JPH0870878A - トロポロニルアラニンの製造法 - Google Patents
トロポロニルアラニンの製造法Info
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- JPH0870878A JPH0870878A JP6211215A JP21121594A JPH0870878A JP H0870878 A JPH0870878 A JP H0870878A JP 6211215 A JP6211215 A JP 6211215A JP 21121594 A JP21121594 A JP 21121594A JP H0870878 A JPH0870878 A JP H0870878A
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- tropolone
- troponyl
- serine
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は(1)トロポロン並びに(2)
(a)β−クロロアラニン、(b)ピルビン酸及びアン
モニア叉は(c)セリンからなる基質にチロシンフェノ
ールリアーゼを水性媒体中で作用させることにより、目
的とするL−トロポロニルアラニンを製造する方法であ
る。 【効果】 本発明によると抗菌剤として期待できる目的
とするL−トロポロニルアラニンのみを製造できる。
(a)β−クロロアラニン、(b)ピルビン酸及びアン
モニア叉は(c)セリンからなる基質にチロシンフェノ
ールリアーゼを水性媒体中で作用させることにより、目
的とするL−トロポロニルアラニンを製造する方法であ
る。 【効果】 本発明によると抗菌剤として期待できる目的
とするL−トロポロニルアラニンのみを製造できる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はL−トロポロニルアラニ
ンの製造法に関し、詳しくはチロシンフェノールリアー
ゼ(別名β−チロシナ−ゼともいう)の作用により、L
−トロポロニルアラニンを製造する方法に関する。この
L−トロポロニルアラニンは抗菌剤や抗虫剤として、ま
たアミノ酸アナログとしての代謝拮抗剤としての利用が
考えられている。
ンの製造法に関し、詳しくはチロシンフェノールリアー
ゼ(別名β−チロシナ−ゼともいう)の作用により、L
−トロポロニルアラニンを製造する方法に関する。この
L−トロポロニルアラニンは抗菌剤や抗虫剤として、ま
たアミノ酸アナログとしての代謝拮抗剤としての利用が
考えられている。
【0002】
【従来の技術】従来、トロポロニルアラニンは合成法で
の製造は報告されているが(The Bul-letin of the Che
mical Society of Japan, Vol 33, No8, pp 1084-1086,
(1960))、DL体の製造が主たるものである。従っ
て、L体のみを得る為には製造したDL体を光学分割す
るか、叉はL体のみを不斉合成するかのいずれかの方法
を取らなければならなかった。しかしながら、現時点で
は技術的な理由からいずれも成功していない。
の製造は報告されているが(The Bul-letin of the Che
mical Society of Japan, Vol 33, No8, pp 1084-1086,
(1960))、DL体の製造が主たるものである。従っ
て、L体のみを得る為には製造したDL体を光学分割す
るか、叉はL体のみを不斉合成するかのいずれかの方法
を取らなければならなかった。しかしながら、現時点で
は技術的な理由からいずれも成功していない。
【0003】さて、チロシンフェノールリアーゼの利用
法としてはL−ド−パやL−チロシンの製造法が知られ
ている(特公昭48−16194、特公昭51−547
5、特公昭53−43594)のみで、L−トロポロニ
ルアラニンの製造法については報告されていない。
法としてはL−ド−パやL−チロシンの製造法が知られ
ている(特公昭48−16194、特公昭51−547
5、特公昭53−43594)のみで、L−トロポロニ
ルアラニンの製造法については報告されていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はチロシ
ンフェノールリアーゼを利用して、これまで反応基質と
考えられていなかったトロポロンからL−トロポロニル
アラニンのみを効率よく製造する方法を提供することに
ある。
ンフェノールリアーゼを利用して、これまで反応基質と
考えられていなかったトロポロンからL−トロポロニル
アラニンのみを効率よく製造する方法を提供することに
ある。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の課題
を解決するために、種々検討を行った結果、チロシンフ
ェノールリアーゼの作用により(1)トロポロン並びに
(2)(a)β−クロロアラニン、(b)ピルビン酸及
びアンモニア叉は(c)セリンからL−トロポロニルア
ラニンのみが効率良く生成されることを見出し、本発明
を完成に至らしめた。即ち、本発明は(1)トロポロン
並びに(2)(a)β−クロロアラニン、(b)ピルビ
ン酸及びアンモニア叉は(c)セリンからなる基質にチ
ロシンフェノールリアーゼを水性媒体中で作用させ、該
水性媒体中にL−トロポロニルアラニンを生成せしめ、
L−トロポロニルアラニンを採取することを特徴とする
L−トロポロニルアラニンの製造法である。以下に本発
明を詳細に説明する。
を解決するために、種々検討を行った結果、チロシンフ
ェノールリアーゼの作用により(1)トロポロン並びに
(2)(a)β−クロロアラニン、(b)ピルビン酸及
びアンモニア叉は(c)セリンからL−トロポロニルア
ラニンのみが効率良く生成されることを見出し、本発明
を完成に至らしめた。即ち、本発明は(1)トロポロン
並びに(2)(a)β−クロロアラニン、(b)ピルビ
ン酸及びアンモニア叉は(c)セリンからなる基質にチ
ロシンフェノールリアーゼを水性媒体中で作用させ、該
水性媒体中にL−トロポロニルアラニンを生成せしめ、
L−トロポロニルアラニンを採取することを特徴とする
L−トロポロニルアラニンの製造法である。以下に本発
明を詳細に説明する。
【0006】本発明において使用されるチロシンフェノ
ールリアーゼに特に制限はないが、微生物由来のものが
好ましい。チロシンフェノールリアーゼを産生する能力
を有する微生物としては、具体的には以下に示すような
ものがある。 エルビニア・ヘルビコーラ(Erwinia herbicola) ATCC 2
1433, ATCC21434 シトロバクター・フロインデイー(Citrobacter freundi
i) ATCC 6750 エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) ATCC 15289 プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis) ATCC 152
90 エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)
ATCC 7256 フラボバクテリウム・フラベッセンス(Flavobacterium
flavescens) ATCC 8315 アクロモバクター・キャンデイカンス(Achromobacter c
andicans) OUT 8005シンビオバクテリウム・サーモフィラム (Symbiobacterium thermophilum) 尚、上記微生物は一例に過ぎず、チロシンフェノールリ
アーゼを産生する能力を有する微生物であれば如何なる
微生物でも使用できる。
ールリアーゼに特に制限はないが、微生物由来のものが
好ましい。チロシンフェノールリアーゼを産生する能力
を有する微生物としては、具体的には以下に示すような
ものがある。 エルビニア・ヘルビコーラ(Erwinia herbicola) ATCC 2
1433, ATCC21434 シトロバクター・フロインデイー(Citrobacter freundi
i) ATCC 6750 エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) ATCC 15289 プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis) ATCC 152
90 エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)
ATCC 7256 フラボバクテリウム・フラベッセンス(Flavobacterium
flavescens) ATCC 8315 アクロモバクター・キャンデイカンス(Achromobacter c
andicans) OUT 8005シンビオバクテリウム・サーモフィラム (Symbiobacterium thermophilum) 尚、上記微生物は一例に過ぎず、チロシンフェノールリ
アーゼを産生する能力を有する微生物であれば如何なる
微生物でも使用できる。
【0007】(1)トロポロン並びに(2)(a)β−
クロロアラニン、(b)ピルビン酸及びアンモニア叉は
(c)セリンからなる基質にこれらの微生物を作用させ
る方法は、液体培地中に本微生物を培養する際に(1)
トロポロン並びに(2)(a)β−クロロアラニン、
(b)ピルビン酸及びアンモニア叉は(c)セリンから
なる基質を添加し、培養しながら反応させてもよいし、
叉は本微生物を培養した後、微生物の培養物、菌体、菌
体処理物、菌体の蛋白質画分または種々の精製段階の酵
素等を上記基質に作用させてもよい。
クロロアラニン、(b)ピルビン酸及びアンモニア叉は
(c)セリンからなる基質にこれらの微生物を作用させ
る方法は、液体培地中に本微生物を培養する際に(1)
トロポロン並びに(2)(a)β−クロロアラニン、
(b)ピルビン酸及びアンモニア叉は(c)セリンから
なる基質を添加し、培養しながら反応させてもよいし、
叉は本微生物を培養した後、微生物の培養物、菌体、菌
体処理物、菌体の蛋白質画分または種々の精製段階の酵
素等を上記基質に作用させてもよい。
【0008】上記微生物を培養するための培地としては
通常の炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培
地が用いられる。さらに高い酵素活性を得る為にはビタ
ミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加することが望
ましい。特にチロシンフェノールリアーゼを誘導する為
にL−チロシンの添加は有効である。尚、必要なL−チ
ロシンの量は使用する微生物菌株によっても多少相違す
るが、通常0.01%以上であり、0.1%〜0.5%
程度が好ましい。また一般に反応活性を高めるために培
地中にビタミンB6類を添加することも有効で、その添
加量は培地中0.5mg/dl以上である。
通常の炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培
地が用いられる。さらに高い酵素活性を得る為にはビタ
ミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加することが望
ましい。特にチロシンフェノールリアーゼを誘導する為
にL−チロシンの添加は有効である。尚、必要なL−チ
ロシンの量は使用する微生物菌株によっても多少相違す
るが、通常0.01%以上であり、0.1%〜0.5%
程度が好ましい。また一般に反応活性を高めるために培
地中にビタミンB6類を添加することも有効で、その添
加量は培地中0.5mg/dl以上である。
【0009】炭素源としては、グルコースやシュクロー
ス等の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その
他が適宜使用される。窒素源としては、アンモニアガ
ス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が用いられ
る。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イ
オン、カリウムイオン、鉄イオン、その他が必要に応じ
適宜使用できる。また、培養は好気条件下に通常、pH
5.0〜8.5、温度15〜40℃の適当な範囲に制御
しつつ、1ないし3日間培養を行なえば良い。即ち、上
記微生物を用いて培養中に目的とするL−トロポロニル
アラニンを生成させる為には、基質である(1)トロポ
ロン並びに(2)(a)β−クロロアラニン、(b)ピ
ルビン酸及びアンモニア叉は(c)セリンを添加し、上
記のpH,温度にて培養すれば良い。尚、基質となるト
ロポロンやβ−クロロアラニン等は培養の開始時に添加
してもよいし、培養途中に添加してもよい。
ス等の炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その
他が適宜使用される。窒素源としては、アンモニアガ
ス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が用いられ
る。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、燐酸イ
オン、カリウムイオン、鉄イオン、その他が必要に応じ
適宜使用できる。また、培養は好気条件下に通常、pH
5.0〜8.5、温度15〜40℃の適当な範囲に制御
しつつ、1ないし3日間培養を行なえば良い。即ち、上
記微生物を用いて培養中に目的とするL−トロポロニル
アラニンを生成させる為には、基質である(1)トロポ
ロン並びに(2)(a)β−クロロアラニン、(b)ピ
ルビン酸及びアンモニア叉は(c)セリンを添加し、上
記のpH,温度にて培養すれば良い。尚、基質となるト
ロポロンやβ−クロロアラニン等は培養の開始時に添加
してもよいし、培養途中に添加してもよい。
【0010】また、上記微生物を上記培地で、かつ上記
培養条件で培養した培養物は高いチロシンフェノールリ
アーゼ活性を含むので菌体を未分離のまま酵素源として
用いても良く、また菌体を一旦培養液より分離して洗浄
叉は洗浄せずに使用してもよい。また、菌体処理物を酵
素源として用いることもでき、このような菌体処理物と
しては、機械的摩砕菌体、超音波にて処理した菌体、凍
結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、リゾチウム等の酵素で
処理した菌体、界面活性剤、トルエン等で処理した菌
体、菌体の蛋白質画分、これらの固定化物叉はその他が
適宜用いられる。要は酵素活性が維持されている限り使
用できるわけである。さて、該酵素源を水性媒体中にて
基質である(1)トロポロン並びに(2)(a)β−ク
ロロアラニン、(b)ピルビン酸とアンモニア叉は
(c)セリンから選ばれたものに作用させるには、該酵
素源を上記基質を含む水性媒体に溶解または懸濁させ、
各水性媒体をpH5〜10、温度を0〜60℃の適当な
条件に調節しつつ暫時静置または攪拌すればよい。
培養条件で培養した培養物は高いチロシンフェノールリ
アーゼ活性を含むので菌体を未分離のまま酵素源として
用いても良く、また菌体を一旦培養液より分離して洗浄
叉は洗浄せずに使用してもよい。また、菌体処理物を酵
素源として用いることもでき、このような菌体処理物と
しては、機械的摩砕菌体、超音波にて処理した菌体、凍
結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、リゾチウム等の酵素で
処理した菌体、界面活性剤、トルエン等で処理した菌
体、菌体の蛋白質画分、これらの固定化物叉はその他が
適宜用いられる。要は酵素活性が維持されている限り使
用できるわけである。さて、該酵素源を水性媒体中にて
基質である(1)トロポロン並びに(2)(a)β−ク
ロロアラニン、(b)ピルビン酸とアンモニア叉は
(c)セリンから選ばれたものに作用させるには、該酵
素源を上記基質を含む水性媒体に溶解または懸濁させ、
各水性媒体をpH5〜10、温度を0〜60℃の適当な
条件に調節しつつ暫時静置または攪拌すればよい。
【0011】尚、L−トロポロニルアラニンを生成せし
める反応において、トロポロンの使用量は特に制限され
ないが、通常バッチ法で行う場合には0.01から0.
2M、好ましくは0.05から0.15M程度である。
また、他方の反応基質としては(a)β−クロロアラニ
ン、(b)ピルビン酸とアンモニア、及び(c)セリン
のいずれかを使用すればよく、その使用量は上記トロポ
ロンの1から6倍モル程度を用いればよい。これらは反
応開始時に全量加えても良く、また反応の進行に伴い、
逐次分割添加しても良い。
める反応において、トロポロンの使用量は特に制限され
ないが、通常バッチ法で行う場合には0.01から0.
2M、好ましくは0.05から0.15M程度である。
また、他方の反応基質としては(a)β−クロロアラニ
ン、(b)ピルビン酸とアンモニア、及び(c)セリン
のいずれかを使用すればよく、その使用量は上記トロポ
ロンの1から6倍モル程度を用いればよい。これらは反
応開始時に全量加えても良く、また反応の進行に伴い、
逐次分割添加しても良い。
【0012】使用されるβ−クロロアラニンはβ−クロ
ロ−Lーアラニン、β−クロロ−Dーアラニン、β−ク
ロロ−DLーアラニンのいずれでもよく、またセリンも
Lーセリン、Dーセリン、DL−セリンのいずれでもよ
い。また、β−クロロアラニン等に代えて、O−エチル
セリン、O−n−プロピルセリン、O−イソプロピルセ
リン、O−n−ブチルセリン、O−sec−ブチルセリ
ン、O−n−アミルセリン、O−イソアミルセリン、O
−シクロペンチルセリン、O−2−プロペニルセリン、
O−2−プロピニルセリン、O−2−ブテニルセリン、
O−3−メチル−2−ブテニルセリンなどのセリン誘導
体も基質として使用可能である。しかし好ましくは、
(a)β−クロロアラニン、(b)ピルビン酸とアンモ
ニア叉は(c)セリンが好ましい。尚、L−トロポロニ
ルアラニンの確認、定量は薄層クロマトグラフィーおよ
び高速液体クロマトグラフィーを用いる通常の方法によ
り行える。
ロ−Lーアラニン、β−クロロ−Dーアラニン、β−ク
ロロ−DLーアラニンのいずれでもよく、またセリンも
Lーセリン、Dーセリン、DL−セリンのいずれでもよ
い。また、β−クロロアラニン等に代えて、O−エチル
セリン、O−n−プロピルセリン、O−イソプロピルセ
リン、O−n−ブチルセリン、O−sec−ブチルセリ
ン、O−n−アミルセリン、O−イソアミルセリン、O
−シクロペンチルセリン、O−2−プロペニルセリン、
O−2−プロピニルセリン、O−2−ブテニルセリン、
O−3−メチル−2−ブテニルセリンなどのセリン誘導
体も基質として使用可能である。しかし好ましくは、
(a)β−クロロアラニン、(b)ピルビン酸とアンモ
ニア叉は(c)セリンが好ましい。尚、L−トロポロニ
ルアラニンの確認、定量は薄層クロマトグラフィーおよ
び高速液体クロマトグラフィーを用いる通常の方法によ
り行える。
【0013】
【実施例】以下に本発明を実施例に従って具体的に説明
する。尚、本発明は実施例に限定されるものでは無い。
する。尚、本発明は実施例に限定されるものでは無い。
【0014】(実施例1)ブイヨン寒天培地(スラン
ト)で30℃、一晩培養した菌株Erwinia herbicola AT
CC21434 の1スラント分を、同じブイヨン培地500m
lを含む3L容フラスコに接種し、30℃で一晩振盪培
養した。このシード培養液をマンニット0.5g/d
l、グリセロール0.6g/dl、KH2PO4 0.0
5g/dl、MgSO4・7H2O 0.05g/dl、
大豆蛋白質酸加水分解物1.0g/dl、L−アラニン
0.4g/dl、グリシン0.3g/dl、DL−メチ
オニン0.1g/dl、L−グルタミン酸0.4g/d
l、L−チロシン0.1g/dl、L−フェニルアラニ
ン0.2g/dl、FeSO4・7H2O 0.005g
/dl、ZnSO4・5H2O 0.001g/dl、塩
酸ピリドキシン0.025g/dlを含む培地(pH
7.5)の30L張り込みのジャーに接種し、30℃で
一晩、通気攪拌培養を行った。
ト)で30℃、一晩培養した菌株Erwinia herbicola AT
CC21434 の1スラント分を、同じブイヨン培地500m
lを含む3L容フラスコに接種し、30℃で一晩振盪培
養した。このシード培養液をマンニット0.5g/d
l、グリセロール0.6g/dl、KH2PO4 0.0
5g/dl、MgSO4・7H2O 0.05g/dl、
大豆蛋白質酸加水分解物1.0g/dl、L−アラニン
0.4g/dl、グリシン0.3g/dl、DL−メチ
オニン0.1g/dl、L−グルタミン酸0.4g/d
l、L−チロシン0.1g/dl、L−フェニルアラニ
ン0.2g/dl、FeSO4・7H2O 0.005g
/dl、ZnSO4・5H2O 0.001g/dl、塩
酸ピリドキシン0.025g/dlを含む培地(pH
7.5)の30L張り込みのジャーに接種し、30℃で
一晩、通気攪拌培養を行った。
【0015】これらの培養液30Lより、遠心分離(1
0,000rpm、20分、4℃)により菌体を採取
し、生理食塩水で1回洗浄し、同じ遠心分離条件で菌体
を集めた。この菌体の1/4量を0.2mMピリドキサ
ールリン酸(PLP)、5mM2−メルカプトエタノー
ルと4mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を含
む10mMリン酸バッファー(pH7.0)400ml
を加えて懸濁し、氷冷中でトータル20分間、超音波処
理を行い、細胞を破壊後、4℃で10,000rpm、
20分間遠心分離を行い、その上清液を得た。こうして
得た上清液を上述のリン酸バッファーで一晩、透析を行
い、再度、遠心分離により、その上清液を得た。これを
無細胞抽出画分とした。
0,000rpm、20分、4℃)により菌体を採取
し、生理食塩水で1回洗浄し、同じ遠心分離条件で菌体
を集めた。この菌体の1/4量を0.2mMピリドキサ
ールリン酸(PLP)、5mM2−メルカプトエタノー
ルと4mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を含
む10mMリン酸バッファー(pH7.0)400ml
を加えて懸濁し、氷冷中でトータル20分間、超音波処
理を行い、細胞を破壊後、4℃で10,000rpm、
20分間遠心分離を行い、その上清液を得た。こうして
得た上清液を上述のリン酸バッファーで一晩、透析を行
い、再度、遠心分離により、その上清液を得た。これを
無細胞抽出画分とした。
【0016】この無細胞抽出液より硫酸アンモニウム処
理で30−80%の沈澱画分を調製し、透析後、DEA
E−Sepharose CL−6B(Pharmac
ia社製)カラムクロマトグラフィーを、さらにBut
yl−Toyopearl650M(東ソー社製)カラ
ムクロマトグラフィーを行い、精製酵素標品を得た。こ
のチロシンフェノールリアーゼの精製標品2mgを、1
0mMトロポロン、10mMβ−クロロ−L−アラニ
ン、0.05mMピリドキサールリン酸(PLP)、1
00mM水酸化ナトリウム及び100mMリン酸バッフ
ァー(pH8.0)を含む反応液2mlに添加し、30
℃、90分間反応した。上記の反応系において、対照区
として酵素を除いたもの、基質のトロポロンを除いた区
もそれぞれ設定した。
理で30−80%の沈澱画分を調製し、透析後、DEA
E−Sepharose CL−6B(Pharmac
ia社製)カラムクロマトグラフィーを、さらにBut
yl−Toyopearl650M(東ソー社製)カラ
ムクロマトグラフィーを行い、精製酵素標品を得た。こ
のチロシンフェノールリアーゼの精製標品2mgを、1
0mMトロポロン、10mMβ−クロロ−L−アラニ
ン、0.05mMピリドキサールリン酸(PLP)、1
00mM水酸化ナトリウム及び100mMリン酸バッフ
ァー(pH8.0)を含む反応液2mlに添加し、30
℃、90分間反応した。上記の反応系において、対照区
として酵素を除いたもの、基質のトロポロンを除いた区
もそれぞれ設定した。
【0017】反応後、濃塩酸0.4mlを加えて反応を
停止させ、遠心分離により酵素を除去し、上清液を得
た。これらの3つのサンプルにつき薄層クロマトグラフ
ィーを行い、ニンヒドリンにて生成アミノ酸の分析を行
った結果、反応系の区では2つの対照区にはない、新た
なニンヒドリン発色スポットが認められた。さらにアミ
ノ酸分析をした場合にも、反応系の区ではβ−クロロ−
L−アラニンとは異なる新たなアミノ酸のピークが認め
られたことから、トロポロニルアラニンの酵素合成が明
らかになった。尚、トロポロンとβ−クロロ−L−アラ
ニンからトロポロニルアラニンの生成スキームは図1に
示す。
停止させ、遠心分離により酵素を除去し、上清液を得
た。これらの3つのサンプルにつき薄層クロマトグラフ
ィーを行い、ニンヒドリンにて生成アミノ酸の分析を行
った結果、反応系の区では2つの対照区にはない、新た
なニンヒドリン発色スポットが認められた。さらにアミ
ノ酸分析をした場合にも、反応系の区ではβ−クロロ−
L−アラニンとは異なる新たなアミノ酸のピークが認め
られたことから、トロポロニルアラニンの酵素合成が明
らかになった。尚、トロポロンとβ−クロロ−L−アラ
ニンからトロポロニルアラニンの生成スキームは図1に
示す。
【0018】(実施例2)実施例1で得たチロシンフェ
ノールリアーゼの無細胞抽出画分1.6gを100mM
トロポロン、100mMβ−クロロ−L−アラニン、
0.05mMピリドキサールリン酸(PLP)、100
mM水酸化ナトリウム及び100mMリン酸バッファー
(pH8.0)を含む反応液500mlに添加し、30
℃、16時間反応した。なお反応中は2N水酸化ナトリ
ウムを用いて、pHを8.0に調整した。反応後、濃塩
酸100mlを加えて反応を停止させ、遠心分離により
酵素を除去し、上清液を濃縮乾固した。エーテルにより
未反応のトロポロンを除去した後、メタノールによりト
ロポロニルアラニンを抽出し、濃縮乾固した。これを1
20mlの水に溶解し、Dowex 50W−X
(H+)により、目的画分を溶出させたものを濃縮乾固
し、エタノールで抽出した。濃縮乾固後、水−エタノー
ルにより結晶化を行った。収量は約15mgであった。
結晶標品のアミノ酸分析、紫外線吸収スペクトル、赤外
線吸収スペクトル、NMRを測定した結果、トロポロニ
ルアラニンであることが確認された。
ノールリアーゼの無細胞抽出画分1.6gを100mM
トロポロン、100mMβ−クロロ−L−アラニン、
0.05mMピリドキサールリン酸(PLP)、100
mM水酸化ナトリウム及び100mMリン酸バッファー
(pH8.0)を含む反応液500mlに添加し、30
℃、16時間反応した。なお反応中は2N水酸化ナトリ
ウムを用いて、pHを8.0に調整した。反応後、濃塩
酸100mlを加えて反応を停止させ、遠心分離により
酵素を除去し、上清液を濃縮乾固した。エーテルにより
未反応のトロポロンを除去した後、メタノールによりト
ロポロニルアラニンを抽出し、濃縮乾固した。これを1
20mlの水に溶解し、Dowex 50W−X
(H+)により、目的画分を溶出させたものを濃縮乾固
し、エタノールで抽出した。濃縮乾固後、水−エタノー
ルにより結晶化を行った。収量は約15mgであった。
結晶標品のアミノ酸分析、紫外線吸収スペクトル、赤外
線吸収スペクトル、NMRを測定した結果、トロポロニ
ルアラニンであることが確認された。
【0019】得られた結晶は赤色で、トロポロニルアラ
ニンに鉄イオンがキレートしていると思われたので、
0.2mlの水に溶解し、1MNaHS溶液によって鉄
イオンを取り除いた。しかし、これらの一連の操作によ
り、かなり収率が低下した。また酵素合成された精製ト
ロポロニルアラニンをL体特異的及びD体特異的アミノ
酸酸化酵素で処理を行い、その分解性を検討した。L体
特異的アミノ酸酸化酵素で分解され、D体特異的アミノ
酸酸化酵素で分解されなかったことから、本トロポロニ
ルアラニンはL−トロポロニルアラニンであることが確
認された。
ニンに鉄イオンがキレートしていると思われたので、
0.2mlの水に溶解し、1MNaHS溶液によって鉄
イオンを取り除いた。しかし、これらの一連の操作によ
り、かなり収率が低下した。また酵素合成された精製ト
ロポロニルアラニンをL体特異的及びD体特異的アミノ
酸酸化酵素で処理を行い、その分解性を検討した。L体
特異的アミノ酸酸化酵素で分解され、D体特異的アミノ
酸酸化酵素で分解されなかったことから、本トロポロニ
ルアラニンはL−トロポロニルアラニンであることが確
認された。
【0020】(実施例3)マンニット0.5g/dl、
グリセロール0.6g/dl、KH2PO4 0.05g
/dl、MgSO4・7H2O 0.05g/dl、大豆
蛋白質酸加水分解物1.0g/dl、L−アラニン0.
4g/dl、グリシン0.3g/dl、DL−メチオニ
ン0.1g/dl、L−グルタミン酸0.4g/dl、
L−チロシン0.1g/dl、L−フェニルアラニン
0.2g/dl、FeSO4・7H2O0.005g/d
l、ZnSO4・5H2O 0.001g/dl、塩酸ピ
リドキシン0.025g/dlを含む培地(pH7.
5)を500ml容フラスコに50ml入れ、115゜
Cで15分間殺菌した。これに別殺菌した炭酸カルシウ
ム2gを添加し、ブイヨン寒天培地で30゜Cで一晩培
養したErwinia herbicola ATCC21433 を1白金耳接種
し、30℃、一晩振盪培養した。このフラスコ20本分
の培養液1Lより遠心分離により菌体を集め、生理食塩
水で1回洗浄した菌体を得た。
グリセロール0.6g/dl、KH2PO4 0.05g
/dl、MgSO4・7H2O 0.05g/dl、大豆
蛋白質酸加水分解物1.0g/dl、L−アラニン0.
4g/dl、グリシン0.3g/dl、DL−メチオニ
ン0.1g/dl、L−グルタミン酸0.4g/dl、
L−チロシン0.1g/dl、L−フェニルアラニン
0.2g/dl、FeSO4・7H2O0.005g/d
l、ZnSO4・5H2O 0.001g/dl、塩酸ピ
リドキシン0.025g/dlを含む培地(pH7.
5)を500ml容フラスコに50ml入れ、115゜
Cで15分間殺菌した。これに別殺菌した炭酸カルシウ
ム2gを添加し、ブイヨン寒天培地で30゜Cで一晩培
養したErwinia herbicola ATCC21433 を1白金耳接種
し、30℃、一晩振盪培養した。このフラスコ20本分
の培養液1Lより遠心分離により菌体を集め、生理食塩
水で1回洗浄した菌体を得た。
【0021】この菌体約10gを100mMトロポロ
ン、100mMβ−クロロ−L−アラニン、0.05m
Mピリドキサールリン酸(PLP)、100mM水酸化
ナトリウム及び100mMリン酸バッファー(pH8.
0)を含む反応液500mlに添加し、30℃、16時
間反応した。なお反応中は2N水酸化ナトリウムを用い
て、pHを8.0に調整した。反応後、遠心分離により
菌体を除去し、さらに濃塩酸100mlを加えて反応を
停止させ、遠心分離により蛋白質を除去し、上清液を濃
縮乾固した。エーテルにより未反応のトロポロンを除去
した後、メタノールによりトロポロニルアラニンを抽出
し、濃縮乾固した。それを50mlの水に溶解し、Do
wex 50W−X(H+)により、目的画分を溶出さ
せたものを濃縮乾固し、エタノールで抽出した。濃縮乾
固後、水−エタノールにより結晶化を行った。収量は約
4mgであった。結晶化したトロポロニルアラニンを用
いて、アミノ酸分析、紫外線吸収スペクトル、赤外線吸
収スペクトル、NMRを測定した結果、トロポロニルア
ラニンであることが確認された。
ン、100mMβ−クロロ−L−アラニン、0.05m
Mピリドキサールリン酸(PLP)、100mM水酸化
ナトリウム及び100mMリン酸バッファー(pH8.
0)を含む反応液500mlに添加し、30℃、16時
間反応した。なお反応中は2N水酸化ナトリウムを用い
て、pHを8.0に調整した。反応後、遠心分離により
菌体を除去し、さらに濃塩酸100mlを加えて反応を
停止させ、遠心分離により蛋白質を除去し、上清液を濃
縮乾固した。エーテルにより未反応のトロポロンを除去
した後、メタノールによりトロポロニルアラニンを抽出
し、濃縮乾固した。それを50mlの水に溶解し、Do
wex 50W−X(H+)により、目的画分を溶出さ
せたものを濃縮乾固し、エタノールで抽出した。濃縮乾
固後、水−エタノールにより結晶化を行った。収量は約
4mgであった。結晶化したトロポロニルアラニンを用
いて、アミノ酸分析、紫外線吸収スペクトル、赤外線吸
収スペクトル、NMRを測定した結果、トロポロニルア
ラニンであることが確認された。
【0022】
(1)トロポロン並びに(2)(a)β−クロロアラニ
ン、(b)ピルビン酸及びアンモニア叉は(c)セリン
からなる基質にチロシンフェノールリアーゼを水性媒体
中で作用させることにより、目的とするL−トロポロニ
ルアラニンのみを取得できる。
ン、(b)ピルビン酸及びアンモニア叉は(c)セリン
からなる基質にチロシンフェノールリアーゼを水性媒体
中で作用させることにより、目的とするL−トロポロニ
ルアラニンのみを取得できる。
【図1】はトロポロンとβ−クロロ−Lーアラニンから
チロシンフェノールリアーゼの作用により、L−トロポ
ロニルアラニンが生成される機構を示す図である。
チロシンフェノールリアーゼの作用により、L−トロポ
ロニルアラニンが生成される機構を示す図である。
Claims (2)
- 【請求項1】 (1)トロポロン並びに(2)(a)β
−クロロアラニン、(b)ピルビン酸及びアンモニア叉
は(c)セリンからなる基質にチロシンフェノールリア
ーゼを水性媒体中で作用させ、該水性媒体中にL−トロ
ポロニルアラニンを生成せしめ、L−トロポロニルアラ
ニンを採取することを特徴とするL−トロポロニルアラ
ニンの製造法。 - 【請求項2】 チロシンフェノールリアーゼがエルビニ
ア・ヘルビコーラ由来である請求項1記載のL−トロポ
ロニルアラニンの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6211215A JPH0870878A (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | トロポロニルアラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6211215A JPH0870878A (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | トロポロニルアラニンの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0870878A true JPH0870878A (ja) | 1996-03-19 |
Family
ID=16602216
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6211215A Pending JPH0870878A (ja) | 1994-09-05 | 1994-09-05 | トロポロニルアラニンの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0870878A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113151348A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-23 | 华南农业大学 | 水稻OsTAM1基因在调控植物抗虫性中的应用 |
-
1994
- 1994-09-05 JP JP6211215A patent/JPH0870878A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113151348A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-23 | 华南农业大学 | 水稻OsTAM1基因在调控植物抗虫性中的应用 |
CN113151348B (zh) * | 2021-03-17 | 2023-01-10 | 华南农业大学 | 水稻OsTAM1基因在调控植物抗虫性中的应用 |
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