JPH0912598A - Separation and purification of hemoglobin - Google Patents
Separation and purification of hemoglobinInfo
- Publication number
- JPH0912598A JPH0912598A JP7163599A JP16359995A JPH0912598A JP H0912598 A JPH0912598 A JP H0912598A JP 7163599 A JP7163599 A JP 7163599A JP 16359995 A JP16359995 A JP 16359995A JP H0912598 A JPH0912598 A JP H0912598A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hemoglobin
- substance
- liquid
- complex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ヘモグロビンの分離精
製方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for separating and purifying hemoglobin.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ヘモグロビンは、血色素として酸素運搬
にあずかる、ヘムとグロビンから構成される複合糖蛋白
質であり、古くから、生理学、生化学、分子生物学の分
野で最もよい研究素材の一つとして用いられてきてい
る。また、ヘモグロビンは、臨床検査化学の分野では、
種々の病態把握のための検査項目として広く測定されて
おり、治療医学の分野では、代替人工赤血球の材料とし
ても用いられるようになってきている。そのため、この
ように、利用価値の高いヘモグロビンを血液から簡単
に、高収率で得る技術が望まれている。Background Art Hemoglobin is a complex glycoprotein composed of heme and globin that participates in oxygen transport as a hemoglobin, and has been one of the best research materials in the fields of physiology, biochemistry and molecular biology since ancient times. Has been used. Hemoglobin is also used in the field of clinical laboratory chemistry,
It has been widely measured as a test item for grasping various pathological conditions, and has come to be used as a material for substitute artificial red blood cells in the field of therapeutic medicine. Therefore, a technique for obtaining hemoglobin having a high utility value from blood in a simple manner at high yield is desired.
【０００３】従来、ヘモグロビンの分離精製は、血液を
遠心分離等の処理によって、血球と血漿成分に分離し、
数度の遠心洗浄の後、低張塩処理などによって赤血球を
溶血させ、その後に、アルコール分画、電気泳動法、カ
ラムクロマトグラフィー法等の通常の蛋白質の分離精製
方法が採られてきた。例えば、特開昭５９−１８３３７
０号公報には、赤血球を等張塩化ナトリウム（ＮａＣ
ｌ）溶液で洗浄後、溶血させて四塩化炭素あるいは、ト
ルエンで脂質及び細胞残留物を除去する方法が開示され
ているが、このような方法は、非常に時間がかかり、熟
練を要するものであり、また収率もよくないものであっ
た。Conventionally, hemoglobin has been separated and purified by separating blood into blood cells and plasma components by a process such as centrifugation.
After centrifuging and washing several times, erythrocytes are hemolyzed by hypotonic salt treatment and the like, and then, ordinary protein separation and purification methods such as alcohol fractionation, electrophoresis and column chromatography have been adopted. For example, JP-A-59-18337
No. 0 publication describes red blood cells as isotonic sodium chloride (NaC).
l) A method of removing lipids and cell residues with carbon tetrachloride or toluene by washing with a solution and then hemolyzing is disclosed, but such a method is very time-consuming and requires skill. However, the yield was not good.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
欠点を解決するものであり、その目的は、従来よりも、
短時間で、簡単に、高収率で血液等から、ヘモグロビン
を分離精製する方法を提供することにある。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention solves the above-mentioned conventional drawbacks, and its object is
An object of the present invention is to provide a method for separating and purifying hemoglobin from blood or the like in a short time, easily and with high yield.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明は、ヘモグロビン
の２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対して結合
性を有する物質とヘモグロビン含有液とを、ｐＨ５．０
〜６．８の液体中で接触させて、該物質にヘモグロビン
が結合された水不溶性の複合体を生成させる工程、該複
合体を該液体から分離する工程、及び、分離された複合
体をｐＨ７．０〜１０．０の液体に接触させるか、又は
電気伝導度６．５ｍＳ／ｃｍ以上の液体に接触させて、
該物質とヘモグロビンを解離させる工程からなることを
特徴とするヘモグロビンの分離精製方法である。According to the present invention, a substance having a binding property to a 2,3-diphosphoglyceric acid pocket of hemoglobin and a hemoglobin-containing solution are adjusted to pH 5.0.
Contacting in a liquid of ˜6.8 to form a water-insoluble complex in which hemoglobin is bound to the substance, separating the complex from the liquid, and separating the complex from pH 7 .0 to 10.0, or a liquid having an electric conductivity of 6.5 mS / cm or more,
A method for separating and purifying hemoglobin, comprising the step of dissociating the substance and hemoglobin.
【０００６】本発明の第１の工程は、ヘモグロビンの
２，３−ジホスホグリセリン酸ポケットに対して結合性
を有する物質とヘモグロビン含有液とを、ｐＨ５．０〜
６．８の液体中で接触させて、該物質にヘモグロビンが
結合された水不溶性の複合体を生成させる工程である。In the first step of the present invention, a substance having a binding property to the 2,3-diphosphoglyceric acid pocket of hemoglobin and a hemoglobin-containing solution are adjusted to pH 5.0 to 5.0.
The step of contacting in a liquid of 6.8 to form a water-insoluble complex in which hemoglobin is bound to the substance.
【０００７】上記の、ヘモグロビンの２，３−ジホスホ
グリセリン酸ポケットについて説明する。ヘモグロビン
は、一般に、図１の模式図に示されるような、２つのα
鎖と２つのβ鎖からなる４量体構造をしており、β鎖の
会合部に２，３−ジホスホグリセリン酸が結合する部位
が存在しており、この部位は２，３−ジホスホグリセリ
ン酸ポケット（以下、ＤＰＧポケットという）と呼ばれ
ている。ＤＰＧポケットは、図１にアミノ酸残基につけ
たＮ末端からの通し番号で示したように、ヘモグロビン
のβ鎖のヒスチジン、リジンなどの塩基性アミノ酸残
基、及びβ鎖Ｎ末端バリンによって形成されるカチオン
性を帯びた部位であり、アニオン性の物質を結合し易
い。血液中の２，３−ジホスホグリセリン酸は、このＤ
ＰＧポケットに結合することにより、ヘモグロビンの酸
素解離能をアロステリックに調節していることが知られ
ている（今井清博、蛋白質、核酸、酵素、Vol.32 No.
6,81-88,1987 ）。The above-mentioned 2,3-diphosphoglyceric acid pocket of hemoglobin will be described. Hemoglobin generally consists of two αs, as shown in the schematic diagram of FIG.
It has a tetrameric structure consisting of a chain and two β chains, and there is a site to which 2,3-diphosphoglyceric acid binds at the β chain association site. It is called a glyceric acid pocket (hereinafter referred to as a DPG pocket). The DPG pocket is a cation formed by a basic amino acid residue such as histidine and lysine in the β chain of hemoglobin and a β chain N-terminal valine, as shown by a serial number from the N terminus attached to the amino acid residue in FIG. It is a sexually charged site and easily binds an anionic substance. 2,3-diphosphoglyceric acid in blood is
It is known that the oxygen dissociation ability of hemoglobin is regulated allosterically by binding to the PG pocket (Kiyohiro Imai, Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Vol.32 No.
6,81-88,1987).
【０００８】本発明で用いられる、ＤＰＧポケットに対
して結合性を有する物質とは、ＤＰＧポケットに対して
結合性を有する化合物（以下、ＤＰＧポケットに対して
結合性を有する化合物のことを、ＤＰＧポケット結合性
化合物という）が担持された担体、または、ＤＰＧポケ
ットに対して結合性を有する高分子化合物である。The substance having a binding property to the DPG pocket used in the present invention means a compound having a binding property to the DPG pocket (hereinafter, a compound having a binding property to the DPG pocket is referred to as DPG). A carrier carrying a pocket-binding compound) or a polymer compound having a binding property to a DPG pocket.
【０００９】上記のＤＰＧポケット結合性化合物として
は、特開昭６３−２９８０６３号公報や特開平２−２５
９４６号公報に不安定型糖化ヘモグロビン解離剤として
記載されているものが挙げられ、例えば、リン酸縮合
体、フィチン酸およびフィチン酸塩のような多価リン酸
化合物が挙げられる。As the above-mentioned DPG pocket-binding compound, there are disclosed in JP-A-63-298063 and JP-A-2-25.
Examples of the unstable glycated hemoglobin dissociating agent described in Japanese Patent No. 946 include polyphosphoric acid compounds such as phosphoric acid condensates, phytic acid, and phytate salts.
【００１０】リン酸縮合体としては、（ＨＰＯ3 ）
n （ｎは２以上の整数）で表されるメタリン酸、２原子
以上のリン原子を含みＰ−Ｏ−Ｐ結合を有するポリリン
酸またはそれらの類似体が挙げられる。メタリン酸とし
ては、トリメタリン酸、テトラメタリン酸などが、ポリ
リン酸としては、ピロリン酸、テトラポリリン酸、など
が挙げられる。As the phosphoric acid condensate, (HPO 3 )
Examples include metaphosphoric acid represented by n (n is an integer of 2 or more), polyphosphoric acid containing 2 or more phosphorus atoms and having a P-O-P bond, or an analog thereof. Examples of metaphosphoric acid include trimetaphosphoric acid and tetrametaphosphoric acid, and examples of polyphosphoric acid include pyrophosphoric acid and tetrapolyphosphoric acid.
【００１１】また、ＤＰＧポケット結合性化合物として
は、他に、特開平６−３３１６２９号公報に不安定型糖
化ヘモグロビン解離剤として記載されているものが挙げ
られ、例えば、アンモニア、１級アミンまたは２級アミ
ンの窒素原子に結合した少なくとも一つの水素原子がメ
チレンホスホン酸基（−ＣＨ2 ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換され
てなる化合物が挙げられる。上記アミンとしては、種々
のアルキルモノアミンやアミノ酸、直鎖アルキレンジア
ミン、ジアミノシクロヘキサン、ジエチレントリアミ
ン、トリエチレンテトラアミン、グリコールエーテルジ
アミン等が挙げられる。また、上記分子中の水素原子が
アルキル基、水酸基などに置換された化合物、例えばエ
チレンジアミンの１置換体として、水素原子がメチル基
に置換されて得られる１，２−ジアミノプロパン、プロ
ピレンジアミンの１置換体として、２の位置の炭素に結
合する水素原子が水酸基に置換された１，３−ジアミノ
−２−プロパノール等が挙げられる。Other examples of the DPG pocket-binding compound include those described as an unstable glycated hemoglobin dissociator in JP-A-6-331629, and examples thereof include ammonia, primary amines or secondary amines. A compound obtained by substituting at least one hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of amine with a methylenephosphonic acid group (—CH 2 PO 3 H 2 ). Examples of the amine include various alkylmonoamines, amino acids, linear alkylenediamines, diaminocyclohexane, diethylenetriamine, triethylenetetraamine, glycol etherdiamines, and the like. Further, a compound in which a hydrogen atom in the molecule is substituted with an alkyl group, a hydroxyl group or the like, for example, a monosubstituted product of ethylenediamine, 1,2-diaminopropane obtained by substituting a hydrogen atom with a methyl group, or 1 of propylenediamine is obtained. Examples of the substituent include 1,3-diamino-2-propanol in which a hydrogen atom bonded to the carbon at the 2 position is substituted with a hydroxyl group.
【００１２】前記のメチレンホスホン酸基置換体の製造
方法は、古くから種々の方法が知られているが、例え
ば、Irani,R,R 等、J.Org.Chem.31,1603(1966)によって
開発された方法が挙げられる。この方法は、アミン、ホ
ルマリン、及び亜リン酸のMannich 反応を利用したもの
であり、ホスホン酸誘導体の合成方法として優れた方法
である。また、Motekaitis,R.J. 等、J.inorg.nucl.Che
m.33,3353(1971) によって開発された方法も該置換体の
製造方法として利用できる。この方法は、クロロメチレ
ンホスフィン酸を用いて、まずアミノ基の水素原子をメ
チレンホスフィン酸に置換し、続いて塩化水銀を加えて
加熱し、メチレンホスフィン酸をメチレンホスホン酸に
酸化する方法であり、得られるメチレンホスホン酸置換
体の純度も高く好ましい方法である。Various methods have been known for a long time as the method for producing the above-mentioned methylenephosphonic acid group-substituted compound. For example, according to Irani, R, R, J. Org. Chem. 31, 1603 (1966). The method developed is mentioned. This method utilizes the Mannich reaction of amine, formalin, and phosphorous acid, and is an excellent method for synthesizing a phosphonic acid derivative. Also, Motekaitis, RJ, J.inorg.nucl.Che
The method developed by m.33, 3353 (1971) can also be used as a method for producing the substitution product. This method is a method in which chloromethylenephosphinic acid is used to first replace the hydrogen atom of the amino group with methylenephosphinic acid, and then mercury chloride is added and heated to oxidize methylenephosphinic acid to methylenephosphonic acid. This is a preferred method because the obtained methylenephosphonic acid-substituted product has high purity.
【００１３】本発明で用いられる担体とは、前述のＤＰ
Ｇポケット結合性物質を固定化し得る、種々の水溶性ポ
リマーや、従来から生化学分野で担体として使用されて
きた種々の水不溶性物質が挙げられる。The carrier used in the present invention is the above-mentioned DP.
Examples include various water-soluble polymers capable of immobilizing G-pocket binding substances, and various water-insoluble substances conventionally used as carriers in the biochemical field.
【００１４】上記の水溶性ポリマーとしては、例えば、
ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びその塩、ポ
リアミノ酸等が挙げられる。The above water-soluble polymer is, for example,
Examples thereof include polyvinyl alcohol, polyacrylic acid and salts thereof, polyamino acid and the like.
【００１５】上記の水不溶性物質としては、例えば、架
橋デキストランや架橋アガロースのようなクロマトグラ
フィー用担体として使用されてきたもの；ポリスチレン
ビーズのようなポリマービーズ；ガラスビーズ；ポリス
チレンラテックスのようなラテックス粒子等が挙げられ
る。Examples of the above water-insoluble substances that have been used as chromatographic carriers such as crosslinked dextran and crosslinked agarose; polymer beads such as polystyrene beads; glass beads; latex particles such as polystyrene latex Etc.
【００１６】担体にＤＰＧポケット結合性化合物を担持
させる方法は、ＤＰＧポケット結合性物質または水溶性
ポリマーもしくは水不溶性担体の種類に応じて、従来の
種々の方法が利用できる。例えば、前述のＤＰＧポケッ
ト結合性物質または水溶性ポリマーもしくは水不溶性担
体のいずれか一方の水酸基をブロモシアンで活性化し、
他方のアミノ基と反応させる方法や、両方のアミノ基を
グルタルアルデヒドで架橋する方法や、いずれか一方の
カルボキシル基と他方のアミノ基とを水溶性カルボジイ
ミドのような試薬で縮合させる方法等の化学結合法が挙
げられる。また、水不溶性担体の場合、ＤＰＧポケット
結合性物質を予めアルブミンなどの蛋白質に前記化学結
合法により結合し、この結合物を水不溶性担体に物理吸
着させることもできる。As a method for supporting the DPG pocket-binding compound on the carrier, various conventional methods can be used depending on the type of the DPG pocket-binding substance, the water-soluble polymer or the water-insoluble carrier. For example, the hydroxyl group of either the above-mentioned DPG pocket binding substance or water-soluble polymer or water-insoluble carrier is activated with bromocyan,
Chemistry such as a method of reacting with the other amino group, a method of crosslinking both amino groups with glutaraldehyde, a method of condensing one of the carboxyl groups and the other amino group with a reagent such as a water-soluble carbodiimide, etc. The coupling method can be mentioned. In the case of a water-insoluble carrier, a DPG pocket-binding substance may be previously bound to a protein such as albumin by the above-mentioned chemical binding method, and the bound product may be physically adsorbed on the water-insoluble carrier.
【００１７】また、本発明で用いられる、ＤＰＧポケッ
トに対して結合性を有する高分子化合物とは、１級アミ
ンまたは２級アミンを有するポリマー、例えばポリアリ
ルアミンやポリリジンなどのポリマーの窒素原子に結合
した少なくとも一つの水素原子がメチレンホスホン酸基
（−ＣＨ2 ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換された構造の高分子化合
物やビニルホスホン酸のようなホスホン基を有するモノ
マーの重合体が挙げられる。上記の１級アミンまたは２
級アミンを有するポリマーの窒素原子に結合した少なく
とも一つの水素原子がメチレンホスホン酸基（−ＣＨ2
ＰＯ3 Ｈ2 ）に置換された構造の高分子化合物の製造方
法は、１級または２級アミンを有するポリマーを直接前
述のような反応を介してメチルホスホン化する方法が挙
げられる。Further, the polymer compound having a binding property to the DPG pocket used in the present invention is a polymer having a primary amine or a secondary amine, for example, a nitrogen atom of a polymer such as polyallylamine or polylysine. at least one hydrogen atom may be mentioned polymers of a monomer having a phosphonic group, such as a polymer compound or vinylphosphonic acid substituted structure methylene phosphonic acid group (-CH 2 PO 3 H 2) is. The above primary amine or 2
At least one hydrogen atom bonded to the nitrogen atom of the polymer having a primary amine has a methylenephosphonic acid group (-CH 2
Examples of the method for producing a polymer compound having a structure substituted with PO 3 H 2 ) include a method in which a polymer having a primary or secondary amine is directly methylphosphonized through the reaction as described above.
【００１８】ヘモグロビンのＤＰＧポケットに対して結
合性を有する上述したような種々の物質は、多価のリン
酸基やホスホン酸基というアニオン性官能基を有するた
め、カチオン性を帯びたＤＰＧポケットに結合すること
ができる。この結合は、イオン相互作用によって生じて
いるため、上記のＤＰＧポケットに対して結合性を有す
る物質（以下、ＤＰＧポケットに対して結合性を有する
物質のことを、ＤＰＧポケット結合性物質という）とヘ
モグロビンの反応は、後述の実施例から明らかなよう
に、反応溶液のｐＨやイオン強度に強く影響を受ける。Since various substances as described above having the binding property to the DPG pocket of hemoglobin have anionic functional groups such as polyvalent phosphoric acid group and phosphonic acid group, they have a cationic DPG pocket. Can be combined. Since this bond is generated by ionic interaction, the substance has a binding property to the DPG pocket (hereinafter, the substance having a binding property to the DPG pocket is referred to as a DPG pocket binding substance). The reaction of hemoglobin is strongly affected by the pH and ionic strength of the reaction solution, as will be apparent from the examples described below.
【００１９】本発明においてＤＰＧポケット結合性物質
とヘモグロビン含有液とを接触させて、該物質にヘモグ
ロビンが結合された水不溶性の複合体を生成させる工程
は、反応の媒体である液体のｐＨが５．０〜６．８の範
囲で行われる。ｐＨが５．０よりも低くなると、蛋白質
の変性により、ヘモグロビン以外の蛋白質が不純物とし
て混入する恐れが有り、６．８より高くなると、ヘモグ
ロビンとの結合反応が極度に低下する。In the present invention, the step of bringing the DPG pocket-binding substance into contact with a hemoglobin-containing liquid to form a water-insoluble complex in which hemoglobin is bound to the substance, the pH of the reaction medium liquid is 5 It is performed in the range of 0.0 to 6.8. If the pH is lower than 5.0, proteins other than hemoglobin may be mixed as impurities due to protein denaturation, and if it is higher than 6.8, the binding reaction with hemoglobin is extremely reduced.
【００２０】上記の反応の媒体である液体としては、水
でもよいが、より好ましくは、５．０〜６．８のｐＨの
範囲で緩衝能を有するリン酸緩衝液や、クエン酸緩衝
液、フタル酸緩衝液等が好適である。The liquid as the medium for the above reaction may be water, but more preferably, a phosphate buffer solution having a buffering capacity in the pH range of 5.0 to 6.8, a citrate buffer solution, Phthalate buffer is suitable.
【００２１】本工程に用いられるヘモグロビン含有液と
は、例えば、血液の溶血液など、ヘモグロビンを含む溶
液であれば種類を問わない。The hemoglobin-containing liquid used in this step may be of any type as long as it is a solution containing hemoglobin, such as hemolyzed blood.
【００２２】本発明の第２の工程は、ＤＰＧポケット結
合性物質にヘモグロビンが結合された水不溶性の複合体
を反応媒体である液体から分離する工程である。The second step of the present invention is a step of separating the water-insoluble complex in which hemoglobin is bound to the DPG pocket binding substance from the liquid which is the reaction medium.
【００２３】上記の分離方法としては、上記の複合体生
成反応終了後の液体を単に静置するか、または、より短
時間で分離するには、遠心分離などの手段を用いて、該
複合体を沈殿させた後、デカンテーション等の手段で液
体を除去することにより分離できる。As the above-mentioned separation method, the liquid after completion of the above-mentioned complex formation reaction is simply allowed to stand, or in order to separate in a shorter time, a means such as centrifugation is used. Can be separated by removing the liquid by means such as decantation after the precipitation.
【００２４】本発明の第３の工程は、上記のようにして
分離された複合体をｐＨ７．０〜１０．０の液体に接触
させるか、又は電気伝導度６．５ｍＳ／ｃｍ以上の液体
に接触させて、ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビ
ンを解離させる工程である。In the third step of the present invention, the complex separated as described above is brought into contact with a liquid having a pH of 7.0 to 10.0 or a liquid having an electric conductivity of 6.5 mS / cm or more. It is a step of contacting to dissociate the DPG pocket binding substance and hemoglobin.
【００２５】上記のｐＨ７．０〜１０．０の液体として
は、７．０〜１０．０のｐＨの範囲で緩衝能を有するリ
ン酸緩衝液や、Ｇｏｏｄの緩衝液、ホウ酸緩衝液、重炭
酸緩衝液等が好適である。ｐＨが７．０未満では、複合
体の解離効果が不十分であり、ｐＨが１０を超えると、
ヘモグロビンが変性する恐れがある。The above-mentioned liquid having a pH of 7.0 to 10.0 includes a phosphate buffer solution having a buffering capacity in the pH range of 7.0 to 10.0, a Good's buffer solution, a borate buffer solution, and a heavy buffer solution. A carbonate buffer solution or the like is suitable. If the pH is less than 7.0, the dissociation effect of the complex is insufficient, and if the pH exceeds 10,
Hemoglobin may be denatured.
【００２６】上記の電気伝導度６．５ｍＳ／ｃｍ以上の
液体としては、例えば、水に溶けてイオン化する物質の
溶液が挙げられる。上記のイオン化する物質としては、
特に限定されないが、水への解離度が高い強酸と強塩基
より得られる塩が反応媒体のｐＨを変動させにくいので
好適であり、例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウム等
が好ましい。この液体の電気伝導度が６．５ｍＳ／ｃｍ
未満になると、複合体の解離効果が不十分であり、一
方、適用可能な溶液の電気伝導度の上限値は、そのイオ
ン化する物質の水に対する飽和溶解度における電気伝導
度まで使用可能である。この場合、イオン化する物質の
水溶液中の濃度が高くなり、解離後のヘモグロビンが塩
析効果により沈殿する場合は、該溶液を分離した後、ヘ
モグロビンを他の適当な液体に溶解すればよい。Examples of the liquid having an electric conductivity of 6.5 mS / cm or more include a solution of a substance which is dissolved in water and ionized. As the above-mentioned ionizable substance,
Although not particularly limited, a salt obtained from a strong acid and a strong base having a high degree of dissociation into water is preferable because it does not easily change the pH of the reaction medium, and for example, sodium chloride, potassium chloride and the like are preferable. The electric conductivity of this liquid is 6.5 mS / cm
Below this, the dissociation effect of the complex is insufficient, while the upper limit of the electric conductivity of the applicable solution can be used up to the electric conductivity at the saturated solubility of the ionizable substance in water. In this case, when the concentration of the ionizable substance in the aqueous solution becomes high and the hemoglobin after dissociation precipitates due to the salting-out effect, the solution may be separated and then hemoglobin may be dissolved in another suitable liquid.
【００２７】この工程によって、ＤＰＧポケット結合性
物質とヘモグロビンを解離した後に、ＤＰＧポケット結
合性物質が水不溶性である場合には、上澄み液としてヘ
モグロビンを回収することができ、ＤＰＧポケット結合
性物質が水溶性である場合には、この状態のままヘモグ
ロビン溶液として用いることもできるし、必要に応じ
て、アニオン吸着樹脂などを用いてＤＰＧポケット結合
性物質を除くこともできる。By this step, after dissociating the DPG pocket-binding substance and hemoglobin, if the DPG pocket-binding substance is water-insoluble, hemoglobin can be recovered as a supernatant liquid, and the DPG pocket-binding substance can be recovered. When it is water-soluble, it can be used as a hemoglobin solution in this state, or if necessary, an anion-adsorbing resin or the like can be used to remove the DPG pocket-binding substance.
【００２８】また、上記の第１工程のＤＰＧポケット結
合性物質とヘモグロビンの複合体を生成させる工程およ
び第３工程の上記複合体を解離させる工程で使用される
反応媒体である液体の最適のイオン強度は、用いるＤＰ
Ｇポケット結合性物質の種類や濃度、ヘモグロビン濃
度、ｐＨによって変化し、目的に応じて最適のイオン強
度が選択されるべきである。例えば、ＤＰＧポケット結
合性物質としてポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を
用い、ヘモグロビン含有液として血液を用い、複合体の
解離物質として塩化ナトリウムを用いた場合を取り上げ
ると、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体濃度０．０
０２〜０．０２重量％、反応溶液のｐＨ５．０〜７．
０、血液の希釈度２５０〜１０００倍希釈のそれぞれの
変動させうる条件の中から、ある一つの条件を設定した
場合、塩化ナトリウム濃度を１０〜１００ｍＭの範囲か
ら最適の条件を設定することができる。Further, the optimum ion of a liquid as a reaction medium used in the step of forming the complex of the DPG pocket binding substance and hemoglobin in the first step and the step of dissociating the complex in the third step. Strength is DP to use
The optimum ionic strength should be selected according to the purpose, depending on the type and concentration of the G-pocket binding substance, the hemoglobin concentration, and the pH. For example, when the phosphonic acid derivative of polyallylamine is used as the DPG pocket binding substance, blood is used as the hemoglobin-containing liquid, and sodium chloride is used as the dissociation substance of the complex, the concentration of the phosphonic acid derivative of polyallylamine is 0.1. 0
02-0.02% by weight, pH of reaction solution 5.0-7.
0, when the blood dilution is 250 to 1000 times and each variable condition can be varied, the optimum condition can be set from the sodium chloride concentration range of 10 to 100 mM. .
【００２９】また、上記の第１工程で、ヘモグロビン含
有液として血液を用いる場合、赤血球をまず溶血させる
必要がある。赤血球の溶血方法としては既存の種々の方
法を用いることができるが、例えば、古くからよく知ら
れる蒸留水等の低張液での処理や、血液の凍結融解によ
り赤血球を破壊せしめる方法が挙げられ、また、通常、
よく用いられる種々の溶血剤で処理してもよい。このよ
うな溶血剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアル
キルアリールエーテル；高級脂肪族アルコール；スルホ
ネート化合物またはサルフェート化合物のポリオキシエ
チレンエーテル；ソルビット脂肪酸エステルのポリオキ
シエチレン付加体等の界面活性剤が使用できる。溶血剤
の使用量は、その種類等によっても異なるが、通常血液
１ｍｌ当たり、１０〜２００ｍｇである。溶血剤が過剰
である場合には、ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロ
ビンとの反応が阻害される場合があり、溶血液の適当な
希釈が必要である。When blood is used as the hemoglobin-containing liquid in the first step, it is necessary to hemolyze the red blood cells first. Various existing methods can be used as a method for hemolyzing red blood cells, for example, a treatment with a hypotonic solution such as distilled water, which has been well known since ancient times, and a method of destroying red blood cells by freezing and thawing blood are mentioned. , Also usually
It may be treated with various commonly used hemolytic agents. As such a hemolytic agent, for example, a surfactant such as polyoxyethylene alkylaryl ether; higher aliphatic alcohol; polyoxyethylene ether of sulfonate compound or sulfate compound; polyoxyethylene adduct of sorbit fatty acid ester can be used. . The amount of the hemolytic agent used varies depending on the type and the like, but is usually 10 to 200 mg per 1 ml of blood. When the hemolytic agent is in excess, the reaction between the DPG pocket binding substance and hemoglobin may be inhibited, and appropriate dilution of the hemolyzed blood is necessary.
【００３０】また、本発明のヘモグロビンの分離精製方
法は、天然ヘモグロビン（Fe2+）だけでなく、シアンメ
トヘモグロビン（Fe3+）でも同様に適用できるので、安
定なヘモグロビン標準物質としてシアンメトヘモグロビ
ンを分離調製する際にも好適に用いられる。Since the method for separating and purifying hemoglobin of the present invention can be applied not only to natural hemoglobin (Fe 2+ ) but also to cyanmethemoglobin (Fe 3+ ), it can be used as a stable hemoglobin standard substance. It is also preferably used when separately preparing.
【００３１】[0031]
【実施例】次に本発明を実施例によって説明するが、本
発明はこの実施例に制限されるものではない。EXAMPLES The present invention will now be described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００３２】（参考例１）ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の合成 ポリアリルアミン塩酸塩（日東紡績社製、MW.7500 〜1
1,000）５．７ｇとホスホン酸（ナカライテスク社製）
１６．４ｇを１００ｍｌの脱イオン水に溶解し、５００
ｍｌのセパラブルフラスコに入れた。これに、温度計、
撹拌棒、環流管、滴下ロートをセットした。次に、濃塩
酸（１１．３３Ｎ）１００ｍｌを添加し、マントルヒー
ターにて加熱した。次に環流状態に達したところで、滴
下ロートに６０ｍｌのホルムアルデヒド水（３７重量
％）を入れ、１時間かけてゆっくり滴下した。それから
さらに、１時間反応を続けた。次に、この溶液を２０℃
に冷却し、水酸化ナトリウム５４ｇを加えた。次にこの
溶液を約８００ｍｌのアセトンにコマゴメピペットを用
いゆっくり滴下し、白色沈殿を生成させた。この沈殿物
を吸引ロートを用いて濾過した。沈殿物は、アセトン：
水＝４：１の溶液で３回洗浄濾過し、沈殿物をスパーテ
ルでサンプル瓶に回収し、約２００ｍｌの脱イオン水を
少量ずつ加えながら、沈殿物を泥濘状にし、これを透析
チューブにつめ、脱イオン水に一昼夜以上、外液を５回
交換して、透析した。透析チューブ内で溶解したポリア
リルアミンのホスホン酸誘導体をもう一度アセトンに滴
下し、沈殿させ、上記のように濾過し、沈殿物を２０℃
で減圧乾燥して６．４ｇのポリアリルアミンのホスホン
酸誘導体を得た。Reference Example 1 Synthesis of phosphonic acid derivative of polyallylamine Polyallylamine hydrochloride (manufactured by Nitto Boseki Co., MW. 7500-1)
1,000) 5.7 g and phosphonic acid (manufactured by Nacalai Tesque)
Dissolve 16.4 g in 100 ml deionized water and add 500
Placed in a ml separable flask. With a thermometer,
A stirring bar, a reflux tube, and a dropping funnel were set. Next, 100 ml of concentrated hydrochloric acid (11.33N) was added and heated with a mantle heater. Next, when the reflux state was reached, 60 ml of formaldehyde water (37% by weight) was put into the dropping funnel and slowly dropped over 1 hour. Then, the reaction was continued for another hour. Next, this solution is kept at 20 ° C.
After cooling, 54 g of sodium hydroxide was added. Next, this solution was slowly added dropwise to about 800 ml of acetone using a Komagome pipette to form a white precipitate. The precipitate was filtered using a suction funnel. The precipitate is acetone:
Wash and filter 3 times with a solution of water = 4: 1, collect the precipitate in a sample bottle with a spatula, add about 200 ml of deionized water little by little to make the precipitate muddy, and plug this in a dialysis tube. The dialysate was exchanged with deionized water for one day or more and the external solution was changed 5 times. The phosphonic acid derivative of polyallylamine dissolved in the dialysis tube was once again added dropwise to acetone to cause precipitation, and the precipitate was filtered as above, and the precipitate was heated at 20 ° C.
After drying under reduced pressure, 6.4 g of a phosphonic acid derivative of polyallylamine was obtained.
【００３３】（参考例２）ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの反応性評
価 ＤＰＧポケット結合性物質として、参考例１で合成した
ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を使用し、そのヒ
トヘモグロビンとの反応性を評価した。ヒトヘモグロビ
ンはＳｉｇｍａ社より購入したものを用いた。反応緩衝
液として、１０ｍＭの濃度でＮａＣｌを含有する１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２４）を用い、この反応緩
衝液に図２にＨｂ Ｃｏｎｃ．として示した０．２〜
０．６ｍｇ／ｍｌの最終濃度でヒトヘモグロビンを溶解
した。次に、この溶液に上記ポリアリルアミンのホスホ
ン酸誘導体を最終濃度０．００４重量％になるように添
加し、２０℃で５分間攪拌しながら反応させた後、溶液
の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所製ＵＶ２６
０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）で
測定した。この結果を図２に示した。図２から明らかな
ようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導体は、ヒトヘ
モグロビンと反応し、ヒトヘモグロビンの濃度に依存し
て濁度が増加し、水不溶性複合体が形成されることが示
された。(Reference Example 2) Evaluation of reactivity of DPG pocket binding substance with hemoglobin
The phosphonic acid derivative of polyallylamine synthesized in Reference Example 1 was used as the divalent DPG pocket binding substance, and its reactivity with human hemoglobin was evaluated. Human hemoglobin used was purchased from Sigma. 10m containing NaCl at a concentration of 10mM as a reaction buffer
M phosphate buffer (pH = 6.24) was used. Shown as 0.2 ~
Human hemoglobin was dissolved at a final concentration of 0.6 mg / ml. Next, the phosphonic acid derivative of polyallylamine was added to this solution so that the final concentration was 0.004% by weight, and the mixture was reacted at 20 ° C. for 5 minutes while stirring. Total (UV26 made by Shimadzu Corporation
0), and the absorbance at a wavelength of 660 nm (OD660 nm) was measured. The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 2, the phosphonic acid derivative of polyallylamine was shown to react with human hemoglobin, increase turbidity depending on the concentration of human hemoglobin, and form a water-insoluble complex.
【００３４】（参考比較例１）ポリアリルアミンのホス
ホン酸誘導体（最終濃度０．００４重量％）の代わりに
ポリアリルアミン塩酸塩（最終濃度０．００４重量％）
を用いたことの他は、、参考例２と同様に行った。結果
は、図２に参考例２の結果と一緒に示した。この結果か
ら明らかなように、ホスホン酸誘導体化していないポリ
アリルアミンは、ヒトヘモグロビンと反応しなかった。Reference Comparative Example 1 Polyallylamine hydrochloride (final concentration 0.004% by weight) instead of phosphonic acid derivative of polyallylamine (final concentration 0.004% by weight)
Was performed in the same manner as in Reference Example 2 except that The results are shown in FIG. 2 together with the results of Reference Example 2. As is clear from this result, polyallylamine not derivatized with phosphonic acid did not react with human hemoglobin.
【００３５】（参考例３）ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの反応性評
価（ｐＨ依存性 ） １／１５Ｍリン酸２ナトリウム水溶液と１／１５Ｍリン
酸１カリウム水溶液ととを種々の比率で混合し、図３に
示したようにｐＨ５．２〜８．４のＳφｒｅｎｓｅｎの
リン酸緩衝液を調製し、それを１０ｍＭになるように脱
イオン水で希釈した。各々のｐＨの緩衝液にヒトヘモグ
ロビン（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度０．３ｍｇ／ｍｌに
なるように溶解した。次に、参考例１で得られたポリア
リルアミンのホスホン酸誘導体を最終濃度０．００４重
量％になるように添加し、２０℃で５分間攪拌しながら
反応させた後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津
製作所製ＵＶ２６０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（Ｏ
Ｄ６６０ｎｍ）で測定した。この結果を図３に示した。
図３から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸
誘導体は、ｐＨ５．０〜７．０でヒトヘモグロビンと反
応し、濁度が増加した。また、ｐＨが７．０を超えると
濁度が急激に低下していることが分かる。Reference Example 3 Evaluation of Reactivity between DPG Pocket-Binding Substance and Hemoglobin
Value (pH dependency ) 1/15 M disodium phosphate aqueous solution and 1/15 M potassium phosphate aqueous solution were mixed at various ratios, and as shown in FIG. 3, Sφrensen of pH 5.2 to 8.4 was mixed. A phosphate buffer was prepared and diluted to 10 mM with deionized water. Human hemoglobin (Sigma) was dissolved in each pH buffer to a final concentration of 0.3 mg / ml. Next, the phosphonic acid derivative of polyallylamine obtained in Reference Example 1 was added so that the final concentration was 0.004% by weight, and the mixture was reacted at 20 ° C. for 5 minutes with stirring. Using a visible spectrophotometer (UV260 manufactured by Shimadzu Corporation), the absorbance (O
D660 nm). The result is shown in FIG.
As is clear from FIG. 3, the phosphonic acid derivative of polyallylamine reacted with human hemoglobin at pH 5.0 to 7.0 to increase the turbidity. Also, it can be seen that when the pH exceeds 7.0, the turbidity sharply decreases.
【００３６】（参考例４）ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの反応性評
価（電気伝導度依存性） 反応緩衝液に１０ｍＭリン酸緩衝液を使用し、これにＮ
ａＣｌを溶解し、図４および図５に示したような電気伝
導度（Electric Conductivity ）１．３３５〜９．７５
ｍＳ／ｃｍの緩衝液を調製した。各々の電気伝導度の緩
衝液にヒトヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度が
０．２５ｍｇ／ｍｌになるように溶解した。次に、参考
例１で得られたポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を
添加し、２０℃で５分間攪拌しながら反応させた後、溶
液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所製ＵＶ２６
０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）で
測定した。この結果を図４および図５に示した。なお、
図４は、リン酸緩衝液のｐＨ６．２４、ポリアリルアミ
ンのホスホン酸誘導体の反応時の濃度が０．００４重量
％の場合の結果を、図５は、リン酸緩衝液のｐＨ６．０
０、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の反応時の濃
度が０．００６重量％の場合の結果を示した。図４およ
び図５から明らかなようにポリアリルアミンのホスホン
酸誘導体とヒトヘモグロビンとの反応による濁度は、反
応時のｐＨやポリアリルアミンのホスホン酸誘導体の濃
度が変わると電気伝導度依存性も異なるパターンを示
し、各条件により最適の電気伝導度（言い換えると、Ｎ
ａＣｌ濃度）があることが分かる。Reference Example 4 Evaluation of Reactivity between DPG Pocket Binding Substance and Hemoglobin
10 mM phosphate buffer was used as the valency (electrical conductivity-dependent) reaction buffer, and N
aCl is dissolved, and the electric conductivity as shown in FIGS. 4 and 5 is 1.335 to 9.75.
A buffer solution of mS / cm was prepared. Human hemoglobin (Sigma) was dissolved in each conductivity buffer so that the final concentration was 0.25 mg / ml. Next, the phosphonic acid derivative of polyallylamine obtained in Reference Example 1 was added, and the mixture was reacted at 20 ° C. for 5 minutes while stirring. Then, the turbidity of the solution was measured by an ultraviolet-visible spectrophotometer (UV26 manufactured by Shimadzu Corporation).
0), and the absorbance at a wavelength of 660 nm (OD660 nm) was measured. The results are shown in FIGS. 4 and 5. In addition,
FIG. 4 shows the results when the pH of the phosphate buffer was 6.24 and the concentration of the phosphonic acid derivative of polyallylamine was 0.004% by weight, and FIG. 5 is the result of the phosphate buffer having a pH of 6.0.
0, the result when the concentration of the phosphonic acid derivative of polyallylamine during the reaction was 0.006% by weight was shown. As is clear from FIGS. 4 and 5, the turbidity due to the reaction between the polyphosphoric acid derivative of polyallylamine and human hemoglobin has different electrical conductivity dependences when the pH during the reaction and the concentration of the phosphonic acid derivative of polyallylamine are changed. A pattern is shown, and the optimum electrical conductivity (in other words, N
It can be seen that there is an aCl concentration).
【００３７】（参考例５）ＤＰＧポケット結合性物質の反応特異性の評価 参考例１で得られたポリアリルアミンのホスホン酸誘導
体の特異性を評価した。反応緩衝液として、１０ｍＭの
濃度でＮａＣｌを含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
＝６．２１）を用い、これに、ヒトヘモグロビン（Ｓｉ
ｇｍａ社）（終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）、牛アルブミ
ン（ＭＩＬＥＳ社）（終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ）また
はヒト血漿希釈液（最終希釈度２５０倍）を上記の括弧
内の終濃度または最終希釈度となるように添加し、次い
で上記のポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を図６に
示した０．００〜０．０５重量％の範囲の種々の濃度と
なるように添加し、２０℃で５分間攪拌しながら反応さ
せた後、溶液の濁度を紫外可視分光光度計（島津製作所
製ＵＶ２６０）で、波長６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６
０ｎｍ）で測定した。この結果を図６に示した。図６か
ら、明らかなようにポリアリルアミンのホスホン酸誘導
体は、ヘモグロビンとは反応し、牛アルブミンや血漿希
釈液とは反応しなかった。Reference Example 5 Evaluation of Reaction Specificity of DPG Pocket-Binding Substance The specificity of the phosphonic acid derivative of polyallylamine obtained in Reference Example 1 was evaluated. As a reaction buffer, 10 mM phosphate buffer (pH containing NaCl at a concentration of 10 mM)
= 6.21), to which human hemoglobin (Si
gma) (final concentration 0.25 mg / ml), bovine albumin (MILES) (final concentration 0.25 mg / ml) or human plasma diluted solution (final dilution 250 times) to the final concentration in parentheses or final The polyphosphoric acid derivative of polyallylamine was added at various concentrations within the range of 0.00 to 0.05% by weight shown in FIG. After reacting for 1 minute while stirring, the turbidity of the solution was measured with an ultraviolet-visible spectrophotometer (UV260 manufactured by Shimadzu Corporation) to measure the absorbance at a wavelength of 660 nm (OD66).
0 nm). The result is shown in FIG. As is clear from FIG. 6, the phosphonic acid derivative of polyallylamine reacted with hemoglobin and did not react with bovine albumin or the plasma diluent.
【００３８】（実施例１）ヒト血液からのヘモグロビンの分離精製 正常ヒト血液１００μｌに蒸留水１２．５ｍｌを添加
し、次に、５０ｍＭの濃度でＮａＣｌを、０．０１２重
量％の濃度で参考例１で得られたポリアリルアミンのホ
スホン酸誘導体を溶解している１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ＝６．００）を１２．５ｍｌ添加し、撹拌後、４
℃で２４時間静置した。次に上澄み液と赤色の沈殿物を
デカンテーションで分離した。得られた赤色の沈殿物
に、ダルベッコのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４、１３８
ｍＭＮａＣｌ）を２５ｍｌ添加し、沈殿物を再溶解させ
た。この再溶解溶液（後出の図７および表１において、
この液のことを、精製品という）；先に分離した上澄み
液；および上記の正常ヒト血液１００μｌに蒸留水１
２．５ｍｌを添加した液に、ポリアリルアミンのホスホ
ン酸誘導体を含むリン酸緩衝液１２．５ｍｌの代わり
に、ポリアリルアミンのホスホン酸誘導体を含まないリ
ン酸緩衝液１２．５ｍｌを添加した液（後出の図７およ
び表１において、この液のことを、出発原料という）、
それぞれの波長２４０〜７００ｎｍの吸収曲線を比較
し、図７に示した。また、５４０ｎｍの吸光度の値から
正常ヒト血液中のヘモグロビンの回収率を測定し、結果
を表１に示した。Example 1 Separation and Purification of Hemoglobin from Human Blood 12.5 ml of distilled water was added to 100 μl of normal human blood, and then NaCl was added at a concentration of 50 mM and a concentration of 0.012% by weight as a reference example. 12.5 ml of 10 mM phosphate buffer solution (pH = 6.00) in which the phosphonic acid derivative of polyallylamine obtained in 1 was dissolved was added, and after stirring, 4
It was allowed to stand at 24 ° C. for 24 hours. Next, the supernatant and the red precipitate were separated by decantation. Dulbecco's phosphate buffer (pH = 7.4, 138) was added to the obtained red precipitate.
25 ml of (mM NaCl) was added to redissolve the precipitate. This redissolved solution (see FIG. 7 and Table 1 below,
This liquid is referred to as a purified product); the supernatant liquid separated above; and 100 μl of the above normal human blood to 1 part of distilled water
A solution obtained by adding 12.5 ml of a phosphate buffer solution containing no phosphonic acid derivative of polyallylamine to the solution containing 2.5 ml instead of 12.5 ml of a phosphate buffer solution containing a phosphonic acid derivative of polyallylamine ( In FIG. 7 and Table 1 above, this liquid is referred to as a starting material),
The absorption curves at wavelengths of 240 to 700 nm are compared and shown in FIG. 7. Further, the recovery rate of hemoglobin in normal human blood was measured from the absorbance value at 540 nm, and the results are shown in Table 1.
【００３９】[0039]
【表１】 [Table 1]
【００４０】[0040]
【発明の効果】本発明の構成は上記の通りであり、ＤＰ
Ｇポケット結合性物質を利用し、従来よりも、短時間
で、簡単な操作で、高収率で、血液等からヘモグロビン
を分離精製できる。The structure of the present invention is as described above.
By using the G-pocket binding substance, hemoglobin can be separated and purified from blood or the like in a shorter time, with a simple operation, and in a higher yield than ever before.
【図１】ヘモグロビンの構造を示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of hemoglobin.
【図２】ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの
反応性を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the reactivity of a DPG pocket binding substance with hemoglobin.
【図３】ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの
反応における、反応時のｐＨ依存性を示すグラフであ
る。FIG. 3 is a graph showing the pH dependence during the reaction in the reaction between a DPG pocket binding substance and hemoglobin.
【図４】ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの
反応における、反応時の溶液の電気伝導度依存性を示す
グラフである。FIG. 4 is a graph showing the electrical conductivity dependence of a solution at the time of reaction in a reaction between a DPG pocket binding substance and hemoglobin.
【図５】ＤＰＧポケット結合性物質とヘモグロビンとの
反応における、反応時の溶液の電気伝導度依存性を示す
グラフである。FIG. 5 is a graph showing the electrical conductivity dependence of a solution at the time of reaction in the reaction between a DPG pocket binding substance and hemoglobin.
【図６】ＤＰＧポケット結合性物質の反応特異性を示す
グラフである。FIG. 6 is a graph showing the reaction specificity of a DPG pocket binding substance.
【図７】ヒト血液からヘモグロビンの分離精製を行った
際の、出発原料、上澄み液、精製品の波長２４０〜７０
０ｎｍの吸収曲線である。FIG. 7: Wavelengths 240 to 70 of starting material, supernatant, and purified product when hemoglobin is separated and purified from human blood
It is an absorption curve of 0 nm.
Claims (1)
リン酸ポケットに対して結合性を有する物質とヘモグロ
ビン含有液とを、ｐＨ５．０〜６．８の液体中で接触さ
せて、該物質にヘモグロビンが結合された水不溶性の複
合体を生成させる工程、該複合体を該液体から分離する
工程、及び、分離された複合体をｐＨ７．０〜１０．０
の液体に接触させるか、又は電気伝導度６．５ｍＳ／ｃ
ｍ以上の液体に接触させて、該物質とヘモグロビンを解
離させる工程からなることを特徴とするヘモグロビンの
分離精製方法。1. A substance having a binding property to a 2,3-diphosphoglyceric acid pocket of hemoglobin is brought into contact with a hemoglobin-containing liquid in a liquid having a pH of 5.0 to 6.8 to allow the substance to hemoglobin. To form a water-insoluble complex bound with the compound, separating the complex from the liquid, and separating the separated complex from pH 7.0 to 10.0.
Contact with liquid or electrical conductivity of 6.5mS / c
A method for separating and purifying hemoglobin, which comprises the step of dissociating the substance and hemoglobin by bringing them into contact with a liquid of m or more.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7163599A JPH0912598A (en) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | Separation and purification of hemoglobin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7163599A JPH0912598A (en) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | Separation and purification of hemoglobin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0912598A true JPH0912598A (en) | 1997-01-14 |
Family
ID=15776991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7163599A Pending JPH0912598A (en) | 1995-06-29 | 1995-06-29 | Separation and purification of hemoglobin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0912598A (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005063814A1 (en) * | 2003-12-26 | 2005-07-14 | Oxygenix Co., Ltd. | Process for purification of hemoglobin |
| JP2014240391A (en) * | 2010-05-17 | 2014-12-25 | イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン | Stimulus responsive polymers for purification of biomolecules |
| US9803165B2 (en) | 2008-12-16 | 2017-10-31 | Emd Millipore Corporation | Stirred tank reactor and method |
| TWI603772B (en) * | 2016-05-25 | 2017-11-01 | 中華醫事科技大學 | Method of purifying hemoglobin and apparatus thereof |
| US10233211B2 (en) | 2006-12-21 | 2019-03-19 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| US10793593B2 (en) | 2006-12-21 | 2020-10-06 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63500305A (en) * | 1985-06-26 | 1988-02-04 | ヘモソ−ル インコ−ポレイテツド | Purification of hemoglobin and denatured hemoglobin by affinity chromatography |
| JPS63298063A (en) * | 1987-05-28 | 1988-12-05 | Sekisui Chem Co Ltd | Method for measuring saccharogenic hemoglobin |
| JPH02259467A (en) * | 1989-03-30 | 1990-10-22 | Sekisui Chem Co Ltd | Unstable type saccharified hemoglobin dissociation agent |
| JPH06331629A (en) * | 1993-05-20 | 1994-12-02 | Sekisui Chem Co Ltd | Unstable saccharified hemoglobin dissociating agent and measuring method for saccharified hemoglobin using same |
-
1995
- 1995-06-29 JP JP7163599A patent/JPH0912598A/en active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63500305A (en) * | 1985-06-26 | 1988-02-04 | ヘモソ−ル インコ−ポレイテツド | Purification of hemoglobin and denatured hemoglobin by affinity chromatography |
| JPS63298063A (en) * | 1987-05-28 | 1988-12-05 | Sekisui Chem Co Ltd | Method for measuring saccharogenic hemoglobin |
| JPH02259467A (en) * | 1989-03-30 | 1990-10-22 | Sekisui Chem Co Ltd | Unstable type saccharified hemoglobin dissociation agent |
| JPH06331629A (en) * | 1993-05-20 | 1994-12-02 | Sekisui Chem Co Ltd | Unstable saccharified hemoglobin dissociating agent and measuring method for saccharified hemoglobin using same |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005063814A1 (en) * | 2003-12-26 | 2005-07-14 | Oxygenix Co., Ltd. | Process for purification of hemoglobin |
| JPWO2005063814A1 (en) * | 2003-12-26 | 2007-12-20 | 株式会社 オキシジェニクス | Hemoglobin purification method |
| US10233211B2 (en) | 2006-12-21 | 2019-03-19 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| US10793593B2 (en) | 2006-12-21 | 2020-10-06 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| US9803165B2 (en) | 2008-12-16 | 2017-10-31 | Emd Millipore Corporation | Stirred tank reactor and method |
| JP2014240391A (en) * | 2010-05-17 | 2014-12-25 | イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン | Stimulus responsive polymers for purification of biomolecules |
| US9731288B2 (en) | 2010-05-17 | 2017-08-15 | Emd Millipore Corporation | Stimulus responsive polymers for the purification of biomolecules |
| TWI603772B (en) * | 2016-05-25 | 2017-11-01 | 中華醫事科技大學 | Method of purifying hemoglobin and apparatus thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wiley et al. | The structure of vitellogenin. Multiple vitellogenins in Xenopus laevis give rise to multiple forms of the yolk proteins. | |
| Rosenberg et al. | Fractionation of the protein components of human erythrocyte membranes | |
| Thompson et al. | Lipid and subunit III depleted cytochrome c oxidase purified by horse cytochrome c affinity chromatography in lauryl maltoside | |
| Press et al. | The isolation and properties of a proteolytic enzyme, cathepsin D, from bovine spleen | |
| Bohak | Purification and characterization of chicken pepsinogen and chicken pepsin | |
| Reinhammar | Purification and properties of laccase and stellacyanin from Rhus vernicifera | |
| Smith et al. | Crosslinking of ubiquinone cytochrome c reductase (complex III) with periodate-cleavable bifunctional reagents | |
| EP0031955B1 (en) | Process for purification of lipoprotein cholesterol for use as a cholesterol reference material | |
| Suzuki et al. | Studies of Fc. gamma. receptors of human B lymphocytes: phospholipase A2 activity of Fc. gamma. receptors | |
| Lau et al. | Inorganic mercury (II)‐binding components in normal human blood serum | |
| Vacher-Lepretre et al. | Study of the apoprotein of Folch-Pi bovine proteolipid. II. Characterization of the components isolated from sodium dodecyl sulfate solutions | |
| Pollack et al. | A new iron-binding protein isolated from intestinal mucosa | |
| JPH0912598A (en) | Separation and purification of hemoglobin | |
| Pepper et al. | The different forms of antithrombin III in serum | |
| JPS6351335A (en) | Degranulation inhibitor for mast cell | |
| Jacobsen et al. | Dansylation of human serum albumin in the study of the primary binding sites of bilirubin and L-tryptophan | |
| Marfey et al. | Cross-linking of phospholipids in human erythrocyte membrane | |
| JP3478913B2 (en) | Method for measuring hemoglobin A1c | |
| Fronticelli et al. | [10] Conformational and functional characteristics of bovine hemoglobin | |
| Harris et al. | The carboxymethylation of human metmyoglobin | |
| KR100361894B1 (en) | Substituted Chromatography Methods and Purified Hemoglobin Products | |
| Wang | A crystalline protein-proteinase inhibitor from pinto bean seeds | |
| JPH06331629A (en) | Unstable saccharified hemoglobin dissociating agent and measuring method for saccharified hemoglobin using same | |
| Brandt et al. | Coupling of dyes to biopolymers by sensitized photooxidation. Affinity labeling of a binding site in bovine serum albumin | |
| Quesada et al. | A rapid method for the functional reconstitution of amino acid transport systems from rat liver plasma membranes. Partial purification of System A |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040630 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20041027 |