JPH0912599A - γ−リベチンの分離精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 卵黄水溶性蛋白質溶液から、簡便に高純度の
γ−リベチンを連続的に得ることを目的とする。 【構成】 本発明法は、卵黄水溶性蛋白質溶液に０．７
〜３Ｍの濃度になるように塩を添加することで、γ−リ
ベチンを一時的に二量体もしくは凝集体にし、更に蛋白
質同士の会合を解離させることで膜分離する方法であ
る。本発明法により、γ−リベチンが既存の膜を使用し
て更に液性も中性付近において分離できるようになっ
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は既存の分離膜を用い抗体
活性を損なうことなく、卵黄水溶性蛋白質溶液中のγ−
リベチンを高純度でしかも効率良く分離精製する方法を
提供することを目的とする。

【０００２】

【従来の技術】鶏卵卵黄中には蛋白質が約20％含まれて
おり、卵黄脂質と結合したリポ蛋白質の状態や脂質と結
合していない水溶性蛋白質の状態で存在している。この
水溶性蛋白質の中には、リベチン、ホスビチン及びリボ
フラビン結合性蛋白質が含まれている。また、リベチン
はα−リベチン、β−リベチン及びγ−リベチンに分類
され、このγ−リベチンと血清中のγ−グロブリンＧは
免疫学的に同等であることが証明されている。しかし、
γ−リベチンは、兎等の哺乳類血清γ−グロブリンＧと
比較して、分子量(E.Orlans, Immunology,14, 61-67(19
68))や等電点(A.Polson et al., Immunol. Commun., 9,
495-514(1980)）等の蛋白化学的性質が異なるため、比
較免疫学の分野では別異のものとして扱われている。従
来、鶏卵中のγ−リベチンを分離精製する方法として次
のような方法が開示されている。卵黄中のリポ蛋白質を
カラギーナン、寒天、ファーセレラン、ペクチン及びキ
サンタンガムの内より選ばれた一種以上を加えて凝集さ
せ、その上清より水溶性蛋白質を得る方法（特開昭64-3
8098号）、同様にデキストラン硫酸とカルシウムイオン
を加える方法（J.C.Jensenius, J. Immunol. Methods,
46,63-68(1981)）、同様にポリエチレングリコールを加
える方法（A.Polson et al.,Immunological Communica
tions, 9(5), 495-514 (1980)）、同様にアルギン酸、
アルギン酸塩あるいはアルギン酸誘導体を加える方法
（特開昭63-215699 号）、同様にカゼインナトリウム水
溶液を加える方法（特開平6-116297）などがある。

【０００３】更に溶剤を使用する方法として、卵黄液を
遠心分離して得られた上清画分に、炭素数１〜４の第一
級アルコールから選ばれた少なくとも一種を加えること
によって生じた沈殿から、塩水溶液または緩衝液から選
ばれた一種を用い水溶性画分を得る方法（特開平3ー1455
00）、第二級アルコールを加え、生じた沈殿を緩衝液又
は塩水溶液に懸濁し不溶物を取り除くことで水溶性画分
を得る方法（特開平6ー329700）等があげられる。上記方
法で卵黄中の水溶性蛋白質溶液を得た後、水溶性蛋白質
溶液中のγ−リベチンは、血清蛋白質分画法と同様に塩
析法、アルコール沈澱法、ポリエチレングリコール法、
分別沈澱法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ
ー法を用いて精製されている。しかし、塩析法、アルコ
ール沈澱法、ポリエチレングリコール法、分別沈澱法は
蛋白質の変性による抗体の失活の恐れがあり、さらに、
ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法等のカラ
ムによる分離は設備面、コスト面等を考慮すると大量ス
ケールでの生産は困難である。

【０００４】また、蛋白質の分離方法として膜濾過の方
法も知られている。膜濾過による分離方法は操作が簡単
であるため大量スケールに適しており、更に物性の変化
を伴わないため非常に有効な手段であることが考えられ
る。通常、濾過膜の分離性能は、分画分子量によって表
される。しかし、実際夾雑蛋白質から目的の蛋白質を分
離する場合、その分離能は厳密なものではなく、蛋白質
分子の形やその他の性質により分離結果が異なると言わ
れている("蛋白質I"、日本生化学会編、第10章、東京化
学同人(1990)）。そのため、特に極めて分子量が近似す
る血漿蛋白質の分離などは非常に分離が難しく(S.Sakse
na and A.L.Zydney, Biotech. and Bioengineer., 46,
960-968(1994))、溶液のpHの調整を行ったり、特殊な膜
を使用することが必要となる。濾過膜を使用したグロブ
リンの分離精製技術として、特開昭56-81521号の既存の
高分子分離膜を用い、血清蛋白混合物溶液の全蛋白質濃
度及び塩濃度をそれぞれ４g/dl以下及び0.6 モル以下、
液性をpH3.8 ないし4.7 とし血清中のアルブミンとグロ
ブリンの分離をした報告や、特開平5-222091号の珪酸系
の特殊な多孔質ガラス膜を用いて血清中のアルブミンと
グロブリンを分離した報告がある。

【０００５】しかし、特開昭56-81521号ではアルブミン
とγ−グロブリンを既存の膜で分離するために溶液をpH
3.8 ないし4.7 の酸性領域に制御しないと効率の良い分
離が行えず、酸性側で不安定な(M.Shimizu et al., Bio
sci. Biotech. Biochem., 56(2),270-274(1992))γ−リ
ベチンはこの方法は活性を損なうため再現できない。更
に、この方法における溶液の塩濃度は0.6 Ｍ以下に調整
すると記されており、これを越える濃度ではアルブミン
とγ−グロブリンの分離は期待できず、又、塩濃度は蛋
白質が溶解している限り低ければ低いほど良いと記載さ
れている。本発明は塩を添加することによりγ−リベチ
ンが凝集することを利用して膜分離を行っており、従来
法における塩濃度の範囲では、凝集が起こらないため分
離が行えない。また、特許（特開平5-222091号）に開示
された方法では血漿中のアルブミンと二量体以上のγ−
グロブリンの分離は可能であるが、アルブミンと単量体
のγ−グロブリンの分離に関しては満足な結果が得られ
ていないという問題がある。更に、本発明はγ−リベチ
ンの分離方法であり、上記γ−グロブリンはγ−リベチ
ンと蛋白化学的性質が異なるため、従来の方法では同じ
ように分離することができない。

【０００６】

【発明が解決しようとしている課題】抗体を用いる場
合、高度に精製された抗体が必要とされる。しかし、市
販されている割卵機によって割卵された卵黄には卵白の
混入を避けることは難しく、この中に含まれるオボアル
ブミンはアレルゲン性の高い蛋白質である。このような
オボアルブミン等の夾雑蛋白質を除去し、γ−リベチン
の精度を高める方法として超遠心法、カラムによる分離
法等が知られているが、いずれも大量スケールでの製造
には適さない。また、分子量によって分離できる濾過膜
を用い特定の蛋白質を分離する技術もあるが、分子量が
近い蛋白質同士は会合等の影響があるため一般的に分離
は困難である(S.Saksena and A.L.Zydney, Biotech.and
Bioengineer., 46, 960-968(1994))。しかし、膜によ
る分離法は、他の分離法と比べて省エネルギー、低コス
ト、操作や操作性の簡便性が認められ、逆浸透法や限外
濾過法など液系の膜分離技術はすでに幅広い分野で実用
化されている。それ故、膜による分離精製法は安価でか
つ大量に処理するのに適しておりγ−リベチンを精製す
る方法としての利用が期待される。本発明は、前記卵黄
水溶性蛋白質溶液に塩を添加することで、膜によってγ
−リベチンを効率良く分離することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決しようとする手段】本発明は、卵黄水溶性
蛋白質溶液中のγ−リベチンを膜によって簡便に分離精
製する技術である。前記のように膜による蛋白質の分離
は、一般的に特殊な分離膜を用いたり、液性も特定の条
件下で行わないと効率の良い分離が行えないことが知ら
れている。しかし、本発明は、従来中性付近では分離す
ることが不可能であった既存の膜を使用して、γ−リベ
チンを分離する方法である。前記のように、溶液または
血清中に複数の蛋白質が含まれている場合、蛋白質同士
が複雑に会合しあい、巨大分子を作っていることが考え
られる。それ故、限外濾過膜ではγ−リベチン（分子量
180kDa）と夾雑蛋白質（分子量90kDa より低分子量）の
両者に分子量の差があっても分離できない。しかし、γ
−リベチンは、1.5 ＭのNaCl存在下で二量体として存在
する（A. Polson et al., Immunological Communicatio
ns, 9(5), 495-514(1980））。 このことは、哺乳類抗体とは異なり鳥類抗体特有の性質
である。卵黄水溶性蛋白質溶液中に塩を添加することで
γ−リベチンのみが二量体となり、水溶性蛋白質中に含
まれるα−リベチン、β−リベチンなどの蛋白質と分子
量に大きな差が生じる。本発明は、この分子量の差を利
用して、γ−リベチンのみを膜により分離精製すること
を特徴とする精製法である。この精製方法によって、割
卵時の混入が危惧される卵白由来のオボアルブミンのよ
うな蛋白質の除去も可能になる。

【０００８】本発明におけるγ−リベチン含有溶液と
は、従来技術であげた方法により得られた卵黄水溶性蛋
白質溶液、もしくは鶏卵又は卵黄の粉末を溶かした水溶
液のことをいう。本発明に用いられる塩の種類は特に限
定されないが、例えば、NaCl、KCl 、CaCl₂ 、MgCl₂ 、
NaH₂PO₄ 、Na₂HPO₄ 、Na₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₂S
O₄ 、(NH₄)₂SO₄ 、及びMgSO₄ より選ばれる群よりなる
１種以上のものが挙げられる。本発明における膜は、分
画分子量90〜500KDaの、好ましくは100 〜300KDaの膜で
ある。ここで、γ−リベチンと夾雑蛋白質との分離を効
果的に行う観点から、分画分子量は 90KDa以上500KDa以
下が好ましい。膜の種類は、分画分子量が上記の範囲の
ものであれば特に限定されるものではない。具体的に
は、例えば限外濾過膜、透析膜、逆浸透膜等が挙げられ
る。以上、具体的な操作について説明する。膜を用いて
の精製の際の塩濃度は0.7 〜3.0 Ｍであるが、より好ま
しくは1.5〜2.0 Ｍである。γ−リベチンが２量体にな
る観点から、塩濃度は0.7 Ｍ以上が好ましい。これは、
γ−リベチンが２量体となると、他の蛋白質との分子量
の差が大きくなり、分離が可能となるからである。ま
た、塩の添加量に対する分離効率の観点から、3.0 Ｍ以
下が好ましい。

【０００９】また、塩の添加の態様としては、塩そのも
のを添加してもよく、塩の水溶液を添加してもよい。膜
を用いて精製する際の塩添加溶液のpHは、5.0 〜11.0で
あるが、pH5.5 〜11.0が好ましく、pH7.5 〜9.0 がより
好ましく、pH8.0 〜9.0 が特に好ましい。蛋白質の変性
又は失活を抑える観点から、pH5.0 よりアルカリ性側が
好ましく、pH11.0より酸性側が好ましい。精製時の塩添
加溶液の水温は特に限定されないが、0 〜70℃が好まし
く、0 〜20℃がより好ましく、0 〜10℃が特に好まし
く、３〜６℃が最も好ましい。当該溶液が凍結するおそ
れがあり、そのため分離操作ができなくなるのを防ぐ観
点から水温は０℃以上が好ましく、γ−リベチンの活性
の失活を抑える観点から70℃以下が好ましい。

【００１０】また、より高純度のγ−リベチンを得るた
めに、透析液を連続的に加えて試料の液量を一定に保ち
ながら濾過を行うダイアフィルターレーション法を用い
て精製を行ってもよい。また、その場合の透析液は、上
記精製の際の塩濃度及びpH、温度のものが使用される。
例えば、10ｍＭリン酸綬衝液（１.5ＭのNaCl含有）pH8.
0 等が挙げられる。透析液の量は、卵黄水溶性蛋白質液
１重量部に対して透析液１重量部以上が好ましい。ただ
し、コスト等の問題により上記蛋白質液１重量部に対し
て５重量部以下が好ましい。かかるγ−リベチンは、特
に限定されることなく幅広い用途に用いられる。例え
ば、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、飼料、その他
抗体の通常用途に用いられることができるが、風味の点
で優れていることより食品に好適に用いることができ
る。本溶液の水温は０〜70℃が好ましく、更に好ましく
は０〜20℃、特に好ましくは０〜10℃、最も好ましくは
３〜６℃である。この範囲より低くなると本溶液が凍結
するため膜分離操作が出来なくなり、一方高くなるとγ
−リベチンの抗体活性が失活する。

【００１１】本発明は0.7 〜3.0 Ｍの塩を添加したこと
で、公知技術では不可能であった既存の膜を使用して、
さらに液性も中性付近においてγ−リベチンの分離を可
能にした。卵黄水溶性蛋白質溶液中には、γ−リベチ
ン、α−リベチン、β−リベチン、ホスビチン及びリボ
フラビン結合性蛋白質、更に卵白由来のオボアルブミン
などの蛋白質が含まれている。γ−リベチンの分子量は
約180kDa、α−リベチンの分子量は約90kDa 、β−リベ
チンの分子量は約42kDa 、オボアルブミンの分子量は約
46kDa 、ホスビチンの分子量は約36kDa 、リボフラビン
結合性蛋白質の分子量は約36kDa であるが、これらを含
有する卵黄水溶性蛋白質溶液は、分画分子量100kDaの限
外濾過膜を使用してもγ−リベチンと他の夾雑蛋白を分
離することが出来ない。これは、卵黄水溶性蛋白質中の
蛋白質同士が複雑に会合し合っているため、分子ふるい
を原理とする限外濾過膜では分離できない。しかし、本
発明法は、0.7 〜3.0 Ｍの塩を添加することで100kDaの
膜でも分離が可能となった。これは、単にγ−リベチン
が二量体となったことで他の蛋白質と分子量の差が大き
くなったために分離がし易くなったということだけでは
なく、驚くべきことに塩を添加することによって夾雑蛋
白質同士の会合が解離したことが考えられる。以下、本
発明についてより詳細に説明する。ただし、これらによ
って発明を制限するものではない。

【００１２】

【実施例】

実施例１ 特異抗体含有卵黄液の調製 特定抗原として、ストレプトコッカス・ミュータンス
MT8148（以下S.mutansと言う）菌体を用い、産卵鶏を免
疫した。抗原の調製はS.mutansを砂糖を５％含むブレイ
ンハートインフュージョン培地で増殖させ、3000×ｇ、
10分間の遠心分離操作で集菌後、菌体を生理食塩水で十
分に洗浄し、その1ml 当り約10⁸ 個のS.mutansが含まれ
るよう調製した。産卵鶏１羽に対しこの抗原１mlを一週
間に一度、合計４回筋肉注射した。最終の筋肉注射によ
り３ヶ月間にわたり、鶏卵を集め、その卵黄を分離し
た。卵黄はホモミキサーにより均質化し、この溶液を卵
黄液とした。得られた卵黄液１kgに対し１kgの水を加え
均質化し、そこに0.15％のλ−カラギーナン水溶液を４
kg加え撹拌後２時間静置した。静置後、濾過助剤を用い
た吸引濾過を行い約５kgの濾液を分取した。この時の濾
液のpHは6.5 であった。この濾液を卵黄水溶性蛋白質溶
液とした。

【００１３】実施例２ NaCl添加した時のγ−リベチン濃縮液の調製 実施例１の方法により得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１
リットルに、NaClを87.66g(1.5Ｍ) 添加して撹拌を行っ
た後、比較例１と同様に分画分子量100kDa又は300kDaの
限外濾過膜を使用して液量が200ml になるまで濃縮（５
倍濃縮）し、試料を得た。 比較例１ γ−リベチン濃縮液の調製 実施例１の方法により得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１
リットルを、分画分子量100kDa又は300kDaの限外濾過膜
（膜面積：3,500cm²、材質：ポリエーテルスルフォン、
ミニセットシステム（富士フィルター工業））を使用し
て液量が200mlになるまで濃縮（５倍濃縮）し、試料を
得た。

【００１４】試験例１ γ−リベチンの濃縮効果の比較 比較例１及び実施例２で得られた各試料中のγ−リベチ
ン量は、SRID（一元放射免疫拡散）法(G.Mancini et a
l., Immunochemistry, 2, 235(1965)）を用い、抗ニワ
トリIgＧウサギ血清（コスモバイオ）を４％加えた２％
寒天プレート上にできる沈降輪の大きさを測定してγ−
リベチン濃度を求め、その値に溶液の体積量を乗じて求
めた。更に、比較例１及び実施例１で得られた各試料中
の蛋白質量は、Lowly 法(M.K.Markwell et al., Anal.
Biochem., 87, 206(1978))を用いて濃度を求め、その値
に溶液の体積量を乗じて求めた。このγ−リベチンと蛋
白質量を用い、γ−リベチンの純度（％）は次式 と定義した。又、γ−リベチンの回収率を と定義した。比較例１と実施例２で得られた各試料中の
γ−リベチンの純度と回収率を求めた結果を表１に示
す。

【００１５】

【表１】

【００１６】表１より明らかなように、塩無添加の場
合、分画分子量100kDaの膜では、γ−リベチンの回収率
は良かったが純度は濃縮の前後でほとんど変わらず、濃
縮出来ないことが示唆された。また、分画分子量300kDa
の膜を使用したときは、回収率も純度も低い値であり、
このことから夾雑蛋白質と一緒にγ−リベチンも膜を通
り抜けてしまい濃縮できないことが示唆された。しかし
NaCl添加の場合は分画分子量100kDa,300kDa のどちらの
膜を使用しても、γ−リベチンの回収率もよく更に濃縮
後のγ−リベチンの純度も約40％を越えており、濃縮可
能であることが示された。 実施例３ 様々な膜を用いたγ−リベチン精製液の調製 更に純度の高いγ−リベチンを得るため、透析液を連続
的に加えて試料の液量を一定に保ちながら濾過を行うダ
イアフィルトレーション法を用いた。ダイアフィルトレ
ーション用の透析液には1.5 ＭのNaCl水溶液を用いた。
実施例２と同様に卵黄水溶性蛋白質溶液１リットルにNa
Clを87.66g(1.5Ｍ) 添加した後、分画分子量100kDaの限
外濾過膜を用い、10リットル（卵黄水溶性蛋白質溶液に
対して10倍量）の透析液によりダイアフィルトレーショ
ンを行い１リットルの試料を得た。又、膜の種類による
精製効率を調べるため、上記同様の方法で分画分子量30
0kDaの限外濾過膜、透析膜、逆浸透膜、それぞれの膜を
使用してダイアフィルトレーションを行い各１リットル
の試料を得た。更に透析液量に対する純度を調べるた
め、各試料に加えた透析液量が１、２、５、８、10リッ
トルの時の卵黄水溶性蛋白質溶液を採取し試料とした。 試験例２ 膜の種類による精製効率の比較 実施例３で得られた試料を用い、試験例１に従ってγ−
リベチンの純度を測定した。その結果を表２で示す。

【００１７】

【表２】

【００１８】表２より明らかなように、分画分子量100k
Da及び300kDaの限外濾過膜どちらを使用しても、10リッ
トル（卵黄水溶性蛋白質溶液に対して10倍量）の透析液
を用いて精製を行えば、純度が約80％のγ−リベチン精
製液が得られることが示された。更に透析膜や逆浸透膜
による精製は、限外濾過膜と比較して精製効率は下回る
が、1.5 Ｍの濃度になるようNaClを添加していれば可能
であることが示された。 試験例３ 特異抗体活性回収率の比較 実施例１により得られた卵黄水溶性蛋白質溶液と、実施
例3により得られたγ−リベチン精製液のS.mutansに対
する特異的抗体力価を、酵素免疫測定法（以下ELISA 法
という）により測定し特異抗体活性回収率の比較を行っ
た。各試料液を100 μl ／ウエルの割合で、抗原として
用いたS.mutansを固相へコーティングしたELISA プレー
ト(96 穴, ヌンク社製) へ添加し、25℃、２時間静置す
ることにより、抗原と特異的抗体の反応を行った。各ウ
エルをPBS-Tween で充分洗浄した後、抗ニワトリIgG ウ
サギIgG −アルカリホスファターゼコンジュゲート（ザ
イメット社）のPBS-Tween 希釈液(2000 倍) を100 μl
/ ウエルの割合で添加した。25℃で１時間放置すること
により、抗原と反応した特異的抗体と上記コンジュゲー
トの反応を行った。各ウエルをPBS-Tween で充分洗浄し
た後、0.1% P−フェニルジソジウムホスフェート溶液
(0.1Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液pH9.6 に溶解）を基質とし
て100 μl ／ウエルの割合で添加し、25℃、15分間酵素
反応を行った。反応の停止は２Ｍ水酸化ナトリウム溶液
を50μl ／ウエル添加することにより行い、405nm にお
ける各ウエルの吸光度をプレートリーダーにより測定し
た。なお、対照としては試料の代わりにPBS-Tween を用
いた。各試料につき、４ウエルを用いた。各試料の示す
吸光度の平均値から対照の示す吸光度を引き、それぞれ
の試料重量を乗じた値（総吸光度）を各試料の総抗体活
性とした。実施例１により得られた処理前の卵黄水溶性
蛋白質溶液と実施例３により得られたγ−リベチン精製
液は、ほぼ同じ抗体活性が得られた。それ故、本発明法
による抗体活性の失活はないことが示された。

【００１９】試験例４ 各pHによる抗体活性の安定性と精製効率の比較 実施例１の方法で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１リッ
トルにHCl もしくはNaOHを数適添加して、pH3.0 、4.0
、4.5 、5.0 、5.5 、6.0 、6.5 、7.0 、7.5 、8.0
、8.5 、9.0 、10.0、11.0、12.0の各溶液を調整し
た。各溶液の特異抗体活性の安定性を試験例３の方法で
測定し、液性を調整する前の抗体活性を100%として調整
後の抗体活性を求めた。その結果を表３で示す。

【００２０】

【表３】

【００２１】表３より明らかなように、液性がpH5からp
H11の範囲内では特異抗体活性はほとんど失活しない
が、この範囲外では失活することが確認された。更に調
整した各溶液を１リットル用いて、実施例２と同様にNa
Clを87.66g(1.5Ｍ) 添加し、分画分子量300kDaの限外濾
過膜により各溶液の濃縮を行い200ml(５倍濃縮）の試料
を得た。得られた試料中のγ−リベチンの純度は試験例
１の方法を用いて求めた。その結果を表３で示す。その
結果、液性がpH5.5 からpH6.5 もしくはpH7.5 からpH9.
0 の範囲の時、γ−リベチンの純度は中性付近の液性で
分離するより上昇した。また、最も精製効率が良かった
のは液性をpH８に調整したときであった。 試験例５ 液性をpH８にした時の精製効率 実施例１で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１リットルに
NaClを87.66g(1.5Ｍ)添加した後、３ＮNaOHを用い溶液
がpH８になるように調整した。調整した溶液を用い、実
施例２と同様に分画分子量300kDaと100kDaの限外濾過膜
を使用しγ−リベチン分離精製を行った。精製時に用い
る透析液には1.5 ＭのNaClを含んだpH８の20ｍＭリン酸
緩衝液５リットルを用い、試料に加えた透析液量が１、
２、５リットルの時の卵黄水溶性蛋白質溶液を採取し試
料とした。得られた各試料を用い、試験例１に従ってγ
−リベチンの純度を測定した。その結果を表４で示す。

【００２２】

【表４】

【００２３】pH無調整の時、γ−リベチンの純度を約80
％にするためには透析液を10リットル必要としたが、表
４より明らかなように液性をpH８に調整した時、同レベ
ルの精製液は透析液を２リットル用いれば得られ、この
ことより濃縮効率が約５倍良くなったことが示された。
又、pH８の条件で透析液を５リットル用いて精製を行う
と、分画分子量300kDaと100kDaの限外濾過膜のどちらで
も純度98％以上のγ−リベチンが得られることが示唆さ
れた。更に、本方法でで得られたγ−リベチンの精製液
をゲル濾過法（カラム：superdex200HR 10/30(Pharmaci
a)、移動相：50mMリン酸緩衝液(0.05 Ｍ Na₂HPO₄ , 1.5
Ｍ NaCl ,pH8.0) ）により分析した結果、γ−リベチン
は二量体として存在することが確認された。又、このγ
−リベチン精製液１リットルに水を約５リットル加え脱
塩を行い、得られた水溶液を同様のゲル濾過法で分析し
た結果、γ−リベチンは単量体に戻ることが示唆され
た。 比較例２ 従来法による精製γ−リベチンの調製 実施例１で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１リットルに
170g（17％W/V)の硫酸ナトリウムを添加して塩析物を20
ｍＭのリン酸緩衝液pH8.0 に溶解し、DEAE-Sepharoseカ
ラムによりγ−リベチンのみを吸着させた後、 200ｍＭ
のリン酸緩衝液をカラムに流しγ−リベチンを溶出し
て、精製γ−リベチン液とした。

【００２４】試験例６ 従来法との特異抗体活性の回収率比較 試験例５で得られた本発明によるγ−リベチン精製液と
比較例２で得られた精製γ−リベチン液を試験例3に従
い総特異抗体活性を測定し、精製前の卵黄水溶性蛋白質
溶液の総特異抗体活性を100%として特異抗体活性の回収
率を算出した。その結果、比較例２による精製γ−リベ
チン液には特異抗体活性の回収率が83％であったが、試
験例５で得られた本発明によるγ−リベチン精製液で
は、特異抗体活性は98％回収できた。これは、従来法の
比較例２では、塩析によってγ−リベチンが変性し、活
性が損なわれたが、本発明の試験例５の方法では、全く
活性が損なわれなく、活性を維持したγ−リベチンを得
ることに成功したためと考えられる。 試験例７ 精製に用いる塩の種類と濃度の影響 実施例１で得られた卵黄水溶性蛋白質溶液１リットル
に、NaCl、KCl 、CaCl₂、 MgCl₂、NaH₂PO₄ 、Na₂HP
O₄ 、KH₂PO₄、K₂HPO₄、Na₂SO₄、(NH₄)₂SO₄ 、MgSO₄、K₂
SO₄ より選ばれる一種または二種以上の塩を0.6 〜4.0
Ｍの濃度となるように添加し攪拌した。この溶液を用
い、実施例２の方法により分画分子量300kDaの限外濾過
膜でγ−リベチンを精製した。その結果、全ての塩につ
いて、塩の添加が0.7 Ｍ以上でγ−リベチンの精製が可
能であった。又、全ての塩について、塩の添加が3.0 Ｍ
以上であってもγ−リベチンの分離効率の向上が認めら
れなかったため、0.7 Ｍ〜3.0 Ｍの塩濃度が有効である
と考えられる。

【００２５】本発明の実施態様ならびに目的生成物を挙
げれば以下の通りである。 （１）γ−リベチン含有溶液に0.7 〜3.0 Ｍの濃度にな
るように塩を添加し、液性をpH5.0 〜11.0とし、分画分
子量90〜500kDaの膜を用いて精製することを特徴とする
γ−リベチンの分離精製法。 （２）膜が限外濾過膜である前記(1) 記載のγ−リベチ
ンの分離精製法。 （３）膜が透析膜である前記(1) 記載のγ−リベチンの
分離精製法。 （４）膜が逆浸透膜である前記(1) 記載のγ−リベチン
の分離精製法。 （５）膜の孔径が0.006 μｍより大きく0.01μｍ未満で
ある前記（１）記載のγ−リベチンの分離精製法。 （６）塩がNaCl、KCl 、CaCl₂ 、MgCl₂ 、NaH₂PO₄ 、Na
₂HPO₄ 、KH₂PO₄、K₂HPO₄より選ばれる１種又は２種以上
である前記（１）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。 （７）塩がNaCl、KCl 、CaCl₂ 、MgCl₂ 、NaH₂PO₄ 、Na
₂HPO₄ 、KH₂PO₄、K₂HPO₄より選ばれる１種又は２種以上
である前記（２）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。 （８）塩がNaCl、KCl 、CaCl₂ 、MgCl₂ 、NaH₂PO₄ 、Na
₂HPO₄ 、KH₂PO₄、K₂HPO₄より選ばれる１種又は２種以上
である前記（３）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。 （９）塩がNaCl、KCl 、CaCl₂ 、MgCl₂ 、NaH₂PO₄ 、Na
₂HPO₄ 、KH₂PO₄、K₂HPO₄より選ばれる１種又は２種以上
である前記（４）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。

【００２６】（１０）塩がNa₂SO₄、(NH₄)₂SO₄ 、MgS
O₄ 、K₂SO₄ より選ばれる１種又は２種以上である前記
（１）記載のγ−リベチンの膜分離精製法。 （１１）塩がNa₂SO₄、(NH₄)₂SO₄ 、MgSO₄ 、K₂SO₄ より
選ばれる１種又は２種以上である前記（２）記載のγ−
リベチンの膜分離精製法。 （１２）塩がNa₂SO₄、(NH₄)₂SO₄ 、MgSO₄ 、K₂SO₄ より
選ばれる１種又は２種以上である前記（３）記載のγ−
リベチンの膜分離精製法。 （１３）塩がNa₂SO₄、(NH₄)₂SO₄ 、MgSO₄ 、K₂SO₄ より
選ばれる１種又は２種以上である前記（４）記載のγ−
リベチンの膜分離精製法。 （１４）塩がNaClである前記（１）記載のγ−リベチン
の膜分離精製法。 （１５）塩がNaClである前記（２）記載のγ−リベチン
の膜分離精製法。 （１６）塩がNaClである前記（３）記載のγ−リベチン
の膜分離精製法。 （１７）塩がNaClである前記（４）記載のγ−リベチン
の膜分離精製法。

【００２７】

【発明の効果】本発明は、鳥類由来抗体の利点を最大限
に生かし、初めて簡便に高純度のγ−リベチンを連続的
に得ることを可能にした製造法を与えるものである。従
来純度の高い抗体は少量しか利用できなかったが、本発
明において今後、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、
飼料、その他抗体の通常用途に用いられる分野において
純度の高い抗体を大量に供給でき、各種産業への貢献は
大きい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 藤木 優 三重県四日市市赤堀新町９番５号 太陽化 学株式会社内 (72)発明者 金 武祚 三重県四日市市赤堀新町９番５号 太陽化 学株式会社内 (72)発明者 山崎 長孝 三重県四日市市赤堀新町９番５号 太陽化 学株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 γ−リベチン含有溶液に０．７〜３．０
   Ｍの濃度になるように塩を添加した後、液性をpH 5.0〜
   11.0として、分画分子量90〜500kDaの膜を用いて精製す
   ることを特徴とするγ−リベチンの分離精製法。
2. 【請求項２】 膜が限外濾過膜である請求項１記載のγ
   −リベチンの分離精製法。
3. 【請求項３】 塩がＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ₂ 、Ｍ
   ｇＣｌ₂ 、ＮａＨ₂ＰＯ₄ 、Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ 、ＫＨ₂ Ｐ
   Ｏ４₄ 、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ より選ばれる１種又は２種以上で
   ある請求項１記載のγ−リベチンの膜分離精製法。