.01 to 0.5M.

【００１０】さらに、第三の方法は、前記第一の発明の
工程の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜
０．０５Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させた後
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出
する工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法である。Further, in the third method, instead of the step of the first invention, pH 6-8 and salt concentration 0.001-.
A method for producing human serum albumin, which comprises a step of contacting with an anion exchanger under a condition of 0.05 M and then eluting under a condition of pH 6 to 8 and a salt concentration of 0.05 to 1 M.

【００１１】さらに、第四の方法は、前記第一の発明の
工程との間、との間、またはの後で、ｐＨ３
〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、沈澱
画分を回収する工程をさらに含むヒト血清アルブミンの
製造方法である。Further, the fourth method is that the pH value is adjusted to 3 during, during, or after the step of the first invention.
-5, a method for producing human serum albumin, further comprising a step of salting out under conditions of a salt concentration of 0.5 to 3 M, and collecting a precipitate fraction.

【００１２】（１）遺伝子操作による得られるＨＳＡ 本発明において用いられる遺伝子操作により調製された
ＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調製されたもの
であれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの
他、今後開発されるものであっても適宜利用することが
できる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性と
された菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細
胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主と
して、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)
〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス
（Pichia pastoris ）〕が使用されることが好ましい。
また、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。
さらにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株
（a, his 4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリスＧＴ
Ｓ１１５株 (his 4)等が好適に用いられる。(1) HSA Obtained by Genetic Manipulation The HSA-producing host prepared by genetic engineering used in the present invention is not particularly limited as long as it is prepared by genetic engineering, and it has already been described in known literature. In addition to the ones, those developed in the future can be appropriately used. Specific examples include bacteria (eg, Escherichia coli, yeast, Bacillus subtilis, etc.) that have been made HSA-producing through genetic manipulation, animal cells, and the like. In particular, in the present invention, as a host, yeast, especially Saccharomyces genus [for example, Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae)
], Or Pichia genus [eg Pichia pastoris] is preferably used.
Also, auxotrophic strains and antibiotic sensitive strains can be used.
Furthermore, Saccharomyces cerevisiae AH22 strain (a, his 4, leu 2, can 1), Pichia pastoris GT
S115 strain (his 4) and the like are preferably used.

【００１３】これらのＨＳＡ産生性宿主の調製方法およ
びその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳ
Ａの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手
法を採用することによって実施される。例えば、ＨＳＡ
産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法として
は、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方
法（特開昭５８−５６６８４、同５８−９０５１５、同
５８−１５０５１７号公報）、新規なヒト血清アルブミ
ン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５、特開
平１−９８４８６号公報）、合成シグナル配列を用いる
方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミ
ンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５
号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法
（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させ
る方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含
有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ₂ プロ
モーターを用いる方法（特願平３−６３５９８、同３−
６３５９９号公報）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開
昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現
（特開昭６０−４１４８７、同６３−３９５７６、同６
３−７４４９３号公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発
現（特開平２−１０４２９０号公報）等が例示される。Method for preparing these HSA-producing hosts, method for producing HSA by culturing them, and HS from culture
All the separation and collection methods of A are carried out by adopting publicly known methods and their modifications. For example, HSA
Examples of the method for preparing the producing host (or HSA producing strain) include a method using a normal human serum albumin gene (Japanese Patent Laid-Open Nos. 58-56684, 58-90515, 58-150517), and novel human serum. Method using albumin gene (JP-A-62-29985, JP-A-1-98486), method using synthetic signal sequence (JP-A-1-240191), method using serum albumin signal sequence (JP-A-2- 167095
JP-A-3-72889), a method of fusing hosts with each other (JP-A-3-53877), a method of causing mutation in a medium containing methanol, Method using mutant AOX ₂ promoter (Japanese Patent Application No. 3-63598, 3-
63599), HSA expression by Bacillus subtilis (JP-A-62-25133), and yeast expression of HSA (JP-A-60-41487, 63-39576, 6).
3-74493), HSA expression by Pichia yeast (JP-A-2-104290), and the like.

【００１４】このうち、メタノール含有培地中で変異を
起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわ
ち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的に
はＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
のＡＯＸ₁ 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ₁ プロモータ
ー支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラ
スミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４
２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培
地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタ
ノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能
な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度として
は、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工
培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１
５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。Of these, the method for causing mutation in a medium containing methanol is specifically performed as follows. That is, first, an appropriate host, preferably Pichia yeast, specifically, the GTS115 strain (NRRL accession number Y-15851)
Obtain a transformant HSA by a conventional method to AOX ₁ gene region under AOX ₁ promoter governing of introducing a plasmid having a transcription unit to express (JP 2-104
290). This transformant has a low ability to grow in a methanol medium. Therefore, this transformant is cultured in a medium containing methanol to cause mutation, and only a viable strain is recovered. At this time, the methanol concentration is, for example, about 0.0001 to 5%. The medium may be an artificial medium or a natural medium. Culture conditions are 1
5 to 40 ° C. and about 1 to 1000 hours are exemplified.

【００１５】また、ＨＳＡ産生性宿主の培養方法（すな
わちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度
のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対す
る高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る
方法（特願平１−２１９５６１号公報）、培地中に脂肪
酸を添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特願平３−
８１７１９号公報）等が例示される。さらにＨＳＡの分
離採取方法としては、上記の各公報に記載された方法の
他に加熱処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−
１０３１８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体お
よび活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一を用い
てＨＳＡと着色成分を分離することによる着色抑制方法
（特開平４−５４１９８号公報）等が例示される。As a method for culturing an HSA-producing host (that is, a method for producing HSA), in addition to the methods described in the above-mentioned publications, high-concentration glucose is supplied in appropriate small amounts by fed-batch culture. Then, a method for obtaining a high-concentration bacterial cell and a product by avoiding high-concentration substrate inhibition on the producing bacterial cell (Japanese Patent Application No. 1-219561), and a method for enhancing the production of HSA by adding a fatty acid to the medium (Patent application 3-
No. 81719). Further, as a method for separating and collecting HSA, in addition to the methods described in the above-mentioned publications, inactivation of protease by heat treatment (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 3 (1998) -31868).
No. 103188), a method for suppressing coloration by separating HSA and a coloring component using at least one selected from the group consisting of an anion exchanger, a hydrophobic carrier, and activated carbon (JP-A-4-54198). It is illustrated.

【００１６】形質転換宿主の培養に用いられる培地は、
通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸
またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一
般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然
培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、
合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素
源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養
素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩
としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ
などが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イースト
ナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコー
ス〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ
液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社
製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコ
ース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基
性、弱酸性でよい。またメタノール資化性宿主の場合
は、メタノール含有培地を用いることができる。この場
合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。The medium used for culturing the transformed host is
Usually, a medium known in the art to which a fatty acid having 10 to 26 carbon atoms or a salt thereof is added is used, and the culture condition is carried out according to a general conventional method. The medium may be a synthetic medium or a natural medium, and a liquid medium is preferable. For example,
As a synthetic medium, generally, various sugars as carbon sources, urea, ammonium salts, nitrates and the like as nitrogen sources, various vitamins and nucleotides as micronutrients, and Mg, Ca, Fe, Na, K, Mn and Co as inorganic salts are generally used. , Cu
And the like. YNB liquid medium [0.7% yeast nitrite base (manufactured by Difco), 2% glucose] and the like can be mentioned. As a natural medium, YPD
A liquid medium [1% yeast extract (manufactured by Difco), 2% bactopeptone (manufactured by Difco), 2% glucose] is exemplified. The pH of the medium may be neutral, weakly basic or weakly acidic. Further, in the case of a methanol-assimilating host, a methanol-containing medium can be used. In this case, the methanol concentration is about 0.01-5%.

【００１７】培養温度は、１５〜４３℃（酵母は２０〜
３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は
１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、
攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続
培養法により実施される。なお、当該培養に先立って前
培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例
えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前
培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間
は１０〜１００時間、温度は酵母では３０℃、細菌では
３７℃程度が好ましい。The culturing temperature is 15 to 43 ° C (20 to 20 ° C for yeast).
30 ° C., and bacteria preferably 20 to 37 ° C.). The culturing time is about 1 to 1000 hours, and the culturing is allowed to stand or shake,
It is carried out by a batch culture method, a semi-batch culture method or a continuous culture method under stirring and aeration. Preferably, pre-culture is performed prior to the culture. As the medium at this time, for example, YNB liquid medium or YPD liquid medium is used. The culture conditions of the preculture are as follows. That is, the culture time is preferably 10 to 100 hours, and the temperature is preferably about 30 ° C. for yeast and about 37 ° C. for bacteria.

【００１８】かくして培養終了後、ＨＳＡは培養濾液ま
たは菌体、細胞からそれぞれ公知の分離手段により採取
される。After the completion of the culture, HSA is collected from the culture filtrate, cells or cells by known separation means.

【００１９】（２）ＨＳＡの精製 (i) 限外濾過 本工程は、ＨＳＡ産生宿主を分離した培養上清から、Ｈ
ＳＡ以外の高分子量物質および低分子量物質を限外濾過
法により分離除去する工程である。高分子量物質の除去
には分画分子量１０万〜５０万程度、好ましくは３０万
程度の限外濾過膜を、低分子量物質の除去には分画分子
量１０００〜５万程度、好ましくは１万〜３万程度の限
外濾過膜を使用する。高分子量物質の除去では残存する
ＨＳＡ産生宿主の分離が、また、低分子量物質の除去で
は液量の濃縮が同時に行われる。(2) Purification of HSA (i) Ultrafiltration In this step, the HSA-producing host is separated from the culture supernatant to obtain HSA.
It is a step of separating and removing high molecular weight substances and low molecular weight substances other than SA by an ultrafiltration method. An ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of about 100,000 to 500,000, preferably about 300,000 is used for removing high molecular weight substances, and a molecular weight cutoff of about 1,000 to 50,000, preferably about 10,000 for removing low molecular weight substances. An ultrafiltration membrane of about 30,000 is used. The removal of the high molecular weight substance simultaneously separates the remaining HSA-producing host, and the removal of the low molecular weight substance simultaneously concentrates the liquid amount.

【００２０】(ii) 加熱処理 (i) で得られた濃縮液を50〜70℃で30分〜５時間程度、
好ましくは60℃で１〜３時間程度加熱処理する。本工程
は安定化剤の存在下に行うことが好ましい。安定化剤と
しては、アセチルトリプトファン、炭素数６〜１８の有
機カルボン酸またはその塩等が例示される。両者は併用
してもよい。アセチルトリプトファンの添加量としては
１〜100mM 程度が例示される。炭素数６〜１８の有機カ
ルボン酸としては、カプロン酸（炭素数６）、カプリル
酸（炭素数８）、カプリン酸（炭素数１０）、ラウリン
酸（炭素数１２）、パルミチン酸（炭素数１６）、オレ
イン酸（炭素数１８）等が例示される。その塩として
は、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム
塩等）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩
等）が例示される。炭素数６〜１８の有機カルボン酸ま
たはその塩の添加量としては、１〜１００ｍＭ程度が例
示される。また、加熱処理時にチオール系化合物（例え
ば、メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタ
チオン等）を１〜１００ｍＭ程度、好ましくは５〜３０
ｍＭ、さらにアミノグアニジンを１０〜１０００ｍＭ添
加することにより加熱で生じる着色を抑制できる。本工
程は一部公知である（特開平３−１０３１８８号公
報）。(Ii) Heat treatment The concentrated solution obtained in (i) is heated at 50 to 70 ° C. for about 30 minutes to 5 hours,
Preferably, heat treatment is performed at 60 ° C. for about 1 to 3 hours. This step is preferably performed in the presence of a stabilizer. Examples of the stabilizer include acetyltryptophan, organic carboxylic acids having 6 to 18 carbon atoms or salts thereof, and the like. Both may be used in combination. The amount of acetyltryptophan added is, for example, about 1 to 100 mM. Examples of the organic carboxylic acid having 6 to 18 carbon atoms include caproic acid (6 carbon atoms), caprylic acid (8 carbon atoms), capric acid (10 carbon atoms), lauric acid (12 carbon atoms), palmitic acid (16 carbon atoms). ), Oleic acid (having 18 carbon atoms) and the like. Examples of the salt include alkali metal salts (eg sodium salt, potassium salt etc.) and alkaline earth metal salts (eg calcium salt etc.). The addition amount of the organic carboxylic acid having 6 to 18 carbon atoms or its salt is, for example, about 1 to 100 mM. In addition, a thiol compound (eg, mercaptoethanol, cysteine, reduced glutathione) at the time of heat treatment is about 1 to 100 mM, preferably 5 to 30 mM.
By adding mM, and further 10 to 1000 mM of aminoguanidine, coloring caused by heating can be suppressed. This step is partially known (Japanese Patent Laid-Open No. 3-103188).

【００２１】(iii) 酸処理 (ii)の処理液のｐＨを３〜５程度、好ましくは４〜４．
６程度に調整し、１〜１２時間程度静置する。(Iii) Acid treatment The pH of the treatment liquid of (ii) is about 3 to 5, preferably 4 to 4.
Adjust to about 6 and leave it for about 1 to 12 hours.

【００２２】(iv) 限外濾過 本工程は、高分子化した夾雑物質を限外濾過法により分
離除去する工程である。高分子量物質の除去には、分画
分子量１０万〜５０万程度、好ましくは３０万程度の限
外濾過膜を使用する。また、必要に応じて、分画分子量
１０００〜５万程度、好ましくは１万〜３万程度の限外
濾過膜を用いて、次工程の陽イオン交換体処理のための
緩衝液交換を行うことができる。(Iv) Ultrafiltration This step is a step of separating and removing polymerized contaminants by an ultrafiltration method. An ultrafiltration membrane having a cut-off molecular weight of about 100,000 to 500,000, preferably about 300,000 is used for removing the high molecular weight substance. In addition, if necessary, a buffer exchange for the cation exchanger treatment in the next step is performed using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of about 1,000 to 50,000, preferably about 10,000 to 30,000. You can

【００２３】(v) 陽イオン交換体処理 陽イオン交換体としては、スルホ基型、カルボキシル基
型等が例示される。スルホ基型としては、スルホ−アガ
ロース（商品名Ｓ−セファロース、ファルマシア社
製）、スルホプロピル−デキストラン（商品名ＳＰ−セ
ファデックス、ファルマシア社製）、スルホプロピル−
ポリビニル（商品名ＳＰ−トヨパール、東ソー社製）等
が例示される。また、カルボキシル基型としては、カル
ボキシメチル−デキストラン〔商品名ＣＭ−セファデッ
クス（ファルマシア社製）、商品名ＣＭ−セルロファイ
ン（生化学工業社製）〕等が例示される。接触、洗浄条
件としては、ｐＨ３〜５程度、好ましくは４〜４．６程
度、塩濃度０．０１〜０．２Ｍ程度、好ましくは０．０
５〜０．１Ｍ程度が例示される。溶出条件としては、ｐ
Ｈ８〜１０程度、好ましくは８．５〜９．５程度、塩濃
度０．２〜０．５Ｍ程度、好ましくは０．３〜０．４Ｍ
程度が例示される。(V) Cation Exchanger Treatment Examples of the cation exchanger include sulfo group type and carboxyl group type. As the sulfo group type, sulfo-agarose (trade name S-Sepharose, manufactured by Pharmacia), sulfopropyl-dextran (trade name SP-Sephadex, manufactured by Pharmacia), sulfopropyl-
Polyvinyl (trade name SP-Toyopearl, manufactured by Tosoh Corporation) and the like are exemplified. Examples of the carboxyl group type include carboxymethyl-dextran [trade name CM-Sephadex (produced by Pharmacia), trade name CM-cellulofine (produced by Seikagaku Corporation)] and the like. As contact and washing conditions, pH is about 3 to 5, preferably about 4 to 4.6, salt concentration is about 0.01 to 0.2 M, preferably 0.0.
An example is about 5 to 0.1M. The elution conditions are p
H8-10, preferably 8.5-9.5, salt concentration 0.2-0.5M, preferably 0.3-0.4M
The degree is illustrated.

【００２４】(vi) 疎水性クロマト処理 疎水性クロマト用担体としては、炭素数４〜１８のアル
キル基型（ブチル基型、オクチル基型、オクチルデシル
基型等）、フェニル基型等が例示される。ブチル基型と
しては、ブチル−アガロース、ブチル−ポリビニル（商
品名ブチル−トヨパール、東ソー社製）、オクチル基型
としては、オクチル−アガロース、オクチルデシル基型
としては、オクチルデシル−アガロース、フェニル基型
としては、フェニル−セルロース（商品名フェニルセロ
ファイン、生化学工業社製）等が例示される。本工程で
は、ＨＳＡを非吸着画分に回収することができる。その
場合、接触条件は、ｐＨ６〜８程度、好ましくは６．５
〜７程度、塩濃度０．０１〜０．５Ｍ程度、好ましくは
０．０５〜０．２Ｍ程度である。また、ＨＳＡを上記担
体に吸着させた後に溶出することができる。この場合、
接触、洗浄条件としては、ｐＨ６〜８程度、好ましくは
６．５〜７程度、塩濃度１〜３Ｍ程度、好ましくは１．
５〜２Ｍ程度である。溶出条件としては、ｐＨ６〜８程
度、好ましくは６．５〜７程度、塩濃度０．０１〜０．
５Ｍ程度、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ程度である。(Vi) Hydrophobic Chromatographic Treatment Examples of the carrier for hydrophobic chromatography include alkyl group type having 4 to 18 carbon atoms (butyl group type, octyl group type, octyldecyl group type, etc.), phenyl group type and the like. It As the butyl group type, butyl-agarose, butyl-polyvinyl (trade name butyl-Toyopearl, manufactured by Tosoh Corporation), as the octyl group type, octyl-agarose, and as the octyldecyl group type, octyldecyl-agarose, phenyl group type Examples thereof include phenyl-cellulose (trade name phenyl cellophine, manufactured by Seikagaku Corporation) and the like. In this step, HSA can be collected in the non-adsorbed fraction. In that case, the contact condition is about pH 6 to 8, preferably 6.5.
The salt concentration is about 0.01 to 0.5M, preferably about 0.05 to 0.2M. Further, HSA can be eluted after being adsorbed on the carrier. in this case,
As contact and washing conditions, pH is about 6 to 8, preferably about 6.5 to 7, salt concentration is about 1 to 3 M, preferably 1.
It is about 5 to 2M. The elution conditions are about pH 6-8, preferably about 6.5-7, and a salt concentration of 0.01-0.
It is about 5M, preferably about 0.05 to 0.2M.

【００２５】(vii) 陰イオン交換体処理 陰イオン交換体としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥ
ＡＥ）基型、四級アミノエチル（ＱＡＥ）基型等が例示
される。ＤＥＡＥ基型としては、ＤＥＡＥ−アガロース
（商品名ＤＥＡＥ−セファロース、ファルマシア社
製）、ＤＥＡＥ−デキストラン（商品名ＤＥＡＥ−セフ
ァデックス、ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−ポリビニ
ル（商品名ＤＥＡＥ−トヨパール、東ソー社製）等が例
示される。また、ＱＡＥ基型としては、ＱＡＥ−アガロ
ース（商品名Ｑ−セファロース、ファルマシア社製）、
ＱＡＥ−ポリビニル（商品名ＱＡＥ−トヨパール、東ソ
ー社製）等が例示される。本工程では、ＨＳＡを非吸着
画分に回収することができる。その場合、接触条件は、
ｐＨ６〜８程度、好ましくは６．５〜７程度、塩濃度
０．０１〜０．１Ｍ程度である。また、ＨＳＡを上記担
体に吸着させた後に溶出することができる。この場合、
接触、洗浄条件としては、ｐＨ６〜８程度、好ましくは
６．５〜７程度、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍ程度、
好ましくは０．０１〜０．０２Ｍ程度である。溶出条件
としては、ｐＨ６〜８程度、好ましくは６．５〜７程
度、塩濃度０．０５〜１Ｍ程度である。(Vii) Anion Exchanger Treatment As anion exchanger, diethylaminoethyl (DE
Examples thereof include AE) group type and quaternary aminoethyl (QAE) group type. As the DEAE base type, DEAE-agarose (trade name DEAE-Sepharose, manufactured by Pharmacia), DEAE-dextran (trade name DEAE-Sephadex, manufactured by Pharmacia), DEAE-polyvinyl (trade name DEAE-Toyopearl, manufactured by Tosoh Corporation). ) Etc. are illustrated. In addition, as the QAE base type, QAE-agarose (trade name Q-Sepharose, manufactured by Pharmacia),
Examples include QAE-polyvinyl (trade name QAE-Toyopearl, manufactured by Tosoh Corporation) and the like. In this step, HSA can be collected in the non-adsorbed fraction. In that case, the contact conditions are
The pH is about 6 to 8, preferably about 6.5 to 7, and the salt concentration is about 0.01 to 0.1M. Further, HSA can be eluted after being adsorbed on the carrier. in this case,
As contact and washing conditions, pH is about 6 to 8, preferably about 6.5 to 7, salt concentration is about 0.001 to 0.05M,
It is preferably about 0.01 to 0.02M. The elution conditions are about pH 6 to 8, preferably about 6.5 to 7, and a salt concentration of about 0.05 to 1M.

【００２６】(viii) 塩析処理 本工程では、塩濃度が０．１〜３Ｍ、好ましくは０．５
〜１．５Ｍ程度になるように塩成分を添加し、ｐＨ３〜
５程度、好ましくは３．５〜４．５程度に調節すること
で、ＨＳＡを特異的に沈澱させ、これを分離することで
上清に存在しているＨＳＡ以外の不純物を分離すること
ができる。沈澱したＨＳＡは、適当な緩衝液に溶解す
る。イオン強度を調整するための塩成分は、特に限定し
ないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニ
ウム、チオシアン酸ナトリウム（または、カリウム）、
硫酸ナトリウム等が適当である。また、ＨＳＡ沈澱と上
清の分離方法は特に限定しないが、遠心分離、圧搾分
離、クロスフローによる膜分離等が適当である。本工程
は、(vii) の陰イオン交換体処理後に行うことは好まし
いが、(v) の陽イオン交換体処理と(vi)の疎水性クロマ
ト処理の間、あるいは (vi) の疎水性クロマト処理と(v
ii) の陰イオン交換体処理の間に行ってもよい。(Viii) Salting-out treatment In this step, the salt concentration is 0.1 to 3M, preferably 0.5.
~ Add a salt component to about 1.5M, pH 3 ~
By adjusting to about 5, preferably about 3.5 to 4.5, HSA is specifically precipitated, and by separating this, impurities other than HSA present in the supernatant can be separated. . The precipitated HSA is dissolved in a suitable buffer. The salt component for adjusting the ionic strength is not particularly limited, but sodium chloride, potassium chloride, ammonium sulfate, sodium (or potassium) thiocyanate,
Sodium sulfate and the like are suitable. The method of separating the HSA precipitate and the supernatant is not particularly limited, but centrifugation, compression separation, cross-flow membrane separation, etc. are suitable. This step is preferably performed after the anion exchanger treatment of (vii), but between the cation exchanger treatment of (v) and the hydrophobic chromatographic treatment of (vi), or the hydrophobic chromatographic treatment of (vi). And (v
It may be performed during the anion exchanger treatment of ii).

【００２７】（３）製剤化 得られたＨＳＡは公知の手法（限外濾過、安定化剤の添
加、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化するこ
とができる。こうして調製されたＨＳＡ製剤は注射剤と
して血漿由来ＨＳＡ製剤と同様に臨床上用いることがで
きる。また、医薬品の安定化剤あるいは担体、運搬体と
しても利用可能である。(3) Formulation The obtained HSA can be formulated by a known method (ultrafiltration, addition of a stabilizer, sterile filtration, dispensing, lyophilization, etc.). The HSA preparation thus prepared can be clinically used as an injection in the same manner as the plasma-derived HSA preparation. It can also be used as a stabilizer, carrier or carrier for pharmaceuticals.

【００２８】（４）精製された遺伝子操作由来のＨＳＡ
の性状 本発明の遺伝子操作由来のＨＳＡは分子量約６７０００
の単一物質である。本発明のＨＳＡ含有組成物は、上記
ＨＳＡの二量体あるいは重合体、分解物（分子量約４３
０００）を実質的に含まない。また、産生宿主に由来す
る夾雑成分、多糖類、特に抗原性の夾雑成分あるいは多
糖類も実質的に含まない。ここで、「実質的に含まな
い」とは、後記実施例の検出法での検出限界を下回るこ
とを意味する。また、着色度がＨＳＡ２５％溶液の場合
でＡ₃₅₀ ／Ａ ₂₈₀が０．０１〜０．０５、Ａ ₄₅₀／Ａ
₂₈₀が０．００１〜０．０２程度である。(4) Purified genetically engineered HSA
The genetically engineered HSA of the present invention has a molecular weight of about 67,000.
Is a single substance of. The HSA-containing composition of the present invention is a dimer or polymer of the above HSA, or a decomposition product (molecular weight of about 43).
000) is not substantially contained. Further, it is substantially free of contaminants and polysaccharides derived from the production host, particularly antigenic contaminants and polysaccharides. Here, "substantially free of" means that it is below the detection limit of the detection method of the Examples described below. Further, when the coloring degree is a 25% HSA solution, A ₃₅₀ / A ₂₈₀ is 0.01 to 0.05, A ₄₅₀ / A
₂₈₀ is about 0.001 to 0.02.

【００２９】[0029]

【発明の効果】本発明によれば、遺伝子操作により得ら
れるＨＳＡを効率よく精製することができる。また、遺
伝子操作により得られ、かつ、産生宿主関連成分あるい
はその他の夾雑成分を含まず、着色も充分に抑えられた
ＨＳＡを提供することができる。According to the present invention, HSA obtained by genetic engineering can be efficiently purified. Further, it is possible to provide HSA which is obtained by genetic engineering, does not contain components related to the production host or other contaminants, and has sufficiently suppressed coloring.

【００３０】[0030]

【実施例】本発明をより詳細に説明するために、実施例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。EXAMPLES In order to explain the present invention in more detail, examples will be given, but the present invention is not limited thereto.

【００３１】参考例１ (1) 使用菌株：Pichia pastoris GCP101株 特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に
より、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ₁ 遺伝子領域に、ＡＯＸ₁ プロ
モーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つ
プラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換
して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ₁
遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培
地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。Reference Example 1 (1) Strains used: Pichia pastoris GCP101 strain Pichia pastoris GTS11 was prepared by the method described in JP-A-2-104290.
The AOX ₁ gene region of 5 (his4) was replaced with a fragment cleaved with Not1 of plasmid pPGP1 having a transcription unit expressing HSA under the control of AOX ₁ promoter to obtain PC4130. This strain is AOX ₁
Due to the absence of the gene, the ability to grow in a medium containing methanol as a carbon source is low (Mut- strain).

【００３２】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０⁷ cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの
有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した
２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０
個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株は
ほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。PC4130 was inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract, 2% bactopeptone, 2% glucose), and after 24 hours, initial OD ₅₄₀ = 0.1.
Was inoculated into 50 ml of YPD medium. 3 days 30
YPD so that the initial OD ₅₄₀ = 0.1 after culturing at
The cells were inoculated into 50 ml of the medium. The same passage was repeated every three days. The cells were diluted with sterile water to 10 ⁷ cells / plate for each passage, and were diluted with 2% MeOH-YNBw / oa.
a. Plate (0.7% yeastite rosin ene base with out amino acid, 2% methanol, 1.5
% Agar powder) and cultured at 30 ° C. for 5 days to determine the presence or absence of colonies. As a result, 2% MeOH-YNBw / oa. a. 20 from the plate
Colonies resulted. Mut-strains can hardly grow on this plate, while Mut + strains can grow. That is, the formation of colonies in this plate indicates that the assimilation of methanol was increased and a strain converted to Mut + was obtained. One of the resulting colonies was appropriately diluted with sterile water to give 2% MeOH-YNBw / o.
a. a. It was spread on a plate and isolated into a single colony.
One of them was named GCP101.

【００３３】(2) 菌株の培養 （前々培養）グリセロール凍結ストック菌株１mlを２０
０mlのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００
ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養
した。(2) Culture of strain (pre-preculture) 20 ml of 1 ml of glycerol frozen stock strain
Baffled 1,000 with 0 ml YPD medium (Table 1)
The cells were inoculated into an Erlenmeyer flask of ml volume and cultured at 30 ° C for 24 hours with shaking.

【００３４】[0034]

【表１】 [Table 1]

【００３５】（前培養）ＹＰＤ培地５Ｌを含む１０Ｌ容
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。(Pre-culture) A pre-preculture solution was inoculated into a 10-L jar fermenter containing 5 L of YPD medium, and agitated and cultured for 24 hours. Culture temperature is 30 ℃, aeration rate is 5L /
Minutes. Further, the pH was not controlled in the preculture.

【００３６】（本培養）バッチ培養用培地（表２）２５
０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５kg／c
m² 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中に
メタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養
を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加すること
により、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。(Main culture) Medium for batch culture (Table 2) 25
The preculture liquid was inoculated into 0 L and cultured with aeration and stirring using a 1,200 L volume fermenter. The tank pressure is 0.5 kg / c
Batch culture was started while controlling the stirring speed so that the dissolved oxygen concentration was maintained at about 50% to 30% of the saturated dissolved oxygen concentration with m ² and the maximum aeration amount set to 800 NL / min.
The addition of the feed medium (Table 3) was started when the glycerol in the medium was consumed in the batch culture. A computer was used to add this feed medium, and high-density culture was performed while controlling so that methanol did not accumulate in the medium. The pH was controlled to a fixed value of pH 5.85 by adding 28% ammonia water. For defoaming, add an antifoaming agent (Adecanol, manufactured by Asahi Denka Co., Ltd.) to 0.3 at the start of batch culture.
It was carried out by adding 0 ml / L in advance and then adding a small amount as needed.

【００３７】[0037]

【表２】 [Table 2]

【００３８】[0038]

【表３】 [Table 3]

【００３９】参考例２ 参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモ
ーター [変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（TEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol.,9, 1316-1
323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基が
ＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラス
ミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia
pastoris) ＧＴＴ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特願平３−６３５９９号）。参考例
１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産
生させた。Reference Example 2 AOX2 promoter [mutant type] isolated from the GCP101 strain of Reference Example 1. Natural AOX2 promoter (TEAST,
5, 167-177 (1988) or Mol. Cell, Biol., 9, 1316-1
323 (1989)), the HSA expression plasmid pMM042 was constructed by mutating the 255th base upstream of the start codon from T to C].
pastoris) transformant UHG introduced into GTT115 strain
42-3 strain was obtained (Japanese Patent Application No. 3-63599). This UHG42-3 strain was cultured according to Reference Example 1 to produce HSA.

【００４０】実施例１ [i] 培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ） 参考例１で得られた培養液約８００Ｌを圧搾することに
より培養上清を分離した。培養上清を分画分子量が３０
万の限外濾過膜で処理した。次いで、分画分子量が３万
の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌに濃縮した〔膜分
画（Ｉ）〕。続いて、６０℃、３時間の加熱処理を行っ
た。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナトリウム、１０ｍＭ
システイン、１００ｍＭアミノグアニジンの共存下にｐ
Ｈ７．５で行った。加熱処理液を急速に約１５℃に冷却
し、ｐＨ４．５に調整した後に、再度分画分子量が３０
万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜分画（ＩＩ）〕。
次いで、分画分子量が３万の限外濾過膜を用いてアルブ
ミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５
０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に交換した。Example 1 [i] Separation of culture supernatant-membrane fraction (II) About 800 L of the culture solution obtained in Reference Example 1 was squeezed to separate the culture supernatant. The culture supernatant has a molecular weight cutoff of 30.
Treated with 10,000 ultrafiltration membranes. Then, the liquid amount was concentrated to about 80 L using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 30,000 [membrane fraction (I)]. Subsequently, heat treatment was performed at 60 ° C. for 3 hours. Heat treatment is 5 mM sodium caprylate, 10 mM
P in the presence of cysteine and 100 mM aminoguanidine
It was conducted at H7.5. The heat-treated solution was rapidly cooled to about 15 ° C. and adjusted to pH 4.5.
The membrane was treated with an ultrafiltration membrane [membrane fraction (II)].
Then, using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 30,000, the buffer solution in the albumin solution contains 5OmM sodium chloride.
The medium was replaced with 0 mM acetate buffer, pH 4.5.

【００４１】[ii] 陽イオン交換体処理 ５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐ
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにア
ルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。本処理前後の多糖
体含量をフェノール硫酸法で測定したところ、処理後の
サンプルでは処理前の１／２０に低下した。[Ii] Cation exchanger treatment 50 mM acetate buffer containing 50 mM sodium chloride, p
After adsorbing albumin on an S-sepharose packed column equilibrated with H4.5 and thoroughly washing with the same buffer,
0.1M phosphate buffer containing 0.3M sodium chloride,
Elution of albumin was performed at pH 9. When the polysaccharide content before and after the main treatment was measured by the phenol-sulfuric acid method, the sample after treatment showed a reduction to 1/20 of that before treatment.

【００４２】[iii] 疎水性クロマト処理 Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたアルブミン
溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファイ
ンを充填したカラムに添加した。この条件ではアルブミ
ンはフェニルセルロファインに吸着することなく、カラ
ムを通過した。カラムを通過したアルブミンは、分画分
子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮す
るとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン
酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。[Iii] Hydrophobic Chromatography Treatment The albumin solution eluted from the column packed with S-Sepharose was loaded onto a column packed with phenylcellulofine equilibrated with 50 mM phosphate buffer containing 0.15 M sodium chloride, pH 6.8. Was added. Under this condition, albumin passed through the column without being adsorbed on phenylcellulofine. The albumin that passed through the column was concentrated to a volume of about 50 L using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 30,000, and the buffer solution in the albumin solution was replaced with a 50 mM phosphate buffer solution, pH 6.8.

【００４３】[iv] 陰イオン交換体処理 疎水性クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったア
ルブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平
衡化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添
加した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロ
ースに吸着することなく、カラムを通過した。[Iv] Anion exchanger treatment After the hydrophobic chromatography treatment, the albumin solution which had been concentrated and buffer-exchanged was added to a column packed with DEAE-Sepharose equilibrated with 50 mM phosphate buffer, pH 6.8. did. Under these conditions, albumin passed through the column without being adsorbed on DEAE-Sepharose.

【００４４】[v] ＨＳＡの塩析処理 ５％濃度のＨＳＡに塩化ナトリウムを添加して最終濃度
１Ｍとした溶液を、酢酸でｐＨ３．５に調整し、ＨＳＡ
を沈澱させた。この沈澱を遠心により上清と分離し、不
純物を除去した。沈澱したアルブミンは溶解させ、分画
分子量３万の限外濾過膜を用いて濃縮および緩衝液交換
を行い、必要に応じ安定化剤を添加したのち、除菌濾過
することにより、注射剤として使用することができる。[V] HSA salting-out treatment A solution having a final concentration of 1 M by adding sodium chloride to 5% concentration of HSA was adjusted to pH 3.5 with acetic acid to prepare HSA.
Was precipitated. This precipitate was separated from the supernatant by centrifugation to remove impurities. The precipitated albumin is dissolved, concentrated and buffer-exchanged using an ultrafiltration membrane with a cut-off molecular weight of 30,000, and a stabilizer is added if necessary, followed by sterile filtration for use as an injection. can do.

【００４５】[vi] 精製工程のＨＰＬＣ分析 疎水性クロマト処理までの精製工程を終了したＨＳＡを
ＨＰＬＣゲル濾過により分析した。ゲル濾過分析は下記
の条件で行った。 カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社
製） 展開液：0.1M KH₂PO₄/0.3M NaCl 緩衝液 検出：波長２８０ｎｍでの吸光度 図１に示すように、精製ＨＳＡはＨＳＡモノマーのシン
グルピークとなった。[Vi] HPLC analysis of purification step HSA after the purification step up to the hydrophobic chromatographic treatment was analyzed by HPLC gel filtration. Gel filtration analysis was performed under the following conditions. Column: TSK gel G3000SW (manufactured by Tosoh Corporation) Developer: 0.1M KH ₂ PO ₄ /0.3M NaCl buffer Detection: Absorbance at wavelength 280 nm As shown in FIG. 1, purified HSA became a single peak of HSA monomer. .

【００４６】[vii] 酵母由来成分分析 アルブミン非産生酵母の培養上清を本法と同様の方法で
粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用
いて精製アルブミン溶液中に存在する酵母由来成分の検
出を行った。測定は酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で行っ
た。表４に塩析処理後のサンプルについての酵母由来成
分の検出結果を示す。サンプルはアルブミン濃度として
250 mg／mlに調整したものを用いて測定した。[Vii] Yeast-derived component analysis A culture supernatant of albumin non-producing yeast was crudely purified by the same method as this method to immunize a rabbit, and the obtained antiserum was used to exist in a purified albumin solution. The yeast-derived component was detected. The measurement was performed by an enzyme immunoassay (EIA method). Table 4 shows the detection results of yeast-derived components in the sample after the salting-out treatment. Sample as albumin concentration
The measurement was performed using the one adjusted to 250 mg / ml.

【００４７】[0047]

【表４】 [Table 4]

【００４８】アルブミン濃度250 mg/ml 中の酵母由来成
分量は疎水性クロマト処理後のサンプルで1,360 ng/ml
、陰イオン交換体処理後のサンプルでは5.4 ng/ml と
なり、１／２５０に低下した。さらに、塩析処理後の精
製アルブミンでは、0.1 ng/mlの検出限界において、酵
母由来成分は検出されなかった。The amount of yeast-derived components in the albumin concentration of 250 mg / ml was 1,360 ng / ml in the sample after hydrophobic chromatography.
, The sample after the anion exchanger treatment was 5.4 ng / ml, which was 1/250. Furthermore, yeast-derived components were not detected in the detection limit of 0.1 ng / ml in purified albumin after salting-out treatment.

【００４９】実施例２ 本発明の精製ＨＳＡの性状 （１）分子量 分子量測定は前述のＨＰＬＣゲル濾過法によった。本発
明の精製ＨＳＡの分子量は約６７０００であり、血漿由
来のＨＳＡと同程度であった。 （２）等電点 等電点は薄層ポリアクリルアミドゲルを用い、Allen ら
の方法 [J. Chromatog., 146, 1 (1978)] に準じて測定
した。本発明の精製ＨＳＡの等電点は約４．６であり、
血漿由来のＨＳＡと同程度であった。 （３）着色度 着色度は２８０ｎｍ、３５０ｎｍ、４５０ｎｍでの吸光
度を測定し、Ａ₃₅₀ ／Ａ ₂₈₀、Ａ ₄₅₀／Ａ ₂₈₀を算出し
た。本発明の精製ＨＳＡの着色度はＡ₃₅₀ ／Ａ ₂₈₀は約
０．０２、Ａ ₄₅₀／Ａ ₂₈₀は約０．０１であり、血漿由
来のＨＳＡと同程度であった。Example 2 Properties of purified HSA of the present invention (1) Molecular weight The molecular weight was measured by the above-mentioned HPLC gel filtration method. Departure
Akira's purified HSA has a molecular weight of about 67,000,
It was about the same as the conventional HSA. (2) Isoelectric point For the isoelectric point, a thin layer polyacrylamide gel is used.
Method [J. Chromatog., 146, 1 (1978)]
did. The isoelectric point of the purified HSA of the present invention is about 4.6,
It was comparable to plasma-derived HSA. (3) Coloring degree The coloring degree is absorption at 280 nm, 350 nm and 450 nm.
Measure the degree, A₃₅₀/ A₂₈₀, A₄₅₀/ A₂₈₀Is calculated
Was. The degree of coloring of the purified HSA of the present invention is A₃₅₀/ A ₂₈₀Is about
0.02, A₄₅₀/ A₂₈₀Is about 0.01,
It was about the same as the conventional HSA.

【００５０】実施例３ 参考例２で得た培養液を実施例１と同様に処理した。精
製されたＨＳＡの性状は実施例２で開示した分子量・等
電点および着色度、実施例１で開示した多糖体含量、ゲ
ル濾過パターンおよび酵母由来成分量と同程度であっ
た。Example 3 The culture solution obtained in Reference Example 2 was treated in the same manner as in Example 1. The properties of the purified HSA were similar to the molecular weight, isoelectric point and coloring degree disclosed in Example 2, the polysaccharide content, gel filtration pattern and yeast-derived component amount disclosed in Example 1.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】疎水性クロマト精製工程後のＨＰＬＣ分析結果
を示す。FIG. 1 shows the HPLC analysis results after the hydrophobic chromatography purification step.

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 古畑 直人 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 竹島 一哉 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 上出 佳永子 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 野田 宗宏 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 近藤 雅英 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 石川 昭一 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 大原 和宏 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 横山 和正 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Office reference number FI technical display location C12P 21/02 C12P 21/02 A // (C12P 21/02 C12R 1:84) (72) Inventor Naoto Furuhata 2-25-1 Otani Otani, Hirakata-shi, Osaka, Ltd. Midori Cross Central Research Institute Co., Ltd. (72) Inventor Kazuya Takeshima 2-25-1 Otani, Otani, Hirakata City, Hirakata, Osaka (72) Inventor Kanaeko Umeda 2-25-1 Odaitani, Hirakata-shi, Osaka Prefecture Midori Cross Central Research Institute Co., Ltd. (72) Inventor Munehiro Noda 2-25-1 Otani, Hirakata-shi, Osaka Prefecture Midori Cross Central Co., Ltd. Inside the laboratory (72) Inventor Masahide Kondo 2-25-1 Otani, Hidakata, Hirakata-shi, Osaka Stock Company Midori Cross Central Laboratory (72) Inventor Shoichi Ishikawa 2-25-1, Otani, Hirakata-shi, Osaka Company Midori Cross Central Research Institute (72) Inventor Kazuhiro Ohara Invited by Hirakata City, Osaka Prefecture Valley 2-chome 25th No. 1 Co., Ltd. Green Cross center in the Institute (72) inventor Kazumasa Yokoyama Hirakata, Osaka Shodaiotani 2-chome 25th No. 1 Co., Ltd. Green Cross center in the Institute

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 遺伝子操作により得られる分子量６万７
千のヒト血清アルブミンを含有し、且つ以下の特徴を有
するヒト血清アルブミン含有組成物； （１）ヒト血清アルブミンの二量体、重合体または分解
物を実質的に含まない （２）産生宿主に由来する夾雑成分あるいは多糖類を実
質的に含まない。1. A molecular weight of 60,7 obtained by genetic engineering.
Human serum albumin-containing composition containing 1,000 human serum albumin and having the following characteristics: (1) Substantially free of human serum albumin dimer, polymer or degradation product (2) In production host It is substantially free of derived contaminants or polysaccharides. 【請求項２】 さらに、該ヒト血清アルブミン含有組成
物の溶液が、（ｉ）Ａ₃₅₀ ／Ａ₂₈₀ が０．０１以上０．
０２未満、（ii）Ａ₄₅₀ ／Ａ₂₈₀ が０．００１以上０．
０１未満の着色度を有することを特徴とする請求項１記
載のヒト血清アルブミン含有組成物。2. The solution of the human serum albumin-containing composition has (i) A ₃₅₀ / A ₂₈₀ of 0.01 or more and 0.1.
Less than 02, (ii) A ₄₅₀ / A ₂₈₀ is 0.001 or more and 0.
The human serum albumin-containing composition according to claim 1, which has a coloring degree of less than 01. 【請求項３】 さらに、ヒト血清アルブミン以外のヒト
由来成分を含まないことを特徴とする請求項１または２
記載のヒト血清アルブミン含有組成物。3. A human-derived component other than human serum albumin is not contained.
The human serum albumin-containing composition as described. 【請求項４】 産生宿主に由来する夾雑成分あるいは多
糖類が抗原性物質である請求項１〜３のいずれかに記載
のヒト血清アルブミン含有組成物。4. The human serum albumin-containing composition according to claim 1, wherein the contaminant component or polysaccharide derived from the production host is an antigenic substance. 【請求項５】 以下の〜の工程を含む精製方法によ
り得られうる請求項１〜４のいずれかに記載のヒト血清
アルブミン含有組成物； ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分
子量１０万〜５０万、及び１０００〜５万の限外濾過膜
を用いて処理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８〜１０、塩濃度
０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する、そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。5. The human serum albumin-containing composition according to any one of claims 1 to 4, which can be obtained by a purification method including the following steps: a culture supernatant of a human serum albumin producing host is fractionated into a molecular weight. Treat with 100,000-500,000 and 1000-50,000 ultrafiltration membranes. Heat treatment is performed at 50 to 70 ° C. for 30 minutes to 5 hours. Acid treatment at pH 3-5. Treatment is carried out using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of 100,000 to 500,000. After contacting with a cation exchanger under conditions of pH 3 to 5 and salt concentration of 0.01 to 0.2M, elution is performed under conditions of pH 8 to 10 and salt concentration of 0.2 to 0.5M. The non-adsorbed fraction is recovered by contacting the carrier for hydrophobic chromatography under the conditions of pH 6 to 8 and salt concentration of 0.01 to 0.5M, and pH 6 to 8 and salt concentration of 0.01 to 0.1M. The non-adsorbed fraction is collected by contacting the anion exchanger under the conditions. 【請求項６】 請求項５の工程の代わりにｐＨ６〜
８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に
接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５
Ｍの条件下で溶出する工程を含む精製方法により得られ
うる請求項１〜３のいずれかに記載のヒト血清アルブミ
ン含有組成物。6. A pH of 6 to 6 instead of the step of claim 5.
8. After contacting the carrier for hydrophobic chromatography under the condition of salt concentration of 1 to 3 M, pH 6 to 8 and salt concentration of 0.01 to 0.5
The human serum albumin-containing composition according to claim 1, which can be obtained by a purification method including a step of eluting under the condition of M. 【請求項７】 請求項５の工程の代わりにｐＨ６〜
８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件下で陰イオン
交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５
〜１Ｍの条件下で溶出する工程を含む精製方法により得
られうる請求項１〜３のいずれかに記載のヒト血清アル
ブミン含有組成物。7. A pH of 6 to 6 instead of the step of claim 5.
8. After contacting with an anion exchanger under the condition of salt concentration 0.001-0.05M, pH 6-8, salt concentration 0.05
The human serum albumin-containing composition according to any one of claims 1 to 3, which can be obtained by a purification method including a step of eluting under a condition of ~ 1M. 【請求項８】 請求項５の工程との間、との
間、またはの後で、ｐＨ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍ
の条件下で塩析処理し、沈澱画分を回収する工程をさら
に含む精製方法により得られうる請求項１〜３のいずれ
かに記載のヒト血清アルブミン含有組成物。8. A pH of 3 to 5 and a salt concentration of 0.5 to 3 M during, after, or after the step of claim 5.
The human serum albumin-containing composition according to any one of claims 1 to 3, which can be obtained by a purification method further comprising a step of performing a salting-out treatment under the conditions of 1) and collecting a precipitate fraction.