JPH09173070A - Plasmid, microorganism containing plasmid transduced thereinto, their production and use thereof - Google Patents
Plasmid, microorganism containing plasmid transduced thereinto, their production and use thereofInfo
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- JPH09173070A JPH09173070A JP7336707A JP33670795A JPH09173070A JP H09173070 A JPH09173070 A JP H09173070A JP 7336707 A JP7336707 A JP 7336707A JP 33670795 A JP33670795 A JP 33670795A JP H09173070 A JPH09173070 A JP H09173070A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、選択マーカー遺伝
子を有しないプラスミド、該プラスミドを導入した微生
物、それらの製造方法、該プラスミド導入微生物を用い
た有用物質の生産法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a plasmid having no selectable marker gene, a microorganism into which the plasmid has been introduced, a method for producing them, and a method for producing a useful substance using the plasmid-introduced microorganism.
【0002】[0002]
【従来の技術】近年、さまざまな微生物において宿主−
ベクター系が開発され、遺伝子操作技術を取り入れるこ
とにより有用物質の大量生産が可能となってきた。例え
ば、枯草菌と枯草菌用プラスミドベクターの系において
は、タンパク質分泌用に構築されたプラスミドベクター
にインターフェロン―α2遺伝子を挿入した組換えプラ
スミドを枯草菌に導入し、同菌を培養することにより、
インターフェロン―αの分泌発現を可能にしている(P
alva,I.et al.,Gene,22,229
(1983))。今日確立している遺伝子操作技術で
は、ベクターとして使用するプラスミドが有する選択マ
ーカー遺伝子の活性発現により同プラスミドが導入され
た微生物を容易に選択することが可能である。代表的な
例としては、プラスミドに天然でコードされる、または
人工的に組み込まれた薬剤耐性遺伝子が発現することに
より、薬剤を含む選択培地でプラスミド非導入微生物は
生育できないが、目的とするプラスミド導入微生物のみ
が生育可能な条件を設定することができる。このように
培地に選択圧をかけることによりプラスミドを所持しな
い微生物の増殖を防ぎ、プラスミド上の遺伝子の発現産
物、または同発現産物が関与することによって生成する
物質の大量生産をより安定化することができる。2. Description of the Related Art Recently, various microorganisms have been used as hosts.
The development of vector systems has made it possible to mass-produce useful substances by incorporating genetic engineering techniques. For example, in the system of Bacillus subtilis and a plasmid vector for Bacillus subtilis, a recombinant plasmid in which the interferon-α2 gene is inserted into a plasmid vector constructed for protein secretion is introduced into Bacillus subtilis, and by culturing the same,
It enables secretory expression of interferon-α (P
alva, I.D. et al. , Gene, 22, 229
(1983)). With the gene manipulation technology established today, it is possible to easily select the microorganism into which the plasmid used as a vector has been introduced by the active expression of the selectable marker gene. As a typical example, the expression of a drug resistance gene naturally encoded in a plasmid or artificially integrated prevents expression of a plasmid-introduced microorganism in a selective medium containing a drug, but Conditions under which only the introduced microorganism can grow can be set. In this way, by applying selective pressure to the medium, it is possible to prevent the growth of microorganisms that do not have a plasmid, and to stabilize the expression product of the gene on the plasmid or the mass production of the substance produced by the involvement of the expression product. You can
【0003】しかしながら、プラスミドが培地の選択圧
に依存することなく宿主細胞内に安定に保持される場
合、培地に必ずしも選択圧をかける必要はない。この場
合、プラスミド上の選択マーカー遺伝子の活性発現は必
須条件ではなくなり、同遺伝子の発現のために宿主細胞
は余計なエネルギーを消費していることになる。また、
同遺伝子はプラスミドのサイズを意味なく大きくしてい
るに過ぎず、これもまた宿主細胞のエネルギー的負担を
増大させ、プラスミド導入微生物の生育やプラスミド導
入微生物の培養により大量に得ようとする有用物質の生
産性に不利に働くと考えることができる。また、選択マ
ーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合、同遺伝子が
不活性化したプラスミドまたは同遺伝子が存在しないプ
ラスミドを導入した微生物を用いることは生産される有
用物質が、食品、医薬品等の分野に供される場合に、よ
り好ましい態様となる。However, when the plasmid is stably retained in the host cells without depending on the selective pressure of the medium, it is not always necessary to apply selective pressure to the medium. In this case, the active expression of the selectable marker gene on the plasmid is not an essential condition, and the host cell consumes extra energy for the expression of the gene. Also,
The gene only increases the size of the plasmid without meaning, which also increases the energy burden of the host cell, and is a useful substance to be obtained in large quantities by growing the plasmid-introducing microorganism or culturing the plasmid-introducing microorganism. Can be thought to work against the productivity of. Further, when the selectable marker gene is a drug resistance gene, using a plasmid in which the gene is inactivated or a plasmid in which the gene is not present makes it possible to produce useful substances in fields such as food and pharmaceuticals. When provided, it is a more preferable embodiment.
【0004】[0004]
【本発明が解決しようとする課題】上述したように、ベ
クターとして使用するプラスミドにおいて、プラスミド
の複製に関与しないDNA領域を不活性化または削除し
たプラスミドを用いることは大いに意義深い。しかし、
一方で選択マーカー遺伝子が活性発現しないプラスミド
が導入された微生物を取得することは非常に困難にな
る。なぜなら、プラスミドが導入されていない微生物と
導入された微生物を培地上で生育を指標として分離する
ことができないからである。特にプラスミド導入効率の
低い宿主細胞においてこの問題は深刻である。さらに、
プラスミドベクターと挿入DNA断片によるライゲーシ
ョン直後の反応生成物で通常のプラスミド導入操作を行
なう場合は、目的とするプラスミドの導入効率はライゲ
ーション効率を乗じた分だけさらに低下する。このため
目的とするプラスミドが選択マーカー遺伝子を活性発現
しない場合、同プラスミドが導入された微生物を培地上
で選択することは多大な労力を要する。As described above, in the plasmid used as a vector, it is very significant to use a plasmid in which a DNA region not involved in the replication of the plasmid is inactivated or deleted. But,
On the other hand, it becomes very difficult to obtain a microorganism into which a plasmid in which the selectable marker gene is not actively expressed is introduced. This is because it is not possible to separate the microorganisms into which the plasmid has not been introduced and the introduced microorganisms on the medium by using the growth as an index. In particular, this problem is serious in host cells with low plasmid transfer efficiency. further,
When the usual plasmid introduction operation is performed on the reaction product immediately after ligation with the plasmid vector and the inserted DNA fragment, the introduction efficiency of the desired plasmid is further reduced by the amount obtained by multiplying the ligation efficiency. Therefore, when the target plasmid does not actively express the selectable marker gene, it takes a lot of labor to select the microorganism into which the plasmid has been introduced on the medium.
【0005】有用物質の大量生産において微生物を用い
ることは有力な手段であり、微生物に選択マーカー遺伝
子を有しないプラスミドを効率良く導入できるシステム
があれば微生物応用産業の発展に大きく寄与することに
なる。しかしながら今日までにそのようなプラスミド導
入微生物を効率的に取得する方法は知られていない。そ
のため、そのようなプラスミド導入微生物やプラスミド
自体も知られていない。従って本発明は、選択マーカー
遺伝子を有しない微生物用プラスミド及び該プラスミド
を導入した微生物を提供することを目的とする。また、
該プラスミド導入微生物を用いた有用物質の効率良い生
産法を提供することを目的とする。The use of microorganisms in mass production of useful substances is a powerful means, and a system capable of efficiently introducing a plasmid having no selectable marker gene into microorganisms will greatly contribute to the development of the microorganism application industry. . However, to date, there is no known method for efficiently obtaining such a plasmid-introduced microorganism. Therefore, such a plasmid-introduced microorganism and the plasmid itself are not known. Therefore, it is an object of the present invention to provide a plasmid for a microorganism that does not have a selection marker gene and a microorganism into which the plasmid has been introduced. Also,
It is an object of the present invention to provide an efficient production method of a useful substance using the plasmid-introduced microorganism.
【0006】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ベクター
として使用するプラスミド上の選択マーカー遺伝子を不
活性化または削除し、かつDNA断片を挿入した組換え
プラスミドの作製を試み、同組換えプラスミドを選択マ
ーカー遺伝子を有するプラスミドとともに宿主細胞内に
導入した2種プラスミド導入微生物を選抜後、後者プラ
スミドのみを同2種プラスミド導入微生物から脱落さ
せ、前者組換えプラスミドのみを含む微生物を効率的に
取得する方法を開発するに至った。前者組換えプラスミ
ドのみを含む微生物の培養を行なった結果、選択マーカ
ー遺伝子を不活性化または削除しない組換えプラスミド
を用いた場合に比べて、挿入DNA断片に由来する目的
物質の生産性が向上することを確認した。すなわち、本
発明は以下のものを提供するものである。The present inventors have attempted to prepare a recombinant plasmid in which a selectable marker gene on a plasmid used as a vector has been inactivated or deleted and a DNA fragment has been inserted. After selecting two types of plasmid-introduced microorganisms in which the plasmid was introduced into a host cell together with a plasmid having a selectable marker gene, only the latter plasmid was eliminated from the two types of plasmid-introduced microorganisms, and the microorganism containing only the former recombinant plasmid was efficiently prepared. Came to develop a way to get. As a result of culturing a microorganism containing only the former recombinant plasmid, the productivity of the target substance derived from the inserted DNA fragment is improved as compared with the case of using a recombinant plasmid that does not inactivate or delete the selectable marker gene. It was confirmed. That is, the present invention provides the following.
【0007】[1]少なくとも1種類の微生物の中で複
製可能なプラスミドであって、該微生物中で発現する選
択マーカー遺伝子を有しないことを特徴とするプラスミ
ド。 [2]微生物が細菌または酵母である前記[1]記載の
プラスミド。 [3]微生物がバチルス(Bacillus)属細菌、エスシェ
リシア(Escherichia)属細菌、シュードモナス(Pseud
omonas )属細菌、またはサッカロミセス(Saccharomyc
es )属酵母である前記[1]記載のプラスミド。[1] A plasmid which is replicable in at least one kind of microorganism and has no selectable marker gene expressed in the microorganism. [2] The plasmid according to [1] above, wherein the microorganism is bacteria or yeast. [3] Microorganisms include Bacillus , Escherichia , and Pseud
omonas ) or Saccharomyces ( Saccharomyc
es ) The plasmid according to [1] above, which is a genus yeast.
【0008】[4]プラスミドの複製可能な微生物のう
ちの少なくとも1種の微生物中で発現可能な遺伝子を有
する前記[1]〜[3]のいずれかに記載のプラスミ
ド。 [5]遺伝子がタンパク質遺伝子である前記[4]記載
のプラスミド。 [6]遺伝子が酵素遺伝子である前記[4]記載のプラ
スミド。 [7]遺伝子が加水分解酵素遺伝子である前記[4]記
載のプラスミド。 [8]遺伝子がプロテアーゼ遺伝子またはリパーゼ遺伝
子である前記[4]記載のプラスミド。 [9]遺伝子がバチルス(Bacillus)属細菌、エスシェ
リシア(Escherichia)属細菌またはシュードモナス(P
seudomonas )属細菌由来である前記[4]〜[8]の
いずれか記載のプラスミド。[4] The plasmid according to any one of the above [1] to [3], which has a gene that can be expressed in at least one kind of microorganism capable of replicating the plasmid. [5] The plasmid according to [4] above, wherein the gene is a protein gene. [6] The plasmid according to [4] above, wherein the gene is an enzyme gene. [7] The plasmid according to [4] above, wherein the gene is a hydrolase gene. [8] The plasmid according to the above [4], wherein the gene is a protease gene or a lipase gene. [9] Gene Bacillus (Bacillus) bacteria, Esusherishia (Escherichia) bacteria or Pseudomonas (P
The plasmid according to any one of [4] to [8] above, which is derived from a bacterium belonging to the genus seudomonas .
【0009】[10]前記[1]〜[9]のいずれかに
記載のプラスミドを有する微生物であって、該プラスミ
ドが該微生物中で発現する選択マーカー遺伝子を有しな
いことを特徴とするプラスミド導入微生物。 [11]2種類以上のプラスミドを有する微生物であっ
て、少なくとも1種のプラスミドは該微生物中で発現す
る選択マーカー遺伝子を有しない前記[1]〜[9]の
いずれかに記載のプラスミドであり、他の少なくとも1
種のプラスミドは該微生物中で発現する選択マーカー遺
伝子を有することを特徴とするプラスミド導入微生物。 [12]2種類以上のプラスミドを有する微生物であっ
て、少なくとも1種のプラスミドは該微生物中で発現す
る選択マーカー遺伝子を有しない前記[1]〜[9]の
いずれかに記載のプラスミドであり、他の少なくとも1
種のプラスミドは該微生物中で発現する選択マーカー遺
伝子及び該微生物中で複製するための温度感受性複製起
点を有することを特徴とするプラスミド導入微生物。[10] A microorganism having the plasmid according to any one of [1] to [9], wherein the plasmid does not have a selectable marker gene expressed in the microorganism. Microorganisms. [11] A microorganism having two or more kinds of plasmids, wherein at least one kind of plasmid is the plasmid according to any one of the above [1] to [9], which does not have a selectable marker gene expressed in the microorganism. , The other at least 1
A plasmid-introduced microorganism, wherein the seed plasmid has a selectable marker gene expressed in the microorganism. [12] A microorganism having two or more types of plasmids, wherein at least one type of plasmid is the plasmid according to any one of the above [1] to [9], which does not have a selectable marker gene expressed in the microorganism. , The other at least 1
A plasmid-introduced microorganism, wherein the seed plasmid has a selectable marker gene expressed in the microorganism and a temperature-sensitive origin of replication for replication in the microorganism.
【0010】[13]微生物が細菌である前記[10]
〜[12]のいずれかに記載のプラスミド導入微生物。 [14]微生物が酵母である前記[10]〜[12]の
いずれかに記載のプラスミド導入微生物。 [15]微生物がバチルス(Bacillus)属細菌である前
記[10]〜[12]のいずれかに記載のプラスミド導
入微生物。 [16]微生物がシュードモナス(Pseudomonas )属細
菌である前記[10]〜[12]のいずれかに記載のプ
ラスミド導入微生物。 [17]微生物がエスシェリシア(Escherichia )属細
菌である前記[10]〜[12]のいずれかに記載のプ
ラスミド導入微生物。 [18]微生物がサッカロミセス(Saccharomyces )属
酵母である前記[10]〜[12]のいずれかに記載の
プラスミド導入微生物。[13] The above-mentioned [10], wherein the microorganism is a bacterium.
~ The plasmid-introduced microorganism according to any one of [12]. [14] The plasmid-introduced microorganism according to any of [10] to [12], wherein the microorganism is yeast. [15] The plasmid-introduced microorganism according to any of [10] to [12], wherein the microorganism is a bacterium belonging to the genus Bacillus . [16] The plasmid-introduced microorganism according to any one of [10] to [12] above, wherein the microorganism is a bacterium of the genus Pseudomonas . [17] The plasmid-introduced microorganism according to any of [10] to [12] above, wherein the microorganism is a bacterium belonging to the genus Escherichia . [18] The plasmid-introduced microorganism according to any one of [10] to [12] above, wherein the microorganism is a yeast of the genus Saccharomyces .
【0011】[19]選択マーカー遺伝子を有するプラ
スミドDNAを鋳型として選択マーカー遺伝子をコード
する部分のDNAの全部もしくは一部を除く形でPCR
法によりDNAを増幅する工程を含むことを特徴とす
る、選択マーカー遺伝子を除去したプラスミドの製造方
法。 [20]選択マーカー遺伝子を含まないプラスミド
(A)を有する微生物を得るための方法であって、以下
の構成から成る方法。 1)選択マーカー遺伝子を含まないプラスミド(A)及
び選択マーカー遺伝子を含むプラスミド(B)を同時に
微生物に導入する。 2)プラスミド(B)上の選択マーカー遺伝子を利用し
て少なくともプラスミド(B)を有する微生物を複数選
択する。 3)2)で得られた微生物群からプラスミド(A)を有
する微生物を選択する。 [21]以下の構成から成る、プラスミドとして選択マ
ーカー遺伝子を含まないプラスミド(A)のみを有する
微生物を得る方法。 1)選択マーカー遺伝子を含まないプラスミド(A)及
び選択マーカー遺伝子を含むプラスミド(B)を同時に
微生物に導入する。 2)プラスミド(B)上の選択マーカー遺伝子を利用し
て少なくともプラスミド(B)を有する微生物を複数選
択する。 3)2)で得られた微生物群からプラスミド(A)を有
する微生物を選択する。 4)3)で得られた微生物からプラスミド(B)を脱落
させる。 [22]微生物内で複製するためのプラスミド(B)の
複製起点が温度感受性であることを特徴とする前記[2
1]記載の微生物を得る方法。[19] PCR using a plasmid DNA having a selectable marker gene as a template and excluding all or part of the DNA encoding the selectable marker gene
A method for producing a plasmid from which a selection marker gene has been removed, which comprises a step of amplifying DNA by the method. [20] A method for obtaining a microorganism having a plasmid (A) that does not contain a selectable marker gene, the method having the following constitution. 1) A plasmid (A) containing no selection marker gene and a plasmid (B) containing a selection marker gene are simultaneously introduced into a microorganism. 2) A plurality of microorganisms having at least the plasmid (B) are selected using the selectable marker gene on the plasmid (B). 3) Select a microorganism having the plasmid (A) from the group of microorganisms obtained in 2). [21] A method for obtaining a microorganism having only the plasmid (A) containing no selectable marker gene as a plasmid, which has the following constitution. 1) A plasmid (A) containing no selection marker gene and a plasmid (B) containing a selection marker gene are simultaneously introduced into a microorganism. 2) A plurality of microorganisms having at least the plasmid (B) are selected using the selectable marker gene on the plasmid (B). 3) Select a microorganism having the plasmid (A) from the group of microorganisms obtained in 2). 4) The plasmid (B) is eliminated from the microorganism obtained in 3). [22] The origin of replication of the plasmid (B) for replication in a microorganism is temperature sensitive, [2]
1] A method for obtaining the microorganism as described above.
【0012】[23]プラスミド導入微生物を培養して
培養物より微生物生産物質を回収することによる微生物
生産物質の製造方法であって、該微生物が有するプラス
ミドが該微生物内で発現する選択マーカー遺伝子を含ま
ず、該微生物生産物質の生産に関与する遺伝子を含むこ
とを特徴とする微生物生産物質の製造方法。 [24]プラスミド導入微生物を培養して培養物よりタ
ンパク質を回収することによるタンパク質の製造方法で
あって、該微生物が有するプラスミドが該微生物内で発
現する選択マーカー遺伝子を含まず、該タンパク質をコ
ードする遺伝子または該タンパク質の発現を調節する遺
伝子を含むことを特徴とするタンパク質の製造方法。 [25]前記[10]〜[18]のいずれかに記載のプ
ラスミド導入微生物を培養し、培養物より選択マーカー
遺伝子を有しないプラスミドを回収することを特徴とす
るプラスミドの製造方法。[23] A method for producing a microorganism-produced substance by culturing a plasmid-introduced microorganism and recovering the microorganism-produced substance from the culture, wherein the plasmid possessed by the microorganism comprises a selectable marker gene expressed in the microorganism. A method for producing a microbial product, which does not contain a gene involved in the production of the microbial product. [24] A method for producing a protein by culturing a plasmid-introduced microorganism and recovering the protein from the culture, wherein the plasmid contained in the microorganism does not contain a selectable marker gene expressed in the microorganism, and encodes the protein. A method for producing a protein, comprising a gene that controls the expression of the protein or a gene that regulates the expression of the protein. [25] A method for producing a plasmid, which comprises culturing the plasmid-introduced microorganism according to any of [10] to [18] and recovering a plasmid having no selectable marker gene from the culture.
【0013】以下に本発明を詳細に説明する。本発明の
選択マーカー遺伝子を含まないプラスミド(以下プラス
ミド(A)という)を有する微生物を得るための方法は
以下の構成から成る。 1)プラスミド(A)及び選択マーカー遺伝子を含むプ
ラスミド(以下プラスミド(B)という)を同時に微生
物に導入する。 2)プラスミド(B)上の選択マーカー遺伝子を利用し
て少なくともプラスミド(B)を有する微生物を複数選
択する。 3)2)で得られた微生物群からプラスミド(A)を有
する微生物を選択する。 4)必要に応じてプラスミド(B)を脱落させる。Hereinafter, the present invention will be described in detail. The method for obtaining a microorganism having a plasmid (hereinafter referred to as plasmid (A)) containing no selectable marker gene of the present invention has the following constitution. 1) A plasmid (A) and a plasmid containing a selectable marker gene (hereinafter referred to as plasmid (B)) are simultaneously introduced into a microorganism. 2) A plurality of microorganisms having at least the plasmid (B) are selected using the selectable marker gene on the plasmid (B). 3) Select a microorganism having the plasmid (A) from the group of microorganisms obtained in 2). 4) Drop off the plasmid (B) if necessary.
【0014】なお、本発明において、選択マーカー遺伝
子とは、非プラスミド導入微生物は生育できない特定の
培地において同遺伝子が発現することによりプラスミド
導入微生物のみの生育を可能にする遺伝子を意味する。
例えば、選択マーカー遺伝子としては、宿主細胞の生育
を阻害する物質に対する耐性を宿主細胞に付与する表現
型、あるいは宿主細胞の栄養要求性を補う表現型を示す
遺伝子などが挙げられる。宿主細胞の生育を阻害する物
質としてはアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイ
シンなどの抗生物質などがあてはまる。したがって、宿
主細胞に対して薬剤耐性の付与及び栄養要求性の補完を
しないプロテアーゼ遺伝子、リパーゼ遺伝子、アミラー
ゼ遺伝子等がプラスミド(A)にコードされている場合
は、それらの発現産物である分泌性酵素が寒天培地上で
コロニーの周りの基質を分解して生じるクリアゾーンを
利用してプラスミド(A)を有する微生物の選択ができ
るが、本発明における選択マーカー遺伝子には該当しな
い。In the present invention, the selectable marker gene means a gene that allows only the plasmid-introduced microorganism to grow by expressing the gene in a specific medium in which the non-plasmid-introduced microorganism cannot grow.
For example, the selectable marker gene includes a phenotype that imparts resistance to the host cell to a substance that inhibits the growth of the host cell, or a gene that exhibits a phenotype that complements the auxotrophy of the host cell. Antibiotics such as ampicillin, tetracycline, and kanamycin are applicable as substances that inhibit the growth of host cells. Therefore, when a plasmid (A) encodes a protease gene, a lipase gene, an amylase gene or the like that does not impart drug resistance to the host cell and complements auxotrophy, the secretory enzyme that is the expression product of them. The microorganism having the plasmid (A) can be selected by utilizing the clear zone formed by degrading the substrate around the colony on the agar medium, but it does not correspond to the selection marker gene in the present invention.
【0015】[プラスミド(A)]本発明のプラスミド
(A)は、少なくとも1種類の微生物の中で複製可能で
あり、該微生物中で発現する選択マーカー遺伝子を有し
ないことを特徴とする。このようなプラスミドにおいて
該微生物中で発現可能な遺伝子(選択マーカー遺伝子を
除く)を有するもの(以下プラスミド(A1)という)
は、それを導入した微生物を培養することにより、その
遺伝子の発現産物または発現産物が関与して生成する物
質を効率よく得るために使用することができる。また、
そのような遺伝子を有しないプラスミド(以下プラスミ
ド(A2)という)は、プラスミド(A1)を作製する
ための材料として用いることができる。発現する選択マ
ーカー遺伝子を有しない状況として考えられるのは、選
択マーカー遺伝子をコードするDNAを完全な形では含
まない場合と、選択マーカー遺伝子をコードするDNA
を完全な形で含むが該微生物中では発現しない場合があ
る。[Plasmid (A)] The plasmid (A) of the present invention is characterized by being replicable in at least one kind of microorganism and having no selectable marker gene expressed in the microorganism. Such a plasmid having a gene (excluding a selection marker gene) that can be expressed in the microorganism (hereinafter referred to as plasmid (A1))
Can be used for efficiently obtaining an expression product of the gene or a substance produced by the expression product by culturing the microorganism into which the gene has been introduced. Also,
A plasmid having no such gene (hereinafter referred to as plasmid (A2)) can be used as a material for preparing plasmid (A1). Possible situations in which the selectable marker gene is not expressed include the case where the DNA encoding the selectable marker gene is not completely contained and the case where the selectable marker gene is encoded.
May be completely expressed but may not be expressed in the microorganism.
【0016】本発明のプラスミド(A)を製造するため
の方法の1つとして既存のプラスミドの改良があるが、
改良する元のプラスミド(以下プラスミド(O)とい
う)としては、自然界から分離したプラスミド、それを
人工的に改変したもの、人工的に作製したもの等のいず
れでも構わず、宿主細胞内において染色体DNAと独立
して自律複製するプラスミドであればどのようなもので
も用いることができる。また、2種類以上のプラスミド
が連結した形のプラスミドも用いることができる。ただ
し、ここで対象とするプラスミド(O)は、プラスミド
の複製に関与しないDNA領域を含む。このようなDN
A領域としては、選択マーカー遺伝子等のコード領域や
遺伝子間のスペーサー領域などがあてはまる。プラスミ
ド(O)上の選択マーカー遺伝子を不活性化または削除
することにより本発明のプラスミド(A)を得ることが
できるが、それ以外の遺伝子で宿主細胞の生育やプラス
ミドの複製に特に必要とされないものを不活性化または
削除することやスペーサー領域を可能な限り削除するこ
とも宿主細胞のエネルギー的負担を軽減し得るため有益
である。これらのDNA領域を不活性化または削除する
方法を以下に示す。One of the methods for producing the plasmid (A) of the present invention is improvement of existing plasmids.
The original plasmid to be improved (hereinafter referred to as plasmid (O)) may be a plasmid isolated from the natural world, an artificially modified one thereof, or an artificially prepared one. Any plasmid can be used as long as it is a plasmid that autonomously replicates independently of. Also, a plasmid in which two or more kinds of plasmids are linked can be used. However, the plasmid (O) of interest here includes a DNA region that is not involved in plasmid replication. DN like this
As the A region, a coding region such as a selectable marker gene and a spacer region between genes are applicable. The plasmid (A) of the present invention can be obtained by inactivating or deleting the selectable marker gene on the plasmid (O), but other genes are not particularly required for the growth of host cells and replication of the plasmid. It is also beneficial to inactivate or delete the substance or delete the spacer region as much as possible because the energy burden of the host cell can be reduced. The method for inactivating or deleting these DNA regions is shown below.
【0017】プラスミド(O)において、プラスミドの
複製に関与しない遺伝子を不活性化する方法としては、
プロモーターやSD配列の不活性化による遺伝子の非発
現化、構造遺伝子内での変異(塩基の置換、挿入、欠
失)による遺伝子産物の不活性化等あげられ、これらは
一般的な遺伝子操作技術を用いることにより容易に達成
できる。In the plasmid (O), a method of inactivating a gene that is not involved in plasmid replication is as follows:
Gene non-expression due to inactivation of promoter and SD sequence, inactivation of gene product due to mutation (base substitution, insertion, deletion) in the structural gene, and the like. These are general gene manipulation techniques. Can be easily achieved by using.
【0018】プラスミド(O)において、プラスミドの
複製に関与しないDNA領域を削除する方法としては、
制限酵素処理によりDNA領域を除去すること、あるい
はPCR(ポリメラーゼ・チェイン・リアクション)法
(Saiki,R.K.etal.,Science,
239,487(1988))を利用し、DNA領域以
外の領域を増幅することなどが挙げられるが、必ずしも
これらの方法に限らない。ただし、削除するDNA領域
には、プラスミドの複製系や宿主細胞内での安定性に関
与する因子が存在しないことを確認しておくことが望ま
しい。PCR法を使用するDNA領域の除去方法の一例
としては以下の通りである。図1aのように、プラスミ
ド上で除去したいDNA領域のすぐ外側の部分に対応す
る2つのプライマー(各々外向き)を作製し、該プラス
ミドDNAを鋳型としてPCRを行う。これにより除去
したいDNA領域以外の部分の直鎖DNAが得られる。
これをそのまま環状化すれば元のプラスミドと比べて除
去したい部分のみが除かれたプラスミドDNAが得られ
るが、更に他のDNA断片を挿入する場合には、そのD
NA断片と結合させることによって環状化したり、ある
いは一旦他のプラスミドDNAと結合してシャトルベク
ターにした後に目的とするDNA断片を挿入することも
可能である。In the plasmid (O), a method for deleting a DNA region that is not involved in plasmid replication is as follows:
Removal of the DNA region by restriction enzyme treatment, or PCR (polymerase chain reaction) method (Saiki, RK et al., Science,
239, 487 (1988)) and amplifying a region other than the DNA region, but not limited to these methods. However, it is desirable to confirm that the DNA region to be deleted does not have a factor involved in stability of the plasmid replication system or in the host cell. An example of the method for removing the DNA region using the PCR method is as follows. As shown in FIG. 1a, two primers (each facing outward) corresponding to a portion immediately outside the DNA region to be removed on the plasmid are prepared, and PCR is performed using the plasmid DNA as a template. As a result, linear DNA in a portion other than the DNA region to be removed can be obtained.
If this is circularized as it is, a plasmid DNA in which only the portion to be removed is removed as compared with the original plasmid can be obtained. However, when another DNA fragment is inserted, the D
It is also possible to circularize the DNA fragment by ligating it with the NA fragment, or once ligating it with another plasmid DNA to form a shuttle vector, and then inserting the target DNA fragment.
【0019】以上の操作によりプラスミド(A2)が取
得できるわけであるが、プラスミド(A1)を作製する
ためには更にDNA断片を組み込む必要がある。なお、
プラスミド(A1)を作製する別の方法として、DNA
断片を挿入した後にプラスミドの複製に関与しないDN
A領域を不活性化または削除する方法があげられる。ど
ちらの方法においてもDNA断片はプラスミド上に複数
組み込むことができる。挿入するDNA断片としては遺
伝子を含むことが望ましい。この遺伝子は、構造遺伝子
以外にプロモーター、SD配列、ターミネーター、その
他発現調節領域などを伴い、発現、場合によっては分泌
まで不備なく進行するように構成されていることが望ま
しい。さらに同遺伝子はある表現型を有し、プラスミド
導入微生物の検出を容易にすることが好ましく、特に宿
主細胞外に分泌生産される有用な酵素の遺伝子を有する
ことが望ましいが、これに限るものではない。Although the plasmid (A2) can be obtained by the above operation, it is necessary to further incorporate a DNA fragment in order to prepare the plasmid (A1). In addition,
As another method for preparing the plasmid (A1), DNA
DN not involved in plasmid replication after insertion of fragment
There is a method of inactivating or deleting the A region. In either method, a plurality of DNA fragments can be incorporated on the plasmid. The DNA fragment to be inserted preferably contains a gene. In addition to the structural gene, this gene preferably has a promoter, an SD sequence, a terminator, other expression control regions, etc., and is preferably constructed so that expression and, in some cases, secretion can proceed without defect. Furthermore, it is preferable that this gene has a certain phenotype and facilitates detection of a plasmid-introduced microorganism, and in particular, it is desirable to have a gene for a useful enzyme secreted and produced outside the host cell. Absent.
【0020】例えば、プロテアーゼを分泌生産する表現
型であればスキムミルクなどを含む培地上でコロニーの
周辺に形成されるクリアゾーンの大きさによりプラスミ
ド導入微生物を容易に検出できる。リパーゼの分泌生産
を表現型にする場合においてもエマルジョン化したオリ
ーブ油などを含む培地を用いれば同様に検出が容易であ
る。アミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、カタラー
ゼなどの酵素分泌生産が表現型である場合でもそれぞれ
の酵素に対する適当な基質成分を培地中に混ぜ、コロニ
ー周辺に酵素反応による変化を確認することでプラスミ
ド導入微生物の検出が可能である。また、挿入したDN
A断片にコードされている遺伝子の発現産物が目的物質
の生成に関与する場合も、目的物質はその検出が容易な
性質を有することが望ましい。この発現産物の範疇に含
まれるものとしては、目的物質を生成させる酵素や目的
物質の活性発現を制御する物質などがある。なお、ここ
で容易に検出できるとは、あくまでも1株ずつDNAを
調製してプラスミドの有無を直接確認する方法に比べた
場合よりは簡単であるという意味であって、状況によっ
ては有効でない場合がある。例えば、プラスミド(A
1)のみを微生物に導入する場合には、プラスミド導入
微生物のみを生育させる方法がないため非常に多くのコ
ロニーの中から検出しなければならないので決して容易
ではない。この問題点を解決するための方法がすなわち
本発明の選択マーカー遺伝子を含まないプラスミド
(A)を有する微生物を得る方法なのである。For example, in the case of a phenotype of secretory production of protease, the plasmid-introduced microorganism can be easily detected by the size of the clear zone formed around the colony on the medium containing skim milk or the like. Similarly, when making secretory production of lipase phenotype, detection can be easily performed by using a medium containing emulsified olive oil and the like. Even if the secretory production of enzymes such as amylase, cellulase, xylanase, and catalase is phenotype, a suitable substrate component for each enzyme is mixed in the medium, and the change due to the enzyme reaction is confirmed around the colony to detect the plasmid-introduced microorganism. Is possible. Also, the inserted DN
Even when the expression product of the gene encoded by the A fragment is involved in the production of the target substance, it is desirable that the target substance has the property of being easily detected. Included in the category of this expression product are an enzyme that produces a target substance and a substance that controls the activity expression of the target substance. It should be noted that the term “easily detectable” here means that it is simpler than the method of directly confirming the presence or absence of a plasmid by preparing DNA one by one, and it may not be effective depending on the situation. is there. For example, the plasmid (A
In the case of introducing only 1) into a microorganism, there is no method for growing only the plasmid-introduced microorganism, and therefore it has to be detected from a very large number of colonies, which is by no means easy. A method for solving this problem is to obtain a microorganism having a plasmid (A) containing no selectable marker gene of the present invention.
【0021】その他プラスミド(A)の性質として、宿
主細胞の染色体DNAにインテグレーションされず、安
定して宿主細胞内に存在できることが望ましい。また、
プラスミド(A)をライゲーション操作を経て作製した
場合、これらのプラスミドを分離・取得するためには後
述するような方法によってプラスミド導入微生物を取得
する必要がある。In addition, it is desirable that the plasmid (A) is not integrated with the chromosomal DNA of the host cell and can stably exist in the host cell. Also,
When the plasmid (A) is produced through a ligation operation, it is necessary to obtain a plasmid-introduced microorganism by the method described below in order to separate and obtain these plasmids.
【0022】[宿主細胞]宿主細胞としては、プラスミ
ド(A)を導入することが可能な微生物であり、導入し
ようとするプラスミドが宿主細胞内で複製可能であれば
真核生物、原核生物などの生物種を問わずどのような微
生物でも対象とすることができる。また、宿主細胞とプ
ラスミド(A)の組み合わせとして、宿主細胞の***過
程においてプラスミド(A)が娘細胞に偏りなく分配さ
れ、プラスミド(A)の脱落が起きにくいことが望まし
い。[Host cell] The host cell is a microorganism into which the plasmid (A) can be introduced, and if the plasmid to be introduced is replicable in the host cell, it may be a eukaryote, a prokaryote or the like. Any microorganism can be used regardless of species. In addition, as a combination of the host cell and the plasmid (A), it is desirable that the plasmid (A) is uniformly distributed to the daughter cells in the division process of the host cell, and the plasmid (A) is unlikely to drop out.
【0023】宿主細胞として使用出来る微生物の具体例
としては、バチルス(Bacillus)属細菌、エスシェリシ
ア(Escherichia )属細菌もしくはシュードモナス(Ps
eudomonas )属細菌等の細菌やサッカロミセス(Saccha
romyces )属酵母等の酵母があげられ、好ましくはバチ
ルス・ズブチリス(Bacillus subtilis )、バチルス・
アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefacie
ns)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheni
formis)、バチルス・ファーマス(Bacillusfirmus)、
バチルス・レンタス(Bacillus lentus )、バチルス・
アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus )、大腸
菌、またはサッカロミセス・セルビジア(Saccharomyce
s cerevisiae)である。Specific examples of the microorganism that can be used as a host cell include Bacillus bacteria, Escherichia bacteria, and Pseudomonas ( Ps).
bacteria such as eudomonas ) and Saccharomyces ( Saccha
romyces ) and other yeasts, preferably Bacillus subtilis , Bacillus subtilis
Bacillus amyloliquefacie
ns ), Bacillus licheni
formis), Bacillus Famasu (Bacillusfirmus),
Bacillus lentus , Bacillus
Bacillus alkalophilus , E. coli, or Saccharomyce
s cerevisiae ).
【0024】[プラスミド(B)]プラスミド(B)と
して用いることができるプラスミドは、宿主細胞内で複
製可能であり、宿主細胞内で発現する選択マーカー遺伝
子を有しており、かつ宿主細胞内におけるプラスミド
(A)とプラスミド(B)の和合性があればよい。更に
本発明におけるプラスミド(B)のみの脱落という操作
の必要性からは、プラスミド(B)は温度感受性の複製
起点を有することが好ましい。[Plasmid (B)] The plasmid that can be used as the plasmid (B) is replicable in the host cell, has a selectable marker gene that is expressed in the host cell, and is in the host cell. It is sufficient that the plasmid (A) and the plasmid (B) are compatible. Further, from the necessity of the operation of dropping only the plasmid (B) in the present invention, it is preferable that the plasmid (B) has a temperature-sensitive replication origin.
【0025】[プラスミド導入微生物の取得] 1)本発明の選択マーカー遺伝子を含まないプラスミド
(A)を有する微生物を得るためには、まず、プラスミ
ド(A)とプラスミド(B)を同時に微生物に導入する
わけであるが、プラスミド(A)としてライゲーション
反応生成物を直接用いる場合は、ライゲーション反応生
成物はできる限り多量に用いることがプラスミド(A)
の宿主細胞内への導入頻度を高める結果につながる。宿
主細胞内へのプラスミド導入法としては、プラスミド導
入が達成できればどのような方法でも用いることがで
き、慣用の方法も使用可能である。例えば大腸菌にプラ
スミドを導入するには、コンピテントセル法(Hana
han,D.,J.Mol.Biol.,166,55
7(1983))、エレクトロポレーション法(Dow
er,W.J.et al.,Nucleic Aci
ds Res.,16,6127(1988))などで
実施可能である。バチルス属細菌にプラスミドを導入す
るには、プロトプラスト法(Chang,S.and
Cohen,S.N.,Molec.Gen.Gene
t.,168,111(1979))やエレクトロポレ
ーション法(Brigidi,P.et al.,FE
MS Microbiol.Lett.,67,135
(1990))などが使用可能である。またサッカロミ
セス属等の酵母にプラスミドを導入するには、スフェロ
プラスト法(Burgers,M.J.and Per
cival,K.J.,Anal.Biochem.,
163,391(1987))やエレクトロポレーショ
ン法(Becker,D.M.and Guarent
e,L.,Meth.Enzymol.,194,18
2(1990))等が使用可能である。[Acquisition of Plasmid-Introduced Microorganisms] 1) In order to obtain a microorganism having a plasmid (A) containing no selectable marker gene of the present invention, first, the plasmid (A) and the plasmid (B) are simultaneously introduced into the microorganism. However, when the ligation reaction product is directly used as the plasmid (A), the ligation reaction product should be used in a large amount as much as possible.
This results in the increased frequency of introduction into the host cell. As a method for introducing a plasmid into a host cell, any method can be used as long as plasmid introduction can be achieved, and a conventional method can also be used. For example, to introduce a plasmid into E. coli, the competent cell method (Hana
han, D.C. , J. et al. Mol. Biol. , 166,55
7 (1983)), electroporation method (Dow
er, W.C. J. et al. , Nucleic Aci
ds Res. , 16, 6127 (1988)) and the like. To introduce a plasmid into a Bacillus bacterium, the protoplast method (Chang, S. and
Cohen, S .; N. , Molec. Gen. Gene
t. , 168, 111 (1979)) and the electroporation method (Brigidi, P. et al., FE).
MS Microbiol. Lett. , 67,135
(1990)) and the like can be used. To introduce a plasmid into yeast such as Saccharomyces, the spheroplast method (Burgers, M. J. and Per) is used.
cival, K .; J. , Anal. Biochem. ,
163, 391 (1987)) and the electroporation method (Becker, DM and Guarent).
e, L. , Meth. Enzymol. , 194, 18
2 (1990)) and the like can be used.
【0026】2)次にプラスミド導入微生物を選択する
わけであるが、初めにプラスミド(B)上の選択マーカ
ー遺伝子を利用して少なくともプラスミド(B)が導入
された微生物を複数選択する。すなわち、選択マーカー
遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合は、当該薬剤を含む寒天
培地上で生育してくるものを選択すれば良い。また、選
択マーカー遺伝子が栄養要求性を補完するものである場
合は、当該栄養の欠如した寒天培地上で生育してくるも
のを選択すれば良い。このステップを経ることにより、
全くプラスミドが導入されていない微生物を除くことが
できる。形質転換能の低い微生物を宿主として用いた場
合には、大部分の微生物に形質転換能が無く、当然のこ
とながらそのような微生物にはプラスミド(A)は入ら
ないので、このステップによりそのような不必要な微生
物を取り除くことができ、検出効率を大幅にアップする
ことができるのである。なお、ここで複数の候補を選択
したのは、後のステップでこの中から更にプラスミド
(A)をも有する微生物を選択するためである。したが
って、ここで選択する候補の数はプラスミド(A)をも
有する微生物が含まれる数なら良いが、その数はプラス
ミド(A)やプラスミド(B)の種類や実験条件等によ
って異なるので一該には決められない。人間の労力等を
考慮すると好ましくは1万株以内、より好ましくは10
00株以内、更により好ましくは100株以内で取得出
来るようにプラスミドの選択、実験条件の設定等を行う
のが良い。また、実際に選択する数は多めのほうが無難
である。2) Next, a plasmid-introduced microorganism is selected. First, a plurality of microorganisms into which at least the plasmid (B) has been introduced are selected using the selection marker gene on the plasmid (B). That is, when the selectable marker gene is a drug resistance gene, one that grows on an agar medium containing the drug may be selected. When the selectable marker gene complements the auxotrophy, one that grows on the nutrient-deficient agar medium may be selected. By going through this step,
Microorganisms into which no plasmid has been introduced can be eliminated. When a microorganism having a low transforming ability is used as a host, most of the microorganisms have no transforming ability, and naturally, such a microorganism does not contain the plasmid (A). Unnecessary microorganisms can be removed and the detection efficiency can be greatly improved. The plurality of candidates are selected here in order to select a microorganism that also has the plasmid (A) in the later step. Therefore, the number of candidates to be selected here should be a number that includes microorganisms that also have the plasmid (A), but since the number varies depending on the types of plasmid (A) and plasmid (B), experimental conditions, etc. Can't decide Considering human labor, etc., preferably within 10,000 shares, more preferably 10 shares
It is advisable to select plasmids and set experimental conditions so that 100 or less strains can be obtained, and more preferably 100 or less strains can be obtained. In addition, it is safer to actually select a larger number.
【0027】3)2)で得られたプラスミド導入微生物
の中から更にプラスミド(A)を有するものを選択する
には、いくつかの方法がある。例えば、各々の株からプ
ラスミドを調製してその有無を調べる方法や、適当なプ
ローブを用いてハイブリダイゼーションを行う方法があ
げられる。それぞれ一般的に用いられている方法を適用
できるが、ハイブリダイゼーションの場合は、プローブ
と相同的な配列が宿主細胞の染色体DNA上に存在しな
いことが必要条件である。なお、所望のDNA断片が挿
入されたプラスミド(A)を有する微生物を選択する場
合は、そのDNA断片に応じたプローブを用いることが
できるが、挿入したDNA断片が宿主細胞の染色体DN
Aに由来する場合は、染色体DNAに含まれない配列を
DNA断片に連結してそれで検出することが必要にな
る。また、好ましくは前述したようにDNA断片がある
表現型を有し、培地上でより容易にプラスミド(A)導
入微生物の検出を可能にすることが望ましい。特に宿主
細胞としては、プラスミド(A)に挿入したDNA断片
が分泌性酵素をコードする場合においては同分泌性酵素
を細胞外に分泌する能力があれば、培地上でのプラスミ
ド(A)導入微生物の検出が容易になるので望ましい。3) There are several methods for selecting a plasmid-containing microorganism (A) from the plasmid-introduced microorganisms obtained in 2). For example, there is a method of preparing a plasmid from each strain and checking the presence or absence thereof, or a method of carrying out hybridization using an appropriate probe. Although generally used methods can be applied, in the case of hybridization, it is a necessary condition that a sequence homologous to the probe does not exist on the chromosomal DNA of the host cell. When selecting a microorganism having a plasmid (A) into which a desired DNA fragment has been inserted, a probe corresponding to the DNA fragment can be used.
When it is derived from A, it is necessary to ligate a sequence not included in the chromosomal DNA to the DNA fragment and detect it. In addition, it is desirable that the DNA fragment preferably has a certain phenotype as described above and enables detection of the plasmid (A) -introduced microorganism more easily on the medium. In particular, as a host cell, when the DNA fragment inserted into the plasmid (A) encodes a secretory enzyme, if it has the ability to secrete the secretory enzyme to the outside of the cell, the plasmid (A) -introduced microorganism on the medium is used. Is easy to detect, which is desirable.
【0028】4)次に必要に応じて、2種のプラスミド
を導入した微生物からプラスミド(B)のみを脱落させ
る。例えば、プラスミド(B)導入微生物をある一定温
度以上の高温で培養した場合にプラスミド(B)が複製
不可能になるような温度感受性プラスミドであれば、2
種のプラスミドを導入した微生物を高温培養することに
よりプラスミド(B)の選択的脱落を効率良く達成でき
る。培養条件の変更などによって同プラスミドの脱落を
誘発できないような場合においても、2種のプラスミド
を導入した微生物の継代培養によりプラスミド(B)の
みを脱落させることも可能である。ただし、プラスミド
(B)を宿主細胞から脱落させる方法は必ずしもこれら
の方法に限らない。以上の操作により、目的のプラスミ
ド導入微生物を得ることができる。4) Next, if necessary, only the plasmid (B) is removed from the microorganism into which the two types of plasmids have been introduced. For example, if the temperature sensitive plasmid is such that the plasmid (B) cannot be replicated when the plasmid (B) -introduced microorganism is cultured at a high temperature of a certain temperature or higher, 2
By selectively culturing the microorganism into which the seed plasmid has been introduced at a high temperature, selective loss of the plasmid (B) can be efficiently achieved. Even when the loss of the plasmid cannot be induced by changing the culture conditions, it is possible to remove only the plasmid (B) by subculturing the microorganism into which the two plasmids have been introduced. However, the method of removing the plasmid (B) from the host cell is not necessarily limited to these methods. By the above operation, the target plasmid-introduced microorganism can be obtained.
【0029】[プラスミド導入微生物]本発明のプラス
ミド導入微生物は、プラスミド(A)を有することを特
徴とするが、それ以外のプラスミドを有していても良
い。例えば前述のごとくプラスミド(A)を有する微生
物を取得するために一旦複数のプラスミドを導入するわ
けであるが、導入するプラスミドの種類は2種類以上、
好ましくは3種類以内、より好ましくは2種類である。
なお、この場合、一種類はプラスミド(A)であり、残
りの少なくとも一種類は選択マーカー遺伝子を有してい
ることを必要とする。プラスミド(A)以外のプラスミ
ドを除く必要が無い場合、あるいは除くのが困難である
場合にはそれを残していても良い。また、2種類以上の
物質を生産すること等を考えた場合に、それに応じた2
種類以上のプラスミド(A)を有していても良い。[Plasmid-introduced microorganism] The plasmid-introduced microorganism of the present invention is characterized by having the plasmid (A), but may have other plasmids. For example, as described above, a plurality of plasmids are introduced once in order to obtain a microorganism having the plasmid (A). However, two or more types of plasmids are introduced,
It is preferably within 3 types, more preferably 2 types.
In this case, it is necessary that one kind is a plasmid (A) and at least one kind remaining has a selectable marker gene. If it is not necessary to remove a plasmid other than the plasmid (A), or if it is difficult to remove it, it may be left. Moreover, when considering the production of two or more kinds of substances,
It may have more than one type of plasmid (A).
【0030】[プラスミド導入微生物の用途]プラスミ
ド(A)導入微生物を培養し、プラスミド(A)上のD
NAに由来する目的物質、またはDNAに由来する物質
が関与することで生成する目的物質を得ることができ
る。目的物質を得るために使用する培地、培養条件とし
ては特に制限はなく、プラスミド(A)導入微生物が生
育するものであればどのような培地、培養条件でも用い
ることができる。目的物質である微生物生産物質として
は、微生物が本来生産する能力を有していたものでも、
人工的に生産性を付与した結果生産できるようになった
ものでも良い。例えば、微生物由来のものとしては、プ
ロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、キシ
ラナーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼ等の酵素をはじめ
とするタンパク質、糖、アミノ酸、脂質などがあげられ
る。また、微生物に由来しないものとしてはヒト成長ホ
ルモン等のホルモンに代表されるタンパク質等があげら
れる。また、プラスミド(A)導入微生物を培養してそ
こからDNAを調製することにより、プラスミド(A)
を大量に得ることができる。得られたプラスミド(A)
は他の微生物に導入するために利用したり、新たなプラ
スミド作製のための材料として有効に用いることができ
る。[Use of plasmid-introduced microorganism] A plasmid (A) -introduced microorganism is cultivated, and D on the plasmid (A) is cultivated.
A target substance derived from NA or a target substance generated by the involvement of a substance derived from DNA can be obtained. The medium and culture conditions used to obtain the target substance are not particularly limited, and any medium and culture conditions can be used as long as they can grow the plasmid (A) -introduced microorganism. As a microbial production substance that is the target substance, even if it had the ability to produce microorganisms originally,
It may be one that can be produced as a result of artificially imparting productivity. Examples of microorganism-derived substances include proteins such as enzymes such as protease, amylase, lipase, cellulase, xylanase, catalase and oxidase, sugars, amino acids and lipids. In addition, proteins that are not derived from microorganisms include proteins represented by hormones such as human growth hormone. In addition, by culturing a plasmid (A) -introduced microorganism and preparing DNA therefrom, the plasmid (A)
Can be obtained in large quantities. The obtained plasmid (A)
Can be used for introduction into other microorganisms, or can be effectively used as a material for producing a new plasmid.
【0031】[0031]
【発明の実施の形態】本発明の実施の一形態として、宿
主としてバチルス属細菌、プラスミド(A)としてプラ
スミドpUB110のカナマイシン耐性遺伝子を削除し
てプロテアーゼ遺伝子を挿入したもの、プラスミド
(B)としてpE194を用いたものがあげられる。す
なわち、プラスミドpUB110のカナマイシン耐性遺
伝子(=ネオマイシン耐性遺伝子)をコードするDNA
部分を削除し、プロテアーゼ遺伝子をコードするDNA
を挿入してプラスミド(A)を製造する。次に、得られ
たプラスミド(A)及びプラスミド(B)としてのpE
194を同時にバチルス属細菌に導入した後、エリスロ
マイシン及びスキムミルクを含む寒天プレート上で生育
させる。ここで生育してくる株は少なくともpE194
を有する。さらにこれらの株のうち、大きなクリアゾー
ンを形成しているものはプラスミド(A)をも有してい
る。上記の操作で得られるプラスミド(A)及びプラス
ミドpE194を有する株を高温で培養することによ
り、温度感受性の複製起点を有するpE194を脱落さ
せ、プラスミド(A)のみを有する微生物を得ることが
できる。こうして得られるプラスミド導入微生物を培養
してプロテアーゼ生産を行い、あるいは大量にプラスミ
ド(A)を製造することができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In one embodiment of the present invention, a bacterium belonging to the genus Bacillus is used as a host, a plasmid gene is a plasmid pUB110 in which a kanamycin resistance gene is deleted and a protease gene is inserted, and a plasmid (B) is pE194. There is one using. That is, the DNA encoding the kanamycin resistance gene (= neomycin resistance gene) of the plasmid pUB110.
DNA with deleted part and coding for protease gene
Is inserted to produce plasmid (A). Next, pE as the obtained plasmid (A) and plasmid (B)
194 is simultaneously introduced into Bacillus bacteria and then grown on agar plates containing erythromycin and skim milk. The strains growing here are at least pE194
Having. Furthermore, among these strains, those forming a large clear zone also have the plasmid (A). By culturing the strain having the plasmid (A) and the plasmid pE194 obtained by the above operation at high temperature, pE194 having a temperature-sensitive replication origin can be eliminated, and a microorganism having only the plasmid (A) can be obtained. The plasmid-introduced microorganism thus obtained can be cultured to perform protease production, or the plasmid (A) can be produced in large quantities.
【0032】[0032]
【実施例】以下に本発明についての具体例を示す。ただ
し、これらは単なる例示であり、本発明はこれらのみに
限られるものではない。 [実施例1]選択マーカー遺伝子を削除し、プロテアーゼ遺伝子をコ
ードするDNA断片を挿入したプラスミドの作製 まず、5´末端側に制限酵素認識配列を付加した一対の
プライマー(配列番号1、2)と鋳型DNAとしてプラ
スミドベクターpUB110(McKenzie,T.
et al.,Plasmid,15,93(198
6))を用いて、pUB110ベクター上のカナマイシ
ン耐性遺伝子(Kmr )を除いた領域をPCR法により
増幅した(図1a)。ここでPCR法では、Perki
n Elmer Cetus社製の試薬キットとDNA
Thermal Cycler機を利用し、94℃、
1.5分(二本鎖DNAの熱変性)→55℃、3分(プ
ライマーと鋳型DNAのアニーリング)→72℃、3分
(TaqDNAポリメラーゼによるプライマーの伸長反
応)を30サイクル繰り返した(以後、用いるPCR法
は同様の条件で行なった)。EXAMPLES Specific examples of the present invention are shown below. However, these are merely examples, and the present invention is not limited to only these. [Example 1] The selection marker gene was deleted and the protease gene was cloned.
Preparation of a plasmid into which a DNA fragment to be inserted is inserted. First, a pair of primers (SEQ ID NOs: 1 and 2) having a restriction enzyme recognition sequence added to the 5'end side and plasmid vector pUB110 (McKenzie, T. et al.
et al. , Plasmid, 15, 93 (198
6)), the region excluding the kanamycin resistance gene (Km r ) on the pUB110 vector was amplified by the PCR method (FIG. 1a). Here, in the PCR method, Perki
n Elmer Cetus reagent kit and DNA
Using a Thermal Cycler machine, 94 ℃,
1.5 minutes (heat denaturation of double-stranded DNA) → 55 ° C., 3 minutes (annealing of primer and template DNA) → 72 ° C., 3 minutes (primer extension reaction by Taq DNA polymerase) was repeated 30 cycles (hereinafter, The PCR method used was performed under the same conditions).
【0033】この増幅したDNA断片を制限酵素Sal
Iで消化した後、同じく制限酵素SalIでの消化とさ
らにアルカリフォスファターゼ処理をしたプラスミドベ
クターpPD119(pUC119(宝酒造(株))の
マルチクローニングサイト中の制限酵素PstI認識部
位を欠失させたプラスミドベクター)と混合し、T4D
NAリガーゼ処理を行なった。この反応液を用い、コン
ピテントセル法により大腸菌JM101株の形質転換操
作を行ない、20ppmのアンピシリン(Amp)、
0.1mMのIPTG、40ppmのX―galを含む
L寒天培地(1%ポリペプトン、0.5%イーストエキ
ストラクト、0.5%塩化ナトリウム、2%アガー)上
で白色コロニーとなった形質転換株を選択した。これら
の形質転換株から常法によりプラスミドDNAを抽出、
精製し、制限酵素SalIによる切断後の0.8%アガ
ロースゲル電気泳動の結果から、目的とするシャトルベ
クターpSV1が構築されたことを確認した(図1b)
(以後の遺伝子操作にも同様の手順を用いた)。なお、
図1b及びc中、Ampr はアンピシリン耐性遺伝子を
表す。The amplified DNA fragment was digested with the restriction enzyme Sal.
After digestion with I, the plasmid vector pPD119 (plasmid vector in which the restriction enzyme PstI recognition site in the multiple cloning site of pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was also digested with the restriction enzyme SalI and further treated with alkaline phosphatase) Mixed with T4D
NA ligase treatment was performed. Using this reaction solution, Escherichia coli JM101 strain was transformed by the competent cell method, and 20 ppm of ampicillin (Amp),
A transformant that became a white colony on L agar medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 2% agar) containing 0.1 mM IPTG and 40 ppm X-gal. Was selected. Extraction of plasmid DNA from these transformants by a conventional method,
The result of 0.8% agarose gel electrophoresis after purification and digestion with the restriction enzyme SalI confirmed that the target shuttle vector pSV1 was constructed (FIG. 1b).
(A similar procedure was used for the subsequent genetic manipulation). In addition,
In FIGS. 1b and c, Amp r represents an ampicillin resistance gene.
【0034】さらに、このシャトルベクターにバチルス
NKS―21株(受託番号 FERM BP−93−
1)由来のプロテアーゼ遺伝子を制限酵素PstI認識
部位に挿入した。このプロテアーゼ遺伝子としては、特
開平1−141596に記載の方法により取得したCl
aI切断断片をエキソヌクレアーゼで処理して適当な長
さにし、リンカーを接続してPstI切断末端と接続で
きるようにしたDNAを用いた。なお、同等のDNAは
バチルスNKS−21株の染色体DNAを鋳型として、
配列番号3、4に示したDNAをプライマーとしてPC
Rを行うことによっても得られる。制限酵素PstIま
たはSacIによる切断後の0.8%アガロースゲル電
気泳動の結果から、プロテアーゼ遺伝子がpUB110
のORFβと同方向に組み込まれたプラスミドpSV2
が構築されたことを確認した(図1c)。次に、このプ
ロテアーゼ遺伝子を挿入したプラスミド20μgを制限
酵素SalI処理し、0.8%アガロースゲル電気泳動
によりpPD119以外の領域を回収後、T4DNAリ
ガーゼ処理により環状化して(pKDPI1を得た(図
1c)。In addition, the shuttle vector contains Bacillus NKS-21 strain (accession number FERM BP-93-
The protease gene derived from 1) was inserted into the restriction enzyme PstI recognition site. The protease gene is Cl obtained by the method described in JP-A-1-141596.
The aI digested fragment was treated with exonuclease to have an appropriate length, and a DNA was used in which a linker was ligated so that it could be ligated to a PstI digested end. In addition, an equivalent DNA was prepared using the chromosomal DNA of Bacillus NKS-21 strain as a template.
PC using the DNAs shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 as primers
It can also be obtained by performing R. From the results of 0.8% agarose gel electrophoresis after digestion with the restriction enzymes PstI or SacI, the protease gene was identified as pUB110.
Plasmid pSV2 integrated in the same direction as ORFβ of
Was confirmed to have been constructed (Fig. 1c). Next, 20 μg of the plasmid into which this protease gene had been inserted was treated with a restriction enzyme SalI, the region other than pPD119 was recovered by 0.8% agarose gel electrophoresis, and then circularized by treatment with T4 DNA ligase (pKDPI1 was obtained (FIG. 1c). ).
【0035】[実施例2]pKDPI1とpE194によるバチルスNKS―21
の同時形質転換 実施例1で最終的に得たライゲーション反応生成物とエ
リスロマイシン耐性遺伝子を有するpE194(Hor
inouchi,S.and Weisblum,
B.,J.Bacteriol.,150,804(1
982))500ngの混合物を用いて以下のような方
法によりバチルスNKS―21株の形質転換を行なっ
た。Example 2 Bacillus NKS-21 with pKDPI1 and pE194
PE194 with final ligation reaction products and erythromycin resistance gene was obtained by cotransformation Example 1 (Hor
inouchi, S .; and Weisblum,
B. , J. et al. Bacteriol. , 150, 804 (1
982)) Bacillus NKS-21 strain was transformed by the following method using 500 ng of the mixture.
【0036】バチルスNKS―21株をL液体培地(1
%ポリペプトン、0.5%イーストエキストラクト、
0.5%塩化ナトリウム、炭酸ナトリウムでpH9.5
に調整)にて37℃で一晩振とう培養した。この培養液
をSPI培地(0.2%硫酸アンモニウム、1.4%リ
ン酸水素2カリウム、0.6%リン酸2水素カリウム、
0.1%クエン酸ナトリウム2水和物、0.02%硫酸
マグネシウム7水和物、0.5%グルコース、0.02
%カザミノ酸、0.1%イーストエキストラクト、50
ppm L−ロイシン、50ppm L−メチオニン)
に体積比で1%接種し、さらに対数増殖期後期まで37
℃で振とう培養した。この培養液にグリセリンを終濃度
で12.5%になるように添加し、さらにSPII培地
(0.2%硫酸アンモニウム、1.4%リン酸水素2カ
リウム、0.6%リン酸2水素カリウム、0.1%クエ
ン酸ナトリウム2水和物、0.02%硫酸マグネシウム
7水和物、0.5%グルコース、0.02%カザミノ
酸、0.1%イーストエキストラクト、5ppm L−
ロイシン、5ppm L−メチオニン)で7.5倍に希
釈した後、37℃で90分間振とう培養し、コンピテン
トセル浮遊液を作製した。このコンピテントセル浮遊液
1mlに上記のプラスミド混合物を加え、30℃で30
分間振とうした後、2mlのL液体培地(pH9.5)
を加え、さらに30℃で60分間振とうした。この培養
液を10ppmのエリスロマイシンと2%のスキムミル
クを含むL寒天培地(炭酸ナトリウムでpH9.5に調
整)50枚に塗布し、30℃で30時間培養した後エリ
スロマイシン耐性を示し、かつ大きなクリアゾーンを形
成するコロニー、すなわちpKDPI1とpE194に
よる同時形質転換株を選択した(表1)。The Bacillus NKS-21 strain was mixed with L liquid medium (1
% Polypeptone, 0.5% yeast extract,
PH 9.5 with 0.5% sodium chloride and sodium carbonate
The culture was performed overnight at 37 ° C. with shaking. This culture broth was treated with SPI medium (0.2% ammonium sulfate, 1.4% dipotassium hydrogen phosphate, 0.6% potassium dihydrogen phosphate,
0.1% sodium citrate dihydrate, 0.02% magnesium sulfate heptahydrate, 0.5% glucose, 0.02
% Casamino acid, 0.1% yeast extract, 50
ppm L-leucine, 50 ppm L-methionine)
Inoculate 1% by volume, and 37
Shaking culture was performed at ℃. Glycerin was added to this culture solution to a final concentration of 12.5%, and SPII medium (0.2% ammonium sulfate, 1.4% dipotassium hydrogen phosphate, 0.6% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% sodium citrate dihydrate, 0.02% magnesium sulfate heptahydrate, 0.5% glucose, 0.02% casamino acid, 0.1% yeast extract, 5 ppm L-
After being diluted 7.5 times with leucine and 5 ppm L-methionine), the mixture was shake-cultured at 37 ° C. for 90 minutes to prepare a competent cell suspension. To 1 ml of this competent cell suspension, add the above-mentioned plasmid mixture and
After shaking for 2 minutes, 2 ml of L liquid medium (pH 9.5)
Was added, and the mixture was further shaken at 30 ° C. for 60 minutes. This culture solution was applied to 50 L-agar medium (adjusted to pH 9.5 with sodium carbonate) containing 10 ppm erythromycin and 2% skim milk, and after culturing at 30 ° C. for 30 hours, it showed erythromycin resistance and a large clear zone. A colony that formed p., That is, a cotransformant with pKDPI1 and pE194 was selected (Table 1).
【0037】[0037]
【表1】 [Table 1]
【0038】[実施例3]実施例2で取得した同時形質転換株からのpE194の
選択的脱落 実施例2で作製した同時形質転換株をL液体培地を用い
て50℃で20時間培養した。その培養液を生理食塩水
で適当に希釈した後、2%のスキムミルクを含んだL寒
天培地(pH9.5)に撒き広げ、37℃で20時間培
養した。L寒天培地上に生じたコロニーの中から、より
大きいクリアゾーンを形成するコロニーを100株選び
出し、2%のスキムミルクと10ppmのエリスロマイ
シンを含んだL寒天培地(pH9.5)と2%のスキム
ミルクのみを含んだL寒天培地(pH9.5)にそれぞ
れ移した。さらにこれらのL寒天培地を37℃で20時
間培養した後、前者のL寒天培地では生育できないが、
後者のL寒天培地では大きなクリアゾーンを形成する株
を98株取得した。次にこれらの株からpE194のみ
が選択的に脱落していることを確認する作業を行なっ
た。上記98株から無作為に選んだ10株について常法
により菌体内からプラスミドの調製を行ない、制限酵素
PstIで処理した後、0.8%アガロースゲル電気泳
動を行なった。その結果、10株すべてにおいてpKD
PI1のみが確認できた。さらにこの電気泳動後のアガ
ロースゲルを用いてニトロセルロースフィルターへのサ
ザンブロッティングを行ない、pE194をプローブに
してハイブリダイゼーションも行なったが、プローブに
ハイブリダイズするDNAバンドは全く検出されなかっ
た。このことから菌体内よりpE194は完全に脱落し
ていると結論した。[Example 3] pE194 from the cotransformant obtained in Example 2
Selective shedding The cotransformant prepared in Example 2 was cultured in L liquid medium at 50 ° C. for 20 hours. The culture solution was appropriately diluted with physiological saline, spread on L agar medium (pH 9.5) containing 2% skim milk, and cultured at 37 ° C. for 20 hours. 100 colonies forming a larger clear zone were selected from the colonies formed on the L agar medium, and only L agar medium (pH 9.5) containing 2% skim milk and 10 ppm erythromycin and 2% skim milk were selected. Were transferred to L agar medium (pH 9.5) containing Furthermore, after culturing these L agar media at 37 ° C. for 20 hours, they cannot grow on the former L agar media,
In the latter L agar medium, 98 strains forming a large clear zone were obtained. Next, work was performed to confirm that only pE194 was selectively shed from these strains. 10 strains randomly selected from the 98 strains were prepared from the inside of the cells by a conventional method, treated with the restriction enzyme PstI, and then subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis. As a result, pKD for all 10 strains
Only PI1 could be confirmed. Further, Southern blotting was performed on a nitrocellulose filter using this agarose gel after electrophoresis, and hybridization was also performed using pE194 as a probe, but no DNA band hybridizing with the probe was detected. From this, it was concluded that pE194 was completely shed from the cells.
【0039】[実施例4]選択マーカー遺伝子を不活性化し、プロテアーゼ遺伝子
をコードするDNA断片を挿入したプラスミドの作製 まず、5´末端側に制限酵素認識配列を付加した一対の
プライマー(配列番号1、5)と鋳型DNAとしてpU
B110を用いて、pUB110全域をPCR法により
増幅した。この増幅したDNA断片を制限酵素SalI
認識部位でpPD119に挿入した。さらに、このシャ
トルベクターに実施例1で用いたバチルスNKS―21
株由来のプロテアーゼ遺伝子をpUB110のPre遺
伝子と同方向に組み込まれるように制限酵素PstI認
識部位で挿入した。このプラスミドに対してカナマイシ
ン耐性遺伝子の不活性化を実施した。ここでは、同遺伝
子の開始コドンの後に部位特異的変異を導入し、終止コ
ドンを出現させることにより同遺伝子の不活性化を図っ
た。部位特異的変異は、以下のようにKunkel法に
従って行なった。[Example 4] Inactivation of a selectable marker gene to give a protease gene
Construction of a plasmid into which a DNA fragment coding for is inserted. First, a pair of primers (SEQ ID NOs: 1 and 5) having a restriction enzyme recognition sequence added to the 5'end and pU as a template DNA.
Using B110, the entire region of pUB110 was amplified by the PCR method. The amplified DNA fragment is treated with the restriction enzyme SalI.
It was inserted into pPD119 at the recognition site. Furthermore, the Bacillus NKS-21 used in Example 1 was added to this shuttle vector.
The strain-derived protease gene was inserted at the restriction enzyme PstI recognition site so that it was integrated in the same direction as the Pre gene of pUB110. Inactivation of the kanamycin resistance gene was performed on this plasmid. Here, the site-specific mutation was introduced after the start codon of the gene to make the stop codon appear to inactivate the gene. The site-specific mutation was performed according to the Kunkel method as follows.
【0040】上記プラスミドを大腸菌BW313株(H
frKL16PO/45[lysA(61−62)],
dut1,nug1,thy−1,relA1)に常法
に従い導入し、上記プラスミドを有する大腸菌BW31
3株を得た。さらに、この大腸菌から、Messing
らの方法(Vieira,J.and Messin
g,J.,Method in Enzymolog
y,153,3(1987))に従い1本鎖DNAを調
製し、DNA中のデオキシチアミン(dT)の一部がデ
オキシウラシル(dU)に置換された1本鎖DNAを得
た。また、配列番号6に示したオリゴヌクレオチドを化
学合成し、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより5´末
端をリン酸化した。このオリゴヌクレオチドを用いて上
記の1本鎖DNAをアニーリングバッファー(20mM
トリス塩酸塩(pH8.0),10mM塩化マグネシウ
ム,50mM塩化ナトリウム,1mM DTT)中で混
合し、65℃で15分間静置後、さらに37℃で15分
間静置し、オリゴヌクレオチドを変異の目的部位にアニ
ーリングさせた。次にこのDNA混合液に2.5倍量の
エクステンションバッファー(50mMトリス塩酸塩
(pH8.0),60mM酢酸アンモニウム,5mM塩
化マグネシウム,5mMジチオトレイトール,1mMニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド,0.5mM d
ATP,0.5mMdCTP,0.5mM dGTP,
0.5mM dTTP)を加え、さらに大腸菌DNAリ
ガーゼとT4DNAポリメラーゼを加えて25℃で2時
間静置することで相補鎖の合成を行なった。その後、こ
のDNAを大腸菌BMH71−18mutS株に常法に
従い導入し、アンピシリン耐性の形質転換株を選択し
た。得られた形質転換株から、常法に従い1本鎖DNA
を調製しジデオキシ法により塩基配列を決定し、目的の
変異が導入されたプラスミドを取得した。次に、このプ
ラスミド20μgを制限酵素SalI処理し、0.8%
アガロースゲル電気泳動によりpPD119以外の領域
を回収後、T4DNAリガーゼ処理により環状化した
(pKIPI1、図2)。なお、図2においてKm´は
不活性化したカナマイシン耐性遺伝子を表す。E. coli BW313 strain (H
frKL16PO / 45 [lysA (61-62)],
dut1, nug1, thy-1, relA1) according to a conventional method, and Escherichia coli BW31 having the above plasmid.
3 strains were obtained. Furthermore, from this E. coli,
Et al. (Vieira, J. and Messin).
g, J. , Method in Enzymolog
y, 153, 3 (1987)), a single-stranded DNA was prepared, and a single-stranded DNA in which a part of deoxythiamine (dT) in the DNA was replaced with deoxyuracil (dU) was obtained. In addition, the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 6 was chemically synthesized, and its 5 ′ end was phosphorylated with T4 polynucleotide kinase. Using this oligonucleotide, the above single-stranded DNA is annealed in a buffer (20 mM).
The mixture was mixed in Tris hydrochloride (pH 8.0), 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride, 1 mM DTT), allowed to stand at 65 ° C. for 15 minutes, and further allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes to change the oligonucleotide. The site was annealed. Next, 2.5 times as much extension buffer (50 mM Tris hydrochloride (pH 8.0), 60 mM ammonium acetate, 5 mM magnesium chloride, 5 mM dithiothreitol, 1 mM nicotinamide adenine dinucleotide, 0.5 mM d was added to this DNA mixture.
ATP, 0.5 mM dCTP, 0.5 mM dGTP,
0.5 mM dTTP) was added, E. coli DNA ligase and T4 DNA polymerase were further added, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 2 hours to synthesize a complementary strand. Then, this DNA was introduced into Escherichia coli BMH71-18mutS strain by a conventional method, and an ampicillin-resistant transformant was selected. Single-stranded DNA is obtained from the obtained transformant according to a conventional method.
Was prepared and the nucleotide sequence was determined by the dideoxy method to obtain a plasmid into which the desired mutation was introduced. Next, 20 μg of this plasmid was treated with the restriction enzyme SalI to give 0.8%
After recovering the region other than pPD119 by agarose gel electrophoresis, it was circularized by treatment with T4 DNA ligase (pKIPI1, FIG. 2). In FIG. 2, Km ′ represents an inactivated kanamycin resistance gene.
【0041】[実施例5]pKIPI1とpE194によるバチルスNKS―21
の同時形質転換 実施例2と同様の手順により、pKIPI1とpE19
4による同時形質転換株を取得した。また、この同時形
質転換株はカナマイシン含有L寒天培地(pH9.5)
では生育できず、カナマイシン耐性遺伝子が不活性化し
ていることを確認した。Example 5 Bacillus NKS-21 with pKIPI1 and pE194
By the same procedure as in Example 2.
The co-transformed strain of 4 was obtained. In addition, this co-transformant is a kanamycin-containing L agar medium (pH 9.5).
However, it was confirmed that the kanamycin resistance gene was inactivated.
【0042】[実施例6]実施例5で取得した同時形質転換株からのpE194の
選択的脱落 実施例3と同様の手順により、同時形質転換株からpE
194を脱落させ、pKIPI1のみから成る形質転換
株を取得した。[Example 6] pE194 from the cotransformant obtained in Example 5
Selective shedding pE from the co-transformed strain by the same procedure as in Example 3.
194 was eliminated and a transformant consisting of pKIPI1 alone was obtained.
【0043】[実施例7]プロテアーゼ遺伝子をコードするDNA断片を挿入した
プラスミドによる形質転換株の作製 まず、実施例4と同様にpUB110とpPD119を
連結したシャトルベクターにプロテアーゼ遺伝子を挿入
したプラスミドを構築した。次に、このプラスミド2μ
gからpUC119部分を制限酵素SalI処理により
取り除き、0.8%アガロースゲル電気泳動で残りの領
域を回収後、T4DNAリガーゼ処理により環状化した
(pPI1、図3)。なお、図3におけるKmr は図1
と同じ。このようにして構築したプラスミドを用いてバ
チルスNKS―21株の形質転換を行なった。形質転換
株の検出には20ppmのカナマイシンを含むL寒天培
地(pH9.5)10枚に塗布し、37℃で20時間培
養した後生育してきたコロニーを取得した。上記コロニ
ー5株について常法により菌体内からプラスミドの調製
を行ない、制限酵素PstIで処理した後、0.8%ア
ガロースゲル電気泳動を行なった。その結果、5株すべ
てにおいて目的のプラスミドが確認できた。[Example 7] A DNA fragment encoding a protease gene was inserted.
Preparation of transformant strain using plasmid First, a plasmid in which a protease gene was inserted into a shuttle vector in which pUB110 and pPD119 were ligated was constructed in the same manner as in Example 4. Next, this plasmid 2μ
The pUC119 portion was removed from g by treatment with the restriction enzyme SalI, the remaining region was recovered by 0.8% agarose gel electrophoresis, and circularized by treatment with T4 DNA ligase (pPI1, FIG. 3). Note that Km r in FIG.
Same as. The thus constructed plasmid was used to transform the Bacillus NKS-21 strain. For detection of the transformant, 10 L agar medium (pH 9.5) containing 20 ppm of kanamycin was applied and cultured at 37 ° C. for 20 hours, and then grown colonies were obtained. A plasmid was prepared from the inside of the cells of the 5 colony strains by a conventional method, treated with the restriction enzyme PstI, and then subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis. As a result, the target plasmid was confirmed in all 5 strains.
【0044】[実施例8]実施例3、6、7で作製した形質転換株の培養および分
泌プロテアーゼの蓄積活性の測定 バチルスNKS−21と実施例3、6、7で取得した形
質転換株を各々C液体培地(1%カゼイン、1%肉エキ
ス、1%ポリペプトン、炭酸ナトリウムでpH9.5に
調整)300ml中において37℃で50時間振盪培養
し、培地中にプロテアーゼを生産させた。この培養液を
4℃で遠心分離にかけ、上清を粗酵素液とした。次にプ
ロテアーゼの活性測定を以下のように行なった。50m
Mのホウ酸バッファー(pH10)500μlに適当に
希釈した50μlの粗酵素液を加え、30℃で5分間プ
レインキュベーションした。この溶液に2%のハマース
テンカゼイン溶液500μlを加え、30℃で10分間
インキュベーションした後、さらにトリクロロ酢酸溶液
2mlを加えて反応を停止させた。これを30℃で10
分間以上放置後、フィルターペーパーを用いて濾過を行
なった。この濾液1mlに0.4M炭酸ナトリウム5m
l、6倍希釈のフェノール試薬1mlを添加し、30℃
で20分間放置して発色させた後、660nmにおける
吸光度を測定した。酵素単位の定義は、30℃、pH1
0でカゼインを基質として反応させた場合にトリクロロ
酢酸可溶画分中に1秒間でチロシン1モル相当の660
nmの発色を示す分解物を生成するプロテアーゼ活性を
1カタール(katal)とした。バチルスNKS―2
1株をC液体培地で培養した場合の培養液上澄みのプロ
テアーゼ活性を100として、pKDPI1、pKIP
I1、pPI1よる形質転換株を培養した場合の培養液
上澄みのプロテアーゼ活性を相対値で示した結果を表2
にまとめた。[Example 8] Cultivation and isolation of the transformants prepared in Examples 3, 6 and 7.
Measurement of accumulation activity of secretory protease Bacillus NKS-21 and the transformants obtained in Examples 3, 6 and 7 were respectively used in C liquid medium (1% casein, 1% meat extract, 1% polypeptone, sodium carbonate, pH 9.5). It was cultivated by shaking in 300 ml at 37 ° C. for 50 hours to produce protease in the medium. This culture solution was centrifuged at 4 ° C., and the supernatant was used as a crude enzyme solution. Next, the activity of protease was measured as follows. 50m
50 μl of the appropriately diluted crude enzyme solution was added to 500 μl of M borate buffer (pH 10) and preincubated at 30 ° C. for 5 minutes. To this solution, 500 μl of 2% Hammer Stencasein solution was added, and after incubation at 30 ° C. for 10 minutes, 2 ml of trichloroacetic acid solution was further added to stop the reaction. This is 10 at 30 ℃
After standing for more than one minute, filtration was performed using filter paper. 0.4 ml of sodium carbonate was added to 1 ml of this filtrate.
l, add 1 ml of 6-fold diluted phenol reagent, 30 ℃
After allowing it to stand for 20 minutes for color development, the absorbance at 660 nm was measured. Enzyme unit is defined as 30 ℃, pH1
When casein was used as a substrate at 0 and the reaction was performed in the trichloroacetic acid-soluble fraction for 1 second, 660 equivalent to 1 mol of tyrosine was obtained.
The protease activity that produces a degradation product exhibiting a color of nm was defined as 1 katal. Bacillus NKS-2
The protease activity of the supernatant of the culture broth when one strain was cultivated in a liquid C medium was defined as 100, and pKDPI1 and pKIP
Table 2 shows the results showing the relative protease activity of the supernatant of the culture broth in the case of culturing the transformant strain with I1 and pPI1.
Summarized in
【0045】[0045]
【表2】 [Table 2]
【0046】この結果より、カナマイシン耐性遺伝子を
削除したプラスミドによる形質転換株のプロテアーゼ生
産性は、カナマイシン耐性遺伝子が活性発現するプラス
ミドを用いた場合に比べて約1.3倍向上していること
がわかった。また、カナマイシン耐性遺伝子を不活性化
したプラスミドによる形質転換株のプロテアーゼ生産性
は、カナマイシン耐性遺伝子が活性発現するプラスミド
を用いた場合に比べて約1.1倍向上していることがわ
かった。さらに宿主細胞のプラスミド保持率を以下のよ
うに調べた。pKDPI1、あるいはpKIPI1によ
る形質転換株をC液体培地において37℃で50時間振
とう培養し、この培養液を生理食塩水で適当に希釈し、
L寒天培地(pH9.5)に塗布した。37℃で培養し
た後に生じたコロニー1000株をニトロセルロースフ
ィルターに転写し、pUB110をプローブにしてコロ
ニーハイブリダイゼーションを行なったところ、双方の
形質転換株とも99%以上のコロニーがポジティブシグ
ナルを示し、プラスミドを安定に保持していることがわ
かった。From this result, it is found that the protease productivity of the transformant strain with the plasmid in which the kanamycin resistance gene is deleted is improved by about 1.3 times as compared with the case of using the plasmid in which the kanamycin resistance gene is actively expressed. all right. Further, it was found that the protease productivity of the transformant strain using the plasmid in which the kanamycin resistance gene was inactivated was improved by about 1.1 times as compared with the case of using the plasmid in which the kanamycin resistance gene was actively expressed. Further, the plasmid retention rate of the host cells was examined as follows. The transformant strain with pKDPI1 or pKIPI1 was shake-cultured in a C liquid medium at 37 ° C. for 50 hours, and this culture solution was appropriately diluted with physiological saline.
It was spread on L agar medium (pH 9.5). When 1000 colonies generated after culturing at 37 ° C. were transferred to a nitrocellulose filter and subjected to colony hybridization using pUB110 as a probe, 99% or more colonies of both transformants showed a positive signal, It has been found to hold stable.
【0047】[0047]
【発明の効果】以上詳細に説明した通り、本発明の選択
マーカー遺伝子を含まないプラスミドを導入した微生物
を培養することにより目的物質の生産性を向上させるこ
とができる。上記プラスミドを用いることにより、選択
マーカー遺伝子を含むプラスミドを用いた場合に比べ
て、宿主細胞のエネルギー的負担が軽減する。従って、
上記プラスミド導入微生物を培養することにより目的物
質を大量に得ようとする際の生産に特に有利である。さ
らに、選択マーカー遺伝子が薬剤耐性を表現型とする場
合、同遺伝子を不活性化したプラスミドや同遺伝子が存
在しないプラスミドを用いる方が、プラスミド導入細胞
に薬剤耐性を付与しないため、それによって生産した産
物が食品、医薬品等に供される場合はより好ましい態様
となる。また、本発明の選択マーカー遺伝子を含まない
プラスミドを有する微生物を得るための方法により、効
率良く該微生物を得ることができる。また、本発明のP
CR法を用いたプラスミドの製造方法により、本発明の
選択マーカー遺伝子を含まないプラスミドを効率良く作
製することができる。As described above in detail, the productivity of the target substance can be improved by culturing the microorganism into which the plasmid of the present invention which does not contain the selectable marker gene is introduced. The use of the above plasmid reduces the energy burden on the host cell as compared with the case of using a plasmid containing a selectable marker gene. Therefore,
It is particularly advantageous for production when a large amount of a target substance is obtained by culturing the above plasmid-introduced microorganism. Furthermore, when the selectable marker gene phenotypes drug resistance, a plasmid in which the gene is inactivated or a plasmid in which the gene is not present does not impart drug resistance to the plasmid-introduced cells, and thus is produced by that. It is a more preferable embodiment when the product is used for foods, pharmaceuticals and the like. In addition, the method for obtaining a microorganism having a plasmid that does not contain the selectable marker gene of the present invention can efficiently obtain the microorganism. In addition, the P of the present invention
By the method for producing a plasmid using the CR method, the plasmid not containing the selectable marker gene of the present invention can be efficiently produced.
【0048】[配列表] 配列番号:1 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GGGAGCTCGG CCCGTTTGTT GAACTA 26[Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 26 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: 1 strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA sequence GGGAGCTCGG CCCGTTTGTT GAACTA 26
【0049】配列番号:2 配列の長さ:32 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GGGAGCTCCT GCAGCTCTTG TATCTTTTTT AT 32SEQ ID NO: 2 Sequence length: 32 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA sequence GGGAGCTCCT GCAGCTCTTG TATCTTTTTT AT 32
【0050】配列番号:3 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GGCTGCAGAT AACGGTCCAG GTATTC 26SEQ ID NO: 3 Sequence length: 26 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA sequence GGCTGCAGAT AACGGTCCAG GTATTC 26
【0051】配列番号:4 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GGCTGCAGGT ATGCGAAAGT TGAGTT 26SEQ ID NO: 4 Sequence length: 26 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA sequence GGCTGCAGGT ATGCGAAAGT TGAGTT 26
【0052】配列番号:5 配列の長さ:32 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GGGAGCTCCT GCAGAGGTCT CTCGTATCTT TT 32SEQ ID NO: 5 Sequence length: 32 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA sequence GGGAGCTCCT GCAGAGGTCT CTCGTATCTT TT 32
【0053】配列番号:6 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 AATAGTGAAT TGACCAATAA TSEQ ID NO: 6 Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence AATAGTGAAT TGACCAATAA T
【図1a】プラスミドpKDPI1の作製の過程。FIG. 1a: Process of construction of plasmid pKDPI1.
【図1b】プラスミドpKDPI1の作製の過程。FIG. 1b: Process of construction of plasmid pKDPI1.
【図1c】プラスミドpKDPI1の作製の過程。FIG. 1c: Process of construction of plasmid pKDPI1.
【図2】プラスミドpKIPI1の構造。FIG. 2. Structure of plasmid pKIPI1.
【図3】プラスミドpPI1の構造。FIG. 3: Structure of plasmid pPI1.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 9/50 C12N 9/50 C12P 21/02 C12P 21/02 C C12Q 1/68 7823−4B C12Q 1/68 A //(C12N 1/19 C12R 1:85) (C12N 1/21 C12R 1:07) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1:38) (C12N 9/20 C12R 1:07) (C12N 9/20 C12R 1:19) (C12N 9/20 C12R 1:38) (C12N 9/20 C12R 1:85) (C12N 9/50 C12R 1:07) (C12N 9/50 C12R 1:19) (C12N 9/50 C12R 1:38) (C12N 9/50 C12R 1:85) (C12P 21/02 C12R 1:07) (C12P 21/02 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:38) (C12P 21/02 C12R 1:85) (72)発明者 福山 志朗 千葉県千葉市緑区大野台1丁目1番1号 昭和電工株式会社 総合研究所内 (72)発明者 御代田 喜昭 千葉県千葉市緑区大野台1丁目1番1号 昭和電工株式会社 総合研究所内 (72)発明者 米田 正 千葉県千葉市緑区大野台1丁目1番1号 昭和電工株式会社 総合研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Office reference number FI Technical display location C12N 9/50 C12N 9/50 C12P 21/02 C12P 21/02 C C12Q 1/68 7823-4B C12Q 1/68 A // (C12N 1/19 C12R 1:85) (C12N 1/21 C12R 1:07) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1:38) (C12N 9 / 20 C12R 1:07) (C12N 9/20 C12R 1:19) (C12N 9/20 C12R 1:38) (C12N 9/20 C12R 1:85) (C12N 9/50 C12R 1:07) (C12N 9 / 50 C12R 1:19) (C12N 9/50 C12R 1:38) (C12N 9/50 C12R 1:85) (C12P 21/02 C12R 1:07) (C12P 21/02 C12R 1:19) (C12P 21 / 02 C12R 1:38) ( 12P 21/02 C12R 1:85) (72) Inventor Shiro Fukuyama 1-1-1, Onodai, Midori-ku, Chiba-shi, Chiba Showa Denko KK Research Institute (72) Inventor Yoshiaki Miyoda Onodai, Midori-ku, Chiba-shi 1-1-1 Showa Denko KK Research Institute (72) Inventor Tadashi Yoneda 1-1-1 Onodai, Midori-ku, Chiba-shi, Chiba Showa Denko KK Research Institute
Claims (25)
能なプラスミドであって、該微生物中で発現する選択マ
ーカー遺伝子を有しないことを特徴とするプラスミド。1. A plasmid capable of replicating in at least one kind of microorganism and having no selectable marker gene expressed in the microorganism.
記載のプラスミド。2. The microorganism is a bacterium or a yeast.
The described plasmid.
エスシェリシア(Escherichia )属細菌、シュードモナ
ス(Pseudomonas )属細菌、またはサッカロミセス(Sa
ccharomyces )属酵母である請求項1記載のプラスミ
ド。3. A bacterium of the genus Bacillus ,
Escherichia spp, Pseudomonas spp , or Saccharomyces ( Sa
The plasmid according to claim 1, which is a yeast of the genus ccharomyces ).
少なくとも1種の微生物中で発現可能な遺伝子を有する
請求項1〜3のいずれかに記載のプラスミド。4. The plasmid according to any one of claims 1 to 3, which has a gene that can be expressed in at least one microorganism of the replicable microorganisms of the plasmid.
4記載のプラスミド。5. The plasmid according to claim 4, wherein the gene is a protein gene.
のプラスミド。6. The plasmid according to claim 4, wherein the gene is an enzyme gene.
項4記載のプラスミド。7. The plasmid according to claim 4, wherein the gene is a hydrolase gene.
ーゼ遺伝子である請求項4記載のプラスミド。8. The plasmid according to claim 4, wherein the gene is a protease gene or a lipase gene.
エスシェリシア(Escherichia )属細菌またはシュード
モナス(Pseudomonas )属細菌由来である請求項4〜8
のいずれか記載のプラスミド。9. A bacterium of the genus Bacillus having a gene,
Esusherishia (Escherichia) bacteria or Pseudomonas (Pseudomonas) bacteria from a which claims 4-8
The plasmid according to any one of 1.
スミドを有する微生物であって、該プラスミドが該微生
物中で発現する選択マーカー遺伝子を有しないことを特
徴とするプラスミド導入微生物。10. A microorganism having the plasmid according to any one of claims 1 to 9, wherein the plasmid does not have a selectable marker gene expressed in the microorganism.
物であって、少なくとも1種のプラスミドは該微生物中
で発現する選択マーカー遺伝子を有しない請求項1〜9
のいずれかに記載のプラスミドであり、他の少なくとも
1種のプラスミドは該微生物中で発現する選択マーカー
遺伝子を有することを特徴とするプラスミド導入微生
物。11. A microorganism having two or more kinds of plasmids, wherein at least one kind of plasmid does not have a selectable marker gene expressed in the microorganism.
5. The plasmid-introduced microorganism, which is the plasmid according to any one of claims 1 to 3, wherein at least one other plasmid has a selectable marker gene that is expressed in the microorganism.
物であって、少なくとも1種のプラスミドは該微生物中
で発現する選択マーカー遺伝子を有しない請求項1〜9
のいずれかに記載のプラスミドであり、他の少なくとも
1種のプラスミドは該微生物中で発現する選択マーカー
遺伝子及び該微生物中で複製するための温度感受性複製
起点を有することを特徴とするプラスミド導入微生物。12. A microorganism having two or more kinds of plasmids, wherein at least one kind of plasmid does not have a selectable marker gene expressed in the microorganism.
5. The plasmid-introduced microorganism, characterized in that the at least one other plasmid has a selectable marker gene expressed in the microorganism and a temperature-sensitive replication origin for replication in the microorganism. .
のいずれかに記載のプラスミド導入微生物。13. The microorganism according to claim 10, which is a bacterium.
The plasmid-introduced microorganism according to any one of 1.
のいずれかに記載のプラスミド導入微生物。14. The microorganism according to claim 10, which is yeast.
The plasmid-introduced microorganism according to any one of 1.
である請求項10〜12のいずれかに記載のプラスミド
導入微生物。15. The plasmid-introduced microorganism according to claim 10, wherein the microorganism is a bacterium of the genus Bacillus .
s )属細菌である請求項10〜12のいずれかに記載の
プラスミド導入微生物。16. The microorganism is Pseudomona.
The plasmid-introduced microorganism according to any one of claims 10 to 12, which is a s ) bacterium.
a )属細菌である請求項10〜12のいずれかに記載の
プラスミド導入微生物。17. The microorganism is Escherichi.
The plasmid-introduced microorganism according to any one of claims 10 to 12, which is a genus bacterium.
ces )属酵母である請求項10〜12のいずれかに記載
のプラスミド導入微生物。18. The microorganism is Saccharomyces.
ces ) yeast, The plasmid-introduced microorganism according to any one of claims 10 to 12.
ドDNAを鋳型として選択マーカー遺伝子をコードする
部分のDNAの全部もしくは一部を除く形でPCR法に
よりDNAを増幅する工程を含むことを特徴とする、選
択マーカー遺伝子を除去したプラスミドの製造方法。19. A method comprising the step of amplifying a DNA by a PCR method using a plasmid DNA having a selectable marker gene as a template and removing all or part of the DNA of the portion encoding the selectable marker gene. A method for producing a plasmid from which a marker gene has been removed.
ミド(A)を有する微生物を得るための方法であって、
以下の構成から成る方法。 1)選択マーカー遺伝子を含まないプラスミド(A)及
び選択マーカー遺伝子を含むプラスミド(B)を同時に
微生物に導入する。 2)プラスミド(B)上の選択マーカー遺伝子を利用し
て少なくともプラスミド(B)を有する微生物を複数選
択する。 3)2)で得られた微生物群からプラスミド(A)を有
する微生物を選択する。20. A method for obtaining a microorganism having a plasmid (A) containing no selectable marker gene, which comprises:
A method consisting of the following configurations. 1) A plasmid (A) containing no selection marker gene and a plasmid (B) containing a selection marker gene are simultaneously introduced into a microorganism. 2) A plurality of microorganisms having at least the plasmid (B) are selected using the selectable marker gene on the plasmid (B). 3) Select a microorganism having the plasmid (A) from the group of microorganisms obtained in 2).
て選択マーカー遺伝子を含まないプラスミド(A)のみ
を有する微生物を得る方法。 1)選択マーカー遺伝子を含まないプラスミド(A)及
び選択マーカー遺伝子を含むプラスミド(B)を同時に
微生物に導入する。 2)プラスミド(B)上の選択マーカー遺伝子を利用し
て少なくともプラスミド(B)を有する微生物を複数選
択する。 3)2)で得られた微生物群からプラスミド(A)を有
する微生物を選択する。 4)3)で得られた微生物からプラスミド(B)を脱落
させる。21. A method for obtaining a microorganism having only a plasmid (A) containing no selectable marker gene as a plasmid, which comprises the following constitution: 1) A plasmid (A) containing no selection marker gene and a plasmid (B) containing a selection marker gene are simultaneously introduced into a microorganism. 2) A plurality of microorganisms having at least the plasmid (B) are selected using the selectable marker gene on the plasmid (B). 3) Select a microorganism having the plasmid (A) from the group of microorganisms obtained in 2). 4) The plasmid (B) is eliminated from the microorganism obtained in 3).
(B)の複製起点が温度感受性であることを特徴とする
請求項21記載の微生物を得る方法。22. The method for obtaining a microorganism according to claim 21, wherein the origin of replication of the plasmid (B) for replication in the microorganism is temperature sensitive.
物より微生物生産物質を回収することによる微生物生産
物質の製造方法であって、該微生物が有するプラスミド
が該微生物内で発現する選択マーカー遺伝子を含まず、
該微生物生産物質の生産に関与する遺伝子を含むことを
特徴とする微生物生産物質の製造方法。23. A method for producing a microorganism-producing substance by culturing a plasmid-introduced microorganism and recovering the microorganism-producing substance from the culture, wherein the plasmid contained in the microorganism contains a selectable marker gene expressed in the microorganism. No
A method for producing a microbial product, comprising a gene involved in the production of the microbial product.
物よりタンパク質を回収することによるタンパク質の製
造方法であって、該微生物が有するプラスミドが該微生
物内で発現する選択マーカー遺伝子を含まず、該タンパ
ク質をコードする遺伝子または該タンパク質の発現を調
節する遺伝子を含むことを特徴とするタンパク質の製造
方法。24. A method for producing a protein by culturing a plasmid-introduced microorganism and recovering the protein from the culture, wherein the plasmid contained in the microorganism does not contain a selectable marker gene expressed in the microorganism. A method for producing a protein, which comprises a gene encoding the protein or a gene that regulates the expression of the protein.
プラスミド導入微生物を培養し、培養物より選択マーカ
ー遺伝子を有しないプラスミドを回収することを特徴と
するプラスミドの製造方法。25. A method for producing a plasmid, which comprises culturing the plasmid-introduced microorganism according to any one of claims 10 to 18 and recovering a plasmid having no selectable marker gene from the culture.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7336707A JPH09173070A (en) | 1995-12-25 | 1995-12-25 | Plasmid, microorganism containing plasmid transduced thereinto, their production and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7336707A JPH09173070A (en) | 1995-12-25 | 1995-12-25 | Plasmid, microorganism containing plasmid transduced thereinto, their production and use thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09173070A true JPH09173070A (en) | 1997-07-08 |
Family
ID=18301967
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7336707A Pending JPH09173070A (en) | 1995-12-25 | 1995-12-25 | Plasmid, microorganism containing plasmid transduced thereinto, their production and use thereof |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH09173070A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002543834A (en) * | 1999-05-19 | 2002-12-24 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | Controlled evolution of microorganisms |
-
1995
- 1995-12-25 JP JP7336707A patent/JPH09173070A/en active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002543834A (en) * | 1999-05-19 | 2002-12-24 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | Controlled evolution of microorganisms |
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